抗体発現最適化配列を使用する発現制御
本発明は、抗体分子を生成するためのジシストロニックなメッセージを提供し、上流のシストロンが抗体の軽鎖をコードするＤＮＡを含み、かつ下流のシストロンが対応する重鎖をコードするＤＮＡを含み、ジシストロニックなメッセージがＡＥＯＳ１（配列番号１）、ＡＥＯＳ２（配列番号２）、ＡＥＯＳ３（配列番号３）、ＡＥＯＳ４（配列番号４）、ＡＥＯＳ５（配列番号５）、ＡＥＯＳ６（配列番号６）、ＡＥＯＳ７（配列番号７）、ＡＥＯＳ８（配列番号８）、ＡＥＯＳ９（配列番号９）、ＡＥＯＳ１０（配列番号１０）及びＡＥＯＳ１１（配列番号１１）から選択される配列を含むことを特徴とする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定の抗体分子の重鎖及び軽鎖がジシストロニックなメッセージ内にあるＤＮＡによってコードされている抗体の生成方法に関する。より具体的には本発明は、抗体がジシストロニックなメッセージとして発現される場合に、抗体の発現及び収量を最適化するための１組の配列を提供する。
【背景技術】
【０００２】
ＷＯ０３／０４８２０８は、抗体の発現及び収量を最適化するために使用できる具体的なジシストロニックなメッセージを記載している。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
本発明は、抗体がジシストロニックなメッセージとして発現される場合に、抗体の発現及び収量を改善するために使用できる１１個からなる１組の抗体発現最適化配列（ＡＥＯＳ）を提供する。このように、本発明は、抗体分子を生成するためのジシストロニックなメッセージであって、その上流のシストロンが抗体の軽鎖をコードするＤＮＡを含み、その下流のシストロンが対応する重鎖をコードするＤＮＡを含む、ジシストロニックなメッセージにおいて、
【化１】
から選択される配列を含むことを特徴とする、ジシストロニックなメッセージを提供する。
【０００４】
本発明のジシストロニックなメッセージは、特定の抗体分子の重鎖及び軽鎖をコードする。本発明の抗体は、可変領域（ＶＨ／ＶＬ）及び定常領域（ＣＨ／ＣＬ）を有する任意の重鎖及び軽鎖の対であることができ、好ましくはその抗体の軽鎖定常領域はκアイソタイプである。本発明の抗体は、抗体全体或いは特にＦａｂ若しくはＦａｂ’又はＷＯ２００５／００３１７０に記載の切断型Ｆａｂ断片などのその断片であることもできる。
【０００５】
本発明のＦａｂ’断片は、天然又は改変ヒンジ領域を有することができる。天然ヒンジ領域は、抗体分子のＣＨ１ドメインと正常に結合しているヒンジ領域である。改変ヒンジ領域は、天然のヒンジ領域と長さ及び／又は組成の点において異なっている任意のヒンジである。そのようなヒンジは、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ハムスター、ラクダ、ラマ又はヤギのヒンジ領域などの任意の適切な種由来のヒンジ領域を含むことができる。他の改変ヒンジ領域は、そのＣＨ１ドメインとは異なるクラス又はサブクラスの抗体に由来する全ヒンジ領域を含むこともできる。このように、例えばクラスγ１のＣＨ１ドメインがクラスγ４のヒンジ領域に結合することもできる。また、改変ヒンジ領域は、天然ヒンジ領域又は繰り返しの各単位が天然ヒンジ領域由来である繰り返し単位の一部分を含むこともできる。さらにまた、天然ヒンジ領域を１つ若しくは複数のシステイン又は他の残基をアラニンなどの中性残基に変換すること或いは適切な位置の残基をシステイン残基に変換することによって改変することもできる。このような方法によって、ヒンジ領域中のシステイン残基の数を増加又は減少させることができる。加えて、軽鎖の鎖間システインからヒンジシステインの間の距離、ヒンジのシステインの間の距離、及び可動性などのヒンジの特性に影響を与え得るヒンジ中の他のアミノ酸の組成などのヒンジの他の特徴を制御することができる。例えばグリシンは回転性の可動性を増大させるためにヒンジに組み込むことができ、プロリンは可動性を減少させるために組み込むことができる。また、荷電した残基又は疎水性の残基の組合せを多量体化特性を付与するためにヒンジ中に導入することもできる。他の改変ヒンジ領域は、完全に合成によることもできるし、長さ、組成及び可動性などの望ましい特性を有するように設計することもできる。例えばＵＳ５６７７４２５、ＷＯ９９／１５５４９、ＷＯ９８／２５９７１及びＷＯ２００５／００３１７１において、多数の改変ヒンジ領域が既に記載されており、これらを本明細書に参考文献として援用する。
【０００６】
本発明の抗体は、例えばＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥを含む任意の抗体のアイソタイプ、並びに例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４を含むそれらのサブクラス由来であることができる。好ましくは、本発明の抗体はＩｇＧ１由来である。好ましくは、軽鎖定常領域はκイソタイプである。抗体は、例えばマウス、ラット、ウサギ、ブタ、ハムスター、ラクダ、ラマ、ヤギ又はヒトを含む任意の種から得ることができる。好ましくは、本発明の抗体の少なくとも定常領域はヒトである。抗体の一部分は複数の種から得ることができ、例えば抗体はキメラであることができる。一例において、定常領域はある１つの種由来でありかつ可変領域は他の種由来である。他の例においては、抗体の可変領域は、組換えＤＮＡ工学技術を使用して作製されている。このような工学的に作り出されたバージョンは、例えば天然の抗体のアミノ酸配列への挿入、欠失又は変更によって天然の抗体の可変領域から作製されたものを含む。このタイプの具体的な例は、ある１つの抗体に由来する、少なくとも１つのＣＤＲ及び場合によって１つ又は複数のフレームワークアミノ酸と、第二の抗体に由来する、可変領域ドメインの残りの部分とを含有する工学的に作り出された可変領域ドメインを含む。
【０００７】
組換え抗体を作製及び製造するための方法は、当業者に周知である（例えば、Ｂｏｓｓら、ＵＳ４８１６３９７；Ｃａｂｉｌｌｙら、ＵＳ６３３１４１５；Ｓｈｒａｄｅｒら、ＷＯ９２／０２５５１；Ｏｒｌａｎｄｉら、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８６、３８３３；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、１９８８、Ｎａｔｕｒｅ、３２２、３２３；Ｑｕｅｅｎら、ＵＳ５５８５０８９；Ａｄａｉｒ、ＷＯ９１／０９９６７；Ｍｏｕｎｔａｉｎ及びＡｄａｉｒ、１９９２，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｅｎｇ．Ｒｅｖ、１０、１〜１４２；Ｖｅｒｍａら、１９９８、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ、２１６、１６５〜１８１を参照）。
【０００８】
本発明の抗体分子は、一般に抗原に選択的に結合することができる。抗原は、例えば細菌細胞、酵母細胞、Ｔ細胞、内皮細胞若しくは腫瘍細胞などの細胞上の細胞表面抗原である任意の細胞関連抗原であることができるし、又は可溶性抗原であることもできる。抗原は、例えば受容体及び／若しくはそれらに対応するリガンドなど、疾患時又は感染時に上方制御される抗原などの医学関連抗原であることもできる。細胞表面抗原の具体的な例は、例えばＶＬＡ−４であるβ１インテグリンなどのインテグリン、Ｅ−セレクチン、Ｐセレクチン又はＬ−セレクチンを例とする接着分子、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤＷ５２、ＣＤ６９、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、ヒト乳脂肪グロブリン（ＨＭＦＧ１及び２）、ＭＨＣクラスＩ及びＭＨＣクラスＩＩ抗原、及びＶＥＧＦ、並びに適当な場合これらの受容体を含む。可溶性抗原は、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１６又はＩＬ−１７などのインターロイキン、例えば呼吸器多核体ウイルス抗原又はサイトメガロウイルス抗原などのウイルス抗原、ＩｇＥなどの免疫グロブリン、インターフェロンα、インターフェロンβ又はインターフェロンγなどのインターフェロン、腫瘍壊死因子α、腫瘍壊死因子β、Ｇ−ＣＳＦ又はＧＭ−ＣＳＦなどのコロニー刺激因子、及びＰＤＧＦ−α及びＰＤＧＦ−βなどの血小板由来増殖因子、並びに適当な場合これらの受容体を含む。
【０００９】
本発明のジシストロニックなメッセージは、合成ＤＮＡ、ｃＤＮＡ若しくはゲノムＤＮＡ又はこれらの任意の組合せを含むことができる。
【００１０】
具体的な抗体についてのＤＮＡコード配列は、当業者に周知の方法によって得ることができる。例えば、抗体の重鎖及び軽鎖の一部分又は全部をコードするＤＮＡ配列は、決定されているＤＮＡ配列又は対応するアミノ酸配列に基づいて要望通りに合成することができる。
【００１１】
分子生物学の標準的技術を、特定の抗体分子の重鎖及び軽鎖をコードし、本発明によって提供される配列を含むＤＮＡ配列を調製するために使用できる。望ましいＤＮＡ配列を、オリゴヌクレオチド合成技術を使用して完全に又は部分的に合成することができる。必要に応じて、部位特異的突然変異誘発及びポリメーラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を使用することもできる。
【００１２】
本発明のジシストロニックなメッセージは、抗体鎖の１つをコードするＤＮＡ配列に融合している、エフェクター又はレポータータンパク質をコードするＤＮＡ配列を含むことができる。
【００１３】
本発明のジシストロニックなメッセージは、ジシストロニックなメッセージから発現される抗体にエフェクター若しくはレポータータンパク質又は分子が続いて結合できるように、抗体鎖の１つをコードするＤＮＡ配列に融合しているペプチドリンケージをコードするＤＮＡ配列を含むこともできる。
【００１４】
本発明のジシストロニックなメッセージは、ペリプラズム又は細胞の外側への抗体鎖のターゲティングを可能にするために、抗体鎖の１つ又は両方をコードするＤＮＡ配列の上流に融合している分泌シグナル配列も含むことができる。
【００１５】
好ましくは、分泌シグナル配列は、ＯｍｐＡペプチド配列である。好ましくは重鎖及び軽鎖両方のための分泌シグナル配列は、ＯｍｐＡペプチド配列である。
【００１６】
好ましくは、本発明のジシストロニックなメッセージによってコードされる抗体分子は、抗腫瘍壊死因子α抗体である。さらに好ましくは、本発明のジシストロニックなメッセージによってコードされる抗体分子は、ヒトＴＮＦαに特異性を有し、かつ図８において示す配列（配列番号２４）から成る軽鎖及び図９において示す配列（配列番号２５）から成る重鎖を含む。好ましくは、ジシストロニックなメッセージによってコードされる抗体が抗ＴＮＦ−α抗体Ｆａｂ’断片である場合、ジシストロニックなメッセージは、配列ＡＥＯＳ１１（配列番号１１）を含む。一実施形態において、ジシストロニックなメッセージによってコードされる抗体が抗ＴＮＦ−α抗体Ｆａｂ’断片である場合、ジシストロニックなメッセージはＩＧＳ１７の配列（配列番号２２）を含む。好ましい一実施形態において、本発明のジシストロニックなメッセージは、図１０において提供する配列（配列番号２６）を含む。
【００１７】
本発明の抗体発現最適化配列は、２つのシストロンの改善された翻訳カップリングが成されるように、長さ、配列及び二次構造に関して改変されている。
【００１８】
ＷＯ０３／０４８２０８において記載の通り、下流のシストロンの翻訳に影響を与えることができるジシストロニックなメッセージの特性がいくつかある。これらは、上流のシストロン中のシャイン・ダルカーノ（ＳＤ）モチーフの存在、ＳＤモチーフの性質、ＳＤ部位と下流のシストロンのＡＵＧ開始コドンとの間の距離、上流のシストロンの終止コドンと下流のシストロンのＡＵＧ開始コドンとの間の距離並びにこの間の介在配列の性質を含む。
【００１９】
本発明のＡＥＯ配列は全てシャイン・ダルカーノ（ＳＤ）モチーフ（リボソーム結合部位）及びそこからジシストロン中の２つの遺伝子の第２の開始（スタート）コドンへの特定の範囲のヌクレオチド距離を有している。以前記載された配列（ＷＯ０３／０４８２０８参照）とは対照的に、シストロン中の第２の遺伝子の発現レベルを最適化するために、同一のＳＤ及び終止コドンが各配列において使用された。
【００２０】
本発明によって提供されるＡＥＯヌクレオチド配列は、図１に示す通り
【化２】
である。
示した配列は、
ｉ）３’１２ｂｐのヒトｃκ（ＮＲＧＥＣＣをコード）
ｉｉ）内部シャイン・ダルカーノ部位（下線）
ｉｉｉ）ＴＡＡ終止コドン（＊）及び終止コドンと開始コドンＡＴＧとの間の遺伝子間スペーサー配列
ｉｖ）開始コドンＡＴＧ
を含む。
【００２１】
最初のシストロンの終止コドンと２番目のシストロンのＡＴＧとの間の距離も示されている。
【００２２】
開始コドンＡＴＧがＧＴＧ及びＴＴＧなどの他の適切なコドンによって置換できることは、理解される。
【００２３】
特定の抗体分子に最適な抗体発現最適化配列は、以下の方法を使用して経験的に決定することができる。方法は、抗体分子に試験のために挿入することができる
【化３】
から選択される一連のＡＥＯ配列バリアントを含む、一連の適切な発現ベクターを構築することを含む。各抗体についての各ＡＥＯ配列の経験的試験は、適切な宿主へ発現ベクターを形質転換し、抗体の発現及び収量を分析することによって行うことができる。長さ及び配列が変化している本願に記載の１組のＡＥＯ配列を、特定の抗体分子に最適なＡＥＯ配列を選択することができる前記ベクターを構築するために使用できる。クローンの構築を容易にするために同一の制限酵素部位を使用している各ＡＥＯ配列を含む１組のＤＮＡカセットも本発明によって提供される（図２）。これらのカセットは、抗体分子の重鎖及び軽鎖それぞれの挿入に適するＨｉｎｄＩＩＩ及びＭｕｎＩの制限酵素部位を含み、ここでＯｍｐＡリーダー配列が重鎖の配列に先行している。これらのカセットは、最初のシストロンに軽鎖定常領域のＣ末端、ｃκ（ＳＦＮＲＧＥＣ）を、及び二番目のシストロンに、ＯｍｐＡリーダー配列のＮ末端の一部（ＭＫＫＴＡＩＡＩ）を含んでいる。本発明によって提供されるカセット配列は
【化４】
である。
【００２４】
したがって、本発明は、本発明のジシストロニックなメッセージを含む発現ベクターも提供する。
【００２５】
適切な発現ベクターは、当業者において周知である。そのようなベクターの例はＷＯ０３／０４８２０８に記載の通りｐＴＴＯ及びｐＴＴＯＤを含む。
【００２６】
本発明は、本発明によるジシストロニックなメッセージを含むクローニングベクターも提供する。
【００２７】
発現ベクター及びクローニングベクターを構築することができる一般的な方法、形質転換方法及び培養方法は当業者に周知である。
【００２８】
本発明は、特定の抗体分子を生成するための方法であって、本発明の発現ベクターで形質転換された細菌宿主細胞を、当該抗体分子をコードするＤＮＡの発現を誘導するのに適した条件下で培養すること及び当該抗体分子を単離することを含み、当該抗体の発現レベルが最適化されている、方法も提供する。
【００２９】
任意の適切な細菌宿主細胞を、本発明によるジシストロニックなメッセージによってコードされた特定の抗体分子の重鎖及び軽鎖の発現のために使用することができる。好ましくは、細菌宿主細胞はグラム陰性であり、非限定的にサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を含む。好ましくは大腸菌宿主細胞が使用される。他の微生物システムも使用できる。
【００３０】
抗体分子を、適切なシグナル配列によって、細胞の外へ分泌したり又はペリプラズムにターゲティングしたりすることができる。また抗体分子を、細胞の細胞質中に蓄積させてもよい。生成する抗体及び使用する方法に依存して、抗体分子をリホールドし、機能的コンホメーションを形成させることが望ましい場合がある。抗体分子をリホールドさせるための方法は当業者に周知である。
【００３１】
本発明の抗体分子は、宿主細胞で生成されれば当業者に既知である任意の適切な方法を使用して抽出及び精製することができる。適切な精製方法は、非限定的にサイズ排除、疎水性相互作用クロマトグラフィー、プロテインＡ、Ｇ又はＬアフィニティークロマトグラフィー及びイオン交換を含む。
【００３２】
本発明によるジシストロニックなメッセージによって生成される抗体分子は、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤若しくは担体との組合せで特定の抗体を含む治療用又は診断用組成物を作製するために使用できる。
【００３３】
抗体分子は、治療用又は診断用組成物中で唯一の活性成分であってもよく、或いは例えば抗Ｔ細胞抗体、抗ＩＦＮγ抗体若しくは抗ＬＰＳ抗体などの他の抗体成分、又はキサンチンなどの非抗体成分を含む１つ又は複数の他の活性成分を伴ってもよい。
【００３４】
本発明によって生成される特定の抗体分子は、それが使用される療法に応じて任意の適切な形態及び量で投与することができる。
【００３５】
投与のための適切形態は、例えばボーラス注射若しくは持続輸液などの、例えば注射投与又は輸液といった非経口投与に適する形態を含む。生成物が注射用又は輸液用である場合、それは油性若しくは水溶性の媒体中の懸濁液、溶液又は乳液の形態であることができるし、懸濁剤、保存剤、安定化剤及び／又は分散剤などの製剤用薬剤を含むこともできる。
【００３６】
また抗体分子は、使用前に適切な滅菌液体で再構成するための乾燥形態であることもできる。
【００３７】
例えば抗体断片である場合など抗体分子が経口投与に適する場合、製剤は活性成分に加えて経口投与組成物の製剤中に使用される適切な添加剤を含むことができる。
【００３８】
治療用及び診断用組成物は、単位投与形態であることができ、その場合各単位投与量は有効量の特定の抗体分子を含んでいる。投与量は患者の年齢及び状態に応じて選択されることになる。
【００３９】
抗体分子が短い半減期（例えば２から１０時間）を有すると、１日当たり１回又は複数回の投与を行う必要がある場合がある。一方、抗体分子が長い半減期（例えば２から１５日間）を有すれば、１日１回、１週間に１回、又はさらに１ヶ月若しくは２ヶ月ごとに１回の投与を行う必要があるだけの場合もある。
【００４０】
本発明を、添付の図を参照する以下の例において例示的方法によってさらに説明する。
【実施例】
【００４１】
一般的方法
抗ＴＮＦα抗体をコードするジシストロニックなメッセージ
本発明のジシストロニックなメッセージを、ＷＯ０１／９４５８５に記載の抗ＴＮＦαＦａｂ’断片の高レベルでの発現を達成するために使用した。上流のシストロンは抗体の軽鎖をコードし（図８）、一方下流のシストロンは抗体の重鎖をコードした（図９）。ペリプラズムへの効率的な分泌を行うためにＯｍｐＡシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列を軽鎖及び重鎖のそれぞれをコードするＤＮＡの５’末端に結合した。
【００４２】
一定範囲の異なる抗体発現最適化配列（ＡＥＯＳ）をコードする１連のオリゴヌクレオチドカセット（図２）を、重鎖の発現レベルを変化させるためにジシストロニックなメッセージに使用した。異なるＡＥＯＳの使用は、重鎖の翻訳開始速度を変化させ、翻訳された重鎖生成物の蓄積速度の範囲に変動を生じた。
【００４３】
方法は、本質的にＷＯ０３／０４８２０８に記載の通りであった。ＩＧＳ１、２、３及び４は、ＷＯ０３／０４８２０８による。
【００４４】
構築物は、５’ＨｉｎｄＩＩＩ部位からＯｍｐＡにわたる長い順方向５’オリゴを使用して作製された。発現実験は、標準的方法、Ｗ３１１０へのプラスミドの形質転換、及び２１個のフラスコ中での２００ｍｌ ＬＢ ３０℃での震盪フラスコでの実験、２００μＭ ＩＰＴＧでのＯＤ６００＝０．５における誘導であった。決めた時点での試料を、Ｔｒｉｓ／ＥＤＴＡ抽出用緩衝液（１００ｍＭ／１０ｍＭ ｐＨ７．４）中に１ｍｌ当たり３０ＯＤ６００に再懸濁し、３０℃で一晩震盪した。抗ヒト−κＨＲＰ複合体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＨＰ６０６２）での６０４５捕捉（抗ＣＨ１）及び検出を使用する、アセンブリーＥＬＩＳＡによって、Ｆａｂ’濃度をアッセイした。
【００４５】
発現の経時変化は、ＩＧＳ７〜１４の全てが以前記載されたＩＧＳ１及びＩＧＳ２と同程度又はより良いレベルでＦａｂ’を発現できることを示した（図３）。ＩＧＳ９は、ＩＧＳ２と比較して、これら両者が終止コドンと開始コドンの間に同じスペーシング（＋１）を有するにもかかわらず、収量の増大を生じており、これらはＨｉｎｄＩＩＩ部位の存在／不在、スペーシングヌクレオチドＡ対Ｔ、及びＯｍｐＡＩＩの最初の２つリシンのコドンのＡＡＧ ＡＡＧ対ＡＡＡ ＡＡＧにおいて異なっている。
【００４６】
図４は、どちらも−１の遺伝子間スペーシングを有する２つのＩＧＳプラスミド（ＩＧＳ１及びＩＧＳ７）を比較している。これらのプラスミドからのＦａｂ’の発現が有意には異ならないことは、ＨｉｎｄＩＩＩ部位の存在及びＯｍｐＡＩＩの２つリシンのコドンのＡＡＧ ＡＡＧからＡＡＡ ＡＡＧへの変化が発現レベルの変化を生じないことを示唆している。このため、他のＩＧＳ構築物においても存在するこれら２つの変化は、異なるＩＧＳの間で比較する場合おそらく無視することができる。したがって以下の例において重要なことはＡＥＯ配列である。
【００４７】
図５ａ〜ｅ：ＩＧＳ１０〜１３（スペーシング＋２、＋３、＋４及び＋５）に対するＩＧＳ２（スペーシング＋１）の比較は、ＩＧＳ２を超える収量の改善は２つの要因、ＩＧＳ２において使用されるＧＡＧＧＧＧ配列よりもむしろＧＡＧＧＡＧ ＳＤ配列の使用、及びＳＤとＡＴＧ開始コドンの間に最適な距離を有することによることを示している。データは、＋４及び＋５のスペーシングで収量が一定の低減傾向にあり、＋２及び＋３のスペーシングがこのＦａｂ’に最適であることを示唆している。この傾向は、ＩＧＳ２（＋１）での収量とほぼ同程度であるＩＧＳ１４（＋６）での収量のさらなる低下によって支持される、図５ｅ参照。
【００４８】
図６は、構築物間の差異が終止コドンとＡＴＧとの間のスペーシングだけである２つのプラスミド間に有意差があることを確証している。ＩＧＳ１０（＋２）及びＩＧＳ１４（＋６）は同一のＨｉｎｄＩＩＩ、ＳＤ配列、ＴＡＡ終止コドン及びＡＡＡ ＡＡＧのＯｍｐＡＩＩコドンを有する。このデータは、ポリシストロン中の２番目の遺伝子の発現レベルがＩＧＳ中のＳＤ−ＡＴＧスペーシングの長さによって精密に調整でき、したがってＩＧＳカセット中のＡＥＯ配列に依存していることを確証している。
【００４９】
新規ＩＧＳカセット７〜１４の増殖プロフィールを実験し、ＩＧＳ１及びＩＧＳ２と比較した。ＯＤ６００が０．５に達した時に培養を誘導し、次いで４時間続けた。ほとんどの培養は、２つの注目すべき例外を除き同じ様に観察された。ＩＧＳ９（＋１）をコードするプラスミドは、より高いＯＤ６００に細胞を培養可能にし、誘導後も他のＩＧＳカセットよりもより良い増殖が継続する。次に良い増殖プロフィールは、ＩＧＳ２（＋１）をコードするプラスミドである。これら２つのＩＧＳが有する共通の性質は、＋１残基のスペーシングギャップだけである。ＩＧＳ２及び９は、それぞれ±ＨｉｎｄＩＩＩ、ＧＡＧＧＧＧ対ＧＡＧＧＡＧであり、ＴＡＡとＡＴＧの間にＡ対Ｔを有し、かつリシンコドンにＡＡＧ ＡＡＧ対ＡＡＡ ＡＡＧを有する。ＩＧＳ９の収量がＩＧＳ２よりいくぶん高いことから、この増殖の有利点は、タンパク質生成物の生成量が少ないことによるストレスの低下によるものではないであろう。したがってこれらのデータは、＋１の終止−ＡＴＧスペーシングに、転写／翻訳メカニズムに対する恩恵によって付与される生物学的利点があることを示唆する。
【００５０】
ＩＧＳ１０、１７及び１８に対するＩＧＳ２の種々の１リットル培養試験での発現の比較についての増殖プロフィールは、新規ＩＧＳはＦａｂ’誘導の前又は後で大腸菌の増殖に有害な影響を及ぼさないことを示した。図７ａ、ｂ及びｃは、ペリプラズム成分（プロテインＧ ＨＰＬＣアッセイによって測定）及び培養上清成分（Ｆａｂ’サンドイッチＥＬＩＳＡによって測定）についてのＦａｂ’蓄積のプロフィールを示す。データは、ＩＧＳ１７及び１８についてのＦａｂ’収量がＩＧＳ２と比較して減少していないことを示している。培養データは、試料採取及びアッセイの変動によって生じるノイズを必然的に有する傾向があるが、３セットの培養データを合わせて考慮すると、ＩＧＳ１７が約１０〜２０％のＦａｂ収量の改善を示すことが示唆される。
【００５１】
ＩＧＳ１７を含む抗ＴＮＦα抗体Ｆａｂ’断片をコードするジシストロニックなメッセージを図１０に示し、この配列の翻訳を図１１に示す。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】本発明において使用する抗体発現最適化配列（ＡＥＯＳ）を示す表である。
【図２】抗体発現最適化配列を含むカセットを示す表である。
【図３】以前記載されたＩＧＳ１及びＩＧＳ２とＩＧＳ７〜１４とを比較した、震盪フラスコ中で実施したＦａｂ’発現の経時変化を示すグラフである。
【図４】両方が−１の遺伝子間スペーシングを有する２つのＩＧＳカセット（ＩＧＳ１及びＩＧＳ７）を比較した、震盪フラスコ中で実施したＦａｂ’発現の経時変化を示すグラフである。
【図５ａ】ＩＧＳ２とＩＧＳ１０とを比較した、震盪フラスコ中で実施したＦａｂ’発現の経時変化を示すグラフである。
【図５ｂ】ＩＧＳ２とＩＧＳ１１とを比較した、震盪フラスコ中で実施したＦａｂ’発現の経時変化を示すグラフである。
【図５ｃ】ＩＧＳ２とＩＧＳ１２とを比較した、震盪フラスコ中で実施したＦａｂ’発現の経時変化を示すグラフである。
【図５ｄ】ＩＧＳ２とＩＧＳ１３とを比較した、震盪フラスコ中で実施したＦａｂ’発現の経時変化を示すグラフである。
【図５ｅ】ＩＧＳ２とＩＧＳ１４とを比較した、震盪フラスコ中で実施したＦａｂ’発現の経時変化を示すグラフである。
【図６】ＩＧＳ１０とＩＧＳ１４とを比較した、震盪フラスコ中で実施したＦａｂ’発現の経時変化を示すグラフである。
【図７ａ】ＩＧＳ２、ＩＧＳ１０、ＩＧＳ１７及びＩＧＳ１８を使用する１リットル培養でのペリプラズムＦａｂ’及び培地上清Ｆａｂ’についてＦａｂ’の蓄積の経時変化を示すグラフである。
【図７ｂ】ＩＧＳ２、ＩＧＳ１７及びＩＧＳ１８を使用する１リットル培養でのペリプラズムＦａｂ’及び培地上清Ｆａｂ’についてＦａｂ’の蓄積の経時変化を示すグラフである。
【図７ｃ】ＩＧＳ２及びＩＧＳ１７を使用する１リットル培養でのペリプラズムＦａｂ’及び培地上清Ｆａｂ’についてＦａｂ’の蓄積の経時変化を示すグラフである。
【図８】抗ＴＮＦαＦａｂ’断片の軽鎖のアミノ酸配列を示す図である。
【図９】抗ＴＮＦαＦａｂ’断片の重鎖のアミノ酸配列を示す図である。
【図１０】ＡＥＯＳ１１及びＯｍｐＡリーダーを含む抗ＴＮＦαＦａｂ’断片の全コード領域を示す図である。
【図１１】ＡＥＯＳ１１を含む抗ＴＮＦαＦａｂ’断片の全コード領域と翻訳を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定の抗体分子の重鎖及び軽鎖がジシストロニックなメッセージ内にあるＤＮＡによってコードされている抗体の生成方法に関する。より具体的には本発明は、抗体がジシストロニックなメッセージとして発現される場合に、抗体の発現及び収量を最適化するための１組の配列を提供する。
【背景技術】
【０００２】
ＷＯ０３／０４８２０８は、抗体の発現及び収量を最適化するために使用できる具体的なジシストロニックなメッセージを記載している。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
本発明は、抗体がジシストロニックなメッセージとして発現される場合に、抗体の発現及び収量を改善するために使用できる１１個からなる１組の抗体発現最適化配列（ＡＥＯＳ）を提供する。このように、本発明は、抗体分子を生成するためのジシストロニックなメッセージであって、その上流のシストロンが抗体の軽鎖をコードするＤＮＡを含み、その下流のシストロンが対応する重鎖をコードするＤＮＡを含む、ジシストロニックなメッセージにおいて、
【化１】
から選択される配列を含むことを特徴とする、ジシストロニックなメッセージを提供する。
【０００４】
本発明のジシストロニックなメッセージは、特定の抗体分子の重鎖及び軽鎖をコードする。本発明の抗体は、可変領域（ＶＨ／ＶＬ）及び定常領域（ＣＨ／ＣＬ）を有する任意の重鎖及び軽鎖の対であることができ、好ましくはその抗体の軽鎖定常領域はκアイソタイプである。本発明の抗体は、抗体全体或いは特にＦａｂ若しくはＦａｂ’又はＷＯ２００５／００３１７０に記載の切断型Ｆａｂ断片などのその断片であることもできる。
【０００５】
本発明のＦａｂ’断片は、天然又は改変ヒンジ領域を有することができる。天然ヒンジ領域は、抗体分子のＣＨ１ドメインと正常に結合しているヒンジ領域である。改変ヒンジ領域は、天然のヒンジ領域と長さ及び／又は組成の点において異なっている任意のヒンジである。そのようなヒンジは、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ハムスター、ラクダ、ラマ又はヤギのヒンジ領域などの任意の適切な種由来のヒンジ領域を含むことができる。他の改変ヒンジ領域は、そのＣＨ１ドメインとは異なるクラス又はサブクラスの抗体に由来する全ヒンジ領域を含むこともできる。このように、例えばクラスγ１のＣＨ１ドメインがクラスγ４のヒンジ領域に結合することもできる。また、改変ヒンジ領域は、天然ヒンジ領域又は繰り返しの各単位が天然ヒンジ領域由来である繰り返し単位の一部分を含むこともできる。さらにまた、天然ヒンジ領域を１つ若しくは複数のシステイン又は他の残基をアラニンなどの中性残基に変換すること或いは適切な位置の残基をシステイン残基に変換することによって改変することもできる。このような方法によって、ヒンジ領域中のシステイン残基の数を増加又は減少させることができる。加えて、軽鎖の鎖間システインからヒンジシステインの間の距離、ヒンジのシステインの間の距離、及び可動性などのヒンジの特性に影響を与え得るヒンジ中の他のアミノ酸の組成などのヒンジの他の特徴を制御することができる。例えばグリシンは回転性の可動性を増大させるためにヒンジに組み込むことができ、プロリンは可動性を減少させるために組み込むことができる。また、荷電した残基又は疎水性の残基の組合せを多量体化特性を付与するためにヒンジ中に導入することもできる。他の改変ヒンジ領域は、完全に合成によることもできるし、長さ、組成及び可動性などの望ましい特性を有するように設計することもできる。例えばＵＳ５６７７４２５、ＷＯ９９／１５５４９、ＷＯ９８／２５９７１及びＷＯ２００５／００３１７１において、多数の改変ヒンジ領域が既に記載されており、これらを本明細書に参考文献として援用する。
【０００６】
本発明の抗体は、例えばＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥを含む任意の抗体のアイソタイプ、並びに例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４を含むそれらのサブクラス由来であることができる。好ましくは、本発明の抗体はＩｇＧ１由来である。好ましくは、軽鎖定常領域はκイソタイプである。抗体は、例えばマウス、ラット、ウサギ、ブタ、ハムスター、ラクダ、ラマ、ヤギ又はヒトを含む任意の種から得ることができる。好ましくは、本発明の抗体の少なくとも定常領域はヒトである。抗体の一部分は複数の種から得ることができ、例えば抗体はキメラであることができる。一例において、定常領域はある１つの種由来でありかつ可変領域は他の種由来である。他の例においては、抗体の可変領域は、組換えＤＮＡ工学技術を使用して作製されている。このような工学的に作り出されたバージョンは、例えば天然の抗体のアミノ酸配列への挿入、欠失又は変更によって天然の抗体の可変領域から作製されたものを含む。このタイプの具体的な例は、ある１つの抗体に由来する、少なくとも１つのＣＤＲ及び場合によって１つ又は複数のフレームワークアミノ酸と、第二の抗体に由来する、可変領域ドメインの残りの部分とを含有する工学的に作り出された可変領域ドメインを含む。
【０００７】
組換え抗体を作製及び製造するための方法は、当業者に周知である（例えば、Ｂｏｓｓら、ＵＳ４８１６３９７；Ｃａｂｉｌｌｙら、ＵＳ６３３１４１５；Ｓｈｒａｄｅｒら、ＷＯ９２／０２５５１；Ｏｒｌａｎｄｉら、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８６、３８３３；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、１９８８、Ｎａｔｕｒｅ、３２２、３２３；Ｑｕｅｅｎら、ＵＳ５５８５０８９；Ａｄａｉｒ、ＷＯ９１／０９９６７；Ｍｏｕｎｔａｉｎ及びＡｄａｉｒ、１９９２，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｅｎｇ．Ｒｅｖ、１０、１〜１４２；Ｖｅｒｍａら、１９９８、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ、２１６、１６５〜１８１を参照）。
【０００８】
本発明の抗体分子は、一般に抗原に選択的に結合することができる。抗原は、例えば細菌細胞、酵母細胞、Ｔ細胞、内皮細胞若しくは腫瘍細胞などの細胞上の細胞表面抗原である任意の細胞関連抗原であることができるし、又は可溶性抗原であることもできる。抗原は、例えば受容体及び／若しくはそれらに対応するリガンドなど、疾患時又は感染時に上方制御される抗原などの医学関連抗原であることもできる。細胞表面抗原の具体的な例は、例えばＶＬＡ−４であるβ１インテグリンなどのインテグリン、Ｅ−セレクチン、Ｐセレクチン又はＬ−セレクチンを例とする接着分子、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤＷ５２、ＣＤ６９、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、ヒト乳脂肪グロブリン（ＨＭＦＧ１及び２）、ＭＨＣクラスＩ及びＭＨＣクラスＩＩ抗原、及びＶＥＧＦ、並びに適当な場合これらの受容体を含む。可溶性抗原は、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１６又はＩＬ−１７などのインターロイキン、例えば呼吸器多核体ウイルス抗原又はサイトメガロウイルス抗原などのウイルス抗原、ＩｇＥなどの免疫グロブリン、インターフェロンα、インターフェロンβ又はインターフェロンγなどのインターフェロン、腫瘍壊死因子α、腫瘍壊死因子β、Ｇ−ＣＳＦ又はＧＭ−ＣＳＦなどのコロニー刺激因子、及びＰＤＧＦ−α及びＰＤＧＦ−βなどの血小板由来増殖因子、並びに適当な場合これらの受容体を含む。
【０００９】
本発明のジシストロニックなメッセージは、合成ＤＮＡ、ｃＤＮＡ若しくはゲノムＤＮＡ又はこれらの任意の組合せを含むことができる。
【００１０】
具体的な抗体についてのＤＮＡコード配列は、当業者に周知の方法によって得ることができる。例えば、抗体の重鎖及び軽鎖の一部分又は全部をコードするＤＮＡ配列は、決定されているＤＮＡ配列又は対応するアミノ酸配列に基づいて要望通りに合成することができる。
【００１１】
分子生物学の標準的技術を、特定の抗体分子の重鎖及び軽鎖をコードし、本発明によって提供される配列を含むＤＮＡ配列を調製するために使用できる。望ましいＤＮＡ配列を、オリゴヌクレオチド合成技術を使用して完全に又は部分的に合成することができる。必要に応じて、部位特異的突然変異誘発及びポリメーラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を使用することもできる。
【００１２】
本発明のジシストロニックなメッセージは、抗体鎖の１つをコードするＤＮＡ配列に融合している、エフェクター又はレポータータンパク質をコードするＤＮＡ配列を含むことができる。
【００１３】
本発明のジシストロニックなメッセージは、ジシストロニックなメッセージから発現される抗体にエフェクター若しくはレポータータンパク質又は分子が続いて結合できるように、抗体鎖の１つをコードするＤＮＡ配列に融合しているペプチドリンケージをコードするＤＮＡ配列を含むこともできる。
【００１４】
本発明のジシストロニックなメッセージは、ペリプラズム又は細胞の外側への抗体鎖のターゲティングを可能にするために、抗体鎖の１つ又は両方をコードするＤＮＡ配列の上流に融合している分泌シグナル配列も含むことができる。
【００１５】
好ましくは、分泌シグナル配列は、ＯｍｐＡペプチド配列である。好ましくは重鎖及び軽鎖両方のための分泌シグナル配列は、ＯｍｐＡペプチド配列である。
【００１６】
好ましくは、本発明のジシストロニックなメッセージによってコードされる抗体分子は、抗腫瘍壊死因子α抗体である。さらに好ましくは、本発明のジシストロニックなメッセージによってコードされる抗体分子は、ヒトＴＮＦαに特異性を有し、かつ図８において示す配列（配列番号２４）から成る軽鎖及び図９において示す配列（配列番号２５）から成る重鎖を含む。好ましくは、ジシストロニックなメッセージによってコードされる抗体が抗ＴＮＦ−α抗体Ｆａｂ’断片である場合、ジシストロニックなメッセージは、配列ＡＥＯＳ１１（配列番号１１）を含む。一実施形態において、ジシストロニックなメッセージによってコードされる抗体が抗ＴＮＦ−α抗体Ｆａｂ’断片である場合、ジシストロニックなメッセージはＩＧＳ１７の配列（配列番号２２）を含む。好ましい一実施形態において、本発明のジシストロニックなメッセージは、図１０において提供する配列（配列番号２６）を含む。
【００１７】
本発明の抗体発現最適化配列は、２つのシストロンの改善された翻訳カップリングが成されるように、長さ、配列及び二次構造に関して改変されている。
【００１８】
ＷＯ０３／０４８２０８において記載の通り、下流のシストロンの翻訳に影響を与えることができるジシストロニックなメッセージの特性がいくつかある。これらは、上流のシストロン中のシャイン・ダルカーノ（ＳＤ）モチーフの存在、ＳＤモチーフの性質、ＳＤ部位と下流のシストロンのＡＵＧ開始コドンとの間の距離、上流のシストロンの終止コドンと下流のシストロンのＡＵＧ開始コドンとの間の距離並びにこの間の介在配列の性質を含む。
【００１９】
本発明のＡＥＯ配列は全てシャイン・ダルカーノ（ＳＤ）モチーフ（リボソーム結合部位）及びそこからジシストロン中の２つの遺伝子の第２の開始（スタート）コドンへの特定の範囲のヌクレオチド距離を有している。以前記載された配列（ＷＯ０３／０４８２０８参照）とは対照的に、シストロン中の第２の遺伝子の発現レベルを最適化するために、同一のＳＤ及び終止コドンが各配列において使用された。
【００２０】
本発明によって提供されるＡＥＯヌクレオチド配列は、図１に示す通り
【化２】
である。
示した配列は、
ｉ）３’１２ｂｐのヒトｃκ（ＮＲＧＥＣＣをコード）
ｉｉ）内部シャイン・ダルカーノ部位（下線）
ｉｉｉ）ＴＡＡ終止コドン（＊）及び終止コドンと開始コドンＡＴＧとの間の遺伝子間スペーサー配列
ｉｖ）開始コドンＡＴＧ
を含む。
【００２１】
最初のシストロンの終止コドンと２番目のシストロンのＡＴＧとの間の距離も示されている。
【００２２】
開始コドンＡＴＧがＧＴＧ及びＴＴＧなどの他の適切なコドンによって置換できることは、理解される。
【００２３】
特定の抗体分子に最適な抗体発現最適化配列は、以下の方法を使用して経験的に決定することができる。方法は、抗体分子に試験のために挿入することができる
【化３】
から選択される一連のＡＥＯ配列バリアントを含む、一連の適切な発現ベクターを構築することを含む。各抗体についての各ＡＥＯ配列の経験的試験は、適切な宿主へ発現ベクターを形質転換し、抗体の発現及び収量を分析することによって行うことができる。長さ及び配列が変化している本願に記載の１組のＡＥＯ配列を、特定の抗体分子に最適なＡＥＯ配列を選択することができる前記ベクターを構築するために使用できる。クローンの構築を容易にするために同一の制限酵素部位を使用している各ＡＥＯ配列を含む１組のＤＮＡカセットも本発明によって提供される（図２）。これらのカセットは、抗体分子の重鎖及び軽鎖それぞれの挿入に適するＨｉｎｄＩＩＩ及びＭｕｎＩの制限酵素部位を含み、ここでＯｍｐＡリーダー配列が重鎖の配列に先行している。これらのカセットは、最初のシストロンに軽鎖定常領域のＣ末端、ｃκ（ＳＦＮＲＧＥＣ）を、及び二番目のシストロンに、ＯｍｐＡリーダー配列のＮ末端の一部（ＭＫＫＴＡＩＡＩ）を含んでいる。本発明によって提供されるカセット配列は
【化４】
である。
【００２４】
したがって、本発明は、本発明のジシストロニックなメッセージを含む発現ベクターも提供する。
【００２５】
適切な発現ベクターは、当業者において周知である。そのようなベクターの例はＷＯ０３／０４８２０８に記載の通りｐＴＴＯ及びｐＴＴＯＤを含む。
【００２６】
本発明は、本発明によるジシストロニックなメッセージを含むクローニングベクターも提供する。
【００２７】
発現ベクター及びクローニングベクターを構築することができる一般的な方法、形質転換方法及び培養方法は当業者に周知である。
【００２８】
本発明は、特定の抗体分子を生成するための方法であって、本発明の発現ベクターで形質転換された細菌宿主細胞を、当該抗体分子をコードするＤＮＡの発現を誘導するのに適した条件下で培養すること及び当該抗体分子を単離することを含み、当該抗体の発現レベルが最適化されている、方法も提供する。
【００２９】
任意の適切な細菌宿主細胞を、本発明によるジシストロニックなメッセージによってコードされた特定の抗体分子の重鎖及び軽鎖の発現のために使用することができる。好ましくは、細菌宿主細胞はグラム陰性であり、非限定的にサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を含む。好ましくは大腸菌宿主細胞が使用される。他の微生物システムも使用できる。
【００３０】
抗体分子を、適切なシグナル配列によって、細胞の外へ分泌したり又はペリプラズムにターゲティングしたりすることができる。また抗体分子を、細胞の細胞質中に蓄積させてもよい。生成する抗体及び使用する方法に依存して、抗体分子をリホールドし、機能的コンホメーションを形成させることが望ましい場合がある。抗体分子をリホールドさせるための方法は当業者に周知である。
【００３１】
本発明の抗体分子は、宿主細胞で生成されれば当業者に既知である任意の適切な方法を使用して抽出及び精製することができる。適切な精製方法は、非限定的にサイズ排除、疎水性相互作用クロマトグラフィー、プロテインＡ、Ｇ又はＬアフィニティークロマトグラフィー及びイオン交換を含む。
【００３２】
本発明によるジシストロニックなメッセージによって生成される抗体分子は、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤若しくは担体との組合せで特定の抗体を含む治療用又は診断用組成物を作製するために使用できる。
【００３３】
抗体分子は、治療用又は診断用組成物中で唯一の活性成分であってもよく、或いは例えば抗Ｔ細胞抗体、抗ＩＦＮγ抗体若しくは抗ＬＰＳ抗体などの他の抗体成分、又はキサンチンなどの非抗体成分を含む１つ又は複数の他の活性成分を伴ってもよい。
【００３４】
本発明によって生成される特定の抗体分子は、それが使用される療法に応じて任意の適切な形態及び量で投与することができる。
【００３５】
投与のための適切形態は、例えばボーラス注射若しくは持続輸液などの、例えば注射投与又は輸液といった非経口投与に適する形態を含む。生成物が注射用又は輸液用である場合、それは油性若しくは水溶性の媒体中の懸濁液、溶液又は乳液の形態であることができるし、懸濁剤、保存剤、安定化剤及び／又は分散剤などの製剤用薬剤を含むこともできる。
【００３６】
また抗体分子は、使用前に適切な滅菌液体で再構成するための乾燥形態であることもできる。
【００３７】
例えば抗体断片である場合など抗体分子が経口投与に適する場合、製剤は活性成分に加えて経口投与組成物の製剤中に使用される適切な添加剤を含むことができる。
【００３８】
治療用及び診断用組成物は、単位投与形態であることができ、その場合各単位投与量は有効量の特定の抗体分子を含んでいる。投与量は患者の年齢及び状態に応じて選択されることになる。
【００３９】
抗体分子が短い半減期（例えば２から１０時間）を有すると、１日当たり１回又は複数回の投与を行う必要がある場合がある。一方、抗体分子が長い半減期（例えば２から１５日間）を有すれば、１日１回、１週間に１回、又はさらに１ヶ月若しくは２ヶ月ごとに１回の投与を行う必要があるだけの場合もある。
【００４０】
本発明を、添付の図を参照する以下の例において例示的方法によってさらに説明する。
【実施例】
【００４１】
一般的方法
抗ＴＮＦα抗体をコードするジシストロニックなメッセージ
本発明のジシストロニックなメッセージを、ＷＯ０１／９４５８５に記載の抗ＴＮＦαＦａｂ’断片の高レベルでの発現を達成するために使用した。上流のシストロンは抗体の軽鎖をコードし（図８）、一方下流のシストロンは抗体の重鎖をコードした（図９）。ペリプラズムへの効率的な分泌を行うためにＯｍｐＡシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列を軽鎖及び重鎖のそれぞれをコードするＤＮＡの５’末端に結合した。
【００４２】
一定範囲の異なる抗体発現最適化配列（ＡＥＯＳ）をコードする１連のオリゴヌクレオチドカセット（図２）を、重鎖の発現レベルを変化させるためにジシストロニックなメッセージに使用した。異なるＡＥＯＳの使用は、重鎖の翻訳開始速度を変化させ、翻訳された重鎖生成物の蓄積速度の範囲に変動を生じた。
【００４３】
方法は、本質的にＷＯ０３／０４８２０８に記載の通りであった。ＩＧＳ１、２、３及び４は、ＷＯ０３／０４８２０８による。
【００４４】
構築物は、５’ＨｉｎｄＩＩＩ部位からＯｍｐＡにわたる長い順方向５’オリゴを使用して作製された。発現実験は、標準的方法、Ｗ３１１０へのプラスミドの形質転換、及び２１個のフラスコ中での２００ｍｌ ＬＢ ３０℃での震盪フラスコでの実験、２００μＭ ＩＰＴＧでのＯＤ６００＝０．５における誘導であった。決めた時点での試料を、Ｔｒｉｓ／ＥＤＴＡ抽出用緩衝液（１００ｍＭ／１０ｍＭ ｐＨ７．４）中に１ｍｌ当たり３０ＯＤ６００に再懸濁し、３０℃で一晩震盪した。抗ヒト−κＨＲＰ複合体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＨＰ６０６２）での６０４５捕捉（抗ＣＨ１）及び検出を使用する、アセンブリーＥＬＩＳＡによって、Ｆａｂ’濃度をアッセイした。
【００４５】
発現の経時変化は、ＩＧＳ７〜１４の全てが以前記載されたＩＧＳ１及びＩＧＳ２と同程度又はより良いレベルでＦａｂ’を発現できることを示した（図３）。ＩＧＳ９は、ＩＧＳ２と比較して、これら両者が終止コドンと開始コドンの間に同じスペーシング（＋１）を有するにもかかわらず、収量の増大を生じており、これらはＨｉｎｄＩＩＩ部位の存在／不在、スペーシングヌクレオチドＡ対Ｔ、及びＯｍｐＡＩＩの最初の２つリシンのコドンのＡＡＧ ＡＡＧ対ＡＡＡ ＡＡＧにおいて異なっている。
【００４６】
図４は、どちらも−１の遺伝子間スペーシングを有する２つのＩＧＳプラスミド（ＩＧＳ１及びＩＧＳ７）を比較している。これらのプラスミドからのＦａｂ’の発現が有意には異ならないことは、ＨｉｎｄＩＩＩ部位の存在及びＯｍｐＡＩＩの２つリシンのコドンのＡＡＧ ＡＡＧからＡＡＡ ＡＡＧへの変化が発現レベルの変化を生じないことを示唆している。このため、他のＩＧＳ構築物においても存在するこれら２つの変化は、異なるＩＧＳの間で比較する場合おそらく無視することができる。したがって以下の例において重要なことはＡＥＯ配列である。
【００４７】
図５ａ〜ｅ：ＩＧＳ１０〜１３（スペーシング＋２、＋３、＋４及び＋５）に対するＩＧＳ２（スペーシング＋１）の比較は、ＩＧＳ２を超える収量の改善は２つの要因、ＩＧＳ２において使用されるＧＡＧＧＧＧ配列よりもむしろＧＡＧＧＡＧ ＳＤ配列の使用、及びＳＤとＡＴＧ開始コドンの間に最適な距離を有することによることを示している。データは、＋４及び＋５のスペーシングで収量が一定の低減傾向にあり、＋２及び＋３のスペーシングがこのＦａｂ’に最適であることを示唆している。この傾向は、ＩＧＳ２（＋１）での収量とほぼ同程度であるＩＧＳ１４（＋６）での収量のさらなる低下によって支持される、図５ｅ参照。
【００４８】
図６は、構築物間の差異が終止コドンとＡＴＧとの間のスペーシングだけである２つのプラスミド間に有意差があることを確証している。ＩＧＳ１０（＋２）及びＩＧＳ１４（＋６）は同一のＨｉｎｄＩＩＩ、ＳＤ配列、ＴＡＡ終止コドン及びＡＡＡ ＡＡＧのＯｍｐＡＩＩコドンを有する。このデータは、ポリシストロン中の２番目の遺伝子の発現レベルがＩＧＳ中のＳＤ−ＡＴＧスペーシングの長さによって精密に調整でき、したがってＩＧＳカセット中のＡＥＯ配列に依存していることを確証している。
【００４９】
新規ＩＧＳカセット７〜１４の増殖プロフィールを実験し、ＩＧＳ１及びＩＧＳ２と比較した。ＯＤ６００が０．５に達した時に培養を誘導し、次いで４時間続けた。ほとんどの培養は、２つの注目すべき例外を除き同じ様に観察された。ＩＧＳ９（＋１）をコードするプラスミドは、より高いＯＤ６００に細胞を培養可能にし、誘導後も他のＩＧＳカセットよりもより良い増殖が継続する。次に良い増殖プロフィールは、ＩＧＳ２（＋１）をコードするプラスミドである。これら２つのＩＧＳが有する共通の性質は、＋１残基のスペーシングギャップだけである。ＩＧＳ２及び９は、それぞれ±ＨｉｎｄＩＩＩ、ＧＡＧＧＧＧ対ＧＡＧＧＡＧであり、ＴＡＡとＡＴＧの間にＡ対Ｔを有し、かつリシンコドンにＡＡＧ ＡＡＧ対ＡＡＡ ＡＡＧを有する。ＩＧＳ９の収量がＩＧＳ２よりいくぶん高いことから、この増殖の有利点は、タンパク質生成物の生成量が少ないことによるストレスの低下によるものではないであろう。したがってこれらのデータは、＋１の終止−ＡＴＧスペーシングに、転写／翻訳メカニズムに対する恩恵によって付与される生物学的利点があることを示唆する。
【００５０】
ＩＧＳ１０、１７及び１８に対するＩＧＳ２の種々の１リットル培養試験での発現の比較についての増殖プロフィールは、新規ＩＧＳはＦａｂ’誘導の前又は後で大腸菌の増殖に有害な影響を及ぼさないことを示した。図７ａ、ｂ及びｃは、ペリプラズム成分（プロテインＧ ＨＰＬＣアッセイによって測定）及び培養上清成分（Ｆａｂ’サンドイッチＥＬＩＳＡによって測定）についてのＦａｂ’蓄積のプロフィールを示す。データは、ＩＧＳ１７及び１８についてのＦａｂ’収量がＩＧＳ２と比較して減少していないことを示している。培養データは、試料採取及びアッセイの変動によって生じるノイズを必然的に有する傾向があるが、３セットの培養データを合わせて考慮すると、ＩＧＳ１７が約１０〜２０％のＦａｂ収量の改善を示すことが示唆される。
【００５１】
ＩＧＳ１７を含む抗ＴＮＦα抗体Ｆａｂ’断片をコードするジシストロニックなメッセージを図１０に示し、この配列の翻訳を図１１に示す。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】本発明において使用する抗体発現最適化配列（ＡＥＯＳ）を示す表である。
【図２】抗体発現最適化配列を含むカセットを示す表である。
【図３】以前記載されたＩＧＳ１及びＩＧＳ２とＩＧＳ７〜１４とを比較した、震盪フラスコ中で実施したＦａｂ’発現の経時変化を示すグラフである。
【図４】両方が−１の遺伝子間スペーシングを有する２つのＩＧＳカセット（ＩＧＳ１及びＩＧＳ７）を比較した、震盪フラスコ中で実施したＦａｂ’発現の経時変化を示すグラフである。
【図５ａ】ＩＧＳ２とＩＧＳ１０とを比較した、震盪フラスコ中で実施したＦａｂ’発現の経時変化を示すグラフである。
【図５ｂ】ＩＧＳ２とＩＧＳ１１とを比較した、震盪フラスコ中で実施したＦａｂ’発現の経時変化を示すグラフである。
【図５ｃ】ＩＧＳ２とＩＧＳ１２とを比較した、震盪フラスコ中で実施したＦａｂ’発現の経時変化を示すグラフである。
【図５ｄ】ＩＧＳ２とＩＧＳ１３とを比較した、震盪フラスコ中で実施したＦａｂ’発現の経時変化を示すグラフである。
【図５ｅ】ＩＧＳ２とＩＧＳ１４とを比較した、震盪フラスコ中で実施したＦａｂ’発現の経時変化を示すグラフである。
【図６】ＩＧＳ１０とＩＧＳ１４とを比較した、震盪フラスコ中で実施したＦａｂ’発現の経時変化を示すグラフである。
【図７ａ】ＩＧＳ２、ＩＧＳ１０、ＩＧＳ１７及びＩＧＳ１８を使用する１リットル培養でのペリプラズムＦａｂ’及び培地上清Ｆａｂ’についてＦａｂ’の蓄積の経時変化を示すグラフである。
【図７ｂ】ＩＧＳ２、ＩＧＳ１７及びＩＧＳ１８を使用する１リットル培養でのペリプラズムＦａｂ’及び培地上清Ｆａｂ’についてＦａｂ’の蓄積の経時変化を示すグラフである。
【図７ｃ】ＩＧＳ２及びＩＧＳ１７を使用する１リットル培養でのペリプラズムＦａｂ’及び培地上清Ｆａｂ’についてＦａｂ’の蓄積の経時変化を示すグラフである。
【図８】抗ＴＮＦαＦａｂ’断片の軽鎖のアミノ酸配列を示す図である。
【図９】抗ＴＮＦαＦａｂ’断片の重鎖のアミノ酸配列を示す図である。
【図１０】ＡＥＯＳ１１及びＯｍｐＡリーダーを含む抗ＴＮＦαＦａｂ’断片の全コード領域を示す図である。
【図１１】ＡＥＯＳ１１を含む抗ＴＮＦαＦａｂ’断片の全コード領域と翻訳を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体分子を生成するためのジシストロニックなメッセージであって、上流のシストロンが抗体の軽鎖をコードするＤＮＡを含み、かつ下流のシストロンが対応する重鎖をコードするＤＮＡを含む、ジシストロニックなメッセージにおいて、
【化１】
から選択される配列を含むことを特徴とする、ジシストロニックなメッセージ。
【請求項２】
抗体分子を生成するためのジシストロニックなメッセージであって、上流のシストロンが抗体の軽鎖をコードするＤＮＡを含み、かつ下流のシストロンが対応する重鎖をコードするＤＮＡを含む、ジシストロニックなメッセージにおいて、
【化２】
から選択される配列を含むことを特徴とする、ジシストロニックなメッセージ。
【請求項３】
前記メッセージによってコードされる前記抗体分子の軽鎖が、配列番号２４に記載の配列を含み、かつ前記メッセージによってコードされる前記抗体分子の重鎖が、配列番号２５に記載の配列を含む、請求項１又は請求項２に記載のジシストロニックなメッセージ。
【請求項４】
前記メッセージが配列番号２６に記載の配列を含む、請求項３に記載のジシストロニックなメッセージ。
【請求項５】
請求項１、２、３又は４のいずれか一項に記載のジシストロニックなメッセージを含む発現ベクター。
【請求項６】
発現ベクターがｐＴＴＯ−１又はｐＴＴＯＤである、請求項５に記載の発現ベクター。
【請求項７】
請求項５又は請求項６に記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項８】
宿主細胞が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である、請求項７に記載の宿主細胞。
【請求項９】
請求項７又は請求項８に記載の宿主細胞を培養することを含む抗体分子を生成するための方法。
【請求項１】
抗体分子を生成するためのジシストロニックなメッセージであって、上流のシストロンが抗体の軽鎖をコードするＤＮＡを含み、かつ下流のシストロンが対応する重鎖をコードするＤＮＡを含む、ジシストロニックなメッセージにおいて、
【化１】
から選択される配列を含むことを特徴とする、ジシストロニックなメッセージ。
【請求項２】
抗体分子を生成するためのジシストロニックなメッセージであって、上流のシストロンが抗体の軽鎖をコードするＤＮＡを含み、かつ下流のシストロンが対応する重鎖をコードするＤＮＡを含む、ジシストロニックなメッセージにおいて、
【化２】
から選択される配列を含むことを特徴とする、ジシストロニックなメッセージ。
【請求項３】
前記メッセージによってコードされる前記抗体分子の軽鎖が、配列番号２４に記載の配列を含み、かつ前記メッセージによってコードされる前記抗体分子の重鎖が、配列番号２５に記載の配列を含む、請求項１又は請求項２に記載のジシストロニックなメッセージ。
【請求項４】
前記メッセージが配列番号２６に記載の配列を含む、請求項３に記載のジシストロニックなメッセージ。
【請求項５】
請求項１、２、３又は４のいずれか一項に記載のジシストロニックなメッセージを含む発現ベクター。
【請求項６】
発現ベクターがｐＴＴＯ−１又はｐＴＴＯＤである、請求項５に記載の発現ベクター。
【請求項７】
請求項５又は請求項６に記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項８】
宿主細胞が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である、請求項７に記載の宿主細胞。
【請求項９】
請求項７又は請求項８に記載の宿主細胞を培養することを含む抗体分子を生成するための方法。
【図１】
【図２−１】
【図２−２】
【図３】
【図４】
【図５ａ】
【図５ｂ】
【図５ｃ】
【図５ｄ】
【図５ｅ】
【図６】
【図７ａ】
【図７ｂ】
【図７ｃ】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１−１】
【図１１−２】
【図１１−３】
【図２−１】
【図２−２】
【図３】
【図４】
【図５ａ】
【図５ｂ】
【図５ｃ】
【図５ｄ】
【図５ｅ】
【図６】
【図７ａ】
【図７ｂ】
【図７ｃ】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１−１】
【図１１−２】
【図１１−３】
【公表番号】特表２００９−５０９５６１（Ｐ２００９−５０９５６１Ａ）
【公表日】平成２１年３月１２日（２００９．３．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５３４０６５（Ｐ２００８−５３４０６５）
【出願日】平成１８年９月２９日（２００６．９．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００６／００３６４０
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０３９７１４
【国際公開日】平成１９年４月１２日（２００７．４．１２）
【出願人】（５０７０７３９１８）ユセベ ファルマ ソシエテ アノニム (70)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年３月１２日（２００９．３．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年９月２９日（２００６．９．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００６／００３６４０
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０３９７１４
【国際公開日】平成１９年４月１２日（２００７．４．１２）
【出願人】（５０７０７３９１８）ユセベ ファルマ ソシエテ アノニム (70)
【Ｆターム（参考）】
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