抗植物病原菌剤および抗植物病原菌組成物
【課題】ツルレイシをはじめとする農産物において、種々の植物病原菌に拮抗してその活動を抑制することのできる微生物を見出し、これを有効成分とする抗植物病原菌剤を提供すること。
【解決手段】ハンスフォルディア（ Hansfordia ）属に属する微生物を有効成分とする抗植物病原菌剤およびこれを利用するツルレイシ表面での黒かび病発生防止方法。
【解決手段】ハンスフォルディア（ Hansfordia ）属に属する微生物を有効成分とする抗植物病原菌剤およびこれを利用するツルレイシ表面での黒かび病発生防止方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗植物病原菌剤に関し、更に詳細には、植物病害の原因となる黒かび病菌、炭疽病菌、貯蔵病害菌、つる割病菌等の植物病原菌を有効に防除することが可能となる抗植物病原菌剤および抗植物病原菌組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ツルレイシ（ニガウリ）果実に含まれる栄養素が他の野菜と比べて高いことから、健康食品として注目され、栽培地域が拡大しているが、その一方で病害の発生が問題となっている。このようなツルレイシの病害防除は、一般的に化学薬剤によって行われている。
【０００３】
また、ツルレイシを収穫した後の貯蔵時における病害被害が顕在化しており、特に、黒かび病の発生が新病害として報告され、早急な防除法の確立が望まれている。
【０００４】
近年、環境問題や食の安全に対する関心の高まりから、化学合成薬剤の多用が懸念されており、環境負荷の小さい病害虫防除法、例えば微生物を用いた生物防除法の開発が切望されているが、ツルレイシ病害に対する生物防除に関する研究はこれまで行われていない。
【０００５】
同様に、他の農作物においても、種々の植物病原菌、例えば、黒かび病菌、炭疽病菌、貯蔵病害菌、つる割病菌等による被害が知られているが、これらについても化学合成薬剤を極力使わず、生物防除によりその被害を低下させることが求められている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明が解決しようとする課題は、ツルレイシをはじめとする農産物において、種々の植物病原菌に拮抗してその活動を抑制することのできる微生物を見出し、これを有効成分とする抗植物病原菌剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、これら貯蔵中あるいは栽培中の作物に病害を引き起こす微生物は、圃場内または植物表面上に普遍的に存在するものであり、栽培中作物または収穫物に収穫物表面において発病レベルに達しない程度に病原菌を管理することができれば発病を抑えることが可能であると考えた。
【０００８】
そこで、沖縄県で栽培されているツルレイシ葉から、農作物の葉や果実に定着能があり、栽培中および収穫後も植物表面で病原菌の活動を抑制することのできる拮抗微生物を選抜していたところ、特定の微生物がこの条件を満たすものであり、しかも、農薬登録がなされている薬剤との併用についても問題がないことを見出し、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち本発明は、ハンスフォルディア（ Hansfordia ）属に属する微生物を有効成分とする抗植物病原菌剤である。
【００１０】
また本発明は、上記の抗植物病原菌剤と、ＴＰＮ、アゾキシストロビンおよびキノキサリン系水和剤から選ばれる薬剤とを含有する抗植物病原菌組成物である。
【００１１】
更に本発明は、ツルレイシ表面にハンスフォルディア属に属する微生物を散布するツルレイシ表面での黒かび病発生防止方法である。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の抗植物病原菌剤を、ツルレイシをはじめとする農作物の表面に散布することにより、黒かび病菌、炭疽病菌、貯蔵病害菌、つる割病菌等を原因とする病害を防止ないし軽減することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明の抗植物病原菌剤の有効成分であるハンスフォルディア（ Hansfordia ）属に属する微生物は、ツルレイシ等の農作物の葉圏に生息する内生糸状菌である。この葉圏（phyllosphere）は、土壌中に存在する農作物の根圏（rhizosphere）に対する語であり、これには葉の表面と、その内部が含まれている。
【００１４】
目的とするハンスフォルディア（ Hansfordia ）属に属する微生物を取得するには、まず、定法に従ってツルレイシ葉圏から糸状菌を分離し、これと病原菌との対峙培養試験を行うことにより選抜を行い、更に、各種病原菌の菌糸伸長および胞子発芽抑制効果を調べ、高い抗菌活性を有するものを再選抜すれば良い。
【００１５】
このような手法により、ツルレイシの葉の内部から得られたハンスフォルディア（ Hansfordia ）属に属する微生物の一例として、ハンスフォルディア エスピー Ｇ６−４（Hansfordia sp. G6-4）株が挙げられる。このものは、平成１８年１１月１３日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒305-8566茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）にＦＥＲＭ ＡＰ−２１０８８として寄託した。
【００１６】
本発明の抗植物病原菌剤は、上記のハンスフォルディア属に属する微生物を有効成分とするものであるが、その態様の例としては、その胞子懸濁液を使用する形態およびその培養濾液を使用する形態が挙げられる。
【００１７】
胞子懸濁液の形態の抗植物病原菌剤は、常法に従い、水等の担体１ｍｌに対し、１×１０４ないし１×１０１０個程度の胞子を懸濁させることにより調製できる。また、培養濾液の形態の抗植物病原菌剤は、ハンスフォルディア属に属する微生物を培養した後、菌体からろ別した培養液を適宜使用すればよい。
【００１８】
本発明の抗植物病原菌剤は、上記した以外は、生物農薬の一般的な方法に従って製造することができる。すなわち、前記胞子懸濁液、培養濾液には、必要により、展着剤、界面活性剤、香料等を加えても良い。
【００１９】
本発明の抗植物病原菌剤には、更に、他の植物病原菌に有効な薬剤を加え、抗植物病原菌組成物とすることもできる。添加することのできる薬剤の例としては、ＴＰＮ、アゾキシストロビン、キノキサリン系水和剤等を挙げることができる。
【００２０】
本発明の抗植物病原菌剤や、抗植物病原菌組成物は、病害が発生してから使用することも可能であるが、病害の発生していない農作物の表面に予め散布することが好ましい。すなわち、ツルレイシ等の農作物の葉や果実にこれらを噴霧することにより各種病害の発生を抑制することが好ましい。
【００２１】
抗植物病原菌剤等の散布方法は、例えば、ツルレイシ等の農作物に対し、全面が濡れる程度に、生育期間中、１ないし３回程度散布すればよい。なお、培養濾液を使用する場合の使用量は、培養濾液ごとにその抗菌活性が異なるので、目的とする病害菌に対する抗菌活性を調べた上で適宜決定すればよい。
【００２２】
本発明の抗植物病原菌剤等により、植物病原菌による病害を防ぐことのできる理由は、以下のように考えられている。
【００２３】
すなわち、ハンスフォルディア属に属する微生物の胞子等をツルレイシ果実等の農産物に予め噴霧接種（予防接種）すると、果実表面にこの微生物が優占的に生息することになる。そして、この微生物は、植物病原菌に拮抗してその侵入を阻害するとともに、進入し得た病原菌についても、本菌が生産すると考えられる抗菌物質により、その植物体内での増殖を防止するものと考えられる。
【実施例】
【００２４】
次に実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例に何ら制約されるものではない。
【００２５】
実 施 例 １
ツルレイシ葉面微生物の分離および同定
慣行栽培圃場、減農薬栽培圃場、有機栽培圃場および露地栽培圃場より採取したツルレイシ葉から葉面上に生息する細菌および糸状菌の分離を行った。分離に使用した品種は、慣行栽培圃場、減農薬栽培圃場および有機栽培圃場で「群星」、露地栽培圃場で「あばし」を使用した。
【００２６】
各圃場で採取したツルレイシ葉は、５ｃｍ２に切り取り、それをさらに細かい断片にしたものを、１０ｍｌの滅菌水が入った試験管に入れ、１０分間攪拌し、これを１０−１区希釈液とした。これより１ｍｌをとり、９ｍｌの滅菌水が入った別の試験管に入れて攪拌し、これを１０−２区希釈液とした。同様の手順で１０−５区まで作成した。
【００２７】
この希釈液を１ｍｌとり、マーチンローズベンガル培地＊およびアルブミン培地＊＊が９ｍｌ入った試験管に入れて攪拌後、シャーレに流し込んだ。シャーレは２５℃条件下で培養した。数日後に形成された糸状菌および細菌数をカウントし、それぞれＰＤＡ斜面培地＋および細菌用ＰＳＡ斜面培地＋＋に分離した。
【００２８】
* ローズベンガル培地
ＫＨ２ＰＯ４ １ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０.５ｇ、ペプトン ５ｇ、グルコー
ス １０ｇ、ローズベンガル ０.０３３ｇ、寒天 ２０ｇ、クロラムフェニコール
０.０５ｇ、蒸留水 １,０００ｍｌ
** アルブミン培地
卵白アルブミン ０.２５ｇ、グルコース １ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４ ０.５ｇ、Ｍｇ
ＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０.２ｇ、Ｆｅ２（ＳＯ４）３微量、寒天 １５ｇ、蒸留水
１,０００ｍｌ
+ ＰＤＡ培地
ジャガイモ（デンプン） ２００ｇ、グルコース ２０ｇ、寒天 ２０ｇ、蒸留
水 １,０００ｍｌ
++ 細菌用ＰＳＡ培地
ジャガイモ（デンプン）３００ｇ、Ｃａ（ＮＯ３）２ ０.５ｇ、Ｎａ２ＨＰＯ ２
ｇ、ペプトン ５ｇ、スクロース １５ｇ、寒天 ２０ｇ、蒸留水 １,０００ｍｌ
【００２９】
この結果、慣行栽培圃場、減農薬栽培圃場、有機栽培圃場および露地栽培圃場より採取したツルレイシ葉より、希釈平板法を用いて葉面に生息する糸状菌と細菌の分離、同定を行ったところ、分離された葉面菌において、細菌数は２.１×１０３から１.７×１０４、糸状菌数は５.２×１０２から２.７×１０３の間で変移した。両菌ともハウス栽培に比べ露地栽培での分離数が低かったが、栽培形式による菌数の変異に大きな差は認められなかった。
【００３０】
なお細菌では、露地栽培と減農薬栽培では陽性菌がそれぞれ７８.０％と７４.０％と高い分離率が認められたのに対して、有機栽培では陰性菌が８１.０％となった。また、慣行栽培では陽性菌と陰性菌がそれぞれ５９.０％と４１.０％と同程度の分離率となった。
【００３１】
一方、葉面糸状菌では不完全菌類４２属、鞭毛菌類および接合菌類が分離された。露地栽培とハウス栽培を比べてみると露地栽培では不完全菌類３３属が分離されたのに対して、ハウス栽培では不完全菌１９属、鞭毛菌類３属および接合菌類１属と菌相の単純化が認められた。糸状菌相をみてみると各試験区においてクラドスポリウム（Cladosporium）属菌が各試験区で最も高い分離率を示し、慣行栽培区で１００％、有機栽培区で９１.０％となった。フザリウム（Fusarium）とペニシリウム（Penicillium）属菌が慣行栽培、減農薬栽培および有機栽培区で分離された。また、減農薬栽培区においてペニシリウム属菌の分離率は２１.６％を占めた。
【００３２】
なお、分離菌の同定は、次のようにして行った。
（１）細菌の同定
ＰＳＡ平板培地で培養した分離細菌から白金餌で菌泥をかき取り３％ＫＯＨ法３０）行った。グラム陽性菌は粘性がなく、グラム陰性菌は粘性があるため、これを基準に分類した。指示菌としては、グラム陽性菌にバチルス エスピー（Bacillus sp.）、グラム陰性菌にエルウイニア・カロトボラ（Erwinia carotovora）を使用した。
【００３３】
（２）糸状菌の同定
ＰＤＡ平板培地で培養した分離糸状菌から菌片をとり、プレパラートを作成し、形態的特徴から属レベルまで各試験区とも１００菌株の同定を行った。また、分生子を形成しない菌は、紫外線ランプまたは胞子形成培地により分生子形成を試みた。
【００３４】
実 施 例 ２
ツルレイシ葉からの内生糸状菌の分離
沖縄県本島の圃場よりツルレイシ葉を採取し、内生糸状菌の分離を行った。内生糸状菌の分離は、古賀ら（１９９３）の方法を一部改良して行った。最初に葉片を７０％エタノールに３０秒浸漬し、次に３％次亜塩素酸ナトリウムに９０−１２０秒浸漬、その後滅菌水で２回洗浄した。葉片を滅菌濾紙で十分乾燥させた後、寒天培地上で培養し、葉片より伸長してきた菌糸の先端を白金餌でかき取り、ＰＤＡ平板培地＊で培養後、単胞子分離を行いＳＮＡ斜面培地＊＊に保存した。なお、胞子形成が見られなかった糸状菌は単菌糸分離を行った。
【００３５】
* 実施例１のＰＤＡ培地と同じ組成
** ＳＮＡ培地
ＫＨ２ＰＯ４ １ｇ、ＫＮＯ３ １ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０.５ｇ、ＫＣｌ
０.５ｇ、ＮａＯＨ（１Ｎ） ０.６ｍｌ、グルコース ０.２ｇ、スクロース
０.２ｇ、寒天 ２３ｇ、蒸留水 １,０００ｍｌ
【００３６】
実施例と同様にして分離菌の同定を行ったところ、内生糸状菌は不完全菌類４４属、子嚢菌類および接合菌類が分離された。内生糸状菌は葉面糸状菌と異なり、最も分離率が高かったのはニグロスポア（Ｎｉｇｒｏｓｐｏｒｅ）属菌の２４.０％であり、次いでクラドスポリウム属菌の１７.８％、ペニシリウム属菌の１０.１％であった。
【００３７】
実 施 例 ３
簡易対峙培養による拮抗菌の選抜
実施例１および２でツルレイシ葉より分離した細菌および糸状菌を用いて、ツルレイシに発生する各種病原菌との簡易対峙培養を行った。ＰＤＡ平板培地で前培養した分離菌と病原菌のコロニーの先端を、直径４ｍｍのコルクボーラーで打ち抜き、別のＰＤＡ平板培地上で対峙培養をした。数日後、阻止帯の形成が認められた場合、その幅を測定しシーゲル（Siegel）ら（１９９１）の指標を参考に評価した。前培養の日数は分離菌により生育の速度が異なるため、各菌とも適度な大きさになるまで培養を行なった。
【００３８】
病原菌としては、炭疽病菌（Colletotrichum orbiculare(Berkeley et Montagene)Von Arx）、貯蔵病害菌（Phoma sp.）、つる割病菌（Fusarium oxysporum f. sp. momordicae）および黒かび病菌（Rhizopus stolonifer (Ehrenberg:Fries)Vuillemin var. stolonifer）を用い、培養は、黒かび病菌は２日間、他のものについては５日間行った。
【００３９】
この結果、各種病原菌に対して葉面糸状菌２菌株、内生糸状菌４菌株で拮抗性が認められた（表１）。
【００４０】
【表１】
【００４１】
拮抗性があった６菌株のうち特に、Ｅ−７８、Ｐ−１およびＧ６−４株では実験に用いたすべての病原菌に対して拮抗性が認められた。特に、Ｅ−７８株は貯蔵病害菌と炭疽病菌に対して、またＧ６−４株では炭疽病菌において阻止円の幅が５−７ｍｍと特に高い値を示した。更にＲ−７９株は３種の病原菌に対して拮抗性が認められ、黒かび病菌、炭疽病菌において特に強い拮抗性が認められた。供試したすべての病原菌に対して拮抗性をもち、抗菌活性が強いと考えられるＥ−７８株およびＧ６−４株の２菌株を選抜し、次の実験に供試した。
【００４２】
実 施 例 ４
各種病原菌に及ぼす培養濾液の影響
（１）抗菌分画の精製
実施例４の簡易対峙培養により選抜した分離菌株のうち、Ｅ−７８株とＧ６−４株を用いて培養液による各種病原菌の菌糸伸長と胞子発芽における影響を検討した。これら微生物をＰＤＡ平板培地で５日間培養し、菌糸先端を直径４ｍｍのコルクボーラーで打ち抜き、その菌片をＰＳ液体培地が２５０ｍｌ入った５００ｍｌの三角フラスコに接種した。三角フラスコは振盪培養機（ＴＨＥＲＭＯＳＴＡＴＩＣ ＳＨＡＫＩＮＧ ＩＮＣＵＢＡＴＯＲ ＡＴＩＺＲ、ＴＨＯＭＡＳ）を用い、２５℃、１５０ｒｐｍで１０日間振盪培養した後、吸引濾過器で菌体と培養液に分けた。その培養液と酢酸エチルを２：１の割合で混合して転溶を行い、酢酸エチル分画をロータリーエバポレーター（ＲＥ−４６Ｂ、大和科学株式会社製）で１０倍濃縮したものを原液として試験に用いた。
【００４３】
（２）各種病原菌の菌糸伸長に及ぼす培養液の影響
上記抗菌分画１ｍｌをＰＤＡ平板培地に広げ、クリーンベンチ内でシャーレの蓋を開け、酢酸エチルを完全に揮発させた。各病原菌の菌叢を直径４ｍｍのコルクボーラーで打ち抜き、含菌寒天片をＰＤＡ培地上に置床し、５日後までの菌叢直径を測定した。対照区として酢酸エチル１ｍｌをＰＤＡ平板培地に広げ、完全に揮発させたものを用いた。試験は５反復で行った。
【００４４】
この結果、黒かび病菌は対照区において接種１日目に菌叢直径６９.３ｍｍとなり、接種２日目にはシャーレ内に菌糸が繁茂し、測定不能となった。しかし、Ｅ−７８株培養濾液区では接種２日目までは２７.０ｍｍと菌糸伸長を抑制し、Ｇ６−４株培養濾液区においては接種後５日を経過しても菌糸伸長は認められなかった（表２）
【００４５】
【表２】
【００４６】
貯蔵病害菌は、対照区において接種４日目に菌叢直径７７.０ｍｍ、接種５日目には測定不能となったのに対して、Ｅ−７８株培養濾液区では接種３日目に菌叢直径９.０ｍｍ、接種５日目に２６.７ｍｍと明らかな菌糸伸長抑制が認められた。Ｇ６−４株培養濾液区では黒かび病菌と同様、接種後５日を経過しても菌糸伸長は認められなかった（表３）。
【００４７】
【表３】
【００４８】
炭疽病菌は対照区において接種５日目までに菌叢直径が６６.３ｍｍとなった。Ｅ−７８株培養濾液区では菌叢直径が５.３ｍｍ、Ｇ６−４株培養濾液区は菌叢直径が４１.４ｍｍとなり、Ｅ−７８株培養濾液による抑制効果は高かったが、Ｇ６−４株培養濾液による炭疽病菌の菌糸伸長抑制効果は低かった（表４）。
【００４９】
【表４】
【００５０】
つる割病菌は接種５日目に対照区が６４.３ｍｍであるのに対して、Ｅ−７８株培養濾液区とＧ６−４株培養濾液区ではそれぞれ３６.０ｍｍと５１.８ｍｍとなり、他の病原菌と比べて抑制効果は減少した（表５）。
【００５１】
【表５】
【００５２】
（３）各種病原菌の胞子発芽に及ぼす培養濾液の影響
酢酸エチル９ｍｌに、（１）で得た抗菌分画を１ｍｌ加えて１０倍希釈液を作成し、更に１００倍希釈液まで作成した。ホールスライド内に希釈抗菌分画液をピペットで数滴滴下し、完全に酢酸エチルを揮発させた後、各病原菌の胞子懸濁液を数滴添加した。滅菌水を十分含ませた濾紙を敷いたシャーレ内にホールスライドを置き、２５℃下で静置した。測定は胞子１００個あたりの発芽率を６時間おきに２４時間まで行った。対照区としては、酢酸エチルをホールスライドに数滴置き、完全に揮発させたものを用いた。各試験区あたり胞子を１００個測定し、それを３反復行った。
【００５３】
この結果、Ｅ−７８培養濾液は原液区において黒かび病菌の胞子発芽を完全に抑制し、１／１０区と１／１００区でも有意に胞子発芽率が低下した（表６）。また、貯蔵病害菌においても原液区で発芽率５.８％と高い発芽抑制効果を示した。しかし、１／１０区と１／１００区では顕著な抑制効果は認められず、対照区に対し有意差は認められなかった。
【００５４】
炭疽病菌とつる割病菌においては、高い発芽抑制効果は認められなかったが、両病原菌の対照区は接種１８時間後に菌糸の繁茂により測定不能となったのに対し、原液区では菌糸の繁茂は見られず発芽後の菌糸伸長抑制が観察された。
【００５５】
【表６】
【００５６】
一方、Ｇ６−４培養濾液はすべての濃度で黒かび病菌の胞子発芽を完全に抑制した（表７）。貯蔵病害菌では原液区のみ、炭疽病菌とつる割病菌に対しては原液区および１／１０区で胞子発芽を完全に抑制し、炭疽病菌においては１／１００区でも高い発芽抑制効果を示した（表８および９）。その他の濃度でも接種６時後には高い発芽抑制効果が認められたが、接種２４時間後では対照区と比べ、発芽率に大きな差は認められなかった。
【００５７】
【表７】
【００５８】
【表８】
【００５９】
【表９】
【００６０】
実 施 例 ６
拮抗菌の同定
有用菌の種レベルの同定を行った。光学顕微鏡による形態の観察により、菌類検索表を用いて再同定を行った。また、分生子柄、分生子形成細胞および胞子の大きさを測定し、既報の菌との比較も行った。
【００６１】
インビトロの実験で最も効果の認められたＧ６−４株のＰＤＡ培地上での菌叢は、はじめ白色、後に淡灰色〜灰色となった。分生子柄は無色で隔壁を有し、不規則に分岐、分生子離脱後は抜歯状であった。分生子は外性出芽・シンポジオ型で頂生または側生、無色、単胞で卵形〜楕円形であった（図１）。形態的特徴を基に菌類検索表（１９６４）からハンスフォルディア（Hansfordia）属と判断した。次に種の同定を行ったところ、分生子柄の大きさは６０−２３７．５×１．５−４μｍ、分生子形成細胞は１１．９−２８．７×２−３μｍおよび分生子は４〜７×３〜４μｍであった。既報のハンスフォルディア属菌と比較した結果、完全に一致する種は認められなかった（表１０）。そのため本菌株をハンスフォルディア エスピー（ Hansfordia sp.）と同定し、ハンスフォルディア エスピー Ｇ６−４（ Hansfordia sp. G6-4 ）株と命名した。
【００６２】
【表１０】
【００６３】
実 施 例 ７
ツルレイシ果実への接種試験
（１）胞子懸濁液の作成
ハンスフォルディア エスピー Ｇ６−４株は３０日、黒かび病菌は４日ＰＤＡ平板培地で前培養を行った。胞子懸濁液は各シャーレに１０ｍｌの滅菌水を入れ、コンラージ棒で培地表面を軽くこすり、胞子を懸濁した後、二重にしたガーゼを通して得た。各胞子濃度は血球計算盤（エルマ光学株式会社）を用いてハンスフォルディア エスピー Ｇ６−４を１×１０６ＣＦＵ／ｍｌ、黒かび病菌を１×１０５ＣＦＵ／ｍｌに調整した。
【００６４】
（２）ツルレイシ果実への接種
接種果実には市販のツルレイシ果実を使用した。試験区としては、黒かび病菌単独区、黒かび病菌とハンスフォルディア エスピー Ｇ６−４株同時処理区、ハンスフォルディア エスピー Ｇ６−４株前処理区、ハンスフォルディア エスピー Ｇ６−４株単独区、ＴＰＮ水和剤処理区および滅菌水区を設けた。各試験区とも、有傷接種と無傷接種を行った。有傷接種は火炎滅菌した柄付き針で果実表面に２８箇所傷を付けた果実を使用した。ハンスフォルディア エスピー Ｇ６−４株前処理区ではハンスフォルディア エスピー Ｇ６−４株胞子懸濁液を接種してから２４時間後に黒かび病菌を接種した。またＴＰＮ水和剤は１０００倍に希釈して散布を行い、十分に乾燥させてから黒かび病菌を接種した。各試験区とも果実を５個使用し、接種後の果実は過湿にしたプラスチックバットの中に入れ、接種３日後に発病の有無を確認した。
【００６５】
この結果、果実への発病は接種２日目より見られた。接種５日目の黒かび病菌単独接種区において有傷接種、無傷接種ではそれぞれ発病率８０％と６０％となった。また、ハンスフォルディア エスピー Ｇ６−４株と黒かび病菌の同時処理区においても同様の発病率となり、同時接種による防除効果は認められなかった。さらに、ＴＰＮ水和剤処理区では有傷接種において発病率１００％と最も高い発病率を示した。これに対して、ハンスフォルディア エスピー Ｇ６−４株前処理区では有傷接種、無傷接種共に発病は見られず高い防除効果が認められた（表１１）。
【００６６】
【表１１】
【００６７】
図２に示すようにハンスフォルディア エスピー Ｇ６−４株単独前処理区において発病が観察されなかったことから、ハンスフォルディア エスピー Ｇ６−４株はツルレイシに対して病原性がないことが確認された。
【００６８】
実 施 例 ８
ハンスフォルディア エスピー Ｇ６−４株に及ぼす薬剤の影響
薬剤試験には市販のＴＰＮ（商品名：武田ダコニール１０００、原体含率４０％）、アゾキシストロビン（商品名：アミスター２０フロアブル、原体含率２０％）、キノキサリン（商品名：サンケイモレスタン水和剤、原体含率２５％）、クレソキシムメチル（商品名：ストロビーフロアブル、原体含率４１.５％）およびチオファネートメチル水和剤を使用した。ＰＤＡ培地が９ｍｌ入った試験管に各農薬を１ｍｌ添加して、各使用濃度になるように調整した。攪拌後、シャーレ内に流し込み、ハンスフォルディア エスピー Ｇ６−４株と黒かび病菌の菌叢を直径４ｍｍのコルクボーラーで打ち抜き、それぞれの含菌寒天片を培地の中央に置いた。２５℃で培養を行いハンスフォルディア エスピー Ｇ６−４は５日後、黒かび病菌は３日後に、菌叢直径を測定した。試験区は５反復行った。
【００６９】
この結果を表１２に示すが、ＴＰＮ、アゾキシスロンビンおよびキノキサリン系水和剤は、ハンスフォルディア エスピー Ｇ６−４株の菌糸伸長をやや抑制するが、混合処理が可能であることが示された。
【００７０】
【表１２】
【産業上の利用可能性】
【００７１】
本発明の抗植物病原菌剤によれば、植物病害の原因となる黒かび病菌、炭疽病菌、貯蔵病害菌、つる割病菌等の植物病原菌を有効に防除することが可能となる。
【００７２】
また、本発明の抗植物病原菌剤の有効成分であるハンスフォルディア エスピーに属する微生物は、農作物病害に広く使用されている薬剤に対する耐性が高いので、これらと組合せ、より効果の高い抗植物病原菌組成物とすることができる。
【００７３】
従って本発明の抗植物病原菌剤は、ツルレイシを始め、多くの野菜等の栽培において、広く利用できる可能性を有するものである。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】ハンスフォルディア エスピー Ｇ６−４株の形態を示す図面（写真）。図中、Ａは菌叢、Ｂは分生子形成細胞、Ｃは分生子、Ｄは分生子形成細胞および分生子を示す。
【図２】実施例６の接種試験結果を示す図面（写真）。図中、Ａは黒かび病菌（R.stolonifer）単独接種区、Ｂは黒かび病菌とハンスフォルディア エスピー Ｇ６−４株の同時処理区、Ｃはハンスフォルディア エスピー Ｇ６−４株単独前処理区、ＤはＴＰＮ水和剤処理区を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗植物病原菌剤に関し、更に詳細には、植物病害の原因となる黒かび病菌、炭疽病菌、貯蔵病害菌、つる割病菌等の植物病原菌を有効に防除することが可能となる抗植物病原菌剤および抗植物病原菌組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ツルレイシ（ニガウリ）果実に含まれる栄養素が他の野菜と比べて高いことから、健康食品として注目され、栽培地域が拡大しているが、その一方で病害の発生が問題となっている。このようなツルレイシの病害防除は、一般的に化学薬剤によって行われている。
【０００３】
また、ツルレイシを収穫した後の貯蔵時における病害被害が顕在化しており、特に、黒かび病の発生が新病害として報告され、早急な防除法の確立が望まれている。
【０００４】
近年、環境問題や食の安全に対する関心の高まりから、化学合成薬剤の多用が懸念されており、環境負荷の小さい病害虫防除法、例えば微生物を用いた生物防除法の開発が切望されているが、ツルレイシ病害に対する生物防除に関する研究はこれまで行われていない。
【０００５】
同様に、他の農作物においても、種々の植物病原菌、例えば、黒かび病菌、炭疽病菌、貯蔵病害菌、つる割病菌等による被害が知られているが、これらについても化学合成薬剤を極力使わず、生物防除によりその被害を低下させることが求められている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明が解決しようとする課題は、ツルレイシをはじめとする農産物において、種々の植物病原菌に拮抗してその活動を抑制することのできる微生物を見出し、これを有効成分とする抗植物病原菌剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、これら貯蔵中あるいは栽培中の作物に病害を引き起こす微生物は、圃場内または植物表面上に普遍的に存在するものであり、栽培中作物または収穫物に収穫物表面において発病レベルに達しない程度に病原菌を管理することができれば発病を抑えることが可能であると考えた。
【０００８】
そこで、沖縄県で栽培されているツルレイシ葉から、農作物の葉や果実に定着能があり、栽培中および収穫後も植物表面で病原菌の活動を抑制することのできる拮抗微生物を選抜していたところ、特定の微生物がこの条件を満たすものであり、しかも、農薬登録がなされている薬剤との併用についても問題がないことを見出し、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち本発明は、ハンスフォルディア（ Hansfordia ）属に属する微生物を有効成分とする抗植物病原菌剤である。
【００１０】
また本発明は、上記の抗植物病原菌剤と、ＴＰＮ、アゾキシストロビンおよびキノキサリン系水和剤から選ばれる薬剤とを含有する抗植物病原菌組成物である。
【００１１】
更に本発明は、ツルレイシ表面にハンスフォルディア属に属する微生物を散布するツルレイシ表面での黒かび病発生防止方法である。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の抗植物病原菌剤を、ツルレイシをはじめとする農作物の表面に散布することにより、黒かび病菌、炭疽病菌、貯蔵病害菌、つる割病菌等を原因とする病害を防止ないし軽減することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明の抗植物病原菌剤の有効成分であるハンスフォルディア（ Hansfordia ）属に属する微生物は、ツルレイシ等の農作物の葉圏に生息する内生糸状菌である。この葉圏（phyllosphere）は、土壌中に存在する農作物の根圏（rhizosphere）に対する語であり、これには葉の表面と、その内部が含まれている。
【００１４】
目的とするハンスフォルディア（ Hansfordia ）属に属する微生物を取得するには、まず、定法に従ってツルレイシ葉圏から糸状菌を分離し、これと病原菌との対峙培養試験を行うことにより選抜を行い、更に、各種病原菌の菌糸伸長および胞子発芽抑制効果を調べ、高い抗菌活性を有するものを再選抜すれば良い。
【００１５】
このような手法により、ツルレイシの葉の内部から得られたハンスフォルディア（ Hansfordia ）属に属する微生物の一例として、ハンスフォルディア エスピー Ｇ６−４（Hansfordia sp. G6-4）株が挙げられる。このものは、平成１８年１１月１３日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒305-8566茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）にＦＥＲＭ ＡＰ−２１０８８として寄託した。
【００１６】
本発明の抗植物病原菌剤は、上記のハンスフォルディア属に属する微生物を有効成分とするものであるが、その態様の例としては、その胞子懸濁液を使用する形態およびその培養濾液を使用する形態が挙げられる。
【００１７】
胞子懸濁液の形態の抗植物病原菌剤は、常法に従い、水等の担体１ｍｌに対し、１×１０４ないし１×１０１０個程度の胞子を懸濁させることにより調製できる。また、培養濾液の形態の抗植物病原菌剤は、ハンスフォルディア属に属する微生物を培養した後、菌体からろ別した培養液を適宜使用すればよい。
【００１８】
本発明の抗植物病原菌剤は、上記した以外は、生物農薬の一般的な方法に従って製造することができる。すなわち、前記胞子懸濁液、培養濾液には、必要により、展着剤、界面活性剤、香料等を加えても良い。
【００１９】
本発明の抗植物病原菌剤には、更に、他の植物病原菌に有効な薬剤を加え、抗植物病原菌組成物とすることもできる。添加することのできる薬剤の例としては、ＴＰＮ、アゾキシストロビン、キノキサリン系水和剤等を挙げることができる。
【００２０】
本発明の抗植物病原菌剤や、抗植物病原菌組成物は、病害が発生してから使用することも可能であるが、病害の発生していない農作物の表面に予め散布することが好ましい。すなわち、ツルレイシ等の農作物の葉や果実にこれらを噴霧することにより各種病害の発生を抑制することが好ましい。
【００２１】
抗植物病原菌剤等の散布方法は、例えば、ツルレイシ等の農作物に対し、全面が濡れる程度に、生育期間中、１ないし３回程度散布すればよい。なお、培養濾液を使用する場合の使用量は、培養濾液ごとにその抗菌活性が異なるので、目的とする病害菌に対する抗菌活性を調べた上で適宜決定すればよい。
【００２２】
本発明の抗植物病原菌剤等により、植物病原菌による病害を防ぐことのできる理由は、以下のように考えられている。
【００２３】
すなわち、ハンスフォルディア属に属する微生物の胞子等をツルレイシ果実等の農産物に予め噴霧接種（予防接種）すると、果実表面にこの微生物が優占的に生息することになる。そして、この微生物は、植物病原菌に拮抗してその侵入を阻害するとともに、進入し得た病原菌についても、本菌が生産すると考えられる抗菌物質により、その植物体内での増殖を防止するものと考えられる。
【実施例】
【００２４】
次に実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例に何ら制約されるものではない。
【００２５】
実 施 例 １
ツルレイシ葉面微生物の分離および同定
慣行栽培圃場、減農薬栽培圃場、有機栽培圃場および露地栽培圃場より採取したツルレイシ葉から葉面上に生息する細菌および糸状菌の分離を行った。分離に使用した品種は、慣行栽培圃場、減農薬栽培圃場および有機栽培圃場で「群星」、露地栽培圃場で「あばし」を使用した。
【００２６】
各圃場で採取したツルレイシ葉は、５ｃｍ２に切り取り、それをさらに細かい断片にしたものを、１０ｍｌの滅菌水が入った試験管に入れ、１０分間攪拌し、これを１０−１区希釈液とした。これより１ｍｌをとり、９ｍｌの滅菌水が入った別の試験管に入れて攪拌し、これを１０−２区希釈液とした。同様の手順で１０−５区まで作成した。
【００２７】
この希釈液を１ｍｌとり、マーチンローズベンガル培地＊およびアルブミン培地＊＊が９ｍｌ入った試験管に入れて攪拌後、シャーレに流し込んだ。シャーレは２５℃条件下で培養した。数日後に形成された糸状菌および細菌数をカウントし、それぞれＰＤＡ斜面培地＋および細菌用ＰＳＡ斜面培地＋＋に分離した。
【００２８】
* ローズベンガル培地
ＫＨ２ＰＯ４ １ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０.５ｇ、ペプトン ５ｇ、グルコー
ス １０ｇ、ローズベンガル ０.０３３ｇ、寒天 ２０ｇ、クロラムフェニコール
０.０５ｇ、蒸留水 １,０００ｍｌ
** アルブミン培地
卵白アルブミン ０.２５ｇ、グルコース １ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４ ０.５ｇ、Ｍｇ
ＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０.２ｇ、Ｆｅ２（ＳＯ４）３微量、寒天 １５ｇ、蒸留水
１,０００ｍｌ
+ ＰＤＡ培地
ジャガイモ（デンプン） ２００ｇ、グルコース ２０ｇ、寒天 ２０ｇ、蒸留
水 １,０００ｍｌ
++ 細菌用ＰＳＡ培地
ジャガイモ（デンプン）３００ｇ、Ｃａ（ＮＯ３）２ ０.５ｇ、Ｎａ２ＨＰＯ ２
ｇ、ペプトン ５ｇ、スクロース １５ｇ、寒天 ２０ｇ、蒸留水 １,０００ｍｌ
【００２９】
この結果、慣行栽培圃場、減農薬栽培圃場、有機栽培圃場および露地栽培圃場より採取したツルレイシ葉より、希釈平板法を用いて葉面に生息する糸状菌と細菌の分離、同定を行ったところ、分離された葉面菌において、細菌数は２.１×１０３から１.７×１０４、糸状菌数は５.２×１０２から２.７×１０３の間で変移した。両菌ともハウス栽培に比べ露地栽培での分離数が低かったが、栽培形式による菌数の変異に大きな差は認められなかった。
【００３０】
なお細菌では、露地栽培と減農薬栽培では陽性菌がそれぞれ７８.０％と７４.０％と高い分離率が認められたのに対して、有機栽培では陰性菌が８１.０％となった。また、慣行栽培では陽性菌と陰性菌がそれぞれ５９.０％と４１.０％と同程度の分離率となった。
【００３１】
一方、葉面糸状菌では不完全菌類４２属、鞭毛菌類および接合菌類が分離された。露地栽培とハウス栽培を比べてみると露地栽培では不完全菌類３３属が分離されたのに対して、ハウス栽培では不完全菌１９属、鞭毛菌類３属および接合菌類１属と菌相の単純化が認められた。糸状菌相をみてみると各試験区においてクラドスポリウム（Cladosporium）属菌が各試験区で最も高い分離率を示し、慣行栽培区で１００％、有機栽培区で９１.０％となった。フザリウム（Fusarium）とペニシリウム（Penicillium）属菌が慣行栽培、減農薬栽培および有機栽培区で分離された。また、減農薬栽培区においてペニシリウム属菌の分離率は２１.６％を占めた。
【００３２】
なお、分離菌の同定は、次のようにして行った。
（１）細菌の同定
ＰＳＡ平板培地で培養した分離細菌から白金餌で菌泥をかき取り３％ＫＯＨ法３０）行った。グラム陽性菌は粘性がなく、グラム陰性菌は粘性があるため、これを基準に分類した。指示菌としては、グラム陽性菌にバチルス エスピー（Bacillus sp.）、グラム陰性菌にエルウイニア・カロトボラ（Erwinia carotovora）を使用した。
【００３３】
（２）糸状菌の同定
ＰＤＡ平板培地で培養した分離糸状菌から菌片をとり、プレパラートを作成し、形態的特徴から属レベルまで各試験区とも１００菌株の同定を行った。また、分生子を形成しない菌は、紫外線ランプまたは胞子形成培地により分生子形成を試みた。
【００３４】
実 施 例 ２
ツルレイシ葉からの内生糸状菌の分離
沖縄県本島の圃場よりツルレイシ葉を採取し、内生糸状菌の分離を行った。内生糸状菌の分離は、古賀ら（１９９３）の方法を一部改良して行った。最初に葉片を７０％エタノールに３０秒浸漬し、次に３％次亜塩素酸ナトリウムに９０−１２０秒浸漬、その後滅菌水で２回洗浄した。葉片を滅菌濾紙で十分乾燥させた後、寒天培地上で培養し、葉片より伸長してきた菌糸の先端を白金餌でかき取り、ＰＤＡ平板培地＊で培養後、単胞子分離を行いＳＮＡ斜面培地＊＊に保存した。なお、胞子形成が見られなかった糸状菌は単菌糸分離を行った。
【００３５】
* 実施例１のＰＤＡ培地と同じ組成
** ＳＮＡ培地
ＫＨ２ＰＯ４ １ｇ、ＫＮＯ３ １ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０.５ｇ、ＫＣｌ
０.５ｇ、ＮａＯＨ（１Ｎ） ０.６ｍｌ、グルコース ０.２ｇ、スクロース
０.２ｇ、寒天 ２３ｇ、蒸留水 １,０００ｍｌ
【００３６】
実施例と同様にして分離菌の同定を行ったところ、内生糸状菌は不完全菌類４４属、子嚢菌類および接合菌類が分離された。内生糸状菌は葉面糸状菌と異なり、最も分離率が高かったのはニグロスポア（Ｎｉｇｒｏｓｐｏｒｅ）属菌の２４.０％であり、次いでクラドスポリウム属菌の１７.８％、ペニシリウム属菌の１０.１％であった。
【００３７】
実 施 例 ３
簡易対峙培養による拮抗菌の選抜
実施例１および２でツルレイシ葉より分離した細菌および糸状菌を用いて、ツルレイシに発生する各種病原菌との簡易対峙培養を行った。ＰＤＡ平板培地で前培養した分離菌と病原菌のコロニーの先端を、直径４ｍｍのコルクボーラーで打ち抜き、別のＰＤＡ平板培地上で対峙培養をした。数日後、阻止帯の形成が認められた場合、その幅を測定しシーゲル（Siegel）ら（１９９１）の指標を参考に評価した。前培養の日数は分離菌により生育の速度が異なるため、各菌とも適度な大きさになるまで培養を行なった。
【００３８】
病原菌としては、炭疽病菌（Colletotrichum orbiculare(Berkeley et Montagene)Von Arx）、貯蔵病害菌（Phoma sp.）、つる割病菌（Fusarium oxysporum f. sp. momordicae）および黒かび病菌（Rhizopus stolonifer (Ehrenberg:Fries)Vuillemin var. stolonifer）を用い、培養は、黒かび病菌は２日間、他のものについては５日間行った。
【００３９】
この結果、各種病原菌に対して葉面糸状菌２菌株、内生糸状菌４菌株で拮抗性が認められた（表１）。
【００４０】
【表１】
【００４１】
拮抗性があった６菌株のうち特に、Ｅ−７８、Ｐ−１およびＧ６−４株では実験に用いたすべての病原菌に対して拮抗性が認められた。特に、Ｅ−７８株は貯蔵病害菌と炭疽病菌に対して、またＧ６−４株では炭疽病菌において阻止円の幅が５−７ｍｍと特に高い値を示した。更にＲ−７９株は３種の病原菌に対して拮抗性が認められ、黒かび病菌、炭疽病菌において特に強い拮抗性が認められた。供試したすべての病原菌に対して拮抗性をもち、抗菌活性が強いと考えられるＥ−７８株およびＧ６−４株の２菌株を選抜し、次の実験に供試した。
【００４２】
実 施 例 ４
各種病原菌に及ぼす培養濾液の影響
（１）抗菌分画の精製
実施例４の簡易対峙培養により選抜した分離菌株のうち、Ｅ−７８株とＧ６−４株を用いて培養液による各種病原菌の菌糸伸長と胞子発芽における影響を検討した。これら微生物をＰＤＡ平板培地で５日間培養し、菌糸先端を直径４ｍｍのコルクボーラーで打ち抜き、その菌片をＰＳ液体培地が２５０ｍｌ入った５００ｍｌの三角フラスコに接種した。三角フラスコは振盪培養機（ＴＨＥＲＭＯＳＴＡＴＩＣ ＳＨＡＫＩＮＧ ＩＮＣＵＢＡＴＯＲ ＡＴＩＺＲ、ＴＨＯＭＡＳ）を用い、２５℃、１５０ｒｐｍで１０日間振盪培養した後、吸引濾過器で菌体と培養液に分けた。その培養液と酢酸エチルを２：１の割合で混合して転溶を行い、酢酸エチル分画をロータリーエバポレーター（ＲＥ−４６Ｂ、大和科学株式会社製）で１０倍濃縮したものを原液として試験に用いた。
【００４３】
（２）各種病原菌の菌糸伸長に及ぼす培養液の影響
上記抗菌分画１ｍｌをＰＤＡ平板培地に広げ、クリーンベンチ内でシャーレの蓋を開け、酢酸エチルを完全に揮発させた。各病原菌の菌叢を直径４ｍｍのコルクボーラーで打ち抜き、含菌寒天片をＰＤＡ培地上に置床し、５日後までの菌叢直径を測定した。対照区として酢酸エチル１ｍｌをＰＤＡ平板培地に広げ、完全に揮発させたものを用いた。試験は５反復で行った。
【００４４】
この結果、黒かび病菌は対照区において接種１日目に菌叢直径６９.３ｍｍとなり、接種２日目にはシャーレ内に菌糸が繁茂し、測定不能となった。しかし、Ｅ−７８株培養濾液区では接種２日目までは２７.０ｍｍと菌糸伸長を抑制し、Ｇ６−４株培養濾液区においては接種後５日を経過しても菌糸伸長は認められなかった（表２）
【００４５】
【表２】
【００４６】
貯蔵病害菌は、対照区において接種４日目に菌叢直径７７.０ｍｍ、接種５日目には測定不能となったのに対して、Ｅ−７８株培養濾液区では接種３日目に菌叢直径９.０ｍｍ、接種５日目に２６.７ｍｍと明らかな菌糸伸長抑制が認められた。Ｇ６−４株培養濾液区では黒かび病菌と同様、接種後５日を経過しても菌糸伸長は認められなかった（表３）。
【００４７】
【表３】
【００４８】
炭疽病菌は対照区において接種５日目までに菌叢直径が６６.３ｍｍとなった。Ｅ−７８株培養濾液区では菌叢直径が５.３ｍｍ、Ｇ６−４株培養濾液区は菌叢直径が４１.４ｍｍとなり、Ｅ−７８株培養濾液による抑制効果は高かったが、Ｇ６−４株培養濾液による炭疽病菌の菌糸伸長抑制効果は低かった（表４）。
【００４９】
【表４】
【００５０】
つる割病菌は接種５日目に対照区が６４.３ｍｍであるのに対して、Ｅ−７８株培養濾液区とＧ６−４株培養濾液区ではそれぞれ３６.０ｍｍと５１.８ｍｍとなり、他の病原菌と比べて抑制効果は減少した（表５）。
【００５１】
【表５】
【００５２】
（３）各種病原菌の胞子発芽に及ぼす培養濾液の影響
酢酸エチル９ｍｌに、（１）で得た抗菌分画を１ｍｌ加えて１０倍希釈液を作成し、更に１００倍希釈液まで作成した。ホールスライド内に希釈抗菌分画液をピペットで数滴滴下し、完全に酢酸エチルを揮発させた後、各病原菌の胞子懸濁液を数滴添加した。滅菌水を十分含ませた濾紙を敷いたシャーレ内にホールスライドを置き、２５℃下で静置した。測定は胞子１００個あたりの発芽率を６時間おきに２４時間まで行った。対照区としては、酢酸エチルをホールスライドに数滴置き、完全に揮発させたものを用いた。各試験区あたり胞子を１００個測定し、それを３反復行った。
【００５３】
この結果、Ｅ−７８培養濾液は原液区において黒かび病菌の胞子発芽を完全に抑制し、１／１０区と１／１００区でも有意に胞子発芽率が低下した（表６）。また、貯蔵病害菌においても原液区で発芽率５.８％と高い発芽抑制効果を示した。しかし、１／１０区と１／１００区では顕著な抑制効果は認められず、対照区に対し有意差は認められなかった。
【００５４】
炭疽病菌とつる割病菌においては、高い発芽抑制効果は認められなかったが、両病原菌の対照区は接種１８時間後に菌糸の繁茂により測定不能となったのに対し、原液区では菌糸の繁茂は見られず発芽後の菌糸伸長抑制が観察された。
【００５５】
【表６】
【００５６】
一方、Ｇ６−４培養濾液はすべての濃度で黒かび病菌の胞子発芽を完全に抑制した（表７）。貯蔵病害菌では原液区のみ、炭疽病菌とつる割病菌に対しては原液区および１／１０区で胞子発芽を完全に抑制し、炭疽病菌においては１／１００区でも高い発芽抑制効果を示した（表８および９）。その他の濃度でも接種６時後には高い発芽抑制効果が認められたが、接種２４時間後では対照区と比べ、発芽率に大きな差は認められなかった。
【００５７】
【表７】
【００５８】
【表８】
【００５９】
【表９】
【００６０】
実 施 例 ６
拮抗菌の同定
有用菌の種レベルの同定を行った。光学顕微鏡による形態の観察により、菌類検索表を用いて再同定を行った。また、分生子柄、分生子形成細胞および胞子の大きさを測定し、既報の菌との比較も行った。
【００６１】
インビトロの実験で最も効果の認められたＧ６−４株のＰＤＡ培地上での菌叢は、はじめ白色、後に淡灰色〜灰色となった。分生子柄は無色で隔壁を有し、不規則に分岐、分生子離脱後は抜歯状であった。分生子は外性出芽・シンポジオ型で頂生または側生、無色、単胞で卵形〜楕円形であった（図１）。形態的特徴を基に菌類検索表（１９６４）からハンスフォルディア（Hansfordia）属と判断した。次に種の同定を行ったところ、分生子柄の大きさは６０−２３７．５×１．５−４μｍ、分生子形成細胞は１１．９−２８．７×２−３μｍおよび分生子は４〜７×３〜４μｍであった。既報のハンスフォルディア属菌と比較した結果、完全に一致する種は認められなかった（表１０）。そのため本菌株をハンスフォルディア エスピー（ Hansfordia sp.）と同定し、ハンスフォルディア エスピー Ｇ６−４（ Hansfordia sp. G6-4 ）株と命名した。
【００６２】
【表１０】
【００６３】
実 施 例 ７
ツルレイシ果実への接種試験
（１）胞子懸濁液の作成
ハンスフォルディア エスピー Ｇ６−４株は３０日、黒かび病菌は４日ＰＤＡ平板培地で前培養を行った。胞子懸濁液は各シャーレに１０ｍｌの滅菌水を入れ、コンラージ棒で培地表面を軽くこすり、胞子を懸濁した後、二重にしたガーゼを通して得た。各胞子濃度は血球計算盤（エルマ光学株式会社）を用いてハンスフォルディア エスピー Ｇ６−４を１×１０６ＣＦＵ／ｍｌ、黒かび病菌を１×１０５ＣＦＵ／ｍｌに調整した。
【００６４】
（２）ツルレイシ果実への接種
接種果実には市販のツルレイシ果実を使用した。試験区としては、黒かび病菌単独区、黒かび病菌とハンスフォルディア エスピー Ｇ６−４株同時処理区、ハンスフォルディア エスピー Ｇ６−４株前処理区、ハンスフォルディア エスピー Ｇ６−４株単独区、ＴＰＮ水和剤処理区および滅菌水区を設けた。各試験区とも、有傷接種と無傷接種を行った。有傷接種は火炎滅菌した柄付き針で果実表面に２８箇所傷を付けた果実を使用した。ハンスフォルディア エスピー Ｇ６−４株前処理区ではハンスフォルディア エスピー Ｇ６−４株胞子懸濁液を接種してから２４時間後に黒かび病菌を接種した。またＴＰＮ水和剤は１０００倍に希釈して散布を行い、十分に乾燥させてから黒かび病菌を接種した。各試験区とも果実を５個使用し、接種後の果実は過湿にしたプラスチックバットの中に入れ、接種３日後に発病の有無を確認した。
【００６５】
この結果、果実への発病は接種２日目より見られた。接種５日目の黒かび病菌単独接種区において有傷接種、無傷接種ではそれぞれ発病率８０％と６０％となった。また、ハンスフォルディア エスピー Ｇ６−４株と黒かび病菌の同時処理区においても同様の発病率となり、同時接種による防除効果は認められなかった。さらに、ＴＰＮ水和剤処理区では有傷接種において発病率１００％と最も高い発病率を示した。これに対して、ハンスフォルディア エスピー Ｇ６−４株前処理区では有傷接種、無傷接種共に発病は見られず高い防除効果が認められた（表１１）。
【００６６】
【表１１】
【００６７】
図２に示すようにハンスフォルディア エスピー Ｇ６−４株単独前処理区において発病が観察されなかったことから、ハンスフォルディア エスピー Ｇ６−４株はツルレイシに対して病原性がないことが確認された。
【００６８】
実 施 例 ８
ハンスフォルディア エスピー Ｇ６−４株に及ぼす薬剤の影響
薬剤試験には市販のＴＰＮ（商品名：武田ダコニール１０００、原体含率４０％）、アゾキシストロビン（商品名：アミスター２０フロアブル、原体含率２０％）、キノキサリン（商品名：サンケイモレスタン水和剤、原体含率２５％）、クレソキシムメチル（商品名：ストロビーフロアブル、原体含率４１.５％）およびチオファネートメチル水和剤を使用した。ＰＤＡ培地が９ｍｌ入った試験管に各農薬を１ｍｌ添加して、各使用濃度になるように調整した。攪拌後、シャーレ内に流し込み、ハンスフォルディア エスピー Ｇ６−４株と黒かび病菌の菌叢を直径４ｍｍのコルクボーラーで打ち抜き、それぞれの含菌寒天片を培地の中央に置いた。２５℃で培養を行いハンスフォルディア エスピー Ｇ６−４は５日後、黒かび病菌は３日後に、菌叢直径を測定した。試験区は５反復行った。
【００６９】
この結果を表１２に示すが、ＴＰＮ、アゾキシスロンビンおよびキノキサリン系水和剤は、ハンスフォルディア エスピー Ｇ６−４株の菌糸伸長をやや抑制するが、混合処理が可能であることが示された。
【００７０】
【表１２】
【産業上の利用可能性】
【００７１】
本発明の抗植物病原菌剤によれば、植物病害の原因となる黒かび病菌、炭疽病菌、貯蔵病害菌、つる割病菌等の植物病原菌を有効に防除することが可能となる。
【００７２】
また、本発明の抗植物病原菌剤の有効成分であるハンスフォルディア エスピーに属する微生物は、農作物病害に広く使用されている薬剤に対する耐性が高いので、これらと組合せ、より効果の高い抗植物病原菌組成物とすることができる。
【００７３】
従って本発明の抗植物病原菌剤は、ツルレイシを始め、多くの野菜等の栽培において、広く利用できる可能性を有するものである。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】ハンスフォルディア エスピー Ｇ６−４株の形態を示す図面（写真）。図中、Ａは菌叢、Ｂは分生子形成細胞、Ｃは分生子、Ｄは分生子形成細胞および分生子を示す。
【図２】実施例６の接種試験結果を示す図面（写真）。図中、Ａは黒かび病菌（R.stolonifer）単独接種区、Ｂは黒かび病菌とハンスフォルディア エスピー Ｇ６−４株の同時処理区、Ｃはハンスフォルディア エスピー Ｇ６−４株単独前処理区、ＤはＴＰＮ水和剤処理区を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ハンスフォルディア（ Hansfordia ）属に属する微生物を有効成分とする抗植物病原菌剤。
【請求項２】
ハンスフォルディア（ Hansfordia ）属に属する微生物が、ツルレイシ内生菌である請求項第１項記載の抗植物病原菌剤。
【請求項３】
ハンスフォルディア属に属する微生物の胞子懸濁液を使用するものである請求項第１項または第２項記載の抗植物病原菌剤。
【請求項４】
ハンスフォルディア属に属する微生物の培養濾液を使用するものである請求項第１項または第２項記載の抗植物病原菌剤。
【請求項５】
植物病原菌が、黒かび病菌、炭疽病菌、貯蔵病害菌またはつる割病菌の少なくとも１種である請求項第１項ないし第４項記載の抗植物病原菌剤。
【請求項６】
ハンスフォルディア属に属する微生物が、ハンスフォルディア エスピー Ｇ６−４（ＦＥＲＭ ＡＰ−２１０８８）株である請求項第１項ないし第５項の何れかの項記載の抗植物病原菌剤。
【請求項７】
請求項第１項ないし第６項の何れかの項に記載の抗植物病原菌剤と、ＴＰＮ、アゾキシストロビンおよびキノキサリン系水和剤から選ばれる薬剤とを含有する抗植物病原菌組成物。
【請求項８】
ツルレイシ表面にハンスフォルディア属に属する微生物を散布することを特徴とするツルレイシ表面での黒かび病発生防止方法。
【請求項９】
ハンスフォルディア属に属する微生物を、胞子懸濁液として散布するものである請求項第８項記載のツルレイシ表面での黒かび病発生防止方法。
【請求項１０】
ハンスフォルディア エスピー Ｇ６−４（ＦＥＲＭ ＡＰ−２１０８８）株。
【請求項１】
ハンスフォルディア（ Hansfordia ）属に属する微生物を有効成分とする抗植物病原菌剤。
【請求項２】
ハンスフォルディア（ Hansfordia ）属に属する微生物が、ツルレイシ内生菌である請求項第１項記載の抗植物病原菌剤。
【請求項３】
ハンスフォルディア属に属する微生物の胞子懸濁液を使用するものである請求項第１項または第２項記載の抗植物病原菌剤。
【請求項４】
ハンスフォルディア属に属する微生物の培養濾液を使用するものである請求項第１項または第２項記載の抗植物病原菌剤。
【請求項５】
植物病原菌が、黒かび病菌、炭疽病菌、貯蔵病害菌またはつる割病菌の少なくとも１種である請求項第１項ないし第４項記載の抗植物病原菌剤。
【請求項６】
ハンスフォルディア属に属する微生物が、ハンスフォルディア エスピー Ｇ６−４（ＦＥＲＭ ＡＰ−２１０８８）株である請求項第１項ないし第５項の何れかの項記載の抗植物病原菌剤。
【請求項７】
請求項第１項ないし第６項の何れかの項に記載の抗植物病原菌剤と、ＴＰＮ、アゾキシストロビンおよびキノキサリン系水和剤から選ばれる薬剤とを含有する抗植物病原菌組成物。
【請求項８】
ツルレイシ表面にハンスフォルディア属に属する微生物を散布することを特徴とするツルレイシ表面での黒かび病発生防止方法。
【請求項９】
ハンスフォルディア属に属する微生物を、胞子懸濁液として散布するものである請求項第８項記載のツルレイシ表面での黒かび病発生防止方法。
【請求項１０】
ハンスフォルディア エスピー Ｇ６−４（ＦＥＲＭ ＡＰ−２１０８８）株。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２００８−１２０７５１（Ｐ２００８−１２０７５１Ａ）
【公開日】平成２０年５月２９日（２００８．５．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−３０８３７８（Ｐ２００６−３０８３７８）
【出願日】平成１８年１１月１４日（２００６．１１．１４）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成１８年５月１５日 日本植物病理学会発行の「平成１８年度 日本植物病理学会大会 プログラム・講演要旨予稿集」に発表
【出願人】（５０４１４５３０８）国立大学法人 琉球大学 (100)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年５月２９日（２００８．５．２９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１１月１４日（２００６．１１．１４）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成１８年５月１５日 日本植物病理学会発行の「平成１８年度 日本植物病理学会大会 プログラム・講演要旨予稿集」に発表
【出願人】（５０４１４５３０８）国立大学法人 琉球大学 (100)
【Ｆターム（参考）】
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