新規なプロテアーゼ遺伝子、組換え体ＤＮＡ及びプロテアーゼの製造法
【課題】醤油及び酵素分解調味料等の原料に存在するタンパク質を分解することができる新規プロテアーゼ、該プロテアーゼをコードする新規遺伝子、該遺伝子を含む組換え体ＤＮＡ、該組換え体ＤＮＡを含む形質転換体又は形質導入体及び該形質転換体又は形質導入体を用いたプロテアーゼの製造法を提供する。
【解決手段】特定のアミノ酸配列を含むプロテアーゼ活性を有するタンパク質等、該タンパク質等をコードする遺伝子、該遺伝子を含有する組換えベクター、該組換えベクターを含む形質転換体、及び、該形質転換体を培養し、得られる培養物からプロテアーゼを回収することを特徴とする該プロテアーゼの製造方法。
【解決手段】特定のアミノ酸配列を含むプロテアーゼ活性を有するタンパク質等、該タンパク質等をコードする遺伝子、該遺伝子を含有する組換えベクター、該組換えベクターを含む形質転換体、及び、該形質転換体を培養し、得られる培養物からプロテアーゼを回収することを特徴とする該プロテアーゼの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なプロテアーゼ遺伝子、組換え体ＤＮＡ、及びプロテアーゼの製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
麹カビであるアスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）およびアスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｏｊａｅ）は、古くから日本における醸造食品の製造に用いられてきた糸状菌であり、ともに産業上非常に重要な微生物である (非特許文献１)。
【０００３】
このうち、アスペルギルス・オリゼーは醤油、味噌、日本酒の醸造など幅広い用途に用いられている。なかでもアスペルギルス・オリゼーＲＩＢ４０株については、そのゲノム解析が実施され、２００５年に公開されている(非特許文献２)。一方アスペルギルス・ソーヤは、主として醤油醸造に用いられる微生物であり、本菌に関してのゲノム解析は、本願出願の時点において公開されているものはない。
【０００４】
しょうゆ醸造において麹カビの生産する数多くの酵素は、原料分解という重要な役割を担っている。なかでもプロテアーゼは複数の異なった性質の酵素群が協調して働くことで、原料中のタンパク質を分解・可溶化させる働きをしているため、しょうゆ醸造にとって極めて重要である。（非特許文献１、３）麹カビのエンド型プロテアーゼとしては、酸性プロテアーゼ アスペルギロペプシン Ｉ（ＥＣ３．４．２３．１８）、中性プロテアーゼ（ＥＣ３．４．２４．２７）、デューテロライシン（中性プロテアーゼＩＩ）（ＥＣ３．４．２４．３９）およびアルカリプロテアーゼ（ＥＣ３．４．２１．６３）などが知られている。エキソ型プロテアーゼとしては、酸性カルボキシペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１６．５）、ロイシルアミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）のようなアミノペプチダーゼ（３．４．１１）やジペプチダーゼなどが知られている（非特許論文３）。しょうゆの生産性と品質の向上をはかるためには、これら既知プロテアーゼの生産量を増やす方法も考えられるが、これまでに知られていない新規プロテアーゼを積極的に活用していくことも、有効な手段と成りうると考えられる。そこで我々は、ゲノム情報が未知であるアスペルギルス・ソーヤのゲノム解析を実施し、目的とするプロテアーゼ遺伝子を見出し、さらにその遺伝子産物の酵素化学的な解析を行うことで、しょうゆ及び酵素分解調味液等の醸造に重要なプロテアーゼ遺伝子を得る事を試み、本発明を完成させるに至った。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】醤油の科学と技術、栃倉辰六郎編集
【非特許文献２】Ｎａｔｕｒｅ； ４３８， １１５７−１１６１ （２００５）
【非特許文献３】ものと人間の文化史１３８ 麹（こうじ）、一島 英治 著
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、しょうゆ及び酵素分解調味料等の原料に存在するタンパク質を分解することができる新規プロテアーゼ、該プロテアーゼをコードする新規遺伝子、該遺伝子を含む組換え体ＤＮＡ、該組換え体ＤＮＡを含む形質転換体又は形質導入体及び該形質転換体又は形質導入体を用いたプロテアーゼの製造法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者等は、上記課題について種々検討した結果、アスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｏｊａｅ）由来のプロテアーゼ遺伝子を単離し、該遺伝子を酵母および麹菌にて発現し、該発現タンパク質のプロテアーゼ活性を確認し、本発明を完成した。
【０００８】
即ち、第１の発明は、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質である。
（ａ）配列番号２、配列番号４、配列番号６および配列番号８に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（ｂ）配列番号２、配列番号４、配列番号６および配列番号８に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個（２〜５個）のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつプロテアーゼ活性を有するタンパク質
【０００９】
第２の発明は、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質（プロテアーゼ）をコードするプロテアーゼ遺伝子である。
（ａ）配列番号２、配列番号４、配列番号６および配列番号８に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（ｂ）配列番号２、配列番号４、配列番号６および配列番号８に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個（２〜５個）のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、プロテアーゼ活性を有するタンパク質
【００１０】
第３の発明は、以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡからなるプロテアーゼ遺伝子である。
（ａ）配列番号１、配列番号３、配列番号５および配列番号７に示される塩基配列からなるＤＮＡ（ｂ）配列番号１、配列番号３、配列番号５および配列番号７に示される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、プロテアーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡである。
【００１１】
第４の発明は、上記プロテアーゼ遺伝子をベクターＤＮＡに挿入したことを特徴とする新規な組換え体ＤＮＡである。第５の発明は、上記組換え体ＤＮＡを含む形質転換体又は形質導入体である。第６の発明は、上記形質転換体又は形質導入体を培地に培養し、培養物からプロテアーゼを採取することを特徴とするプロテアーゼの製造法である。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、新規プロテアーゼ、プロテアーゼ遺伝子、該遺伝子を含む組換えベクター及び形質転換体を提供することができる。また、本発明によりプロテアーゼの生産方法を提供することができる。その結果、麹菌によるプロテアーゼの効率的な生産が行えるようになる。さらに、上記プロテアーゼのタンパク質工学的な改良が行えるようになるとともに、食品加工用の酵素生産、醸造食品の生産に用いる微生物の改良にも用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】ＲＴ−ＰＣＲによる４種新規プロテアーゼｃＤＮＡの増幅
【図２】ゲノム上存在する新規プロテアーゼ遺伝子のエクソン‐イントロン構造
【図３】４種新規プロテアーゼにおける菌体外分泌シグナルおよびＰｒｏ領域の予測結果
【図４】新規プロテアーゼ1〜３のアフィニティークロマトグラフィー精製画分の 酸性プロテアーゼ活性測定結果
【図５】新規プロテアーゼ３のアフィニティークロマトグラフィー精製画分の酸性カルボキシペプチダーゼ活性測定結果
【図６】新規プロテアーゼ４のアフィニティークロマトグラフィー精製画分の酸性プロテアーゼ活性測定結果
【図７】新規プロテアーゼ強制発現用ベクターのアスペルギルス・ソーヤへの導入方法
【図８】新規プロテアーゼ遺伝子強制発現株のＰＣＲによる確認
【図９】新規プロテアーゼ遺伝子強制発現株のサザンハイブリダイゼーションによる確認
【図１０】ＡｓｋｕＰＧ０２Ｂ株のＰＣＲによる確認
【図１１】新規プロテアーゼ１ 遺伝子強制発現株 をしょうゆ麹にて４０時間培養した際のプロテアーゼ活性評価結果
【図１２】新規プロテアーゼ２ 遺伝子強制発現株 をしょうゆ麹にて７２時間培養した際のプロテアーゼ活性評価結果
【図１３】新規プロテアーゼ３ 遺伝子強制発現株 をしょうゆ麹にて４０時間培養した際のプロテアーゼ活性評価結果
【図１４】新規プロテアーゼ4 遺伝子強制発現株 をしょうゆ麹にて７２時間培養した際のプロテアーゼ活性評価結果
【図１５】大豆タンパク質分解における新規プロテアーゼ遺伝子強制発現の効果
【図１６】新規プロテアーゼ４ 遺伝子強制発現株をＣｚａｐｅｋ-Ｄｏｘ液体培地にて培養した際の酸性プロテアーゼ活性評価結果
【図１７】新規プロテアーゼ４遺伝子強制発現のプロタミン分解活性への効果
【図１８】小麦グルテン分解における新規プロテアーゼ１および２ 遺伝子強制発現の効果
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の新規タンパク質は、配列番号２、配列番号４、配列番号６および配列番号８で表される各アミノ酸配列からなるタンパク質であり、プロテアーゼ活性を有する。該タンパク質は、例えば、アスペルギルス・ソーヤなどの麹菌の培養液もしくは菌体破砕液より得ることができる。また、該プロテアーゼは、上記麹菌等からクローニングしたプロテアーゼ遺伝子を適当な宿主−ベクター系で発現させることにより得られる。
【００１５】
該タンパク質は、プロテアーゼ活性を有する限り、配列番号２，４，６又は８で表される各アミノ酸配列において１若しくは数個（２〜５個）のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されていてもよい。さらに、プロテアーゼ活性を有する限り、上記の各配列番号で表されるアミノ酸配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、更に好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の配列同一性を示すアミノ酸配列を含むタンパク質、又はその部分断片であってもよい。
【００１６】
２つのアミノ酸配列又は塩基配列における配列同一性を決定するために、配列は比較に最適な状態に前処理される。例えば、一方の配列にギャップを入れることにより、他方の配列とのアラインメントの最適化を行う。その後、各部位におけるアミノ酸残基又は塩基が比較される。第一の配列における、ある部位に、第二の配列の相当する部位と同じアミノ酸残基又は塩基が存在する場合、それらの配列は、その部位において同一である。２つの配列における配列同一性は、配列間での同一である部位数の全部位（全アミノ酸又は全塩基）数に対する百分率で示される。
【００１７】
上記の原理に従い、２つのアミノ酸配列又は塩基配列における配列同一性は、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｈｕｌのアルゴリズム（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２２６４−２２６８，１９９０及びＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３−５８７７，１９９３）により決定される。このようなアルゴリズムを用いたＢＬＡＳＴプログラムがＡｌｔｓｈｕｌらによって開発された（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０，１９９０）。さらに、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴはＢＬＡＳＴより感度良く配列同一性を決定するプログラムである（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２，１９９７）。上記のプログラムは、主に与えられた配列に対し、高い配列同一性を示す配列をデータベース中から検索するために用いられる。これらは、例えば米国Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのインターネット上のウェブサイトにおいて利用可能である。
【００１８】
配列間の配列同一性として、Ｔａｔｉａｎａ Ａ． Ｔａｔｕｓｏｖａらによって開発されたＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓソフトウェア（ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ．，１７４：２４７−２５０，１９９９）を用いて決定した値を用いる。このソフトウェアは米国Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのインターネット上のウェブサイトにおいて利用可能であり、入手も可能である。用いるプログラム及びパラメーターは以下のとおりである。アミノ酸配列の場合、ｂｌａｓｔｐプログラムを用いパラメーターとしては、Ｏｐｅｎ ｇａｐ：１１ ａｎｄ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｇａｐ：１ ｐｅｎａｌｔｉｅｓ，ｇａｐ ｘ＿ｄｒｏｐｏｆｆ：５０，ｅｘｐｅｃｔ：１０，ｗｏｒｄ ｓｉｚｅ：３，Ｆｉｌｔｅｒ：ＯＮを用いる。塩基配列の場合、ｂｌａｓｔｎプログラムを用いパラメーターとしては、Ｒｅｗａｒｄ ｆｏｒ ａ ｍａｔｃｈ：１，Ｐｅｎａｌｔｙ ｆｏｒ ａｍｉｓｍａｔｃｈ：−２， Ｓｔｒａｎｄ ｏｐｔｉｏｎ：Ｂｏｔｈ ｓｔｒａｎｄｓ， Ｏｐｅｎ ｇａｐ：５ ａｎｄ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｇａｐ：２ ｐｅｎａｌｔｉｅｓ，ｇａｐ ｘ＿ｄｒｏｐｏｆｆ：５０，ｅｘｐｅｃｔ：１０，ｗｏｒｄ ｓｉｚｅ：１１，Ｆｉｌｔｅｒ：ＯＮを用いる。いずれのパラメーターも、ウェブサイト上でデフォルト値として用いられているものである。
【００１９】
ただし、上記ＢＬＡＳＴソフトウェアで有意な配列同一性を示す配列が見つからない場合には、さらに高感度なＦＡＳＴＡソフトウェア（Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｄ．Ｊ．Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：２４４４−２４４８，１９８８）を用いて配列同一性を示す配列をデータベースから検索することもできる。ＦＡＳＴＡソフトウェアは、例えば、ゲノムネットのウェブサイトで利用できる。この場合も、パラメーターはデフォルト値を用いる。例えば、塩基配列についての検索を行う場合は、データベースにｎｒ−ｎｔを用い、ｋｔｕｐ値は６を用いる。ただし、いずれの場合も、全体の３０％以上、５０％以上又は７０％以上のオーバーラップを示さない場合は、機能的に相関しているとは必ずしも推定されないため、２つの配列間の配列同一性を示す値としては用いない。
【００２０】
本発明の新規プロテアーゼ遺伝子及びタンパク質（プロテアーゼ）は本明細書の開示内容に基づき当業者であれば容易に単離・調製することができる。例えば、アスペルギルス・ソーヤ、さらに具体的には、アスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株（寄託機関：独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部、寄託番号ＩＤ：ＮＢＲＣ４２３９）が挙げられる。これら菌体を、該プロテアーゼの生産を誘導する条件の培地で培養したものから、常法により全ＲＮＡを回収する。培地としては、例えば、小麦フスマを用いることができる。上記培地で適当な時間、例えば、３６時間静置培養したのち、菌体を回収し液体窒素を満たした乳鉢中に適量、例えば、０．３ｇを移し、乳棒を用いて粉砕し、Ｃａｔｈａｌａらの方法（ＤＮＡ，２：３２９−３３５，１９８３）で全ＲＮＡを調製する。
【００２１】
こうして得られた全ＲＮＡを鋳型として、ＲＴ−ＰＣＲを行う。プライマーとしては、本発明のプロテアーゼ遺伝子を増幅することのできる組み合せであればどのような組み合せのものを用いてもよいが、例えば、後述の配列番号９から配列番号１６までの配列のオリゴヌクレオチドプライマーを用いることができる。ＲＴ−ＰＣＲは、市販のキット、例えば、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ−ＰＣＲ Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて常法により行うことができる。得られた本発明のプロテアーゼ遺伝子を含むＤＮＡは、例えば、常法によりプラスミドに組み込むことができる。
【００２２】
このようにして得られたＤＮＡの塩基配列は、サンガー法等の方法により、市販の試薬及びＤＮＡシークエンサーを用いて決定することができる。得られる本発明のプロテアーゼ遺伝子を含むＤＮＡ及び該ＤＮＡによりコードされるプロテアーゼの例をそれぞれ配列番号１から配列番号８に例示する。
【００２３】
プロテアーゼ遺伝子は、プロテアーゼ活性を有する限り、配列番号２，４，６，又は８で表される各アミノ酸配列において１若しくは数個（２〜５個）のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質をコードしているものであってもよい。このような遺伝子は、後述するハイブリダイゼーションによる選択のほか、種々の公知の変異導入方法によって得ることもできる。
【００２４】
プロテアーゼ遺伝子は、ハイブリダイゼーションによる選択法を用いて得ることもできる。遺伝子源としては、例えば、アスペルギルス・ソーヤがあげられる。これらの生物から、常法によりＲＮＡ又はゲノムＤＮＡを調製し、プラスミド又はファージに組み込み、ライブラリーを調製する。
【００２５】
続いて、プローブとして用いる核酸を検出法に応じた方法で標識する。プローブとして用いる核酸は、十分な特異性を得られる長さであればよく、例えば、配列番号１，３，５又は７に記載の配列の少なくとも１００塩基以上、好ましくは２００塩基以上、最も好ましくは４５０塩基以上の部分又は全体を含むものが挙げられる。
【００２６】
次いで、標識したプローブにストリンジェントな条件でハイブリダイズするクローンを上記ライブラリーから選択する。ハイブリダイゼーションは、プラスミドライブラリーならコロニーハイブリダイゼーションによって、ファージライブラリーならプラークハイブリダイゼーションによって行うことができる。
【００２７】
ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドのシグナルが非特異的なハイブリッドのシグナルと明確に識別される条件であり、使用するハイブリダイゼーションの系と、プローブの種類、配列及び長さによって異なる。条件は、ハイブリダイゼーションの温度を変えること、洗浄の温度及び塩濃度を変えることにより決定可能である。例えば、非特異的なハイブリッドのシグナルまで強く検出されてしまう場合には、ハイブリダイゼーション及び洗浄の温度を上げるとともに、必要に応じて洗浄の塩濃度を下げることにより特異性を上げることができる。
【００２８】
また、特異的なハイブリッドのシグナルも検出されない場合には、ハイブリダイゼーション及び洗浄の温度を下げるとともに、必要に応じて洗浄の塩濃度を上げることにより、ハイブリッドを安定化させることができる。このような最適化は、本技術分野の研究者が容易に行いうるものである。
【００２９】
ストリンジェントな条件の具体例としては、例えば、ハイブリダイゼーションは、５×ＳＳＣ、１．０％（Ｗ／Ｖ）核酸ハイブリダイゼーション用ブロッキング試薬（ロシュ・ダイアグノスティクス社製）、０．１％（Ｗ／Ｖ）Ｎ−ラウロイルサルコシン、０．０２％（Ｗ／Ｖ）ＳＤＳを用い一晩（８〜１６時間程度）で行い、洗いは、０．５×ＳＳＣ、０．１％（Ｗ／Ｖ）ＳＤＳ、好ましくは０．１×ＳＳＣ、０．１％（Ｗ／Ｖ）ＳＤＳを用い、１５分間、２回行う。ハイブリダイゼーションと洗いの温度は、５２℃以上、好ましくは５７℃以上、さらに好ましくは６２℃以上、最も好ましくは６７℃以上である。
【００３０】
さらに、配列番号１，３，５，又は７に記載の各塩基配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、更に好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の配列同一性を示す塩基配列は、本発明のプロテアーゼと実質的に同等の活性を有するタンパク質をコードしていると考えられる。このようなＤＮＡは、上記のハイブリダイゼーションを指標に得ることもできるが、ゲノム塩基配列解析等によって得られた機能未知のＤＮＡ群や公共データベースのなかから、例えば、前述のＢＬＡＳＴソフトウェアを用いた検索により発見することも容易である。このような検索は、本技術分野の研究者が通常用いている方法である。
【００３１】
得られたＤＮＡがプロテアーゼ活性を有するタンパク質をコードしていることは、後述のように、適当な宿主において対象遺伝子を過剰発現させたのち、破砕・部分精製等の処理を行ったのちプロテアーゼ活性を検出することで確認することができる。
【００３２】
本発明の組換えベクターは、プロテアーゼ遺伝子を適当なベクター上に連結することにより得ることができる。ベクターとしては、形質転換する宿主中でプロテアーゼを生産させうるものであればどのようなものでも用いることができ、例えば、プラスミド、コスミド、ファージ、ウイルス、染色体組み込み型、人工染色体などのベクターを用いることができる。
【００３３】
ベクターには、形質転換された細胞を選択することを可能にするためのマーカー遺伝子が含まれていてもよい。
【００３４】
マーカー遺伝子としては、例えば、ｕｒａ３、ｎｉａＤ、およびｐｙｒＧのような、宿主の栄養要求性を相補する遺伝子や、アンピシリンやカナマイシン、オリゴマイシンなどの薬剤に対する抵抗遺伝子などが挙げられる。
【００３５】
また、組換えベクターは、宿主細胞中で本発明の遺伝子を発現することのできるプロモーター又はその他の制御配列、例えば、エンハンサー配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列等を含むことが望ましい。
【００３６】
プロモーターとしては、例えば、ＧＡＬ１プロモーター、ｔｅｆ１プロモーター、ｌａｃプロモーター等が挙げられる。また、精製のためのタグをつけることもできる。具体的には、プロテアーゼ遺伝子の下流に適宜リンカー配列を接続し、ヒスチジンをコードする塩基配列を６コドン以上接続することにより、ニッケルカラムを用いた精製を可能にすることができる。
【００３７】
本発明の形質転換体は、宿主を、組換えベクターで形質転換することにより得られる。宿主としては、プロテアーゼを生産することができるものであれば特に限定されず、例えば、チゴサッカロミセス・ルキシー（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｒｏｕｘｉｉ）等の酵母、アスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｏｊａｅ）、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）等の糸状菌、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、バチルス・ズブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等の細菌であってもよい。尚、ｔｅｆ１プロモーターのような構成的プロモーターを使用することにより強制発現株を作製することができ、この強制発現株によって制御対象のタンパク質を強制的に発現させることができる。
【００３８】
形質転換は、宿主に応じて公知の方法で行うことができる。宿主に酵母を用いる場合は、例えば、酢酸リチウムを用いるＭｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，５，２５５−２６９（１９９５）に記載の方法が利用できる。糸状菌を用いる場合は、例えば、プロトプラスト化した後ポリエチレングリコール及び塩化カルシウムを用いるＭｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２１８：９９−１０４，１９８９に記載の方法が利用できる。細菌を用いる場合は、例えば、エレクトロポレーションによるＭｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４：１８２−１８７，１９９０に記載の方法が利用できる。
【００３９】
本発明のプロテアーゼの製造法は、プロテアーゼ遺伝子を発現させた形質転換体を培養し、常法によって、得られる培養物からプロテアーゼのタンパク質を効率よく回収することからなる。培地及び培養方法は、宿主の種類と組換えベクター中の発現制御配列によって適当なものを選ぶ。宿主がアスペルギルス・ソーヤであり、発現制御配列がａｍｙＢプロモーターである場合、例えば、マルトースを炭素源とする液体最少培地で培養することにより、本発明のプロテアーゼを高発現させることがでる。宿主が大腸菌であり、発現制御配列がｌａｃプロモーターである場合、例えば、ＩＰＴＧを含有する液体培地で培養することにより、該プロテアーゼを生産させることができる。
【００４０】
また、プロテアーゼが菌体内又は菌体表面に生産された場合は、菌体を培地から分離し、その菌体を適当に処理することでプロテアーゼを得ることができる。例えば、チゴサッカロミセス・ルキシーの菌体表面に生産された場合、破砕した後、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、Ｔｗｅｅｎ−２０、あるいはＮｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０等の非イオン性の界面活性剤を低濃度で作用させ、遠心分離した上清よりプロテアーゼを回収することができる。培養液中にプロテアーゼが生産された場合は、遠心分離・ろ過等により菌体を除去することによりプロテアーゼを得ることができる。何れの場合も、硫安分画、各種クロマトグラフィー、アルコール沈殿、限外ろ過等を用いた常法により、得られたプロテアーゼをさらに純度の高いものとして得ることもできる。
【００４１】
以下、実施例に即して本発明を具体的に説明するが、本発明の技術的範囲は、これらの記載によって、なんら制限されるものではない。
【実施例１】
【００４２】
[４種プロテアーゼ遺伝子のｃＤＮＡクローニングと酵母発現系を用いたプロテアーゼ活性の確認]
[Ｔｏｔａｌ ＲＮＡの調製]
アスペルギルス・ソーヤ ＮＢＲＣ４２３９株の分生子約１０，０００，０００個を５．０ｇ の小麦フスマ (フスマ：水 ＝ ５：４) に植え、３０℃にて３６時間培養した。培養終了後、約３００から４００ｍｇの菌体を液体窒素により急速に凍結したのち、冷却しておいた乳鉢と乳棒で破砕した。この破砕菌体１００ｍｇを８００μＬのＩＳＯＧＥＮ (ニッポンジーン) にて室温で５分間処理し、クロロフォルム処理およびアルコール沈殿を経てＴｏｔａｌ ＲＮＡを得た。この検体を、ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（タカラバイオ） の存在下でＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ のＤＮａｓｅ Ｉ (タカラバイオ) にて４時間処理することにより、混入しているゲノムＤＮＡを出来うる限り分解した。さらにＤＮａｓｅ Ｉ処理した Ｔｏｔａｌ ＲＮＡを、ＱＩＡＧＥＮ社のＲＮｅａｓｙ カラムにて精製し、精製Ｔｏｔａｌ ＲＮＡを得た。
【００４３】
[ＲＴ−ＰＣＲによる新規プロテアーゼ遺伝子（ｃＤＮＡ）の増幅]
精製Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ １００ ｎｇを鋳型とし、タカラバイオ社のＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴａｓｅ を用い全量２０μＬにて、４２℃、６０分間の逆転写反応を行った。プライマーはＯｌｉｇｏ ｄＴプライマーとＲａｎｄｏｍ ６ｍｅｒｓを１：１ の割合にて混合したものを反応系に２．０μＬ添加した。反応終了後、反応液を７０℃で１５分間処理することにより逆転写酵素を失活させた。次にＰＣＲによる各プロテアーゼ遺伝子のｃＤＮＡの増幅を行った。反応には正確性の高いＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ (タカラバイオ) を用い、液量は５０μLで反応を行った。１．０μLの逆転写反応液を鋳型として添加し、プライマーは終濃度がそれぞれ１．０μＭになるよう反応系に添加した。逆転写反応を行わない反応系では、反応系に５．０ ｎｇ の精製Ｔｏｔａｌ ＲＮＡを添加しＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応の温度条件は、９８℃１０秒ののち、９８℃１０秒、 ６０℃１０秒、７２ ℃ ２０秒を３８サイクルにて実施した。オリゴヌクレオチドプライマーの組み合わせは、新規プロテアーゼ１遺伝子の増幅時は配列番号９と１０を、新規プロテアーゼ２遺伝子の増幅時は配列番号１１と１２を、新規プロテアーゼ３遺伝子の増幅時には配列番号１３と１４を、そして新規プロテアーゼ４遺伝子の増幅時は配列番号１５と１６をそれぞれ用いた。
【００４４】
【表１】
【００４５】
ＲＴ−ＰＣＲによる４種プロテアーゼ遺伝子の増幅結果を図１に示した。いずれの遺伝子についても逆転写反応を実施した時のみ、特異的な増幅産物を得ることができた。新規プロテアーゼ２遺伝子と、新規プロテアーゼ３遺伝子および新規プロテアーゼ４遺伝子を増幅させた系列では単一の産物だけが増幅され、いずれの産物のサイズもゲノム解析データより予測された各遺伝子のｃＤＮＡのサイズとほぼ等しいものであった。また、新規プロテアーゼ１遺伝子を増幅させた系列では複数の産物が増幅されていが、目的とする遺伝子の予測ｃＤＮＡのサイズとほぼ等しいサイズの産物が、メインバンドのひとつとして検出されていた。そのため新規プロテアーゼ１遺伝子については、ゲノム解析データにて予想されていたサイズと等しい大きさのＰＣＲ産物を、ゲル抽出により精製しＤＮＡシーケンス解析を行った。
【００４６】
[ｐＵＣ１１８へのサブクローニングとＤＮＡシーケンスの解析]
前記ＲＴ−ＰＣＲの反応液４８μＬをアガロースゲルにより電気泳動しバンドを切り出した後、ＤＮＡフラグメントをＧｅｎｅ Ｃｌｅａｎ ＩＩ Ｋｉｔ（Ｑ・バイオジーン）を用いて精製した。精製したＤＮＡフラグメントを平滑末端化・リン酸化したのち、ＨｉｎｃＩＩ 処理後に脱リン酸化してあるｐＵＣ１１８にライゲーションした。平滑末端クローニングにはＭｉｇｈｔｙ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ Ｂｌｕｎｔ Ｅｎｄ (タカラバイオ)を用いた。このプラスミドを大腸菌ＤＨ５αに導入後、５０μｇ／ｍＬの濃度のアンピシリンを含むＬＢ培地にて一晩培養したのち、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｍｉｎｉ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ （ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドを精製した。プラスミドにインサートが導入されているかを制限酵素処理およびＰＣＲ法にて確認した。インサートが導入されていたプラスミドについてはインサートのＤＮＡシーケンス解析を行った。その結果、新規プロテアーゼ１遺伝子の増幅産物では配列番号１に、新規プロテアーゼ２遺伝子の増幅産物では配列番号３に、新規プロテアーゼ３遺伝子の増幅産物では配列番号５に、そして新規プロテアーゼ４遺伝子の増幅産物では配列番号７に示す配列をそれぞれ得ることができた。
【００４７】
上記の各配列番号のｃＤＮＡの塩基配列についてアスペルギルス・ソーヤのゲノム上の対応する配列と比較することで、ゲノム上に存在する対象遺伝子のエクソン‐イントロン構造を調べた（図２）。その結果、新規プロテアーゼ１遺伝子には２個の、新規プロテアーゼ２遺伝子には４個の、そして新規プロテアーゼ４遺伝子では２個のイントロンが存在することが分かった。また、新規プロテアーゼ３遺伝子についてはイントロンを有していない遺伝子であることがわかった。
【００４８】
[ＢＬＡＳＴプログラムを用いた相同性検索]
上記の各配列番号に示す配列についてＢＬＡＳＴプログラムを用いてｎｒデータベースに対する相同性を調べたところ、７０％以上の同一性を示す配列は見出されなかった。また、配列番号１，３，５，及び７に示した塩基配列より推定されたアミノ酸配列を配列番号２，４，６，及び８に記した。これらアミノ酸配列についても塩基配列と同様にＢＬＡＳＴプログラムを用いてｎｔデータベースに対する相同性を調べたところ、７０％以上の同一性を示す配列は見出されなかった。以上のことから、本発明により見出された４種の遺伝子とその産物は、いずれも新規のものであることが確認された。
【００４９】
[Ｐｆａｍ Ｓｃａｎを用いた各遺伝子産物のモチーフ解析]
各対象遺伝子の予測遺伝子産物のアミノ酸配列を、タンパク質モチーフデータベースの検索方法のひとつであるＰｆａｍ Ｓｃａｎ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．；Ｄａｔａｂａｓｅ Ｉｓｓｕｅ ３６，Ｄ２８１，２００８）により解析し、対象とする遺伝子産物が有しているモチーフを調べた。その結果、新規プロテアーゼ１遺伝子および新規プロテアーゼ２遺伝子の産物は酸性プロテアーゼのモチーフを有していた。また、新規プロテアーゼ３遺伝子産物はファミリーＳ１５のセリンプロテアーゼが含まれるα・β−スーパーファミリーのモチーフを有しおり、新規プロテアーゼ４遺伝子産物はファミリーＭ３５の金属プロテアーゼのモチーフを有していた。
【００５０】
[対象遺伝子産物のプロテアーゼ活性確認のための酵母発現系の構築]
本発明の新規プロテアーゼのタンパク質加水分解能を確認するため、対象遺伝子の酵母発現系を構築した。本発現系を用いて生産したプロテアーゼの活性を評価する場合、宿主由来のプロテアーゼが大量に存在している状態では、目的とするタンパク質の活性を評価することが困難であることが予想された。そのためには、目的タンパク質をヒスチジンタグ融合タンパク質として生産させ、アフィニティーカラムによる精製を行うことで宿主由来のプロテアーゼのバックグランドを低減できると考えられた。その際、本発明の目的タンパク質の中には、成熟時に切断されるＰｒｏ配列を有しているものがあると考えられたため、その位置を予想したうえでヒスチジンタグの付加位置を決定する必要があった。そこで、各プロテアーゼが菌体外分泌シグナルやＰｒｏ領域がどの位置に存在しているかを、相同性のあるタンパク質と比較し予想した (図３)。新規プロテアーゼ１は酵母の酸性プロテアーゼであるＹａｐｓｉｎと相同性がありＮ末端側に菌体外分泌シグナルと、Ｐｒｏ領域を有すると予想された。新規プロテアーゼ２は、酸性プロテアーゼであるＰｅｐｓｉｎおよびＹａｐｓｉｎと低い相同性があり、Ｎ末端側に菌体外分泌シグナルとＰｒｏ領域が存在すると予想された。新規プロテアーゼ３はＤｉｅｎｅｌａｃｔｏｎｅ ｈｙｄｒｏｌａｓｅと相同性があり、ファミリーＳ１５のセリンプロテアーゼとも低い相同性があった。本タンパク質には、Ｐｒｏ領域は存在せずＮ末端領域に菌体外分泌シグナルだけが存在すると予想された。また、新規プロテアーゼ４は、ファミリーＭ３５に分類される金属プロテアーゼ、デューテロライシンＣと相同性を有しており、Ｎ末端側に菌体外分泌シグナルとＰｒｏ領域を有していると予想された。以上のように、いずれのタンパク質もＮ末端領域に菌体外分泌シグナルおよびＰｒｏ領域を有していることから、Ｎ末端に精製用のヒスチジンタグを付加すると最終的にはタグが切断除去されてしまう危険性があると思われた。そのため、活性の確認に使用する発現系ではヒスチジンタグを各タンパク質のＣ-末端側に付加することができる、ｐＹＥＳ２／ＣＴベクター(インビトロジェン)を用いることにした。
【００５１】
[各プロテアーゼ遺伝子の酵母発現用ベクターｐＹＥＳ２／ＣＴへの導入]
各プロテアーゼのｃＤＮＡが導入されたプラスミドを鋳型とし、ＰＣＲ 反応を行いｃＤＮＡの両端に制限酵素認識部位を導入したＤＮＡフラグメントを増幅した。このときに、目的タンパク質の サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）内での翻訳効率を向上させるための、開始子コドンの上流側への９ 塩基のアデニンの付加も同時に行った。反応には正確性の高いＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ (タカラバイオ) を用い、液量は５０μＬで反応を行った。各ｃＤＮＡをサブクローニングしたプラスミド１ｎｇを鋳型として添加し、プライマーは終濃度がそれぞれ１．０μＭになるよう反応系に添加した。オリゴヌクレオチドプライマーの組み合わせは、新規プロテアーゼ１遺伝子の増幅時は配列番号１７と１８を、新規プロテアーゼ２遺伝子の増幅時は配列番号１９と２０を、新規プロテアーゼ３遺伝子の増幅時には配列番号２１と２２を、そして新規プロテアーゼ４増幅時は配列番号２３と２４をそれぞれ用い、反応を行った。得られたＤＮＡフラグメントを、Ｇｅｎｅ Ｃｌｅａｎ ＩＩ Ｋｉｔ（Ｑ・バイオジーン） を用いてゲル抽出し、各ＤＮＡフラグメント末端の制限酵素認識部位に対応する酵素にて消化した。これを、各フラグメントの制限酵素サイトに対応するように処理したｐＹＥＳ２／ＣＴベクター (インビトロジェン) にライゲーションした。これらのプラスミドを、実施例１に記したｃＤＮＡクローニングの時と同じ方法にて大腸菌への導入し、プラスミドの抽出と選抜を行なった。インサートが導入されていたプラスミドについてはＤＮＡシーケンス解析を行い、ベクター中にインサートが正しく導入されているかを確認した。ベクターに正しくインサートが導入されていた酵母発現用プラスミドをそれぞれ、ｐＡＳＡ１−１、ｐＡＳＡ１−２、ｐＡＳＡＢＨ−１、およびｐＡＳＭ３５−１と名づけた。
【００５２】
【表２】
【００５３】
[発現用ベクターの酵母ＩＮＶＳｃ１株への導入]
ｐＹＥＳ２／ＣＴにアスペルギルス・ソーヤのプロテアーゼ遺伝子を組み込んだ発現用ベクターとｐＹＥＳ２／ＣＴ(ネガティブコントロール)を、ウラシル要求性株であるサッカロミセス・セレビシエ ＩＮＶＳｃ１株（インビトロジェン）に導入した。形質転換用試薬にはインビトロジェン社のＳ．ｃ． ＥａｓｙＣｏｍｐＴＭ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いた。形質転換体の選抜にはウラシルを含まないＳＣ （ＳＣ Ｕｒａ−）寒天培地を用いた。
【００５４】
[新規プロテアーゼ１、新規プロテアーゼ２、および新規プロテアーゼ３の酵母での発現とプロテアーゼ活性の確認]
３種の遺伝子の発現用ベクターおよびｐＹＥＳ２／ＣＴを導入したサッカロミセス・セレビシエの形質転換体をＳＣ Ｕｒａ−の寒天培地に植え、３０℃で３日間培養しシングルコロニーを分離した。このシングルコロニーを、坂口フラスコに入った１２０ ｍＬの２％ガラクトースと１%ラフィノースを含むＳＣ Ｕｒａ−に植え、３０℃にて３０時間、１３０ ｒｐｍで振とう培養した。培養終了後、培養液を２，０００ × ｇで１５分間遠心分離し菌体を回収した。得られた菌体１．２ｇあたりに４ｍＬの５％グリセロールを含む５０ ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液 （ｐＨ ７．４） を加え懸濁させたのち、２ ｍＬのスクリューキャップ付きポリプロピレンチューブに８００μＬずつ分注した。ここに懸濁液と等量のガラスビーズ（直径０．５ｍｍ）を加えたのち、マルチビーズショッカー（安井機器）により菌体を破砕した。菌体破砕後、１０，０００ × ｇで１５分間遠心分離を行い菌体の残渣を沈殿として除去し、菌体破砕液を得た。本破砕液４ｍＬ に４ ｍＬの１．０ Ｍ ＮａＣｌと４０ ｍＭイミダゾールを含む２００ ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液 （ｐＨ ７．４）を加え穏やかに混合したのち、０．２μｍの滅菌用フィルターによりろ過した。このろ液を、あらかじめ２０ｍＭイミダゾールと５００ ｍＭ ＮａＣｌを含む１００ ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液 （ｐＨ ７．４）にて平衡化した、１．０ ｍＬのＨｉｓ−Ｔｒａｐ ＨＰカラム （ＧＥヘルスケア） にアプライしたのち、カラムを２０ｍＭイミダゾールと５００ ｍＭ ＮａＣｌを含む１００ ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液 （ｐＨ ７．４） ２０ ｍＬにて洗浄した。洗浄完了後、５００ｍＭイミダゾールと５００ ｍＭ ＮａＣｌを含む１００ ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液 （ｐＨ ７．４） をカラムに流すことによりカラムに結合しているヒスチジンタグ融合タンパク質を溶出させた。このとき、１．０ ｍＬずつ１０本の溶出画分を回収した。なお本カラム操作では流速は常に１．０ ｍＬ／ｍｉｎに保ち実験を行った。溶出完了後、溶出タンパク質が含まれている溶出フラクションを１つにまとめ、ミリポア社のＭｉｃｒｏｃｏｎ ＹＭ−３０ （分画分子量 ３０，０００） を用い約１００μLまで濃縮した。ここに、４００μＬの２０ ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液 （ｐＨ７．４） を加えたのち、再度Ｍｉｃｒｏｃｏｎ ＹＭ−３０ を用いて約１００ μＬまで濃縮した。この濃縮液を回収後、各検体の液量を２０ ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液 （ｐＨ７．４）により正確に２００μＬにあわせた。この溶液を次のプロテアーゼ活性の確認に使用した。
【００５５】
[酸性プロテアーゼ活性の確認]
プロテアーゼ活性測定用の酸変性ヘモグロビン (シグマアルドリッチ)を、終濃度が２％となるように超純水に溶解した。この２％ヘモグロビン溶液１０００μＬに、１２５０μＬの１００ ｍＭのグリシン塩酸緩衝液 （ｐＨ ３．０）と１５０ μＬの 超純水を小試験管に加えボルテックスミキサーにより混合した。ここに、１００ ｍＭ グリシン塩酸緩衝液 （ｐＨ ３．０） により５倍希釈した濃縮・脱塩済みのＨｉｓ−Ｔｒａｐ ＨＰカラム溶出液を１００ μＬ加えて混合し、パラフィルムにより小試験管の口を閉じたのち、３０℃にて７２時間インキュベートした。反応終了後、２．５ ｍＬの４００ ｍＭ トリクロロ酢酸を加えて混合し、３０分間室温で静置した。この酸変性溶液を、ＡＤＶＡＮＴＥＣ ５Ｃのろ紙によりろ過したのち、ろ液１．０ ｍＬを別の小試験管に分取した。ここに４．０ ｍＬの４００ ｍＭ炭酸ナトリウムと１．０ ｍＬの２倍希釈したフォーリン―チオカルト試薬(＝フェノール試薬、超純水により希釈)を加え、室温で３０分以上静置したのち、６６０ｎｍにおける吸光度を測定することで各検体の酸性プロテアーゼ活性を求めた。
【００５６】
各検体の酸性プロテアーゼ活性の測定結果を図４に示した。新規プロテアーゼ１遺伝子を発現させた系ではインサートの無いベクターを導入したネガティブコントロールと比較し６．５倍、倍高い酸性プロテアーゼ活性が見られた。また、新規プロテアーゼ２遺伝子および新規プロテアーゼ３遺伝子を発現させた系においてもコントロールと比較し、１．７倍および２．５倍高い活性が見られた。以上の通り、いずれの検体のアフィニティークロマトグラフィー精製画分においても、ネガティブコントロールと比較し高い酸性プロテアーゼ活性を有していることがわかった。このことから、新規プロテアーゼ１、新規プロテアーゼ２、および新規プロテアーゼ３は、活性の強さには差があるが、いずれも酸性プロテアーゼ活性を有するタンパク質であることが確認された。
【００５７】
[酸性カルボキシペプチダーゼ活性の確認]
酸性カルボキシペプチダーゼ活性の測定には、キッコーマン（株）製の酸性カルボキシペプチダーゼ活性キットを利用した。濃縮・脱塩済みのＨｉｓ−Ｔｒａｐ ＨＰカラムの溶出液を１００ ｍＭ グリシン塩酸緩衝液 （ｐＨ ３．０） にて８倍に希釈した。この希釈液４０μＬを４００μＬの基質溶液に加え、４０℃で１４時間インキュベートした。反応液に８００μＬの反応停止液を添加することにより酵素反応を停止し、３７℃で５分間インキュベートしたのち、４０μLの定量用酵素液を加えさらに２０分間３７℃でインキュベートした。インキュベート終了後、４０μLの定量発色液を添加してさらに３７℃で１０分間インキュベートし、４６０ｎｍにおける吸光度を測定することで各検体の酸性カルボキシペプチダーゼ活性を求めた。
【００５８】
[酸性カルボキシペプチダーゼ活性測定結果]
新規プロテアーゼ３の酸性カルボキシペプチダーゼ活性測定結果を図５に示した。新規プロテアーゼ３遺伝子を発現させた系では、コントロールと比較して２.２倍高い活性を示すことがわかった。本結果は、上記遺伝子の産物がタンパク質をＣ末端側から加水分解する、カルボキシペプチダーゼ活性を有するタンパク質であることを示唆するものである。
【００５９】
[新規プロテアーゼ４の酵母での発現とプロテアーゼ活性の確認]
新規プロテアーゼ４発現用ベクターおよびｐＹＥＳ２／ＣＴを導入したサッカロミセス・セレビシエの形質転換体をＳＣ Ｕｒａ−の寒天培地に植え、３０℃で４日間培養しシングルコロニーを分離した。このシングルコロニーを、２０ ｍＬの２%ラフィノースを炭素源としたＳＣ Ｕｒａ−液体培地３本に植え、２５℃にて４８時間、１８０ ｒｐｍで振とう培養した。この培養液を、坂口フラスコに入った１００ｍＬの２００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を含み２％ガラクトースと１％ラフィノースを炭素源としたＳＣ Ｕｒａ-液体培地３本に１０ ｍＬずつ加え、３０℃、１３０ｒｐｍで４０時間振とう培養した。培養終了後、培養液を２，０００ × ｇで１５分間遠心分離し菌体を回収した。得られた菌体を１ｇあたり１．２ｍＬの５％グリセロールを含む５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液 （ｐＨ ７．４、検体・コントロールともに約 ６ mL） に懸濁させたのち、２ ｍＬのスクリューキャップ付きポリプロピレンチューブに８００μＬずつ分注した。ここに懸濁液と等量のガラスビーズ（直径０．５ｍｍ）を加えたのち、マルチビーズショッカー（安井機器）により菌体を破砕した。菌体破砕後、２０，０００ × ｇで３０分間遠心分離を行ったのち、上澄みを０．２μｍのフィルターに通し固形物を除去した。この破砕液４ mＬを、５．０ ｍＬのＨｉｓ−Ｔｒａｐ ＨＰカラム （ＧＥヘルスケア） にアプライしたのち、カラムを２０ｍＭイミダゾールと５００ ｍＭ ＮａＣｌを含む１００ ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液 （ｐＨ ７．４） ８０ ｍＬにて洗浄した。洗浄完了後、５００ｍＭイミダゾールと５００ ｍＭ ＮａＣｌを含む１００ ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液 （ｐＨ ７．４）を２５mLカラムに流すことにより、カラムに結合しているしているタンパク質を溶出させた。なお本カラム操作では流速は常に４．０ ｍＬ／ｍｉｎに保ち実験を行った。得られた２５ｍＬの溶出液を、等量の１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液 (ｐＨ ７．０)により２倍希釈したのち、ＰＩＡＣＥ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｒ を用いて１５００ μＬまで濃縮した。ここに１３．５ ｍＬの１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液 (ｐＨ ７．０)を加えたのち、再度ＰＩＡＣＥ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｒ を用いて１５００ μＬまで濃縮した。本操作を２回繰り返したのち、ＰＩＡＣＥ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｒにより検体を１２００μＬ程度まで濃縮したのち、１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）にて、１４００μＬに正確に定容した。この検体を次の酸性プロテアーゼ活性の確認に用いた。
【００６０】
[新規プロテアーゼ４の酸性プロテアーゼ活性の確認]
プロテアーゼ活性測定用の酸変性ヘモグロビン (シグマアルドリッチ)を、終濃度が２％となるように２００ ｍＭのグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ ３．０）に溶解した。この２％ヘモグロビン溶液８００μＬに、１０００μＬの２００ ｍＭのグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ ３．０）と１００ μＬの２５ ｍＭ 硫酸亜鉛溶液を小試験管に加えボルテックスミキサーにより混合した。ここに、濃縮・脱塩済みのＨｉｓ−Ｔｒａｐ ＨＰカラム溶出液を１００ μＬ加えて混合し、パラフィルムにより小試験管の口を閉じたのち、４０℃にて４０時間インキュベートした。反応終了後、２．０ ｍＬの４００ ｍＭ トリクロロ酢酸を加えて混合し、１０分間室温で静置した。この酸変性溶液を、ＡＤＶＡＮＴＥＣ ５Ｃのろ紙によりろ過したのち、ろ液１．０ ｍＬを別の小試験管に分取した。ここに４．０ ｍＬの４００ ｍＭ炭酸ナトリウムと１．０ ｍＬの２倍希釈したフォーリン―チオカルト試薬(＝フェノール試薬、超純水により希釈)を加え、室温で３０分以上静置したのち、６６０ｎｍにおける吸光度を測定することで各検体の酸性プロテアーゼ活性を求めた。
【００６１】
新規プロテアーゼ４遺伝子産物のアフィニティークロマトグラフィー精製画分の酸性プロテアーゼ活性の測定結果を図６に示した。新規プロテアーゼ４遺伝子産物の精製画分はネガティブコントロールと比べ約２．３倍高い酸性プロテアーゼ活性を有していた。
【実施例２】
【００６２】
新規プロテアーゼ遺伝子群のアスペルギルス・ソーヤでの強制発現株作製
麹菌のプロテアーゼ生産能増強を目的とし、配列番号１，３，５および７に示す新規プロテアーゼ遺伝子群を麹菌にて強制発現させた菌株を作製した。新規プロテアーゼ遺伝子のプロモーター部分とその構造遺伝子の間にマーカー遺伝子であるｐｙｒＧとｔｅｆ１プロモーターを挿入し、新規プロテアーゼ遺伝子がｔｅｆ１プロモーターの支配下となり、構成的に発現するようにした。強制発現株の作製方法は下記の通りである。
【００６３】
［アスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株のゲノムＤＮＡの調製］
ベクター作製時のＦｕｓｉｏｎ ＰＣＲの鋳型ＤＮＡとして使用するために、下記の方法により麹菌アスペルギルス・ソーヤのゲノムＤＮＡを抽出・精製した。本菌株を、１５０ｍｌ容の三角フラスコに入った４０ｍｌのデキストリン−ペプトン培地に植え、３０℃、１５０ｒｐｍで３日間培養した。培養終了後、ろ過により菌体を回収し、ペーパータオルで挟み、水分を除いた後、液体窒素を用いて急速に凍結させた。次に、液体窒素を注いで冷却してある乳鉢に凍結した菌体を入れ、液体窒素で冷却してある乳棒を用いて念入りに粉砕した。この粉砕から、Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（プロメガ社製）を用いて全ＤＮＡを抽出したのち、ＤＮａｓｅ ｆｒｅｅ のＲＮａｓｅ Ｉ（ニッポンジーン社製）にて検体を処理し、混入していたＲＮＡを分解し以降の実験に用いた。
［Ｆｕｓｉｏｎ ＰＣＲによる強制発現用ベクターの作製と形質転換］
【００６４】
強制発現系の概要を図７に示した。まず、相同組換え用の左右のアーム部分（フラグメントＬ及びＲ）、ｔｅｆ１プロモーター及び形質転換時のマーカー遺伝子であるｐｙｒＧ遺伝子（フラグメントＰ）のＤＮＡフラグメントをＰＣＲ法により増幅した。ＰＣＲには、ＫＯＤ ＦＸ（東洋紡績社製）を使用し、オリゴヌクレオチドプライマーは配列を表３に記したものを使用した。また、各フラグメントを増幅した際のプライマーの組合せを表４に記した。ＰＣＲ反応の鋳型には１５０ｎｇのアスペルギルス・ソーヤ ＮＢＲＣ４２３９株のゲノムＤＮＡを使用し、反応系は全量５０μｌで実施した。ＰＣＲ反応は、９４℃、２分の後、９４℃１０秒、６８℃５分を３０サイクル行った。得られたＤＮＡフラグメントはアガロースゲル電気泳動にて確認したのち、各ＤＮＡフラグメントをＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉt （キアゲン社製）を用いて精製した。
【００６５】
【表３】
【００６６】
【表４】
【００６７】
精製したＬフラグメント１．１μｌ、Ｒフラグメント１．１μｌ、ｔｅｆ１プロモーター３．４μｌ、及びｐｙｒＧマーカーのフラグメント３．４μｌを混合しフュージョンＰＣＲ用の鋳型とした。次に、フュージョンＰＣＲにより４つのフラグメントを結合させた。ＰＣＲにはＫＯＤ Ｆｘ（東洋紡績社製）を使用した。ＰＣＲ用のプライマーの配列および組合せは表５および表６に示した通りである。ＰＣＲ反応の鋳型には、前述の９μｌのＬ、Ｒ、ｔｅｆ１及びＰの混合液を用い、反応系は全量４００μｌで実施した。ＰＣＲ反応は、９４℃２分の後、９８℃１０秒、６８℃９分の２ステップサイクルを４０サイクル行った。増幅産物の一部を０．８％アガロースゲルにより電気泳動し、強制発現用のベクターカセットが増幅されていることを確認した。確認終了後、残っている反応液全量を０．８％アガロースゲルにより電気泳動し、ゲル抽出によりＤＮＡフラグメントを精製した後、アルコール沈殿によりＤＮＡフラグメントを濃縮した。これを新規プロテアーゼ強制発現用ベクターとした。本ベクターを、アスペルギルス・ソーヤのｐｙｒＧマーカーおよびｋｕ７０遺伝子破壊株であるＡｓＸｋｕ７０：：ｐｔｒＡ株（Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２７５：４６０，２００６）に常法であるプロトプラスト−ＰＥＧ法（Ｇｅｎｅ，６１，３８５，１９８７）を用いて導入した。形質転換体の選抜は、ウリジンを含まず１．２Ｍソルビトールを含むＣｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ最少培地（３．０％ ｇｌｕｃｏｓｅ，０．０５％ ＫＣｌ，０．２ ％ ＮａＮＯ３，０．１％ ＫＨ２ＰＯ４，０．０５％ ＭｇＳＯ４，０．００１％ ＦｅＳＯ４，ｐＨ ６．０）を利用したｐｙｒＧポジティブセレクションを実施し形質転換体を得た。
【００６８】
【表５】
【００６９】
【表６】
【００７０】
［形質転換体のＰＣＲによる確認］
作製した形質転換体にベクターが正しく導入されているかを、ＰＣＲ法により確認した。始めに、強制発現株および宿主株より、実施例２に前述の方法を用いてゲノムＤＮＡを調製した。このゲノムＤＮＡを鋳型とし、表６に記した組合せのオリゴヌクレオチドプライマーを使用しＰＣＲを行った。ＰＣＲ用の酵素には、ＫＯＤ ＦＸ（東洋紡績株式会社製）を用いた。ＰＣＲ反応は、９４℃２分の後、９４℃１０秒、６８℃９分３０秒の２ステップサイクルを４０サイクル行った（図８）。いずれの新規プロテアーゼ遺伝子強制発現株においても、強制発現株の作製に使用した宿主株であるＡｓＸｋｕ：：ｐｔｒＡ由来のゲノムＤＮＡを鋳型とした時と比較して、ｐｙｒＧマーカーおよびｔｅｆ１プロモーターが導入された分、約３ｋｂ大きいサイズのＰＣＲ産物がメインバンドとして確認された。また、これらの形質転換体ではＡｓＸｋｕ：：ｐｔｒ８株で観測されたバンドと同じサイズのＰＣＲ産物は確認されなかった。以上のことから、これら形質転換体には正しくベクターが導入されており、核も純化されていることがわかった。
【００７１】
［宿主ｐｙｒＧ復元株ＡｓｋｕＰＢ０２Ｂ株の作製］
本実施例において作製した強制発現株は、ｐｙｒＧポジティブセレクションにより取得したものであるため、全てｐｙｒＧ＋株となっている。そのため、強制発現株のプロテアーゼ生産能を評価するに当たり、ｐｙｒＧ欠失株であるＡｓＸｋｕ７０：：ｐｔｒ８株（宿主株）をコントロールとして用いることは適切ではないと考えられる。そのため、宿主株のｐｙｒＧ遺伝子を復元したＡｓｋｕＰＧ０２Ｂ株を作製し、新規プロテアーゼ遺伝子強制発現株を評価する際のコントロールとして使用することとした。その作製方法は下記の通りである。
【００７２】
配列番号５９および配列番号６０に記したオリゴヌクレオチドプライマーを用い、野生株のｐｙｒＧ遺伝子の構造遺伝子、プロモーターおよびターミネーターを含む約６．６ｋｂのＤＮＡフラグメントをＰＣＲにより増幅した。
【００７３】
【表７】
【００７４】
ＰＣＲ用酵素にはＫＯＤ ＦＸ（東洋紡績社製）を使用し、鋳型ＤＮＡには１５０ｎｇのアスペルギルス・ソーヤ ＮＢＲＣ４２３９株由来ゲノムＤＮＡを用いた。反応系は全量４００μｌで実施した。ＰＣＲ反応は、９４℃２分の後、９８℃１０秒、６８℃９分の２ステップサイクルを３０サイクル行った。増幅産物の一部を０．８％アガロースゲルにて電気泳動を行い、約６．６ｋｂのＤＮＡフラグメントが増幅されていることを確認した。ＰＣＲ反応による増幅の確認後、残っている反応液全量を０．８％アガロースゲルにより電気泳動し、ゲル抽出によりＤＮＡフラグメントを精製した後、アルコール沈殿によりＤＮＡフラグメントを濃縮した。これをｐｙｒＧ復元用ベクターとした。本ベクターを、前述のＡｓＸｋｕ７０：：ｐｔｒＡ（宿主株）に常法であるプロトプラスト−ＰＥＧ法（Ｇｅｎｅ，６１：３８５，１９８７）を用いて導入した。形質転換体の選抜は、ウリジンを含まず１．２Ｍソルビトールを含むＣｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ最少培地を利用したｐｙｒＧポジティブセレクションを実施し、ＡｓｋｕＰＧ０２Ｂ株を得た。
【００７５】
［ＡｓｋｕＰＧ０２Ｂ株のＰＣＲ法による確認］
前記の方法により調製した形質転換体のゲノムＤＮＡ約１５０ｎｇを鋳型とし、配列番号５９及び６０のオリゴヌクレオチドプライマーを用いＰＣＲを行い、形質転換体中のｐｙｒＧ遺伝子が復元されているかを調べた。対象として、ＡｓＸｋｕ７０：：ｐｔｒＡ株およびアスペルギルス・ソーヤ ＮＢＲＣ４２３９株のゲノムＤＮＡを鋳型とした反応系を用いた。ＰＲＣ用の酵素にはＫＯＤ ＦＸ（東洋紡績株式会社製）を使用し、反応液の全量は２０μＬとした。ＰＣＲ反応は、９４℃２分の後、９４℃１０秒、６８℃９分のシャトルサイクルを３５サイクル行った。その結果を図１０に示した。いずれの検体もシングルバンドが検出された。また、形質転換体ではＡｓｋｕ７０：：ｐｔｒＡ株よりも大きいサイズのバンドが確認され、そのサイズはＰＣＲの鋳型として使用したアスペルギルス・ソーヤ ＮＢＲＣ４２３９株と同じであった。このことから、形質転換体中のｐｙｒＧ遺伝子は復元されており、さらに核も純化されていることが確認された。
【００７６】
［新規プロテアーゼ遺伝子強制発現株のサザンハイブリダイゼーションによる確認］
新規プロテアーゼ遺伝子強制発現株をサザンハイブリダイゼーションにより確認した。形質転換体およびＡｓＸｋｕ：：ｐｔｒＡ株のゲノムＤＮＡ約５．０μｇを制限酵素により３７℃で一晩消化を行った後、０．８％アガロースゲルにより電気泳動を行った。制限酵素としては、新規プロテアーゼ１遺伝子強制発現株の確認ではＸｂａＩを、新規プロテアーゼ２遺伝子強制発現株ではＢｇｌＩＩを新規プロテアーゼ３遺伝子強制発現株の確認ではＥｃｏＲＩを、新規プロテアーゼ４遺伝子強制発現株の確認ではＳｓｐＩを使用した。泳動した核酸を、ポジティブ電荷を持つナイロン膜であるハイボンドＮ＋（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）にブロットした後、ジコキシゲニン（ＤＩＧ）−ラベルを行ったプローブを用い、フォルムアミドを含まないハイブリダイゼーションバッファーにて６８℃で一晩ハイブリダイゼーションを行った。ＤＩＧ−ラベルプローブの作製には、ＤＩＧ ＰＣＲ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ(ロシュダイアグノスティクス社製)を使用し、ＰＣＲ用の酵素にはＥｘＴａｑ（タカラバイオ社製）を、鋳型には１５０ｎｇのアスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株のゲノムＤＮＡを用いた。ＰＣＲ用プライマーはに示すオリゴヌクレオチドプライマーを使用し、反応系は全量２５μＬで実施した。オリゴヌクレオチドプライマーは、表８に示したものを使用した。また、新規プロテアーゼ２および３遺伝子強制発現株確認用のプローブを増幅させる際には、反応系に対し終濃度が５．０％になるようにジメチルスルフォキシドを添加した。
新規プロテアーゼ遺伝子強制発現株のサザンハイブリダイゼーションの結果を図９に記した。いずれの新規プロテアーゼ遺伝子強制発現株においても、ＡｓＸｋｕ：：ｐｔｒ８では検出されない高分子量側に存在するバンドが確認され、そのサイズは強制発現用カセットがゲノム中に正しく導入されている場合の理論値と等しいものであった。以上の結果より、新規プロテアーゼ遺伝子強制発現用カセットは、ＡｓＸｋｕ：：ｐｔｒ８株の目的とする領域に挿入されていると判断した。
【００７７】
【表８】
【実施例３】
【００７８】
［新規プロテアーゼ遺伝子を強制発現させたアスペルギルス・ソーヤのプロテアーゼ生産能の評価］
新規プロテアーゼ遺伝子の強制発現により麹菌アスペルギルス・ソーヤのプロテアーゼ生産能が増強されているかを下記の方法を用いて評価した。
【００７９】
［新規プロテアーゼ遺伝子強制発現株のしょうゆ麹培養と粗酵素溶液の調製］
脱脂大豆１０ｇに焙煎割砕小麦１０ｇと１４ｍＬの水を加えよく混合した。これを、７ｇずつ１５０ｍＬ容の三角フラスコに分取し、綿栓をしたのち１２１℃で３０分間オートクレーブにより滅菌し、しょうゆ麹を作製した。ここに、各形質転換体もしくはＡｓｋｕＰＧ０２Ｂ株（コントロール株）の分生子を１０,０００,０００個ずつ接種し３０℃にて４０時間（新規プロテアーゼ１および３）もしくは７２時間培養（新規プロテアーゼ２および４）した。培養終了後、２０ｍＬの２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液 pH7.5)を加え激しく撹拌したのち、懸濁液を４℃にて一晩静置し菌体外酵素を抽出した。この懸濁液をろ紙（Ｎｏ．２、ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製）にてろ過したのち、ろ液を１０，０００×ｇで２０分間、４℃にて遠心分離し固形物を除去した。本サンプルを粗酵素溶液とし以降の酵素活性測定に用いた。
【００８０】
［酸性プロテアーゼ活性測定法］
プロテアーゼ活性測定用の酸変性ヘモグロビン (シグマアルドリッチ)を、終濃度が２％となるように２０ｍＭグリシン-塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）に溶解させた。この２％ヘモグロビン溶液１０００μＬに、８５０μＬの緩衝液を小試験管に加えボルテックスミキサーにより混合した。ここに、１０ ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液 （ｐＨ ７．５） により２０倍希釈した粗酵素溶液を１５０ μＬ加えて混合し、４０℃にて３０分間インキュベートした。反応終了後、２．０ ｍＬの４００ ｍＭ トリクロロ酢酸を加えて混合し、１０分間室温で静置した。この酸変性溶液を、ＡＤＶＡＮＴＥＣ ５Ｃのろ紙によりろ過したのち、ろ液０．５ ｍＬを別の小試験管に分取した。ここに２．０ ｍＬの４００ ｍＭ炭酸ナトリウムと０．５ ｍＬの２倍希釈したフォーリン―チオカルト試薬(＝フェノール試薬、超純水により希釈)を加え、室温で３０分静置したのち、６６０ｎｍにおける吸光度を測定することで各検体の酸性プロテアーゼ活性を求めた。なお本実験は、コントロールならびに形質転換体ともに培養から独立した３連で実施した。また、図中のエラーバーは標準誤差を示した。
【００８１】
［中性プロテアーゼ活性測定法］
ミルクカゼインを終濃度が２％となるように２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ７．５）に溶解させた。この２％ミルクカゼイン溶液１０００μＬに、８５０μＬの２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液を小試験管に加えボルテックスミキサーにより混合した。ここに、１０ ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液 （ｐＨ ７．５） により１０倍希釈した粗酵素溶液を１５０ μＬ加えて混合し、４０℃にて３０分間インキュベートした。反応終了後、２．０ ｍＬの４００ ｍＭ トリクロロ酢酸を加えて混合し、１０分間室温で静置した。この酸変性溶液を、ＡＤＶＡＮＴＥＣ ５Ｃのろ紙によりろ過したのち、ろ液０．５ ｍＬを別の小試験管に分取した。ここに２．０ ｍＬの４００ ｍＭ炭酸ナトリウムと０．５ ｍＬの２倍希釈したフォーリン―チオカルト試薬(＝フェノール試薬、超純水により希釈)を加え、室温で３０分静置したのち、６６０ｎｍにおける吸光度を測定することで各検体の中性プロテアーゼ活性を求めた。なお本実験は、コントロールならびに形質転換体ともに培養から独立した３連で実施した。また、図中のエラーバーは標準誤差を示した。
【００８２】
［新規プロテアーゼ遺伝子強制発現株をしょうゆ麹にて培養したときのプロテアーゼ活性の評価結果］
新規プロテアーゼ１遺伝子を強制発現させた系では、コントロールであるＡｓｋｕＰＢ０２Ｂ株を用いた系と比較し、中性プロテアーゼ活性は１３．４％、酸性プロテアーゼ活性は１４．４％と顕著に上昇していた（図１１）。新規プロテアーゼ２遺伝子を強制発現させた系では、コントロール株と比較し酸性プロテアーゼ活性については有意な変化は見られなかったが、中性プロテアーゼ活性が８．４％上昇した（図１２）。また、新規プロテアーゼ３遺伝子を強制発現させた系では、中性プロテアーゼ活性は４．１％の上昇であったが、酸性プロテアーゼ活性については１３．９％の上昇が見られた（図１３）。また、新規プロテアーゼ遺伝子４を強制発現させた系では、中性プロテアーゼ活性については変化が見られなかったが、酸性プロテアーゼ活性が１３．２％上昇した（図１４）。以上結果より、新規プロテアーゼ遺伝子を強制発現させた場合、効果が見られるプロテアーゼの種類は対象遺伝子ごとに異なっているが、いずれの新規プロテアーゼ遺伝子についても麹菌アスペルギルス・ソーヤのプロテアーゼ生産能を増強させる働きがあることが確認された。なかでも酸性プロテアーゼをコードする新規プロテアーゼ１遺伝子の強制発現は、麹菌の酸性プロテアーゼ生産能だけでなく中性プロテアーゼ生産能も向上させることができるという有用な働きがある。
【実施例４】
【００８３】
［新規プロテアーゼ遺伝子強制発現株の大豆タンパク質分解活性の評価］
［新規プロテアーゼ遺伝子強制発現株のしょうゆ麹での培養と粗酵素抽出液の調製］
脱脂大豆１０ｇに焙煎割砕小麦１０ｇと１４ｍＬの水を加えよく混合した。これを、７ｇずつ１５０ｍＬ容の三角フラスコに分取し、綿栓をしたのち１２１℃で３０分間オートクレーブにより滅菌し、しょうゆ麹を作製した。ここに、各形質転換体もしくはＡｓｋｕＰＧ０２Ｂ株（コントロール株）の分生子を１０,０００,０００個ずつ接種し３０℃にて７２時間培養した。培養終了後、２０ｍＬの２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液 （ｐＨ７．５)を加え激しく撹拌したのち、懸濁液を４℃にて一晩静置し菌体外酵素を抽出した。この懸濁液をろ紙（Ｎｏ２、ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製）にてろ過したのち、ろ液を１０，０００×ｇで２０分間、４℃にて遠心分離し固形物を除去した。次にこの抽出液１２０μＬを、２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）により平衡化したＰＤ ＳｐｉｎＴｒａｐ Ｇ-２５（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）により処理することにより、抽出液に含まれるアミノ酸等を除去した。
【００８４】
［大豆タンパク質分解反応］
２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に大豆タンパク質を終濃度が１．０％となるように溶解したのち、オートクレーブにより滅菌した。本大豆タンパク質溶液２００μＬに２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）を用いて１０倍希釈した希釈したＰＤ ＳｐｉｎＴｒａｐ Ｇ−２５溶出液を、１００μＬ加えた。これを３０℃、１５０ｒｐｍにて２０時間反応させたのち、１２，０００ｘｇにて２０分間遠心分離することで、未反応の大豆タンパク質を沈殿させた。遠心分離後の上清２０μＬを９８０μＬの２００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）により希釈した。これにニンヒドリン試薬−Ｌ８５００セット（和光純薬工業株式会社製）のニンヒドリン試薬と緩衝液を１：１で混合したものを１ｍＬ加え、１００℃にて１５分間加温し発色させたのち、反応液を１５分間水冷した。この発色液を１００μＬ分取後、２，９００μＬの２００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）を加えたのち、５７０nmにおける吸光度を測定することで、反応により遊離したアミノ酸量を定量した。なお本実験は、コントロールならびに形質転換体ともに培養から独立した３連で実施した。また、図中のエラーバーは標準誤差を示した。
【００８５】
［大豆タンパク質分解活性測定結果］
大豆タンパク質分解活性測定結果を図１５に記した。新規プロテアーゼ遺伝子１および２を強制発現させた系では、コントロールであるＡｓｋｕＰＧ０２Ｂ株を用いた系と比較して、大豆タンパク質分解活性がそれぞれ１８．２％および１３．６％上昇していた。このことから、新規プロテアーゼ１および２遺伝子を強制発現させた麹菌は、原料として大豆タンパク質を利用する各種調味料の生産に有用であると考えられる。一方、新規プロテアーゼ３および４遺伝子を強制発現させた系では、ＡｓｋｕＰＧ０２Ｂ株を用いた系と比較し、大豆タンパク質分解活性の有意な上昇は見られなかった。
【実施例５】
【００８６】
［新規プロテアーゼ４遺伝子強制発現株をＣｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ最少液体培地にて培養した際の酸性プロテアーゼ活性ならびにプロタミン分解活性の評価］
【００８７】
［新規プロテアーゼ４遺伝子強制発現株およびＡｓｋｕＰＧ０２Ｂ株の培養］
各形質転換体もしくはＡｓｋｕＰＧ０２Ｂ株（コントロール株）の分生子を１０,０００,０００個ずつ３０ｍＬのＣｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ液体培地に接種し３０℃にて６日間培養した。この培養液をろ紙（Ｎｏ．２，ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製）によりろ過することにより菌体を除き、菌体外酵素が含まれる培地を回収しその酸性プロテアーゼ活性およびプロタミン分解活性を測定した。
【００８８】
［酸性プロテアーゼ活性の測定法］
酸性プロテアーゼ活性の測定方法は、酵素反応の時間を３０分間から９０分間にし、培養液を希釈せず測定したこと以外は、実施例３にて記した方法を用いて実施した。なお本実施例については、培養から独立した５連で実験を行った。また、図中のエラーバーは標準誤差を示した。
【００８９】
［プロタミン分解活性の測定法］
培養終了後、ろ過により菌体を除去した培地画分１２０μＬを、２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）により平衡化したＰＤ ＳｐｉｎＴｒａｐ Ｇ-２５（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）により処理することにより、培養液に含まれるアミノ酸等を除去した。この処理済みの溶液を２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）により１０倍希釈した。本希釈液１００μＬに４００μＬの１．２５％プロタミン溶液（サケ由来、ｐＨ７．５の２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液に溶解）を混合したのち、４０℃にて１６時間反応させた。反応液に５００μＬの２５％トリクロロ酢酸を加え反応を停止したのち、４℃にて１４，０００Ｘｇ、３０分間遠心分離することで未反応のプロタミンを沈殿させた。遠心分離後の上清２０μＬを９８０μＬの２００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）を加え５０倍希釈したのち、ニンヒドリン試液−Ｌ８５００セット（和光純薬工業株式会社製）のニンヒドリン試薬と緩衝液を１：１で混合したものを１ｍＬ加え、１００℃にて１５分間加温し発色させた。加熱終了後、反応液を１５分間水冷したたのち、２，０００μＬの２００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）を加えたうえで５７０nmの吸光度を測定することで、反応により遊離したアミノ酸量を定量した。
【００９０】
［液体培養を行った新規プロテアーゼ４遺伝子強制発現株の酸性プロテアーゼ活性評価結果］
液体培養時における新規プロテアーゼ４強制発現株の酸性プロテアーゼ活性評価結果を図１６に示した。新規プロテアーゼ４遺伝子を強制発現させた株の系の酸性プロテアーゼ活性は、コントロールであるＡｓＫｕＰＧ０２Ｂ株を使用した系と比較して、平均で４４.２％活性が上昇していた。
【００９１】
［液体培養を行った新規プロテアーゼ４遺伝子強制発現株のプロタミン分解活性評価結果］
新規プロテアーゼ４は中性プロテアーゼＩＩ（デューテロライシンＡ）と同じくファミリーＭ３５の金属プロテアーゼのモチーフを有するタンパク質である。中性プロテアーゼＩＩに関してはこれまでにいくつの解析が行われており、本タンパク質は塩基性タンパク質であるヒストンやプロタミンに対して高い活性を示すことが公知となっている（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４０，７０３−７０９，１９７６）。そこで、新規プロテアーゼ４に関しても塩基性タンパク質に対して高い活性を有するか調べるために、本酵素のプロタミン分解活性を調べた。その結果、新規プロテアーゼ４は、コントロール株と比べて約２．１倍高いプロタミン分解活性を有しいた（図１７）。このことから、新規プロテアーゼ４はプロタミンなどの各種塩基性タンパク質分解産物の調製に利用できると考えられる。
【実施例６】
【００９２】
［醤油麹にて培養した新規プロテアーゼ１および２強制発現株の小麦グルテン分解活性の評価］
脱脂大豆１０ｇに焙煎割砕小麦１０ｇと１４ｍＬの水を加えよく混合した。これを、１０ｇずつ１５０ｍＬ容の三角フラスコに分取し、綿栓をしたのち１２１℃で３０分間オートクレーブにより滅菌し、しょうゆ麹を作製した。ここに、各形質転換体もしくはＡｓｋｕＰＧ０２Ｂ株（コントロール株）の分生子を１０,０００,０００個ずつ接種し３０℃にて７２時間培養した。この三角フラスコに、小麦グルテン粉末３０ｇと５００μｇ／ｍＬの濃度でアンピシリンを含む１３％塩化ナトリウム水溶液３０ｍＬを加えたのち、４０℃、１５０ｒｐｍにて６日間分解反応を行った。分解反応終了後、分解産物を５ｇ分取し、Ｎｏ５Ａのろ紙（ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製）にてろ過し、ろ紙上の残渣を８％塩化ナトリウム溶液にて洗浄したのち、本洗浄液を８％塩化ナトリウム溶液にて１００ｍＬに定容した。この洗浄液中に含まれる可溶性窒素の量をケルダール法（生化学実験講座１、タンパク質の化学ＩＩ，日本生化学会編、ｐｐ.6）により測定した。なお実施例６については、培養から独立した２連で実施し、その平均値にて比較を行った。
【００９３】
本結果を図１８に記した。新規プロテアーゼ１を用いた系におけるグルテン分解諸味１ｇあたりに含まれる可溶性窒素の量（％Ｎ）は、コントロールであるＡｓｋｕＰＧ０２Ｂ株を用いた系と比較して、約１．３％増加していた。また、新規プロテアーゼ２遺伝子を強制発現させた株を用いた系では約１．８％増加していた。以上のことから、新規プロテアーゼ１および２遺伝子を強制発現させた麹菌は、小麦グルテンを原料として使用する各種調味料生産に有用であると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００９４】
以上のとおり、本発明の新規プロテアーゼ遺伝子はいずれも活性を有するプロテアーゼをコードしていることがわかった。このことから本発明は、麹菌によるプロテアーゼの効率的な生産や、食品加工用の酵素生産、醸造食品の生産に用いる微生物の改良にも用いることができると考えられる。なかでも、新規プロテアーゼ遺伝子１および２は強制発現株については大豆タンパク質を分解する際に、新規プロテアーゼ遺伝子４の強制発現株については塩基性の高いタンパク質を分解する際に有用であると考えられる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なプロテアーゼ遺伝子、組換え体ＤＮＡ、及びプロテアーゼの製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
麹カビであるアスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）およびアスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｏｊａｅ）は、古くから日本における醸造食品の製造に用いられてきた糸状菌であり、ともに産業上非常に重要な微生物である (非特許文献１)。
【０００３】
このうち、アスペルギルス・オリゼーは醤油、味噌、日本酒の醸造など幅広い用途に用いられている。なかでもアスペルギルス・オリゼーＲＩＢ４０株については、そのゲノム解析が実施され、２００５年に公開されている(非特許文献２)。一方アスペルギルス・ソーヤは、主として醤油醸造に用いられる微生物であり、本菌に関してのゲノム解析は、本願出願の時点において公開されているものはない。
【０００４】
しょうゆ醸造において麹カビの生産する数多くの酵素は、原料分解という重要な役割を担っている。なかでもプロテアーゼは複数の異なった性質の酵素群が協調して働くことで、原料中のタンパク質を分解・可溶化させる働きをしているため、しょうゆ醸造にとって極めて重要である。（非特許文献１、３）麹カビのエンド型プロテアーゼとしては、酸性プロテアーゼ アスペルギロペプシン Ｉ（ＥＣ３．４．２３．１８）、中性プロテアーゼ（ＥＣ３．４．２４．２７）、デューテロライシン（中性プロテアーゼＩＩ）（ＥＣ３．４．２４．３９）およびアルカリプロテアーゼ（ＥＣ３．４．２１．６３）などが知られている。エキソ型プロテアーゼとしては、酸性カルボキシペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１６．５）、ロイシルアミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）のようなアミノペプチダーゼ（３．４．１１）やジペプチダーゼなどが知られている（非特許論文３）。しょうゆの生産性と品質の向上をはかるためには、これら既知プロテアーゼの生産量を増やす方法も考えられるが、これまでに知られていない新規プロテアーゼを積極的に活用していくことも、有効な手段と成りうると考えられる。そこで我々は、ゲノム情報が未知であるアスペルギルス・ソーヤのゲノム解析を実施し、目的とするプロテアーゼ遺伝子を見出し、さらにその遺伝子産物の酵素化学的な解析を行うことで、しょうゆ及び酵素分解調味液等の醸造に重要なプロテアーゼ遺伝子を得る事を試み、本発明を完成させるに至った。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】醤油の科学と技術、栃倉辰六郎編集
【非特許文献２】Ｎａｔｕｒｅ； ４３８， １１５７−１１６１ （２００５）
【非特許文献３】ものと人間の文化史１３８ 麹（こうじ）、一島 英治 著
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、しょうゆ及び酵素分解調味料等の原料に存在するタンパク質を分解することができる新規プロテアーゼ、該プロテアーゼをコードする新規遺伝子、該遺伝子を含む組換え体ＤＮＡ、該組換え体ＤＮＡを含む形質転換体又は形質導入体及び該形質転換体又は形質導入体を用いたプロテアーゼの製造法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者等は、上記課題について種々検討した結果、アスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｏｊａｅ）由来のプロテアーゼ遺伝子を単離し、該遺伝子を酵母および麹菌にて発現し、該発現タンパク質のプロテアーゼ活性を確認し、本発明を完成した。
【０００８】
即ち、第１の発明は、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質である。
（ａ）配列番号２、配列番号４、配列番号６および配列番号８に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（ｂ）配列番号２、配列番号４、配列番号６および配列番号８に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個（２〜５個）のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつプロテアーゼ活性を有するタンパク質
【０００９】
第２の発明は、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質（プロテアーゼ）をコードするプロテアーゼ遺伝子である。
（ａ）配列番号２、配列番号４、配列番号６および配列番号８に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（ｂ）配列番号２、配列番号４、配列番号６および配列番号８に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個（２〜５個）のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、プロテアーゼ活性を有するタンパク質
【００１０】
第３の発明は、以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡからなるプロテアーゼ遺伝子である。
（ａ）配列番号１、配列番号３、配列番号５および配列番号７に示される塩基配列からなるＤＮＡ（ｂ）配列番号１、配列番号３、配列番号５および配列番号７に示される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、プロテアーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡである。
【００１１】
第４の発明は、上記プロテアーゼ遺伝子をベクターＤＮＡに挿入したことを特徴とする新規な組換え体ＤＮＡである。第５の発明は、上記組換え体ＤＮＡを含む形質転換体又は形質導入体である。第６の発明は、上記形質転換体又は形質導入体を培地に培養し、培養物からプロテアーゼを採取することを特徴とするプロテアーゼの製造法である。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、新規プロテアーゼ、プロテアーゼ遺伝子、該遺伝子を含む組換えベクター及び形質転換体を提供することができる。また、本発明によりプロテアーゼの生産方法を提供することができる。その結果、麹菌によるプロテアーゼの効率的な生産が行えるようになる。さらに、上記プロテアーゼのタンパク質工学的な改良が行えるようになるとともに、食品加工用の酵素生産、醸造食品の生産に用いる微生物の改良にも用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】ＲＴ−ＰＣＲによる４種新規プロテアーゼｃＤＮＡの増幅
【図２】ゲノム上存在する新規プロテアーゼ遺伝子のエクソン‐イントロン構造
【図３】４種新規プロテアーゼにおける菌体外分泌シグナルおよびＰｒｏ領域の予測結果
【図４】新規プロテアーゼ1〜３のアフィニティークロマトグラフィー精製画分の 酸性プロテアーゼ活性測定結果
【図５】新規プロテアーゼ３のアフィニティークロマトグラフィー精製画分の酸性カルボキシペプチダーゼ活性測定結果
【図６】新規プロテアーゼ４のアフィニティークロマトグラフィー精製画分の酸性プロテアーゼ活性測定結果
【図７】新規プロテアーゼ強制発現用ベクターのアスペルギルス・ソーヤへの導入方法
【図８】新規プロテアーゼ遺伝子強制発現株のＰＣＲによる確認
【図９】新規プロテアーゼ遺伝子強制発現株のサザンハイブリダイゼーションによる確認
【図１０】ＡｓｋｕＰＧ０２Ｂ株のＰＣＲによる確認
【図１１】新規プロテアーゼ１ 遺伝子強制発現株 をしょうゆ麹にて４０時間培養した際のプロテアーゼ活性評価結果
【図１２】新規プロテアーゼ２ 遺伝子強制発現株 をしょうゆ麹にて７２時間培養した際のプロテアーゼ活性評価結果
【図１３】新規プロテアーゼ３ 遺伝子強制発現株 をしょうゆ麹にて４０時間培養した際のプロテアーゼ活性評価結果
【図１４】新規プロテアーゼ4 遺伝子強制発現株 をしょうゆ麹にて７２時間培養した際のプロテアーゼ活性評価結果
【図１５】大豆タンパク質分解における新規プロテアーゼ遺伝子強制発現の効果
【図１６】新規プロテアーゼ４ 遺伝子強制発現株をＣｚａｐｅｋ-Ｄｏｘ液体培地にて培養した際の酸性プロテアーゼ活性評価結果
【図１７】新規プロテアーゼ４遺伝子強制発現のプロタミン分解活性への効果
【図１８】小麦グルテン分解における新規プロテアーゼ１および２ 遺伝子強制発現の効果
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の新規タンパク質は、配列番号２、配列番号４、配列番号６および配列番号８で表される各アミノ酸配列からなるタンパク質であり、プロテアーゼ活性を有する。該タンパク質は、例えば、アスペルギルス・ソーヤなどの麹菌の培養液もしくは菌体破砕液より得ることができる。また、該プロテアーゼは、上記麹菌等からクローニングしたプロテアーゼ遺伝子を適当な宿主−ベクター系で発現させることにより得られる。
【００１５】
該タンパク質は、プロテアーゼ活性を有する限り、配列番号２，４，６又は８で表される各アミノ酸配列において１若しくは数個（２〜５個）のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されていてもよい。さらに、プロテアーゼ活性を有する限り、上記の各配列番号で表されるアミノ酸配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、更に好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の配列同一性を示すアミノ酸配列を含むタンパク質、又はその部分断片であってもよい。
【００１６】
２つのアミノ酸配列又は塩基配列における配列同一性を決定するために、配列は比較に最適な状態に前処理される。例えば、一方の配列にギャップを入れることにより、他方の配列とのアラインメントの最適化を行う。その後、各部位におけるアミノ酸残基又は塩基が比較される。第一の配列における、ある部位に、第二の配列の相当する部位と同じアミノ酸残基又は塩基が存在する場合、それらの配列は、その部位において同一である。２つの配列における配列同一性は、配列間での同一である部位数の全部位（全アミノ酸又は全塩基）数に対する百分率で示される。
【００１７】
上記の原理に従い、２つのアミノ酸配列又は塩基配列における配列同一性は、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｈｕｌのアルゴリズム（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２２６４−２２６８，１９９０及びＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３−５８７７，１９９３）により決定される。このようなアルゴリズムを用いたＢＬＡＳＴプログラムがＡｌｔｓｈｕｌらによって開発された（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０，１９９０）。さらに、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴはＢＬＡＳＴより感度良く配列同一性を決定するプログラムである（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２，１９９７）。上記のプログラムは、主に与えられた配列に対し、高い配列同一性を示す配列をデータベース中から検索するために用いられる。これらは、例えば米国Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのインターネット上のウェブサイトにおいて利用可能である。
【００１８】
配列間の配列同一性として、Ｔａｔｉａｎａ Ａ． Ｔａｔｕｓｏｖａらによって開発されたＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓソフトウェア（ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ．，１７４：２４７−２５０，１９９９）を用いて決定した値を用いる。このソフトウェアは米国Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのインターネット上のウェブサイトにおいて利用可能であり、入手も可能である。用いるプログラム及びパラメーターは以下のとおりである。アミノ酸配列の場合、ｂｌａｓｔｐプログラムを用いパラメーターとしては、Ｏｐｅｎ ｇａｐ：１１ ａｎｄ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｇａｐ：１ ｐｅｎａｌｔｉｅｓ，ｇａｐ ｘ＿ｄｒｏｐｏｆｆ：５０，ｅｘｐｅｃｔ：１０，ｗｏｒｄ ｓｉｚｅ：３，Ｆｉｌｔｅｒ：ＯＮを用いる。塩基配列の場合、ｂｌａｓｔｎプログラムを用いパラメーターとしては、Ｒｅｗａｒｄ ｆｏｒ ａ ｍａｔｃｈ：１，Ｐｅｎａｌｔｙ ｆｏｒ ａｍｉｓｍａｔｃｈ：−２， Ｓｔｒａｎｄ ｏｐｔｉｏｎ：Ｂｏｔｈ ｓｔｒａｎｄｓ， Ｏｐｅｎ ｇａｐ：５ ａｎｄ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｇａｐ：２ ｐｅｎａｌｔｉｅｓ，ｇａｐ ｘ＿ｄｒｏｐｏｆｆ：５０，ｅｘｐｅｃｔ：１０，ｗｏｒｄ ｓｉｚｅ：１１，Ｆｉｌｔｅｒ：ＯＮを用いる。いずれのパラメーターも、ウェブサイト上でデフォルト値として用いられているものである。
【００１９】
ただし、上記ＢＬＡＳＴソフトウェアで有意な配列同一性を示す配列が見つからない場合には、さらに高感度なＦＡＳＴＡソフトウェア（Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｄ．Ｊ．Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：２４４４−２４４８，１９８８）を用いて配列同一性を示す配列をデータベースから検索することもできる。ＦＡＳＴＡソフトウェアは、例えば、ゲノムネットのウェブサイトで利用できる。この場合も、パラメーターはデフォルト値を用いる。例えば、塩基配列についての検索を行う場合は、データベースにｎｒ−ｎｔを用い、ｋｔｕｐ値は６を用いる。ただし、いずれの場合も、全体の３０％以上、５０％以上又は７０％以上のオーバーラップを示さない場合は、機能的に相関しているとは必ずしも推定されないため、２つの配列間の配列同一性を示す値としては用いない。
【００２０】
本発明の新規プロテアーゼ遺伝子及びタンパク質（プロテアーゼ）は本明細書の開示内容に基づき当業者であれば容易に単離・調製することができる。例えば、アスペルギルス・ソーヤ、さらに具体的には、アスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株（寄託機関：独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部、寄託番号ＩＤ：ＮＢＲＣ４２３９）が挙げられる。これら菌体を、該プロテアーゼの生産を誘導する条件の培地で培養したものから、常法により全ＲＮＡを回収する。培地としては、例えば、小麦フスマを用いることができる。上記培地で適当な時間、例えば、３６時間静置培養したのち、菌体を回収し液体窒素を満たした乳鉢中に適量、例えば、０．３ｇを移し、乳棒を用いて粉砕し、Ｃａｔｈａｌａらの方法（ＤＮＡ，２：３２９−３３５，１９８３）で全ＲＮＡを調製する。
【００２１】
こうして得られた全ＲＮＡを鋳型として、ＲＴ−ＰＣＲを行う。プライマーとしては、本発明のプロテアーゼ遺伝子を増幅することのできる組み合せであればどのような組み合せのものを用いてもよいが、例えば、後述の配列番号９から配列番号１６までの配列のオリゴヌクレオチドプライマーを用いることができる。ＲＴ−ＰＣＲは、市販のキット、例えば、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ−ＰＣＲ Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて常法により行うことができる。得られた本発明のプロテアーゼ遺伝子を含むＤＮＡは、例えば、常法によりプラスミドに組み込むことができる。
【００２２】
このようにして得られたＤＮＡの塩基配列は、サンガー法等の方法により、市販の試薬及びＤＮＡシークエンサーを用いて決定することができる。得られる本発明のプロテアーゼ遺伝子を含むＤＮＡ及び該ＤＮＡによりコードされるプロテアーゼの例をそれぞれ配列番号１から配列番号８に例示する。
【００２３】
プロテアーゼ遺伝子は、プロテアーゼ活性を有する限り、配列番号２，４，６，又は８で表される各アミノ酸配列において１若しくは数個（２〜５個）のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質をコードしているものであってもよい。このような遺伝子は、後述するハイブリダイゼーションによる選択のほか、種々の公知の変異導入方法によって得ることもできる。
【００２４】
プロテアーゼ遺伝子は、ハイブリダイゼーションによる選択法を用いて得ることもできる。遺伝子源としては、例えば、アスペルギルス・ソーヤがあげられる。これらの生物から、常法によりＲＮＡ又はゲノムＤＮＡを調製し、プラスミド又はファージに組み込み、ライブラリーを調製する。
【００２５】
続いて、プローブとして用いる核酸を検出法に応じた方法で標識する。プローブとして用いる核酸は、十分な特異性を得られる長さであればよく、例えば、配列番号１，３，５又は７に記載の配列の少なくとも１００塩基以上、好ましくは２００塩基以上、最も好ましくは４５０塩基以上の部分又は全体を含むものが挙げられる。
【００２６】
次いで、標識したプローブにストリンジェントな条件でハイブリダイズするクローンを上記ライブラリーから選択する。ハイブリダイゼーションは、プラスミドライブラリーならコロニーハイブリダイゼーションによって、ファージライブラリーならプラークハイブリダイゼーションによって行うことができる。
【００２７】
ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドのシグナルが非特異的なハイブリッドのシグナルと明確に識別される条件であり、使用するハイブリダイゼーションの系と、プローブの種類、配列及び長さによって異なる。条件は、ハイブリダイゼーションの温度を変えること、洗浄の温度及び塩濃度を変えることにより決定可能である。例えば、非特異的なハイブリッドのシグナルまで強く検出されてしまう場合には、ハイブリダイゼーション及び洗浄の温度を上げるとともに、必要に応じて洗浄の塩濃度を下げることにより特異性を上げることができる。
【００２８】
また、特異的なハイブリッドのシグナルも検出されない場合には、ハイブリダイゼーション及び洗浄の温度を下げるとともに、必要に応じて洗浄の塩濃度を上げることにより、ハイブリッドを安定化させることができる。このような最適化は、本技術分野の研究者が容易に行いうるものである。
【００２９】
ストリンジェントな条件の具体例としては、例えば、ハイブリダイゼーションは、５×ＳＳＣ、１．０％（Ｗ／Ｖ）核酸ハイブリダイゼーション用ブロッキング試薬（ロシュ・ダイアグノスティクス社製）、０．１％（Ｗ／Ｖ）Ｎ−ラウロイルサルコシン、０．０２％（Ｗ／Ｖ）ＳＤＳを用い一晩（８〜１６時間程度）で行い、洗いは、０．５×ＳＳＣ、０．１％（Ｗ／Ｖ）ＳＤＳ、好ましくは０．１×ＳＳＣ、０．１％（Ｗ／Ｖ）ＳＤＳを用い、１５分間、２回行う。ハイブリダイゼーションと洗いの温度は、５２℃以上、好ましくは５７℃以上、さらに好ましくは６２℃以上、最も好ましくは６７℃以上である。
【００３０】
さらに、配列番号１，３，５，又は７に記載の各塩基配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、更に好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の配列同一性を示す塩基配列は、本発明のプロテアーゼと実質的に同等の活性を有するタンパク質をコードしていると考えられる。このようなＤＮＡは、上記のハイブリダイゼーションを指標に得ることもできるが、ゲノム塩基配列解析等によって得られた機能未知のＤＮＡ群や公共データベースのなかから、例えば、前述のＢＬＡＳＴソフトウェアを用いた検索により発見することも容易である。このような検索は、本技術分野の研究者が通常用いている方法である。
【００３１】
得られたＤＮＡがプロテアーゼ活性を有するタンパク質をコードしていることは、後述のように、適当な宿主において対象遺伝子を過剰発現させたのち、破砕・部分精製等の処理を行ったのちプロテアーゼ活性を検出することで確認することができる。
【００３２】
本発明の組換えベクターは、プロテアーゼ遺伝子を適当なベクター上に連結することにより得ることができる。ベクターとしては、形質転換する宿主中でプロテアーゼを生産させうるものであればどのようなものでも用いることができ、例えば、プラスミド、コスミド、ファージ、ウイルス、染色体組み込み型、人工染色体などのベクターを用いることができる。
【００３３】
ベクターには、形質転換された細胞を選択することを可能にするためのマーカー遺伝子が含まれていてもよい。
【００３４】
マーカー遺伝子としては、例えば、ｕｒａ３、ｎｉａＤ、およびｐｙｒＧのような、宿主の栄養要求性を相補する遺伝子や、アンピシリンやカナマイシン、オリゴマイシンなどの薬剤に対する抵抗遺伝子などが挙げられる。
【００３５】
また、組換えベクターは、宿主細胞中で本発明の遺伝子を発現することのできるプロモーター又はその他の制御配列、例えば、エンハンサー配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列等を含むことが望ましい。
【００３６】
プロモーターとしては、例えば、ＧＡＬ１プロモーター、ｔｅｆ１プロモーター、ｌａｃプロモーター等が挙げられる。また、精製のためのタグをつけることもできる。具体的には、プロテアーゼ遺伝子の下流に適宜リンカー配列を接続し、ヒスチジンをコードする塩基配列を６コドン以上接続することにより、ニッケルカラムを用いた精製を可能にすることができる。
【００３７】
本発明の形質転換体は、宿主を、組換えベクターで形質転換することにより得られる。宿主としては、プロテアーゼを生産することができるものであれば特に限定されず、例えば、チゴサッカロミセス・ルキシー（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｒｏｕｘｉｉ）等の酵母、アスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｏｊａｅ）、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）等の糸状菌、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、バチルス・ズブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等の細菌であってもよい。尚、ｔｅｆ１プロモーターのような構成的プロモーターを使用することにより強制発現株を作製することができ、この強制発現株によって制御対象のタンパク質を強制的に発現させることができる。
【００３８】
形質転換は、宿主に応じて公知の方法で行うことができる。宿主に酵母を用いる場合は、例えば、酢酸リチウムを用いるＭｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，５，２５５−２６９（１９９５）に記載の方法が利用できる。糸状菌を用いる場合は、例えば、プロトプラスト化した後ポリエチレングリコール及び塩化カルシウムを用いるＭｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２１８：９９−１０４，１９８９に記載の方法が利用できる。細菌を用いる場合は、例えば、エレクトロポレーションによるＭｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４：１８２−１８７，１９９０に記載の方法が利用できる。
【００３９】
本発明のプロテアーゼの製造法は、プロテアーゼ遺伝子を発現させた形質転換体を培養し、常法によって、得られる培養物からプロテアーゼのタンパク質を効率よく回収することからなる。培地及び培養方法は、宿主の種類と組換えベクター中の発現制御配列によって適当なものを選ぶ。宿主がアスペルギルス・ソーヤであり、発現制御配列がａｍｙＢプロモーターである場合、例えば、マルトースを炭素源とする液体最少培地で培養することにより、本発明のプロテアーゼを高発現させることがでる。宿主が大腸菌であり、発現制御配列がｌａｃプロモーターである場合、例えば、ＩＰＴＧを含有する液体培地で培養することにより、該プロテアーゼを生産させることができる。
【００４０】
また、プロテアーゼが菌体内又は菌体表面に生産された場合は、菌体を培地から分離し、その菌体を適当に処理することでプロテアーゼを得ることができる。例えば、チゴサッカロミセス・ルキシーの菌体表面に生産された場合、破砕した後、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、Ｔｗｅｅｎ−２０、あるいはＮｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０等の非イオン性の界面活性剤を低濃度で作用させ、遠心分離した上清よりプロテアーゼを回収することができる。培養液中にプロテアーゼが生産された場合は、遠心分離・ろ過等により菌体を除去することによりプロテアーゼを得ることができる。何れの場合も、硫安分画、各種クロマトグラフィー、アルコール沈殿、限外ろ過等を用いた常法により、得られたプロテアーゼをさらに純度の高いものとして得ることもできる。
【００４１】
以下、実施例に即して本発明を具体的に説明するが、本発明の技術的範囲は、これらの記載によって、なんら制限されるものではない。
【実施例１】
【００４２】
[４種プロテアーゼ遺伝子のｃＤＮＡクローニングと酵母発現系を用いたプロテアーゼ活性の確認]
[Ｔｏｔａｌ ＲＮＡの調製]
アスペルギルス・ソーヤ ＮＢＲＣ４２３９株の分生子約１０，０００，０００個を５．０ｇ の小麦フスマ (フスマ：水 ＝ ５：４) に植え、３０℃にて３６時間培養した。培養終了後、約３００から４００ｍｇの菌体を液体窒素により急速に凍結したのち、冷却しておいた乳鉢と乳棒で破砕した。この破砕菌体１００ｍｇを８００μＬのＩＳＯＧＥＮ (ニッポンジーン) にて室温で５分間処理し、クロロフォルム処理およびアルコール沈殿を経てＴｏｔａｌ ＲＮＡを得た。この検体を、ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（タカラバイオ） の存在下でＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ のＤＮａｓｅ Ｉ (タカラバイオ) にて４時間処理することにより、混入しているゲノムＤＮＡを出来うる限り分解した。さらにＤＮａｓｅ Ｉ処理した Ｔｏｔａｌ ＲＮＡを、ＱＩＡＧＥＮ社のＲＮｅａｓｙ カラムにて精製し、精製Ｔｏｔａｌ ＲＮＡを得た。
【００４３】
[ＲＴ−ＰＣＲによる新規プロテアーゼ遺伝子（ｃＤＮＡ）の増幅]
精製Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ １００ ｎｇを鋳型とし、タカラバイオ社のＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴａｓｅ を用い全量２０μＬにて、４２℃、６０分間の逆転写反応を行った。プライマーはＯｌｉｇｏ ｄＴプライマーとＲａｎｄｏｍ ６ｍｅｒｓを１：１ の割合にて混合したものを反応系に２．０μＬ添加した。反応終了後、反応液を７０℃で１５分間処理することにより逆転写酵素を失活させた。次にＰＣＲによる各プロテアーゼ遺伝子のｃＤＮＡの増幅を行った。反応には正確性の高いＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ (タカラバイオ) を用い、液量は５０μLで反応を行った。１．０μLの逆転写反応液を鋳型として添加し、プライマーは終濃度がそれぞれ１．０μＭになるよう反応系に添加した。逆転写反応を行わない反応系では、反応系に５．０ ｎｇ の精製Ｔｏｔａｌ ＲＮＡを添加しＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応の温度条件は、９８℃１０秒ののち、９８℃１０秒、 ６０℃１０秒、７２ ℃ ２０秒を３８サイクルにて実施した。オリゴヌクレオチドプライマーの組み合わせは、新規プロテアーゼ１遺伝子の増幅時は配列番号９と１０を、新規プロテアーゼ２遺伝子の増幅時は配列番号１１と１２を、新規プロテアーゼ３遺伝子の増幅時には配列番号１３と１４を、そして新規プロテアーゼ４遺伝子の増幅時は配列番号１５と１６をそれぞれ用いた。
【００４４】
【表１】
【００４５】
ＲＴ−ＰＣＲによる４種プロテアーゼ遺伝子の増幅結果を図１に示した。いずれの遺伝子についても逆転写反応を実施した時のみ、特異的な増幅産物を得ることができた。新規プロテアーゼ２遺伝子と、新規プロテアーゼ３遺伝子および新規プロテアーゼ４遺伝子を増幅させた系列では単一の産物だけが増幅され、いずれの産物のサイズもゲノム解析データより予測された各遺伝子のｃＤＮＡのサイズとほぼ等しいものであった。また、新規プロテアーゼ１遺伝子を増幅させた系列では複数の産物が増幅されていが、目的とする遺伝子の予測ｃＤＮＡのサイズとほぼ等しいサイズの産物が、メインバンドのひとつとして検出されていた。そのため新規プロテアーゼ１遺伝子については、ゲノム解析データにて予想されていたサイズと等しい大きさのＰＣＲ産物を、ゲル抽出により精製しＤＮＡシーケンス解析を行った。
【００４６】
[ｐＵＣ１１８へのサブクローニングとＤＮＡシーケンスの解析]
前記ＲＴ−ＰＣＲの反応液４８μＬをアガロースゲルにより電気泳動しバンドを切り出した後、ＤＮＡフラグメントをＧｅｎｅ Ｃｌｅａｎ ＩＩ Ｋｉｔ（Ｑ・バイオジーン）を用いて精製した。精製したＤＮＡフラグメントを平滑末端化・リン酸化したのち、ＨｉｎｃＩＩ 処理後に脱リン酸化してあるｐＵＣ１１８にライゲーションした。平滑末端クローニングにはＭｉｇｈｔｙ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ Ｂｌｕｎｔ Ｅｎｄ (タカラバイオ)を用いた。このプラスミドを大腸菌ＤＨ５αに導入後、５０μｇ／ｍＬの濃度のアンピシリンを含むＬＢ培地にて一晩培養したのち、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｍｉｎｉ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ （ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドを精製した。プラスミドにインサートが導入されているかを制限酵素処理およびＰＣＲ法にて確認した。インサートが導入されていたプラスミドについてはインサートのＤＮＡシーケンス解析を行った。その結果、新規プロテアーゼ１遺伝子の増幅産物では配列番号１に、新規プロテアーゼ２遺伝子の増幅産物では配列番号３に、新規プロテアーゼ３遺伝子の増幅産物では配列番号５に、そして新規プロテアーゼ４遺伝子の増幅産物では配列番号７に示す配列をそれぞれ得ることができた。
【００４７】
上記の各配列番号のｃＤＮＡの塩基配列についてアスペルギルス・ソーヤのゲノム上の対応する配列と比較することで、ゲノム上に存在する対象遺伝子のエクソン‐イントロン構造を調べた（図２）。その結果、新規プロテアーゼ１遺伝子には２個の、新規プロテアーゼ２遺伝子には４個の、そして新規プロテアーゼ４遺伝子では２個のイントロンが存在することが分かった。また、新規プロテアーゼ３遺伝子についてはイントロンを有していない遺伝子であることがわかった。
【００４８】
[ＢＬＡＳＴプログラムを用いた相同性検索]
上記の各配列番号に示す配列についてＢＬＡＳＴプログラムを用いてｎｒデータベースに対する相同性を調べたところ、７０％以上の同一性を示す配列は見出されなかった。また、配列番号１，３，５，及び７に示した塩基配列より推定されたアミノ酸配列を配列番号２，４，６，及び８に記した。これらアミノ酸配列についても塩基配列と同様にＢＬＡＳＴプログラムを用いてｎｔデータベースに対する相同性を調べたところ、７０％以上の同一性を示す配列は見出されなかった。以上のことから、本発明により見出された４種の遺伝子とその産物は、いずれも新規のものであることが確認された。
【００４９】
[Ｐｆａｍ Ｓｃａｎを用いた各遺伝子産物のモチーフ解析]
各対象遺伝子の予測遺伝子産物のアミノ酸配列を、タンパク質モチーフデータベースの検索方法のひとつであるＰｆａｍ Ｓｃａｎ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．；Ｄａｔａｂａｓｅ Ｉｓｓｕｅ ３６，Ｄ２８１，２００８）により解析し、対象とする遺伝子産物が有しているモチーフを調べた。その結果、新規プロテアーゼ１遺伝子および新規プロテアーゼ２遺伝子の産物は酸性プロテアーゼのモチーフを有していた。また、新規プロテアーゼ３遺伝子産物はファミリーＳ１５のセリンプロテアーゼが含まれるα・β−スーパーファミリーのモチーフを有しおり、新規プロテアーゼ４遺伝子産物はファミリーＭ３５の金属プロテアーゼのモチーフを有していた。
【００５０】
[対象遺伝子産物のプロテアーゼ活性確認のための酵母発現系の構築]
本発明の新規プロテアーゼのタンパク質加水分解能を確認するため、対象遺伝子の酵母発現系を構築した。本発現系を用いて生産したプロテアーゼの活性を評価する場合、宿主由来のプロテアーゼが大量に存在している状態では、目的とするタンパク質の活性を評価することが困難であることが予想された。そのためには、目的タンパク質をヒスチジンタグ融合タンパク質として生産させ、アフィニティーカラムによる精製を行うことで宿主由来のプロテアーゼのバックグランドを低減できると考えられた。その際、本発明の目的タンパク質の中には、成熟時に切断されるＰｒｏ配列を有しているものがあると考えられたため、その位置を予想したうえでヒスチジンタグの付加位置を決定する必要があった。そこで、各プロテアーゼが菌体外分泌シグナルやＰｒｏ領域がどの位置に存在しているかを、相同性のあるタンパク質と比較し予想した (図３)。新規プロテアーゼ１は酵母の酸性プロテアーゼであるＹａｐｓｉｎと相同性がありＮ末端側に菌体外分泌シグナルと、Ｐｒｏ領域を有すると予想された。新規プロテアーゼ２は、酸性プロテアーゼであるＰｅｐｓｉｎおよびＹａｐｓｉｎと低い相同性があり、Ｎ末端側に菌体外分泌シグナルとＰｒｏ領域が存在すると予想された。新規プロテアーゼ３はＤｉｅｎｅｌａｃｔｏｎｅ ｈｙｄｒｏｌａｓｅと相同性があり、ファミリーＳ１５のセリンプロテアーゼとも低い相同性があった。本タンパク質には、Ｐｒｏ領域は存在せずＮ末端領域に菌体外分泌シグナルだけが存在すると予想された。また、新規プロテアーゼ４は、ファミリーＭ３５に分類される金属プロテアーゼ、デューテロライシンＣと相同性を有しており、Ｎ末端側に菌体外分泌シグナルとＰｒｏ領域を有していると予想された。以上のように、いずれのタンパク質もＮ末端領域に菌体外分泌シグナルおよびＰｒｏ領域を有していることから、Ｎ末端に精製用のヒスチジンタグを付加すると最終的にはタグが切断除去されてしまう危険性があると思われた。そのため、活性の確認に使用する発現系ではヒスチジンタグを各タンパク質のＣ-末端側に付加することができる、ｐＹＥＳ２／ＣＴベクター(インビトロジェン)を用いることにした。
【００５１】
[各プロテアーゼ遺伝子の酵母発現用ベクターｐＹＥＳ２／ＣＴへの導入]
各プロテアーゼのｃＤＮＡが導入されたプラスミドを鋳型とし、ＰＣＲ 反応を行いｃＤＮＡの両端に制限酵素認識部位を導入したＤＮＡフラグメントを増幅した。このときに、目的タンパク質の サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）内での翻訳効率を向上させるための、開始子コドンの上流側への９ 塩基のアデニンの付加も同時に行った。反応には正確性の高いＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ (タカラバイオ) を用い、液量は５０μＬで反応を行った。各ｃＤＮＡをサブクローニングしたプラスミド１ｎｇを鋳型として添加し、プライマーは終濃度がそれぞれ１．０μＭになるよう反応系に添加した。オリゴヌクレオチドプライマーの組み合わせは、新規プロテアーゼ１遺伝子の増幅時は配列番号１７と１８を、新規プロテアーゼ２遺伝子の増幅時は配列番号１９と２０を、新規プロテアーゼ３遺伝子の増幅時には配列番号２１と２２を、そして新規プロテアーゼ４増幅時は配列番号２３と２４をそれぞれ用い、反応を行った。得られたＤＮＡフラグメントを、Ｇｅｎｅ Ｃｌｅａｎ ＩＩ Ｋｉｔ（Ｑ・バイオジーン） を用いてゲル抽出し、各ＤＮＡフラグメント末端の制限酵素認識部位に対応する酵素にて消化した。これを、各フラグメントの制限酵素サイトに対応するように処理したｐＹＥＳ２／ＣＴベクター (インビトロジェン) にライゲーションした。これらのプラスミドを、実施例１に記したｃＤＮＡクローニングの時と同じ方法にて大腸菌への導入し、プラスミドの抽出と選抜を行なった。インサートが導入されていたプラスミドについてはＤＮＡシーケンス解析を行い、ベクター中にインサートが正しく導入されているかを確認した。ベクターに正しくインサートが導入されていた酵母発現用プラスミドをそれぞれ、ｐＡＳＡ１−１、ｐＡＳＡ１−２、ｐＡＳＡＢＨ−１、およびｐＡＳＭ３５−１と名づけた。
【００５２】
【表２】
【００５３】
[発現用ベクターの酵母ＩＮＶＳｃ１株への導入]
ｐＹＥＳ２／ＣＴにアスペルギルス・ソーヤのプロテアーゼ遺伝子を組み込んだ発現用ベクターとｐＹＥＳ２／ＣＴ(ネガティブコントロール)を、ウラシル要求性株であるサッカロミセス・セレビシエ ＩＮＶＳｃ１株（インビトロジェン）に導入した。形質転換用試薬にはインビトロジェン社のＳ．ｃ． ＥａｓｙＣｏｍｐＴＭ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いた。形質転換体の選抜にはウラシルを含まないＳＣ （ＳＣ Ｕｒａ−）寒天培地を用いた。
【００５４】
[新規プロテアーゼ１、新規プロテアーゼ２、および新規プロテアーゼ３の酵母での発現とプロテアーゼ活性の確認]
３種の遺伝子の発現用ベクターおよびｐＹＥＳ２／ＣＴを導入したサッカロミセス・セレビシエの形質転換体をＳＣ Ｕｒａ−の寒天培地に植え、３０℃で３日間培養しシングルコロニーを分離した。このシングルコロニーを、坂口フラスコに入った１２０ ｍＬの２％ガラクトースと１%ラフィノースを含むＳＣ Ｕｒａ−に植え、３０℃にて３０時間、１３０ ｒｐｍで振とう培養した。培養終了後、培養液を２，０００ × ｇで１５分間遠心分離し菌体を回収した。得られた菌体１．２ｇあたりに４ｍＬの５％グリセロールを含む５０ ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液 （ｐＨ ７．４） を加え懸濁させたのち、２ ｍＬのスクリューキャップ付きポリプロピレンチューブに８００μＬずつ分注した。ここに懸濁液と等量のガラスビーズ（直径０．５ｍｍ）を加えたのち、マルチビーズショッカー（安井機器）により菌体を破砕した。菌体破砕後、１０，０００ × ｇで１５分間遠心分離を行い菌体の残渣を沈殿として除去し、菌体破砕液を得た。本破砕液４ｍＬ に４ ｍＬの１．０ Ｍ ＮａＣｌと４０ ｍＭイミダゾールを含む２００ ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液 （ｐＨ ７．４）を加え穏やかに混合したのち、０．２μｍの滅菌用フィルターによりろ過した。このろ液を、あらかじめ２０ｍＭイミダゾールと５００ ｍＭ ＮａＣｌを含む１００ ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液 （ｐＨ ７．４）にて平衡化した、１．０ ｍＬのＨｉｓ−Ｔｒａｐ ＨＰカラム （ＧＥヘルスケア） にアプライしたのち、カラムを２０ｍＭイミダゾールと５００ ｍＭ ＮａＣｌを含む１００ ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液 （ｐＨ ７．４） ２０ ｍＬにて洗浄した。洗浄完了後、５００ｍＭイミダゾールと５００ ｍＭ ＮａＣｌを含む１００ ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液 （ｐＨ ７．４） をカラムに流すことによりカラムに結合しているヒスチジンタグ融合タンパク質を溶出させた。このとき、１．０ ｍＬずつ１０本の溶出画分を回収した。なお本カラム操作では流速は常に１．０ ｍＬ／ｍｉｎに保ち実験を行った。溶出完了後、溶出タンパク質が含まれている溶出フラクションを１つにまとめ、ミリポア社のＭｉｃｒｏｃｏｎ ＹＭ−３０ （分画分子量 ３０，０００） を用い約１００μLまで濃縮した。ここに、４００μＬの２０ ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液 （ｐＨ７．４） を加えたのち、再度Ｍｉｃｒｏｃｏｎ ＹＭ−３０ を用いて約１００ μＬまで濃縮した。この濃縮液を回収後、各検体の液量を２０ ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液 （ｐＨ７．４）により正確に２００μＬにあわせた。この溶液を次のプロテアーゼ活性の確認に使用した。
【００５５】
[酸性プロテアーゼ活性の確認]
プロテアーゼ活性測定用の酸変性ヘモグロビン (シグマアルドリッチ)を、終濃度が２％となるように超純水に溶解した。この２％ヘモグロビン溶液１０００μＬに、１２５０μＬの１００ ｍＭのグリシン塩酸緩衝液 （ｐＨ ３．０）と１５０ μＬの 超純水を小試験管に加えボルテックスミキサーにより混合した。ここに、１００ ｍＭ グリシン塩酸緩衝液 （ｐＨ ３．０） により５倍希釈した濃縮・脱塩済みのＨｉｓ−Ｔｒａｐ ＨＰカラム溶出液を１００ μＬ加えて混合し、パラフィルムにより小試験管の口を閉じたのち、３０℃にて７２時間インキュベートした。反応終了後、２．５ ｍＬの４００ ｍＭ トリクロロ酢酸を加えて混合し、３０分間室温で静置した。この酸変性溶液を、ＡＤＶＡＮＴＥＣ ５Ｃのろ紙によりろ過したのち、ろ液１．０ ｍＬを別の小試験管に分取した。ここに４．０ ｍＬの４００ ｍＭ炭酸ナトリウムと１．０ ｍＬの２倍希釈したフォーリン―チオカルト試薬(＝フェノール試薬、超純水により希釈)を加え、室温で３０分以上静置したのち、６６０ｎｍにおける吸光度を測定することで各検体の酸性プロテアーゼ活性を求めた。
【００５６】
各検体の酸性プロテアーゼ活性の測定結果を図４に示した。新規プロテアーゼ１遺伝子を発現させた系ではインサートの無いベクターを導入したネガティブコントロールと比較し６．５倍、倍高い酸性プロテアーゼ活性が見られた。また、新規プロテアーゼ２遺伝子および新規プロテアーゼ３遺伝子を発現させた系においてもコントロールと比較し、１．７倍および２．５倍高い活性が見られた。以上の通り、いずれの検体のアフィニティークロマトグラフィー精製画分においても、ネガティブコントロールと比較し高い酸性プロテアーゼ活性を有していることがわかった。このことから、新規プロテアーゼ１、新規プロテアーゼ２、および新規プロテアーゼ３は、活性の強さには差があるが、いずれも酸性プロテアーゼ活性を有するタンパク質であることが確認された。
【００５７】
[酸性カルボキシペプチダーゼ活性の確認]
酸性カルボキシペプチダーゼ活性の測定には、キッコーマン（株）製の酸性カルボキシペプチダーゼ活性キットを利用した。濃縮・脱塩済みのＨｉｓ−Ｔｒａｐ ＨＰカラムの溶出液を１００ ｍＭ グリシン塩酸緩衝液 （ｐＨ ３．０） にて８倍に希釈した。この希釈液４０μＬを４００μＬの基質溶液に加え、４０℃で１４時間インキュベートした。反応液に８００μＬの反応停止液を添加することにより酵素反応を停止し、３７℃で５分間インキュベートしたのち、４０μLの定量用酵素液を加えさらに２０分間３７℃でインキュベートした。インキュベート終了後、４０μLの定量発色液を添加してさらに３７℃で１０分間インキュベートし、４６０ｎｍにおける吸光度を測定することで各検体の酸性カルボキシペプチダーゼ活性を求めた。
【００５８】
[酸性カルボキシペプチダーゼ活性測定結果]
新規プロテアーゼ３の酸性カルボキシペプチダーゼ活性測定結果を図５に示した。新規プロテアーゼ３遺伝子を発現させた系では、コントロールと比較して２.２倍高い活性を示すことがわかった。本結果は、上記遺伝子の産物がタンパク質をＣ末端側から加水分解する、カルボキシペプチダーゼ活性を有するタンパク質であることを示唆するものである。
【００５９】
[新規プロテアーゼ４の酵母での発現とプロテアーゼ活性の確認]
新規プロテアーゼ４発現用ベクターおよびｐＹＥＳ２／ＣＴを導入したサッカロミセス・セレビシエの形質転換体をＳＣ Ｕｒａ−の寒天培地に植え、３０℃で４日間培養しシングルコロニーを分離した。このシングルコロニーを、２０ ｍＬの２%ラフィノースを炭素源としたＳＣ Ｕｒａ−液体培地３本に植え、２５℃にて４８時間、１８０ ｒｐｍで振とう培養した。この培養液を、坂口フラスコに入った１００ｍＬの２００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を含み２％ガラクトースと１％ラフィノースを炭素源としたＳＣ Ｕｒａ-液体培地３本に１０ ｍＬずつ加え、３０℃、１３０ｒｐｍで４０時間振とう培養した。培養終了後、培養液を２，０００ × ｇで１５分間遠心分離し菌体を回収した。得られた菌体を１ｇあたり１．２ｍＬの５％グリセロールを含む５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液 （ｐＨ ７．４、検体・コントロールともに約 ６ mL） に懸濁させたのち、２ ｍＬのスクリューキャップ付きポリプロピレンチューブに８００μＬずつ分注した。ここに懸濁液と等量のガラスビーズ（直径０．５ｍｍ）を加えたのち、マルチビーズショッカー（安井機器）により菌体を破砕した。菌体破砕後、２０，０００ × ｇで３０分間遠心分離を行ったのち、上澄みを０．２μｍのフィルターに通し固形物を除去した。この破砕液４ mＬを、５．０ ｍＬのＨｉｓ−Ｔｒａｐ ＨＰカラム （ＧＥヘルスケア） にアプライしたのち、カラムを２０ｍＭイミダゾールと５００ ｍＭ ＮａＣｌを含む１００ ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液 （ｐＨ ７．４） ８０ ｍＬにて洗浄した。洗浄完了後、５００ｍＭイミダゾールと５００ ｍＭ ＮａＣｌを含む１００ ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液 （ｐＨ ７．４）を２５mLカラムに流すことにより、カラムに結合しているしているタンパク質を溶出させた。なお本カラム操作では流速は常に４．０ ｍＬ／ｍｉｎに保ち実験を行った。得られた２５ｍＬの溶出液を、等量の１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液 (ｐＨ ７．０)により２倍希釈したのち、ＰＩＡＣＥ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｒ を用いて１５００ μＬまで濃縮した。ここに１３．５ ｍＬの１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液 (ｐＨ ７．０)を加えたのち、再度ＰＩＡＣＥ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｒ を用いて１５００ μＬまで濃縮した。本操作を２回繰り返したのち、ＰＩＡＣＥ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｒにより検体を１２００μＬ程度まで濃縮したのち、１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）にて、１４００μＬに正確に定容した。この検体を次の酸性プロテアーゼ活性の確認に用いた。
【００６０】
[新規プロテアーゼ４の酸性プロテアーゼ活性の確認]
プロテアーゼ活性測定用の酸変性ヘモグロビン (シグマアルドリッチ)を、終濃度が２％となるように２００ ｍＭのグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ ３．０）に溶解した。この２％ヘモグロビン溶液８００μＬに、１０００μＬの２００ ｍＭのグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ ３．０）と１００ μＬの２５ ｍＭ 硫酸亜鉛溶液を小試験管に加えボルテックスミキサーにより混合した。ここに、濃縮・脱塩済みのＨｉｓ−Ｔｒａｐ ＨＰカラム溶出液を１００ μＬ加えて混合し、パラフィルムにより小試験管の口を閉じたのち、４０℃にて４０時間インキュベートした。反応終了後、２．０ ｍＬの４００ ｍＭ トリクロロ酢酸を加えて混合し、１０分間室温で静置した。この酸変性溶液を、ＡＤＶＡＮＴＥＣ ５Ｃのろ紙によりろ過したのち、ろ液１．０ ｍＬを別の小試験管に分取した。ここに４．０ ｍＬの４００ ｍＭ炭酸ナトリウムと１．０ ｍＬの２倍希釈したフォーリン―チオカルト試薬(＝フェノール試薬、超純水により希釈)を加え、室温で３０分以上静置したのち、６６０ｎｍにおける吸光度を測定することで各検体の酸性プロテアーゼ活性を求めた。
【００６１】
新規プロテアーゼ４遺伝子産物のアフィニティークロマトグラフィー精製画分の酸性プロテアーゼ活性の測定結果を図６に示した。新規プロテアーゼ４遺伝子産物の精製画分はネガティブコントロールと比べ約２．３倍高い酸性プロテアーゼ活性を有していた。
【実施例２】
【００６２】
新規プロテアーゼ遺伝子群のアスペルギルス・ソーヤでの強制発現株作製
麹菌のプロテアーゼ生産能増強を目的とし、配列番号１，３，５および７に示す新規プロテアーゼ遺伝子群を麹菌にて強制発現させた菌株を作製した。新規プロテアーゼ遺伝子のプロモーター部分とその構造遺伝子の間にマーカー遺伝子であるｐｙｒＧとｔｅｆ１プロモーターを挿入し、新規プロテアーゼ遺伝子がｔｅｆ１プロモーターの支配下となり、構成的に発現するようにした。強制発現株の作製方法は下記の通りである。
【００６３】
［アスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株のゲノムＤＮＡの調製］
ベクター作製時のＦｕｓｉｏｎ ＰＣＲの鋳型ＤＮＡとして使用するために、下記の方法により麹菌アスペルギルス・ソーヤのゲノムＤＮＡを抽出・精製した。本菌株を、１５０ｍｌ容の三角フラスコに入った４０ｍｌのデキストリン−ペプトン培地に植え、３０℃、１５０ｒｐｍで３日間培養した。培養終了後、ろ過により菌体を回収し、ペーパータオルで挟み、水分を除いた後、液体窒素を用いて急速に凍結させた。次に、液体窒素を注いで冷却してある乳鉢に凍結した菌体を入れ、液体窒素で冷却してある乳棒を用いて念入りに粉砕した。この粉砕から、Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（プロメガ社製）を用いて全ＤＮＡを抽出したのち、ＤＮａｓｅ ｆｒｅｅ のＲＮａｓｅ Ｉ（ニッポンジーン社製）にて検体を処理し、混入していたＲＮＡを分解し以降の実験に用いた。
［Ｆｕｓｉｏｎ ＰＣＲによる強制発現用ベクターの作製と形質転換］
【００６４】
強制発現系の概要を図７に示した。まず、相同組換え用の左右のアーム部分（フラグメントＬ及びＲ）、ｔｅｆ１プロモーター及び形質転換時のマーカー遺伝子であるｐｙｒＧ遺伝子（フラグメントＰ）のＤＮＡフラグメントをＰＣＲ法により増幅した。ＰＣＲには、ＫＯＤ ＦＸ（東洋紡績社製）を使用し、オリゴヌクレオチドプライマーは配列を表３に記したものを使用した。また、各フラグメントを増幅した際のプライマーの組合せを表４に記した。ＰＣＲ反応の鋳型には１５０ｎｇのアスペルギルス・ソーヤ ＮＢＲＣ４２３９株のゲノムＤＮＡを使用し、反応系は全量５０μｌで実施した。ＰＣＲ反応は、９４℃、２分の後、９４℃１０秒、６８℃５分を３０サイクル行った。得られたＤＮＡフラグメントはアガロースゲル電気泳動にて確認したのち、各ＤＮＡフラグメントをＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉt （キアゲン社製）を用いて精製した。
【００６５】
【表３】
【００６６】
【表４】
【００６７】
精製したＬフラグメント１．１μｌ、Ｒフラグメント１．１μｌ、ｔｅｆ１プロモーター３．４μｌ、及びｐｙｒＧマーカーのフラグメント３．４μｌを混合しフュージョンＰＣＲ用の鋳型とした。次に、フュージョンＰＣＲにより４つのフラグメントを結合させた。ＰＣＲにはＫＯＤ Ｆｘ（東洋紡績社製）を使用した。ＰＣＲ用のプライマーの配列および組合せは表５および表６に示した通りである。ＰＣＲ反応の鋳型には、前述の９μｌのＬ、Ｒ、ｔｅｆ１及びＰの混合液を用い、反応系は全量４００μｌで実施した。ＰＣＲ反応は、９４℃２分の後、９８℃１０秒、６８℃９分の２ステップサイクルを４０サイクル行った。増幅産物の一部を０．８％アガロースゲルにより電気泳動し、強制発現用のベクターカセットが増幅されていることを確認した。確認終了後、残っている反応液全量を０．８％アガロースゲルにより電気泳動し、ゲル抽出によりＤＮＡフラグメントを精製した後、アルコール沈殿によりＤＮＡフラグメントを濃縮した。これを新規プロテアーゼ強制発現用ベクターとした。本ベクターを、アスペルギルス・ソーヤのｐｙｒＧマーカーおよびｋｕ７０遺伝子破壊株であるＡｓＸｋｕ７０：：ｐｔｒＡ株（Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２７５：４６０，２００６）に常法であるプロトプラスト−ＰＥＧ法（Ｇｅｎｅ，６１，３８５，１９８７）を用いて導入した。形質転換体の選抜は、ウリジンを含まず１．２Ｍソルビトールを含むＣｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ最少培地（３．０％ ｇｌｕｃｏｓｅ，０．０５％ ＫＣｌ，０．２ ％ ＮａＮＯ３，０．１％ ＫＨ２ＰＯ４，０．０５％ ＭｇＳＯ４，０．００１％ ＦｅＳＯ４，ｐＨ ６．０）を利用したｐｙｒＧポジティブセレクションを実施し形質転換体を得た。
【００６８】
【表５】
【００６９】
【表６】
【００７０】
［形質転換体のＰＣＲによる確認］
作製した形質転換体にベクターが正しく導入されているかを、ＰＣＲ法により確認した。始めに、強制発現株および宿主株より、実施例２に前述の方法を用いてゲノムＤＮＡを調製した。このゲノムＤＮＡを鋳型とし、表６に記した組合せのオリゴヌクレオチドプライマーを使用しＰＣＲを行った。ＰＣＲ用の酵素には、ＫＯＤ ＦＸ（東洋紡績株式会社製）を用いた。ＰＣＲ反応は、９４℃２分の後、９４℃１０秒、６８℃９分３０秒の２ステップサイクルを４０サイクル行った（図８）。いずれの新規プロテアーゼ遺伝子強制発現株においても、強制発現株の作製に使用した宿主株であるＡｓＸｋｕ：：ｐｔｒＡ由来のゲノムＤＮＡを鋳型とした時と比較して、ｐｙｒＧマーカーおよびｔｅｆ１プロモーターが導入された分、約３ｋｂ大きいサイズのＰＣＲ産物がメインバンドとして確認された。また、これらの形質転換体ではＡｓＸｋｕ：：ｐｔｒ８株で観測されたバンドと同じサイズのＰＣＲ産物は確認されなかった。以上のことから、これら形質転換体には正しくベクターが導入されており、核も純化されていることがわかった。
【００７１】
［宿主ｐｙｒＧ復元株ＡｓｋｕＰＢ０２Ｂ株の作製］
本実施例において作製した強制発現株は、ｐｙｒＧポジティブセレクションにより取得したものであるため、全てｐｙｒＧ＋株となっている。そのため、強制発現株のプロテアーゼ生産能を評価するに当たり、ｐｙｒＧ欠失株であるＡｓＸｋｕ７０：：ｐｔｒ８株（宿主株）をコントロールとして用いることは適切ではないと考えられる。そのため、宿主株のｐｙｒＧ遺伝子を復元したＡｓｋｕＰＧ０２Ｂ株を作製し、新規プロテアーゼ遺伝子強制発現株を評価する際のコントロールとして使用することとした。その作製方法は下記の通りである。
【００７２】
配列番号５９および配列番号６０に記したオリゴヌクレオチドプライマーを用い、野生株のｐｙｒＧ遺伝子の構造遺伝子、プロモーターおよびターミネーターを含む約６．６ｋｂのＤＮＡフラグメントをＰＣＲにより増幅した。
【００７３】
【表７】
【００７４】
ＰＣＲ用酵素にはＫＯＤ ＦＸ（東洋紡績社製）を使用し、鋳型ＤＮＡには１５０ｎｇのアスペルギルス・ソーヤ ＮＢＲＣ４２３９株由来ゲノムＤＮＡを用いた。反応系は全量４００μｌで実施した。ＰＣＲ反応は、９４℃２分の後、９８℃１０秒、６８℃９分の２ステップサイクルを３０サイクル行った。増幅産物の一部を０．８％アガロースゲルにて電気泳動を行い、約６．６ｋｂのＤＮＡフラグメントが増幅されていることを確認した。ＰＣＲ反応による増幅の確認後、残っている反応液全量を０．８％アガロースゲルにより電気泳動し、ゲル抽出によりＤＮＡフラグメントを精製した後、アルコール沈殿によりＤＮＡフラグメントを濃縮した。これをｐｙｒＧ復元用ベクターとした。本ベクターを、前述のＡｓＸｋｕ７０：：ｐｔｒＡ（宿主株）に常法であるプロトプラスト−ＰＥＧ法（Ｇｅｎｅ，６１：３８５，１９８７）を用いて導入した。形質転換体の選抜は、ウリジンを含まず１．２Ｍソルビトールを含むＣｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ最少培地を利用したｐｙｒＧポジティブセレクションを実施し、ＡｓｋｕＰＧ０２Ｂ株を得た。
【００７５】
［ＡｓｋｕＰＧ０２Ｂ株のＰＣＲ法による確認］
前記の方法により調製した形質転換体のゲノムＤＮＡ約１５０ｎｇを鋳型とし、配列番号５９及び６０のオリゴヌクレオチドプライマーを用いＰＣＲを行い、形質転換体中のｐｙｒＧ遺伝子が復元されているかを調べた。対象として、ＡｓＸｋｕ７０：：ｐｔｒＡ株およびアスペルギルス・ソーヤ ＮＢＲＣ４２３９株のゲノムＤＮＡを鋳型とした反応系を用いた。ＰＲＣ用の酵素にはＫＯＤ ＦＸ（東洋紡績株式会社製）を使用し、反応液の全量は２０μＬとした。ＰＣＲ反応は、９４℃２分の後、９４℃１０秒、６８℃９分のシャトルサイクルを３５サイクル行った。その結果を図１０に示した。いずれの検体もシングルバンドが検出された。また、形質転換体ではＡｓｋｕ７０：：ｐｔｒＡ株よりも大きいサイズのバンドが確認され、そのサイズはＰＣＲの鋳型として使用したアスペルギルス・ソーヤ ＮＢＲＣ４２３９株と同じであった。このことから、形質転換体中のｐｙｒＧ遺伝子は復元されており、さらに核も純化されていることが確認された。
【００７６】
［新規プロテアーゼ遺伝子強制発現株のサザンハイブリダイゼーションによる確認］
新規プロテアーゼ遺伝子強制発現株をサザンハイブリダイゼーションにより確認した。形質転換体およびＡｓＸｋｕ：：ｐｔｒＡ株のゲノムＤＮＡ約５．０μｇを制限酵素により３７℃で一晩消化を行った後、０．８％アガロースゲルにより電気泳動を行った。制限酵素としては、新規プロテアーゼ１遺伝子強制発現株の確認ではＸｂａＩを、新規プロテアーゼ２遺伝子強制発現株ではＢｇｌＩＩを新規プロテアーゼ３遺伝子強制発現株の確認ではＥｃｏＲＩを、新規プロテアーゼ４遺伝子強制発現株の確認ではＳｓｐＩを使用した。泳動した核酸を、ポジティブ電荷を持つナイロン膜であるハイボンドＮ＋（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）にブロットした後、ジコキシゲニン（ＤＩＧ）−ラベルを行ったプローブを用い、フォルムアミドを含まないハイブリダイゼーションバッファーにて６８℃で一晩ハイブリダイゼーションを行った。ＤＩＧ−ラベルプローブの作製には、ＤＩＧ ＰＣＲ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ(ロシュダイアグノスティクス社製)を使用し、ＰＣＲ用の酵素にはＥｘＴａｑ（タカラバイオ社製）を、鋳型には１５０ｎｇのアスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株のゲノムＤＮＡを用いた。ＰＣＲ用プライマーはに示すオリゴヌクレオチドプライマーを使用し、反応系は全量２５μＬで実施した。オリゴヌクレオチドプライマーは、表８に示したものを使用した。また、新規プロテアーゼ２および３遺伝子強制発現株確認用のプローブを増幅させる際には、反応系に対し終濃度が５．０％になるようにジメチルスルフォキシドを添加した。
新規プロテアーゼ遺伝子強制発現株のサザンハイブリダイゼーションの結果を図９に記した。いずれの新規プロテアーゼ遺伝子強制発現株においても、ＡｓＸｋｕ：：ｐｔｒ８では検出されない高分子量側に存在するバンドが確認され、そのサイズは強制発現用カセットがゲノム中に正しく導入されている場合の理論値と等しいものであった。以上の結果より、新規プロテアーゼ遺伝子強制発現用カセットは、ＡｓＸｋｕ：：ｐｔｒ８株の目的とする領域に挿入されていると判断した。
【００７７】
【表８】
【実施例３】
【００７８】
［新規プロテアーゼ遺伝子を強制発現させたアスペルギルス・ソーヤのプロテアーゼ生産能の評価］
新規プロテアーゼ遺伝子の強制発現により麹菌アスペルギルス・ソーヤのプロテアーゼ生産能が増強されているかを下記の方法を用いて評価した。
【００７９】
［新規プロテアーゼ遺伝子強制発現株のしょうゆ麹培養と粗酵素溶液の調製］
脱脂大豆１０ｇに焙煎割砕小麦１０ｇと１４ｍＬの水を加えよく混合した。これを、７ｇずつ１５０ｍＬ容の三角フラスコに分取し、綿栓をしたのち１２１℃で３０分間オートクレーブにより滅菌し、しょうゆ麹を作製した。ここに、各形質転換体もしくはＡｓｋｕＰＧ０２Ｂ株（コントロール株）の分生子を１０,０００,０００個ずつ接種し３０℃にて４０時間（新規プロテアーゼ１および３）もしくは７２時間培養（新規プロテアーゼ２および４）した。培養終了後、２０ｍＬの２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液 pH7.5)を加え激しく撹拌したのち、懸濁液を４℃にて一晩静置し菌体外酵素を抽出した。この懸濁液をろ紙（Ｎｏ．２、ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製）にてろ過したのち、ろ液を１０，０００×ｇで２０分間、４℃にて遠心分離し固形物を除去した。本サンプルを粗酵素溶液とし以降の酵素活性測定に用いた。
【００８０】
［酸性プロテアーゼ活性測定法］
プロテアーゼ活性測定用の酸変性ヘモグロビン (シグマアルドリッチ)を、終濃度が２％となるように２０ｍＭグリシン-塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）に溶解させた。この２％ヘモグロビン溶液１０００μＬに、８５０μＬの緩衝液を小試験管に加えボルテックスミキサーにより混合した。ここに、１０ ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液 （ｐＨ ７．５） により２０倍希釈した粗酵素溶液を１５０ μＬ加えて混合し、４０℃にて３０分間インキュベートした。反応終了後、２．０ ｍＬの４００ ｍＭ トリクロロ酢酸を加えて混合し、１０分間室温で静置した。この酸変性溶液を、ＡＤＶＡＮＴＥＣ ５Ｃのろ紙によりろ過したのち、ろ液０．５ ｍＬを別の小試験管に分取した。ここに２．０ ｍＬの４００ ｍＭ炭酸ナトリウムと０．５ ｍＬの２倍希釈したフォーリン―チオカルト試薬(＝フェノール試薬、超純水により希釈)を加え、室温で３０分静置したのち、６６０ｎｍにおける吸光度を測定することで各検体の酸性プロテアーゼ活性を求めた。なお本実験は、コントロールならびに形質転換体ともに培養から独立した３連で実施した。また、図中のエラーバーは標準誤差を示した。
【００８１】
［中性プロテアーゼ活性測定法］
ミルクカゼインを終濃度が２％となるように２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ７．５）に溶解させた。この２％ミルクカゼイン溶液１０００μＬに、８５０μＬの２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液を小試験管に加えボルテックスミキサーにより混合した。ここに、１０ ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液 （ｐＨ ７．５） により１０倍希釈した粗酵素溶液を１５０ μＬ加えて混合し、４０℃にて３０分間インキュベートした。反応終了後、２．０ ｍＬの４００ ｍＭ トリクロロ酢酸を加えて混合し、１０分間室温で静置した。この酸変性溶液を、ＡＤＶＡＮＴＥＣ ５Ｃのろ紙によりろ過したのち、ろ液０．５ ｍＬを別の小試験管に分取した。ここに２．０ ｍＬの４００ ｍＭ炭酸ナトリウムと０．５ ｍＬの２倍希釈したフォーリン―チオカルト試薬(＝フェノール試薬、超純水により希釈)を加え、室温で３０分静置したのち、６６０ｎｍにおける吸光度を測定することで各検体の中性プロテアーゼ活性を求めた。なお本実験は、コントロールならびに形質転換体ともに培養から独立した３連で実施した。また、図中のエラーバーは標準誤差を示した。
【００８２】
［新規プロテアーゼ遺伝子強制発現株をしょうゆ麹にて培養したときのプロテアーゼ活性の評価結果］
新規プロテアーゼ１遺伝子を強制発現させた系では、コントロールであるＡｓｋｕＰＢ０２Ｂ株を用いた系と比較し、中性プロテアーゼ活性は１３．４％、酸性プロテアーゼ活性は１４．４％と顕著に上昇していた（図１１）。新規プロテアーゼ２遺伝子を強制発現させた系では、コントロール株と比較し酸性プロテアーゼ活性については有意な変化は見られなかったが、中性プロテアーゼ活性が８．４％上昇した（図１２）。また、新規プロテアーゼ３遺伝子を強制発現させた系では、中性プロテアーゼ活性は４．１％の上昇であったが、酸性プロテアーゼ活性については１３．９％の上昇が見られた（図１３）。また、新規プロテアーゼ遺伝子４を強制発現させた系では、中性プロテアーゼ活性については変化が見られなかったが、酸性プロテアーゼ活性が１３．２％上昇した（図１４）。以上結果より、新規プロテアーゼ遺伝子を強制発現させた場合、効果が見られるプロテアーゼの種類は対象遺伝子ごとに異なっているが、いずれの新規プロテアーゼ遺伝子についても麹菌アスペルギルス・ソーヤのプロテアーゼ生産能を増強させる働きがあることが確認された。なかでも酸性プロテアーゼをコードする新規プロテアーゼ１遺伝子の強制発現は、麹菌の酸性プロテアーゼ生産能だけでなく中性プロテアーゼ生産能も向上させることができるという有用な働きがある。
【実施例４】
【００８３】
［新規プロテアーゼ遺伝子強制発現株の大豆タンパク質分解活性の評価］
［新規プロテアーゼ遺伝子強制発現株のしょうゆ麹での培養と粗酵素抽出液の調製］
脱脂大豆１０ｇに焙煎割砕小麦１０ｇと１４ｍＬの水を加えよく混合した。これを、７ｇずつ１５０ｍＬ容の三角フラスコに分取し、綿栓をしたのち１２１℃で３０分間オートクレーブにより滅菌し、しょうゆ麹を作製した。ここに、各形質転換体もしくはＡｓｋｕＰＧ０２Ｂ株（コントロール株）の分生子を１０,０００,０００個ずつ接種し３０℃にて７２時間培養した。培養終了後、２０ｍＬの２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液 （ｐＨ７．５)を加え激しく撹拌したのち、懸濁液を４℃にて一晩静置し菌体外酵素を抽出した。この懸濁液をろ紙（Ｎｏ２、ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製）にてろ過したのち、ろ液を１０，０００×ｇで２０分間、４℃にて遠心分離し固形物を除去した。次にこの抽出液１２０μＬを、２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）により平衡化したＰＤ ＳｐｉｎＴｒａｐ Ｇ-２５（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）により処理することにより、抽出液に含まれるアミノ酸等を除去した。
【００８４】
［大豆タンパク質分解反応］
２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に大豆タンパク質を終濃度が１．０％となるように溶解したのち、オートクレーブにより滅菌した。本大豆タンパク質溶液２００μＬに２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）を用いて１０倍希釈した希釈したＰＤ ＳｐｉｎＴｒａｐ Ｇ−２５溶出液を、１００μＬ加えた。これを３０℃、１５０ｒｐｍにて２０時間反応させたのち、１２，０００ｘｇにて２０分間遠心分離することで、未反応の大豆タンパク質を沈殿させた。遠心分離後の上清２０μＬを９８０μＬの２００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）により希釈した。これにニンヒドリン試薬−Ｌ８５００セット（和光純薬工業株式会社製）のニンヒドリン試薬と緩衝液を１：１で混合したものを１ｍＬ加え、１００℃にて１５分間加温し発色させたのち、反応液を１５分間水冷した。この発色液を１００μＬ分取後、２，９００μＬの２００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）を加えたのち、５７０nmにおける吸光度を測定することで、反応により遊離したアミノ酸量を定量した。なお本実験は、コントロールならびに形質転換体ともに培養から独立した３連で実施した。また、図中のエラーバーは標準誤差を示した。
【００８５】
［大豆タンパク質分解活性測定結果］
大豆タンパク質分解活性測定結果を図１５に記した。新規プロテアーゼ遺伝子１および２を強制発現させた系では、コントロールであるＡｓｋｕＰＧ０２Ｂ株を用いた系と比較して、大豆タンパク質分解活性がそれぞれ１８．２％および１３．６％上昇していた。このことから、新規プロテアーゼ１および２遺伝子を強制発現させた麹菌は、原料として大豆タンパク質を利用する各種調味料の生産に有用であると考えられる。一方、新規プロテアーゼ３および４遺伝子を強制発現させた系では、ＡｓｋｕＰＧ０２Ｂ株を用いた系と比較し、大豆タンパク質分解活性の有意な上昇は見られなかった。
【実施例５】
【００８６】
［新規プロテアーゼ４遺伝子強制発現株をＣｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ最少液体培地にて培養した際の酸性プロテアーゼ活性ならびにプロタミン分解活性の評価］
【００８７】
［新規プロテアーゼ４遺伝子強制発現株およびＡｓｋｕＰＧ０２Ｂ株の培養］
各形質転換体もしくはＡｓｋｕＰＧ０２Ｂ株（コントロール株）の分生子を１０,０００,０００個ずつ３０ｍＬのＣｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ液体培地に接種し３０℃にて６日間培養した。この培養液をろ紙（Ｎｏ．２，ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製）によりろ過することにより菌体を除き、菌体外酵素が含まれる培地を回収しその酸性プロテアーゼ活性およびプロタミン分解活性を測定した。
【００８８】
［酸性プロテアーゼ活性の測定法］
酸性プロテアーゼ活性の測定方法は、酵素反応の時間を３０分間から９０分間にし、培養液を希釈せず測定したこと以外は、実施例３にて記した方法を用いて実施した。なお本実施例については、培養から独立した５連で実験を行った。また、図中のエラーバーは標準誤差を示した。
【００８９】
［プロタミン分解活性の測定法］
培養終了後、ろ過により菌体を除去した培地画分１２０μＬを、２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）により平衡化したＰＤ ＳｐｉｎＴｒａｐ Ｇ-２５（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）により処理することにより、培養液に含まれるアミノ酸等を除去した。この処理済みの溶液を２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）により１０倍希釈した。本希釈液１００μＬに４００μＬの１．２５％プロタミン溶液（サケ由来、ｐＨ７．５の２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液に溶解）を混合したのち、４０℃にて１６時間反応させた。反応液に５００μＬの２５％トリクロロ酢酸を加え反応を停止したのち、４℃にて１４，０００Ｘｇ、３０分間遠心分離することで未反応のプロタミンを沈殿させた。遠心分離後の上清２０μＬを９８０μＬの２００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）を加え５０倍希釈したのち、ニンヒドリン試液−Ｌ８５００セット（和光純薬工業株式会社製）のニンヒドリン試薬と緩衝液を１：１で混合したものを１ｍＬ加え、１００℃にて１５分間加温し発色させた。加熱終了後、反応液を１５分間水冷したたのち、２，０００μＬの２００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）を加えたうえで５７０nmの吸光度を測定することで、反応により遊離したアミノ酸量を定量した。
【００９０】
［液体培養を行った新規プロテアーゼ４遺伝子強制発現株の酸性プロテアーゼ活性評価結果］
液体培養時における新規プロテアーゼ４強制発現株の酸性プロテアーゼ活性評価結果を図１６に示した。新規プロテアーゼ４遺伝子を強制発現させた株の系の酸性プロテアーゼ活性は、コントロールであるＡｓＫｕＰＧ０２Ｂ株を使用した系と比較して、平均で４４.２％活性が上昇していた。
【００９１】
［液体培養を行った新規プロテアーゼ４遺伝子強制発現株のプロタミン分解活性評価結果］
新規プロテアーゼ４は中性プロテアーゼＩＩ（デューテロライシンＡ）と同じくファミリーＭ３５の金属プロテアーゼのモチーフを有するタンパク質である。中性プロテアーゼＩＩに関してはこれまでにいくつの解析が行われており、本タンパク質は塩基性タンパク質であるヒストンやプロタミンに対して高い活性を示すことが公知となっている（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４０，７０３−７０９，１９７６）。そこで、新規プロテアーゼ４に関しても塩基性タンパク質に対して高い活性を有するか調べるために、本酵素のプロタミン分解活性を調べた。その結果、新規プロテアーゼ４は、コントロール株と比べて約２．１倍高いプロタミン分解活性を有しいた（図１７）。このことから、新規プロテアーゼ４はプロタミンなどの各種塩基性タンパク質分解産物の調製に利用できると考えられる。
【実施例６】
【００９２】
［醤油麹にて培養した新規プロテアーゼ１および２強制発現株の小麦グルテン分解活性の評価］
脱脂大豆１０ｇに焙煎割砕小麦１０ｇと１４ｍＬの水を加えよく混合した。これを、１０ｇずつ１５０ｍＬ容の三角フラスコに分取し、綿栓をしたのち１２１℃で３０分間オートクレーブにより滅菌し、しょうゆ麹を作製した。ここに、各形質転換体もしくはＡｓｋｕＰＧ０２Ｂ株（コントロール株）の分生子を１０,０００,０００個ずつ接種し３０℃にて７２時間培養した。この三角フラスコに、小麦グルテン粉末３０ｇと５００μｇ／ｍＬの濃度でアンピシリンを含む１３％塩化ナトリウム水溶液３０ｍＬを加えたのち、４０℃、１５０ｒｐｍにて６日間分解反応を行った。分解反応終了後、分解産物を５ｇ分取し、Ｎｏ５Ａのろ紙（ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製）にてろ過し、ろ紙上の残渣を８％塩化ナトリウム溶液にて洗浄したのち、本洗浄液を８％塩化ナトリウム溶液にて１００ｍＬに定容した。この洗浄液中に含まれる可溶性窒素の量をケルダール法（生化学実験講座１、タンパク質の化学ＩＩ，日本生化学会編、ｐｐ.6）により測定した。なお実施例６については、培養から独立した２連で実施し、その平均値にて比較を行った。
【００９３】
本結果を図１８に記した。新規プロテアーゼ１を用いた系におけるグルテン分解諸味１ｇあたりに含まれる可溶性窒素の量（％Ｎ）は、コントロールであるＡｓｋｕＰＧ０２Ｂ株を用いた系と比較して、約１．３％増加していた。また、新規プロテアーゼ２遺伝子を強制発現させた株を用いた系では約１．８％増加していた。以上のことから、新規プロテアーゼ１および２遺伝子を強制発現させた麹菌は、小麦グルテンを原料として使用する各種調味料生産に有用であると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００９４】
以上のとおり、本発明の新規プロテアーゼ遺伝子はいずれも活性を有するプロテアーゼをコードしていることがわかった。このことから本発明は、麹菌によるプロテアーゼの効率的な生産や、食品加工用の酵素生産、醸造食品の生産に用いる微生物の改良にも用いることができると考えられる。なかでも、新規プロテアーゼ遺伝子１および２は強制発現株については大豆タンパク質を分解する際に、新規プロテアーゼ遺伝子４の強制発現株については塩基性の高いタンパク質を分解する際に有用であると考えられる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のタンパク質。
（ａ）配列番号２，４，６，および８で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｂ）配列番号２，４，６，および８で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、プロテアーゼ活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号２，４，６，および８で表されるアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を示すアミノ酸配列を含むタンパク質又はその部分断片であり、かつプロテアーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項２】
以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のタンパク質をコードする遺伝子。
（ａ）配列番号２，４，６，および８で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｂ）配列番号２，４，６，および８で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつプロテアーゼ活性を有するタンパク質
（ｃ） 配列番号２，４，６，および８で表されるアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を示すアミノ酸配列を含むタンパク質又はその部分断片であり、かつプロテアーゼ活性を有するタンパク質
【請求項３】
以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）のＤＮＡから成る遺伝子
（ａ） 配列番号１，３，５，および７で表される塩基配列を含むＤＮＡ
（ｂ） 配列番号１，３，５，および７で表される塩基配列又はその相補鎖を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつプロテアーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｃ） 配列番号２，４，６，および８で表されるアミノ酸配列をコードする核酸又はその相補鎖を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつプロテアーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｄ） 配列番号１，３，５，および７で表される塩基配列のＤＮＡと７０％以上の配列同一性を示し、かつプロテアーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【請求項４】
請求項２又は３に記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
【請求項５】
請求項４記載の組換えベクターを含む形質転換体。
【請求項６】
請求項５記載の形質転換体を培養し、得られる培養物からプロテアーゼを回収することを特徴とする該プロテアーゼの製造方法。
【請求項１】
以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のタンパク質。
（ａ）配列番号２，４，６，および８で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｂ）配列番号２，４，６，および８で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、プロテアーゼ活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号２，４，６，および８で表されるアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を示すアミノ酸配列を含むタンパク質又はその部分断片であり、かつプロテアーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項２】
以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のタンパク質をコードする遺伝子。
（ａ）配列番号２，４，６，および８で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｂ）配列番号２，４，６，および８で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつプロテアーゼ活性を有するタンパク質
（ｃ） 配列番号２，４，６，および８で表されるアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を示すアミノ酸配列を含むタンパク質又はその部分断片であり、かつプロテアーゼ活性を有するタンパク質
【請求項３】
以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）のＤＮＡから成る遺伝子
（ａ） 配列番号１，３，５，および７で表される塩基配列を含むＤＮＡ
（ｂ） 配列番号１，３，５，および７で表される塩基配列又はその相補鎖を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつプロテアーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｃ） 配列番号２，４，６，および８で表されるアミノ酸配列をコードする核酸又はその相補鎖を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつプロテアーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｄ） 配列番号１，３，５，および７で表される塩基配列のＤＮＡと７０％以上の配列同一性を示し、かつプロテアーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【請求項４】
請求項２又は３に記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
【請求項５】
請求項４記載の組換えベクターを含む形質転換体。
【請求項６】
請求項５記載の形質転換体を培養し、得られる培養物からプロテアーゼを回収することを特徴とする該プロテアーゼの製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【公開番号】特開２０１２−１８７１０２（Ｐ２０１２−１８７１０２Ａ）
【公開日】平成２４年１０月４日（２０１２．１０．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−３９２３０（Ｐ２０１２−３９２３０）
【出願日】平成２４年２月２４日（２０１２．２．２４）
【出願人】（０００００４４７７）キッコーマン株式会社 (212)
【出願人】（０００１７３９３５）公益財団法人野田産業科学研究所 (9)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１０月４日（２０１２．１０．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２４年２月２４日（２０１２．２．２４）
【出願人】（０００００４４７７）キッコーマン株式会社 (212)
【出願人】（０００１７３９３５）公益財団法人野田産業科学研究所 (9)
【Ｆターム（参考）】
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