新規なベクター、それを含有する医薬及び癌の治療方法
【課題】癌を治療するためのＡＤＰ（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ Ｄｅａｔｈ Ｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子をコードしたベクター又はＡＤＰ遺伝子とＧＭ−ＣＳＦ遺伝子の両者をコードしたベクターの提供。
【解決手段】ＡＤＰ遺伝子又はＡＤＰ遺伝子とＧＭ−ＣＳＦ遺伝子の両者をコードしたベクター。ＡＤＰ遺伝子又はＡＤＰ遺伝子とＧＭ−ＣＳＦ遺伝子の両者をコードしたベクターと遺伝子導入化試薬を含有する複合体。それらを含有する医薬。それらを用いる癌の治療方法。
【解決手段】ＡＤＰ遺伝子又はＡＤＰ遺伝子とＧＭ−ＣＳＦ遺伝子の両者をコードしたベクター。ＡＤＰ遺伝子又はＡＤＰ遺伝子とＧＭ−ＣＳＦ遺伝子の両者をコードしたベクターと遺伝子導入化試薬を含有する複合体。それらを含有する医薬。それらを用いる癌の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＡＤＰ（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ Ｄｅａｔｈ Ｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子をコードしたベクター又はＡＤＰ遺伝子とＧＭ−ＣＳＦ遺伝子の両者をコードしたベクター、及びこれらベクターと遺伝子導入試薬との複合体、それらを含有する医薬並びにそれらを用いる癌の治療方法に関する。
【技術背景】
【０００２】
遺伝子治療は、遺伝子に欠損や異常があることによる遺伝子疾患の患者に、正常遺伝子を与えて病気を治す、根治的な治療法として期待され、試みられてきた。正式な手続きを踏み、治療目的として行われた初めての遺伝子治療は、１９９０年に、ＡＤＡ（アデノシンデアミ ナーゼ）欠損症の患者に対して行われた。治療に必要な遺伝子をコードしたＤＮＡを目的の細胞に導入するためには、多くの場合ベクターと呼ばれる遺伝子の運びやが使用される、ベクターには現在（１）ウイルスベクターと（２）カチオン性ポリマー、あるいはカチオン性脂質などの非ウイルスベクターとがある。
【０００３】
これまで行われてきた遺伝子治療臨床試験の多くはウイルスベクターを利用したものである。（１）レトロウイルスベクター（２）アデノウイルス（Ａｄ）ベクター（３）アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターなどが使用されてきた。このうちアデノウイルスベクターは、これまでに最も多く利用されたベクターであり、４００例の臨床試験が試みられている。
アデノウイルスには５０種類以上の血清型が知られているが、ベクターとしては、アデノウイルス５型を遺伝子組み換えした非増殖型組換えアデノウイルスが、その優れた遺伝子導入特性から遺伝子治療研究において広く用いられてきた。
【０００４】
多くの非増殖型アデノウイルスベクターでは、アデノウイルスのＥ１遺伝子を取り除き、代わりにｐ５３などの治療用の遺伝子を挿入している。アデノウイルス遺伝子の発現の開始に必要なＥ１遺伝子を欠損しているため、一般の細胞内では増殖しないが、Ｅ１を発現している２９３細胞のような特殊な細胞内では増殖させることが可能である。このようにして得られる非増殖型組換えアデノウイルスは、標的細胞に効率良く感染し、治療遺伝子を発現するが、標的細胞内にはＥ１遺伝子産物がないため、増殖することなく安全性が高いと考えられる。
また、目的遺伝子を挿入するためのより大きなスペースを確保するために、培養細胞での増殖に必須ではないＥ３領域も除去したものが広く利用されてきた。
【０００５】
アデノウイルスベクターは感染性が強く、また、レトロウイルスベクターが分裂細胞にしか導入できないのに対して、非分裂細胞にも遺伝子を直接導入できる。しかし、成人のほとんどは抗アデノウイルス抗体を持つ。また、アデノウイルスベクターの発現は一過性であるため複数回の投与が必要であり、治療開始時に患者に抗アデノウイルス抗体がなくても、投与を繰り返すことで抗アデノウイルス抗体ができる。そのために感染、遺伝子導入は著しく阻害され、ｐ５３遺伝子を組み込んだアデノウイルスベクターが中国では認可され使用されているが、十分治癒効果は得られていない。
【０００６】
一方、アデノウイルスの細胞溶解活性を利用して、腫瘍細胞のみを選択的に殺す組み替えウイルスが、癌遺伝子治療の新しい手法として開発された。これらは、腫瘍溶解性ウイルス、制限増殖型ウイルスなどと呼ばれ、アデノウイルスのＥ１領域のプロモーターを腫瘍細胞でのみ選択的に発現するプロモーターで置換して得られる。腫瘍選択的プロモーターとしては、テロメラーゼプロモーター、ミドカインプロモーター、ＩＡＩ３Ｂプロモーターなどが利用されてきた。
これらの腫瘍溶解性ウイルスにおいても、Ｅ３領域は必須ではないため、当初はＥ３領域を除去したものが作成され、試された。しかし、Ｓｕｚｕｋｉら（非特許文献１）によって、Ｅ３領域を残したアデノウイルスの方が高い腫瘍細胞溶解性を示すことが明らかになった。Ｅ３領域にはＡＤＰ（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ Ｄｅａｔｈ Ｐｒｏｔｅｉｎ）がコードされている。ＡＤＰの機能はすべて解明されたわけではないが、アデノウイルスの感染後期において、細胞融解とウイルスの細胞からの放出の効率を向上させることが報告（非特許文献２）されており、この機能がＥ３領域を持つ腫瘍溶解性ウイルスの高い効率と関連すると推測されている。
【０００７】
また、Ｅ３領域を除去した後に、ＡＤＰ遺伝子のみを再挿入した腫瘍溶解性アデノウイルスは、強い腫瘍増殖抑制能力を示したとの報告（非特許文献３）もあり、ＡＤＰが重要な役割を担っていることが考えられた。
また一方で、本発明者の一人でもある濱田らは、Ｅ３領域を持つ腫瘍溶解性ウイルスによって治癒されたマウスにおいては、抗アデノウイルス免疫だけでなく、抗腫瘍免疫が大きく活性化されていることを見いだした（非特許文献４）。このことは、腫瘍溶解性ウイルス治療における抗腫瘍効果が、必ずしもウイルス自体による殺細胞効果だけではなく、腫瘍溶解性ウイルスによって活性化されたＣＴＬによる効果である可能性を示唆している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
▲１▼Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．８，３３４８−３３５９，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ２００２，Ｋａｏｒｉ Ｓｕｚｕｋｉ，Ｒａｍｏ´ｎ Ａｌｅｍａｎｙ，
Ｍａｓａｔｏ Ｙａｍａｍｏｔｏ，ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｔ．Ｃｕｒｉｅｌ
▲２▼ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＶＩＲＯＬＯＧＹ，Ａｐｒ．１９９６，ｐ．２２９６−２３０６，ＡＮＮ Ｅ．ＴＯＬＬＥＦＳＯＮ，ＡＢＲＡＨＡＭ ＳＣＡＲＩＡ，ＴＥＲＲＹ Ｗ．ＨＥＲＭＩＳＴＯＮ，ＪＡＮ Ｓ．ＲＹＥＲＳＥ，ＬＯＲＡ Ｊ．ＷＯＬＤ，ＡＮＤ ＷＩＬＬＩＡＭ Ｓ．Ｍ．ＷＯＬＤ
▲３▼ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＶＩＲＯＬＯＧＹ，Ｊｕｌｙ ２０００，ｐ．６１４７−６１５５，ＫＯＮＳＴＡＮＴＩＮ ＤＯＲＯＮＩＮ，ＫＡＲＯＬＹ ＴＯＴＨ，ＭＯＨＡＮ ＫＵＰＰＵＳＷＡＭＹ，ＰＥＴＥＲ ＷＡＲＤ，ＡＮＮ Ｅ．ＴＯＬＬＥＦＳＯＮ，ＡＮＤ ＷＩＬＬＩＡＭ Ｓ．Ｍ，ＷＯＬＤ
▲４▼Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ｖｏｌ．１５ ｎｏ．６，１１２１−１１２８（２００７），Ｋａｔｓｕｙｕｋｉ Ｈａｍａｄａ，Ｊｕｎｚｏ Ｄｅｓａｋｉ，Ｋｏｕ Ｎａｋａｇａｗａ，Ｔｉｎｇ Ｚｈａｎｇ，Ｔｏｓｈｉｒｏ Ｓｈｉｒａｋａｗａ，Ａｋｉｎｏｂｕ Ｇｏｔｏｈ ａｎｄ Ｍａｓａｔｏｓｈｉ Ｔａｇａｗａ
▲５▼Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ３１（２０１０）２９１２−２９１８，Ｔｏｍｏｋｏ Ｉｔｏ，Ｃｈｉｅｋｏ Ｙｏｓｈｉｈａｒａ，Ｋａｔｓｕｙｕｋｉ Ｈａｍａｄａ，Ｙｏｓｈｉｙｕｋｉ Ｋｏｙａｍａ，
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
このような状況下、本発明者らは、腫瘍溶解性ウイルスによる抗腫瘍免疫活性化のメカニズムを詳細に検討した結果、感染した腫瘍細胞におけるＡＤＰの発現が、抗腫瘍免疫の成立に関わっている可能性を見いだした。
さらに我々は、上述の非ウイルス型遺伝子治療のためのツールとして、生体内で高発現するプラスミドＤＮＡのシステムを固有技術として持っている（非特許文献５）。そこで、ＡＤＰの遺伝子をコードしたプラスミドを構築し、そのイオン複合体からなる遺伝子導入システムを調製し、担癌モデルマウスに腫瘍局所内投与してみた。すると、最も抗腫瘍効果が高いといわれているサイトカインであるＧＭ−ＣＳＦの遺伝子をコードしたプラスミドを用いた比較例よりも、著しく高い抗腫瘍効果が確認された。
【００１０】
また、前述の腫瘍溶解性ウイルスによる抗腫瘍効果の発現には、ＧＭ−ＣＳＦＦの同時投与が有効であることを見いだしている（非特許文献５）。そこで、ＡＤＰの遺伝子をコードしたプラスミド複合体とＧＭ−ＣＳＦの遺伝子をコードしたプラスミド複合体を混合して担癌モデルマウスに腫瘍局所内投与したところ、ＡＤＰの遺伝子をコードしたプラスミド複合体単独よりもさらに高い抗腫瘍効果が認められた。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、
（１）ＡＤＰ（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ Ｄｅａｔｈ Ｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子又はＡＤＰ遺伝子とＧＭ−ＣＳＦ遺伝子の両者をコードしたベクター。
（２）ベクターがプラスミドベクターであることを特徴とする上記（１）記載のベクター。
（３）ＡＤＰ遺伝子又はＡＤＰ遺伝子とＧＭ−ＣＳＦ遺伝子の両者をコードしたベクターと遺伝子導入化試薬を含有する複合体。
（４）ベクターがプラスミドベクターであることを特徴とする上記（３）記載の複合体。
（５）遺伝子導入試薬が、カチオン性ポリマー、カチオン性脂質及びアニオン性ポリマーから選択される１以上の化合物からなることを特徴とする上記（３）又は（４）記載の複合体。
【００１２】
（６）遺伝子導入試薬が、カチオン性ポリマー又はカチオン性脂質と、アニオン性ポリマーからなることを特徴とする上記（５）記載の複合体。
（７）カチオン性ポリマーが、ポリエチレンイミン（直鎖状ポリエチレンイミン又はポリ分枝型エチレンイミン）、２−ジメチルアミノエチルメタクリレートの重合体又は共重合体、２−トリメチルアミノエイルメタクリレートの重合体又は共重合体、ポリアミドアミンデンドリマー、ポリリジンデンドリマー、プロタミン、ヒストン、ＨｅｌΔ１、ゼラチン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリアルギニン、ポリオルニチン、ポリビニルイミダゾール、側鎖にエチレンジアミン構造を有する高分子及びそれらの共重合体、またはそれらの塩から１つ以上選択される上記（５）又は（６）記載の複合体。
【００１３】
（８）カチオン性脂質が、ＤＣ−Ｃｈｏｌ（３β−（Ｎ−（Ｎ‘，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）カルバモイル）コレステロール、ＤＤＡＢ（Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド）、ＤＭＲＩ（Ｎ−（１，２−ジミリスチルオキシプパ−３−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド）、ＤＯＤＡＣ（Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド）、ＤＯＧＳ（ジヘプタデシルアミドグリシルスペルミジン）、ＤＯＳＰＡ（Ｎ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ−（２−（スペルミンカルボキサミド）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムトリフルオロアセタート）、ＤＯＴＡＰ（Ｎ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド）及びＤＯＴＭＡ（Ｎ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ、Ｎ、Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド）およびそれらの異なる酸との塩から１つ以上選択される上記（５）又は（６）記載の複合体。
【００１４】
（９）アニオン性ポリマーが、カルボキシル側鎖を持つＰＥＧ誘導体、アクリル酸又はメタクリル酸の重合体若しくは共重合体、ポリビニルアルコールの硫酸エステル体、サクシニミジル化ポリ−Ｌ−リジン、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、ヒアルロン酸、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパリン、デルタマン硫酸又はそれらの誘導体、及びそれらの塩から１つ以上選択される上記（５）又は（６）記載の複合体。
（１０）凍結乾燥処理を施した上記（３）から（９）いずれか記載の複合体。
（１１）ＡＤＰ遺伝子又はＡＤＰ遺伝子とＧＭ−ＣＳＦ遺伝子の両者をコードしたベクターを含有する医薬。
（１２）ベクターがプラスミドベクターであることを特徴とする上記（１１）記載の医薬。
（１３）ＡＤＰ遺伝子又はＡＤＰ遺伝子とＧＭ−ＣＳＦ遺伝子の両者をコードしたベクターと遺伝子導入化試薬を含有する医薬。
（１４）ベクターがプラスミドベクターであることを特徴とする上記（１３）記載の医薬。
【００１５】
（１５）遺伝子導入試薬が、カチオン性ポリマー、カチオン性脂質及びアニオン性ポリマーから選択される１以上の化合物からなることを特徴とする上記（１３）又は（１４）記載の医薬。
（１６）遺伝子導入試薬が、カチオン性ポリマー又はカチオン性脂質と、アニオン性ポリマーからなることを特徴とする上記（１５）記載の医薬。
（１７）カチオン性ポリマーが、ポリエチレンイミン（直鎖状ポリエチレンイミン又はポリ分枝型エチレンイミン）、２−ジメチルアミノエチルメタクリレートの重合体又は共重合体、２−トリメチルアミノエイルメタクリレートの重合体又は共重合体、ポリアミドアミンデンドリマー、ポリリジンデンドリマー、プロタミン、ヒストン、ＨｅｌΔ１、ゼラチン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリアルギニン、ポリオルニチン、ポリビニルイミダゾール、側鎖にエチレンジアミン構造を有する高分子及びそれらの共重合体、またはそれらの塩から１つ以上選択される上記（１５）又は（１６）記載の医薬。
【００１６】
（１８）カチオン性脂質が、ＤＣ−Ｃｈｏｌ（３β−（Ｎ−（Ｎ‘，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）カルバモイル）コレステロール、ＤＤＡＢ（Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド）、ＤＭＲＩ（Ｎ−（１，２−ジミリスチルオキシプパ−３−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド）、ＤＯＤＡＣ（Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド）、ＤＯＧＳ（ジヘプタデシルアミドグリシルスペルミジン）、ＤＯＳＰＡ（Ｎ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ−（２−（スペルミンカルボキサミド）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムトリフルオロアセタート）、ＤＯＴＡＰ（Ｎ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド）及びＤＯＴＭＡ（Ｎ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ、Ｎ、Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド）およびそれらの異なる酸との塩から１つ以上選択される上記（１５）又は（１６）記載の医薬。
【００１７】
（１９）アニオン性ポリマーが、カルボキシル側鎖を持つＰＥＧ誘導体、アクリル酸又はメタクリル酸の重合体若しくは共重合体、ポリビニルアルコールの硫酸エステル体、サクシニミジル化ポリ−Ｌ−リジン、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、ヒアルロン酸、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパリン、デルタマン硫酸又はそれらの誘導体、及びそれらの塩から１つ以上選択される上記（１５）又は（１６）記載の医薬。
（２０）凍結乾燥処理を施した上記（１３）から（１９）いずれか記載の医薬。
（２１）ＡＤＰ遺伝子又はＡＤＰ遺伝子とＧＭ−ＣＳＦ遺伝子の両者をコードしたベクターを有効量投与すること特徴とする癌の治療方法。
（２２）ベクターがプラスミドベクターであることを特徴とする上記（２１）記載の癌の治療方法。
【００１８】
（２３）ＡＤＰ遺伝子又はＡＤＰ遺伝子とＧＭ−ＣＳＦ遺伝子の両者をコードしたベクターと遺伝子導入化試薬を含有する複合体を有効量投与すること特徴とする癌の治療方法。
（２４）ベクターがプラスミドベクターであることを特徴とする上記（２３）記載の癌の治療方法。
（２５）遺伝子導入試薬が、カチオン性ポリマー、カチオン性脂質及びアニオン性ポリマーから選択される１以上の化合物からなることを特徴とする上記（２３）又は（２４）記載の癌の治療方法。
（２６）遺伝子導入試薬が、カチオン性ポリマー又はカチオン性脂質と、アニオン性ポリマーからなることを特徴とする上記（２５）記載の癌の治療方法。
（２７）カチオン性ポリマーが、ポリエチレンイミン（直鎖状ポリエチレンイミン又はポリ分枝型エチレンイミン）、２−ジメチルアミノエチルメタクリレートの重合体又は共重合体、２−トリメチルアミノエイルメタクリレートの重合体又は共重合体、ポリアミドアミンデンドリマー、ポリリジンデンドリマー、プロタミン、ヒストン、ＨｅｌΔ１、ゼラチン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリアルギニン、ポリオルニチン、ポリビニルイミダゾール、側鎖にエチレンジアミン構造を有する高分子及びそれらの共重合体、またはそれらの塩から１つ以上選択される上記（２５）又は（２６）記載の癌の治療方法。
【００１９】
（２８）カチオン性脂質が、ＤＣ−Ｃｈｏｌ（３β−（Ｎ−（Ｎ‘，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）カルバモイル）コレステロール、ＤＤＡＢ（Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド）、ＤＭＲＩ（Ｎ−（１，２−ジミリスチルオキシプパ−３−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド）、ＤＯＤＡＣ（Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド）、ＤＯＧＳ（ジヘプタデシルアミドグリシルスペルミジン）、ＤＯＳＰＡ（Ｎ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ−（２−（スペルミンカルボキサミド）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムトリフルオロアセタート）、ＤＯＴＡＰ（Ｎ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド）及びＤＯＴＭＡ（Ｎ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ、Ｎ、Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド）およびそれらの異なる酸との塩から１つ以上選択される上記（２５）又は（２６）記載の癌の治療方法。
【００２０】
（２９）アニオン性ポリマーが、カルボキシル側鎖を持つＰＥＧ誘導体、アクリル酸又はメタクリル酸の重合体若しくは共重合体、ポリビニルアルコールの硫酸エステル体、サクシニミジル化ポリ−Ｌ−リジン、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、ヒアルロン酸、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパリン、デルタマン硫酸又はそれらの誘導体、及びそれらの塩から１つ以上選択される上記（２５）又は（２６）記載の癌の治療方法。
（３０）凍結乾燥処理を施した上記（２３）から（２９）いずれか記載の癌の治療方法。
に関する。
【発明の効果】
【００２１】
本発明のＡＤＰ遺伝子をコードしたベクター又はＡＤＰ遺伝子とＧＭ−ＣＳＦ遺伝子の両者をコードしたベクター、及びこれらベクターと遺伝子導入試薬との複合体は、ＡＤＰ遺伝子やＧＭ−ＣＳＦ遺伝子を効率よく細胞に導入可能で、医薬分野、特に、癌の治療に有効である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本発明において、ＡＤＰ遺伝子とは、ＡＤＰをコードするアデノウイルスＥ３−１１．６Ｋタンパクの遺伝子（Ａｄ５型では１１．６ｋではなく１０．５ｋであるが、発見者らによってこのように呼ばれている。）のほか、その一部を欠失したものや、一部を置換したのもなど、ＡＤＰが有する機能を発揮するタンパク又はペプチドをコードする遺伝子を意味する。また、ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子とは、ＧＭ−ＣＳＦをコードする遺伝子のほか、その一部を欠失したのもや、一部を置換したものなど、ＧＭ−ＣＳＦが有する機能を発揮するタンパク又はペプチドをコードする遺伝子を意味し、ヒトＧＭ−ＣＳＦや犬猫等の動物用ＧＭ−ＣＳＦも意味する。
さらに、ＡＤＰ遺伝子とＧＭ−ＣＳＦ遺伝子の両者をコードする場合、たとえばＡＤＰ遺伝子発現カセットとＧＭ−ＣＳＦ遺伝子発現カセットをベクターにタンデムに挿入したものなどを使用することができる。
また、ＡＤＰのプラスミドとＧＭ−ＣＳＦのプラスミドの両者を含む複合体、またはそれぞれの複合体を混合して用いてもよい。
【００２３】
また、本発明において、ベクターとは、遺伝子組み換え技術で用いられる、組み換えＤＮＡを増幅、維持、導入させる核酸分子を意味し、通常使用される、ｐＣＭＶ、ｐｃＤＮＡ、ｐＡＣＴ等のプラスミドベクター；コスミドベクター；ＰＡＣベクター、ＹＡＣベクター、ＢＡＣベクター等の人工染色体ベクターなど、通常、当該分野で使用されるベクターを意味する。
さらに、本発明において、遺伝子導入試薬とは、通常使用されている、遺伝子を導入する目的で使用される試薬、たとえば、カチオン性ポリマー、カチオン性脂質、アニオン性ポリマーなどを意味し、また、これらを組み合わせたものも意味する。
本発明の複合体中で遺伝子をコードしたベクター（以後、「核酸等」と記載する）は、カチオン性ポリマー又はカチオン性脂質若しくはそれを含む集合体とイオン結合による複合体を形成しており、アニオン性ポリマーを加えた場合は、アニオン性ポリマーはカチオン性ポリマー又はカチオン性脂質とイオン結合している。これらは、混合比、混合順序等によっては、主にアニオン性ポリマーで覆われた複合体を形成することができる。
【００２４】
本発明の複合体に用いることができるカチオン性ポリマーとしては、正に荷電された分子量が１０００〜３００万程度の天然由来又は合成高分子であって、水中でＤＮＡと複合体を形成できる官能基を１分子中に複数、好ましくは５個以上有する高分子を使用することができ、このような官能基としては、例えば置換されていてもよいアミノ基若しくはアンモニウム基又はその塩（これらの基は、例えば炭素数１〜６のアルキル基、フェニル基などで単又は多置換されていてもよい）、イミノ基、イミダゾリル基、グアニジノ基などの有機アミノ基を挙げることができる。このようなカチオン性ポリマーとしては、例えば、正に荷電された蛋白質やポリペプチド；正に荷電されたデンドリマー；正に荷電された合成ポリマー；及び正に荷電された多糖類誘導体、又はそれらのグラフト、あるいはブロック共重合体およびそれらの塩、並びにそれらの組み合わせが挙げられる。
【００２５】
本発明の複合体にカチオン性ポリマーとして用いることができる正に荷電された蛋白質、正に荷電されたポリペプチドの分子量は、好ましくは１０００〜５０万程度である。このような蛋白質、ポリペプチドとしては、具体的にはプロタミン、ヒストン、ＨｅｌΔ１、ゼラチンなどのタンパク質及びポリペプチドを例示することができ、また、正に荷電されたアミノ酸残基を含むポリアミノ酸もまた例示することができる。このような正に荷電されたアミノ酸残基を含むポリアミノ酸としては、具体的にはポリ−Ｌ−リジン、ポリアルギニン、ポリオルニチンなどを例示することができる。これらの蛋白質、及びポリペプチドの塩としては、塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩、ホウ酸塩などを例示することができる。
カチオン性ポリマーとして用いることができる上記のような官能基を有する正に荷電されたデンドリマーとは、分岐した分子鎖の末端または内部に、置換されていてもよいアミノ基若しくはアンモニウム基又はその塩（これらの基は、例えば炭素数１〜６のアルキル基、フェニル基などで単又は多置換されていてもよい）を有するデンドリマーであり、その分子量は、好ましくは１０００〜５０万程度である。デンドリマーとしては、具体的にはポリアミドアミンデンドリマー、ポリリジンデンドリマーなどを例示することができる。また、デンドリマーの塩としては、塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩、ホウ酸塩などを例示することができる。
【００２６】
カチオン性ポリマーとして用いることができる正に荷電された合成ポリマーは、上記のような、水中でＤＮＡと複合体を形成できる官能基を１分子中に複数、好ましくは５個以上有する合成ポリマーであって、分子量が好ましくは１０００〜３００万である合成ポリマーである。合成ポリマーとしては具体的には、ポリエチレンイミン（直鎖状ポリエチレンイミン、又はポリ分岐型エチレンイミンを含む）、２−ジメチルアミノエチルメタクリレートの重合体又は共重合体、２−トリメチルアミノエチルメタクリレートの重合体又は共重合体、ポリビニルイミダゾール、側鎖にエチレンジアミン構造を有する高分子及びそれらの共重合体、またはそれらの塩などを例示することができる。合成ポリマーの一例であるポリエチレンイミンの分子量は、好ましくは１０００〜５０万程度であり、より好ましくは５０００〜２０万程度であり、もっとも好ましくは１万〜１０万程度である。あるいは、より短いポリエチレンイミンを結合して得られるブロック共重合体である。また、ポリエチレンイミンの塩として、塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩、ホウ酸塩などを例示することができる。
【００２７】
カチオン性ポリマーとして用いることができる正に荷電された多糖類誘導体は、水中でＤＮＡと複合体を形成できる官能基を１分子中に複数、好ましくは５個以上有する、分子量が、好ましくは１０００〜３００万であり、より好ましくは５０００〜５０万である多糖類誘導体である。このような多糖類としては、具体的にはキトサン、上記のような官能基を導入したデキストラン誘導体などを例示することができる。これらのうちキトサンの分子量は、好ましくは１０００〜５０万程度であり、より好ましくは５０００〜２０万程度であり、もっとも好ましくは１万〜１０万程度である。キトサンの塩としては、塩酸塩、酢酸塩などを例示することができる。また、デキストラン誘導体の分子量は、好ましくは３０００〜１００万である。このようなデキストラン誘導体としては、具体的にはジエチルアミノエチル−デキストランなどを例示することができる。
【００２８】
上記のカチオン性ポリマーは、従来正に荷電していないものにアミノ基などの官能基を導入し、正に荷電するようにしたものでも良い。また、通常は正に荷電されていないものであっても、複合体形成時に正に荷電されるものであれば使用可能であり、また、必要により糖鎖、オリゴペプチド、抗体などで更に修飾されていてもよい。
【００２９】
本発明の複合体に用いることができるカチオン性脂質（カチオン性コレステロール誘導体を含む）としては、ＤＣ−Ｃｈｏｌ（３β−（Ｎ−（Ｎ′，Ｎ′−ジメチルアミノエタン）カルバモイル）コレステロール）、ＤＤＡＢ（Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド）、ＤＭＲＩ（Ｎ−（１，２−ジミリスチルオキシプロパ−３−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド）、ＤＯＤＡＣ（Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド）、ＤＯＧＳ（ジヘプタデシルアミドグリシルスペルミジン）、ＤＯＳＰＡ（Ｎ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ−（２−（スペルミンカルボキサミド）エチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムトリフルオロアセタート）、ＤＯＴＡＰ（Ｎ−（１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド）、又はＤＯＴＭＡ（Ｎ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド）、およびそれらの異なる酸との塩、並びにそれらの組み合わせが挙げられる。
【００３０】
また、カチオン性脂質を含む集合体としては、上記カチオン性脂質（たとえばＤＯＳＰＡ）と、例えばＤＯＰＥ（ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン）、コレステロールなどの中性物質を混合したものを使用することができる。例えばカチオン性脂質を含む集合体としては、リポフェクタミン（上記ＤＯＳＰＡとＤＯＰＥの３：１ｗ／ｗ混合体リポソーム）、リポフェクチン（上記ＤＯＴＭＡとＤＯＰＥの１：１ｗ／ｗ混合体リポソーム）、またはこれらの混合物などを好ましく挙げることができる。また、ポドプラニン、ポドカリキシン、キタラン硫酸、ガングリオシド、ポドプラニン−ＣＬＥＣ−２受容体（Ｃ型レクチン様受容体，Ｃ−ｔｙｐｅ ｌｅｃｔｉｎ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−２）、ＭＵＣ、あるいは腫瘍細胞特異的な各種糖タンパクに対する抗体等、あるいは抗体医薬である リツキシマブ（抗ＣＤ２０抗体）、トラスツマブ（ハーセプチン）などの抗ＨＥＲ−２抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、オムニターグなどを結合したカチオン性ポリマーを使用し、標的指向性を付与することができる。
【００３１】
本発明の複合体においては、カチオン性ポリマーとしては、ポリエチレンイミン；プロタミン；ＨｅｌΔ１；ポリアミドアミンデンドリマー、ポリリジンデンドリマーなどのデンドリマー；キトサン；２−ジメチルアミノエチルメタクリレートの重合体又は共重合体；２−トリメチルアミノエチルメタクリレートの重合体又は共重合体などを好ましく用いることができ、ポリエチレンイミン、ポリアミドアミンデンドリマー、ポリリジンデンドリマー、キトサンを特に好ましく用いることができる。また、カチオン性脂質若しくはそれを含む集合体としては、リポフェクタミン（上記ＤＯＳＰＡとＤＯＰＥの３：１ｗ／ｗ混合体リポソーム）を好ましくは用いることができる。
【００３２】
本発明の複合体において使用するアニオン性ポリマーとしては、分子中にアニオン性基を含む、負に荷電された、分子量が５００〜４００万程度の天然由来又は合成高分子であって、水中でポリカチオンと複合体を形成できる官能基を１分子中に複数、好ましくは５個以上有する高分子を使用することができ、このような官能基としては、例えばカルボキシル基、−ＯＳＯ３Ｈ基、−ＳＯ３Ｈ基、リン酸基、及びこれらの塩を挙げることができる。このようなアニオン性ポリマーとしては、両イオン性ポリマーも含まれる。
【００３３】
本発明の複合体においては、アニオン性ポリマーとしては、カルボキシル基、−ＯＳＯ３Ｈ基、−ＳＯ３Ｈ基、リン酸基、及びこれらの塩から選択される官能基を有する多糖類又はその誘導体；負に荷電した側鎖を有するアミノ酸残基を含むポリアミノ酸；カルボキシル側鎖を持つＰＥＧ誘導体；カルボキシル基、−ＯＳＯ３Ｈ基、−ＳＯ３Ｈ基、リン酸基、及びこれらの塩から選択される官能基を有する合成高分子；カルボキシル基、−ＯＳＯ３Ｈ基、−ＳＯ３Ｈ基、リン酸基、及びこれらの塩から選択される官能基、並びに置換されていてもよいアミノ基若しくはアンモニウム基又はその塩（これらの基は、例えば炭素数１〜６のアルキル基、フェニル基などで単又は多置換されていてもよい）を有する高分子；並びにそれらの組み合わせを用いることができる。
【００３４】
本発明の複合体においてアニオン性ポリマーとして用いることができる上記のような官能基を有する多糖類又はその誘導体としては、好ましくはグルコサミノグリカンを用いることができる。このようなグルコサミノグリカンの分子量は、好ましくは１０００〜４００万、より好ましくは４０００〜３００万である。このようなグルコサミノグリカンとして、具体的には例えばヒアルロン酸、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパリン、デルマタン硫酸などを例示することができる。なかでもヒアルロン酸を好ましく用いることができる。ヒアルロン酸は、その塩又は負に荷電した誘導体としても用いることができる。その分子量は、５，０００以上であればよいが、１０，０００以上が好ましく、１０万〜３００万がより好ましい。ヒアルロン酸の塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩などを例示することができる。また、ヒアルロン酸の誘導体としては、例えば、ヒアルロン酸にポリエチレングリコール、ペプチド、糖、蛋白質、ヨウ酸、抗体又はその一部などを導入することによって得られるものが挙げられ、スペルミン、スペルミジン等を導入し、プラスに荷電した部分を持つ両イオン性の誘導体も含まれる。
【００３５】
本発明の複合体においてアニオン性ポリマーとして用いることができる、負に荷電した側鎖を有するアミノ酸残基を含むポリアミノ酸とは、カルボキシル基、−Ｏ−ＳＯ３Ｈ基、−ＳＯ３Ｈ基、リン酸基、及びこれらの塩などの基を側鎖として有するアミノ酸残基を含む、好ましくは５００〜１００万の分子量を有するポリアミノ酸である。このようなポリアミノ酸としては、具体的にはポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸などを例示することができる。
【００３６】
本発明の複合体においてアニオン性ポリマーとして用いることができるカルボキシル側鎖を持つＰＥＧ誘導体とは、ＰＥＧ１分子当たりカルボキシル側鎖を複数、好ましくは５個以上有する、５００以上、好ましくは２０００以上、より好ましくは４０００〜４００００の分子量を有するＰＥＧ誘導体である。カルボキシル側鎖を持つＰＥＧ誘導体は、その塩又は負に荷電した誘導体としても用いることができる。これらの塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩などを例示することができる。このようなＰＥＧ誘導体としては、具体的にはＪ．Ｂｉｏｍａｔｅｒ．Ｓｃｉ．Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｅｄｎ．Ｖｏｌ．１４，ｐｐ ５１５−５３１（２００３）などに記載されたＰＥＧ誘導体を例示することができる。
【００３７】
本発明の複合体においてアニオン性ポリマーとして用いることができるカルボキシル基、−ＯＳＯ３Ｈ基、−ＳＯ３Ｈ基、リン酸基、及びこれらの塩から選択される官能基を有する合成高分子とは、１分子当たり複数、好ましくは５個以上の、カルボキシル基、−Ｏ−ＳＯ３Ｈ基、−ＳＯ３Ｈ基、リン酸基、及びこれらの塩から選択される官能基を有する重合体又は共重合体であって、好ましくは５００〜４００万の分子量を有する重合体又は共重合体である。このような重合体又は共重合体としては、具体的には分子量１０００〜３００万のアクリル酸又はメタクリル酸の重合体又は共重合体、あるいはポリビニルアルコールの硫酸エステル体、サクシニミジル化ポリ−Ｌ−リジンなどを例示することができる。
【００３８】
本発明の複合体においてアニオン性ポリマーとして用いることができるカルボキシル基、−ＯＳＯ３Ｈ基、−ＳＯ３Ｈ基、リン酸基、及びこれらの塩から選択される官能基、並びに置換されていてもよいアミノ基若しくはアンモニウム基又はその塩（これらの基は、例えば炭素数１〜６のアルキル基、フェニル基などで単又は多置換されていてもよい）を有する高分子とは、１分子当たりカルボキシル基、−ＯＳＯ３Ｈ基、−ＳＯ３Ｈ基、リン酸基、及びこれらの塩から選択される官能基を複数、好ましくは５個以上、並びに上記のように置換されていてもよいアミノ基若しくはアンモニウム基又はその塩を有する、５００以上、好ましくは２０００以上、より好ましくは４０００〜４００００の分子量を有する高分子である。このような高分子としては、好ましくは、カルボキシル側鎖とその当量以下の上記のアミノ基若しくはアンモニウム基又はその塩を持つＰＥＧ誘導体を挙げることができ、具体的にはＭａｃｒｏｍｏｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｖｏｌ．２，ｐｐ ２５１−２５６（２００２）などに記載されている方法で調製することができるＰＥＧ誘導体を例示することができる。
【００３９】
本発明の複合体において用いることができるアニオン性ポリマーは、従来負に荷電していないものにカルボキシル基などの官能基を導入し、負に荷電するようにしたものでも良い。通常は負に荷電されていないものであっても、複合体形成時に負に荷電されるものであれば使用可能であり、また必要により糖鎖、オリゴペプチド、抗体などで更に修飾されていてもよい。
【００４０】
本発明の複合体においては、アニオン性ポリマーとしては、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、カルボキシル側鎖を持つＰＥＧ誘導体、ポリアクリル酸などのアニオン性ポリマー又はそれらの塩を好ましく用いることができ、ヒアルロン酸、カルボキシル側鎖を持つＰＥＧ誘導体又はそれらの塩などを特に好ましく用いることができる。
【００４１】
また、アニオン性ポリマーとして、遺伝子導入の標的細胞に対して特異的接着能を有するものを用いることにより、標的細胞に対して特異的に遺伝子導入をすることが可能である。例えばアニオン性ポリマーとしてヒアルロン酸を用いる場合、ヒアルロン酸と特異的に結合するＣＤ４４などの細胞表面分子を有する細胞を標的とすることができる。また、ＲＧＤペプチドを導入したアニオン性ポリマーを用いることにより、多くの種類の腫瘍細胞を標的とすることができ、またガラクトース側鎖を導入したアニオン性ポリマーを用いることにより肝細胞又は肝由来の細胞を標的とすることができる。また、ポドプラニン、ポドカリキシン、キタラン硫酸、ガングリオシド、ポドブラニン−ＣＬＥＣ−２受容体（Ｃ型レクチン様受容体，Ｃ−ｔｙｐｅ ｌｅｃｔｉｎ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−２）、ＭＵＣ、あるいは腫瘍細胞特異的な各種糖タンパクに対する抗体等、あるいは抗体医薬であるリツキシマブ（抗ＣＤ２０抗体）、トラスツマブ（ハーセプチン）などの抗ＨＥＲ−２抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、オムニターグなどを結合したアニオン性ポリマーを使用し、標的指向性を付与することができる。
【００４２】
本発明の複合体において、カチオン性ポリマー又はカチオン性脂質若しくはそれを含む集合体と、アニオン性ポリマーの組み合わせとしては、ポリエチレンイミンとヒアルロン酸；ポリエチレンイミンとコンドロイチン硫酸；ポリエチレンイミンとカルボキシル側鎖を持つＰＥＧ誘導体；ＤＯＳＰＡを含む集合体（例えばリポフェクタミン（ＤＯＳＰＡとＤＯＰＥの３：１ｗ／ｗ混合体リポソーム））とヒアルロン酸；ＤＯＳＰＡを含む集合体（例えばリポフェクタミン）とカルボキシル側鎖を持つＰＥＧ誘導体を好ましく挙げることができる。
【００４３】
本発明の複合体において使用する核酸等と、カチオン性ポリマー又はカチオン性脂質若しくはそれを含む集合体の各荷電基のモル比（負電荷：正電荷比）は、標的細胞・核酸等・カチオン性ポリマー等の種類により異なるが、１：０．８〜１：１００であるとよく、好ましくは１：１〜１：５０であり、より好ましくは１：１．２〜１：３０である。ここでいう核酸等と、カチオン性ポリマー又はカチオン性脂質若しくはそれを含む集合体の配合比とは、各荷電基のモル比であり、具体的には核酸、オリゴ核酸、又はその誘導体のリン酸アニオンによる負電荷：カチオン性ポリマー又はカチオン性脂質若しくはそれを含む集合体の正電荷又は正に帯電できる官能基のモル比を指す。
【００４４】
本発明の複合体において使用する核酸等と、アニオン性ポリマーの各荷電基のモル比（負電荷：負電荷比）は、標的細胞・核酸等・アニオン性ポリマーの種類により異なるが、１：０．２〜１：１０００であるとよく、好ましくは１：０．２〜１：１００であり、より好ましくは１：１〜１：６０である。ここでいう核酸等と、アニオン性ポリマーの配合比とは、各荷電基のモル比であり、具体的には核酸、オリゴ核酸、又はその誘導体のリン酸アニオンによる負電荷：アニオン性ポリマーの負電荷又は負に帯電できる官能基のモル比を指す。
【００４５】
例えばアニオン性ポリマーとしてヒアルロン酸やコンドロイチン硫酸を用いる場合、核酸等とヒアルロン酸やコンドロイチン硫酸との配合比は、１：０．２〜１：１０００であるとよく、好ましくは１：０．２〜１：１００であり、より好ましくは１：１〜１：６０である。
【００４６】
例えばアニオン性ポリマーとしてカルボキシル側鎖を持つＰＥＧ誘導体を用いる場合、核酸等とカルボキシル側鎖を持つＰＥＧ誘導体との配合比は、１：０．２〜１：１０００であるとよく、好ましくは１：０．２〜１：１００であり、より好ましくは１：１〜１：６０である。
【００４７】
特に、カチオン性ポリマーとしてポリエチレンイミンを、アニオン性ポリマーとしてヒアルロン酸やコンドロイチン硫酸を用いる場合、核酸等：ポリエチレンイミン：ヒアルロン酸（又はコンドロイチン硫酸）配合比は、１：２〜６０：１〜２４０、好ましくは１：４〜２４：１〜１６０であり、より好ましくは１：５〜２０：２〜６０、特に好ましくは１：６〜１４：２〜３２である。
【００４８】
特に、カチオン性ポリマーとしてポリエチレンイミンを、アニオン性ポリマーとしてカルボキシル側鎖を持つＰＥＧ誘導体を用いる場合、核酸等：ポリエチレンイミン：カルボキシル側鎖を持つＰＥＧ誘導体配合比は、１：２〜６０：１〜２４０、好ましくは１：４〜２４：２〜１６０であり、より好ましくは１：５〜２０：２〜６０、特に好ましくは１：６〜１８：４〜４２である。
【００４９】
特に、カチオン性脂質を含む集合体としてリポフェクタミン（ＤＯＳＰＡとＤＯＰＥの３：１ｗ／ｗ混合体リポソーム）を、アニオン性ポリマーとしてヒアルロン酸やコンドロイチン硫酸を用いる場合、核酸等：リポフェクタミン：ヒアルロン酸（又はコンドロイチン硫酸）配合比は、１：１〜５０：０．２〜２４０、好ましくは１：１．２〜４８：０．２〜１６０であり、より好ましくは１：１．５〜３０：０．５〜６０、特に好ましくは１：１．８〜１６：１〜３２である。
【００５０】
特に、カチオン性脂質を含む集合体としてリポフェクタミンを、アニオン性ポリマーとしてカルボキシル側鎖を持つＰＥＧ誘導体を用いる場合、核酸等：リポフェクタミン：カルボキシル側鎖を持つＰＥＧ誘導体配合比は、１：１〜５０：０．１〜１６０、好ましくは１：１．２〜４８：０．２〜１６０であり、より好ましくは１：１．５〜３０：０．５〜６０特に好ましくは１：１．８〜１６：２〜３２である。
【００５１】
本発明の複合体に含まれる核酸等；カチオン性ポリマー又はカチオン性脂質若しくはそれを含む集合体；及びアニオン性ポリマーの好ましい配合比は、上述のとおりであるが、核酸などを導入する細胞の数や種類により最適な条件は変動するため、配合比は、当業者が、用いる細胞、核酸等の種類に応じて、適宜決定することができる。
【００５２】
本発明の複合体は、上述した核酸等；カチオン性ポリマー又はカチオン性脂質若しくはそれを含む集合体；及び必要であればアニオン性ポリマーを、上述した配合比で、混合することによって複合体を形成させる工程、必要ならばこれに次いでこれを凍結乾燥する工程によって調製することができる。混合する順序としては、［１］核酸等；［２］カチオン性ポリマー又はカチオン性脂質若しくはそれを含む集合体、［３］アニオン性ポリマーの順、又は、［１］核酸等；［２］アニオン性ポリマー、［３］カチオン性ポリマー又はカチオン性脂質若しくはそれを含む集合体の順が好ましい。核酸等は、カチオン性ポリマー又はカチオン性脂質若しくはそれを含む集合体とイオン結合によって結合し、さらにカチオン性ポリマー又はカチオン性脂質若しくはそれを含む集合体が、アニオン性ポリマーともイオン結合した複合体が形成される。あるいは、各成分の配合組成によっては、このような複合体構造の外殻を主にアニオン性ポリマーが被覆し、負の表面電位を有する態様が形成される
【００５３】
次いで、必要であれば得られた複合体を凍結乾燥する。凍結乾燥は、通常の凍結乾燥条件下で行うことができ、例えば減圧下（好ましくは、５〜１００ｍｍＨｇ、より好ましくは１０ｍｍＨｇ）、外気温−７８℃〜６０℃、好ましくは−３０℃〜４０℃で乾燥することによって行うことができる。乾燥に要する時間は、減圧度、溶媒の量によって異なり、通常は１時間〜２日間で完了する。
【００５４】
このようにして調製した本発明の複合体は、ヒトや動物に対する各種の遺伝子治療、免疫治療、あるいはＡＤＰ遺伝子やＧＭ−ＣＳＦ遺伝子を導入した実験動物や細胞の作成に利用することができる。凍結乾燥を施した場合には、使用前に本発明の複合体を水、生理食塩水、緩衝液、ブドウ糖溶液、培地液などの溶媒に懸濁又は溶解することにより再水和物としてから用いることができる。再水和に際しては、凍結乾燥体を、例えば核酸、又はその誘導体の１００〜１００００倍（重量比）の溶媒を用いて懸濁又は稀釈する。凍結乾燥前と異なる量、異なる種類の溶媒を用いることができるため、従来困難であった比較的高濃度の懸濁液や溶液（たとえば１ｍｌ中にＤＮＡを１ｍｇ含む液）も容易に調製することができる。
【００５５】
このようにして再水和した本発明の複合体は、細胞への核酸等の導入に際しては、具体的には、例えば、ウェル中、体外に取り出した標的細胞を、水和した本発明の複合体で処理することにより遺伝子を導入した後、該細胞を生体内に戻して、目的とする遺伝子を発現させるｅｘ ｖｉｖｏ法（ワクチン療法）、あるいは、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｓｉｔｕ法などの直接的な遺伝子導入法など、生体細胞への核酸、又はその誘導体の導入に通常用いられる任意の方法を用いることができる。
また、本発明の複合体は、凍結乾燥後、再水和することなく、そのまま核酸等の導入を行う細胞と接触させたり、核酸等の導入を行う動物に皮下移殖する、核酸等の導入の標的である組織内、組織表面、または近傍に移殖するなどの手段によって投与することもできる。
【００５６】
本発明の複合体の細胞への適用量は、上述した導入方法、疾患の種類などによって異なるが、例えば核酸、又はその誘導体の量にして、ｅｘ ｖｉｖｏ法、ｉｎ ｓｉｔｕ法では、直径１〜２ｃｍのウェル当たりで０．２〜１０μｇ／１０４〜７個・細胞、ｉｎ ｖｉｖｏ法では、投与部位によって大きく異なるが、腫瘍内への局所投与では例えば５〜１０００μｇ／ｃｍ３・腫瘍、膀胱などの臓器への投与では例えば０．１μｇ〜１００ｍｇ／臓器、全身投与では例えば０．１ｎｇ〜１０ｍｇ／Ｋｇ・体重とすることができる。
【００５７】
生体に直接投与するｉｎ ｖｉｖｏ法としては、本発明の複合体、または水和させた本発明の凍結乾燥体水和物を、静脈、皮下又は筋肉、腹腔、腫瘍内、腫瘍近傍などへ注射し；鼻腔、口腔、肺などから吸入させ；膀胱内、直腸内に直接注入し；病変部組織ないし近傍の血管内に直接投与し；あるいは、ゲル状物、スポンジなどの多孔体、不織布などに担持させて留置するなど、遺伝子治療技術の如何なる方法も用いることができる。
また、本発明の凍結乾燥体水和物を再水和することなく用いる際においても、上記の量の凍結乾燥体を、上述したようなｅｘ ｖｉｖｏ法、ｉｎ ｓｉｔｕ法、またはｉｎ ｖｉｖｏ法により、用いることができる。
【００５８】
本発明の複合体においては、通常の核酸等と、カチオン性ポリマー又はカチオン性脂質若しくはそれを含む集合体との複合体が持つ正の荷電を、アニオン性ポリマーが中和すると共に、その中和作用が、生体、細胞への投与後においても保持されていることによって、複合体と、血清タンパク質、血球細胞、細胞外マトリックスなどとによる凝集等の相互作用が阻止され、また、核酸、オリゴ核酸、又はその誘導体等の酵素分解が阻止されるため、核酸が細胞に効率的に取り込まれ、その発現効率も高い。
上記より、本発明の複合体は、核酸、又はその誘導体の導入用製剤又は試薬として、あるいは核酸、又はその誘導体の導入用キットとして使用することができる。
【００５９】
本発明に使用するプラスミドまたはその誘導体のＧＭ−ＣＳＦ遺伝子は、対象とする動物種によって、ヒトＧＭ−ＣＳＦ、ネコＧＭ−ＣＳＦ、イヌＧＭ−ＣＳＦなどから、効果のあるものを自由に選ぶことが出来る。
【００６０】
本発明に使用するプラスミドまたはその誘導体のプロモーターは、対象とする動物種、細胞種によって、サイトメガウイルス由来プロモーター、ＲＳＶ（Ｒｏｕｓ Ｓａｒｃｏｍａ ｖｉｒｕｓ，ラウス肉腫ウイルス）由来プロモーター、ＳＶ４０（ｓｉｍｉａｎ ｖｉｒｕｓ４０（シミアンウイルス））由来プロモーター、Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ １ａ プロモーター等の癌選択性プロモーターなどから、自由に選ぶことが出来る。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】 ＡＤＰの遺伝子をコードしたプラスミド／ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）／コンドロイチン硫酸（ＣＳ）複合体の腫瘍局所内注射による皮下移植Ｂ１６細胞に対する治癒効果
【図２】ＡＤＰの遺伝子をコードしたプラスミド複合体にマウスＧＭ−ＣＳＦの遺伝子をコードしたプラスミド複合体を併用した腫瘍局所内注射による皮下移植Ｂ１６細胞に対する治癒効果
【００６２】
【図３】ＡＤＰをコードしたプラスミドによる事前免疫有無でのマウスの腫瘍退縮効果
【図４】ＡＤＰをコードしたプラスミド複合体の腫瘍局所内注射による、マウス（事前免疫した）への皮下移植卵巣癌由来ＯＶＨＭ細胞に対する治癒効果
【実施例】
本発明を、実施例により更に具体的に説明する。なお、これらの実施例は、本発明を説明するためのものであって、本発明を何ら限定するものではない。
【実施例１】
【００６３】
ＡＤＰの遺伝子をコードしたプラスミド／ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）／コンドロイチン硫酸（ＣＳ）複合体の腫瘍局所内注射による皮下移植Ｂ１６細胞に対する治癒効果
ＡＤＰの遺伝子をコードしたプラスミド・ＰＥＩ・ＣＳからなる三成分の複合体をマウスのメラノーマ細胞由来のＢ１６を皮下に移植したマウスに腫瘍局所内投与し、腫瘍増大抑制効果を確認した。
【００６４】
ＣＳは、生化学工業株式会社製のサメ由来のものを用いた。ＰＢＳはＲｏｍａｎ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社製のＰｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｔｓ（Ｔａｂｌｅｔ）を蒸留したイオン交換水に溶解したものを用いた。ＰＥＩは、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ社製の直鎖状ＰＥＩ、Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ“Ｍａｘ”（Ｍｗ＝４００００）を用いた。これらは以降の実施例でも同様である。
［操作手順］
［１］ＡＤＰの遺伝子をコードしたプラスミドは、以下の通り作成した。
アデノウイルス５型の右側ｌａｒｇｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ（Ｍｉｃｒｏｖｉｘ社、カナダ）をテンプレートにして、下記のＡＤＰ−Ｓ、ＡＤＰ−ＡＳをプライマーにしてＥＸ Ｔａｇ（ｔａｋａｒａ）の酵素を用いてＰＣＲを行いクローニングベクターｐＴＡＣ−１に挿入した。Ｓｅｑｕｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓ（ＡＢＩ）にてｓｅｑｕｅｎｃｅを確認して発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３．１（−）：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共にＥｃｏ ＲＩ，Ｂａｍ ＨＩにて酵素処理して発現ベクターに挿入し、ｐｃＤＮＡ３．１（−）−ＡＤＰ−Ｓ−ＡＳ１を作成した。さらに，Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ（ＡＢＩ）にてｓｅｑｕｅｎｃｅを確認した。
ＡＤＰ−Ｓ：ＡＴＧＡＣＣＡＡＣＡＣＡＡＣＣＡＡＣＧＣ
ＡＤＰ−ＡＳ−１：ＡＣＴＣＧＡＧＧＡＡＴＣＡＴＧＴＣＴＣＡ
【００６５】
［２］細胞培養ディッシュにＢ１６細胞をまき、ＥＭＥＭ培地を用いてインキュベートし、移植用細胞を準備した。
［３］移植する直前に培養した培地を取り除き、１０％ＦＣＳと２５Ｕのペニシリンと２５μｇのストレプトマイシンを含むＥＭＥＭ加え、細胞を剥離した。
［４］５週令の雄のＣ５７ＢＬ／６マウスに、ＡＤＰの遺伝子をコードしたプラスミド１０μｇを後肢筋肉内に投与しマウスを免役した。２〜３週間後に２０ｘ１０５個のＢ１６メラノーマ細胞を腹部の皮下に移植した。比較のため、免役していないマウスに関しても同様に実験した。
【００６６】
［５］ 導入する数日前に以下の方法でプラスミド複合体を調製した。
ＡＤＰの遺伝子をコードしたプラスミド１００μｇを含む７．４ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）４８２０μｌに、５９４μｇのＣＳを含む水溶液１１９μｌを加え、続いてＰＥＩ２９３．５μｇを含む水溶液５９μｌを加えて攪拌後、２０分室温で放置した。
その後、１０％デキストラン溶液を５０μｌ加え、さらに１０分放置後、マイナス３０℃で凍結した。その後、凍結乾燥して、本発明の複合体を調製した。
［６］［４］で作成した担癌マウスモデルの腫瘍サイズが短径３ｍｍ以上になったところで、［５］で調製した凍結乾燥体に純水２５０μｌを加え、十分に溶解、分散させたものを、腫瘍組織内に投与した。
［７］１〜２日に１度腫瘍のサイズを測定した。
【００６７】
［結果］
結果を図１に示す。ここで、図中の腫瘍サイズは、（４／３）ｘ短径ｘ短径ｘ長径ｘ（１／８）ｘ３．１４として計算したものである。
何も投与していないコントロール群では急激な腫瘍の増大が見られたのに対して、ＡＤＰの遺伝子をコードしたプラスミド／ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）／コンドロイチン硫酸（ＣＳ）複合体を腫瘍局所内投与したマウスでは明確な腫瘍増大抑制が見られた。
【実施例２】
【００６８】
ＡＤＰの遺伝子をコードしたプラスミド複合体にマウスＧＭ−ＣＳＦの遺伝子をコードしたプラスミド複合体を併用した腫瘍局所内注射による皮下移植Ｂ１６細胞に対する治癒効果。
マウスＧＭ−ＣＳＦの遺伝子をコードしたプラスミド／ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）／コンドロイチン硫酸（ＣＳ）複合体を実施例１と同様に作成し、実施例１で作成したＡＤＰの遺伝子をコードしたプラスミド／ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）／コンドロイチン硫酸（ＣＳ）複合体とともにマウスのメラノーマ細胞由来のＢ１６を皮下に移植したマウスに腫瘍局所内投与し、腫瘍増大抑制効果を確認した。
【００６９】
［操作手順］
［１］実施例１と同様に担癌モデルマウス、ＡＤＰの遺伝子をコードしたプラスミド／ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）／コンドロイチン硫酸（ＣＳ）複合体、およびマウスＧＭ−ＣＳＦの遺伝子をコードしたプラスミド／ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）／コンドロイチン硫酸（ＣＳ）複合体を用意した。
［２］担癌マウスモデルの腫瘍サイズが短径３ｍｍ以上になったところで、上記２種類の凍結乾燥体にそれぞれ純水１００μｌを加え、十分に溶解、分散させたものを混合し、腫瘍組織内に投与した。
［３］１〜２日に１度腫瘍のサイズを測定した。
【００７０】
［結果］
結果を図２に示す。ここで、図中の腫瘍サイズは、（４／３）ｘ短径ｘ短径ｘ長径ｘ（１／８）ｘ３．１４として計算したものを示した。
ＡＤＰの遺伝子をコードしたプラスミド複合体のみ、あるいは、ＧＭ−ＣＳＦの遺伝子をコードしたプラスミド複合体のみを投与した群に比べ、両者を混合して腫瘍組織内投与したマウスの方が腫瘍の退縮が速く、相乗効果が認められた。
【実施例３】
【００７１】
実施例２と同様の実験を、実験の開始３週間前にＡＤＰのプラスミド１０μｇを後肢に筋肉内投与して免疫したマウスと、免疫していないマウスとで行い、腫瘍退縮の早さを比べたのが図３である。Ｄａｙ０での腫瘍サイズを１００として腫瘍の比サイズで表している。ここで、図中の腫瘍サイズは、（４／３）ｘ短径ｘ長径ｘ長径ｘ３．１４として計算したものをＤＮＡ複合体投与日のサイズに対する相対値示したものである。
あらかじめ免疫したマウスの方が腫瘍の退縮が速く、事前免疫の効果が認められた。
【実施例４】
【００７２】
［１］マウス卵巣癌由来のＯＶＨＭ細胞（Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．８０，４５９−４６３（１９８９）に記載された「ＯＶ２９４４−ＨＭ−１」）を、ＦＣＳ１０％を含むＲＰＭＩ培地を用いて培養し、移植用細胞を準備した。
［２］３週間前に１０１０ｐｆｕのＡｄ−ＧＦＰで予め免疫処置した雌の（Ｃ５７ＢＬ／６×Ｃ３／Ｈｅ）Ｆ１マウス（入手先：日本クレア）に、マウス一匹あたり１０６個の割合で、皮下に投与した。
［３］ 導入する数日前に以下の方法でプラスミド複合体を調製した。
ＡＤＰの遺伝子をコードしたプラスミド１００μｇを含む７．４ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）４８２０μｌに、５９４μｇのＣＳを含む水溶液１１９μｌを加え、絖いてＰＥＩ２９３．５μｇを含む水溶液５９μｌを加えて攪拌後、２０分室温で放置した。その後、１０％デキストラン溶液を５０μｌ加え、さらに１０分放置後、マイナス３０℃で凍結した。その後、凍結乾燥して、本発明の複合体を調製した。
［４］［２］で作成した担癌マウスモデルの腫瘍サイズが直径７ｍｍ以上になったところで、［３］で調製した凍結乾燥体に純水２５０μｌを加え十分に溶解、分散させたものを、さらに２５０μｌのＰＢＳで希釈した後、腫瘍組織内に連日３回投与した。
【００７３】
［６］１〜２日に１度腫瘍のサイズを測定した。
［結果］
結果を図４に示す。ここで、図中の腫瘍サイズは、（４／３）ｘ短径ｘ短径ｘ長径ｘ（１／８）ｘ３．１４として計算したものである。
何も投与していないコントロール群では急激な腫瘍の増大が見られたのに対して、ＡＤＰの遺伝子をコードしたプラスミド／ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）／コンドロイチン硫酸（ＣＳ）複合体を腫瘍局所内投与したマウスでは明確な腫瘍増大抑制が見られた。
【産業上の利用可能性】
本発明は、ＡＤＰ（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ Ｄｅａｔｈ Ｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子をコードしたベクター又はＡＤＰ遺伝子とＧＭ−ＣＳＦ遺伝子の両者をコードしたベクター、及びこれらベクターと遺伝子導入試薬との複合体、それらを含有する医薬並びにそれらを用いる癌の治療方法に有用である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＡＤＰ（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ Ｄｅａｔｈ Ｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子をコードしたベクター又はＡＤＰ遺伝子とＧＭ−ＣＳＦ遺伝子の両者をコードしたベクター、及びこれらベクターと遺伝子導入試薬との複合体、それらを含有する医薬並びにそれらを用いる癌の治療方法に関する。
【技術背景】
【０００２】
遺伝子治療は、遺伝子に欠損や異常があることによる遺伝子疾患の患者に、正常遺伝子を与えて病気を治す、根治的な治療法として期待され、試みられてきた。正式な手続きを踏み、治療目的として行われた初めての遺伝子治療は、１９９０年に、ＡＤＡ（アデノシンデアミ ナーゼ）欠損症の患者に対して行われた。治療に必要な遺伝子をコードしたＤＮＡを目的の細胞に導入するためには、多くの場合ベクターと呼ばれる遺伝子の運びやが使用される、ベクターには現在（１）ウイルスベクターと（２）カチオン性ポリマー、あるいはカチオン性脂質などの非ウイルスベクターとがある。
【０００３】
これまで行われてきた遺伝子治療臨床試験の多くはウイルスベクターを利用したものである。（１）レトロウイルスベクター（２）アデノウイルス（Ａｄ）ベクター（３）アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターなどが使用されてきた。このうちアデノウイルスベクターは、これまでに最も多く利用されたベクターであり、４００例の臨床試験が試みられている。
アデノウイルスには５０種類以上の血清型が知られているが、ベクターとしては、アデノウイルス５型を遺伝子組み換えした非増殖型組換えアデノウイルスが、その優れた遺伝子導入特性から遺伝子治療研究において広く用いられてきた。
【０００４】
多くの非増殖型アデノウイルスベクターでは、アデノウイルスのＥ１遺伝子を取り除き、代わりにｐ５３などの治療用の遺伝子を挿入している。アデノウイルス遺伝子の発現の開始に必要なＥ１遺伝子を欠損しているため、一般の細胞内では増殖しないが、Ｅ１を発現している２９３細胞のような特殊な細胞内では増殖させることが可能である。このようにして得られる非増殖型組換えアデノウイルスは、標的細胞に効率良く感染し、治療遺伝子を発現するが、標的細胞内にはＥ１遺伝子産物がないため、増殖することなく安全性が高いと考えられる。
また、目的遺伝子を挿入するためのより大きなスペースを確保するために、培養細胞での増殖に必須ではないＥ３領域も除去したものが広く利用されてきた。
【０００５】
アデノウイルスベクターは感染性が強く、また、レトロウイルスベクターが分裂細胞にしか導入できないのに対して、非分裂細胞にも遺伝子を直接導入できる。しかし、成人のほとんどは抗アデノウイルス抗体を持つ。また、アデノウイルスベクターの発現は一過性であるため複数回の投与が必要であり、治療開始時に患者に抗アデノウイルス抗体がなくても、投与を繰り返すことで抗アデノウイルス抗体ができる。そのために感染、遺伝子導入は著しく阻害され、ｐ５３遺伝子を組み込んだアデノウイルスベクターが中国では認可され使用されているが、十分治癒効果は得られていない。
【０００６】
一方、アデノウイルスの細胞溶解活性を利用して、腫瘍細胞のみを選択的に殺す組み替えウイルスが、癌遺伝子治療の新しい手法として開発された。これらは、腫瘍溶解性ウイルス、制限増殖型ウイルスなどと呼ばれ、アデノウイルスのＥ１領域のプロモーターを腫瘍細胞でのみ選択的に発現するプロモーターで置換して得られる。腫瘍選択的プロモーターとしては、テロメラーゼプロモーター、ミドカインプロモーター、ＩＡＩ３Ｂプロモーターなどが利用されてきた。
これらの腫瘍溶解性ウイルスにおいても、Ｅ３領域は必須ではないため、当初はＥ３領域を除去したものが作成され、試された。しかし、Ｓｕｚｕｋｉら（非特許文献１）によって、Ｅ３領域を残したアデノウイルスの方が高い腫瘍細胞溶解性を示すことが明らかになった。Ｅ３領域にはＡＤＰ（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ Ｄｅａｔｈ Ｐｒｏｔｅｉｎ）がコードされている。ＡＤＰの機能はすべて解明されたわけではないが、アデノウイルスの感染後期において、細胞融解とウイルスの細胞からの放出の効率を向上させることが報告（非特許文献２）されており、この機能がＥ３領域を持つ腫瘍溶解性ウイルスの高い効率と関連すると推測されている。
【０００７】
また、Ｅ３領域を除去した後に、ＡＤＰ遺伝子のみを再挿入した腫瘍溶解性アデノウイルスは、強い腫瘍増殖抑制能力を示したとの報告（非特許文献３）もあり、ＡＤＰが重要な役割を担っていることが考えられた。
また一方で、本発明者の一人でもある濱田らは、Ｅ３領域を持つ腫瘍溶解性ウイルスによって治癒されたマウスにおいては、抗アデノウイルス免疫だけでなく、抗腫瘍免疫が大きく活性化されていることを見いだした（非特許文献４）。このことは、腫瘍溶解性ウイルス治療における抗腫瘍効果が、必ずしもウイルス自体による殺細胞効果だけではなく、腫瘍溶解性ウイルスによって活性化されたＣＴＬによる効果である可能性を示唆している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
▲１▼Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．８，３３４８−３３５９，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ２００２，Ｋａｏｒｉ Ｓｕｚｕｋｉ，Ｒａｍｏ´ｎ Ａｌｅｍａｎｙ，
Ｍａｓａｔｏ Ｙａｍａｍｏｔｏ，ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｔ．Ｃｕｒｉｅｌ
▲２▼ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＶＩＲＯＬＯＧＹ，Ａｐｒ．１９９６，ｐ．２２９６−２３０６，ＡＮＮ Ｅ．ＴＯＬＬＥＦＳＯＮ，ＡＢＲＡＨＡＭ ＳＣＡＲＩＡ，ＴＥＲＲＹ Ｗ．ＨＥＲＭＩＳＴＯＮ，ＪＡＮ Ｓ．ＲＹＥＲＳＥ，ＬＯＲＡ Ｊ．ＷＯＬＤ，ＡＮＤ ＷＩＬＬＩＡＭ Ｓ．Ｍ．ＷＯＬＤ
▲３▼ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＶＩＲＯＬＯＧＹ，Ｊｕｌｙ ２０００，ｐ．６１４７−６１５５，ＫＯＮＳＴＡＮＴＩＮ ＤＯＲＯＮＩＮ，ＫＡＲＯＬＹ ＴＯＴＨ，ＭＯＨＡＮ ＫＵＰＰＵＳＷＡＭＹ，ＰＥＴＥＲ ＷＡＲＤ，ＡＮＮ Ｅ．ＴＯＬＬＥＦＳＯＮ，ＡＮＤ ＷＩＬＬＩＡＭ Ｓ．Ｍ，ＷＯＬＤ
▲４▼Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ｖｏｌ．１５ ｎｏ．６，１１２１−１１２８（２００７），Ｋａｔｓｕｙｕｋｉ Ｈａｍａｄａ，Ｊｕｎｚｏ Ｄｅｓａｋｉ，Ｋｏｕ Ｎａｋａｇａｗａ，Ｔｉｎｇ Ｚｈａｎｇ，Ｔｏｓｈｉｒｏ Ｓｈｉｒａｋａｗａ，Ａｋｉｎｏｂｕ Ｇｏｔｏｈ ａｎｄ Ｍａｓａｔｏｓｈｉ Ｔａｇａｗａ
▲５▼Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ３１（２０１０）２９１２−２９１８，Ｔｏｍｏｋｏ Ｉｔｏ，Ｃｈｉｅｋｏ Ｙｏｓｈｉｈａｒａ，Ｋａｔｓｕｙｕｋｉ Ｈａｍａｄａ，Ｙｏｓｈｉｙｕｋｉ Ｋｏｙａｍａ，
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
このような状況下、本発明者らは、腫瘍溶解性ウイルスによる抗腫瘍免疫活性化のメカニズムを詳細に検討した結果、感染した腫瘍細胞におけるＡＤＰの発現が、抗腫瘍免疫の成立に関わっている可能性を見いだした。
さらに我々は、上述の非ウイルス型遺伝子治療のためのツールとして、生体内で高発現するプラスミドＤＮＡのシステムを固有技術として持っている（非特許文献５）。そこで、ＡＤＰの遺伝子をコードしたプラスミドを構築し、そのイオン複合体からなる遺伝子導入システムを調製し、担癌モデルマウスに腫瘍局所内投与してみた。すると、最も抗腫瘍効果が高いといわれているサイトカインであるＧＭ−ＣＳＦの遺伝子をコードしたプラスミドを用いた比較例よりも、著しく高い抗腫瘍効果が確認された。
【００１０】
また、前述の腫瘍溶解性ウイルスによる抗腫瘍効果の発現には、ＧＭ−ＣＳＦＦの同時投与が有効であることを見いだしている（非特許文献５）。そこで、ＡＤＰの遺伝子をコードしたプラスミド複合体とＧＭ−ＣＳＦの遺伝子をコードしたプラスミド複合体を混合して担癌モデルマウスに腫瘍局所内投与したところ、ＡＤＰの遺伝子をコードしたプラスミド複合体単独よりもさらに高い抗腫瘍効果が認められた。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、
（１）ＡＤＰ（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ Ｄｅａｔｈ Ｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子又はＡＤＰ遺伝子とＧＭ−ＣＳＦ遺伝子の両者をコードしたベクター。
（２）ベクターがプラスミドベクターであることを特徴とする上記（１）記載のベクター。
（３）ＡＤＰ遺伝子又はＡＤＰ遺伝子とＧＭ−ＣＳＦ遺伝子の両者をコードしたベクターと遺伝子導入化試薬を含有する複合体。
（４）ベクターがプラスミドベクターであることを特徴とする上記（３）記載の複合体。
（５）遺伝子導入試薬が、カチオン性ポリマー、カチオン性脂質及びアニオン性ポリマーから選択される１以上の化合物からなることを特徴とする上記（３）又は（４）記載の複合体。
【００１２】
（６）遺伝子導入試薬が、カチオン性ポリマー又はカチオン性脂質と、アニオン性ポリマーからなることを特徴とする上記（５）記載の複合体。
（７）カチオン性ポリマーが、ポリエチレンイミン（直鎖状ポリエチレンイミン又はポリ分枝型エチレンイミン）、２−ジメチルアミノエチルメタクリレートの重合体又は共重合体、２−トリメチルアミノエイルメタクリレートの重合体又は共重合体、ポリアミドアミンデンドリマー、ポリリジンデンドリマー、プロタミン、ヒストン、ＨｅｌΔ１、ゼラチン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリアルギニン、ポリオルニチン、ポリビニルイミダゾール、側鎖にエチレンジアミン構造を有する高分子及びそれらの共重合体、またはそれらの塩から１つ以上選択される上記（５）又は（６）記載の複合体。
【００１３】
（８）カチオン性脂質が、ＤＣ−Ｃｈｏｌ（３β−（Ｎ−（Ｎ‘，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）カルバモイル）コレステロール、ＤＤＡＢ（Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド）、ＤＭＲＩ（Ｎ−（１，２−ジミリスチルオキシプパ−３−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド）、ＤＯＤＡＣ（Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド）、ＤＯＧＳ（ジヘプタデシルアミドグリシルスペルミジン）、ＤＯＳＰＡ（Ｎ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ−（２−（スペルミンカルボキサミド）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムトリフルオロアセタート）、ＤＯＴＡＰ（Ｎ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド）及びＤＯＴＭＡ（Ｎ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ、Ｎ、Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド）およびそれらの異なる酸との塩から１つ以上選択される上記（５）又は（６）記載の複合体。
【００１４】
（９）アニオン性ポリマーが、カルボキシル側鎖を持つＰＥＧ誘導体、アクリル酸又はメタクリル酸の重合体若しくは共重合体、ポリビニルアルコールの硫酸エステル体、サクシニミジル化ポリ−Ｌ−リジン、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、ヒアルロン酸、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパリン、デルタマン硫酸又はそれらの誘導体、及びそれらの塩から１つ以上選択される上記（５）又は（６）記載の複合体。
（１０）凍結乾燥処理を施した上記（３）から（９）いずれか記載の複合体。
（１１）ＡＤＰ遺伝子又はＡＤＰ遺伝子とＧＭ−ＣＳＦ遺伝子の両者をコードしたベクターを含有する医薬。
（１２）ベクターがプラスミドベクターであることを特徴とする上記（１１）記載の医薬。
（１３）ＡＤＰ遺伝子又はＡＤＰ遺伝子とＧＭ−ＣＳＦ遺伝子の両者をコードしたベクターと遺伝子導入化試薬を含有する医薬。
（１４）ベクターがプラスミドベクターであることを特徴とする上記（１３）記載の医薬。
【００１５】
（１５）遺伝子導入試薬が、カチオン性ポリマー、カチオン性脂質及びアニオン性ポリマーから選択される１以上の化合物からなることを特徴とする上記（１３）又は（１４）記載の医薬。
（１６）遺伝子導入試薬が、カチオン性ポリマー又はカチオン性脂質と、アニオン性ポリマーからなることを特徴とする上記（１５）記載の医薬。
（１７）カチオン性ポリマーが、ポリエチレンイミン（直鎖状ポリエチレンイミン又はポリ分枝型エチレンイミン）、２−ジメチルアミノエチルメタクリレートの重合体又は共重合体、２−トリメチルアミノエイルメタクリレートの重合体又は共重合体、ポリアミドアミンデンドリマー、ポリリジンデンドリマー、プロタミン、ヒストン、ＨｅｌΔ１、ゼラチン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリアルギニン、ポリオルニチン、ポリビニルイミダゾール、側鎖にエチレンジアミン構造を有する高分子及びそれらの共重合体、またはそれらの塩から１つ以上選択される上記（１５）又は（１６）記載の医薬。
【００１６】
（１８）カチオン性脂質が、ＤＣ−Ｃｈｏｌ（３β−（Ｎ−（Ｎ‘，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）カルバモイル）コレステロール、ＤＤＡＢ（Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド）、ＤＭＲＩ（Ｎ−（１，２−ジミリスチルオキシプパ−３−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド）、ＤＯＤＡＣ（Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド）、ＤＯＧＳ（ジヘプタデシルアミドグリシルスペルミジン）、ＤＯＳＰＡ（Ｎ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ−（２−（スペルミンカルボキサミド）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムトリフルオロアセタート）、ＤＯＴＡＰ（Ｎ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド）及びＤＯＴＭＡ（Ｎ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ、Ｎ、Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド）およびそれらの異なる酸との塩から１つ以上選択される上記（１５）又は（１６）記載の医薬。
【００１７】
（１９）アニオン性ポリマーが、カルボキシル側鎖を持つＰＥＧ誘導体、アクリル酸又はメタクリル酸の重合体若しくは共重合体、ポリビニルアルコールの硫酸エステル体、サクシニミジル化ポリ−Ｌ−リジン、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、ヒアルロン酸、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパリン、デルタマン硫酸又はそれらの誘導体、及びそれらの塩から１つ以上選択される上記（１５）又は（１６）記載の医薬。
（２０）凍結乾燥処理を施した上記（１３）から（１９）いずれか記載の医薬。
（２１）ＡＤＰ遺伝子又はＡＤＰ遺伝子とＧＭ−ＣＳＦ遺伝子の両者をコードしたベクターを有効量投与すること特徴とする癌の治療方法。
（２２）ベクターがプラスミドベクターであることを特徴とする上記（２１）記載の癌の治療方法。
【００１８】
（２３）ＡＤＰ遺伝子又はＡＤＰ遺伝子とＧＭ−ＣＳＦ遺伝子の両者をコードしたベクターと遺伝子導入化試薬を含有する複合体を有効量投与すること特徴とする癌の治療方法。
（２４）ベクターがプラスミドベクターであることを特徴とする上記（２３）記載の癌の治療方法。
（２５）遺伝子導入試薬が、カチオン性ポリマー、カチオン性脂質及びアニオン性ポリマーから選択される１以上の化合物からなることを特徴とする上記（２３）又は（２４）記載の癌の治療方法。
（２６）遺伝子導入試薬が、カチオン性ポリマー又はカチオン性脂質と、アニオン性ポリマーからなることを特徴とする上記（２５）記載の癌の治療方法。
（２７）カチオン性ポリマーが、ポリエチレンイミン（直鎖状ポリエチレンイミン又はポリ分枝型エチレンイミン）、２−ジメチルアミノエチルメタクリレートの重合体又は共重合体、２−トリメチルアミノエイルメタクリレートの重合体又は共重合体、ポリアミドアミンデンドリマー、ポリリジンデンドリマー、プロタミン、ヒストン、ＨｅｌΔ１、ゼラチン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリアルギニン、ポリオルニチン、ポリビニルイミダゾール、側鎖にエチレンジアミン構造を有する高分子及びそれらの共重合体、またはそれらの塩から１つ以上選択される上記（２５）又は（２６）記載の癌の治療方法。
【００１９】
（２８）カチオン性脂質が、ＤＣ−Ｃｈｏｌ（３β−（Ｎ−（Ｎ‘，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）カルバモイル）コレステロール、ＤＤＡＢ（Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド）、ＤＭＲＩ（Ｎ−（１，２−ジミリスチルオキシプパ−３−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド）、ＤＯＤＡＣ（Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド）、ＤＯＧＳ（ジヘプタデシルアミドグリシルスペルミジン）、ＤＯＳＰＡ（Ｎ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ−（２−（スペルミンカルボキサミド）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムトリフルオロアセタート）、ＤＯＴＡＰ（Ｎ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド）及びＤＯＴＭＡ（Ｎ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ、Ｎ、Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド）およびそれらの異なる酸との塩から１つ以上選択される上記（２５）又は（２６）記載の癌の治療方法。
【００２０】
（２９）アニオン性ポリマーが、カルボキシル側鎖を持つＰＥＧ誘導体、アクリル酸又はメタクリル酸の重合体若しくは共重合体、ポリビニルアルコールの硫酸エステル体、サクシニミジル化ポリ−Ｌ−リジン、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、ヒアルロン酸、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパリン、デルタマン硫酸又はそれらの誘導体、及びそれらの塩から１つ以上選択される上記（２５）又は（２６）記載の癌の治療方法。
（３０）凍結乾燥処理を施した上記（２３）から（２９）いずれか記載の癌の治療方法。
に関する。
【発明の効果】
【００２１】
本発明のＡＤＰ遺伝子をコードしたベクター又はＡＤＰ遺伝子とＧＭ−ＣＳＦ遺伝子の両者をコードしたベクター、及びこれらベクターと遺伝子導入試薬との複合体は、ＡＤＰ遺伝子やＧＭ−ＣＳＦ遺伝子を効率よく細胞に導入可能で、医薬分野、特に、癌の治療に有効である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本発明において、ＡＤＰ遺伝子とは、ＡＤＰをコードするアデノウイルスＥ３−１１．６Ｋタンパクの遺伝子（Ａｄ５型では１１．６ｋではなく１０．５ｋであるが、発見者らによってこのように呼ばれている。）のほか、その一部を欠失したものや、一部を置換したのもなど、ＡＤＰが有する機能を発揮するタンパク又はペプチドをコードする遺伝子を意味する。また、ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子とは、ＧＭ−ＣＳＦをコードする遺伝子のほか、その一部を欠失したのもや、一部を置換したものなど、ＧＭ−ＣＳＦが有する機能を発揮するタンパク又はペプチドをコードする遺伝子を意味し、ヒトＧＭ−ＣＳＦや犬猫等の動物用ＧＭ−ＣＳＦも意味する。
さらに、ＡＤＰ遺伝子とＧＭ−ＣＳＦ遺伝子の両者をコードする場合、たとえばＡＤＰ遺伝子発現カセットとＧＭ−ＣＳＦ遺伝子発現カセットをベクターにタンデムに挿入したものなどを使用することができる。
また、ＡＤＰのプラスミドとＧＭ−ＣＳＦのプラスミドの両者を含む複合体、またはそれぞれの複合体を混合して用いてもよい。
【００２３】
また、本発明において、ベクターとは、遺伝子組み換え技術で用いられる、組み換えＤＮＡを増幅、維持、導入させる核酸分子を意味し、通常使用される、ｐＣＭＶ、ｐｃＤＮＡ、ｐＡＣＴ等のプラスミドベクター；コスミドベクター；ＰＡＣベクター、ＹＡＣベクター、ＢＡＣベクター等の人工染色体ベクターなど、通常、当該分野で使用されるベクターを意味する。
さらに、本発明において、遺伝子導入試薬とは、通常使用されている、遺伝子を導入する目的で使用される試薬、たとえば、カチオン性ポリマー、カチオン性脂質、アニオン性ポリマーなどを意味し、また、これらを組み合わせたものも意味する。
本発明の複合体中で遺伝子をコードしたベクター（以後、「核酸等」と記載する）は、カチオン性ポリマー又はカチオン性脂質若しくはそれを含む集合体とイオン結合による複合体を形成しており、アニオン性ポリマーを加えた場合は、アニオン性ポリマーはカチオン性ポリマー又はカチオン性脂質とイオン結合している。これらは、混合比、混合順序等によっては、主にアニオン性ポリマーで覆われた複合体を形成することができる。
【００２４】
本発明の複合体に用いることができるカチオン性ポリマーとしては、正に荷電された分子量が１０００〜３００万程度の天然由来又は合成高分子であって、水中でＤＮＡと複合体を形成できる官能基を１分子中に複数、好ましくは５個以上有する高分子を使用することができ、このような官能基としては、例えば置換されていてもよいアミノ基若しくはアンモニウム基又はその塩（これらの基は、例えば炭素数１〜６のアルキル基、フェニル基などで単又は多置換されていてもよい）、イミノ基、イミダゾリル基、グアニジノ基などの有機アミノ基を挙げることができる。このようなカチオン性ポリマーとしては、例えば、正に荷電された蛋白質やポリペプチド；正に荷電されたデンドリマー；正に荷電された合成ポリマー；及び正に荷電された多糖類誘導体、又はそれらのグラフト、あるいはブロック共重合体およびそれらの塩、並びにそれらの組み合わせが挙げられる。
【００２５】
本発明の複合体にカチオン性ポリマーとして用いることができる正に荷電された蛋白質、正に荷電されたポリペプチドの分子量は、好ましくは１０００〜５０万程度である。このような蛋白質、ポリペプチドとしては、具体的にはプロタミン、ヒストン、ＨｅｌΔ１、ゼラチンなどのタンパク質及びポリペプチドを例示することができ、また、正に荷電されたアミノ酸残基を含むポリアミノ酸もまた例示することができる。このような正に荷電されたアミノ酸残基を含むポリアミノ酸としては、具体的にはポリ−Ｌ−リジン、ポリアルギニン、ポリオルニチンなどを例示することができる。これらの蛋白質、及びポリペプチドの塩としては、塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩、ホウ酸塩などを例示することができる。
カチオン性ポリマーとして用いることができる上記のような官能基を有する正に荷電されたデンドリマーとは、分岐した分子鎖の末端または内部に、置換されていてもよいアミノ基若しくはアンモニウム基又はその塩（これらの基は、例えば炭素数１〜６のアルキル基、フェニル基などで単又は多置換されていてもよい）を有するデンドリマーであり、その分子量は、好ましくは１０００〜５０万程度である。デンドリマーとしては、具体的にはポリアミドアミンデンドリマー、ポリリジンデンドリマーなどを例示することができる。また、デンドリマーの塩としては、塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩、ホウ酸塩などを例示することができる。
【００２６】
カチオン性ポリマーとして用いることができる正に荷電された合成ポリマーは、上記のような、水中でＤＮＡと複合体を形成できる官能基を１分子中に複数、好ましくは５個以上有する合成ポリマーであって、分子量が好ましくは１０００〜３００万である合成ポリマーである。合成ポリマーとしては具体的には、ポリエチレンイミン（直鎖状ポリエチレンイミン、又はポリ分岐型エチレンイミンを含む）、２−ジメチルアミノエチルメタクリレートの重合体又は共重合体、２−トリメチルアミノエチルメタクリレートの重合体又は共重合体、ポリビニルイミダゾール、側鎖にエチレンジアミン構造を有する高分子及びそれらの共重合体、またはそれらの塩などを例示することができる。合成ポリマーの一例であるポリエチレンイミンの分子量は、好ましくは１０００〜５０万程度であり、より好ましくは５０００〜２０万程度であり、もっとも好ましくは１万〜１０万程度である。あるいは、より短いポリエチレンイミンを結合して得られるブロック共重合体である。また、ポリエチレンイミンの塩として、塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩、ホウ酸塩などを例示することができる。
【００２７】
カチオン性ポリマーとして用いることができる正に荷電された多糖類誘導体は、水中でＤＮＡと複合体を形成できる官能基を１分子中に複数、好ましくは５個以上有する、分子量が、好ましくは１０００〜３００万であり、より好ましくは５０００〜５０万である多糖類誘導体である。このような多糖類としては、具体的にはキトサン、上記のような官能基を導入したデキストラン誘導体などを例示することができる。これらのうちキトサンの分子量は、好ましくは１０００〜５０万程度であり、より好ましくは５０００〜２０万程度であり、もっとも好ましくは１万〜１０万程度である。キトサンの塩としては、塩酸塩、酢酸塩などを例示することができる。また、デキストラン誘導体の分子量は、好ましくは３０００〜１００万である。このようなデキストラン誘導体としては、具体的にはジエチルアミノエチル−デキストランなどを例示することができる。
【００２８】
上記のカチオン性ポリマーは、従来正に荷電していないものにアミノ基などの官能基を導入し、正に荷電するようにしたものでも良い。また、通常は正に荷電されていないものであっても、複合体形成時に正に荷電されるものであれば使用可能であり、また、必要により糖鎖、オリゴペプチド、抗体などで更に修飾されていてもよい。
【００２９】
本発明の複合体に用いることができるカチオン性脂質（カチオン性コレステロール誘導体を含む）としては、ＤＣ−Ｃｈｏｌ（３β−（Ｎ−（Ｎ′，Ｎ′−ジメチルアミノエタン）カルバモイル）コレステロール）、ＤＤＡＢ（Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド）、ＤＭＲＩ（Ｎ−（１，２−ジミリスチルオキシプロパ−３−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド）、ＤＯＤＡＣ（Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド）、ＤＯＧＳ（ジヘプタデシルアミドグリシルスペルミジン）、ＤＯＳＰＡ（Ｎ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ−（２−（スペルミンカルボキサミド）エチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムトリフルオロアセタート）、ＤＯＴＡＰ（Ｎ−（１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド）、又はＤＯＴＭＡ（Ｎ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド）、およびそれらの異なる酸との塩、並びにそれらの組み合わせが挙げられる。
【００３０】
また、カチオン性脂質を含む集合体としては、上記カチオン性脂質（たとえばＤＯＳＰＡ）と、例えばＤＯＰＥ（ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン）、コレステロールなどの中性物質を混合したものを使用することができる。例えばカチオン性脂質を含む集合体としては、リポフェクタミン（上記ＤＯＳＰＡとＤＯＰＥの３：１ｗ／ｗ混合体リポソーム）、リポフェクチン（上記ＤＯＴＭＡとＤＯＰＥの１：１ｗ／ｗ混合体リポソーム）、またはこれらの混合物などを好ましく挙げることができる。また、ポドプラニン、ポドカリキシン、キタラン硫酸、ガングリオシド、ポドプラニン−ＣＬＥＣ−２受容体（Ｃ型レクチン様受容体，Ｃ−ｔｙｐｅ ｌｅｃｔｉｎ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−２）、ＭＵＣ、あるいは腫瘍細胞特異的な各種糖タンパクに対する抗体等、あるいは抗体医薬である リツキシマブ（抗ＣＤ２０抗体）、トラスツマブ（ハーセプチン）などの抗ＨＥＲ−２抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、オムニターグなどを結合したカチオン性ポリマーを使用し、標的指向性を付与することができる。
【００３１】
本発明の複合体においては、カチオン性ポリマーとしては、ポリエチレンイミン；プロタミン；ＨｅｌΔ１；ポリアミドアミンデンドリマー、ポリリジンデンドリマーなどのデンドリマー；キトサン；２−ジメチルアミノエチルメタクリレートの重合体又は共重合体；２−トリメチルアミノエチルメタクリレートの重合体又は共重合体などを好ましく用いることができ、ポリエチレンイミン、ポリアミドアミンデンドリマー、ポリリジンデンドリマー、キトサンを特に好ましく用いることができる。また、カチオン性脂質若しくはそれを含む集合体としては、リポフェクタミン（上記ＤＯＳＰＡとＤＯＰＥの３：１ｗ／ｗ混合体リポソーム）を好ましくは用いることができる。
【００３２】
本発明の複合体において使用するアニオン性ポリマーとしては、分子中にアニオン性基を含む、負に荷電された、分子量が５００〜４００万程度の天然由来又は合成高分子であって、水中でポリカチオンと複合体を形成できる官能基を１分子中に複数、好ましくは５個以上有する高分子を使用することができ、このような官能基としては、例えばカルボキシル基、−ＯＳＯ３Ｈ基、−ＳＯ３Ｈ基、リン酸基、及びこれらの塩を挙げることができる。このようなアニオン性ポリマーとしては、両イオン性ポリマーも含まれる。
【００３３】
本発明の複合体においては、アニオン性ポリマーとしては、カルボキシル基、−ＯＳＯ３Ｈ基、−ＳＯ３Ｈ基、リン酸基、及びこれらの塩から選択される官能基を有する多糖類又はその誘導体；負に荷電した側鎖を有するアミノ酸残基を含むポリアミノ酸；カルボキシル側鎖を持つＰＥＧ誘導体；カルボキシル基、−ＯＳＯ３Ｈ基、−ＳＯ３Ｈ基、リン酸基、及びこれらの塩から選択される官能基を有する合成高分子；カルボキシル基、−ＯＳＯ３Ｈ基、−ＳＯ３Ｈ基、リン酸基、及びこれらの塩から選択される官能基、並びに置換されていてもよいアミノ基若しくはアンモニウム基又はその塩（これらの基は、例えば炭素数１〜６のアルキル基、フェニル基などで単又は多置換されていてもよい）を有する高分子；並びにそれらの組み合わせを用いることができる。
【００３４】
本発明の複合体においてアニオン性ポリマーとして用いることができる上記のような官能基を有する多糖類又はその誘導体としては、好ましくはグルコサミノグリカンを用いることができる。このようなグルコサミノグリカンの分子量は、好ましくは１０００〜４００万、より好ましくは４０００〜３００万である。このようなグルコサミノグリカンとして、具体的には例えばヒアルロン酸、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパリン、デルマタン硫酸などを例示することができる。なかでもヒアルロン酸を好ましく用いることができる。ヒアルロン酸は、その塩又は負に荷電した誘導体としても用いることができる。その分子量は、５，０００以上であればよいが、１０，０００以上が好ましく、１０万〜３００万がより好ましい。ヒアルロン酸の塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩などを例示することができる。また、ヒアルロン酸の誘導体としては、例えば、ヒアルロン酸にポリエチレングリコール、ペプチド、糖、蛋白質、ヨウ酸、抗体又はその一部などを導入することによって得られるものが挙げられ、スペルミン、スペルミジン等を導入し、プラスに荷電した部分を持つ両イオン性の誘導体も含まれる。
【００３５】
本発明の複合体においてアニオン性ポリマーとして用いることができる、負に荷電した側鎖を有するアミノ酸残基を含むポリアミノ酸とは、カルボキシル基、−Ｏ−ＳＯ３Ｈ基、−ＳＯ３Ｈ基、リン酸基、及びこれらの塩などの基を側鎖として有するアミノ酸残基を含む、好ましくは５００〜１００万の分子量を有するポリアミノ酸である。このようなポリアミノ酸としては、具体的にはポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸などを例示することができる。
【００３６】
本発明の複合体においてアニオン性ポリマーとして用いることができるカルボキシル側鎖を持つＰＥＧ誘導体とは、ＰＥＧ１分子当たりカルボキシル側鎖を複数、好ましくは５個以上有する、５００以上、好ましくは２０００以上、より好ましくは４０００〜４００００の分子量を有するＰＥＧ誘導体である。カルボキシル側鎖を持つＰＥＧ誘導体は、その塩又は負に荷電した誘導体としても用いることができる。これらの塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩などを例示することができる。このようなＰＥＧ誘導体としては、具体的にはＪ．Ｂｉｏｍａｔｅｒ．Ｓｃｉ．Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｅｄｎ．Ｖｏｌ．１４，ｐｐ ５１５−５３１（２００３）などに記載されたＰＥＧ誘導体を例示することができる。
【００３７】
本発明の複合体においてアニオン性ポリマーとして用いることができるカルボキシル基、−ＯＳＯ３Ｈ基、−ＳＯ３Ｈ基、リン酸基、及びこれらの塩から選択される官能基を有する合成高分子とは、１分子当たり複数、好ましくは５個以上の、カルボキシル基、−Ｏ−ＳＯ３Ｈ基、−ＳＯ３Ｈ基、リン酸基、及びこれらの塩から選択される官能基を有する重合体又は共重合体であって、好ましくは５００〜４００万の分子量を有する重合体又は共重合体である。このような重合体又は共重合体としては、具体的には分子量１０００〜３００万のアクリル酸又はメタクリル酸の重合体又は共重合体、あるいはポリビニルアルコールの硫酸エステル体、サクシニミジル化ポリ−Ｌ−リジンなどを例示することができる。
【００３８】
本発明の複合体においてアニオン性ポリマーとして用いることができるカルボキシル基、−ＯＳＯ３Ｈ基、−ＳＯ３Ｈ基、リン酸基、及びこれらの塩から選択される官能基、並びに置換されていてもよいアミノ基若しくはアンモニウム基又はその塩（これらの基は、例えば炭素数１〜６のアルキル基、フェニル基などで単又は多置換されていてもよい）を有する高分子とは、１分子当たりカルボキシル基、−ＯＳＯ３Ｈ基、−ＳＯ３Ｈ基、リン酸基、及びこれらの塩から選択される官能基を複数、好ましくは５個以上、並びに上記のように置換されていてもよいアミノ基若しくはアンモニウム基又はその塩を有する、５００以上、好ましくは２０００以上、より好ましくは４０００〜４００００の分子量を有する高分子である。このような高分子としては、好ましくは、カルボキシル側鎖とその当量以下の上記のアミノ基若しくはアンモニウム基又はその塩を持つＰＥＧ誘導体を挙げることができ、具体的にはＭａｃｒｏｍｏｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｖｏｌ．２，ｐｐ ２５１−２５６（２００２）などに記載されている方法で調製することができるＰＥＧ誘導体を例示することができる。
【００３９】
本発明の複合体において用いることができるアニオン性ポリマーは、従来負に荷電していないものにカルボキシル基などの官能基を導入し、負に荷電するようにしたものでも良い。通常は負に荷電されていないものであっても、複合体形成時に負に荷電されるものであれば使用可能であり、また必要により糖鎖、オリゴペプチド、抗体などで更に修飾されていてもよい。
【００４０】
本発明の複合体においては、アニオン性ポリマーとしては、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、カルボキシル側鎖を持つＰＥＧ誘導体、ポリアクリル酸などのアニオン性ポリマー又はそれらの塩を好ましく用いることができ、ヒアルロン酸、カルボキシル側鎖を持つＰＥＧ誘導体又はそれらの塩などを特に好ましく用いることができる。
【００４１】
また、アニオン性ポリマーとして、遺伝子導入の標的細胞に対して特異的接着能を有するものを用いることにより、標的細胞に対して特異的に遺伝子導入をすることが可能である。例えばアニオン性ポリマーとしてヒアルロン酸を用いる場合、ヒアルロン酸と特異的に結合するＣＤ４４などの細胞表面分子を有する細胞を標的とすることができる。また、ＲＧＤペプチドを導入したアニオン性ポリマーを用いることにより、多くの種類の腫瘍細胞を標的とすることができ、またガラクトース側鎖を導入したアニオン性ポリマーを用いることにより肝細胞又は肝由来の細胞を標的とすることができる。また、ポドプラニン、ポドカリキシン、キタラン硫酸、ガングリオシド、ポドブラニン−ＣＬＥＣ−２受容体（Ｃ型レクチン様受容体，Ｃ−ｔｙｐｅ ｌｅｃｔｉｎ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−２）、ＭＵＣ、あるいは腫瘍細胞特異的な各種糖タンパクに対する抗体等、あるいは抗体医薬であるリツキシマブ（抗ＣＤ２０抗体）、トラスツマブ（ハーセプチン）などの抗ＨＥＲ−２抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、オムニターグなどを結合したアニオン性ポリマーを使用し、標的指向性を付与することができる。
【００４２】
本発明の複合体において、カチオン性ポリマー又はカチオン性脂質若しくはそれを含む集合体と、アニオン性ポリマーの組み合わせとしては、ポリエチレンイミンとヒアルロン酸；ポリエチレンイミンとコンドロイチン硫酸；ポリエチレンイミンとカルボキシル側鎖を持つＰＥＧ誘導体；ＤＯＳＰＡを含む集合体（例えばリポフェクタミン（ＤＯＳＰＡとＤＯＰＥの３：１ｗ／ｗ混合体リポソーム））とヒアルロン酸；ＤＯＳＰＡを含む集合体（例えばリポフェクタミン）とカルボキシル側鎖を持つＰＥＧ誘導体を好ましく挙げることができる。
【００４３】
本発明の複合体において使用する核酸等と、カチオン性ポリマー又はカチオン性脂質若しくはそれを含む集合体の各荷電基のモル比（負電荷：正電荷比）は、標的細胞・核酸等・カチオン性ポリマー等の種類により異なるが、１：０．８〜１：１００であるとよく、好ましくは１：１〜１：５０であり、より好ましくは１：１．２〜１：３０である。ここでいう核酸等と、カチオン性ポリマー又はカチオン性脂質若しくはそれを含む集合体の配合比とは、各荷電基のモル比であり、具体的には核酸、オリゴ核酸、又はその誘導体のリン酸アニオンによる負電荷：カチオン性ポリマー又はカチオン性脂質若しくはそれを含む集合体の正電荷又は正に帯電できる官能基のモル比を指す。
【００４４】
本発明の複合体において使用する核酸等と、アニオン性ポリマーの各荷電基のモル比（負電荷：負電荷比）は、標的細胞・核酸等・アニオン性ポリマーの種類により異なるが、１：０．２〜１：１０００であるとよく、好ましくは１：０．２〜１：１００であり、より好ましくは１：１〜１：６０である。ここでいう核酸等と、アニオン性ポリマーの配合比とは、各荷電基のモル比であり、具体的には核酸、オリゴ核酸、又はその誘導体のリン酸アニオンによる負電荷：アニオン性ポリマーの負電荷又は負に帯電できる官能基のモル比を指す。
【００４５】
例えばアニオン性ポリマーとしてヒアルロン酸やコンドロイチン硫酸を用いる場合、核酸等とヒアルロン酸やコンドロイチン硫酸との配合比は、１：０．２〜１：１０００であるとよく、好ましくは１：０．２〜１：１００であり、より好ましくは１：１〜１：６０である。
【００４６】
例えばアニオン性ポリマーとしてカルボキシル側鎖を持つＰＥＧ誘導体を用いる場合、核酸等とカルボキシル側鎖を持つＰＥＧ誘導体との配合比は、１：０．２〜１：１０００であるとよく、好ましくは１：０．２〜１：１００であり、より好ましくは１：１〜１：６０である。
【００４７】
特に、カチオン性ポリマーとしてポリエチレンイミンを、アニオン性ポリマーとしてヒアルロン酸やコンドロイチン硫酸を用いる場合、核酸等：ポリエチレンイミン：ヒアルロン酸（又はコンドロイチン硫酸）配合比は、１：２〜６０：１〜２４０、好ましくは１：４〜２４：１〜１６０であり、より好ましくは１：５〜２０：２〜６０、特に好ましくは１：６〜１４：２〜３２である。
【００４８】
特に、カチオン性ポリマーとしてポリエチレンイミンを、アニオン性ポリマーとしてカルボキシル側鎖を持つＰＥＧ誘導体を用いる場合、核酸等：ポリエチレンイミン：カルボキシル側鎖を持つＰＥＧ誘導体配合比は、１：２〜６０：１〜２４０、好ましくは１：４〜２４：２〜１６０であり、より好ましくは１：５〜２０：２〜６０、特に好ましくは１：６〜１８：４〜４２である。
【００４９】
特に、カチオン性脂質を含む集合体としてリポフェクタミン（ＤＯＳＰＡとＤＯＰＥの３：１ｗ／ｗ混合体リポソーム）を、アニオン性ポリマーとしてヒアルロン酸やコンドロイチン硫酸を用いる場合、核酸等：リポフェクタミン：ヒアルロン酸（又はコンドロイチン硫酸）配合比は、１：１〜５０：０．２〜２４０、好ましくは１：１．２〜４８：０．２〜１６０であり、より好ましくは１：１．５〜３０：０．５〜６０、特に好ましくは１：１．８〜１６：１〜３２である。
【００５０】
特に、カチオン性脂質を含む集合体としてリポフェクタミンを、アニオン性ポリマーとしてカルボキシル側鎖を持つＰＥＧ誘導体を用いる場合、核酸等：リポフェクタミン：カルボキシル側鎖を持つＰＥＧ誘導体配合比は、１：１〜５０：０．１〜１６０、好ましくは１：１．２〜４８：０．２〜１６０であり、より好ましくは１：１．５〜３０：０．５〜６０特に好ましくは１：１．８〜１６：２〜３２である。
【００５１】
本発明の複合体に含まれる核酸等；カチオン性ポリマー又はカチオン性脂質若しくはそれを含む集合体；及びアニオン性ポリマーの好ましい配合比は、上述のとおりであるが、核酸などを導入する細胞の数や種類により最適な条件は変動するため、配合比は、当業者が、用いる細胞、核酸等の種類に応じて、適宜決定することができる。
【００５２】
本発明の複合体は、上述した核酸等；カチオン性ポリマー又はカチオン性脂質若しくはそれを含む集合体；及び必要であればアニオン性ポリマーを、上述した配合比で、混合することによって複合体を形成させる工程、必要ならばこれに次いでこれを凍結乾燥する工程によって調製することができる。混合する順序としては、［１］核酸等；［２］カチオン性ポリマー又はカチオン性脂質若しくはそれを含む集合体、［３］アニオン性ポリマーの順、又は、［１］核酸等；［２］アニオン性ポリマー、［３］カチオン性ポリマー又はカチオン性脂質若しくはそれを含む集合体の順が好ましい。核酸等は、カチオン性ポリマー又はカチオン性脂質若しくはそれを含む集合体とイオン結合によって結合し、さらにカチオン性ポリマー又はカチオン性脂質若しくはそれを含む集合体が、アニオン性ポリマーともイオン結合した複合体が形成される。あるいは、各成分の配合組成によっては、このような複合体構造の外殻を主にアニオン性ポリマーが被覆し、負の表面電位を有する態様が形成される
【００５３】
次いで、必要であれば得られた複合体を凍結乾燥する。凍結乾燥は、通常の凍結乾燥条件下で行うことができ、例えば減圧下（好ましくは、５〜１００ｍｍＨｇ、より好ましくは１０ｍｍＨｇ）、外気温−７８℃〜６０℃、好ましくは−３０℃〜４０℃で乾燥することによって行うことができる。乾燥に要する時間は、減圧度、溶媒の量によって異なり、通常は１時間〜２日間で完了する。
【００５４】
このようにして調製した本発明の複合体は、ヒトや動物に対する各種の遺伝子治療、免疫治療、あるいはＡＤＰ遺伝子やＧＭ−ＣＳＦ遺伝子を導入した実験動物や細胞の作成に利用することができる。凍結乾燥を施した場合には、使用前に本発明の複合体を水、生理食塩水、緩衝液、ブドウ糖溶液、培地液などの溶媒に懸濁又は溶解することにより再水和物としてから用いることができる。再水和に際しては、凍結乾燥体を、例えば核酸、又はその誘導体の１００〜１００００倍（重量比）の溶媒を用いて懸濁又は稀釈する。凍結乾燥前と異なる量、異なる種類の溶媒を用いることができるため、従来困難であった比較的高濃度の懸濁液や溶液（たとえば１ｍｌ中にＤＮＡを１ｍｇ含む液）も容易に調製することができる。
【００５５】
このようにして再水和した本発明の複合体は、細胞への核酸等の導入に際しては、具体的には、例えば、ウェル中、体外に取り出した標的細胞を、水和した本発明の複合体で処理することにより遺伝子を導入した後、該細胞を生体内に戻して、目的とする遺伝子を発現させるｅｘ ｖｉｖｏ法（ワクチン療法）、あるいは、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｓｉｔｕ法などの直接的な遺伝子導入法など、生体細胞への核酸、又はその誘導体の導入に通常用いられる任意の方法を用いることができる。
また、本発明の複合体は、凍結乾燥後、再水和することなく、そのまま核酸等の導入を行う細胞と接触させたり、核酸等の導入を行う動物に皮下移殖する、核酸等の導入の標的である組織内、組織表面、または近傍に移殖するなどの手段によって投与することもできる。
【００５６】
本発明の複合体の細胞への適用量は、上述した導入方法、疾患の種類などによって異なるが、例えば核酸、又はその誘導体の量にして、ｅｘ ｖｉｖｏ法、ｉｎ ｓｉｔｕ法では、直径１〜２ｃｍのウェル当たりで０．２〜１０μｇ／１０４〜７個・細胞、ｉｎ ｖｉｖｏ法では、投与部位によって大きく異なるが、腫瘍内への局所投与では例えば５〜１０００μｇ／ｃｍ３・腫瘍、膀胱などの臓器への投与では例えば０．１μｇ〜１００ｍｇ／臓器、全身投与では例えば０．１ｎｇ〜１０ｍｇ／Ｋｇ・体重とすることができる。
【００５７】
生体に直接投与するｉｎ ｖｉｖｏ法としては、本発明の複合体、または水和させた本発明の凍結乾燥体水和物を、静脈、皮下又は筋肉、腹腔、腫瘍内、腫瘍近傍などへ注射し；鼻腔、口腔、肺などから吸入させ；膀胱内、直腸内に直接注入し；病変部組織ないし近傍の血管内に直接投与し；あるいは、ゲル状物、スポンジなどの多孔体、不織布などに担持させて留置するなど、遺伝子治療技術の如何なる方法も用いることができる。
また、本発明の凍結乾燥体水和物を再水和することなく用いる際においても、上記の量の凍結乾燥体を、上述したようなｅｘ ｖｉｖｏ法、ｉｎ ｓｉｔｕ法、またはｉｎ ｖｉｖｏ法により、用いることができる。
【００５８】
本発明の複合体においては、通常の核酸等と、カチオン性ポリマー又はカチオン性脂質若しくはそれを含む集合体との複合体が持つ正の荷電を、アニオン性ポリマーが中和すると共に、その中和作用が、生体、細胞への投与後においても保持されていることによって、複合体と、血清タンパク質、血球細胞、細胞外マトリックスなどとによる凝集等の相互作用が阻止され、また、核酸、オリゴ核酸、又はその誘導体等の酵素分解が阻止されるため、核酸が細胞に効率的に取り込まれ、その発現効率も高い。
上記より、本発明の複合体は、核酸、又はその誘導体の導入用製剤又は試薬として、あるいは核酸、又はその誘導体の導入用キットとして使用することができる。
【００５９】
本発明に使用するプラスミドまたはその誘導体のＧＭ−ＣＳＦ遺伝子は、対象とする動物種によって、ヒトＧＭ−ＣＳＦ、ネコＧＭ−ＣＳＦ、イヌＧＭ−ＣＳＦなどから、効果のあるものを自由に選ぶことが出来る。
【００６０】
本発明に使用するプラスミドまたはその誘導体のプロモーターは、対象とする動物種、細胞種によって、サイトメガウイルス由来プロモーター、ＲＳＶ（Ｒｏｕｓ Ｓａｒｃｏｍａ ｖｉｒｕｓ，ラウス肉腫ウイルス）由来プロモーター、ＳＶ４０（ｓｉｍｉａｎ ｖｉｒｕｓ４０（シミアンウイルス））由来プロモーター、Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ １ａ プロモーター等の癌選択性プロモーターなどから、自由に選ぶことが出来る。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】 ＡＤＰの遺伝子をコードしたプラスミド／ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）／コンドロイチン硫酸（ＣＳ）複合体の腫瘍局所内注射による皮下移植Ｂ１６細胞に対する治癒効果
【図２】ＡＤＰの遺伝子をコードしたプラスミド複合体にマウスＧＭ−ＣＳＦの遺伝子をコードしたプラスミド複合体を併用した腫瘍局所内注射による皮下移植Ｂ１６細胞に対する治癒効果
【００６２】
【図３】ＡＤＰをコードしたプラスミドによる事前免疫有無でのマウスの腫瘍退縮効果
【図４】ＡＤＰをコードしたプラスミド複合体の腫瘍局所内注射による、マウス（事前免疫した）への皮下移植卵巣癌由来ＯＶＨＭ細胞に対する治癒効果
【実施例】
本発明を、実施例により更に具体的に説明する。なお、これらの実施例は、本発明を説明するためのものであって、本発明を何ら限定するものではない。
【実施例１】
【００６３】
ＡＤＰの遺伝子をコードしたプラスミド／ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）／コンドロイチン硫酸（ＣＳ）複合体の腫瘍局所内注射による皮下移植Ｂ１６細胞に対する治癒効果
ＡＤＰの遺伝子をコードしたプラスミド・ＰＥＩ・ＣＳからなる三成分の複合体をマウスのメラノーマ細胞由来のＢ１６を皮下に移植したマウスに腫瘍局所内投与し、腫瘍増大抑制効果を確認した。
【００６４】
ＣＳは、生化学工業株式会社製のサメ由来のものを用いた。ＰＢＳはＲｏｍａｎ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社製のＰｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｔｓ（Ｔａｂｌｅｔ）を蒸留したイオン交換水に溶解したものを用いた。ＰＥＩは、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ社製の直鎖状ＰＥＩ、Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ“Ｍａｘ”（Ｍｗ＝４００００）を用いた。これらは以降の実施例でも同様である。
［操作手順］
［１］ＡＤＰの遺伝子をコードしたプラスミドは、以下の通り作成した。
アデノウイルス５型の右側ｌａｒｇｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ（Ｍｉｃｒｏｖｉｘ社、カナダ）をテンプレートにして、下記のＡＤＰ−Ｓ、ＡＤＰ−ＡＳをプライマーにしてＥＸ Ｔａｇ（ｔａｋａｒａ）の酵素を用いてＰＣＲを行いクローニングベクターｐＴＡＣ−１に挿入した。Ｓｅｑｕｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓ（ＡＢＩ）にてｓｅｑｕｅｎｃｅを確認して発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３．１（−）：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共にＥｃｏ ＲＩ，Ｂａｍ ＨＩにて酵素処理して発現ベクターに挿入し、ｐｃＤＮＡ３．１（−）−ＡＤＰ−Ｓ−ＡＳ１を作成した。さらに，Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ（ＡＢＩ）にてｓｅｑｕｅｎｃｅを確認した。
ＡＤＰ−Ｓ：ＡＴＧＡＣＣＡＡＣＡＣＡＡＣＣＡＡＣＧＣ
ＡＤＰ−ＡＳ−１：ＡＣＴＣＧＡＧＧＡＡＴＣＡＴＧＴＣＴＣＡ
【００６５】
［２］細胞培養ディッシュにＢ１６細胞をまき、ＥＭＥＭ培地を用いてインキュベートし、移植用細胞を準備した。
［３］移植する直前に培養した培地を取り除き、１０％ＦＣＳと２５Ｕのペニシリンと２５μｇのストレプトマイシンを含むＥＭＥＭ加え、細胞を剥離した。
［４］５週令の雄のＣ５７ＢＬ／６マウスに、ＡＤＰの遺伝子をコードしたプラスミド１０μｇを後肢筋肉内に投与しマウスを免役した。２〜３週間後に２０ｘ１０５個のＢ１６メラノーマ細胞を腹部の皮下に移植した。比較のため、免役していないマウスに関しても同様に実験した。
【００６６】
［５］ 導入する数日前に以下の方法でプラスミド複合体を調製した。
ＡＤＰの遺伝子をコードしたプラスミド１００μｇを含む７．４ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）４８２０μｌに、５９４μｇのＣＳを含む水溶液１１９μｌを加え、続いてＰＥＩ２９３．５μｇを含む水溶液５９μｌを加えて攪拌後、２０分室温で放置した。
その後、１０％デキストラン溶液を５０μｌ加え、さらに１０分放置後、マイナス３０℃で凍結した。その後、凍結乾燥して、本発明の複合体を調製した。
［６］［４］で作成した担癌マウスモデルの腫瘍サイズが短径３ｍｍ以上になったところで、［５］で調製した凍結乾燥体に純水２５０μｌを加え、十分に溶解、分散させたものを、腫瘍組織内に投与した。
［７］１〜２日に１度腫瘍のサイズを測定した。
【００６７】
［結果］
結果を図１に示す。ここで、図中の腫瘍サイズは、（４／３）ｘ短径ｘ短径ｘ長径ｘ（１／８）ｘ３．１４として計算したものである。
何も投与していないコントロール群では急激な腫瘍の増大が見られたのに対して、ＡＤＰの遺伝子をコードしたプラスミド／ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）／コンドロイチン硫酸（ＣＳ）複合体を腫瘍局所内投与したマウスでは明確な腫瘍増大抑制が見られた。
【実施例２】
【００６８】
ＡＤＰの遺伝子をコードしたプラスミド複合体にマウスＧＭ−ＣＳＦの遺伝子をコードしたプラスミド複合体を併用した腫瘍局所内注射による皮下移植Ｂ１６細胞に対する治癒効果。
マウスＧＭ−ＣＳＦの遺伝子をコードしたプラスミド／ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）／コンドロイチン硫酸（ＣＳ）複合体を実施例１と同様に作成し、実施例１で作成したＡＤＰの遺伝子をコードしたプラスミド／ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）／コンドロイチン硫酸（ＣＳ）複合体とともにマウスのメラノーマ細胞由来のＢ１６を皮下に移植したマウスに腫瘍局所内投与し、腫瘍増大抑制効果を確認した。
【００６９】
［操作手順］
［１］実施例１と同様に担癌モデルマウス、ＡＤＰの遺伝子をコードしたプラスミド／ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）／コンドロイチン硫酸（ＣＳ）複合体、およびマウスＧＭ−ＣＳＦの遺伝子をコードしたプラスミド／ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）／コンドロイチン硫酸（ＣＳ）複合体を用意した。
［２］担癌マウスモデルの腫瘍サイズが短径３ｍｍ以上になったところで、上記２種類の凍結乾燥体にそれぞれ純水１００μｌを加え、十分に溶解、分散させたものを混合し、腫瘍組織内に投与した。
［３］１〜２日に１度腫瘍のサイズを測定した。
【００７０】
［結果］
結果を図２に示す。ここで、図中の腫瘍サイズは、（４／３）ｘ短径ｘ短径ｘ長径ｘ（１／８）ｘ３．１４として計算したものを示した。
ＡＤＰの遺伝子をコードしたプラスミド複合体のみ、あるいは、ＧＭ−ＣＳＦの遺伝子をコードしたプラスミド複合体のみを投与した群に比べ、両者を混合して腫瘍組織内投与したマウスの方が腫瘍の退縮が速く、相乗効果が認められた。
【実施例３】
【００７１】
実施例２と同様の実験を、実験の開始３週間前にＡＤＰのプラスミド１０μｇを後肢に筋肉内投与して免疫したマウスと、免疫していないマウスとで行い、腫瘍退縮の早さを比べたのが図３である。Ｄａｙ０での腫瘍サイズを１００として腫瘍の比サイズで表している。ここで、図中の腫瘍サイズは、（４／３）ｘ短径ｘ長径ｘ長径ｘ３．１４として計算したものをＤＮＡ複合体投与日のサイズに対する相対値示したものである。
あらかじめ免疫したマウスの方が腫瘍の退縮が速く、事前免疫の効果が認められた。
【実施例４】
【００７２】
［１］マウス卵巣癌由来のＯＶＨＭ細胞（Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．８０，４５９−４６３（１９８９）に記載された「ＯＶ２９４４−ＨＭ−１」）を、ＦＣＳ１０％を含むＲＰＭＩ培地を用いて培養し、移植用細胞を準備した。
［２］３週間前に１０１０ｐｆｕのＡｄ−ＧＦＰで予め免疫処置した雌の（Ｃ５７ＢＬ／６×Ｃ３／Ｈｅ）Ｆ１マウス（入手先：日本クレア）に、マウス一匹あたり１０６個の割合で、皮下に投与した。
［３］ 導入する数日前に以下の方法でプラスミド複合体を調製した。
ＡＤＰの遺伝子をコードしたプラスミド１００μｇを含む７．４ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）４８２０μｌに、５９４μｇのＣＳを含む水溶液１１９μｌを加え、絖いてＰＥＩ２９３．５μｇを含む水溶液５９μｌを加えて攪拌後、２０分室温で放置した。その後、１０％デキストラン溶液を５０μｌ加え、さらに１０分放置後、マイナス３０℃で凍結した。その後、凍結乾燥して、本発明の複合体を調製した。
［４］［２］で作成した担癌マウスモデルの腫瘍サイズが直径７ｍｍ以上になったところで、［３］で調製した凍結乾燥体に純水２５０μｌを加え十分に溶解、分散させたものを、さらに２５０μｌのＰＢＳで希釈した後、腫瘍組織内に連日３回投与した。
【００７３】
［６］１〜２日に１度腫瘍のサイズを測定した。
［結果］
結果を図４に示す。ここで、図中の腫瘍サイズは、（４／３）ｘ短径ｘ短径ｘ長径ｘ（１／８）ｘ３．１４として計算したものである。
何も投与していないコントロール群では急激な腫瘍の増大が見られたのに対して、ＡＤＰの遺伝子をコードしたプラスミド／ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）／コンドロイチン硫酸（ＣＳ）複合体を腫瘍局所内投与したマウスでは明確な腫瘍増大抑制が見られた。
【産業上の利用可能性】
本発明は、ＡＤＰ（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ Ｄｅａｔｈ Ｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子をコードしたベクター又はＡＤＰ遺伝子とＧＭ−ＣＳＦ遺伝子の両者をコードしたベクター、及びこれらベクターと遺伝子導入試薬との複合体、それらを含有する医薬並びにそれらを用いる癌の治療方法に有用である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＤＰ（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ Ｄｅａｔｈ Ｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子又はＡＤＰ遺伝子とＧＭ−ＣＳＦ遺伝子の両者をコードしたベクター。
【請求項２】
ベクターがプラスミドベクターであることを特徴とする請求項１記載のベクター。
【請求項３】
ＡＤＰ遺伝子又はＡＤＰ遺伝子とＧＭ−ＣＳＦ遺伝子の両者をコードしたベクターと遺伝子導入化試薬を含有する複合体。
【請求項４】
ベクターがプラスミドベクターであることを特徴とする請求項３記載の複合体。
【請求項５】
遺伝子導入試薬が、カチオン性ポリマー、カチオン性脂質及びアニオン性ポリマーから選択される１以上の化合物からなることを特徴とする請求項３又は４記載の複合体。
【請求項６】
遺伝子導入試薬が、カチオン性ポリマー又はカチオン性脂質と、アニオン性ポリマーからなることを特徴とする請求項５記載の複合体。
【請求項７】
カチオン性ポリマーが、ポリエチレンイミン（直鎖状ポリエチレンイミン又はポリ分枝型エチレンイミン）、２−ジメチルアミノエチルメタクリレートの重合体又は共重合体、２−トリメチルアミノエイルメタクリレートの重合体又は共重合体、ポリアミドアミンデンドリマー、ポリリジンデンドリマー、プロタミン、ヒストン、ＨｅｌΔ１、ゼラチン、ポリーＬ−リジン、ポリアルギニン、ポリオルニチン、ポリビニルイミダゾール、側鎖にエチレンジアミン構造を有する高分子及びそれらの共重合体、またはそれらの塩から１つ以上選択される請求項５又は６記載の複合体。
【請求項８】
カチオン性脂質が、ＤＣ−Ｃｈｏｌ（３β−（Ｎ−（Ｎ‘，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）カルバモイル）コレステロール、ＤＤＡＢ（Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド）、ＤＭＲＩ（Ｎ−（１，２−ジミリスチルオキシプパ−３−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド）、ＤＯＤＡＣ（Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド）、ＤＯＧＳ（ジヘプタデシルアミドグリシルスペルミジン）、ＤＯＳＰＡ（Ｎ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ−（２−（スペルミンカルボキサミド）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムトリフルオロアセタート）、ＤＯＴＡＰ（Ｎ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド）及びＤＯＴＭＡ（Ｎ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ、Ｎ、Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド）およびそれらの異なる酸との塩から１つ以上選択される請求項５又は６記載の複合体。
【請求項９】
アニオン性ポリマーが、カルボキシル側鎖を持つＰＥＧ誘導体、アクリル酸又はメタクリル酸の重合体若しくは共重合体、ポリビニルアルコールの硫酸エステル体、サクシニミジル化ポリ−Ｌ−リジン、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、ヒアルロン酸、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパリン、デルタマン硫酸又はそれらの誘導体、及びそれらの塩から１つ以上選択される請求項５又は６記載の複合体。
【請求項１０】
凍結乾燥処理を施した請求項３から９いずれかの項記載の複合体。
【請求項１１】
ＡＤＰ遺伝子又はＡＤＰ遺伝子とＧＭ−ＣＳＦ遺伝子の両者をコードしたベクターを含有する医薬。
【請求項１２】
ベクターがプラスミドベクターであることを特徴とする請求項１１記載の医薬。
【請求項１３】
ＡＤＰ遺伝子又はＡＤＰ遺伝子とＧＭ−ＣＳＦ遺伝子の両者をコードしたベクターと遺伝子導入化試薬を含有する医薬。
【請求項１４】
ベクターがプラスミドベクターであることを特徴とする請求項１３記載の医薬。
【請求項１５】
遺伝子導入試薬が、カチオン性ポリマー、カチオン性脂質及びアニオン性ポリマーから選択される１以上の化合物からなることを特徴とする請求項１３又は１４記載の医薬。
【請求項１６】
遺伝子導入試薬が、カチオン性ポリマー又はカチオン性脂質と、アニオン性ポリマーからなることを特徴とする請求項１５記載の医薬。
【請求項１７】
カチオン性ポリマーが、ポリエチレンイミン（直鎖状ポリエチレンイミン又はポリ分枝型エチレンイミン）、２−ジメチルアミノエチルメタクリレートの重合体又は共重合体、２−トリメチルアミノエイルメタクリレートの重合体又は共重合体、ポリアミドアミンデンドリマー、ポリリジンデンドリマー、プロタミン、ヒストン、ＨｅｌΔ１、ゼラチン、ポリーＬ−リジン、ポリアルギニン、ポリオルニチン、ポリビニルイミダゾール、側鎖にエチレンジアミン構造を有する高分子及びそれらの共重合体、またはそれらの塩から１つ以上選択される請求項１５又は１６記載の医薬。
【請求項１８】
カチオン性脂質が、ＤＣ−Ｃｈｏｌ（３β−（Ｎ−（Ｎ‘，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）カルバモイル）コレステロール、ＤＤＡＢ（Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド）、ＤＭＲＩ（Ｎ−（１，２−ジミリスチルオキシプパ−３−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド）、ＤＯＤＡＣ（Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド）、ＤＯＧＳ（ジヘプタデシルアミドグリシルスペルミジン）、ＤＯＳＰＡ（Ｎ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ−（２−（スペルミンカルボキサミド）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムトリフルオロアセタート）、ＤＯＴＡＰ（Ｎ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド）及びＤＯＴＭＡ（Ｎ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ、Ｎ、Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド）およびそれらの異なる酸との塩から１つ以上選択される請求項１５又は１６記載の医薬。
【請求項１９】
アニオン性ポリマーが、カルボキシル側鎖を持つＰＥＧ誘導体、アクリル酸又はメタクリル酸の重合体若しくは共重合体、ポリビニルアルコールの硫酸エステル体、サクシニミジル化ポリ−Ｌ−リジン、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、ヒアルロン酸、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパリン、デルタマン硫酸又はそれらの誘導体、及びそれらの塩から１つ以上選択される請求項１５又は１６記載の医薬。
【請求項２０】
凍結乾燥処理を施した請求項１３から１９いずれかの項記載の医薬。
【請求項２１】
ＡＤＰ遺伝子又はＡＤＰ遺伝子とＧＭ−ＣＳＦ遺伝子の両者をコードしたベクターを有効量投与すること特徴とする癌の治療方法。
【請求項２２】
ベクターがプラスミドベクターであることを特徴とする請求項２１記載の癌の治療方法。
【請求項２３】
ＡＤＰ遺伝子又はＡＤＰ遺伝子とＧＭ−ＣＳＦ遺伝子の両者をコードしたベクターと遺伝子導入化試薬を含有する複合体を有効量投与すること特徴とする癌の治療方法。
【請求項２４】
ベクターがプラスミドベクターであることを特徴とする請求項２３記載の癌の治療方法。
【請求項２５】
遺伝子導入試薬が、カチオン性ポリマー、カチオン性脂質及びアニオン性ポリマーから選択される１以上の化合物からなることを特徴とする請求項２３又は２４記載の癌の治療方法。
【請求項２６】
遺伝子導入試薬が、カチオン性ポリマー又はカチオン性脂質と、アニオン性ポリマーからなることを特徴とする請求項２５記載の癌の治療方法。
【請求項２７】
カチオン性ポリマーが、ポリエチレンイミン（直鎖状ポリエチレンイミン又はポリ分枝型エチレンイミン）、２−ジメチルアミノエチルメタクリレートの重合体又は共重合体、２−トリメチルアミノエイルメタクリレートの重合体又は共重合体、ポリアミドアミンデンドリマー、ポリリジンデンドリマー、プロタミン、ヒストン、ＨｅｌΔ１、ゼラチン、ポリーＬ−リジン、ポリアルギニン、ポリオルニチン、ポリビニルイミダゾール、側鎖にエチレンジアミン構造を有する高分子及びそれらの共重合体、またはそれらの塩から１つ以上選択される請求項２５又は２６記載の癌の治療方法。
【請求項２８】
カチオン性脂質が、ＤＣ−Ｃｈｏｌ（３β−（Ｎ−（Ｎ‘，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）カルバモイル）コレステロール、ＤＤＡＢ（Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド）、ＤＭＲＩ（Ｎ−（１，２−ジミリスチルオキシプパ−３−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド）、ＤＯＤＡＣ（Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド）、ＤＯＧＳ（ジヘプタデシルアミドグリシルスペルミジン）、ＤＯＳＰＡ（Ｎ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ−（２−（スペルミンカルボキサミド）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムトリフルオロアセタート）、ＤＯＴＡＰ（Ｎ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド）及びＤＯＴＭＡ（Ｎ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ、Ｎ、Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド）およびそれらの異なる酸との塩から１つ以上選択される請求項２５又は２６記載の癌の治療方法。
【請求項２９】
アニオン性ポリマーが、カルボキシル側鎖を持つＰＥＧ誘導体、アクリル酸又はメタクリル酸の重合体若しくは共重合体、ポリビニルアルコールの硫酸エステル体、サクシニミジル化ポリ−Ｌ−リジン、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、ヒアルロン酸、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパリン、デルタマン硫酸又はそれらの誘導体、及びそれらの塩から１つ以上選択される請求項２５又は２６記載の癌の治療方法。
【請求項３０】
凍結乾燥処理を施した請求項２３から２９いずれかの項記載の癌の治療方法。
【請求項１】
ＡＤＰ（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ Ｄｅａｔｈ Ｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子又はＡＤＰ遺伝子とＧＭ−ＣＳＦ遺伝子の両者をコードしたベクター。
【請求項２】
ベクターがプラスミドベクターであることを特徴とする請求項１記載のベクター。
【請求項３】
ＡＤＰ遺伝子又はＡＤＰ遺伝子とＧＭ−ＣＳＦ遺伝子の両者をコードしたベクターと遺伝子導入化試薬を含有する複合体。
【請求項４】
ベクターがプラスミドベクターであることを特徴とする請求項３記載の複合体。
【請求項５】
遺伝子導入試薬が、カチオン性ポリマー、カチオン性脂質及びアニオン性ポリマーから選択される１以上の化合物からなることを特徴とする請求項３又は４記載の複合体。
【請求項６】
遺伝子導入試薬が、カチオン性ポリマー又はカチオン性脂質と、アニオン性ポリマーからなることを特徴とする請求項５記載の複合体。
【請求項７】
カチオン性ポリマーが、ポリエチレンイミン（直鎖状ポリエチレンイミン又はポリ分枝型エチレンイミン）、２−ジメチルアミノエチルメタクリレートの重合体又は共重合体、２−トリメチルアミノエイルメタクリレートの重合体又は共重合体、ポリアミドアミンデンドリマー、ポリリジンデンドリマー、プロタミン、ヒストン、ＨｅｌΔ１、ゼラチン、ポリーＬ−リジン、ポリアルギニン、ポリオルニチン、ポリビニルイミダゾール、側鎖にエチレンジアミン構造を有する高分子及びそれらの共重合体、またはそれらの塩から１つ以上選択される請求項５又は６記載の複合体。
【請求項８】
カチオン性脂質が、ＤＣ−Ｃｈｏｌ（３β−（Ｎ−（Ｎ‘，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）カルバモイル）コレステロール、ＤＤＡＢ（Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド）、ＤＭＲＩ（Ｎ−（１，２−ジミリスチルオキシプパ−３−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド）、ＤＯＤＡＣ（Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド）、ＤＯＧＳ（ジヘプタデシルアミドグリシルスペルミジン）、ＤＯＳＰＡ（Ｎ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ−（２−（スペルミンカルボキサミド）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムトリフルオロアセタート）、ＤＯＴＡＰ（Ｎ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド）及びＤＯＴＭＡ（Ｎ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ、Ｎ、Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド）およびそれらの異なる酸との塩から１つ以上選択される請求項５又は６記載の複合体。
【請求項９】
アニオン性ポリマーが、カルボキシル側鎖を持つＰＥＧ誘導体、アクリル酸又はメタクリル酸の重合体若しくは共重合体、ポリビニルアルコールの硫酸エステル体、サクシニミジル化ポリ−Ｌ−リジン、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、ヒアルロン酸、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパリン、デルタマン硫酸又はそれらの誘導体、及びそれらの塩から１つ以上選択される請求項５又は６記載の複合体。
【請求項１０】
凍結乾燥処理を施した請求項３から９いずれかの項記載の複合体。
【請求項１１】
ＡＤＰ遺伝子又はＡＤＰ遺伝子とＧＭ−ＣＳＦ遺伝子の両者をコードしたベクターを含有する医薬。
【請求項１２】
ベクターがプラスミドベクターであることを特徴とする請求項１１記載の医薬。
【請求項１３】
ＡＤＰ遺伝子又はＡＤＰ遺伝子とＧＭ−ＣＳＦ遺伝子の両者をコードしたベクターと遺伝子導入化試薬を含有する医薬。
【請求項１４】
ベクターがプラスミドベクターであることを特徴とする請求項１３記載の医薬。
【請求項１５】
遺伝子導入試薬が、カチオン性ポリマー、カチオン性脂質及びアニオン性ポリマーから選択される１以上の化合物からなることを特徴とする請求項１３又は１４記載の医薬。
【請求項１６】
遺伝子導入試薬が、カチオン性ポリマー又はカチオン性脂質と、アニオン性ポリマーからなることを特徴とする請求項１５記載の医薬。
【請求項１７】
カチオン性ポリマーが、ポリエチレンイミン（直鎖状ポリエチレンイミン又はポリ分枝型エチレンイミン）、２−ジメチルアミノエチルメタクリレートの重合体又は共重合体、２−トリメチルアミノエイルメタクリレートの重合体又は共重合体、ポリアミドアミンデンドリマー、ポリリジンデンドリマー、プロタミン、ヒストン、ＨｅｌΔ１、ゼラチン、ポリーＬ−リジン、ポリアルギニン、ポリオルニチン、ポリビニルイミダゾール、側鎖にエチレンジアミン構造を有する高分子及びそれらの共重合体、またはそれらの塩から１つ以上選択される請求項１５又は１６記載の医薬。
【請求項１８】
カチオン性脂質が、ＤＣ−Ｃｈｏｌ（３β−（Ｎ−（Ｎ‘，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）カルバモイル）コレステロール、ＤＤＡＢ（Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド）、ＤＭＲＩ（Ｎ−（１，２−ジミリスチルオキシプパ−３−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド）、ＤＯＤＡＣ（Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド）、ＤＯＧＳ（ジヘプタデシルアミドグリシルスペルミジン）、ＤＯＳＰＡ（Ｎ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ−（２−（スペルミンカルボキサミド）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムトリフルオロアセタート）、ＤＯＴＡＰ（Ｎ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド）及びＤＯＴＭＡ（Ｎ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ、Ｎ、Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド）およびそれらの異なる酸との塩から１つ以上選択される請求項１５又は１６記載の医薬。
【請求項１９】
アニオン性ポリマーが、カルボキシル側鎖を持つＰＥＧ誘導体、アクリル酸又はメタクリル酸の重合体若しくは共重合体、ポリビニルアルコールの硫酸エステル体、サクシニミジル化ポリ−Ｌ−リジン、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、ヒアルロン酸、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパリン、デルタマン硫酸又はそれらの誘導体、及びそれらの塩から１つ以上選択される請求項１５又は１６記載の医薬。
【請求項２０】
凍結乾燥処理を施した請求項１３から１９いずれかの項記載の医薬。
【請求項２１】
ＡＤＰ遺伝子又はＡＤＰ遺伝子とＧＭ−ＣＳＦ遺伝子の両者をコードしたベクターを有効量投与すること特徴とする癌の治療方法。
【請求項２２】
ベクターがプラスミドベクターであることを特徴とする請求項２１記載の癌の治療方法。
【請求項２３】
ＡＤＰ遺伝子又はＡＤＰ遺伝子とＧＭ−ＣＳＦ遺伝子の両者をコードしたベクターと遺伝子導入化試薬を含有する複合体を有効量投与すること特徴とする癌の治療方法。
【請求項２４】
ベクターがプラスミドベクターであることを特徴とする請求項２３記載の癌の治療方法。
【請求項２５】
遺伝子導入試薬が、カチオン性ポリマー、カチオン性脂質及びアニオン性ポリマーから選択される１以上の化合物からなることを特徴とする請求項２３又は２４記載の癌の治療方法。
【請求項２６】
遺伝子導入試薬が、カチオン性ポリマー又はカチオン性脂質と、アニオン性ポリマーからなることを特徴とする請求項２５記載の癌の治療方法。
【請求項２７】
カチオン性ポリマーが、ポリエチレンイミン（直鎖状ポリエチレンイミン又はポリ分枝型エチレンイミン）、２−ジメチルアミノエチルメタクリレートの重合体又は共重合体、２−トリメチルアミノエイルメタクリレートの重合体又は共重合体、ポリアミドアミンデンドリマー、ポリリジンデンドリマー、プロタミン、ヒストン、ＨｅｌΔ１、ゼラチン、ポリーＬ−リジン、ポリアルギニン、ポリオルニチン、ポリビニルイミダゾール、側鎖にエチレンジアミン構造を有する高分子及びそれらの共重合体、またはそれらの塩から１つ以上選択される請求項２５又は２６記載の癌の治療方法。
【請求項２８】
カチオン性脂質が、ＤＣ−Ｃｈｏｌ（３β−（Ｎ−（Ｎ‘，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）カルバモイル）コレステロール、ＤＤＡＢ（Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド）、ＤＭＲＩ（Ｎ−（１，２−ジミリスチルオキシプパ−３−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド）、ＤＯＤＡＣ（Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド）、ＤＯＧＳ（ジヘプタデシルアミドグリシルスペルミジン）、ＤＯＳＰＡ（Ｎ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ−（２−（スペルミンカルボキサミド）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムトリフルオロアセタート）、ＤＯＴＡＰ（Ｎ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド）及びＤＯＴＭＡ（Ｎ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ、Ｎ、Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド）およびそれらの異なる酸との塩から１つ以上選択される請求項２５又は２６記載の癌の治療方法。
【請求項２９】
アニオン性ポリマーが、カルボキシル側鎖を持つＰＥＧ誘導体、アクリル酸又はメタクリル酸の重合体若しくは共重合体、ポリビニルアルコールの硫酸エステル体、サクシニミジル化ポリ−Ｌ−リジン、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、ヒアルロン酸、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパリン、デルタマン硫酸又はそれらの誘導体、及びそれらの塩から１つ以上選択される請求項２５又は２６記載の癌の治療方法。
【請求項３０】
凍結乾燥処理を施した請求項２３から２９いずれかの項記載の癌の治療方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２０１２−５０４１７（Ｐ２０１２−５０４１７Ａ）
【公開日】平成２４年３月１５日（２０１２．３．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２０７２６６（Ｐ２０１０−２０７２６６）
【出願日】平成２２年８月３１日（２０１０．８．３１）
【出願人】（５０８３６３２２５）株式会社アルファ・ナノ・メディカ (4)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年３月１５日（２０１２．３．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年８月３１日（２０１０．８．３１）
【出願人】（５０８３６３２２５）株式会社アルファ・ナノ・メディカ (4)
【Ｆターム（参考）】
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