改善された癌細胞特異性と活性を有する変形されたテロメア逆転写酵素のプロモーターおよびこれを含む組み換えベクター
本発明は、改善された癌細胞特異性と活性を有する転写調節配列およびこれを含む組み換えベクターに係り、さらに詳しくは、ヒトのテロメア逆転写酵素プロモーターに一つ以上のc−Myc結合部位および/または一つ以上のSp1結合部位を含む核酸配列が連結された転写調節配列、および前記転写調節配列に作動可能に連結された任意の遺伝子を含む組み換えベクターに関するものである。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【0001】
〔技術分野〕
本発明は、改善された癌細胞特異性と活性を有する転写調節配列およびこれを含む組み換えベクターに係り、さらに詳しくは、ヒトのテロメア逆転写酵素プロモーターに一つ以上のc−Myc結合部位および/または一つ以上のSp1結合部位を含む核酸配列が連結された転写調節配列、および前記転写調節配列に作動可能に連結された任意の遺伝子を含む組み換えベクターに関する。
【0002】
〔背景技術〕
アデノウィルスは、生体内・外遺伝子伝達効率が高く、細胞分裂状態を問わずに遺伝子の伝達と発現が可能であり、高い力価のウィルスに生産されるうえ、ヒトに癌を誘発しないという様々な利点が浮彫りとなるにつれて、癌を対象疾患とする遺伝子治療にその使用頻度が大きく増加している(Graham, F.L. ‘Adenovirus vectors for high-efficiency gene transfer into mammalian cells.’ Immunol. Today, 2000,21,426-8; Castell, J.V. et al. ‘Adenovirus-mediated gene transfer into human hepatocytes: analysis of the biochemical functionality of transduce cells.’ Gene Ther., 1997,4,455-64)。癌は、遺伝子療法(gene therapy)で治療する場合、長期的で持続的な治療遺伝子の発現を必要とせず、ウィルスによって誘導される宿主の免疫反応が大きく問題とならないかまたは寧ろ長所になることもある。このため、アデノウィルスが癌治療用遺伝子伝達体として脚光を浴びている。
【0003】
ところが、既存の癌治療用組み換えアデノウィルスは、大部分が増殖不可能な第1世代ウィルスであって、これらを遺伝子伝達体として用いる場合は、一次感染細胞または極めて一部の周辺細胞にのみ抗癌効果を誘発することができて、臨床的な実用性の面では多くの制約がある(Vile, R.G. et al. ‘Cancer gene therapy: hard lession and new courses.’ Gene Ther., 2000,7,2-8; Paillard, F. Cancer gene therapy annual conference. 1997: trends and news, Hum. Gene Ther., 1998,4,283-6; Lattime, E.C. et al. ‘Selectively replicating viruses as therapeutic agents against cancer.’ in: D. Kirn (Ed), Gene therapy of cancer, Academic Press, New York, 1999,235-50)。
【0004】
これを克服することが可能な一方案として、癌細胞でのみ選択的に増殖して癌細胞を殺傷する腫瘍細胞特異増殖および細胞殺傷組み換えアデノウィルスに対する研究がMcCormickの研究チームによって最初報告され以来、腫瘍細胞特異殺傷アデノウィルスの可能性が多角度から研究されている(Bischoff, J.R. et al. ‘An adenovirus mutant that replicates selectively in P53-deficient human tumor cells.’ Science, 1996,18,274(5286),373-6; Heise, C. et al. ‘ONYX-015, an E1B gene-attenuated adenovirus, causes tumor-specific cytolysis and antitumoral efficacy that can be augmented by standard chemotherapeutic agents.’ Nat. Med., 1997,3(6),639-45)。腫瘍殺傷アデノウィルス伝達体は、一次感染細胞の細胞殺傷のみならず、これによるウィルスの増殖によって周辺の腫瘍細胞も二次的に感染させることになり、その治療効果がドミノ現象の如く広がり続けて治療効果を著しく増大させることができるうえ、周辺の正常細胞では腫瘍殺傷アデノウィルスの増殖が抑制されるのでアデノウィルスに対する毒性を減少させるという長所ももっている。
【0005】
腫瘍特異的増殖可能アデノウィルスは、大きく2つの方法で開発されている。第1の方法によれば、腫瘍または組織特異的プロモーターを用いて、癌組織内でのみアデノウィルスの複製に必須的な蛋白質E1Aの発現を制限することにより、腫瘍特異的増殖機能アデノウィルスを開発することができる。Rodriguezの研究チームは、1997年に前立腺癌で選択的に発現される前立腺特異抗原(prostate-specific antigen:PSA)のプロモーター(promoter)/エンハンサー(enhancer)部位を、E1A遺伝子のアップストリーム(upstream)に位置した内在プロモーターと置換して挿入することにより、PSAの発現がたくさん起こる前立腺癌細胞内でのみ選択的にアデノウィルスが複製されるようにすることができることを報告した(Rodriguez, R. et al. ‘Prostate attenuated replication competent adenovirus (ARCA) CN706: a selective cytotoxic for prostate-specific antigen-positive prostate cancer cells.’ Cancer Res., 1997,1,57(13),2559-63)。このような前立腺癌特異的増殖可能アデノウィルスCN706(Cayldon Pharmaceuticals、CA、USA)は、現在開発した前立腺癌患者を対象として第1相臨床実験が行われている。また、前立腺癌特異的エンハンサー部位をアデノウィルス初期遺伝子E1Bのアップストリームにも挿入してアデノウィルスの2種の初期遺伝子(E1AおよびE1B)の発現をPSAの発現程度に応じて調節できるようにして、さらに前立腺癌特異的増殖アデノウィルスを開発する研究も行われている(Yu, D.C. et al. ‘Identification of the transcriptional regulatory sequences of human kallikrein 2 and their use in the construction of cyldon virus 764, an attenuated replication competent adenovirus for prostate cancer therapy.’ Cancer Res., 1999,1,59(7),1498-504)。この他にも、AFP(alpha-fetorprotein)、 CEA(carcinoembryonic antigen)およびMUC−1のように特定の癌細胞でのみ活性化される遺伝子のプロモーターを用いて腫瘍特異的増殖アデノウィルスを開発している(Kanai, F. et al. ‘Gene therapy for alpha-fetoprotein-producing human hepatoma cells by adenovirus-mediated transfer of the herpes simplex virus thymidine kinase gene.’ Hepatology, 1996,53,963-7; Marshall, J.F. et al. ‘Tissue specific promoters in targeting systemically delivered gene therapy.’ Semin. Oncol., 1996,23,154-8; Osaki, T. et al. ‘Gene therapy for carcinoembryonic antigen-producing human lung cancer cells by cell type specific expression of herpes simplex virus thymidine kinase gene.’ Cancer Res., 1994,54,5258-61; Kurihara, T. et al. ‘Selectivity of a replication-competent adenovirus for human breast carcinoma cells expressing the MUC1 antigen.’ J. Clin. Invest., 2000,106,763-71)。
【0006】
腫瘍特異的増殖アデノウィルスを開発するための第2の方法として、正常細胞ではウィルス複製を活発に起こすのに必須的であるが、癌細胞では必須的ではないアデノウィルス遺伝子の機能を選択的に消失させることにより、腫瘍特異的に増殖が可能なアデノウィルスを開発する方法が試みられている(Whyte, P. et al. ‘Cellular targets for transformation by the adenovirus E1A proteins.’ Cell, 1989,56,67-75; Fueyo, J. et al. ‘A mutant oncolytic adenovirus targeting the Rb pathway produces anti-glioma effect in vivo.’ Oncogen., 2000,19,2-12)。1996年にBischoff研究チームは、腫瘍抑制蛋白質p53と結合してこれを不活性化させる機能をするアデノウィルス初期遺伝子E1B55kDの消失されたアデノウィルスがp53機能の喪失された癌細胞でのみ特異的に増殖することができることを最初に報告した。野生型アデノウィルスが正常細胞を感染させると、感染した細胞は腫瘍抑制蛋白質p53を活性化させてウィルスの増殖を抑制するが、この際、E1B55kDa蛋白質がp53蛋白質に結合してp53の機能を抑制する役割をし、これにより野生型アデノウィルスは活発に増殖をして究極的に感染細胞の殺傷を誘導する(Yew, P.R. et al. ‘Adenovirus E1B oncoprotein tethers a transcriptional repression domain to p53.’ Genes, 1994,8,190-202; Dobner, T. et al. ‘Blockage by adenovirus E4 or F6 of transcriptional activation by the p53 tumor suppressor.’ Science, 1996,7,272(5267),1470-3.)。しかし、E1B55kD遺伝子の消失された組み換えアデノウィルスが正常細胞を感染させると、これらの細胞に在るp53による非活性化を誘導することができなくてウィルスの増殖が抑制されるが、p53の機能が抑制されている各種癌細胞では、ウィルスの増殖が活発に起こって究極的に感染細胞の殺傷を誘導する。これに基づいて本発明者が製造した、E1B55kD遺伝子の消失された腫瘍特異的殺傷アデノウィルスYKL−1は、既存の1世代アデノウィルスである複製不能アデノウィルスより形質導入の側面において著しく優れており、多種の人体癌細胞株に対する特異的殺傷能力を持つことが検証された(Lee, H. et al. ‘Oncolytic potential of E1B55kDa-deleted YKL-1 recombinant adenovirus: Correlation with p53 functional status.’ Int. J. Cancer, 2000, 88,454-63)。
【0007】
ところが、E1B55kD遺伝子は、p53を不活性化させる機能の他にも、アデノウィルスmRNAの細胞質への移動およびアデノウィルスの構成蛋白質の合成を促進する重要な機能をするので、効率的なアデノウィルス複製に必須的である。したがって、E1B55kD遺伝子の消失された複製可能アデノウィルスは、癌細胞内におけるウィルス増殖が制限されて発生するしかないため、細胞殺傷能が低下し、これによる生体内抗腫瘍効果が減少する。これを補完するために、本発明者は、アポトーシス(apoptosis)抑制役割をするアデノウィルスのE1b19kDの消失されたAd−ΔE1B19アデノウィルスを製作し、細胞殺傷能が一層増加でき且つ生体内抗腫瘍効果を増大できることを報告した(Kim, J. et al. ‘Evaluation of E1B gene attenuated replicating adenoviruses for cancer gene therapy.’ Cancer Gene Therapy, 2002,9,725-736)。しかし、アデノウィルスの複製を効果的に起こすために再導入したE1B55kD遺伝子によって、アデノウィルスの増殖による細胞死は増加したが、癌細胞特異的複製能は消失したので、これを対象とする遺伝子治療に利用するためには腫瘍特異性を与える必要性があることが確認された。
【0008】
ヒトのテロメア逆転写酵素(hTERT)は、染色体複製の間にテロメア(telomere)の長さを一定に保つことに関与する酵素テロメラーゼの構成要素であって、細胞老化、癌、細胞不滅に関与するものと知られている(Counter, C.M. et al. ‘Telomere shortening associated with chromosome instability is arrested in immortal cell which express telomerase activity.’ EMBO J. 1992,11,1921-29; Kim, N.W. et al. ‘Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer.’ Science, 1994,21,66,2011-5; Harley, C.B. et al. ‘Telomeres shorten during aging of human fibroblasts.’ Nature, 1990,345,458-60)。テロメラーゼの活性は、ヒトの場合、卵素と睾丸の生殖細胞およびリンパ球から観察されているが、その他の正常体細胞では観察されていない(Wright, W.E. et al. ‘Telomerase activity in human germline and embryonic tissues and cells.’ Dev. Genet. 1996,18,173-9)。したがって、正常体細胞は、制限された回数の細胞分裂後にはテロメアの長さが一定の長さ以下に減少してそれ以上分裂せずに死滅する(Yasumoto, S. et al. ‘Telomerase activity in normal human epithelial cells.’ Oncogene. 1996,13,433-9)。これに対し、癌進行前段階である陽性腫瘍細胞および癌細胞では、テロメラーゼの活性が増加する(Broccoli, D. et al. ‘Telomerase activity in normal and malignant hematopoietic cells.’ Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA. 1995,92,9082-6.)。卵素癌においてテロメラーゼの活性増加が最初に報告された以後、血液癌、胃癌、肺癌、肝癌、大腸癌、脳癌、前立腺癌、頭頚部癌、乳癌など殆ど全ての人体癌からテロメラーゼの活性増加が観察されている(Counter, C.M. et al. ‘Telomerase activity in human ovarian carcinoma.’ Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA. 1994,91,2900-4; Counter, C.M. et al. ‘Stabilization of short telomeres and telomerase activity accompany immortalization of Epstein-Barr virus-transformed human B lympho-cytes.’ J. Virol., 1994,68,3410-4; Shay, J.W. et al. ‘A survey of telomerase activity in human cancer.’ Eur. J. Cancer, 1997,33,787-91; Harle-Bachor, C. et al. ‘Telomerase activity in the regenerative basal layer of the epidermis in human skin and in immortal and carcinoma-derived skin keratinocytes.’ Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA. 1996,93,6476-81)。
【0009】
テロメラーゼの機能に必須的な役割をするhTERTの発現は、テロメラーゼの活性と関連しおり、最近は、テロメラーゼの発現がhTERTプロメーターの活性、すなわちhTERTのmRNAの量に応じて調節されることが明らかになった。hTERTの活性を調節するための最小のプロモーターの大きさは181bpであり、野生型hTERTプロモーターには2つのc−Myc結合部位と5つのSp1結合部位が含まれている。正常細胞に比べて癌細胞で著しく高く発現される発癌蛋白質(oncoprotein)c−MycおよびSp1と前記結合部位との結合はhTERTのプロモーターを活性化させることが報告された。また、1999年、Takakura研究チームは、c−Mycの過多発現によってhTERTプロモーターの活性が増加することを観察した(Cerni, C. ‘Telomeres, telomerase, and myc.’ An update. Mutat. Res., 2000,462,31-47; Greenberg, R.A. et al. ‘Telomerase reverse transcriptase gene is a direct target of c-Myc but is not functionally equivalent in cellular transformation.’ Oncogene, 1999,18,1219-26; Takakura, M. et al. ‘Cloning of human telomerase reverse transcriptase gene promoter and identification of proximal core promoter essential for transcriptional activation of hTERT in immortalized and cancer cells.’ Cancer Res., 1999,59,551-9)。
【0010】
Shoji研究チームは、hTERTプロモーターを用いて癌細胞特異的遺伝子発現を誘導してカスパーゼ−8(Caspase-8)のようなアポトーシス(apoptosis)を誘導する毒性遺伝子を癌細胞でのみ発現させることができた(Shoji, K. et al. ‘A novel telomerase-specific gene therapy: gene transfer of caspase-8 utilizing the human telomerase catalytic subunit gene promoter.’ Human Gene Therapy, 2000,11,1397-406.)。ところが、hTERTプロモーターのみでは十分な癌細胞特異性を達成するのに限界があった。
【0011】
〔発明の要約〕
本発明者は、かかる問題点を改善するために、hTERTプロモーターにc−Myc結合部位および/またはSp1結合部位を含む核酸配列が連結された転写調節配列を製造し、これを導入した組み換えベクター、特に組み換えアデノウィルスベクターを製造するに至った。
【0012】
一つの観点として、本発明は、ヒトのテロメア逆転写酵素プロモーターに、一つ以上のc−Myc結合部位および/または一つ以上のSp1結合部位を含む核酸配列が連結された転写調節配列に提供する。
【0013】
他の観点として、本発明は、前記転写調節配列に作動可能に連結された任意の遺伝子を含む組み換えベクターを提供する。
【0014】
別の観点として、本発明は、前記組み換えベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。
【0015】
別の観点として、本発明は、(a)前記組み換えベクターの治療学的有効量、および(b)薬剤学的に許容される担体を含む薬剤学的組成物を提供する。
【0016】
〔発明の詳細な説明〕
本発明は、ヒトテロメア逆転写酵素(hTERT)プロモーターに、一つ以上のc−Myc結合部位(binding site)および/または一つ以上のSp1結合部位を含む核酸配列が連結された転写調節配列を提供する。本発明は、一つの様態として、hTERTプロモーターに1つのc−Myc結合部位および5つのSp1結合部位を含む核酸配列が連結された転写調節配列を提供する。
【0017】
一般に、転写調節配列(transcriptional regulatory sequence)は、これに作動可能に連結された遺伝子の転写を調節する配列を総称するもので、代表的な例にはプロモーターおよびエンハンサーが含まれる。ところが、本発明の明細書において、転写調節配列は、プロモーターとして用いられることが好ましく、よって前記転写調節配列が任意の遺伝子の転写を調節するためには互いに隣接して位置しなければならない。本発明の実施例において、m−hTERTプロモーターは、本発明に係る転写調節配列の一様態として提供される。
【0018】
本発明では、hTERTプロモーターとしてヒトゲノム由来の野生型hTERTプロモーター(配列番号1)を用いることが最も好ましいが、哺乳動物から由来したTERT(telomere reverse transcriptase)プロモーターだけでなく、生物学的機能が維持される範囲内で変異された、人工的に合成されたTERTプロモーターも利用できる。用語「生物学的機能が維持される範囲」とは、あるTERTプロモーターにRNAポリメラーゼだけでなく、c−Myc発癌蛋白質およびSp1蛋白質が結合でき、これに作動可能に連結された任意の遺伝子の発現を誘導することが可能な状態を意味する。例えば、前記hTERTプロモーター内に本来含有されたc−Myc結合部位またはSp1結合部位は、当業界に公知されているその他のc−Myc結合部位またはSp1結合部位と置換できる。
【0019】
一方、hTERTプロモーターは、当業界に公知されている方法を用いると容易に製造できるが、例えばヒトのゲノムを鋳型とし、適切なプライマーを用いてPCRを行い、あるいは自動DNA合成器(例えば、バイオサーチ、アプライドバイオシステムTMなどから購入可能なもの)を用いれば製造することができる。
【0020】
前記「c−Myc結合部位」は、c−Myc発癌蛋白質が結合するオリゴヌクレオチドであって、c−Myc結合部位のコンセンサス配列は、cacgtg(配列番号2)である。本発明に係る転写調節配列には、c−Myc発癌蛋白質が結合する全ての公知配列が導入できる。そのようなc−Myc結合部位は、多数存在し、例えばcacgcg(配列番号3)、catgcg(配列番号4)などがある。
【0021】
また、前記「Sp1結合部位」は、Sp1発癌蛋白質が結合するオリゴヌクレオチドであって、Sp1結合部位のコンセンサス配列は、gggcgg(配列番号5)である。本発明に係る転写調節配列には、Sp1発癌蛋白質が結合する全ての公知配列が導入できる。そのようなSp1結合部位は、多数存在し、例えばccgccc(配列番号6)、ctccgcctc(配列番号7)、cccagcccc(配列番号8)、gggcgg(配列番号5)、ggggcgg(配列番号9)、cccccgcccc(配列番号10)などがある。
【0022】
本発明の明細書で使用された用語「コンセンサス配列(consensus sequence)」とは、同一ではないが関連している多数の配列の定義に用いられるヌクレオチド配列であり、コンセンサス配列のそれぞれの位置は実際配列のその位置で最も頻繁に発見されるヌクレオチドを示す。
【0023】
本発明に係る転写調節配列において、一つ以上のc−Myc結合部位および/または一つ以上のSp1結合部位を含む核酸配列は、hTERTプロモーターの5−末端または3−末端に連結され、あるいはhTERTプロモーターの生物学的機能が維持される範囲内でhTERTプロモーターの内部に含まれることもある。しかし、本発明においてc−Myc結合部位および/またはSp1結合部位を含む核酸配列は、hTERTプロモーターの3末端に連結されることが好ましい。一方、hTERTプロモーターとc−Myc結合部位および/Sp1結合部位を含む塩基配列との連結は、便利な制限酵素部位でライゲーションによって行われる。そのような部位が存在しない場合、通常の方法による合成オリゴヌクレオチドアダプタ(oligonucleotide adaptor)またはリンカー(linker)を使用する。
【0024】
本発明に係る転写調節配列は、これに作動可能に連結された任意の遺伝子を癌細胞でのみ特異的に高効率で発現することができるため、癌治療を目的とする遺伝子ビヒクル(vehicle)として、通常用いられるベクターに全て導入できる。ここで、ベクターは、ウィルスベクターおよび非ウィルスベクターを含む。
【0025】
したがって、本発明は、一つの様態として、hTERTプロモーターに一つ以上のc−Myc結合部位および/または一つ以上のSp1結合部位を含む核酸配列が連結された転写調節配列がウィルスの複製に必要な遺伝子に作動可能に連結された組み換えウィルスベクターを提供する。このようなウィルスベクターは、癌細胞または正常細胞に導入された後、癌細胞でのみ特異的に自分を複製することにより、癌細胞を高効率で殺傷することができる。また、本発明は、他の様態として、hTERTプロモーターに一つ以上のc−Myc結合部位および/または一つ以上のSp1結合部位を含む核酸配列が連結された転写調節配列が治療学トランス遺伝子に作動可能に連結された組み換えウィルスベクターを提供する。
【0026】
このようなウィルスベクターは、複製不能のものと複製可能のものの両方ともを含む。複製不能組み換えウィルスベクターは、癌細胞または正常細胞に導入された後、癌細胞でのみ特異的に治療学的トランス遺伝子を発現することにより、癌を治療することができるが、これに対し、複製可能組み換えウィルスベクターは、ウィルスの複製による細胞殺傷効果および治療学的トランス遺伝子の発現による細胞殺傷効果が共に誘導されることにより、抗癌効果が倍加できる。さらに、本発明は、別の様態として、hTERTプロモーターに一つ以上のc−Myc結合部位および/または一つ以上のSp1結合部位を含む核酸配列が連結された転写調節配列が治療学的トランス遺伝子に作動可能に連結された組み換え非ウィルスベクターを提供する。このような非ウィルスベクターは、癌細胞または正常細胞に導入された後、癌細胞でのみ特異的に治療学的トランス遺伝子を発現することにより、癌を治療することができる。
【0027】
本発明の明細書において、用語「ウィルス」は、「ウィルスベクター」と同一に使用されており、蛋白質合成またはエネルギー生成メカニズムを持っていない絶対的な細胞内寄生物質(obligate intracellular parasite)を総称する。ウィルスゲノムは、脂質膜からなる蛋白質成分のコーティング構造体内に含有されたRNAまたはDNAである。本発明の実施に有用なウィルスの例としては、バキュロビリジアエ(baculoviridiae)、パルボビリジアエ(parvoviridiae)、ピコルノビリジアエ(picornoviridiae)、ヘルペスビリジアエ(herpesviridiae)、ポックスビリジアエ(poxviridiae)、アデノビリジアエ(adenoviridiae)、ピコトルナビリジアエ(picotrnaviridiae)などが挙げられる。用語「組み換えウィルス」は、キメラウィルス(またはマルチマウィルス)、すなわち一つ以上のウィルスサブタイプから由来した相補的なコード配列を用いて作製されたベクターを含む(Feng et al. Nature Biotechnology, 15, 866-870)。
【0028】
本発明の明細書において、用語「非ウィルスベクター」は、前述したウィルスベクターを除いた、通常遺伝子治療療法で使用される全てのベクターを意味し、そのような例には、真核細胞で発現可能な各種プラスミッドおよびリポソームなどがある。
【0029】
本発明の明細書において、用語「作動可能に連結された(operably linked)」は、核酸配列間の結合が機能的に連関していることを意味する。任意の核酸配列が作動可能に連結される場合は、任意の核酸配列が他の核酸配列と機能的に関連性を持つように位置している場合である。本発明において、任意の転写調節配列が任意の遺伝子の転写に影響を及ぼす場合、前記転写調節配列が前記遺伝子と作動可能に連結されているという。
【0030】
本発明の明細書において、用語「ウィルスの複製に必要な遺伝子」はウィルスのゲノムを構成する全ての遺伝子を意味し、これらは初期遺伝子と後期遺伝子に分類される。初期遺伝子は、ウィルス増殖過程の初期、特にウィルスゲノムの複製が開始されるまでの間に発現が始まるウィルス遺伝子であって、ウィルスゲノムの複製に関係する。初期遺伝子中のあるものは、宿主細胞のメカニズムをそのまま利用してその情報がRNAに転写されるが、あるものは初期遺伝子産物の一部が生成されなければ転写されない。このように初期遺伝子の中でも漸進的な情報発現が起こり、特にウィルスの感染後に宿主酵素によって直ちに転写される遺伝子を前初期遺伝子(very early gene)とも呼ぶ。後期遺伝子は、宿主細胞にウィルスが感染するとき、ウィルスゲノムの複製が開始された後に発現されるウィルス遺伝子であって、外殻蛋白質の構造を決定する遺伝子である。
【0031】
本発明の明細書において、用語「治療学的トランス遺伝子(therapeutic transgene)」は、癌細胞内で発現されて治療学的効果を示すヌクレオチド配列を意味し、腫瘍抑制因子遺伝子、免疫調節遺伝子(サイトカイン遺伝子、ケモカイン遺伝子、補助刺激因子(costimulatory factor)(B7.1やB7.2などのT細胞活性に必要な補助分子)、抗原性遺伝子、細胞毒性遺伝子、細胞増殖抑制遺伝子、親−細胞死滅遺伝子および抗−新生血管生成遺伝子などを含み、これらに限定されるものではない。
【0032】
本発明の明細書において、用語「腫瘍抑制因子遺伝子(tumor suppressor gene)」は、標的細胞内で発現されて腫瘍表現型を抑制することができあるいは細胞死滅を誘導することができるヌクレオチド配列を意味する。本発明の実施に有用な腫瘍抑制因子遺伝子には、p53遺伝子、Rb遺伝子、APC遺伝子、DPC−4/Smad4遺伝子、BRCA−1遺伝子、BRCA−2遺伝子、WT−1遺伝子、網膜芽細胞腫遺伝子(Lee et al., Nature, 1987, 329,642) 、MMAC−1遺伝子、大腸線種様ポリポーシス蛋白質(adenomatous polyposis coli protein) (Albertsen et al., 米国特許公報US5,783,666号)、欠損した結腸腫瘍(DCC)遺伝子、MMSC−2遺伝子、NF−1遺伝子、染色体3p21.3に位置した鼻咽喉腫瘍抑制因子遺伝子(Cheng et al., Proc. Nat’l. Acad. Sci., 1998, USA 95,3042-3047)、MTS1遺伝子、CDK4遺伝子、NF−1遺伝子、NF−2遺伝子およびVHL遺伝子が含まれる。
【0033】
本発明の明細書において、用語「抗原性遺伝子(antigenic gene)」は、標的細胞内で発現されて免疫システムで認識できる細胞表面抗原性蛋白質を生産するヌクレオチド配列を意味する。このような抗原性遺伝子の例には、癌胎児性抗原(carcinoembryonic antigen、CEA)、PSA(prostate specific antigen)、AFP(a-feto protein)、p53(Levine, A. 国際特許出願公開WO94/02167号)が含まれる。免疫システムが容易に認識するようにするため、前記抗原性遺伝子をMHC第I型抗原に結合させることができる。
【0034】
本発明の明細書において、用語「細胞毒性遺伝子(cytotoxic gene)」は、細胞内で発現されて毒性効果を示すヌクレオチド配列を意味する。このような細胞毒性遺伝子の例には、シュードモナス外毒素(exotoxin)、リシン毒素、ジフテリア毒素などをコードするヌクレオチド配列が含まれる。
【0035】
本発明の明細書において、用語「細胞増殖抑制遺伝子(cytostatic gene)」は、細胞内で発現されて細胞周期途中で細胞周期を停止させるヌクレオチド配列を意味する。このような細胞増殖抑制遺伝子の例には、p21、網膜芽細胞腫遺伝子、E2F−Rb融合蛋白質遺伝子、サイクリン依存性キナーゼインヒビターをコードする遺伝子(例えばp16、p15、p18およびp19)、成長中止特異性ホメオボックス(growth arrest specific homeobox、GAX)遺伝子(国際特許出願公開WO97/16459号およびWO96/30385号)などがあり、これらに限定されるものではない。
【0036】
本発明の明細書において、「サイトカイン遺伝子(cytokine)」は、細胞内で発現されてサイトカインを生成するヌクレオチド配列を意味する。このようなサイトカインの例には、GM−CSF、インターロイキン(特に、IL−1、IL−2、IL−4、IL−12、IL−10、IL−19、IL−20)、インターフェロンα、β、γ(特に、インターフェロンα−2b)およびインターフェロンα−2α−1のような融合体などが含まれる。
【0037】
本発明の明細書において、用語「ケモカイン遺伝子(chemokine gene)」は、分裂促進活性、化学走性活性または炎症活性を有する細胞から放出される、構造的に関連性のある低分子量のサイトカイングループを意味する。主に、これらは4つの保存されたシステイン残基を共有する70〜100個のアミノ酸残基からなる陽イオン性蛋白質である。これらの蛋白質は、2つのアミノ末端システインの間隔を基準として2つのグループに区分することができる。第1グループでは1つの残基(cys−x−cys)だけ離れており、第2グループでは直接隣接している(cys−cys)。「cys−x−cysケモカイン」グループに属する蛋白質は、血小板因子4(PF4)、血小板基本蛋白質(PBP)、インターロイキン−8(IL−8)、黒色腫成長刺激活性蛋白質(MGSA)、マクロファージ炎症性蛋白質2(MIP−2)、マウスのMig(m119)、鶏の9E3(またはpCEF−4)、豚の肺胞マクロファージ化学走性因子IおよびII(AMCF−Iおよび−II)、前駆B細胞成長促進因子(PBSF)およびIP10などが例示され、これらに限定されるものではない。「C−Cケモカイン」グループに属する蛋白質は、単核球化学走性蛋白質1(MCP−1)、単核球化学走性蛋白質2(MCP−2)、単核球化学走性蛋白質3(MCP−3)、単核球化学走性蛋白質4(MCP−4)、マクロファージ炎症性蛋白質1α(MIP−1α)、マクロファージ炎症性蛋白質1β(MIP−1β)、マクロファージ炎症性蛋白質1γ(MIP−1γ)、マクロファージ炎症性蛋白質3α(MIP−3α)、マクロファージ炎症性蛋白質3β(MIP−3β)、ケモカイン(ELC)、マクロファージ炎症性蛋白質4(MIP−4)、マクロファージ炎症性蛋白質5(MIP−5)、LD78β、RANTES、SIS−エプシロン(p500)、TARC(thymus and activation-regulated chemokine)、エオタキシン、I−309、ヒト蛋白質HCC−1/NCC−2、ヒト蛋白質HCC−3、マウス蛋白質C10などが例示され、これらに限定されるものではない。
【0038】
本発明の明細書において、用語「親−細胞死滅遺伝子(pro-apoptotic gene)」は、発現され、プログラムされた細胞消滅を誘導するヌクレオチド配列を意味する。このような親−細胞死滅遺伝子の例には、p53、アデノウィルスE3−11.6K(Ad2およびAd5由来)またはアデノウィルスE3−10.5K(Ad由来)、アデノウィルスE4遺伝子、Fas ligand、TNF−α、TRAIL、p53経路遺伝子、およびカスパーゼをコードする遺伝子が含まれる。
【0039】
本発明の明細書において、用語「抗−新生血管生成遺伝子(anti-angiogenic gene)」は、発現されて抗−新生血管生成因子を細胞の外に放出するヌクレオチド配列を意味する。抗−新生血管新生因子には、アンギオスタチン、Tie2(PNAS, 1998, 95,8795-800)のような血管内皮成長因子(VEFG)の抑制因子、エンドスタチンなどが含まれる。
【0040】
上述したように、本発明に係る転写調節配列は、遺伝子ビヒクルとして通常用いられるウィルスベクターまたは非ウィルスベクターに導入できるが、アデノウィルスベクターが遺伝子ビヒクルとして適したものと認識されており、実際、その使用頻度が増加している。よって、本発明に係る転写調節配列は、アデノウィルスベクターに導入することが特に好ましい。したがって、本発明は、hTERTプロモーターに一つ以上のc−Myc結合部位および/または一つ以上のSp1結合部位を含む核酸配列が連結された転写調節配列がアデノウィルスの複製に必要な遺伝子に作動可能に連結された組み換えアデノウィルスベクターを提供する。
【0041】
本発明の明細書において、用語「複製可能アデノウィルスベクター」は、複製に必ず必要な遺伝子が保存されたアデノウィルスベクターを意味し、これらは、癌細胞内で自分を複製して細胞を殺傷することにより、癌を治療することができる。別の用語「複製不能アデノウィルスベクター」は、複製に必ず必要な、特に感染の初期段階に必要な遺伝子が除去されたアデノウィルスベクターを意味するが、これらは、主に治療学的トランス遺伝子を含んでおり、癌細胞でこれらを発現することにより癌を治療することができる。ところが、前述したように、本発明は、治療学的トランス遺伝子を含むと共に、複製可能なウィルスベクターを含む。すなわち、本発明の明細書において、複製不能アデノウィルスベクターとは、治療学的トランス遺伝子を含むアデノウィルスベクターの一様態として提供された複製不能アデノウィルスベクターを意味する。
【0042】
本発明の明細書において、用語「アデノウィルス」は、「アデノウィルスベクター」と同一に使用されており、「アデノビリジアエ」属に属するウィルスを意味する。用語「アデノビリジアエ」は、「マストアデノウィルス(Mastadenovirus)」属の動物性アデノウィルス(ヒト、牛、羊、馬、犬、豚、マウスおよび猿のアデノウィルス亜属を含み、これらに限定されるものではない。)を総体的に呼ぶ。特に、ヒトのアデノウィルスは、A−F亜属(subgenera)およびこの個々の血清型を含み、A−F亜属は、ヒトのアデノウィルス第1型、第2型、第3型、第4型、第4a型、第5型、第6型、第7型、第8型、第9型、第10型、第11型(Ad11AおよびAd11P)、第12型、第13型、第14型、第15型、第16型、第17型、第18型、第19型、第19a型、第20型、第21型、第22型、第23型、第24型、第25型、第26型、第27型、第28型、第29型、第30型、第31型、第32型、第33型、第34型、第34a型、第35型、第35p型、第36型、第37型、第38型、第39型、第40型、第41型、第42型、第43型、第44型、第45型、第46型、第47型、第48型および第91型を含み、これらに限定されるものではない。本発明の好適な様態におけるアデノウィルスは、ヒトのアデノウィルス第2または第5血清型(serotype)から由来したものである。
【0043】
アデノウィルスの血清型によって若干の差異はあるが、一般に、アデノウィルスゲノムは、E1A、E1B、E2、E3およびE4を含んだ初期遺伝子と、L1、L2、L3、L4およびL5を含んだ後期遺伝子からなっている。初期遺伝子において、E1A遺伝子は、ウィルス感染し次第(0−2h)、その他のウィルス遺伝子に先立って発現される。E1A蛋白質は、転写調節因子(transcriptional regulatory factor)として作用し、その他の初期遺伝子の発現に必ず必要である。E1A遺伝子の欠失は、ウィルスDNA複製に必要な遺伝子産物が生産できないため、ウィルスの感染が行われない。E1B蛋白質は、後期遺伝子mRNAを核から細胞質に移動させるのに必須的である。E1B発現の欠陥は、ウィルス後期遺伝子の微々たる発現と宿主細胞蛋白質合成の不完全な遮断に繋がる。E4遺伝子は、多数の転写産物を含んでいるが、E4転写単位(transcriptional unit)のオープンリーディングフレーム(open reading frame)3および6は、E1Bの55kD蛋白質とE2F−1およびDR−1からなる異種二量体(heterodimer)の結合による主要後期転写単位mRNA(late transcriptional unit mRNA)の蓄積を増加させる。オープンリーディングフレーム3および6から由来した蛋白質に欠陥があれば、プラーク(plaque)は、野生型ウィルスのそれより10−6以下の効率で生産される。L1、L2、L3、L4およびL5を含んだ後期遺伝子は、アデノウィルスの構造蛋白質を暗号化している。
【0044】
初期遺伝子および後期遺伝子はいずれもアデノウィルスの効率的な複製に必要である。したがって、本発明は、一様態として、hTERTプロモーターに一つ以上のc−Myc結合部位および/または一つ以上のSp1結合部位を含核酸配列が連結された転写調節配列がアデノウィルスの初期遺伝子および後期遺伝子の少なくとも一つに作動可能に連結されたアデノウィルスベクターを含む。初期遺伝子および後期遺伝子の中でも、特に初期遺伝子がウィルスゲノムの複製に関与するので、本発明は、より好適な様態として、hTERTプロモーターに一つ以上のc−Myc結合部位および/または一つ以上のSp1結合部位を含む核酸配列が連結された転写調節配列がアデノウィルスの初期遺伝子に作動可能に連結されたアデノウィルスベクターを提供する。初期遺伝子の中でも、特にE1A遺伝子は、転写因子であって、その結合によってその他のウィルス遺伝子が発現されるので、ウィルスの複製には最も重要な要素であると言える。したがって、本発明は、更に好適な様態として、hTERTプロモーターに一つ以上のc−Myc結合部位および/または一つ以上のSp1結合部位を含む塩基配列が連結された転写調節配列がアデノウィルスのE1A遺伝子に作動可能に連結された組み換えアデノウィルスベクターを提供する。
【0045】
本発明に係る転写調節配列がアデノウィルスの複製に必要な遺伝子に作動可能に連結された組み換えアデノウィルスベクターは、c−Myc発癌蛋白質またはSp1蛋白質の存在によってテロメラーゼが活性化された癌細胞内に流入された後、自分を高効率で増殖することにより癌細胞を殺傷する反面、正常細胞に流入されたアデノウィルスベクターは、増殖が殆ど不可能なので、細胞にあまり影響を及ぼさない。
【0046】
このようにウィルス増殖によって癌細胞を殺傷する組み換えアデノウィルスベクターに関連したより好適な様態は、E1B19kD遺伝子の欠失した組み換えアデノウィルスベクターを用いる。E1B19kDa蛋白質は、強力なアポトーシス(apoptosis)抑制剤であって、アデノウィルスの初期発現遺伝子E1Aによって誘導されるアポトーシスを抑制し、ヒトの各種主要細胞においてp53によって誘導されるアポトーシスも抑制する。また、成長因子の除去、放射線治療または抗癌剤によって誘導されるアポトーシスを抑制するにおいても、E1B19kD蛋白質はBcl−2と機能的に同じ役割をすることができる。したがって、E1B19kD遺伝子の欠失した組み換えアデノウィルスは、ウィルス増殖によるアポトーシスだけでなく、感染した細胞内でアポトーシスを共に誘発して効率よく癌細胞を殺傷させ、周囲癌細胞に拡散する効果も卓越である。これにより、前記組み換えアデノウィルスベクターは、癌細胞で特異的に高効率にて増殖して癌細胞のみを選択的に殺傷する能力が一層優れている。
【0047】
アデノウィルスの増殖による癌細胞の殺傷だけでなく、アデノウィルスベクターに治療学的トランス遺伝子をクローニングし、これを癌細胞で発現させることにより、癌を治療することもできる。したがって、本発明は、hTERTプロモーターにc−Myc結合部位および/またはSp1結合部位を含む核酸配列が連結された転写調節配列が治療学的トランス遺伝子に作動可能に連結された組み換えアデノウィルスベクターを提供する。前記治療学的トランス遺伝子は、癌細胞では特異的に高効率にて発現することができるが、正常細胞では発現が不可能なので、細胞毒性や副作用を誘発しない。
【0048】
通常、治療学的トランス遺伝子は、アデノウィルスのE1遺伝子またはE3遺伝子の代わりに導入できる。したがって、本発明は、一様態として、前記転写調節配列がアデノウィルスのE1遺伝子の代わりに導入された治療学的トランス遺伝子に作動可能に連結された複製不可能な組み換えアデノウィルスベクターを提供する。このような組み換えアデノウィルスベクターは、ウィルスの複製に必須的なE1遺伝子が欠失しているので、ウィルスの複製は不可能であり、単に治療学的トランス遺伝子の発現によって腫瘍が治療できる。また、本発明は、別の様態として、前記転写調節配列がアデノウィルスのE3遺伝子の代わりに導入された治療学的トランス遺伝子に作動可能に連結された複製可能な組み換えアデノウィルスベクターを提供する。このような組み換えアデノウィルスベクターは、複製可能なので、アデノウィルスの複製による細胞殺傷効果と治療学的トランス遺伝子の発現による細胞殺傷効果が共に誘導されて抗腫瘍効果が倍加できる。しかし、E1およびE3遺伝子の欠失したアデノウィルスが、他のベクターとは対照的に、相当高い遺伝子伝達効率を有しかつ広いスペクトルの細胞類型でトランス遺伝子を発現するため、好適な様態は、アデノウィルスとして、E1およびE3遺伝子の欠失した複製不能のアデノウィルスベクターを使用することである。したがって、本発明は、前記転写調節配列がE1A遺伝子の代わりに導入された治療学的トランス遺伝子に作動可能に連結され、E1およびE3遺伝子の欠失した組み換えアデノウィルスベクターを提供する。
【0049】
前述した組み換えベクターを製造するためには、これらを適切な宿主細胞に導入しなければならない。したがって、本発明は、前記組み換えウィルスベクターまたは非ウィルスベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。ベクターを宿主細胞に導入する好適な方法には、例えば、リン酸カルシウム形質転換(calcium phosphate transfection)、DAEA−デキストラン媒介形質転換(DAEA-dextran mediated transfection)、罹患(transvection)、 微量注入(microinjection)、陽イオン脂質−媒介形質転換(cationic lipid-mediated transfection)、 電気穿孔(electroporation)、形質導入(transduction)、 スクレイプローディング(scrape loading)、バリスティック導入(ballistic introduction)あるいは感染(infection)などが含まれる。一方、宿主細胞は組み換えベクターによって選択可能であり、好適な宿主細胞は当業界に公知されている。
【0050】
本発明において、組み換えアデノウィルスベクターは、hTERTプロモーターにc−Myc結合部位またはSp1結合部位を含む核酸配列が連結された転写調節配列を含有するシャトルベクターを作製し、前記シャトルベクターをアデノウィルスベクターと遺伝子相同組み換えさせ、これにより得られた組み換えアデノウィルスプラスミドを適切な細胞に形質転換またはトランスフェクトさせることにより生産される。
【0051】
hTERTプロモーターにc−Myc結合部位またはSp1結合部位を含む核酸配列が連結された転写調節配列を含むシャトルベクターを製作するときに使用されるプラスミドは、原核性であれ真核性であれ、公知または市販されているいずれも使用可能である。また、組み換えアデノウィルスを生産するための組み換えプラスミドの宿主細胞も当業者によく知られており、代表的な例としてはAd5のヌクレオチド1−4344によって形質転換されたヒト胚腎細胞株293(E1A/B+)およびAd5のヌクレオチド79−5789を含有したヒト胚網膜母細胞腫細胞911が含まれる。
【0052】
本発明に係る組み換えウィルスベクターまたは非ウィルスベクターは、様々な癌細胞、特にテロメラーゼが活発に発現される肝癌細胞、肺癌細胞、子宮頚部癌細胞および脳腫瘍細胞を含む癌細胞のみ特異的に高効率で殺傷することができる。したがって、本発明は、これらを活性成分として含む薬剤学的組成物を提供しようとする。
【0053】
本発明は、(a)hTERTプロモーターに一つ以上のc−Myc結合部位および/または一つ以上のSp1結合部位を含む核酸配列が連結された転写調節配列がウィルスの複製に必要な遺伝子に作動可能に連結された組み換えウィルスベクターの治療学的有効量、および(b)薬剤学的に許容される担体を含む薬剤学的組成物を提供する。このような本発明の薬剤学的組成物は、これに含まれる組み換えウィルスベクターが上述したように様々な癌細胞に対して殺傷効能を示すので、腫瘍と関連した様々な疾病または疾患、例えば胃癌、肺癌、卵巣癌、肝癌、気管支癌、鼻咽頭癌、喉頭癌、膵臓癌、膀胱癌、結腸癌および子宮頚部癌などの治療に利用できる。
【0054】
本発明は、(a)hTERTプロモーターに一つ以上のc−Myc結合部位および/または一つ以上のSp1結合部位を含む核酸配列が連結された転写調節配列が治療学的トランス遺伝子に作動可能に連結された組み換えウィルスベクターの治療学的有効量、および(b)薬剤学的に許容される担体を含む薬剤学的組成物を提供する。このような本発明の薬剤学的組成物は、これに含有された組み換えウィルスベクターに導入された治療学的トランス遺伝子が癌細胞内で発現されることにより、例えば、黒色腫、乳癌、肺癌、神経母細胞腫、腎細胞腫、卵巣癌、脳腫瘍、頭頚部腫瘍、卵巣癌および中皮腫などの様々な癌の治療に利用できる。
【0055】
前述した薬剤学的組成物に関する好適な様態は、ウィルスベクターとしてアデノウィルスベクターを用いることである。したがって、本発明は、(a)hTERTプロモーターに一つ以上のc−Myc結合部位および/または一つ以上のSp1結合部位を含む核酸配列が連結された転写調節配列がウィルスの複製に必要な遺伝子に作動可能に連結された組み換えアデノウィルスベクターの治療学的有効量、および(b)薬剤学的に許容される担体を含む薬剤学的組成物を提供する。また、本発明は、(a)hTERTプロモーターに一つ以上のc−Myc結合部位および/または一つ以上のSp1結合部位を含む核酸配列が連結された転写調節配列が治療学的トランス遺伝子に作動可能に連結された組み換えアデノウィルスベクターの治療学的有効量、および(b)薬剤学的に許容される担体を含む薬剤学的組成物を提供する。
【0056】
本発明は、(a)hTERTプロモーターに一つ以上のc−Myc結合部位および/または一つ以上のSp1結合部位を含む核酸配列が連結された転写調節配列が治療学的トランス遺伝子に作動可能に連結された非ウィルスベクターの治療学的有効量、および(b)薬剤学的に許容される担体を含む薬剤学的組成物を提供する。
【0057】
本明細書において、用語「治療」は、疾病または疾患の完治、抑制および軽減を意味する。したがって、本明細書において、用語「治療学的有効量」は、前述した薬理学的効果の達成に十分な量を意味する。
【0058】
本発明の組成物に含まれる薬剤学的に許容される担体は、製剤の際に通常用いられるものであって、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギン酸塩、ゼラチン、珪酸カルシウム、微細結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、滑石、ステアリン酸マグネシウムおよびミネラルオイルなどを含むが、これらに限定されるものではない。本発明の薬剤学的組成物は、前記成分ら以外に潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などをさらに含んでもよい。
【0059】
本発明の薬剤学的組成物は、遺伝子療法で通常用いられる経路によって投与でき、非経口投与が好ましく、例えば静脈内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、皮下投与または局部投与を用いて投与することができる。例えば、卵巣癌において腹腔内投与を行う場合、および肝癌において門脈投与を行う場合には注入方法を採用することができ、乳癌および頭頚部癌の場合には腫瘍マスに直接注射して投与することができ、結腸癌の場合には灌腸に直接注射して投与することができ、膀胱癌の場合にはカテーテル内に直接注射して投与することができる。本発明では、静脈内投与、腹腔内投与または腫瘍内投与が特に好ましい。
【0060】
本発明の薬剤学的組成物の適合な投与量は、製剤化方法、投与方法、患者の年齢、体重、性、疾病症状の程度、飲食、投与時間、投与経路、排泄速度および反応感応性などの要因によって異なり、普通熟練した医師は、所望の治療に効果的な投与量を容易に決定および処方することができる。例えば、本発明の薬剤学的組成物は1×105〜1×1015PFU/mLの組み換えアデノウィルスを含み、通常、組み換えアデノウィルスは約1×1010PFUを二日に1回ずつ2週間にわたって注射する。
【0061】
本発明の組み換えベクターを含有した薬剤学的組成物は、本発明の属する技術分野で通常の知識を有する者が容易に実施しうる方法によって、薬剤学的に許容される担体および/または賦形剤を用いて製剤化されることにより、単位容量の形で製造でき、あるいは多容量容器内に内入して製造できる。この際、剤型は、オイルまたは水性媒質中の溶液、懸濁液または乳化液の形であり、あるいはエキス剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤またはカプセル剤の形であってもよく、分散剤または安定化剤をさらに含んでもよい。
【0062】
本発明の組み換えベクターを含有した薬剤学的組成物は、単独の療法で利用できるが、他の通常の化学療法または放射療法と共に利用でき、このような並行療法を行う場合には、より効果的に癌治療を行うことができる。本発明の組成物と共に利用できる化学療法剤は、シスプラチ(cisplatin)、 カルボプラチン(carboplatin)、プロカルバジン(procarbazine)、メクロレタミン(mechlorethamine)、シクロホスファミド(cyclophosphamide)、イホスファミド(ifosfamide)、メルファラン(melphalan)、クロラムブシル(chlorambucil)、ブスルファン(busulfan)、ニトロソウレア(nitrosourea)、ダクチノマイシン(dactinomycin)、ダウノルビシン(daunorubicin)、ドキソルビシン(doxorubicin)、ブレオマイシン(bleomycin)、プリコマイシン(plicomycin)、マイトマイシン(mitomycin)、エトポシド(etoposide)、タモキシフェン(tamoxifen)、タクソール(taxol)、トランスプラチナム(transplatinum)、5−フルオロウラシル(5-fluorouracil)、ビンクリスチン(vincristin)、ビンブラスチン(vinblastin)およびメトトレキサート(methotrexate)などを含む。本発明の組成物と共に利用できる放射療法は、X線照射およびγ線照射などである。
【0063】
本発明の組み換えベクターを含有した薬剤学的組成物は、室温における安定性を増加させ、高い低温貯蔵の必要性を減らし、貯蔵寿命(shelf-life)を延長するために凍結乾燥させることができる。凍結乾燥工程は、凍結、1次乾燥および2次乾燥の連続段階からなる。組成物を凍結させた後、圧力を降下させ、組成物を水蒸気の昇華のために加熱する。2次乾燥段階では、乾燥物から吸収された残余水分を蒸発させる。
【0064】
一様態として、本発明に係る薬剤学的組成物の凍結乾燥方法は、次の順序とおりである。(1)凍結乾燥顕微鏡分析法を用いて製剤の崩壊温度(collapse temperature)を決定する(Pikal, M. J. et al. Int. J. Pharm., 1990, 62, 165-186)。(2)バイアルを室温下の凍結−乾燥機の棚に置き、以後に−1℃で約30分間平衡化させる。(3)棚を−55℃に冷却させ、この温度を2時間維持する。(4)約−32℃の生成物温度または崩壊温度より5℃低い温度で1次乾燥を行う。(5)35℃で2次乾燥を行う。チャンバーの圧力を55〜120mmHgに調節した後、乾燥を完成する。(6)凍結乾燥機の真空下でバイアルを栓で塞ぎ、凍結乾燥したバイアルをクリンプシールして2℃〜8℃で保存する。
【0065】
凍結乾燥した製剤には、賦形剤(excipients)および凍結乾燥保護剤(lyoprotectant)が含まれる。賦形剤は、これらに限定されるものではないが、0.9%NaClと10mMリン酸ナトリウム(pH7.0)または10mMクエン酸ナトリウム(pH7.0)の緩衝液を含む。凍結乾燥保護剤は、凍結および乾燥工程中に生物学的分子を保護し、最終産物に機械性(mechanical support)を与える役割をし、その例としては、PBS(pH7.0)、PBS/4%、12%または15%トレロースなどを挙げることができる。
【0066】
(実施例1)
対象癌細胞株と正常細胞株およびこれらの培養
本発明で使用された細胞株は、人体肝癌細胞株(SK−Hep1、Hep3B、HepG2)、脳癌細胞株(U251N、U343)、肺癌細胞株(A549、H460)、子宮頚部癌細胞株(C33A、HeLa)、乳癌細胞株(MCF7)などの癌細胞株と人体正常細胞株(173We、CBHEL、MRC5、WI38、IMR90、BJ)であり、全てATCC(American Type Culture Collection)から購入した。前記細胞株はいずれも、10%の牛胎児血清(GIBCO BRL、NY)が含有されたDMEM培地(GIBCO BRL、NY)を培養液として抗生剤のフェニシリン/ストレプトマイシン(GIBCO BRL、NY)を添加して5%CO2、37℃の恒温培養器で培養した。
【0067】
(実施例2)
本発明で使用された細胞株の内在テロメラーゼの活性度測定
各細胞株の内在テロメラーゼの活性度測定は、TRAPEZE ELISA(enzyme linked immunosorbent assay)テロメラーゼ検出キット(Oncor、Gaithsberg、MD)を利用し、測定方法は、製造会社の提示方法によって行われた。まず、1×106個の細胞を200Lの冷たい細胞溶解用(lysis)溶液で溶解させた後、10,000×gで15分間遠心分離して細胞抽出液を分離し次第、直ちに−80℃で保管した。細胞抽出液中の蛋白質の濃度は、蛋白分析キット(Bio−Rad、Hercules、CA)によって定量した後、同量の蛋白質を次のTRAP検定(telomeric repeat amplification protocol assay)に利用した。100ngの細胞抽出液と10μlの5×TRAP反応混合物(reaction mix)および2単位のTaqポリメラーゼを添加して50μlの反応液を作った後、TRAP延長(extension)のために常温で30分間反応させてからPCRを行った。PCR反応は、94℃で30秒、55℃で30秒間33回繰り返し行い、各サンプルのテロメラーゼ活性を調べるために、PCR産物をELISAによって450nmおよび650nmで吸光度を測定した。全ての実験は、3回以上繰り返し行い、その平均値を求めた。
【0068】
図3に示すように、MCF−7乳癌細胞株を除いた全ての癌細胞株、すなわち肝癌(Hep3B、SK−Hep1、HepG2)、肺癌(H460、A5409)、子宮頚部癌(C33A、HeLa)、脳癌(U251N)ではテロメラーゼ活性が高いが、173We、BJ、IMR90、WI38のような正常細胞ではその活性が殆ど観察されなかった。
【0069】
(実施例3)
hTERTプロモーターおよびm−hTERTプロモーターの製造
hTERTプロモーターを製造するために、正常胚細胞であるMRC5細胞株からゲノムDNA(genomic DNA)を抽出した後、下記のプライマーセットを用いて2つのc−Myc結合部位および5つのSp1結合部位が存在するhTERTプロモーターをPCR増幅した。センスプライマーは、5'−cccaaagcttaggccgattcgagatctctcc−3'(配列番号11)であって、クローニング上の便宜のために、PvuII制限酵素部位を挿入し(下線部分)、アンチセンスプライマーは、5'−gaattcaagctt cgcggggtg gccggggcc−3'(配列番号12)であって、EcoRIとHindIII制限酵素部位が含まれている(下線部分)。MRC5のゲノムDNAを鋳型としてPCRを行った後、生成されたサイズ447bpの産物をBglIIとHindIII制限酵素で処理した後、アルカリ性ホスファダーゼ(alkaline phosphatase)酵素を発現するpSEAP−basicベクター(Clontech、Palo Alto、CA)に挿入してpSEAP−TERTを製造した。
【0070】
hTERTプロモーターに1つのc−Myc結合部位および5つのSp1結合部位をさらに含ませたm−hTERTプロモーター(配列番号13:図1)を製造するために、2つのc−Myc結合部位および5つのSp1結合部位が存在する野生型hTERTプロモーターに、1つのc−Myc結合部位および5つのSp1結合部位が入っているhTERTプロモーターを結合させた。このため、まず1つのc−Myc結合部位および5つのSp1結合部位が含まれたpGL2−hTERTベクターをEcoRIとHindIIIで切断した後、同種の制限酵素で処理されたpSEAP−TERTに挿入してpSEAP−mTERTを製造した。
【0071】
(実施例4)
組み換えアデノウィルスの製造および生産
A.複製不能組み換えアデノウィルスdl−CMV−LacZ、dl−TERT−Zおよびdl−mTERT−Zの製造および生産
CMVプロモーターによってLacZ遺伝子の発現が調節されるE1アデノウィルスシャトルベクターを製造するために、LacZを発現するpcDNA−hygro−LacZ(CMVプロモーターによって調節されるLacZ)プラスミドからCMVプロモーター、LacZおよびpolA部位をHindIIIとNaeIで処理して分離した後、これをE1アデノウィルスシャトルベクターpΔE1SP1Aに挿入してpΔE1SP1A/CMV−lazZシャトルベクターを製造した。
【0072】
hTERTプロモーターおよび前記プロモーターにc−Myc結合部位およびSp1結合部位を含んだm−hTERTプロモーターによってLacZの発現が調節されるベクターを製造するために、pSEAP−TERTとpSEAP−mTERTプラスミドからBalIIとEcoRIを用いてhTERTプロモーターとm−hTERTプロモーターを分離した後、これらをBamHIとEcorIで処理し、CMVプロモーターの除去されたpΔE1SP1A/LacZに挿入してpΔE1SP1A/TERT−LacZとpΔE1SP1A/mTERT−LacZシャトルベクターをそれぞれ製造した。
【0073】
製造されたそれぞれのシャトルベクターは、XmnI制限酵素で切断した後、BstBI制限酵素で処理して1本鎖になったアデノウィルスdl324BstB1(SwissのFribourgh大学のVerca博士から得る)と共に大腸菌BJ5183で同時に形質転換させて遺伝子相同組み換えを誘導した。相同組み換えの行われたプラスミドDNAは、PacI制限酵素で処理した後、293細胞株に形質転換してdl−CMV−Z、dl−TERT−Zおよびdl−mTERT−Z組み換えアデノウィルスを生産した(図2A)。組み換えアデノウィルスdl−mTERT−Zは、ブダペスト協約の下にKCCM(Korean Culture Center of Microorganisms)に2003年2月20日付で寄託番号KCCM−10471にて国際寄託された。
【0074】
B.複製可能組み換えアデノウィルスAd−TERT−Δ19およびAd−mTERT−Δ19の製造および生産
hTERTとm−hTERTそれぞれのプロモーターによってアデノウィルスの複製が調節されるアデノウィルスを製造するために、E1B19kD部位の欠損した複製可能アデノウィルスAd−ΔE1B19を鋳型アデノウィルスプラスミドとして使用した。まず、pSEAP−TERTとpSEAP−mTERTからBglIIとEcoRIを用いてhTERTプロモーターとm−hTERTプロモーターを分離し、BamHIとEcoRIで前処理されたpΔE1SP1A/ΔE1B19にそれぞれ挿入してpΔE1SP1A/hTERT−ΔE1B19とpΔE1SP1A/mTERT−ΔE1B19シャトルベクターをそれぞれ製造した。
【0075】
製造されたシャトルベクターは、XmnI制限酵素で処理した後、BstBI制限酵素で処理して1本鎖になったAd−ΔE1B19と共に大腸菌BJ5183で同時に形質転換させて遺伝子相同組み換えを誘導し、Ad−TERT−Δ19とAd−mTERT−Δ19複製可能アデノウィルスを製造した(図2B)。組み換えアデノウィルスの生産、濃縮および力価の決定は293細胞株で行った。組み換えアデノウィルスAd−mTERT−Δ19は、ブダペスト協約の下にKCCM(Korean Culture Center of Microorganisms)に2003年2月20日付で寄託番号KCCM−10470にて国際寄託された。
【0076】
(実施例5)
複製不能組み換えアデノウィルスの遺伝子発現様相の究明
hTERTプロモーター及びm−hTERTプロモーターによる遺伝子発現が細胞内テロメラーゼの活性程度と関連があるかを検証するために、標識遺伝子として、LacZを発現する複製不能組み換えアデノウィルスdl−CMV−Z、dl−TERT−Zおよびdl−mTERT−Zを用いて様々な癌細胞でのLacZ遺伝子の発現様相を評価した。24−ウェルプレートに2×105個の癌細胞(C33A、U251N、MCF−7)と正常細胞(WI38、173We)をそれぞれ分注した後、翌日β−ガラクトシダーゼ(galactosidase)を発現するdl−CMV−Z、dl−TERT−Zまたはdl−mTERT−ZアデノウィルスをMOI50で感染させ、二日後にX−gal染色を行った。β−galの活性は、固定液(1%ホルムアルデヒド、0.2%グルタルアルデヒドin H2O-)で5分間細胞を固定させた後、染色溶液(0.4mg/ml X−gal、4mMフェリシアン化カリウム、4mMフェロシアン化カリウム、2mM MgCl2 in PBS)を用いて37℃で4〜16時間反応させて観察した。
【0077】
図4に示すように、CMVプロモーターの場合は、細胞内のテロメラーゼ活性と関係なく、本発明で用いられた全ての細胞株でLacZ発現を強く誘導することにより、癌細胞特異性が欠如していることを確認することができた。ところが、癌細胞特異的に遺伝子発現を調節することが可能なhTERTまたはm−hTERTの場合は、テロメラーゼ活性の高い細胞株でのみLacZの発現を誘導することにより、癌細胞特異的活性プロモーターであることを検証することができた。また、hTERTプロモーターにc−Myc結合部位およびSp1結合部位がさらに含まれたm−hTERTの場合は、テロメラーゼ活性の高い細胞株(C33A、U251N)では野生型プロモーターhTERTより高い遺伝子の発現を誘導することができてプロモーターの活性がさらに増加したことを確認し、テロメラーゼ活性の低いいろいろの細胞株(MCF−7、173We、WI38)では、その活性が効果的に減少して癌細胞特異性にも優れることを検証することができた。
【0078】
本発明で製造したhTERTまたはm−hTERTプロモーターによる遺伝子発現効率と癌細胞特異性を定量的に観察するために、dl−CMV−Z、dl−TERT−Zおよびdl−mTERT−Zアデノウィルスをいろいろの癌細胞株と正常細胞株にそれぞれ様々な濃度の力価で二日間感染させた後、細胞を溶解させてβ−galの活性を測定した。24−ウェルプレートに2×105個の癌細胞(H460、A549、C33A、SK−Hep1、HepG2、Hep3B、U343、U251N、MCF7)と正常細胞(173WE、CBHEL、MRC5、IMR90、W138、BJ)をそれぞれ分注した後、ここにdl−CMV−Z、dl−TERT−Zまたはdl−mTERT−ZアデノウィルスをMOI10、50、100で二日間感染させた後、ChengとBaltimoreの方法でβ−galの活性を測定した(Cheng,G. et al. ‘A co-inducer with TRAF2 of TNF-and CD40L-NK-kappaB activation.’ Genes & Develop., 1996,10,963-973.)。 まず、プレートから培地を除去し、Z緩衝溶液(60mM Na2HPO4、40mM NaH2PO4、10mM KCl、1mM MgSO4、50mM β−メルカプトエタノール)で細胞を分離させた後、1×106個の細胞を蛋白質分解抑制剤(20μm PMSF、20μM TLCK、20μM TPCK)が含まれた100μlの細胞溶解用緩衝溶液(β−メルカプトエタノールのないZ緩衝溶液プラス1%NP−40)で細胞を溶解させた。細胞溶出液を遠心分離して得た上澄液30μlを96−ウェルプレートにそれぞれ分注し、ここにONPG(o−ニトロフェニル−β−D−ガラクトピラノシド)4mgを6mlのZ緩衝溶液に溶かして120μlずつ分注し、37℃で30分間反応させた後、420nmで吸光度を測定した。
【0079】
図5A〜図5Oに示すように、CMVプロモーターによってLacZの発現が調節される場合、細胞を感染させたウィルスの力価に比例してLacZの発現が増加することが分かる。特に細胞内テロメラーゼ活性と関係なく、正常細胞株を含んだ全ての細胞株でLacZの発現を非常に強く誘導した。これとは対照的に、hTERTまたはm−hTERTプロモーターの場合は、テロメラーゼ活性の高い癌細胞株、すなわちMCF−7人体乳癌細胞株を除いた全ての癌細胞株では感染に用いられたウィルスの力価に比例してLacZの発現を誘導したが、正常癌細胞株ではMOI100の高力価でもβ−galの活性が殆ど観察されないため、これら2種のプロモーターの癌細胞特異的活性調節能に優れることを確認した。具体的に、IMR90正常細胞株の場合、MOI100でCMVプロモーターによって発現されるLacZの相対的な量O.D.420の値は1.714であるが、これに対し、hTERTまたはm−hTERTプロモーターによって発現されるLacZの相対的なO.D.420値は0.101と0.025であって、hTERTプロモーターの場合には約17倍程度低く、m−hTERTプロモーターの場合には約68倍程度低いことが分かる。BJ正常細胞株の場合、MOI500の高濃度のウィルスによって感染した場合、CMV、hTERTまたはm−hTERTプロモーターによって発現されるLacZの相対的なO.D.420値がそれぞれ0.548、0.001、0.001であって、hTERTまたはm−hTERTプロモーターが全く活性化されないことが分かる。このようなLacZ発現の大きい差は、他の正常細胞株である173We、CBHEL、WI38、MRC5などからも観察された。一方、テロメラーゼの活性が高いいろいろの癌細胞株では、m−hTERTプロモーターによって発現されるLacZの量が、野生型プロモーターのhTERTプロモーターに比べて一層強く誘導されることを確認した。すなわち、MOI50のdl−TERT−Zによって感染したSK−Hep1細胞株で発現されたLacZの相対的なO.D.420値は0.182であるが、これに対し、同量の力価でdl−mTERT−Zアデノウィルスによって感染した場合には発現されたLacZの相対的なO.D.420値が1.82であって約10倍程度強く誘導され、Hep3B細胞株でも約10倍程度(dl−TERT−Z:0.135、dl−mTERT−Z:1.322)強く誘導された(表1)。このような一連の実施例によって、本発明で製造されたm−hTERTプロモーターが、野生型プロモーターhTERTに比べて、癌細胞では一層強く遺伝子発現を誘導することができるため一層強いプロモーターであるが、正常細胞株では活性が殆ど起こらないため癌細胞特異性にも優れることを確認することができた。
【0080】
【表1】
【0081】
(実施例6)
複製可能組み換えアデノウィルスの免疫ブロット分析
複製が癌細胞特異的に起こるかを調べるために、対照群ウィルスAd−ΔE1B19と共に人体癌細胞株および正常細胞株にそれぞれ感染させた後、アデノウィルスによって発現されるE1蛋白質の発現様相を検証した。6−ウェルプレートに3×105〜1×106個の癌細胞株(C33A、A549、HeLa、SK−Hep1)および正常細胞株(IMR90、MRC5、BJ)をそれぞれ分注した後、翌日Ad−ΔE1B19、Ad−TERT−Δ19またはAd−mTERT−Δ19を、癌細胞はMOI1で、正常細胞株はMOI10でそれぞれ感染させた。ウィルス感染二日後に、感染した細胞を回収して細胞溶解用緩衝溶液(50mM HEPES、0.15M NaCl、0.5% NP−40、プロテアーゼ抑制剤:PMSF、TLCK、TPCK)で細胞を溶解させてSDS−PAGE(Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)電気泳動を行った。電気泳動の後、ゲルにある蛋白質をPVDF膜に電気移動(electro transfer)した後、アデノウィルスE1A蛋白質を特異的に認知する抗体(sc−430;Santa Cruz Biotech., Santa Cruz, CA)を1次抗体として混成化(hybridization)させ、HRP(horse radish peroxidase)が結合した2次抗体をさらに混成化させた後、ECL(Enhanced Chemi−Luminescence:sc−2048;Santa Cruz Biotech., Santa Cruz, CA)を用いて蛋白質の発現様相を究明した。
【0082】
図6に示すように、Ad−ΔE1B19によって感染した場合は、癌細胞と正常細胞の両方ともでウィルスの複製が活発に起こってE1蛋白質が高く発現されたが、これに対し、Ad−mTERT−Δ19アデノウィルスによって感染した場合は、テロメラーゼ活性の高い癌細胞でのみ発現され、テロメラーゼ活性の微々な全ての正常細胞株(WI38、BJ、IMR90)では全く発現されなかった。このような結果は、Ad−mTERT−Δ19アデノウィルスの複製がm−hTERTプロモーターによって癌細胞特異的に調節されることを意味する。しかし、野生型hTERTプロモーターによって複製が調節されるAd−TERT−Δ19の場合は、癌細胞で複製が活発に起こってE1蛋白質が高く発現されたが、正常細胞株であるW138とBJ細胞株でもE1蛋白質が発現されてAd−mTERT−Δ19アデノウィルスに比べて癌細胞特異的複製能が微弱に調節されることが分かった。
【0083】
(実施例7)
複製可能組み換えアデノウィルスの細胞殺傷能検証
Ad−TERT−Δ19とAd−mTERT−Δ19アデノウィルスの癌細胞特異的殺傷能を検証するために、多種の癌細胞株および正常細胞株に対照群複製可能アデノウィルスAd−ΔE1B19と陰性対照群ウィルスdl−CMV−Z複製不能アデノウィルスをそれぞれ様々な濃度の力価で感染させて細胞殺傷程度を観察した。24−ウェルプレートに2〜5×104個の多種の癌細胞株(SK−Hep1、H460、C33A、U251N、A549、HeLa)と正常細胞株(BJ、WI38、IMR90)をそれぞれ分注した後、翌日dl−CMV−Z、Ad−ΔE1B19、Ad−TERT−Δ19またはAd−mTERT−Δ19アデノウィルスをMOI0.01、0.1、1、10、100でそれぞれ感染させた。MOI0.01または0.1で投与したAd−ΔE1B19アデノウィルスが細胞を殆ど死滅させた時点に全ての培地を除去し、プレートの底に残っている細胞を0.5%クリスタルバイオレット(50%メタノール)で固定し染色した後、分析した。
【0084】
図7A〜図7Fに示すように、陰性対照群dl−CMV−Z複製不能アデノウィルスで感染した癌細胞では、ウィルス複製が全く起こらなくて細胞殺傷効果が観察されなかったが、Ad−TERT−Δ19またはAd−mTERT−Δ19で感染した大部分の癌細胞株では、Ad−ΔE1B19と殆ど類似の程度で細胞殺傷を誘導して細胞殺傷能(potency)に優れることを確認することができた。ところが、図7G〜図7Iに示すように、正常細胞株であるBJ、WI38、IMR90では、Ad−TERT−Δ19の場合は、癌細胞に対する特異性が全くないAd−ΔE1B19と殆ど類似の類準で正常細胞を殺傷させたが、Ad−mTERT−Δ19の場合は、Ad−ΔE1B19に比べて約100倍程度低い細胞殺傷を示してAd−mTERT−Δ19の癌細胞に対する特異性(specificity)に優れることを確認した。
【0085】
細胞株のテロメラーゼ活性度によるAd−TERT−Δ19およびAd−mTERT−Δ19の細胞殺傷能を定量化するために、MTT分析を行った。癌細胞(SK−Hep1、H460、C33A、U251N、A549およびHeLa)と正常細胞(BJ、WI38およびIMR90)を24−ウェルプレートに70〜90%の密集度(confluency)でそれぞれ分注した後、翌日dl−CMV−Z、Ad−ΔE1B19、Ad−TERT−Δ19またはAd−mTERT−Δ19アデノウィルスを、癌細胞はMOI10で、正常細胞はMOI50でそれぞれ感染させた。一定の時間間隔でMTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide、2mg/ml)溶液200μlずつをウェルに添加して4時間37℃の恒温器で反応させた後、1mlのDMSO(dimethyl sulphoxide)を添加し、37℃で10分間放置した後、540nmで吸光度を測定して細胞の相対的生存率を測定した。
【0086】
図8A〜図8Fに示すように、本発明で使用された全ての癌細胞では、ウィルス感染後に時間が経過するにつれて、Ad−TERT−Δ19、Ad−mTERT−Δ19およびAd−ΔE1B19が類似の水準で細胞を最も速く殺傷する反面、図8G〜図8Iに示すように、正常細胞株では、Ad−ΔE1B19およびAd−TERT−Δ19で感染した場合は、時間が経過するにつれて、細胞生存率が急激に減少するが(細胞生存率5〜20%)、Ad−mTERT−Δ19で感染した場合には、感染後9日が経過しても、約90%以上の細胞が生存することを観察することができた。このような結果により、Ad−mTERT−Δ19の癌細胞特異的殺傷能に優れることを検証した。これはまた、Ad−mTERT−Δ19の場合、対照群複製可能アデノウィルスAd−ΔE1B19および野生型hTERTによって複製が調節されるAd−TERT−Δ19より正常細胞における安全性が大幅増加したことを意味する。
【0087】
(実施例8)
複製可能組み換えアデノウィルスの生体内抗腫瘍効果検証
hTERTプロモーターによって複製が調節されるアデノウィルスAd−TERT−Δ19とm−hTERTプロモーターによって複製が調節されるAd−mTERT−Δ19アデノウィルスの生体内抗腫瘍効果を比較検証するために、人体子宮癌細胞株をヌードマウスに接種した後、形成された腫瘍にAd−TERT−Δ19とAd−mTERT−Δ19アデノウィルスを陽性対照群ウィルスAd−ΔE1B19と共に腫瘍内投与した後、腫瘍の大きさを観察した。生後6〜8週齢のヌードマウスの腹壁に皮下で1×107個の人体子宮癌細胞株C33Aを注射した後、腫瘍が50〜80mm3程度成長したときに5×108PFU(plaque forming unit)のAd−ΔE1B19、Ad−TERT−Δ19またはAd−mTERT−Δ19アデノウィルスを陰性対照群PBSと共に二日間隔で3回腫瘍に直接注射した後、腫瘍の成長を観察した。腫瘍の容積は、カリパス(capliper)を用いて腫瘍の長軸と短軸を測定した後、次の公式で算出した(腫瘍の容積=(短軸mm)2×長軸mm×0.523)。
【0088】
図9に示すように、陰性対照群PBSを投与したマウスの場合、ウィルス投与後32日目には、急激に成長して腫瘍の大きさが4,232±2,185mm3であったが、複製可能アデノウィルス(Ad−TERT−Δ19、Ad−mTERT−Δ19、Ad−ΔE1B19)を投与したマウスの場合は、腫瘍の成長が大きく遅延することを確認することができた。すなわち、Ad−ΔE1B19を投与したマウスの場合、ウィルス投与後32日目に腫瘍の大きさが44±38mm3であり、Ad−TERT−Δ19は229±168mm3、Ad−mTERT−Δ19は18±20mm3程度とはっきりとした抗腫瘍効果を示した(p<0.05)。また、ウィルス投与後60日目には、PBSを投与した全6匹のマウスが死んでそれ以上腫瘍の成長を測定することができず、Ad−ΔE1B19、Ad−TERT−Δ19またはAd−mTERT−Δ19を投与した場合には、腫瘍の大きさがそれぞれ62±104mm3、550±368mm3、15±15mm3であって、m−hTERTによって複製が調節されるアデノウィルスAd−mTERT−Δ19の場合、Ad−ΔE1B19だけ抗腫瘍効果が優れた(p<0.05)。また、Ad−mTERT−Δ19を投与したマウスの場合、ウィルス投与後10日頃に5匹のマウス中の2匹で腫瘍が完全に無くなることを観察することができ、2ヶ月が経過しても、腫瘍の再成長は観察されなかった。
【0089】
(実施例9)
hTERTまたはm−hTERTプロモーターの生体内正常組織における活性検証
生体内正常組織でhTERTまたはm−hTERTプロモーターの活性を検証するために、hTERTまたはm−hTERTプロモーターによって発現が調節されるLacZ標識遺伝子の挿入された複製不能アデノウィルスdl−TERT−Zとdl−mTERT−Zを陽性対照群dl−CMV−Zと共にマウスに静脈投与した。生後6〜8週齢のマウスの尾静脈に5×1010PFUのdl−CMV−Z、dl−TERT−Zおよびdl−mTERT−Zをそれぞれ100μlずつ投与してから3日後にマウスから各臓器(肝、心臓、肺、脾臓、腎臓、胃腸、精巣、筋肉)を摘出した。摘出された各組織を4%パラホルムアルデヒド溶液に仕込んだ後、4℃で4〜8時間固定させ、その後スクロース溶液でオーバーナイト(overnight)して脱水させた。脱水した組織は、O.C.T.コンパウンド(Sakura Finetec、Torrance、CA)で凍結薄片した後、8μlの厚さに切断し、ゼラインのコートされたスライドガラス上に付着させてX−gal染色を行った。
【0090】
図10Aおよび図10Bに示すように、構成性(constitutive)プロモーターによってLacZの発現が調節されるアデノウィルスdl−CMV−Zを静脈投与した場合、肝組織におけるLacZ発現が非常に高く起こり、脾臓、胃および腎臓でもLacZの発現が低く起こることを観察することができた。ところが、dl−TERT−Zとdl−mTERT−Zを投与した場合には、静脈投与後にアデノウィルスが最も多く検出されると知られている器官の肝組織においてLacZの発現が全く起こらないため、hTERTまたはm−hTERTプロモーターの活性が正常肝細胞で全く起こらないことを確認することができた。脾臓組織では、dl−TERT−Zまたはdl−mTERT−Zを投与した場合がdl−CMV−Zを投与した場合より一層微弱にLacZの発現が起こって、脾臓細胞でもhTERTとm−hTERTプロモーターの活性が抑制されることが分かった。胃腸組織では、dl−CMV−Zまたはdl−TERT−Zを投与した場合はLacZの発現が少量検出されたが、dl−mTERT−Zを投与した場合は全くLacZの発現が観察されておらず、腎臓組織では、dl−CMV−Zを投与した場合は微弱にLacZの発現が起こったが、dl−TERT−Zまたはdl−mTERT−Zを投与した場合は全くLacZの発現が観察されていないため、m−hTERTプロモーターの癌細胞特異性に優れることを確認した。
【0091】
(実施例10)
h−TERTまたはm−hTERTプロモーターの生体内腫瘍組織および正常組織における活性検証
腫瘍組織および正常組織におけるhTERTまたはm−hTERTプロモーターの活性を比較検証するために、生後6〜8週齢のヌードマウスの腹壁に皮下で1×107個の人体子宮癌細胞株C33Aを注射した後、腫瘍が100mm3程度成長したとき、5×108PFU(plaque forming unit)のdl−TERT−Zとdl−mTERT−Zアデノウィルスを陽性対照群dl−CMV−Zと共に1回マウスに腫瘍内投与(intratumoral injection)した。ウィルス投与3日後に腫瘍組織および正常組織を摘出した後、前述の方法によってX−gal染色を行った。
【0092】
図11Aおよび図11Bに示すように、dl−CMV−Zを投与したマウスの場合、腫瘍組織でLacZの発現が強く誘導されたが、正常組織の肝においてもLacZの発現が検出された反面、dl−TERT−Zまたはdl−mTERT−Zを投与したマウスの場合、腫瘍組織ではLacZが高く発現されるが、正常肝組織では全くLacZの発現を観察することができなかった。また、dl−TERT−Zウィルスは、極めて一部の癌細胞でのみLacZの発現を誘導したが、dl−mTERT−Zウィルスは、腫瘍組織内の多くの癌細胞でLacZの発現を誘導してmTERTプロモーターの活性がTERTプロモーターに比べて癌細胞で一層強く活性化されることが分かった。
【0093】
(実施例11)
癌細胞および正常細胞におけるウィルス生産量の比較
TERTまたはm−hTERTプロモーターによる癌細胞特異的複製で癌細胞と正常細胞におけるウィルス生産量を比較するために、6−ウェルプレートに3×105個の癌細胞(HeLa細胞)と正常細胞(BJ細胞)を分注した翌日、Ad−ΔE1B19、Ad−TERT−Δ19、Ad−mTERT−Δ19と陰性対照群として複製不能ウィルスdl−CMV−ZをMOI10で4時間感染させ、その後ウィルスの含まれた培地を取り除いて新規の培地で取り替えた後、一定の時間間隔で細胞と培養液を回収した。3回の凍結と解凍を繰り返し行った後、293細胞株でlimiting titeration方法によってウィルス力価を決定した。
【0094】
図12Aおよび図12Bに示すように、HeLa細胞株では、Ad−mTERT−Δ19で感染させた場合には陽性対照群ウィルスAd−ΔE1B19と類似にウィルスが活発に生成されるが、Ad−TERT−Δ19で感染した場合にはウィルスの生産量が著しく低かった。しかし、人体正常細胞株BJでは、Ad−mTERT−Δ19によって感染した場合、ウィルスが殆ど生産されないため、これらのウィルスの癌細胞特異的複製能を確認することができた。
【0095】
(実施例12)
腫瘍組織における複製可能アデノウィルスの複製能分析
生後6〜8週齢のヌードマウスの腹壁に皮下で1×107個の人体子宮癌細胞株C33Aを注射した後、腫瘍が約50〜80mm3程度成長したとき、5×108PFUのAd−ΔE1B19、Ad−TERT−Δ19またはAd−mTERT−Δ19アデノウィルスを直接投与した。ウィルス投与7日後に腫瘍を摘出してパラフィンブロックを製作した後、アデノウィルスのヘキソン部位と選択的に結合する抗体を用いて免疫組織化学(immunohistochemistry)をした。アデノウィルスのヘキソン(hexon)部位と選択的に結合する抗体(AB1056F;Chemicon、Temecula、CA、USA)を1次抗体として混成化させた後、HRP(horse Radish peroxidase)が結合した2次抗体をさらに混成化させてヘキソンの発現様相を究明した。
【0096】
図13に示すように、Ad−TERT−Δ19を投与した場合に比べて、Ad−ΔE1B19またはAd−mTERT−Δ19を投与した腫瘍組織がさらに広い部位からアデノウィルスが検出された。このような実験結果は、癌組織内におけるAd−mTERT−Δ19複製能がAd−TERT−Δ19より活発に起こることを意味する。
【0097】
(実施例13)
複製可能アデノウィルスが正常肝組織に及ぼす細胞毒性の分析
人体子宮癌細胞株C33Aをヌードマウスに接種した後、形成された腫瘍にAd−mTERT−Δ19またはAd−ΔE1B19アデノウィルスをそれぞれ腫瘍内投与してから7日後にマウスから肝組織を摘出し、ヘマトキシリン・エオシン(hematoxylin & eosin)で染色して組織の状態を検証した。
【0098】
図14に示すように、Ad−ΔE1B19を投与したマウスの肝の場合、類似分裂(mitosis)が多く観察され、核が大きくなっており、濃く染色されたことからみて、ウィルスによる核の損傷を確認することができた。また、クッパー細胞(kupffer cell)の増殖、多くの炎症細胞、およびアポトーシス(apoptosis)に進む細胞も観察された。Ad−mTERT−Δ19を投与したマウスの肝を見れば、核がやや大きくなっているが、類似分裂の行われる細胞を観察することができず、クッパー細胞もやはり正常的な形をしており、反応性感染(reactive hepatitis)または炎症(inflammation)現象も観察することができなかった。このような結果からみて、Ad−mTERT−Δ19ウィルスの場合、Ad−ΔE1B19に比べて細胞毒性が著しく低下することを確認することができた。
【0099】
(実施例14)
本発明のアデノウィルス投与量および投与経路によるマウスの致死率検証
癌細胞特異的に複製が可能なアデノウィルスAd−mTERT−Δ19と対照群ウィルスAd−ΔE1B19の生体内投与量による毒性を投与経路別にそれぞれ検証した。
【0100】
A.静脈内投与による毒性検証
尾静脈内投与によるアデノウィルスの投与による毒性を調べるために、生後6〜8週齢のマウスの尾静脈に1×1010、3×1010、5×1010PFUのAd−ΔE1B19またはAd−mTERT−Δ19をPBSが100μlとなるようにして投与した後、マウスの生存率を調べた(図15A)。
【0101】
Ad−ΔE1B19またはAd−mTERT−Δ19アデノウィルスをそれぞれ1×1010PFUで全身投与した場合、10匹のマウスが全てウィルス投与後15日まで生存し、1×1010PFUのウィルスを静脈から全身投与したときにマウスの致死率が0であることを確認することができた。Ad−mTERT−Δ19を3×1010PFUで全身投与した場合には、5匹のマウスの中で4匹がウィルス投与後15日まで生存したが、Ad−ΔE1B19を投与した場合には、5匹のマウスがウィルス投与後8日以内に全て死んだ。このような結果は、癌細胞に対する選択性が欠如しているAd−ΔE1B19の場合には、3×1010ウィルスの力価では致死率100%と毒性が確認されたが、癌細胞特異的に活性が調節されるAd−mTERT−Δ19の場合には、致死率20%と毒性が弱化したことを意味する。5×1010PFUの場合、Ad−ΔE1B19またはAd−mTERT−Δ19ウィルスを投与した全てのマウスがウィルス投与後5日以内に死んで、このような高濃度のウィルスを静脈から全身投与したときには毒性が最も大きいことを確認することができた。
【0102】
B.腹腔内投与による毒性検証
腹腔内投与によるアデノウィルスの投与量による毒性を調べるために、生後6〜8週齢のマウスの腹腔に5×1010と1×1011PFUのAd−ΔE1B19またはAd−mTERT−Δ19を1mlの量で投与した後、マウスの生存率を調べた(図15B)。
【0103】
Ad−ΔE1B19またはAd−mTERT−Δ19アデノウィルスをそれぞれ5×1010PFUで腹腔内投与した場合、10匹のマウスが全てウィルス投与後15日まで生存し、5×1010PFUのウィルスを腹腔内投与したときにマウスの致死率が0であることを確認することができた。Ad−mTERT−Δ19を1×1011PFUで腹腔内投与した場合には、5匹のマウスの中で4匹がウィルス投与後15日まで生存し、Ad−ΔE1B19を投与した場合には、5匹のマウスの中で3匹がウィルス投与後15日まで生存した。このような結果は、癌細胞に対する選択性が欠如しているAd−ΔE1B19の場合には致死率が40%であるが、癌細胞特異的に活性が調節されるAd−mTERT−Δ19の場合には致死率20%と毒性がやや弱化したことを意味する。また、5×1010PFUのウィルスをマウスの尾静脈から全身投与した場合には全てのマウスがウィルス投与後5日以内に死んだが、腹腔投与した場合にはマウスの致死率が0であることを確認することができた。これは、アデノウィルスを腹腔に投与することが静脈投与することより安全であることを意味する。
【0104】
C.腫瘍内投与による毒性検証
腫瘍内投与によるアデノウィルスの投与量による毒性を調べるために、生後6〜8週齢のマウスの腹壁にB16F10細胞株を接種した後、腫瘍の大きさが約100mm3程度成長したとき、Ad−Δ19またはAd−mTERT−Δ19アデノウィルスをそれぞれ5×1010と1×1011PFUで腫瘍内投与した(図15C)。
【0105】
5×1010PFUのウィルスを投与した全20匹のマウスがウィルス投与後15日まで生存し、前記PFUのウィルスを腫瘍内投与したときにマウスの致死率が0であることを確認することができた。Ad−ΔE1B19を1×1011PFUで腫瘍内投与した場合には、投与を受けた10匹のマウスの中で2匹がウィルス投与後8日目に死んだ。Ad−mTERT−Δ19を投与した場合には、投与を受けた10匹のマウスの中で2匹がウィルス投与後12日以内に死んだ。したがって、ウィルス投与後15日を基点としたマウスの致死率は、2種のウィルスを投与した場合に全て20%であるが、Ad−mTERT−Δ19を投与したマウスの生存期間がAd−ΔE1B19を投与したマウスの生存期間より増加した。
【0106】
このような結果をまとめると、癌細胞特異的に複製が起こるAd−mTERT−Δ19アデノウィルスを静脈投与または腹腔内投与した場合の致死率が癌細胞に対する選択性が欠如しているAd−ΔE1B19アデノウィルスの場合に比べて減少し、癌細胞特異的に増殖されるアデノウィルスによる生体内毒性が弱化したことが分かる。また、同じ力価のアデノウィルスを投与した場合、静脈からの全身投与が腹腔内投与または腫瘍内投与より強い毒性を示して高致死率を示すことも分かった。
【0107】
(実施例15)
投与経路別投与量による正常組織に対する毒性比較
癌細胞特異的に複製が可能なアデノウィルスAd−mTERT−Δ19と対照群ウィルスAd−ΔE1B19の生体内投与容量による正常組織に対する毒性を組織病理学的な素見で検証するために、生後6〜8週齢のマウスに1×1010PFUのAd−mTERT−Δ19、Ad−ΔE1B19またはPBSを尾静脈、腹腔内または腫瘍内投与してから7日経過した後、マウスからいろいろの臓器(腎臓、肝、肺、脾臓)を摘出して凍結薄片した後、ヘマトキシリン・エオシン(H&E)で染色して組織の状態を検証した(図16A〜図16C)。
【0108】
Ad−ΔE1B19アデノウィルスを尾静脈から全身投与した場合、肝門脈の周辺に炎症反応が激しく起こり、クッパー細胞の増殖とアポトーシスに進む細胞も観察された。また、多くの類似分裂が観察され、核が大きくなり、濃く染色されたことからみて、ウィルスによる核の損傷を確認することができた。この他に、リンパ様(lymphoid)小胞体にリンパ球が殆どない特徴を観察することができた。ところが、Ad−mTERT−Δ19ウィルスを尾静脈から全身投与した肝では、炎症反応が弱く起こり、核がやや肥大になっていたが、類似分裂が進む細胞を観察することができなかった。そして、肝組織外の他の組織では、異常現象が観察されなかった。尾静脈からの全身投与ではなく、腹腔内または腫瘍内に同じ力価のAd−mTERT−Δ19またはAd−ΔE1B19アデノウィルスを投与した場合には、当該実施例で摘出した全ての組織の状態が良好であることも確認することができた。このような結果より、アデノウィルスを全身投与した場合は、腹腔内投与した場合より激しい毒性を誘発することが分かり、腫瘍特異的に複製が調節されるAd−mTERT−Δ19アデノウィルスを生体内投与した場合、生体内組織に及ぼす毒性がAd−ΔE1B19ウィルスに比べて一層減少することが分かった。
【0109】
(実施例16)
投与経路別投与量による正常組織に対する毒性比較
これと共に血液分析によって、肝機能に関連したいろいろの酵素(GOT、GPT、T−bililubin)、腎臓機能に関連した酵素(BUN、CREA、尿酸)、全体コレステロールおよび電解質イオン(Na+、K+、Cl−)の濃度を定量分析した(表2〜表4)。
【0110】
Ad−mTERT−Δ19またはAd−ΔE1B19アデノウィルスを5×1010PFUで尾静脈から全身投与した場合は、ウィルス投与後7日内にマウスが死んで血液分析実験を行うことができなかったが、これに対し、同じ力価のアデノウィルスを腹腔投与または腫瘍内投与した場合は、投与後7日頃には肝毒性が大きく弱化したうえ、腎臓毒性が現れておらず、電解質イオンの濃度も全て正常範囲内にあった。このような結果は、アデノウィルスを腹腔または腫瘍内投与することが静脈投与することより安全であることを意味する。
【0111】
アデノウィルスを1×1010PFUで全身投与した場合に発生する肝毒性を比較すると、Ad−ΔE1B19を投与したときには、GOTとGPT濃度が著しく大幅増加して分析可能最大値を超過したが、Ad−mTERT−Δ19を投与したときには、GOTとGPT濃度が正常数値より約5〜16倍増加した。しかし、肝機能を検証することが可能な別の酵素T−bililubinの場合は、Ad−ΔE1B19を投与したときに大きく増加したが、Ad−mTERT−Δ19を投与したときには正常範囲にあった。
【0112】
また、Ad−ΔE1B19アデノウィルスを5×1010PFUで腹腔内投与した場合、GPTの濃度が増加したが、Ad−mTERT−Δ19を投与したマウスではGPTの濃度が正常範囲にあり、これらのアデノウィルスを腫瘍内投与した場合には、GOTとT−bililubinの濃度がAd−ΔE1B19アデノウィルスを投与したときに増加した。したがって、このような結果より、癌細胞特異的複製能を有するアデノウィルスによる生体内肝毒性が癌細胞特異性のないアデノウィルスに比べて減少することが分かった。
【0113】
【表2】
【0114】
【表3】
【0115】
【表4】
【産業上の利用可能性】
【0116】
本発明に係る転写調節配列は、癌細胞でのみ特異的であり、高効率で自分と作動可能に連結された遺伝子の発現を誘導することにより癌細胞のみを選択的に殺傷することができるため、副作用を最小化した抗癌治療剤として利用できる。
【図面の簡単な説明】
【0117】
【図1】本発明に係る転写調節配列の一実施例に係るm−hTERTプロモーターの塩基配列を示す図である。
【図2A】本発明に係る複製不能組み換えアデノウィルスベクターdl−CMV−Z、dl−TERT−Zおよびdl−mTERT−Zの模式図である。
【図2B】本発明に係る複製可能組み換えアデノウィルスベクターAd−ΔE1B19、Ad−TERT−Δ19およびAd−mTERT−Δ19の模式図である。
【図3】本発明で用いられる様々な癌細胞株および正常細胞株の相対的な内在テロメラーゼの活性度を示すグラフである。
【図4】様々な癌細胞株または正常細胞株において本発明に係る複製不能組み換えアデノウィルスdl−CMV−Z、dl−TERT−Zまたはdl−mTERT−ZのLacZ遺伝子の発現様相を示す写真である。
【図5A】癌細胞株(H460)における本発明に係る複製不能組み換えアデノウィルスdl−CMV−Z(■)、dl−TERT−Z(○)またはdl−mTERT−Z(△)のLacZ遺伝子の発現様相を定量化したグラフである。
【図5B】癌細胞株(A549)における本発明に係る複製不能組み換えアデノウィルスdl−CMV−Z(■)、dl−TERT−Z(○)またはdl−mTERT−Z(△)のLacZ遺伝子の発現様相を定量化したグラフである。
【図5C】癌細胞株(C33A)における本発明に係る複製不能組み換えアデノウィルスdl−CMV−Z(■)、dl−TERT−Z(○)またはdl−mTERT−Z(△)のLacZ遺伝子の発現様相を定量化したグラフである。
【図5D】癌細胞株(SK−Hep1)における本発明に係る複製不能組み換えアデノウィルスdl−CMV−Z(■)、dl−TERT−Z(○)またはdl−mTERT−Z(△)のLacZ遺伝子の発現様相を定量化したグラフである。
【図5E】癌細胞株(HepG2)における本発明に係る複製不能組み換えアデノウィルスdl−CMV−Z(■)、dl−TERT−Z(○)またはdl−mTERT−Z(△)のLacZ遺伝子の発現様相を定量化したグラフである。
【図5F】癌細胞株(Hep3B)における本発明に係る複製不能組み換えアデノウィルスdl−CMV−Z(■)、dl−TERT−Z(○)またはdl−mTERT−Z(△)のLacZ遺伝子お発現様相を定量化したグラフである。
【図5G】癌細胞株(U343)における本発明に係る複製不能組み換えアデノウィルスdl−CMV−Z(■)、dl−TERT−Z(○)またはdl−mTERT−Z(△)のLacZ遺伝子の発現様相を定量化したグラフである。
【図5H】癌細胞株(U251N)における本発明に係る複製不能組み換えアデノウィルスdl−CMV−Z(■)、dl−TERT−Z(○)またはdl−mTERT−Z(△)のLacZ遺伝子の発現様相を定量化したグラフである。
【図5I】癌細胞株(MCF7)における本発明に係る複製不能組み換えアデノウィルスdl−CMV−Z(■)、dl−TERT−Z(○)またはdl−mTERT−Z(△)のLacZ遺伝子の発現様相を定量化したグラフである。
【図5J】正常細胞株(173WE)における本発明に係る複製不能組み換えアデノウィルスdl−CMV−Z(■)、dl−TERT−Z(○)またはdl−mTERT−Z(△)のLacZ遺伝子の発現様相を定量化したグラフである。
【図5K】正常細胞株(CBHEL)における本発明に係る複製不能組み換えアデノウィルスdl−CMV−Z(■)、dl−TERT−Z(○)またはdl−mTERT−Z(△)のLacZ遺伝子の発現様相を定量化したグラフである。
【図5L】正常細胞株(MRC5)における本発明に係る複製不能組み換えアデノウィルスdl−CMV−Z(■)、dl−TERT−Z(○)またはdl−mTERT−Z(△)のLacZ遺伝子の発現様相を定量化したグラフである。
【図5M】正常細胞株(IMR90)で本発明に係る複製不能組み換えアデノウィルスdl−CMV−Z(■)、dl−TERT−Z(○)またはdl−mTERT−Z(△)のLacZ遺伝子発現様相を定量化したグラフである。
【図5N】正常細胞株(W138)における本発明に係る複製不能組み換えアデノウィルスdl−CMV−Z(■)、dl−TERT−Z(○)またはdl−mTERT−Z(△)のLacZ遺伝子の発現様相を定量化したグラフである。
【図5O】正常細胞株(BJ)における本発明に係る複製不能組み換えアデノウィルスdl−CMV−Z(■)、dl−TERT−Z(○)またはdl−mTERT−Z(△)のLacZ遺伝子の発現様相を定量化したグラフである。
【図6】様々な癌細胞株または正常細胞株における本発明に係る複製可能組み換えアデノウィルスAd−mTERT−Δ19、Ad−TERT−Δ19またはAd−ΔE1B19のE1遺伝子の発現様相を示す図である(1:C33A、2:A549、3:HeLa、4:SK−Hep1、5:W138、6:BJ、7:IMR90)。
【図7A】本発明に係る複製可能組み換えアデノウィルスによって感染した癌細胞株(SK−Hep1)の殺傷程度を示す図である(1:dl−CMV−Z、2:Ad−ΔE1B19、3:Ad−TERT−Δ19、4:Ad−mTERT−Δ19)。。
【図7B】本発明に係る複製可能組み換えアデノウィルスによって感染した癌細胞株(H460)の殺傷程度を示す図である(1:dl−CMV−Z、2:Ad−ΔE1B19、3:Ad−TERT−Δ19、4:Ad−mTERT−Δ19)。
【図7C】本発明に係る複製可能組み換えアデノウィルスによって感染した癌細胞株(C33A)の殺傷程度を示す図である(1:dl−CMV−Z、2:Ad−ΔE1B19、3:Ad−TERT−Δ19、4:Ad−mTERT−Δ19)。
【図7D】本発明に係る複製可能組み換えアデノウィルスによって感染した癌細胞株(U251N)の殺傷程度を示す図である(1:dl−CMV−Z、2:Ad−ΔE1B19、3:Ad−TERT−Δ19、4:Ad−mTERT−Δ19)。
【図7E】本発明に係る複製可能組み換えアデノウィルスによって感染した癌細胞株(A549)の殺傷程度を示す図である(1:dl−CMV−Z、2:Ad−ΔE1B19、3:Ad−TERT−Δ19、4:Ad−mTERT−Δ19)。
【図7F】本発明に係る複製可能組み換えアデノウィルスによって感染した癌細胞株(HeLa)の殺傷程度を示す図である(1:dl−CMV−Z、2:Ad−ΔE1B19、3:Ad−TERT−Δ19、4:Ad−mTERT−Δ19)。
【図7G】本発明に係る複製可能組み換えアデノウィルスによって感染した正常細胞株(BJ)の殺傷程度を示す図である(1:dl−CMV−Z、2:Ad−ΔE1B19、3:Ad−TERT−Δ19、4:Ad−mTERT−Δ19)。
【図7H】本発明に係る複製可能組み換えアデノウィルスによって感染した正常細胞株(WI38)の殺傷程度を示す図である(1:dl−CMV−Z、2:Ad−ΔE1B19、3:Ad−TERT−Δ19、4:Ad−mTERT−Δ19)。
【図7I】本発明に係る複製可能組み換えアデノウィルスによって感染した正常細胞株(IMR90)の殺傷程度を示す図である(1:dl−CMV−Z、2:Ad−ΔE1B19、3:Ad−TERT−Δ19、4:Ad−mTERT−Δ19)。
【図8A】本発明に係る複製可能組み換えアデノウィルスによって感染した癌細胞株(SK−Hep1)の殺傷程度を定量化したグラフである(■:dl−CMV−Z、○:Ad−ΔE1B19、□:Ad−TERT−Δ19、△:Ad−mTERT−Δ19)。
【図8B】本発明に係る複製可能組み換えアデノウィルスによって感染した癌細胞株(H460)の殺傷程度を定量化したグラフである(■:dl−CMV−Z、○:Ad−ΔE1B19、□:Ad−TERT−Δ19、△:Ad−mTERT−Δ19)。
【図8C】本発明に係る複製可能組み換えアデノウィルスによって感染した癌細胞株(C33A)の殺傷程度を定量化したグラフである(■:dl−CMV−Z、○:Ad−ΔE1B19、□:Ad−TERT−Δ19、△:Ad−mTERT−Δ19)。
【図8D】本発明に係る複製可能組み換えアデノウィルスによって感染した癌細胞株(U251N)の殺傷程度を定量化したグラフである(■:dl−CMV−Z、○:Ad−ΔE1B19、□:Ad−TERT−Δ19、△:Ad−mTERT−Δ19)。
【図8E】本発明に係る複製可能組み換えアデノウィルスによって感染した癌細胞株(A549)の殺傷程度を定量化したグラフである(■:dl−CMV−Z、○:Ad−ΔE1B19、□:Ad−TERT−Δ19、△:Ad−mTERT−Δ19)。
【図8F】本発明に係る複製可能組み換えアデノウィルスによって感染した癌細胞株(HeLa)の殺傷程度を定量化したグラフである(■:dl−CMV−Z、○:Ad−ΔE1B19、□:Ad−TERT−Δ19、△:Ad−mTERT−Δ19)。
【図8G】本発明に係る複製可能組み換えアデノウィルスによって感染した正常細胞株(BJ)の殺傷程度を定量化したグラフである(■:dl−CMV−Z、○:Ad−ΔE1B19、□:Ad−TERT−Δ19、△:Ad−mTERT−Δ19)。
【図8H】本発明に係る複製可能組み換えアデノウィルスによって感染した正常細胞株(WI38)の殺傷程度を定量化したグラフである(■:dl−CMV−Z、○:Ad−ΔE1B19、□:Ad−TERT−Δ19、△:Ad−mTERT−Δ19)。
【図8I】本発明に係る複製可能組み換えアデノウィルスによって感染した正常細胞株(IMR90)の殺傷程度を定量化したグラフである(■:dl−CMV−Z、○:Ad−ΔE1B19、□:Ad−TERT−Δ19、△:Ad−mTERT−Δ19)。
【図9】腫瘍の形成されたヌードマウスにおける本発明に係る複製可能組み換えアデノウィルスの腫瘍殺傷程度を示すグラフである(■:PBS、□:Ad−ΔE1B19、○:Ad−TERT−Δ19、△:Ad−mTERT−Δ19)。
【図10A】様々な生体内正常組織における本発明に係る複製不能組み換えアデノウィルスdl−CMV−Z、dl−TERT−Zまたはdl−mTERT−ZのLacZ遺伝子の発現様相を示すものである。
【図10B】様々な生体内正常組織における本発明に係る複製不能組み換えアデノウィルスdl−CMV−Z、dl−TERT−Zまたはdl−mTERT−ZのLacZ遺伝子の発現様相を示すものである。
【図10C】様々な生体内正常組織における本発明に係る複製不能組み換えアデノウィルスdl−CMV−Z、dl−TERT−Zまたはdl−mTERT−ZのLacZ遺伝子の発現様相を示すものである。
【図11A】生体内癌組織における本発明に係る複製不能組み換えアデノウィルスdl−CMV−Z、dl−TERT−Zまたはdl−mTERT−ZのLacZ遺伝子の発現様相を示すものである。
【図11B】生体内癌組織に本発明に係る複製不能組み換えアデノウィルスdl−CMV−Z、dl−TERT−Zまたはdl−mTERT−Zウィルスを腫瘍内投与した後、生体内肝組織でのLacZ遺伝子の発現様相を示すものである。
【図12A】HeLa癌細胞における本発明に係る複製可能組み換えアデノウィルスの生産量を示すグラフである。(□:Ad−ΔE1B19、○:Ad−TERT−Δ19、△Ad−mTERT−Δ19、■:dl−CMV−Z)。
【図12B】BJ正常細胞における本発明に係る複製可能組み換えアデノウィルスの生産量を示すグラフである。(□:Ad−ΔE1B19、○:Ad−TERT−Δ19、△Ad−mTERT−Δ19、■:dl−CMV−Z)。
【図13】癌組織内における本発明に係る複製可能アデノウィルスAd−ΔE1B19、Ad−TERT−Δ19またはAd−mTERT−Δ19の複製能を比較するための免疫組織化学(immunohistochemistry)結果を示すものである。
【図14】正常肝組織内における本発明に係る複製可能アデノウィルスAd−ΔE1B19またはAd−mTERT−Δ19の毒性を比較するためのヘマトキシリン・エオジン(Hematoxylin&Eosin)染色結果を示すものである。
【図15A】本発明に係る複製可能アデノウィルスAd−ΔE1B19またはAd−mTERT−Δ19を静脈内投与する場合の投与量によるマウスの生存率グラフである。
【図15B】本発明に係る複製可能アデノウィルスAd−ΔE1B19またはAd−mTERT−Δ19を腹腔内投与する場合の投与量によるマウスの生存率グラフである。
【図15C】本発明に係る複製可能アデノウィルスAd−ΔE1B19またはAd−mTERT−Δ19を腫瘍内投与する場合の投与量によるマウスの生存率グラフである。
【図16A】本発明に係る複製可能アデノウィルスAd−ΔE1B19またはAd−mTERT−Δ19を静脈内投与する場合の投与量による正常組織に対する毒性を示す写真である。
【図16B】本発明に係る複製可能アデノウィルスAd−ΔE1B19またはAd−mTERT−Δ19を腹腔内投与する場合の投与量による正常組織に対する毒性を示す写真である。
【図16C】本発明に係る複製可能アデノウィルスAd−ΔE1B19またはAd−mTERT−Δ19を腫瘍内投与する場合の投与量による正常組織に対する毒性を示す写真である。
【発明の詳細な説明】
【0001】
〔技術分野〕
本発明は、改善された癌細胞特異性と活性を有する転写調節配列およびこれを含む組み換えベクターに係り、さらに詳しくは、ヒトのテロメア逆転写酵素プロモーターに一つ以上のc−Myc結合部位および/または一つ以上のSp1結合部位を含む核酸配列が連結された転写調節配列、および前記転写調節配列に作動可能に連結された任意の遺伝子を含む組み換えベクターに関する。
【0002】
〔背景技術〕
アデノウィルスは、生体内・外遺伝子伝達効率が高く、細胞分裂状態を問わずに遺伝子の伝達と発現が可能であり、高い力価のウィルスに生産されるうえ、ヒトに癌を誘発しないという様々な利点が浮彫りとなるにつれて、癌を対象疾患とする遺伝子治療にその使用頻度が大きく増加している(Graham, F.L. ‘Adenovirus vectors for high-efficiency gene transfer into mammalian cells.’ Immunol. Today, 2000,21,426-8; Castell, J.V. et al. ‘Adenovirus-mediated gene transfer into human hepatocytes: analysis of the biochemical functionality of transduce cells.’ Gene Ther., 1997,4,455-64)。癌は、遺伝子療法(gene therapy)で治療する場合、長期的で持続的な治療遺伝子の発現を必要とせず、ウィルスによって誘導される宿主の免疫反応が大きく問題とならないかまたは寧ろ長所になることもある。このため、アデノウィルスが癌治療用遺伝子伝達体として脚光を浴びている。
【0003】
ところが、既存の癌治療用組み換えアデノウィルスは、大部分が増殖不可能な第1世代ウィルスであって、これらを遺伝子伝達体として用いる場合は、一次感染細胞または極めて一部の周辺細胞にのみ抗癌効果を誘発することができて、臨床的な実用性の面では多くの制約がある(Vile, R.G. et al. ‘Cancer gene therapy: hard lession and new courses.’ Gene Ther., 2000,7,2-8; Paillard, F. Cancer gene therapy annual conference. 1997: trends and news, Hum. Gene Ther., 1998,4,283-6; Lattime, E.C. et al. ‘Selectively replicating viruses as therapeutic agents against cancer.’ in: D. Kirn (Ed), Gene therapy of cancer, Academic Press, New York, 1999,235-50)。
【0004】
これを克服することが可能な一方案として、癌細胞でのみ選択的に増殖して癌細胞を殺傷する腫瘍細胞特異増殖および細胞殺傷組み換えアデノウィルスに対する研究がMcCormickの研究チームによって最初報告され以来、腫瘍細胞特異殺傷アデノウィルスの可能性が多角度から研究されている(Bischoff, J.R. et al. ‘An adenovirus mutant that replicates selectively in P53-deficient human tumor cells.’ Science, 1996,18,274(5286),373-6; Heise, C. et al. ‘ONYX-015, an E1B gene-attenuated adenovirus, causes tumor-specific cytolysis and antitumoral efficacy that can be augmented by standard chemotherapeutic agents.’ Nat. Med., 1997,3(6),639-45)。腫瘍殺傷アデノウィルス伝達体は、一次感染細胞の細胞殺傷のみならず、これによるウィルスの増殖によって周辺の腫瘍細胞も二次的に感染させることになり、その治療効果がドミノ現象の如く広がり続けて治療効果を著しく増大させることができるうえ、周辺の正常細胞では腫瘍殺傷アデノウィルスの増殖が抑制されるのでアデノウィルスに対する毒性を減少させるという長所ももっている。
【0005】
腫瘍特異的増殖可能アデノウィルスは、大きく2つの方法で開発されている。第1の方法によれば、腫瘍または組織特異的プロモーターを用いて、癌組織内でのみアデノウィルスの複製に必須的な蛋白質E1Aの発現を制限することにより、腫瘍特異的増殖機能アデノウィルスを開発することができる。Rodriguezの研究チームは、1997年に前立腺癌で選択的に発現される前立腺特異抗原(prostate-specific antigen:PSA)のプロモーター(promoter)/エンハンサー(enhancer)部位を、E1A遺伝子のアップストリーム(upstream)に位置した内在プロモーターと置換して挿入することにより、PSAの発現がたくさん起こる前立腺癌細胞内でのみ選択的にアデノウィルスが複製されるようにすることができることを報告した(Rodriguez, R. et al. ‘Prostate attenuated replication competent adenovirus (ARCA) CN706: a selective cytotoxic for prostate-specific antigen-positive prostate cancer cells.’ Cancer Res., 1997,1,57(13),2559-63)。このような前立腺癌特異的増殖可能アデノウィルスCN706(Cayldon Pharmaceuticals、CA、USA)は、現在開発した前立腺癌患者を対象として第1相臨床実験が行われている。また、前立腺癌特異的エンハンサー部位をアデノウィルス初期遺伝子E1Bのアップストリームにも挿入してアデノウィルスの2種の初期遺伝子(E1AおよびE1B)の発現をPSAの発現程度に応じて調節できるようにして、さらに前立腺癌特異的増殖アデノウィルスを開発する研究も行われている(Yu, D.C. et al. ‘Identification of the transcriptional regulatory sequences of human kallikrein 2 and their use in the construction of cyldon virus 764, an attenuated replication competent adenovirus for prostate cancer therapy.’ Cancer Res., 1999,1,59(7),1498-504)。この他にも、AFP(alpha-fetorprotein)、 CEA(carcinoembryonic antigen)およびMUC−1のように特定の癌細胞でのみ活性化される遺伝子のプロモーターを用いて腫瘍特異的増殖アデノウィルスを開発している(Kanai, F. et al. ‘Gene therapy for alpha-fetoprotein-producing human hepatoma cells by adenovirus-mediated transfer of the herpes simplex virus thymidine kinase gene.’ Hepatology, 1996,53,963-7; Marshall, J.F. et al. ‘Tissue specific promoters in targeting systemically delivered gene therapy.’ Semin. Oncol., 1996,23,154-8; Osaki, T. et al. ‘Gene therapy for carcinoembryonic antigen-producing human lung cancer cells by cell type specific expression of herpes simplex virus thymidine kinase gene.’ Cancer Res., 1994,54,5258-61; Kurihara, T. et al. ‘Selectivity of a replication-competent adenovirus for human breast carcinoma cells expressing the MUC1 antigen.’ J. Clin. Invest., 2000,106,763-71)。
【0006】
腫瘍特異的増殖アデノウィルスを開発するための第2の方法として、正常細胞ではウィルス複製を活発に起こすのに必須的であるが、癌細胞では必須的ではないアデノウィルス遺伝子の機能を選択的に消失させることにより、腫瘍特異的に増殖が可能なアデノウィルスを開発する方法が試みられている(Whyte, P. et al. ‘Cellular targets for transformation by the adenovirus E1A proteins.’ Cell, 1989,56,67-75; Fueyo, J. et al. ‘A mutant oncolytic adenovirus targeting the Rb pathway produces anti-glioma effect in vivo.’ Oncogen., 2000,19,2-12)。1996年にBischoff研究チームは、腫瘍抑制蛋白質p53と結合してこれを不活性化させる機能をするアデノウィルス初期遺伝子E1B55kDの消失されたアデノウィルスがp53機能の喪失された癌細胞でのみ特異的に増殖することができることを最初に報告した。野生型アデノウィルスが正常細胞を感染させると、感染した細胞は腫瘍抑制蛋白質p53を活性化させてウィルスの増殖を抑制するが、この際、E1B55kDa蛋白質がp53蛋白質に結合してp53の機能を抑制する役割をし、これにより野生型アデノウィルスは活発に増殖をして究極的に感染細胞の殺傷を誘導する(Yew, P.R. et al. ‘Adenovirus E1B oncoprotein tethers a transcriptional repression domain to p53.’ Genes, 1994,8,190-202; Dobner, T. et al. ‘Blockage by adenovirus E4 or F6 of transcriptional activation by the p53 tumor suppressor.’ Science, 1996,7,272(5267),1470-3.)。しかし、E1B55kD遺伝子の消失された組み換えアデノウィルスが正常細胞を感染させると、これらの細胞に在るp53による非活性化を誘導することができなくてウィルスの増殖が抑制されるが、p53の機能が抑制されている各種癌細胞では、ウィルスの増殖が活発に起こって究極的に感染細胞の殺傷を誘導する。これに基づいて本発明者が製造した、E1B55kD遺伝子の消失された腫瘍特異的殺傷アデノウィルスYKL−1は、既存の1世代アデノウィルスである複製不能アデノウィルスより形質導入の側面において著しく優れており、多種の人体癌細胞株に対する特異的殺傷能力を持つことが検証された(Lee, H. et al. ‘Oncolytic potential of E1B55kDa-deleted YKL-1 recombinant adenovirus: Correlation with p53 functional status.’ Int. J. Cancer, 2000, 88,454-63)。
【0007】
ところが、E1B55kD遺伝子は、p53を不活性化させる機能の他にも、アデノウィルスmRNAの細胞質への移動およびアデノウィルスの構成蛋白質の合成を促進する重要な機能をするので、効率的なアデノウィルス複製に必須的である。したがって、E1B55kD遺伝子の消失された複製可能アデノウィルスは、癌細胞内におけるウィルス増殖が制限されて発生するしかないため、細胞殺傷能が低下し、これによる生体内抗腫瘍効果が減少する。これを補完するために、本発明者は、アポトーシス(apoptosis)抑制役割をするアデノウィルスのE1b19kDの消失されたAd−ΔE1B19アデノウィルスを製作し、細胞殺傷能が一層増加でき且つ生体内抗腫瘍効果を増大できることを報告した(Kim, J. et al. ‘Evaluation of E1B gene attenuated replicating adenoviruses for cancer gene therapy.’ Cancer Gene Therapy, 2002,9,725-736)。しかし、アデノウィルスの複製を効果的に起こすために再導入したE1B55kD遺伝子によって、アデノウィルスの増殖による細胞死は増加したが、癌細胞特異的複製能は消失したので、これを対象とする遺伝子治療に利用するためには腫瘍特異性を与える必要性があることが確認された。
【0008】
ヒトのテロメア逆転写酵素(hTERT)は、染色体複製の間にテロメア(telomere)の長さを一定に保つことに関与する酵素テロメラーゼの構成要素であって、細胞老化、癌、細胞不滅に関与するものと知られている(Counter, C.M. et al. ‘Telomere shortening associated with chromosome instability is arrested in immortal cell which express telomerase activity.’ EMBO J. 1992,11,1921-29; Kim, N.W. et al. ‘Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer.’ Science, 1994,21,66,2011-5; Harley, C.B. et al. ‘Telomeres shorten during aging of human fibroblasts.’ Nature, 1990,345,458-60)。テロメラーゼの活性は、ヒトの場合、卵素と睾丸の生殖細胞およびリンパ球から観察されているが、その他の正常体細胞では観察されていない(Wright, W.E. et al. ‘Telomerase activity in human germline and embryonic tissues and cells.’ Dev. Genet. 1996,18,173-9)。したがって、正常体細胞は、制限された回数の細胞分裂後にはテロメアの長さが一定の長さ以下に減少してそれ以上分裂せずに死滅する(Yasumoto, S. et al. ‘Telomerase activity in normal human epithelial cells.’ Oncogene. 1996,13,433-9)。これに対し、癌進行前段階である陽性腫瘍細胞および癌細胞では、テロメラーゼの活性が増加する(Broccoli, D. et al. ‘Telomerase activity in normal and malignant hematopoietic cells.’ Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA. 1995,92,9082-6.)。卵素癌においてテロメラーゼの活性増加が最初に報告された以後、血液癌、胃癌、肺癌、肝癌、大腸癌、脳癌、前立腺癌、頭頚部癌、乳癌など殆ど全ての人体癌からテロメラーゼの活性増加が観察されている(Counter, C.M. et al. ‘Telomerase activity in human ovarian carcinoma.’ Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA. 1994,91,2900-4; Counter, C.M. et al. ‘Stabilization of short telomeres and telomerase activity accompany immortalization of Epstein-Barr virus-transformed human B lympho-cytes.’ J. Virol., 1994,68,3410-4; Shay, J.W. et al. ‘A survey of telomerase activity in human cancer.’ Eur. J. Cancer, 1997,33,787-91; Harle-Bachor, C. et al. ‘Telomerase activity in the regenerative basal layer of the epidermis in human skin and in immortal and carcinoma-derived skin keratinocytes.’ Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA. 1996,93,6476-81)。
【0009】
テロメラーゼの機能に必須的な役割をするhTERTの発現は、テロメラーゼの活性と関連しおり、最近は、テロメラーゼの発現がhTERTプロメーターの活性、すなわちhTERTのmRNAの量に応じて調節されることが明らかになった。hTERTの活性を調節するための最小のプロモーターの大きさは181bpであり、野生型hTERTプロモーターには2つのc−Myc結合部位と5つのSp1結合部位が含まれている。正常細胞に比べて癌細胞で著しく高く発現される発癌蛋白質(oncoprotein)c−MycおよびSp1と前記結合部位との結合はhTERTのプロモーターを活性化させることが報告された。また、1999年、Takakura研究チームは、c−Mycの過多発現によってhTERTプロモーターの活性が増加することを観察した(Cerni, C. ‘Telomeres, telomerase, and myc.’ An update. Mutat. Res., 2000,462,31-47; Greenberg, R.A. et al. ‘Telomerase reverse transcriptase gene is a direct target of c-Myc but is not functionally equivalent in cellular transformation.’ Oncogene, 1999,18,1219-26; Takakura, M. et al. ‘Cloning of human telomerase reverse transcriptase gene promoter and identification of proximal core promoter essential for transcriptional activation of hTERT in immortalized and cancer cells.’ Cancer Res., 1999,59,551-9)。
【0010】
Shoji研究チームは、hTERTプロモーターを用いて癌細胞特異的遺伝子発現を誘導してカスパーゼ−8(Caspase-8)のようなアポトーシス(apoptosis)を誘導する毒性遺伝子を癌細胞でのみ発現させることができた(Shoji, K. et al. ‘A novel telomerase-specific gene therapy: gene transfer of caspase-8 utilizing the human telomerase catalytic subunit gene promoter.’ Human Gene Therapy, 2000,11,1397-406.)。ところが、hTERTプロモーターのみでは十分な癌細胞特異性を達成するのに限界があった。
【0011】
〔発明の要約〕
本発明者は、かかる問題点を改善するために、hTERTプロモーターにc−Myc結合部位および/またはSp1結合部位を含む核酸配列が連結された転写調節配列を製造し、これを導入した組み換えベクター、特に組み換えアデノウィルスベクターを製造するに至った。
【0012】
一つの観点として、本発明は、ヒトのテロメア逆転写酵素プロモーターに、一つ以上のc−Myc結合部位および/または一つ以上のSp1結合部位を含む核酸配列が連結された転写調節配列に提供する。
【0013】
他の観点として、本発明は、前記転写調節配列に作動可能に連結された任意の遺伝子を含む組み換えベクターを提供する。
【0014】
別の観点として、本発明は、前記組み換えベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。
【0015】
別の観点として、本発明は、(a)前記組み換えベクターの治療学的有効量、および(b)薬剤学的に許容される担体を含む薬剤学的組成物を提供する。
【0016】
〔発明の詳細な説明〕
本発明は、ヒトテロメア逆転写酵素(hTERT)プロモーターに、一つ以上のc−Myc結合部位(binding site)および/または一つ以上のSp1結合部位を含む核酸配列が連結された転写調節配列を提供する。本発明は、一つの様態として、hTERTプロモーターに1つのc−Myc結合部位および5つのSp1結合部位を含む核酸配列が連結された転写調節配列を提供する。
【0017】
一般に、転写調節配列(transcriptional regulatory sequence)は、これに作動可能に連結された遺伝子の転写を調節する配列を総称するもので、代表的な例にはプロモーターおよびエンハンサーが含まれる。ところが、本発明の明細書において、転写調節配列は、プロモーターとして用いられることが好ましく、よって前記転写調節配列が任意の遺伝子の転写を調節するためには互いに隣接して位置しなければならない。本発明の実施例において、m−hTERTプロモーターは、本発明に係る転写調節配列の一様態として提供される。
【0018】
本発明では、hTERTプロモーターとしてヒトゲノム由来の野生型hTERTプロモーター(配列番号1)を用いることが最も好ましいが、哺乳動物から由来したTERT(telomere reverse transcriptase)プロモーターだけでなく、生物学的機能が維持される範囲内で変異された、人工的に合成されたTERTプロモーターも利用できる。用語「生物学的機能が維持される範囲」とは、あるTERTプロモーターにRNAポリメラーゼだけでなく、c−Myc発癌蛋白質およびSp1蛋白質が結合でき、これに作動可能に連結された任意の遺伝子の発現を誘導することが可能な状態を意味する。例えば、前記hTERTプロモーター内に本来含有されたc−Myc結合部位またはSp1結合部位は、当業界に公知されているその他のc−Myc結合部位またはSp1結合部位と置換できる。
【0019】
一方、hTERTプロモーターは、当業界に公知されている方法を用いると容易に製造できるが、例えばヒトのゲノムを鋳型とし、適切なプライマーを用いてPCRを行い、あるいは自動DNA合成器(例えば、バイオサーチ、アプライドバイオシステムTMなどから購入可能なもの)を用いれば製造することができる。
【0020】
前記「c−Myc結合部位」は、c−Myc発癌蛋白質が結合するオリゴヌクレオチドであって、c−Myc結合部位のコンセンサス配列は、cacgtg(配列番号2)である。本発明に係る転写調節配列には、c−Myc発癌蛋白質が結合する全ての公知配列が導入できる。そのようなc−Myc結合部位は、多数存在し、例えばcacgcg(配列番号3)、catgcg(配列番号4)などがある。
【0021】
また、前記「Sp1結合部位」は、Sp1発癌蛋白質が結合するオリゴヌクレオチドであって、Sp1結合部位のコンセンサス配列は、gggcgg(配列番号5)である。本発明に係る転写調節配列には、Sp1発癌蛋白質が結合する全ての公知配列が導入できる。そのようなSp1結合部位は、多数存在し、例えばccgccc(配列番号6)、ctccgcctc(配列番号7)、cccagcccc(配列番号8)、gggcgg(配列番号5)、ggggcgg(配列番号9)、cccccgcccc(配列番号10)などがある。
【0022】
本発明の明細書で使用された用語「コンセンサス配列(consensus sequence)」とは、同一ではないが関連している多数の配列の定義に用いられるヌクレオチド配列であり、コンセンサス配列のそれぞれの位置は実際配列のその位置で最も頻繁に発見されるヌクレオチドを示す。
【0023】
本発明に係る転写調節配列において、一つ以上のc−Myc結合部位および/または一つ以上のSp1結合部位を含む核酸配列は、hTERTプロモーターの5−末端または3−末端に連結され、あるいはhTERTプロモーターの生物学的機能が維持される範囲内でhTERTプロモーターの内部に含まれることもある。しかし、本発明においてc−Myc結合部位および/またはSp1結合部位を含む核酸配列は、hTERTプロモーターの3末端に連結されることが好ましい。一方、hTERTプロモーターとc−Myc結合部位および/Sp1結合部位を含む塩基配列との連結は、便利な制限酵素部位でライゲーションによって行われる。そのような部位が存在しない場合、通常の方法による合成オリゴヌクレオチドアダプタ(oligonucleotide adaptor)またはリンカー(linker)を使用する。
【0024】
本発明に係る転写調節配列は、これに作動可能に連結された任意の遺伝子を癌細胞でのみ特異的に高効率で発現することができるため、癌治療を目的とする遺伝子ビヒクル(vehicle)として、通常用いられるベクターに全て導入できる。ここで、ベクターは、ウィルスベクターおよび非ウィルスベクターを含む。
【0025】
したがって、本発明は、一つの様態として、hTERTプロモーターに一つ以上のc−Myc結合部位および/または一つ以上のSp1結合部位を含む核酸配列が連結された転写調節配列がウィルスの複製に必要な遺伝子に作動可能に連結された組み換えウィルスベクターを提供する。このようなウィルスベクターは、癌細胞または正常細胞に導入された後、癌細胞でのみ特異的に自分を複製することにより、癌細胞を高効率で殺傷することができる。また、本発明は、他の様態として、hTERTプロモーターに一つ以上のc−Myc結合部位および/または一つ以上のSp1結合部位を含む核酸配列が連結された転写調節配列が治療学トランス遺伝子に作動可能に連結された組み換えウィルスベクターを提供する。
【0026】
このようなウィルスベクターは、複製不能のものと複製可能のものの両方ともを含む。複製不能組み換えウィルスベクターは、癌細胞または正常細胞に導入された後、癌細胞でのみ特異的に治療学的トランス遺伝子を発現することにより、癌を治療することができるが、これに対し、複製可能組み換えウィルスベクターは、ウィルスの複製による細胞殺傷効果および治療学的トランス遺伝子の発現による細胞殺傷効果が共に誘導されることにより、抗癌効果が倍加できる。さらに、本発明は、別の様態として、hTERTプロモーターに一つ以上のc−Myc結合部位および/または一つ以上のSp1結合部位を含む核酸配列が連結された転写調節配列が治療学的トランス遺伝子に作動可能に連結された組み換え非ウィルスベクターを提供する。このような非ウィルスベクターは、癌細胞または正常細胞に導入された後、癌細胞でのみ特異的に治療学的トランス遺伝子を発現することにより、癌を治療することができる。
【0027】
本発明の明細書において、用語「ウィルス」は、「ウィルスベクター」と同一に使用されており、蛋白質合成またはエネルギー生成メカニズムを持っていない絶対的な細胞内寄生物質(obligate intracellular parasite)を総称する。ウィルスゲノムは、脂質膜からなる蛋白質成分のコーティング構造体内に含有されたRNAまたはDNAである。本発明の実施に有用なウィルスの例としては、バキュロビリジアエ(baculoviridiae)、パルボビリジアエ(parvoviridiae)、ピコルノビリジアエ(picornoviridiae)、ヘルペスビリジアエ(herpesviridiae)、ポックスビリジアエ(poxviridiae)、アデノビリジアエ(adenoviridiae)、ピコトルナビリジアエ(picotrnaviridiae)などが挙げられる。用語「組み換えウィルス」は、キメラウィルス(またはマルチマウィルス)、すなわち一つ以上のウィルスサブタイプから由来した相補的なコード配列を用いて作製されたベクターを含む(Feng et al. Nature Biotechnology, 15, 866-870)。
【0028】
本発明の明細書において、用語「非ウィルスベクター」は、前述したウィルスベクターを除いた、通常遺伝子治療療法で使用される全てのベクターを意味し、そのような例には、真核細胞で発現可能な各種プラスミッドおよびリポソームなどがある。
【0029】
本発明の明細書において、用語「作動可能に連結された(operably linked)」は、核酸配列間の結合が機能的に連関していることを意味する。任意の核酸配列が作動可能に連結される場合は、任意の核酸配列が他の核酸配列と機能的に関連性を持つように位置している場合である。本発明において、任意の転写調節配列が任意の遺伝子の転写に影響を及ぼす場合、前記転写調節配列が前記遺伝子と作動可能に連結されているという。
【0030】
本発明の明細書において、用語「ウィルスの複製に必要な遺伝子」はウィルスのゲノムを構成する全ての遺伝子を意味し、これらは初期遺伝子と後期遺伝子に分類される。初期遺伝子は、ウィルス増殖過程の初期、特にウィルスゲノムの複製が開始されるまでの間に発現が始まるウィルス遺伝子であって、ウィルスゲノムの複製に関係する。初期遺伝子中のあるものは、宿主細胞のメカニズムをそのまま利用してその情報がRNAに転写されるが、あるものは初期遺伝子産物の一部が生成されなければ転写されない。このように初期遺伝子の中でも漸進的な情報発現が起こり、特にウィルスの感染後に宿主酵素によって直ちに転写される遺伝子を前初期遺伝子(very early gene)とも呼ぶ。後期遺伝子は、宿主細胞にウィルスが感染するとき、ウィルスゲノムの複製が開始された後に発現されるウィルス遺伝子であって、外殻蛋白質の構造を決定する遺伝子である。
【0031】
本発明の明細書において、用語「治療学的トランス遺伝子(therapeutic transgene)」は、癌細胞内で発現されて治療学的効果を示すヌクレオチド配列を意味し、腫瘍抑制因子遺伝子、免疫調節遺伝子(サイトカイン遺伝子、ケモカイン遺伝子、補助刺激因子(costimulatory factor)(B7.1やB7.2などのT細胞活性に必要な補助分子)、抗原性遺伝子、細胞毒性遺伝子、細胞増殖抑制遺伝子、親−細胞死滅遺伝子および抗−新生血管生成遺伝子などを含み、これらに限定されるものではない。
【0032】
本発明の明細書において、用語「腫瘍抑制因子遺伝子(tumor suppressor gene)」は、標的細胞内で発現されて腫瘍表現型を抑制することができあるいは細胞死滅を誘導することができるヌクレオチド配列を意味する。本発明の実施に有用な腫瘍抑制因子遺伝子には、p53遺伝子、Rb遺伝子、APC遺伝子、DPC−4/Smad4遺伝子、BRCA−1遺伝子、BRCA−2遺伝子、WT−1遺伝子、網膜芽細胞腫遺伝子(Lee et al., Nature, 1987, 329,642) 、MMAC−1遺伝子、大腸線種様ポリポーシス蛋白質(adenomatous polyposis coli protein) (Albertsen et al., 米国特許公報US5,783,666号)、欠損した結腸腫瘍(DCC)遺伝子、MMSC−2遺伝子、NF−1遺伝子、染色体3p21.3に位置した鼻咽喉腫瘍抑制因子遺伝子(Cheng et al., Proc. Nat’l. Acad. Sci., 1998, USA 95,3042-3047)、MTS1遺伝子、CDK4遺伝子、NF−1遺伝子、NF−2遺伝子およびVHL遺伝子が含まれる。
【0033】
本発明の明細書において、用語「抗原性遺伝子(antigenic gene)」は、標的細胞内で発現されて免疫システムで認識できる細胞表面抗原性蛋白質を生産するヌクレオチド配列を意味する。このような抗原性遺伝子の例には、癌胎児性抗原(carcinoembryonic antigen、CEA)、PSA(prostate specific antigen)、AFP(a-feto protein)、p53(Levine, A. 国際特許出願公開WO94/02167号)が含まれる。免疫システムが容易に認識するようにするため、前記抗原性遺伝子をMHC第I型抗原に結合させることができる。
【0034】
本発明の明細書において、用語「細胞毒性遺伝子(cytotoxic gene)」は、細胞内で発現されて毒性効果を示すヌクレオチド配列を意味する。このような細胞毒性遺伝子の例には、シュードモナス外毒素(exotoxin)、リシン毒素、ジフテリア毒素などをコードするヌクレオチド配列が含まれる。
【0035】
本発明の明細書において、用語「細胞増殖抑制遺伝子(cytostatic gene)」は、細胞内で発現されて細胞周期途中で細胞周期を停止させるヌクレオチド配列を意味する。このような細胞増殖抑制遺伝子の例には、p21、網膜芽細胞腫遺伝子、E2F−Rb融合蛋白質遺伝子、サイクリン依存性キナーゼインヒビターをコードする遺伝子(例えばp16、p15、p18およびp19)、成長中止特異性ホメオボックス(growth arrest specific homeobox、GAX)遺伝子(国際特許出願公開WO97/16459号およびWO96/30385号)などがあり、これらに限定されるものではない。
【0036】
本発明の明細書において、「サイトカイン遺伝子(cytokine)」は、細胞内で発現されてサイトカインを生成するヌクレオチド配列を意味する。このようなサイトカインの例には、GM−CSF、インターロイキン(特に、IL−1、IL−2、IL−4、IL−12、IL−10、IL−19、IL−20)、インターフェロンα、β、γ(特に、インターフェロンα−2b)およびインターフェロンα−2α−1のような融合体などが含まれる。
【0037】
本発明の明細書において、用語「ケモカイン遺伝子(chemokine gene)」は、分裂促進活性、化学走性活性または炎症活性を有する細胞から放出される、構造的に関連性のある低分子量のサイトカイングループを意味する。主に、これらは4つの保存されたシステイン残基を共有する70〜100個のアミノ酸残基からなる陽イオン性蛋白質である。これらの蛋白質は、2つのアミノ末端システインの間隔を基準として2つのグループに区分することができる。第1グループでは1つの残基(cys−x−cys)だけ離れており、第2グループでは直接隣接している(cys−cys)。「cys−x−cysケモカイン」グループに属する蛋白質は、血小板因子4(PF4)、血小板基本蛋白質(PBP)、インターロイキン−8(IL−8)、黒色腫成長刺激活性蛋白質(MGSA)、マクロファージ炎症性蛋白質2(MIP−2)、マウスのMig(m119)、鶏の9E3(またはpCEF−4)、豚の肺胞マクロファージ化学走性因子IおよびII(AMCF−Iおよび−II)、前駆B細胞成長促進因子(PBSF)およびIP10などが例示され、これらに限定されるものではない。「C−Cケモカイン」グループに属する蛋白質は、単核球化学走性蛋白質1(MCP−1)、単核球化学走性蛋白質2(MCP−2)、単核球化学走性蛋白質3(MCP−3)、単核球化学走性蛋白質4(MCP−4)、マクロファージ炎症性蛋白質1α(MIP−1α)、マクロファージ炎症性蛋白質1β(MIP−1β)、マクロファージ炎症性蛋白質1γ(MIP−1γ)、マクロファージ炎症性蛋白質3α(MIP−3α)、マクロファージ炎症性蛋白質3β(MIP−3β)、ケモカイン(ELC)、マクロファージ炎症性蛋白質4(MIP−4)、マクロファージ炎症性蛋白質5(MIP−5)、LD78β、RANTES、SIS−エプシロン(p500)、TARC(thymus and activation-regulated chemokine)、エオタキシン、I−309、ヒト蛋白質HCC−1/NCC−2、ヒト蛋白質HCC−3、マウス蛋白質C10などが例示され、これらに限定されるものではない。
【0038】
本発明の明細書において、用語「親−細胞死滅遺伝子(pro-apoptotic gene)」は、発現され、プログラムされた細胞消滅を誘導するヌクレオチド配列を意味する。このような親−細胞死滅遺伝子の例には、p53、アデノウィルスE3−11.6K(Ad2およびAd5由来)またはアデノウィルスE3−10.5K(Ad由来)、アデノウィルスE4遺伝子、Fas ligand、TNF−α、TRAIL、p53経路遺伝子、およびカスパーゼをコードする遺伝子が含まれる。
【0039】
本発明の明細書において、用語「抗−新生血管生成遺伝子(anti-angiogenic gene)」は、発現されて抗−新生血管生成因子を細胞の外に放出するヌクレオチド配列を意味する。抗−新生血管新生因子には、アンギオスタチン、Tie2(PNAS, 1998, 95,8795-800)のような血管内皮成長因子(VEFG)の抑制因子、エンドスタチンなどが含まれる。
【0040】
上述したように、本発明に係る転写調節配列は、遺伝子ビヒクルとして通常用いられるウィルスベクターまたは非ウィルスベクターに導入できるが、アデノウィルスベクターが遺伝子ビヒクルとして適したものと認識されており、実際、その使用頻度が増加している。よって、本発明に係る転写調節配列は、アデノウィルスベクターに導入することが特に好ましい。したがって、本発明は、hTERTプロモーターに一つ以上のc−Myc結合部位および/または一つ以上のSp1結合部位を含む核酸配列が連結された転写調節配列がアデノウィルスの複製に必要な遺伝子に作動可能に連結された組み換えアデノウィルスベクターを提供する。
【0041】
本発明の明細書において、用語「複製可能アデノウィルスベクター」は、複製に必ず必要な遺伝子が保存されたアデノウィルスベクターを意味し、これらは、癌細胞内で自分を複製して細胞を殺傷することにより、癌を治療することができる。別の用語「複製不能アデノウィルスベクター」は、複製に必ず必要な、特に感染の初期段階に必要な遺伝子が除去されたアデノウィルスベクターを意味するが、これらは、主に治療学的トランス遺伝子を含んでおり、癌細胞でこれらを発現することにより癌を治療することができる。ところが、前述したように、本発明は、治療学的トランス遺伝子を含むと共に、複製可能なウィルスベクターを含む。すなわち、本発明の明細書において、複製不能アデノウィルスベクターとは、治療学的トランス遺伝子を含むアデノウィルスベクターの一様態として提供された複製不能アデノウィルスベクターを意味する。
【0042】
本発明の明細書において、用語「アデノウィルス」は、「アデノウィルスベクター」と同一に使用されており、「アデノビリジアエ」属に属するウィルスを意味する。用語「アデノビリジアエ」は、「マストアデノウィルス(Mastadenovirus)」属の動物性アデノウィルス(ヒト、牛、羊、馬、犬、豚、マウスおよび猿のアデノウィルス亜属を含み、これらに限定されるものではない。)を総体的に呼ぶ。特に、ヒトのアデノウィルスは、A−F亜属(subgenera)およびこの個々の血清型を含み、A−F亜属は、ヒトのアデノウィルス第1型、第2型、第3型、第4型、第4a型、第5型、第6型、第7型、第8型、第9型、第10型、第11型(Ad11AおよびAd11P)、第12型、第13型、第14型、第15型、第16型、第17型、第18型、第19型、第19a型、第20型、第21型、第22型、第23型、第24型、第25型、第26型、第27型、第28型、第29型、第30型、第31型、第32型、第33型、第34型、第34a型、第35型、第35p型、第36型、第37型、第38型、第39型、第40型、第41型、第42型、第43型、第44型、第45型、第46型、第47型、第48型および第91型を含み、これらに限定されるものではない。本発明の好適な様態におけるアデノウィルスは、ヒトのアデノウィルス第2または第5血清型(serotype)から由来したものである。
【0043】
アデノウィルスの血清型によって若干の差異はあるが、一般に、アデノウィルスゲノムは、E1A、E1B、E2、E3およびE4を含んだ初期遺伝子と、L1、L2、L3、L4およびL5を含んだ後期遺伝子からなっている。初期遺伝子において、E1A遺伝子は、ウィルス感染し次第(0−2h)、その他のウィルス遺伝子に先立って発現される。E1A蛋白質は、転写調節因子(transcriptional regulatory factor)として作用し、その他の初期遺伝子の発現に必ず必要である。E1A遺伝子の欠失は、ウィルスDNA複製に必要な遺伝子産物が生産できないため、ウィルスの感染が行われない。E1B蛋白質は、後期遺伝子mRNAを核から細胞質に移動させるのに必須的である。E1B発現の欠陥は、ウィルス後期遺伝子の微々たる発現と宿主細胞蛋白質合成の不完全な遮断に繋がる。E4遺伝子は、多数の転写産物を含んでいるが、E4転写単位(transcriptional unit)のオープンリーディングフレーム(open reading frame)3および6は、E1Bの55kD蛋白質とE2F−1およびDR−1からなる異種二量体(heterodimer)の結合による主要後期転写単位mRNA(late transcriptional unit mRNA)の蓄積を増加させる。オープンリーディングフレーム3および6から由来した蛋白質に欠陥があれば、プラーク(plaque)は、野生型ウィルスのそれより10−6以下の効率で生産される。L1、L2、L3、L4およびL5を含んだ後期遺伝子は、アデノウィルスの構造蛋白質を暗号化している。
【0044】
初期遺伝子および後期遺伝子はいずれもアデノウィルスの効率的な複製に必要である。したがって、本発明は、一様態として、hTERTプロモーターに一つ以上のc−Myc結合部位および/または一つ以上のSp1結合部位を含核酸配列が連結された転写調節配列がアデノウィルスの初期遺伝子および後期遺伝子の少なくとも一つに作動可能に連結されたアデノウィルスベクターを含む。初期遺伝子および後期遺伝子の中でも、特に初期遺伝子がウィルスゲノムの複製に関与するので、本発明は、より好適な様態として、hTERTプロモーターに一つ以上のc−Myc結合部位および/または一つ以上のSp1結合部位を含む核酸配列が連結された転写調節配列がアデノウィルスの初期遺伝子に作動可能に連結されたアデノウィルスベクターを提供する。初期遺伝子の中でも、特にE1A遺伝子は、転写因子であって、その結合によってその他のウィルス遺伝子が発現されるので、ウィルスの複製には最も重要な要素であると言える。したがって、本発明は、更に好適な様態として、hTERTプロモーターに一つ以上のc−Myc結合部位および/または一つ以上のSp1結合部位を含む塩基配列が連結された転写調節配列がアデノウィルスのE1A遺伝子に作動可能に連結された組み換えアデノウィルスベクターを提供する。
【0045】
本発明に係る転写調節配列がアデノウィルスの複製に必要な遺伝子に作動可能に連結された組み換えアデノウィルスベクターは、c−Myc発癌蛋白質またはSp1蛋白質の存在によってテロメラーゼが活性化された癌細胞内に流入された後、自分を高効率で増殖することにより癌細胞を殺傷する反面、正常細胞に流入されたアデノウィルスベクターは、増殖が殆ど不可能なので、細胞にあまり影響を及ぼさない。
【0046】
このようにウィルス増殖によって癌細胞を殺傷する組み換えアデノウィルスベクターに関連したより好適な様態は、E1B19kD遺伝子の欠失した組み換えアデノウィルスベクターを用いる。E1B19kDa蛋白質は、強力なアポトーシス(apoptosis)抑制剤であって、アデノウィルスの初期発現遺伝子E1Aによって誘導されるアポトーシスを抑制し、ヒトの各種主要細胞においてp53によって誘導されるアポトーシスも抑制する。また、成長因子の除去、放射線治療または抗癌剤によって誘導されるアポトーシスを抑制するにおいても、E1B19kD蛋白質はBcl−2と機能的に同じ役割をすることができる。したがって、E1B19kD遺伝子の欠失した組み換えアデノウィルスは、ウィルス増殖によるアポトーシスだけでなく、感染した細胞内でアポトーシスを共に誘発して効率よく癌細胞を殺傷させ、周囲癌細胞に拡散する効果も卓越である。これにより、前記組み換えアデノウィルスベクターは、癌細胞で特異的に高効率にて増殖して癌細胞のみを選択的に殺傷する能力が一層優れている。
【0047】
アデノウィルスの増殖による癌細胞の殺傷だけでなく、アデノウィルスベクターに治療学的トランス遺伝子をクローニングし、これを癌細胞で発現させることにより、癌を治療することもできる。したがって、本発明は、hTERTプロモーターにc−Myc結合部位および/またはSp1結合部位を含む核酸配列が連結された転写調節配列が治療学的トランス遺伝子に作動可能に連結された組み換えアデノウィルスベクターを提供する。前記治療学的トランス遺伝子は、癌細胞では特異的に高効率にて発現することができるが、正常細胞では発現が不可能なので、細胞毒性や副作用を誘発しない。
【0048】
通常、治療学的トランス遺伝子は、アデノウィルスのE1遺伝子またはE3遺伝子の代わりに導入できる。したがって、本発明は、一様態として、前記転写調節配列がアデノウィルスのE1遺伝子の代わりに導入された治療学的トランス遺伝子に作動可能に連結された複製不可能な組み換えアデノウィルスベクターを提供する。このような組み換えアデノウィルスベクターは、ウィルスの複製に必須的なE1遺伝子が欠失しているので、ウィルスの複製は不可能であり、単に治療学的トランス遺伝子の発現によって腫瘍が治療できる。また、本発明は、別の様態として、前記転写調節配列がアデノウィルスのE3遺伝子の代わりに導入された治療学的トランス遺伝子に作動可能に連結された複製可能な組み換えアデノウィルスベクターを提供する。このような組み換えアデノウィルスベクターは、複製可能なので、アデノウィルスの複製による細胞殺傷効果と治療学的トランス遺伝子の発現による細胞殺傷効果が共に誘導されて抗腫瘍効果が倍加できる。しかし、E1およびE3遺伝子の欠失したアデノウィルスが、他のベクターとは対照的に、相当高い遺伝子伝達効率を有しかつ広いスペクトルの細胞類型でトランス遺伝子を発現するため、好適な様態は、アデノウィルスとして、E1およびE3遺伝子の欠失した複製不能のアデノウィルスベクターを使用することである。したがって、本発明は、前記転写調節配列がE1A遺伝子の代わりに導入された治療学的トランス遺伝子に作動可能に連結され、E1およびE3遺伝子の欠失した組み換えアデノウィルスベクターを提供する。
【0049】
前述した組み換えベクターを製造するためには、これらを適切な宿主細胞に導入しなければならない。したがって、本発明は、前記組み換えウィルスベクターまたは非ウィルスベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。ベクターを宿主細胞に導入する好適な方法には、例えば、リン酸カルシウム形質転換(calcium phosphate transfection)、DAEA−デキストラン媒介形質転換(DAEA-dextran mediated transfection)、罹患(transvection)、 微量注入(microinjection)、陽イオン脂質−媒介形質転換(cationic lipid-mediated transfection)、 電気穿孔(electroporation)、形質導入(transduction)、 スクレイプローディング(scrape loading)、バリスティック導入(ballistic introduction)あるいは感染(infection)などが含まれる。一方、宿主細胞は組み換えベクターによって選択可能であり、好適な宿主細胞は当業界に公知されている。
【0050】
本発明において、組み換えアデノウィルスベクターは、hTERTプロモーターにc−Myc結合部位またはSp1結合部位を含む核酸配列が連結された転写調節配列を含有するシャトルベクターを作製し、前記シャトルベクターをアデノウィルスベクターと遺伝子相同組み換えさせ、これにより得られた組み換えアデノウィルスプラスミドを適切な細胞に形質転換またはトランスフェクトさせることにより生産される。
【0051】
hTERTプロモーターにc−Myc結合部位またはSp1結合部位を含む核酸配列が連結された転写調節配列を含むシャトルベクターを製作するときに使用されるプラスミドは、原核性であれ真核性であれ、公知または市販されているいずれも使用可能である。また、組み換えアデノウィルスを生産するための組み換えプラスミドの宿主細胞も当業者によく知られており、代表的な例としてはAd5のヌクレオチド1−4344によって形質転換されたヒト胚腎細胞株293(E1A/B+)およびAd5のヌクレオチド79−5789を含有したヒト胚網膜母細胞腫細胞911が含まれる。
【0052】
本発明に係る組み換えウィルスベクターまたは非ウィルスベクターは、様々な癌細胞、特にテロメラーゼが活発に発現される肝癌細胞、肺癌細胞、子宮頚部癌細胞および脳腫瘍細胞を含む癌細胞のみ特異的に高効率で殺傷することができる。したがって、本発明は、これらを活性成分として含む薬剤学的組成物を提供しようとする。
【0053】
本発明は、(a)hTERTプロモーターに一つ以上のc−Myc結合部位および/または一つ以上のSp1結合部位を含む核酸配列が連結された転写調節配列がウィルスの複製に必要な遺伝子に作動可能に連結された組み換えウィルスベクターの治療学的有効量、および(b)薬剤学的に許容される担体を含む薬剤学的組成物を提供する。このような本発明の薬剤学的組成物は、これに含まれる組み換えウィルスベクターが上述したように様々な癌細胞に対して殺傷効能を示すので、腫瘍と関連した様々な疾病または疾患、例えば胃癌、肺癌、卵巣癌、肝癌、気管支癌、鼻咽頭癌、喉頭癌、膵臓癌、膀胱癌、結腸癌および子宮頚部癌などの治療に利用できる。
【0054】
本発明は、(a)hTERTプロモーターに一つ以上のc−Myc結合部位および/または一つ以上のSp1結合部位を含む核酸配列が連結された転写調節配列が治療学的トランス遺伝子に作動可能に連結された組み換えウィルスベクターの治療学的有効量、および(b)薬剤学的に許容される担体を含む薬剤学的組成物を提供する。このような本発明の薬剤学的組成物は、これに含有された組み換えウィルスベクターに導入された治療学的トランス遺伝子が癌細胞内で発現されることにより、例えば、黒色腫、乳癌、肺癌、神経母細胞腫、腎細胞腫、卵巣癌、脳腫瘍、頭頚部腫瘍、卵巣癌および中皮腫などの様々な癌の治療に利用できる。
【0055】
前述した薬剤学的組成物に関する好適な様態は、ウィルスベクターとしてアデノウィルスベクターを用いることである。したがって、本発明は、(a)hTERTプロモーターに一つ以上のc−Myc結合部位および/または一つ以上のSp1結合部位を含む核酸配列が連結された転写調節配列がウィルスの複製に必要な遺伝子に作動可能に連結された組み換えアデノウィルスベクターの治療学的有効量、および(b)薬剤学的に許容される担体を含む薬剤学的組成物を提供する。また、本発明は、(a)hTERTプロモーターに一つ以上のc−Myc結合部位および/または一つ以上のSp1結合部位を含む核酸配列が連結された転写調節配列が治療学的トランス遺伝子に作動可能に連結された組み換えアデノウィルスベクターの治療学的有効量、および(b)薬剤学的に許容される担体を含む薬剤学的組成物を提供する。
【0056】
本発明は、(a)hTERTプロモーターに一つ以上のc−Myc結合部位および/または一つ以上のSp1結合部位を含む核酸配列が連結された転写調節配列が治療学的トランス遺伝子に作動可能に連結された非ウィルスベクターの治療学的有効量、および(b)薬剤学的に許容される担体を含む薬剤学的組成物を提供する。
【0057】
本明細書において、用語「治療」は、疾病または疾患の完治、抑制および軽減を意味する。したがって、本明細書において、用語「治療学的有効量」は、前述した薬理学的効果の達成に十分な量を意味する。
【0058】
本発明の組成物に含まれる薬剤学的に許容される担体は、製剤の際に通常用いられるものであって、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギン酸塩、ゼラチン、珪酸カルシウム、微細結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、滑石、ステアリン酸マグネシウムおよびミネラルオイルなどを含むが、これらに限定されるものではない。本発明の薬剤学的組成物は、前記成分ら以外に潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などをさらに含んでもよい。
【0059】
本発明の薬剤学的組成物は、遺伝子療法で通常用いられる経路によって投与でき、非経口投与が好ましく、例えば静脈内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、皮下投与または局部投与を用いて投与することができる。例えば、卵巣癌において腹腔内投与を行う場合、および肝癌において門脈投与を行う場合には注入方法を採用することができ、乳癌および頭頚部癌の場合には腫瘍マスに直接注射して投与することができ、結腸癌の場合には灌腸に直接注射して投与することができ、膀胱癌の場合にはカテーテル内に直接注射して投与することができる。本発明では、静脈内投与、腹腔内投与または腫瘍内投与が特に好ましい。
【0060】
本発明の薬剤学的組成物の適合な投与量は、製剤化方法、投与方法、患者の年齢、体重、性、疾病症状の程度、飲食、投与時間、投与経路、排泄速度および反応感応性などの要因によって異なり、普通熟練した医師は、所望の治療に効果的な投与量を容易に決定および処方することができる。例えば、本発明の薬剤学的組成物は1×105〜1×1015PFU/mLの組み換えアデノウィルスを含み、通常、組み換えアデノウィルスは約1×1010PFUを二日に1回ずつ2週間にわたって注射する。
【0061】
本発明の組み換えベクターを含有した薬剤学的組成物は、本発明の属する技術分野で通常の知識を有する者が容易に実施しうる方法によって、薬剤学的に許容される担体および/または賦形剤を用いて製剤化されることにより、単位容量の形で製造でき、あるいは多容量容器内に内入して製造できる。この際、剤型は、オイルまたは水性媒質中の溶液、懸濁液または乳化液の形であり、あるいはエキス剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤またはカプセル剤の形であってもよく、分散剤または安定化剤をさらに含んでもよい。
【0062】
本発明の組み換えベクターを含有した薬剤学的組成物は、単独の療法で利用できるが、他の通常の化学療法または放射療法と共に利用でき、このような並行療法を行う場合には、より効果的に癌治療を行うことができる。本発明の組成物と共に利用できる化学療法剤は、シスプラチ(cisplatin)、 カルボプラチン(carboplatin)、プロカルバジン(procarbazine)、メクロレタミン(mechlorethamine)、シクロホスファミド(cyclophosphamide)、イホスファミド(ifosfamide)、メルファラン(melphalan)、クロラムブシル(chlorambucil)、ブスルファン(busulfan)、ニトロソウレア(nitrosourea)、ダクチノマイシン(dactinomycin)、ダウノルビシン(daunorubicin)、ドキソルビシン(doxorubicin)、ブレオマイシン(bleomycin)、プリコマイシン(plicomycin)、マイトマイシン(mitomycin)、エトポシド(etoposide)、タモキシフェン(tamoxifen)、タクソール(taxol)、トランスプラチナム(transplatinum)、5−フルオロウラシル(5-fluorouracil)、ビンクリスチン(vincristin)、ビンブラスチン(vinblastin)およびメトトレキサート(methotrexate)などを含む。本発明の組成物と共に利用できる放射療法は、X線照射およびγ線照射などである。
【0063】
本発明の組み換えベクターを含有した薬剤学的組成物は、室温における安定性を増加させ、高い低温貯蔵の必要性を減らし、貯蔵寿命(shelf-life)を延長するために凍結乾燥させることができる。凍結乾燥工程は、凍結、1次乾燥および2次乾燥の連続段階からなる。組成物を凍結させた後、圧力を降下させ、組成物を水蒸気の昇華のために加熱する。2次乾燥段階では、乾燥物から吸収された残余水分を蒸発させる。
【0064】
一様態として、本発明に係る薬剤学的組成物の凍結乾燥方法は、次の順序とおりである。(1)凍結乾燥顕微鏡分析法を用いて製剤の崩壊温度(collapse temperature)を決定する(Pikal, M. J. et al. Int. J. Pharm., 1990, 62, 165-186)。(2)バイアルを室温下の凍結−乾燥機の棚に置き、以後に−1℃で約30分間平衡化させる。(3)棚を−55℃に冷却させ、この温度を2時間維持する。(4)約−32℃の生成物温度または崩壊温度より5℃低い温度で1次乾燥を行う。(5)35℃で2次乾燥を行う。チャンバーの圧力を55〜120mmHgに調節した後、乾燥を完成する。(6)凍結乾燥機の真空下でバイアルを栓で塞ぎ、凍結乾燥したバイアルをクリンプシールして2℃〜8℃で保存する。
【0065】
凍結乾燥した製剤には、賦形剤(excipients)および凍結乾燥保護剤(lyoprotectant)が含まれる。賦形剤は、これらに限定されるものではないが、0.9%NaClと10mMリン酸ナトリウム(pH7.0)または10mMクエン酸ナトリウム(pH7.0)の緩衝液を含む。凍結乾燥保護剤は、凍結および乾燥工程中に生物学的分子を保護し、最終産物に機械性(mechanical support)を与える役割をし、その例としては、PBS(pH7.0)、PBS/4%、12%または15%トレロースなどを挙げることができる。
【0066】
(実施例1)
対象癌細胞株と正常細胞株およびこれらの培養
本発明で使用された細胞株は、人体肝癌細胞株(SK−Hep1、Hep3B、HepG2)、脳癌細胞株(U251N、U343)、肺癌細胞株(A549、H460)、子宮頚部癌細胞株(C33A、HeLa)、乳癌細胞株(MCF7)などの癌細胞株と人体正常細胞株(173We、CBHEL、MRC5、WI38、IMR90、BJ)であり、全てATCC(American Type Culture Collection)から購入した。前記細胞株はいずれも、10%の牛胎児血清(GIBCO BRL、NY)が含有されたDMEM培地(GIBCO BRL、NY)を培養液として抗生剤のフェニシリン/ストレプトマイシン(GIBCO BRL、NY)を添加して5%CO2、37℃の恒温培養器で培養した。
【0067】
(実施例2)
本発明で使用された細胞株の内在テロメラーゼの活性度測定
各細胞株の内在テロメラーゼの活性度測定は、TRAPEZE ELISA(enzyme linked immunosorbent assay)テロメラーゼ検出キット(Oncor、Gaithsberg、MD)を利用し、測定方法は、製造会社の提示方法によって行われた。まず、1×106個の細胞を200Lの冷たい細胞溶解用(lysis)溶液で溶解させた後、10,000×gで15分間遠心分離して細胞抽出液を分離し次第、直ちに−80℃で保管した。細胞抽出液中の蛋白質の濃度は、蛋白分析キット(Bio−Rad、Hercules、CA)によって定量した後、同量の蛋白質を次のTRAP検定(telomeric repeat amplification protocol assay)に利用した。100ngの細胞抽出液と10μlの5×TRAP反応混合物(reaction mix)および2単位のTaqポリメラーゼを添加して50μlの反応液を作った後、TRAP延長(extension)のために常温で30分間反応させてからPCRを行った。PCR反応は、94℃で30秒、55℃で30秒間33回繰り返し行い、各サンプルのテロメラーゼ活性を調べるために、PCR産物をELISAによって450nmおよび650nmで吸光度を測定した。全ての実験は、3回以上繰り返し行い、その平均値を求めた。
【0068】
図3に示すように、MCF−7乳癌細胞株を除いた全ての癌細胞株、すなわち肝癌(Hep3B、SK−Hep1、HepG2)、肺癌(H460、A5409)、子宮頚部癌(C33A、HeLa)、脳癌(U251N)ではテロメラーゼ活性が高いが、173We、BJ、IMR90、WI38のような正常細胞ではその活性が殆ど観察されなかった。
【0069】
(実施例3)
hTERTプロモーターおよびm−hTERTプロモーターの製造
hTERTプロモーターを製造するために、正常胚細胞であるMRC5細胞株からゲノムDNA(genomic DNA)を抽出した後、下記のプライマーセットを用いて2つのc−Myc結合部位および5つのSp1結合部位が存在するhTERTプロモーターをPCR増幅した。センスプライマーは、5'−cccaaagcttaggccgattcgagatctctcc−3'(配列番号11)であって、クローニング上の便宜のために、PvuII制限酵素部位を挿入し(下線部分)、アンチセンスプライマーは、5'−gaattcaagctt cgcggggtg gccggggcc−3'(配列番号12)であって、EcoRIとHindIII制限酵素部位が含まれている(下線部分)。MRC5のゲノムDNAを鋳型としてPCRを行った後、生成されたサイズ447bpの産物をBglIIとHindIII制限酵素で処理した後、アルカリ性ホスファダーゼ(alkaline phosphatase)酵素を発現するpSEAP−basicベクター(Clontech、Palo Alto、CA)に挿入してpSEAP−TERTを製造した。
【0070】
hTERTプロモーターに1つのc−Myc結合部位および5つのSp1結合部位をさらに含ませたm−hTERTプロモーター(配列番号13:図1)を製造するために、2つのc−Myc結合部位および5つのSp1結合部位が存在する野生型hTERTプロモーターに、1つのc−Myc結合部位および5つのSp1結合部位が入っているhTERTプロモーターを結合させた。このため、まず1つのc−Myc結合部位および5つのSp1結合部位が含まれたpGL2−hTERTベクターをEcoRIとHindIIIで切断した後、同種の制限酵素で処理されたpSEAP−TERTに挿入してpSEAP−mTERTを製造した。
【0071】
(実施例4)
組み換えアデノウィルスの製造および生産
A.複製不能組み換えアデノウィルスdl−CMV−LacZ、dl−TERT−Zおよびdl−mTERT−Zの製造および生産
CMVプロモーターによってLacZ遺伝子の発現が調節されるE1アデノウィルスシャトルベクターを製造するために、LacZを発現するpcDNA−hygro−LacZ(CMVプロモーターによって調節されるLacZ)プラスミドからCMVプロモーター、LacZおよびpolA部位をHindIIIとNaeIで処理して分離した後、これをE1アデノウィルスシャトルベクターpΔE1SP1Aに挿入してpΔE1SP1A/CMV−lazZシャトルベクターを製造した。
【0072】
hTERTプロモーターおよび前記プロモーターにc−Myc結合部位およびSp1結合部位を含んだm−hTERTプロモーターによってLacZの発現が調節されるベクターを製造するために、pSEAP−TERTとpSEAP−mTERTプラスミドからBalIIとEcoRIを用いてhTERTプロモーターとm−hTERTプロモーターを分離した後、これらをBamHIとEcorIで処理し、CMVプロモーターの除去されたpΔE1SP1A/LacZに挿入してpΔE1SP1A/TERT−LacZとpΔE1SP1A/mTERT−LacZシャトルベクターをそれぞれ製造した。
【0073】
製造されたそれぞれのシャトルベクターは、XmnI制限酵素で切断した後、BstBI制限酵素で処理して1本鎖になったアデノウィルスdl324BstB1(SwissのFribourgh大学のVerca博士から得る)と共に大腸菌BJ5183で同時に形質転換させて遺伝子相同組み換えを誘導した。相同組み換えの行われたプラスミドDNAは、PacI制限酵素で処理した後、293細胞株に形質転換してdl−CMV−Z、dl−TERT−Zおよびdl−mTERT−Z組み換えアデノウィルスを生産した(図2A)。組み換えアデノウィルスdl−mTERT−Zは、ブダペスト協約の下にKCCM(Korean Culture Center of Microorganisms)に2003年2月20日付で寄託番号KCCM−10471にて国際寄託された。
【0074】
B.複製可能組み換えアデノウィルスAd−TERT−Δ19およびAd−mTERT−Δ19の製造および生産
hTERTとm−hTERTそれぞれのプロモーターによってアデノウィルスの複製が調節されるアデノウィルスを製造するために、E1B19kD部位の欠損した複製可能アデノウィルスAd−ΔE1B19を鋳型アデノウィルスプラスミドとして使用した。まず、pSEAP−TERTとpSEAP−mTERTからBglIIとEcoRIを用いてhTERTプロモーターとm−hTERTプロモーターを分離し、BamHIとEcoRIで前処理されたpΔE1SP1A/ΔE1B19にそれぞれ挿入してpΔE1SP1A/hTERT−ΔE1B19とpΔE1SP1A/mTERT−ΔE1B19シャトルベクターをそれぞれ製造した。
【0075】
製造されたシャトルベクターは、XmnI制限酵素で処理した後、BstBI制限酵素で処理して1本鎖になったAd−ΔE1B19と共に大腸菌BJ5183で同時に形質転換させて遺伝子相同組み換えを誘導し、Ad−TERT−Δ19とAd−mTERT−Δ19複製可能アデノウィルスを製造した(図2B)。組み換えアデノウィルスの生産、濃縮および力価の決定は293細胞株で行った。組み換えアデノウィルスAd−mTERT−Δ19は、ブダペスト協約の下にKCCM(Korean Culture Center of Microorganisms)に2003年2月20日付で寄託番号KCCM−10470にて国際寄託された。
【0076】
(実施例5)
複製不能組み換えアデノウィルスの遺伝子発現様相の究明
hTERTプロモーター及びm−hTERTプロモーターによる遺伝子発現が細胞内テロメラーゼの活性程度と関連があるかを検証するために、標識遺伝子として、LacZを発現する複製不能組み換えアデノウィルスdl−CMV−Z、dl−TERT−Zおよびdl−mTERT−Zを用いて様々な癌細胞でのLacZ遺伝子の発現様相を評価した。24−ウェルプレートに2×105個の癌細胞(C33A、U251N、MCF−7)と正常細胞(WI38、173We)をそれぞれ分注した後、翌日β−ガラクトシダーゼ(galactosidase)を発現するdl−CMV−Z、dl−TERT−Zまたはdl−mTERT−ZアデノウィルスをMOI50で感染させ、二日後にX−gal染色を行った。β−galの活性は、固定液(1%ホルムアルデヒド、0.2%グルタルアルデヒドin H2O-)で5分間細胞を固定させた後、染色溶液(0.4mg/ml X−gal、4mMフェリシアン化カリウム、4mMフェロシアン化カリウム、2mM MgCl2 in PBS)を用いて37℃で4〜16時間反応させて観察した。
【0077】
図4に示すように、CMVプロモーターの場合は、細胞内のテロメラーゼ活性と関係なく、本発明で用いられた全ての細胞株でLacZ発現を強く誘導することにより、癌細胞特異性が欠如していることを確認することができた。ところが、癌細胞特異的に遺伝子発現を調節することが可能なhTERTまたはm−hTERTの場合は、テロメラーゼ活性の高い細胞株でのみLacZの発現を誘導することにより、癌細胞特異的活性プロモーターであることを検証することができた。また、hTERTプロモーターにc−Myc結合部位およびSp1結合部位がさらに含まれたm−hTERTの場合は、テロメラーゼ活性の高い細胞株(C33A、U251N)では野生型プロモーターhTERTより高い遺伝子の発現を誘導することができてプロモーターの活性がさらに増加したことを確認し、テロメラーゼ活性の低いいろいろの細胞株(MCF−7、173We、WI38)では、その活性が効果的に減少して癌細胞特異性にも優れることを検証することができた。
【0078】
本発明で製造したhTERTまたはm−hTERTプロモーターによる遺伝子発現効率と癌細胞特異性を定量的に観察するために、dl−CMV−Z、dl−TERT−Zおよびdl−mTERT−Zアデノウィルスをいろいろの癌細胞株と正常細胞株にそれぞれ様々な濃度の力価で二日間感染させた後、細胞を溶解させてβ−galの活性を測定した。24−ウェルプレートに2×105個の癌細胞(H460、A549、C33A、SK−Hep1、HepG2、Hep3B、U343、U251N、MCF7)と正常細胞(173WE、CBHEL、MRC5、IMR90、W138、BJ)をそれぞれ分注した後、ここにdl−CMV−Z、dl−TERT−Zまたはdl−mTERT−ZアデノウィルスをMOI10、50、100で二日間感染させた後、ChengとBaltimoreの方法でβ−galの活性を測定した(Cheng,G. et al. ‘A co-inducer with TRAF2 of TNF-and CD40L-NK-kappaB activation.’ Genes & Develop., 1996,10,963-973.)。 まず、プレートから培地を除去し、Z緩衝溶液(60mM Na2HPO4、40mM NaH2PO4、10mM KCl、1mM MgSO4、50mM β−メルカプトエタノール)で細胞を分離させた後、1×106個の細胞を蛋白質分解抑制剤(20μm PMSF、20μM TLCK、20μM TPCK)が含まれた100μlの細胞溶解用緩衝溶液(β−メルカプトエタノールのないZ緩衝溶液プラス1%NP−40)で細胞を溶解させた。細胞溶出液を遠心分離して得た上澄液30μlを96−ウェルプレートにそれぞれ分注し、ここにONPG(o−ニトロフェニル−β−D−ガラクトピラノシド)4mgを6mlのZ緩衝溶液に溶かして120μlずつ分注し、37℃で30分間反応させた後、420nmで吸光度を測定した。
【0079】
図5A〜図5Oに示すように、CMVプロモーターによってLacZの発現が調節される場合、細胞を感染させたウィルスの力価に比例してLacZの発現が増加することが分かる。特に細胞内テロメラーゼ活性と関係なく、正常細胞株を含んだ全ての細胞株でLacZの発現を非常に強く誘導した。これとは対照的に、hTERTまたはm−hTERTプロモーターの場合は、テロメラーゼ活性の高い癌細胞株、すなわちMCF−7人体乳癌細胞株を除いた全ての癌細胞株では感染に用いられたウィルスの力価に比例してLacZの発現を誘導したが、正常癌細胞株ではMOI100の高力価でもβ−galの活性が殆ど観察されないため、これら2種のプロモーターの癌細胞特異的活性調節能に優れることを確認した。具体的に、IMR90正常細胞株の場合、MOI100でCMVプロモーターによって発現されるLacZの相対的な量O.D.420の値は1.714であるが、これに対し、hTERTまたはm−hTERTプロモーターによって発現されるLacZの相対的なO.D.420値は0.101と0.025であって、hTERTプロモーターの場合には約17倍程度低く、m−hTERTプロモーターの場合には約68倍程度低いことが分かる。BJ正常細胞株の場合、MOI500の高濃度のウィルスによって感染した場合、CMV、hTERTまたはm−hTERTプロモーターによって発現されるLacZの相対的なO.D.420値がそれぞれ0.548、0.001、0.001であって、hTERTまたはm−hTERTプロモーターが全く活性化されないことが分かる。このようなLacZ発現の大きい差は、他の正常細胞株である173We、CBHEL、WI38、MRC5などからも観察された。一方、テロメラーゼの活性が高いいろいろの癌細胞株では、m−hTERTプロモーターによって発現されるLacZの量が、野生型プロモーターのhTERTプロモーターに比べて一層強く誘導されることを確認した。すなわち、MOI50のdl−TERT−Zによって感染したSK−Hep1細胞株で発現されたLacZの相対的なO.D.420値は0.182であるが、これに対し、同量の力価でdl−mTERT−Zアデノウィルスによって感染した場合には発現されたLacZの相対的なO.D.420値が1.82であって約10倍程度強く誘導され、Hep3B細胞株でも約10倍程度(dl−TERT−Z:0.135、dl−mTERT−Z:1.322)強く誘導された(表1)。このような一連の実施例によって、本発明で製造されたm−hTERTプロモーターが、野生型プロモーターhTERTに比べて、癌細胞では一層強く遺伝子発現を誘導することができるため一層強いプロモーターであるが、正常細胞株では活性が殆ど起こらないため癌細胞特異性にも優れることを確認することができた。
【0080】
【表1】
【0081】
(実施例6)
複製可能組み換えアデノウィルスの免疫ブロット分析
複製が癌細胞特異的に起こるかを調べるために、対照群ウィルスAd−ΔE1B19と共に人体癌細胞株および正常細胞株にそれぞれ感染させた後、アデノウィルスによって発現されるE1蛋白質の発現様相を検証した。6−ウェルプレートに3×105〜1×106個の癌細胞株(C33A、A549、HeLa、SK−Hep1)および正常細胞株(IMR90、MRC5、BJ)をそれぞれ分注した後、翌日Ad−ΔE1B19、Ad−TERT−Δ19またはAd−mTERT−Δ19を、癌細胞はMOI1で、正常細胞株はMOI10でそれぞれ感染させた。ウィルス感染二日後に、感染した細胞を回収して細胞溶解用緩衝溶液(50mM HEPES、0.15M NaCl、0.5% NP−40、プロテアーゼ抑制剤:PMSF、TLCK、TPCK)で細胞を溶解させてSDS−PAGE(Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)電気泳動を行った。電気泳動の後、ゲルにある蛋白質をPVDF膜に電気移動(electro transfer)した後、アデノウィルスE1A蛋白質を特異的に認知する抗体(sc−430;Santa Cruz Biotech., Santa Cruz, CA)を1次抗体として混成化(hybridization)させ、HRP(horse radish peroxidase)が結合した2次抗体をさらに混成化させた後、ECL(Enhanced Chemi−Luminescence:sc−2048;Santa Cruz Biotech., Santa Cruz, CA)を用いて蛋白質の発現様相を究明した。
【0082】
図6に示すように、Ad−ΔE1B19によって感染した場合は、癌細胞と正常細胞の両方ともでウィルスの複製が活発に起こってE1蛋白質が高く発現されたが、これに対し、Ad−mTERT−Δ19アデノウィルスによって感染した場合は、テロメラーゼ活性の高い癌細胞でのみ発現され、テロメラーゼ活性の微々な全ての正常細胞株(WI38、BJ、IMR90)では全く発現されなかった。このような結果は、Ad−mTERT−Δ19アデノウィルスの複製がm−hTERTプロモーターによって癌細胞特異的に調節されることを意味する。しかし、野生型hTERTプロモーターによって複製が調節されるAd−TERT−Δ19の場合は、癌細胞で複製が活発に起こってE1蛋白質が高く発現されたが、正常細胞株であるW138とBJ細胞株でもE1蛋白質が発現されてAd−mTERT−Δ19アデノウィルスに比べて癌細胞特異的複製能が微弱に調節されることが分かった。
【0083】
(実施例7)
複製可能組み換えアデノウィルスの細胞殺傷能検証
Ad−TERT−Δ19とAd−mTERT−Δ19アデノウィルスの癌細胞特異的殺傷能を検証するために、多種の癌細胞株および正常細胞株に対照群複製可能アデノウィルスAd−ΔE1B19と陰性対照群ウィルスdl−CMV−Z複製不能アデノウィルスをそれぞれ様々な濃度の力価で感染させて細胞殺傷程度を観察した。24−ウェルプレートに2〜5×104個の多種の癌細胞株(SK−Hep1、H460、C33A、U251N、A549、HeLa)と正常細胞株(BJ、WI38、IMR90)をそれぞれ分注した後、翌日dl−CMV−Z、Ad−ΔE1B19、Ad−TERT−Δ19またはAd−mTERT−Δ19アデノウィルスをMOI0.01、0.1、1、10、100でそれぞれ感染させた。MOI0.01または0.1で投与したAd−ΔE1B19アデノウィルスが細胞を殆ど死滅させた時点に全ての培地を除去し、プレートの底に残っている細胞を0.5%クリスタルバイオレット(50%メタノール)で固定し染色した後、分析した。
【0084】
図7A〜図7Fに示すように、陰性対照群dl−CMV−Z複製不能アデノウィルスで感染した癌細胞では、ウィルス複製が全く起こらなくて細胞殺傷効果が観察されなかったが、Ad−TERT−Δ19またはAd−mTERT−Δ19で感染した大部分の癌細胞株では、Ad−ΔE1B19と殆ど類似の程度で細胞殺傷を誘導して細胞殺傷能(potency)に優れることを確認することができた。ところが、図7G〜図7Iに示すように、正常細胞株であるBJ、WI38、IMR90では、Ad−TERT−Δ19の場合は、癌細胞に対する特異性が全くないAd−ΔE1B19と殆ど類似の類準で正常細胞を殺傷させたが、Ad−mTERT−Δ19の場合は、Ad−ΔE1B19に比べて約100倍程度低い細胞殺傷を示してAd−mTERT−Δ19の癌細胞に対する特異性(specificity)に優れることを確認した。
【0085】
細胞株のテロメラーゼ活性度によるAd−TERT−Δ19およびAd−mTERT−Δ19の細胞殺傷能を定量化するために、MTT分析を行った。癌細胞(SK−Hep1、H460、C33A、U251N、A549およびHeLa)と正常細胞(BJ、WI38およびIMR90)を24−ウェルプレートに70〜90%の密集度(confluency)でそれぞれ分注した後、翌日dl−CMV−Z、Ad−ΔE1B19、Ad−TERT−Δ19またはAd−mTERT−Δ19アデノウィルスを、癌細胞はMOI10で、正常細胞はMOI50でそれぞれ感染させた。一定の時間間隔でMTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide、2mg/ml)溶液200μlずつをウェルに添加して4時間37℃の恒温器で反応させた後、1mlのDMSO(dimethyl sulphoxide)を添加し、37℃で10分間放置した後、540nmで吸光度を測定して細胞の相対的生存率を測定した。
【0086】
図8A〜図8Fに示すように、本発明で使用された全ての癌細胞では、ウィルス感染後に時間が経過するにつれて、Ad−TERT−Δ19、Ad−mTERT−Δ19およびAd−ΔE1B19が類似の水準で細胞を最も速く殺傷する反面、図8G〜図8Iに示すように、正常細胞株では、Ad−ΔE1B19およびAd−TERT−Δ19で感染した場合は、時間が経過するにつれて、細胞生存率が急激に減少するが(細胞生存率5〜20%)、Ad−mTERT−Δ19で感染した場合には、感染後9日が経過しても、約90%以上の細胞が生存することを観察することができた。このような結果により、Ad−mTERT−Δ19の癌細胞特異的殺傷能に優れることを検証した。これはまた、Ad−mTERT−Δ19の場合、対照群複製可能アデノウィルスAd−ΔE1B19および野生型hTERTによって複製が調節されるAd−TERT−Δ19より正常細胞における安全性が大幅増加したことを意味する。
【0087】
(実施例8)
複製可能組み換えアデノウィルスの生体内抗腫瘍効果検証
hTERTプロモーターによって複製が調節されるアデノウィルスAd−TERT−Δ19とm−hTERTプロモーターによって複製が調節されるAd−mTERT−Δ19アデノウィルスの生体内抗腫瘍効果を比較検証するために、人体子宮癌細胞株をヌードマウスに接種した後、形成された腫瘍にAd−TERT−Δ19とAd−mTERT−Δ19アデノウィルスを陽性対照群ウィルスAd−ΔE1B19と共に腫瘍内投与した後、腫瘍の大きさを観察した。生後6〜8週齢のヌードマウスの腹壁に皮下で1×107個の人体子宮癌細胞株C33Aを注射した後、腫瘍が50〜80mm3程度成長したときに5×108PFU(plaque forming unit)のAd−ΔE1B19、Ad−TERT−Δ19またはAd−mTERT−Δ19アデノウィルスを陰性対照群PBSと共に二日間隔で3回腫瘍に直接注射した後、腫瘍の成長を観察した。腫瘍の容積は、カリパス(capliper)を用いて腫瘍の長軸と短軸を測定した後、次の公式で算出した(腫瘍の容積=(短軸mm)2×長軸mm×0.523)。
【0088】
図9に示すように、陰性対照群PBSを投与したマウスの場合、ウィルス投与後32日目には、急激に成長して腫瘍の大きさが4,232±2,185mm3であったが、複製可能アデノウィルス(Ad−TERT−Δ19、Ad−mTERT−Δ19、Ad−ΔE1B19)を投与したマウスの場合は、腫瘍の成長が大きく遅延することを確認することができた。すなわち、Ad−ΔE1B19を投与したマウスの場合、ウィルス投与後32日目に腫瘍の大きさが44±38mm3であり、Ad−TERT−Δ19は229±168mm3、Ad−mTERT−Δ19は18±20mm3程度とはっきりとした抗腫瘍効果を示した(p<0.05)。また、ウィルス投与後60日目には、PBSを投与した全6匹のマウスが死んでそれ以上腫瘍の成長を測定することができず、Ad−ΔE1B19、Ad−TERT−Δ19またはAd−mTERT−Δ19を投与した場合には、腫瘍の大きさがそれぞれ62±104mm3、550±368mm3、15±15mm3であって、m−hTERTによって複製が調節されるアデノウィルスAd−mTERT−Δ19の場合、Ad−ΔE1B19だけ抗腫瘍効果が優れた(p<0.05)。また、Ad−mTERT−Δ19を投与したマウスの場合、ウィルス投与後10日頃に5匹のマウス中の2匹で腫瘍が完全に無くなることを観察することができ、2ヶ月が経過しても、腫瘍の再成長は観察されなかった。
【0089】
(実施例9)
hTERTまたはm−hTERTプロモーターの生体内正常組織における活性検証
生体内正常組織でhTERTまたはm−hTERTプロモーターの活性を検証するために、hTERTまたはm−hTERTプロモーターによって発現が調節されるLacZ標識遺伝子の挿入された複製不能アデノウィルスdl−TERT−Zとdl−mTERT−Zを陽性対照群dl−CMV−Zと共にマウスに静脈投与した。生後6〜8週齢のマウスの尾静脈に5×1010PFUのdl−CMV−Z、dl−TERT−Zおよびdl−mTERT−Zをそれぞれ100μlずつ投与してから3日後にマウスから各臓器(肝、心臓、肺、脾臓、腎臓、胃腸、精巣、筋肉)を摘出した。摘出された各組織を4%パラホルムアルデヒド溶液に仕込んだ後、4℃で4〜8時間固定させ、その後スクロース溶液でオーバーナイト(overnight)して脱水させた。脱水した組織は、O.C.T.コンパウンド(Sakura Finetec、Torrance、CA)で凍結薄片した後、8μlの厚さに切断し、ゼラインのコートされたスライドガラス上に付着させてX−gal染色を行った。
【0090】
図10Aおよび図10Bに示すように、構成性(constitutive)プロモーターによってLacZの発現が調節されるアデノウィルスdl−CMV−Zを静脈投与した場合、肝組織におけるLacZ発現が非常に高く起こり、脾臓、胃および腎臓でもLacZの発現が低く起こることを観察することができた。ところが、dl−TERT−Zとdl−mTERT−Zを投与した場合には、静脈投与後にアデノウィルスが最も多く検出されると知られている器官の肝組織においてLacZの発現が全く起こらないため、hTERTまたはm−hTERTプロモーターの活性が正常肝細胞で全く起こらないことを確認することができた。脾臓組織では、dl−TERT−Zまたはdl−mTERT−Zを投与した場合がdl−CMV−Zを投与した場合より一層微弱にLacZの発現が起こって、脾臓細胞でもhTERTとm−hTERTプロモーターの活性が抑制されることが分かった。胃腸組織では、dl−CMV−Zまたはdl−TERT−Zを投与した場合はLacZの発現が少量検出されたが、dl−mTERT−Zを投与した場合は全くLacZの発現が観察されておらず、腎臓組織では、dl−CMV−Zを投与した場合は微弱にLacZの発現が起こったが、dl−TERT−Zまたはdl−mTERT−Zを投与した場合は全くLacZの発現が観察されていないため、m−hTERTプロモーターの癌細胞特異性に優れることを確認した。
【0091】
(実施例10)
h−TERTまたはm−hTERTプロモーターの生体内腫瘍組織および正常組織における活性検証
腫瘍組織および正常組織におけるhTERTまたはm−hTERTプロモーターの活性を比較検証するために、生後6〜8週齢のヌードマウスの腹壁に皮下で1×107個の人体子宮癌細胞株C33Aを注射した後、腫瘍が100mm3程度成長したとき、5×108PFU(plaque forming unit)のdl−TERT−Zとdl−mTERT−Zアデノウィルスを陽性対照群dl−CMV−Zと共に1回マウスに腫瘍内投与(intratumoral injection)した。ウィルス投与3日後に腫瘍組織および正常組織を摘出した後、前述の方法によってX−gal染色を行った。
【0092】
図11Aおよび図11Bに示すように、dl−CMV−Zを投与したマウスの場合、腫瘍組織でLacZの発現が強く誘導されたが、正常組織の肝においてもLacZの発現が検出された反面、dl−TERT−Zまたはdl−mTERT−Zを投与したマウスの場合、腫瘍組織ではLacZが高く発現されるが、正常肝組織では全くLacZの発現を観察することができなかった。また、dl−TERT−Zウィルスは、極めて一部の癌細胞でのみLacZの発現を誘導したが、dl−mTERT−Zウィルスは、腫瘍組織内の多くの癌細胞でLacZの発現を誘導してmTERTプロモーターの活性がTERTプロモーターに比べて癌細胞で一層強く活性化されることが分かった。
【0093】
(実施例11)
癌細胞および正常細胞におけるウィルス生産量の比較
TERTまたはm−hTERTプロモーターによる癌細胞特異的複製で癌細胞と正常細胞におけるウィルス生産量を比較するために、6−ウェルプレートに3×105個の癌細胞(HeLa細胞)と正常細胞(BJ細胞)を分注した翌日、Ad−ΔE1B19、Ad−TERT−Δ19、Ad−mTERT−Δ19と陰性対照群として複製不能ウィルスdl−CMV−ZをMOI10で4時間感染させ、その後ウィルスの含まれた培地を取り除いて新規の培地で取り替えた後、一定の時間間隔で細胞と培養液を回収した。3回の凍結と解凍を繰り返し行った後、293細胞株でlimiting titeration方法によってウィルス力価を決定した。
【0094】
図12Aおよび図12Bに示すように、HeLa細胞株では、Ad−mTERT−Δ19で感染させた場合には陽性対照群ウィルスAd−ΔE1B19と類似にウィルスが活発に生成されるが、Ad−TERT−Δ19で感染した場合にはウィルスの生産量が著しく低かった。しかし、人体正常細胞株BJでは、Ad−mTERT−Δ19によって感染した場合、ウィルスが殆ど生産されないため、これらのウィルスの癌細胞特異的複製能を確認することができた。
【0095】
(実施例12)
腫瘍組織における複製可能アデノウィルスの複製能分析
生後6〜8週齢のヌードマウスの腹壁に皮下で1×107個の人体子宮癌細胞株C33Aを注射した後、腫瘍が約50〜80mm3程度成長したとき、5×108PFUのAd−ΔE1B19、Ad−TERT−Δ19またはAd−mTERT−Δ19アデノウィルスを直接投与した。ウィルス投与7日後に腫瘍を摘出してパラフィンブロックを製作した後、アデノウィルスのヘキソン部位と選択的に結合する抗体を用いて免疫組織化学(immunohistochemistry)をした。アデノウィルスのヘキソン(hexon)部位と選択的に結合する抗体(AB1056F;Chemicon、Temecula、CA、USA)を1次抗体として混成化させた後、HRP(horse Radish peroxidase)が結合した2次抗体をさらに混成化させてヘキソンの発現様相を究明した。
【0096】
図13に示すように、Ad−TERT−Δ19を投与した場合に比べて、Ad−ΔE1B19またはAd−mTERT−Δ19を投与した腫瘍組織がさらに広い部位からアデノウィルスが検出された。このような実験結果は、癌組織内におけるAd−mTERT−Δ19複製能がAd−TERT−Δ19より活発に起こることを意味する。
【0097】
(実施例13)
複製可能アデノウィルスが正常肝組織に及ぼす細胞毒性の分析
人体子宮癌細胞株C33Aをヌードマウスに接種した後、形成された腫瘍にAd−mTERT−Δ19またはAd−ΔE1B19アデノウィルスをそれぞれ腫瘍内投与してから7日後にマウスから肝組織を摘出し、ヘマトキシリン・エオシン(hematoxylin & eosin)で染色して組織の状態を検証した。
【0098】
図14に示すように、Ad−ΔE1B19を投与したマウスの肝の場合、類似分裂(mitosis)が多く観察され、核が大きくなっており、濃く染色されたことからみて、ウィルスによる核の損傷を確認することができた。また、クッパー細胞(kupffer cell)の増殖、多くの炎症細胞、およびアポトーシス(apoptosis)に進む細胞も観察された。Ad−mTERT−Δ19を投与したマウスの肝を見れば、核がやや大きくなっているが、類似分裂の行われる細胞を観察することができず、クッパー細胞もやはり正常的な形をしており、反応性感染(reactive hepatitis)または炎症(inflammation)現象も観察することができなかった。このような結果からみて、Ad−mTERT−Δ19ウィルスの場合、Ad−ΔE1B19に比べて細胞毒性が著しく低下することを確認することができた。
【0099】
(実施例14)
本発明のアデノウィルス投与量および投与経路によるマウスの致死率検証
癌細胞特異的に複製が可能なアデノウィルスAd−mTERT−Δ19と対照群ウィルスAd−ΔE1B19の生体内投与量による毒性を投与経路別にそれぞれ検証した。
【0100】
A.静脈内投与による毒性検証
尾静脈内投与によるアデノウィルスの投与による毒性を調べるために、生後6〜8週齢のマウスの尾静脈に1×1010、3×1010、5×1010PFUのAd−ΔE1B19またはAd−mTERT−Δ19をPBSが100μlとなるようにして投与した後、マウスの生存率を調べた(図15A)。
【0101】
Ad−ΔE1B19またはAd−mTERT−Δ19アデノウィルスをそれぞれ1×1010PFUで全身投与した場合、10匹のマウスが全てウィルス投与後15日まで生存し、1×1010PFUのウィルスを静脈から全身投与したときにマウスの致死率が0であることを確認することができた。Ad−mTERT−Δ19を3×1010PFUで全身投与した場合には、5匹のマウスの中で4匹がウィルス投与後15日まで生存したが、Ad−ΔE1B19を投与した場合には、5匹のマウスがウィルス投与後8日以内に全て死んだ。このような結果は、癌細胞に対する選択性が欠如しているAd−ΔE1B19の場合には、3×1010ウィルスの力価では致死率100%と毒性が確認されたが、癌細胞特異的に活性が調節されるAd−mTERT−Δ19の場合には、致死率20%と毒性が弱化したことを意味する。5×1010PFUの場合、Ad−ΔE1B19またはAd−mTERT−Δ19ウィルスを投与した全てのマウスがウィルス投与後5日以内に死んで、このような高濃度のウィルスを静脈から全身投与したときには毒性が最も大きいことを確認することができた。
【0102】
B.腹腔内投与による毒性検証
腹腔内投与によるアデノウィルスの投与量による毒性を調べるために、生後6〜8週齢のマウスの腹腔に5×1010と1×1011PFUのAd−ΔE1B19またはAd−mTERT−Δ19を1mlの量で投与した後、マウスの生存率を調べた(図15B)。
【0103】
Ad−ΔE1B19またはAd−mTERT−Δ19アデノウィルスをそれぞれ5×1010PFUで腹腔内投与した場合、10匹のマウスが全てウィルス投与後15日まで生存し、5×1010PFUのウィルスを腹腔内投与したときにマウスの致死率が0であることを確認することができた。Ad−mTERT−Δ19を1×1011PFUで腹腔内投与した場合には、5匹のマウスの中で4匹がウィルス投与後15日まで生存し、Ad−ΔE1B19を投与した場合には、5匹のマウスの中で3匹がウィルス投与後15日まで生存した。このような結果は、癌細胞に対する選択性が欠如しているAd−ΔE1B19の場合には致死率が40%であるが、癌細胞特異的に活性が調節されるAd−mTERT−Δ19の場合には致死率20%と毒性がやや弱化したことを意味する。また、5×1010PFUのウィルスをマウスの尾静脈から全身投与した場合には全てのマウスがウィルス投与後5日以内に死んだが、腹腔投与した場合にはマウスの致死率が0であることを確認することができた。これは、アデノウィルスを腹腔に投与することが静脈投与することより安全であることを意味する。
【0104】
C.腫瘍内投与による毒性検証
腫瘍内投与によるアデノウィルスの投与量による毒性を調べるために、生後6〜8週齢のマウスの腹壁にB16F10細胞株を接種した後、腫瘍の大きさが約100mm3程度成長したとき、Ad−Δ19またはAd−mTERT−Δ19アデノウィルスをそれぞれ5×1010と1×1011PFUで腫瘍内投与した(図15C)。
【0105】
5×1010PFUのウィルスを投与した全20匹のマウスがウィルス投与後15日まで生存し、前記PFUのウィルスを腫瘍内投与したときにマウスの致死率が0であることを確認することができた。Ad−ΔE1B19を1×1011PFUで腫瘍内投与した場合には、投与を受けた10匹のマウスの中で2匹がウィルス投与後8日目に死んだ。Ad−mTERT−Δ19を投与した場合には、投与を受けた10匹のマウスの中で2匹がウィルス投与後12日以内に死んだ。したがって、ウィルス投与後15日を基点としたマウスの致死率は、2種のウィルスを投与した場合に全て20%であるが、Ad−mTERT−Δ19を投与したマウスの生存期間がAd−ΔE1B19を投与したマウスの生存期間より増加した。
【0106】
このような結果をまとめると、癌細胞特異的に複製が起こるAd−mTERT−Δ19アデノウィルスを静脈投与または腹腔内投与した場合の致死率が癌細胞に対する選択性が欠如しているAd−ΔE1B19アデノウィルスの場合に比べて減少し、癌細胞特異的に増殖されるアデノウィルスによる生体内毒性が弱化したことが分かる。また、同じ力価のアデノウィルスを投与した場合、静脈からの全身投与が腹腔内投与または腫瘍内投与より強い毒性を示して高致死率を示すことも分かった。
【0107】
(実施例15)
投与経路別投与量による正常組織に対する毒性比較
癌細胞特異的に複製が可能なアデノウィルスAd−mTERT−Δ19と対照群ウィルスAd−ΔE1B19の生体内投与容量による正常組織に対する毒性を組織病理学的な素見で検証するために、生後6〜8週齢のマウスに1×1010PFUのAd−mTERT−Δ19、Ad−ΔE1B19またはPBSを尾静脈、腹腔内または腫瘍内投与してから7日経過した後、マウスからいろいろの臓器(腎臓、肝、肺、脾臓)を摘出して凍結薄片した後、ヘマトキシリン・エオシン(H&E)で染色して組織の状態を検証した(図16A〜図16C)。
【0108】
Ad−ΔE1B19アデノウィルスを尾静脈から全身投与した場合、肝門脈の周辺に炎症反応が激しく起こり、クッパー細胞の増殖とアポトーシスに進む細胞も観察された。また、多くの類似分裂が観察され、核が大きくなり、濃く染色されたことからみて、ウィルスによる核の損傷を確認することができた。この他に、リンパ様(lymphoid)小胞体にリンパ球が殆どない特徴を観察することができた。ところが、Ad−mTERT−Δ19ウィルスを尾静脈から全身投与した肝では、炎症反応が弱く起こり、核がやや肥大になっていたが、類似分裂が進む細胞を観察することができなかった。そして、肝組織外の他の組織では、異常現象が観察されなかった。尾静脈からの全身投与ではなく、腹腔内または腫瘍内に同じ力価のAd−mTERT−Δ19またはAd−ΔE1B19アデノウィルスを投与した場合には、当該実施例で摘出した全ての組織の状態が良好であることも確認することができた。このような結果より、アデノウィルスを全身投与した場合は、腹腔内投与した場合より激しい毒性を誘発することが分かり、腫瘍特異的に複製が調節されるAd−mTERT−Δ19アデノウィルスを生体内投与した場合、生体内組織に及ぼす毒性がAd−ΔE1B19ウィルスに比べて一層減少することが分かった。
【0109】
(実施例16)
投与経路別投与量による正常組織に対する毒性比較
これと共に血液分析によって、肝機能に関連したいろいろの酵素(GOT、GPT、T−bililubin)、腎臓機能に関連した酵素(BUN、CREA、尿酸)、全体コレステロールおよび電解質イオン(Na+、K+、Cl−)の濃度を定量分析した(表2〜表4)。
【0110】
Ad−mTERT−Δ19またはAd−ΔE1B19アデノウィルスを5×1010PFUで尾静脈から全身投与した場合は、ウィルス投与後7日内にマウスが死んで血液分析実験を行うことができなかったが、これに対し、同じ力価のアデノウィルスを腹腔投与または腫瘍内投与した場合は、投与後7日頃には肝毒性が大きく弱化したうえ、腎臓毒性が現れておらず、電解質イオンの濃度も全て正常範囲内にあった。このような結果は、アデノウィルスを腹腔または腫瘍内投与することが静脈投与することより安全であることを意味する。
【0111】
アデノウィルスを1×1010PFUで全身投与した場合に発生する肝毒性を比較すると、Ad−ΔE1B19を投与したときには、GOTとGPT濃度が著しく大幅増加して分析可能最大値を超過したが、Ad−mTERT−Δ19を投与したときには、GOTとGPT濃度が正常数値より約5〜16倍増加した。しかし、肝機能を検証することが可能な別の酵素T−bililubinの場合は、Ad−ΔE1B19を投与したときに大きく増加したが、Ad−mTERT−Δ19を投与したときには正常範囲にあった。
【0112】
また、Ad−ΔE1B19アデノウィルスを5×1010PFUで腹腔内投与した場合、GPTの濃度が増加したが、Ad−mTERT−Δ19を投与したマウスではGPTの濃度が正常範囲にあり、これらのアデノウィルスを腫瘍内投与した場合には、GOTとT−bililubinの濃度がAd−ΔE1B19アデノウィルスを投与したときに増加した。したがって、このような結果より、癌細胞特異的複製能を有するアデノウィルスによる生体内肝毒性が癌細胞特異性のないアデノウィルスに比べて減少することが分かった。
【0113】
【表2】
【0114】
【表3】
【0115】
【表4】
【産業上の利用可能性】
【0116】
本発明に係る転写調節配列は、癌細胞でのみ特異的であり、高効率で自分と作動可能に連結された遺伝子の発現を誘導することにより癌細胞のみを選択的に殺傷することができるため、副作用を最小化した抗癌治療剤として利用できる。
【図面の簡単な説明】
【0117】
【図1】本発明に係る転写調節配列の一実施例に係るm−hTERTプロモーターの塩基配列を示す図である。
【図2A】本発明に係る複製不能組み換えアデノウィルスベクターdl−CMV−Z、dl−TERT−Zおよびdl−mTERT−Zの模式図である。
【図2B】本発明に係る複製可能組み換えアデノウィルスベクターAd−ΔE1B19、Ad−TERT−Δ19およびAd−mTERT−Δ19の模式図である。
【図3】本発明で用いられる様々な癌細胞株および正常細胞株の相対的な内在テロメラーゼの活性度を示すグラフである。
【図4】様々な癌細胞株または正常細胞株において本発明に係る複製不能組み換えアデノウィルスdl−CMV−Z、dl−TERT−Zまたはdl−mTERT−ZのLacZ遺伝子の発現様相を示す写真である。
【図5A】癌細胞株(H460)における本発明に係る複製不能組み換えアデノウィルスdl−CMV−Z(■)、dl−TERT−Z(○)またはdl−mTERT−Z(△)のLacZ遺伝子の発現様相を定量化したグラフである。
【図5B】癌細胞株(A549)における本発明に係る複製不能組み換えアデノウィルスdl−CMV−Z(■)、dl−TERT−Z(○)またはdl−mTERT−Z(△)のLacZ遺伝子の発現様相を定量化したグラフである。
【図5C】癌細胞株(C33A)における本発明に係る複製不能組み換えアデノウィルスdl−CMV−Z(■)、dl−TERT−Z(○)またはdl−mTERT−Z(△)のLacZ遺伝子の発現様相を定量化したグラフである。
【図5D】癌細胞株(SK−Hep1)における本発明に係る複製不能組み換えアデノウィルスdl−CMV−Z(■)、dl−TERT−Z(○)またはdl−mTERT−Z(△)のLacZ遺伝子の発現様相を定量化したグラフである。
【図5E】癌細胞株(HepG2)における本発明に係る複製不能組み換えアデノウィルスdl−CMV−Z(■)、dl−TERT−Z(○)またはdl−mTERT−Z(△)のLacZ遺伝子の発現様相を定量化したグラフである。
【図5F】癌細胞株(Hep3B)における本発明に係る複製不能組み換えアデノウィルスdl−CMV−Z(■)、dl−TERT−Z(○)またはdl−mTERT−Z(△)のLacZ遺伝子お発現様相を定量化したグラフである。
【図5G】癌細胞株(U343)における本発明に係る複製不能組み換えアデノウィルスdl−CMV−Z(■)、dl−TERT−Z(○)またはdl−mTERT−Z(△)のLacZ遺伝子の発現様相を定量化したグラフである。
【図5H】癌細胞株(U251N)における本発明に係る複製不能組み換えアデノウィルスdl−CMV−Z(■)、dl−TERT−Z(○)またはdl−mTERT−Z(△)のLacZ遺伝子の発現様相を定量化したグラフである。
【図5I】癌細胞株(MCF7)における本発明に係る複製不能組み換えアデノウィルスdl−CMV−Z(■)、dl−TERT−Z(○)またはdl−mTERT−Z(△)のLacZ遺伝子の発現様相を定量化したグラフである。
【図5J】正常細胞株(173WE)における本発明に係る複製不能組み換えアデノウィルスdl−CMV−Z(■)、dl−TERT−Z(○)またはdl−mTERT−Z(△)のLacZ遺伝子の発現様相を定量化したグラフである。
【図5K】正常細胞株(CBHEL)における本発明に係る複製不能組み換えアデノウィルスdl−CMV−Z(■)、dl−TERT−Z(○)またはdl−mTERT−Z(△)のLacZ遺伝子の発現様相を定量化したグラフである。
【図5L】正常細胞株(MRC5)における本発明に係る複製不能組み換えアデノウィルスdl−CMV−Z(■)、dl−TERT−Z(○)またはdl−mTERT−Z(△)のLacZ遺伝子の発現様相を定量化したグラフである。
【図5M】正常細胞株(IMR90)で本発明に係る複製不能組み換えアデノウィルスdl−CMV−Z(■)、dl−TERT−Z(○)またはdl−mTERT−Z(△)のLacZ遺伝子発現様相を定量化したグラフである。
【図5N】正常細胞株(W138)における本発明に係る複製不能組み換えアデノウィルスdl−CMV−Z(■)、dl−TERT−Z(○)またはdl−mTERT−Z(△)のLacZ遺伝子の発現様相を定量化したグラフである。
【図5O】正常細胞株(BJ)における本発明に係る複製不能組み換えアデノウィルスdl−CMV−Z(■)、dl−TERT−Z(○)またはdl−mTERT−Z(△)のLacZ遺伝子の発現様相を定量化したグラフである。
【図6】様々な癌細胞株または正常細胞株における本発明に係る複製可能組み換えアデノウィルスAd−mTERT−Δ19、Ad−TERT−Δ19またはAd−ΔE1B19のE1遺伝子の発現様相を示す図である(1:C33A、2:A549、3:HeLa、4:SK−Hep1、5:W138、6:BJ、7:IMR90)。
【図7A】本発明に係る複製可能組み換えアデノウィルスによって感染した癌細胞株(SK−Hep1)の殺傷程度を示す図である(1:dl−CMV−Z、2:Ad−ΔE1B19、3:Ad−TERT−Δ19、4:Ad−mTERT−Δ19)。。
【図7B】本発明に係る複製可能組み換えアデノウィルスによって感染した癌細胞株(H460)の殺傷程度を示す図である(1:dl−CMV−Z、2:Ad−ΔE1B19、3:Ad−TERT−Δ19、4:Ad−mTERT−Δ19)。
【図7C】本発明に係る複製可能組み換えアデノウィルスによって感染した癌細胞株(C33A)の殺傷程度を示す図である(1:dl−CMV−Z、2:Ad−ΔE1B19、3:Ad−TERT−Δ19、4:Ad−mTERT−Δ19)。
【図7D】本発明に係る複製可能組み換えアデノウィルスによって感染した癌細胞株(U251N)の殺傷程度を示す図である(1:dl−CMV−Z、2:Ad−ΔE1B19、3:Ad−TERT−Δ19、4:Ad−mTERT−Δ19)。
【図7E】本発明に係る複製可能組み換えアデノウィルスによって感染した癌細胞株(A549)の殺傷程度を示す図である(1:dl−CMV−Z、2:Ad−ΔE1B19、3:Ad−TERT−Δ19、4:Ad−mTERT−Δ19)。
【図7F】本発明に係る複製可能組み換えアデノウィルスによって感染した癌細胞株(HeLa)の殺傷程度を示す図である(1:dl−CMV−Z、2:Ad−ΔE1B19、3:Ad−TERT−Δ19、4:Ad−mTERT−Δ19)。
【図7G】本発明に係る複製可能組み換えアデノウィルスによって感染した正常細胞株(BJ)の殺傷程度を示す図である(1:dl−CMV−Z、2:Ad−ΔE1B19、3:Ad−TERT−Δ19、4:Ad−mTERT−Δ19)。
【図7H】本発明に係る複製可能組み換えアデノウィルスによって感染した正常細胞株(WI38)の殺傷程度を示す図である(1:dl−CMV−Z、2:Ad−ΔE1B19、3:Ad−TERT−Δ19、4:Ad−mTERT−Δ19)。
【図7I】本発明に係る複製可能組み換えアデノウィルスによって感染した正常細胞株(IMR90)の殺傷程度を示す図である(1:dl−CMV−Z、2:Ad−ΔE1B19、3:Ad−TERT−Δ19、4:Ad−mTERT−Δ19)。
【図8A】本発明に係る複製可能組み換えアデノウィルスによって感染した癌細胞株(SK−Hep1)の殺傷程度を定量化したグラフである(■:dl−CMV−Z、○:Ad−ΔE1B19、□:Ad−TERT−Δ19、△:Ad−mTERT−Δ19)。
【図8B】本発明に係る複製可能組み換えアデノウィルスによって感染した癌細胞株(H460)の殺傷程度を定量化したグラフである(■:dl−CMV−Z、○:Ad−ΔE1B19、□:Ad−TERT−Δ19、△:Ad−mTERT−Δ19)。
【図8C】本発明に係る複製可能組み換えアデノウィルスによって感染した癌細胞株(C33A)の殺傷程度を定量化したグラフである(■:dl−CMV−Z、○:Ad−ΔE1B19、□:Ad−TERT−Δ19、△:Ad−mTERT−Δ19)。
【図8D】本発明に係る複製可能組み換えアデノウィルスによって感染した癌細胞株(U251N)の殺傷程度を定量化したグラフである(■:dl−CMV−Z、○:Ad−ΔE1B19、□:Ad−TERT−Δ19、△:Ad−mTERT−Δ19)。
【図8E】本発明に係る複製可能組み換えアデノウィルスによって感染した癌細胞株(A549)の殺傷程度を定量化したグラフである(■:dl−CMV−Z、○:Ad−ΔE1B19、□:Ad−TERT−Δ19、△:Ad−mTERT−Δ19)。
【図8F】本発明に係る複製可能組み換えアデノウィルスによって感染した癌細胞株(HeLa)の殺傷程度を定量化したグラフである(■:dl−CMV−Z、○:Ad−ΔE1B19、□:Ad−TERT−Δ19、△:Ad−mTERT−Δ19)。
【図8G】本発明に係る複製可能組み換えアデノウィルスによって感染した正常細胞株(BJ)の殺傷程度を定量化したグラフである(■:dl−CMV−Z、○:Ad−ΔE1B19、□:Ad−TERT−Δ19、△:Ad−mTERT−Δ19)。
【図8H】本発明に係る複製可能組み換えアデノウィルスによって感染した正常細胞株(WI38)の殺傷程度を定量化したグラフである(■:dl−CMV−Z、○:Ad−ΔE1B19、□:Ad−TERT−Δ19、△:Ad−mTERT−Δ19)。
【図8I】本発明に係る複製可能組み換えアデノウィルスによって感染した正常細胞株(IMR90)の殺傷程度を定量化したグラフである(■:dl−CMV−Z、○:Ad−ΔE1B19、□:Ad−TERT−Δ19、△:Ad−mTERT−Δ19)。
【図9】腫瘍の形成されたヌードマウスにおける本発明に係る複製可能組み換えアデノウィルスの腫瘍殺傷程度を示すグラフである(■:PBS、□:Ad−ΔE1B19、○:Ad−TERT−Δ19、△:Ad−mTERT−Δ19)。
【図10A】様々な生体内正常組織における本発明に係る複製不能組み換えアデノウィルスdl−CMV−Z、dl−TERT−Zまたはdl−mTERT−ZのLacZ遺伝子の発現様相を示すものである。
【図10B】様々な生体内正常組織における本発明に係る複製不能組み換えアデノウィルスdl−CMV−Z、dl−TERT−Zまたはdl−mTERT−ZのLacZ遺伝子の発現様相を示すものである。
【図10C】様々な生体内正常組織における本発明に係る複製不能組み換えアデノウィルスdl−CMV−Z、dl−TERT−Zまたはdl−mTERT−ZのLacZ遺伝子の発現様相を示すものである。
【図11A】生体内癌組織における本発明に係る複製不能組み換えアデノウィルスdl−CMV−Z、dl−TERT−Zまたはdl−mTERT−ZのLacZ遺伝子の発現様相を示すものである。
【図11B】生体内癌組織に本発明に係る複製不能組み換えアデノウィルスdl−CMV−Z、dl−TERT−Zまたはdl−mTERT−Zウィルスを腫瘍内投与した後、生体内肝組織でのLacZ遺伝子の発現様相を示すものである。
【図12A】HeLa癌細胞における本発明に係る複製可能組み換えアデノウィルスの生産量を示すグラフである。(□:Ad−ΔE1B19、○:Ad−TERT−Δ19、△Ad−mTERT−Δ19、■:dl−CMV−Z)。
【図12B】BJ正常細胞における本発明に係る複製可能組み換えアデノウィルスの生産量を示すグラフである。(□:Ad−ΔE1B19、○:Ad−TERT−Δ19、△Ad−mTERT−Δ19、■:dl−CMV−Z)。
【図13】癌組織内における本発明に係る複製可能アデノウィルスAd−ΔE1B19、Ad−TERT−Δ19またはAd−mTERT−Δ19の複製能を比較するための免疫組織化学(immunohistochemistry)結果を示すものである。
【図14】正常肝組織内における本発明に係る複製可能アデノウィルスAd−ΔE1B19またはAd−mTERT−Δ19の毒性を比較するためのヘマトキシリン・エオジン(Hematoxylin&Eosin)染色結果を示すものである。
【図15A】本発明に係る複製可能アデノウィルスAd−ΔE1B19またはAd−mTERT−Δ19を静脈内投与する場合の投与量によるマウスの生存率グラフである。
【図15B】本発明に係る複製可能アデノウィルスAd−ΔE1B19またはAd−mTERT−Δ19を腹腔内投与する場合の投与量によるマウスの生存率グラフである。
【図15C】本発明に係る複製可能アデノウィルスAd−ΔE1B19またはAd−mTERT−Δ19を腫瘍内投与する場合の投与量によるマウスの生存率グラフである。
【図16A】本発明に係る複製可能アデノウィルスAd−ΔE1B19またはAd−mTERT−Δ19を静脈内投与する場合の投与量による正常組織に対する毒性を示す写真である。
【図16B】本発明に係る複製可能アデノウィルスAd−ΔE1B19またはAd−mTERT−Δ19を腹腔内投与する場合の投与量による正常組織に対する毒性を示す写真である。
【図16C】本発明に係る複製可能アデノウィルスAd−ΔE1B19またはAd−mTERT−Δ19を腫瘍内投与する場合の投与量による正常組織に対する毒性を示す写真である。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ヒトのテロメア逆転写酵素プロモーターに、一つ以上のc−Myc結合部位および/または一つ以上のSp1結合部位を含む核酸配列が連結されたことを特徴とする、転写調節配列。
【請求項2】
ヒトのテロメア逆転写酵素プロモーターに、1つのc−Myc結合部位および5つのSp1結合部位を含む核酸配列が連結されたことを特徴とする、請求項1に記載の転写調節配列。
【請求項3】
c−Myc結合部位が、配列番号2、配列番号3または配列番号4よりなる群から選択されることを特徴とする、請求項1または2に記載の転写調節配列。
【請求項4】
Sp1結合部位が、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9または配列番号10よりなる群から選択されることを特徴とする、請求項1または2に記載の転写調節配列。
【請求項5】
ヒトのテロメア逆転写酵素プロモーターの5'−末端または3'−末端に、一つ以上のc−Myc結合部位および/または一つ以上のSp1結合部位を含む核酸配列が連結されることを特徴とする、請求項1に記載の転写調節配列。
【請求項6】
前記転写調節配列が配列番号13の核酸配列を持つことを特徴とする、請求項1に記載の転写調節配列。
【請求項7】
請求項1〜6のいずれか1項に記載の転写調節配列が、ウィルスの複製に必要な遺伝子に作動可能に連結されたことを特徴とする、組み換えウィルスベクター。
【請求項8】
前記ウィルスベクターが、アデノビリジアエ(adenoviridiae)属から由来したウィルスであることを特徴とする、請求項7に記載の組み換えウィルスベクター。
【請求項9】
前記ウィルスの複製に必要な遺伝子が、アデノウィルスの初期遺伝子であることを特徴とする、請求項7または8に記載の組み換えウィルスベクター。
【請求項10】
前記アデノウィルスの初期遺伝子が、E1A遺伝子であることを特徴とする、請求項9に記載の組み換えウィルスベクター。
【請求項11】
前記アデノウィルスが、E1B19kDa遺伝子の欠失しているものであることを特徴とする、請求項8〜10のいずれか1項に記載の組み換えウィルスベクター。
【請求項12】
前記組み換えウィルスベクターが、KCCM−10470であることを特徴とする、請求項11に記載の組み換えウィルスベクター。
【請求項13】
請求項1〜6のいずれか1項に記載の転写調節配列が、治療学的トランス遺伝子に作動可能に連結されたことを特徴とする、組み換えウィルスベクター。
【請求項14】
前記治療学的トランス遺伝子が、腫瘍抑制因子遺伝子、抗原性遺伝子、細胞毒性遺伝子、細胞増殖抑制遺伝子、細胞死滅遺伝子および抗−新生血管生成遺伝子よりなる群から選択されることを特徴とする、請求項13に記載の組み換えウィルスベクター。
【請求項15】
前記ウィルスベクターが、アデノビリジアエ属から由来したウィルスであることを特徴とする、請求項13に記載の組み換えウィルスベクター。
【請求項16】
前記治療学的トランス遺伝子がアデノウィルスのE1遺伝子の代わりに導入され、前記組み換えウィルスベクターが複製不能であることを特徴とする、請求項14または15に記載の組み換えウィルスベクター。
【請求項17】
前記治療学的トランス遺伝子がアデノウィルスのE3遺伝子の代わりに導入され、前記組み換えウィルスベクターが複製可能であることを特徴とする、請求項14または15に記載の組み換えウィルスベクター。
【請求項18】
治療学的トランス遺伝子がE1A遺伝子の代わりに導入され、アデノウィルスのE1およびE3電子が除去されたことを特徴とする、請求項14に記載の組み換えウィルスベクター。
【請求項19】
請求項1〜6のいずれか1項に記載の転写調節配列が、治療学的トランス遺伝子に作動可能に連結されたことを特徴とする、組み換え非ウィルスベクター。
【請求項20】
前記治療学的トランス遺伝子が、腫瘍抑制因子遺伝子、抗原性遺伝子、細胞毒性遺伝子、細胞増殖抑制遺伝子、細胞死滅遺伝子および抗−新生血管生成遺伝子よりなる群から選択されることを特徴とする、請求項19に記載の組み換え非ウィルスベクター。
【請求項21】
請求項7〜12のいずれか1項に記載の組み換えウィルスベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項22】
請求項13〜18のいずれか1項に記載の組み換えウィルスベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項23】
請求項19または20に記載の組み換え非ウィルスベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項24】
(a)ヒトのテロメア逆転写酵素プロモーターに一つ以上のc−Myc結合部位および/または一つ以上のSp1結合部位を含む核酸配列が連結された転写調節配列がウィルスの複製に必要な遺伝子に作動可能に連結された組み換えウィルスベクターの治療学的有効量、および(b)薬剤学的に許容される担体を含む、薬剤学的組成物。
【請求項25】
前記ウィルスベクターが、アデノビリジアエ属から由来したウィルスであることを特徴とする、請求項24に記載の薬剤学的組成物。
【請求項26】
(a)ヒトのテロメア逆転写酵素プロモーターに一つ以上のc−Myc結合部位および/または一つ以上のSp1結合部位を含む核酸配列が連結された転写調節配列が治療学的トランス遺伝子に作動可能に連結された組み換えウィルスベクターの治療学的有効量、および(b)薬剤学的に許容される担体を含む、薬剤学的組成物。
【請求項27】
前記ウィルスベクターが、アデノビリジアエ属から由来したウィルスであることを特徴とする、請求項26に記載の薬剤学的組成物。
【請求項28】
(a)ヒトのテロメア逆転写酵素プロモーターに一つ以上のc−Myc結合部位および/または一つ以上のSp1結合部位を含む核酸配列が連結された転写調節配列が治療学的トランス遺伝子に作動可能に連結された組み換え非ウィルスベクターの治療学的有効量、および(b)薬剤学的に許容される担体を含む、薬剤学的組成物。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ヒトの野生型テロメア逆転写酵素プロモーターに、一つ以上のc−Myc結合部位および一つ以上のSp1結合部位を含む核酸配列が連結されたことを特徴とする、転写調節配列。
【請求項2】
ヒトのテロメア逆転写酵素プロモーターに、1つのc−Myc結合部位および5つのSp1結合部位を含む核酸配列が連結されたことを特徴とする、請求項1に記載の転写調節配列。
【請求項3】
c−Myc結合部位が、配列番号2、配列番号3または配列番号4よりなる群から選択されることを特徴とする、請求項1または2に記載の転写調節配列。
【請求項4】
Sp1結合部位が、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9または配列番号10よりなる群から選択されることを特徴とする、請求項1または2に記載の転写調節配列。
【請求項5】
ヒトのテロメア逆転写酵素プロモーターの5'−末端または3'−末端に、一つ以上のc−Myc結合部位および一つ以上のSp1結合部位を含む核酸配列が連結されることを特徴とする、請求項1に記載の転写調節配列。
【請求項6】
前記転写調節配列が配列番号13の核酸配列を持つことを特徴とする、請求項1に記載の転写調節配列。
【請求項7】
請求項1〜6のいずれか1項に記載の転写調節配列が、ウィルスの複製に必要な遺伝子に作動可能に連結されたことを特徴とする、組み換えウィルスベクター。
【請求項8】
前記ウィルスベクターが、アデノビリジアエ(adenoviridiae)属から由来したウィルスであることを特徴とする、請求項7に記載の組み換えウィルスベクター。
【請求項9】
前記ウィルスの複製に必要な遺伝子が、アデノウィルスの初期遺伝子であることを特徴とする、請求項7または8に記載の組み換えウィルスベクター。
【請求項10】
前記アデノウィルスの初期遺伝子が、E1A遺伝子であることを特徴とする、請求項9に記載の組み換えウィルスベクター。
【請求項11】
前記アデノウィルスが、E1B19kDa遺伝子の欠失しているものであることを特徴とする、請求項8〜10のいずれか1項に記載の組み換えウィルスベクター。
【請求項12】
前記組み換えウィルスベクターが、KCCM−10470であることを特徴とする、請求項11に記載の組み換えウィルスベクター。
【請求項13】
請求項1〜6のいずれか1項に記載の転写調節配列が、治療学的トランス遺伝子に作動可能に連結されたことを特徴とする、組み換えウィルスベクター。
【請求項14】
前記治療学的トランス遺伝子が、腫瘍抑制因子遺伝子、抗原性遺伝子、細胞毒性遺伝子、細胞増殖抑制遺伝子、細胞死滅遺伝子および抗−新生血管生成遺伝子よりなる群から選択されることを特徴とする、請求項13に記載の組み換えウィルスベクター。
【請求項15】
前記ウィルスベクターが、アデノビリジアエ属から由来したウィルスであることを特徴とする、請求項13に記載の組み換えウィルスベクター。
【請求項16】
前記治療学的トランス遺伝子がアデノウィルスのE1遺伝子の代わりに導入され、前記組み換えウィルスベクターが複製不能であることを特徴とする、請求項14または15に記載の組み換えウィルスベクター。
【請求項17】
前記治療学的トランス遺伝子がアデノウィルスのE3遺伝子の代わりに導入され、前記組み換えウィルスベクターが複製可能であることを特徴とする、請求項14または15に記載の組み換えウィルスベクター。
【請求項18】
治療学的トランス遺伝子がE1A遺伝子の代わりに導入され、アデノウィルスのE1およびE3電子が除去されたことを特徴とする、請求項14に記載の組み換えウィルスベクター。
【請求項19】
請求項1〜6のいずれか1項に記載の転写調節配列が、治療学的トランス遺伝子に作動可能に連結されたことを特徴とする、組み換え非ウィルスベクター。
【請求項20】
前記治療学的トランス遺伝子が、腫瘍抑制因子遺伝子、抗原性遺伝子、細胞毒性遺伝子、細胞増殖抑制遺伝子、細胞死滅遺伝子および抗−新生血管生成遺伝子よりなる群から選択されることを特徴とする、請求項19に記載の組み換え非ウィルスベクター。
【請求項21】
請求項7〜12のいずれか1項に記載の組み換えウィルスベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項22】
請求項13〜18のいずれか1項に記載の組み換えウィルスベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項23】
請求項19または20に記載の組み換え非ウィルスベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項24】
(a)ヒトのテロメア逆転写酵素プロモーターに一つ以上のc−Myc結合部位および一つ以上のSp1結合部位を含む核酸配列が連結された転写調節配列がウィルスの複製に必要な遺伝子に作動可能に連結された組み換えウィルスベクターの治療学的有効量、および(b)薬剤学的に許容される担体を含む、薬剤学的組成物。
【請求項25】
前記ウィルスベクターが、アデノビリジアエ属から由来したウィルスであることを特徴とする、請求項24に記載の薬剤学的組成物。
【請求項26】
(a)ヒトのテロメア逆転写酵素プロモーターに一つ以上のc−Myc結合部位および一つ以上のSp1結合部位を含む核酸配列が連結された転写調節配列が治療学的トランス遺伝子に作動可能に連結された組み換えウィルスベクターの治療学的有効量、および(b)薬剤学的に許容される担体を含む、薬剤学的組成物。
【請求項27】
前記ウィルスベクターが、アデノビリジアエ属から由来したウィルスであることを特徴とする、請求項26に記載の薬剤学的組成物。
【請求項28】
(a)ヒトのテロメア逆転写酵素プロモーターに一つ以上のc−Myc結合部位および一つ以上のSp1結合部位を含む核酸配列が連結された転写調節配列が治療学的トランス遺伝子に作動可能に連結された組み換え非ウィルスベクターの治療学的有効量、および(b)薬剤学的に許容される担体を含む、薬剤学的組成物。
【請求項1】
ヒトのテロメア逆転写酵素プロモーターに、一つ以上のc−Myc結合部位および/または一つ以上のSp1結合部位を含む核酸配列が連結されたことを特徴とする、転写調節配列。
【請求項2】
ヒトのテロメア逆転写酵素プロモーターに、1つのc−Myc結合部位および5つのSp1結合部位を含む核酸配列が連結されたことを特徴とする、請求項1に記載の転写調節配列。
【請求項3】
c−Myc結合部位が、配列番号2、配列番号3または配列番号4よりなる群から選択されることを特徴とする、請求項1または2に記載の転写調節配列。
【請求項4】
Sp1結合部位が、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9または配列番号10よりなる群から選択されることを特徴とする、請求項1または2に記載の転写調節配列。
【請求項5】
ヒトのテロメア逆転写酵素プロモーターの5'−末端または3'−末端に、一つ以上のc−Myc結合部位および/または一つ以上のSp1結合部位を含む核酸配列が連結されることを特徴とする、請求項1に記載の転写調節配列。
【請求項6】
前記転写調節配列が配列番号13の核酸配列を持つことを特徴とする、請求項1に記載の転写調節配列。
【請求項7】
請求項1〜6のいずれか1項に記載の転写調節配列が、ウィルスの複製に必要な遺伝子に作動可能に連結されたことを特徴とする、組み換えウィルスベクター。
【請求項8】
前記ウィルスベクターが、アデノビリジアエ(adenoviridiae)属から由来したウィルスであることを特徴とする、請求項7に記載の組み換えウィルスベクター。
【請求項9】
前記ウィルスの複製に必要な遺伝子が、アデノウィルスの初期遺伝子であることを特徴とする、請求項7または8に記載の組み換えウィルスベクター。
【請求項10】
前記アデノウィルスの初期遺伝子が、E1A遺伝子であることを特徴とする、請求項9に記載の組み換えウィルスベクター。
【請求項11】
前記アデノウィルスが、E1B19kDa遺伝子の欠失しているものであることを特徴とする、請求項8〜10のいずれか1項に記載の組み換えウィルスベクター。
【請求項12】
前記組み換えウィルスベクターが、KCCM−10470であることを特徴とする、請求項11に記載の組み換えウィルスベクター。
【請求項13】
請求項1〜6のいずれか1項に記載の転写調節配列が、治療学的トランス遺伝子に作動可能に連結されたことを特徴とする、組み換えウィルスベクター。
【請求項14】
前記治療学的トランス遺伝子が、腫瘍抑制因子遺伝子、抗原性遺伝子、細胞毒性遺伝子、細胞増殖抑制遺伝子、細胞死滅遺伝子および抗−新生血管生成遺伝子よりなる群から選択されることを特徴とする、請求項13に記載の組み換えウィルスベクター。
【請求項15】
前記ウィルスベクターが、アデノビリジアエ属から由来したウィルスであることを特徴とする、請求項13に記載の組み換えウィルスベクター。
【請求項16】
前記治療学的トランス遺伝子がアデノウィルスのE1遺伝子の代わりに導入され、前記組み換えウィルスベクターが複製不能であることを特徴とする、請求項14または15に記載の組み換えウィルスベクター。
【請求項17】
前記治療学的トランス遺伝子がアデノウィルスのE3遺伝子の代わりに導入され、前記組み換えウィルスベクターが複製可能であることを特徴とする、請求項14または15に記載の組み換えウィルスベクター。
【請求項18】
治療学的トランス遺伝子がE1A遺伝子の代わりに導入され、アデノウィルスのE1およびE3電子が除去されたことを特徴とする、請求項14に記載の組み換えウィルスベクター。
【請求項19】
請求項1〜6のいずれか1項に記載の転写調節配列が、治療学的トランス遺伝子に作動可能に連結されたことを特徴とする、組み換え非ウィルスベクター。
【請求項20】
前記治療学的トランス遺伝子が、腫瘍抑制因子遺伝子、抗原性遺伝子、細胞毒性遺伝子、細胞増殖抑制遺伝子、細胞死滅遺伝子および抗−新生血管生成遺伝子よりなる群から選択されることを特徴とする、請求項19に記載の組み換え非ウィルスベクター。
【請求項21】
請求項7〜12のいずれか1項に記載の組み換えウィルスベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項22】
請求項13〜18のいずれか1項に記載の組み換えウィルスベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項23】
請求項19または20に記載の組み換え非ウィルスベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項24】
(a)ヒトのテロメア逆転写酵素プロモーターに一つ以上のc−Myc結合部位および/または一つ以上のSp1結合部位を含む核酸配列が連結された転写調節配列がウィルスの複製に必要な遺伝子に作動可能に連結された組み換えウィルスベクターの治療学的有効量、および(b)薬剤学的に許容される担体を含む、薬剤学的組成物。
【請求項25】
前記ウィルスベクターが、アデノビリジアエ属から由来したウィルスであることを特徴とする、請求項24に記載の薬剤学的組成物。
【請求項26】
(a)ヒトのテロメア逆転写酵素プロモーターに一つ以上のc−Myc結合部位および/または一つ以上のSp1結合部位を含む核酸配列が連結された転写調節配列が治療学的トランス遺伝子に作動可能に連結された組み換えウィルスベクターの治療学的有効量、および(b)薬剤学的に許容される担体を含む、薬剤学的組成物。
【請求項27】
前記ウィルスベクターが、アデノビリジアエ属から由来したウィルスであることを特徴とする、請求項26に記載の薬剤学的組成物。
【請求項28】
(a)ヒトのテロメア逆転写酵素プロモーターに一つ以上のc−Myc結合部位および/または一つ以上のSp1結合部位を含む核酸配列が連結された転写調節配列が治療学的トランス遺伝子に作動可能に連結された組み換え非ウィルスベクターの治療学的有効量、および(b)薬剤学的に許容される担体を含む、薬剤学的組成物。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ヒトの野生型テロメア逆転写酵素プロモーターに、一つ以上のc−Myc結合部位および一つ以上のSp1結合部位を含む核酸配列が連結されたことを特徴とする、転写調節配列。
【請求項2】
ヒトのテロメア逆転写酵素プロモーターに、1つのc−Myc結合部位および5つのSp1結合部位を含む核酸配列が連結されたことを特徴とする、請求項1に記載の転写調節配列。
【請求項3】
c−Myc結合部位が、配列番号2、配列番号3または配列番号4よりなる群から選択されることを特徴とする、請求項1または2に記載の転写調節配列。
【請求項4】
Sp1結合部位が、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9または配列番号10よりなる群から選択されることを特徴とする、請求項1または2に記載の転写調節配列。
【請求項5】
ヒトのテロメア逆転写酵素プロモーターの5'−末端または3'−末端に、一つ以上のc−Myc結合部位および一つ以上のSp1結合部位を含む核酸配列が連結されることを特徴とする、請求項1に記載の転写調節配列。
【請求項6】
前記転写調節配列が配列番号13の核酸配列を持つことを特徴とする、請求項1に記載の転写調節配列。
【請求項7】
請求項1〜6のいずれか1項に記載の転写調節配列が、ウィルスの複製に必要な遺伝子に作動可能に連結されたことを特徴とする、組み換えウィルスベクター。
【請求項8】
前記ウィルスベクターが、アデノビリジアエ(adenoviridiae)属から由来したウィルスであることを特徴とする、請求項7に記載の組み換えウィルスベクター。
【請求項9】
前記ウィルスの複製に必要な遺伝子が、アデノウィルスの初期遺伝子であることを特徴とする、請求項7または8に記載の組み換えウィルスベクター。
【請求項10】
前記アデノウィルスの初期遺伝子が、E1A遺伝子であることを特徴とする、請求項9に記載の組み換えウィルスベクター。
【請求項11】
前記アデノウィルスが、E1B19kDa遺伝子の欠失しているものであることを特徴とする、請求項8〜10のいずれか1項に記載の組み換えウィルスベクター。
【請求項12】
前記組み換えウィルスベクターが、KCCM−10470であることを特徴とする、請求項11に記載の組み換えウィルスベクター。
【請求項13】
請求項1〜6のいずれか1項に記載の転写調節配列が、治療学的トランス遺伝子に作動可能に連結されたことを特徴とする、組み換えウィルスベクター。
【請求項14】
前記治療学的トランス遺伝子が、腫瘍抑制因子遺伝子、抗原性遺伝子、細胞毒性遺伝子、細胞増殖抑制遺伝子、細胞死滅遺伝子および抗−新生血管生成遺伝子よりなる群から選択されることを特徴とする、請求項13に記載の組み換えウィルスベクター。
【請求項15】
前記ウィルスベクターが、アデノビリジアエ属から由来したウィルスであることを特徴とする、請求項13に記載の組み換えウィルスベクター。
【請求項16】
前記治療学的トランス遺伝子がアデノウィルスのE1遺伝子の代わりに導入され、前記組み換えウィルスベクターが複製不能であることを特徴とする、請求項14または15に記載の組み換えウィルスベクター。
【請求項17】
前記治療学的トランス遺伝子がアデノウィルスのE3遺伝子の代わりに導入され、前記組み換えウィルスベクターが複製可能であることを特徴とする、請求項14または15に記載の組み換えウィルスベクター。
【請求項18】
治療学的トランス遺伝子がE1A遺伝子の代わりに導入され、アデノウィルスのE1およびE3電子が除去されたことを特徴とする、請求項14に記載の組み換えウィルスベクター。
【請求項19】
請求項1〜6のいずれか1項に記載の転写調節配列が、治療学的トランス遺伝子に作動可能に連結されたことを特徴とする、組み換え非ウィルスベクター。
【請求項20】
前記治療学的トランス遺伝子が、腫瘍抑制因子遺伝子、抗原性遺伝子、細胞毒性遺伝子、細胞増殖抑制遺伝子、細胞死滅遺伝子および抗−新生血管生成遺伝子よりなる群から選択されることを特徴とする、請求項19に記載の組み換え非ウィルスベクター。
【請求項21】
請求項7〜12のいずれか1項に記載の組み換えウィルスベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項22】
請求項13〜18のいずれか1項に記載の組み換えウィルスベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項23】
請求項19または20に記載の組み換え非ウィルスベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項24】
(a)ヒトのテロメア逆転写酵素プロモーターに一つ以上のc−Myc結合部位および一つ以上のSp1結合部位を含む核酸配列が連結された転写調節配列がウィルスの複製に必要な遺伝子に作動可能に連結された組み換えウィルスベクターの治療学的有効量、および(b)薬剤学的に許容される担体を含む、薬剤学的組成物。
【請求項25】
前記ウィルスベクターが、アデノビリジアエ属から由来したウィルスであることを特徴とする、請求項24に記載の薬剤学的組成物。
【請求項26】
(a)ヒトのテロメア逆転写酵素プロモーターに一つ以上のc−Myc結合部位および一つ以上のSp1結合部位を含む核酸配列が連結された転写調節配列が治療学的トランス遺伝子に作動可能に連結された組み換えウィルスベクターの治療学的有効量、および(b)薬剤学的に許容される担体を含む、薬剤学的組成物。
【請求項27】
前記ウィルスベクターが、アデノビリジアエ属から由来したウィルスであることを特徴とする、請求項26に記載の薬剤学的組成物。
【請求項28】
(a)ヒトのテロメア逆転写酵素プロモーターに一つ以上のc−Myc結合部位および一つ以上のSp1結合部位を含む核酸配列が連結された転写調節配列が治療学的トランス遺伝子に作動可能に連結された組み換え非ウィルスベクターの治療学的有効量、および(b)薬剤学的に許容される担体を含む、薬剤学的組成物。
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図3】
【図4】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図5D】
【図5E】
【図5F】
【図5G】
【図5H】
【図5I】
【図5J】
【図5K】
【図5L】
【図5M】
【図5N】
【図5O】
【図6】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【図8D】
【図8E】
【図8F】
【図8G】
【図8H】
【図8I】
【図9】
【図10A】
【図10B】
【図10C】
【図12A】
【図12B】
【図13】
【図14】
【図15A】
【図15B】
【図15C】
【図16A】
【図16B】
【図16C】
【図2A】
【図2B】
【図3】
【図4】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図5D】
【図5E】
【図5F】
【図5G】
【図5H】
【図5I】
【図5J】
【図5K】
【図5L】
【図5M】
【図5N】
【図5O】
【図6】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【図8D】
【図8E】
【図8F】
【図8G】
【図8H】
【図8I】
【図9】
【図10A】
【図10B】
【図10C】
【図12A】
【図12B】
【図13】
【図14】
【図15A】
【図15B】
【図15C】
【図16A】
【図16B】
【図16C】
【公表番号】特表2006−520585(P2006−520585A)
【公表日】平成18年9月14日(2006.9.14)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2006−500654(P2006−500654)
【出願日】平成16年2月27日(2004.2.27)
【国際出願番号】PCT/KR2004/000427
【国際公開番号】WO2004/076668
【国際公開日】平成16年9月10日(2004.9.10)
【出願人】(505326117)
【出願人】(504122066)
【Fターム(参考)】
【公表日】平成18年9月14日(2006.9.14)
【国際特許分類】
【出願日】平成16年2月27日(2004.2.27)
【国際出願番号】PCT/KR2004/000427
【国際公開番号】WO2004/076668
【国際公開日】平成16年9月10日(2004.9.10)
【出願人】(505326117)
【出願人】(504122066)
【Fターム(参考)】
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