改変されたトランスポーター発現を経由してエチルカルバメートの生産を最小化させる酵母の機能的な増強
【課題】低減したエチルカルバメート濃度を有する醗酵飲料及び発酵食品を生産するプロセスを提供する。
【解決手段】醗酵条件下において尿素トランスポーターを発現して活発に尿素を酵母細胞に輸送するように機能的に増強された酵母ストレインを使用する。該酵母を醗酵条件下において細胞内性の尿素分解酵素活性を発現するように増強してもよい。尿素トランスポーターは、例えば、ＤＵＲ３ｐであり得るし、尿素分解酵素活性はＤＵＲ１，２ｐであり得る。
【解決手段】醗酵条件下において尿素トランスポーターを発現して活発に尿素を酵母細胞に輸送するように機能的に増強された酵母ストレインを使用する。該酵母を醗酵条件下において細胞内性の尿素分解酵素活性を発現するように増強してもよい。尿素トランスポーターは、例えば、ＤＵＲ３ｐであり得るし、尿素分解酵素活性はＤＵＲ１，２ｐであり得る。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
エチルカルバメートは、ウレタンとしても知られており、発酵食品及び醗酵飲料への酵母の使用からの直接的な副生成物として形成される。例えば、エチルカルバメート（おそらく発癌性物質である）の形成は、ブドウのマスト（ワイン）の醗酵において、尿素とエタノールの反応によって起こる。
【０００２】
ＤＵＲ１，２の恒常的な（constitutive）発現を経由して尿素を分解する酵母ストレインは、低い（low）エチルカルバメートの濃度の醗酵飲料又は醗酵食品を製造することに使用することができる（Coulon et al., 2006, Am. J. Enol. Vitic.: 113 - 124）。
【０００３】
サッカロミセス・セレビシエにおいて、ＤＵＲ３遺伝子は、ある条件下で酵母細胞に尿素を活発に輸送する尿素トランスポーター（ＤＵＲ３ｐ）をコードする。ＤＵＲ３遺伝子の転写は、通常、窒素カタボライト抑制（NCR）を受ける（ElBerry et al., 1993, J. Bacteriol. 175: 4688 - 4698; Goffeau et al., 1996, Science 274 （5287）, 546-547; Johnston et al., 1994, Science 265 （5181）, 2077-2082）。このことは、炭水化物を利用する酵母細胞における窒素代謝に関与する同化（アナボリック：anabolic）酵素及び異化（カタボリック：catabolic）酵素の調節ネットワークのたった１つの側面である。
【発明の概要】
【０００４】
本発明は、一部分において、醗酵条件下において尿素トランスポーター（ＤＵＲ３など）を発現して、酵母細胞に尿素を活発に輸送するように形質転換した酵母ストレインを使用して、醗酵飲料又は醗酵食品におけるエチルカルバメート濃度の低減を提供する製品及びプロセスに関する。酵母を、醗酵条件下において細胞内性の尿素分解酵素活性（ＤＵＲ１，２など）を発現するように改変することもできる。
【０００５】
本発明は、一部分において、醗酵条件下においてＤＵＲ３を発現する（例えば、恒常的に）ように形質転換した新規の酵母ストレイン、並びに、酵母が醗酵条件下においてＤＵＲ３を発現するようにする（例えば、恒常的に）酵母ストレインの機能的な増強方法、及び、醗酵飲料又は醗酵食品におけるエチルカルバメートの低減のための前記酵母ストレインの使用を提供する。
【０００６】
本発明の他の実施形態において、ＤＵＲ１，２及びＤＵＲ３を恒常的に発現するように形質転換した新規の酵母ストレイン、そして、醗酵飲料又は醗酵食品におけるエチルカルバメートの低減のための前記酵母ストレインの使用が提供される。
【０００７】
本発明の更なる実施形態では、ＤＵＲ３ｐを継続的に（continually）発現するように形質転換した酵母ストレイン、そして、ＤＵＲ３ｐ及び尿素アミドリアーゼ（尿素カルボキシラーゼとアロファン酸ヒドロラーゼの両方の活性を含有する）の双方を継続的に発現するように形質転換した酵母ストレインが提供される。
【０００８】
本発明の更なる実施形態では、醗酵条件下で尿素を継続的に取り込むように形質転換した酵母ストレインが提供される。この実施形態において、前記酵母はＤＵＲ３を恒常的に発現することができる。
【０００９】
本発明の更なる実施形態では、醗酵条件下で尿素を継続的に取り込み、かつ、分解するように形質転換した酵母ストレインが提供される。この実施形態において、前記酵母ストレインはＤＵＲ１，２及びＤＵＲ３の両方を恒常的に発現することができる。
【００１０】
本発明の更なる実施形態では、醗酵条件下において尿素トランスポーターの発現の窒素カタボライト抑制が低減するように前記酵母ストレインを形質転換することを含む酵母ストレインの改変方法が提供される。この実施形態において、前記尿素トランスポーターがＤＵＲ３によってコードされていても良いし、前記尿素トランスポーターがＤＵＲ３ｐであっても良い
【００１１】
本発明の更なる実施形態では、ＤＵＲ３を恒常的に発現するように酵母ストレインを改変する方法が提供される。この実施形態において、前記方法が1/2TRP1-PGKp-DUR3-PGKt-kanMX-1/2TRP1カセットのＴＲＰ１ローカス（locus）への組込みを含んでも良い。この実施形態において、前記方法が、ＤＵＲ３ｐをコードするコーディング配列を含む新規の核酸で前記酵母ストレインを形質転換することを含んでも良い。この実施形態において、前記方法が、窒素カタボライト抑制を受けないプロモーターを含む組換え核酸で前記酵母を形質転換することを含んでもよい。
【００１２】
本発明の更なる実施形態では、醗酵条件下においてＤＵＲ３、又は、ＤＵＲ１，２及びＤＵＲ３の両方を（例えば、恒常的な発現によって）発現する方法など、上述のように機能的に増強した酵母ストレインの使用による醗酵飲料又は醗酵食品の作製方法が提供される。
【００１３】
本発明の更なる実施形態では、ＤＵＲ３、又は、ＤＵＲ１，２及びＤＵＲ３の両方を恒常的に発現して、醗酵飲料又は醗酵食品におけるエチルカルバメートの濃度を低減する形質転換酵母ストレインの使用が提供される。この実施形態において、醗酵飲料又は醗酵食品はワインであり得るし、エチルカルバメートの低減された濃度が３０ｐｐｂ未満であり得る。
【００１４】
本発明の更なる実施形態では、ＤＵＲ３、又は、ＤＵＲ１，２及びＤＵＲ３の両方を恒常的に発現する形質転換酵母ストレインを使用して製造された低減したエチルカルバメート濃度を有する醗酵飲料又は醗酵食品が提供される。この実施形態において、醗酵飲料又は醗酵食品がワインであり得るし、エチルカルバメートの低減された濃度が３０ｐｐｂ未満であり得る。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、ＤＵＲ３の遺伝子カセットを示す。
【００１６】
【図２】図２は、Ｓ・セレビシエのＤＵＲ３ｐのタンパク質配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）を示す。
【００１７】
【図３】図３は、Ｓ・セレビシエのＤＵＲ３のコーディング配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）を示す。
【００１８】
【図４】図４は、ＤＵＲ１，２の開始コドンで終了するＤＵＲ１，２遺伝子の上流領域の部分の配列を示す（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）。２つの推定上のＮＣＲエレメントＧＡＴＡＡ（Ｇ）ボックス（１つは−５４から−５８に位置し、他方は−３２０から−３２４に位置する）及び推定上のＴＡＴＡＡボックスは、ハイライトされている。
【００１９】
【図５】図５は、ＤＵＲ３遺伝子の上流領域の部分の配列を示す（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）。
【００２０】
【図６−１】図６−１は、ＤＵＲ３ｐ（sequence NP_011847.1（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７））と、７つの他のタンパク質（sequence NP_595871.1 （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）、XP_452980.1 （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）、NP_982989.1 （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）, XP_364218.1 （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）、XP_329657.1 （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）、NP_199351.1 （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）及びNP_001065513.1 （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７））との間のホモロジーを表す複数の（multiple）タンパク質配列のアライメントを示す。
【図６−２】図６−２は、図６−１の続きのアライメントを示す。
【図６−３】図６−３は、図６−２の続きのアライメントを示す。
【図６−４】図６−４は、図６−３の続きのアライメントを示す。
【図６−５】図６−５は、図６−４の続きのアライメントを示す。
【図６−６】図６−６は、図６−５の続きのアライメントを示す。
【図６−７】図６−７は、図６−６の続きのアライメントを示す。
【００２１】
【図７−１】図７は、ＤＵＲ３ｐ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）と、サッカロミセス・ポンベの尿素トランスポーター（おそらく）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）とのＢＬＡＳＴ比較を表し、コンセンサス配列を示す。他の実施形態において、本発明の尿素トランスポーターは、Ｓ・セレビシエのＤＵＲ３ｐ配列、Ｓ・ポンベの尿素トランスポーター、又は図７に示したコンセンサス配列との比較において、多様な度合いの同一性（適切に整列させた場合の８０％の同一性など）を有することができる。
【図７−２】図７−２は、図７−１の続きの配列を示す。
【図７−３】図７−３は、図７−２の続きの配列を示す。
【００２２】
【図８】図８は、シャルドネワインの中でのワイン酵母ストレイン５２２、５２２ＤＵＲ１，２［５２２ＥＣ−についての他の名称］、５２２ＤＵＲ３、及び５２２ＤＵＲ１，２/ＤＵＲ３［５２２ＥＣ−ＤＵＲ３についての他の名称］の醗酵プロファイル（重量の減少）を示す。シャルドネワインに最終的にＯＤ６００＝０．１まで接種し、醗酵が完了するまで（〜３００時間）２０℃でインキュベートした濾過していないケローナシャルドネのマストから生産した。醗酵は３回ずつ実行し、データを平均化した；エラーバーは標準偏差を示す。
【００２３】
【図９】図９は、本発明のＤＵＲ３のセルフクローニングカセットの模式図である。
【００２４】
【図１０】図１０は、ｋａｎＭＸマーカーを使用してセルフクローニングleu2-PGK1p-kanMX-PGK1p-DUR3-PGK1t-leu2カセットのＳ・セレビシエ産業ストレインへのＬＥＵ２ローカスへの組込み、次にＰＧＫ１プロモーターの直列反復配列の組換えによってマーカーを欠失させることの模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本願において直接的に定義されていない任意の用語は、本発明の技術分野において理解されるような、その用語から一般的に連想される意味を有すると理解されるべきである。ある用語は、本発明の実施形態の構成物（ないしは、組成物）、装置、方法及び同様のものが記載され、そしてどのようにそれらを作製するまたは使用するかが記載されることで、以下において、あるいは明細書内の他の場所において議論され、実施者に追加的なガイダンスを提供する。同一のものが１つを上回る呼び方で呼ばれ得ることがわかるだろう。従って、他の言い回しや同義語が、本願において議論されるいずれか１つ以上の用語について使用され得る。用語が推敲されているか否か、あるいは本願において議論されているか否かについては、重要性はない。いくつかの同義の、あるいは代用可能な方法、物質及び同様のものが提供される。１つ又はほんの少しの同義語あるいは同等の言葉の記載（recital）は、それが明白に記載されていない限り、他の同義語あるいは同等の言葉の使用を除外しない。明細書における例の使用（用語の例を含む）は、例示のみを目的とし、本発明の実施形態の範囲及び意味を制限するものではない。
【００２６】
本願において記載される場合には、「酵母ストレイン」は、サッカロミセス・セレビシエのストレインであり得る。他の実施形態において、本発明は、例えば、Ｓ・バヤナス（bayanus）酵母ストレイン又はスキツォサッカロミセス（Schizosaccharomyces）酵母ストレインを利用することができる。
【００２７】
他の視点において、本発明は、醗酵に使用され、種々の製品（醗酵飲料又は醗酵食品など）を製造する酵母ストレインに関連する。「醗酵飲料又は醗酵食品」は、ワイン、ブランデー、ウィスキー、蒸留酒、エタノール、酒、シェリー、ビール、パン生地製品（（ないし、練り粉製品：dough）、パン、酢又は醤油であり得るが、それらに限定されない。
【００２８】
種々の視点において、本発明は遺伝子の改変及び組換え遺伝子の使用に関連する。この文脈において、用語「遺伝子」とは、その普通の定義のとおりに使用され、機能上（ないし作動的に）リンクされた（operatively linked）核酸配列の群を意味する。本発明の文脈において、遺伝子の改変とは、当該遺伝子内の、機能上リンクされた種々の配列のいずれか１つの改変を含み得る。（遺伝子発現において）「機能上リンクされた（operatively linked）」とは、特定の配列が直接的又は間接的のいずれかで相互作用し、遺伝子発現の媒介（mediation）又は調節（modulation）など、それらの意図された機能を実行することが意味として表される（以下では、「機能上リンクされ」と称する）。機能上リンクされた配列の相互作用は、例えば、次いで（in turn）核酸配列に相互作用するタンパク質によって媒介され得る。
＜なお、「機能上リンクされ（operatively linked）」とは、プロモーターがコーディング配列の発現をもたらす関係も意味する。従って、「ＤＵＲ３ｐをコードするコーディング配列が窒素カタボライト抑制を受けないプロモーターに機能上リンクされていること」は、「ＤＵＲ３ｐをコードするコーディング配列の発現が、窒素カタボライト抑制を受けないプロモーターによってもたらされること」と言い換えることもできる。＞
【００２９】
本発明の文脈において、「プロモーター」は、転写調節領域が目的の配列に機能上リンクされる場合には、所望の空間的な（spatial）、あるいは時間的な（temporal）パターンに、そして所望の程度まで目的のヌクレオチド配列の転写を媒介する又は調節することができるヌクレオチド配列を意味する。転写調節領域及び目的の配列は、転写調節領域によって媒介又は調節されるべき目的の配列の転写が可能となるように機能的に連結される（connected）場合には、当該転写調節領域及び目的の配列は「機能上リンクされている（operably linked）」と言える。いくつかの実施形態において、転写調節領域は、機能上リンクされるように、目的の配列と同じ鎖（strand）に位置し得る。いくつかの実施形態において転写調節領域は、目的の配列の５’に位置することができる。そのような実施形態において、転写調節領域は、目的の配列の５’に直接的に［連結］してもよいし、あるいはこれらの領域の間に介在配列があっても良い。いくつかの実施形態において、転写調節配列は、目的の配列の３’に位置することができる。転写調節領域及び目的の配列の機能上のリンケージ（operable linkage）が、転写調節領域に結合すべき（転写活性化タンパク質のような）適切な分子を必要としても良く、従って、本発明はインビトロ又はインビボのいずれにおいてもそのような分子が提供される実施形態を包含する。
【００３０】
本発明の種々の遺伝子及び核酸配列は、組換え配列であり得る。用語「組換え」は何かが組換えられていることを意味し、核酸構築物に関しては、当該用語は、ある（some）ポイントで互いに結合され（joined）、分子生物学的な技術の仕方によって生産された核酸配列から構成される分子を意味する。用語「組換え」は、タンパク質又はポリペプチドに関連する場合には、分子生物学的な技術の仕方によって作られた組換え核酸構築物を使用して発現されるタンパク質又はポリペプチドの分子を意味する。用語「組換え」は、遺伝子の組成（genetic composition）に関連して用いられる場合には、天然に生ずる親ゲノムにおいては生じない、新たなるアレルの組み合わせを有する配偶子（gamete）、子孫、細胞又はゲノムを意味する。組換え核酸構築物は、それが自然には連結されない核酸配列（あるいは、自然には異なる場所で連結される核酸配列）に連結される（あるいは、連結するように操作される）ヌクレオチド配列を含むことができる。従って、「組換え体」としての核酸構築物に関しては、核酸分子が遺伝子操作を使用して人の介在によって操作されていることを示す。
【００３１】
組換え核酸構築物は、例えば、形質転換によって宿主細胞に導入することができる。そのような組換え核酸構築物は、同一の宿主細胞種由来の配列、又は異なる宿主細胞種由来の配列を含むことができ、単離して宿主の種の細胞に再導入される。
【００３２】
組換え核酸配列は、宿主細胞の最初の形質転換の結果としてか、あるいは、後の組換え及び／又は修復イベントの結果として、宿主細胞ゲノムに組み込むことができる。あるいは、組換え配列は、染色体外の（extra-chromosomal）エレメントとして維持することもできる。そのような配列を、例えば、形質転換酵母ストレインなどの生命体を、突然変異導入、マスマッチング、又はプロトプラスト融合によって行われるストレイン改良プロセスのためのスタートのストレインとして使用することによって再生産することもできる。本発明の組換え配列を保存する結果として得られたストレインはそれら自体が本願で使用される用語のとしての「組換え体」とみなされる。
【００３３】
本発明の種々の視点において、核酸分子は、例えば、Itakura et al.米国特許番号４，５９８，０４９、Caruthers et al. 米国特許番号４，４５８，０６６、そして、Itakura et al. 米国特許番号４，４０１，７９６、及び４，３７３，０７１などに開示の技術を使用して化学的に合成することができる。そのような合成核酸は、それら自体、本願で使用される用語のとしての「組換え体」である（分子の構成パーツを組み合わせる連続的ステップの生産物である）。
【００３４】
形質転換とは、細胞によって保有（carried）された遺伝的な物質を１つ以上の外来性の核酸の細胞に取り込ませて変化させるプロセスである。例えば、酵母は、種々のプロトコルを使用して形質転換することができる（Gietz et al., 1995）。そのような形質転換は、細胞の遺伝的な物質への外来性の核酸の取り込みによって、あるいは、細胞を外来性の核酸に曝すことによる細胞の内在性の遺伝的な物質における変化によって生じ得る。形質転換体又は形質転換した細胞は、外来性の核酸の取り込みを介して機能的に増強された細胞、又は細胞の子孫である。本願でこれらの用語が使用される場合には、これらの用語は、それ以降の世代の細胞にも存在し得る他の突然変異又は変化とは無関係に所望の遺伝的変化がそれ以降の細胞世代を通じて保存される形質転換細胞の子孫に適用される。
【００３５】
ワイン作製に使用するための形質転換した宿主細胞は、例えば、ブルゴビン（ＲＣ２１２ サッカロミセス・セレビシエ）、ＩＣＶ Ｄ−４７ サッカロミセス・セレビシエ、７１Ｂ−１１２２ サッカロミセス・セレビシエ、Ｋ１Ｖ−１１１６ サッカロミセス・セレビシエ、ＥＣ−１１１８ サッカロミセス・バイヤス、Ｖｉｎ１３、Ｖｉｎ７、Ｎ９６及びＷＥ３５２のようなサッカロミセス・セレビシエ又はスキツォサッカロミセスのストレインを含み得る。酵母ストレインについての商業上の供給源は、Ｌａｌｌｅｍａｎｄ Ｉｎｃ．（カナダ）、ＡＢ Ｍａｕｒｉ（オーストラリア）、Ｌｅｓａｆｆｒｅ（フランス）など、多々存在する。
【００３６】
種々の実施形態において、本発明の諸々の視点では、ＤＵＲ３の尿素輸送活性などの尿素輸送活性を有する内在性又は異種性の酵素を使用することができる。同様に、いくつかの実施形態において、本発明の諸々の視点では、ＤＵＲ１，２ｐの尿素カルボキシラーゼ活性及びアロファン酸ヒドロラーゼ活性などの尿素分解活性を有する内在性又は異種性の酵素を使用することができる。これらの酵素は、例えば、ＤＵＲ３ｐ又はＤＵＲ１，２ｐと相同（homologous）であるか、関連する活性を有するＤＵＲ３ｐ又はＤＵＲ１，２ｐの領域と相同であり得る。
【００３７】
配列間（天然のＤＵＲ３ｐ又はＤＵＲ１，２ｐ、あるいは天然のＤＵＲ３又はＤＵＲ１，２の核酸配列、そして本発明において使用されるその他のタンパク質又は核酸の配列など）の相同性の度合いは、配列を適切に整列（アライン）させたときの同一性のパーセンテージとして表現することができ、配列間の正確なマッチ（matches）の出現率を意味する。同一性比較のための配列の最適なアライメントは、種々のアルゴリズム、例えば、Smith and Waterman, 1981,Adv. Appl. Math 2: 482の局所的ホモロジーアルゴリズム、Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443のホモロジーアライメントアルゴリズム、Pearson and Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444の類似度サーチ方法、そしてこれらアルゴリズムのコンピュータによる実行（Genetics Computer Group, Madison, WI, U.S.A.のウィスコンシンジェネティックスソフトウェアパッケージのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡなど）によって実行することができる。配列のアライメントは、Altschulet al., 1990, J. Mol. Biol. 215: 403-10に記載されたＢＬＡＳＴアルゴリズム（公表されたデフォルト設定を使用）を使用して実行することも可能である。ＢＬＡＳＴ解析を実行するためのソフトウェアは、National Center for Biotechnology Informationから（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/でインターネットを介して）入手可能である。ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、データベース配列中の同じ長さの１つのワードとアラインさせたときに、マッチするか、あるいはいくつかのポジティブな値としての閾値スコアＴを満足する問い合わせ配列（query sequence）中の長さＷの短いワードを同定することによってハイスコア配列対（ＨＳＰｓ）を最初に同定することを含む。Ｔは、近接ワードスコア閾値と称する。最初の近接ワードヒット（複数）は、より長いＨＳＰｓを発見するサーチを開始するためのシーズ（seeds）としての役割を果たす。該ワードヒット（複数）は、累積アライメントスコアが増大可能である限り、個々の配列に沿って両方向に拡張（進行）される。各方向におけるワードヒットの拡張は、以下のパラメータを充足したときに停止する：累積アライメントスコアが最大達成値から量Ｘだけ低下すること；１つ以上のネガティブなスコアを与える残基アライメントの蓄積に応じて累積スコアがゼロ以下になること；又は、いずれかの配列の末端に到達すること。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメータＷ、Ｔ及びＸは、アライメントの精度及び速度を決定する。ＢＬＡＳＴプログラムは、核酸の両方のストランドの比較については、デフォルト設定として以下の値を使用することができる：ワード長（Ｗ）として１１、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Henikoff and Henikoff, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919）、アライメント（Ｂ）として５０、期待値（expectation）（Ｅ）として１０（期待値（Ｅ）は、他の実施形態では１、０．１、０．０１、０．００１又は０．０００１に変えることができる。つまり、０．１より遥かに大きいＥ値では機能的に類似の配列を同定することができないかもしれないが、０．１〜１０の間のＥ値は短い領域の類似性についての低い（lower）有意性を有するヒット（複数）を調べることには有用である。）、Ｍ＝５、Ｎ＝４[sic,−４]。タンパク質の比較については、ＢＬＡＳＴＰは、以下のデフォルト設定を用いて使用することができる：Ｇ＝１１（ギャップを開くためのコスト）；Ｅ＝１（ギャップを拡張するためのコスト）；Ｅ＝１０（期待値、この設定では、規定のアライメントスコアＳと等しいかより良いスコアを有する１０個のヒットが、サーチされるものと同じサイズのデータベースに偶然に現れることが予測される；Ｅ値を増加あるいは減少させてサーチの厳密性を変えることができる）；Ｗ＝３（ワードサイズ、デフォルト値は、ＢＬＡＳＴＮついては１１であり、他のｂｌａｓｔプログラムついては３である）。ＢＬＯＳＵＭマトリックスは、関連するタンパク質内のコンセンサスブロック間で生ずることが知られている置換の頻度に基づくアライメント内の各位置についての確率スコアを与える（assigns）。ＢＬＯＳＵＭ６２（ギャップ存在コスト＝１１；残基当りのギャップコスト＝１；ラムダ比＝０．８５）の置換マトリックスは、ＢＬＡＳＴ２．０ではデフォルトで使用される。ＰＡＭ３０（9, 1, 0.87）；ＰＡＭ７０（10, 1, 0.87）；ＢＬＯＳＵＭ８０（10, 1, 0.87）；ＢＬＯＳＵＭ６２（11, 1, 0.82）及びＢＬＯＳＵＭ４５（14, 2, 0.87）などの種々の他のマトリックスをＢＬＯＳＵＭ６２の代わりに使用することができる。ＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いたときの２つの配列間の統計的類似性の１つの尺度（measure）は、最少和確率（smallest sum probability）（Ｐ（Ｎ））であり、２つのヌクレオチド又はアミノ酸配列の間でのマッチが偶然に生じるであろう確率の指標を提供する。本発明の他の実施形態においては、ヌクレオチド又はアミノ酸配列は、テスト配列の比較において最小和確率がおよそ１未満、好ましくはおよそ０．１未満、より好ましくはおよそ０．０１未満、最も好ましくはおよそ０．００１未満であれば、実質的に同一であるとみなされる。
【００３８】
いくつかの実施形態の中で、本発明の核酸及びタンパク質の配列（複数）は、ＤＵＲ３ｐ又はＤＵＲ１，２ｐ、あるいはＤＵＲ３又はＤＵＲ１，２の核酸配列と実質的に同一であるといったように、実質的に同一であり得る。そのような配列の実質的な同一性は、適切にアラインされたときの同一性のパーセンテージ（例えば、５０％超、８０％〜１００％、少なくとも８０％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％であり得る）に反映され得、遺伝子ターゲッティング基質の場合には、遺伝子ターゲッティング基質の一部とターゲット配列の一部との同一性を意味し、その度合いの同一性は相同的な対合、そして組換え及び／又は修復を促進し得る。２つの核酸配列が実質的に同一であることの他の指標は、当該２つの配列が互いに、適度にストリンジェントな条件下で、好ましくはストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることである。適度にストリンジェントな条件下でのフィルタに結合した配列へのハイブリダイゼーションは、例えば、０．５ＭのＮａＨＰＯ４、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１ｍＭのＥＤＴＡの中で６５℃で行い、そして、０．２ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで４２℃で洗浄するというような条件で行うことができる（Ausubel, et al. (eds), 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, Green Publishing Associates, Inc., and John Wiley & Sons, Inc., New York, p.2.10. 3参照）。あるいは、ストリンジェントな条件下でのフィルタ結合配列へのハイブリダイゼーションは、例えば、０．５Ｍ ＮａＨＰ０４、７％ＳＤＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡの中で６５℃で行い、そして、０．１ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで６８℃で洗浄するというような条件で行うことができる（上記Ausubel, et al. (eds), 1989参照）ハイブリダイゼーション条件は、目的の配列に応じて既知の方法に従って修正してもよい（Tijssen, 1993, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology- - Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2 “Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays”, Elsevier, New York参照）。一般的には、ストリンジェント条件は、所定のイオン強度及びｐＨにおける特定の配列についての熱融解温度よりおよそ５℃低くなるように選択される。ストリンジェントハイブリダイゼーションのための洗浄は、例えば、少なくとも１５分、３０分、４５分、６０分、７５分、９０分、１０５分、又は１２０分であり得る。
【００３９】
ＤＵＲ３又はＤＵＲ１，２などのポリペプチドの構造に、当該ペプチドの生物学的機能を実質的に変化することなく幾つかの修正及び変更を加えて、生物学的に等価なポリペプチドを得ることができることは、本発明の分野において良く知られている。本発明の１つの視点では、尿素輸送活性を有するタンパク質は、保存的アミノ酸置換による天然のＤＵＲ３配列と異なるタンパク質を含み得る。同様に、尿素カルボキシラーゼ及び／又はアロファン酸ヒドロラーゼ活性を有するタンパク質は、保存的アミノ酸置換による天然のＤＵＲ１，２配列と異なるタンパク質を含み得る。本願において使用する場合に、用語「保存されたアミノ酸置換」とは、タンパク質の所与の位置における１つのアミノ酸の他のアミノ酸への置換を意味し、この置換は関連する機能を実質的に喪失させること無く行われる。そのような改変体を作製する際には、アミノ酸残基などの置換を、側鎖置換基の相対的類似性、例えば、サイズ、電荷、疎水性、親水性等に基づいて実行することができるし、そのような置換は、ルーチン的なテストにより、タンパク質の機能に対するそれらの影響についてアッセイすることができる。
【００４０】
いくつかの実施形態において、保存されたアミノ酸置換を行っても良く、この実施形態では、アミノ酸残基は類似の親水性値（例えば、±２．０の範囲内の値）を有する他のアミノ酸残基に置換することによって実行することができる。そのような実施形態では、以下のものがおよそ−１．６の疎水性親水性指標を有するアミノ酸であり得、Ｔｙｒ（−１．３）又はＰｒｏ（−１．６）がアミノ酸残基に割り当てられる（詳細は米国特許番号４，５５４，１０１参照。この文献は引用を持って本書に繰り込まれその開示内容は本書に記載されているものとみなす）：Ａｒｇ（＋３．０）；Ｌｙｓ（＋３．０）；Ａｓｐ（＋３．０）；Ｇｌｕ（＋３．０）；Ｓｅｒ（＋０．３）；Ａｓｎ（＋０．２）；Ｇｌｎ（＋０．２）；Ｇｌｙ（０）；Ｐｒｏ（−０．５）；Ｔｈｒ（−０．４）；Ａｌａ（−０．５）；Ｈｉｓ（−０．５）；Ｃｙｓ（−１．０）；Ｍｅｔ（−１．３）；Ｖａｌ（−１．５）；Ｌｅｕ（−１．８）；Ｉｌｅ（−１．８）；Ｔｙｒ（−２．３）；Ｐｈｅ（−２．５）及びＴｒｐ（−３．４）。
【００４１】
他の実施形態において、保存されたアミノ酸置換を行っても良く、この実施形態では、アミノ酸残基は類似の疎水性親水性指標（例えば±２．０の範囲内の値）を有する他のアミノ酸残基で置換される。そのような実施形態では、個々のアミノ酸残基には、以下のように、その疎水性及び電荷特性に基づいた疎水性親水性指標を割り当てることができる：Ｉｌｅ（＋４．５）；Ｖａｌ（＋４．２）；Ｌｅｕ（＋３．８）；Ｐｈｅ（＋２．８）；Ｃｙｓ（＋２．５）；Ｍｅｔ（＋１．９）；Ａｌａ（＋１．８）；Ｇｌｙ（−０．４）；Ｔｈｒ（−０．７）；Ｓｅｒ（−０．８）；Ｔｒｐ（−０．９）；Ｔｙｒ（−１．３）；Ｐｒｏ（−１．６）；Ｈｉｓ（−３．２）；Ｇｌｕ（−３．５）；Ｇｌｎ（−３．５）；Ａｓｐ（−３．５）；Ａｓｎ（−３．５）；Ｌｙｓ（−３．９）及びＡｒｇ（−４．５）。
【００４２】
他の実施形態において、保存されたアミノ酸置換を行っても良く、この実施形態では、アミノ酸残基を同じクラスの他のアミノ酸残基で置換される。アミノ酸は、以下のように、非極性、酸性、塩基性及び中性の各クラスに分類される：非極性：Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ；酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；塩基性：Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ；中性：Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｔｙｒ。
【００４３】
他の実施形態において、保存されたアミノ酸の変化には、親水性又は疎水性、サイズ又は容積、又は電荷を考慮した変化を含む。アミノ酸は、一般に、主としてアミノ酸側鎖の特性に基づいて、疎水性又は親水性として特徴付けることができる。Eisenberg et al（J. Mol. Bio. 179: 125-142, 184）の規格化されたコンセンサスな疎水性スケールに基づくと、疎水性アミノ酸はゼロより大きい疎水性を示し、親水性アミノ酸はゼロ未満の親水性を示す。遺伝的にコードされた疎水性アミノ酸にはＧｌｙ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ及びＴｒｐが含まれ、遺伝的にコードされた親水性アミノ酸にはＴｈｒ、Ｈｉｓ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ及びＬｙｓが含まれる。非遺伝的にコードされた疎水性アミノ酸にはｔ−ブチルアラニンが含まれ、非遺伝的にコードされた親水性アミノ酸にはシトルリン及びホモシステインが含まれる。
【００４４】
疎水性又は親水性アミノ酸は、それらの側鎖の特徴に基づいて更に細分類することができる。例えば、芳香性アミノ酸は、少なくとも１つの芳香環又はヘテロ芳香族環を含有する側鎖を有する疎水性アミノ酸であり、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＣＮ、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−ＮＯ２、−ＮＯ、−ＮＨ２、−ＮＨＲ、−ＮＲＲ、−Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲＲなどの１つ以上の置換基を含み得る。これらの置換基において、Ｒは、独立して、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、置換（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルケニル、置換（Ｃ１−Ｃ６）アルケニル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキニル、置換（Ｃ１−Ｃ６）アルキニル、（Ｃ５−Ｃ２０）アリール、置換（Ｃ５−Ｃ２０）アリール、（Ｃ６−Ｃ２６）アルカリール（alkaryl）、置換（Ｃ６−Ｃ２６）アルカリール、５−２０員ヘテロアリール、置換５−２０員ヘテロアリール、６−２６員アルクヘテロアリール（alkheteroaryl）又は置換６−２６員アルクヘテロアリールである。遺伝的にコードされた芳香族アミノ酸には、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、及びＴｒｐが含まれる。
【００４５】
無極性アミノ酸とは、生理的なｐＨで非帯電であり、かつ２つの原子間の共有電子対が一般的に当該２つの原子の各々によって等しく保持される結合を有する側鎖（即ち側鎖は極性ではない）を有する疎水性アミノ酸である。遺伝的にコードされた無極性アミノ酸には、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ａｌａ及びＭｅｔが含まれる。無極性アミノ酸は、脂肪族炭化水素側鎖を有する疎水性アミノ酸である脂肪族アミノ酸を含むように更に細分類することができる。遺伝的にコードされた脂肪族アミノ酸には、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ及びＩｌｅが含まれる。
【００４６】
極性アミノ酸とは、生理的なｐＨで非帯電であるが、２つの原子間の共有電子対が一方の原子に偏って保持される１つの結合を有する側鎖を有する親水性アミノ酸である。遺伝的にコードされた極性アミノ酸には、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ及びＧｌｎが含まれる。
【００４７】
酸性アミノ酸とは、７未満の側鎖ｐＫａ値を有する親水性アミノ酸である。酸性アミノ酸は、典型的には、水素イオンの放出により生理的なｐＨで負に帯電した側鎖を有する。遺伝的にコードされた酸性アミノ酸には、Ａｓｐ及びＧｌｕが含まれる。塩基性アミノ酸とは、７より大きい側鎖ｐＫａ値を有する親水性アミノ酸である。塩基性アミノ酸は、典型的には、ヒドロニウムイオンの受容（association）により生理的なｐＨで正に帯電した側鎖を有する。遺伝的にコードされた塩基性アミノ酸には、Ａｒｇ、Ｌｙｓ及びＨｉｓが含まれる。
【００４８】
上述の分類は絶対的なものではなく、１つのアミノ酸が２つ以上のカテゴリーに分類し得ることは、当業者であれば理解することができる。更に、アミノ酸は、特定のアッセイにより又は予め同定されたアミノ酸との比較により、既知の挙動及び／又は特徴的な化学的、物理的又は生物学的な特性に基づいて分類することもできる。
【００４９】
本発明の種々の視点において、宿主の尿素輸送活性及び尿素分解活性は、例えば、ワイン発酵条件下などの発酵条件下で所望のレベルになるように調節することができる。用語「発酵条件（fermentation conditions又はfermenting conditions）」は、サッカロミセス・セレビシエなどの生命体が発酵によってエネルギーを生産する条件、すなわち発酵が行われる培養条件を意味する。広義には、酸素の不在下で微生物の成長のためのエネルギーを産生できる嫌気反応がすべて含まれる。発酵のエネルギーは、基質レベルのリン酸化によって供給される。発酵においては、ある有機化合物（エネルギー源）が電子のドナー（供与体）としての役割を果たし、他の有機化合物が電子アクセプタ（受容体）である。例えば、炭水化物、アミノ酸、プリン及びピリミジンなどの種々の有機基質を発酵に使用することができる。１つの視点では、本発明は、炭水化物を発酵させて、エチルアルコールを生産することができる生物（酵母など）に関連する。
【００５０】
ワインの発酵では、マスト（ブドウ汁）の培養条件は、出発物質として使用されるジュースによって決められる。例えば、ブドウジュースの主成分は、グルコース（典型的にはおよそ７５〜１５０ｇ／Ｌ）、フルクトース（典型的にはおよそ７５〜１５０ｇ／Ｌ）、酒石酸（典型的にはおよそ２〜１０ｇ／Ｌ）、マレイン酸（典型的にはおよそ１〜８ｇ／Ｌ）及び遊離アミノ酸（典型的にはおよそ０．２〜２．５ｇ／Ｌ）である。しかしながら、実質的にはどの果物または糖生成植物（sugary plant）の液汁（sap）であっても、炭水化物のエチルアルコールへの変換が主反応であるプロセスにおいて、アルコール飲料に加工することができる。
【００５１】
ワイン酵母は、典型的には、およそ３．２〜４．５の範囲のｐＨで増殖及び発酵し、およそ０．８５の最小水分活性（又はおよそ８８％の相対湿度）を必要とする。発酵は、自発的に進行させてもよいが、予め発酵させたマストを接種することによって開始することもできる（その場合には、ジュースに、１０６〜およそ１０７ｃｆｕ／ｍＬ（ジュースあたり）の個体数の酵母を接種することができる）。マストに通気して、酵母の個体数を増加させてもよい。ひとたび発酵が始まると、一般的には、嫌気条件が二酸化炭素の急速な生産によって維持される。発酵温度は、通常、１０℃〜３０℃であり、発酵プロセスの期間は、例えば、数日間から数週間に拡張させることができる。
【００５２】
１つの視点では、本発明は、発酵アルコール飲料中のエチルカルバメートの濃度を低減させることが可能な酵母ストレインを提供する。例えば、本発明は、４０ｐｐｂ（μｇ／Ｌ）未満、３５ｐｐｂ（未満）、３０ｐｐｂ（未満）、２５ｐｐｂ（未満）、２０ｐｐｂ（未満）、１５ｐｐｂ（未満）、１０ｐｐｂ（未満）又は５ｐｐｂ（未満）（又は５０ｐｐｂ〜１ｐｐｂの間のいずれかの整数値）の濃度のエチルカルバメートを有するワインを提供することに使用することができる。他の実施形態では、本発明は、およそ５００ｐｐｂ未満、４００ｐｐｂ（未満）、３００ｐｐｂ（未満）、２００ｐｐｂ（未満）、１５０ｐｐｂ（未満）、１００ｐｐｂ（未満）、９０ｐｐｂ（未満）、８０ｐｐｂ（未満）、７０ｐｐｂ（未満）、６０ｐｐｂ（未満）、５０ｐｐｂ（未満）、４０ｐｐｂ（未満）、３０ｐｐｂ（未満）、２０ｐｐｂ（未満）又は１０ｐｐｂ（未満）（又は５００ｐｐｂ〜１０ｐｐｂの間のいずれかの整数値）の濃度のエチルカルバメートを有する栄養強化ワイン又は蒸留酒を提供することに使用することができる。
【００５３】
他の実施形態では、本発明は、ブドウマスト中の低減された尿素濃度を維持することが可能な酵母ストレインを提供することができる。例えば、尿素濃度を、およそ１５ｍｇ／Ｌ（未満）、１０ｍｇ／Ｌ（未満）、５ｍｇ／Ｌ（未満）、４ｍｇ／Ｌ（未満）、３ｍｇ／Ｌ（未満）、２ｍｇ／Ｌ（未満）又は１ｍｇ／Ｌ未満に維持することができる。
【００５４】
１つの視点では、本発明は、醗酵条件下で所望のレベルの尿素分解活性を有する発酵生命体の自然変異体を選択するための方法を提供する。例えば、ＤＵＲ３のＮＣＲが欠失している酵母株を選択することができる。酵母の突然変異及び選択プロトコルの一例としては、2000年10月31日にMortimer et al.に発行された米国特許番号6,140,108を参照されたい。そのような方法では、酵母ストレインをエチルメタンスルホネート、亜硝酸又はヒドロキシルアミンなどの突然変異誘発物質で処置して、塩基対置換を有する突然変異体を作製することができる。改変した尿素分解活性を有する突然変異体は、例えば、適切な培地でプレーティングすることによってスクリーニングすることができる。
【００５５】
他の実施形態では、部位特異的な突然変異導入を採用して、宿主における尿素輸送活性又は尿素分解活性のレベルを変えることができる。例えば、部位特異的な突然変異導入を採用して、ＤＵＲ３又はＤＵＲ１，２ プロモーターなどの酵母のプロモーターからＮＣＲ媒介エレメント（mediating elements）を除去することができる。例えば、図４に示すような、ネイティブなＤＵＲ１，２プロモーター配列におけるＧＡＴＡＡ（Ｇ）ボックスを、削除又は置換改変することができる。１つの実施形態では、例えば、一方又は両方のＧＡＴＡＡボックスを、ＧをＴで置換して改変し、配列をＴＡＴＡＡにすることができる。部位特異的な突然変異導入方法は、例えば、Rothstein, 1991; Simon and Moore, 1987; Winzeler et al., 1999、及びNegritto et al., 1997に開示されている。他の実施形態では、Ｓ・セレビシエにおいてＮＣＲを媒介するＧｌｎ３ｐ及びＧａｔ１ｐをコードする遺伝子を突然変異させて、ＮＣＲを調節することもできる。その際には、選択又は遺伝子操作されてＮＣＲが欠失したプロモーターを、醗酵条件下におけるＤＵＲ３の発現を媒介するように、ＤＵＲ３のコーディング配列に機能上リンクさせることができる。
【００５６】
本発明の酵母ストレインの相対的な尿素輸送活性又は尿素分解酵素活性は、形質転換していない親ストレインと相対的に測定することができる。例えば、本発明の形質転換酵母ストレインは、醗酵条件下において親ストレインよりも大きい（greater）尿素輸送活性又は尿素分解活性を有するもの、又は、例えば、親ストレインの活性の少なくとも１５０％、２００％、２５０％、３００％、４００％又は５００％など、同一の醗酵条件下において親ストレインの活性よりも幾分大きな（some greater）割合の活性を有するものが選択され得る。同様に、本発明の組換え核酸によって発現又はコードされた酵素の活性は、それらが由来する非組換え配列と相対的に決定して、同様の倍率の活性を有するストレインを使用することができる。
【００５７】
本発明の１つの視点では、ＤＵＲ３ポリペプチドの調節された発現を媒介する異種性のプロモーター配列の制御下にＤＵＲ３コーディング配列又はそのホモログを有する組換え核酸分子を含むベクターを提供することができる。そのようなベクターを提供するために、Ｓ・セレビシエからのＤＵＲ３オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を、組換えＤＵＲ３遺伝子の発現を調節する発現カセットを含有するプラスミドに挿入することができる。組換え分子を選択された酵母ストレインに導入して、改変した尿素輸送活性を有する形質転換したストレインを提供することができる。他の実施形態では、Ｓ・セレビシエなどの宿主におけるネイティブなＤＵＲ３コーディング配列のホモログの発現に、ネイティブなプロモーターを他のプロモーターで置き換えることによって影響を与えることもできる。付加的な調節エレメントを、内在性のコーディング配列を利用する組換え発現カセットを構築することに使用することもできる。組換え遺伝子又は発現カセットを、Ｓ・セレビシエなどの宿主の染色体ＤＮＡに組込むこともできる。
【００５８】
本発明の他の側面で使用するプロモーターは、ＰＧＫ１又はＣＡＲ１プロモーターなどの適するネイティブなＳ・セレビシエのプロモーターから選択することができる。そのようなプロモーターは、ＰＧＫ１及びＣＡＲ１ターミネーターなどの付加的な調節エレメントと一緒に使用することができる。種々のネイティブ又は組換え型のプロモーターを使用することができ、その場合にはプロモーターは、選択された条件下（ワイン製造条件下など）での尿素分解活性（ＤＵＲ１，２活性など）の発現を媒介するように選択又は構築される。種々の恒常的なプロモーターを、例えば、ＤＵＲ３のコーディング配列に機能上リンクすることができる。
【００５９】
本発明の１つの視点によれば、宿主の尿素輸送（取り込み）活性を調節する組換え核酸で形質転換した宿主（酵母ストレインなど）を用いた炭水化物の発酵方法（ワインの発酵方法など）が提供される。例えば、ＤＵＲ３遺伝子のＮＣＲを、ワイン製造酵母ストレインにおける尿素の取り込みを増強するように調節することができる。本発明のこの視点によれば、ブドウのマストの発酵を、該酵母ストレインを用いて、エチルカルバメートが限定された量しか産生されないように実行することができる。
【００６０】
本願においては、本発明の種々の実施形態を開示したが、当業者の通常の一般知識に従って、本発明の範囲内において種々の適合化・改変を行うことができる。そのような改変には、実質的に同じ仕方で同じ結果を達成するために、本発明の任意の視点を既知の均等物（equivalent）で置換することが含まれる。数値範囲には、その範囲を定義している数値も含まれる。本願明細書において、用語「含む（comprising）」は、開放型（open-ended）の用語として使用され、実質的には、語句「〜を含むが、それらに限定されない（including, but not limited to）」に等しく、用語「含む（comprises）」は、これに対応する意味を有する。本願における文献の引用を、そのような文献が本発明の先行技術であることの認証として解釈するべきではない。個々の刊行物それぞれが本願において引用によって取り込まれるべきであることが特段かつ個々に示されている場合や、本願において十分に定義されている場合には、本願明細書において引用したすべての刊行物（特許及び特許出願を含むがこれらに限定されない）は、引用によって本願に繰り込まれる。本発明は、上述のような、そして、実施例及び図面に示した実質的に全ての実施形態及びバリエーションを含む。
【００６１】
本発明の１つの実施形態では、醗酵条件下において尿素トランスポーターの発現の窒素カタボライト抑制を低減するように形質転換した酵母ストレインが提供される。例えば、尿素トランスポーターはＤＵＲ３によってコードされていてもよく、該尿素トランスポーターはＤＵＲ３ｐであり得る。
【００６２】
本発明の更なる実施形態では、醗酵条件下において、尿素トランスポーターの発現と尿素分解酵素の発現の両方の窒素カタボライト抑制を低減するように形質転換した酵母ストレインが提供される。尿素トランスポーターはＤＵＲ３によってコードされていてもよく、尿素分解酵素はＤＵＲ１，２によってコードされていてもよく、尿素トランスポーターはＤＵＲ３ｐであり得、尿素分解酵素は尿素カルボキシラーゼ／アロファン酸ヒドロラーゼであり得る。
【００６３】
本発明の更なる実施形態では、醗酵条件下において尿素を継続的に取り込むように形質転換された酵母ストレインが提供される。酵母は、例えば、ＤＵＲ３を恒常的に発現する。
【００６４】
本発明の更なる実施形態では、醗酵条件下において尿素を継続的に取り込みかつ尿素を分解するように形質転換した酵母ストレインが提供される。この実施形態において、酵母ストレインは、ＤＵＲ１，２とＤＵＲ３の両方を恒常的に発現することができる。
【００６５】
本発明の更なる実施形態では、醗酵条件下において尿素トランスポーターの発現の窒素カタボライト（異化代謝産物）抑制を低減させるように酵母ストレインを形質転換することを含む酵母ストレインの改変方法が提供される。尿素トランスポーターは、例えば、ＤＵＲ３によってコードされていてもよく、尿素トランスポーターはＤＵＲ３ｐであり得る。
【００６６】
本発明の更なる実施形態では、醗酵条件下において尿素トランスポーターの発現及び尿素分解酵素の発現の窒素カタボライト抑制を低減させるように酵母ストレインを形質転換することを含む酵母ストレインの改変方法が提供される。尿素トランスポーターはＤＵＲ３によってコードされていても良く、該尿素分解酵素はＤＵＲ１，２によってコードされていてもよく、尿素トランスポーターはＤＵＲ３ｐであり得、該尿素分解酵素は尿素カルボキシラーゼ又はアロファン酸ヒドロラーゼであり得る。
【００６７】
本発明の更なる実施形態では、ＤＵＲ３を恒常的に発現するように酵母ストレインを改変する方法が提供される。該方法は、1/2TRP1-PGKp-DUR３-PGKt-kanMX-1/2TRP1カセットのTRP1ローカスへの組込みを含むことができる。あるいは、該方法は、ＤＵＲ３ｐをコードするコーディング配列を含む組換え核酸を用いて前記酵母ストレインを形質転換することを含むことができる。あるいは、該方法は、窒素カタボライト抑制を受けないプロモーターを含む組換え核酸を用いて前記酵母を形質転換することを含むことができる。
【００６８】
本発明の更なる実施形態では、醗酵条件下において尿素トランスポーターの発現窒素カタボライト抑制を低減させるように形質転換した酵母ストレインを使用する醗酵飲料又は醗酵食品の製造方法が提供される。尿素トランスポーターはＤＵＲ３によってコードされていても良く、尿素トランスポーターはＤＵＲ３ｐであり得る。
【００６９】
本発明の更なる実施形態では、醗酵条件下において尿素トランスポーターの発現及び尿素分解酵素の発現の両方の窒素カタボライト抑制を低減させるように形質転換した酵母ストレインを使用する醗酵飲料又は醗酵食品の製造方法が提供される。尿素トランスポーターはＤＵＲ３によってコードされていても良く、前記尿素分解酵素はＤＵＲ１，２によってコードされていても良い。尿素トランスポーターはＤＵＲ３ｐであり得るし、前記尿素分解酵素は尿素カルボキシラーゼ又はアロファン酸ヒドロラーゼであり得る。
【００７０】
本発明の更なる実施形態では、ＤＵＲ３を恒常的に発現して醗酵飲料又は醗酵食品におけるエチルカルバメートの濃度を低減させる形質転換した酵母ストレインの使用が提供される。
【００７１】
本発明の更なる実施形態では、ＤＵＲ１，２及びＤＵＲ３の両方を恒常的に発現して醗酵飲料又は醗酵食品におけるエチルカルバメートの濃度を低減させる形質転換した酵母ストレインの使用が提供される。
【００７２】
本発明の更なる実施形態では、ＤＵＲ３を恒常的に発現して３０ｐｐｂ未満のエチルカルバメート濃度を有するワインを生産する形質転換した酵母ストレインの使用が提供される。
【００７３】
本発明の更なる実施形態では、ＤＵＲ１，２及びＤＵＲ３の両方を恒常的に発現して３０ｐｐｂ未満のエチルカルバメート濃度を有するワインを生産する形質転換した酵母ストレインの使用が提供される。
【００７４】
本発明の更なる実施形態では、ＤＵＲ３を恒常的に発現する形質転換した酵母ストレインを使用して生産された低減したエチルカルバメート濃度を有する醗酵飲料又は醗酵食品が提供される。
【００７５】
本発明の更なる実施形態では、ＤＵＲ１，２及びＤＵＲ３の両方を恒常的に発現する形質転換した酵母ストレインを使用して生産された低減したエチルカルバメート濃度を有する醗酵飲料又は醗酵食品が提供される。
【００７６】
本発明の更なる実施形態では、ＤＵＲ３を恒常的に発現する形質転換した酵母ストレインを使用して生産された３０ｐｐｂ未満のエチルカルバメート濃度を有するワインが提供される。
【００７７】
本発明の更なる実施形態では、ＤＵＲ１，２及びＤＵＲ３の両方を恒常的に発現する形質転換した酵母ストレインを使用して生産された、３０ｐｐｂ未満のエチルカルバメート濃度を有するワインが提供される。
【実施例】
【００７８】
本発明は、以下の実施例を参照して記載されるが、それら実施例に限定されない。採用された実験手順の記載は、実施例の後に続く。
【実施例１】
【００７９】
サッカロミセス・セレビシエのワインストレインのＤＵＲ３遺伝子のクローニング及び恒常的な（constitutive）発現。
【００８０】
クローンの選択のために、抗生物質耐性マーカーｋａｎＭＸを使用した。酵母ストレインＵＣ Ｄａｖｉｓ ５２２（Montrachet）、Ｐｒｉｓｅ ｄｅ Ｍｏｕｓｓｅ（EC1118）及びＫ７−０１（酒酵母）を、ＤＵＲ３単独、又はＤＵＲ１，２及びＤＵＲ３の両方を恒常的に発現するように形質転換した。広範囲にわたるテスト（extensive testing）は、形質転換した酵母が実質的にそれらの親ストレインと同等であることを示している。すなわち、遺伝子的かつ代謝的な改変は、意図されたＤＵＲ３、又はＤＵＲ１，２及びＤＵＲ３の両方の恒常的な発現のみである。
【実施例２】
【００８１】
ＤＵＲ３遺伝子カセットを用いた酵母の形質転換
【００８２】
酵母をＰＧＫ１のプロモーター及びターミネーターシグナルの制御下にＤＵＲ３遺伝子を含有する組換え核酸で形質転換した。ＰＧＫ１プロモーターはＮＣＲを受けない。ＤＵＲ３遺伝子カセット−1/2TRP1-PGKp-DUR3-PGKt-kanMX-1/2TRP1
【実施例３】
【００８３】
減少したエチルカルバメートの出現を確立するための組換え酵母を用いた醗酵実験
【００８４】
ＤＵＲ３の恒常的な発現は、アルギニン代謝の副生成物として排泄された尿素を再吸収するが、ブドウのマストの中に天然に存在する尿素も吸収する酵母ストレインを創造する。エチルカルバメートの有意な低減が５２２ＤＵＲ３酵母ストレインに曝されたワインにおいて見られ（〜８１％）、２５及び１３％の低減がＫ７ＤＵＲ３及びＰＤＭＤＵＲ３酵母ストレインそれぞれに曝された後に見られた（表１のデータ）。恒常的にＤＵＲ３を発現する酵母が、恒常的にＤＵＲ１，２を発現する酵母と同じ程度に効率的にエチルカルバメート濃度を低減させることも示されている。
【００８５】
ＤＵＲ１，２及びＤＵＲ３の両方の恒常的な発現の組み合わせは、５５２及びＫ７酵母ストレインにおいてＤＵＲ１，２又はＤＵＲ３のいずれか単独とおよそ同じ程度までエチルカルバメートを減少させる。しかしながら、ＰＤＭＥＣ−ＤＵＲ３（ＤＵＲ１，２及びＤＵＲ３）は、ＰＤＭＤＵＲ３（ＤＵＲ３）又はＰＤＭＥＣ（ＤＵＲ１，２）ストレインのいずれか単独よりも大きな（greater）程度にワインのマストにおけるエチルカルバメートを減少させることができる酵母ストレインの例である。
【実施例４】
【００８６】
選択可能マーカーの除去を可能にするセルフ−クローニングカセット
【００８７】
図９及び１０は、形質転換した酵母の選択の次に、直列反復配列（direct repeats）の組換えを経由した抗生物質耐性マーカーの除去を可能にするＤＵＲ３遺伝子のカセットleu2-PGK1p-kanMX-PGKp-DUR3-PGK1t-leu2（以下に記載のようにこの実施例で使用される）を表す。
【００８８】
形質転換した酵母の選択の次に、直列反復配列の組換えを経由した抗生物質耐性マーカーの除去を可能するＰＧＫ１のプロモーター及びターミネーターシグナルの制御下にＤＵＲ３遺伝子を含む組換え核酸で酵母を形質転換した。ＰＧＫ１プロモーターはＮＣＲを受けない。ＤＵＲ３遺伝子カセット−leu2-PGK1p-kanMX-PGKp-DUR3-PGK1t-leu2。４つのストレイン（CY3079、Bordeaux Red、そしてＤＵＲ１，２形質転換ストレインD80ec-及びD254ec-）をleu2-PGK1p-kanMX-PGKp-DUR3-PGK1t-leu2カセットで形質転換した。これは、D254ec-について５５個のストレイン、D80ec-について１２５個のストレイン、Bordeaux Redについておよそ２００個のストレイン、CY3079についておよそ３００個のストレインを産出した。およそ１ストレイン当たりおよそ２０〜６０個のクローンをミニ醗酵のために選択し、ＥＣ低減を決定した。２つのCY3079のクローンは実験室条件下で９４．２％及び４６．５％のＥＣ低減を有し、３つのBordeaux Redのクローンは５７．６％〜６４．９％のＥＣ低減を有し、D80ec-クローンは６０．８％−６６．１％のＥＣ低減を有し、２つのD254ec-クローンは８７．５％及び７５．１％のＥＣ低減を有した。
【００８９】
［上述の実施例において採用した実験手順］
ｐＨＶＸ２Ｄ３の作製
【００９０】
恒常的なＰＧＫ１プロモーター及びターミネーターシグナルの制御下にＤＵＲ３を置くために、ＤＵＲ３のＯＲＦをｐＨＶＸ２にクローニングした。それらの５’末端に構築されたＸｈｏ１制限酵素サイトを含有する以下のプライマーを使用してＤＵＲ３のＯＲＦを５２２ゲノムＤＮＡから増幅した：
DUR3forXho1 （5'-AAAACTCGAGATGGGAGAATTTAAACCTCCGCTAC-3'） （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）
DUR3revXho1 （5'-AAAACTCGAGCTAAATTATTTCATCAACTTGTCCGAAATGTG-3'） （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）。
【００９１】
ＰＣＲの後に、０．８％アガロースゲルで可視化し、ＰＣＲ精製（Qiagen, USA - PCR Purification Kit）して、ＰＣＲ産物（挿入配列）及びｐＨＶＸ２（ベクター）の両方をＸｈｏ１で消化した（Roche, Germany）。消化されたベクターをＳＡＰ（Fermentas, USA）で処理して再び環状化することを防止した後、挿入配列、及び直線化したＳＡＰ処置ベクターをオーバーナイトで２２℃で連結させ（Ｔ４ＤＮＡライゲース - Fermentas, USA）、ライゲーション混合液（5μL）を使用してＤＨ５α（登録商標）コンピテント細胞（Invitrogen, USA）を形質転換し、次に１００μg/mLアンピシリン（Fisher, USA）添加のＬＢ（Difco, USA）プレート上で成長させた。形質転換体コロニーの中で無作為に選択されたもの由来のプラスミドを取得し（Qiagen, USA - QIAprep Spin Miniprep kit）、ＥｃｏＲ１（Roche, Germany）によって消化し、内側−外側のプライマーを使用してＰＣＲを行って、所望の挿入配列を有するプラスミドを確認した。結果として得られたPGK1p-DUR3-PGK1tを含有するプラスミドをｐＨＶＸ２Ｄ３と命名した。
【００９２】
ｐＨＶＸＫＤ３の作製
【００９３】
ｋａｎＭＸマーカーをＸｈｏ１及びＳａｌ１を用いた二重消化を経由してｐＵＧ６から得た。消化の後、１５００ｂｐのｋａｎＭＸのバンドをゲル精製し（Qiagen, USA - Gel Extraction Kit）、直線化したＳＡＰ処置ｐＨＶＸ２Ｄ３のＳａｌ１サイトに連結した。ライゲーション混合液（5μL）を使用してＤＨ５α（登録商標）コンピテント細胞を形質転換し、ＬＢ−アンピシリン（100μg/mL）の上で成長させた。組換えプラスミドを、２４個の無作為に選択したコロニーから単離したプラスミドのＨｉｎｄＩＩＩ（Roche, Germany）消化によって確認した。結果として得られたPGK1p-DUR3-PGK1t-kanMXを含有するプラスミドは、ｐＨＶＸＫＤ３と命名した。
【００９４】
ｐＵＣＴＲＰ１の作製
【００９５】
ＢａｍＨ１そして次にＡｐａ１サイトをそれらのそれらの５’末端に各々含有するＴＲＰ１に特異的なプライマーを使用して、ＴＲＰ１のコード領域を５２２ゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅した：
BamH1Apa1TRP1ORFfwd（5'-AAAAAAGGATCCAAAAAAGGGCCCATGTCTGTTATTAATTTCACAGG-3'）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）
BamH1Apa1TRP1ORFrev（5'-AAAAAAGGATCCAAAAAAGGGCCCCTATTTCTTAGCATTTTTGACG-3'）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）。
【００９６】
増幅の後、精製し、定量し、〜７５０ｂｐのフラグメントを直線化したＳＡＰ処置ｐＵＣ１８のBａｍＨ１（Roche, Germany）サイトに連結した。組換えプラスミドを最初に青／白スクリーニング（５０μg/mLのＸｇａｌを添加したＬＢ−アンピシリンでの成長）を介して確認し、次にＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲ１消化を介して確かめた。結果として得られたＴＲＰ１を含有するプラスミドは、ｐＵＣＴＲＰ１と呼ばれる。
【００９７】
ｐＵＣＭＤの作製
【００９８】
ｐＨＶＸＫＤ３の中に配置されたPGK1p-DUR3-PGK1t-kanMXカセットをカセットに特異的なプライマーを使用してｐＨＶＸＫＤ３プラスミドＤＮＡから増幅した：
pHVXKfwdlong（5'-CTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAG-3'） （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）
pHVXKrevlong（5'-CTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGG-3'） （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）。
【００９９】
増幅の後、精製し、定量し、直線化したＳＡＰ処置ｐＵＣＴＲＰ１の平滑状のＥｃｏＲＶ（Fermentas, USA）サイトへのライゲーションを促進するために、〜６５００ｂｐの平滑末端のＰＣＲ合成フラグメントをポリヌクレオチドキナーゼで処理した（New England Biolabs, USA）。
【０１００】
組換えプラスミドを最初にＥ−ｌｙｓｅ解析を使用して確認し、その後にＡｐａ１（Stratagene, USA）／Ｓａｌ１消化を経由して確かめた。手短に言えば、Ｅ−ｌｙｓｅは、アガロースゲルのウェル内にコロニーを溶解し、次に電気泳動することによって、プラスミドＤＮＡの存在について大多数のコロニーを効率的にスクリーニングする。より明確には、選択培地にパッチング（patching）した後、コロニーの小さな（small）アリコットを５μＬのＴＢＥバッファーに懸濁し、次に、１０μＬのＳＲＬバッファー（２５％ｖ／ｖスクロース、５０μｇ／ｍＬＲＮａｓｅ、１ｍｇ／ｍＬリゾチーム）と混合した。ピペッティングによって混合した後、細胞懸濁液を０．２％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ−０．８％（ｗ／ｖ）アガロースゲルのウェルに載せた。ウェル内の細胞懸濁液が細胞の溶解を示すクリア状態（clear）になった後（〜３０分）、ＤＮＡを２０Ｖで４５分、次に８０Ｖで４５分間電気泳動した。最後に、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｓａｆｅ （Invitrogen, USA）で要求されているようにゲルを染色した。
【０１０１】
直線状のＤＵＲ３カセットのＳ・セレビシエへの形質転換及び形質転換体の選択
【０１０２】
６５３６ｂｐのＤＵＲ３カセットをＡｐａ１（Stratagene, USA）を使用してｐＵＣＭＤから切り出し、０．８％アガロースゲルで可視化した。ゲルから、予測された６５３６ｂｐのバンドを分離し、抽出した（Qiagen, USA - Gel extraction kit）。抽出の後、精製し、ナノドロップＮＤ−１０００分光光度計（Nanodrop, USA）を使用して定量し、２５０ｎｇの直線状のカセットを使用してＳ・セレビシエのストレインである５２２、５２２ＥＣ−、ＰＤＭ、ＰＤＭＥＣ−、Ｋ７及びＫ７ＥＣ−を形質転換した。酵母ストレインをリチウム酢酸／ポリエチレングリコール／ｓｓＤＮＡ法を使用して形質転換した。形質転換の後、３００μｇ／ｍＬのＧ４１８（Sigma, USA）を添加したＹＰＤプレートに蒔く前に３０℃のＹＰＤに２時間放置して回復させた。プレートは３０℃でコロニーが出現するまでインキュベートした。
【０１０３】
ケローナシャルドネ（Calona Chardonnay）
【０１０４】
ろ過していないシャルドネブドウのジュース（23.75 Brix, pH 3.41,アンモニア 91.6 mg/L, FAN 309.6 mg/L）をオカナガンバレー（Okanagan Valley）のケローナワインヤード（Calona Vineyards）から取得し、改変した酵母の接種のために使用した。鮮度良く線画されたＹＰＤプレートから、親ストレイン（５２２、ＰＤＭ、Ｋ７及びＫ９）及び適切な機能的に増強されたストレインの単一コロニーを５ｍＬのＹＰＤに接種し、オーバーナイトで成長させた（３０℃、ロータリーホイール）。細胞を５０ｍＬのＹＰＤに継代し（OD600 = 0.05）、再びオーバーナイトで成長させた（３０℃、１８０ｒｐｍシェイカーバス）。細胞を遠心分離（５０００ｒｐｍ、４℃、５分間）によって取得し、５０ｍＬの滅菌水で一度洗浄した。細胞のペレットを５ｍＬの滅菌水に再懸濁し、ＯＤ６００を測定した。ケローナワインヤード、ケロウナ（Kelowna）、ＢＣ、カナダから得たろ過していないシャルドネのジュース２００ｍＬで満たした滅菌した２５０ｍＬのショットボトル（Schott bottles）に、最終的にＯＤ６００＝０．１まで、接種することに細胞懸濁液を使用した。滅菌水で満たされた滅菌した（７０％ ｖ／ｖ エタノール）蒸気ロックで無菌的に密閉した。密閉したボトルを２０℃でインキュベートし、毎日重量を測定してＣＯ２の生産をモニタした。データをエクセルにプロットして醗酵プロファイルを作製した。醗酵の終了時において、細胞を遠心分離によって除去し（５０００ｒｐｍ、４℃、５分間）、〜５０ｍＬのワインを滅菌した５０ｍＬのショットボトルにデカントした。ボトルを７０℃のウォーターバス内で正確に４８時間インキュベートしてＥＣの産出を最大限にし（maximize）、次に４℃でＧＣ／ＭＳ解析まで保管した
【０１０５】
ＳＰＭＥ及びＧＣ−ＭＳによるワイン内のエチルカルバメートの定量
【０１０６】
シャルドネワインを７０℃で４８時間加熱して、エチルカルバメートの産出を促進させた。１０−ｍＬのワインサンプルを２０−ｍＬのサンプルバイアルにピペットで入れた。小さい（small）磁石の攪拌子及び３ｇのＮａＣｌを加え、バイアルをＰＴＦＥ／シリコンのセプタム（septum）でキャップした。バイアルを２２℃でスターラーの上に置き、攪拌で１５分間平衡化するようにした。ＳＰＭＥファイバー（６５μｍ カーボワックス/ジビニルベンゼン）を使用する前に２５０℃で３０分間慣らした（conditioned）。サンプルの平衡化の後に、ファイバーをヘッドスペース（headspace）に挿入した。３０分後、ファイバーをサンプルバイアルから除去し、インジェクションポートに１５分間挿入した。ブランクのランを各サンプルのランの前に実行した。定量は、外部の（external）標準的な方法を使用して行った。１２％（ｖ／ｖ）エタノール及び１ｍＭ酒石酸をｐＨ３．１で含有する蒸留したＨ２Ｏの中で０．１ｍｇ／ｍＬでエチルカルバメート（Sigma-Aldrich, Milwaukee, WI）標準保存溶液を調製した。５、１０、２０、４０、９０μｇ／ＬのＥＣ濃度のもので検量標準（calibration standards）を調製した。標準溶液を冷蔵庫の中で４℃で保管した。ワインの中のエチルカルバメートは、5973N Mass Selective Detectorにインターフェース接続されたAgilent 6890N GCを使用して定量した。６０ｍ ｘ ０．２５ｍｍ（内径）、０．２５μｍ（厚さ）のDBWAX fused-silica open tubular column（J&W Scientific, Folsom, CA）を採用した。キャリアガスは、３６ｃｍ／ｓのコンスタントな流速の超高純度のヘリウムであった。インジェクター及びトランスファーラインの温度は２５０℃にセットした。オーブンの温度は、最初は２分間７０℃にセットし、次に、８℃／分で１８０℃まで上昇させ、３分間保持した。温度は、次に、２０℃／分づつ２２０℃まで増加し、１５分間保持するようにプログラムした。全体のラン時間は、３５．７５分であった。インジェクションモードは、５分間のスプリットレスであった（パージフロー：５ｍＬ／分、パージ時間：５分間）。ＭＳは、電子衝撃イオン化法を用いて選択イオンモニタリング（selected ion monitoring: SIM）モードで実施した；MS quadの温度は１５０℃であり、MS sourceの温度は２３０℃であった。溶媒ディレイは８分であった。特異的なイオン４４、６２、７４、８９が１００ミリ秒のドウェルタイムでモニタされた。Mass 62を信頼のおける（authentic）ＥＣ標準のマススペクトルに対する定量に使用した。
【０１０７】
醗酵プロファイルを図８に示し、機能的に増強されたストレインとコントロールストレインによって産出したエタノールの最終的な量を表２に示す。
【０１０８】
ワイン作製の間のエチルカルバメート低減の概要
酒酵母ストレイン（Ｋ７、Ｋ７ＥＣ−（８）、Ｋ７ＤＵＲ３、Ｋ７ＥＣ−ＤＵＲ３）、そしてワイン酵母ストレイン（５２２、５２２ＥＣ−、５２２ＤＵＲ３、５２２ＥＣ−ＤＵＲ３、ＰＤＭ、ＰＤＭＥＣ−、ＰＤＭＤＵＲ３、ＰＤＭＥＣ−ＤＵＲ３）によって濾過されていないケローナシャルドネマストから生産されたシャルドネワインの中のエチルカルバメート（μｇ／Ｌ）をＧＣ／ＭＳによって定量した。醗酵が完了するまで（〜３００時間）２０℃でインキュベートした。
ＥＣ−ＤＵＲ１，２の恒常的な発現
ＤＵＲ３ＤＵＲ３の恒常的な発現
ＥＣ−ＤＵＲ３ＤＵＲ１，２及びＤＵＲ３の組み合わせられた恒常的な発現
［表１］
【０１０９】
シャルドネワインの中でのワイン酵母ストレイン（５２２、５２２ＤＵＲ１，２［５２２ＥＣ−についての他の名称］、５２２ＤＵＲ３、及び５２２ＤＵＲ１，２/ＤＵＲ３［５２２ＥＣ−ＤＵＲ３についての他の名称］）によるエタノールの生産。エタノール含有量（％ｖ／ｖ）は、醗酵の終了時にＬＣによって測定した。醗酵プロファイルを図３［sic, 図８］に示す。統計的な有意性についてデータを２要因ＡＮＯＶＡ解析を使用して解析した（ｐ≦０．０５）。
［表２］
ｓ：ｐ≦０．０５で有意、ｎ：有意でない
【背景技術】
【０００１】
エチルカルバメートは、ウレタンとしても知られており、発酵食品及び醗酵飲料への酵母の使用からの直接的な副生成物として形成される。例えば、エチルカルバメート（おそらく発癌性物質である）の形成は、ブドウのマスト（ワイン）の醗酵において、尿素とエタノールの反応によって起こる。
【０００２】
ＤＵＲ１，２の恒常的な（constitutive）発現を経由して尿素を分解する酵母ストレインは、低い（low）エチルカルバメートの濃度の醗酵飲料又は醗酵食品を製造することに使用することができる（Coulon et al., 2006, Am. J. Enol. Vitic.: 113 - 124）。
【０００３】
サッカロミセス・セレビシエにおいて、ＤＵＲ３遺伝子は、ある条件下で酵母細胞に尿素を活発に輸送する尿素トランスポーター（ＤＵＲ３ｐ）をコードする。ＤＵＲ３遺伝子の転写は、通常、窒素カタボライト抑制（NCR）を受ける（ElBerry et al., 1993, J. Bacteriol. 175: 4688 - 4698; Goffeau et al., 1996, Science 274 （5287）, 546-547; Johnston et al., 1994, Science 265 （5181）, 2077-2082）。このことは、炭水化物を利用する酵母細胞における窒素代謝に関与する同化（アナボリック：anabolic）酵素及び異化（カタボリック：catabolic）酵素の調節ネットワークのたった１つの側面である。
【発明の概要】
【０００４】
本発明は、一部分において、醗酵条件下において尿素トランスポーター（ＤＵＲ３など）を発現して、酵母細胞に尿素を活発に輸送するように形質転換した酵母ストレインを使用して、醗酵飲料又は醗酵食品におけるエチルカルバメート濃度の低減を提供する製品及びプロセスに関する。酵母を、醗酵条件下において細胞内性の尿素分解酵素活性（ＤＵＲ１，２など）を発現するように改変することもできる。
【０００５】
本発明は、一部分において、醗酵条件下においてＤＵＲ３を発現する（例えば、恒常的に）ように形質転換した新規の酵母ストレイン、並びに、酵母が醗酵条件下においてＤＵＲ３を発現するようにする（例えば、恒常的に）酵母ストレインの機能的な増強方法、及び、醗酵飲料又は醗酵食品におけるエチルカルバメートの低減のための前記酵母ストレインの使用を提供する。
【０００６】
本発明の他の実施形態において、ＤＵＲ１，２及びＤＵＲ３を恒常的に発現するように形質転換した新規の酵母ストレイン、そして、醗酵飲料又は醗酵食品におけるエチルカルバメートの低減のための前記酵母ストレインの使用が提供される。
【０００７】
本発明の更なる実施形態では、ＤＵＲ３ｐを継続的に（continually）発現するように形質転換した酵母ストレイン、そして、ＤＵＲ３ｐ及び尿素アミドリアーゼ（尿素カルボキシラーゼとアロファン酸ヒドロラーゼの両方の活性を含有する）の双方を継続的に発現するように形質転換した酵母ストレインが提供される。
【０００８】
本発明の更なる実施形態では、醗酵条件下で尿素を継続的に取り込むように形質転換した酵母ストレインが提供される。この実施形態において、前記酵母はＤＵＲ３を恒常的に発現することができる。
【０００９】
本発明の更なる実施形態では、醗酵条件下で尿素を継続的に取り込み、かつ、分解するように形質転換した酵母ストレインが提供される。この実施形態において、前記酵母ストレインはＤＵＲ１，２及びＤＵＲ３の両方を恒常的に発現することができる。
【００１０】
本発明の更なる実施形態では、醗酵条件下において尿素トランスポーターの発現の窒素カタボライト抑制が低減するように前記酵母ストレインを形質転換することを含む酵母ストレインの改変方法が提供される。この実施形態において、前記尿素トランスポーターがＤＵＲ３によってコードされていても良いし、前記尿素トランスポーターがＤＵＲ３ｐであっても良い
【００１１】
本発明の更なる実施形態では、ＤＵＲ３を恒常的に発現するように酵母ストレインを改変する方法が提供される。この実施形態において、前記方法が1/2TRP1-PGKp-DUR3-PGKt-kanMX-1/2TRP1カセットのＴＲＰ１ローカス（locus）への組込みを含んでも良い。この実施形態において、前記方法が、ＤＵＲ３ｐをコードするコーディング配列を含む新規の核酸で前記酵母ストレインを形質転換することを含んでも良い。この実施形態において、前記方法が、窒素カタボライト抑制を受けないプロモーターを含む組換え核酸で前記酵母を形質転換することを含んでもよい。
【００１２】
本発明の更なる実施形態では、醗酵条件下においてＤＵＲ３、又は、ＤＵＲ１，２及びＤＵＲ３の両方を（例えば、恒常的な発現によって）発現する方法など、上述のように機能的に増強した酵母ストレインの使用による醗酵飲料又は醗酵食品の作製方法が提供される。
【００１３】
本発明の更なる実施形態では、ＤＵＲ３、又は、ＤＵＲ１，２及びＤＵＲ３の両方を恒常的に発現して、醗酵飲料又は醗酵食品におけるエチルカルバメートの濃度を低減する形質転換酵母ストレインの使用が提供される。この実施形態において、醗酵飲料又は醗酵食品はワインであり得るし、エチルカルバメートの低減された濃度が３０ｐｐｂ未満であり得る。
【００１４】
本発明の更なる実施形態では、ＤＵＲ３、又は、ＤＵＲ１，２及びＤＵＲ３の両方を恒常的に発現する形質転換酵母ストレインを使用して製造された低減したエチルカルバメート濃度を有する醗酵飲料又は醗酵食品が提供される。この実施形態において、醗酵飲料又は醗酵食品がワインであり得るし、エチルカルバメートの低減された濃度が３０ｐｐｂ未満であり得る。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、ＤＵＲ３の遺伝子カセットを示す。
【００１６】
【図２】図２は、Ｓ・セレビシエのＤＵＲ３ｐのタンパク質配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）を示す。
【００１７】
【図３】図３は、Ｓ・セレビシエのＤＵＲ３のコーディング配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）を示す。
【００１８】
【図４】図４は、ＤＵＲ１，２の開始コドンで終了するＤＵＲ１，２遺伝子の上流領域の部分の配列を示す（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）。２つの推定上のＮＣＲエレメントＧＡＴＡＡ（Ｇ）ボックス（１つは−５４から−５８に位置し、他方は−３２０から−３２４に位置する）及び推定上のＴＡＴＡＡボックスは、ハイライトされている。
【００１９】
【図５】図５は、ＤＵＲ３遺伝子の上流領域の部分の配列を示す（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）。
【００２０】
【図６−１】図６−１は、ＤＵＲ３ｐ（sequence NP_011847.1（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７））と、７つの他のタンパク質（sequence NP_595871.1 （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）、XP_452980.1 （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）、NP_982989.1 （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）, XP_364218.1 （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）、XP_329657.1 （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）、NP_199351.1 （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）及びNP_001065513.1 （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７））との間のホモロジーを表す複数の（multiple）タンパク質配列のアライメントを示す。
【図６−２】図６−２は、図６−１の続きのアライメントを示す。
【図６−３】図６−３は、図６−２の続きのアライメントを示す。
【図６−４】図６−４は、図６−３の続きのアライメントを示す。
【図６−５】図６−５は、図６−４の続きのアライメントを示す。
【図６−６】図６−６は、図６−５の続きのアライメントを示す。
【図６−７】図６−７は、図６−６の続きのアライメントを示す。
【００２１】
【図７−１】図７は、ＤＵＲ３ｐ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）と、サッカロミセス・ポンベの尿素トランスポーター（おそらく）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）とのＢＬＡＳＴ比較を表し、コンセンサス配列を示す。他の実施形態において、本発明の尿素トランスポーターは、Ｓ・セレビシエのＤＵＲ３ｐ配列、Ｓ・ポンベの尿素トランスポーター、又は図７に示したコンセンサス配列との比較において、多様な度合いの同一性（適切に整列させた場合の８０％の同一性など）を有することができる。
【図７−２】図７−２は、図７−１の続きの配列を示す。
【図７−３】図７−３は、図７−２の続きの配列を示す。
【００２２】
【図８】図８は、シャルドネワインの中でのワイン酵母ストレイン５２２、５２２ＤＵＲ１，２［５２２ＥＣ−についての他の名称］、５２２ＤＵＲ３、及び５２２ＤＵＲ１，２/ＤＵＲ３［５２２ＥＣ−ＤＵＲ３についての他の名称］の醗酵プロファイル（重量の減少）を示す。シャルドネワインに最終的にＯＤ６００＝０．１まで接種し、醗酵が完了するまで（〜３００時間）２０℃でインキュベートした濾過していないケローナシャルドネのマストから生産した。醗酵は３回ずつ実行し、データを平均化した；エラーバーは標準偏差を示す。
【００２３】
【図９】図９は、本発明のＤＵＲ３のセルフクローニングカセットの模式図である。
【００２４】
【図１０】図１０は、ｋａｎＭＸマーカーを使用してセルフクローニングleu2-PGK1p-kanMX-PGK1p-DUR3-PGK1t-leu2カセットのＳ・セレビシエ産業ストレインへのＬＥＵ２ローカスへの組込み、次にＰＧＫ１プロモーターの直列反復配列の組換えによってマーカーを欠失させることの模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本願において直接的に定義されていない任意の用語は、本発明の技術分野において理解されるような、その用語から一般的に連想される意味を有すると理解されるべきである。ある用語は、本発明の実施形態の構成物（ないしは、組成物）、装置、方法及び同様のものが記載され、そしてどのようにそれらを作製するまたは使用するかが記載されることで、以下において、あるいは明細書内の他の場所において議論され、実施者に追加的なガイダンスを提供する。同一のものが１つを上回る呼び方で呼ばれ得ることがわかるだろう。従って、他の言い回しや同義語が、本願において議論されるいずれか１つ以上の用語について使用され得る。用語が推敲されているか否か、あるいは本願において議論されているか否かについては、重要性はない。いくつかの同義の、あるいは代用可能な方法、物質及び同様のものが提供される。１つ又はほんの少しの同義語あるいは同等の言葉の記載（recital）は、それが明白に記載されていない限り、他の同義語あるいは同等の言葉の使用を除外しない。明細書における例の使用（用語の例を含む）は、例示のみを目的とし、本発明の実施形態の範囲及び意味を制限するものではない。
【００２６】
本願において記載される場合には、「酵母ストレイン」は、サッカロミセス・セレビシエのストレインであり得る。他の実施形態において、本発明は、例えば、Ｓ・バヤナス（bayanus）酵母ストレイン又はスキツォサッカロミセス（Schizosaccharomyces）酵母ストレインを利用することができる。
【００２７】
他の視点において、本発明は、醗酵に使用され、種々の製品（醗酵飲料又は醗酵食品など）を製造する酵母ストレインに関連する。「醗酵飲料又は醗酵食品」は、ワイン、ブランデー、ウィスキー、蒸留酒、エタノール、酒、シェリー、ビール、パン生地製品（（ないし、練り粉製品：dough）、パン、酢又は醤油であり得るが、それらに限定されない。
【００２８】
種々の視点において、本発明は遺伝子の改変及び組換え遺伝子の使用に関連する。この文脈において、用語「遺伝子」とは、その普通の定義のとおりに使用され、機能上（ないし作動的に）リンクされた（operatively linked）核酸配列の群を意味する。本発明の文脈において、遺伝子の改変とは、当該遺伝子内の、機能上リンクされた種々の配列のいずれか１つの改変を含み得る。（遺伝子発現において）「機能上リンクされた（operatively linked）」とは、特定の配列が直接的又は間接的のいずれかで相互作用し、遺伝子発現の媒介（mediation）又は調節（modulation）など、それらの意図された機能を実行することが意味として表される（以下では、「機能上リンクされ」と称する）。機能上リンクされた配列の相互作用は、例えば、次いで（in turn）核酸配列に相互作用するタンパク質によって媒介され得る。
＜なお、「機能上リンクされ（operatively linked）」とは、プロモーターがコーディング配列の発現をもたらす関係も意味する。従って、「ＤＵＲ３ｐをコードするコーディング配列が窒素カタボライト抑制を受けないプロモーターに機能上リンクされていること」は、「ＤＵＲ３ｐをコードするコーディング配列の発現が、窒素カタボライト抑制を受けないプロモーターによってもたらされること」と言い換えることもできる。＞
【００２９】
本発明の文脈において、「プロモーター」は、転写調節領域が目的の配列に機能上リンクされる場合には、所望の空間的な（spatial）、あるいは時間的な（temporal）パターンに、そして所望の程度まで目的のヌクレオチド配列の転写を媒介する又は調節することができるヌクレオチド配列を意味する。転写調節領域及び目的の配列は、転写調節領域によって媒介又は調節されるべき目的の配列の転写が可能となるように機能的に連結される（connected）場合には、当該転写調節領域及び目的の配列は「機能上リンクされている（operably linked）」と言える。いくつかの実施形態において、転写調節領域は、機能上リンクされるように、目的の配列と同じ鎖（strand）に位置し得る。いくつかの実施形態において転写調節領域は、目的の配列の５’に位置することができる。そのような実施形態において、転写調節領域は、目的の配列の５’に直接的に［連結］してもよいし、あるいはこれらの領域の間に介在配列があっても良い。いくつかの実施形態において、転写調節配列は、目的の配列の３’に位置することができる。転写調節領域及び目的の配列の機能上のリンケージ（operable linkage）が、転写調節領域に結合すべき（転写活性化タンパク質のような）適切な分子を必要としても良く、従って、本発明はインビトロ又はインビボのいずれにおいてもそのような分子が提供される実施形態を包含する。
【００３０】
本発明の種々の遺伝子及び核酸配列は、組換え配列であり得る。用語「組換え」は何かが組換えられていることを意味し、核酸構築物に関しては、当該用語は、ある（some）ポイントで互いに結合され（joined）、分子生物学的な技術の仕方によって生産された核酸配列から構成される分子を意味する。用語「組換え」は、タンパク質又はポリペプチドに関連する場合には、分子生物学的な技術の仕方によって作られた組換え核酸構築物を使用して発現されるタンパク質又はポリペプチドの分子を意味する。用語「組換え」は、遺伝子の組成（genetic composition）に関連して用いられる場合には、天然に生ずる親ゲノムにおいては生じない、新たなるアレルの組み合わせを有する配偶子（gamete）、子孫、細胞又はゲノムを意味する。組換え核酸構築物は、それが自然には連結されない核酸配列（あるいは、自然には異なる場所で連結される核酸配列）に連結される（あるいは、連結するように操作される）ヌクレオチド配列を含むことができる。従って、「組換え体」としての核酸構築物に関しては、核酸分子が遺伝子操作を使用して人の介在によって操作されていることを示す。
【００３１】
組換え核酸構築物は、例えば、形質転換によって宿主細胞に導入することができる。そのような組換え核酸構築物は、同一の宿主細胞種由来の配列、又は異なる宿主細胞種由来の配列を含むことができ、単離して宿主の種の細胞に再導入される。
【００３２】
組換え核酸配列は、宿主細胞の最初の形質転換の結果としてか、あるいは、後の組換え及び／又は修復イベントの結果として、宿主細胞ゲノムに組み込むことができる。あるいは、組換え配列は、染色体外の（extra-chromosomal）エレメントとして維持することもできる。そのような配列を、例えば、形質転換酵母ストレインなどの生命体を、突然変異導入、マスマッチング、又はプロトプラスト融合によって行われるストレイン改良プロセスのためのスタートのストレインとして使用することによって再生産することもできる。本発明の組換え配列を保存する結果として得られたストレインはそれら自体が本願で使用される用語のとしての「組換え体」とみなされる。
【００３３】
本発明の種々の視点において、核酸分子は、例えば、Itakura et al.米国特許番号４，５９８，０４９、Caruthers et al. 米国特許番号４，４５８，０６６、そして、Itakura et al. 米国特許番号４，４０１，７９６、及び４，３７３，０７１などに開示の技術を使用して化学的に合成することができる。そのような合成核酸は、それら自体、本願で使用される用語のとしての「組換え体」である（分子の構成パーツを組み合わせる連続的ステップの生産物である）。
【００３４】
形質転換とは、細胞によって保有（carried）された遺伝的な物質を１つ以上の外来性の核酸の細胞に取り込ませて変化させるプロセスである。例えば、酵母は、種々のプロトコルを使用して形質転換することができる（Gietz et al., 1995）。そのような形質転換は、細胞の遺伝的な物質への外来性の核酸の取り込みによって、あるいは、細胞を外来性の核酸に曝すことによる細胞の内在性の遺伝的な物質における変化によって生じ得る。形質転換体又は形質転換した細胞は、外来性の核酸の取り込みを介して機能的に増強された細胞、又は細胞の子孫である。本願でこれらの用語が使用される場合には、これらの用語は、それ以降の世代の細胞にも存在し得る他の突然変異又は変化とは無関係に所望の遺伝的変化がそれ以降の細胞世代を通じて保存される形質転換細胞の子孫に適用される。
【００３５】
ワイン作製に使用するための形質転換した宿主細胞は、例えば、ブルゴビン（ＲＣ２１２ サッカロミセス・セレビシエ）、ＩＣＶ Ｄ−４７ サッカロミセス・セレビシエ、７１Ｂ−１１２２ サッカロミセス・セレビシエ、Ｋ１Ｖ−１１１６ サッカロミセス・セレビシエ、ＥＣ−１１１８ サッカロミセス・バイヤス、Ｖｉｎ１３、Ｖｉｎ７、Ｎ９６及びＷＥ３５２のようなサッカロミセス・セレビシエ又はスキツォサッカロミセスのストレインを含み得る。酵母ストレインについての商業上の供給源は、Ｌａｌｌｅｍａｎｄ Ｉｎｃ．（カナダ）、ＡＢ Ｍａｕｒｉ（オーストラリア）、Ｌｅｓａｆｆｒｅ（フランス）など、多々存在する。
【００３６】
種々の実施形態において、本発明の諸々の視点では、ＤＵＲ３の尿素輸送活性などの尿素輸送活性を有する内在性又は異種性の酵素を使用することができる。同様に、いくつかの実施形態において、本発明の諸々の視点では、ＤＵＲ１，２ｐの尿素カルボキシラーゼ活性及びアロファン酸ヒドロラーゼ活性などの尿素分解活性を有する内在性又は異種性の酵素を使用することができる。これらの酵素は、例えば、ＤＵＲ３ｐ又はＤＵＲ１，２ｐと相同（homologous）であるか、関連する活性を有するＤＵＲ３ｐ又はＤＵＲ１，２ｐの領域と相同であり得る。
【００３７】
配列間（天然のＤＵＲ３ｐ又はＤＵＲ１，２ｐ、あるいは天然のＤＵＲ３又はＤＵＲ１，２の核酸配列、そして本発明において使用されるその他のタンパク質又は核酸の配列など）の相同性の度合いは、配列を適切に整列（アライン）させたときの同一性のパーセンテージとして表現することができ、配列間の正確なマッチ（matches）の出現率を意味する。同一性比較のための配列の最適なアライメントは、種々のアルゴリズム、例えば、Smith and Waterman, 1981,Adv. Appl. Math 2: 482の局所的ホモロジーアルゴリズム、Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443のホモロジーアライメントアルゴリズム、Pearson and Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444の類似度サーチ方法、そしてこれらアルゴリズムのコンピュータによる実行（Genetics Computer Group, Madison, WI, U.S.A.のウィスコンシンジェネティックスソフトウェアパッケージのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡなど）によって実行することができる。配列のアライメントは、Altschulet al., 1990, J. Mol. Biol. 215: 403-10に記載されたＢＬＡＳＴアルゴリズム（公表されたデフォルト設定を使用）を使用して実行することも可能である。ＢＬＡＳＴ解析を実行するためのソフトウェアは、National Center for Biotechnology Informationから（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/でインターネットを介して）入手可能である。ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、データベース配列中の同じ長さの１つのワードとアラインさせたときに、マッチするか、あるいはいくつかのポジティブな値としての閾値スコアＴを満足する問い合わせ配列（query sequence）中の長さＷの短いワードを同定することによってハイスコア配列対（ＨＳＰｓ）を最初に同定することを含む。Ｔは、近接ワードスコア閾値と称する。最初の近接ワードヒット（複数）は、より長いＨＳＰｓを発見するサーチを開始するためのシーズ（seeds）としての役割を果たす。該ワードヒット（複数）は、累積アライメントスコアが増大可能である限り、個々の配列に沿って両方向に拡張（進行）される。各方向におけるワードヒットの拡張は、以下のパラメータを充足したときに停止する：累積アライメントスコアが最大達成値から量Ｘだけ低下すること；１つ以上のネガティブなスコアを与える残基アライメントの蓄積に応じて累積スコアがゼロ以下になること；又は、いずれかの配列の末端に到達すること。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメータＷ、Ｔ及びＸは、アライメントの精度及び速度を決定する。ＢＬＡＳＴプログラムは、核酸の両方のストランドの比較については、デフォルト設定として以下の値を使用することができる：ワード長（Ｗ）として１１、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Henikoff and Henikoff, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919）、アライメント（Ｂ）として５０、期待値（expectation）（Ｅ）として１０（期待値（Ｅ）は、他の実施形態では１、０．１、０．０１、０．００１又は０．０００１に変えることができる。つまり、０．１より遥かに大きいＥ値では機能的に類似の配列を同定することができないかもしれないが、０．１〜１０の間のＥ値は短い領域の類似性についての低い（lower）有意性を有するヒット（複数）を調べることには有用である。）、Ｍ＝５、Ｎ＝４[sic,−４]。タンパク質の比較については、ＢＬＡＳＴＰは、以下のデフォルト設定を用いて使用することができる：Ｇ＝１１（ギャップを開くためのコスト）；Ｅ＝１（ギャップを拡張するためのコスト）；Ｅ＝１０（期待値、この設定では、規定のアライメントスコアＳと等しいかより良いスコアを有する１０個のヒットが、サーチされるものと同じサイズのデータベースに偶然に現れることが予測される；Ｅ値を増加あるいは減少させてサーチの厳密性を変えることができる）；Ｗ＝３（ワードサイズ、デフォルト値は、ＢＬＡＳＴＮついては１１であり、他のｂｌａｓｔプログラムついては３である）。ＢＬＯＳＵＭマトリックスは、関連するタンパク質内のコンセンサスブロック間で生ずることが知られている置換の頻度に基づくアライメント内の各位置についての確率スコアを与える（assigns）。ＢＬＯＳＵＭ６２（ギャップ存在コスト＝１１；残基当りのギャップコスト＝１；ラムダ比＝０．８５）の置換マトリックスは、ＢＬＡＳＴ２．０ではデフォルトで使用される。ＰＡＭ３０（9, 1, 0.87）；ＰＡＭ７０（10, 1, 0.87）；ＢＬＯＳＵＭ８０（10, 1, 0.87）；ＢＬＯＳＵＭ６２（11, 1, 0.82）及びＢＬＯＳＵＭ４５（14, 2, 0.87）などの種々の他のマトリックスをＢＬＯＳＵＭ６２の代わりに使用することができる。ＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いたときの２つの配列間の統計的類似性の１つの尺度（measure）は、最少和確率（smallest sum probability）（Ｐ（Ｎ））であり、２つのヌクレオチド又はアミノ酸配列の間でのマッチが偶然に生じるであろう確率の指標を提供する。本発明の他の実施形態においては、ヌクレオチド又はアミノ酸配列は、テスト配列の比較において最小和確率がおよそ１未満、好ましくはおよそ０．１未満、より好ましくはおよそ０．０１未満、最も好ましくはおよそ０．００１未満であれば、実質的に同一であるとみなされる。
【００３８】
いくつかの実施形態の中で、本発明の核酸及びタンパク質の配列（複数）は、ＤＵＲ３ｐ又はＤＵＲ１，２ｐ、あるいはＤＵＲ３又はＤＵＲ１，２の核酸配列と実質的に同一であるといったように、実質的に同一であり得る。そのような配列の実質的な同一性は、適切にアラインされたときの同一性のパーセンテージ（例えば、５０％超、８０％〜１００％、少なくとも８０％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％であり得る）に反映され得、遺伝子ターゲッティング基質の場合には、遺伝子ターゲッティング基質の一部とターゲット配列の一部との同一性を意味し、その度合いの同一性は相同的な対合、そして組換え及び／又は修復を促進し得る。２つの核酸配列が実質的に同一であることの他の指標は、当該２つの配列が互いに、適度にストリンジェントな条件下で、好ましくはストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることである。適度にストリンジェントな条件下でのフィルタに結合した配列へのハイブリダイゼーションは、例えば、０．５ＭのＮａＨＰＯ４、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１ｍＭのＥＤＴＡの中で６５℃で行い、そして、０．２ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで４２℃で洗浄するというような条件で行うことができる（Ausubel, et al. (eds), 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, Green Publishing Associates, Inc., and John Wiley & Sons, Inc., New York, p.2.10. 3参照）。あるいは、ストリンジェントな条件下でのフィルタ結合配列へのハイブリダイゼーションは、例えば、０．５Ｍ ＮａＨＰ０４、７％ＳＤＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡの中で６５℃で行い、そして、０．１ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで６８℃で洗浄するというような条件で行うことができる（上記Ausubel, et al. (eds), 1989参照）ハイブリダイゼーション条件は、目的の配列に応じて既知の方法に従って修正してもよい（Tijssen, 1993, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology- - Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2 “Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays”, Elsevier, New York参照）。一般的には、ストリンジェント条件は、所定のイオン強度及びｐＨにおける特定の配列についての熱融解温度よりおよそ５℃低くなるように選択される。ストリンジェントハイブリダイゼーションのための洗浄は、例えば、少なくとも１５分、３０分、４５分、６０分、７５分、９０分、１０５分、又は１２０分であり得る。
【００３９】
ＤＵＲ３又はＤＵＲ１，２などのポリペプチドの構造に、当該ペプチドの生物学的機能を実質的に変化することなく幾つかの修正及び変更を加えて、生物学的に等価なポリペプチドを得ることができることは、本発明の分野において良く知られている。本発明の１つの視点では、尿素輸送活性を有するタンパク質は、保存的アミノ酸置換による天然のＤＵＲ３配列と異なるタンパク質を含み得る。同様に、尿素カルボキシラーゼ及び／又はアロファン酸ヒドロラーゼ活性を有するタンパク質は、保存的アミノ酸置換による天然のＤＵＲ１，２配列と異なるタンパク質を含み得る。本願において使用する場合に、用語「保存されたアミノ酸置換」とは、タンパク質の所与の位置における１つのアミノ酸の他のアミノ酸への置換を意味し、この置換は関連する機能を実質的に喪失させること無く行われる。そのような改変体を作製する際には、アミノ酸残基などの置換を、側鎖置換基の相対的類似性、例えば、サイズ、電荷、疎水性、親水性等に基づいて実行することができるし、そのような置換は、ルーチン的なテストにより、タンパク質の機能に対するそれらの影響についてアッセイすることができる。
【００４０】
いくつかの実施形態において、保存されたアミノ酸置換を行っても良く、この実施形態では、アミノ酸残基は類似の親水性値（例えば、±２．０の範囲内の値）を有する他のアミノ酸残基に置換することによって実行することができる。そのような実施形態では、以下のものがおよそ−１．６の疎水性親水性指標を有するアミノ酸であり得、Ｔｙｒ（−１．３）又はＰｒｏ（−１．６）がアミノ酸残基に割り当てられる（詳細は米国特許番号４，５５４，１０１参照。この文献は引用を持って本書に繰り込まれその開示内容は本書に記載されているものとみなす）：Ａｒｇ（＋３．０）；Ｌｙｓ（＋３．０）；Ａｓｐ（＋３．０）；Ｇｌｕ（＋３．０）；Ｓｅｒ（＋０．３）；Ａｓｎ（＋０．２）；Ｇｌｎ（＋０．２）；Ｇｌｙ（０）；Ｐｒｏ（−０．５）；Ｔｈｒ（−０．４）；Ａｌａ（−０．５）；Ｈｉｓ（−０．５）；Ｃｙｓ（−１．０）；Ｍｅｔ（−１．３）；Ｖａｌ（−１．５）；Ｌｅｕ（−１．８）；Ｉｌｅ（−１．８）；Ｔｙｒ（−２．３）；Ｐｈｅ（−２．５）及びＴｒｐ（−３．４）。
【００４１】
他の実施形態において、保存されたアミノ酸置換を行っても良く、この実施形態では、アミノ酸残基は類似の疎水性親水性指標（例えば±２．０の範囲内の値）を有する他のアミノ酸残基で置換される。そのような実施形態では、個々のアミノ酸残基には、以下のように、その疎水性及び電荷特性に基づいた疎水性親水性指標を割り当てることができる：Ｉｌｅ（＋４．５）；Ｖａｌ（＋４．２）；Ｌｅｕ（＋３．８）；Ｐｈｅ（＋２．８）；Ｃｙｓ（＋２．５）；Ｍｅｔ（＋１．９）；Ａｌａ（＋１．８）；Ｇｌｙ（−０．４）；Ｔｈｒ（−０．７）；Ｓｅｒ（−０．８）；Ｔｒｐ（−０．９）；Ｔｙｒ（−１．３）；Ｐｒｏ（−１．６）；Ｈｉｓ（−３．２）；Ｇｌｕ（−３．５）；Ｇｌｎ（−３．５）；Ａｓｐ（−３．５）；Ａｓｎ（−３．５）；Ｌｙｓ（−３．９）及びＡｒｇ（−４．５）。
【００４２】
他の実施形態において、保存されたアミノ酸置換を行っても良く、この実施形態では、アミノ酸残基を同じクラスの他のアミノ酸残基で置換される。アミノ酸は、以下のように、非極性、酸性、塩基性及び中性の各クラスに分類される：非極性：Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ；酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；塩基性：Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ；中性：Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｔｙｒ。
【００４３】
他の実施形態において、保存されたアミノ酸の変化には、親水性又は疎水性、サイズ又は容積、又は電荷を考慮した変化を含む。アミノ酸は、一般に、主としてアミノ酸側鎖の特性に基づいて、疎水性又は親水性として特徴付けることができる。Eisenberg et al（J. Mol. Bio. 179: 125-142, 184）の規格化されたコンセンサスな疎水性スケールに基づくと、疎水性アミノ酸はゼロより大きい疎水性を示し、親水性アミノ酸はゼロ未満の親水性を示す。遺伝的にコードされた疎水性アミノ酸にはＧｌｙ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ及びＴｒｐが含まれ、遺伝的にコードされた親水性アミノ酸にはＴｈｒ、Ｈｉｓ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ及びＬｙｓが含まれる。非遺伝的にコードされた疎水性アミノ酸にはｔ−ブチルアラニンが含まれ、非遺伝的にコードされた親水性アミノ酸にはシトルリン及びホモシステインが含まれる。
【００４４】
疎水性又は親水性アミノ酸は、それらの側鎖の特徴に基づいて更に細分類することができる。例えば、芳香性アミノ酸は、少なくとも１つの芳香環又はヘテロ芳香族環を含有する側鎖を有する疎水性アミノ酸であり、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＣＮ、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−ＮＯ２、−ＮＯ、−ＮＨ２、−ＮＨＲ、−ＮＲＲ、−Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲＲなどの１つ以上の置換基を含み得る。これらの置換基において、Ｒは、独立して、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、置換（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルケニル、置換（Ｃ１−Ｃ６）アルケニル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキニル、置換（Ｃ１−Ｃ６）アルキニル、（Ｃ５−Ｃ２０）アリール、置換（Ｃ５−Ｃ２０）アリール、（Ｃ６−Ｃ２６）アルカリール（alkaryl）、置換（Ｃ６−Ｃ２６）アルカリール、５−２０員ヘテロアリール、置換５−２０員ヘテロアリール、６−２６員アルクヘテロアリール（alkheteroaryl）又は置換６−２６員アルクヘテロアリールである。遺伝的にコードされた芳香族アミノ酸には、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、及びＴｒｐが含まれる。
【００４５】
無極性アミノ酸とは、生理的なｐＨで非帯電であり、かつ２つの原子間の共有電子対が一般的に当該２つの原子の各々によって等しく保持される結合を有する側鎖（即ち側鎖は極性ではない）を有する疎水性アミノ酸である。遺伝的にコードされた無極性アミノ酸には、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ａｌａ及びＭｅｔが含まれる。無極性アミノ酸は、脂肪族炭化水素側鎖を有する疎水性アミノ酸である脂肪族アミノ酸を含むように更に細分類することができる。遺伝的にコードされた脂肪族アミノ酸には、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ及びＩｌｅが含まれる。
【００４６】
極性アミノ酸とは、生理的なｐＨで非帯電であるが、２つの原子間の共有電子対が一方の原子に偏って保持される１つの結合を有する側鎖を有する親水性アミノ酸である。遺伝的にコードされた極性アミノ酸には、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ及びＧｌｎが含まれる。
【００４７】
酸性アミノ酸とは、７未満の側鎖ｐＫａ値を有する親水性アミノ酸である。酸性アミノ酸は、典型的には、水素イオンの放出により生理的なｐＨで負に帯電した側鎖を有する。遺伝的にコードされた酸性アミノ酸には、Ａｓｐ及びＧｌｕが含まれる。塩基性アミノ酸とは、７より大きい側鎖ｐＫａ値を有する親水性アミノ酸である。塩基性アミノ酸は、典型的には、ヒドロニウムイオンの受容（association）により生理的なｐＨで正に帯電した側鎖を有する。遺伝的にコードされた塩基性アミノ酸には、Ａｒｇ、Ｌｙｓ及びＨｉｓが含まれる。
【００４８】
上述の分類は絶対的なものではなく、１つのアミノ酸が２つ以上のカテゴリーに分類し得ることは、当業者であれば理解することができる。更に、アミノ酸は、特定のアッセイにより又は予め同定されたアミノ酸との比較により、既知の挙動及び／又は特徴的な化学的、物理的又は生物学的な特性に基づいて分類することもできる。
【００４９】
本発明の種々の視点において、宿主の尿素輸送活性及び尿素分解活性は、例えば、ワイン発酵条件下などの発酵条件下で所望のレベルになるように調節することができる。用語「発酵条件（fermentation conditions又はfermenting conditions）」は、サッカロミセス・セレビシエなどの生命体が発酵によってエネルギーを生産する条件、すなわち発酵が行われる培養条件を意味する。広義には、酸素の不在下で微生物の成長のためのエネルギーを産生できる嫌気反応がすべて含まれる。発酵のエネルギーは、基質レベルのリン酸化によって供給される。発酵においては、ある有機化合物（エネルギー源）が電子のドナー（供与体）としての役割を果たし、他の有機化合物が電子アクセプタ（受容体）である。例えば、炭水化物、アミノ酸、プリン及びピリミジンなどの種々の有機基質を発酵に使用することができる。１つの視点では、本発明は、炭水化物を発酵させて、エチルアルコールを生産することができる生物（酵母など）に関連する。
【００５０】
ワインの発酵では、マスト（ブドウ汁）の培養条件は、出発物質として使用されるジュースによって決められる。例えば、ブドウジュースの主成分は、グルコース（典型的にはおよそ７５〜１５０ｇ／Ｌ）、フルクトース（典型的にはおよそ７５〜１５０ｇ／Ｌ）、酒石酸（典型的にはおよそ２〜１０ｇ／Ｌ）、マレイン酸（典型的にはおよそ１〜８ｇ／Ｌ）及び遊離アミノ酸（典型的にはおよそ０．２〜２．５ｇ／Ｌ）である。しかしながら、実質的にはどの果物または糖生成植物（sugary plant）の液汁（sap）であっても、炭水化物のエチルアルコールへの変換が主反応であるプロセスにおいて、アルコール飲料に加工することができる。
【００５１】
ワイン酵母は、典型的には、およそ３．２〜４．５の範囲のｐＨで増殖及び発酵し、およそ０．８５の最小水分活性（又はおよそ８８％の相対湿度）を必要とする。発酵は、自発的に進行させてもよいが、予め発酵させたマストを接種することによって開始することもできる（その場合には、ジュースに、１０６〜およそ１０７ｃｆｕ／ｍＬ（ジュースあたり）の個体数の酵母を接種することができる）。マストに通気して、酵母の個体数を増加させてもよい。ひとたび発酵が始まると、一般的には、嫌気条件が二酸化炭素の急速な生産によって維持される。発酵温度は、通常、１０℃〜３０℃であり、発酵プロセスの期間は、例えば、数日間から数週間に拡張させることができる。
【００５２】
１つの視点では、本発明は、発酵アルコール飲料中のエチルカルバメートの濃度を低減させることが可能な酵母ストレインを提供する。例えば、本発明は、４０ｐｐｂ（μｇ／Ｌ）未満、３５ｐｐｂ（未満）、３０ｐｐｂ（未満）、２５ｐｐｂ（未満）、２０ｐｐｂ（未満）、１５ｐｐｂ（未満）、１０ｐｐｂ（未満）又は５ｐｐｂ（未満）（又は５０ｐｐｂ〜１ｐｐｂの間のいずれかの整数値）の濃度のエチルカルバメートを有するワインを提供することに使用することができる。他の実施形態では、本発明は、およそ５００ｐｐｂ未満、４００ｐｐｂ（未満）、３００ｐｐｂ（未満）、２００ｐｐｂ（未満）、１５０ｐｐｂ（未満）、１００ｐｐｂ（未満）、９０ｐｐｂ（未満）、８０ｐｐｂ（未満）、７０ｐｐｂ（未満）、６０ｐｐｂ（未満）、５０ｐｐｂ（未満）、４０ｐｐｂ（未満）、３０ｐｐｂ（未満）、２０ｐｐｂ（未満）又は１０ｐｐｂ（未満）（又は５００ｐｐｂ〜１０ｐｐｂの間のいずれかの整数値）の濃度のエチルカルバメートを有する栄養強化ワイン又は蒸留酒を提供することに使用することができる。
【００５３】
他の実施形態では、本発明は、ブドウマスト中の低減された尿素濃度を維持することが可能な酵母ストレインを提供することができる。例えば、尿素濃度を、およそ１５ｍｇ／Ｌ（未満）、１０ｍｇ／Ｌ（未満）、５ｍｇ／Ｌ（未満）、４ｍｇ／Ｌ（未満）、３ｍｇ／Ｌ（未満）、２ｍｇ／Ｌ（未満）又は１ｍｇ／Ｌ未満に維持することができる。
【００５４】
１つの視点では、本発明は、醗酵条件下で所望のレベルの尿素分解活性を有する発酵生命体の自然変異体を選択するための方法を提供する。例えば、ＤＵＲ３のＮＣＲが欠失している酵母株を選択することができる。酵母の突然変異及び選択プロトコルの一例としては、2000年10月31日にMortimer et al.に発行された米国特許番号6,140,108を参照されたい。そのような方法では、酵母ストレインをエチルメタンスルホネート、亜硝酸又はヒドロキシルアミンなどの突然変異誘発物質で処置して、塩基対置換を有する突然変異体を作製することができる。改変した尿素分解活性を有する突然変異体は、例えば、適切な培地でプレーティングすることによってスクリーニングすることができる。
【００５５】
他の実施形態では、部位特異的な突然変異導入を採用して、宿主における尿素輸送活性又は尿素分解活性のレベルを変えることができる。例えば、部位特異的な突然変異導入を採用して、ＤＵＲ３又はＤＵＲ１，２ プロモーターなどの酵母のプロモーターからＮＣＲ媒介エレメント（mediating elements）を除去することができる。例えば、図４に示すような、ネイティブなＤＵＲ１，２プロモーター配列におけるＧＡＴＡＡ（Ｇ）ボックスを、削除又は置換改変することができる。１つの実施形態では、例えば、一方又は両方のＧＡＴＡＡボックスを、ＧをＴで置換して改変し、配列をＴＡＴＡＡにすることができる。部位特異的な突然変異導入方法は、例えば、Rothstein, 1991; Simon and Moore, 1987; Winzeler et al., 1999、及びNegritto et al., 1997に開示されている。他の実施形態では、Ｓ・セレビシエにおいてＮＣＲを媒介するＧｌｎ３ｐ及びＧａｔ１ｐをコードする遺伝子を突然変異させて、ＮＣＲを調節することもできる。その際には、選択又は遺伝子操作されてＮＣＲが欠失したプロモーターを、醗酵条件下におけるＤＵＲ３の発現を媒介するように、ＤＵＲ３のコーディング配列に機能上リンクさせることができる。
【００５６】
本発明の酵母ストレインの相対的な尿素輸送活性又は尿素分解酵素活性は、形質転換していない親ストレインと相対的に測定することができる。例えば、本発明の形質転換酵母ストレインは、醗酵条件下において親ストレインよりも大きい（greater）尿素輸送活性又は尿素分解活性を有するもの、又は、例えば、親ストレインの活性の少なくとも１５０％、２００％、２５０％、３００％、４００％又は５００％など、同一の醗酵条件下において親ストレインの活性よりも幾分大きな（some greater）割合の活性を有するものが選択され得る。同様に、本発明の組換え核酸によって発現又はコードされた酵素の活性は、それらが由来する非組換え配列と相対的に決定して、同様の倍率の活性を有するストレインを使用することができる。
【００５７】
本発明の１つの視点では、ＤＵＲ３ポリペプチドの調節された発現を媒介する異種性のプロモーター配列の制御下にＤＵＲ３コーディング配列又はそのホモログを有する組換え核酸分子を含むベクターを提供することができる。そのようなベクターを提供するために、Ｓ・セレビシエからのＤＵＲ３オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を、組換えＤＵＲ３遺伝子の発現を調節する発現カセットを含有するプラスミドに挿入することができる。組換え分子を選択された酵母ストレインに導入して、改変した尿素輸送活性を有する形質転換したストレインを提供することができる。他の実施形態では、Ｓ・セレビシエなどの宿主におけるネイティブなＤＵＲ３コーディング配列のホモログの発現に、ネイティブなプロモーターを他のプロモーターで置き換えることによって影響を与えることもできる。付加的な調節エレメントを、内在性のコーディング配列を利用する組換え発現カセットを構築することに使用することもできる。組換え遺伝子又は発現カセットを、Ｓ・セレビシエなどの宿主の染色体ＤＮＡに組込むこともできる。
【００５８】
本発明の他の側面で使用するプロモーターは、ＰＧＫ１又はＣＡＲ１プロモーターなどの適するネイティブなＳ・セレビシエのプロモーターから選択することができる。そのようなプロモーターは、ＰＧＫ１及びＣＡＲ１ターミネーターなどの付加的な調節エレメントと一緒に使用することができる。種々のネイティブ又は組換え型のプロモーターを使用することができ、その場合にはプロモーターは、選択された条件下（ワイン製造条件下など）での尿素分解活性（ＤＵＲ１，２活性など）の発現を媒介するように選択又は構築される。種々の恒常的なプロモーターを、例えば、ＤＵＲ３のコーディング配列に機能上リンクすることができる。
【００５９】
本発明の１つの視点によれば、宿主の尿素輸送（取り込み）活性を調節する組換え核酸で形質転換した宿主（酵母ストレインなど）を用いた炭水化物の発酵方法（ワインの発酵方法など）が提供される。例えば、ＤＵＲ３遺伝子のＮＣＲを、ワイン製造酵母ストレインにおける尿素の取り込みを増強するように調節することができる。本発明のこの視点によれば、ブドウのマストの発酵を、該酵母ストレインを用いて、エチルカルバメートが限定された量しか産生されないように実行することができる。
【００６０】
本願においては、本発明の種々の実施形態を開示したが、当業者の通常の一般知識に従って、本発明の範囲内において種々の適合化・改変を行うことができる。そのような改変には、実質的に同じ仕方で同じ結果を達成するために、本発明の任意の視点を既知の均等物（equivalent）で置換することが含まれる。数値範囲には、その範囲を定義している数値も含まれる。本願明細書において、用語「含む（comprising）」は、開放型（open-ended）の用語として使用され、実質的には、語句「〜を含むが、それらに限定されない（including, but not limited to）」に等しく、用語「含む（comprises）」は、これに対応する意味を有する。本願における文献の引用を、そのような文献が本発明の先行技術であることの認証として解釈するべきではない。個々の刊行物それぞれが本願において引用によって取り込まれるべきであることが特段かつ個々に示されている場合や、本願において十分に定義されている場合には、本願明細書において引用したすべての刊行物（特許及び特許出願を含むがこれらに限定されない）は、引用によって本願に繰り込まれる。本発明は、上述のような、そして、実施例及び図面に示した実質的に全ての実施形態及びバリエーションを含む。
【００６１】
本発明の１つの実施形態では、醗酵条件下において尿素トランスポーターの発現の窒素カタボライト抑制を低減するように形質転換した酵母ストレインが提供される。例えば、尿素トランスポーターはＤＵＲ３によってコードされていてもよく、該尿素トランスポーターはＤＵＲ３ｐであり得る。
【００６２】
本発明の更なる実施形態では、醗酵条件下において、尿素トランスポーターの発現と尿素分解酵素の発現の両方の窒素カタボライト抑制を低減するように形質転換した酵母ストレインが提供される。尿素トランスポーターはＤＵＲ３によってコードされていてもよく、尿素分解酵素はＤＵＲ１，２によってコードされていてもよく、尿素トランスポーターはＤＵＲ３ｐであり得、尿素分解酵素は尿素カルボキシラーゼ／アロファン酸ヒドロラーゼであり得る。
【００６３】
本発明の更なる実施形態では、醗酵条件下において尿素を継続的に取り込むように形質転換された酵母ストレインが提供される。酵母は、例えば、ＤＵＲ３を恒常的に発現する。
【００６４】
本発明の更なる実施形態では、醗酵条件下において尿素を継続的に取り込みかつ尿素を分解するように形質転換した酵母ストレインが提供される。この実施形態において、酵母ストレインは、ＤＵＲ１，２とＤＵＲ３の両方を恒常的に発現することができる。
【００６５】
本発明の更なる実施形態では、醗酵条件下において尿素トランスポーターの発現の窒素カタボライト（異化代謝産物）抑制を低減させるように酵母ストレインを形質転換することを含む酵母ストレインの改変方法が提供される。尿素トランスポーターは、例えば、ＤＵＲ３によってコードされていてもよく、尿素トランスポーターはＤＵＲ３ｐであり得る。
【００６６】
本発明の更なる実施形態では、醗酵条件下において尿素トランスポーターの発現及び尿素分解酵素の発現の窒素カタボライト抑制を低減させるように酵母ストレインを形質転換することを含む酵母ストレインの改変方法が提供される。尿素トランスポーターはＤＵＲ３によってコードされていても良く、該尿素分解酵素はＤＵＲ１，２によってコードされていてもよく、尿素トランスポーターはＤＵＲ３ｐであり得、該尿素分解酵素は尿素カルボキシラーゼ又はアロファン酸ヒドロラーゼであり得る。
【００６７】
本発明の更なる実施形態では、ＤＵＲ３を恒常的に発現するように酵母ストレインを改変する方法が提供される。該方法は、1/2TRP1-PGKp-DUR３-PGKt-kanMX-1/2TRP1カセットのTRP1ローカスへの組込みを含むことができる。あるいは、該方法は、ＤＵＲ３ｐをコードするコーディング配列を含む組換え核酸を用いて前記酵母ストレインを形質転換することを含むことができる。あるいは、該方法は、窒素カタボライト抑制を受けないプロモーターを含む組換え核酸を用いて前記酵母を形質転換することを含むことができる。
【００６８】
本発明の更なる実施形態では、醗酵条件下において尿素トランスポーターの発現窒素カタボライト抑制を低減させるように形質転換した酵母ストレインを使用する醗酵飲料又は醗酵食品の製造方法が提供される。尿素トランスポーターはＤＵＲ３によってコードされていても良く、尿素トランスポーターはＤＵＲ３ｐであり得る。
【００６９】
本発明の更なる実施形態では、醗酵条件下において尿素トランスポーターの発現及び尿素分解酵素の発現の両方の窒素カタボライト抑制を低減させるように形質転換した酵母ストレインを使用する醗酵飲料又は醗酵食品の製造方法が提供される。尿素トランスポーターはＤＵＲ３によってコードされていても良く、前記尿素分解酵素はＤＵＲ１，２によってコードされていても良い。尿素トランスポーターはＤＵＲ３ｐであり得るし、前記尿素分解酵素は尿素カルボキシラーゼ又はアロファン酸ヒドロラーゼであり得る。
【００７０】
本発明の更なる実施形態では、ＤＵＲ３を恒常的に発現して醗酵飲料又は醗酵食品におけるエチルカルバメートの濃度を低減させる形質転換した酵母ストレインの使用が提供される。
【００７１】
本発明の更なる実施形態では、ＤＵＲ１，２及びＤＵＲ３の両方を恒常的に発現して醗酵飲料又は醗酵食品におけるエチルカルバメートの濃度を低減させる形質転換した酵母ストレインの使用が提供される。
【００７２】
本発明の更なる実施形態では、ＤＵＲ３を恒常的に発現して３０ｐｐｂ未満のエチルカルバメート濃度を有するワインを生産する形質転換した酵母ストレインの使用が提供される。
【００７３】
本発明の更なる実施形態では、ＤＵＲ１，２及びＤＵＲ３の両方を恒常的に発現して３０ｐｐｂ未満のエチルカルバメート濃度を有するワインを生産する形質転換した酵母ストレインの使用が提供される。
【００７４】
本発明の更なる実施形態では、ＤＵＲ３を恒常的に発現する形質転換した酵母ストレインを使用して生産された低減したエチルカルバメート濃度を有する醗酵飲料又は醗酵食品が提供される。
【００７５】
本発明の更なる実施形態では、ＤＵＲ１，２及びＤＵＲ３の両方を恒常的に発現する形質転換した酵母ストレインを使用して生産された低減したエチルカルバメート濃度を有する醗酵飲料又は醗酵食品が提供される。
【００７６】
本発明の更なる実施形態では、ＤＵＲ３を恒常的に発現する形質転換した酵母ストレインを使用して生産された３０ｐｐｂ未満のエチルカルバメート濃度を有するワインが提供される。
【００７７】
本発明の更なる実施形態では、ＤＵＲ１，２及びＤＵＲ３の両方を恒常的に発現する形質転換した酵母ストレインを使用して生産された、３０ｐｐｂ未満のエチルカルバメート濃度を有するワインが提供される。
【実施例】
【００７８】
本発明は、以下の実施例を参照して記載されるが、それら実施例に限定されない。採用された実験手順の記載は、実施例の後に続く。
【実施例１】
【００７９】
サッカロミセス・セレビシエのワインストレインのＤＵＲ３遺伝子のクローニング及び恒常的な（constitutive）発現。
【００８０】
クローンの選択のために、抗生物質耐性マーカーｋａｎＭＸを使用した。酵母ストレインＵＣ Ｄａｖｉｓ ５２２（Montrachet）、Ｐｒｉｓｅ ｄｅ Ｍｏｕｓｓｅ（EC1118）及びＫ７−０１（酒酵母）を、ＤＵＲ３単独、又はＤＵＲ１，２及びＤＵＲ３の両方を恒常的に発現するように形質転換した。広範囲にわたるテスト（extensive testing）は、形質転換した酵母が実質的にそれらの親ストレインと同等であることを示している。すなわち、遺伝子的かつ代謝的な改変は、意図されたＤＵＲ３、又はＤＵＲ１，２及びＤＵＲ３の両方の恒常的な発現のみである。
【実施例２】
【００８１】
ＤＵＲ３遺伝子カセットを用いた酵母の形質転換
【００８２】
酵母をＰＧＫ１のプロモーター及びターミネーターシグナルの制御下にＤＵＲ３遺伝子を含有する組換え核酸で形質転換した。ＰＧＫ１プロモーターはＮＣＲを受けない。ＤＵＲ３遺伝子カセット−1/2TRP1-PGKp-DUR3-PGKt-kanMX-1/2TRP1
【実施例３】
【００８３】
減少したエチルカルバメートの出現を確立するための組換え酵母を用いた醗酵実験
【００８４】
ＤＵＲ３の恒常的な発現は、アルギニン代謝の副生成物として排泄された尿素を再吸収するが、ブドウのマストの中に天然に存在する尿素も吸収する酵母ストレインを創造する。エチルカルバメートの有意な低減が５２２ＤＵＲ３酵母ストレインに曝されたワインにおいて見られ（〜８１％）、２５及び１３％の低減がＫ７ＤＵＲ３及びＰＤＭＤＵＲ３酵母ストレインそれぞれに曝された後に見られた（表１のデータ）。恒常的にＤＵＲ３を発現する酵母が、恒常的にＤＵＲ１，２を発現する酵母と同じ程度に効率的にエチルカルバメート濃度を低減させることも示されている。
【００８５】
ＤＵＲ１，２及びＤＵＲ３の両方の恒常的な発現の組み合わせは、５５２及びＫ７酵母ストレインにおいてＤＵＲ１，２又はＤＵＲ３のいずれか単独とおよそ同じ程度までエチルカルバメートを減少させる。しかしながら、ＰＤＭＥＣ−ＤＵＲ３（ＤＵＲ１，２及びＤＵＲ３）は、ＰＤＭＤＵＲ３（ＤＵＲ３）又はＰＤＭＥＣ（ＤＵＲ１，２）ストレインのいずれか単独よりも大きな（greater）程度にワインのマストにおけるエチルカルバメートを減少させることができる酵母ストレインの例である。
【実施例４】
【００８６】
選択可能マーカーの除去を可能にするセルフ−クローニングカセット
【００８７】
図９及び１０は、形質転換した酵母の選択の次に、直列反復配列（direct repeats）の組換えを経由した抗生物質耐性マーカーの除去を可能にするＤＵＲ３遺伝子のカセットleu2-PGK1p-kanMX-PGKp-DUR3-PGK1t-leu2（以下に記載のようにこの実施例で使用される）を表す。
【００８８】
形質転換した酵母の選択の次に、直列反復配列の組換えを経由した抗生物質耐性マーカーの除去を可能するＰＧＫ１のプロモーター及びターミネーターシグナルの制御下にＤＵＲ３遺伝子を含む組換え核酸で酵母を形質転換した。ＰＧＫ１プロモーターはＮＣＲを受けない。ＤＵＲ３遺伝子カセット−leu2-PGK1p-kanMX-PGKp-DUR3-PGK1t-leu2。４つのストレイン（CY3079、Bordeaux Red、そしてＤＵＲ１，２形質転換ストレインD80ec-及びD254ec-）をleu2-PGK1p-kanMX-PGKp-DUR3-PGK1t-leu2カセットで形質転換した。これは、D254ec-について５５個のストレイン、D80ec-について１２５個のストレイン、Bordeaux Redについておよそ２００個のストレイン、CY3079についておよそ３００個のストレインを産出した。およそ１ストレイン当たりおよそ２０〜６０個のクローンをミニ醗酵のために選択し、ＥＣ低減を決定した。２つのCY3079のクローンは実験室条件下で９４．２％及び４６．５％のＥＣ低減を有し、３つのBordeaux Redのクローンは５７．６％〜６４．９％のＥＣ低減を有し、D80ec-クローンは６０．８％−６６．１％のＥＣ低減を有し、２つのD254ec-クローンは８７．５％及び７５．１％のＥＣ低減を有した。
【００８９】
［上述の実施例において採用した実験手順］
ｐＨＶＸ２Ｄ３の作製
【００９０】
恒常的なＰＧＫ１プロモーター及びターミネーターシグナルの制御下にＤＵＲ３を置くために、ＤＵＲ３のＯＲＦをｐＨＶＸ２にクローニングした。それらの５’末端に構築されたＸｈｏ１制限酵素サイトを含有する以下のプライマーを使用してＤＵＲ３のＯＲＦを５２２ゲノムＤＮＡから増幅した：
DUR3forXho1 （5'-AAAACTCGAGATGGGAGAATTTAAACCTCCGCTAC-3'） （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）
DUR3revXho1 （5'-AAAACTCGAGCTAAATTATTTCATCAACTTGTCCGAAATGTG-3'） （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）。
【００９１】
ＰＣＲの後に、０．８％アガロースゲルで可視化し、ＰＣＲ精製（Qiagen, USA - PCR Purification Kit）して、ＰＣＲ産物（挿入配列）及びｐＨＶＸ２（ベクター）の両方をＸｈｏ１で消化した（Roche, Germany）。消化されたベクターをＳＡＰ（Fermentas, USA）で処理して再び環状化することを防止した後、挿入配列、及び直線化したＳＡＰ処置ベクターをオーバーナイトで２２℃で連結させ（Ｔ４ＤＮＡライゲース - Fermentas, USA）、ライゲーション混合液（5μL）を使用してＤＨ５α（登録商標）コンピテント細胞（Invitrogen, USA）を形質転換し、次に１００μg/mLアンピシリン（Fisher, USA）添加のＬＢ（Difco, USA）プレート上で成長させた。形質転換体コロニーの中で無作為に選択されたもの由来のプラスミドを取得し（Qiagen, USA - QIAprep Spin Miniprep kit）、ＥｃｏＲ１（Roche, Germany）によって消化し、内側−外側のプライマーを使用してＰＣＲを行って、所望の挿入配列を有するプラスミドを確認した。結果として得られたPGK1p-DUR3-PGK1tを含有するプラスミドをｐＨＶＸ２Ｄ３と命名した。
【００９２】
ｐＨＶＸＫＤ３の作製
【００９３】
ｋａｎＭＸマーカーをＸｈｏ１及びＳａｌ１を用いた二重消化を経由してｐＵＧ６から得た。消化の後、１５００ｂｐのｋａｎＭＸのバンドをゲル精製し（Qiagen, USA - Gel Extraction Kit）、直線化したＳＡＰ処置ｐＨＶＸ２Ｄ３のＳａｌ１サイトに連結した。ライゲーション混合液（5μL）を使用してＤＨ５α（登録商標）コンピテント細胞を形質転換し、ＬＢ−アンピシリン（100μg/mL）の上で成長させた。組換えプラスミドを、２４個の無作為に選択したコロニーから単離したプラスミドのＨｉｎｄＩＩＩ（Roche, Germany）消化によって確認した。結果として得られたPGK1p-DUR3-PGK1t-kanMXを含有するプラスミドは、ｐＨＶＸＫＤ３と命名した。
【００９４】
ｐＵＣＴＲＰ１の作製
【００９５】
ＢａｍＨ１そして次にＡｐａ１サイトをそれらのそれらの５’末端に各々含有するＴＲＰ１に特異的なプライマーを使用して、ＴＲＰ１のコード領域を５２２ゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅した：
BamH1Apa1TRP1ORFfwd（5'-AAAAAAGGATCCAAAAAAGGGCCCATGTCTGTTATTAATTTCACAGG-3'）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）
BamH1Apa1TRP1ORFrev（5'-AAAAAAGGATCCAAAAAAGGGCCCCTATTTCTTAGCATTTTTGACG-3'）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）。
【００９６】
増幅の後、精製し、定量し、〜７５０ｂｐのフラグメントを直線化したＳＡＰ処置ｐＵＣ１８のBａｍＨ１（Roche, Germany）サイトに連結した。組換えプラスミドを最初に青／白スクリーニング（５０μg/mLのＸｇａｌを添加したＬＢ−アンピシリンでの成長）を介して確認し、次にＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲ１消化を介して確かめた。結果として得られたＴＲＰ１を含有するプラスミドは、ｐＵＣＴＲＰ１と呼ばれる。
【００９７】
ｐＵＣＭＤの作製
【００９８】
ｐＨＶＸＫＤ３の中に配置されたPGK1p-DUR3-PGK1t-kanMXカセットをカセットに特異的なプライマーを使用してｐＨＶＸＫＤ３プラスミドＤＮＡから増幅した：
pHVXKfwdlong（5'-CTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAG-3'） （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）
pHVXKrevlong（5'-CTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGG-3'） （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）。
【００９９】
増幅の後、精製し、定量し、直線化したＳＡＰ処置ｐＵＣＴＲＰ１の平滑状のＥｃｏＲＶ（Fermentas, USA）サイトへのライゲーションを促進するために、〜６５００ｂｐの平滑末端のＰＣＲ合成フラグメントをポリヌクレオチドキナーゼで処理した（New England Biolabs, USA）。
【０１００】
組換えプラスミドを最初にＥ−ｌｙｓｅ解析を使用して確認し、その後にＡｐａ１（Stratagene, USA）／Ｓａｌ１消化を経由して確かめた。手短に言えば、Ｅ−ｌｙｓｅは、アガロースゲルのウェル内にコロニーを溶解し、次に電気泳動することによって、プラスミドＤＮＡの存在について大多数のコロニーを効率的にスクリーニングする。より明確には、選択培地にパッチング（patching）した後、コロニーの小さな（small）アリコットを５μＬのＴＢＥバッファーに懸濁し、次に、１０μＬのＳＲＬバッファー（２５％ｖ／ｖスクロース、５０μｇ／ｍＬＲＮａｓｅ、１ｍｇ／ｍＬリゾチーム）と混合した。ピペッティングによって混合した後、細胞懸濁液を０．２％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ−０．８％（ｗ／ｖ）アガロースゲルのウェルに載せた。ウェル内の細胞懸濁液が細胞の溶解を示すクリア状態（clear）になった後（〜３０分）、ＤＮＡを２０Ｖで４５分、次に８０Ｖで４５分間電気泳動した。最後に、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｓａｆｅ （Invitrogen, USA）で要求されているようにゲルを染色した。
【０１０１】
直線状のＤＵＲ３カセットのＳ・セレビシエへの形質転換及び形質転換体の選択
【０１０２】
６５３６ｂｐのＤＵＲ３カセットをＡｐａ１（Stratagene, USA）を使用してｐＵＣＭＤから切り出し、０．８％アガロースゲルで可視化した。ゲルから、予測された６５３６ｂｐのバンドを分離し、抽出した（Qiagen, USA - Gel extraction kit）。抽出の後、精製し、ナノドロップＮＤ−１０００分光光度計（Nanodrop, USA）を使用して定量し、２５０ｎｇの直線状のカセットを使用してＳ・セレビシエのストレインである５２２、５２２ＥＣ−、ＰＤＭ、ＰＤＭＥＣ−、Ｋ７及びＫ７ＥＣ−を形質転換した。酵母ストレインをリチウム酢酸／ポリエチレングリコール／ｓｓＤＮＡ法を使用して形質転換した。形質転換の後、３００μｇ／ｍＬのＧ４１８（Sigma, USA）を添加したＹＰＤプレートに蒔く前に３０℃のＹＰＤに２時間放置して回復させた。プレートは３０℃でコロニーが出現するまでインキュベートした。
【０１０３】
ケローナシャルドネ（Calona Chardonnay）
【０１０４】
ろ過していないシャルドネブドウのジュース（23.75 Brix, pH 3.41,アンモニア 91.6 mg/L, FAN 309.6 mg/L）をオカナガンバレー（Okanagan Valley）のケローナワインヤード（Calona Vineyards）から取得し、改変した酵母の接種のために使用した。鮮度良く線画されたＹＰＤプレートから、親ストレイン（５２２、ＰＤＭ、Ｋ７及びＫ９）及び適切な機能的に増強されたストレインの単一コロニーを５ｍＬのＹＰＤに接種し、オーバーナイトで成長させた（３０℃、ロータリーホイール）。細胞を５０ｍＬのＹＰＤに継代し（OD600 = 0.05）、再びオーバーナイトで成長させた（３０℃、１８０ｒｐｍシェイカーバス）。細胞を遠心分離（５０００ｒｐｍ、４℃、５分間）によって取得し、５０ｍＬの滅菌水で一度洗浄した。細胞のペレットを５ｍＬの滅菌水に再懸濁し、ＯＤ６００を測定した。ケローナワインヤード、ケロウナ（Kelowna）、ＢＣ、カナダから得たろ過していないシャルドネのジュース２００ｍＬで満たした滅菌した２５０ｍＬのショットボトル（Schott bottles）に、最終的にＯＤ６００＝０．１まで、接種することに細胞懸濁液を使用した。滅菌水で満たされた滅菌した（７０％ ｖ／ｖ エタノール）蒸気ロックで無菌的に密閉した。密閉したボトルを２０℃でインキュベートし、毎日重量を測定してＣＯ２の生産をモニタした。データをエクセルにプロットして醗酵プロファイルを作製した。醗酵の終了時において、細胞を遠心分離によって除去し（５０００ｒｐｍ、４℃、５分間）、〜５０ｍＬのワインを滅菌した５０ｍＬのショットボトルにデカントした。ボトルを７０℃のウォーターバス内で正確に４８時間インキュベートしてＥＣの産出を最大限にし（maximize）、次に４℃でＧＣ／ＭＳ解析まで保管した
【０１０５】
ＳＰＭＥ及びＧＣ−ＭＳによるワイン内のエチルカルバメートの定量
【０１０６】
シャルドネワインを７０℃で４８時間加熱して、エチルカルバメートの産出を促進させた。１０−ｍＬのワインサンプルを２０−ｍＬのサンプルバイアルにピペットで入れた。小さい（small）磁石の攪拌子及び３ｇのＮａＣｌを加え、バイアルをＰＴＦＥ／シリコンのセプタム（septum）でキャップした。バイアルを２２℃でスターラーの上に置き、攪拌で１５分間平衡化するようにした。ＳＰＭＥファイバー（６５μｍ カーボワックス/ジビニルベンゼン）を使用する前に２５０℃で３０分間慣らした（conditioned）。サンプルの平衡化の後に、ファイバーをヘッドスペース（headspace）に挿入した。３０分後、ファイバーをサンプルバイアルから除去し、インジェクションポートに１５分間挿入した。ブランクのランを各サンプルのランの前に実行した。定量は、外部の（external）標準的な方法を使用して行った。１２％（ｖ／ｖ）エタノール及び１ｍＭ酒石酸をｐＨ３．１で含有する蒸留したＨ２Ｏの中で０．１ｍｇ／ｍＬでエチルカルバメート（Sigma-Aldrich, Milwaukee, WI）標準保存溶液を調製した。５、１０、２０、４０、９０μｇ／ＬのＥＣ濃度のもので検量標準（calibration standards）を調製した。標準溶液を冷蔵庫の中で４℃で保管した。ワインの中のエチルカルバメートは、5973N Mass Selective Detectorにインターフェース接続されたAgilent 6890N GCを使用して定量した。６０ｍ ｘ ０．２５ｍｍ（内径）、０．２５μｍ（厚さ）のDBWAX fused-silica open tubular column（J&W Scientific, Folsom, CA）を採用した。キャリアガスは、３６ｃｍ／ｓのコンスタントな流速の超高純度のヘリウムであった。インジェクター及びトランスファーラインの温度は２５０℃にセットした。オーブンの温度は、最初は２分間７０℃にセットし、次に、８℃／分で１８０℃まで上昇させ、３分間保持した。温度は、次に、２０℃／分づつ２２０℃まで増加し、１５分間保持するようにプログラムした。全体のラン時間は、３５．７５分であった。インジェクションモードは、５分間のスプリットレスであった（パージフロー：５ｍＬ／分、パージ時間：５分間）。ＭＳは、電子衝撃イオン化法を用いて選択イオンモニタリング（selected ion monitoring: SIM）モードで実施した；MS quadの温度は１５０℃であり、MS sourceの温度は２３０℃であった。溶媒ディレイは８分であった。特異的なイオン４４、６２、７４、８９が１００ミリ秒のドウェルタイムでモニタされた。Mass 62を信頼のおける（authentic）ＥＣ標準のマススペクトルに対する定量に使用した。
【０１０７】
醗酵プロファイルを図８に示し、機能的に増強されたストレインとコントロールストレインによって産出したエタノールの最終的な量を表２に示す。
【０１０８】
ワイン作製の間のエチルカルバメート低減の概要
酒酵母ストレイン（Ｋ７、Ｋ７ＥＣ−（８）、Ｋ７ＤＵＲ３、Ｋ７ＥＣ−ＤＵＲ３）、そしてワイン酵母ストレイン（５２２、５２２ＥＣ−、５２２ＤＵＲ３、５２２ＥＣ−ＤＵＲ３、ＰＤＭ、ＰＤＭＥＣ−、ＰＤＭＤＵＲ３、ＰＤＭＥＣ−ＤＵＲ３）によって濾過されていないケローナシャルドネマストから生産されたシャルドネワインの中のエチルカルバメート（μｇ／Ｌ）をＧＣ／ＭＳによって定量した。醗酵が完了するまで（〜３００時間）２０℃でインキュベートした。
ＥＣ−ＤＵＲ１，２の恒常的な発現
ＤＵＲ３ＤＵＲ３の恒常的な発現
ＥＣ−ＤＵＲ３ＤＵＲ１，２及びＤＵＲ３の組み合わせられた恒常的な発現
［表１］
【０１０９】
シャルドネワインの中でのワイン酵母ストレイン（５２２、５２２ＤＵＲ１，２［５２２ＥＣ−についての他の名称］、５２２ＤＵＲ３、及び５２２ＤＵＲ１，２/ＤＵＲ３［５２２ＥＣ−ＤＵＲ３についての他の名称］）によるエタノールの生産。エタノール含有量（％ｖ／ｖ）は、醗酵の終了時にＬＣによって測定した。醗酵プロファイルを図３［sic, 図８］に示す。統計的な有意性についてデータを２要因ＡＮＯＶＡ解析を使用して解析した（ｐ≦０．０５）。
［表２］
ｓ：ｐ≦０．０５で有意、ｎ：有意でない
【特許請求の範囲】
【請求項１】
醗酵条件下において尿素トランスポータータンパク質の遺伝子発現の窒素カタボライト抑制を低減するように形質転換した酵母ストレイン。
【請求項２】
尿素トランスポーターがＤＵＲ３によってコードされていることを特徴とする請求項１に記載の酵母ストレイン。
【請求項３】
尿素トランスポーターがＤＵＲ３ｐであることを特徴とする請求項１に記載の酵母ストレイン。
【請求項４】
醗酵条件下において尿素分解酵素の遺伝子発現の窒素カタボライト抑制を低減するように更に形質転換した請求項１〜３のいずれか一項に記載の酵母ストレイン。
【請求項５】
尿素分解酵素がＤＵＲ１，２によってコードされることを特徴とする請求項４に記載の酵母ストレイン。
【請求項６】
尿素分解酵素が尿素カルボキシラーゼ／アロファン酸ヒドロラーゼ又は尿素アミドリアーゼであることを特徴とする請求項４に記載の酵母ストレイン。
【請求項７】
醗酵条件下において継続的に尿素を取り込むように形質転換した請求項１〜６のいずれか一項に記載の酵母ストレイン。
【請求項８】
酵母が恒常的にＤＵＲ３を発現するように形質転換されていることを特徴とする請求項７に記載の酵母ストレイン
【請求項９】
醗酵条件下において継続的に尿素を取り込み、かつ継続的に尿素を分解するように形質転換した請求項４の酵母ストレイン。
【請求項１０】
酵母ストレインがＤＵＲ１，２及びＤＵＲ３を恒常的に発現するように形質転換されていることを特徴とする請求項９に記載の酵母ストレイン。
【請求項１１】
醗酵条件下において尿素トランスポーターの遺伝子発現の窒素カタボライト抑制を低減するように酵母ストレインを形質転換することを含む酵母ストレインの改変方法。
【請求項１２】
尿素トランスポーターがＤＵＲ３によってコードされていることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
尿素トランスポーターがＤＵＲ３ｐであることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
酵母ストレインを、醗酵条件下において尿素分解酵素の遺伝子発現の窒素カタボライト抑制を低減するように更に形質転換することを特徴とする請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
尿素分解酵素がＤＵＲ１，２によってコードされていることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
尿素分解酵素が尿素カルボキシラーゼ、アロファン酸ヒドロラーゼ又は尿素アミドリアーゼであることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
酵母ストレインがＤＵＲ３を恒常的に発現するように形質転換されていることを特徴とする請求項１１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
酵母ストレインがＤＵＲ３ｐをコードするコーディング配列を含む組換え核酸で形質転換されていることを特徴とする請求項１１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
ＤＵＲ３ｐをコードするコーディング配列が窒素カタボライト抑制を受けないプロモーターに機能上リンクされていることを特徴とする請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
醗酵条件下において請求項１〜１０のいずれか一項に記載の酵母ストレインを維持して、低減したエチルカルバメートの濃度を有する醗酵飲料又は醗酵食品を生産することを含む醗酵飲料又は醗酵食品の作製方法。
【請求項２１】
低減したエチルカルバメートの濃度を有する醗酵飲料又は醗酵食品を生産するための請求項１〜１０のいずれか一項に記載の形質転換した酵母ストレインの使用。
【請求項２２】
醗酵飲料又は醗酵食品が３０ｐｐｂ未満のエチルカルバメート濃度を有することを特徴とする請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
醗酵飲料又は醗酵食品が３０ｐｐｂ未満のエチルカルバメート濃度を有することを特徴とする請求項２１に記載の使用。
【請求項２４】
醗酵飲料又は醗酵食品がワインであることを特徴とする請求項２０又は２２に記載の方法。
【請求項２５】
醗酵飲料又は醗酵食品がワインであることを特徴とする請求項２１又は２３に記載の使用。
【請求項２６】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の形質転換した酵母ストレインを使用して生産された低減したエチルカルバメートの濃度を有する醗酵飲料又は醗酵食品。
【請求項２７】
ワインであることを特徴とする請求項２６に記載の醗酵飲料又は醗酵食品。
【請求項２８】
３０ｐｐｂ未満のエチルカルバメート濃度を有する請求項２７に記載のワイン。
【請求項１】
醗酵条件下において尿素トランスポータータンパク質の遺伝子発現の窒素カタボライト抑制を低減するように形質転換した酵母ストレイン。
【請求項２】
尿素トランスポーターがＤＵＲ３によってコードされていることを特徴とする請求項１に記載の酵母ストレイン。
【請求項３】
尿素トランスポーターがＤＵＲ３ｐであることを特徴とする請求項１に記載の酵母ストレイン。
【請求項４】
醗酵条件下において尿素分解酵素の遺伝子発現の窒素カタボライト抑制を低減するように更に形質転換した請求項１〜３のいずれか一項に記載の酵母ストレイン。
【請求項５】
尿素分解酵素がＤＵＲ１，２によってコードされることを特徴とする請求項４に記載の酵母ストレイン。
【請求項６】
尿素分解酵素が尿素カルボキシラーゼ／アロファン酸ヒドロラーゼ又は尿素アミドリアーゼであることを特徴とする請求項４に記載の酵母ストレイン。
【請求項７】
醗酵条件下において継続的に尿素を取り込むように形質転換した請求項１〜６のいずれか一項に記載の酵母ストレイン。
【請求項８】
酵母が恒常的にＤＵＲ３を発現するように形質転換されていることを特徴とする請求項７に記載の酵母ストレイン
【請求項９】
醗酵条件下において継続的に尿素を取り込み、かつ継続的に尿素を分解するように形質転換した請求項４の酵母ストレイン。
【請求項１０】
酵母ストレインがＤＵＲ１，２及びＤＵＲ３を恒常的に発現するように形質転換されていることを特徴とする請求項９に記載の酵母ストレイン。
【請求項１１】
醗酵条件下において尿素トランスポーターの遺伝子発現の窒素カタボライト抑制を低減するように酵母ストレインを形質転換することを含む酵母ストレインの改変方法。
【請求項１２】
尿素トランスポーターがＤＵＲ３によってコードされていることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
尿素トランスポーターがＤＵＲ３ｐであることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
酵母ストレインを、醗酵条件下において尿素分解酵素の遺伝子発現の窒素カタボライト抑制を低減するように更に形質転換することを特徴とする請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
尿素分解酵素がＤＵＲ１，２によってコードされていることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
尿素分解酵素が尿素カルボキシラーゼ、アロファン酸ヒドロラーゼ又は尿素アミドリアーゼであることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
酵母ストレインがＤＵＲ３を恒常的に発現するように形質転換されていることを特徴とする請求項１１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
酵母ストレインがＤＵＲ３ｐをコードするコーディング配列を含む組換え核酸で形質転換されていることを特徴とする請求項１１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
ＤＵＲ３ｐをコードするコーディング配列が窒素カタボライト抑制を受けないプロモーターに機能上リンクされていることを特徴とする請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
醗酵条件下において請求項１〜１０のいずれか一項に記載の酵母ストレインを維持して、低減したエチルカルバメートの濃度を有する醗酵飲料又は醗酵食品を生産することを含む醗酵飲料又は醗酵食品の作製方法。
【請求項２１】
低減したエチルカルバメートの濃度を有する醗酵飲料又は醗酵食品を生産するための請求項１〜１０のいずれか一項に記載の形質転換した酵母ストレインの使用。
【請求項２２】
醗酵飲料又は醗酵食品が３０ｐｐｂ未満のエチルカルバメート濃度を有することを特徴とする請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
醗酵飲料又は醗酵食品が３０ｐｐｂ未満のエチルカルバメート濃度を有することを特徴とする請求項２１に記載の使用。
【請求項２４】
醗酵飲料又は醗酵食品がワインであることを特徴とする請求項２０又は２２に記載の方法。
【請求項２５】
醗酵飲料又は醗酵食品がワインであることを特徴とする請求項２１又は２３に記載の使用。
【請求項２６】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の形質転換した酵母ストレインを使用して生産された低減したエチルカルバメートの濃度を有する醗酵飲料又は醗酵食品。
【請求項２７】
ワインであることを特徴とする請求項２６に記載の醗酵飲料又は醗酵食品。
【請求項２８】
３０ｐｐｂ未満のエチルカルバメート濃度を有する請求項２７に記載のワイン。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６−１】
【図６−２】
【図６−３】
【図６−４】
【図６−５】
【図６−６】
【図６−７】
【図７−１】
【図７−２】
【図７−３】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６−１】
【図６−２】
【図６−３】
【図６−４】
【図６−５】
【図６−６】
【図６−７】
【図７−１】
【図７−２】
【図７−３】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公表番号】特表２０１１−５１６０８５（Ｐ２０１１−５１６０８５Ａ）
【公表日】平成２３年５月２６日（２０１１．５．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５０４２９０（Ｐ２０１１−５０４２９０）
【出願日】平成２１年４月１４日（２００９．４．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＡ２００９／０００４８１
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１２７０５０
【国際公開日】平成２１年１０月２２日（２００９．１０．２２）
【出願人】（３０００６６８７４）ザ・ユニバーシティ・オブ・ブリティッシュ・コロンビア (24)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年５月２６日（２０１１．５．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年４月１４日（２００９．４．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＡ２００９／０００４８１
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１２７０５０
【国際公開日】平成２１年１０月２２日（２００９．１０．２２）
【出願人】（３０００６６８７４）ザ・ユニバーシティ・オブ・ブリティッシュ・コロンビア (24)
【Ｆターム（参考）】
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