改良されたウイルス精製法
【課題】改良されたウイルス（具体的には、レオウイルス）の精製方法の提供。
【解決手段】感染性ウイルスは、細胞培養物から界面活性剤を用いて抽出することができ、高力価のウイルスが得られる。ウイルスは、その後、濾過およびカラムクロマトグラフィーのような簡単な工程によって精製することができる。本発明にしたがって調製されたウイルスおよびウイルスを含む組成物もまた提供される。本発明は、小規模および大規模のいずれのウイルス生産にも適用することができる、細胞培養物からウイルスを抽出し精製する改良された方法に関する。この方法には、細胞培養物に界面活性剤が直接添加される、簡単な抽出工程が含まれる。
【解決手段】感染性ウイルスは、細胞培養物から界面活性剤を用いて抽出することができ、高力価のウイルスが得られる。ウイルスは、その後、濾過およびカラムクロマトグラフィーのような簡単な工程によって精製することができる。本発明にしたがって調製されたウイルスおよびウイルスを含む組成物もまた提供される。本発明は、小規模および大規模のいずれのウイルス生産にも適用することができる、細胞培養物からウイルスを抽出し精製する改良された方法に関する。この方法には、細胞培養物に界面活性剤が直接添加される、簡単な抽出工程が含まれる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞培養物からウイルスを抽出する方法に関する。具体的には、この方法は哺乳動物（ヒトを含む）への臨床投与に適している形態で感染性ウイルスを抽出するために有用である。
【背景技術】
【０００２】
（参考文献）
【０００３】
【数１】
【０００４】
【数２】
【０００５】
【数３】
（発明の背景）
ウイルスによって引き起こされる膨大な数の疾患が原因で、ウイルス学は重点的に研究されている分野となっている。ウイルスタンパク質を単離し精製するため、ワクチンを作成するため、あるいは、実験室での研究用の感染性ウイルスを提供するためにウイルスを効率よく生産することは常に求められている。最近、新規のウイルス治療の開発には、さらに、感染性ウイルスの効率的な生産の必要性が必然的に伴う。
【０００６】
レオウイルス治療はウイルス治療の一例である。レオウイルスは、多数の細胞に結合することができる二本鎖のＲＮＡウイルスである。しかし、ほとんどの細胞は、レオウイルスには感染しにくく、その細胞受容体に対するレオウイルスの結合によってはこれらの細胞の中でのウイルスの複製またはウイルス粒子の生産は生じない。これが、おそらく、レオウイルスがいずれの特定の疾患にも関係していることが明らかになっていないことの理由である。
【０００７】
ｒａｓ腫瘍遺伝子で形質転換された細胞はレオウイルスに感染しやすくなるが、形質転換されていない対応する細胞はそうではない（非特許文献１）。例えば、レオウイルス耐性ＮＩＨ ３Ｔ３細胞が活性化させられたＲａｓまたはＳｏｓ（Ｒａｓを活性化させるタンパク質）で形質転換された場合には、レオウイルス感染が促進される。同様に、レオウイルス感染に耐性があるマウス線維芽細胞も、ＥＧＦ受容体遺伝子またはｖ−ｅｒｂＢ腫瘍遺伝子（いずれもｒａｓ経路を活性化させる）でのトランスフェクションの後には感染しやすくなる（非特許文献２；非特許文献３）。したがって、レオウイルスは、Ｒａｓ経路が活性化させられている細胞に選択的に感染し、その中で複製することができる。
【０００８】
ｒａｓ腫瘍遺伝子は、哺乳動物の腫瘍の大部分について主要な原因となっている。ｒａｓ遺伝子自体の活性化変異が、ヒト腫瘍全体の約３０％において生じており（Ｂｏｓ，１９８９）、主に、膵臓ガン（９０％）、散発性結腸直腸ガン（５０％）、および肺ガン（４０％）、ならびに骨髄性白血病（３０％）において生じている。ｒａｓ経路においてｒａｓの上流または下流にある複数の因子の活性化もまた腫瘍に関係している。例えば、ＨＥＲ２／Ｎｅｕ／ＥｒｂＢ２または上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）受容体の過剰発現は、乳ガンにおいて一般的であり（２５〜３０％）、そして血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）受容体またはＥＧＦ受容体の過剰発現は、神経膠腫および膠芽細胞腫において一般的である（４０〜５０％）。ＥＧＦ受容体およびＰＤＧＦ受容体はいずれも、それらのそれぞれのリガンドに結合するとｒａｓを活性化させることが知られており、そしてｖ−ｅｒｂＢは細胞外ドメインを欠失している構成的に活性化されている受容体をコードする。
【０００９】
多数のヒト腫瘍がプロトオンコジーンｒａｓの遺伝子変化または高いＲａｓ活性の主な原因であるので、レオウイルス治療は、このような症状についての新規のうまくいきそうな治療方法である（非特許文献４）。レオウイルス治療はＲａｓ関連腫瘍細胞に対する選択性が高く、正常な細胞は感染していないままにする。この治療方法には広い用途があり、ヒトおよびヒト以外の動物のいずれにおいても使用することができる。
【００１０】
臨床投与に適しているレオウイルスを生産するためには、培養された細胞の中でレオウイルスを迅速に効率よく生産する方法が必要である。さらに、培養された細胞からウイルスを精製するための伝統的な方法は面倒で時間がかかり、それによってウイルス生産のコストがあまりに高くなってしまう。したがって、改良されたウイルスの精製方法もまた必要である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｓｔｒｏｎｇ Ｊ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，「Ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂａｓｉｓ ｏｆ ｖｉｒａｌ ｏｎｃｏｌｙｓｉｓ：ｕｓｕｒｐａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｒａｓ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ ｂｙ ｒｅｏｖｉｒｕｓ」，ＥＭＢＯ Ｊ．（１９９８）１７：ｐ．３３５１−３３６２
【非特許文献２】Ｓｔｒｏｎｇ Ｊ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，「Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｔｈａｔ ｔｈｅ Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｏｎ Ｈｏｓｔ Ｃｅｌｌｓ Ｃｏｎｆｅｒｓ Ｒｅｏｖｉｒｕｓ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ」，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９３）１９７（１）：ｐ．４０５−４１１
【非特許文献３】Ｓｔｒｏｎｇ Ｊ．Ｅ．，ａｎｄ Ｐ．Ｗ．Ｌｅｅ，「Ｔｈｅ ｖ−ｅｒｂＶ ｏｎｃｏｇｅｎｅ ｃｏｎｆｅｒｓ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｔｏ ｒｅｏｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ」，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９６）７０：ｐ．６１２−６１６
【非特許文献４】Ｃｏｆｆｅｙ，Ｍ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．，「Ｒｅｏｖｉｒｕｓ ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｔｕｍｏｒｓ ｗｉｔｈ ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｒａｓ ｐａｔｈｗａｙ」，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９８）２８２：ｐ．１３３２−１３３４
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、小規模および大規模のいずれのウイルス生産にも適用することができる、細胞培養物からウイルスを抽出し精製する改良された方法に関する。この方法には、細胞培養物に界面活性剤が直接添加される、簡単な抽出工程が含まれる。その後、細胞の破片は、例えば、濾過または遠心分離によって抽出混合物から取り除くことができる。得られたウイルス懸濁液は、クロマトグラフィー方法によってさらに濃縮および／または富化させることができる。本発明にしたがって調製されたウイルスは、ウイルスタンパク質の精製、予防接種、宿主細胞の感染、および臨床投与を含む任意の目的のために使用することができる。
【００１３】
したがって、本発明の１つの態様により、以下の工程を含む、細胞の培養物からウイルスを生産する方法が提供される：
（ａ）ウイルスに感染した細胞の培養物を提供する工程；
（ｂ）培養物に界面活性剤を添加し、細胞溶解物を生じさせるための期間インキュベートすることによって、細胞からウイルスを抽出する工程；
（ｃ）細胞の破片を取り除く工程；ならびに
（ｄ）ウイルスを回収する工程。
【００１４】
任意の方法を、工程（ｃ）において細胞の破片を取り除く（すなわち、細胞溶解物を明澄化させる）ために使用することができる。この方法は、好ましくは、ウイルスと細胞溶解物中の他の構成成分との間のサイズまたは密度の差に基づく簡単な方法（例えば、濾過または遠心分離）である。さらに好ましくは、濾過（具体的には、段階的濾過）が使用される。適切な段階的濾過には、より大きな孔サイズを有するプレフィルターと、その後に、プレフィルターの孔サイズよりも小さい孔サイズを有する少なくとも１つの別のフィルターが含まれる。好ましい実施形態においては、細胞の破片は、以下の工程を含む段階的濾過によって取り除かれる：
（１）５μＭまたは８μＭの孔サイズを有するプレフィルターを通して濾過する工程、および
（２）工程（１）の後に、３μＭおよび０．８μＭの孔サイズを有する連結フィルター（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｆｉｌｔｅｒ）を通して濾過する工程。
【００１５】
別の好ましい実施形態においては、上記工程（２）には、工程（１）の後に、０．８μＭの孔サイズを有するフィルターを通して濾過する工程が含まれる。
【００１６】
細胞溶解物は、状況に応じて、ＢＥＮＺＯＮＡＳＥ（登録商標）エンドヌクレアーゼまたは他のＤＮＡ切断酵素で処理して、長い粘着性のある細胞性ＤＮＡを細かくすることができる。濾過によって細胞の破片を取り除いた後、濾液を必要に応じて濃縮して、ウイルス懸濁液の容量を減少させることができる。ウイルスの濃縮に適している任意の方法（好ましくは、限外濾過または透析（接線流濾過を含む））を使用することができる。例示的な方法としては、平板枠組み（Ｐｌａｔｅ ａｎｄ Ｆｒａｍｅ）システムと中空繊維（Ｈｏｌｌｏｗ Ｆｉｂｅｒ）システムが挙げられる。より好ましくは、中空繊維システムが使用される。好ましい実施形態においては、中空繊維システムでの透析には、３００ｋＤａの分子量カットオフを有する中空繊維カートリッジの使用が含まれる。
【００１７】
本発明の方法は、任意のウイルス（好ましくは、非被包性ウイルスであり、最も好ましくは、レオウイルス）の生産に適用することができる。レオウイルスは、好ましくは、哺乳動物レオウイルスであり、より好ましくは、ヒトレオウイルスであり、なおより好ましくは、血清３型レオウイルスであり、最も好ましくは、Ｄｅａｒｉｎｇ株レオウイルスである。レオウイルスは組み換え体レオウイルスであり得る。組み換え体レオウイルスは、細胞（例えば、哺乳動物細胞または鳥類細胞）の、異なるサブタイプのレオウイルスでの同時感染によって作成することができる。組み換え体レオウイルスは自然界に存在しているものである場合も、また自然界には存在しないものである場合もある。組み換え体レオウイルスは、２種類以上のレオウイルス株（具体的には、Ｄｅａｒｉｎｇ株、Ａｂｎｅｙ株、Ｊｏｎｅｓ株、およびＬａｎｇ株からなる群より選択される２種類以上のレオウイルス株）に由来し得る。組み換え体レオウイルスはまた、血清型の異なるもの（例えば、血清１型レオウイルス、血清２型レオウイルス、および血清３型レオウイルスからなる群より選択される）からのレオウイルスの混ぜ合わせによって生じる場合もある。組み換え体レオウイルスには、自然界に存在している変異体コートタンパク質をコードする配列、または変異したコートタンパク質をコードする配列が含まれる場合がある。
【００１８】
本発明で使用される細胞培養物には、所望されるウイルスの生産に適している任意の細胞が含まれ得る。レオウイルスについては、細胞は、好ましくは、ヒト胚腎臓細胞２９３（ＨＥＫ２９３）細胞またはそれらに由来する細胞（具体的には、懸濁培養物中での増殖に適応させられたＨＥＫ２９３細胞）である。
【００１９】
この方法には、状況に応じて、イオン交換クロマトグラフィーの工程が含まれる。この場合、ウイルスは、適切な条件下でイオン交換樹脂に結合させることによって富化させられる。その後、ウイルスは、適切な溶出溶液を使用してイオン交換体から溶出させられる。イオン交換体と結合／溶出条件の選択は、精製されるウイルスに応じて様々であろう。レオウイルスについては、陰イオン交換体とおよそ７．０〜９．０のｐＨが最も有効である。ｐＨは好ましくは、約７．５から約８．５であり、最も好ましくは、約８．０である。好ましくは、イオン交換はリン酸緩衝液（例えば、５０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２）中で行われる。結合／溶出緩衝液にはマグネシウム塩が含まれないことが好ましい。
【００２０】
ウイルスはまた、サイズ排除クロマトグラフィーを使用することによっても精製することができる。サイズ排除クロマトグラフィーは、好ましくは、リン酸緩衝液（例えば、５０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２）中で行われる。さらに、サイズ排除クロマトグラフィーは、マグネシウム塩が存在しない条件で行うことができる。具体的には、イオン交換クロマトグラフィーとサイズ排除クロマトグラフィーの組み合わせを使用することができる。１つの実施形態においては、レオウイルスは、陰イオン交換体を使用して精製され、その後、サイズ排除クロマトグラフィーによって精製される。
【００２１】
本発明の別の態様により、本明細書中に記載される方法のいずれかにしたがって精製されたウイルスを含む組成物が提供される。組成物は、好ましくは、臨床投与に適しており、ヒトへの臨床投与に特に適している。より好ましくは、組成物には、薬学的に許容される賦形剤および／または担体が含まれる。
【００２２】
本発明の別の態様によって、以下の工程を含む、感染性レオウイルスを生産する方法が提供される：
（ａ）レオウイルスに感染させたＨＥＫ２９３細胞の培養物を提供する工程；
（ｂ）ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００（オクトキシノール−９から１０）を培養物に添加し、約２５℃から約３７℃でインキュベートすることによって細胞からウイルスを抽出する工程；
（ｃ）ＢＥＮＺＯＮＡＳＥ（登録商標）エンドヌクレアーゼで工程（ｂ）による混合物を処理する工程；
（ｄ）濾過によって細胞の破片を取り除く工程；
（ｅ）限外濾過または透析によって濾液を濃縮する工程；
（ｆ）イオン交換クロマトグラフィーとサイズ排除クロマトグラフィーの組み合わせによってレオウイルスを精製する工程；ならびに
（ｇ）レオウイルスを回収する工程。
【００２３】
この方法にしたがって回収されたレオウイルスを含む組成物（具体的には、薬学的に許容される賦形剤および／または担体をさらに含む組成物）もまた提供される。
【００２４】
本発明の１つ以上の実施形態の詳細は、添付の図面と以下の記載に示される。本発明の他の特徴、目的、および利点は、記載事項および図面から、さらには、特許請求の範囲から明らかであろう。
例えば、本願発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
細胞の培養物からのウイルスの生産方法であって、以下：
（ａ）該ウイルスに感染した細胞の培養物を提供する工程；
（ｂ）該培養物に界面活性剤を添加し、そして細胞溶解物を得るための期間インキュベートすることによって、該細胞からウイルスを抽出する工程；
（ｃ）細胞の破片を取り除く工程；および
（ｄ）該ウイルスを回収する工程、
を包含する、方法。
（項目２）
前記細胞の破片が濾過によって取り除かれる、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記細胞の破片が段階的濾過によって取り除かれる、項目１に記載の方法であって、該方法は、以下：
（１）５μＭまたは８μＭの孔サイズを有するプレフィルターを通して濾過する工程、および
（２）工程（１）の後に、３μＭと０．８μＭの孔サイズを有する連結フィルターを通して濾過する工程、
を包含する、方法。
（項目４）
項目１に記載の方法であって、前記細胞の破片は、以下：
（１）５μＭまたは８μＭの孔サイズを有するプレフィルターを通して濾過する工程、および
（２）工程（１）の後に、０．８μＭの孔サイズを有するフィルターを通して濾過する工程、
を含む段階的濾過によって取り除かれる、方法。
（項目５）
ＤＮＡ切断酵素で前記細胞溶解物を処理する工程をさらに包含する、項目１に記載の方法。
（項目６）
濾液を濃縮する工程をさらに包含する、項目２に記載の方法。
（項目７）
前記濾液は透析によって濃縮される、項目６に記載の方法。
（項目８）
前記透析が、３００ｋＤａの分子量カットオフを有する中空繊維カートリッジを用いて行われる、項目７に記載の方法。
（項目９）
前記ウイルスが非被包性ウイルスである、項目１に記載の方法。
（項目１０）
前記ウイルスがレオウイルスである、項目１に記載の方法。
（項目１１）
前記レオウイルスが哺乳動物のレオウイルスである、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記哺乳動物のレオウイルスがヒトレオウイルスである、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記ヒトレオウイルスが血清３型ウイルスである、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記血清３型レオウイルスがＤｅａｒｉｎｇ株である、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記レオウイルスが組み換え体レオウイルスである、項目１０に記載の方法。
（項目１６）
前記細胞がヒト胚腎臓２９３（ＨＥＫ ２９３）細胞である、項目１に記載の方法。
（項目１７）
前記ＨＥＫ ２９３細胞が懸濁液の中で増殖させられる、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
陰イオン交換クロマトグラフィーによってウイルスを精製する工程をさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目１９）
イオン交換クロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーの組み合わせによって前記ウイルスを精製する工程をさらに包含する、項目１に記載の方法。
（項目２０）
前記イオン交換が陰イオン交換体を使用して行われる、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記イオン交換がサイズ排除クロマトグラフィーの前に行われる、項目１９に記載の方法。
（項目２２）
前記イオン交換クロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーが、マグネシウムが存在しない条件で行われる、項目１９に記載の方法。
（項目２３）
前記イオン交換クロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーにおいてリン酸緩衝液が使用される、項目１９に記載の方法。
（項目２４）
前記リン酸緩衝液に、５０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２が含まれる、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
項目１にしたがって回収されたウイルスを含む、組成物。
（項目２６）
臨床投与に適している、項目２５に記載の組成物。
（項目２７）
薬学的に許容される賦形剤および／または担体をさらに含む、項目２６に記載の組成物。
（項目２８）
感染性レオウイルスの生産方法であって、以下：
（ａ）レオウイルスに感染したＨＥＫ２９３細胞の培養物を提供する工程；
（ｂ）オクトキシノール−９から１０を該培養物に添加し、約２５℃から約３７℃でインキュベートすることによって、該細胞からウイルスを抽出する工程；
（ｃ）ＤＮＡ切断酵素で工程（ｂ）による混合物を処理する工程；
（ｄ）濾過によって細胞の破片を取り除く工程；
（ｅ）限外濾過または透析によって濾液を濃縮する工程；
（ｆ）イオン交換クロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーの組み合わせによってレオウイルスを精製する工程；ならびに
（ｇ）該レオウイルスを回収する工程、
を包含する、方法。
（項目２９）
工程（ｆ）は、アニオン交換クロマトグラフィーおよびその後のサイズ排除クロマトグラフィーを含む、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
項目２８に記載の方法にしたがって調製されたレオウイルスを含む、組成物。
（項目３１）
薬学的に許容される賦形剤および／または担体をさらに含む、項目３０に記載の組成物
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は、レオウイルスの限外濾過／透析（ＵＦ／ＤＦ）材料の、１５０ｃｍ／ｈでの分離を示す。材料を、ＨＲ５＿２００ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗカラム上で５０ｍＭのリン酸塩（ｐＨ７．２）、５％のグリセロールに緩衝液交換した。０．３０ＣＶの試料を載せた。０．３７ ＣＶ〜０．６２ ＣＶから溶出された空隙容量を回収した。ｘ軸はＣＶ；ｙ軸は２８０ｎｍでのミリ吸光度単位。
【図２】図２は、Aｋｔａ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ １００上で５０ｃｍ／ｈでの、予備精製した材料のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）での分離を示す。緩衝液Ａ：５０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ５．６、５％のグリセロール。緩衝液Ｂ：Ａ＋１Ｍの塩化ナトリウム。ｘ軸はｍｌ；ｙ軸は２８０ｎｍでのミリ吸光度単位。Ａ２８０ ＣＭの線は、１ｍｌのＨｉＴｒａｐ ＣＭ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムからの溶出プロフィールを示し、Ａ２８０ ＳＰの線は、１ｍｌのＨｉＴｒａｐ ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムからの溶出プロフィールを示す。
【図３】図３は、種々のＨｉＴｒａｐ陰イオン交換カラム上でのＳＥＣで予備精製したレオウイルスの分離を示す。流速；５０ｃｍ／ｈ。緩衝液Ａ：２５ｍＭのＴｒｉｓＣｌ（ｐＨ７．２）、５％のグリセロール。緩衝液Ｂ：Ａ＋１Ｍの塩化ナトリウム。１０ ＣＶ勾配を材料を溶出させるために流した。ｘ軸はｍｌ；ｙ軸は２８０ｎｍでのミリ吸光度単位。Ａ２８０ｎｍによって検出した場合の溶出プロフィールは以下とした：Ａ２８０ ＤＥＡＥ＝ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ；Ａ２８０ Ｑ ＸＬ＝Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＸＬ，ＡＮＸ Ｈｉｇｈ Ｓｕｂ＝ＡＮＸ ｈｉｇｈ ｓｕｂ；Ｑ ＨＰ＝Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ。
【図４】図４は、ＨＲ５＿１００ Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰカラム上で５０ｃｍ／ｈでの、５〜１０％のブレイクスルーによる動的結合能力の決定を示す。１２より大きいＣＶを載せ、その後、ブレイクスルーを観察した。緩衝液Ａ：５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）、５％のグリセロール。緩衝液Ｂ：５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）、５％のグリセロール、２Ｍの塩化ナトリウム。１Ｍの塩化ナトリウムまでの１０ＣＶの直線勾配を使用し、その後、２Ｍの塩化ナトリウムまで、５ ＣＶ工程を続けた。ウイルス画分（ウイルス活性）をＲＴ−ＰＣＲおよびウェスタンブロッティングによって決定した。ｙ軸は２８０ｎｍでのｍＡＵ；ｘ軸はｍｌでの容量。
【図５】図５は、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ上でのレオウイルスの捕捉の簡単なスケールアップのための段階的プロトコールの開発を示す。Ａｅｋｔａ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ １００に繋いだＨＲ５＿１００ Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰカラム上で希塩酸でｐＨ７．２に調整した５ ＣＶのＵＦ／ＤＦレオウイルスの精製。緩衝液Ａ：５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）、５％のグリセロール。緩衝液Ｂ：５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）、５％のグリセロール、２Ｍの塩化ナトリウム。段階的勾配：５ ＣＶについての１２％のＢ（洗浄）、５ ＣＶについての２５％のＢ（溶出）、５ ＣＶについての５０％のＢ（再生）、および２ ＣＶについてのＣＩＰ（１Ｍの水酸化ナトリウム、その後の１００％のＢの５ ＣＶ）。Ｙ軸：ｍＡＵ、ｘ軸：ｍｌでの容量。ウイルスを含む画分をｒｅｏ＋で示す。
【図６】図６は、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ上でのレオウイルスの捕捉の８倍のスケールアップを示す。ＨＲ１０＿１００ Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰカラム上で希塩酸でｐＨ７．２に調整した１０ ＣＶのＵＦ／ＤＦレオウイルスの精製。緩衝液Ａ：５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）、５％のグリセロール。緩衝液Ｂ：５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）、５％のグリセロール、１Ｍの塩化ナトリウム。段階的勾配：５ ＣＶについての１２％のＢ（洗浄）、５ ＣＶについての２５％のＢ（溶出）、５ ＣＶについての５０％のＢ（再生）、および２ ＣＶについてのＣＩＰ（１Ｍの水酸化ナトリウム、その後の１００％のＢの５ ＣＶ）。Ｙ軸：ｍＡＵ、ｘ軸：ｍｌでの容量。ウイルスは、約５ｍｌの容量の、画分Ｂ３／２中に溶出された。
【図７】図７は、ＨＲ１０＿２００ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ ２０ｍｌカラム上でのウイルス画分の精製の第２工程の８倍のスケールアップを示す。０．２５ ＣＶを載せた（図６に示す画分Ｂ３／２）。線流速：１５０ｃｍ／ｈ。緩衝液：ＰＢＳ，５％のグリセロール。
【図８】図８Ａは、以下についての銀染色した４〜１２％のＳＤＳ ＰＡＧＥゲルを示す：レーン１：Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ精製後のウイルス画分、レーン２：ＣｓＣｌ精製した標準物、レーン３：２倍に希釈したＳＥＣ精製した最終物質。図８Ｂは、精製手順の４〜１２％のＳＤＳ ＰＡＧＥのクマシー染色したゲルを示す。レーン１：出発材料、レーン２：Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ材料、レーン３：２倍希釈したＣｓＣｌ材料、レーン４：希釈していないＣｓＣｌ材料、レーン５：ＳＥＣ精製した材料。図８Ｃは、ＴＣＩＤ５０によって決定したレオウイルスの回収率の表である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明は、小規模および大規模のいずれのウイルス生産にも適用することができる、細胞培養物からウイルスを抽出し精製する改良された方法に関する。この方法には、細胞培養物に界面活性剤が直接添加される、簡単な抽出工程が含まれる。その後、細胞の破片は、例えば、濾過または遠心分離によって抽出混合物から取り除くことができる。得られたウイルス懸濁液は、クロマトグラフィー方法によってさらに濃縮および／または富化させることができる。本発明にしたがって調製されたウイルスは、ウイルスタンパク質の精製、予防接種、宿主細胞の感染、および臨床投与を含む任意の目的のために使用することができる。
【００２７】
本発明がさらに詳細に記載される前に、本出願で使用される用語は、特に断りのない限りは、以下のように定義される。
【００２８】
定義
本明細書中で使用される場合は、「接着細胞」は、細胞培養物中において培養容器に接着している細胞を意味する。接着細胞の例としては単層細胞が挙げられ、これは、培養容器の表面上に１層の細胞を形成する細胞である。「懸濁細胞」または「細胞浮遊液」は、細胞培養物中で培養容器には接着しない細胞を意味する。懸濁細胞は、培養培地が培養プロセスの間中攪拌され続ける培養である「回転培養（ｓｐｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅ）」において増殖させることができる。
【００２９】
本明細書中で使用される場合は、「環境温度」は、約１０℃から約３０℃の間の温度を意味する。環境温度は、好ましくは、約１５℃から約３０℃であり、より好ましくは、約２０℃から２５℃であり、そしてもっとも好ましくは、約２５℃である。
【００３０】
本明細書中で使用される場合は、「細胞結合型（ｃｅｌｌ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）」ウイルスは、ウイルスがその中で生産される細胞の一部に付着するかまたは細胞の一部に捕捉されるウイルスを意味する。したがって、ウイルスは、宿主細胞が溶解する前は細胞結合型である。細胞の溶解が始まっても、ウイルスは崩壊した細胞の一部に付着したまま、または崩壊した細胞の一部に捕捉されたままである場合もあり、細胞に結合したままであり得る。しかし、ウイルスが培地に放出されて遊離させられると、これはもはや細胞結合型ではない。「無細胞型（ｃｅｌｌ ｆｒｅｅ）ウイルス」は、細胞結合型ではないウイルスである。
【００３１】
本明細書中で使用される場合は、「細胞培養物」または「細胞の培養物」は、それらの培養条件で見られるような培養された細胞の集団を意味する。具体的には、細胞培養物には、細胞と培養培地が含まれる。ペレット状の細胞は、それらが再び、培養条件下にある培養培地の中に置かれでもしない限りは、細胞培養物とは見なされない。
【００３２】
本明細書中で使用される場合は、「細胞溶解」は、細胞の細胞膜の破裂と、その後の細胞の内容物の全てまたはその一部の放出を意味する。
【００３３】
本明細書中で使用される場合は、物質の「臨床投与」は、生物の健康状態を改善または維持するために、生存している生物の体の任意の部分を物質と接触させることを意味する。
【００３４】
本明細書中で使用される場合は、ウイルスを「回収する」は、先にウイルスに感染させられた細胞培養物から生産されたウイルスを分離する行為を意味する。ウイルスは、通常、ウイルスから細胞の破片を分離し、そしてウイルスを含む部分を集めることによって回収される。状況によっては、ウイルスはさらに、可溶性物質から、例えば、遠心分離によって分離することができる。
【００３５】
本明細書中で使用される場合は、「培養条件」は、細胞の培養に使用される条件を意味し、これには、温度、培養容器のタイプ、湿度、培養容器内で使用されるＣＯ２または任意の他の気体の濃度、培養培地のタイプ、培養される細胞の初期密度、および細胞がウイルスに感染している場合には、初期感染多重度が含まれるが、これらに限定はされない。
【００３６】
本明細書中で使用される場合は、「細胞変性効果」は、感染した宿主細胞に対する損傷である。細胞変性効果は、細胞が外見において膨張して顆粒状になり、細胞塊が破裂することによって示される。細胞変性効果を示す細胞はまた、生存している細胞の計数において染色色素を取り込む。
【００３７】
本明細書中で使用される場合は、「界面活性剤」は、親水性部分と疎水性部分を有する物質である。界面活性剤は、好ましくは、合成の化合物であり、より好ましくは、生分解性の合成の化合物である。本発明に有用な界面活性剤は、破裂した細胞の内容物の放出を促進するように、細胞膜の破裂を増進する。
【００３８】
本明細書中で使用される場合は、細胞は、細胞膜が破裂させられ、細胞内容物の少なくとも一部が細胞から放出されると、「破裂」させられる。細胞は、例えば、凍結解凍、超音波処理、または界面活性剤での処理によって破裂させることができる。
【００３９】
本明細書中で使用される場合は、ウイルスを「抽出する」は、細胞結合型ウイルスを無細胞型ウイルスに変える行為を意味する。
【００４０】
本明細書中で使用される場合は、「ＨＥＫ ２９３細胞」は、２９３（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１５７３）と指定されたヒトの胚腎臓細胞株またはその誘導体を意味する。例えば、２９３／ＳＦ細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１５７３．１）は、血清を含まない培地の中で増殖するように適応させられたＨＥＫ ２９３細胞である。他の培養条件下で増殖するように適応させられたＨＥＫ ２９３細胞、あるいは、外因性ＤＮＡで形質転換されるＨＥＫ ２９３細胞の任意の種または誘導体もまた、この形質転換体が本発明に記載される効率的なレオウイルスの生産をサポートする細胞の能力を損なわない限りは、本発明において意図される。
【００４１】
本明細書中で使用される場合は、細胞培養物への界面活性剤の添加後の「インキュベート」は、一定の期間の間、細胞培養物を界面活性剤と混合させる行為を意味する。
【００４２】
本明細書中で使用される場合は、「感染多重度」、すなわち「ＭＯＩ」は、細胞と接触させるためにウイルスが使用された場合には、細胞の数に対するウイルスの数の比を意味する。
【００４３】
本明細書中で使用される場合は、「非被包性ウイルス」は、非被包性を有していないウイルスである。例えば、非被包性ウイルスは、アデノウイルス科（Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、アデノウイルス）、ピコルナウイルス科（Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、ポリオウイルス）、レオウイルス科（Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、レオウイルス）、パポバウイルス科（Ｐａｐｏｖａｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、パピローマウイルス）、パルボウイルス科（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、キラムラットウイルス）、またはイリドウイルス科（Ｉｒｉｄｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、ｔｉｐｕｌａ ｉｒｉｄｅｓｃｅｎｔウイルス）に属する任意のウイルスであり得る。
【００４４】
本明細書中で使用される場合は、「レオウイルス」は、自然界に存在しているものであるか、修飾されたものであるか、または組み換え体であるかにはかかわらず、レオウイルス属に分類される任意のウイルスを意味する。レオウイルスは、二本鎖のセグメント化されたＲＮＡゲノムを含むウイルスである。ビリオンは６０〜８０ｎｍの直径であり、２つの同心のキャプシドの殻を有する。これらはそれぞれ、２０面体である。ゲノムは、１０〜１２の不連続なセグメントの二本鎖ＲＮＡからなり、ゲノム全体のサイズは１６〜２７ｋｂｐである。個々のＲＮＡｓｅグメントの大きさは様々である。３つの異なるが関連しているレオウイルスのタイプが、多くの種から回収されている。これらの３つのタイプの全てが共通している補体結合抗原を有する。
【００４５】
ヒトレオウイルスは３つの血清型から構成される：１型（Ｌａｎｇ株、すなわち、Ｔ１Ｌ）、２型（Ｊｏｎｅｓ株、Ｔ２Ｊ）、および３型（Ｄｅａｒｉｎｇ株またはＡｂｎｅｙ株、Ｔ３Ｄ）。これらの３つの血清型は、中和アッセイとヘマグルチニン阻害アッセイ（例えば、Ｆｉｅｌｄｓ，Ｂ．Ｎ．ｅｔ ａｌ．，１９９６）に基づいて容易に同定することができる。
【００４６】
レオウイルスは、自然界に存在しているものである場合も、また、修飾されている場合もある。レオウイルスは、それが自然界での供給源から単離でき、そして実験室においてヒトによって意図的に修飾されていない場合には「自然界に存在している」ものである。例えば、レオウイルスは、「現場の供給源（ｆｉｅｌｄ ｓｏｕｒｃｅ）」、すなわち、レオウイルスに感染したヒトに由来し得る。
【００４７】
レオウイルスは、２種類以上の遺伝的に異なるレオウイルスに由来するゲノムセグメントの組み換え／混ぜ合わせによって生じる、組み換え体レオウイルスであり得る。レオウイルスのゲノムセグメントの組み換え／混ぜ合わせは、少なくとも２種類の遺伝的に異なるレオウイルスでの宿主生物の感染後に、自然界で生じる場合がある。組み換え体ビリオンはまた、例えば、遺伝的に異なるレオウイルスでの感染に対して許容状態にある宿主細胞の同時感染によって、細胞培養物中で作成することもできる（Ｎｉｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，１９９５）。
【００４８】
したがって、本発明によって、２種類以上の遺伝的に異なるレオウイルス（ヒトレオウイルス（例えば、１型（例えば、Ｌａｎｇ株）、２型（例えば、Ｊｏｎｅｓ株）、および３型（例えば、Ｄｅａｒｉｎｇ株またはＡｂｎｅｙ株））、ヒト以外の哺乳動物のレオウイルス、または鳥類レオウイルスを含むが、これらに限定はされない）に由来するゲノムセグメントの混ぜ合わせによって得られる組み換え体レオウイルスが意図される。本発明によって、さらに、少なくとも一方のもとのウイルスが遺伝子操作されているか、１つ以上の化学合成されたゲノムセグメントを含むか、化学的もしくは物理的な突然変異誘発物質で処理されたか、またはそれ自体が組み換え事象の結果である、２種類以上の遺伝的に異なるレオウイルスに由来するゲノムセグメントの混ぜ合わせによって生じる組み換え体レオウイルスが意図される。本発明によって、さらに、化学的突然変異誘発物質（硫酸ジメチルおよび臭化エチジウムを含むが、これらに限定はされない）、物理的突然変異誘発物質（紫外線および他の形態の放射線を含むが、これらに限定はされない）の存在下で組み換えを受けた組み換え体レオウイルスが意図される。
【００４９】
本発明によって、さらに、１つ以上のゲノムセグメントに欠失または重複を含む組換え体レオウイルスが意図される。これには、宿主細胞のゲノムとの組み換えの結果としてのさらなる遺伝情報が含まれるか、または、合成の遺伝子が含まれる。
【００５０】
レオウイルスは、変異したコートタンパク質（例えば、σ１）の、ビリオンの外側のキャプシドへの組み込みによって修飾することができる。このタンパク質は、置換、挿入、または欠失によって変異させることができる。置換には、自然界に存在しているアミノ酸に代わる異なるアミノ酸の挿入が含まれる。挿入には、１つ以上の位置でのタンパク質へのさらなるアミノ酸残基の挿入が含まれる。欠失には、タンパク質の中の１つ以上のアミノ酸残基の欠失が含まれる。このような変異は、当該分野で公知の方法によって作成することができる。例えば、コートタンパク質の１つをコードする遺伝子のオリゴヌクレオチド部位特異的突然変異誘発によって、所望される変異体コートタンパク質の作成を生じることができる。レオウイルスに感染した哺乳動物細胞（例えば、ＣＯＳ１細胞）の中でのインビトロでの変異したタンパク質の発現によっては、レオウイルスのビリオン粒子への変異したタンパク質の組み込みが生じるであろう（Ｔｕｒｎｅｒ ａｎｄ Ｄｕｎｃａｎ，１９９２；Ｄｕｎｃａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１；Ｍａｈ ｅｔ ａｌ．，１９９０）。
【００５１】
本明細書中で使用される場合は、「細胞の生存性」または「なおも生存している細胞の割合」は、集団の中の細胞変性効果を示さない細胞の割合（％）である。
【００５２】
本明細書中で使用される場合は、「ウイルス感染」は、細胞へのウイルスの侵入と、その後の細胞内でのウイルスの複製を意味する。
【００５３】
方法
本発明者らは、ＨＥＫ ２９３細胞の中でのレオウイルスの増殖方法を以前に開発した（米国特許出願公開番号２００２００３７５７６）。レオウイルスは、ＨＥＫ ２９３細胞の中で複製し、感染の直後に細胞の中で高力価のウイルスを生じ、これによって、レオウイルスの簡単で効率的な生産方法を提供する。加えて、ＨＥＫ ２９３細胞を、大量に培養することができる懸濁液の中で増殖するように適応させ、そして本発明者らは大量生産方法を開発した。懸濁培養物からレオウイルスを単離するために、本発明者らは、最初に、従来方法にしたがってウイルス粒子を抽出し、精製した。簡単に説明すると、細胞を、凍結解凍によって破裂させ、ＦＲＥＯＮ（登録商標）（１，１，２−トリクロロ−１，１，２−トリフルオロ−エタン）で３回抽出した。その後、ウイルス粒子をＣｓＣｌ勾配と限外濾過によって精製した。しかし、このプロトコールは、大規模なウイルスの生産については面倒であり、時間がかかりすぎた。
【００５４】
したがって、本発明者らは、レオウイルスを抽出するための簡略化した方法を開発した。ＨＥＫ ２９３細胞培養物を界面活性剤とともに短時間インキュベートすることによって、高レベルの感染性レオウイルスが抽出物中に放出されることを発見した。その後、ウイルスを、サイズまたは密度の差に基づく簡単な分離方法（例えば、濾過、透析、またはサイズ排除）を用いて細胞の破片から分離することができ、そして得られたウイルスはレオウイルス治療に使用することができる。本発明にしたがって生産されたレオウイルスは、ヒトへの投与に適しており、そしてこのプロトコールは、界面活性剤の存在下で細胞を破裂させることについてのＦＤＡによる推奨と一致している。
【００５５】
本発明者らは、予備実験において４種類の界面活性剤を試験した：非イオン性界面活性剤オクトキシノール−９から１０（ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００）、オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＮＯＮＩＤＥＴ（登録商標）Ｐ４０またはＮＰ−４０）、およびポリエチレングリコールソルビタンモノラウレート（ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０）、ならびに、イオン性界面活性剤デオキシコール酸ナトリウム。これらの４種類の界面活性剤の全てが細胞を溶解させ、そしてバックグラウンドのレベルを上回って感染性ウイルス粒子を放出させることができたが、ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００が最も有効であった。他の界面活性剤（具体的には、細胞を破裂させるために一般的に使用されているもの）を同様に本発明で使用できることが意図される。これらの他の界面活性剤の例としては、他のＴＲＩＴＯＮ（登録商標）界面活性剤、他のＴＷＥＥＮ（登録商標）界面活性剤（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０）、ドデシル硫酸ナトリウム、ドデシル硫酸リチウム、および塩化ドデシルトリメチルアンモニウムが挙げられる。
【００５６】
これらの結果もまた、界面活性剤による抽出が、ウイルスの抽出のための標準的な手順である凍結解凍よりも効果的であり得ることを示している。加えて、レオウイルスが高度に細胞に結合しているＶｅｒｏ細胞から鳥類レオウイルスを抽出するためには、蒸留された脱イオン水が、凍結解凍、ＦＲＥＯＮ（登録商標）（１，１，２−トリクロロ−１，１，２−トリフルオロ−エタン）での抽出、またはトリプシン処理よりも効果的であったことが報告されている（Ｄｒａｓｔｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，１９９２）。本発明によって、より迅速で便利であり、なおも効果的なアプローチが提供される。なぜなら、これには、蒸留水を用いる方法に必要な細胞のペレット化とその後の再懸濁の必要はないからである。
【００５７】
高濃度の塩（例えば、塩化グアニジン）を、界面活性剤の代わりに本発明で使用できることが意図される。しかし、高濃度の塩よりも界面活性剤を使用することが好ましい。
【００５８】
したがって、本発明により、細胞培養物からウイルスを抽出する、迅速で簡単な方法が提供される。界面活性剤は、懸濁培養物に、または接着細胞の培地に対して直接添加することができる。いずれの場合にも、培地を迅速に取り除く必要はない。さらに、細胞を破裂させるか、またはウイルスを抽出する以外の手段（例えば、凍結解凍、または超音波処理）は必要ない。
【００５９】
本発明の重要な特徴は、抽出手順を、環境温度で、または環境温度よりも高い温度で行うことができることである。従来、ウイルスの抽出と精製は、タンパク質の構造と機能を保存するために低温（通常は、０〜４℃）で行われる。同じ理由のために、プロテアーゼ阻害因子もまた、通常は、抽出溶液に含められる。したがって、本発明のプロトコールを、プロテアーゼ阻害因子を全く使用することなく高温で行うことができることは驚くべきである。実際、３７℃のような高温で、２５℃の温度とほぼ同量の感染性ウイルスが得られた。結果として、ウイルスの抽出は、温度を変化させる必要なく、細胞培養物に直接界面活性剤を添加し、そしてウイルスを放出させるために培養物を攪拌し続けることによって、行うことができる。あるいは、本発明にしたがうウイルスの抽出のためには温度を一定に保つ必要はないので、この手順は、環境温度が場所によって変わっても、また、同じ場所で時間と共に変化しても、環境温度で行うことができる。
【００６０】
抽出の後、ウイルスは、例えば、ウイルスと抽出物中の他の構成成分との間でのサイズまたは密度の差に基づいて精製することができる。具体的には、濾過または遠心分離を、ウイルスから細胞の破片を取り除くために使用することができる。濾過条件を最適化するために、本発明者らは、いくつかの様々な抽出用界面活性剤の存在下での種々のフィルターの効果を試験した（実施例１）。段階的濾過のプロトコールが最も有効であることが立証された。したがって、比較的大きな孔サイズ（例えば、５μＭまたは８μＭ）を有するプレフィルターが、抽出混合物から大きな断片を取り除くために最初に使用され、その後、小さい孔サイズのフィルター（例えば、３μＭのフィルターおよび０．８μＭのフィルターを含む連結フィルターユニット）が使用される。プレフィルターがない場合には、抽出混合物は、フィルターをすぐに詰まらせ、これによって材料と時間のいずれもが無駄になる。別の実施形態においては、５μＭまたは８μＭのプレフィルターの工程の後に、０．８μＭの１つの孔サイズを有する１つのフィルターを使用することができる。
【００６１】
濾過後に回収された容量に基づいて、実施例１に示されるように、ウイルスの抽出のために１％のＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００を使用することが好ましい。加えて、酢酸セルロース膜フィルターは硝子繊維膜フィルターよりも優れている。なぜなら、酢酸セルロース膜フィルターは、多量の抽出混合物を濾過することができ、大量生産により適しているからである。
【００６２】
ウイルスの生産の目的に応じて、ウイルスを含む濾液を濃縮することが所望される場合がある。限外濾過／透析を使用する濃縮工程が、実施例２および４に示される。実施例２には、２種類の限外濾過／透析システム（Ｐａｌｌ Ｆｉｌｔｒｏｎの平板枠組みカセット（Ｐｌａｔｅ ａｎｄ Ｆｒａｍｅ Ｃａｓｓｅｔｔｅ）とＡ／Ｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙの中空繊維カートリッジ（Ｈｏｌｌｏｗ Ｆｉｂｅｒ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ））が試験された。結果は、これらの２種類のシステムは、それらの操作速度または損失容量の程度においては同等であるが、中空繊維カートリッジは操作がより容易であったことを示している。実施例４では、結果は、３００ｋＤａの分子カットオフを有する中空繊維カートリッジによって、その後の精製のために良好な材料が提供されることを示している。
【００６３】
ウイルスは、その表面電荷に基づいてさらに精製することができる。それぞれのウイルスは様々な表面タンパク質を有する（これによって、任意の所定のｐＨにそれらの表面電荷が決定される）ので、精製に適している条件を個々のウイルスについて決定しなればならない。実施例３には、レオウイルスについての最適なイオン交換条件の決定が説明される。したがって、様々な樹脂を含むイオン交換カラムが、抽出されたレオウイルス調製物を精製するために種々のｐＨで使用され、上記のように濾過され、そして濃縮された。結果は、ｐＨ ７．０〜８．５のＡＮＸ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）を含む弱い陰イオンカラムが最も有効であることを示している。ｐＨは、約７．５または８．０であることが好ましく、最も好ましくは、約８．０である。
【００６４】
ウイルスはまた、大きさの差に基づいて、例えば、サイズ排除クロマトグラフィーで精製することもできる。レオウイルスについては、イオン交換クロマトグラフィーとサイズ排除クロマトグラフィーの組み合わせが特に有効である。好ましくは、陰イオン交換カラムが、サイズ排除クロマトグラフィーの前に使用される。結合／溶出緩衝液中のマグネシウム塩を回避することもまた好ましい。Ｔｒｉｓをベースとする緩衝液ではなく、リン酸緩衝液を使用することにより、結合および選択性が改善する。他のクロマトグラフィー方法（例えば、親和性または疎水性相互作用に基づくクロマトグラフィー）もまた、適切である場合には使用することができる。したがって、カラムクロマトグラフィーを、良好な収量、純度、および拡張性を達成するために、ＣｓＣｌ密度勾配超遠心分離に代わる有効なものとして採用することができる。
【００６５】
本発明の方法は、ＨＥＫ ２９３細胞以外の細胞（マウスＬ９２９細胞、Ｖｅｒｏ細胞、およびチャイニーズハムスター卵巣細胞を含むが、これらに限定はされない）を使用するレオウイルスの生産に適用することができる。本発明の方法が、同様に他のウイルス（特に、他の非被包性ウイルス）にも適用されることが意図される。他のウイルスの精製に適している条件は、当業者であれば本明細書の開示に基づいて決定することができる。本発明の方法を使用して調製することができるウイルスとしては、以下のファミリーのウイルスが挙げられるが、これらに限定はされない：ミオウイルス科（ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）、シフォビラーダ科（ｓｉｐｈｏｖｉｒｉｄａｅ）、ポドウイルス科（ｐｏｄｐｖｉｒｉｄａｅ）、テクティウイルス科（ｔｅｃｉｖｉｒｉｄａｅ）、コルチコウイルス科（ｃｏｒｔｉｃｏｖｉｒｉｄａｅ）、プラズマウイルス科（ｐｌａｓｍａｖｉｒｉｄａｅ）、リポスリクスウイルス科（ｌｉｐｏｔｈｒｉｘｖｉｒｉｄａｅ）、フセロウイルス科（ｆｕｓｅｌｌｏｖｉｒｉｄａｅ）、ポックスウイルス科（ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ）、イリドウイルス科（ｉｒｉｄｏｖｉｒｉｄａｅ）、フィコドナウイルス科（ｐｈｙｃｏｄｎａｖｉｒｉｄａｅ）、バキュロウイルス科（ｂａｃｕｌｏｖｉｒｉｄａｅ）、ヘルペスウイルス科（ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ）、アデノウイルス科（ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ）、パポバウイルス科（ｐａｐｏｖａｖｉｒｉｄａｅ）、ポリドナウイルス科（ｐｏｌｙｄｎａｖｉｒｉｄａｅ）、イノウイルス科（ｉｎｏｖｉｒｉｄａｅ）、ミクロウイルス科（ｍｉｃｒｏｖｉｒｉｄａｅ）、ジェミニウイルス科（ｇｅｍｉｎｉｖｉｒｉｄａｅ）、サーコウイルス科（ｃｉｒｃｏｖｉｒｉｄａｅ）、パルボウイルス科（ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ）、ヘパドナウイルス科（ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ）、レトロウイルス科（ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）、シクトウイルス科（ｃｙｃｔｏｖｉｒｉｄａｅ）、レオウイルス科（ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ）、ビルナウイルス科（ｂｉｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）、パラミクソウイルス科（ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）、ラブドウイルス科（ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ）、フィロウイルス科（ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ）、オルトミクソウイルス科（ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）、ブンヤウイルス科（ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ）、アレナウイルス科（ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ）、レビウイルス科（ｌｅｖｉｖｉｒｉｄａｅ）、ピコルナウイルス科（ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）、セキウイルス科（ｓｅｑｕｉｖｉｒｉｄａｅ）、コモウイルス科（ｃｏｍｏｖｉｒｉｄａｅ）、ポティウイルス科（ｐｏｔｙｖｉｒｉｄａｅ）、カルシウイルス科（ｃａｌｃｉｖｉｒｉｄａｅ）、アストロウイルス科（ａｓｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）、ノダウイルス科（ｎｏｄａｖｉｒｉｄａｅ）、テトラウイルス科（ｔｅｔｒａｖｉｒｉｄａｅ）、トンブスウイルス科（ｔｏｍｂｕｓｖｉｒｉｄａｅ）、コロナウイルス科（ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ）、グラビウイルス科（ｇｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）、トガウイルス科（ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ）、およびバルナウイルス科（ｂａｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）。
【００６６】
組成物
本発明の方法にしたがって調製されたウイルスを含む組成物もまた提供される。これらの組成物は、ウイルスタンパク質の単離および特性決定、ワクチンの生産、または、組成物に感染性ウイルスが含まれる場合には、ウイルスのストックとして、あるいは臨床投与において使用することができる。
【００６７】
臨床投与の目的のためには、組成物は、通常、賦形剤と混合されるか、賦形剤で希釈されるか、または担体（これは、薬学的組成物としての、カプセル、小袋、紙容器または他の容器（ＷＯ９９／０８６９２Ａ１）の形態であり得る）の中に封入される。薬学的に許容される賦形剤が希釈剤としての役割を担う場合は、これは固体の物質であっても、半固体の物質であっても、または液体の物質であってもよく、これは、有効成分についての媒介物（ｖｅｈｉｃｌｅ）、担体、または媒体として作用する。したがって、組成物は、錠剤、丸剤、散剤、トローチ剤、小袋に入った薬、カシェ剤、エリキシル剤、懸濁剤、エマルジョン、液剤、シロップ剤、エアゾール（固体として、または液体の媒体中のもの）、例えば１０重量％までの活性のある化合物を含む軟膏、軟ゼラチンおよび硬質ゼラチンカプセル、坐剤、滅菌の注射可能な液剤、および滅菌のパッケージされた散剤の形態であり得る。
【００６８】
適切な賦形剤のいくつかの例としては、乳糖、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギン酸塩、トラガカント、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、滅菌水、滅菌生理食塩水、シロップ、およびメチルセルロースが挙げられる。処方物にはさらに、潤滑剤（例えば、タルク、ステアリン酸マグネシウム、およびミネラルオイル）；湿潤剤：乳化剤および懸濁剤；保存剤（例えば、安息香酸メチルおよびプロピルヒドロキシ安息香酸）；甘味剤；ならびに香味剤を含めることができる。本発明の組成物は、当該分野で公知の手順を使用することによる患者への投与後に、有効成分の迅速な放出、徐放、またはゆっくりとした放出を提供するように処方することができる。
【００６９】
レオウイルスが投与される経路、ならびに、処方物、担体、または媒介物は、標的細胞の位置ならびにタイプに応じて様々であろう。多種多様の投与経路を使用することができる。例えば、接触可能な固形の新生物については、レオウイルスを新生物への直接の注射によって投与することができる。造血系新生物については、例えば、レオウイルスを静脈内または脈管内に投与することができる。体内の容易には接触できない新生物（例えば、転移）については、レオウイルスは、哺乳動物の体全体に全身的に輸送することができ、それによって新生物に達することができる様式で（例えば、静脈内または筋肉内に）投与される。あるいは、レオウイルスは、１つの固体の新生物に直接投与することができ、これはその後、転移に、体全体を通じて全身的に運ばれる。レオウイルスはまた、皮下、腹腔内、髄腔内（例えば、脳腫瘍について）、局所（例えば、黒色腫について）、経口（例えば、口腔腫瘍または食道腫瘍について）、直腸（例えば、結腸直腸腫瘍について）、膣（例えば、子宮頸腫瘍または膣腫瘍について）、鼻または吸入噴霧によって（例えば、肺腫瘍について）投与することができる。好ましくは、レオウイルスは注射によって投与される。
【００７０】
本発明の薬学的組成物を経口投与のために、または注射による投与のために取り込ませることができる液体形態としては、水性の溶液、適切に香味付けしたシロップ、水性または油性懸濁液、および食用油（例えば、トウモロコシ油、菜種油、ゴマ油、ココナッツ油、またはピーナッツ油）で香味付けしたエマルジョン、さらには、エリキシル剤、ならびに同様の薬学的媒介物が挙げられる。
【００７１】
錠剤のような固体の組成物を調製するためには、主たる有効成分／レオウイルスは、本発明の化合物の均質な混合物を含む固体の予備処方組成物を形成するように、薬学的賦形剤と混合される。これらの予備処方組成物について均質であると言う場合には、これは、有効成分が組成物全体に均一に分散させられていることを意味する。その結果、組成物は、錠剤、丸剤、およびカプセル剤のような、等しい有効単位投与量形態に容易に分けることができる。
【００７２】
本発明の錠剤または丸剤はコーティングすることができ、また別の方法で調合して、長時間にわたる作用の利点を提供する投与量形態を提供することができる。例えば、錠剤または丸剤には、内部投与量成分と外部投与量成分が含まれ得、後者は、前者のまわりの非被包性の形態である。２つの成分は、胃での消化に抵抗するように作用する腸溶性の層によって分離することができ、これによって、内部成分を完全な状態のまま十二指腸にまで通過させるか、または放出を遅らせることができる。種々の材料を、このような腸溶性の層またはコーティングに使用することができる。このような物質としては、多数のポリマー酸、ならびに、シェラック、セチルアルコール、および酢酸セルロースのような物質とのポリマー酸の混合物が挙げられる。
【００７３】
吸入または吹送のための組成物としては、薬学的に許容される水性もしくは有機溶媒、またはその混合物中の溶液および懸濁液、ならびに散剤が挙げられる。液体または固体組成物には、本明細書中に記載される適切な薬学的に許容される賦形剤を含めることができる。好ましくは、組成物は、局所効果または全身的効果のために、経口または鼻呼吸経路によって投与される。好ましい薬学的に許容される溶媒中の組成物は、不活性ガスの使用によってネブライザーで投与することができる。ネブライザーで投与される溶液は、噴霧デバイスから直接吸入することも、また、噴霧デバイスを、フェイスマスクテント（ｆａｃｅ ｍａｓｋ ｔｅｎｔ）に、もしくは間欠的な陽圧呼吸器に取り付けることもできる。溶液、懸濁液、または粉末組成物は、適切な様式で処方物を送達するデバイスによって、好ましくは、経口または鼻腔に投与することができる。
【００７４】
本発明の方法に使用される別の好ましい処方物には、経皮送達デバイス（「パッチ」）が使用される。このような経皮パッチは、管理された量の本発明のレオウイルスの連続的または断続的な注入を提供するために使用することができる。医薬品の送達のための経皮パッチの構成および使用は、当該分野で周知である。例えば、米国特許第５，０２３，２５２号（引用により本明細書中に組み入れられる）を参照のこと。このようなパッチは、医薬品の連続的送達、パルス送達、または求めに応じた送達のために構築することができる。
【００７５】
本発明で使用される他の適切な処方物は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓに見ることができる。
【００７６】
以下の実施例は本発明を説明するために提供され、そして決して本発明の範囲の限定とは解釈されない。
【実施例】
【００７７】
以下の実施例では、以下の略語は以下の意味を有する。定義しない略語は、それらの一般的に受け入れられている意味を有する。
【００７８】
ＣＩＰ＝定置洗浄
ＣＶ＝カラム容量
ＣＩ＝信頼区間
℃＝セ氏温度
ＤＦ＝透析
ＤＴＴ＝ジチオスレイトール（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｉｅｔｏｌ）
ＦＢＳ＝ウシ胎児血清
ｇ／Ｌ＝１リットル当たりのグラム数
ｈｒ＝時間
β−ＭＥ＝β−メルカプトエタノール
μｇ＝マイクログラム
μｌ＝マイクロリットル
μＭ＝マイクロモル
ｍＡＵ＝ミリ吸光度単位
ｍｇ＝ミリグラム
ｍｌ＝ミリリットル
ｍＭ＝ミリモル
Ｍ＝モル
ＭＯＩまたはｍ．ｏ．ｉ．＝感染多重度
ＮＰ−４０＝ＮＯＮＩＤＥＴ（登録商標）Ｐ−４０（オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）
ＰＢＳ＝リン酸緩衝化生理食塩水
ＰＦＵ＝プラーク形成単位
ｒｐｍ＝１分あたりの回転数
ＳＥＣ＝サイズ排除クロマトグラフィー
ＳＤＳ＝ドデシル硫酸ナトリウム
ＴＣＩＤ５０＝組織培養物感染量５０
ＵＦ＝限外濾過
一般的な材料および方法（特に明記しない限り）
細胞およびウイルス
ヒト胚腎臓２９３（ＨＥＫ ２９３）細胞およびマウス線維芽細胞Ｌ−９２９細胞は、製造業者ＢｉｏＲｅｌｉａｎｃｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄ）によって提供された。ＨＥＫ ２９３細胞は、１０％の熱で不活化させたウマ血清と９０％の以下の混合物を含む培養培地の中で増殖させた：２ｍＭのＬ−グルタミンを含むＥａｇｌｅ最小必須培地と、１．５ｇ／Ｌの重炭酸ナトリウム、０．１ｍＭの必須ではないアミノ酸、および１．０ｍＭのピルビン酸ナトリウムを含むように調整したＥａｒｌｅ平衡化塩溶液。マウスＬ−９２９細胞は、１０％のＦＢＳと、９０％の以下の混合物を含む培養培地の中で増殖させた：２ｍＭのＬ−グルタミンを含むＥａｇｌｅ最小必須培地と、１．５ｇ／Ｌの重炭酸ナトリウム、０．１ｍＭの必須ではないアミノ酸、および１．０ｍＭのピルビン酸ナトリウムを含むように調整したＥａｒｌｅ平衡化塩溶液。
【００７９】
２９３／ＳＦ細胞を、４ｍＭのＬ−グルタミンを補充した血清を含まない２９３培地（２９３ Ｓｅｒｕｍ Ｆｒｅｅ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．））の中で、３６℃±２℃、６％±２％のＣＯ２および８０％±５％の相対湿度で、３５〜４０ｒｐｍの推進速度のスピナーフラスコの中で増殖させた。
【００８０】
これらの実験に使用した血清３型レオウイルスのＤｅａｒｉｎｇ株は、β−メルカプトエタノール（β−ＭＥ）を抽出緩衝液から省略したことを除いて、Ｓｍｉｔｈ（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，１９６９）にしたがって精製したＬ−９２９細胞の懸濁培養物中で、最初に増殖させた。精製したレオウイルスについての粒子／ＰＦＵ比は、通常は、１００／１であった。ウイルス力価をＬ−９２９細胞上でのプラークの滴定によって決定し、Ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍｌとして表した。その後、ウイルスを、２９３／ＳＦ細胞中で大体量に生産させた。
【００８１】
懸濁細胞の感染
２９３／ＳＦ細胞を１０６／ｍｌまで増殖させ、そしてレオウイルスに感染させた。培養物を、培地の色が赤色からオレンジ色に変わるまで、または、細胞の生存性が生存している細胞数によって証明される所望されるレベルに下がるまで、増殖させた。生存している細胞のカウントは、細胞変性効果（これは、細胞が外見において膨張して顆粒状になり、細胞塊が破裂することによって示される）を示さない細胞について顕微鏡下で行うことができる。生存している細胞のカウントはまた、当該分野で一般的に使用されているような、生存能力についての染色によって行うこともできる。
【００８２】
所望される細胞の生存性レベルに達した時点で、細胞を遠心分離によってペレット状にし、１０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．４）、２５０ｍＭのＮａＣｌ、および０．１％のＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００の中に再度懸濁させた。その後、細胞を、凍結解凍によって溶解させ、定期的にボルテックスして細胞を混合しながら氷上で２０〜４０分間維持し、細胞を溶解させた。懸濁液を、予め冷却しておいた等量のＦＲＥＯＮ（登録商標）（１，１，２−トリクロロ−１，１，２−トリフルオロ−エタン）で、１０分間ボルテックスすることによって抽出し、その後、４℃で２５００ｒｐｍで１０分間遠心分離して種々の相を分離させた。水相（上部）を取り出し、上記に記載したように２回再度抽出し、そしてウイルスを、４℃で１時間の２５，０００ｒｐｍでの超遠心分離によってペレット状にした。
【００８３】
ウイルスの抽出および精製のための従来法
ペレットをＰＢＳに再度懸濁させ、ウイルスを塩化セシウムの段階的勾配によって精製した。勾配には、１０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．４）の中に調製した２層のＣｓＣｌ溶液（それぞれ、１．２０ｇ／ｍｌおよび１．４ｇ／ｍｌ）を含めた。ウイルス懸濁液を勾配の上にロードし、そしてＳＷ ２８．１ローターの中で、４℃で２時間、２６，０００ｒｐｍで遠心分離した。ウイルスのバンド（２つのバンドのうちの下の方、なぜなら、上部のバンドには空のキャプシドが含まれているので）を回収し、滅菌したＰＢＳに対して透析した。
【００８４】
ＢＥＮＺＯＮＡＳＥ（登録商標）エンドヌクレアーゼ処理
細胞を界面活性剤で溶解させた後、５０ｍＭのＭｇＣｌ２の溶液を、１ｍＭのＭｇＣｌ２の最終濃度となるように粗溶解物に添加した。その後、ＢＥＮＺＯＮＡＳＥ（登録商標）エンドヌクレアーゼ（２５０，０００単位／ｍｌ、ＥＭ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓカタログ番号１０１６９７９Ｍ）を、およそ１０単位／ｍｌとなるように添加した。溶解物を３６℃で１時間、インキュベーターの中で攪拌した。
【００８５】
（実施例１）
明澄化：細胞の破片の除去
本実施例の目的は、細胞を溶解させるために界面活性剤を使用するプロトコールと適合し、さらに将来のスケールアップおよび製造がしやすい、適切な明澄化手順を開発することであった。本実施例においては、溶解物を、３μｍ／０．８μｍのカプセルフィルターを通すか、またはプレフィルター（５μｍもしくは８μｍ）と、その後の３μｍ／０．８μｍのカプセルフィルターの組み合わせを通過させるかのいずれかによって濾過した。本実験に使用したフィルターは全て、０．０１５ｆｔ２の表面積を有していた。０．０１５ｆｔ２膜を通して濾過した容量に基づいて、膜の能力を、大規模な濾過について決定した。また、濾過効率を、２種類の異なる膜材質（３μｍ／０．８μｍのカプセルフィルターについて酢酸セルロース膜と硝子繊維膜）を比較した。
【００８６】
３種類の界面活性剤を試験した。レオウイルスを有する細胞を、試験する以下の３種類の溶解剤についてラベルした３つの滅菌した１Ｌのボトルに等量に分けた：１％のＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００、０．３％のＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００、および０．１％のＮａ−ＤＯＣ。９２ｍＬと２８ｍＬの容量の１０％のＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００をボトル１および２に添加して、これらのボトルの中の作業濃度を、それぞれ、１％および０．３％のＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００とした。９．２ｍＬの容量の１０％のＮａ−ＤＯＣを第３のボトルに添加して、作業濃度を０．１％とした。これらのボトルを全て攪拌プレートの上に置き、室温で３０分間、１６０±２０ｒｐｍで攪拌した。溶解後の試料を、力価の分析のために個々の溶解条件について採取した。
【００８７】
約２０ｍＬの５０ｍＭのＭｇＣｌ２を、個々のボトルの中の粗溶解物に添加して、作業濃度をおよそ１ｍＭのＭｇＣｌ２とした。その後、これに４０μＬのＢＥＮＺＯＮＡＳＥ（登録商標）エンドヌクレアーゼ（２５０，０００単位／ｍＬ）を添加して、作業濃度をおよそ１０単位／ｍＬとした。粗溶解物を、３６℃のインキュベーターの中で１時間、５の設定で攪拌した。これらの工程は、宿主細胞のＤＮＡを取り除くため、および溶解物の粘性を低下させ、これによってさらなる処理を容易にするために含めた。
【００８８】
Ｗａｔｓｏｎ−Ｍａｒｌｏｗポンプ（５０５Ｕ）を、ポンプ速度に対して流速を合致させるために調整した。製造供給元による示唆にしたがって、５ｒｐｍのポンプ速度（４０ｍＬ／分の流速）を、明澄化実験全体を通じて使用した。
【００８９】
個々の処理条件による溶解物を、以下のフィルターの１つに通過させた：
１）３μｍ／０．８μｍのカプセルフィルター；
２）連結させたプレフィルター５μｍのサイズ → ３μｍ／０．８μｍのカプセルフィルター；および
３）連結させた孔サイズ８μｍのプレフィルター、３μｍ／０．８μｍのカプセルフィルター。
【００９０】
３μｍ／０．８μｍのカプセルフィルターは二重層構造の不均質な膜構成を有しており、これによって、高いダート積載能力と高い処理能力が得られる。第１のフィルターは、第２のフィルター（０．８μｍ）よりも大きな孔サイズ（３μｍ）を有するフィルターである。プレフィルターは、多層の、徐々に細かい襞になるように折り畳まれた不織ポリプロピレンデプスフィルター材料が組み合わせられている。本実験で使用したフィルターは全て、０．０１５ｆｔ２の表面積を有していた。２種類の膜材質、すなわち、酢酸セルロースと硝子繊維を、３μｍ／０．８μｍのカプセルフィルターについて試験した。
【００９１】
溶解剤とフィルター条件の最良の組み合わせを、滴定値とフィルターを通過した容量に基づいて決定した。膜を通過する圧力の低下を、膜の詰まりが生じた時点を決定するためにモニターした。膜付着物の兆候は２５ｐｓｉの圧力低下であり、これを超えるとフィルターは破れる可能性がある。３μｍ／０．８μｍのカプセルフィルターを単独で使用した場合には、膜が詰まるまでに、わずか３５ｍＬしかこれらのカプセルフィルターを通過できなかった。３／０．８μｍのサイズの膜は５分以内に詰まり、これは、プレフィルターの使用が細胞の破片による膜の凝固をなくすためには不可欠であることを示唆している。３／０．８μｍのカプセルフィルターの前に５μｍのプレフィルターを使用することによって、得られる濾過量は大幅に大きくなったが、８μｍのプレフィルターを通過し、その後に３μｍ／０．８μｍのカプセルフィルターを通過した濾過によっては、膜を通過した容量に関して最も高い膜能力が得られた（０．０１５ｆｔ２のフィルターの表面積あたり２００ｍＬの平均が回収された）。１％のＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００が、他の２種類の溶解条件と比較すると最良の結果を生じた。
【００９２】
結果はまた、これらの膜を通して濾過した容量に基づくと、酢酸セルロース膜材料が硝子繊維膜よりもうまく作用したことを示している。感染力についての有意なロスは、バルクの回収物（溶解および濾過前の細胞培養物）の感染力と比較しても、濾過のいずれの段階においても観察されなかった。これらの実験の結果に基づくと、２０Ｌのバルクの回収物には、濾過のために１．５ｆｔ２の膜表面積が必要である。
【００９３】
（実施例２）
濃度
明澄化した溶解物を濃縮し透析するための適切なシステムを選択するために、Ｐａｌｌ
Ｆｉｌｔｒｏｎの平板枠組み（Ｐｌａｔｅ ａｎｄ Ｆｒａｍｅ）カセット（ｗｗｗ．ｐａｌｌ．ｃｏｍ）とＡ／Ｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙの中空繊維（Ｈｏｌｌｏｗ Ｆｉｂｅｒカートリッジ（ｗｗｗ．ａｇｔｅｃｈ．ｃｏｍ）を比較した。同じポリエーテルスルホン膜材料を両方のシステムに使用した。選択の基準は、使い勝手のよさ、達成される濃縮の程度、および生成物のウイルス力価とした。
【００９４】
本実験で使用した平板枠組みカセットは、研究室用のベンチトップ型のユニットであるＰａｌｌのＭＩＮＩＭシステムと、２つの吊り下げられたスクリーンチャンネル３００ｋＤ限外濾過膜（Ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｍｅｍｂｒａｎｅ（それぞれ、０．２ｆｔ２））を含むＬＶ Ｃｅｎｔｒａｍａｔｅであった。明澄化した溶解物を濃縮する前に、装置を２ＬのＲｅｖｅｒｓｅ Ｏｓｍｏｓｉｓ（ＲＯ）水（ＵＳＰグレード）でリンスして、保管用ゲルを洗い流した。カセットを２Ｌの温めた０．１ＮのＮａＯＨで消毒した。その後、システムを排水し、２ＬのＲＯ水でリンスし、そしてウイルス用の増殖培地でコンディショニングした。システム全体を排水し、システムと配管のホールドアップ容量を６ｍＬと決定した。
【００９５】
本実験で試験した中空繊維カートリッジは、Ａ／Ｇ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙのＱＵＩＸＳＴＡＮＤ（登録商標）Ｂｅｎｃｈｔｏｐ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｓｉｚｅ ４Ｍカラム限外濾過カートリッジ（Ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ）（６５０ｃｍ２の表面積）である。平板枠組みカセットと同様に、装置を最初に２ＬのＲｅｖｅｒｓｅ
Ｏｓｍｏｓｉｓ（ＲＯ）水（ＵＳＰグレード）を勢いよく流して、保管用ゲルを洗い流した。カセットを２Ｌの温めた０．１ＮのＮａＯＨで消毒した。その後、システムを排水し、２ＬのＲＯ水でリンスし、そしてウイルスの増殖培地を勢いよく流すことによってコンディショニングした。６００ｍＬ／分の一定の流速を、実験を通じて使用した。
【００９６】
両方のシステムに、明澄化した溶解物を、材料が約２５０ｍＬに濃縮される（１０倍濃縮）まで再循環させ、試料を滴定分析した（１回目の濃縮後（Ｐｏｓｔ Ｉ−Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ））。濃縮物（保持物）を１Ｌ（５倍の透析容量）の透析緩衝液（Ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ）（２０ｍＭのＴｒｉｓ＋０．２ＭのＮａＣｌ＋１ｍＭのＭｇＣｌ２、ｐＨ８．０±０．１）に対して透析し、別の試料を滴定分析のために採取した（透析後（Ｐｏｓｔ−Ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ））。保持物をさらに約１２０ｍＬにまで濃縮した。最後の濃縮の後、生成物をシステムから排出させて、１つの滅菌容器に回収した（最後の濃縮後（Ｐｏｓｔ−ｆｉｎａｌ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ））。その後、システムを４０ｍＬの透析緩衝液でリンスして、最大量の生成物の回収を確実にした。
【００９７】
中空繊維システムと平板枠組みシステムの両方を用いた濃縮プロセスの間にモニターした処理パラメーターを表１に示す。
【００９８】
【表１】
膜間圧（ＴＭＰ）は、中空繊維での処理の間は８ｐｓｉ未満に留まったが、平板枠組みで処理した場合には、ＴＭＰは３０ｐｓｉには上昇した。中空繊維システムにより大きな膜表面積を使用すると、おそらく、カートリッジの詰まりはあまり生じなかった。
【００９９】
約２０倍の濃縮が、４時間、平板枠組みカセットを用いることによって達成されたが、中空繊維カートリッジを使用した場合には、３時間で１４倍の濃縮が得られ、本発明者らは、さらに３０分間で２０倍の濃縮を得た。両方のシステムの溶解後の値と比較すると、生成物の４５〜５０％のロスがあった。中空繊維カートリッジの設定は平板枠組みカセットよりも容易であった。したがって、中空繊維カートリッジが、取り扱いやすさに基づくと、限外濾過および透析工程により適しているシステムである。
【０１００】
（実施例３）
イオン交換
ウイルスは、それらの様々な表面分子が原因で異なる表面電荷を有する。したがって、イオン交換クロマトグラフィーを使用してウイルスを精製することが可能であり、条件はウイルスの性質に応じて変化するであろう。したがって、本発明者らは、レオウイルスの精製について、種々のｐＨのイオン交換クロマトグラフィー条件を試験した。レオウイルスを、上記のように生産させ、抽出し、濾過し、そして様々なｐＨでのイオン交換クロマトグラフィーを行った。それぞれの工程の後で力価を決定し、これを以下の表２に示す。
【０１０１】
【表２】
したがって、ｐＨ７．０〜９．０によって、他のｐＨよりも多量のレオウイルスが得られた。この工程で使用するｐＨは、好ましくは、７．５〜８．５であり、ｐＨ８．０が特に好ましい。陽イオン交換体と陰イオン交換体のいずれもがうまくいったが、陰イオン交換体が一般的にはより有効であった。
【０１０２】
（実施例４）
拡張性のある精製プロトコール
レオウイルスは、ｒａｓ経路が活性化させられている細胞に特異的に感染するエンテロウイルスである。ｒａｓ経路の活性化は、多種多様なタイプのガンに共通している特徴であるので、血清３型レオウイルスは、細胞株、動物モデルにおいて、さらには臨床でも、種々の腫瘍の退行を生じることが示されている。臨床第ＩＩ／ＩＩＩ期試験のために大量の感染性ウイルスを生産する要求に応じるために、濾過およびクロマトグラフィーをベースとするアプローチを開発した。本発明者らは、細胞培養物から活性のあるウイルスを精製するための完全に拡張性のあるプロセスの開発を、本明細書中で報告する。３工程のプロセスには、限外濾過工程、陰イオン交換による精製、および処方緩衝液への基の分離から構成される。このプロセスを、２０リットルのバイオリアクターのスケールにまでスケールアップし、ＧＭＰ設備での生産に移行させた。このプロセスの全体の回収率は＞５０％であり、最終的な純度は２回の連続する塩化セシウム遠心分離工程によって得られる物質に匹敵する。
【０１０３】
材料および方法
クロマトグラフィー：全ての精製実験は、Aｋｔａ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ １００システ
ムで行い、画分を画分回収装置Ｆｒａｃ ９５０を通じて回収した。２８０、２６０、および２１５ｎｍでのＵＶ，さらには、伝導率とｐＨを、日常的に行われている方法でモニターした。全てのクロマトグラフィー媒体と装置は、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから入手した。
【０１０４】
ＳＤＳ ＰＡＧＥ：全てのＳＤＳ ＰＡＧＥ材料はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手した。４〜１２％のＳＤＳ ＰＡＧＥゲルを使用し、製造業者の説明書にしたがって泳動した。全ての試料を、電気泳動の前に６５℃で１０分間変性させた。
【０１０５】
全長のレインボーマーカーを大きさの標準物として使用した（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）。
【０１０６】
ＳＤＳ ＰＡＧＥの染色：銀染色試薬はＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから入手した。コロイドクマシー染色は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手した。染色試薬のそれぞれについて、製造業者の説明書にしたがった。銀染色の発色工程は、ゲルを過度染色のために８分間そのままの状態を維持して、確実に残っている混入物質が明確に見えるようにした。
【０１０７】
ウェスタンブロッティング：ＳＤＳ ＰＡＧＥゲルは、ゲルの一方をＥＣＬニトロセルロースに移動させることができるように、２連で行った。トランスファー緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を除いて、全ての試薬とブロッティング装置はＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから入手した。ゲルを、２０％のメタノールで４５Ｖで４０分かけてブロットした。移動の完成度を、染色したマーカーの移動によってチェックした。膜を脱脂乳（その地の食料品店）の中で一晩ブロックし、そして脱脂乳０．２％のＴｗｅｅｎの中で１：２００００に希釈したポリクローナルヤギ抗体とともにインキュベートした。ブロットを、過剰量のＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ ０．２％で５分×３回リンスし、その後、１：１０００００で、モノクローナル抗ヤギＨＲＰ抗体（Ｓｉｇｍａ）ともにインキュベートした。ブロットを上記のようにリンスし、その後、製造業者の説明書にしたがってＥＣＬ検出試薬で発色させた。その後、ブロットを、Ｋｏｄａｋ ＢｉｏＭａｘ Ｌｉｇｈｔフィルムに３０秒間、１分間、５分間など露光させ、そしてフィルムを、製造業者の説明書にしたがって、ＧＢＸ現像液および定着剤（Ｋｏｄａｋ）を用いて手作業で現像した。
【０１０８】
ＲＮＡの単離：試料を、ＲＮＡＷｉｚａｒｄ（Ａｍｂｉｏｎ）での各画分の０．５ｍｌの試料からのＲＮＡの抽出によって、ＲＴ−ＰＣＲのために調製した。製造業者のプロトコールにしたがい、そしてＲＮＡのペレットをＤＥＰＣで処理した水に再度懸濁させて、最終容量を０．１ｍｌとした。１ｍｌの各試料、ならびに１：１０希釈物を、ＲＴ−ＰＣＲによる増幅に使用した。
【０１０９】
ＰＣＲ試料のアガロースゲル電気泳動：ＰＣＲ反応物を４％のＥＺゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上で、１：１００００希釈でＶｉｓｔｒａＧｒｅｅｎ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含む２０ｍｌの６×ローディング色素と５０％のグリセロールを添加することによって、分析した。２０ｍｌをそれぞれのウェルに載せ、そして５０ｂｐのラダー（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を、サイズ標準物として使用した。
【０１１０】
ＰＣＲバンドの検出：全てのゲルを、６５０ ＰＭＴのエチジウムブロマイド設定と、５０ミクロンの解像度の通常の感度調整で、Ｔｙｐｈｏｏｎ ９６００スキャナー上でスキャンした。
【０１１１】
Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、AＫＴＡｅｘｐｌｏｒｅｒ、Ｕｎｉｃｏｒｎ、ＨＲ、Ｉｍａｇｅ
Ｑｕａｎｔ，Ｖｉｓｔｒａ Ｇｒｅｅｎ、および Ｔｙｐｈｏｏｎは、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅの登録商標である。ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅは、Ｇｅｎｅｒａｌ Ｅｌｅｃｔｒｉｃの登録商標である。
【０１１２】
Ｅ−ｇｅｌおよびＮｏｖｅｘ ｇｅｌは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐの登録商標である。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ ａｎｄ Ｆ．Ｈｏｆｆｍａｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ｌｔｄが所有する特許の適用を受けている。
【０１１３】
プロセスの開発：染色材料についての記載
レオウイルスは、２０面体の対称性と周知のタンパク質組成を有する、非被包性の二本鎖のＲＮＡウイルスである。これは、約８５ｎｍの直径と、約１２６，０００，０００ダルトンの分子量を有する。クロマトグラフィーマトリックスに対するウイルスの結合特性を決定する外側のキャプシドは、７６．３ｋＤａの分子量を有する主要な外側のキャプシドタンパク質λ１の６００個のコピー、外側のキャプシドのビルディングブロックが実際にμ１σ３のヘテロ６量体を作り上げる主要な外側のキャプシドタンパク質σ３の６００個のコピーから構成されている。加えて、３６コピーの主要ではない外側のキャプシドタンパク質σ１もまた、ホモ３量体としてウイルスの表面上で見られる。σ１は細胞表面へのウイルスの付着を媒介する。３つの外側のキャプシドタンパク質σ３、σ１、およびμ１は、それぞれ、５．２、５．２、および６．６の等電点を有する。内側のキャプシドは、１２０コピーのλ１（２量体）、６０コピーのλ２（５量体として）、および２４コピーのμ１から構成されている。コアは、１２コピーのλ３、ＲＮＡポリメラーゼ、および１２０コピーのσ２、主要なコアタンパク質から構成されている。全てのλタンパク質は、およそ１２０ｋＤａ、μタンパク質はおよそ８０ｋＤａ、そしてσタンパク質はおよそ４７〜４８ｋＤａの分子量を有する。
【０１１４】
プロセスの開発に使用した全ての材料を以下のように作成した。２０リットルのバイオリアクターに、４ｍＭのグルタミンとフェノールレッドを含む無血清培地の中に、ＨＥＫ
２９３に由来する細胞株を接種した。細胞を２〜３日間増殖させ、１×１０６細胞／ｍｌの細胞数で、０．５のＭＯＩで感染させた。さらに２〜３日間、ウイルスの生産を進行させた。細胞を、１％の最終濃度になるように１０％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を添加することによって、１２０ｒｐｍで３７℃で３０分間溶解させた。粗溶解物の試料濃度を１ｍＭの塩化マグネシウムになるように調整し、１０μ／ｍｌのベンゾナーゼで、３７℃および１２０ｒｐｍで１時間消化させた。その後、材料を、８マイクロンのフィルター、その後に０．８マイクロンのフィルターを通して濾過した。３００ｋＤａの分子量カットオフおよび４８００ｃｍ２の全面積を有するＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ中空繊維カートリッジ上で材料をさらに濃縮し、緩衝液交換を行った。材料を、５倍容量の２０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ ７．８）、２５ｍＭの塩化ナトリウムに対して交換した。透析後、グリセロールを１０％の最終濃度となるように添加した。
【０１１５】
レオウイルスの精製に許容される作業範囲を決定するためのパラメーター
３型レオウイルスＤｅａｒｉｎｇの精製のための安定性ウィンドウは、以下の参考文献に示されている（Ｆｌｏｙｄ ｅｔ ａｌ．，１９９７；Ｆｌｏｙｄ ｅｔ ａｌ．，１９７８、ｐ．１０７９−１０８３および１０８４−１０９４；Ｆｌｏｙｄ ｅｔ ａｌ．，１９７９；Ｄｒａｙｎａ ｅｔ ａｌ．，１９８２）。これらの文献に基づいて、５．０〜８．０のｐＨ範囲全体についてのクロマトグラフィー条件と、０〜２Ｍまでの塩化ナトリウムの塩濃度が良好な開始範囲であると推測した。凝集、および凝集を誘導する可能性がある条件もまた、考えられる要因である。文献（前記）によるデータに基づいて、５．０〜８．０のｐＨウィンドウと、０．０２５〜２Ｍの塩化ナトリウムの塩濃度が許容されると推測した。グリセロールもまた、凝集を防ぐために全ての緩衝液に加えた。グリセロールの省略が、凝集によるウイルスのロスが原因でウイルスの安定性および感染力に悪影響を与えているかどうかは試験しなかった。
【０１１６】
ビリオンの等電点（ｐＩ）は文献（Ｆｌｏｙｄ ｅｔ ａｌ．，１９７８、ｐ．１０８４−１０７９、Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９８１）に記載されている。３．８〜３．９の見かけのｐＩが、クロマト分画、および全粒子（ｗｈｏｌｅ−ｐａｒｔｉｃｌｅ）顕微電気泳動を使用して示されている。３型レオウイルスであるＤｅａｒｉｎｇの２つの最も豊富に存在している主要なコートタンパク質（σ３、およびμ１）は、低い酸性ｐＩを有する（上記を参照のこと）。これはまた、種々のイオン交換体に対するウイルスの吸着特性と良好に一致している（Ｚｅｒｄａ ｅｔ ａｌ．，１９８１）。相違は、クロマト分画が、多くの態様においては、溶液中の全体的な変化よりはむしろ電荷を有するドメインを測定する二次元技術であり、一方、顕微電気泳動は、実験結果にも影響を与える可能性がある緩衝液条件の調整によるいくつかの偏差を生じる可能性があるという事実によって、おそらく説明される。緩衝液処方物中でのマグネシウム塩の使用は、マグネシウムの存在下での凍結の際のウイルスの感染力の低下が報告されている（Ｅｓｔｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９７９）ので、避けた。
【０１１７】
最初の培地の選定
イオン交換体（ＩＥＸ）、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、ヘパリンアフィニティークロマトグラフィー、および固定化金属キレートクロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）を、全て最初に評価した。σ３（２つの主要な外側のキャプシドタンパク質のうちの１つ）には、ジンク・フィンガーモチーフが含まれている。したがって、ＩＭＡＣを、このウイルスについての見込みのある捕捉技術と考えた。
【０１１８】
ビリオンが種々のタイプのクロマトグラフィー媒体にそもそも結合するかどうかを決定するために、ウイルスもまた、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｅ Ｆｌｏｗ上でグループ分けして、主要な混入物質の一部を取り除き、ウイルスを結合により適している緩衝液条件に交換した。Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６および４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗの両方を、最初に、２０ｃｍのベッド高と１５０ｃｍ／ｈの線流速で評価した。カラム容量の５〜３０％の試料の容量を載せた。Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗのサイズ排除限界は、球状分子については２００〜５００万ダルトンの範囲であり、そしてＳｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗは約２０００万ダルトンの排除限界を有するので、後者のほうが分解能が高く、したがって、２５％のカラム容量までを載せることができた。この値を上回るピークは、もはや分解できなかった。これは、塩またはエチレングリコールの添加によっても抑制することはできなかった。ＨＲ５＿２０ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗカラム上での出発物質のサイズ分離の典型的なクロマトグラムを図１に示す。
【０１１９】
陽イオン交換媒体を、５．０〜６．０のｐＨ範囲で試験した。弱い（カルボキシメチル）陽イオン交換基および強い（スルホプロピル）陽イオン交換基の双方を使用した（図２）。
【０１２０】
サイズ排除で予め精製したウイルスについては、ウイルスの良好な結合が、ｐＨ５．６のＳＰおよびＣＭ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗの両方について観察された。しかし、ＵＦ／ＤＦ材料は、５．０のｐＨでさえも全く結合しなかった。２．５％のエチレングリコールの添加は、ウイルスの結合を形成し可能にする凝集の崩壊を助けたが、ウイルスの感染力は低下した。
【０１２１】
カルシウム、亜鉛、およびマグネシウムに荷電したキレート金属セファロースもまた、ＳＥＣで予備精製した材料とのウイルスの結合について試験した。しかし、２５および５０ｃｍ／ｈのいずれの試料のアプリケーションでも、ウイルスはカラム上に保持されなかった。Ｈｅｐａｒｉｎ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗもまた、予備精製したウイルスを用いて種々の塩の濃度で評価したが、ここでも、結合は観察されなかった。画分を、記載されている（Ｓｐｉｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００１）ようにＲＴ ＰＣＲによって、ならびに、ウェスタンブロッティングとＳＤＳ ＰＡＧＥによって分析した。
【０１２２】
全てのＨＩＣカラムがある程度ウイルスを保持したように思えたが、選択性は低く、塩化ナトリウムを離液性の塩として使用した場合もなお、沈殿が多かったことが原因で、ロスが多かった。
【０１２３】
種々の陰イオン交換体もまた、選択性と結合についてスクリーニングした。ＤＥＡＥ、ＡＮＸ ｈｉｇｈ ｓｕｂ、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、ＸＬ、および高速（Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ（ＨＰ））を全て、ウイルスの結合について評価した。ＳＥＣで予備精製した材料を試験した場合には、選択性が異なるように思えた（図３）。
【０１２４】
陰イオン交換が、最初の精製工程について最も着実な拡張性のある選択肢であると思われた。したがって、種々の陰イオン交換体を、レオリジン（ｒｅｏｌｙｓｉｎ）の精製についてさらに評価した。
【０１２５】
陰イオン交換による捕捉工程の最適化
種々の陰イオン交換体によって、明確に様々な選択性が付与される。Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＸＬは最も顕著に異なり、ウイルスの分裂ピークを生じる。ウイルスはｐＨ８．０を超えると安定ではないので、結合の間の陰イオン交換体の微環境を１ｐＨ単位高くし、試料をｐＨ ７．２で載せ、その後の全ての工程は７．０のｐＨに維持した。試料を、希塩酸で７．２のｐＨに調整した。
【０１２６】
Ｔｒｉｓ−Ｃｌ緩衝液中での選択性は低いと考えたので、リン酸緩衝液もまた評価した。結合と選択性の両方がリン酸緩衝液の使用によって改善された（データは示さない）。５種類の陰イオン交換体もまた結合能力について比較した。早い漏出（ｂｒｅａｋｔｈｒｏｕｇｈ）が、９０ミクロンのビーズ（ＡＮＸ ｈｉｇｈ ｓｕｂ、ＤＥＡＥ、Ｑ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ，およびＸＬ）の全てについて観察され、この場合、材料は、１〜２倍のカラム容量の後、漏出した。Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅにより、５ｃｍのベッド高および５０ｃｍ／ｈの線流速または６分の滞留時間で、漏出が観察されるまでに、１２ ＣＶより多くのウイルスを載せることができた（図４）。
【０１２７】
したがって、最初の工程のプロセスのさらなる開発については、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅを選択した。１Ｍの塩化ナトリウムまでの直線勾配を用いたＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰからのウイルスの溶出は、０．５Ｍでウイルスが溶出され、勾配のそれよりも早い段階でいくらかの残っている混入物質が溶出し、そして勾配のそれよりも遅い段階でいくらかのさらなる混入物質が溶出したことを示している。
【０１２８】
洗浄、溶出、および再生のための種々の工程の濃度を評価した。最適条件は、カラムを０．２４Ｍの塩化ナトリウムで洗浄し（ウイルスは、約０．２６〜０．２７Ｍの塩化ナトリウムまでは溶出しなかった）、０．５Ｍの塩化ナトリウムで溶出させ、そして２Ｍの塩化ナトリウムで再生した場合に見られた（図５）。
【０１２９】
この工程のプロトコールにより、８〜１０倍のウイルスの濃縮が可能になり、そして滴定、ならびにウェスタンブロッティングとＲＴ−ＰＣＲの両方によって６０〜７０％の回収率が示された。クリーニングレジュメもまた開発され、上向きの流れ方向（ｕｐ−ｆｌｏｗ ｄｉｒｅｃｔｉｏｎ）での、５０ｃｍ／ｈの２ ＣＶについての２Ｍの塩化ナトリウム、その後の２５ｃｍ／ｈの２ ＣＶについての１Ｍの水酸化ナトリウムの再生、それに続く上向きの流れ方向での、５０ｃｍ／ｈのさらに２ ＣＶの２Ｍの塩化ナトリウムの再生の組み合わせによって、カラム最大容量と溶出プロフィールの完全な回収が可能となった（データは示さない）。得られたウイルス力価が最終的な処方物に十分であるほど高い場合には、１５０ｃｍ／ｈおよび２０ｃｍのベッド高でのＳｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ上での基分離を、２回目の精製および緩衝液交換工程のために選択した。全カラム容量の３５％までの容量をこれらの条件下で載せることができ、ウイルスを最終的な処方緩衝液に交換した。
【０１３０】
スケールアップ
陰イオン交換による精製の８倍のスケールアップ
拡張性を示すために、プロセスを、ＨＲ１０＿１００ Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅカラムに８倍にスケールアップした。全てのパラメーター（例えば、滞留時間、載せる容量、工程の濃度、および１ｍｌの樹脂あたりの試料のｍｇ数）を、スケールアップについて、一定に維持した。混入物質の溶出プロフィール、さらには、ウイルスのピークは、この１０倍のスケールアップの間ほぼ同じであった（図６）。
【０１３１】
このプロセスをパイロットプラント用にさらにスケールアップし、その後、５０倍でＧＭＰを行った。５リットルの４×ＵＦ／ＤＦで予備精製したウイルスを、同等の回収率および純度で、開発したプロセスを用いて精製した。
【０１３２】
塩化セシウム勾配で精製した材料と同じ最終的な純度のレベルに達するように、基分離もまた１０倍にスケールアップした。第２工程の１０倍のスケールアップの溶出プロフィールを図７に示す。
【０１３３】
最終産物の純度は、銀染色したＳＤＳ ＰＡＧＥによって示すように（図８Ａ）、勾配で精製した材料と同等であった。２工程の手順によってもまた、クマシー染色したＳＤＳ
ＰＡＧＥによって示したように（図８Ｂ）、勾配で精製した材料よりも高濃度の物質が生じた。ウェスタンブロット分析によって、ウイルスのバンドの実態を確認し、プロセス全体についてウイルスの回収量を定量した。全体的な回収率は＞５０％であった。これを、滴定アッセイによっても確認した（図８Ｃ）。
【０１３４】
実施例４のまとめ
精製プロセスを、非被包性ウイルスの精製のために開発し、５０倍超にスケールアップした。種々のクロマトグラフィーによる分離の原理のスクリーニングは、レオウイルスの場合には、陰イオン交換とサイズ排除が完全な生物学的活性のある（感染性）ビリオンの精製のための最適な選択肢であることを示していた。それぞれ、第１の工程および第２の工程としての陰イオン交換クロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーについての条件を注意深くスクリーニングし、最適化して、着実な拡張性のあるプロトコールを可能にした。第１の工程については、吸着および脱着工程の流速、ならびに、第２の工程の試料の注入およびアイソクラチック溶出に、特に注意を払った。種々の陰イオン交換体についての結合能力を評価し、そして６％のアガロース媒体上では＞２ ＭＤ、そして４％のアガロース媒体上では＞２０ ＭＤの粒子についてのみ表面結合が生じたので、より小さいビーズを使用することによって、ビーズの直径が小さくなることに比例して結合能力が増大した（それぞれ、３倍および９倍）。Ｔｒｉｓベースの緩衝液ではなくリン酸緩衝液を使用することにより、ウイルスの溶出の際によりよい選択性が得られ、そしてまた、生物学的活性の回収に関しても優れていることが見られた。さらに、透析および溶出緩衝液の中でのマグネシウム塩の使用は避けた。
【０１３５】
８倍のスケールアップによって、溶出プロフィールがスケールアップしても再現性があること、および段階的プロトコールによって、約６０〜７０％の収率で感染性ウイルスが回収ができることが示された。第２工程は、２回の連続する密度勾配遠心分離工程によって精製されたウイルスの最終的な純度に達するために必要であり、これによって同時に最終処方緩衝液へのウイルスの緩衝液交換ができた。最終的な力価は、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ媒体の高い能力の理由から、さらなる限外濾過工程を省略できるほど十分に高かった。可能性のある逆圧の問題が原因である負の衝撃（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｉｍｐａｃｔ）は、３４ミクロンのビーズを使用した場合には、ＢＰＧ１００カラムへのスケールアップの際には観察されなかった。ベッド全体の圧力低下は、試料のアプリケーションおよびプロトコール全体の間は、１．５バールよりも低いままであった。
【０１３６】
しかし、最大容量の不一致が、出発物質の種々のバッチの中のフェノールレッドの量が異なることが原因で、低力価のウイルス出発物質を使用した場合に、スケールアップの際に観察された。これらの条件下では、ウイルス材料の一部が洗浄工程の間に失われ、そしてロスは５０％もの高さになり得る。しかし、出発材料の質についてのより良好な管理によって、最初の小規模でのプロセスと匹敵する値にまで、精製プロセスの能力を回復させることができた。
【０１３７】
まとめると、本発明により、従来の小規模なプロセスの質に匹敵する質の大規模なレオウイルスの生産のための精製プロセスが提供される。
【０１３８】
記載される本発明の方法およびシステムの種々の改良およびバリエーションが、本発明の範囲および精神から逸脱することなく当業者に明らかであろう。本発明は、特定の好ましい実施形態と組み合わせて記載されているが、請求される本発明が、このような特定の実施形態に不当に限定されるべきではないことが理解されるはずである。実際、本発明を実施するための記載される方法の様々な改良が、以下の特許請求の範囲に含まれるように意図されることは、当業者に明らかである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞培養物からウイルスを抽出する方法に関する。具体的には、この方法は哺乳動物（ヒトを含む）への臨床投与に適している形態で感染性ウイルスを抽出するために有用である。
【背景技術】
【０００２】
（参考文献）
【０００３】
【数１】
【０００４】
【数２】
【０００５】
【数３】
（発明の背景）
ウイルスによって引き起こされる膨大な数の疾患が原因で、ウイルス学は重点的に研究されている分野となっている。ウイルスタンパク質を単離し精製するため、ワクチンを作成するため、あるいは、実験室での研究用の感染性ウイルスを提供するためにウイルスを効率よく生産することは常に求められている。最近、新規のウイルス治療の開発には、さらに、感染性ウイルスの効率的な生産の必要性が必然的に伴う。
【０００６】
レオウイルス治療はウイルス治療の一例である。レオウイルスは、多数の細胞に結合することができる二本鎖のＲＮＡウイルスである。しかし、ほとんどの細胞は、レオウイルスには感染しにくく、その細胞受容体に対するレオウイルスの結合によってはこれらの細胞の中でのウイルスの複製またはウイルス粒子の生産は生じない。これが、おそらく、レオウイルスがいずれの特定の疾患にも関係していることが明らかになっていないことの理由である。
【０００７】
ｒａｓ腫瘍遺伝子で形質転換された細胞はレオウイルスに感染しやすくなるが、形質転換されていない対応する細胞はそうではない（非特許文献１）。例えば、レオウイルス耐性ＮＩＨ ３Ｔ３細胞が活性化させられたＲａｓまたはＳｏｓ（Ｒａｓを活性化させるタンパク質）で形質転換された場合には、レオウイルス感染が促進される。同様に、レオウイルス感染に耐性があるマウス線維芽細胞も、ＥＧＦ受容体遺伝子またはｖ−ｅｒｂＢ腫瘍遺伝子（いずれもｒａｓ経路を活性化させる）でのトランスフェクションの後には感染しやすくなる（非特許文献２；非特許文献３）。したがって、レオウイルスは、Ｒａｓ経路が活性化させられている細胞に選択的に感染し、その中で複製することができる。
【０００８】
ｒａｓ腫瘍遺伝子は、哺乳動物の腫瘍の大部分について主要な原因となっている。ｒａｓ遺伝子自体の活性化変異が、ヒト腫瘍全体の約３０％において生じており（Ｂｏｓ，１９８９）、主に、膵臓ガン（９０％）、散発性結腸直腸ガン（５０％）、および肺ガン（４０％）、ならびに骨髄性白血病（３０％）において生じている。ｒａｓ経路においてｒａｓの上流または下流にある複数の因子の活性化もまた腫瘍に関係している。例えば、ＨＥＲ２／Ｎｅｕ／ＥｒｂＢ２または上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）受容体の過剰発現は、乳ガンにおいて一般的であり（２５〜３０％）、そして血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）受容体またはＥＧＦ受容体の過剰発現は、神経膠腫および膠芽細胞腫において一般的である（４０〜５０％）。ＥＧＦ受容体およびＰＤＧＦ受容体はいずれも、それらのそれぞれのリガンドに結合するとｒａｓを活性化させることが知られており、そしてｖ−ｅｒｂＢは細胞外ドメインを欠失している構成的に活性化されている受容体をコードする。
【０００９】
多数のヒト腫瘍がプロトオンコジーンｒａｓの遺伝子変化または高いＲａｓ活性の主な原因であるので、レオウイルス治療は、このような症状についての新規のうまくいきそうな治療方法である（非特許文献４）。レオウイルス治療はＲａｓ関連腫瘍細胞に対する選択性が高く、正常な細胞は感染していないままにする。この治療方法には広い用途があり、ヒトおよびヒト以外の動物のいずれにおいても使用することができる。
【００１０】
臨床投与に適しているレオウイルスを生産するためには、培養された細胞の中でレオウイルスを迅速に効率よく生産する方法が必要である。さらに、培養された細胞からウイルスを精製するための伝統的な方法は面倒で時間がかかり、それによってウイルス生産のコストがあまりに高くなってしまう。したがって、改良されたウイルスの精製方法もまた必要である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｓｔｒｏｎｇ Ｊ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，「Ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂａｓｉｓ ｏｆ ｖｉｒａｌ ｏｎｃｏｌｙｓｉｓ：ｕｓｕｒｐａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｒａｓ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ ｂｙ ｒｅｏｖｉｒｕｓ」，ＥＭＢＯ Ｊ．（１９９８）１７：ｐ．３３５１−３３６２
【非特許文献２】Ｓｔｒｏｎｇ Ｊ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，「Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｔｈａｔ ｔｈｅ Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｏｎ Ｈｏｓｔ Ｃｅｌｌｓ Ｃｏｎｆｅｒｓ Ｒｅｏｖｉｒｕｓ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ」，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９３）１９７（１）：ｐ．４０５−４１１
【非特許文献３】Ｓｔｒｏｎｇ Ｊ．Ｅ．，ａｎｄ Ｐ．Ｗ．Ｌｅｅ，「Ｔｈｅ ｖ−ｅｒｂＶ ｏｎｃｏｇｅｎｅ ｃｏｎｆｅｒｓ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｔｏ ｒｅｏｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ」，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９６）７０：ｐ．６１２−６１６
【非特許文献４】Ｃｏｆｆｅｙ，Ｍ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．，「Ｒｅｏｖｉｒｕｓ ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｔｕｍｏｒｓ ｗｉｔｈ ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｒａｓ ｐａｔｈｗａｙ」，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９８）２８２：ｐ．１３３２−１３３４
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、小規模および大規模のいずれのウイルス生産にも適用することができる、細胞培養物からウイルスを抽出し精製する改良された方法に関する。この方法には、細胞培養物に界面活性剤が直接添加される、簡単な抽出工程が含まれる。その後、細胞の破片は、例えば、濾過または遠心分離によって抽出混合物から取り除くことができる。得られたウイルス懸濁液は、クロマトグラフィー方法によってさらに濃縮および／または富化させることができる。本発明にしたがって調製されたウイルスは、ウイルスタンパク質の精製、予防接種、宿主細胞の感染、および臨床投与を含む任意の目的のために使用することができる。
【００１３】
したがって、本発明の１つの態様により、以下の工程を含む、細胞の培養物からウイルスを生産する方法が提供される：
（ａ）ウイルスに感染した細胞の培養物を提供する工程；
（ｂ）培養物に界面活性剤を添加し、細胞溶解物を生じさせるための期間インキュベートすることによって、細胞からウイルスを抽出する工程；
（ｃ）細胞の破片を取り除く工程；ならびに
（ｄ）ウイルスを回収する工程。
【００１４】
任意の方法を、工程（ｃ）において細胞の破片を取り除く（すなわち、細胞溶解物を明澄化させる）ために使用することができる。この方法は、好ましくは、ウイルスと細胞溶解物中の他の構成成分との間のサイズまたは密度の差に基づく簡単な方法（例えば、濾過または遠心分離）である。さらに好ましくは、濾過（具体的には、段階的濾過）が使用される。適切な段階的濾過には、より大きな孔サイズを有するプレフィルターと、その後に、プレフィルターの孔サイズよりも小さい孔サイズを有する少なくとも１つの別のフィルターが含まれる。好ましい実施形態においては、細胞の破片は、以下の工程を含む段階的濾過によって取り除かれる：
（１）５μＭまたは８μＭの孔サイズを有するプレフィルターを通して濾過する工程、および
（２）工程（１）の後に、３μＭおよび０．８μＭの孔サイズを有する連結フィルター（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｆｉｌｔｅｒ）を通して濾過する工程。
【００１５】
別の好ましい実施形態においては、上記工程（２）には、工程（１）の後に、０．８μＭの孔サイズを有するフィルターを通して濾過する工程が含まれる。
【００１６】
細胞溶解物は、状況に応じて、ＢＥＮＺＯＮＡＳＥ（登録商標）エンドヌクレアーゼまたは他のＤＮＡ切断酵素で処理して、長い粘着性のある細胞性ＤＮＡを細かくすることができる。濾過によって細胞の破片を取り除いた後、濾液を必要に応じて濃縮して、ウイルス懸濁液の容量を減少させることができる。ウイルスの濃縮に適している任意の方法（好ましくは、限外濾過または透析（接線流濾過を含む））を使用することができる。例示的な方法としては、平板枠組み（Ｐｌａｔｅ ａｎｄ Ｆｒａｍｅ）システムと中空繊維（Ｈｏｌｌｏｗ Ｆｉｂｅｒ）システムが挙げられる。より好ましくは、中空繊維システムが使用される。好ましい実施形態においては、中空繊維システムでの透析には、３００ｋＤａの分子量カットオフを有する中空繊維カートリッジの使用が含まれる。
【００１７】
本発明の方法は、任意のウイルス（好ましくは、非被包性ウイルスであり、最も好ましくは、レオウイルス）の生産に適用することができる。レオウイルスは、好ましくは、哺乳動物レオウイルスであり、より好ましくは、ヒトレオウイルスであり、なおより好ましくは、血清３型レオウイルスであり、最も好ましくは、Ｄｅａｒｉｎｇ株レオウイルスである。レオウイルスは組み換え体レオウイルスであり得る。組み換え体レオウイルスは、細胞（例えば、哺乳動物細胞または鳥類細胞）の、異なるサブタイプのレオウイルスでの同時感染によって作成することができる。組み換え体レオウイルスは自然界に存在しているものである場合も、また自然界には存在しないものである場合もある。組み換え体レオウイルスは、２種類以上のレオウイルス株（具体的には、Ｄｅａｒｉｎｇ株、Ａｂｎｅｙ株、Ｊｏｎｅｓ株、およびＬａｎｇ株からなる群より選択される２種類以上のレオウイルス株）に由来し得る。組み換え体レオウイルスはまた、血清型の異なるもの（例えば、血清１型レオウイルス、血清２型レオウイルス、および血清３型レオウイルスからなる群より選択される）からのレオウイルスの混ぜ合わせによって生じる場合もある。組み換え体レオウイルスには、自然界に存在している変異体コートタンパク質をコードする配列、または変異したコートタンパク質をコードする配列が含まれる場合がある。
【００１８】
本発明で使用される細胞培養物には、所望されるウイルスの生産に適している任意の細胞が含まれ得る。レオウイルスについては、細胞は、好ましくは、ヒト胚腎臓細胞２９３（ＨＥＫ２９３）細胞またはそれらに由来する細胞（具体的には、懸濁培養物中での増殖に適応させられたＨＥＫ２９３細胞）である。
【００１９】
この方法には、状況に応じて、イオン交換クロマトグラフィーの工程が含まれる。この場合、ウイルスは、適切な条件下でイオン交換樹脂に結合させることによって富化させられる。その後、ウイルスは、適切な溶出溶液を使用してイオン交換体から溶出させられる。イオン交換体と結合／溶出条件の選択は、精製されるウイルスに応じて様々であろう。レオウイルスについては、陰イオン交換体とおよそ７．０〜９．０のｐＨが最も有効である。ｐＨは好ましくは、約７．５から約８．５であり、最も好ましくは、約８．０である。好ましくは、イオン交換はリン酸緩衝液（例えば、５０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２）中で行われる。結合／溶出緩衝液にはマグネシウム塩が含まれないことが好ましい。
【００２０】
ウイルスはまた、サイズ排除クロマトグラフィーを使用することによっても精製することができる。サイズ排除クロマトグラフィーは、好ましくは、リン酸緩衝液（例えば、５０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２）中で行われる。さらに、サイズ排除クロマトグラフィーは、マグネシウム塩が存在しない条件で行うことができる。具体的には、イオン交換クロマトグラフィーとサイズ排除クロマトグラフィーの組み合わせを使用することができる。１つの実施形態においては、レオウイルスは、陰イオン交換体を使用して精製され、その後、サイズ排除クロマトグラフィーによって精製される。
【００２１】
本発明の別の態様により、本明細書中に記載される方法のいずれかにしたがって精製されたウイルスを含む組成物が提供される。組成物は、好ましくは、臨床投与に適しており、ヒトへの臨床投与に特に適している。より好ましくは、組成物には、薬学的に許容される賦形剤および／または担体が含まれる。
【００２２】
本発明の別の態様によって、以下の工程を含む、感染性レオウイルスを生産する方法が提供される：
（ａ）レオウイルスに感染させたＨＥＫ２９３細胞の培養物を提供する工程；
（ｂ）ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００（オクトキシノール−９から１０）を培養物に添加し、約２５℃から約３７℃でインキュベートすることによって細胞からウイルスを抽出する工程；
（ｃ）ＢＥＮＺＯＮＡＳＥ（登録商標）エンドヌクレアーゼで工程（ｂ）による混合物を処理する工程；
（ｄ）濾過によって細胞の破片を取り除く工程；
（ｅ）限外濾過または透析によって濾液を濃縮する工程；
（ｆ）イオン交換クロマトグラフィーとサイズ排除クロマトグラフィーの組み合わせによってレオウイルスを精製する工程；ならびに
（ｇ）レオウイルスを回収する工程。
【００２３】
この方法にしたがって回収されたレオウイルスを含む組成物（具体的には、薬学的に許容される賦形剤および／または担体をさらに含む組成物）もまた提供される。
【００２４】
本発明の１つ以上の実施形態の詳細は、添付の図面と以下の記載に示される。本発明の他の特徴、目的、および利点は、記載事項および図面から、さらには、特許請求の範囲から明らかであろう。
例えば、本願発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
細胞の培養物からのウイルスの生産方法であって、以下：
（ａ）該ウイルスに感染した細胞の培養物を提供する工程；
（ｂ）該培養物に界面活性剤を添加し、そして細胞溶解物を得るための期間インキュベートすることによって、該細胞からウイルスを抽出する工程；
（ｃ）細胞の破片を取り除く工程；および
（ｄ）該ウイルスを回収する工程、
を包含する、方法。
（項目２）
前記細胞の破片が濾過によって取り除かれる、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記細胞の破片が段階的濾過によって取り除かれる、項目１に記載の方法であって、該方法は、以下：
（１）５μＭまたは８μＭの孔サイズを有するプレフィルターを通して濾過する工程、および
（２）工程（１）の後に、３μＭと０．８μＭの孔サイズを有する連結フィルターを通して濾過する工程、
を包含する、方法。
（項目４）
項目１に記載の方法であって、前記細胞の破片は、以下：
（１）５μＭまたは８μＭの孔サイズを有するプレフィルターを通して濾過する工程、および
（２）工程（１）の後に、０．８μＭの孔サイズを有するフィルターを通して濾過する工程、
を含む段階的濾過によって取り除かれる、方法。
（項目５）
ＤＮＡ切断酵素で前記細胞溶解物を処理する工程をさらに包含する、項目１に記載の方法。
（項目６）
濾液を濃縮する工程をさらに包含する、項目２に記載の方法。
（項目７）
前記濾液は透析によって濃縮される、項目６に記載の方法。
（項目８）
前記透析が、３００ｋＤａの分子量カットオフを有する中空繊維カートリッジを用いて行われる、項目７に記載の方法。
（項目９）
前記ウイルスが非被包性ウイルスである、項目１に記載の方法。
（項目１０）
前記ウイルスがレオウイルスである、項目１に記載の方法。
（項目１１）
前記レオウイルスが哺乳動物のレオウイルスである、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記哺乳動物のレオウイルスがヒトレオウイルスである、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記ヒトレオウイルスが血清３型ウイルスである、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記血清３型レオウイルスがＤｅａｒｉｎｇ株である、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記レオウイルスが組み換え体レオウイルスである、項目１０に記載の方法。
（項目１６）
前記細胞がヒト胚腎臓２９３（ＨＥＫ ２９３）細胞である、項目１に記載の方法。
（項目１７）
前記ＨＥＫ ２９３細胞が懸濁液の中で増殖させられる、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
陰イオン交換クロマトグラフィーによってウイルスを精製する工程をさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目１９）
イオン交換クロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーの組み合わせによって前記ウイルスを精製する工程をさらに包含する、項目１に記載の方法。
（項目２０）
前記イオン交換が陰イオン交換体を使用して行われる、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記イオン交換がサイズ排除クロマトグラフィーの前に行われる、項目１９に記載の方法。
（項目２２）
前記イオン交換クロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーが、マグネシウムが存在しない条件で行われる、項目１９に記載の方法。
（項目２３）
前記イオン交換クロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーにおいてリン酸緩衝液が使用される、項目１９に記載の方法。
（項目２４）
前記リン酸緩衝液に、５０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２が含まれる、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
項目１にしたがって回収されたウイルスを含む、組成物。
（項目２６）
臨床投与に適している、項目２５に記載の組成物。
（項目２７）
薬学的に許容される賦形剤および／または担体をさらに含む、項目２６に記載の組成物。
（項目２８）
感染性レオウイルスの生産方法であって、以下：
（ａ）レオウイルスに感染したＨＥＫ２９３細胞の培養物を提供する工程；
（ｂ）オクトキシノール−９から１０を該培養物に添加し、約２５℃から約３７℃でインキュベートすることによって、該細胞からウイルスを抽出する工程；
（ｃ）ＤＮＡ切断酵素で工程（ｂ）による混合物を処理する工程；
（ｄ）濾過によって細胞の破片を取り除く工程；
（ｅ）限外濾過または透析によって濾液を濃縮する工程；
（ｆ）イオン交換クロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーの組み合わせによってレオウイルスを精製する工程；ならびに
（ｇ）該レオウイルスを回収する工程、
を包含する、方法。
（項目２９）
工程（ｆ）は、アニオン交換クロマトグラフィーおよびその後のサイズ排除クロマトグラフィーを含む、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
項目２８に記載の方法にしたがって調製されたレオウイルスを含む、組成物。
（項目３１）
薬学的に許容される賦形剤および／または担体をさらに含む、項目３０に記載の組成物
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は、レオウイルスの限外濾過／透析（ＵＦ／ＤＦ）材料の、１５０ｃｍ／ｈでの分離を示す。材料を、ＨＲ５＿２００ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗカラム上で５０ｍＭのリン酸塩（ｐＨ７．２）、５％のグリセロールに緩衝液交換した。０．３０ＣＶの試料を載せた。０．３７ ＣＶ〜０．６２ ＣＶから溶出された空隙容量を回収した。ｘ軸はＣＶ；ｙ軸は２８０ｎｍでのミリ吸光度単位。
【図２】図２は、Aｋｔａ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ １００上で５０ｃｍ／ｈでの、予備精製した材料のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）での分離を示す。緩衝液Ａ：５０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ５．６、５％のグリセロール。緩衝液Ｂ：Ａ＋１Ｍの塩化ナトリウム。ｘ軸はｍｌ；ｙ軸は２８０ｎｍでのミリ吸光度単位。Ａ２８０ ＣＭの線は、１ｍｌのＨｉＴｒａｐ ＣＭ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムからの溶出プロフィールを示し、Ａ２８０ ＳＰの線は、１ｍｌのＨｉＴｒａｐ ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムからの溶出プロフィールを示す。
【図３】図３は、種々のＨｉＴｒａｐ陰イオン交換カラム上でのＳＥＣで予備精製したレオウイルスの分離を示す。流速；５０ｃｍ／ｈ。緩衝液Ａ：２５ｍＭのＴｒｉｓＣｌ（ｐＨ７．２）、５％のグリセロール。緩衝液Ｂ：Ａ＋１Ｍの塩化ナトリウム。１０ ＣＶ勾配を材料を溶出させるために流した。ｘ軸はｍｌ；ｙ軸は２８０ｎｍでのミリ吸光度単位。Ａ２８０ｎｍによって検出した場合の溶出プロフィールは以下とした：Ａ２８０ ＤＥＡＥ＝ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ；Ａ２８０ Ｑ ＸＬ＝Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＸＬ，ＡＮＸ Ｈｉｇｈ Ｓｕｂ＝ＡＮＸ ｈｉｇｈ ｓｕｂ；Ｑ ＨＰ＝Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ。
【図４】図４は、ＨＲ５＿１００ Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰカラム上で５０ｃｍ／ｈでの、５〜１０％のブレイクスルーによる動的結合能力の決定を示す。１２より大きいＣＶを載せ、その後、ブレイクスルーを観察した。緩衝液Ａ：５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）、５％のグリセロール。緩衝液Ｂ：５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）、５％のグリセロール、２Ｍの塩化ナトリウム。１Ｍの塩化ナトリウムまでの１０ＣＶの直線勾配を使用し、その後、２Ｍの塩化ナトリウムまで、５ ＣＶ工程を続けた。ウイルス画分（ウイルス活性）をＲＴ−ＰＣＲおよびウェスタンブロッティングによって決定した。ｙ軸は２８０ｎｍでのｍＡＵ；ｘ軸はｍｌでの容量。
【図５】図５は、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ上でのレオウイルスの捕捉の簡単なスケールアップのための段階的プロトコールの開発を示す。Ａｅｋｔａ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ １００に繋いだＨＲ５＿１００ Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰカラム上で希塩酸でｐＨ７．２に調整した５ ＣＶのＵＦ／ＤＦレオウイルスの精製。緩衝液Ａ：５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）、５％のグリセロール。緩衝液Ｂ：５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）、５％のグリセロール、２Ｍの塩化ナトリウム。段階的勾配：５ ＣＶについての１２％のＢ（洗浄）、５ ＣＶについての２５％のＢ（溶出）、５ ＣＶについての５０％のＢ（再生）、および２ ＣＶについてのＣＩＰ（１Ｍの水酸化ナトリウム、その後の１００％のＢの５ ＣＶ）。Ｙ軸：ｍＡＵ、ｘ軸：ｍｌでの容量。ウイルスを含む画分をｒｅｏ＋で示す。
【図６】図６は、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ上でのレオウイルスの捕捉の８倍のスケールアップを示す。ＨＲ１０＿１００ Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰカラム上で希塩酸でｐＨ７．２に調整した１０ ＣＶのＵＦ／ＤＦレオウイルスの精製。緩衝液Ａ：５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）、５％のグリセロール。緩衝液Ｂ：５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）、５％のグリセロール、１Ｍの塩化ナトリウム。段階的勾配：５ ＣＶについての１２％のＢ（洗浄）、５ ＣＶについての２５％のＢ（溶出）、５ ＣＶについての５０％のＢ（再生）、および２ ＣＶについてのＣＩＰ（１Ｍの水酸化ナトリウム、その後の１００％のＢの５ ＣＶ）。Ｙ軸：ｍＡＵ、ｘ軸：ｍｌでの容量。ウイルスは、約５ｍｌの容量の、画分Ｂ３／２中に溶出された。
【図７】図７は、ＨＲ１０＿２００ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ ２０ｍｌカラム上でのウイルス画分の精製の第２工程の８倍のスケールアップを示す。０．２５ ＣＶを載せた（図６に示す画分Ｂ３／２）。線流速：１５０ｃｍ／ｈ。緩衝液：ＰＢＳ，５％のグリセロール。
【図８】図８Ａは、以下についての銀染色した４〜１２％のＳＤＳ ＰＡＧＥゲルを示す：レーン１：Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ精製後のウイルス画分、レーン２：ＣｓＣｌ精製した標準物、レーン３：２倍に希釈したＳＥＣ精製した最終物質。図８Ｂは、精製手順の４〜１２％のＳＤＳ ＰＡＧＥのクマシー染色したゲルを示す。レーン１：出発材料、レーン２：Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ材料、レーン３：２倍希釈したＣｓＣｌ材料、レーン４：希釈していないＣｓＣｌ材料、レーン５：ＳＥＣ精製した材料。図８Ｃは、ＴＣＩＤ５０によって決定したレオウイルスの回収率の表である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明は、小規模および大規模のいずれのウイルス生産にも適用することができる、細胞培養物からウイルスを抽出し精製する改良された方法に関する。この方法には、細胞培養物に界面活性剤が直接添加される、簡単な抽出工程が含まれる。その後、細胞の破片は、例えば、濾過または遠心分離によって抽出混合物から取り除くことができる。得られたウイルス懸濁液は、クロマトグラフィー方法によってさらに濃縮および／または富化させることができる。本発明にしたがって調製されたウイルスは、ウイルスタンパク質の精製、予防接種、宿主細胞の感染、および臨床投与を含む任意の目的のために使用することができる。
【００２７】
本発明がさらに詳細に記載される前に、本出願で使用される用語は、特に断りのない限りは、以下のように定義される。
【００２８】
定義
本明細書中で使用される場合は、「接着細胞」は、細胞培養物中において培養容器に接着している細胞を意味する。接着細胞の例としては単層細胞が挙げられ、これは、培養容器の表面上に１層の細胞を形成する細胞である。「懸濁細胞」または「細胞浮遊液」は、細胞培養物中で培養容器には接着しない細胞を意味する。懸濁細胞は、培養培地が培養プロセスの間中攪拌され続ける培養である「回転培養（ｓｐｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅ）」において増殖させることができる。
【００２９】
本明細書中で使用される場合は、「環境温度」は、約１０℃から約３０℃の間の温度を意味する。環境温度は、好ましくは、約１５℃から約３０℃であり、より好ましくは、約２０℃から２５℃であり、そしてもっとも好ましくは、約２５℃である。
【００３０】
本明細書中で使用される場合は、「細胞結合型（ｃｅｌｌ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）」ウイルスは、ウイルスがその中で生産される細胞の一部に付着するかまたは細胞の一部に捕捉されるウイルスを意味する。したがって、ウイルスは、宿主細胞が溶解する前は細胞結合型である。細胞の溶解が始まっても、ウイルスは崩壊した細胞の一部に付着したまま、または崩壊した細胞の一部に捕捉されたままである場合もあり、細胞に結合したままであり得る。しかし、ウイルスが培地に放出されて遊離させられると、これはもはや細胞結合型ではない。「無細胞型（ｃｅｌｌ ｆｒｅｅ）ウイルス」は、細胞結合型ではないウイルスである。
【００３１】
本明細書中で使用される場合は、「細胞培養物」または「細胞の培養物」は、それらの培養条件で見られるような培養された細胞の集団を意味する。具体的には、細胞培養物には、細胞と培養培地が含まれる。ペレット状の細胞は、それらが再び、培養条件下にある培養培地の中に置かれでもしない限りは、細胞培養物とは見なされない。
【００３２】
本明細書中で使用される場合は、「細胞溶解」は、細胞の細胞膜の破裂と、その後の細胞の内容物の全てまたはその一部の放出を意味する。
【００３３】
本明細書中で使用される場合は、物質の「臨床投与」は、生物の健康状態を改善または維持するために、生存している生物の体の任意の部分を物質と接触させることを意味する。
【００３４】
本明細書中で使用される場合は、ウイルスを「回収する」は、先にウイルスに感染させられた細胞培養物から生産されたウイルスを分離する行為を意味する。ウイルスは、通常、ウイルスから細胞の破片を分離し、そしてウイルスを含む部分を集めることによって回収される。状況によっては、ウイルスはさらに、可溶性物質から、例えば、遠心分離によって分離することができる。
【００３５】
本明細書中で使用される場合は、「培養条件」は、細胞の培養に使用される条件を意味し、これには、温度、培養容器のタイプ、湿度、培養容器内で使用されるＣＯ２または任意の他の気体の濃度、培養培地のタイプ、培養される細胞の初期密度、および細胞がウイルスに感染している場合には、初期感染多重度が含まれるが、これらに限定はされない。
【００３６】
本明細書中で使用される場合は、「細胞変性効果」は、感染した宿主細胞に対する損傷である。細胞変性効果は、細胞が外見において膨張して顆粒状になり、細胞塊が破裂することによって示される。細胞変性効果を示す細胞はまた、生存している細胞の計数において染色色素を取り込む。
【００３７】
本明細書中で使用される場合は、「界面活性剤」は、親水性部分と疎水性部分を有する物質である。界面活性剤は、好ましくは、合成の化合物であり、より好ましくは、生分解性の合成の化合物である。本発明に有用な界面活性剤は、破裂した細胞の内容物の放出を促進するように、細胞膜の破裂を増進する。
【００３８】
本明細書中で使用される場合は、細胞は、細胞膜が破裂させられ、細胞内容物の少なくとも一部が細胞から放出されると、「破裂」させられる。細胞は、例えば、凍結解凍、超音波処理、または界面活性剤での処理によって破裂させることができる。
【００３９】
本明細書中で使用される場合は、ウイルスを「抽出する」は、細胞結合型ウイルスを無細胞型ウイルスに変える行為を意味する。
【００４０】
本明細書中で使用される場合は、「ＨＥＫ ２９３細胞」は、２９３（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１５７３）と指定されたヒトの胚腎臓細胞株またはその誘導体を意味する。例えば、２９３／ＳＦ細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１５７３．１）は、血清を含まない培地の中で増殖するように適応させられたＨＥＫ ２９３細胞である。他の培養条件下で増殖するように適応させられたＨＥＫ ２９３細胞、あるいは、外因性ＤＮＡで形質転換されるＨＥＫ ２９３細胞の任意の種または誘導体もまた、この形質転換体が本発明に記載される効率的なレオウイルスの生産をサポートする細胞の能力を損なわない限りは、本発明において意図される。
【００４１】
本明細書中で使用される場合は、細胞培養物への界面活性剤の添加後の「インキュベート」は、一定の期間の間、細胞培養物を界面活性剤と混合させる行為を意味する。
【００４２】
本明細書中で使用される場合は、「感染多重度」、すなわち「ＭＯＩ」は、細胞と接触させるためにウイルスが使用された場合には、細胞の数に対するウイルスの数の比を意味する。
【００４３】
本明細書中で使用される場合は、「非被包性ウイルス」は、非被包性を有していないウイルスである。例えば、非被包性ウイルスは、アデノウイルス科（Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、アデノウイルス）、ピコルナウイルス科（Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、ポリオウイルス）、レオウイルス科（Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、レオウイルス）、パポバウイルス科（Ｐａｐｏｖａｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、パピローマウイルス）、パルボウイルス科（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、キラムラットウイルス）、またはイリドウイルス科（Ｉｒｉｄｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、ｔｉｐｕｌａ ｉｒｉｄｅｓｃｅｎｔウイルス）に属する任意のウイルスであり得る。
【００４４】
本明細書中で使用される場合は、「レオウイルス」は、自然界に存在しているものであるか、修飾されたものであるか、または組み換え体であるかにはかかわらず、レオウイルス属に分類される任意のウイルスを意味する。レオウイルスは、二本鎖のセグメント化されたＲＮＡゲノムを含むウイルスである。ビリオンは６０〜８０ｎｍの直径であり、２つの同心のキャプシドの殻を有する。これらはそれぞれ、２０面体である。ゲノムは、１０〜１２の不連続なセグメントの二本鎖ＲＮＡからなり、ゲノム全体のサイズは１６〜２７ｋｂｐである。個々のＲＮＡｓｅグメントの大きさは様々である。３つの異なるが関連しているレオウイルスのタイプが、多くの種から回収されている。これらの３つのタイプの全てが共通している補体結合抗原を有する。
【００４５】
ヒトレオウイルスは３つの血清型から構成される：１型（Ｌａｎｇ株、すなわち、Ｔ１Ｌ）、２型（Ｊｏｎｅｓ株、Ｔ２Ｊ）、および３型（Ｄｅａｒｉｎｇ株またはＡｂｎｅｙ株、Ｔ３Ｄ）。これらの３つの血清型は、中和アッセイとヘマグルチニン阻害アッセイ（例えば、Ｆｉｅｌｄｓ，Ｂ．Ｎ．ｅｔ ａｌ．，１９９６）に基づいて容易に同定することができる。
【００４６】
レオウイルスは、自然界に存在しているものである場合も、また、修飾されている場合もある。レオウイルスは、それが自然界での供給源から単離でき、そして実験室においてヒトによって意図的に修飾されていない場合には「自然界に存在している」ものである。例えば、レオウイルスは、「現場の供給源（ｆｉｅｌｄ ｓｏｕｒｃｅ）」、すなわち、レオウイルスに感染したヒトに由来し得る。
【００４７】
レオウイルスは、２種類以上の遺伝的に異なるレオウイルスに由来するゲノムセグメントの組み換え／混ぜ合わせによって生じる、組み換え体レオウイルスであり得る。レオウイルスのゲノムセグメントの組み換え／混ぜ合わせは、少なくとも２種類の遺伝的に異なるレオウイルスでの宿主生物の感染後に、自然界で生じる場合がある。組み換え体ビリオンはまた、例えば、遺伝的に異なるレオウイルスでの感染に対して許容状態にある宿主細胞の同時感染によって、細胞培養物中で作成することもできる（Ｎｉｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，１９９５）。
【００４８】
したがって、本発明によって、２種類以上の遺伝的に異なるレオウイルス（ヒトレオウイルス（例えば、１型（例えば、Ｌａｎｇ株）、２型（例えば、Ｊｏｎｅｓ株）、および３型（例えば、Ｄｅａｒｉｎｇ株またはＡｂｎｅｙ株））、ヒト以外の哺乳動物のレオウイルス、または鳥類レオウイルスを含むが、これらに限定はされない）に由来するゲノムセグメントの混ぜ合わせによって得られる組み換え体レオウイルスが意図される。本発明によって、さらに、少なくとも一方のもとのウイルスが遺伝子操作されているか、１つ以上の化学合成されたゲノムセグメントを含むか、化学的もしくは物理的な突然変異誘発物質で処理されたか、またはそれ自体が組み換え事象の結果である、２種類以上の遺伝的に異なるレオウイルスに由来するゲノムセグメントの混ぜ合わせによって生じる組み換え体レオウイルスが意図される。本発明によって、さらに、化学的突然変異誘発物質（硫酸ジメチルおよび臭化エチジウムを含むが、これらに限定はされない）、物理的突然変異誘発物質（紫外線および他の形態の放射線を含むが、これらに限定はされない）の存在下で組み換えを受けた組み換え体レオウイルスが意図される。
【００４９】
本発明によって、さらに、１つ以上のゲノムセグメントに欠失または重複を含む組換え体レオウイルスが意図される。これには、宿主細胞のゲノムとの組み換えの結果としてのさらなる遺伝情報が含まれるか、または、合成の遺伝子が含まれる。
【００５０】
レオウイルスは、変異したコートタンパク質（例えば、σ１）の、ビリオンの外側のキャプシドへの組み込みによって修飾することができる。このタンパク質は、置換、挿入、または欠失によって変異させることができる。置換には、自然界に存在しているアミノ酸に代わる異なるアミノ酸の挿入が含まれる。挿入には、１つ以上の位置でのタンパク質へのさらなるアミノ酸残基の挿入が含まれる。欠失には、タンパク質の中の１つ以上のアミノ酸残基の欠失が含まれる。このような変異は、当該分野で公知の方法によって作成することができる。例えば、コートタンパク質の１つをコードする遺伝子のオリゴヌクレオチド部位特異的突然変異誘発によって、所望される変異体コートタンパク質の作成を生じることができる。レオウイルスに感染した哺乳動物細胞（例えば、ＣＯＳ１細胞）の中でのインビトロでの変異したタンパク質の発現によっては、レオウイルスのビリオン粒子への変異したタンパク質の組み込みが生じるであろう（Ｔｕｒｎｅｒ ａｎｄ Ｄｕｎｃａｎ，１９９２；Ｄｕｎｃａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１；Ｍａｈ ｅｔ ａｌ．，１９９０）。
【００５１】
本明細書中で使用される場合は、「細胞の生存性」または「なおも生存している細胞の割合」は、集団の中の細胞変性効果を示さない細胞の割合（％）である。
【００５２】
本明細書中で使用される場合は、「ウイルス感染」は、細胞へのウイルスの侵入と、その後の細胞内でのウイルスの複製を意味する。
【００５３】
方法
本発明者らは、ＨＥＫ ２９３細胞の中でのレオウイルスの増殖方法を以前に開発した（米国特許出願公開番号２００２００３７５７６）。レオウイルスは、ＨＥＫ ２９３細胞の中で複製し、感染の直後に細胞の中で高力価のウイルスを生じ、これによって、レオウイルスの簡単で効率的な生産方法を提供する。加えて、ＨＥＫ ２９３細胞を、大量に培養することができる懸濁液の中で増殖するように適応させ、そして本発明者らは大量生産方法を開発した。懸濁培養物からレオウイルスを単離するために、本発明者らは、最初に、従来方法にしたがってウイルス粒子を抽出し、精製した。簡単に説明すると、細胞を、凍結解凍によって破裂させ、ＦＲＥＯＮ（登録商標）（１，１，２−トリクロロ−１，１，２−トリフルオロ−エタン）で３回抽出した。その後、ウイルス粒子をＣｓＣｌ勾配と限外濾過によって精製した。しかし、このプロトコールは、大規模なウイルスの生産については面倒であり、時間がかかりすぎた。
【００５４】
したがって、本発明者らは、レオウイルスを抽出するための簡略化した方法を開発した。ＨＥＫ ２９３細胞培養物を界面活性剤とともに短時間インキュベートすることによって、高レベルの感染性レオウイルスが抽出物中に放出されることを発見した。その後、ウイルスを、サイズまたは密度の差に基づく簡単な分離方法（例えば、濾過、透析、またはサイズ排除）を用いて細胞の破片から分離することができ、そして得られたウイルスはレオウイルス治療に使用することができる。本発明にしたがって生産されたレオウイルスは、ヒトへの投与に適しており、そしてこのプロトコールは、界面活性剤の存在下で細胞を破裂させることについてのＦＤＡによる推奨と一致している。
【００５５】
本発明者らは、予備実験において４種類の界面活性剤を試験した：非イオン性界面活性剤オクトキシノール−９から１０（ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００）、オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＮＯＮＩＤＥＴ（登録商標）Ｐ４０またはＮＰ−４０）、およびポリエチレングリコールソルビタンモノラウレート（ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０）、ならびに、イオン性界面活性剤デオキシコール酸ナトリウム。これらの４種類の界面活性剤の全てが細胞を溶解させ、そしてバックグラウンドのレベルを上回って感染性ウイルス粒子を放出させることができたが、ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００が最も有効であった。他の界面活性剤（具体的には、細胞を破裂させるために一般的に使用されているもの）を同様に本発明で使用できることが意図される。これらの他の界面活性剤の例としては、他のＴＲＩＴＯＮ（登録商標）界面活性剤、他のＴＷＥＥＮ（登録商標）界面活性剤（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０）、ドデシル硫酸ナトリウム、ドデシル硫酸リチウム、および塩化ドデシルトリメチルアンモニウムが挙げられる。
【００５６】
これらの結果もまた、界面活性剤による抽出が、ウイルスの抽出のための標準的な手順である凍結解凍よりも効果的であり得ることを示している。加えて、レオウイルスが高度に細胞に結合しているＶｅｒｏ細胞から鳥類レオウイルスを抽出するためには、蒸留された脱イオン水が、凍結解凍、ＦＲＥＯＮ（登録商標）（１，１，２−トリクロロ−１，１，２−トリフルオロ−エタン）での抽出、またはトリプシン処理よりも効果的であったことが報告されている（Ｄｒａｓｔｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，１９９２）。本発明によって、より迅速で便利であり、なおも効果的なアプローチが提供される。なぜなら、これには、蒸留水を用いる方法に必要な細胞のペレット化とその後の再懸濁の必要はないからである。
【００５７】
高濃度の塩（例えば、塩化グアニジン）を、界面活性剤の代わりに本発明で使用できることが意図される。しかし、高濃度の塩よりも界面活性剤を使用することが好ましい。
【００５８】
したがって、本発明により、細胞培養物からウイルスを抽出する、迅速で簡単な方法が提供される。界面活性剤は、懸濁培養物に、または接着細胞の培地に対して直接添加することができる。いずれの場合にも、培地を迅速に取り除く必要はない。さらに、細胞を破裂させるか、またはウイルスを抽出する以外の手段（例えば、凍結解凍、または超音波処理）は必要ない。
【００５９】
本発明の重要な特徴は、抽出手順を、環境温度で、または環境温度よりも高い温度で行うことができることである。従来、ウイルスの抽出と精製は、タンパク質の構造と機能を保存するために低温（通常は、０〜４℃）で行われる。同じ理由のために、プロテアーゼ阻害因子もまた、通常は、抽出溶液に含められる。したがって、本発明のプロトコールを、プロテアーゼ阻害因子を全く使用することなく高温で行うことができることは驚くべきである。実際、３７℃のような高温で、２５℃の温度とほぼ同量の感染性ウイルスが得られた。結果として、ウイルスの抽出は、温度を変化させる必要なく、細胞培養物に直接界面活性剤を添加し、そしてウイルスを放出させるために培養物を攪拌し続けることによって、行うことができる。あるいは、本発明にしたがうウイルスの抽出のためには温度を一定に保つ必要はないので、この手順は、環境温度が場所によって変わっても、また、同じ場所で時間と共に変化しても、環境温度で行うことができる。
【００６０】
抽出の後、ウイルスは、例えば、ウイルスと抽出物中の他の構成成分との間でのサイズまたは密度の差に基づいて精製することができる。具体的には、濾過または遠心分離を、ウイルスから細胞の破片を取り除くために使用することができる。濾過条件を最適化するために、本発明者らは、いくつかの様々な抽出用界面活性剤の存在下での種々のフィルターの効果を試験した（実施例１）。段階的濾過のプロトコールが最も有効であることが立証された。したがって、比較的大きな孔サイズ（例えば、５μＭまたは８μＭ）を有するプレフィルターが、抽出混合物から大きな断片を取り除くために最初に使用され、その後、小さい孔サイズのフィルター（例えば、３μＭのフィルターおよび０．８μＭのフィルターを含む連結フィルターユニット）が使用される。プレフィルターがない場合には、抽出混合物は、フィルターをすぐに詰まらせ、これによって材料と時間のいずれもが無駄になる。別の実施形態においては、５μＭまたは８μＭのプレフィルターの工程の後に、０．８μＭの１つの孔サイズを有する１つのフィルターを使用することができる。
【００６１】
濾過後に回収された容量に基づいて、実施例１に示されるように、ウイルスの抽出のために１％のＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００を使用することが好ましい。加えて、酢酸セルロース膜フィルターは硝子繊維膜フィルターよりも優れている。なぜなら、酢酸セルロース膜フィルターは、多量の抽出混合物を濾過することができ、大量生産により適しているからである。
【００６２】
ウイルスの生産の目的に応じて、ウイルスを含む濾液を濃縮することが所望される場合がある。限外濾過／透析を使用する濃縮工程が、実施例２および４に示される。実施例２には、２種類の限外濾過／透析システム（Ｐａｌｌ Ｆｉｌｔｒｏｎの平板枠組みカセット（Ｐｌａｔｅ ａｎｄ Ｆｒａｍｅ Ｃａｓｓｅｔｔｅ）とＡ／Ｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙの中空繊維カートリッジ（Ｈｏｌｌｏｗ Ｆｉｂｅｒ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ））が試験された。結果は、これらの２種類のシステムは、それらの操作速度または損失容量の程度においては同等であるが、中空繊維カートリッジは操作がより容易であったことを示している。実施例４では、結果は、３００ｋＤａの分子カットオフを有する中空繊維カートリッジによって、その後の精製のために良好な材料が提供されることを示している。
【００６３】
ウイルスは、その表面電荷に基づいてさらに精製することができる。それぞれのウイルスは様々な表面タンパク質を有する（これによって、任意の所定のｐＨにそれらの表面電荷が決定される）ので、精製に適している条件を個々のウイルスについて決定しなればならない。実施例３には、レオウイルスについての最適なイオン交換条件の決定が説明される。したがって、様々な樹脂を含むイオン交換カラムが、抽出されたレオウイルス調製物を精製するために種々のｐＨで使用され、上記のように濾過され、そして濃縮された。結果は、ｐＨ ７．０〜８．５のＡＮＸ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）を含む弱い陰イオンカラムが最も有効であることを示している。ｐＨは、約７．５または８．０であることが好ましく、最も好ましくは、約８．０である。
【００６４】
ウイルスはまた、大きさの差に基づいて、例えば、サイズ排除クロマトグラフィーで精製することもできる。レオウイルスについては、イオン交換クロマトグラフィーとサイズ排除クロマトグラフィーの組み合わせが特に有効である。好ましくは、陰イオン交換カラムが、サイズ排除クロマトグラフィーの前に使用される。結合／溶出緩衝液中のマグネシウム塩を回避することもまた好ましい。Ｔｒｉｓをベースとする緩衝液ではなく、リン酸緩衝液を使用することにより、結合および選択性が改善する。他のクロマトグラフィー方法（例えば、親和性または疎水性相互作用に基づくクロマトグラフィー）もまた、適切である場合には使用することができる。したがって、カラムクロマトグラフィーを、良好な収量、純度、および拡張性を達成するために、ＣｓＣｌ密度勾配超遠心分離に代わる有効なものとして採用することができる。
【００６５】
本発明の方法は、ＨＥＫ ２９３細胞以外の細胞（マウスＬ９２９細胞、Ｖｅｒｏ細胞、およびチャイニーズハムスター卵巣細胞を含むが、これらに限定はされない）を使用するレオウイルスの生産に適用することができる。本発明の方法が、同様に他のウイルス（特に、他の非被包性ウイルス）にも適用されることが意図される。他のウイルスの精製に適している条件は、当業者であれば本明細書の開示に基づいて決定することができる。本発明の方法を使用して調製することができるウイルスとしては、以下のファミリーのウイルスが挙げられるが、これらに限定はされない：ミオウイルス科（ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）、シフォビラーダ科（ｓｉｐｈｏｖｉｒｉｄａｅ）、ポドウイルス科（ｐｏｄｐｖｉｒｉｄａｅ）、テクティウイルス科（ｔｅｃｉｖｉｒｉｄａｅ）、コルチコウイルス科（ｃｏｒｔｉｃｏｖｉｒｉｄａｅ）、プラズマウイルス科（ｐｌａｓｍａｖｉｒｉｄａｅ）、リポスリクスウイルス科（ｌｉｐｏｔｈｒｉｘｖｉｒｉｄａｅ）、フセロウイルス科（ｆｕｓｅｌｌｏｖｉｒｉｄａｅ）、ポックスウイルス科（ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ）、イリドウイルス科（ｉｒｉｄｏｖｉｒｉｄａｅ）、フィコドナウイルス科（ｐｈｙｃｏｄｎａｖｉｒｉｄａｅ）、バキュロウイルス科（ｂａｃｕｌｏｖｉｒｉｄａｅ）、ヘルペスウイルス科（ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ）、アデノウイルス科（ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ）、パポバウイルス科（ｐａｐｏｖａｖｉｒｉｄａｅ）、ポリドナウイルス科（ｐｏｌｙｄｎａｖｉｒｉｄａｅ）、イノウイルス科（ｉｎｏｖｉｒｉｄａｅ）、ミクロウイルス科（ｍｉｃｒｏｖｉｒｉｄａｅ）、ジェミニウイルス科（ｇｅｍｉｎｉｖｉｒｉｄａｅ）、サーコウイルス科（ｃｉｒｃｏｖｉｒｉｄａｅ）、パルボウイルス科（ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ）、ヘパドナウイルス科（ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ）、レトロウイルス科（ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）、シクトウイルス科（ｃｙｃｔｏｖｉｒｉｄａｅ）、レオウイルス科（ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ）、ビルナウイルス科（ｂｉｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）、パラミクソウイルス科（ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）、ラブドウイルス科（ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ）、フィロウイルス科（ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ）、オルトミクソウイルス科（ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）、ブンヤウイルス科（ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ）、アレナウイルス科（ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ）、レビウイルス科（ｌｅｖｉｖｉｒｉｄａｅ）、ピコルナウイルス科（ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）、セキウイルス科（ｓｅｑｕｉｖｉｒｉｄａｅ）、コモウイルス科（ｃｏｍｏｖｉｒｉｄａｅ）、ポティウイルス科（ｐｏｔｙｖｉｒｉｄａｅ）、カルシウイルス科（ｃａｌｃｉｖｉｒｉｄａｅ）、アストロウイルス科（ａｓｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）、ノダウイルス科（ｎｏｄａｖｉｒｉｄａｅ）、テトラウイルス科（ｔｅｔｒａｖｉｒｉｄａｅ）、トンブスウイルス科（ｔｏｍｂｕｓｖｉｒｉｄａｅ）、コロナウイルス科（ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ）、グラビウイルス科（ｇｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）、トガウイルス科（ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ）、およびバルナウイルス科（ｂａｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）。
【００６６】
組成物
本発明の方法にしたがって調製されたウイルスを含む組成物もまた提供される。これらの組成物は、ウイルスタンパク質の単離および特性決定、ワクチンの生産、または、組成物に感染性ウイルスが含まれる場合には、ウイルスのストックとして、あるいは臨床投与において使用することができる。
【００６７】
臨床投与の目的のためには、組成物は、通常、賦形剤と混合されるか、賦形剤で希釈されるか、または担体（これは、薬学的組成物としての、カプセル、小袋、紙容器または他の容器（ＷＯ９９／０８６９２Ａ１）の形態であり得る）の中に封入される。薬学的に許容される賦形剤が希釈剤としての役割を担う場合は、これは固体の物質であっても、半固体の物質であっても、または液体の物質であってもよく、これは、有効成分についての媒介物（ｖｅｈｉｃｌｅ）、担体、または媒体として作用する。したがって、組成物は、錠剤、丸剤、散剤、トローチ剤、小袋に入った薬、カシェ剤、エリキシル剤、懸濁剤、エマルジョン、液剤、シロップ剤、エアゾール（固体として、または液体の媒体中のもの）、例えば１０重量％までの活性のある化合物を含む軟膏、軟ゼラチンおよび硬質ゼラチンカプセル、坐剤、滅菌の注射可能な液剤、および滅菌のパッケージされた散剤の形態であり得る。
【００６８】
適切な賦形剤のいくつかの例としては、乳糖、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギン酸塩、トラガカント、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、滅菌水、滅菌生理食塩水、シロップ、およびメチルセルロースが挙げられる。処方物にはさらに、潤滑剤（例えば、タルク、ステアリン酸マグネシウム、およびミネラルオイル）；湿潤剤：乳化剤および懸濁剤；保存剤（例えば、安息香酸メチルおよびプロピルヒドロキシ安息香酸）；甘味剤；ならびに香味剤を含めることができる。本発明の組成物は、当該分野で公知の手順を使用することによる患者への投与後に、有効成分の迅速な放出、徐放、またはゆっくりとした放出を提供するように処方することができる。
【００６９】
レオウイルスが投与される経路、ならびに、処方物、担体、または媒介物は、標的細胞の位置ならびにタイプに応じて様々であろう。多種多様の投与経路を使用することができる。例えば、接触可能な固形の新生物については、レオウイルスを新生物への直接の注射によって投与することができる。造血系新生物については、例えば、レオウイルスを静脈内または脈管内に投与することができる。体内の容易には接触できない新生物（例えば、転移）については、レオウイルスは、哺乳動物の体全体に全身的に輸送することができ、それによって新生物に達することができる様式で（例えば、静脈内または筋肉内に）投与される。あるいは、レオウイルスは、１つの固体の新生物に直接投与することができ、これはその後、転移に、体全体を通じて全身的に運ばれる。レオウイルスはまた、皮下、腹腔内、髄腔内（例えば、脳腫瘍について）、局所（例えば、黒色腫について）、経口（例えば、口腔腫瘍または食道腫瘍について）、直腸（例えば、結腸直腸腫瘍について）、膣（例えば、子宮頸腫瘍または膣腫瘍について）、鼻または吸入噴霧によって（例えば、肺腫瘍について）投与することができる。好ましくは、レオウイルスは注射によって投与される。
【００７０】
本発明の薬学的組成物を経口投与のために、または注射による投与のために取り込ませることができる液体形態としては、水性の溶液、適切に香味付けしたシロップ、水性または油性懸濁液、および食用油（例えば、トウモロコシ油、菜種油、ゴマ油、ココナッツ油、またはピーナッツ油）で香味付けしたエマルジョン、さらには、エリキシル剤、ならびに同様の薬学的媒介物が挙げられる。
【００７１】
錠剤のような固体の組成物を調製するためには、主たる有効成分／レオウイルスは、本発明の化合物の均質な混合物を含む固体の予備処方組成物を形成するように、薬学的賦形剤と混合される。これらの予備処方組成物について均質であると言う場合には、これは、有効成分が組成物全体に均一に分散させられていることを意味する。その結果、組成物は、錠剤、丸剤、およびカプセル剤のような、等しい有効単位投与量形態に容易に分けることができる。
【００７２】
本発明の錠剤または丸剤はコーティングすることができ、また別の方法で調合して、長時間にわたる作用の利点を提供する投与量形態を提供することができる。例えば、錠剤または丸剤には、内部投与量成分と外部投与量成分が含まれ得、後者は、前者のまわりの非被包性の形態である。２つの成分は、胃での消化に抵抗するように作用する腸溶性の層によって分離することができ、これによって、内部成分を完全な状態のまま十二指腸にまで通過させるか、または放出を遅らせることができる。種々の材料を、このような腸溶性の層またはコーティングに使用することができる。このような物質としては、多数のポリマー酸、ならびに、シェラック、セチルアルコール、および酢酸セルロースのような物質とのポリマー酸の混合物が挙げられる。
【００７３】
吸入または吹送のための組成物としては、薬学的に許容される水性もしくは有機溶媒、またはその混合物中の溶液および懸濁液、ならびに散剤が挙げられる。液体または固体組成物には、本明細書中に記載される適切な薬学的に許容される賦形剤を含めることができる。好ましくは、組成物は、局所効果または全身的効果のために、経口または鼻呼吸経路によって投与される。好ましい薬学的に許容される溶媒中の組成物は、不活性ガスの使用によってネブライザーで投与することができる。ネブライザーで投与される溶液は、噴霧デバイスから直接吸入することも、また、噴霧デバイスを、フェイスマスクテント（ｆａｃｅ ｍａｓｋ ｔｅｎｔ）に、もしくは間欠的な陽圧呼吸器に取り付けることもできる。溶液、懸濁液、または粉末組成物は、適切な様式で処方物を送達するデバイスによって、好ましくは、経口または鼻腔に投与することができる。
【００７４】
本発明の方法に使用される別の好ましい処方物には、経皮送達デバイス（「パッチ」）が使用される。このような経皮パッチは、管理された量の本発明のレオウイルスの連続的または断続的な注入を提供するために使用することができる。医薬品の送達のための経皮パッチの構成および使用は、当該分野で周知である。例えば、米国特許第５，０２３，２５２号（引用により本明細書中に組み入れられる）を参照のこと。このようなパッチは、医薬品の連続的送達、パルス送達、または求めに応じた送達のために構築することができる。
【００７５】
本発明で使用される他の適切な処方物は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓに見ることができる。
【００７６】
以下の実施例は本発明を説明するために提供され、そして決して本発明の範囲の限定とは解釈されない。
【実施例】
【００７７】
以下の実施例では、以下の略語は以下の意味を有する。定義しない略語は、それらの一般的に受け入れられている意味を有する。
【００７８】
ＣＩＰ＝定置洗浄
ＣＶ＝カラム容量
ＣＩ＝信頼区間
℃＝セ氏温度
ＤＦ＝透析
ＤＴＴ＝ジチオスレイトール（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｉｅｔｏｌ）
ＦＢＳ＝ウシ胎児血清
ｇ／Ｌ＝１リットル当たりのグラム数
ｈｒ＝時間
β−ＭＥ＝β−メルカプトエタノール
μｇ＝マイクログラム
μｌ＝マイクロリットル
μＭ＝マイクロモル
ｍＡＵ＝ミリ吸光度単位
ｍｇ＝ミリグラム
ｍｌ＝ミリリットル
ｍＭ＝ミリモル
Ｍ＝モル
ＭＯＩまたはｍ．ｏ．ｉ．＝感染多重度
ＮＰ−４０＝ＮＯＮＩＤＥＴ（登録商標）Ｐ−４０（オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）
ＰＢＳ＝リン酸緩衝化生理食塩水
ＰＦＵ＝プラーク形成単位
ｒｐｍ＝１分あたりの回転数
ＳＥＣ＝サイズ排除クロマトグラフィー
ＳＤＳ＝ドデシル硫酸ナトリウム
ＴＣＩＤ５０＝組織培養物感染量５０
ＵＦ＝限外濾過
一般的な材料および方法（特に明記しない限り）
細胞およびウイルス
ヒト胚腎臓２９３（ＨＥＫ ２９３）細胞およびマウス線維芽細胞Ｌ−９２９細胞は、製造業者ＢｉｏＲｅｌｉａｎｃｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄ）によって提供された。ＨＥＫ ２９３細胞は、１０％の熱で不活化させたウマ血清と９０％の以下の混合物を含む培養培地の中で増殖させた：２ｍＭのＬ−グルタミンを含むＥａｇｌｅ最小必須培地と、１．５ｇ／Ｌの重炭酸ナトリウム、０．１ｍＭの必須ではないアミノ酸、および１．０ｍＭのピルビン酸ナトリウムを含むように調整したＥａｒｌｅ平衡化塩溶液。マウスＬ−９２９細胞は、１０％のＦＢＳと、９０％の以下の混合物を含む培養培地の中で増殖させた：２ｍＭのＬ−グルタミンを含むＥａｇｌｅ最小必須培地と、１．５ｇ／Ｌの重炭酸ナトリウム、０．１ｍＭの必須ではないアミノ酸、および１．０ｍＭのピルビン酸ナトリウムを含むように調整したＥａｒｌｅ平衡化塩溶液。
【００７９】
２９３／ＳＦ細胞を、４ｍＭのＬ−グルタミンを補充した血清を含まない２９３培地（２９３ Ｓｅｒｕｍ Ｆｒｅｅ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．））の中で、３６℃±２℃、６％±２％のＣＯ２および８０％±５％の相対湿度で、３５〜４０ｒｐｍの推進速度のスピナーフラスコの中で増殖させた。
【００８０】
これらの実験に使用した血清３型レオウイルスのＤｅａｒｉｎｇ株は、β−メルカプトエタノール（β−ＭＥ）を抽出緩衝液から省略したことを除いて、Ｓｍｉｔｈ（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，１９６９）にしたがって精製したＬ−９２９細胞の懸濁培養物中で、最初に増殖させた。精製したレオウイルスについての粒子／ＰＦＵ比は、通常は、１００／１であった。ウイルス力価をＬ−９２９細胞上でのプラークの滴定によって決定し、Ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍｌとして表した。その後、ウイルスを、２９３／ＳＦ細胞中で大体量に生産させた。
【００８１】
懸濁細胞の感染
２９３／ＳＦ細胞を１０６／ｍｌまで増殖させ、そしてレオウイルスに感染させた。培養物を、培地の色が赤色からオレンジ色に変わるまで、または、細胞の生存性が生存している細胞数によって証明される所望されるレベルに下がるまで、増殖させた。生存している細胞のカウントは、細胞変性効果（これは、細胞が外見において膨張して顆粒状になり、細胞塊が破裂することによって示される）を示さない細胞について顕微鏡下で行うことができる。生存している細胞のカウントはまた、当該分野で一般的に使用されているような、生存能力についての染色によって行うこともできる。
【００８２】
所望される細胞の生存性レベルに達した時点で、細胞を遠心分離によってペレット状にし、１０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．４）、２５０ｍＭのＮａＣｌ、および０．１％のＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００の中に再度懸濁させた。その後、細胞を、凍結解凍によって溶解させ、定期的にボルテックスして細胞を混合しながら氷上で２０〜４０分間維持し、細胞を溶解させた。懸濁液を、予め冷却しておいた等量のＦＲＥＯＮ（登録商標）（１，１，２−トリクロロ−１，１，２−トリフルオロ−エタン）で、１０分間ボルテックスすることによって抽出し、その後、４℃で２５００ｒｐｍで１０分間遠心分離して種々の相を分離させた。水相（上部）を取り出し、上記に記載したように２回再度抽出し、そしてウイルスを、４℃で１時間の２５，０００ｒｐｍでの超遠心分離によってペレット状にした。
【００８３】
ウイルスの抽出および精製のための従来法
ペレットをＰＢＳに再度懸濁させ、ウイルスを塩化セシウムの段階的勾配によって精製した。勾配には、１０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．４）の中に調製した２層のＣｓＣｌ溶液（それぞれ、１．２０ｇ／ｍｌおよび１．４ｇ／ｍｌ）を含めた。ウイルス懸濁液を勾配の上にロードし、そしてＳＷ ２８．１ローターの中で、４℃で２時間、２６，０００ｒｐｍで遠心分離した。ウイルスのバンド（２つのバンドのうちの下の方、なぜなら、上部のバンドには空のキャプシドが含まれているので）を回収し、滅菌したＰＢＳに対して透析した。
【００８４】
ＢＥＮＺＯＮＡＳＥ（登録商標）エンドヌクレアーゼ処理
細胞を界面活性剤で溶解させた後、５０ｍＭのＭｇＣｌ２の溶液を、１ｍＭのＭｇＣｌ２の最終濃度となるように粗溶解物に添加した。その後、ＢＥＮＺＯＮＡＳＥ（登録商標）エンドヌクレアーゼ（２５０，０００単位／ｍｌ、ＥＭ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓカタログ番号１０１６９７９Ｍ）を、およそ１０単位／ｍｌとなるように添加した。溶解物を３６℃で１時間、インキュベーターの中で攪拌した。
【００８５】
（実施例１）
明澄化：細胞の破片の除去
本実施例の目的は、細胞を溶解させるために界面活性剤を使用するプロトコールと適合し、さらに将来のスケールアップおよび製造がしやすい、適切な明澄化手順を開発することであった。本実施例においては、溶解物を、３μｍ／０．８μｍのカプセルフィルターを通すか、またはプレフィルター（５μｍもしくは８μｍ）と、その後の３μｍ／０．８μｍのカプセルフィルターの組み合わせを通過させるかのいずれかによって濾過した。本実験に使用したフィルターは全て、０．０１５ｆｔ２の表面積を有していた。０．０１５ｆｔ２膜を通して濾過した容量に基づいて、膜の能力を、大規模な濾過について決定した。また、濾過効率を、２種類の異なる膜材質（３μｍ／０．８μｍのカプセルフィルターについて酢酸セルロース膜と硝子繊維膜）を比較した。
【００８６】
３種類の界面活性剤を試験した。レオウイルスを有する細胞を、試験する以下の３種類の溶解剤についてラベルした３つの滅菌した１Ｌのボトルに等量に分けた：１％のＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００、０．３％のＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００、および０．１％のＮａ−ＤＯＣ。９２ｍＬと２８ｍＬの容量の１０％のＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００をボトル１および２に添加して、これらのボトルの中の作業濃度を、それぞれ、１％および０．３％のＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００とした。９．２ｍＬの容量の１０％のＮａ−ＤＯＣを第３のボトルに添加して、作業濃度を０．１％とした。これらのボトルを全て攪拌プレートの上に置き、室温で３０分間、１６０±２０ｒｐｍで攪拌した。溶解後の試料を、力価の分析のために個々の溶解条件について採取した。
【００８７】
約２０ｍＬの５０ｍＭのＭｇＣｌ２を、個々のボトルの中の粗溶解物に添加して、作業濃度をおよそ１ｍＭのＭｇＣｌ２とした。その後、これに４０μＬのＢＥＮＺＯＮＡＳＥ（登録商標）エンドヌクレアーゼ（２５０，０００単位／ｍＬ）を添加して、作業濃度をおよそ１０単位／ｍＬとした。粗溶解物を、３６℃のインキュベーターの中で１時間、５の設定で攪拌した。これらの工程は、宿主細胞のＤＮＡを取り除くため、および溶解物の粘性を低下させ、これによってさらなる処理を容易にするために含めた。
【００８８】
Ｗａｔｓｏｎ−Ｍａｒｌｏｗポンプ（５０５Ｕ）を、ポンプ速度に対して流速を合致させるために調整した。製造供給元による示唆にしたがって、５ｒｐｍのポンプ速度（４０ｍＬ／分の流速）を、明澄化実験全体を通じて使用した。
【００８９】
個々の処理条件による溶解物を、以下のフィルターの１つに通過させた：
１）３μｍ／０．８μｍのカプセルフィルター；
２）連結させたプレフィルター５μｍのサイズ → ３μｍ／０．８μｍのカプセルフィルター；および
３）連結させた孔サイズ８μｍのプレフィルター、３μｍ／０．８μｍのカプセルフィルター。
【００９０】
３μｍ／０．８μｍのカプセルフィルターは二重層構造の不均質な膜構成を有しており、これによって、高いダート積載能力と高い処理能力が得られる。第１のフィルターは、第２のフィルター（０．８μｍ）よりも大きな孔サイズ（３μｍ）を有するフィルターである。プレフィルターは、多層の、徐々に細かい襞になるように折り畳まれた不織ポリプロピレンデプスフィルター材料が組み合わせられている。本実験で使用したフィルターは全て、０．０１５ｆｔ２の表面積を有していた。２種類の膜材質、すなわち、酢酸セルロースと硝子繊維を、３μｍ／０．８μｍのカプセルフィルターについて試験した。
【００９１】
溶解剤とフィルター条件の最良の組み合わせを、滴定値とフィルターを通過した容量に基づいて決定した。膜を通過する圧力の低下を、膜の詰まりが生じた時点を決定するためにモニターした。膜付着物の兆候は２５ｐｓｉの圧力低下であり、これを超えるとフィルターは破れる可能性がある。３μｍ／０．８μｍのカプセルフィルターを単独で使用した場合には、膜が詰まるまでに、わずか３５ｍＬしかこれらのカプセルフィルターを通過できなかった。３／０．８μｍのサイズの膜は５分以内に詰まり、これは、プレフィルターの使用が細胞の破片による膜の凝固をなくすためには不可欠であることを示唆している。３／０．８μｍのカプセルフィルターの前に５μｍのプレフィルターを使用することによって、得られる濾過量は大幅に大きくなったが、８μｍのプレフィルターを通過し、その後に３μｍ／０．８μｍのカプセルフィルターを通過した濾過によっては、膜を通過した容量に関して最も高い膜能力が得られた（０．０１５ｆｔ２のフィルターの表面積あたり２００ｍＬの平均が回収された）。１％のＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００が、他の２種類の溶解条件と比較すると最良の結果を生じた。
【００９２】
結果はまた、これらの膜を通して濾過した容量に基づくと、酢酸セルロース膜材料が硝子繊維膜よりもうまく作用したことを示している。感染力についての有意なロスは、バルクの回収物（溶解および濾過前の細胞培養物）の感染力と比較しても、濾過のいずれの段階においても観察されなかった。これらの実験の結果に基づくと、２０Ｌのバルクの回収物には、濾過のために１．５ｆｔ２の膜表面積が必要である。
【００９３】
（実施例２）
濃度
明澄化した溶解物を濃縮し透析するための適切なシステムを選択するために、Ｐａｌｌ
Ｆｉｌｔｒｏｎの平板枠組み（Ｐｌａｔｅ ａｎｄ Ｆｒａｍｅ）カセット（ｗｗｗ．ｐａｌｌ．ｃｏｍ）とＡ／Ｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙの中空繊維（Ｈｏｌｌｏｗ Ｆｉｂｅｒカートリッジ（ｗｗｗ．ａｇｔｅｃｈ．ｃｏｍ）を比較した。同じポリエーテルスルホン膜材料を両方のシステムに使用した。選択の基準は、使い勝手のよさ、達成される濃縮の程度、および生成物のウイルス力価とした。
【００９４】
本実験で使用した平板枠組みカセットは、研究室用のベンチトップ型のユニットであるＰａｌｌのＭＩＮＩＭシステムと、２つの吊り下げられたスクリーンチャンネル３００ｋＤ限外濾過膜（Ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｍｅｍｂｒａｎｅ（それぞれ、０．２ｆｔ２））を含むＬＶ Ｃｅｎｔｒａｍａｔｅであった。明澄化した溶解物を濃縮する前に、装置を２ＬのＲｅｖｅｒｓｅ Ｏｓｍｏｓｉｓ（ＲＯ）水（ＵＳＰグレード）でリンスして、保管用ゲルを洗い流した。カセットを２Ｌの温めた０．１ＮのＮａＯＨで消毒した。その後、システムを排水し、２ＬのＲＯ水でリンスし、そしてウイルス用の増殖培地でコンディショニングした。システム全体を排水し、システムと配管のホールドアップ容量を６ｍＬと決定した。
【００９５】
本実験で試験した中空繊維カートリッジは、Ａ／Ｇ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙのＱＵＩＸＳＴＡＮＤ（登録商標）Ｂｅｎｃｈｔｏｐ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｓｉｚｅ ４Ｍカラム限外濾過カートリッジ（Ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ）（６５０ｃｍ２の表面積）である。平板枠組みカセットと同様に、装置を最初に２ＬのＲｅｖｅｒｓｅ
Ｏｓｍｏｓｉｓ（ＲＯ）水（ＵＳＰグレード）を勢いよく流して、保管用ゲルを洗い流した。カセットを２Ｌの温めた０．１ＮのＮａＯＨで消毒した。その後、システムを排水し、２ＬのＲＯ水でリンスし、そしてウイルスの増殖培地を勢いよく流すことによってコンディショニングした。６００ｍＬ／分の一定の流速を、実験を通じて使用した。
【００９６】
両方のシステムに、明澄化した溶解物を、材料が約２５０ｍＬに濃縮される（１０倍濃縮）まで再循環させ、試料を滴定分析した（１回目の濃縮後（Ｐｏｓｔ Ｉ−Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ））。濃縮物（保持物）を１Ｌ（５倍の透析容量）の透析緩衝液（Ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ）（２０ｍＭのＴｒｉｓ＋０．２ＭのＮａＣｌ＋１ｍＭのＭｇＣｌ２、ｐＨ８．０±０．１）に対して透析し、別の試料を滴定分析のために採取した（透析後（Ｐｏｓｔ−Ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ））。保持物をさらに約１２０ｍＬにまで濃縮した。最後の濃縮の後、生成物をシステムから排出させて、１つの滅菌容器に回収した（最後の濃縮後（Ｐｏｓｔ−ｆｉｎａｌ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ））。その後、システムを４０ｍＬの透析緩衝液でリンスして、最大量の生成物の回収を確実にした。
【００９７】
中空繊維システムと平板枠組みシステムの両方を用いた濃縮プロセスの間にモニターした処理パラメーターを表１に示す。
【００９８】
【表１】
膜間圧（ＴＭＰ）は、中空繊維での処理の間は８ｐｓｉ未満に留まったが、平板枠組みで処理した場合には、ＴＭＰは３０ｐｓｉには上昇した。中空繊維システムにより大きな膜表面積を使用すると、おそらく、カートリッジの詰まりはあまり生じなかった。
【００９９】
約２０倍の濃縮が、４時間、平板枠組みカセットを用いることによって達成されたが、中空繊維カートリッジを使用した場合には、３時間で１４倍の濃縮が得られ、本発明者らは、さらに３０分間で２０倍の濃縮を得た。両方のシステムの溶解後の値と比較すると、生成物の４５〜５０％のロスがあった。中空繊維カートリッジの設定は平板枠組みカセットよりも容易であった。したがって、中空繊維カートリッジが、取り扱いやすさに基づくと、限外濾過および透析工程により適しているシステムである。
【０１００】
（実施例３）
イオン交換
ウイルスは、それらの様々な表面分子が原因で異なる表面電荷を有する。したがって、イオン交換クロマトグラフィーを使用してウイルスを精製することが可能であり、条件はウイルスの性質に応じて変化するであろう。したがって、本発明者らは、レオウイルスの精製について、種々のｐＨのイオン交換クロマトグラフィー条件を試験した。レオウイルスを、上記のように生産させ、抽出し、濾過し、そして様々なｐＨでのイオン交換クロマトグラフィーを行った。それぞれの工程の後で力価を決定し、これを以下の表２に示す。
【０１０１】
【表２】
したがって、ｐＨ７．０〜９．０によって、他のｐＨよりも多量のレオウイルスが得られた。この工程で使用するｐＨは、好ましくは、７．５〜８．５であり、ｐＨ８．０が特に好ましい。陽イオン交換体と陰イオン交換体のいずれもがうまくいったが、陰イオン交換体が一般的にはより有効であった。
【０１０２】
（実施例４）
拡張性のある精製プロトコール
レオウイルスは、ｒａｓ経路が活性化させられている細胞に特異的に感染するエンテロウイルスである。ｒａｓ経路の活性化は、多種多様なタイプのガンに共通している特徴であるので、血清３型レオウイルスは、細胞株、動物モデルにおいて、さらには臨床でも、種々の腫瘍の退行を生じることが示されている。臨床第ＩＩ／ＩＩＩ期試験のために大量の感染性ウイルスを生産する要求に応じるために、濾過およびクロマトグラフィーをベースとするアプローチを開発した。本発明者らは、細胞培養物から活性のあるウイルスを精製するための完全に拡張性のあるプロセスの開発を、本明細書中で報告する。３工程のプロセスには、限外濾過工程、陰イオン交換による精製、および処方緩衝液への基の分離から構成される。このプロセスを、２０リットルのバイオリアクターのスケールにまでスケールアップし、ＧＭＰ設備での生産に移行させた。このプロセスの全体の回収率は＞５０％であり、最終的な純度は２回の連続する塩化セシウム遠心分離工程によって得られる物質に匹敵する。
【０１０３】
材料および方法
クロマトグラフィー：全ての精製実験は、Aｋｔａ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ １００システ
ムで行い、画分を画分回収装置Ｆｒａｃ ９５０を通じて回収した。２８０、２６０、および２１５ｎｍでのＵＶ，さらには、伝導率とｐＨを、日常的に行われている方法でモニターした。全てのクロマトグラフィー媒体と装置は、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから入手した。
【０１０４】
ＳＤＳ ＰＡＧＥ：全てのＳＤＳ ＰＡＧＥ材料はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手した。４〜１２％のＳＤＳ ＰＡＧＥゲルを使用し、製造業者の説明書にしたがって泳動した。全ての試料を、電気泳動の前に６５℃で１０分間変性させた。
【０１０５】
全長のレインボーマーカーを大きさの標準物として使用した（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）。
【０１０６】
ＳＤＳ ＰＡＧＥの染色：銀染色試薬はＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから入手した。コロイドクマシー染色は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手した。染色試薬のそれぞれについて、製造業者の説明書にしたがった。銀染色の発色工程は、ゲルを過度染色のために８分間そのままの状態を維持して、確実に残っている混入物質が明確に見えるようにした。
【０１０７】
ウェスタンブロッティング：ＳＤＳ ＰＡＧＥゲルは、ゲルの一方をＥＣＬニトロセルロースに移動させることができるように、２連で行った。トランスファー緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を除いて、全ての試薬とブロッティング装置はＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから入手した。ゲルを、２０％のメタノールで４５Ｖで４０分かけてブロットした。移動の完成度を、染色したマーカーの移動によってチェックした。膜を脱脂乳（その地の食料品店）の中で一晩ブロックし、そして脱脂乳０．２％のＴｗｅｅｎの中で１：２００００に希釈したポリクローナルヤギ抗体とともにインキュベートした。ブロットを、過剰量のＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ ０．２％で５分×３回リンスし、その後、１：１０００００で、モノクローナル抗ヤギＨＲＰ抗体（Ｓｉｇｍａ）ともにインキュベートした。ブロットを上記のようにリンスし、その後、製造業者の説明書にしたがってＥＣＬ検出試薬で発色させた。その後、ブロットを、Ｋｏｄａｋ ＢｉｏＭａｘ Ｌｉｇｈｔフィルムに３０秒間、１分間、５分間など露光させ、そしてフィルムを、製造業者の説明書にしたがって、ＧＢＸ現像液および定着剤（Ｋｏｄａｋ）を用いて手作業で現像した。
【０１０８】
ＲＮＡの単離：試料を、ＲＮＡＷｉｚａｒｄ（Ａｍｂｉｏｎ）での各画分の０．５ｍｌの試料からのＲＮＡの抽出によって、ＲＴ−ＰＣＲのために調製した。製造業者のプロトコールにしたがい、そしてＲＮＡのペレットをＤＥＰＣで処理した水に再度懸濁させて、最終容量を０．１ｍｌとした。１ｍｌの各試料、ならびに１：１０希釈物を、ＲＴ−ＰＣＲによる増幅に使用した。
【０１０９】
ＰＣＲ試料のアガロースゲル電気泳動：ＰＣＲ反応物を４％のＥＺゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上で、１：１００００希釈でＶｉｓｔｒａＧｒｅｅｎ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含む２０ｍｌの６×ローディング色素と５０％のグリセロールを添加することによって、分析した。２０ｍｌをそれぞれのウェルに載せ、そして５０ｂｐのラダー（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を、サイズ標準物として使用した。
【０１１０】
ＰＣＲバンドの検出：全てのゲルを、６５０ ＰＭＴのエチジウムブロマイド設定と、５０ミクロンの解像度の通常の感度調整で、Ｔｙｐｈｏｏｎ ９６００スキャナー上でスキャンした。
【０１１１】
Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、AＫＴＡｅｘｐｌｏｒｅｒ、Ｕｎｉｃｏｒｎ、ＨＲ、Ｉｍａｇｅ
Ｑｕａｎｔ，Ｖｉｓｔｒａ Ｇｒｅｅｎ、および Ｔｙｐｈｏｏｎは、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅの登録商標である。ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅは、Ｇｅｎｅｒａｌ Ｅｌｅｃｔｒｉｃの登録商標である。
【０１１２】
Ｅ−ｇｅｌおよびＮｏｖｅｘ ｇｅｌは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐの登録商標である。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ ａｎｄ Ｆ．Ｈｏｆｆｍａｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ｌｔｄが所有する特許の適用を受けている。
【０１１３】
プロセスの開発：染色材料についての記載
レオウイルスは、２０面体の対称性と周知のタンパク質組成を有する、非被包性の二本鎖のＲＮＡウイルスである。これは、約８５ｎｍの直径と、約１２６，０００，０００ダルトンの分子量を有する。クロマトグラフィーマトリックスに対するウイルスの結合特性を決定する外側のキャプシドは、７６．３ｋＤａの分子量を有する主要な外側のキャプシドタンパク質λ１の６００個のコピー、外側のキャプシドのビルディングブロックが実際にμ１σ３のヘテロ６量体を作り上げる主要な外側のキャプシドタンパク質σ３の６００個のコピーから構成されている。加えて、３６コピーの主要ではない外側のキャプシドタンパク質σ１もまた、ホモ３量体としてウイルスの表面上で見られる。σ１は細胞表面へのウイルスの付着を媒介する。３つの外側のキャプシドタンパク質σ３、σ１、およびμ１は、それぞれ、５．２、５．２、および６．６の等電点を有する。内側のキャプシドは、１２０コピーのλ１（２量体）、６０コピーのλ２（５量体として）、および２４コピーのμ１から構成されている。コアは、１２コピーのλ３、ＲＮＡポリメラーゼ、および１２０コピーのσ２、主要なコアタンパク質から構成されている。全てのλタンパク質は、およそ１２０ｋＤａ、μタンパク質はおよそ８０ｋＤａ、そしてσタンパク質はおよそ４７〜４８ｋＤａの分子量を有する。
【０１１４】
プロセスの開発に使用した全ての材料を以下のように作成した。２０リットルのバイオリアクターに、４ｍＭのグルタミンとフェノールレッドを含む無血清培地の中に、ＨＥＫ
２９３に由来する細胞株を接種した。細胞を２〜３日間増殖させ、１×１０６細胞／ｍｌの細胞数で、０．５のＭＯＩで感染させた。さらに２〜３日間、ウイルスの生産を進行させた。細胞を、１％の最終濃度になるように１０％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を添加することによって、１２０ｒｐｍで３７℃で３０分間溶解させた。粗溶解物の試料濃度を１ｍＭの塩化マグネシウムになるように調整し、１０μ／ｍｌのベンゾナーゼで、３７℃および１２０ｒｐｍで１時間消化させた。その後、材料を、８マイクロンのフィルター、その後に０．８マイクロンのフィルターを通して濾過した。３００ｋＤａの分子量カットオフおよび４８００ｃｍ２の全面積を有するＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ中空繊維カートリッジ上で材料をさらに濃縮し、緩衝液交換を行った。材料を、５倍容量の２０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ ７．８）、２５ｍＭの塩化ナトリウムに対して交換した。透析後、グリセロールを１０％の最終濃度となるように添加した。
【０１１５】
レオウイルスの精製に許容される作業範囲を決定するためのパラメーター
３型レオウイルスＤｅａｒｉｎｇの精製のための安定性ウィンドウは、以下の参考文献に示されている（Ｆｌｏｙｄ ｅｔ ａｌ．，１９９７；Ｆｌｏｙｄ ｅｔ ａｌ．，１９７８、ｐ．１０７９−１０８３および１０８４−１０９４；Ｆｌｏｙｄ ｅｔ ａｌ．，１９７９；Ｄｒａｙｎａ ｅｔ ａｌ．，１９８２）。これらの文献に基づいて、５．０〜８．０のｐＨ範囲全体についてのクロマトグラフィー条件と、０〜２Ｍまでの塩化ナトリウムの塩濃度が良好な開始範囲であると推測した。凝集、および凝集を誘導する可能性がある条件もまた、考えられる要因である。文献（前記）によるデータに基づいて、５．０〜８．０のｐＨウィンドウと、０．０２５〜２Ｍの塩化ナトリウムの塩濃度が許容されると推測した。グリセロールもまた、凝集を防ぐために全ての緩衝液に加えた。グリセロールの省略が、凝集によるウイルスのロスが原因でウイルスの安定性および感染力に悪影響を与えているかどうかは試験しなかった。
【０１１６】
ビリオンの等電点（ｐＩ）は文献（Ｆｌｏｙｄ ｅｔ ａｌ．，１９７８、ｐ．１０８４−１０７９、Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９８１）に記載されている。３．８〜３．９の見かけのｐＩが、クロマト分画、および全粒子（ｗｈｏｌｅ−ｐａｒｔｉｃｌｅ）顕微電気泳動を使用して示されている。３型レオウイルスであるＤｅａｒｉｎｇの２つの最も豊富に存在している主要なコートタンパク質（σ３、およびμ１）は、低い酸性ｐＩを有する（上記を参照のこと）。これはまた、種々のイオン交換体に対するウイルスの吸着特性と良好に一致している（Ｚｅｒｄａ ｅｔ ａｌ．，１９８１）。相違は、クロマト分画が、多くの態様においては、溶液中の全体的な変化よりはむしろ電荷を有するドメインを測定する二次元技術であり、一方、顕微電気泳動は、実験結果にも影響を与える可能性がある緩衝液条件の調整によるいくつかの偏差を生じる可能性があるという事実によって、おそらく説明される。緩衝液処方物中でのマグネシウム塩の使用は、マグネシウムの存在下での凍結の際のウイルスの感染力の低下が報告されている（Ｅｓｔｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９７９）ので、避けた。
【０１１７】
最初の培地の選定
イオン交換体（ＩＥＸ）、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、ヘパリンアフィニティークロマトグラフィー、および固定化金属キレートクロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）を、全て最初に評価した。σ３（２つの主要な外側のキャプシドタンパク質のうちの１つ）には、ジンク・フィンガーモチーフが含まれている。したがって、ＩＭＡＣを、このウイルスについての見込みのある捕捉技術と考えた。
【０１１８】
ビリオンが種々のタイプのクロマトグラフィー媒体にそもそも結合するかどうかを決定するために、ウイルスもまた、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｅ Ｆｌｏｗ上でグループ分けして、主要な混入物質の一部を取り除き、ウイルスを結合により適している緩衝液条件に交換した。Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６および４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗの両方を、最初に、２０ｃｍのベッド高と１５０ｃｍ／ｈの線流速で評価した。カラム容量の５〜３０％の試料の容量を載せた。Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗのサイズ排除限界は、球状分子については２００〜５００万ダルトンの範囲であり、そしてＳｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗは約２０００万ダルトンの排除限界を有するので、後者のほうが分解能が高く、したがって、２５％のカラム容量までを載せることができた。この値を上回るピークは、もはや分解できなかった。これは、塩またはエチレングリコールの添加によっても抑制することはできなかった。ＨＲ５＿２０ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗカラム上での出発物質のサイズ分離の典型的なクロマトグラムを図１に示す。
【０１１９】
陽イオン交換媒体を、５．０〜６．０のｐＨ範囲で試験した。弱い（カルボキシメチル）陽イオン交換基および強い（スルホプロピル）陽イオン交換基の双方を使用した（図２）。
【０１２０】
サイズ排除で予め精製したウイルスについては、ウイルスの良好な結合が、ｐＨ５．６のＳＰおよびＣＭ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗの両方について観察された。しかし、ＵＦ／ＤＦ材料は、５．０のｐＨでさえも全く結合しなかった。２．５％のエチレングリコールの添加は、ウイルスの結合を形成し可能にする凝集の崩壊を助けたが、ウイルスの感染力は低下した。
【０１２１】
カルシウム、亜鉛、およびマグネシウムに荷電したキレート金属セファロースもまた、ＳＥＣで予備精製した材料とのウイルスの結合について試験した。しかし、２５および５０ｃｍ／ｈのいずれの試料のアプリケーションでも、ウイルスはカラム上に保持されなかった。Ｈｅｐａｒｉｎ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗもまた、予備精製したウイルスを用いて種々の塩の濃度で評価したが、ここでも、結合は観察されなかった。画分を、記載されている（Ｓｐｉｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００１）ようにＲＴ ＰＣＲによって、ならびに、ウェスタンブロッティングとＳＤＳ ＰＡＧＥによって分析した。
【０１２２】
全てのＨＩＣカラムがある程度ウイルスを保持したように思えたが、選択性は低く、塩化ナトリウムを離液性の塩として使用した場合もなお、沈殿が多かったことが原因で、ロスが多かった。
【０１２３】
種々の陰イオン交換体もまた、選択性と結合についてスクリーニングした。ＤＥＡＥ、ＡＮＸ ｈｉｇｈ ｓｕｂ、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、ＸＬ、および高速（Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ（ＨＰ））を全て、ウイルスの結合について評価した。ＳＥＣで予備精製した材料を試験した場合には、選択性が異なるように思えた（図３）。
【０１２４】
陰イオン交換が、最初の精製工程について最も着実な拡張性のある選択肢であると思われた。したがって、種々の陰イオン交換体を、レオリジン（ｒｅｏｌｙｓｉｎ）の精製についてさらに評価した。
【０１２５】
陰イオン交換による捕捉工程の最適化
種々の陰イオン交換体によって、明確に様々な選択性が付与される。Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＸＬは最も顕著に異なり、ウイルスの分裂ピークを生じる。ウイルスはｐＨ８．０を超えると安定ではないので、結合の間の陰イオン交換体の微環境を１ｐＨ単位高くし、試料をｐＨ ７．２で載せ、その後の全ての工程は７．０のｐＨに維持した。試料を、希塩酸で７．２のｐＨに調整した。
【０１２６】
Ｔｒｉｓ−Ｃｌ緩衝液中での選択性は低いと考えたので、リン酸緩衝液もまた評価した。結合と選択性の両方がリン酸緩衝液の使用によって改善された（データは示さない）。５種類の陰イオン交換体もまた結合能力について比較した。早い漏出（ｂｒｅａｋｔｈｒｏｕｇｈ）が、９０ミクロンのビーズ（ＡＮＸ ｈｉｇｈ ｓｕｂ、ＤＥＡＥ、Ｑ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ，およびＸＬ）の全てについて観察され、この場合、材料は、１〜２倍のカラム容量の後、漏出した。Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅにより、５ｃｍのベッド高および５０ｃｍ／ｈの線流速または６分の滞留時間で、漏出が観察されるまでに、１２ ＣＶより多くのウイルスを載せることができた（図４）。
【０１２７】
したがって、最初の工程のプロセスのさらなる開発については、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅを選択した。１Ｍの塩化ナトリウムまでの直線勾配を用いたＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰからのウイルスの溶出は、０．５Ｍでウイルスが溶出され、勾配のそれよりも早い段階でいくらかの残っている混入物質が溶出し、そして勾配のそれよりも遅い段階でいくらかのさらなる混入物質が溶出したことを示している。
【０１２８】
洗浄、溶出、および再生のための種々の工程の濃度を評価した。最適条件は、カラムを０．２４Ｍの塩化ナトリウムで洗浄し（ウイルスは、約０．２６〜０．２７Ｍの塩化ナトリウムまでは溶出しなかった）、０．５Ｍの塩化ナトリウムで溶出させ、そして２Ｍの塩化ナトリウムで再生した場合に見られた（図５）。
【０１２９】
この工程のプロトコールにより、８〜１０倍のウイルスの濃縮が可能になり、そして滴定、ならびにウェスタンブロッティングとＲＴ−ＰＣＲの両方によって６０〜７０％の回収率が示された。クリーニングレジュメもまた開発され、上向きの流れ方向（ｕｐ−ｆｌｏｗ ｄｉｒｅｃｔｉｏｎ）での、５０ｃｍ／ｈの２ ＣＶについての２Ｍの塩化ナトリウム、その後の２５ｃｍ／ｈの２ ＣＶについての１Ｍの水酸化ナトリウムの再生、それに続く上向きの流れ方向での、５０ｃｍ／ｈのさらに２ ＣＶの２Ｍの塩化ナトリウムの再生の組み合わせによって、カラム最大容量と溶出プロフィールの完全な回収が可能となった（データは示さない）。得られたウイルス力価が最終的な処方物に十分であるほど高い場合には、１５０ｃｍ／ｈおよび２０ｃｍのベッド高でのＳｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ上での基分離を、２回目の精製および緩衝液交換工程のために選択した。全カラム容量の３５％までの容量をこれらの条件下で載せることができ、ウイルスを最終的な処方緩衝液に交換した。
【０１３０】
スケールアップ
陰イオン交換による精製の８倍のスケールアップ
拡張性を示すために、プロセスを、ＨＲ１０＿１００ Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅカラムに８倍にスケールアップした。全てのパラメーター（例えば、滞留時間、載せる容量、工程の濃度、および１ｍｌの樹脂あたりの試料のｍｇ数）を、スケールアップについて、一定に維持した。混入物質の溶出プロフィール、さらには、ウイルスのピークは、この１０倍のスケールアップの間ほぼ同じであった（図６）。
【０１３１】
このプロセスをパイロットプラント用にさらにスケールアップし、その後、５０倍でＧＭＰを行った。５リットルの４×ＵＦ／ＤＦで予備精製したウイルスを、同等の回収率および純度で、開発したプロセスを用いて精製した。
【０１３２】
塩化セシウム勾配で精製した材料と同じ最終的な純度のレベルに達するように、基分離もまた１０倍にスケールアップした。第２工程の１０倍のスケールアップの溶出プロフィールを図７に示す。
【０１３３】
最終産物の純度は、銀染色したＳＤＳ ＰＡＧＥによって示すように（図８Ａ）、勾配で精製した材料と同等であった。２工程の手順によってもまた、クマシー染色したＳＤＳ
ＰＡＧＥによって示したように（図８Ｂ）、勾配で精製した材料よりも高濃度の物質が生じた。ウェスタンブロット分析によって、ウイルスのバンドの実態を確認し、プロセス全体についてウイルスの回収量を定量した。全体的な回収率は＞５０％であった。これを、滴定アッセイによっても確認した（図８Ｃ）。
【０１３４】
実施例４のまとめ
精製プロセスを、非被包性ウイルスの精製のために開発し、５０倍超にスケールアップした。種々のクロマトグラフィーによる分離の原理のスクリーニングは、レオウイルスの場合には、陰イオン交換とサイズ排除が完全な生物学的活性のある（感染性）ビリオンの精製のための最適な選択肢であることを示していた。それぞれ、第１の工程および第２の工程としての陰イオン交換クロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーについての条件を注意深くスクリーニングし、最適化して、着実な拡張性のあるプロトコールを可能にした。第１の工程については、吸着および脱着工程の流速、ならびに、第２の工程の試料の注入およびアイソクラチック溶出に、特に注意を払った。種々の陰イオン交換体についての結合能力を評価し、そして６％のアガロース媒体上では＞２ ＭＤ、そして４％のアガロース媒体上では＞２０ ＭＤの粒子についてのみ表面結合が生じたので、より小さいビーズを使用することによって、ビーズの直径が小さくなることに比例して結合能力が増大した（それぞれ、３倍および９倍）。Ｔｒｉｓベースの緩衝液ではなくリン酸緩衝液を使用することにより、ウイルスの溶出の際によりよい選択性が得られ、そしてまた、生物学的活性の回収に関しても優れていることが見られた。さらに、透析および溶出緩衝液の中でのマグネシウム塩の使用は避けた。
【０１３５】
８倍のスケールアップによって、溶出プロフィールがスケールアップしても再現性があること、および段階的プロトコールによって、約６０〜７０％の収率で感染性ウイルスが回収ができることが示された。第２工程は、２回の連続する密度勾配遠心分離工程によって精製されたウイルスの最終的な純度に達するために必要であり、これによって同時に最終処方緩衝液へのウイルスの緩衝液交換ができた。最終的な力価は、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ媒体の高い能力の理由から、さらなる限外濾過工程を省略できるほど十分に高かった。可能性のある逆圧の問題が原因である負の衝撃（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｉｍｐａｃｔ）は、３４ミクロンのビーズを使用した場合には、ＢＰＧ１００カラムへのスケールアップの際には観察されなかった。ベッド全体の圧力低下は、試料のアプリケーションおよびプロトコール全体の間は、１．５バールよりも低いままであった。
【０１３６】
しかし、最大容量の不一致が、出発物質の種々のバッチの中のフェノールレッドの量が異なることが原因で、低力価のウイルス出発物質を使用した場合に、スケールアップの際に観察された。これらの条件下では、ウイルス材料の一部が洗浄工程の間に失われ、そしてロスは５０％もの高さになり得る。しかし、出発材料の質についてのより良好な管理によって、最初の小規模でのプロセスと匹敵する値にまで、精製プロセスの能力を回復させることができた。
【０１３７】
まとめると、本発明により、従来の小規模なプロセスの質に匹敵する質の大規模なレオウイルスの生産のための精製プロセスが提供される。
【０１３８】
記載される本発明の方法およびシステムの種々の改良およびバリエーションが、本発明の範囲および精神から逸脱することなく当業者に明らかであろう。本発明は、特定の好ましい実施形態と組み合わせて記載されているが、請求される本発明が、このような特定の実施形態に不当に限定されるべきではないことが理解されるはずである。実際、本発明を実施するための記載される方法の様々な改良が、以下の特許請求の範囲に含まれるように意図されることは、当業者に明らかである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書に記載された発明。
【請求項１】
本願明細書に記載された発明。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２０１２−４００２６（Ｐ２０１２−４００２６Ａ）
【公開日】平成２４年３月１日（２０１２．３．１）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２０１１−２５８９８３（Ｐ２０１１−２５８９８３）
【出願日】平成２３年１１月２８日（２０１１．１１．２８）
【分割の表示】特願２００７−５３７０９０（Ｐ２００７−５３７０９０）の分割
【原出願日】平成１７年１０月２１日（２００５．１０．２１）
【出願人】（５０１３３２２６４）オンコリティクス バイオテク，インコーポレーテッド (16)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年３月１日（２０１２．３．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−２５８９８３（Ｐ２０１１−２５８９８３）
【出願日】平成２３年１１月２８日（２０１１．１１．２８）
【分割の表示】特願２００７−５３７０９０（Ｐ２００７−５３７０９０）の分割
【原出願日】平成１７年１０月２１日（２００５．１０．２１）
【出願人】（５０１３３２２６４）オンコリティクス バイオテク，インコーポレーテッド (16)
【Ｆターム（参考）】
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