改良された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ
【課題】核酸の増幅効率が優れた新規な耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを提供する。
【解決手段】３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列中、ポリメラーゼドメイン（Ｐｏｌ領域）に位置するＦｉｎｇｅｒモチーフ内のループ領域のアミノ酸配列のうち、少なくとも１つのアミノ酸を他のアミノ酸に置換した酵素であって、ＰＣＲ増幅効率が改変された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼおよび該酵素を使用する核酸増幅法ならびにそのための試薬。
【解決手段】３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列中、ポリメラーゼドメイン（Ｐｏｌ領域）に位置するＦｉｎｇｅｒモチーフ内のループ領域のアミノ酸配列のうち、少なくとも１つのアミノ酸を他のアミノ酸に置換した酵素であって、ＰＣＲ増幅効率が改変された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼおよび該酵素を使用する核酸増幅法ならびにそのための試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）における増幅効率の向上した耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ及びその製法に関する。更には、該耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いた核酸の増幅方法、並びに該耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含有する試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来から、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）等の核酸を増幅する技術に用いる耐熱性ＤＮＡポリメラーゼに関する研究が多くなされている。
ＰＣＲ反応に用いられる耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは、主としてサーマス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ） 由来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｔｈポリメラ−ゼ） やサーマス・アクアチカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ） 由来のＤＮＡポリメラ−ゼ（Ｔａｑポリメラーゼ）などが用いられてきた。しかしながら、これらの耐熱性ＤＮＡポリメラ−ゼは、核酸の取り込みの際の正確性に欠ける、増幅効率が低い、などの問題がある。
【０００３】
また、超好熱始原菌由来のＤＮＡポリメラーゼ、たとえばパイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ） 由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｆｕポリメラーゼ、特許文献１、特許文献２参照）、サーモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）由来の耐熱性ＤＮＡポリメラ−ゼ（Ｔｌｉポリメラーゼ、特許文献３参照）、サーモコッカス （Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）ｓｐ．ＫＯＤ１由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ、特許文献４参照）なども知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】ＷＯ９２／０９６８９
【特許文献２】特開平５−３２８９６９
【特許文献３】特開平６−７１６０
【特許文献４】特開平７−２９８８７９
【特許文献５】特開平１０−４２８７１
【特許文献６】特開２００５−６５５４０
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ｖｏｌ．２６８， １９６５−１９７５（１９９３）
【非特許文献２】Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６４（１１）， ６４４７−６４５８（１９８９）
【非特許文献３】Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．， ２１ （２）， ２５９−２６５（１９９３）
【非特許文献４】Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８９， ５５７７−５５８１（１９９２）
【非特許文献５】Ｎａｔｕｒｅ， ３２４ （６０９３）， １３−１９（１９８６）
【非特許文献６】Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９１， ２２１６−２２２０（１９９４）
【非特許文献７】Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６３， ７７７−８２２（１９９４）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、従来のα型ＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲ増幅においては、その増幅効率が十分でないなどの問題が存在している。また、これらα型ＤＮＡポリメラーゼには、ＰＣＲの反応時間、酵素量及びプライマー濃度等の至適条件の幅が狭いものが多い。
α型ＤＮＡポリメラーゼにおけるＰＣＲ増幅における上記問題点の原因として、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性の強さが関与していることが考えられる。すなわち、ＰＣＲ時にプライマーなどがその３’−５’エキソヌクレアーゼ活性によって削られることにより、ＰＣＲにおける増幅効率が低下すると考えられている。また、α型ＤＮＡポリメラーゼは単一タンパク質内に３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を示す領域と、ＤＮＡポリメラーゼ活性を示す領域が存在するため、両活性はお互いに相互作用しており、それぞれの領域の核酸への親和性などの違いなどもＰＣＲ増幅に影響を及ぼしていると考えられる。しかしながら、エキソヌクレアーゼ活性を欠失又は１万分の１以下に低減させることにより、α型ＤＮＡポリメラーゼの特徴であるＤＮＡ複製時の正確性も同時に失われるという問題が存在した。
【０００７】
また、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性をもつＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列中には、高度に保存されたアミノ酸領域（ＥＸＯ Ｉ，ＥＸＯ ＩＩ，ＥＸＯ ＩＩＩ）が存在し、そのうち、エキソＩ（ＥＸＯＩ）領域にはＸＤＸＥＸモチーフと呼ばれる領域が存在する。
このモチーフの中で、Ｄ（アスパラギン酸）とＥ（グルタミン酸）を中性アミノ酸であるＡ（アラニン）に置換することによって、エキソヌクレアーゼ活性を欠失または１万分の１以下に低減させることが報告されており、ＤとＥはエキソヌクレアーゼ活性に必須であることが知られている。（Ｋｏｎｇら（１９９３）、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ｖｏｌ．２６８， １９６５−１９７５）（非特許文献１）
特開平１０−４２８７１号公報（特許文献５）では、α型ＤＮＡポリメラーゼの１種であるＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼにおけるＸＤＸＥＸモチーフのＸで示されるアミノ酸を任意のアミノ酸に置換することにより、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を段階的に減衰させる試みが記載されている。しかしながら、この方法によっても、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性が低下するにつれてＰＣＲ効率の上昇と増幅における正確性（ｆｉｄｅｌｉｔｙ）の低下が同時に観察される。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは本課題を解決するためＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼの種々の変異体を作製し鋭意検討を重ねた結果、ポリメラーゼドメイン（Ｐｏｌ領域）に位置するＦｉｎｇｅｒモチーフ内 ループ領域に存在するアミノ酸配列のうち、少なくとも１つのアミノ酸を他の種々のアミノ酸に置換することにより、正確性が損なわれない程度に３’−５’エキソヌクレアーゼ活性の低下した、様々な強さのＰＣＲ効率を示す耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの取得が可能であることを見出し、本発明に到達した。
【０００９】
すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
（１）本願発明は、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列のうち、ポリメラーゼドメイン（Ｐｏｌ領域）に位置するＦｉｎｇｅｒモチーフ内のループ領域のアミノ酸配列のうち、少なくとも１つのアミノ酸を他のアミノ酸に置換した酵素であることを特徴とする、改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼである。
耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとしては、サーモコッカス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）属由来のものが例示でき、さらに、サーモコッカス ｓｐ．ＫＯＤ１由来のＤＮＡポリメラーゼが例示できる。
【００１０】
（２）本願発明は、また、配列表の配列番号１に記載されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなる、（１）に記載の改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼである。
このような改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとして、配列表の配列番号１に記載されるアミノ酸配列のうち、第４７０番目のスレオニン（Ｔｈｒ）をシステイン（Ｃｙｓ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）およびトリプトファン（Ｔｒｐ）のいずれかのアミノ酸に置換したものが例示できる。
さらに、配列表の配列番号１に記載されるアミノ酸配列のうち、第４７０番目のスレオニン（Ｔｈｒ）をシステイン（Ｃｙｓ）に置換したもの、第４７０番目のスレオニン（Ｔｈｒ）をフェニルアラニン（Ｐｈｅ）に置換したもの、第４７０番目のスレオニン（Ｔｈｒ）をトリプトファン（Ｔｒｐ）に置換したもの、第４７１番のイソロイシン（ＩＩｅ）をセリン（Ｓｅｒ）またはスレオニン（Ｔｈｒ）のいずれかのアミノ酸に置換したもの、第４７１番のイソロイシン（ＩＩｅ）をセリン（Ｓｅｒ）に置換したもの、または、第４７１番のイソロイシン（ＩＩｅ）をスレオニン（Ｔｈｒ）に置換したものなどが例示できる。
【００１１】
（３）本願発明は、また、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列のうち、ポリメラーゼドメイン（Ｐｏｌ領域）に位置するＦｉｎｇｅｒモチーフ内のループ領域のアミノ酸配列のうち、少なくとも１つのアミノ酸を他のアミノ酸に置換した酵素であることを特徴とする、改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子である。
このような遺伝子としては、（１）または（２）に記載の、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子が例示できる。
さらには、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、第４７０番目のスレオニンおよび／または第４７１番のイソロイシンを他のアミノ酸に置換した酵素であることを特徴とする、改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子が例示できる。
【００１２】
（４）本願発明は、また、（３）に記載の遺伝子をベクターに挿入した遺伝子組換えベクターである。このような遺伝子組換えベクターとしては、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ由来のものが例示できる。
【００１３】
（５）本願発明は、また、（４）に記載の遺伝子組換えベクターを用いて宿主細胞を形質転換した組換え宿主細胞である。このような宿主細胞としては、大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉが例示できる。
【００１４】
（６）本願発明は、また、（５）に記載の組換え宿主細胞を培養し、培養物から耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを採取する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの製造法である。
【００１５】
（７）本願発明は、また、ＤＮＡを鋳型とし、プライマー、ｄＮＴＰおよび（１）または（２）に記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを反応させて、プライマーを伸長して、ＤＮＡプライマー伸長物を合成することを特徴とする核酸増幅法である。
このような核酸増幅法においては、プライマーが２種のオリゴヌクレオチドであって、一方は他方のＤＮＡ伸長生成物に相補的である方法を用いることができる。また、加熱および冷却を繰り返す方法を用いることができる。
【００１６】
（８）本願発明は、また、一方のプライマーが他方のプライマーのＤＮＡ伸長生成物に相補的である２種のプライマー、ｄＮＴＰおよび（１）または（２）に記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、２価イオン、１価イオンおよび緩衝液を含む核酸増幅用試薬である。
このような核酸増幅用試薬として、一方のプライマーが他方のプライマーのＤＮＡ伸長生成物に相補的である２種のプライマー、ｄＮＴＰおよび（１）または（２）に記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、マグネシウムイオンおよびアンモニウムイオンまたは／およびカリウムイオン、ＢＳＡおよび非イオン界面活性剤および緩衝液を含む核酸増幅用試薬が例示できる。
また、一方のプライマーが他方のプライマーのＤＮＡ伸長生成物に互いに相補的である２種のプライマー、ｄＮＴＰ、（１）または（２）に記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、マグネシウムイオン、アンモニウムイオン及びカリウムイオンからなる群から選ばれる少なくとも１種、ＢＳＡ、非イオン性界面活性剤、緩衝液、及び該耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのポリメラーゼ活性及び３’−５’エキソヌクレアーゼ活性の少なくとも１つの活性を抑制する活性を有する抗体を含有する核酸増幅用試薬が例示できる。
【００１７】
（９）本願発明は、また、（１）または（２）に記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを１種以上混合されたことを特徴とするＤＮＡポリメラーゼ組成物である。
【００１８】
（１０）本願発明は、また、鋳型としてのＤＮＡ、変異導入プライマー、ｄＮＴＰ及び（１）または（２）に記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを反応させることにより、プライマーを伸長させてＤＮＡプライマー伸長物を合成することを含む遺伝子変異導入方法である。
【００１９】
（１１）本願発明は、また、変異導入プライマー、ｄＮＴＰ、及び（１）または（２）に記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含んでなることを特徴とする遺伝子変異導入用試薬である。
【発明の効果】
【００２０】
上述したように、本発明により、ＤＮＡ増幅効率が向上した耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの作製が可能となった。この方法を用いることにより、従来の始原菌由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを様々な用途、すなわち長い領域の増幅や微量な鋳型からの増幅などに使用できるように、改変された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを創出することが可能とするものである。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】各ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ変異体のヒトゲノムＤＮＡを鋳型としたｐ５３遺伝子（４．０ｋｂ）のＰＣＲによる増幅を示す図である。Ａ：ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ− Ｂ：ＨＥ／ＴＣ／ＩＳ Ｃ：ＨＥ／ＮＤ／ＴＣ／ＩＳＭ：マーカー １：鋳型量１０ｎｇ ２：２ｎｇ ３：０．４ｎｇ ４：８０ｐｇ ５：１６ｐｇ
【図２】各ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ変異体のヒトゲノムＤＮＡを鋳型としたβ−ｇｌｏｂｉｎ遺伝子（１７．５ｋｂ）のＰＣＲによる増幅を示す図である。Ｍ：マーカー １：ＫＯＤ ＦＸ ２： ＨＥ／ＲＡ ３：ＨＥ／ＴＣ／ＩＳ ４：ＨＥ／ＮＤ／ＴＣ／ＩＳ
【図３】各ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ変異体のＰＣＲ増幅における変異率（Ｍｕｔａｔｉｏｎｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
以下の説明においてアミノ酸の置換を次のように表す。
例えば「Ｈ１４７Ｅ」は、１４７位のヒスチジンをグルタミン酸に置換した変異体を表す。複数箇所を置換した場合は「／」で区切ってそれぞれの置換を併記して示す。例えば「Ｈ１４７Ｅ／Ｔ４７０Ｃ／Ｉ４７１Ｓ」は、１４７位のヒスチジンをグルタミン酸に置換し、さらに４７０番目のスレオニンと４７１番目のイソロイシンを、それぞれシステインとセリンに置換した変異体を示す。
【００２３】
本発明においては、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列中、ポリメラーゼドメイン（Ｐｏｌ領域）に位置するＦｉｎｇｅｒモチーフ内のループ領域に存在するアミノ酸配列のうち、少なくとも１つのアミノ酸を他のアミノ酸に置換することにより、ＤＮＡ増幅効率を向上させることができる。
実際、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ変異体Ｈ１４７Ｅ／Ｔ４７０Ｃ／Ｉ４７１Ｓ（４７０番目のスレオニンと４７１番目のイソロイシンを、それぞれシステインとセリンに置換）および変異体Ｈ１４７Ｅ／Ｎ２１０Ｄ／Ｔ４７０Ｃ／Ｉ４７１Ｓ（２１０番目のアスパラギン、４７０番目のスレオニンおよび４７１番目のイソロイシンを、それぞれアスパラギン酸、システインおよびセリンに置換）は改変型ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｈ１４７Ｅ）に比べてＤＮＡポリメラーゼ活性がそれぞれ１１６％、１２８％程度と上昇した（表１）。
【００２４】
また、本発明において、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのポリメラーゼドメイン（Ｐｏｌ領域）に位置するＦｉｎｇｅｒモチーフ内 ループ領域に存在するスレオニンをシステインやフェニルアラニンなどの中性アミノ酸に置換すること、および／または該Ｆｉｎｇｅｒ内 ループ領域に存在するイソロイシンをセリンおよびスレオニンのヒドロキシル基をもつ中性アミノ酸に置換することによって、特に低いコピー数のＤＮＡからのＰＣＲ増幅における効率を向上させることができる。
実際、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ変異体Ｈ１４７Ｅ／Ｔ４７０Ｃ／Ｉ４７１Ｓ（４７０番目のスレオニンと４７１番目のイソロイシンを、それぞれシステインとセリンに置換）および変異体Ｈ１４７Ｅ／Ｎ２１０Ｄ／Ｔ４７０Ｃ／Ｉ４７１Ｓ（２１０番目のアスパラギン、４７０番目のスレオニンおよび４７１番目のイソロイシンを、それぞれアスパラギン酸、システインおよびセリンに置換）については、ＰＣＲ効率の上昇を認めることが可能であった（図１、図２）。これら変異体のうちＨ１４７Ｅ／Ｔ４７０Ｃ／Ｉ４７１Ｓにおいては、エキソヌクレアーゼ活性の顕著な低下は見られなかったことから（図３）、該Ｆｉｎｇｅｒ内 ループに存在する４７０番目のスレオニンおよび／または４７１番目のイソロイシンは、エキソヌクレアーゼ活性の強弱とは独立してＰＣＲ効率を左右する役割も担っていることを示唆している。
ＰＣＲ効率（成功率）の向上とは、少ない鋳型（コピー数）から増幅できること（すなわち、ＤＮＡ増幅効率の向上）、あるいは、長いターゲットを増幅できること（すなわち、鎖伸長性の向上）を意味する。これら両方が満たされることは、さらに好ましい。
【００２５】
本発明の一実施態様としては、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列中、ポリメラーゼドメイン（Ｐｏｌ領域）に位置するＦｉｎｇｅｒモチーフ内のループ領域のアミノ酸配列のうち、４７０番目のスレオニンおよび／または４７１番のイソロイシンを他のアミノ酸に置換した酵素であり、ＰＣＲ増幅効率が改変された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼに関する。
【００２６】
３’−５’エキソヌクレアーゼ活性をもつＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列中には、エキソヌクレアーゼ活性に寄与するエキソヌクレアーゼ領域（Ｅｘｏドメイン）と、ポリメラーゼ活性に寄与するポリメラーゼ領域とが存在する。
さらに、ポリメラーゼ領域は２重鎖ＤＮＡの結合を提供すると考えられる大きな裂け目（ｃｌｅｆｔ）を有する。この裂け目は、２組のヘリックスにより形成され、第１の組はｆｉｎｇｅｒモチーフと呼ばれ、第２の組はｔｈｕｍｂモチーフと呼ばれる。裂け目の底は逆平行βシートにより形成され、ｐａｌｍモチーフと呼ばれる。ＤＮＡポリメラーゼ構造の概説は、ＪｏｙｃｅおよびＳｔｅｉｔｚ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６３：７７７−８２２（１９９４）（非特許文献７）において見出され得る。
なかでも、２重鎖ＤＮＡの結合を提供するｆｉｎｇｅｒモチーフは、Ｏ−へリックスおよびＰ−へリックスの２本から成り、ヘリックス同士は数アミノ酸残基のループでつながれている。このループ領域のアミノ酸配列のうち、４７０番目のスレオニンおよび／または４７１番のイソロイシンを他のアミノ酸に置換した酵素であり、ＰＣＲ増幅効率が改変された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼに関する。
【００２７】
特開２００５−６５５４０（特許文献６）には、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ変異体（Ｈ１４７Ｅ）の結晶のＸ線回折データの知見が記載されていて、Ｆｉｎｇｅｒモチーフ（ドメイン）、ループ領域（構造）などを含めた構造解析がなされている。
【００２８】
また、本発明の別な実施態様としては、下記性質を有する改変された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼがある。
（１）熱安定性：ｐＨ８．８（２５℃での測定値）にて９５℃、６時間の処理で６０％以上の残存活性を保持することができる
（２）至適温度：約６５〜７５℃
（３）分子量：８８〜９０ＫＤａ（計算値）であり、下記（４）のスレオニンおよび／またはイソロイシン以外において、糖鎖や欠失、挿入、又は１又は数個のアミノ酸の欠失、置換、挿入、付加があってもよい。
（４）アミノ酸配列：配列番号１に記載のポリメラーゼドメイン（Ｐｏｌ領域） に位置するＦｉｎｇｅｒモチーフ内の ループ領域のアミノ酸配列のうち、４７０番目のスレオニンおよび／または４７１番のイソロイシンを他のアミノ酸に置換したアミノ酸配列を有する。
【００２９】
本発明の更に具体的な例としては、配列番号１に記載のアミノ酸配列中、第４７０番目のスレオニン残基をシステイン、フェニルアラニンおよびトリプトファンのいずれかに置換した耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを挙げることができる。また、配列番号１に記載のアミノ酸配列中、第４７１番目のイソロイシン残基をスレオニンおよびセリンのいずれかに置換した耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを挙げることができる。
ここで、本願発明において、配列番号１に記載のアミノ酸配列とは、第４７０番目のスレオニン残基および／または第４７１番目のイソロイシン以外のアミノ酸のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＤＮＡポリメラーゼ活性を有するものも含むものである。好ましくは、配列番号１のアミノ酸配列と９５％以上の相同性を有する範囲で、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加され、且つＤＮＡポリメラーゼ活性を有するものも含むものが挙げられる。
【００３０】
本発明において、ＤＮＡポリメラーゼ活性とは鋳型ＤＮＡにアニールされたオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの３’−ヒドロキシル基にデオキシヌクレオチド５’−トリホスフェートのα−ホスフェートを共有結合せしめることにより、デオキシリボ核酸にデオキシリボヌクレオチド５’−モノホスフェートを鋳型依存的に導入する反応を触媒する活性をいう。
【００３１】
［ＤＮＡポリメラーゼ活性測定法］
酵素活性が強い場合には、保存緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），５０ｍＭ ＫＣｌ，１ｍＭ ジチオスレイトール，０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０，０．１％ Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ４０，５０％ グリセリン）でサンプルを希釈して測定を行う。
（１）下記のＡ液２５μｌ、Ｂ液５μｌ、Ｃ液５μｌ、滅菌水１０μｌ、及び酵素溶液５μｌをマイクロチューブに加えて７５℃にて１０分間反応する。
（２）その後氷冷し、Ｅ液５０μｌ、Ｄ液１００μｌを加えて、攪拌後更に１０分間氷冷する。
（３）この液をガラスフィルター（ワットマン製ＧＦ／Ｃフィルター）で濾過し、０．１Ｎ 塩酸およびエタノールで十分洗浄する。
（４）フィルターの放射活性を液体シンチレーションカウンター（パッカード製）で計測し、鋳型ＤＮＡのヌクレオチドの取り込みを測定する。
酵素活性の１単位はこの条件で３０分当りの１０ｎｍｏｌのヌクレオチドを酸不溶性画分（即ち、Ｄ液を添加したときに不溶化する画分）に取り込む酵素量とする。
Ａ：４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）１６ｍＭ 塩化マグネシウム１５ｍＭ ジチオスレイトール１００μｇ／ｍｌ ＢＳＡ（牛血清アルブミン）
Ｂ：１．５μｇ／μｌ 活性化仔牛胸腺ＤＮＡ
Ｃ：１．５ｍＭ ｄＮＴＰ（２５０ｃｐｍ／ｐｍｏｌ ［３Ｈ］ｄＴＴＰ）
Ｄ：２０％ トリクロロ酢酸（２ｍＭピロリン酸ナトリウム）
Ｅ：１ｍｇ／ｍｌ仔牛胸腺ＤＮＡ
【００３２】
［ＤＮＡポリメラーゼの正確性］
また、本発明において、ＤＮＡポリメラーゼの正確性とはＤＮＡ複製時における塩基の取り込みの正確性をいう。本発明におけるＤＮＡポリメラーゼの正確性の評価には、各変異型（改変型）ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼでターゲットを増幅後、ＴＡクローンニングを行って大腸菌を形質転換し、ターゲットの塩基配列を解析して変異塩基の型と頻度を算出する。
【００３３】
［正確性（Ｆｉｄｅｌｉｔｙ）測定法］
４９μｌの反応液（１×ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ｂｕｆｆｅｒ（東洋紡績製）、０．９ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、５０ ｎｇヒトゲノムＤＮＡ（Ｒｏｃｈｅ社製）、１０ｐｍｏｌの配列番号１０及び１１に記載のプライマー）に酵素（１Ｕ／μｌ）を１μｌ加えてＰＣＲを実施する。ここでは、サーマルサイクラーはＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社 ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ＧｅｎｅＡｍｐ９７００を用いて以下のように行う。すなわち、９４℃、２分行った後、９４℃、１５秒→６０℃、３０秒→６８℃、２．５分を２７サイクル行う。また、同時に天然型ＫＯＤポリメラーゼ（東洋紡製）についても増幅反応を実施する。
ＰＣＲ終了後ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒＲ −ＰＣＲ ＆ Ｇｅｌ Ｃｌｅａｎ ｕｐ−（東洋紡社製）でＰＣＲ産物の精製を行う。精製産物には、最終濃度が１×Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．２ ｍＭ ｄＮＴＰｓになるように各試薬を添加する。さらにＴＡｒｇｅｔ Ｃｌｏｎｅ −Ｐｌｕｓ−（東洋紡社製）にてＴＡクローニングを行い、エシェリシア・コリＤＨ５α株のコンピテントセルを用いて形質転換する。自動核酸抽出装置でクローンから抽出したプラスミドを鋳型として、配列番号１２及び１３に記載のシーケンスプライマーを用いてターゲット領域約１ ｋｂのシーケンス解析を実施する。配列データは、ソフトウエアＳｅｑｕｅｃｈｅｒ ｖｅｒ４．５を使用しアラインメント解析を行い、変異塩基の位置とその数、変異型について集計し変異挿入率を算出する。
【００３４】
これらの改変された酵素を製造する方法としては、従来の公知の方法が使用できる。
例えば、野生型ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子に変異を導入して、タンパク質工学的手法により新たな機能を有する変異型（改変型）ＤＮＡポリメラーゼを製造する方法がある（Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６４（１１）， ６４４７−６４５８（１９８９））（非特許文献２）。
変異を導入するＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子は特に限定されないが、例えば、パイロコッカス・コダカラエンシスＫＯＤ１株由来の配列表・配列番号１に記載の遺伝子が挙げられる。
また同様に、パイロコッカス・フリオサス（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．， ２１ （２）， ２５９−２６５（１９９３））（非特許文献３）、サーモコッカス・リトラリス（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８９， ５５７７−５５８１（１９９２））（非特許文献４）なども例示することができる。
野生型ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子に変異を導入する方法は既知のいかなる方法を用いてもよい。例えば、野生型ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子と変異原となる薬剤を接触させる方法や紫外線照射による方法などからタンパク質工学的手法、例えばＰＣＲや部位特異的変異などの方法を用いることができる。
【００３５】
本発明で使用したＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキット（ストラタジーン製）は、（１）目的とする遺伝子を挿入したプラスミドを変性させ、該プラスミドに変異プライマーをアニーリングさせ、続いてＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼを用いて伸長反応を行う、（２）（１）のサイクルを１５回繰り返す、（３）例えば、制限酵素ＤｐｎＩを用いて鋳型としたプラスミドのみを選択的に切断する、（４）新たに合成されたプラスミドにより大腸菌を形質転換し、目的とする変異の導入されたプラスミドを保有する形質転換体を取得することのできるキットである。
【００３６】
上記改変ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を必要に応じて発現ベクターに移し替え、宿主として例えば大腸菌を該発現ベクターを用いて形質転換した後、アンピシリン等の薬剤を含む寒天培地に塗布し、コロニーを形成させる。コロニーを栄養培地、例えばＬＢ培地や２×ＹＴ培地に接種し、３７℃で１２〜２０時間培養した後、菌体を破砕して粗酵素液を抽出する。ベクターとしては、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ由来のものが好ましい。菌体を破砕する方法としては公知のいかなる手法を用いても良いが、例えば超音波処理、フレンチプレスやガラスビーズ破砕のような物理的破砕法やリゾチームのような溶菌酵素を用いることができる。 この粗酵素液を８０℃、３０分間熱処理し、宿主由来のポリメラーゼを失活させ、ＤＮＡポリメラーゼ活性を測定する。
【００３７】
上記方法により選抜された菌株から精製ＤＮＡポリメラーゼを取得する方法は、いかなる手法を用いても良いが、例えば下記のような方法がある。栄養培地に培養して得られた菌体を回収した後、酵素的または物理的破砕法により破砕抽出して粗酵素液を得る。得られた粗酵素抽出液から熱処理、例えば８０℃、３０分間処理し、その後硫安沈殿によりＤＮＡポリメラーゼ画分を回収する。この粗酵素液をセファデックスＧ−２５（アマシャムファルマシア・バイオテク製）を用いたゲル濾過等の方法により脱塩を行うことができる。この操作の後、ヘパリンセファロースカラムクロマトグラフィーにより分離、精製し、精製酵素標品を得ることができる。該精製酵素標品はＳＤＳ−ＰＡＧＥによってほぼ単一バンドを示す程度に純化される。
【００３８】
また、得られた酵素を用いてＰＣＲ増幅を行うことにより、その増幅の有無もしくは強度からＰＣＲ効率の評価を行うことができる。本発明の改変されたＤＮＡポリメラーゼは、遺伝子の増幅効率の点で優れており、ＰＣＲに利用できる。
【００３９】
また、本発明の核酸増幅ないし伸長方法は、本発明の改変された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを使用して、ＤＮＡを鋳型とし、少なくとも１種のプライマー、ｄＮＴＰ（即ち、４種類のデオキシリボヌクレオチド３リン酸）を反応させることによりプライマーを伸長して、ＤＮＡプライマー伸長物を合成する方法を含む。該方法は、１種のプライマーを用いて、核酸を伸長する方法を含む。
具体的には、プライマーエクステンション法、シークエンス法、従来の温度サイクルを行わない方法およびサイクルシーケンス法を含む。
【００４０】
また、本発明の方法は、２種以上のプライマーを用いてＰＣＲ法により核酸を増幅させる方法も含む。好ましくは、プライマーは２種のオリゴヌクレオチドであって、互いに一方は他方のＤＮＡ生成物に相補的であるプライマーであることが好ましい。また、加熱および冷却を繰り返すのが好ましい。
具体的には、ＰＣＲ法に基づく遺伝子増幅方法は、標的核酸、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸、一対のプライマー及び本発明の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの存在下で、変性、アニーリング、伸長の３工程からなるサイクルを繰り返すことにより、上記一対のプライマーで挟まれる標的核酸の領域を指数関数的に増幅させる方法である（Ｎａｔｕｒｅ， ３２４ （６０９３）， １３−１９（１９８６））（非特許文献５）。
すなわち、変性工程で試料の核酸を変性し、続くアニーリング工程において各プライマーと、それぞれに相補的な一本鎖標的核酸上の領域とをハイブリダイズさせ、続く伸長工程で、各プライマーを起点としてＤＮＡポリメラーゼの働きにより鋳型となる各一本鎖標的核酸に相補的なＤＮＡ鎖を伸長させ、二本鎖ＤＮＡとする。この１サイクルにより、１本の二本鎖ＤＮＡが２本の二本鎖ＤＮＡに増幅される。従って、このサイクルをｎ回繰り返せば、理論上上記一対のプライマーで挟まれた試料ＤＮＡの領域は２ｎ倍に増幅される。
【００４１】
本発明のＤＮＡポリメラーゼは、その活性を維持するために、例えばマグネシウムイオンのような２価のイオン、及び例えばアンモニウムイオン及び／又はカリウムイオンのような１価のイオンを共存させることが好ましい。
また、ＰＣＲ反応液には、緩衝液及びこれらのイオンを含むと共に、ＢＳＡ、例えばＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００のような非イオン性界面活性剤、及び緩衝液が存在してもよい。
緩衝剤としては、トリスやヘペスなどのグッドバッファーおよび、リン酸緩衝液などが用いられる。
【００４２】
本発明の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いたときのＰＣＲの具体的一態様としては、反応緩衝液（１２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）， １０ｍＭ ＫＣｌ， ６ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４， ０．１％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００， １０μｇ／ｍｌ ＢＳＡ），プライマー各０．４ｐｍｏｌ／μｌ， ｄＮＴＰｓ ０．２ｍＭ， 鋳型ＤＮＡ０．２ｎｇ／μｌ及び本発明のＤＮＡポリメラーゼ０．０５ｕ／μｌを含有する溶液を９４℃；１５秒、６５℃；２秒、７４℃；３０秒の温度サイクルを２５回程度行う。
【００４３】
本発明の核酸増幅用試薬は、一方のプライマーが他方のプライマーのＤＮＡ伸長生成物に互いに相補的である２種のプライマー、ｄＮＴＰ、及び上記のような本発明における耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、２価イオン、１価イオン、及び緩衝液を含み、さらに具体的には、一方のプライマーが他方のプライマーＤＮＡ伸長生成物に相補的である２種のプライマー、ｄＮＴＰ及び上記耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、マグネシウムイオン、アンモニウムイオン及び／又はカリウムイオン、ＢＳＡ、上述のような非イオン界面活性剤及び緩衝液を含む。
【００４４】
本発明の核酸増幅用試薬の別な態様としては、一方のプライマーが他方のプライマーのＤＮＡ伸長生成物に互いに相補的である２種のプライマー、ｄＮＴＰ及び上述したような本発明における耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、２価イオン、１価イオン、緩衝液、及び必要に応じて耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのポリメラーゼ活性及び／又は３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を抑制する活性を有する抗体を含む核酸増幅用試薬がある。
該抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体などが挙げられる。
本核酸増幅用試薬は、ＰＣＲの感度上昇、非特異増幅の軽減に特に有効である。
【００４５】
本発明の遺伝子変異導入用試薬は、一方のプライマーが他方のプライマーのＤＮＡ伸長生成物に互いに相補的である変異導入プライマー、ｄＮＴＰ、及び上述したような本発明における耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含む。
さらに上述したような２価イオン、１価イオン、緩衝液を含んでもよい。本発明における変異導入プライマーは、その長さが２０〜１５０塩基程度であり、共にその配列のほぼ中央あたりに変異部分、即ち、鋳型のなるＤＮＡ配列と異なる部分（例えば、挿入、欠失、置換）を含み、互いに相補的である。
【００４６】
本発明の遺伝子増幅用試薬及び遺伝子変異用試薬において、緩衝液としては、トリスやヘペスなどのグッドバッファーおよび、リン酸緩衝液などが用いられるが、具体的には、１０〜２００ｍＭの各種バッファー（ｐＨ７．５〜９．０（ａｔ ２５℃））が例示できる。
また、マグネシウムイオンやマンガンイオンのような２価のイオンの濃度は、反応段階で０．５〜２ｍＭ、及び例えばアンモニウムイオン及び／又はカリウムイオンのような１価のイオンの濃度は、反応の段階で１０〜１００ｍＭ程度となるようなものがよい。
本発明のＤＮＡポリメラーゼは、反応の段階で０．０１〜０．１単位／μｌ程度となるようなものがよい。また、プライマーの濃度は、０．２〜２ｐｍｏｌ／μｌ程度である。
【００４７】
また、本発明の実施態様としては、上述したような本発明における耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを１種又は２種以上混合したことを特徴とするＤＮＡポリメラーゼ組成物がある。
具体的には、上述のような本発明における耐熱性ＤＮＡポリメラーゼと別なＤＮＡポリメラーゼ、例えば３’−５’エキソヌクレアーゼ活性の低いＤＮＡポリメラーゼなどを混合せしめることによって、長鎖核酸を増幅する場合（例えばｌｏｎｇＰＣＲ）に有用な組成物を得ることができる。
実際、長鎖核酸を増幅する方法として、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を欠くＴａｑポリメラーゼと３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＰｆｕポリメラーゼまたはＴｉポリメラーゼまたはこれらの変異酵素を混合したＤＮＡポリメラーゼ組成物を用いて、ＰＣＲを行う方法が報告されている（Ｂａｒｎｓ， Ｗ．Ｍ．（１９９４） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１， ２２１６−２２２０）（非特許文献６）。
【００４８】
本発明においては、本発明のＤＮＡポリメラーゼとＴｔｈポリメラーゼとの組み合わせや、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性の高いＤＮＡポリメラーゼと本発明のＤＮＡポリメラーゼ活性の高い本発明のＤＮＡポリメラーゼとの見合わせが例示できる。本発明のＤＮＡポリメラーゼ組成物に添加することができる他の成分は、該ＤＮＡポリメラーゼの活性を抑制する抗体などが例示できる。
【実施例１】
【００４９】
以下に、実施例を用いて本発明をより具体的に説明する。
実施例１
ＫＯＤ１株由来の改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を含有するプラスミド、ｐＫＯＤ Ｈ１４７Ｅを回収した。ＫＯＤ１株由来のＤＮＡポリメラーゼ遺伝子は２３２５塩基からなり、７７０個のアミノ酸がコードされていた（配列番号１）。該プラスミドの作製はＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ ｓｉｔｅ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｋｉｔ（ストラタジーン製）を用いた。方法は取扱い説明書に準じて行った。変異作製用プライマーとしては、配列番号２及び３に記載されるプライマーを使用した。なお、変異体の確認は塩基配列の解読で行った。得られたプラスミドによりエシェリシア・コリＪＭ１０９を形質転換し、エシェリシア・コリＪＭ１０９株（ｐＫＯＤ Ｈ１４７Ｅ／Ｔ４７０Ｃ／Ｉ４７１Ｓ）を得た。
【実施例２】
【００５０】
実施例２
得られた菌体の培養は以下のようにして実施した。まず、滅菌処理した１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＴＢ培地（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ、ｐ．Ａ．２）１Ｌを２Ｌ坂口フラスコ３本に分注した。この培地に予め１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する８０ｍｌのＬＢ培地（１％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％塩化ナトリウム；ギブコ製）で３７℃、１６時間培養したエシェリシア・コリＪＭ１０９（ｐＫＯＤ Ｈ１４７Ｅ／Ｔ４７０Ｃ／Ｉ４７１Ｓ）（５００ｍｌ坂口フラスコ使用）を接種し、３５℃にて１２時間通気培養した。培養液より菌体を遠心分離により回収し、４００ｍｌの破砕緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、８０ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ２−メルカプトエタノール、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に懸濁後、フレンチプレス処理により菌体を破砕し、細胞破砕液を得た。次に細胞破砕液を８５℃にて３０分間処理した後、遠心分離にて不溶性画分を除去した。更に、ポリエチレンイミンを用いた除核酸処理、硫安塩析、ヘパリンセファロースクロマトグラフィーを行い、最後に保存緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ 塩化カリウム、１ｍＭ ジチオスレイトール、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０、０．１％ノニデットＰ４０、５０％グリセリン）に置換し、改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（Ｈ１４７Ｅ／Ｔ４７０Ｃ／Ｉ４７１Ｓ）を得た。上記精製工程のＤＮＡポリメラーゼ活性測定は以下の操作で行った。また、酵素活性が高い場合はサンプルを希釈して測定を行った。
【００５１】
（試薬）
Ａ液：４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）、１６ｍＭ 塩化マグネシウム、１５ｍＭ ジチオスレイトール１００μｇ／ｍｌ ＢＳＡ
Ｂ液： １．５μｇ／μｌ 活性化仔牛胸腺ＤＮＡ
Ｃ液： １．５ｍＭ ｄＮＴＰ（２５０ｃｐｍ／ｐｍｏｌ ［３Ｈ］ｄＴＴＰ）
Ｄ液： ２０％ トリクロロ酢酸（２ｍＭピロリン酸ナトリウム）
Ｅ液： １ｍｇ／ｍｌ仔牛胸腺ＤＮＡ
【００５２】
（方法）
Ａ液２５μｌ、Ｂ液５μｌ、Ｃ液５μｌ及び滅菌水１０μｌをマイクロチューブに加えて攪拌混合後、上記精製酵素希釈液５μｌを加えて７５℃で１０分間反応する。その後冷却し、Ｅ液５０μｌ、Ｄ液１００μｌを加えて、攪拌後更に１０分間氷冷する。この液をガラスフィルター（ワットマン製ＧＦ／Ｃフィルター）で濾過し、０．１Ｎ塩酸及びエタノールで十分洗浄し、フィルターの放射活性を液体シンチレーションカウンター（パッカード製）を用いて計測し、鋳型ＤＮＡへのヌクレオチドの取り込みを測定した。酵素活性の１単位はこの条件下で３０分当り１０ｎｍｏｌのヌクレオチドを酸不溶性画分に取り込む酵素量とした。
【００５３】
【表１】
【実施例３】
【００５４】
実施例３
変異体（Ｈ１４７Ｅ／Ｔ４７０Ｃ／Ｉ４７１Ｓ）遺伝子の作製及び改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの精製実施例１と同様の方法にて、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼの第２１０番目のアスパラギン（Ａｓｎ）をアスパラギン酸（Ａｓｐ）に置換した耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を作製した（ｐＫＯＤ Ｈ１４７Ｅ／Ｎ２１０Ｄ／Ｔ４７０Ｃ／Ｉ４７１Ｓ）。変異プライマーとしては、配列番号４及び５に記載されるプライマーを使用した。更に、実施例２と同様の精製方法にて改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（Ｈ１４７Ｅ／Ｎ２１０Ｄ／Ｔ４７０Ｃ／Ｉ４７１Ｓ）を得た。
【実施例４】
【００５５】
実施例４
改変型ＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲ例（１）
野生型（ＷＴ）ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ（ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績製））、並びに改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは４９μｌの反応液（１×ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ｂｕｆｆｅｒ（東洋紡績製）、０．９ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、１０ｎｇのヒトゲノムＤＮＡ（Ｒｏｃｈｅ社製）、１０ｐｍｏｌの配列番号６及び７に記載のプライマー）に各酵素（１Ｕ／μｌ）を１μｌを加えてＰＣＲを実施した。サーマルサイクラーはＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社 ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ＧｅｎｅＡｍｐ９７００を用いて、以下のように行った。すなわち、９４℃、２分反応を行った後、９４℃、２０秒→６０℃、３０秒→６８℃、４分を３０サイクル行った。反応終了後１０μｌの反応液についてアガロース電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色し、紫外線照射下約４．０ｋｂの増幅ＤＮＡ断片を確認した。図１にアガロースゲル電気泳動の写真を示した。この結果より、変異体Ｈ１４７Ｅ／Ｔ４７０Ｃ／Ｉ４７１Ｓ、Ｈ１４７Ｅ／Ｎ２１０Ｄ／Ｔ４７０Ｃ／Ｉ４７１Ｓを用いた場合、特に低いコピー数の鋳型ＤＮＡ（１６ｐｇ）からの増幅において、野生型のＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼを用いるよりも良好な増幅を示すことが証明された。
【実施例５】
【００５６】
実施例５
改変型ＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲ例（２）
実施例１で良好な結果の得られた改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼＨ１４７Ｅ／Ｔ４７０Ｃ／Ｉ４７１Ｓ、Ｈ１４７Ｅ／Ｎ２１０Ｄ／Ｔ４７０Ｃ／Ｉ４７１Ｓについて更にサイズの大きな遺伝子の増幅を試みた。４９μｌの反応液（１×ＫＯＤ ＦＸ ｂｕｆｆｅｒ（東洋紡績製）、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、２００ｎｇヒトゲノムＤＮＡ（Ｒｏｃｈｅ社製）、１０ｐｍｏｌの配列番号８及び９に記載のプライマー）に各酵素（１Ｕ／μｌ）を１μｌ加えてＰＣＲを実施した。サーマルサイクラーはＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社 ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ＧｅｎｅＡｍｐ９７００を用いて以下のように行った。すなわち、９４℃、２分反応後、９８℃、１０秒→７４℃、２４分（５サイクル）→９８℃、１０秒→７２℃、２４分（５サイクル）→９８℃、１０秒→７０℃、２４分（５サイクル）→９８℃、１０秒→６８℃、２４分（２０サイクル）→６８℃、７分のステップダウンで行った。反応終了後、１０μｌの反応液についてアガロース電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色して紫外線照射下約１７．５ｋｂの増幅断片を確認した。その結果、野生型のＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼを用いるよりも良好な増幅を確認することができた（図２）。
【実施例６】
【００５７】
実施例６
改変型ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼの正確性の測定
野生型（ＷＴ）ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ（ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績製））及び改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼについて正確性を以下の方法にて測定した。４９μｌの反応液（１×ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ｂｕｆｆｅｒ（東洋紡績製）、０．９ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、５０ ｎｇヒトゲノムＤＮＡ（Ｒｏｃｈｅ社製）、１０ｐｍｏｌの配列番号１０及び１１に記載のプライマー）に酵素（１Ｕ／μｌ）を１μｌ加えてＰＣＲを実施した。ここでは、サーマルサイクラーはＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社 ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ＧｅｎｅＡｍｐ９７００を用いて以下のように行った。すなわち、９４℃、２分行った後、９４℃、１５秒→６０℃、３０秒→６８℃、２．５分を２７サイクル行った。また、同時に野生型ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績製）についても増幅反応を実施した。
【００５８】
ＰＣＲ終了後ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒＲ −ＰＣＲ ＆ Ｇｅｌ Ｃｌｅａｎ ｕｐ−（東洋紡績製）でＰＣＲ産物の精製を行った。精製産物には、最終濃度が１×Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．２ ｍＭ ｄＮＴＰｓになるように各試薬を添加した。さらにＴＡｒｇｅｔ Ｃｌｏｎｅ −Ｐｌｕｓ−（東洋紡績製）にてＴＡクローニングを行い、エシェリシア・コリＤＨ５α株のコンピテントセルを用いて形質転換した。自動核酸抽出装置でクローンから抽出したプラスミドを鋳型として、配列番号１２及び１３に記載のシーケンスプライマーを用いてターゲット領域約１ ｋｂのシーケンス解析を実施した。配列データは、ソフトウエアＳｅｑｕｅｃｈｅｒ ｖｅｒ４．５を使用しアラインメント解析を行い、変異塩基の位置とその数、変異型について集計し変異挿入率を算出した。この変異率が低いほど、ＤＮＡ複製時のＤＮＡポリメラーゼの正確性が良いことを示している。変異挿入率は、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績製）は１０．３×１０−５、Ｈ１４７Ｅ／Ｔ４７０Ｃ／Ｉ４７１Ｓは１３．７×１０−５であり、変異体Ｈ１４７Ｅ／Ｔ４７０Ｃ／Ｉ４７１ＳはＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−に相当する高正確性を保持していた（図３）。
【産業上の利用可能性】
【００５９】
本発明により、ＤＮＡ増幅効率が向上した耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの作製が可能となった。この方法を用いることにより、従来の始原菌由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを様々な用途、すなわち長い領域の増幅や微量な鋳型からの増幅などに使用できるように、改変された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを創出することが可能となる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）における増幅効率の向上した耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ及びその製法に関する。更には、該耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いた核酸の増幅方法、並びに該耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含有する試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来から、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）等の核酸を増幅する技術に用いる耐熱性ＤＮＡポリメラーゼに関する研究が多くなされている。
ＰＣＲ反応に用いられる耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは、主としてサーマス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ） 由来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｔｈポリメラ−ゼ） やサーマス・アクアチカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ） 由来のＤＮＡポリメラ−ゼ（Ｔａｑポリメラーゼ）などが用いられてきた。しかしながら、これらの耐熱性ＤＮＡポリメラ−ゼは、核酸の取り込みの際の正確性に欠ける、増幅効率が低い、などの問題がある。
【０００３】
また、超好熱始原菌由来のＤＮＡポリメラーゼ、たとえばパイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ） 由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｆｕポリメラーゼ、特許文献１、特許文献２参照）、サーモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）由来の耐熱性ＤＮＡポリメラ−ゼ（Ｔｌｉポリメラーゼ、特許文献３参照）、サーモコッカス （Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）ｓｐ．ＫＯＤ１由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ、特許文献４参照）なども知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】ＷＯ９２／０９６８９
【特許文献２】特開平５−３２８９６９
【特許文献３】特開平６−７１６０
【特許文献４】特開平７−２９８８７９
【特許文献５】特開平１０−４２８７１
【特許文献６】特開２００５−６５５４０
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ｖｏｌ．２６８， １９６５−１９７５（１９９３）
【非特許文献２】Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６４（１１）， ６４４７−６４５８（１９８９）
【非特許文献３】Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．， ２１ （２）， ２５９−２６５（１９９３）
【非特許文献４】Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８９， ５５７７−５５８１（１９９２）
【非特許文献５】Ｎａｔｕｒｅ， ３２４ （６０９３）， １３−１９（１９８６）
【非特許文献６】Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９１， ２２１６−２２２０（１９９４）
【非特許文献７】Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６３， ７７７−８２２（１９９４）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、従来のα型ＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲ増幅においては、その増幅効率が十分でないなどの問題が存在している。また、これらα型ＤＮＡポリメラーゼには、ＰＣＲの反応時間、酵素量及びプライマー濃度等の至適条件の幅が狭いものが多い。
α型ＤＮＡポリメラーゼにおけるＰＣＲ増幅における上記問題点の原因として、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性の強さが関与していることが考えられる。すなわち、ＰＣＲ時にプライマーなどがその３’−５’エキソヌクレアーゼ活性によって削られることにより、ＰＣＲにおける増幅効率が低下すると考えられている。また、α型ＤＮＡポリメラーゼは単一タンパク質内に３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を示す領域と、ＤＮＡポリメラーゼ活性を示す領域が存在するため、両活性はお互いに相互作用しており、それぞれの領域の核酸への親和性などの違いなどもＰＣＲ増幅に影響を及ぼしていると考えられる。しかしながら、エキソヌクレアーゼ活性を欠失又は１万分の１以下に低減させることにより、α型ＤＮＡポリメラーゼの特徴であるＤＮＡ複製時の正確性も同時に失われるという問題が存在した。
【０００７】
また、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性をもつＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列中には、高度に保存されたアミノ酸領域（ＥＸＯ Ｉ，ＥＸＯ ＩＩ，ＥＸＯ ＩＩＩ）が存在し、そのうち、エキソＩ（ＥＸＯＩ）領域にはＸＤＸＥＸモチーフと呼ばれる領域が存在する。
このモチーフの中で、Ｄ（アスパラギン酸）とＥ（グルタミン酸）を中性アミノ酸であるＡ（アラニン）に置換することによって、エキソヌクレアーゼ活性を欠失または１万分の１以下に低減させることが報告されており、ＤとＥはエキソヌクレアーゼ活性に必須であることが知られている。（Ｋｏｎｇら（１９９３）、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ｖｏｌ．２６８， １９６５−１９７５）（非特許文献１）
特開平１０−４２８７１号公報（特許文献５）では、α型ＤＮＡポリメラーゼの１種であるＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼにおけるＸＤＸＥＸモチーフのＸで示されるアミノ酸を任意のアミノ酸に置換することにより、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を段階的に減衰させる試みが記載されている。しかしながら、この方法によっても、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性が低下するにつれてＰＣＲ効率の上昇と増幅における正確性（ｆｉｄｅｌｉｔｙ）の低下が同時に観察される。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは本課題を解決するためＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼの種々の変異体を作製し鋭意検討を重ねた結果、ポリメラーゼドメイン（Ｐｏｌ領域）に位置するＦｉｎｇｅｒモチーフ内 ループ領域に存在するアミノ酸配列のうち、少なくとも１つのアミノ酸を他の種々のアミノ酸に置換することにより、正確性が損なわれない程度に３’−５’エキソヌクレアーゼ活性の低下した、様々な強さのＰＣＲ効率を示す耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの取得が可能であることを見出し、本発明に到達した。
【０００９】
すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
（１）本願発明は、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列のうち、ポリメラーゼドメイン（Ｐｏｌ領域）に位置するＦｉｎｇｅｒモチーフ内のループ領域のアミノ酸配列のうち、少なくとも１つのアミノ酸を他のアミノ酸に置換した酵素であることを特徴とする、改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼである。
耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとしては、サーモコッカス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）属由来のものが例示でき、さらに、サーモコッカス ｓｐ．ＫＯＤ１由来のＤＮＡポリメラーゼが例示できる。
【００１０】
（２）本願発明は、また、配列表の配列番号１に記載されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなる、（１）に記載の改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼである。
このような改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとして、配列表の配列番号１に記載されるアミノ酸配列のうち、第４７０番目のスレオニン（Ｔｈｒ）をシステイン（Ｃｙｓ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）およびトリプトファン（Ｔｒｐ）のいずれかのアミノ酸に置換したものが例示できる。
さらに、配列表の配列番号１に記載されるアミノ酸配列のうち、第４７０番目のスレオニン（Ｔｈｒ）をシステイン（Ｃｙｓ）に置換したもの、第４７０番目のスレオニン（Ｔｈｒ）をフェニルアラニン（Ｐｈｅ）に置換したもの、第４７０番目のスレオニン（Ｔｈｒ）をトリプトファン（Ｔｒｐ）に置換したもの、第４７１番のイソロイシン（ＩＩｅ）をセリン（Ｓｅｒ）またはスレオニン（Ｔｈｒ）のいずれかのアミノ酸に置換したもの、第４７１番のイソロイシン（ＩＩｅ）をセリン（Ｓｅｒ）に置換したもの、または、第４７１番のイソロイシン（ＩＩｅ）をスレオニン（Ｔｈｒ）に置換したものなどが例示できる。
【００１１】
（３）本願発明は、また、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列のうち、ポリメラーゼドメイン（Ｐｏｌ領域）に位置するＦｉｎｇｅｒモチーフ内のループ領域のアミノ酸配列のうち、少なくとも１つのアミノ酸を他のアミノ酸に置換した酵素であることを特徴とする、改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子である。
このような遺伝子としては、（１）または（２）に記載の、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子が例示できる。
さらには、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、第４７０番目のスレオニンおよび／または第４７１番のイソロイシンを他のアミノ酸に置換した酵素であることを特徴とする、改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子が例示できる。
【００１２】
（４）本願発明は、また、（３）に記載の遺伝子をベクターに挿入した遺伝子組換えベクターである。このような遺伝子組換えベクターとしては、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ由来のものが例示できる。
【００１３】
（５）本願発明は、また、（４）に記載の遺伝子組換えベクターを用いて宿主細胞を形質転換した組換え宿主細胞である。このような宿主細胞としては、大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉが例示できる。
【００１４】
（６）本願発明は、また、（５）に記載の組換え宿主細胞を培養し、培養物から耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを採取する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの製造法である。
【００１５】
（７）本願発明は、また、ＤＮＡを鋳型とし、プライマー、ｄＮＴＰおよび（１）または（２）に記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを反応させて、プライマーを伸長して、ＤＮＡプライマー伸長物を合成することを特徴とする核酸増幅法である。
このような核酸増幅法においては、プライマーが２種のオリゴヌクレオチドであって、一方は他方のＤＮＡ伸長生成物に相補的である方法を用いることができる。また、加熱および冷却を繰り返す方法を用いることができる。
【００１６】
（８）本願発明は、また、一方のプライマーが他方のプライマーのＤＮＡ伸長生成物に相補的である２種のプライマー、ｄＮＴＰおよび（１）または（２）に記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、２価イオン、１価イオンおよび緩衝液を含む核酸増幅用試薬である。
このような核酸増幅用試薬として、一方のプライマーが他方のプライマーのＤＮＡ伸長生成物に相補的である２種のプライマー、ｄＮＴＰおよび（１）または（２）に記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、マグネシウムイオンおよびアンモニウムイオンまたは／およびカリウムイオン、ＢＳＡおよび非イオン界面活性剤および緩衝液を含む核酸増幅用試薬が例示できる。
また、一方のプライマーが他方のプライマーのＤＮＡ伸長生成物に互いに相補的である２種のプライマー、ｄＮＴＰ、（１）または（２）に記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、マグネシウムイオン、アンモニウムイオン及びカリウムイオンからなる群から選ばれる少なくとも１種、ＢＳＡ、非イオン性界面活性剤、緩衝液、及び該耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのポリメラーゼ活性及び３’−５’エキソヌクレアーゼ活性の少なくとも１つの活性を抑制する活性を有する抗体を含有する核酸増幅用試薬が例示できる。
【００１７】
（９）本願発明は、また、（１）または（２）に記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを１種以上混合されたことを特徴とするＤＮＡポリメラーゼ組成物である。
【００１８】
（１０）本願発明は、また、鋳型としてのＤＮＡ、変異導入プライマー、ｄＮＴＰ及び（１）または（２）に記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを反応させることにより、プライマーを伸長させてＤＮＡプライマー伸長物を合成することを含む遺伝子変異導入方法である。
【００１９】
（１１）本願発明は、また、変異導入プライマー、ｄＮＴＰ、及び（１）または（２）に記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含んでなることを特徴とする遺伝子変異導入用試薬である。
【発明の効果】
【００２０】
上述したように、本発明により、ＤＮＡ増幅効率が向上した耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの作製が可能となった。この方法を用いることにより、従来の始原菌由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを様々な用途、すなわち長い領域の増幅や微量な鋳型からの増幅などに使用できるように、改変された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを創出することが可能とするものである。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】各ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ変異体のヒトゲノムＤＮＡを鋳型としたｐ５３遺伝子（４．０ｋｂ）のＰＣＲによる増幅を示す図である。Ａ：ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ− Ｂ：ＨＥ／ＴＣ／ＩＳ Ｃ：ＨＥ／ＮＤ／ＴＣ／ＩＳＭ：マーカー １：鋳型量１０ｎｇ ２：２ｎｇ ３：０．４ｎｇ ４：８０ｐｇ ５：１６ｐｇ
【図２】各ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ変異体のヒトゲノムＤＮＡを鋳型としたβ−ｇｌｏｂｉｎ遺伝子（１７．５ｋｂ）のＰＣＲによる増幅を示す図である。Ｍ：マーカー １：ＫＯＤ ＦＸ ２： ＨＥ／ＲＡ ３：ＨＥ／ＴＣ／ＩＳ ４：ＨＥ／ＮＤ／ＴＣ／ＩＳ
【図３】各ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ変異体のＰＣＲ増幅における変異率（Ｍｕｔａｔｉｏｎｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
以下の説明においてアミノ酸の置換を次のように表す。
例えば「Ｈ１４７Ｅ」は、１４７位のヒスチジンをグルタミン酸に置換した変異体を表す。複数箇所を置換した場合は「／」で区切ってそれぞれの置換を併記して示す。例えば「Ｈ１４７Ｅ／Ｔ４７０Ｃ／Ｉ４７１Ｓ」は、１４７位のヒスチジンをグルタミン酸に置換し、さらに４７０番目のスレオニンと４７１番目のイソロイシンを、それぞれシステインとセリンに置換した変異体を示す。
【００２３】
本発明においては、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列中、ポリメラーゼドメイン（Ｐｏｌ領域）に位置するＦｉｎｇｅｒモチーフ内のループ領域に存在するアミノ酸配列のうち、少なくとも１つのアミノ酸を他のアミノ酸に置換することにより、ＤＮＡ増幅効率を向上させることができる。
実際、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ変異体Ｈ１４７Ｅ／Ｔ４７０Ｃ／Ｉ４７１Ｓ（４７０番目のスレオニンと４７１番目のイソロイシンを、それぞれシステインとセリンに置換）および変異体Ｈ１４７Ｅ／Ｎ２１０Ｄ／Ｔ４７０Ｃ／Ｉ４７１Ｓ（２１０番目のアスパラギン、４７０番目のスレオニンおよび４７１番目のイソロイシンを、それぞれアスパラギン酸、システインおよびセリンに置換）は改変型ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｈ１４７Ｅ）に比べてＤＮＡポリメラーゼ活性がそれぞれ１１６％、１２８％程度と上昇した（表１）。
【００２４】
また、本発明において、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのポリメラーゼドメイン（Ｐｏｌ領域）に位置するＦｉｎｇｅｒモチーフ内 ループ領域に存在するスレオニンをシステインやフェニルアラニンなどの中性アミノ酸に置換すること、および／または該Ｆｉｎｇｅｒ内 ループ領域に存在するイソロイシンをセリンおよびスレオニンのヒドロキシル基をもつ中性アミノ酸に置換することによって、特に低いコピー数のＤＮＡからのＰＣＲ増幅における効率を向上させることができる。
実際、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ変異体Ｈ１４７Ｅ／Ｔ４７０Ｃ／Ｉ４７１Ｓ（４７０番目のスレオニンと４７１番目のイソロイシンを、それぞれシステインとセリンに置換）および変異体Ｈ１４７Ｅ／Ｎ２１０Ｄ／Ｔ４７０Ｃ／Ｉ４７１Ｓ（２１０番目のアスパラギン、４７０番目のスレオニンおよび４７１番目のイソロイシンを、それぞれアスパラギン酸、システインおよびセリンに置換）については、ＰＣＲ効率の上昇を認めることが可能であった（図１、図２）。これら変異体のうちＨ１４７Ｅ／Ｔ４７０Ｃ／Ｉ４７１Ｓにおいては、エキソヌクレアーゼ活性の顕著な低下は見られなかったことから（図３）、該Ｆｉｎｇｅｒ内 ループに存在する４７０番目のスレオニンおよび／または４７１番目のイソロイシンは、エキソヌクレアーゼ活性の強弱とは独立してＰＣＲ効率を左右する役割も担っていることを示唆している。
ＰＣＲ効率（成功率）の向上とは、少ない鋳型（コピー数）から増幅できること（すなわち、ＤＮＡ増幅効率の向上）、あるいは、長いターゲットを増幅できること（すなわち、鎖伸長性の向上）を意味する。これら両方が満たされることは、さらに好ましい。
【００２５】
本発明の一実施態様としては、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列中、ポリメラーゼドメイン（Ｐｏｌ領域）に位置するＦｉｎｇｅｒモチーフ内のループ領域のアミノ酸配列のうち、４７０番目のスレオニンおよび／または４７１番のイソロイシンを他のアミノ酸に置換した酵素であり、ＰＣＲ増幅効率が改変された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼに関する。
【００２６】
３’−５’エキソヌクレアーゼ活性をもつＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列中には、エキソヌクレアーゼ活性に寄与するエキソヌクレアーゼ領域（Ｅｘｏドメイン）と、ポリメラーゼ活性に寄与するポリメラーゼ領域とが存在する。
さらに、ポリメラーゼ領域は２重鎖ＤＮＡの結合を提供すると考えられる大きな裂け目（ｃｌｅｆｔ）を有する。この裂け目は、２組のヘリックスにより形成され、第１の組はｆｉｎｇｅｒモチーフと呼ばれ、第２の組はｔｈｕｍｂモチーフと呼ばれる。裂け目の底は逆平行βシートにより形成され、ｐａｌｍモチーフと呼ばれる。ＤＮＡポリメラーゼ構造の概説は、ＪｏｙｃｅおよびＳｔｅｉｔｚ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６３：７７７−８２２（１９９４）（非特許文献７）において見出され得る。
なかでも、２重鎖ＤＮＡの結合を提供するｆｉｎｇｅｒモチーフは、Ｏ−へリックスおよびＰ−へリックスの２本から成り、ヘリックス同士は数アミノ酸残基のループでつながれている。このループ領域のアミノ酸配列のうち、４７０番目のスレオニンおよび／または４７１番のイソロイシンを他のアミノ酸に置換した酵素であり、ＰＣＲ増幅効率が改変された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼに関する。
【００２７】
特開２００５−６５５４０（特許文献６）には、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ変異体（Ｈ１４７Ｅ）の結晶のＸ線回折データの知見が記載されていて、Ｆｉｎｇｅｒモチーフ（ドメイン）、ループ領域（構造）などを含めた構造解析がなされている。
【００２８】
また、本発明の別な実施態様としては、下記性質を有する改変された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼがある。
（１）熱安定性：ｐＨ８．８（２５℃での測定値）にて９５℃、６時間の処理で６０％以上の残存活性を保持することができる
（２）至適温度：約６５〜７５℃
（３）分子量：８８〜９０ＫＤａ（計算値）であり、下記（４）のスレオニンおよび／またはイソロイシン以外において、糖鎖や欠失、挿入、又は１又は数個のアミノ酸の欠失、置換、挿入、付加があってもよい。
（４）アミノ酸配列：配列番号１に記載のポリメラーゼドメイン（Ｐｏｌ領域） に位置するＦｉｎｇｅｒモチーフ内の ループ領域のアミノ酸配列のうち、４７０番目のスレオニンおよび／または４７１番のイソロイシンを他のアミノ酸に置換したアミノ酸配列を有する。
【００２９】
本発明の更に具体的な例としては、配列番号１に記載のアミノ酸配列中、第４７０番目のスレオニン残基をシステイン、フェニルアラニンおよびトリプトファンのいずれかに置換した耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを挙げることができる。また、配列番号１に記載のアミノ酸配列中、第４７１番目のイソロイシン残基をスレオニンおよびセリンのいずれかに置換した耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを挙げることができる。
ここで、本願発明において、配列番号１に記載のアミノ酸配列とは、第４７０番目のスレオニン残基および／または第４７１番目のイソロイシン以外のアミノ酸のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＤＮＡポリメラーゼ活性を有するものも含むものである。好ましくは、配列番号１のアミノ酸配列と９５％以上の相同性を有する範囲で、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加され、且つＤＮＡポリメラーゼ活性を有するものも含むものが挙げられる。
【００３０】
本発明において、ＤＮＡポリメラーゼ活性とは鋳型ＤＮＡにアニールされたオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの３’−ヒドロキシル基にデオキシヌクレオチド５’−トリホスフェートのα−ホスフェートを共有結合せしめることにより、デオキシリボ核酸にデオキシリボヌクレオチド５’−モノホスフェートを鋳型依存的に導入する反応を触媒する活性をいう。
【００３１】
［ＤＮＡポリメラーゼ活性測定法］
酵素活性が強い場合には、保存緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），５０ｍＭ ＫＣｌ，１ｍＭ ジチオスレイトール，０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０，０．１％ Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ４０，５０％ グリセリン）でサンプルを希釈して測定を行う。
（１）下記のＡ液２５μｌ、Ｂ液５μｌ、Ｃ液５μｌ、滅菌水１０μｌ、及び酵素溶液５μｌをマイクロチューブに加えて７５℃にて１０分間反応する。
（２）その後氷冷し、Ｅ液５０μｌ、Ｄ液１００μｌを加えて、攪拌後更に１０分間氷冷する。
（３）この液をガラスフィルター（ワットマン製ＧＦ／Ｃフィルター）で濾過し、０．１Ｎ 塩酸およびエタノールで十分洗浄する。
（４）フィルターの放射活性を液体シンチレーションカウンター（パッカード製）で計測し、鋳型ＤＮＡのヌクレオチドの取り込みを測定する。
酵素活性の１単位はこの条件で３０分当りの１０ｎｍｏｌのヌクレオチドを酸不溶性画分（即ち、Ｄ液を添加したときに不溶化する画分）に取り込む酵素量とする。
Ａ：４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）１６ｍＭ 塩化マグネシウム１５ｍＭ ジチオスレイトール１００μｇ／ｍｌ ＢＳＡ（牛血清アルブミン）
Ｂ：１．５μｇ／μｌ 活性化仔牛胸腺ＤＮＡ
Ｃ：１．５ｍＭ ｄＮＴＰ（２５０ｃｐｍ／ｐｍｏｌ ［３Ｈ］ｄＴＴＰ）
Ｄ：２０％ トリクロロ酢酸（２ｍＭピロリン酸ナトリウム）
Ｅ：１ｍｇ／ｍｌ仔牛胸腺ＤＮＡ
【００３２】
［ＤＮＡポリメラーゼの正確性］
また、本発明において、ＤＮＡポリメラーゼの正確性とはＤＮＡ複製時における塩基の取り込みの正確性をいう。本発明におけるＤＮＡポリメラーゼの正確性の評価には、各変異型（改変型）ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼでターゲットを増幅後、ＴＡクローンニングを行って大腸菌を形質転換し、ターゲットの塩基配列を解析して変異塩基の型と頻度を算出する。
【００３３】
［正確性（Ｆｉｄｅｌｉｔｙ）測定法］
４９μｌの反応液（１×ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ｂｕｆｆｅｒ（東洋紡績製）、０．９ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、５０ ｎｇヒトゲノムＤＮＡ（Ｒｏｃｈｅ社製）、１０ｐｍｏｌの配列番号１０及び１１に記載のプライマー）に酵素（１Ｕ／μｌ）を１μｌ加えてＰＣＲを実施する。ここでは、サーマルサイクラーはＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社 ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ＧｅｎｅＡｍｐ９７００を用いて以下のように行う。すなわち、９４℃、２分行った後、９４℃、１５秒→６０℃、３０秒→６８℃、２．５分を２７サイクル行う。また、同時に天然型ＫＯＤポリメラーゼ（東洋紡製）についても増幅反応を実施する。
ＰＣＲ終了後ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒＲ −ＰＣＲ ＆ Ｇｅｌ Ｃｌｅａｎ ｕｐ−（東洋紡社製）でＰＣＲ産物の精製を行う。精製産物には、最終濃度が１×Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．２ ｍＭ ｄＮＴＰｓになるように各試薬を添加する。さらにＴＡｒｇｅｔ Ｃｌｏｎｅ −Ｐｌｕｓ−（東洋紡社製）にてＴＡクローニングを行い、エシェリシア・コリＤＨ５α株のコンピテントセルを用いて形質転換する。自動核酸抽出装置でクローンから抽出したプラスミドを鋳型として、配列番号１２及び１３に記載のシーケンスプライマーを用いてターゲット領域約１ ｋｂのシーケンス解析を実施する。配列データは、ソフトウエアＳｅｑｕｅｃｈｅｒ ｖｅｒ４．５を使用しアラインメント解析を行い、変異塩基の位置とその数、変異型について集計し変異挿入率を算出する。
【００３４】
これらの改変された酵素を製造する方法としては、従来の公知の方法が使用できる。
例えば、野生型ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子に変異を導入して、タンパク質工学的手法により新たな機能を有する変異型（改変型）ＤＮＡポリメラーゼを製造する方法がある（Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６４（１１）， ６４４７−６４５８（１９８９））（非特許文献２）。
変異を導入するＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子は特に限定されないが、例えば、パイロコッカス・コダカラエンシスＫＯＤ１株由来の配列表・配列番号１に記載の遺伝子が挙げられる。
また同様に、パイロコッカス・フリオサス（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．， ２１ （２）， ２５９−２６５（１９９３））（非特許文献３）、サーモコッカス・リトラリス（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８９， ５５７７−５５８１（１９９２））（非特許文献４）なども例示することができる。
野生型ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子に変異を導入する方法は既知のいかなる方法を用いてもよい。例えば、野生型ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子と変異原となる薬剤を接触させる方法や紫外線照射による方法などからタンパク質工学的手法、例えばＰＣＲや部位特異的変異などの方法を用いることができる。
【００３５】
本発明で使用したＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキット（ストラタジーン製）は、（１）目的とする遺伝子を挿入したプラスミドを変性させ、該プラスミドに変異プライマーをアニーリングさせ、続いてＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼを用いて伸長反応を行う、（２）（１）のサイクルを１５回繰り返す、（３）例えば、制限酵素ＤｐｎＩを用いて鋳型としたプラスミドのみを選択的に切断する、（４）新たに合成されたプラスミドにより大腸菌を形質転換し、目的とする変異の導入されたプラスミドを保有する形質転換体を取得することのできるキットである。
【００３６】
上記改変ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を必要に応じて発現ベクターに移し替え、宿主として例えば大腸菌を該発現ベクターを用いて形質転換した後、アンピシリン等の薬剤を含む寒天培地に塗布し、コロニーを形成させる。コロニーを栄養培地、例えばＬＢ培地や２×ＹＴ培地に接種し、３７℃で１２〜２０時間培養した後、菌体を破砕して粗酵素液を抽出する。ベクターとしては、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ由来のものが好ましい。菌体を破砕する方法としては公知のいかなる手法を用いても良いが、例えば超音波処理、フレンチプレスやガラスビーズ破砕のような物理的破砕法やリゾチームのような溶菌酵素を用いることができる。 この粗酵素液を８０℃、３０分間熱処理し、宿主由来のポリメラーゼを失活させ、ＤＮＡポリメラーゼ活性を測定する。
【００３７】
上記方法により選抜された菌株から精製ＤＮＡポリメラーゼを取得する方法は、いかなる手法を用いても良いが、例えば下記のような方法がある。栄養培地に培養して得られた菌体を回収した後、酵素的または物理的破砕法により破砕抽出して粗酵素液を得る。得られた粗酵素抽出液から熱処理、例えば８０℃、３０分間処理し、その後硫安沈殿によりＤＮＡポリメラーゼ画分を回収する。この粗酵素液をセファデックスＧ−２５（アマシャムファルマシア・バイオテク製）を用いたゲル濾過等の方法により脱塩を行うことができる。この操作の後、ヘパリンセファロースカラムクロマトグラフィーにより分離、精製し、精製酵素標品を得ることができる。該精製酵素標品はＳＤＳ−ＰＡＧＥによってほぼ単一バンドを示す程度に純化される。
【００３８】
また、得られた酵素を用いてＰＣＲ増幅を行うことにより、その増幅の有無もしくは強度からＰＣＲ効率の評価を行うことができる。本発明の改変されたＤＮＡポリメラーゼは、遺伝子の増幅効率の点で優れており、ＰＣＲに利用できる。
【００３９】
また、本発明の核酸増幅ないし伸長方法は、本発明の改変された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを使用して、ＤＮＡを鋳型とし、少なくとも１種のプライマー、ｄＮＴＰ（即ち、４種類のデオキシリボヌクレオチド３リン酸）を反応させることによりプライマーを伸長して、ＤＮＡプライマー伸長物を合成する方法を含む。該方法は、１種のプライマーを用いて、核酸を伸長する方法を含む。
具体的には、プライマーエクステンション法、シークエンス法、従来の温度サイクルを行わない方法およびサイクルシーケンス法を含む。
【００４０】
また、本発明の方法は、２種以上のプライマーを用いてＰＣＲ法により核酸を増幅させる方法も含む。好ましくは、プライマーは２種のオリゴヌクレオチドであって、互いに一方は他方のＤＮＡ生成物に相補的であるプライマーであることが好ましい。また、加熱および冷却を繰り返すのが好ましい。
具体的には、ＰＣＲ法に基づく遺伝子増幅方法は、標的核酸、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸、一対のプライマー及び本発明の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの存在下で、変性、アニーリング、伸長の３工程からなるサイクルを繰り返すことにより、上記一対のプライマーで挟まれる標的核酸の領域を指数関数的に増幅させる方法である（Ｎａｔｕｒｅ， ３２４ （６０９３）， １３−１９（１９８６））（非特許文献５）。
すなわち、変性工程で試料の核酸を変性し、続くアニーリング工程において各プライマーと、それぞれに相補的な一本鎖標的核酸上の領域とをハイブリダイズさせ、続く伸長工程で、各プライマーを起点としてＤＮＡポリメラーゼの働きにより鋳型となる各一本鎖標的核酸に相補的なＤＮＡ鎖を伸長させ、二本鎖ＤＮＡとする。この１サイクルにより、１本の二本鎖ＤＮＡが２本の二本鎖ＤＮＡに増幅される。従って、このサイクルをｎ回繰り返せば、理論上上記一対のプライマーで挟まれた試料ＤＮＡの領域は２ｎ倍に増幅される。
【００４１】
本発明のＤＮＡポリメラーゼは、その活性を維持するために、例えばマグネシウムイオンのような２価のイオン、及び例えばアンモニウムイオン及び／又はカリウムイオンのような１価のイオンを共存させることが好ましい。
また、ＰＣＲ反応液には、緩衝液及びこれらのイオンを含むと共に、ＢＳＡ、例えばＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００のような非イオン性界面活性剤、及び緩衝液が存在してもよい。
緩衝剤としては、トリスやヘペスなどのグッドバッファーおよび、リン酸緩衝液などが用いられる。
【００４２】
本発明の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いたときのＰＣＲの具体的一態様としては、反応緩衝液（１２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）， １０ｍＭ ＫＣｌ， ６ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４， ０．１％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００， １０μｇ／ｍｌ ＢＳＡ），プライマー各０．４ｐｍｏｌ／μｌ， ｄＮＴＰｓ ０．２ｍＭ， 鋳型ＤＮＡ０．２ｎｇ／μｌ及び本発明のＤＮＡポリメラーゼ０．０５ｕ／μｌを含有する溶液を９４℃；１５秒、６５℃；２秒、７４℃；３０秒の温度サイクルを２５回程度行う。
【００４３】
本発明の核酸増幅用試薬は、一方のプライマーが他方のプライマーのＤＮＡ伸長生成物に互いに相補的である２種のプライマー、ｄＮＴＰ、及び上記のような本発明における耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、２価イオン、１価イオン、及び緩衝液を含み、さらに具体的には、一方のプライマーが他方のプライマーＤＮＡ伸長生成物に相補的である２種のプライマー、ｄＮＴＰ及び上記耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、マグネシウムイオン、アンモニウムイオン及び／又はカリウムイオン、ＢＳＡ、上述のような非イオン界面活性剤及び緩衝液を含む。
【００４４】
本発明の核酸増幅用試薬の別な態様としては、一方のプライマーが他方のプライマーのＤＮＡ伸長生成物に互いに相補的である２種のプライマー、ｄＮＴＰ及び上述したような本発明における耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、２価イオン、１価イオン、緩衝液、及び必要に応じて耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのポリメラーゼ活性及び／又は３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を抑制する活性を有する抗体を含む核酸増幅用試薬がある。
該抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体などが挙げられる。
本核酸増幅用試薬は、ＰＣＲの感度上昇、非特異増幅の軽減に特に有効である。
【００４５】
本発明の遺伝子変異導入用試薬は、一方のプライマーが他方のプライマーのＤＮＡ伸長生成物に互いに相補的である変異導入プライマー、ｄＮＴＰ、及び上述したような本発明における耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含む。
さらに上述したような２価イオン、１価イオン、緩衝液を含んでもよい。本発明における変異導入プライマーは、その長さが２０〜１５０塩基程度であり、共にその配列のほぼ中央あたりに変異部分、即ち、鋳型のなるＤＮＡ配列と異なる部分（例えば、挿入、欠失、置換）を含み、互いに相補的である。
【００４６】
本発明の遺伝子増幅用試薬及び遺伝子変異用試薬において、緩衝液としては、トリスやヘペスなどのグッドバッファーおよび、リン酸緩衝液などが用いられるが、具体的には、１０〜２００ｍＭの各種バッファー（ｐＨ７．５〜９．０（ａｔ ２５℃））が例示できる。
また、マグネシウムイオンやマンガンイオンのような２価のイオンの濃度は、反応段階で０．５〜２ｍＭ、及び例えばアンモニウムイオン及び／又はカリウムイオンのような１価のイオンの濃度は、反応の段階で１０〜１００ｍＭ程度となるようなものがよい。
本発明のＤＮＡポリメラーゼは、反応の段階で０．０１〜０．１単位／μｌ程度となるようなものがよい。また、プライマーの濃度は、０．２〜２ｐｍｏｌ／μｌ程度である。
【００４７】
また、本発明の実施態様としては、上述したような本発明における耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを１種又は２種以上混合したことを特徴とするＤＮＡポリメラーゼ組成物がある。
具体的には、上述のような本発明における耐熱性ＤＮＡポリメラーゼと別なＤＮＡポリメラーゼ、例えば３’−５’エキソヌクレアーゼ活性の低いＤＮＡポリメラーゼなどを混合せしめることによって、長鎖核酸を増幅する場合（例えばｌｏｎｇＰＣＲ）に有用な組成物を得ることができる。
実際、長鎖核酸を増幅する方法として、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を欠くＴａｑポリメラーゼと３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＰｆｕポリメラーゼまたはＴｉポリメラーゼまたはこれらの変異酵素を混合したＤＮＡポリメラーゼ組成物を用いて、ＰＣＲを行う方法が報告されている（Ｂａｒｎｓ， Ｗ．Ｍ．（１９９４） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１， ２２１６−２２２０）（非特許文献６）。
【００４８】
本発明においては、本発明のＤＮＡポリメラーゼとＴｔｈポリメラーゼとの組み合わせや、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性の高いＤＮＡポリメラーゼと本発明のＤＮＡポリメラーゼ活性の高い本発明のＤＮＡポリメラーゼとの見合わせが例示できる。本発明のＤＮＡポリメラーゼ組成物に添加することができる他の成分は、該ＤＮＡポリメラーゼの活性を抑制する抗体などが例示できる。
【実施例１】
【００４９】
以下に、実施例を用いて本発明をより具体的に説明する。
実施例１
ＫＯＤ１株由来の改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を含有するプラスミド、ｐＫＯＤ Ｈ１４７Ｅを回収した。ＫＯＤ１株由来のＤＮＡポリメラーゼ遺伝子は２３２５塩基からなり、７７０個のアミノ酸がコードされていた（配列番号１）。該プラスミドの作製はＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ ｓｉｔｅ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｋｉｔ（ストラタジーン製）を用いた。方法は取扱い説明書に準じて行った。変異作製用プライマーとしては、配列番号２及び３に記載されるプライマーを使用した。なお、変異体の確認は塩基配列の解読で行った。得られたプラスミドによりエシェリシア・コリＪＭ１０９を形質転換し、エシェリシア・コリＪＭ１０９株（ｐＫＯＤ Ｈ１４７Ｅ／Ｔ４７０Ｃ／Ｉ４７１Ｓ）を得た。
【実施例２】
【００５０】
実施例２
得られた菌体の培養は以下のようにして実施した。まず、滅菌処理した１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＴＢ培地（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ、ｐ．Ａ．２）１Ｌを２Ｌ坂口フラスコ３本に分注した。この培地に予め１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する８０ｍｌのＬＢ培地（１％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％塩化ナトリウム；ギブコ製）で３７℃、１６時間培養したエシェリシア・コリＪＭ１０９（ｐＫＯＤ Ｈ１４７Ｅ／Ｔ４７０Ｃ／Ｉ４７１Ｓ）（５００ｍｌ坂口フラスコ使用）を接種し、３５℃にて１２時間通気培養した。培養液より菌体を遠心分離により回収し、４００ｍｌの破砕緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、８０ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ２−メルカプトエタノール、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に懸濁後、フレンチプレス処理により菌体を破砕し、細胞破砕液を得た。次に細胞破砕液を８５℃にて３０分間処理した後、遠心分離にて不溶性画分を除去した。更に、ポリエチレンイミンを用いた除核酸処理、硫安塩析、ヘパリンセファロースクロマトグラフィーを行い、最後に保存緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ 塩化カリウム、１ｍＭ ジチオスレイトール、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０、０．１％ノニデットＰ４０、５０％グリセリン）に置換し、改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（Ｈ１４７Ｅ／Ｔ４７０Ｃ／Ｉ４７１Ｓ）を得た。上記精製工程のＤＮＡポリメラーゼ活性測定は以下の操作で行った。また、酵素活性が高い場合はサンプルを希釈して測定を行った。
【００５１】
（試薬）
Ａ液：４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）、１６ｍＭ 塩化マグネシウム、１５ｍＭ ジチオスレイトール１００μｇ／ｍｌ ＢＳＡ
Ｂ液： １．５μｇ／μｌ 活性化仔牛胸腺ＤＮＡ
Ｃ液： １．５ｍＭ ｄＮＴＰ（２５０ｃｐｍ／ｐｍｏｌ ［３Ｈ］ｄＴＴＰ）
Ｄ液： ２０％ トリクロロ酢酸（２ｍＭピロリン酸ナトリウム）
Ｅ液： １ｍｇ／ｍｌ仔牛胸腺ＤＮＡ
【００５２】
（方法）
Ａ液２５μｌ、Ｂ液５μｌ、Ｃ液５μｌ及び滅菌水１０μｌをマイクロチューブに加えて攪拌混合後、上記精製酵素希釈液５μｌを加えて７５℃で１０分間反応する。その後冷却し、Ｅ液５０μｌ、Ｄ液１００μｌを加えて、攪拌後更に１０分間氷冷する。この液をガラスフィルター（ワットマン製ＧＦ／Ｃフィルター）で濾過し、０．１Ｎ塩酸及びエタノールで十分洗浄し、フィルターの放射活性を液体シンチレーションカウンター（パッカード製）を用いて計測し、鋳型ＤＮＡへのヌクレオチドの取り込みを測定した。酵素活性の１単位はこの条件下で３０分当り１０ｎｍｏｌのヌクレオチドを酸不溶性画分に取り込む酵素量とした。
【００５３】
【表１】
【実施例３】
【００５４】
実施例３
変異体（Ｈ１４７Ｅ／Ｔ４７０Ｃ／Ｉ４７１Ｓ）遺伝子の作製及び改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの精製実施例１と同様の方法にて、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼの第２１０番目のアスパラギン（Ａｓｎ）をアスパラギン酸（Ａｓｐ）に置換した耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を作製した（ｐＫＯＤ Ｈ１４７Ｅ／Ｎ２１０Ｄ／Ｔ４７０Ｃ／Ｉ４７１Ｓ）。変異プライマーとしては、配列番号４及び５に記載されるプライマーを使用した。更に、実施例２と同様の精製方法にて改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（Ｈ１４７Ｅ／Ｎ２１０Ｄ／Ｔ４７０Ｃ／Ｉ４７１Ｓ）を得た。
【実施例４】
【００５５】
実施例４
改変型ＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲ例（１）
野生型（ＷＴ）ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ（ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績製））、並びに改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは４９μｌの反応液（１×ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ｂｕｆｆｅｒ（東洋紡績製）、０．９ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、１０ｎｇのヒトゲノムＤＮＡ（Ｒｏｃｈｅ社製）、１０ｐｍｏｌの配列番号６及び７に記載のプライマー）に各酵素（１Ｕ／μｌ）を１μｌを加えてＰＣＲを実施した。サーマルサイクラーはＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社 ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ＧｅｎｅＡｍｐ９７００を用いて、以下のように行った。すなわち、９４℃、２分反応を行った後、９４℃、２０秒→６０℃、３０秒→６８℃、４分を３０サイクル行った。反応終了後１０μｌの反応液についてアガロース電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色し、紫外線照射下約４．０ｋｂの増幅ＤＮＡ断片を確認した。図１にアガロースゲル電気泳動の写真を示した。この結果より、変異体Ｈ１４７Ｅ／Ｔ４７０Ｃ／Ｉ４７１Ｓ、Ｈ１４７Ｅ／Ｎ２１０Ｄ／Ｔ４７０Ｃ／Ｉ４７１Ｓを用いた場合、特に低いコピー数の鋳型ＤＮＡ（１６ｐｇ）からの増幅において、野生型のＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼを用いるよりも良好な増幅を示すことが証明された。
【実施例５】
【００５６】
実施例５
改変型ＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲ例（２）
実施例１で良好な結果の得られた改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼＨ１４７Ｅ／Ｔ４７０Ｃ／Ｉ４７１Ｓ、Ｈ１４７Ｅ／Ｎ２１０Ｄ／Ｔ４７０Ｃ／Ｉ４７１Ｓについて更にサイズの大きな遺伝子の増幅を試みた。４９μｌの反応液（１×ＫＯＤ ＦＸ ｂｕｆｆｅｒ（東洋紡績製）、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、２００ｎｇヒトゲノムＤＮＡ（Ｒｏｃｈｅ社製）、１０ｐｍｏｌの配列番号８及び９に記載のプライマー）に各酵素（１Ｕ／μｌ）を１μｌ加えてＰＣＲを実施した。サーマルサイクラーはＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社 ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ＧｅｎｅＡｍｐ９７００を用いて以下のように行った。すなわち、９４℃、２分反応後、９８℃、１０秒→７４℃、２４分（５サイクル）→９８℃、１０秒→７２℃、２４分（５サイクル）→９８℃、１０秒→７０℃、２４分（５サイクル）→９８℃、１０秒→６８℃、２４分（２０サイクル）→６８℃、７分のステップダウンで行った。反応終了後、１０μｌの反応液についてアガロース電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色して紫外線照射下約１７．５ｋｂの増幅断片を確認した。その結果、野生型のＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼを用いるよりも良好な増幅を確認することができた（図２）。
【実施例６】
【００５７】
実施例６
改変型ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼの正確性の測定
野生型（ＷＴ）ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ（ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績製））及び改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼについて正確性を以下の方法にて測定した。４９μｌの反応液（１×ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ｂｕｆｆｅｒ（東洋紡績製）、０．９ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、５０ ｎｇヒトゲノムＤＮＡ（Ｒｏｃｈｅ社製）、１０ｐｍｏｌの配列番号１０及び１１に記載のプライマー）に酵素（１Ｕ／μｌ）を１μｌ加えてＰＣＲを実施した。ここでは、サーマルサイクラーはＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社 ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ＧｅｎｅＡｍｐ９７００を用いて以下のように行った。すなわち、９４℃、２分行った後、９４℃、１５秒→６０℃、３０秒→６８℃、２．５分を２７サイクル行った。また、同時に野生型ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績製）についても増幅反応を実施した。
【００５８】
ＰＣＲ終了後ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒＲ −ＰＣＲ ＆ Ｇｅｌ Ｃｌｅａｎ ｕｐ−（東洋紡績製）でＰＣＲ産物の精製を行った。精製産物には、最終濃度が１×Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．２ ｍＭ ｄＮＴＰｓになるように各試薬を添加した。さらにＴＡｒｇｅｔ Ｃｌｏｎｅ −Ｐｌｕｓ−（東洋紡績製）にてＴＡクローニングを行い、エシェリシア・コリＤＨ５α株のコンピテントセルを用いて形質転換した。自動核酸抽出装置でクローンから抽出したプラスミドを鋳型として、配列番号１２及び１３に記載のシーケンスプライマーを用いてターゲット領域約１ ｋｂのシーケンス解析を実施した。配列データは、ソフトウエアＳｅｑｕｅｃｈｅｒ ｖｅｒ４．５を使用しアラインメント解析を行い、変異塩基の位置とその数、変異型について集計し変異挿入率を算出した。この変異率が低いほど、ＤＮＡ複製時のＤＮＡポリメラーゼの正確性が良いことを示している。変異挿入率は、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績製）は１０．３×１０−５、Ｈ１４７Ｅ／Ｔ４７０Ｃ／Ｉ４７１Ｓは１３．７×１０−５であり、変異体Ｈ１４７Ｅ／Ｔ４７０Ｃ／Ｉ４７１ＳはＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−に相当する高正確性を保持していた（図３）。
【産業上の利用可能性】
【００５９】
本発明により、ＤＮＡ増幅効率が向上した耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの作製が可能となった。この方法を用いることにより、従来の始原菌由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを様々な用途、すなわち長い領域の増幅や微量な鋳型からの増幅などに使用できるように、改変された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを創出することが可能となる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列のうち、ポリメラーゼドメイン（Ｐｏｌ領域）に位置するＦｉｎｇｅｒモチーフ内のループ領域のアミノ酸配列のうち、少なくとも１つのアミノ酸を他のアミノ酸に置換した酵素であることを特徴とする、改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項２】
配列表の配列番号１に記載されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなる、請求項１に記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項３】
請求項１または２に記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子
【請求項４】
請求項３に記載の遺伝子をベクターに挿入した遺伝子組換えベクター。
【請求項５】
請求項４に記載の遺伝子組み換えベクターを用いて宿主細胞を形質転換した組換え宿主細胞。
【請求項６】
請求項５に記載の組換え宿主細胞を培養し、培養物から耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを採取することを特徴とする耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの製造法。
【請求項７】
ＤＮＡを鋳型とし、プライマー、ｄＮＴＰおよび請求項１または２に記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを反応させて、プライマーを伸長して、ＤＮＡプライマー伸長物を合成することを特徴とする核酸増幅法。
【請求項８】
一方のプライマーが他方のプライマーのＤＮＡ伸長生成物に相補的である２種のプライマー、ｄＮＴＰおよび請求項１または２に記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、２価イオン、１価イオンおよび緩衝液を含む核酸増幅用試薬。
【請求項９】
請求項１または２に記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを１種以上混合されたことを特徴とするＤＮＡポリメラーゼ組成物。
【請求項１０】
鋳型としてのＤＮＡ、変異導入プライマー、ｄＮＴＰ及び請求項１または２に記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを反応させることにより、プライマーを伸長させてＤＮＡプライマー伸長物を合成することを含む遺伝子変異導入方法。
【請求項１１】
変異導入プライマー、ｄＮＴＰ、及び請求項１または２に記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含んでなることを特徴とする遺伝子変異導入用試薬。
【請求項１】
３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列のうち、ポリメラーゼドメイン（Ｐｏｌ領域）に位置するＦｉｎｇｅｒモチーフ内のループ領域のアミノ酸配列のうち、少なくとも１つのアミノ酸を他のアミノ酸に置換した酵素であることを特徴とする、改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項２】
配列表の配列番号１に記載されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなる、請求項１に記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項３】
請求項１または２に記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子
【請求項４】
請求項３に記載の遺伝子をベクターに挿入した遺伝子組換えベクター。
【請求項５】
請求項４に記載の遺伝子組み換えベクターを用いて宿主細胞を形質転換した組換え宿主細胞。
【請求項６】
請求項５に記載の組換え宿主細胞を培養し、培養物から耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを採取することを特徴とする耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの製造法。
【請求項７】
ＤＮＡを鋳型とし、プライマー、ｄＮＴＰおよび請求項１または２に記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを反応させて、プライマーを伸長して、ＤＮＡプライマー伸長物を合成することを特徴とする核酸増幅法。
【請求項８】
一方のプライマーが他方のプライマーのＤＮＡ伸長生成物に相補的である２種のプライマー、ｄＮＴＰおよび請求項１または２に記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、２価イオン、１価イオンおよび緩衝液を含む核酸増幅用試薬。
【請求項９】
請求項１または２に記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを１種以上混合されたことを特徴とするＤＮＡポリメラーゼ組成物。
【請求項１０】
鋳型としてのＤＮＡ、変異導入プライマー、ｄＮＴＰ及び請求項１または２に記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを反応させることにより、プライマーを伸長させてＤＮＡプライマー伸長物を合成することを含む遺伝子変異導入方法。
【請求項１１】
変異導入プライマー、ｄＮＴＰ、及び請求項１または２に記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含んでなることを特徴とする遺伝子変異導入用試薬。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２０１０−２３９８８１（Ｐ２０１０−２３９８８１Ａ）
【公開日】平成２２年１０月２８日（２０１０．１０．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−９００６８（Ｐ２００９−９００６８）
【出願日】平成２１年４月２日（２００９．４．２）
【出願人】（０００００３１６０）東洋紡績株式会社 (3,622)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１０月２８日（２０１０．１０．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年４月２日（２００９．４．２）
【出願人】（０００００３１６０）東洋紡績株式会社 (3,622)
【Ｆターム（参考）】
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