改変型アデノウイルスベクター及びその作製方法
【課題】本発明は、従来開発されたアデノウイルス（Ａｄ）ベクターに比べて、例えばＣＡＲを発現していない細胞であっても、より効果的に各種細胞に遺伝子導入可能な改変型Ａｄベクターを提供することを課題とする。
【解決手段】Ａｄのゲノムのカプシドタンパク質の何れかをコードする遺伝子配列の部位に、外来ペプチドをコードするＤＮＡとしてタンパク質導入ドメイン（ＰＴＤ）を構成するペプチドをコードするＤＮＡをライゲーションした改変型Ａｄベクターによる。具体的には、ＨＩＶ（human immunodeficiency virus）由来のＴａｔペプチドをコードするＤＮＡをライゲーションした改変型Ａｄベクターによる。
【解決手段】Ａｄのゲノムのカプシドタンパク質の何れかをコードする遺伝子配列の部位に、外来ペプチドをコードするＤＮＡとしてタンパク質導入ドメイン（ＰＴＤ）を構成するペプチドをコードするＤＮＡをライゲーションした改変型Ａｄベクターによる。具体的には、ＨＩＶ（human immunodeficiency virus）由来のＴａｔペプチドをコードするＤＮＡをライゲーションした改変型Ａｄベクターによる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
アデノウイルスゲノムのカプシドタンパク質の何れかをコードする遺伝子配列の部位に、外来ペプチドをコードするＤＮＡとしてタンパク質導入ドメイン(Protein Transduction Domain)を構成するペプチドをコードするＤＮＡが付与された改変型アデノウイルスベクター及びその作製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、遺伝子治療のベクターとして用いられているアデノウイルスベクターは、サブグループＣ(sub-group C)に属した５型（あるいは２型）のヒトアデノウイルスを基盤としている。ヒトアデノウイルスはＡからＦまでのサブグループに分けられ、少なくとも５１種類の血清型(serotype)が知られているが、サブグループＢ(sub-group B)に属するウイルスを除き、多くのアデノウイルス（５型アデノウイルスを含む）はレセプターとしてcoxsackievirus and adenovirus receptor（ＣＡＲ）を認識して細胞に感染する（非特許文献１）。アデノウイルスベクターは、種々のタイプの細胞へin vivo又はin vitroで遺伝子を導入するための魅力的なビヒクルとして汎用されている。
【０００３】
アデノウイルスはエンベロープを持たず、２５２個のカプソメアよりなる正２０面体構造をしている。そのうち頂点にある１２個のカプソメアは突起構造を持ったペントン（ペントンベースとファイバーから成る）と呼ばれ、他の２４０個はヘキソンと呼ばれる。ウイルスの細胞内への侵入（感染）は、ファイバーが受容体のＣＡＲに結合し（非特許文献１）、その後ペントンベースのＲＧＤモチーフが細胞表面上のインテグリンに結合することによって起こる（非特許文献２、３）。エンドソームに達したウイルスは酸性条件下でカプシドタンパク質の構造変化を起こし、エンドソームを破壊して、細胞質内に侵入する。従って、細胞表面上の受容体であるＣＡＲにウイルスのファイバーが結合するのが、ウイルスが細胞へ導入される第一ステップであり、ファイバーを修飾することにより、ベクターの感染域を変えることができると考えられる（非特許文献４）。
【０００４】
ＣＡＲの発現が乏しいために、従来の５型アデノウイルスベクターによる効率の良い遺伝子導入が困難な細胞種は意外と多く、そのような細胞として、造血幹細胞をはじめとする血液系細胞、樹状細胞、血管平滑筋細胞、骨格筋細胞、滑膜細胞などが知られている。
【０００５】
また、癌細胞は、悪性度の進行と共にＣＡＲの発現低下及びアデノウイルスベクターでの遺伝子導入効率が低下することが報告されており（非特許文献５、６）、アデノウイルスベクターを用いて癌を対象とした遺伝子治療臨床研究を進める上で、考慮すべき問題と考えられる。さらに気道上皮細胞はＣＡＲを発現しているものの、タイトジャンクション構成部位（あるいは側底膜側）に局在しているため、上皮側からアデノウイルスベクターを作用させてもＣＡＲとは接触できず、効率の良い遺伝子導入が困難である場合もある。
【０００６】
アデノウイルスベクターによる遺伝子導入時のＣＡＲ依存性を克服するために、ファイバータンパク質を改変した改良型ベクターの開発が進んでいる。ファイバータンパク質はテール、シャフト、ノブからなり、ノブ領域がＣＡＲと結合する。ファイバーノブの外来ペプチドの挿入部位として適したＨＩループやＣ末端領域に、１ステップのin vitroライゲーションで任意のペプチドコード遺伝子を挿入できるシステムが報告されており、極めて簡便に種々のペプチドをファイバーに表現した改変型アデノウイルスベクターが作製できるようになった（非特許文献７、８；特許文献１〜３）。例えば、αvインテグリンに親和性があるＲＧＤ(Arg-Gly-Asp)ペプチドや、ヘパラン硫酸に親和性があるポリリジン（Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys;Ｋ７）ペプチド（配列番号８）をファイバー表面上に遺伝子工学的に表現させることにより、ＣＡＲを発現していない細胞に対しても効率良く遺伝子を導入することができる。これらのベクターは、αvインテグリンやヘパラン硫酸が、多くの細胞で発現していることから、広範な細胞種・目的への適用が期待できる。一方、これらの分子を発現していない細胞も依然として存在している。
【非特許文献１】Science 275: 1320-1323, 1997
【非特許文献２】J Virol 67: 5198-5205, 1993
【非特許文献３】Cell 73: 309-319, 1993
【非特許文献４】Hum Gene Ther 10: 2575-2576, 1999
【非特許文献５】Cancer Res. 61: 6592-6600, 2001
【非特許文献６】Cancer Res. 62: 3812-3818, 2002
【非特許文献７】Gene Ther. 8: 730-735, 2001
【非特許文献８】J. Gene Med., 5: 267-276, 2003
【特許文献１】米国出願 09/845,160
【特許文献２】特許第３６３５４６２号公報
【特許文献３】特開２００３−２５０５６６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、従来開発されたアデノウイルス（以下、「Ａｄ」という。）ベクターに比べて、例えばＣＡＲを発現していない細胞であっても、より効果的に各種細胞に遺伝子導入可能な改変型Ａｄベクターを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、Ａｄゲノムのカプシドタンパク質の何れかをコードする遺伝子配列の部位に、外来ペプチドをコードするＤＮＡとして、タンパク質導入ドメイン（Protein Transduction Domain:以下単に「ＰＴＤ」という。）を構成するペプチドをコードするＤＮＡをライゲーション反応により挿入し、付与した改変型Ａｄベクターを構築することにより、より効果的に細胞に遺伝子導入可能な改変型Ａｄベクターを提供しうることを見出し、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち本発明は、以下よりなる。
１．Ａｄゲノムのカプシドタンパク質の何れかをコードする遺伝子配列の部位に、タンパク質導入ドメインを構成するペプチドをコードするＤＮＡを、ライゲーション反応により挿入することを特徴とする、改変型Ａｄベクターの作製方法。
２．Ａｄゲノムのカプシドタンパク質の何れかをコードする遺伝子配列に、該遺伝子配列にユニークな制限酵素認識配列を挿入することを特徴とする、前項１に記載の改変型Ａｄベクターの作製方法。
３．カプシドタンパク質の何れかをコードする遺伝子配列の部位が、ファイバーノブのＨＩループコード遺伝子配列及び／又はファイバーノブのＣ末端コード遺伝子配列である、前項１又は２に記載の改変型Ａｄベクターの作製方法。
４．タンパク質導入ドメインが、ＨＩＶ由来のＴＡＴペプチドである前項１〜３のいずれか１に記載の改変型Ａｄベクターの作製方法。
５．Ａｄゲノムが、Ｅ１領域欠損型Ａｄゲノム又は制限増殖型Ａｄゲノムである、前項１〜４のいずれか１項に記載の改変型Ａｄベクターの作製方法。
６．前項１〜５のいずれか１項に記載の作製方法により作製される改変型Ａｄベクター。
７．Ａｄゲノムが、Ｅ１領域欠損型Ａｄゲノム、あるいは制限増殖型Ａｄゲノムであり、該Ａｄゲノムのカプシドタンパク質の何れかをコードする遺伝子配列の部位に、タンパク質導入ドメインを構成するペプチドをコードするＤＮＡが挿入されていることを特徴とする、改変型Ａｄベクター。
８．カプシドタンパク質の何れかをコードする遺伝子配列の部位が、ファイバーノブのＨＩループコード遺伝子配列及び／又はファイバーノブのＣ末端コード遺伝子配列である、前項７に記載の改変型Ａｄベクター。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のＡｄベクターにより、より効果的に細胞内に目的遺伝子を導入することができる。例えば、ＣＡＲを発現していない細胞種や、悪性度の進行とともにＣＡＲの発現が低下しているような細胞であっても、本発明のＡｄベクターを用いることにより目的遺伝子を導入することが可能となり、例えば遺伝子治療用のＡｄベクターとして応用することが考えられる。さらには、実験室レベルにおいても取扱いが容易なＡｄベクターとして利用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明において、Ａｄとはアデノウイルスをさし、本発明において使用可能なＡｄは、in vivo又はin vitroでＤＮＡやＲＮＡなどの核酸配列を種々のタイプの細胞へ導入するビヒクルとしての機能を達成しうるものであれば良く、特に限定されない。代表的には、ヒトを宿主とする２型、５型、１１型、３５型の各Ａｄ、ヒト以外を宿主とするサルＡｄ、マウスＡｄ、イヌＡｄ、ヒツジＡｄ及びトリＡｄなどが挙げられる。
【００１２】
本発明においてＡｄゲノムとは特に限定されないが、特定の細胞種でのみ複製できるようにしたＡｄのゲノム、具体的にはＥ１領域欠損型Ａｄや、制限増殖型Ａｄのゲノムなどが好適であり、特に好適にはＥ１領域欠損型のＡｄゲノムが挙げられる。特定の細胞種でのみ複製できるとは、例えばＥ１領域欠損型Ａｄについては２９３細胞で、制限増殖型Ａｄについては２９３細胞や癌細胞でのみ増殖できることをいう。２９３細胞は、ヒト胎児腎細胞を５型ＡｄのＥ１遺伝子によりトランスフォーメーションして樹立された細胞株であり、Ｅ１タンパク質を恒常的に発現している。
【００１３】
Ｅ１領域欠損型Ａｄゲノムとは、Ｅ１領域を欠損するＡｄゲノムをいい、制限酵素によりＥ１領域を切断し、欠損させたＡｄゲノムをいう。Ｅ１領域欠損とは、Ｅ１タンパク質をコードする領域を機能的に欠損させることを意味する。機能的に欠損させるとは、例えば、宿主細胞内で機能するＥ１タンパク質を発現させないようにすることであり、Ｅ１タンパク質をコードする遺伝子のすべてを欠損している必要はない。
一般に、ＡｄにおいてＥ１領域を欠損させると、Ｅ１タンパク質を発現している細胞（例えば、２９３細胞）以外では増殖することができない。
【００１４】
５型Ａｄゲノム（GenBank Accession番号：M73260, M29978）の場合において、Ｅ１領域とは、具体的には３４２〜３２５３番目に相当する。したがって、本発明のＡｄベクタープラスミドは、宿主細胞内で機能するＥ１タンパク質を発現しないのであれば、３４２〜３２５３番目の領域の一部を有するものであってもよい。
【００１５】
本発明の改変型Ａｄベクタープラスミドは、Ｅ１領域の他に、例えばＥ３領域を欠損させた５型Ａｄゲノムの一部又は全部であっても良い。５型Ａｄゲノム（GenBank Accession番号：M73260, M29978）のＥ３領域とは、２８１３３〜３０８１８番目又は２７８６５〜３０９９５番目に相当する部位をいう。
【００１６】
制限増殖型Ａｄは、Ｅ１タンパク質の発現が例えば癌細胞でのみ起こるＡｄであり、NATURE MEDICINE, 7, 781-787 (2001)に報告されているものを例示することができる。
【００１７】
本発明において、Ａｄゲノムのカプシドタンパク質とは、ウイルスゲノムの表面タンパク質をいい、具体的にはファイバー、ヘキソン、ペントンベース、ｐＩＸ（プロテインＩＸ）などが挙げられる。ファイバータンパク質は、ノブ、シャフト、テールより構成され、ファイバーノブ、ファイバーシャフト、ファイバーテールともいう。カプシドタンパク質の何れかをコードする遺伝子配列の部位とは、これらのタンパク質の何れかをコードする遺伝子配列の部位であればよく、特に限定されないが、好適にはファイバーノブのＨＩループコード遺伝子配列又はファイバーノブのＣ末端コード遺伝子配列の部位が挙げられ、最も好適にはファイバーノブのＨＩループコード遺伝子配列の部位である。
【００１８】
ファイバーノブのＨＩループコード遺伝子配列とは、Ａｄのファイバー分子のアミノ酸５３７から５４９までの領域をコードする塩基配列をさす。ＨＩループのアミノ酸は大部分が親水基であり、ノブ領域の外側に配向している。この領域に、外来ペプチドをコードするＤＮＡが挿入されてもファイバーの３量体形成には影響を及ぼさない。例えば、５型Ａｄでは、該ウイルスのゲノムＤＮＡの３２６４３〜３２６８５番目に相当する。
【００１９】
本発明において、ＰＴＤは、Protein Transduction Domain（タンパク質導入ドメイン）と称される。ＰＴＤをタンパク質との複合体・融合体として用いることにより、タンパク質を細胞内へ導入できることが知られている。
【００２０】
本発明におけるＰＴＤペプチドは、Ａｄに対して外来ペプチドであり、細胞内移行性の機能を有するペプチドであれば良く、特に限定されない。ＰＴＤペプチドの例として、GRKKRRQRRRPQ（配列番号１）、RQIKIWFQNRRMKWKK（配列番号２）が例示される。また、細胞内移行性の機能、即ちＰＴＤ活性を有するタンパク質として、Antennapedia (Antp)や、Herpes simplex virus type 1 (HSV-1) protein VP22 が挙げられる。本発明において、ＰＴＤペプチドとして５〜３０個、さらには５〜２０個のアミノ酸からなるものが好ましく、特に好適にはＨＩＶ（human immunodeficiency virus）由来のＴａｔペプチド（配列番号１）が挙げられる。そのような機能を有するのであれば、例えば、上記に具体的に例示した各ペプチドのうち、１〜６個程度のアミノ酸が置換、欠失、付加されたものであっても良い。具体的には、上記機能を有するペプチドであるならば、配列番号１に示されるＴａｔペプチドにおいて、１〜６個程度のアミノ酸が置換、欠失、付加されたものであってもよい。
【００２１】
挿入するＰＴＤペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列は、細胞内移行性の機能を有するペプチドをコードするものであればよく、どのような配列であっても良いが、具体的には上記配列番号１又は２に記載のペプチドをコードする塩基配列が好適である。また、上記配列からなるオリゴヌクレオチドＤＮＡのほか、これらの配列のうち、１〜複数程度のヌクレオチドの置換、欠失、付加若しくは誘導されたもの、更にはそれらの塩基配列の相補的配列からなるオリゴヌクレオチドＤＮＡであっても良い。
【００２２】
具体的には、以下の配列番号３〜６で示されるオリゴヌクレオチドａ）〜ｄ）のいずれかが例示される。例えば以下の配列番号３及び４のセットを用いて、配列番号１に記載のＴａｔペプチドを導入することができ、配列番号５及び６のセットを用いて、配列番号１に記載のＴａｔペプチドにリンカーを付加したものを導入することができる。
ａ） CGGGCCGCAAGAAGCGCCGCCAGCGCCGCCGCCCCCCCCAGG （配列番号３）
ｂ） CGCCTGGGGGGGGCGGCGGCGCTGGCGGCGCTTCTTGCGGCC （配列番号４）
ｃ） CGGATCCGGTTCAGGAGTGGCTCTGGCCGCAAGAAGCGCCGCCAGCGCCGCCGCCCCCCCCAGTAAGG （配列番号５）
ｄ） CGCCTTACTGGGGGGGGCGGCGGCGCTGGCGGCGCTTCTTGCGGCCAGAGCCACTCCCTGAACCGGATC （配列番号６）
【００２３】
配列番号１に示されるＴａｔペプチドは、広範囲の細胞に対してＰＴＤ活性を示すことが知られている。
【００２４】
本発明の改変型Ａｄベクターの作製方法は、Ａｄゲノムのカプシドタンパク質の何れかをコードする遺伝子配列の部位に、外来ペプチドをコードするＤＮＡとして、タンパク質導入ドメインを構成するペプチドをコードするＤＮＡを、ライゲーション反応により挿入することを特徴とする。これらＰＴＤをタンパク質との複合体・融合体として用いることにより、タンパク質を細胞内へ導入できることが知られている。ＰＴＤペプチドをコードするＤＮＡの導入は、Ａｄのカプシドタンパク質、例えばファイバーノブのＨＩループコード遺伝子配列中及び／若しくはＣ末端コード遺伝子配列中に、該遺伝子配列にユニークな制限酵素認識配列を挿入し、該遺伝子配列中にＰＴＤペプチドをコードするＤＮＡを導入することにより達成される。
【００２５】
ユニークな制限酵素認識配列とは、ＡｄゲノムＤＮＡに本来存在しない制限酵素認識配列を意味し、例えば、制限酵素Csp45I、ClaI、SwaI、PacI、XbaI、I-CeuI、PI-SceI、I-PpoI、I-SceIにより認識される配列が挙げられる。
【００２６】
上記ユニークな制限酵素認識配列の、カプシドタンパク質、例えばファイバーノブのＨＩループコード遺伝子配列又はファイバーノブのＣ末端コード遺伝子配列への挿入は、例えば本実施例に記載したようにして実施することができる。また、ＰＴＤペプチドをコードするＤＮＡの導入は、例えば、該ペプチドコードＤＮＡと上記のユニークな制限酵素認識配列とを有するオリゴヌクレオチドＤＮＡを合成し、ＨＩループコード領域又はＣ末端コード領域にあらかじめ挿入している制限酵素で切断することによって調製したＤＮＡ中に、直接ライゲーションすることによって達成することができる。
【実施例】
【００２７】
以下に実施例を示して本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。以下の実施例及び比較例では、以下の表１に示すベクタープラスミド及びＡｄベクターを構築した。
【００２８】
【表１】
【００２９】
〔実施例１〕改変型Ａｄベクター(Ad-TAT(HI)-L2)の構築
本実施例ではファイバーノブのＨＩループコード遺伝子配列にＴＡＴペプチドコードＤＮＡを付与したＡｄベクタープラスミドの作製について説明する。
【００３０】
非特許文献８の手法に従い、制限酵素Csp45Iの認識部位を有するＥ１／Ｅ３欠損型Ａｄゲノムを含むベクタープラスミドのファイバーノブのＨＩループをコードする遺伝子配列部分を、制限酵素Csp45Iで切断した。前記切断した部位に、ＴＡＴ配列に相当する合成オリゴＤＮＡ（上記のオリゴヌクレオチド１及び２）を挿入し、pAdHM41-HITATを得た。さらに、Ｅ１欠損領域に制限酵素I-CeuI/PI-SceIで切断したpCMVL1（非特許文献７）を含むルシフェラーゼ発現カセットをin vitroライゲーションで導入し、改変型ＡｄベクタープラスミドpAdHM41-HITAT-L2を構築した。該改変型発現Ａｄベクターにおけるルシフェラーゼ発現単位は、ファイバーノブのＨＩループをコードする遺伝子配列部分に目的のペプチド配列を付与する前に挿入しても良い。
【００３１】
最終的に生じたプラスミドをPacIで切断し、フェノール／クロロホルム抽出及びエタノール沈殿によって精製した。線状化したＤＮＡを２９３細胞にトランスフェクションし、ＨＩループ領域にＴＡＴ配列を付与した改変型Ａｄベクター(Ad-TAT(HI)-L2)を構築した。プラスミド中に挿入されたオリゴヌクレオチドの塩基配列は、適切であることを確認した。
【００３２】
〔実施例２〕 改変型Ａｄベクター(Ad-TAT(C)-L2)の構築
本実施例では、ファイバーノブのＣ末端領域遺伝子配列にＴＡＴペプチドコードＤＮＡを付与したＡｄベクターの作製について説明する。
【００３３】
非特許文献８の手法に従い、制限酵素ClaIの認識部位を有するＥ１／Ｅ３欠損型Ａｄゲノムを含むベクタープラスミドのファイバーノブのＣ末端をコードする遺伝子配列部分を、制限酵素ClaIで切断した。前記切断した部位に、ＴＡＴ配列に相当する合成オリゴＤＮＡ（上記のオリゴヌクレオチド３及び４）を挿入し、pAdHM41-CTATを得た。さらに、Ｅ１欠損領域に制限酵素I-CeuI/PI-SceIで切断したpCMVL1（非特許文献７）を含むルシフェラーゼ発現カセットをin vitroライゲーションで導入し、改変型ＡｄベクタープラスミドpAdHM41-CTAT-L2を構築した。該改変型Ａｄベクターにおけるルシフェラーゼ発現単位は、ファイバーノブのＣ末端領域遺伝子配列に目的のペプチド配列を付与する前に挿入しても良い。
【００３４】
最終的に生じたプラスミドをPacIで切断し、フェノール／クロロホルム抽出及びエタノール沈殿によって精製した。線状化したＤＮＡを２９３細胞にトランスフェクションし、ファイバーノブのＣ末端コード領域にＴＡＴ配列を付与した改変型Ａｄベクター(Ad-TAT(C)-L2)を構築した。プラスミド中に挿入されたオリゴヌクレオチドの塩基配列は、適切であることを確認した。
【００３５】
〔比較例１〕 ＴＡＴペプチドを含まないベクタープラスミド及びＡｄベクター
特許文献２及び３の方法に従い、全く外来ペプチドを含まないベクタープラスミド及びＡｄベクター、ＨＩループ領域にＲＧＤペプチドを含むベクタープラスミド及びＡｄベクター並びにＣ末端領域にＫ７を含むベクタープラスミド及びＡｄベクターを構築した。
【００３６】
〔実験例１〕 各種Ａｄベクターの細胞への導入効果
１．各細胞について、各種Ａｄベクターを３０００ＶＰ／ｃｅｌｌで１．５時間作用させた。２日間培養後、ルシフェラーゼ活性を測定した（means ± SD (n = 4)）。ルシフェラーゼ活性は、ピカジーン・LT2.0(TM)(PicaGeneLT2.0(TM))(東洋インキ社）を用いて常法に従って測定した。
【００３７】
２．細胞は以下を用いた。
（１）ＳＦ２９５細胞（ＣＡＲ陰性）：脳腫瘍細胞
（２）ＳＫ ＨＥＰ−１細胞（ＣＡＲ陽性）：ヒト肝ガン細胞
【００３８】
３．その結果を図３及び４に示した。ＳＫ ＨＥＰ−１細胞では従来型ベクターのAd-L2でも高いルシフェラーゼ発現を示したが、ＳＦ２９５細胞では、Ad-L2によるルシフェラーゼの発現は非常に低かった。しかしＳＦ２９５細胞においても、ＴＡＴペプチドをファイバーノブのＨＩループに挿入したベクター（Ad-TAT(HI)-L2）は特に活性が高く、Ad-RGD(HI)-L2及びAd-K7(C)-L2より高いルシフェラーゼ活性を示した。ＴＡＴペプチドをファイバーノブのＣ末端に挿入したベクター（Ad-TAT(C)-L2）も従来型ベクター（Ad-L2）に比べ高い活性を示した。また、ＳＫ ＨＥＰ−１細胞においても、ＴＡＴペプチドをファイバーノブのＨＩループに挿入したベクター（Ad-TAT(HI)-L2）は、従来型ベクターに比べ、有意に高いルシフェラーゼ活性を示した。
これらにより、ＴＡＴペプチドをファイバーノブのＨＩループに挿入したベクター（Ad-TAT(HI)-L2）は従来型ベクターに比べて有意に高い細胞導入効果が認められた。
【００３９】
〔実験例２〕 各種ＡｄベクターのＣＡＲ陰性付着細胞への導入効果
１．各細胞について、実験例１と同様の手順にて各種Ａｄベクターを以下のＣＡＲ陰性付着細胞へ導入し、培養後のルシフェラーゼ活性を測定した。
【００４０】
２．細胞は以下を用いた。
（１）ＮＩＨ３Ｔ３細胞：マウス繊維芽細胞
（２）ＣＨＯ細胞： チャイニーズハムスター・ovary細胞
（３）Ｂ１６細胞：マウス・メラノーマ細胞
【００４１】
３．その結果を図５〜７に示した。各細胞において、Ad-L2によるルシフェラーゼの発現は非常に低かったが、ＴＡＴペプチドをファイバーノブのＨＩループに挿入したベクター（Ad-TAT(HI)-L2）は特に活性が高く、Ad-RGD(HI)-L2及びAd-K7(C)-L2より高いルシフェラーゼ活性を示した。ＴＡＴペプチドをファイバーノブのＣ末端に挿入したベクター（Ad-TAT(C)-L2）も従来型ベクター（Ad-L2）に比べ高い活性を示した。
これらにより、ＴＡＴペプチドをファイバーノブのＨＩループに挿入したベクター（Ad-TAT(HI)-L2）は従来型ベクターに比べて有意に高い細胞導入効果が認められた。
【００４２】
〔実験例３〕 各種ＡｄベクターのＣＡＲ陰性浮遊系細胞への導入効果
１．各浮遊細胞について、１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ／５０μｌで９６穴のマイクロプレート（ブラックプレート）に播種した。その後各種Ａｄベクターを３０００ＶＰ／ｃｅｌｌ及び３００ＶＰ／ｃｅｌｌ／５０μｌで１．５時間作用させた。２日間培養後、ルシフェラーゼ活性を測定した（means ± SD (n = 4)）。ルシフェラーゼ活性は実験例１と同様に測定した。
【００４３】
２．細胞は以下を用いた。
（１）ＨＬ６０：ヒト急性Ｔ細胞性白血病細胞
（２）Ｕ９３７：ヒト単球性白血病細胞
（３）Ｄａｕｄｉ：ヒトバーキットリンパ腫細胞
【００４４】
３．その結果を図８〜１０に示した。各細胞において、Ad-L2によるルシフェラーゼの発現は非常に低かったが、ＴＡＴペプチドをファイバーノブのＨＩループに挿入したベクター（Ad-TAT(HI)-L2）は特に活性が高く、Ad-RGD(HI)-L2及びAd-K7(C)-L2より高いルシフェラーゼ活性を示した。
これらにより、ＴＡＴペプチドをファイバーノブのＨＩループに挿入したベクター（Ad-TAT(HI)-L2）は従来型ベクターに比べて有意に高い細胞導入効果が認められた。
【産業上の利用可能性】
【００４５】
本発明のＡｄベクターにより、より効果的に細胞内にＡｄベクターを導入することができる。例えば、ＣＡＲを発現していない細胞種や、悪性度の進行とともにＣＡＲの発現が低下しているような細胞であっても、本発明のＡｄベクターを用いることで目的遺伝子を効率良く導入することが可能となり、例えば遺伝子治療用のベクターとして応用することが考えられる。さらには、実験レベルにおいても、取扱いが容易なＡｄベクターとして利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】各種Ａｄベクターの態様を示す図である。野生型のファイバーを持った従来型の５型Ａｄベクターは細胞表面上の受容体であるＣＡＲを認識して感染するが、ＲＧＤ配列やポリリジン（KKKKKKK;Ｋ７）配列をファイバーに有したファイバー改変ベクター（Ad-RGD(HI)-L2及びAd-K7(C)-L2）はＣＡＲだけでなくαvインテグリンやヘパラン硫酸を認識しても感染できる。ＴＡＴペプチドを付与したベクター（Ad-TAT(HI)-L2、Ad-TAT(C)-L2）は、詳細な細胞内移行メカニズムは不明であるがＣＡＲ非依存的に感染できる。
【図２】本発明の改変型Ａｄベクターの作製法を示す図である。ＨＩループ領域にＴＡＴ配列を付与したベクターの例を説明する。ファイバーノブのＨＩループ又はＣ末端をコードする遺伝子配列部分にユニークな制限酵素であるCsp45I又はClaI部位をそれぞれ有するベクタープラスミドpAdHM41をCsp45Iで切断し、ＴＡＴ配列に相当する合成オリゴＤＮＡをin vitroライゲーションで導入する。次にＥ１欠損領域にルシフェラーゼ発現単位をin vitroライゲーションを用いて挿入する。最終的に生じたプラスミドをPacIで切断し、２９３細胞にトランスフェクションすると、ＨＩループ領域にＴＡＴ配列を付与したルシフェラーゼ発現Ａｄベクターができる。ルシフェラーゼ発現単位は、ファイバーノブのＨＩループコード領域やＣ末端コード領域に目的のペプチド配列を付与する前に挿入しても良い。
【図３】ＳＦ２９５細胞（ＣＡＲ陰性）に各種Ａｄベクターを作用させたときの遺伝子導入活性を示す図である。
【図４】ＳＫ ＨＥＰ−１細胞（ＣＡＲ陽性）に各種Ａｄベクターを作用させたときの遺伝子導入活性を示す図である。
【図５】ＮＩＨ３Ｔ３細胞（ＣＡＲ陰性）に各種Ａｄベクターを作用させたときの遺伝子導入活性を示す図である。
【図６】ＣＨＯ細胞（ＣＡＲ陰性）に各種Ａｄベクターを作用させたときの遺伝子導入活性を示す図である。
【図７】Ｂ１６細胞（ＣＡＲ陰性）に各種Ａｄベクターを作用させたときの遺伝子導入活性を示す図である。
【図８】ＨＬ６０細胞（ＣＡＲ陰性浮遊細胞）に各種Ａｄベクターを作用させたときの遺伝子導入活性を示す図である。
【図９】Ｕ９３７細胞（ＣＡＲ陰性浮遊細胞）に各種Ａｄベクターを作用させたときの遺伝子導入活性を示す図である。
【図１０】Ｄａｕｄｉ細胞（ＣＡＲ陰性浮遊細胞）に各種Ａｄベクターを作用させたときの遺伝子導入活性を示す図である。
【符号の説明】
【００４７】
ａ Ad-L2
ｂ Ad-TAT(HI)-L2
ｃ Ad-TAT(C)-L2
ｄ Ad-RGD(HI)-L2
ｅ Ad-K7(C)-L2
ｆ 陰性コントロール（Ａｄベクターを導入しない場合）
【技術分野】
【０００１】
アデノウイルスゲノムのカプシドタンパク質の何れかをコードする遺伝子配列の部位に、外来ペプチドをコードするＤＮＡとしてタンパク質導入ドメイン(Protein Transduction Domain)を構成するペプチドをコードするＤＮＡが付与された改変型アデノウイルスベクター及びその作製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、遺伝子治療のベクターとして用いられているアデノウイルスベクターは、サブグループＣ(sub-group C)に属した５型（あるいは２型）のヒトアデノウイルスを基盤としている。ヒトアデノウイルスはＡからＦまでのサブグループに分けられ、少なくとも５１種類の血清型(serotype)が知られているが、サブグループＢ(sub-group B)に属するウイルスを除き、多くのアデノウイルス（５型アデノウイルスを含む）はレセプターとしてcoxsackievirus and adenovirus receptor（ＣＡＲ）を認識して細胞に感染する（非特許文献１）。アデノウイルスベクターは、種々のタイプの細胞へin vivo又はin vitroで遺伝子を導入するための魅力的なビヒクルとして汎用されている。
【０００３】
アデノウイルスはエンベロープを持たず、２５２個のカプソメアよりなる正２０面体構造をしている。そのうち頂点にある１２個のカプソメアは突起構造を持ったペントン（ペントンベースとファイバーから成る）と呼ばれ、他の２４０個はヘキソンと呼ばれる。ウイルスの細胞内への侵入（感染）は、ファイバーが受容体のＣＡＲに結合し（非特許文献１）、その後ペントンベースのＲＧＤモチーフが細胞表面上のインテグリンに結合することによって起こる（非特許文献２、３）。エンドソームに達したウイルスは酸性条件下でカプシドタンパク質の構造変化を起こし、エンドソームを破壊して、細胞質内に侵入する。従って、細胞表面上の受容体であるＣＡＲにウイルスのファイバーが結合するのが、ウイルスが細胞へ導入される第一ステップであり、ファイバーを修飾することにより、ベクターの感染域を変えることができると考えられる（非特許文献４）。
【０００４】
ＣＡＲの発現が乏しいために、従来の５型アデノウイルスベクターによる効率の良い遺伝子導入が困難な細胞種は意外と多く、そのような細胞として、造血幹細胞をはじめとする血液系細胞、樹状細胞、血管平滑筋細胞、骨格筋細胞、滑膜細胞などが知られている。
【０００５】
また、癌細胞は、悪性度の進行と共にＣＡＲの発現低下及びアデノウイルスベクターでの遺伝子導入効率が低下することが報告されており（非特許文献５、６）、アデノウイルスベクターを用いて癌を対象とした遺伝子治療臨床研究を進める上で、考慮すべき問題と考えられる。さらに気道上皮細胞はＣＡＲを発現しているものの、タイトジャンクション構成部位（あるいは側底膜側）に局在しているため、上皮側からアデノウイルスベクターを作用させてもＣＡＲとは接触できず、効率の良い遺伝子導入が困難である場合もある。
【０００６】
アデノウイルスベクターによる遺伝子導入時のＣＡＲ依存性を克服するために、ファイバータンパク質を改変した改良型ベクターの開発が進んでいる。ファイバータンパク質はテール、シャフト、ノブからなり、ノブ領域がＣＡＲと結合する。ファイバーノブの外来ペプチドの挿入部位として適したＨＩループやＣ末端領域に、１ステップのin vitroライゲーションで任意のペプチドコード遺伝子を挿入できるシステムが報告されており、極めて簡便に種々のペプチドをファイバーに表現した改変型アデノウイルスベクターが作製できるようになった（非特許文献７、８；特許文献１〜３）。例えば、αvインテグリンに親和性があるＲＧＤ(Arg-Gly-Asp)ペプチドや、ヘパラン硫酸に親和性があるポリリジン（Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys;Ｋ７）ペプチド（配列番号８）をファイバー表面上に遺伝子工学的に表現させることにより、ＣＡＲを発現していない細胞に対しても効率良く遺伝子を導入することができる。これらのベクターは、αvインテグリンやヘパラン硫酸が、多くの細胞で発現していることから、広範な細胞種・目的への適用が期待できる。一方、これらの分子を発現していない細胞も依然として存在している。
【非特許文献１】Science 275: 1320-1323, 1997
【非特許文献２】J Virol 67: 5198-5205, 1993
【非特許文献３】Cell 73: 309-319, 1993
【非特許文献４】Hum Gene Ther 10: 2575-2576, 1999
【非特許文献５】Cancer Res. 61: 6592-6600, 2001
【非特許文献６】Cancer Res. 62: 3812-3818, 2002
【非特許文献７】Gene Ther. 8: 730-735, 2001
【非特許文献８】J. Gene Med., 5: 267-276, 2003
【特許文献１】米国出願 09/845,160
【特許文献２】特許第３６３５４６２号公報
【特許文献３】特開２００３−２５０５６６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、従来開発されたアデノウイルス（以下、「Ａｄ」という。）ベクターに比べて、例えばＣＡＲを発現していない細胞であっても、より効果的に各種細胞に遺伝子導入可能な改変型Ａｄベクターを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、Ａｄゲノムのカプシドタンパク質の何れかをコードする遺伝子配列の部位に、外来ペプチドをコードするＤＮＡとして、タンパク質導入ドメイン（Protein Transduction Domain:以下単に「ＰＴＤ」という。）を構成するペプチドをコードするＤＮＡをライゲーション反応により挿入し、付与した改変型Ａｄベクターを構築することにより、より効果的に細胞に遺伝子導入可能な改変型Ａｄベクターを提供しうることを見出し、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち本発明は、以下よりなる。
１．Ａｄゲノムのカプシドタンパク質の何れかをコードする遺伝子配列の部位に、タンパク質導入ドメインを構成するペプチドをコードするＤＮＡを、ライゲーション反応により挿入することを特徴とする、改変型Ａｄベクターの作製方法。
２．Ａｄゲノムのカプシドタンパク質の何れかをコードする遺伝子配列に、該遺伝子配列にユニークな制限酵素認識配列を挿入することを特徴とする、前項１に記載の改変型Ａｄベクターの作製方法。
３．カプシドタンパク質の何れかをコードする遺伝子配列の部位が、ファイバーノブのＨＩループコード遺伝子配列及び／又はファイバーノブのＣ末端コード遺伝子配列である、前項１又は２に記載の改変型Ａｄベクターの作製方法。
４．タンパク質導入ドメインが、ＨＩＶ由来のＴＡＴペプチドである前項１〜３のいずれか１に記載の改変型Ａｄベクターの作製方法。
５．Ａｄゲノムが、Ｅ１領域欠損型Ａｄゲノム又は制限増殖型Ａｄゲノムである、前項１〜４のいずれか１項に記載の改変型Ａｄベクターの作製方法。
６．前項１〜５のいずれか１項に記載の作製方法により作製される改変型Ａｄベクター。
７．Ａｄゲノムが、Ｅ１領域欠損型Ａｄゲノム、あるいは制限増殖型Ａｄゲノムであり、該Ａｄゲノムのカプシドタンパク質の何れかをコードする遺伝子配列の部位に、タンパク質導入ドメインを構成するペプチドをコードするＤＮＡが挿入されていることを特徴とする、改変型Ａｄベクター。
８．カプシドタンパク質の何れかをコードする遺伝子配列の部位が、ファイバーノブのＨＩループコード遺伝子配列及び／又はファイバーノブのＣ末端コード遺伝子配列である、前項７に記載の改変型Ａｄベクター。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のＡｄベクターにより、より効果的に細胞内に目的遺伝子を導入することができる。例えば、ＣＡＲを発現していない細胞種や、悪性度の進行とともにＣＡＲの発現が低下しているような細胞であっても、本発明のＡｄベクターを用いることにより目的遺伝子を導入することが可能となり、例えば遺伝子治療用のＡｄベクターとして応用することが考えられる。さらには、実験室レベルにおいても取扱いが容易なＡｄベクターとして利用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明において、Ａｄとはアデノウイルスをさし、本発明において使用可能なＡｄは、in vivo又はin vitroでＤＮＡやＲＮＡなどの核酸配列を種々のタイプの細胞へ導入するビヒクルとしての機能を達成しうるものであれば良く、特に限定されない。代表的には、ヒトを宿主とする２型、５型、１１型、３５型の各Ａｄ、ヒト以外を宿主とするサルＡｄ、マウスＡｄ、イヌＡｄ、ヒツジＡｄ及びトリＡｄなどが挙げられる。
【００１２】
本発明においてＡｄゲノムとは特に限定されないが、特定の細胞種でのみ複製できるようにしたＡｄのゲノム、具体的にはＥ１領域欠損型Ａｄや、制限増殖型Ａｄのゲノムなどが好適であり、特に好適にはＥ１領域欠損型のＡｄゲノムが挙げられる。特定の細胞種でのみ複製できるとは、例えばＥ１領域欠損型Ａｄについては２９３細胞で、制限増殖型Ａｄについては２９３細胞や癌細胞でのみ増殖できることをいう。２９３細胞は、ヒト胎児腎細胞を５型ＡｄのＥ１遺伝子によりトランスフォーメーションして樹立された細胞株であり、Ｅ１タンパク質を恒常的に発現している。
【００１３】
Ｅ１領域欠損型Ａｄゲノムとは、Ｅ１領域を欠損するＡｄゲノムをいい、制限酵素によりＥ１領域を切断し、欠損させたＡｄゲノムをいう。Ｅ１領域欠損とは、Ｅ１タンパク質をコードする領域を機能的に欠損させることを意味する。機能的に欠損させるとは、例えば、宿主細胞内で機能するＥ１タンパク質を発現させないようにすることであり、Ｅ１タンパク質をコードする遺伝子のすべてを欠損している必要はない。
一般に、ＡｄにおいてＥ１領域を欠損させると、Ｅ１タンパク質を発現している細胞（例えば、２９３細胞）以外では増殖することができない。
【００１４】
５型Ａｄゲノム（GenBank Accession番号：M73260, M29978）の場合において、Ｅ１領域とは、具体的には３４２〜３２５３番目に相当する。したがって、本発明のＡｄベクタープラスミドは、宿主細胞内で機能するＥ１タンパク質を発現しないのであれば、３４２〜３２５３番目の領域の一部を有するものであってもよい。
【００１５】
本発明の改変型Ａｄベクタープラスミドは、Ｅ１領域の他に、例えばＥ３領域を欠損させた５型Ａｄゲノムの一部又は全部であっても良い。５型Ａｄゲノム（GenBank Accession番号：M73260, M29978）のＥ３領域とは、２８１３３〜３０８１８番目又は２７８６５〜３０９９５番目に相当する部位をいう。
【００１６】
制限増殖型Ａｄは、Ｅ１タンパク質の発現が例えば癌細胞でのみ起こるＡｄであり、NATURE MEDICINE, 7, 781-787 (2001)に報告されているものを例示することができる。
【００１７】
本発明において、Ａｄゲノムのカプシドタンパク質とは、ウイルスゲノムの表面タンパク質をいい、具体的にはファイバー、ヘキソン、ペントンベース、ｐＩＸ（プロテインＩＸ）などが挙げられる。ファイバータンパク質は、ノブ、シャフト、テールより構成され、ファイバーノブ、ファイバーシャフト、ファイバーテールともいう。カプシドタンパク質の何れかをコードする遺伝子配列の部位とは、これらのタンパク質の何れかをコードする遺伝子配列の部位であればよく、特に限定されないが、好適にはファイバーノブのＨＩループコード遺伝子配列又はファイバーノブのＣ末端コード遺伝子配列の部位が挙げられ、最も好適にはファイバーノブのＨＩループコード遺伝子配列の部位である。
【００１８】
ファイバーノブのＨＩループコード遺伝子配列とは、Ａｄのファイバー分子のアミノ酸５３７から５４９までの領域をコードする塩基配列をさす。ＨＩループのアミノ酸は大部分が親水基であり、ノブ領域の外側に配向している。この領域に、外来ペプチドをコードするＤＮＡが挿入されてもファイバーの３量体形成には影響を及ぼさない。例えば、５型Ａｄでは、該ウイルスのゲノムＤＮＡの３２６４３〜３２６８５番目に相当する。
【００１９】
本発明において、ＰＴＤは、Protein Transduction Domain（タンパク質導入ドメイン）と称される。ＰＴＤをタンパク質との複合体・融合体として用いることにより、タンパク質を細胞内へ導入できることが知られている。
【００２０】
本発明におけるＰＴＤペプチドは、Ａｄに対して外来ペプチドであり、細胞内移行性の機能を有するペプチドであれば良く、特に限定されない。ＰＴＤペプチドの例として、GRKKRRQRRRPQ（配列番号１）、RQIKIWFQNRRMKWKK（配列番号２）が例示される。また、細胞内移行性の機能、即ちＰＴＤ活性を有するタンパク質として、Antennapedia (Antp)や、Herpes simplex virus type 1 (HSV-1) protein VP22 が挙げられる。本発明において、ＰＴＤペプチドとして５〜３０個、さらには５〜２０個のアミノ酸からなるものが好ましく、特に好適にはＨＩＶ（human immunodeficiency virus）由来のＴａｔペプチド（配列番号１）が挙げられる。そのような機能を有するのであれば、例えば、上記に具体的に例示した各ペプチドのうち、１〜６個程度のアミノ酸が置換、欠失、付加されたものであっても良い。具体的には、上記機能を有するペプチドであるならば、配列番号１に示されるＴａｔペプチドにおいて、１〜６個程度のアミノ酸が置換、欠失、付加されたものであってもよい。
【００２１】
挿入するＰＴＤペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列は、細胞内移行性の機能を有するペプチドをコードするものであればよく、どのような配列であっても良いが、具体的には上記配列番号１又は２に記載のペプチドをコードする塩基配列が好適である。また、上記配列からなるオリゴヌクレオチドＤＮＡのほか、これらの配列のうち、１〜複数程度のヌクレオチドの置換、欠失、付加若しくは誘導されたもの、更にはそれらの塩基配列の相補的配列からなるオリゴヌクレオチドＤＮＡであっても良い。
【００２２】
具体的には、以下の配列番号３〜６で示されるオリゴヌクレオチドａ）〜ｄ）のいずれかが例示される。例えば以下の配列番号３及び４のセットを用いて、配列番号１に記載のＴａｔペプチドを導入することができ、配列番号５及び６のセットを用いて、配列番号１に記載のＴａｔペプチドにリンカーを付加したものを導入することができる。
ａ） CGGGCCGCAAGAAGCGCCGCCAGCGCCGCCGCCCCCCCCAGG （配列番号３）
ｂ） CGCCTGGGGGGGGCGGCGGCGCTGGCGGCGCTTCTTGCGGCC （配列番号４）
ｃ） CGGATCCGGTTCAGGAGTGGCTCTGGCCGCAAGAAGCGCCGCCAGCGCCGCCGCCCCCCCCAGTAAGG （配列番号５）
ｄ） CGCCTTACTGGGGGGGGCGGCGGCGCTGGCGGCGCTTCTTGCGGCCAGAGCCACTCCCTGAACCGGATC （配列番号６）
【００２３】
配列番号１に示されるＴａｔペプチドは、広範囲の細胞に対してＰＴＤ活性を示すことが知られている。
【００２４】
本発明の改変型Ａｄベクターの作製方法は、Ａｄゲノムのカプシドタンパク質の何れかをコードする遺伝子配列の部位に、外来ペプチドをコードするＤＮＡとして、タンパク質導入ドメインを構成するペプチドをコードするＤＮＡを、ライゲーション反応により挿入することを特徴とする。これらＰＴＤをタンパク質との複合体・融合体として用いることにより、タンパク質を細胞内へ導入できることが知られている。ＰＴＤペプチドをコードするＤＮＡの導入は、Ａｄのカプシドタンパク質、例えばファイバーノブのＨＩループコード遺伝子配列中及び／若しくはＣ末端コード遺伝子配列中に、該遺伝子配列にユニークな制限酵素認識配列を挿入し、該遺伝子配列中にＰＴＤペプチドをコードするＤＮＡを導入することにより達成される。
【００２５】
ユニークな制限酵素認識配列とは、ＡｄゲノムＤＮＡに本来存在しない制限酵素認識配列を意味し、例えば、制限酵素Csp45I、ClaI、SwaI、PacI、XbaI、I-CeuI、PI-SceI、I-PpoI、I-SceIにより認識される配列が挙げられる。
【００２６】
上記ユニークな制限酵素認識配列の、カプシドタンパク質、例えばファイバーノブのＨＩループコード遺伝子配列又はファイバーノブのＣ末端コード遺伝子配列への挿入は、例えば本実施例に記載したようにして実施することができる。また、ＰＴＤペプチドをコードするＤＮＡの導入は、例えば、該ペプチドコードＤＮＡと上記のユニークな制限酵素認識配列とを有するオリゴヌクレオチドＤＮＡを合成し、ＨＩループコード領域又はＣ末端コード領域にあらかじめ挿入している制限酵素で切断することによって調製したＤＮＡ中に、直接ライゲーションすることによって達成することができる。
【実施例】
【００２７】
以下に実施例を示して本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。以下の実施例及び比較例では、以下の表１に示すベクタープラスミド及びＡｄベクターを構築した。
【００２８】
【表１】
【００２９】
〔実施例１〕改変型Ａｄベクター(Ad-TAT(HI)-L2)の構築
本実施例ではファイバーノブのＨＩループコード遺伝子配列にＴＡＴペプチドコードＤＮＡを付与したＡｄベクタープラスミドの作製について説明する。
【００３０】
非特許文献８の手法に従い、制限酵素Csp45Iの認識部位を有するＥ１／Ｅ３欠損型Ａｄゲノムを含むベクタープラスミドのファイバーノブのＨＩループをコードする遺伝子配列部分を、制限酵素Csp45Iで切断した。前記切断した部位に、ＴＡＴ配列に相当する合成オリゴＤＮＡ（上記のオリゴヌクレオチド１及び２）を挿入し、pAdHM41-HITATを得た。さらに、Ｅ１欠損領域に制限酵素I-CeuI/PI-SceIで切断したpCMVL1（非特許文献７）を含むルシフェラーゼ発現カセットをin vitroライゲーションで導入し、改変型ＡｄベクタープラスミドpAdHM41-HITAT-L2を構築した。該改変型発現Ａｄベクターにおけるルシフェラーゼ発現単位は、ファイバーノブのＨＩループをコードする遺伝子配列部分に目的のペプチド配列を付与する前に挿入しても良い。
【００３１】
最終的に生じたプラスミドをPacIで切断し、フェノール／クロロホルム抽出及びエタノール沈殿によって精製した。線状化したＤＮＡを２９３細胞にトランスフェクションし、ＨＩループ領域にＴＡＴ配列を付与した改変型Ａｄベクター(Ad-TAT(HI)-L2)を構築した。プラスミド中に挿入されたオリゴヌクレオチドの塩基配列は、適切であることを確認した。
【００３２】
〔実施例２〕 改変型Ａｄベクター(Ad-TAT(C)-L2)の構築
本実施例では、ファイバーノブのＣ末端領域遺伝子配列にＴＡＴペプチドコードＤＮＡを付与したＡｄベクターの作製について説明する。
【００３３】
非特許文献８の手法に従い、制限酵素ClaIの認識部位を有するＥ１／Ｅ３欠損型Ａｄゲノムを含むベクタープラスミドのファイバーノブのＣ末端をコードする遺伝子配列部分を、制限酵素ClaIで切断した。前記切断した部位に、ＴＡＴ配列に相当する合成オリゴＤＮＡ（上記のオリゴヌクレオチド３及び４）を挿入し、pAdHM41-CTATを得た。さらに、Ｅ１欠損領域に制限酵素I-CeuI/PI-SceIで切断したpCMVL1（非特許文献７）を含むルシフェラーゼ発現カセットをin vitroライゲーションで導入し、改変型ＡｄベクタープラスミドpAdHM41-CTAT-L2を構築した。該改変型Ａｄベクターにおけるルシフェラーゼ発現単位は、ファイバーノブのＣ末端領域遺伝子配列に目的のペプチド配列を付与する前に挿入しても良い。
【００３４】
最終的に生じたプラスミドをPacIで切断し、フェノール／クロロホルム抽出及びエタノール沈殿によって精製した。線状化したＤＮＡを２９３細胞にトランスフェクションし、ファイバーノブのＣ末端コード領域にＴＡＴ配列を付与した改変型Ａｄベクター(Ad-TAT(C)-L2)を構築した。プラスミド中に挿入されたオリゴヌクレオチドの塩基配列は、適切であることを確認した。
【００３５】
〔比較例１〕 ＴＡＴペプチドを含まないベクタープラスミド及びＡｄベクター
特許文献２及び３の方法に従い、全く外来ペプチドを含まないベクタープラスミド及びＡｄベクター、ＨＩループ領域にＲＧＤペプチドを含むベクタープラスミド及びＡｄベクター並びにＣ末端領域にＫ７を含むベクタープラスミド及びＡｄベクターを構築した。
【００３６】
〔実験例１〕 各種Ａｄベクターの細胞への導入効果
１．各細胞について、各種Ａｄベクターを３０００ＶＰ／ｃｅｌｌで１．５時間作用させた。２日間培養後、ルシフェラーゼ活性を測定した（means ± SD (n = 4)）。ルシフェラーゼ活性は、ピカジーン・LT2.0(TM)(PicaGeneLT2.0(TM))(東洋インキ社）を用いて常法に従って測定した。
【００３７】
２．細胞は以下を用いた。
（１）ＳＦ２９５細胞（ＣＡＲ陰性）：脳腫瘍細胞
（２）ＳＫ ＨＥＰ−１細胞（ＣＡＲ陽性）：ヒト肝ガン細胞
【００３８】
３．その結果を図３及び４に示した。ＳＫ ＨＥＰ−１細胞では従来型ベクターのAd-L2でも高いルシフェラーゼ発現を示したが、ＳＦ２９５細胞では、Ad-L2によるルシフェラーゼの発現は非常に低かった。しかしＳＦ２９５細胞においても、ＴＡＴペプチドをファイバーノブのＨＩループに挿入したベクター（Ad-TAT(HI)-L2）は特に活性が高く、Ad-RGD(HI)-L2及びAd-K7(C)-L2より高いルシフェラーゼ活性を示した。ＴＡＴペプチドをファイバーノブのＣ末端に挿入したベクター（Ad-TAT(C)-L2）も従来型ベクター（Ad-L2）に比べ高い活性を示した。また、ＳＫ ＨＥＰ−１細胞においても、ＴＡＴペプチドをファイバーノブのＨＩループに挿入したベクター（Ad-TAT(HI)-L2）は、従来型ベクターに比べ、有意に高いルシフェラーゼ活性を示した。
これらにより、ＴＡＴペプチドをファイバーノブのＨＩループに挿入したベクター（Ad-TAT(HI)-L2）は従来型ベクターに比べて有意に高い細胞導入効果が認められた。
【００３９】
〔実験例２〕 各種ＡｄベクターのＣＡＲ陰性付着細胞への導入効果
１．各細胞について、実験例１と同様の手順にて各種Ａｄベクターを以下のＣＡＲ陰性付着細胞へ導入し、培養後のルシフェラーゼ活性を測定した。
【００４０】
２．細胞は以下を用いた。
（１）ＮＩＨ３Ｔ３細胞：マウス繊維芽細胞
（２）ＣＨＯ細胞： チャイニーズハムスター・ovary細胞
（３）Ｂ１６細胞：マウス・メラノーマ細胞
【００４１】
３．その結果を図５〜７に示した。各細胞において、Ad-L2によるルシフェラーゼの発現は非常に低かったが、ＴＡＴペプチドをファイバーノブのＨＩループに挿入したベクター（Ad-TAT(HI)-L2）は特に活性が高く、Ad-RGD(HI)-L2及びAd-K7(C)-L2より高いルシフェラーゼ活性を示した。ＴＡＴペプチドをファイバーノブのＣ末端に挿入したベクター（Ad-TAT(C)-L2）も従来型ベクター（Ad-L2）に比べ高い活性を示した。
これらにより、ＴＡＴペプチドをファイバーノブのＨＩループに挿入したベクター（Ad-TAT(HI)-L2）は従来型ベクターに比べて有意に高い細胞導入効果が認められた。
【００４２】
〔実験例３〕 各種ＡｄベクターのＣＡＲ陰性浮遊系細胞への導入効果
１．各浮遊細胞について、１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ／５０μｌで９６穴のマイクロプレート（ブラックプレート）に播種した。その後各種Ａｄベクターを３０００ＶＰ／ｃｅｌｌ及び３００ＶＰ／ｃｅｌｌ／５０μｌで１．５時間作用させた。２日間培養後、ルシフェラーゼ活性を測定した（means ± SD (n = 4)）。ルシフェラーゼ活性は実験例１と同様に測定した。
【００４３】
２．細胞は以下を用いた。
（１）ＨＬ６０：ヒト急性Ｔ細胞性白血病細胞
（２）Ｕ９３７：ヒト単球性白血病細胞
（３）Ｄａｕｄｉ：ヒトバーキットリンパ腫細胞
【００４４】
３．その結果を図８〜１０に示した。各細胞において、Ad-L2によるルシフェラーゼの発現は非常に低かったが、ＴＡＴペプチドをファイバーノブのＨＩループに挿入したベクター（Ad-TAT(HI)-L2）は特に活性が高く、Ad-RGD(HI)-L2及びAd-K7(C)-L2より高いルシフェラーゼ活性を示した。
これらにより、ＴＡＴペプチドをファイバーノブのＨＩループに挿入したベクター（Ad-TAT(HI)-L2）は従来型ベクターに比べて有意に高い細胞導入効果が認められた。
【産業上の利用可能性】
【００４５】
本発明のＡｄベクターにより、より効果的に細胞内にＡｄベクターを導入することができる。例えば、ＣＡＲを発現していない細胞種や、悪性度の進行とともにＣＡＲの発現が低下しているような細胞であっても、本発明のＡｄベクターを用いることで目的遺伝子を効率良く導入することが可能となり、例えば遺伝子治療用のベクターとして応用することが考えられる。さらには、実験レベルにおいても、取扱いが容易なＡｄベクターとして利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】各種Ａｄベクターの態様を示す図である。野生型のファイバーを持った従来型の５型Ａｄベクターは細胞表面上の受容体であるＣＡＲを認識して感染するが、ＲＧＤ配列やポリリジン（KKKKKKK;Ｋ７）配列をファイバーに有したファイバー改変ベクター（Ad-RGD(HI)-L2及びAd-K7(C)-L2）はＣＡＲだけでなくαvインテグリンやヘパラン硫酸を認識しても感染できる。ＴＡＴペプチドを付与したベクター（Ad-TAT(HI)-L2、Ad-TAT(C)-L2）は、詳細な細胞内移行メカニズムは不明であるがＣＡＲ非依存的に感染できる。
【図２】本発明の改変型Ａｄベクターの作製法を示す図である。ＨＩループ領域にＴＡＴ配列を付与したベクターの例を説明する。ファイバーノブのＨＩループ又はＣ末端をコードする遺伝子配列部分にユニークな制限酵素であるCsp45I又はClaI部位をそれぞれ有するベクタープラスミドpAdHM41をCsp45Iで切断し、ＴＡＴ配列に相当する合成オリゴＤＮＡをin vitroライゲーションで導入する。次にＥ１欠損領域にルシフェラーゼ発現単位をin vitroライゲーションを用いて挿入する。最終的に生じたプラスミドをPacIで切断し、２９３細胞にトランスフェクションすると、ＨＩループ領域にＴＡＴ配列を付与したルシフェラーゼ発現Ａｄベクターができる。ルシフェラーゼ発現単位は、ファイバーノブのＨＩループコード領域やＣ末端コード領域に目的のペプチド配列を付与する前に挿入しても良い。
【図３】ＳＦ２９５細胞（ＣＡＲ陰性）に各種Ａｄベクターを作用させたときの遺伝子導入活性を示す図である。
【図４】ＳＫ ＨＥＰ−１細胞（ＣＡＲ陽性）に各種Ａｄベクターを作用させたときの遺伝子導入活性を示す図である。
【図５】ＮＩＨ３Ｔ３細胞（ＣＡＲ陰性）に各種Ａｄベクターを作用させたときの遺伝子導入活性を示す図である。
【図６】ＣＨＯ細胞（ＣＡＲ陰性）に各種Ａｄベクターを作用させたときの遺伝子導入活性を示す図である。
【図７】Ｂ１６細胞（ＣＡＲ陰性）に各種Ａｄベクターを作用させたときの遺伝子導入活性を示す図である。
【図８】ＨＬ６０細胞（ＣＡＲ陰性浮遊細胞）に各種Ａｄベクターを作用させたときの遺伝子導入活性を示す図である。
【図９】Ｕ９３７細胞（ＣＡＲ陰性浮遊細胞）に各種Ａｄベクターを作用させたときの遺伝子導入活性を示す図である。
【図１０】Ｄａｕｄｉ細胞（ＣＡＲ陰性浮遊細胞）に各種Ａｄベクターを作用させたときの遺伝子導入活性を示す図である。
【符号の説明】
【００４７】
ａ Ad-L2
ｂ Ad-TAT(HI)-L2
ｃ Ad-TAT(C)-L2
ｄ Ad-RGD(HI)-L2
ｅ Ad-K7(C)-L2
ｆ 陰性コントロール（Ａｄベクターを導入しない場合）
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アデノウイルスゲノムのカプシドタンパク質の何れかをコードする遺伝子配列の部位に、タンパク質導入ドメインを構成するペプチドをコードするＤＮＡを、ライゲーション反応により挿入することを特徴とする、改変型アデノウイルスベクターの作製方法。
【請求項２】
アデノウイルスゲノムのカプシドタンパク質の何れかをコードする遺伝子配列に、該遺伝子配列にユニークな制限酵素認識配列を挿入することを特徴とする、請求項１に記載の改変型アデノウイルスベクターの作製方法。
【請求項３】
カプシドタンパク質の何れかをコードする遺伝子配列の部位が、ファイバーノブのＨＩループコード遺伝子配列及び／又はファイバーノブのＣ末端コード遺伝子配列である、請求項１又は２に記載の改変型アデノウイルスベクターの作製方法。
【請求項４】
タンパク質導入ドメインが、ＨＩＶ由来のＴＡＴペプチドである請求項１〜３のいずれか１に記載の改変型アデノウイルスベクターの作製方法。
【請求項５】
アデノウイルスゲノムが、Ｅ１領域欠損型アデノウイルスゲノム又は制限増殖型アデノウイルスゲノムである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の改変型アデノウイルスベクターの作製方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の作製方法により作製される改変型アデノウイルスベクター。
【請求項７】
アデノウイルスゲノムが、Ｅ１領域欠損型アデノウイルスゲノム、あるいは制限増殖型アデノウイルスゲノムであり、該アデノウイルスゲノムのカプシドタンパク質の何れかをコードする遺伝子配列の部位に、タンパク質導入ドメインを構成するペプチドをコードするＤＮＡが挿入されていることを特徴とする、改変型アデノウイルスベクター。
【請求項８】
カプシドタンパク質の何れかをコードする遺伝子配列の部位が、ファイバーノブのＨＩループコード遺伝子配列及び／又はファイバーノブのＣ末端コード遺伝子配列である、請求項７に記載の改変型アデノウイルスベクター。
【請求項１】
アデノウイルスゲノムのカプシドタンパク質の何れかをコードする遺伝子配列の部位に、タンパク質導入ドメインを構成するペプチドをコードするＤＮＡを、ライゲーション反応により挿入することを特徴とする、改変型アデノウイルスベクターの作製方法。
【請求項２】
アデノウイルスゲノムのカプシドタンパク質の何れかをコードする遺伝子配列に、該遺伝子配列にユニークな制限酵素認識配列を挿入することを特徴とする、請求項１に記載の改変型アデノウイルスベクターの作製方法。
【請求項３】
カプシドタンパク質の何れかをコードする遺伝子配列の部位が、ファイバーノブのＨＩループコード遺伝子配列及び／又はファイバーノブのＣ末端コード遺伝子配列である、請求項１又は２に記載の改変型アデノウイルスベクターの作製方法。
【請求項４】
タンパク質導入ドメインが、ＨＩＶ由来のＴＡＴペプチドである請求項１〜３のいずれか１に記載の改変型アデノウイルスベクターの作製方法。
【請求項５】
アデノウイルスゲノムが、Ｅ１領域欠損型アデノウイルスゲノム又は制限増殖型アデノウイルスゲノムである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の改変型アデノウイルスベクターの作製方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の作製方法により作製される改変型アデノウイルスベクター。
【請求項７】
アデノウイルスゲノムが、Ｅ１領域欠損型アデノウイルスゲノム、あるいは制限増殖型アデノウイルスゲノムであり、該アデノウイルスゲノムのカプシドタンパク質の何れかをコードする遺伝子配列の部位に、タンパク質導入ドメインを構成するペプチドをコードするＤＮＡが挿入されていることを特徴とする、改変型アデノウイルスベクター。
【請求項８】
カプシドタンパク質の何れかをコードする遺伝子配列の部位が、ファイバーノブのＨＩループコード遺伝子配列及び／又はファイバーノブのＣ末端コード遺伝子配列である、請求項７に記載の改変型アデノウイルスベクター。
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図１】
【図２】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図１】
【図２】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公開番号】特開２００８−１３６３８１（Ｐ２００８−１３６３８１Ａ）
【公開日】平成２０年６月１９日（２００８．６．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−３２３７７７（Ｐ２００６−３２３７７７）
【出願日】平成１８年１１月３０日（２００６．１１．３０）
【出願人】（８０３００００５６）財団法人ヒューマンサイエンス振興財団 (341)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年６月１９日（２００８．６．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１１月３０日（２００６．１１．３０）
【出願人】（８０３００００５６）財団法人ヒューマンサイエンス振興財団 (341)
【Ｆターム（参考）】
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