新規の間葉系幹細胞及び骨形成性細胞
本発明は、少なくとも１つの間葉系マーカー、好ましくは少なくともＣＤ１０５とＣＤ３４とを共発現する、新たな種類の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）に関する。類似の表現型を有する骨形成性細胞も提供される。本発明は、細胞及び細胞集団に加えて、このような細胞及び細胞集団を含むさらなる製品並びに骨療法におけるそれらの使用も提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は概して、細胞表現型及び細胞分化の分野に関し、医学における細胞の使用に関する。より具体的には、本発明は新たな間葉系幹細胞（ＭＳＣ）型及び新たな骨形成性細胞型を同定し、上記ＭＳＣの骨形成分化、並びに骨疾患における上記ＭＳＣ及び上記骨形成性細胞の治療的及び予防的用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨形成分化を受けることが可能であるか、又はその傾向を有する幹細胞の移植は、骨関連疾患の治療に対して、特に治療に新たな骨の産生が必要となる場合に有望な手段（avenue）である。
【０００３】
骨髄間質細胞又は間葉系幹細胞（ＢＭＳＣ又はＭＳＣと略される）は、成体骨髄及び幾つかの他の組織から、これらの細胞の組織培養プラスチックへの接着性に基づいて容易に単離し、増加させることができる。ＭＳＣは主に三分化能性の（tri-potential）中胚葉関連運命、すなわち骨形成分化、脂肪細胞分化及び軟骨細胞分化を受ける能力を示すが（非特許文献１）、神経細胞、肝細胞及び筋細胞を産生することが可能なＭＳＣも報告されている（非特許文献２）。
【０００４】
ＭＳＣは可溶性表面マーカー、中でもＣＤ１０５、ＣＤ９０及びＣＤ７３を含めて、それらの発現によって規定することができる。さらに、従来技術では一般に、ＭＳＣがＣＤ３４抗原に対して陰性であることが示されており、ＣＤ３４抗原はむしろ未熟血液細胞及び内皮細胞において高度に発現されることが知られている。特に、ＣＤ３４陽性の骨髄起源ＭＳＣは、これまでに説明されていなかった。また、ＣＤ３４陽性ＭＳＣ、特に骨髄に由来するＣＤ３４陽性ＭＳＣに関して、骨形成性及び骨再生（osteoregenerative）性の向上は以前には記載されていなかった。
【０００５】
骨髄移植は骨障害を治療するために利用されている（非特許文献３）。しかしながら、ＭＳＣは骨髄試料中に存在する全ての細胞のうちわずかな割合しか占めず、さらには多様な骨形成分化の傾向を示すことができるため、そのように移植された細胞のかなりの割合が最終的に所望の骨組織の形成に寄与しないだろう。実際、ヒト成体間葉系幹細胞前駆細胞の約１４％しか骨形成能を維持しないことが示されている（非特許文献４）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Pittenger et al. 1999. Science 284: 143-7
【非特許文献２】Prockop 1997. Science 276: 71-4
【非特許文献３】Gangji et al. 2005. Expert Opin Biol Ther 5: 437-42
【非特許文献４】D'Ippolito et al. 1999. J Bone Miner Res. 14: 1115-22
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
以上の点を鑑みると、間葉系幹細胞からの骨芽前駆細胞、骨芽細胞又は骨形成性細胞の産生収率を改善することが引き続き必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、単離し、任意で増加させたＭＳＣ細胞の小サブセットが、少なくとも１つの間葉系マーカー、例えばＣＤ９０又はＣＤ１０５、より好ましくは少なくともＣＤ１０５を、一般に細胞の未熟血液的及び内皮的特質を表すと考えられるマーカーであるＣＤ３４と共に共発現することを結論付けた。
【０００９】
一般的なＭＳＣ細胞集団と比べると、この新たな細胞型は、骨細胞マーカーであるアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）を有意なレベルで発現し、新たな骨マトリクスを合成及び石灰化することができる。したがって、該細胞は、骨再構築に有用な骨形成性細胞を産生する比較的高い可能性を有する。本発明者らはまた、該細胞を大いに増加させることができ、それにより特に骨障害に対する細胞ベース療法にとって十分な量の骨形成性細胞を生成可能であることに気付いた。本発明者らは、その表現型的性質及び生物学的性質を維持する上記細胞サブタイプに関してＭＳＣ細胞を富化することに成功した。
【００１０】
本発明の一態様は、少なくとも１つの間葉系マーカーとＣＤ３４とを共発現することを特徴とする単離間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を提供する。
【００１１】
さらなる態様は、少なくとも１つの間葉系マーカーとＣＤ３４とを共発現するＭＳＣ細胞を得る方法であって、ＭＳＣ細胞集団から、上記少なくとも１つの間葉系マーカーとＣＤ３４とを共発現する細胞のサブセットを富化又は単離することを含む、方法を提供する。実施の形態は、少なくとも１つの間葉系マーカーとＣＤ３４とを共発現するＭＳＣ細胞を得る方法であって、（ａ）被験体の試料からＭＳＣ細胞を単離すること、（ｂ）任意で、（ａ）のＭＳＣ細胞を富化する及び／又は増加させること、並びに（ｃ）（ａ）又は（ｂ）のＭＳＣ細胞から、少なくとも１つの間葉系マーカーとＣＤ３４とを共発現する細胞のサブセットを富化又は単離することを含む、方法を提供する。
【００１２】
別の態様は、ＭＳＣ細胞集団から、少なくとも１つの間葉系マーカーとＣＤ３４とを共発現する細胞のサブセットを単離することを含む方法によって得ることができるＭＳＣ細胞に関する。実施の形態は、（ａ）被験体の試料からＭＳＣ細胞を単離すること、（ｂ）任意で、（ａ）のＭＳＣ細胞を増加させること、並びに（ｃ）（ａ）又は（ｂ）のＭＳＣ細胞から、少なくとも１つの間葉系マーカーとＣＤ３４とを共発現する細胞のサブセットを単離することを含む複数の工程によって得ることができるＭＳＣ細胞を提供する。
【００１３】
上述の態様のいずれかにおいて規定されるような、少なくとも１つの間葉系マーカーとＣＤ３４とを共発現する単離間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を含む細胞集団も提供される。
【００１４】
本発明が、上記で教示されるようなＭＳＣ細胞及び細胞集団、例えば少なくとも１つの間葉系マーカーとＣＤ３４とを共発現するＭＳＣ細胞並びにこのようなＭＳＣ細胞を含む細胞集団の様々な操作、とりわけ培養、維持、増加、富化（例えば選別による）、並びに上記ＭＳＣ細胞及び細胞集団の富化後の増加も含めて包含していることを理解されよう。
【００１５】
さらなる態様は、単離間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、好ましくは本明細書中で教示されるような少なくとも１つの間葉系マーカーとＣＤ３４とを共発現する単離ＭＳＣを、インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で増加させる方法であって、上記ＭＳＣ細胞を造血成長因子及び／又は血管新生成長因子、好ましくは造血成長因子及び血管新生成長因子、例えば１つ又は複数の造血成長因子及び／又は１つ又は複数の血管新生成長因子に曝露することを含む、方法を提供する。
【００１６】
この方法はまた、好適な培養条件を用いて、ＭＳＣ集団（すなわち、比較的不均一性の高いＭＳＣ集団）から、少なくとも１つの間葉系マーカーとＣＤ３４とを共発現するＭＳＣ細胞を得ること、及び／又はＭＳＣ集団（すなわち、比較的不均一性の高いＭＳＣ集団）を少なくとも１つの間葉系マーカーとＣＤ３４とを共発現するＭＳＣ細胞に富化することに適合する場合もある。この方法は、上記比較的不均一性の高いＭＳＣ集団（例えば、被験体の試料から単離したＭＳＣ細胞）を、造血成長因子及び／又は血管新生成長因子、好ましくは造血成長因子及び血管新生成長因子、例えば１つ又は複数の造血成長因子及び／又は１つ又は複数の血管新生成長因子に曝露することを必要とする。
【００１７】
有利には、該方法によって、出発又は初期ＭＳＣ細胞集団から、ＣＤ３４と１つ又は複数の間葉系マーカー、例えば、好ましくはＣＤ１０５、ＣＤ９０及び／又はＣＤ７３、同様に好ましくは少なくともＣＤ１０５、との発現を有するＭＳＣ細胞が得られる及び／又は富化される場合がある。有利には、富化されたＭＳＣ細胞は、造血マーカー及び／又は内皮マーカー、例えばＣＤ４５、ＣＤ１３３、ＣＤ３１、ＣＤ１４及び／又はＣＤ１９の発現を欠いている場合がある。したがって、実施の形態では、富化されたＭＳＣ細胞は、ＣＤ３４、並びにＣＤ１０５、ＣＤ９０及びＣＤ７３の１つ又は複数、又は好ましくは全て、同様に好ましくは少なくともＣＤ１０５の発現を有し、ＣＤ４５、ＣＤ１３３、ＣＤ３１、ＣＤ１４及びＣＤ１９の１つ又は複数、又は好ましくは全ての発現を欠いている場合がある。有利には、本方法は、該方法を適用する過程で、初期ＭＳＣ集団におけるＣＤ３４及び１つ又は複数の間葉系マーカーの共発現を有するＭＳＣ細胞の割合の増大を実現する（例えば、非限定的な実験では、ＣＤ１０５陽性ＭＳＣ細胞及びＣＤ３４陽性ＭＳＣ細胞の割合は培養の間に、それぞれ１５％から９５％、及び１％から５９．４％へと増大した）。
【００１８】
有利には、本明細書中で教示されるような造血成長因子及び／又は血管新生成長因子に曝露することによって増加及び／又は富化されたＭＳＣ細胞は、十分な骨形成性（例えば、ＡＬＰの発現及び染色によって示される）、及び有益な血管新生促進性（例えば、好適なアッセイにおいて、ｖＷＦ及びＶＥＧＦの発現によって、及び／又は毛細血管様構造の形成によって示される）の両方を示す場合がある。
【００１９】
したがって、骨形成性（限定するものではないが、好適にはＡＬＰ発現、ＡＬＰ酵素活性及び／又はＡＬＰ染色によって示される）、及び血管新生促進性（限定するものではないが、好適にはマトリゲルモデル等の好適なモデルにおけるｖＷＦ及び／又はＶＥＧＦ、好ましくはｖＷＦ及びＶＥＧＦの発現によって、及び／又は分岐した新生血管構造又は偽管（pseudotubes）へと組織化する能力によって示される）の両方を示す、概してＭＳＣ細胞、特に少なくとも１つの間葉系マーカーとＣＤ３４とを共発現するＭＳＣ細胞も本明細書中に開示される。このようなＭＳＣ細胞を含む細胞集団がさらに意図される。
【００２０】
ＭＳＣ細胞又は細胞集団を、造血成長因子及び／又は血管新生成長因子を用いて増加させるか、又は富化する上記の方法によって得ることができるか、又は直接得られるＭＳＣ細胞も提供される。
【００２１】
別の態様は、上述の態様において規定されるような少なくとも１つの間葉系マーカーとＣＤ３４とを共発現する間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を、骨形成性細胞、例えば骨芽細胞又は骨芽前駆細胞にｉｎ ｖｉｔｒｏで分化させる方法に関する。
【００２２】
さらなる態様は、上述の態様において規定されるような少なくとも１つの間葉系マーカーとＣＤ３４とを共発現する間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を、骨形成性細胞にｉｎ ｖｉｔｒｏで分化させることによって得ることができる骨形成性細胞、例えば骨芽細胞又は骨芽前駆細胞を提供する。
【００２３】
このような骨形成性細胞の少なくとも一部は、元のＭＳＣ細胞に関連する発現プロファイルを維持することができるため、別の態様は、少なくとも１つの間葉系マーカーとＣＤ３４とを共発現することを特徴とする単離骨形成性細胞、例えば骨芽細胞又は骨芽前駆細胞を提供する。
【００２４】
少なくとも１つの間葉系マーカーとＣＤ３４とを共発現する単離骨形成性細胞を含む細胞集団がさらに開示される。したがって、本明細書中で教示されるような少なくとも１つの間葉系マーカーとＣＤ３４とを共発現する単離ＭＳＣを含み、且つ本明細書中で教示されるような少なくとも１つの間葉系マーカーとＣＤ３４とを共発現する単離骨形成性細胞をさらに含む細胞集団も開示される。
【００２５】
本発明が、上記に教示されるような骨形成性細胞及び細胞集団、例えば少なくとも１つの間葉系マーカーとＣＤ３４とを共発現する骨形成性細胞、並びにこのような骨形成性細胞を含む細胞集団の様々な操作、とりわけ培養、維持、増加、富化（例えば選別による）、並びに上記骨形成性細胞及び細胞集団の富化後の増加も含めて包含していることも理解されよう。
【００２６】
少なくとも１つの間葉系マーカーとＣＤ３４とを共発現する骨形成性細胞を得る方法であって、上記少なくとも１つの間葉系マーカーとＣＤ３４とを共発現するＭＳＣ細胞を、骨形成性細胞に分化させることを含む、方法も開示される。
【００２７】
少なくとも１つの間葉系マーカーとＣＤ３４とを共発現するこのような骨形成性細胞は、他の方法によっても得ることができる。したがって、少なくとも１つの間葉系マーカーとＣＤ３４とを共発現する骨形成性細胞を得る方法であって、骨形成性細胞の集団から、上記少なくとも１つの間葉系マーカーとＣＤ３４とを共発現する細胞のサブセットを富化又は単離することを含む、方法も開示される。実施の形態は、少なくとも１つの間葉系マーカーとＣＤ３４とを共発現する骨形成性細胞を得る方法であって、（ａ）被験体の試料から骨形成性細胞を単離すること、又は被験体の試料から単離したＭＳＣ細胞から骨形成性細胞を分化させること、（ｂ）任意で、（ａ）の骨形成性細胞を富化する及び／又は増加させること、並びに（ｃ）（ａ）又は（ｂ）の骨形成性細胞から、少なくとも１つの間葉系マーカーとＣＤ３４とを共発現する細胞のサブセットを富化又は単離することを含む、方法を提供する。
【００２８】
さらなる態様は、単離骨形成性細胞、好ましくは本明細書中で教示されるような少なくとも１つの間葉系マーカーとＣＤ３４とを共発現する単離骨形成性細胞を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで増加させる方法であって、上記骨形成性細胞を造血成長因子及び／又は血管新生成長因子、好ましくは造血成長因子及び血管新生成長因子、例えば１つ又は複数の造血成長因子及び／又は１つ又は複数の血管新生成長因子に曝露することを含む、方法を提供する。
【００２９】
この方法はまた、好適な培養条件を用いて、骨形成性細胞集団（すなわち、比較的不均一性の高い骨形成性細胞集団）から、少なくとも１つの間葉系マーカーとＣＤ３４とを共発現する骨形成性細胞を得る、及び／又は骨形成性細胞集団（すなわち、比較的不均一性の高い骨形成性細胞集団）を少なくとも１つの間葉系マーカーとＣＤ３４とを共発現する骨形成性細胞に富化するのに適する場合もある。この方法は、上記比較的不均一性の高い骨形成性細胞集団（例えば、被験体の試料から単離した骨形成性細胞、又は被験体の試料から単離したＭＳＣ細胞から分化させた骨形成性細胞）を、造血成長因子及び／又は血管新生成長因子、好ましくは造血成長因子及び血管新生成長因子、例えば１つ又は複数の造血成長因子及び／又は１つ又は複数の血管新生成長因子にｉｎ ｖｉｔｒｏで曝露することを必要とする。
【００３０】
有利には、該方法によって、出発又は初期骨形成性細胞集団から、ＣＤ３４と１つ又は複数の間葉系マーカー、例えば、好ましくはＣＤ１０５、ＣＤ９０及び／又はＣＤ７３、同様に好ましくは少なくともＣＤ１０５との発現を有する骨形成性細胞が得られる及び／又は富化される場合がある。有利には、富化された骨形成性細胞は、造血マーカー及び／又は内皮マーカー、例えばＣＤ４５、ＣＤ１３３、ＣＤ３１、ＣＤ１４及び／又はＣＤ１９の発現を欠いている場合がある。したがって、実施の形態では、富化された骨形成性細胞は、ＣＤ３４、並びにＣＤ１０５、ＣＤ９０及びＣＤ７３の１つ又は複数、又は好ましくは全て、同様に好ましくは少なくともＣＤ１０５の発現を有し、ＣＤ４５、ＣＤ１３３、ＣＤ３１、ＣＤ１４及びＣＤ１９の１つ又は複数、又は好ましくは全ての発現を欠いている場合がある。有利には、本方法は、該方法を適用する過程で、初期骨形成性細胞集団におけるＣＤ３４及び１つ又は複数の間葉系マーカーの共発現を有する骨形成性細胞の割合の増大を実現する。
【００３１】
有利には、本明細書中で教示されるような造血成長因子及び／又は血管新生成長因子に曝露することによって増加及び／又は富化された骨形成性細胞は、十分な骨形成性（例えば、ＡＬＰの発現及び染色によって示される）、及び有益な血管新生促進性（例えば、好適なアッセイにおいて、ｖＷＦ及びＶＥＧＦの発現によって、及び／又は毛細血管様構造の形成によって示される）の両方を示す場合がある。
【００３２】
したがって、骨形成性（限定するものではないが、好適にはＡＬＰ発現、ＡＬＰ酵素活性及び／又はＡＬＰ染色によって示される）、及び血管新生促進性（限定するものではないが、好適にはマトリゲルモデル等の好適なモデルにおけるｖＷＦ及び／又はＶＥＧＦ、好ましくはｖＷＦ及びＶＥＧＦの発現によって、及び／又は分岐した新生血管構造又は偽管へと組織化する能力によって示される）の両方を示す、概して骨形成性細胞、特に少なくとも１つの間葉系マーカーとＣＤ３４とを共発現する骨形成性細胞も本明細書中に開示される。このような骨形成性細胞を含む細胞集団がさらに意図される。
【００３３】
骨形成性細胞又は細胞集団を、造血成長因子及び／又は血管新生成長因子を用いて増加させるか、又は富化する上記の方法によって得ることができるか、又は直接得られる骨形成性細胞も提供される。
【００３４】
実施の形態では、造血成長因子は、当該技術分野で既知の明らかな造血活性を有する任意の成長因子、例えば造血細胞を動員する、その増殖を誘導する、及び／又は造血細胞を刺激することが可能な任意の成長因子を含み得る。実施の形態では、本明細書全体を通して意図される造血成長因子は、コロニー刺激因子２（ＣＳＦ２）、ＣＳＦ３、マクロファージＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球単球ＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターフェロン（ＩＦＮ）、とりわけＩＦＮ−α及びＩＦＮ−γ、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、並びに造血活性のあるサイトカイン、とりわけインターロイキン２（ＩＬ２）、ＩＬ４、ＩＬ１７及びＩＬ１８を含むか、又はこれらから成る群から選択される。好ましくは、造血成長因子は、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＦＮ−γから選択され、より好ましくはＩＦＮ−γであり得る。
【００３５】
実施の形態では、血管新生成長因子は、当該技術分野で既知の明らかな血管新生活性を有する任意の成長因子、例えば内皮細胞を動員するか、又は内皮細胞による毛細血管構造の形成を誘導することが可能な任意の成長因子を含み得る。実施の形態では、本明細書全体を通して意図される血管新生成長因子は、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、とりわけＰＤＧＦａａ、ＰＤＧＦａｂ、ＰＤＧＦｂｂ、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ１又はＶＥＧＦ２）、フォン・ヴィルブランド因子（ｖＷＦ）、アンジオポエチン１又はアンジオポエチン２、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−３、若しくは他のＦＧＦ因子；又はＦＧＦ−１以外、及び／又はＦＧＦ−２以外のＦＧＦ因子）、並びにエリスロポエチン（ＥＰＯ）を含むか、又はこれらから成る群から選択される。別の実施の形態では、血管新生成長因子は、ＰＤＧＦ、ＶＥＧＦ、ｖＷＦ、アンジオポエチン２及びＥＰＯを含むか、又はこれらから成る群から選択され得る。好ましくは、血管新生成長因子は、ＰＤＧＦ、ＦＧＦ−１及びＦＧＦ−３から選択され、より好ましくはＰＤＧＦ又はＦＧＦ−３、さらに好ましくはＰＤＧＦであり得る。
【００３６】
好ましくは、ＭＳＣ又は骨形成性細胞は、上記細胞の維持、増加、取得、富化及び／又は骨形成分化をさらに促すために、上記造血成長因子及び／又は血管新生成長因子に加えてＦＧＦ−２に曝露され、好ましくは同時に曝露され得る。
【００３７】
したがって、好ましい実施の形態では、ＭＳＣ又は骨形成性細胞、例えば本明細書中で教示されるようなＣＤ３４及び１つ又は複数の間葉系マーカーの発現を有するＭＳＣ又は骨形成性細胞を増加させることは、上記ＭＳＣ又は骨形成性細胞を、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γ、ＰＤＧＦ、ＦＧＦ−１及びＦＧＦ−３から選択される１つ又は複数の成長因子、例えばＧＭ−ＣＳＦ及びＩＦＮ−γの１つ又は複数、及び／又はＰＤＧＦ、ＦＧＦ−１及びＦＧＦ−３の１つ又は複数、例えばＧＭ−ＣＳＦ及びＩＦＮ−γの１つ又は複数、並びにＰＤＧＦ、ＦＧＦ−１及びＦＧＦ−３の１つ又は複数に曝露することを含み得る。これらの実施の形態では、任意で、細胞をＦＧＦ−２にさらに曝露しても、好ましくは同時に曝露してもよい。特に好ましい実施の形態では、ＭＳＣ又は骨形成性細胞、例えば本明細書中で教示されるようなＣＤ３４及び１つ又は複数の間葉系マーカーの発現を有するＭＳＣ又は骨形成性細胞を増加させることは、上記ＭＳＣ又は骨形成性細胞をＩＦＮ−γに曝露することを含み得る。この処理によって、そのように処理した細胞の骨形成特性及び血管新生促進特性の両方が著しく向上する。
【００３８】
別の好ましい実施の形態では、初期ＭＳＣ集団又は骨形成性細胞集団から、本明細書中で教示されるようなＣＤ３４及び１つ又は複数の間葉系マーカーの発現を有するＭＳＣ又は骨形成性細胞を富化することは、上記初期ＭＳＣ集団又は骨形成性細胞集団を、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γ、ＰＤＧＦ、ＦＧＦ−１及びＦＧＦ−３から選択される１つ又は複数の成長因子、例えばＧＭ−ＣＳＦ及びＩＦＮ−γの１つ又は複数、及び／又はＰＤＧＦ、ＦＧＦ−１及びＦＧＦ−３の１つ又は複数、例えばＧＭ−ＣＳＦ及びＩＦＮ−γの１つ又は複数、並びにＰＤＧＦ、ＦＧＦ−１及びＦＧＦ−３の１つ又は複数に曝露することを含み得る。これらの実施の形態では、任意で、細胞をＦＧＦ−２にさらに曝露しても、好ましくは同時に曝露してもよい。特に好ましい実施の形態では、初期ＭＳＣ集団又は骨形成性細胞集団から、本明細書中で教示されるようなＣＤ３４及び１つ又は複数の間葉系マーカーの発現を有するＭＳＣ又は骨形成性細胞を富化することは、上記ＭＳＣ又は骨形成性細胞をＩＦＮ−γに曝露することを含み得る。この処理によって、そのように処理した細胞の骨形成特性及び血管新生促進特性の両方が著しく向上する。
【００３９】
さらなる態様は、上述の態様において規定されるような少なくとも１つの間葉系マーカーとＣＤ３４とを共発現する間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、及び／又は上述の態様において規定されるような骨形成性細胞、例えば少なくとも１つの間葉系マーカーとＣＤ３４とを共発現する骨形成性細胞、並びに１つ又は複数の薬学的に許容可能な担体／賦形剤を含む医薬組成物を提供する。医薬組成物は、上記ＭＳＣ及び／又は骨形成性細胞を含む細胞集団、並びに１つ又は複数の薬学的に許容可能な担体／賦形剤を含み得る。
【００４０】
医薬品製剤を調製する製法（ｐｒｏｃｅｓｓ）であって、上述の態様において規定されるような少なくとも１つの間葉系マーカーとＣＤ３４とを共発現する間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、及び／又は上述の態様において規定されるような骨形成性細胞、例えば少なくとも１つの間葉系マーカーとＣＤ３４とを共発現する骨形成性細胞、又はこのようなＭＳＣ及び／又は骨形成性細胞を含む細胞集団を、上記１つ又は複数の薬学的に許容可能な担体／賦形剤と混合することを含む、製法も提供される。
【００４１】
本発明の細胞産物は、骨関連障害の予防的及び治療的処置に特に好適である。したがって、さらなる態様は以下のものに関する：
骨関連障害の治療に使用される、上述の態様において規定されるような少なくとも１つの間葉系マーカーとＣＤ３４とを共発現する間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、又は上述の態様において規定されるような骨形成性細胞、例えば少なくとも１つの間葉系マーカーとＣＤ３４とを共発現する骨形成性細胞、又は上記に規定されるような細胞を含む細胞集団若しくは医薬組成物；
骨関連障害の治療用の薬物の製造のための、上述の態様において規定されるような少なくとも１つの間葉系マーカーとＣＤ３４とを共発現する間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、又は上述の態様において規定されるような骨形成性細胞、例えば少なくとも１つの間葉系マーカーとＣＤ３４とを共発現する骨形成性細胞、又は上記に規定されるような細胞を含む細胞集団の使用；
このような治療を必要とする被験体において骨関連障害を治療する方法であって、上記被験体に、上述の態様において規定されるような少なくとも１つの間葉系マーカーとＣＤ３４とを共発現する間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、又は上述の態様において規定されるような骨形成性細胞、例えば少なくとも１つの間葉系マーカーとＣＤ３４とを共発現する骨形成性細胞、又は上記に規定されるような細胞を含む細胞集団若しくは医薬組成物を、治療的又は予防的に有効な量で投与することを含む、方法。
【００４２】
本発明は、被験体に、例えば全身的に又は骨病変の部位へと組成物を投与するのに適した外科用器具を含み、かつ上記で規定される細胞、細胞集団又は医薬組成物のいずれかをさらに含む装置（arrangement）も提供する。
【００４３】
上記態様及び実施の形態のいずれにおいても、少なくとも１つの間葉系マーカーは、好ましくはＣＤ１０５、ＣＤ９０及びＣＤ７３から選択され、より好ましくはＣＤ９０又はＣＤ１０５であり得る。特に好ましくは、少なくとも１つの間葉系マーカーはＣＤ１０５であり得る。すなわち、本明細書中で教示されるようなＭＳＣ又は骨形成性細胞は、少なくともＣＤ１０５とＣＤ３４とを共発現し得る。
【００４４】
上記態様のいずれかの一部の実施の形態では、細胞（ＭＳＣ細胞、骨形成性細胞）はヒト起源である。好ましくは、ＭＳＣは骨髄に由来し得る。
【００４５】
これらの及びさらなる態様及び実施形態が、以下の章及び特許請求の範囲において説明される。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】ＣＤ９０（ＦＩＴＣ）及びＣＤ３４（ＡＰＣ）の発現の二色フローサイトメトリー分析を示す図である。このドットプロットヒストグラムは、リストモードデータとして収集した５０００個の事象（event）を表す。
【図２】１週間の培養後のＣＤ９０／ＣＤ３４＋細胞の光学顕微鏡検査を示す図である。
【図３】添加培養条件下で増加させた後のＣＤ９０（ＦＩＴＣ）及びＣＤ３４（ＡＰＣ）の発現の二色フローサイトメトリー分析を示す図である。このドットプロットヒストグラムは、リストモードデータとして収集した５０００個の事象を表す。
【図４】ＣＤ９０／ＣＤ３４＋細胞の石灰化（Ａ）及びＡＬＰ染色（Ｂ）を示す図である
【図５】ＣＤ３４＋の百分率に対する石灰化能力の依存関係を示す図である。
【図６】ＡＬＰ染色による細胞の骨形成性を示す図である。
【図７】毛細血管様構造形成アッセイによる細胞の血管新生促進性を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
本明細書中で使用される場合、単数形「a」、「an」及び「the」は、文脈上他に明確な指示のない限り、単数及び複数の両方の指示対象を含む。
【００４８】
本明細書中で使用される場合、「含む（comprising）」、「含む（comprises）」及び「で構成される（comprised of）」という用語は、「含む（including）」、「含む（includes）」、又は「含有する（containing）」、「含有する（contains）」と同義であり、包括的又は無制限であり、付加的な、記載されていない成員、要素又は方法工程を除外するものではない。
【００４９】
端点による数値範囲の記載は、それぞれの範囲内に含まれる全ての数及び分数、並びに記載された端点を含む。
【００５０】
本明細書中で使用される場合、「約（about）」という用語は、パラメータ、量、時間幅（temporal duration）等の測定可能な値を表す場合には、特定の値の、及び特定の値から±１０％以下、好ましくは±５％以下、より好ましくは±１％以下、さらにより好ましくは±０．１％以下の変動を、開示する発明において実施するのにこのような変動が適切である限りにおいて、包含することを意味する。修飾語「約」が表す値自体も、具体的にかつ好ましく開示されると理解すべきである。
【００５１】
本明細書に引用される全ての文献は、その全体が参照により本明細書中に援用される。
【００５２】
特に規定のない限り、本発明を開示する際に使用される、技術用語及び科学用語を含む全ての用語は、本発明が属する技術分野の通常の技術を有する者（当業者）によって一般的に理解される意味を有する。さらなる指針を用いて、用語の定義が本発明の教示をよりよく理解するために記載される。
【００５３】
「幹細胞」という用語は、概して、未だ特殊化しておらず（unspecialised）又は比較的特殊化の程度が低くかつ増殖能を有する細胞であって、自己再生することができ、すなわち分化せずに増殖することができ、且つ自身又はその子孫が少なくとも１つの比較的特殊化の程度の高い細胞型を生じることができる細胞を表す。この用語は、実質的に無制限に自己再生することができる幹細胞、すなわち、幹細胞の子孫又は少なくともその一部分が、母幹細胞の未だ特殊化していない又は比較的特殊化の程度が低い表現型、分化可能性、及び増殖能力を実質的に保持している幹細胞と、限定的な自己再生を示す幹細胞、すなわち、子孫又はその一部分のさらに増殖及び／又は分化する能力が、母細胞と比較して明らかに低減している幹細胞とを包含する。例えば限定するものではないが、幹細胞は、１つ又は複数の系列に沿って分化して、段階的に比較的特殊化の程度の高い細胞を産生することができる子孫（このような子孫、及び／又は段階的に比較的特殊化の程度の高い細胞は、それ自体が本明細書で規定される幹細胞であり得る）、又はさらに、最終分化した細胞、すなわち完全に特殊化した細胞（有糸分裂後のものであり得る）を産生することができる子孫を生じることができる。
【００５４】
本明細書中で使用される場合、「成体幹細胞」という用語は、胎生期又は出生後の生物中に存在する、又はそれらから得た（例えばそれらから単離した）幹細胞を表す。
【００５５】
本明細書中で使用される場合、「間葉系幹細胞」又は「ＭＳＣ」という用語は、間葉系系列、典型的には２つ、好ましくは３つ以上の間葉系系列、例えば骨細胞（骨）系列、軟骨細胞（軟骨）系列、筋細胞（myocytic）（筋肉）系列、腱細胞（tendonocytic）（腱）系列、線維芽細胞（結合組織）系列、脂肪細胞（脂肪）系列、及び間質生成（stromogenic）（髄間質）系列の細胞を生成することができる、成体の中胚葉由来の幹細胞を表す。限定するものではないが、一般に、細胞は、当該技術分野において認められている標準的な分化条件及び細胞表現型評価方法、例えば、非特許文献１又はBarberi et al.（PLoS Med 2: e161, 2005）に記載される方法を用いて、脂肪細胞系列、軟骨細胞系列及び骨細胞系列の各々の細胞を形成することが可能であればＭＳＣであると見なすことができる。ＭＳＣ細胞は、例えば骨髄、血液、臍帯、胎盤、胎生卵黄嚢、真皮、特に胎生期及び青年期の皮膚（Young et al. 2001. Anat Rec 264: 51-62）、骨膜、並びに脂肪組織（Zuk et al. 2001. Tissue Eng 7: 211-28）から単離することができる。ヒトＭＳＣ、その単離、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの増殖及び分化は、例えば非特許文献１、米国特許第５，４８６，３５９号明細書、米国特許第５，８１１，０９４号明細書、米国特許第５，７３６，３９６号明細書、米国特許第５，８３７，５３９号明細書、又は米国特許第５，８２７，７４０号明細書に記載されている。
【００５６】
この用語は、骨髄から得られるＭＳＣ、一般に「骨髄間質細胞」又は「ＢＭＳＣ」と称されるものも包含する。ＢＭＳＣの単離用の骨髄試料は、例えば腸骨稜、大腿骨、脛骨、脊椎、肋骨又は他の髄腔から得ることができる。
【００５７】
好ましい実施形態では、本明細書中で使用される場合、ＭＳＣ又はＭＳＣ集団は骨髄に由来するものであってもよく、例えば骨髄試料から単離され、任意で増加され得る。骨髄に由来するＭＳＣ及びＭＳＣ集団は、他の組織に由来するＭＳＣとは異なる、及び／又はそれよりも都合のよい特性（例えばマーカープロファイル、機能、増加、分化等）を有していてもよく、例えば、限定するものではないが、より効率的及び／又はより制御可能に骨形成性細胞に分化することができる。
【００５８】
「ＭＳＣ」及び「ＢＭＳＣ」という用語は、ＭＳＣ又はＢＭＳＣの子孫、例えば被験体の生体試料から得られるＭＳＣ又はＢＭＳＣのｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｅｘ ｖｉｖｏ増殖によって得られる子孫も包含する。
【００５９】
特定の成分に関して「単離する（isolating）」という用語は、該特定の成分がそれにより「単離される」組成物の少なくとも１つの他の成分からその成分を分離することを示す。任意の細胞、細胞の群又は細胞集団との関係で使用される「単離（isolated）」という用語は、このような細胞、細胞の群又は細胞集団が動物又はヒトの身体の一部分を形成しないことも示唆する。
【００６０】
本明細書で開示される細胞、特にＭＳＣ細胞又は骨形成性細胞は、少なくとも１つの間葉系マーカーとＣＤ３４とを共発現する（すなわち、それらに関して陽性である）。本明細書全体を通して、「共発現する（co-express）」とは、細胞が該細胞を特徴付ける記載された特定のマーカーだけでなく、他のマーカーを発現し得るように、「の共発現を有する（comprising co-expression of）」という意味を包含することを意図する。
【００６１】
細胞が特定のマーカーに関して陽性であると言う場合、これは、当業者が、適切な測定を実施した場合、好適な対照と比較して、そのマーカーに関して、例えば抗体により検出可能な、又は逆転写ポリメラーゼ連鎖反応により検出可能な（detection）顕著なシグナルの存在又は証拠を結論づけるであろうことを意味する。本方法によりそのマーカーの定量的評価が可能になる場合、陽性の細胞は、対照と有意に異なり、より高い又はより強いシグナル、例えば、限定するものではないが、対照細胞が生成したかかるシグナルより少なくとも１．５倍高い、例えば少なくとも２倍、少なくとも４倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍高い、又はさらに高いシグナルを生成する。
【００６２】
細胞特異的マーカーの発現は、当該技術分野で既知の任意の好適な免疫学的手法、例えば免疫細胞化学的検査若しくは親和性吸着法、ウエスタンブロット分析、ＦＡＣＳ、ＥＬＩＳＡ等を使用して、又は酵素活性の任意の好適な生化学的アッセイにより、又はマーカーｍＲＮＡの量を測定する任意の好適な手法、例えばノーザンブロット、半定量的若しくは定量的ＲＴ−ＰＣＲ等により検出することができる。
【００６３】
本開示において列挙したマーカータンパク質に関する核酸及びアミノ酸の配列データは概して既知であり、公的データベース、とりわけＮＩＨの「Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｏｎ ｔｈｅ Ｗｅｂ」データベース（http://mpr.nci.nih.gov/prow/）、ＮＩＨの「Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ」データベース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=gene）、又はＵｎｉｐｒｏｔ／Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔデータベース（http://www.expasy.org/）等から得ることができる。上記マーカーに対して好適な検出試薬及び方法は、このような配列情報に基づいて設計することができるか、又はより一般的には、市販されている（例えば標識モノクローナル抗体試薬）。
【００６４】
例えば、限定するものではないが、上記データベースの登録をこの順序で参照すると、ヒトＣＤ３４抗原は、「ＣＤ３４」、遺伝子ＩＤ９４７、及びアクセッション番号Ｐ２８９０６（配列バージョン２、エントリバージョン７４）（また、Simmons et al. 1992. J Immunol 148: 267-271、Civinet al. 1984. J Immunol 133: 157）の名で存在し、ヒトＣＤ１０５抗原（エンドグリンとしても知られる）は、「ＣＤ１０５」、遺伝子ＩＤ２０２２、及びアクセッション番号Ｐ１７８１３（配列バージョン２、エントリバージョン９１）（また、Bellon et al. 1993. Eur J Immunol 23: 2340）の名で存在し、ヒトＣＤ９０抗原（Ｔｈｙ−１膜糖タンパク質としても知られる）は、「ＣＤ９０」、遺伝子ＩＤ７０７０、及びアクセッション番号Ｐ０４２１６（配列バージョン２、エントリバージョン９４）（また、Cell surface Thy-1, ed. AF Reif and M Schlesinger, 1989, MarcelDekker Inc., New York）の名で存在し、そしてヒトＣＤ７３抗原（エクト−５’−ヌクレオチダーゼ、ＥＣ３．１．３．５としても知られる）は、「ＣＤ７３」、遺伝子ＩＤ４９０７、及びアクセッション番号Ｐ２１５８９（配列バージョン１、エントリバージョン８７）（また、Thomson et al. 1990. Tissue Antigens 35: 9）の名で存在する。
【００６５】
ＣＤ３４の検出に利用可能な抗体試薬の例としては、とりわけモノクローナル抗体６Ａ６、７Ｅ１０及び４Ｈ１１が挙げられ、ＣＤ１０５の検出に利用可能な抗体試薬の例としては、とりわけモノクローナル抗体４４Ｇ４、１Ｇ２、Ｅ−９及びＧＲＥ（Letarte et al. 1995. In: Leukocyte Typing V, ed. SF Schlossman etal., Oxford University Press, Oxford, p. 1756-1759）が挙げられ、ＣＤ９０の検出に利用可能な抗体試薬の例としては、とりわけモノクローナル抗体５Ｅ１０（Craig et al. 1993. J Exp Med 177: 1331）が挙げられ、ＣＤ７３の検出に利用可能な抗体試薬の例としては、とりわけモノクローナル抗体１Ｅ９及び７Ｇ２（Thompson et al. 1990、上掲）及び４Ｇ４（Airas et al.1993. J Immunol 151: 4228）が挙げられる。
【００６６】
一実施形態では、少なくとも１つの間葉系マーカーは、ＣＤ１０５、ＣＤ９０及びＣＤ７３から選択される。好ましくは、少なくとも１つの間葉系マーカーはＣＤ９０又はＣＤ１０５であり、より好ましくは、少なくとも１つの間葉系マーカーはＣＤ１０５である。本発明は、ＣＤ１０５とＣＤ３４とを共発現する細胞、特にＭＳＣ細胞又は骨形成性細胞、ＣＤ９０とＣＤ３４とを共発現する細胞、並びにＣＤ７３とＣＤ３４とを共発現する細胞を意図する。ＣＤ１０５、ＣＤ９０及びＣＤ７３のいずれか２つ又は３つ全てをＣＤ３４と共に共発現する細胞、特にＭＳＣ細胞又は骨形成性細胞、例えば、少なくともＣＤ１０５及びＣＤ９０をＣＤ３４と共に共発現する細胞、又は少なくともＣＤ１０５及びＣＤ７３をＣＤ３４と共に共発現する細胞等も包含される。
【００６７】
実施例に示すように、上記マーカープロファイルの細胞は、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）も共発現し得る。したがって、少なくとも１つの間葉系マーカーとＣＤ３４とを共発現し、かつＡＬＰ、より好ましくは骨−肝臓−腎臓型のＡＬＰ（ＡＬＰＬ）をさらに発現する細胞、特に本明細書で開示されるようなＭＳＣ細胞又は骨形成性細胞も提供される。後者の種類のヒトＡＬＰの例は、Weiss et al. 1986（PNAS 83: 7182-7186）に、Ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔアクセッション番号Ｐ０５１８６（配列バージョン４、エントリバージョン１１０）で記載されている。ＡＬＰは、その既知の配列及び標識抗体等の市販の検出試薬を用いて、基本的には上記で説明したように検出することができる。基質、例えば４−メチルウンベリフェリルリン酸（Fernley et al. 1965. Biochem J. 97: 95-103）又はｐ−ニトロフェニルリン酸等を用いた酵素ベースのアッセイも既知である。
【００６８】
上記マーカープロファイルのＭＳＣ細胞は、典型的には間葉系細胞の他の属性も示し得る。例えば、ＭＳＣ細胞は、ＣＤ１０６（ＶＣＡＭ）、ＣＤ１６６（ＡＬＣＡＭ）、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ５４及びＧＡＴＡ−４から選択される間葉系マーカーの１つ、複数又は全てをさらに発現し得る。ＭＳＣ細胞は、或る特定の形態学的特徴、例えば組織培養プラスチックへの接着性、単層での成長、及び顕著な核小体を有する円形〜楕円形の核を持った単核の卵形、星形又は紡錘形の形状のいずれか１つ又は複数をさらに示す場合がある。
【００６９】
本明細書中で使用される場合、「骨形成性細胞」という用語は概して、骨材料及び／又は骨マトリクスの形成に寄与することが可能な細胞を表し、特に部分的に又は完全に骨形成分化経路に沿って進行した単離細胞又は細胞集団を示す。限定するものではないが、骨形成性細胞は、骨芽前駆細胞、骨芽細胞、骨細胞、及び当該技術分野で既知の他の骨形成系列の細胞型を特に包含する。
【００７０】
したがって、当業者は概して、「骨形成性細胞」という用語の範囲を本明細書で意図されるように理解する。しかし、さらなる指針を用いると、限定するものではないが、本発明の骨形成性細胞は以下の特性のいずれか１つ、複数又は全てを示し得る：
ａ）細胞がアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、より具体的には骨−肝臓−腎臓型のＡＬＰの発現を有すること；
ｂ）細胞が１型プロコラーゲンアミノ末端プロペプチド（Ｐ１ＮＰ）、オステオネクチン（ＯＮ）、オステオポンチン（ＯＰ）、オステオカルシン（ＯＣＮ）及び骨シアロタンパク質（ＢＳＰ）のいずれか１つ又は複数の発現を有すること；
ｃ）細胞が外部環境を石灰化するか、又はカルシウム含有細胞外マトリクスを合成する能力の証拠を示すこと（例えば、骨形成培地に曝露された場合；Jaiswal et al. 1997. J Cell Biochem 64: 295-312を参照されたい）。カルシウムの細胞内での蓄積、及びマトリクスタンパク質中への沈着は、例えば４５Ｃａ２＋中で培養し、洗浄及び再培養し、そしてその後細胞内に存在する若しくは細胞外マトリクス中に沈着した放射活性を確定すること（米国特許第５，９７２，７０３号明細書）により、又はアリザリンレッドベースの石灰化アッセイ（例えば、Gregory et al. 2004. Analytical Biochemistry 329: 77-84を参照されたい）を用いて、従来のように測定することができる；
ｄ）細胞が、脂肪細胞系列（例えば脂肪細胞）又は軟骨細胞系列（例えば軟骨細胞）の細胞のいずれか一方に、好ましくはいずれにも実質的に分化しないこと。これらの細胞系列へ分化しないことは、当該技術分野で確立されている標準的な分化誘導条件（例えばPittenger et al. 1999. Science 284: 143-7を参照されたい）と、アッセイ方法（例えば誘導された場合、脂肪細胞は典型的には脂質蓄積を示すオイルレッドＯで染色され、軟骨細胞は典型的にはアルシアンブルー又はサフラニンＯで染色される）とを使用して試験することができる。脂肪生成分化及び／又は軟骨形成分化への傾向を実質的に欠くとは、典型的には、試験した細胞の５０％未満、又は３０％未満、又は５％未満、又は１％未満が、それぞれの試験に適用したときに、脂肪生成分化又は軟骨形成分化の徴候を示すことを意味し得る。
【００７１】
一実施形態では、骨形成性細胞は、上記ａ）、ｃ）及びｄ）で挙げた全ての特性を示し得る。
【００７２】
本明細書で開示されるような単離ＭＳＣ細胞若しくは骨形成性細胞を含むか、又は上記細胞型の両方を含む任意の細胞集団がさらに意図される。本明細書で開示されるような上記ＭＳＣ細胞若しくは骨形成性細胞は、又は上記細胞型の両方を一緒にして、このような細胞集団中に存在する細胞の少なくとも２％、好ましくは少なくとも５％、例えば少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２０％、例えば少なくとも３０％、さらにより好ましくは少なくとも４０％、例えば少なくとも５０％、又は非常に好ましくは少なくとも６０％、例えば少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は最大で１００％を構成し得る。
【００７３】
好ましくは、本明細書で開示されるようなＭＳＣ細胞又は骨形成性細胞、又はそれらを含む細胞集団は、動物起源、より好ましくは非ヒト哺乳動物起源又はヒト起源、さらにより好ましくはヒト起源である。
【００７４】
少なくとも１つの間葉系マーカー及びＣＤ３４、並びに任意で、本明細書で開示されるような任意の付加的な対象のマーカーを共発現するＭＳＣ細胞は、それ自体が既知の方法によって得ることができる。
【００７５】
例えば、従来の方法によって、被験体の生体試料からＭＳＣ又はＢＭＳＣ細胞を単離し、任意で増加させることが可能である。
【００７６】
本明細書中で使用される場合、「生体試料」又は「試料」という用語は概して、生物源、例えば個体、器官、組織又は細胞培養物等から得られる試料を表す。非ヒト哺乳動物被験体又はヒト被験体等の動物被験体の生体試料は、上記被験体から取り出され、その細胞を含む試料を表す。被験体の生体試料を得る方法は、例えば組織生検又は血液若しくは骨髄採取のように、当該技術分野で既知である。被験体の有用な試料は、そのＭＳＣ又はＢＭＳＣ細胞を含む。このような試料は、典型的には、被験体の骨髄から、例えば腸骨稜、大腿骨、脛骨、脊椎、肋骨又は他の髄空間から得ることができる。ＭＳＣを含むさらに有用な生体試料は、例えば被験体の血液、臍帯、胎盤、胎生卵黄嚢、皮膚、骨膜又は脂肪組織から得ることができる。
【００７７】
ＭＳＣ又はＢＭＳＣを、基板表面、特に組織培養プラスチック表面に接着することができる細胞から選択し、培養することによって、骨髄又は他の供給源から単離し、増加させることができることが記載されている。この原理に基づくプロトコルは、非特許文献１及び本明細書の他の部分で言及した関連の特許文献に詳述されており、Alhadlaq & Mao 2004（Stem Cells Dev 13:436-48）において概説されている。これらのプロトコルは本明細書に適用可能である。
【００７８】
所望のマーカータンパク質を共発現する細胞を、単離して任意で増加させたＭＳＣ又はＢＭＳＣ細胞の母集団から、それ自体が既知の方法、例えば蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）、又は親和性ベースの技術、とりわけ親和性クロマトグラフィー等を用いて選択、富化又は単離することができる。所望の発現プロファイルを有する生細胞を、それぞれのマーカーに特異的な試薬（最も一般的には免疫学的試薬、例えばモノクローナル抗体等）に結合させるが、上記試薬は、例えば上記試薬によって結合されている細胞を、そのように結合されていない細胞から選択又は捕捉するのを促進するために、（例えば、フルオロフォアによって、又は磁性粒子若しくは別の種類の固定相への固定化によって）修飾されている。
【００７９】
これらの方法に関する一般的な指針については、とりわけ、Flow Cytometry and Cell Sorting, 2nd ed., by Andreas Radbruch (ed.),Springer 1999（ＩＳＢＮ ３５４０６５６３０８）、In Living Color: Protocolsin Flow Cytometry and Cell Sorting, 1st ed., by RA Diamond and S Demaggio(eds.), Springer 2000（ＩＳＢＮ ３５４０６５１４９７）、Flow CytometryProtocols (Methods in Molecular Biology), 2nd ed., by TS Hawley and RG Hawley(eds.), Humana Press 2004（ＩＳＢＮ １５８８２９２３５５）、AffinitySeparations: A Practical Approach, P Matejtschuk (ed.), Oxford UniversityPress, 1997（ＩＳＢＮ ０１９９６３５５０１）、及びDainiak et al. 2007. AdvBiochem Eng Biotechnol 106: 1-18を参照されたい。
【００８０】
本発明者らはまた、ＭＳＣ細胞又は骨形成性細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ増加、特に少なくとも１つの間葉系マーカーとＣＤ３４とを共発現する、本明細書で規定されるような単離ＭＳＣ細胞又は骨形成性細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ増加に対して有利な条件を実現したが、これは比較的不均一性の高いＭＳＣ又は骨形成性細胞集団から、少なくとも１つの間葉系マーカーとＣＤ３４とを共発現するＭＳＣ細胞又は骨形成性細胞を富化するのにも適している可能性がある。
【００８１】
「富化する」という用語は、この文脈で使用される場合、細胞集団における所望の細胞型又は細胞表現型の相対的割合を増大させることを表す。例えば、上記ＣＤ３４陽性ＭＳＣ細胞又は骨形成性細胞は、富化を受ける出発細胞集団から、得られる細胞集団中に存在する細胞の少なくとも２％、好ましくは少なくとも５％、例えば少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２０％、例えば少なくとも３０％、さらにより好ましくは少なくとも４０％、例えば少なくとも５０％、又は非常に好ましくは少なくとも６０％、例えば少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は最大で１００％にまで富化され得る。ＭＳＣ細胞若しくはＭＳＣ細胞集団、又は骨形成性細胞若しくは骨形成性細胞集団を、造血成長因子、又は血管新生成長因子、又は造血成長因子及び血管新生成長因子の組み合わせに曝露するが、後者の組み合わせは細胞増加又は富化に対して相乗効果を達成する。造血成長因子及び血管新生成長因子は、同時に又は任意の順序で順次に、好ましくは同時に細胞と接触させることができる。有利には、細胞をＦＧＦ−２に曝露、好ましくは同時に曝露して、その増加及び／又は富化をさらに向上させてもよい。
【００８２】
一実施形態では、造血成長因子は、コロニー刺激因子２（ＣＳＦ２）、ＣＳＦ３、マクロファージＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球単球ＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）、ＩＦＮ−γを含むインターフェロン（ＩＦＮ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、及び造血活性のあるサイトカイン、例えばとりわけインターロイキン２（ＩＬ２）を含むか、又はこれらから成る群から選択される。より好ましくは、造血成長因子は、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＦＮ−γから選択され、さらにより好ましくはＩＦＮ−γであり得る。一実施形態では、血管新生成長因子は、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ１又はＶＥＧＦ２）、フォン・ヴィルブランド因子（ｖＷＦ）、アンジオポエチン２、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−３又は他のＦＧＦ因子）、及びエリスロポエチン（ＥＰＯ）を含むか、又はこれらから成る群から選択される。より好ましくは、血管新生成長因子は、ＰＤＧＦ、ＦＧＦ−１及びＦＧＦ−３、さらにより好ましくはＰＤＧＦ及びＦＧＦ−３から選択され、さらにより好ましくはＰＤＧＦであり得る。
【００８３】
「曝露する」という用語は、本明細書中で使用される場合、１つ又は複数の分子、成分又は材料と別の分子、成分又は材料とを直接的又は間接的に一緒にすること、すなわち接触させ、それによってそれらの間の相互作用を促進することを意味する。典型的には、成長因子（複数可）を、細胞を培養している培地に加えることによって、上記細胞と接触させることができる。本明細書で適用可能な培地、消耗品、及び細胞培養の条件は概して、当該技術分野、例えばＭＳＣ、ＢＭＳＣ及び骨形成性細胞を増殖及び分化させる技術分野において知られている。
【００８４】
骨形成性細胞は、当該技術分野で既知のように単離ＭＳＣ細胞から分化させることによって得ることができる。一例では、単離ＭＳＣ細胞を血清又は血漿、及び塩基性線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ−２）の存在下で培養する、国際公開第２００７／０９３４３１号パンフレットの方法を使用することができる。別の例では、骨形成系列細胞は、非特許文献１及びJaiswal et al. 1997（上掲）によって記載されるように、ＭＳＣ細胞を骨形成培地中で分化させることによって得ることができる。任意で、従来の骨形成培地にＦＧＦ−２を添加してもよい。骨形成性細胞はまた、Skjodt et al. 1985（J Endocrinol 105: 391-6）によって記載されるように、骨梁から直接単離して培養してもよい。
【００８５】
一実施形態では、骨形成性細胞は、少なくとも１つの間葉系マーカーとＣＤ３４とを共発現する単離ＭＳＣ細胞から分化させることができる。このような場合、そのように得られた骨形成性細胞集団を、上記少なくとも１つの間葉系マーカーとＣＤ３４とを共発現する骨形成性細胞に関して富化することができる。別の例では、骨形成性細胞は、少なくとも１つの間葉系マーカーとＣＤ３４とを共発現する細胞に関して富化されていないＭＳＣ細胞から得てもよく、又は被験体から直接単離してもよい。このような場合、そのように得られた骨形成性細胞集団は概して、上記少なくとも１つの間葉系マーカーとＣＤ３４とを共発現する骨形成性細胞に関して富化されていない。
【００８６】
これらの状況のどれにおいても、ＭＳＣ細胞に関して上記で記載されるような手法（例えばＦＡＣＳ、ＭＡＣＳ又は親和性ベースの技術等）を同様に用いて、比較的不均一性の高い骨細胞集団から、上記少なくとも１つの間葉系マーカーとＣＤ３４とを共発現する骨形成性細胞を選択、富化又は単離することができる。上記少なくとも１つの間葉系マーカーとＣＤ３４とを共発現する骨形成性細胞は、本明細書中で教示されるような造血成長因子及び／又は血管新生成長因子を用いて富化することもできる。
【００８７】
本発明の様々な態様との関連において、「骨関連障害」という用語は、その治療が、障害を有する被験体への骨形成系列細胞又は骨形成性細胞、例えば骨芽前駆細胞、骨芽細胞又は骨細胞の投与の利益を受け得る、任意の種類の骨疾患を表す。特に、このような障害は、例えば骨形成の減少、又は過剰な骨吸収により、骨中に存在する骨芽細胞又は骨細胞の数、生存度又は機能の減少、被験体中の骨量の減少、骨痩せ、骨の強度又は弾性の損失等により、特徴づけることができる。
【００８８】
例えば限定するものではないが、該用語は、局所性又は全身性の障害、例えば任意の種類の骨粗鬆症又は骨減少症、例えば原発性、閉経後、老人性、コルチコイド誘発性、任意の二次性の、単一性骨壊死又は多部位性骨壊死、任意の種類の骨折、例えば非癒合、変形癒合、遅延癒合の骨折又は圧迫、骨融合（例えば脊髄融合及び再建）を必要とする病状、顎顔面骨折、例えば外傷性傷害又は癌外科手術後の骨再構築、頭蓋顔面骨再構築、骨形成不全症、溶骨性骨癌、パジェット病、内分泌学的障害、低リン酸血症、低カルシウム血症、腎性骨異栄養症、骨軟化症、無形成骨症、関節リウマチ、副甲状腺機能亢進症、原発性副甲状腺機能亢進症、二次性副甲状腺機能亢進症、歯周疾患、ゴーハム病（Gorham-Stout disease）並びにマクキューン・オールブライト症候群を包含する。
【００８９】
本発明によって記載されるようなものを含むＭＳＣ、ＢＭＳＣ及び骨形成性細胞及び集団は、多岐にわたって、特に骨関連障害の研究、予防及び療法の分野で使用される。
【００９０】
一態様では、細胞又は細胞集団は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで骨マトリクスを産生するために使用することができる。上記骨マトリクスは、骨関連疾患の治療において、例えば細胞若しくは細胞集団と併用して、又は併用せずに利用され得る。
【００９１】
本発明の細胞又は細胞集団を被験体に導入することは、上記被験体における骨折及び骨関連障害の治療に有用であり得る。「被験体」又は「患者」という用語は、治療、観察又は実験の対象とした、好ましくは動物、より好ましくは温血動物、さらにより好ましくは脊椎動物、さらにより好ましくは哺乳動物、具体的にはヒト及び非ヒト哺乳動物を表す。「哺乳動物」という用語は、そのように分類されるいかなる動物をも含み、ヒト、家畜（domestic and farm animals）、動物園の動物、競技用動物、愛玩動物、伴侶動物及び実験動物、例えばマウス、ラット、ハムスター、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、畜牛、乳牛、ヒツジ、ウマ、ブタ、並びに霊長類、例えばサル及び類人猿が挙げられるが、これらに限定されない。性別及び年齢層を問わず、ヒト被験体が特に好ましい。
【００９２】
本発明の治療は、特に、それを必要とする被験体に対して行なわれるが、「それを必要とする被験体」という表現は骨折又は骨関連障害等の所与の病状の治療から利益を受け得る被験体を含む。このような被験体は、上記病状と診断された被験体、上記病状を発症しやすい被験体、及び／又は上記病状が予防されるべき被験体を含み得るが、これらに限定されない。
【００９３】
「治療する」又は「治療」という用語は、既に発症した障害の治療的処置、例えば既に発症した骨関連障害の療法、及び予防的（prophylactic or preventative）措置の両方を包含し、骨関連障害の罹患及び進行の機会を予防する等のように、望ましくない苦痛が発生する機会を予防するか又は減らすことを目的とする。有益な又は所望の臨床結果は、１つ又は複数の症状、又は１つ又は複数の生物学的マーカーの軽減、疾患の範囲の縮小、安定した（すなわち悪化しない）疾患状態、疾患の進行の遅延又は緩徐化、疾患状態の改善又は緩和等を含み得るが、これらに限定されない。「治療」は、治療を受けない場合の予想生存期間と比較して、生存期間を延長することも意味し得る。
【００９４】
「予防的に有効な量」という用語は、研究者、獣医、医師又は他の臨床家によって求められるような、被験体において障害の発症を阻止するか又は遅延させる活性化合物又は医薬品の量を表す。「治療的に有効な量」という用語は、本明細書中で使用される場合、研究者、獣医、医師又は他の臨床家によって求められる、被験体において生物学的反応又は薬理反応を誘発する活性化合物又は医薬品の量を表し、とりわけ治療中の疾患又は障害の症状の軽減を含み得る。治療的及び予防的に有効な用量を確定する方法は当該技術分野で既知である。
【００９５】
治療は、自家性（すなわち、治療を受ける被験体に由来する細胞）、同種（すなわち、治療を受ける被験体以外であるが、同じ種に属する被験体（複数可）に由来する細胞）、又は異種（すなわち、治療を受ける被験体以外の種に属する被験体（複数可）に由来する細胞）の本明細書で規定されるようなＭＳＣ、ＢＭＳＣ又は骨形成性細胞又は細胞集団を利用し得る。
【００９６】
特に、本明細書中で得られるようなヒト自家性又は同種ＭＳＣ、ＢＭＳＣ又は骨形成性細胞又は細胞集団を用いたヒト被験体の治療が想定される。
【００９７】
好適には、本明細書中で得られたＭＳＣ、ＢＭＳＣ又は骨形成性細胞及び細胞集団を、医薬組成物へと製剤化して、投与することができる。
【００９８】
医薬組成物は典型的には、活性成分としての本発明のＭＳＣ、ＢＭＳＣ又は骨形成性細胞又は細胞集団、及び１つ又は複数の薬学的に許容可能な担体／賦形剤を含む。本明細書中で使用される場合、「担体」又は「賦形剤」には、あらゆる溶媒、希釈剤、緩衝液（例えば中性緩衝食塩水又はリン酸緩衝食塩水）、可溶化剤、コロイド、分散媒、ビヒクル、増量剤、キレート剤（例えばＥＤＴＡ又はグルタチオン）、アミノ酸（例えばグリシン等）、タンパク質、崩壊剤、結合剤、滑剤、湿潤剤、乳化剤、甘味剤、着色剤、香味剤、芳香剤（aromatisers）、増粘剤、デポー効果（depot effect）を達成するための薬剤、コーティング剤、抗真菌剤、防腐剤、安定化剤、酸化防止剤、浸透圧調整剤、吸収遅延剤等が含まれる。このような媒体及び薬剤の医薬品活性物質への使用は、当該技術分野で既知である。このような材料は無毒性でなくてはならず、細胞の活性を妨げるものであってはならない。
【００９９】
担体又は賦形剤又は他の材料の正確な性質は、投与経路に応じて異なる。例えば、組成物は、発熱物質を含まず、かつ好適なｐＨ、等張性及び安定性を有する、非経口で許容可能な水溶液の形態であり得る。薬用製剤の一般的な原理に関しては、Cell Therapy: Stem Cell Transplantation, Gene Therapy, and CellularImmunotherapy, by G. Morstyn & W. Sheridan eds., Cambridge UniversityPress, 1996、及びHematopoietic Stem Cell Therapy, E. D.Ball, J. Lister & P. Law, Churchill Livingstone, 2000を参照されたい。
【０１００】
このような医薬組成物は、その中での細胞の生存度を確保するためのさらなる成分を含有していてもよい。例えば、組成物は、望ましいｐＨ、より通常は中性付近のｐＨを達成する好適な緩衝系（例えば、リン酸又は炭酸緩衝系）を含んでいてもよく、細胞に対する浸透圧ストレスを防ぐ等張条件を確保するための十分な塩を含んでいてもよい。例えば、これらの目的のための好適な溶液は、当該技術分野で既知の、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、塩化ナトリウム溶液、リンガー液又は乳酸加リンガー液であり得る。さらに組成物は、細胞の生存度を増大させ得る担体タンパク質、例えばアルブミンを含んでいてもよい。
【０１０１】
医薬組成物は、骨の創傷及び欠損の修復に有用なさらなる成分を含み得る。例えば、このような成分は、限定するものではないが、骨形態発生タンパク質、骨マトリクス（例えば、本発明の細胞又は他の方法によってｉｎ ｖｉｔｒｏで産生された骨マトリクス）、ヒドロキシアパタイト／リン酸三カルシウム粒子（ＨＡ／ＴＣＰ）、ゼラチン、ポリ乳酸、ポリ乳酸グリコール酸、ヒアルロン酸、キトサン、ポリ−Ｌ−リジン及びコラーゲンを含み得る。例えば、骨芽細胞は、脱灰骨マトリクス（ＤＢＭ）、又は複合体を骨形成性（それ自体で骨を形成する）及び骨誘導性にする他のマトリクスと組み合わせてもよい。自家性骨髄細胞と共に同種ＤＢＭを使用する同様の方法により、良好な結果が得られている（Connolly et al. 1995. Clin Orthop 313: 8-18）。
【０１０２】
医薬組成物は、補完的生物活性因子、例えば骨形態発生タンパク質、例えばＢＭＰ−２、ＢＭＰ−７若しくはＢＭＰ−４、又は任意の他の成長因子を、さらに含んでいてもよいし、又はそれらと同時投与してもよい。他の考え得る共存成分は、骨再生を補助するのに好適なカルシウム又はリン酸塩の無機源を含む（国際公開第００／０７６３９号パンフレット）。必要に応じて、細胞調製物を、担体マトリクス又は担体材料上で投与して、組織再生を向上させてもよい。例えば、材料は、粒状セラミック、又は生体高分子、例えばゼラチン、コラーゲン、オステオネクチン、フィブリノーゲン若しくはオステオカルシンであり得る。多孔質マトリクスは、標準的な手法に従って合成することができる（例えば、Mikos et al., Biomaterials 14:323, 1993；Mikoset al., Polymer 35:1068, 1994；Cook et al., J. Biomed.Mater. Res. 35:513, 1997）。
【０１０３】
代替的に又は付加的に、本発明の細胞は、被験体の骨病変、例えば外科手術又は骨折の部位への導入の前に、対象となる核酸で安定的に又は一過性に形質転換することができる。対象となる核酸配列は、骨芽細胞の成長、分化及び／又は石灰化を増強する遺伝子産物をコードするものを含むがこれらに限定されない。例えば、ＢＭＰ−２に関する発現系を、難治性骨折又は骨粗鬆症を治療する目的で、安定に又は一過性に導入することができる。細胞を形質転換する方法は、当業者に既知である。
【０１０４】
さらなる一態様では、本発明は、被験体に、例えば全身的に、局所的に、又は骨病変の部位に組成物を投与するための外科用器具を含み、かつ本発明の細胞若しくは細胞集団、又は上記細胞若しくは細胞集団を含む医薬組成物をさらに含む装置であって、例えば全身的な、局所的な、又は骨病変の部位での医薬組成物の投与に適している装置に関する。例えば、好適な外科用器具は、例えば全身的に、又は骨病変の部位に、本発明の細胞を含む液体組成物を注入することができるものであってもよい。
【０１０５】
細胞又は細胞集団は、目的の組織部位にそれらが移植され又は移動して、且つ機能が欠損した領域をそれらが再構成又は再生することができるように、投与してもよい。組成物の投与は、修復される筋骨格部位に応じて異なる。例えば、骨形成は、組織を再構築する、又は開裂、若しくは人工補装具、例えば人工股関節置換具を挿入する外科手順に従って促進することができる。他の状況では、侵襲的な外科手術は必要ではなく、組成物は、注入により、又は（例えば、脊柱の修復に）誘導型内視鏡を使用して、投与することができる。
【０１０６】
一実施形態では、上で規定した医薬細胞調製物は、液体組成物の形態で投与してもよい。複数の実施形態では、細胞、又は細胞を含む医薬組成物は、全身的に、局所的に、又は病変の部位で、投与してもよい。
【０１０７】
別の実施形態では、細胞又は細胞集団を、好適な基板に移して、及び／又は好適な基板上で培養して、移植部材を提供してもよい。細胞を適用及び培養することができる基板は、金属、例えばチタン、コバルト／クロム合金又はステンレス鋼、生物活性表面、例えばリン酸カルシウム、ポリマー表面、例えばポリエチレン等であり得る。あまり好ましくはないが、ケイ質材料、例えばガラスセラミックスも、基板として使用することができる。最も好ましくは、金属、例えばチタン、及び、リン酸カルシウムは基板の不可欠な成分ではないが、リン酸カルシウムである。基板は多孔質又は非多孔質であり得る。
【０１０８】
例えば、増殖した細胞、又は培養皿で分化させている細胞を、必要に応じて、本発明の液体栄養培地中で固体支持体をインキュベートすることにより、それらを増殖させ、及び／又は分化過程を継続させるために、三次元固体支持体上に移すことができる。細胞は、例えば、上記細胞を含有する液体懸濁液に上記支持体を含浸させることにより、三次元固体支持体上に移すことができる。このようにして得られた含浸支持体は、ヒト被験体に移植することができる。このような含浸支持体を、最終的に移植する前に、液体培養培地中に浸漬することにより、再培養することもできる。
【０１０９】
三次元固体支持体は、ヒトへのその移植を可能にするために、生体適合性を有することが必要である。三次元固体支持体は、任意の好適な形状、例えば円筒、球、平板、又は任意の形状の一部分のものであり得る。生体適合性を有する三次元固体支持体に好適な材料のうち、炭酸カルシウム、特にアラゴナイト、具体的にはサンゴ骨格の形態のアラゴナイト、アルミナ、ジルコニア、リン酸三カルシウムをベースとする多孔質セラミックス、及び／又はヒドロキシアパタイト、炭酸カルシウムをヒドロキシアパタイトに変換することができる水熱交換により得られる擬似サンゴ骨格、又は他にはアパタイト−珪灰石ガラスセラミックス、生物活性ガラスセラミックス、例えばＢｉｏｇｌａｓｓ（商標）ガラスに特に言及することができる。
【０１１０】
上述の態様及び実施形態を、以下の非限定的な例によりさらに裏づける。
【実施例】
【０１１１】
実施例では、骨形成性及び血管新生促進性が向上した、高レベルのＣＤ３４（造血−血管新生（haemato-angiogenic）特性）及びＣＤ１０５（間葉系特性）を共発現する間葉系間質細胞に由来する骨芽前駆細胞の新たな集団サブセットの単離を実証する。この集団は標準的に増加した間葉系間質細胞の１％未満を占めるにすぎない。しかしながら、この集団は、二重（dual）細胞選別によって及び／又は特別な条件下での培養によって最大で９０倍まで首尾よく富化することができる。このような（例えば５％〜５０％まで）富化したＣＤ１０５／ＣＤ３４＋細胞集団は、有意に高い増殖可能性及び有意に高い骨再構築性を有するため、骨疾患の治療に関して非常に重要である。加えて、その血管新生（ＣＤ３４＋）性は、血管再生誘導及び骨再構築の組み合わせが好ましい場合に、治療利益を増大させる。
【０１１２】
実施例１
骨髄ＭＳＣの単離及び培養
１００ｍｌのヘパリン処置した骨髄（ＢＭ）を、患者の腸骨稜、又は健康なボランティアから得た。ＢＭを、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、２ｖ：ｖ）と混合し、密度勾配フィコール溶液上に重層した。遠心分離後、単核細胞を界面から回収し、ＰＢＳ中で２回洗浄した。細胞を、２０％血漿を添加し、任意でＦＧＦ−２を添加したＤＭＥＭ培地中に再懸濁した。細胞を、１×１０７細胞／１７５ｃｍ２でフラスコにプレーティングし（試験範囲１×１０５〜１×１０９）、５％ＣＯ２を含有する３７℃加湿雰囲気中で維持した。細胞を１日〜４日間付着させた後、初期培地を交換し、続いて下記に定めた期間で培養した。
【０１１３】
ＣＤ３４陽性細胞の単離
１４日間の標準的な間葉培養（ＤＭＥＭ及び２０％血漿）後、約１×１０８個の細胞を回収し、ＰＢＳ中で維持した。次いで、全細胞集団を室温で１時間、ＡＰＣ標識抗ＣＤ３４モノクローナル抗体で標識した。ＰＢＳによる洗浄工程の後、細胞を遠心分離によって沈降させ、１ｍｌの脱気した（degasses）冷選別バッファー中に再懸濁した。
【０１１４】
細胞の精製を、Becton Dickinsonのイムノサイトメトリーシステム上で行った。細胞を６８０ｎｍでの緑色蛍光パラメータを用いて選別した後、蛍光細胞を含有する液滴を滅菌微小遠心管（Fisher scientific）に収集し、遠心分離によって沈降させ、割り当てられた（appropriated）フラスコに即座に播種した。
【０１１５】
培養による富化
２８日目に、３７℃で１分間〜５分間トリプシン溶液を使用して、ＭＳＣ細胞を剥がした。細胞を計数し、１×１０６細胞／１７５ｃｍ２でプレーティングし、実施例中で定めた成長因子を用いて又は用いずに、同じ標準的な条件でさらに１週間培養した。
【０１１６】
表現型分析
免疫生物学的細胞表面マーカーをフローサイトメトリーにより分析した。細胞を以下の標識モノクローナル抗体：ＣＤ１０５、ＣＤ９０及びＣＤ７３、並びにＣＤ３４と共に１５分間インキュベートし、その後ＰＢＳで洗浄した後、遠心分離し、０．３ｍｌのＰＢＳ中に再懸濁した。
【０１１７】
ＡＬＰ染色
２８日目又は３５日目に、細胞をＡＬＰ検出のために染色した。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、その後室温で３０秒間、６０％クエン酸緩衝アセトンで固定した後、再度蒸留水で４５秒間すすいだ。次いで、細胞を室温、暗所で３０分間、ファストブルーＲＲ／ナフトールＡＳ−ＭＸフォスフェート溶液を用いて染色した。細胞を蒸留水で２分間洗浄した後、Mayerのヘマトキシリン溶液中で１０分間対比染色した。最後に、細胞を蒸留水で３分間洗浄した。
【０１１８】
石灰化アッセイ
２８日目又は３５日目に、細胞をトリプシンと共にインキュベートすることによって培養物から回収し、６０〜１２００００細胞／ウェルで、６ウェルプレートの増加培地にプレーティングした（１２５００細胞／ｃｍ２）。翌日、培地を２．５ｍｌの骨形成培地と交換した。細胞を２週間、３週間又は４週間培養した。培地は３日〜４日毎に交換した。２週間の培養後、細胞を、３．７％ホルムアルデヒド／ＰＢＳ中で固定し、アリザリンレッドにより染色した。
【０１１９】
ネットワーク形成アッセイ
細胞集団が毛細血管様構造のネットワークを形成する能力を評価するために、マトリゲル管形成アッセイを行った。簡潔に述べると、２４ウェル培養プレートを、１ウェル当たり１０μｌ（３．５ｍｇ／ｍｌ）の純粋な成長因子低減マトリゲル（ＢＤ Ｍａｔｒｉｇｅｌ Ｂａｓｅｍｅｎｔ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｍａｔｒｉｘ、BD Biosciences、Erembodegem-Aalst、Belgium）を用いて、メーカーの使用説明書に従ってコーティングした後、３７℃で３０分間重合させた。合計で３０×１０３細胞／ウェルをマトリゲル上に播種し、３７℃で６時間インキュベートした。洗浄した後、倒立位相差顕微鏡を用いてネットワーク形成及び管形成を観察した。
【０１２０】
培地
デキサメタゾン希釈物：
Ｄｅｘ１（５×１０−４Ｍ）：２μｌのデキサメタゾン原液（５×１０−２Ｍ）＋１９８μｌのα−ＭＥＭ
Ｄｅｘ２（１０−６Ｍ）：２μｌのＤｅｘ１（５×１０−４Ｍ）＋９９８μｌのαＭＥＭ
骨形成培地（４０ｍｌ）
容量 最終濃度
αＭＥＭ ３１ｍｌ ／
ＦＣＳ ６ｍｌ １５％
ＰｅｎＳｔｒｅｐＧｌｕ（１００×） ４００μｌ １×
デキサメタゾン（Ｄｅｘ２） ４００μｌ １０−８Ｍ
アスコルビン酸 ２００μｌ ５０μｇ／ｍｌ
β−グリセロリン酸 ２ｍｌ １０ｍＭ
【０１２１】
実施例２
細胞表現型
実施例１（「骨髄ＭＳＣの単離及び培養」）で説明したように得られ、細胞選別又は成長因子刺激を行っていないＭＳＣ細胞集団は、その間葉系起源と一致して、高レベルの間葉系マーカー（ＣＤ９０、ＣＤ１０５及びＣＤ７３）を発現した。造血ＣＤ３４表面分子は低レベル（通常、全集団の５％〜１５％）で発現された。細胞の骨分化能（bone potential）を表すＡＬＰマーカーも高度に発現された（表１及び表２）。ＣＤ３４＋細胞の３分の１がＣＤ９０＋でもあった（図１−低レベル及び高レベルのＣＤ９０／ＣＤ３４＋発現）。
【０１２２】
【表１】
【０１２３】
【表２】
【０１２４】
実施例３
ＣＤ３４陽性細胞の単離
実施例１（「骨髄ＭＳＣの単離及び培養」）で説明したように行った、細胞選別前の第１の増加工程の終了時に、ＭＳＣ細胞をフラスコから回収した。ＣＤ９０／ＣＤ３４＋集団を単離するために、フローサイトメトリー選別による陽性選択の方法を用いた。細胞をまず、特異的ＡＰＣ結合抗ＣＤ３４抗体溶液で染色した。次いで、細胞集団をBecton Dickinsonの蛍光活性化細胞選別装置に注入し、ＣＤ３４標識細胞を集団から単離した。ＣＤ３４＋細胞を次に、リン酸緩衝食塩溶液中に収集した。
【０１２５】
細胞の一定分量を分析して、純度を確認した。１×１０８個の初期細胞から平均で約５０×１０６個の細胞を選別したが、その１５％〜９０％がＣＤ９０／ＣＤ３４＋骨芽前駆細胞であった。これは１０倍〜３０倍の富化に相当する。これらの細胞を同じ条件下でさらに培養した。
【０１２６】
実施例４
増加方法
実施例３で説明したように得られた単離ＣＤ３４＋細胞を、１週間の培養プロトコルで増加させた。単離画分のうち約７０％〜７５％が精製工程まで生存した。これらの細胞を、成長因子及びサイトカインを添加した、血漿を含有する標準培地中でインキュベートした。代替的に、選別していない細胞を同様に培養することができた。選別の有無にかかわらず同様の結果が得られた。
【０１２７】
単独の又は組み合わせた造血因子（例えばＣＳＦ２、ＣＳＦ３、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ、ＴＮＦ、又はＩＬ２等のサイトカイン）と共にインキュベートした細胞は、標準的な条件で成長させた細胞と同じ収率で成長させることが可能であった。しかしながら、単独の又は組み合わせた血管新生因子（例えばＦＬＴ１、ＰＤＧＦ、ＶＥＧＦ、ｖＷＦ、アンジオポエチン２、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−３及びＥＰＯ）と共にインキュベートした細胞の収率は、標準的な条件で得られる収率よりも平均で２５％高かった。より興味深いことに、造血因子及び血管新生因子両方の組み合わせは、５０％近くという最も高い増加収率の増大をもたすことが可能であった。これは、この組み合わせの相乗効果を示唆している。
【０１２８】
骨形成培地中でインキュベートした細胞を対照として使用したが、これはＣＤ９０／ＣＤ３４＋初期集団の中程度の増加率を示す。
【０１２９】
例えば、ＦＧＦ−２の存在下で造血因子ＧＭ−ＣＳＦと共にインキュベートした細胞は、その収率をＧＭ−ＣＳＦ又はＦＧＦ−２単独と比べて大幅に増大させた（表３）。
【０１３０】
【表３】
【０１３１】
さらに、１週間の培養後のＣＤ９０／ＣＤ３４＋細胞の形態は、初期骨形成性細胞と同じ紡錘状であった（図２）。
【０１３２】
これらの骨芽前駆細胞は、（培養期間中）常に接着したままであり、このことはこの新たな集団が循環することはなく、したがって循環骨芽細胞系列（例えば、Eghbali-Fatourechi et al. 2007. Bone 40: 1370-7の骨芽細胞）とは区別されることを示唆する。
【０１３３】
これらの細胞の増加終了時の表面マーカープロファイルを、標準的な培養条件で分析した。ＣＤ３４マーカーは高レベルで維持されたが、他の間葉系マーカー又は骨特異的マーカーは変化しなかった。これにより、骨形成特性（ＡＬＰ）及び造血特性（ＣＤ３４陽性）の両方を併せ持つ新たな集団の発見が支持される（表４及び図３）。
【０１３４】
【表４】
【０１３５】
実施例５
骨再構築性
この（ＧＭ−ＣＳＦ及びＦＧＦ−２の組み合わせの存在下で実施例３において得られるような）新たな集団の生物学的性質を、ＡＬＰ産生（ＡＬＰ染色）、並びに新たな骨マトリクスを形成及び石灰化するその能力を測定することによって評価した。ＣＤ３４＋細胞は、相当量の骨マトリクスを産生し（最大値２のスコアで２）、ＡＬＰ染色処置に対して有意に陽性であり（最大値２のスコアで２）、この細胞集団に高い骨再構築可能性があったことが示唆される（図４）。比較としては、標準的なＭＳＣ培養物の骨マトリクススコアは１〜１．５であり、ＡＬＰ染色スコアは１．５である。
【０１３６】
興味深いことに、集団中のＣＤ３４＋細胞の％が高いほど、石灰化能力も高くなることが示された（図５）。
【０１３７】
実施例６
ＭＳＣ及び骨形成性細胞の増加、富化及びその性質
造血成長因子及び／又は血管新生成長因子の存在下での増殖（表５）
細胞に対し、実施例１（「培養による富化」）で説明したような富化プロトコルを行った。
【０１３８】
表５（ｎ＝３）に示されるように、ＦＧＦ−２（２ｎｇ／ｍｌ）は、対照条件（ＦＢＳ１５％）と比較して、特異的骨形成性細胞集団の増殖及び増加を誘導した。本発明者らのデータによって、ＦＧＦ−２の存在下で、ＧＭ−ＣＳＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）又はＩＦＮ−γ（１０ｎｇ／ｍｌ）のいずれかを用いると、この骨形成性細胞集団の生成及び／又は増殖が得られ及び／又は維持され、ＦＧＦ−１（２ｎｇ／ｍｌ）、ＦＧＦ−３（２ｎｇ／ｍｌ）又はＰＤＧＦ（１ｎｇ／ｍｌ）の血管新生成長因子を用いると有意に増大することがさらに明らかになった。
【０１３９】
【表５】
【０１４０】
表現型特性化（表６）
増加させた骨形成性細胞のフローサイトメトリー分析（ｎ＝３）によって、この選択された細胞集団が、ＣＤ３４をＣＤ１０５、ＣＤ７３及びＣＤ９０等の典型的な間葉系細胞マーカーと共に発現するが、ＣＤ４５、ＣＤ１３３及びＣＤ３１抗原等の造血細胞表面マーカー及び内皮細胞表面マーカーを欠くという特異的な表現型プロファイルを示したことが実証された。
【０１４１】
【表６】
【０１４２】
骨形成性（表７、図６）
増加させた骨形成性細胞集団のフローサイトメトリー分析及びＡＬＰ染色によって、これらの細胞が強い骨形成性を示すことが示された（ｎ＝３）。さらに、興味深いことに、ＩＦＮ−γがＡＬＰ発現及び染色の両方を選択的かつ大幅に増大させ、それにより細胞の骨形成特性を向上させることが示された。
【０１４３】
【表７】
【０１４４】
血管新生促進性及び毛細血管様構造形成可能性（表７、図７）
増加させた骨形成性細胞のフローサイトメトリー分析によって、ｖＷＦ及びＶＥＧＦ分子発現の上方制御が実証された（ｎ＝３）。さらに、図７に示すように（ｎ＝１）、本発明者らのデータによって、この骨形成性細胞集団がマトリゲルモデルにおいて分岐した新生血管構造及び偽管へと分化及び組織化可能であることが示された。加えて、ＩＦＮ−γがこのネットワーク形成を、対照（及び他の造血因子及び／又は血管新生因子）と比較して明らかに向上させることが示された。これらのｉｎ ｖｉｔｒｏでの結果は、ＩＦＮ−γ及び増加させた骨形成性細胞集団の両方が、管形成及び毛細血管様構造の発生を促進する能力（血管新生促進効果）を有することを示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は概して、細胞表現型及び細胞分化の分野に関し、医学における細胞の使用に関する。より具体的には、本発明は新たな間葉系幹細胞（ＭＳＣ）型及び新たな骨形成性細胞型を同定し、上記ＭＳＣの骨形成分化、並びに骨疾患における上記ＭＳＣ及び上記骨形成性細胞の治療的及び予防的用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨形成分化を受けることが可能であるか、又はその傾向を有する幹細胞の移植は、骨関連疾患の治療に対して、特に治療に新たな骨の産生が必要となる場合に有望な手段（avenue）である。
【０００３】
骨髄間質細胞又は間葉系幹細胞（ＢＭＳＣ又はＭＳＣと略される）は、成体骨髄及び幾つかの他の組織から、これらの細胞の組織培養プラスチックへの接着性に基づいて容易に単離し、増加させることができる。ＭＳＣは主に三分化能性の（tri-potential）中胚葉関連運命、すなわち骨形成分化、脂肪細胞分化及び軟骨細胞分化を受ける能力を示すが（非特許文献１）、神経細胞、肝細胞及び筋細胞を産生することが可能なＭＳＣも報告されている（非特許文献２）。
【０００４】
ＭＳＣは可溶性表面マーカー、中でもＣＤ１０５、ＣＤ９０及びＣＤ７３を含めて、それらの発現によって規定することができる。さらに、従来技術では一般に、ＭＳＣがＣＤ３４抗原に対して陰性であることが示されており、ＣＤ３４抗原はむしろ未熟血液細胞及び内皮細胞において高度に発現されることが知られている。特に、ＣＤ３４陽性の骨髄起源ＭＳＣは、これまでに説明されていなかった。また、ＣＤ３４陽性ＭＳＣ、特に骨髄に由来するＣＤ３４陽性ＭＳＣに関して、骨形成性及び骨再生（osteoregenerative）性の向上は以前には記載されていなかった。
【０００５】
骨髄移植は骨障害を治療するために利用されている（非特許文献３）。しかしながら、ＭＳＣは骨髄試料中に存在する全ての細胞のうちわずかな割合しか占めず、さらには多様な骨形成分化の傾向を示すことができるため、そのように移植された細胞のかなりの割合が最終的に所望の骨組織の形成に寄与しないだろう。実際、ヒト成体間葉系幹細胞前駆細胞の約１４％しか骨形成能を維持しないことが示されている（非特許文献４）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Pittenger et al. 1999. Science 284: 143-7
【非特許文献２】Prockop 1997. Science 276: 71-4
【非特許文献３】Gangji et al. 2005. Expert Opin Biol Ther 5: 437-42
【非特許文献４】D'Ippolito et al. 1999. J Bone Miner Res. 14: 1115-22
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
以上の点を鑑みると、間葉系幹細胞からの骨芽前駆細胞、骨芽細胞又は骨形成性細胞の産生収率を改善することが引き続き必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、単離し、任意で増加させたＭＳＣ細胞の小サブセットが、少なくとも１つの間葉系マーカー、例えばＣＤ９０又はＣＤ１０５、より好ましくは少なくともＣＤ１０５を、一般に細胞の未熟血液的及び内皮的特質を表すと考えられるマーカーであるＣＤ３４と共に共発現することを結論付けた。
【０００９】
一般的なＭＳＣ細胞集団と比べると、この新たな細胞型は、骨細胞マーカーであるアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）を有意なレベルで発現し、新たな骨マトリクスを合成及び石灰化することができる。したがって、該細胞は、骨再構築に有用な骨形成性細胞を産生する比較的高い可能性を有する。本発明者らはまた、該細胞を大いに増加させることができ、それにより特に骨障害に対する細胞ベース療法にとって十分な量の骨形成性細胞を生成可能であることに気付いた。本発明者らは、その表現型的性質及び生物学的性質を維持する上記細胞サブタイプに関してＭＳＣ細胞を富化することに成功した。
【００１０】
本発明の一態様は、少なくとも１つの間葉系マーカーとＣＤ３４とを共発現することを特徴とする単離間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を提供する。
【００１１】
さらなる態様は、少なくとも１つの間葉系マーカーとＣＤ３４とを共発現するＭＳＣ細胞を得る方法であって、ＭＳＣ細胞集団から、上記少なくとも１つの間葉系マーカーとＣＤ３４とを共発現する細胞のサブセットを富化又は単離することを含む、方法を提供する。実施の形態は、少なくとも１つの間葉系マーカーとＣＤ３４とを共発現するＭＳＣ細胞を得る方法であって、（ａ）被験体の試料からＭＳＣ細胞を単離すること、（ｂ）任意で、（ａ）のＭＳＣ細胞を富化する及び／又は増加させること、並びに（ｃ）（ａ）又は（ｂ）のＭＳＣ細胞から、少なくとも１つの間葉系マーカーとＣＤ３４とを共発現する細胞のサブセットを富化又は単離することを含む、方法を提供する。
【００１２】
別の態様は、ＭＳＣ細胞集団から、少なくとも１つの間葉系マーカーとＣＤ３４とを共発現する細胞のサブセットを単離することを含む方法によって得ることができるＭＳＣ細胞に関する。実施の形態は、（ａ）被験体の試料からＭＳＣ細胞を単離すること、（ｂ）任意で、（ａ）のＭＳＣ細胞を増加させること、並びに（ｃ）（ａ）又は（ｂ）のＭＳＣ細胞から、少なくとも１つの間葉系マーカーとＣＤ３４とを共発現する細胞のサブセットを単離することを含む複数の工程によって得ることができるＭＳＣ細胞を提供する。
【００１３】
上述の態様のいずれかにおいて規定されるような、少なくとも１つの間葉系マーカーとＣＤ３４とを共発現する単離間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を含む細胞集団も提供される。
【００１４】
本発明が、上記で教示されるようなＭＳＣ細胞及び細胞集団、例えば少なくとも１つの間葉系マーカーとＣＤ３４とを共発現するＭＳＣ細胞並びにこのようなＭＳＣ細胞を含む細胞集団の様々な操作、とりわけ培養、維持、増加、富化（例えば選別による）、並びに上記ＭＳＣ細胞及び細胞集団の富化後の増加も含めて包含していることを理解されよう。
【００１５】
さらなる態様は、単離間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、好ましくは本明細書中で教示されるような少なくとも１つの間葉系マーカーとＣＤ３４とを共発現する単離ＭＳＣを、インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で増加させる方法であって、上記ＭＳＣ細胞を造血成長因子及び／又は血管新生成長因子、好ましくは造血成長因子及び血管新生成長因子、例えば１つ又は複数の造血成長因子及び／又は１つ又は複数の血管新生成長因子に曝露することを含む、方法を提供する。
【００１６】
この方法はまた、好適な培養条件を用いて、ＭＳＣ集団（すなわち、比較的不均一性の高いＭＳＣ集団）から、少なくとも１つの間葉系マーカーとＣＤ３４とを共発現するＭＳＣ細胞を得ること、及び／又はＭＳＣ集団（すなわち、比較的不均一性の高いＭＳＣ集団）を少なくとも１つの間葉系マーカーとＣＤ３４とを共発現するＭＳＣ細胞に富化することに適合する場合もある。この方法は、上記比較的不均一性の高いＭＳＣ集団（例えば、被験体の試料から単離したＭＳＣ細胞）を、造血成長因子及び／又は血管新生成長因子、好ましくは造血成長因子及び血管新生成長因子、例えば１つ又は複数の造血成長因子及び／又は１つ又は複数の血管新生成長因子に曝露することを必要とする。
【００１７】
有利には、該方法によって、出発又は初期ＭＳＣ細胞集団から、ＣＤ３４と１つ又は複数の間葉系マーカー、例えば、好ましくはＣＤ１０５、ＣＤ９０及び／又はＣＤ７３、同様に好ましくは少なくともＣＤ１０５、との発現を有するＭＳＣ細胞が得られる及び／又は富化される場合がある。有利には、富化されたＭＳＣ細胞は、造血マーカー及び／又は内皮マーカー、例えばＣＤ４５、ＣＤ１３３、ＣＤ３１、ＣＤ１４及び／又はＣＤ１９の発現を欠いている場合がある。したがって、実施の形態では、富化されたＭＳＣ細胞は、ＣＤ３４、並びにＣＤ１０５、ＣＤ９０及びＣＤ７３の１つ又は複数、又は好ましくは全て、同様に好ましくは少なくともＣＤ１０５の発現を有し、ＣＤ４５、ＣＤ１３３、ＣＤ３１、ＣＤ１４及びＣＤ１９の１つ又は複数、又は好ましくは全ての発現を欠いている場合がある。有利には、本方法は、該方法を適用する過程で、初期ＭＳＣ集団におけるＣＤ３４及び１つ又は複数の間葉系マーカーの共発現を有するＭＳＣ細胞の割合の増大を実現する（例えば、非限定的な実験では、ＣＤ１０５陽性ＭＳＣ細胞及びＣＤ３４陽性ＭＳＣ細胞の割合は培養の間に、それぞれ１５％から９５％、及び１％から５９．４％へと増大した）。
【００１８】
有利には、本明細書中で教示されるような造血成長因子及び／又は血管新生成長因子に曝露することによって増加及び／又は富化されたＭＳＣ細胞は、十分な骨形成性（例えば、ＡＬＰの発現及び染色によって示される）、及び有益な血管新生促進性（例えば、好適なアッセイにおいて、ｖＷＦ及びＶＥＧＦの発現によって、及び／又は毛細血管様構造の形成によって示される）の両方を示す場合がある。
【００１９】
したがって、骨形成性（限定するものではないが、好適にはＡＬＰ発現、ＡＬＰ酵素活性及び／又はＡＬＰ染色によって示される）、及び血管新生促進性（限定するものではないが、好適にはマトリゲルモデル等の好適なモデルにおけるｖＷＦ及び／又はＶＥＧＦ、好ましくはｖＷＦ及びＶＥＧＦの発現によって、及び／又は分岐した新生血管構造又は偽管（pseudotubes）へと組織化する能力によって示される）の両方を示す、概してＭＳＣ細胞、特に少なくとも１つの間葉系マーカーとＣＤ３４とを共発現するＭＳＣ細胞も本明細書中に開示される。このようなＭＳＣ細胞を含む細胞集団がさらに意図される。
【００２０】
ＭＳＣ細胞又は細胞集団を、造血成長因子及び／又は血管新生成長因子を用いて増加させるか、又は富化する上記の方法によって得ることができるか、又は直接得られるＭＳＣ細胞も提供される。
【００２１】
別の態様は、上述の態様において規定されるような少なくとも１つの間葉系マーカーとＣＤ３４とを共発現する間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を、骨形成性細胞、例えば骨芽細胞又は骨芽前駆細胞にｉｎ ｖｉｔｒｏで分化させる方法に関する。
【００２２】
さらなる態様は、上述の態様において規定されるような少なくとも１つの間葉系マーカーとＣＤ３４とを共発現する間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を、骨形成性細胞にｉｎ ｖｉｔｒｏで分化させることによって得ることができる骨形成性細胞、例えば骨芽細胞又は骨芽前駆細胞を提供する。
【００２３】
このような骨形成性細胞の少なくとも一部は、元のＭＳＣ細胞に関連する発現プロファイルを維持することができるため、別の態様は、少なくとも１つの間葉系マーカーとＣＤ３４とを共発現することを特徴とする単離骨形成性細胞、例えば骨芽細胞又は骨芽前駆細胞を提供する。
【００２４】
少なくとも１つの間葉系マーカーとＣＤ３４とを共発現する単離骨形成性細胞を含む細胞集団がさらに開示される。したがって、本明細書中で教示されるような少なくとも１つの間葉系マーカーとＣＤ３４とを共発現する単離ＭＳＣを含み、且つ本明細書中で教示されるような少なくとも１つの間葉系マーカーとＣＤ３４とを共発現する単離骨形成性細胞をさらに含む細胞集団も開示される。
【００２５】
本発明が、上記に教示されるような骨形成性細胞及び細胞集団、例えば少なくとも１つの間葉系マーカーとＣＤ３４とを共発現する骨形成性細胞、並びにこのような骨形成性細胞を含む細胞集団の様々な操作、とりわけ培養、維持、増加、富化（例えば選別による）、並びに上記骨形成性細胞及び細胞集団の富化後の増加も含めて包含していることも理解されよう。
【００２６】
少なくとも１つの間葉系マーカーとＣＤ３４とを共発現する骨形成性細胞を得る方法であって、上記少なくとも１つの間葉系マーカーとＣＤ３４とを共発現するＭＳＣ細胞を、骨形成性細胞に分化させることを含む、方法も開示される。
【００２７】
少なくとも１つの間葉系マーカーとＣＤ３４とを共発現するこのような骨形成性細胞は、他の方法によっても得ることができる。したがって、少なくとも１つの間葉系マーカーとＣＤ３４とを共発現する骨形成性細胞を得る方法であって、骨形成性細胞の集団から、上記少なくとも１つの間葉系マーカーとＣＤ３４とを共発現する細胞のサブセットを富化又は単離することを含む、方法も開示される。実施の形態は、少なくとも１つの間葉系マーカーとＣＤ３４とを共発現する骨形成性細胞を得る方法であって、（ａ）被験体の試料から骨形成性細胞を単離すること、又は被験体の試料から単離したＭＳＣ細胞から骨形成性細胞を分化させること、（ｂ）任意で、（ａ）の骨形成性細胞を富化する及び／又は増加させること、並びに（ｃ）（ａ）又は（ｂ）の骨形成性細胞から、少なくとも１つの間葉系マーカーとＣＤ３４とを共発現する細胞のサブセットを富化又は単離することを含む、方法を提供する。
【００２８】
さらなる態様は、単離骨形成性細胞、好ましくは本明細書中で教示されるような少なくとも１つの間葉系マーカーとＣＤ３４とを共発現する単離骨形成性細胞を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで増加させる方法であって、上記骨形成性細胞を造血成長因子及び／又は血管新生成長因子、好ましくは造血成長因子及び血管新生成長因子、例えば１つ又は複数の造血成長因子及び／又は１つ又は複数の血管新生成長因子に曝露することを含む、方法を提供する。
【００２９】
この方法はまた、好適な培養条件を用いて、骨形成性細胞集団（すなわち、比較的不均一性の高い骨形成性細胞集団）から、少なくとも１つの間葉系マーカーとＣＤ３４とを共発現する骨形成性細胞を得る、及び／又は骨形成性細胞集団（すなわち、比較的不均一性の高い骨形成性細胞集団）を少なくとも１つの間葉系マーカーとＣＤ３４とを共発現する骨形成性細胞に富化するのに適する場合もある。この方法は、上記比較的不均一性の高い骨形成性細胞集団（例えば、被験体の試料から単離した骨形成性細胞、又は被験体の試料から単離したＭＳＣ細胞から分化させた骨形成性細胞）を、造血成長因子及び／又は血管新生成長因子、好ましくは造血成長因子及び血管新生成長因子、例えば１つ又は複数の造血成長因子及び／又は１つ又は複数の血管新生成長因子にｉｎ ｖｉｔｒｏで曝露することを必要とする。
【００３０】
有利には、該方法によって、出発又は初期骨形成性細胞集団から、ＣＤ３４と１つ又は複数の間葉系マーカー、例えば、好ましくはＣＤ１０５、ＣＤ９０及び／又はＣＤ７３、同様に好ましくは少なくともＣＤ１０５との発現を有する骨形成性細胞が得られる及び／又は富化される場合がある。有利には、富化された骨形成性細胞は、造血マーカー及び／又は内皮マーカー、例えばＣＤ４５、ＣＤ１３３、ＣＤ３１、ＣＤ１４及び／又はＣＤ１９の発現を欠いている場合がある。したがって、実施の形態では、富化された骨形成性細胞は、ＣＤ３４、並びにＣＤ１０５、ＣＤ９０及びＣＤ７３の１つ又は複数、又は好ましくは全て、同様に好ましくは少なくともＣＤ１０５の発現を有し、ＣＤ４５、ＣＤ１３３、ＣＤ３１、ＣＤ１４及びＣＤ１９の１つ又は複数、又は好ましくは全ての発現を欠いている場合がある。有利には、本方法は、該方法を適用する過程で、初期骨形成性細胞集団におけるＣＤ３４及び１つ又は複数の間葉系マーカーの共発現を有する骨形成性細胞の割合の増大を実現する。
【００３１】
有利には、本明細書中で教示されるような造血成長因子及び／又は血管新生成長因子に曝露することによって増加及び／又は富化された骨形成性細胞は、十分な骨形成性（例えば、ＡＬＰの発現及び染色によって示される）、及び有益な血管新生促進性（例えば、好適なアッセイにおいて、ｖＷＦ及びＶＥＧＦの発現によって、及び／又は毛細血管様構造の形成によって示される）の両方を示す場合がある。
【００３２】
したがって、骨形成性（限定するものではないが、好適にはＡＬＰ発現、ＡＬＰ酵素活性及び／又はＡＬＰ染色によって示される）、及び血管新生促進性（限定するものではないが、好適にはマトリゲルモデル等の好適なモデルにおけるｖＷＦ及び／又はＶＥＧＦ、好ましくはｖＷＦ及びＶＥＧＦの発現によって、及び／又は分岐した新生血管構造又は偽管へと組織化する能力によって示される）の両方を示す、概して骨形成性細胞、特に少なくとも１つの間葉系マーカーとＣＤ３４とを共発現する骨形成性細胞も本明細書中に開示される。このような骨形成性細胞を含む細胞集団がさらに意図される。
【００３３】
骨形成性細胞又は細胞集団を、造血成長因子及び／又は血管新生成長因子を用いて増加させるか、又は富化する上記の方法によって得ることができるか、又は直接得られる骨形成性細胞も提供される。
【００３４】
実施の形態では、造血成長因子は、当該技術分野で既知の明らかな造血活性を有する任意の成長因子、例えば造血細胞を動員する、その増殖を誘導する、及び／又は造血細胞を刺激することが可能な任意の成長因子を含み得る。実施の形態では、本明細書全体を通して意図される造血成長因子は、コロニー刺激因子２（ＣＳＦ２）、ＣＳＦ３、マクロファージＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球単球ＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターフェロン（ＩＦＮ）、とりわけＩＦＮ−α及びＩＦＮ−γ、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、並びに造血活性のあるサイトカイン、とりわけインターロイキン２（ＩＬ２）、ＩＬ４、ＩＬ１７及びＩＬ１８を含むか、又はこれらから成る群から選択される。好ましくは、造血成長因子は、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＦＮ−γから選択され、より好ましくはＩＦＮ−γであり得る。
【００３５】
実施の形態では、血管新生成長因子は、当該技術分野で既知の明らかな血管新生活性を有する任意の成長因子、例えば内皮細胞を動員するか、又は内皮細胞による毛細血管構造の形成を誘導することが可能な任意の成長因子を含み得る。実施の形態では、本明細書全体を通して意図される血管新生成長因子は、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、とりわけＰＤＧＦａａ、ＰＤＧＦａｂ、ＰＤＧＦｂｂ、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ１又はＶＥＧＦ２）、フォン・ヴィルブランド因子（ｖＷＦ）、アンジオポエチン１又はアンジオポエチン２、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−３、若しくは他のＦＧＦ因子；又はＦＧＦ−１以外、及び／又はＦＧＦ−２以外のＦＧＦ因子）、並びにエリスロポエチン（ＥＰＯ）を含むか、又はこれらから成る群から選択される。別の実施の形態では、血管新生成長因子は、ＰＤＧＦ、ＶＥＧＦ、ｖＷＦ、アンジオポエチン２及びＥＰＯを含むか、又はこれらから成る群から選択され得る。好ましくは、血管新生成長因子は、ＰＤＧＦ、ＦＧＦ−１及びＦＧＦ−３から選択され、より好ましくはＰＤＧＦ又はＦＧＦ−３、さらに好ましくはＰＤＧＦであり得る。
【００３６】
好ましくは、ＭＳＣ又は骨形成性細胞は、上記細胞の維持、増加、取得、富化及び／又は骨形成分化をさらに促すために、上記造血成長因子及び／又は血管新生成長因子に加えてＦＧＦ−２に曝露され、好ましくは同時に曝露され得る。
【００３７】
したがって、好ましい実施の形態では、ＭＳＣ又は骨形成性細胞、例えば本明細書中で教示されるようなＣＤ３４及び１つ又は複数の間葉系マーカーの発現を有するＭＳＣ又は骨形成性細胞を増加させることは、上記ＭＳＣ又は骨形成性細胞を、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γ、ＰＤＧＦ、ＦＧＦ−１及びＦＧＦ−３から選択される１つ又は複数の成長因子、例えばＧＭ−ＣＳＦ及びＩＦＮ−γの１つ又は複数、及び／又はＰＤＧＦ、ＦＧＦ−１及びＦＧＦ−３の１つ又は複数、例えばＧＭ−ＣＳＦ及びＩＦＮ−γの１つ又は複数、並びにＰＤＧＦ、ＦＧＦ−１及びＦＧＦ−３の１つ又は複数に曝露することを含み得る。これらの実施の形態では、任意で、細胞をＦＧＦ−２にさらに曝露しても、好ましくは同時に曝露してもよい。特に好ましい実施の形態では、ＭＳＣ又は骨形成性細胞、例えば本明細書中で教示されるようなＣＤ３４及び１つ又は複数の間葉系マーカーの発現を有するＭＳＣ又は骨形成性細胞を増加させることは、上記ＭＳＣ又は骨形成性細胞をＩＦＮ−γに曝露することを含み得る。この処理によって、そのように処理した細胞の骨形成特性及び血管新生促進特性の両方が著しく向上する。
【００３８】
別の好ましい実施の形態では、初期ＭＳＣ集団又は骨形成性細胞集団から、本明細書中で教示されるようなＣＤ３４及び１つ又は複数の間葉系マーカーの発現を有するＭＳＣ又は骨形成性細胞を富化することは、上記初期ＭＳＣ集団又は骨形成性細胞集団を、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γ、ＰＤＧＦ、ＦＧＦ−１及びＦＧＦ−３から選択される１つ又は複数の成長因子、例えばＧＭ−ＣＳＦ及びＩＦＮ−γの１つ又は複数、及び／又はＰＤＧＦ、ＦＧＦ−１及びＦＧＦ−３の１つ又は複数、例えばＧＭ−ＣＳＦ及びＩＦＮ−γの１つ又は複数、並びにＰＤＧＦ、ＦＧＦ−１及びＦＧＦ−３の１つ又は複数に曝露することを含み得る。これらの実施の形態では、任意で、細胞をＦＧＦ−２にさらに曝露しても、好ましくは同時に曝露してもよい。特に好ましい実施の形態では、初期ＭＳＣ集団又は骨形成性細胞集団から、本明細書中で教示されるようなＣＤ３４及び１つ又は複数の間葉系マーカーの発現を有するＭＳＣ又は骨形成性細胞を富化することは、上記ＭＳＣ又は骨形成性細胞をＩＦＮ−γに曝露することを含み得る。この処理によって、そのように処理した細胞の骨形成特性及び血管新生促進特性の両方が著しく向上する。
【００３９】
さらなる態様は、上述の態様において規定されるような少なくとも１つの間葉系マーカーとＣＤ３４とを共発現する間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、及び／又は上述の態様において規定されるような骨形成性細胞、例えば少なくとも１つの間葉系マーカーとＣＤ３４とを共発現する骨形成性細胞、並びに１つ又は複数の薬学的に許容可能な担体／賦形剤を含む医薬組成物を提供する。医薬組成物は、上記ＭＳＣ及び／又は骨形成性細胞を含む細胞集団、並びに１つ又は複数の薬学的に許容可能な担体／賦形剤を含み得る。
【００４０】
医薬品製剤を調製する製法（ｐｒｏｃｅｓｓ）であって、上述の態様において規定されるような少なくとも１つの間葉系マーカーとＣＤ３４とを共発現する間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、及び／又は上述の態様において規定されるような骨形成性細胞、例えば少なくとも１つの間葉系マーカーとＣＤ３４とを共発現する骨形成性細胞、又はこのようなＭＳＣ及び／又は骨形成性細胞を含む細胞集団を、上記１つ又は複数の薬学的に許容可能な担体／賦形剤と混合することを含む、製法も提供される。
【００４１】
本発明の細胞産物は、骨関連障害の予防的及び治療的処置に特に好適である。したがって、さらなる態様は以下のものに関する：
骨関連障害の治療に使用される、上述の態様において規定されるような少なくとも１つの間葉系マーカーとＣＤ３４とを共発現する間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、又は上述の態様において規定されるような骨形成性細胞、例えば少なくとも１つの間葉系マーカーとＣＤ３４とを共発現する骨形成性細胞、又は上記に規定されるような細胞を含む細胞集団若しくは医薬組成物；
骨関連障害の治療用の薬物の製造のための、上述の態様において規定されるような少なくとも１つの間葉系マーカーとＣＤ３４とを共発現する間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、又は上述の態様において規定されるような骨形成性細胞、例えば少なくとも１つの間葉系マーカーとＣＤ３４とを共発現する骨形成性細胞、又は上記に規定されるような細胞を含む細胞集団の使用；
このような治療を必要とする被験体において骨関連障害を治療する方法であって、上記被験体に、上述の態様において規定されるような少なくとも１つの間葉系マーカーとＣＤ３４とを共発現する間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、又は上述の態様において規定されるような骨形成性細胞、例えば少なくとも１つの間葉系マーカーとＣＤ３４とを共発現する骨形成性細胞、又は上記に規定されるような細胞を含む細胞集団若しくは医薬組成物を、治療的又は予防的に有効な量で投与することを含む、方法。
【００４２】
本発明は、被験体に、例えば全身的に又は骨病変の部位へと組成物を投与するのに適した外科用器具を含み、かつ上記で規定される細胞、細胞集団又は医薬組成物のいずれかをさらに含む装置（arrangement）も提供する。
【００４３】
上記態様及び実施の形態のいずれにおいても、少なくとも１つの間葉系マーカーは、好ましくはＣＤ１０５、ＣＤ９０及びＣＤ７３から選択され、より好ましくはＣＤ９０又はＣＤ１０５であり得る。特に好ましくは、少なくとも１つの間葉系マーカーはＣＤ１０５であり得る。すなわち、本明細書中で教示されるようなＭＳＣ又は骨形成性細胞は、少なくともＣＤ１０５とＣＤ３４とを共発現し得る。
【００４４】
上記態様のいずれかの一部の実施の形態では、細胞（ＭＳＣ細胞、骨形成性細胞）はヒト起源である。好ましくは、ＭＳＣは骨髄に由来し得る。
【００４５】
これらの及びさらなる態様及び実施形態が、以下の章及び特許請求の範囲において説明される。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】ＣＤ９０（ＦＩＴＣ）及びＣＤ３４（ＡＰＣ）の発現の二色フローサイトメトリー分析を示す図である。このドットプロットヒストグラムは、リストモードデータとして収集した５０００個の事象（event）を表す。
【図２】１週間の培養後のＣＤ９０／ＣＤ３４＋細胞の光学顕微鏡検査を示す図である。
【図３】添加培養条件下で増加させた後のＣＤ９０（ＦＩＴＣ）及びＣＤ３４（ＡＰＣ）の発現の二色フローサイトメトリー分析を示す図である。このドットプロットヒストグラムは、リストモードデータとして収集した５０００個の事象を表す。
【図４】ＣＤ９０／ＣＤ３４＋細胞の石灰化（Ａ）及びＡＬＰ染色（Ｂ）を示す図である
【図５】ＣＤ３４＋の百分率に対する石灰化能力の依存関係を示す図である。
【図６】ＡＬＰ染色による細胞の骨形成性を示す図である。
【図７】毛細血管様構造形成アッセイによる細胞の血管新生促進性を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
本明細書中で使用される場合、単数形「a」、「an」及び「the」は、文脈上他に明確な指示のない限り、単数及び複数の両方の指示対象を含む。
【００４８】
本明細書中で使用される場合、「含む（comprising）」、「含む（comprises）」及び「で構成される（comprised of）」という用語は、「含む（including）」、「含む（includes）」、又は「含有する（containing）」、「含有する（contains）」と同義であり、包括的又は無制限であり、付加的な、記載されていない成員、要素又は方法工程を除外するものではない。
【００４９】
端点による数値範囲の記載は、それぞれの範囲内に含まれる全ての数及び分数、並びに記載された端点を含む。
【００５０】
本明細書中で使用される場合、「約（about）」という用語は、パラメータ、量、時間幅（temporal duration）等の測定可能な値を表す場合には、特定の値の、及び特定の値から±１０％以下、好ましくは±５％以下、より好ましくは±１％以下、さらにより好ましくは±０．１％以下の変動を、開示する発明において実施するのにこのような変動が適切である限りにおいて、包含することを意味する。修飾語「約」が表す値自体も、具体的にかつ好ましく開示されると理解すべきである。
【００５１】
本明細書に引用される全ての文献は、その全体が参照により本明細書中に援用される。
【００５２】
特に規定のない限り、本発明を開示する際に使用される、技術用語及び科学用語を含む全ての用語は、本発明が属する技術分野の通常の技術を有する者（当業者）によって一般的に理解される意味を有する。さらなる指針を用いて、用語の定義が本発明の教示をよりよく理解するために記載される。
【００５３】
「幹細胞」という用語は、概して、未だ特殊化しておらず（unspecialised）又は比較的特殊化の程度が低くかつ増殖能を有する細胞であって、自己再生することができ、すなわち分化せずに増殖することができ、且つ自身又はその子孫が少なくとも１つの比較的特殊化の程度の高い細胞型を生じることができる細胞を表す。この用語は、実質的に無制限に自己再生することができる幹細胞、すなわち、幹細胞の子孫又は少なくともその一部分が、母幹細胞の未だ特殊化していない又は比較的特殊化の程度が低い表現型、分化可能性、及び増殖能力を実質的に保持している幹細胞と、限定的な自己再生を示す幹細胞、すなわち、子孫又はその一部分のさらに増殖及び／又は分化する能力が、母細胞と比較して明らかに低減している幹細胞とを包含する。例えば限定するものではないが、幹細胞は、１つ又は複数の系列に沿って分化して、段階的に比較的特殊化の程度の高い細胞を産生することができる子孫（このような子孫、及び／又は段階的に比較的特殊化の程度の高い細胞は、それ自体が本明細書で規定される幹細胞であり得る）、又はさらに、最終分化した細胞、すなわち完全に特殊化した細胞（有糸分裂後のものであり得る）を産生することができる子孫を生じることができる。
【００５４】
本明細書中で使用される場合、「成体幹細胞」という用語は、胎生期又は出生後の生物中に存在する、又はそれらから得た（例えばそれらから単離した）幹細胞を表す。
【００５５】
本明細書中で使用される場合、「間葉系幹細胞」又は「ＭＳＣ」という用語は、間葉系系列、典型的には２つ、好ましくは３つ以上の間葉系系列、例えば骨細胞（骨）系列、軟骨細胞（軟骨）系列、筋細胞（myocytic）（筋肉）系列、腱細胞（tendonocytic）（腱）系列、線維芽細胞（結合組織）系列、脂肪細胞（脂肪）系列、及び間質生成（stromogenic）（髄間質）系列の細胞を生成することができる、成体の中胚葉由来の幹細胞を表す。限定するものではないが、一般に、細胞は、当該技術分野において認められている標準的な分化条件及び細胞表現型評価方法、例えば、非特許文献１又はBarberi et al.（PLoS Med 2: e161, 2005）に記載される方法を用いて、脂肪細胞系列、軟骨細胞系列及び骨細胞系列の各々の細胞を形成することが可能であればＭＳＣであると見なすことができる。ＭＳＣ細胞は、例えば骨髄、血液、臍帯、胎盤、胎生卵黄嚢、真皮、特に胎生期及び青年期の皮膚（Young et al. 2001. Anat Rec 264: 51-62）、骨膜、並びに脂肪組織（Zuk et al. 2001. Tissue Eng 7: 211-28）から単離することができる。ヒトＭＳＣ、その単離、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの増殖及び分化は、例えば非特許文献１、米国特許第５，４８６，３５９号明細書、米国特許第５，８１１，０９４号明細書、米国特許第５，７３６，３９６号明細書、米国特許第５，８３７，５３９号明細書、又は米国特許第５，８２７，７４０号明細書に記載されている。
【００５６】
この用語は、骨髄から得られるＭＳＣ、一般に「骨髄間質細胞」又は「ＢＭＳＣ」と称されるものも包含する。ＢＭＳＣの単離用の骨髄試料は、例えば腸骨稜、大腿骨、脛骨、脊椎、肋骨又は他の髄腔から得ることができる。
【００５７】
好ましい実施形態では、本明細書中で使用される場合、ＭＳＣ又はＭＳＣ集団は骨髄に由来するものであってもよく、例えば骨髄試料から単離され、任意で増加され得る。骨髄に由来するＭＳＣ及びＭＳＣ集団は、他の組織に由来するＭＳＣとは異なる、及び／又はそれよりも都合のよい特性（例えばマーカープロファイル、機能、増加、分化等）を有していてもよく、例えば、限定するものではないが、より効率的及び／又はより制御可能に骨形成性細胞に分化することができる。
【００５８】
「ＭＳＣ」及び「ＢＭＳＣ」という用語は、ＭＳＣ又はＢＭＳＣの子孫、例えば被験体の生体試料から得られるＭＳＣ又はＢＭＳＣのｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｅｘ ｖｉｖｏ増殖によって得られる子孫も包含する。
【００５９】
特定の成分に関して「単離する（isolating）」という用語は、該特定の成分がそれにより「単離される」組成物の少なくとも１つの他の成分からその成分を分離することを示す。任意の細胞、細胞の群又は細胞集団との関係で使用される「単離（isolated）」という用語は、このような細胞、細胞の群又は細胞集団が動物又はヒトの身体の一部分を形成しないことも示唆する。
【００６０】
本明細書で開示される細胞、特にＭＳＣ細胞又は骨形成性細胞は、少なくとも１つの間葉系マーカーとＣＤ３４とを共発現する（すなわち、それらに関して陽性である）。本明細書全体を通して、「共発現する（co-express）」とは、細胞が該細胞を特徴付ける記載された特定のマーカーだけでなく、他のマーカーを発現し得るように、「の共発現を有する（comprising co-expression of）」という意味を包含することを意図する。
【００６１】
細胞が特定のマーカーに関して陽性であると言う場合、これは、当業者が、適切な測定を実施した場合、好適な対照と比較して、そのマーカーに関して、例えば抗体により検出可能な、又は逆転写ポリメラーゼ連鎖反応により検出可能な（detection）顕著なシグナルの存在又は証拠を結論づけるであろうことを意味する。本方法によりそのマーカーの定量的評価が可能になる場合、陽性の細胞は、対照と有意に異なり、より高い又はより強いシグナル、例えば、限定するものではないが、対照細胞が生成したかかるシグナルより少なくとも１．５倍高い、例えば少なくとも２倍、少なくとも４倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍高い、又はさらに高いシグナルを生成する。
【００６２】
細胞特異的マーカーの発現は、当該技術分野で既知の任意の好適な免疫学的手法、例えば免疫細胞化学的検査若しくは親和性吸着法、ウエスタンブロット分析、ＦＡＣＳ、ＥＬＩＳＡ等を使用して、又は酵素活性の任意の好適な生化学的アッセイにより、又はマーカーｍＲＮＡの量を測定する任意の好適な手法、例えばノーザンブロット、半定量的若しくは定量的ＲＴ−ＰＣＲ等により検出することができる。
【００６３】
本開示において列挙したマーカータンパク質に関する核酸及びアミノ酸の配列データは概して既知であり、公的データベース、とりわけＮＩＨの「Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｏｎ ｔｈｅ Ｗｅｂ」データベース（http://mpr.nci.nih.gov/prow/）、ＮＩＨの「Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ」データベース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=gene）、又はＵｎｉｐｒｏｔ／Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔデータベース（http://www.expasy.org/）等から得ることができる。上記マーカーに対して好適な検出試薬及び方法は、このような配列情報に基づいて設計することができるか、又はより一般的には、市販されている（例えば標識モノクローナル抗体試薬）。
【００６４】
例えば、限定するものではないが、上記データベースの登録をこの順序で参照すると、ヒトＣＤ３４抗原は、「ＣＤ３４」、遺伝子ＩＤ９４７、及びアクセッション番号Ｐ２８９０６（配列バージョン２、エントリバージョン７４）（また、Simmons et al. 1992. J Immunol 148: 267-271、Civinet al. 1984. J Immunol 133: 157）の名で存在し、ヒトＣＤ１０５抗原（エンドグリンとしても知られる）は、「ＣＤ１０５」、遺伝子ＩＤ２０２２、及びアクセッション番号Ｐ１７８１３（配列バージョン２、エントリバージョン９１）（また、Bellon et al. 1993. Eur J Immunol 23: 2340）の名で存在し、ヒトＣＤ９０抗原（Ｔｈｙ−１膜糖タンパク質としても知られる）は、「ＣＤ９０」、遺伝子ＩＤ７０７０、及びアクセッション番号Ｐ０４２１６（配列バージョン２、エントリバージョン９４）（また、Cell surface Thy-1, ed. AF Reif and M Schlesinger, 1989, MarcelDekker Inc., New York）の名で存在し、そしてヒトＣＤ７３抗原（エクト−５’−ヌクレオチダーゼ、ＥＣ３．１．３．５としても知られる）は、「ＣＤ７３」、遺伝子ＩＤ４９０７、及びアクセッション番号Ｐ２１５８９（配列バージョン１、エントリバージョン８７）（また、Thomson et al. 1990. Tissue Antigens 35: 9）の名で存在する。
【００６５】
ＣＤ３４の検出に利用可能な抗体試薬の例としては、とりわけモノクローナル抗体６Ａ６、７Ｅ１０及び４Ｈ１１が挙げられ、ＣＤ１０５の検出に利用可能な抗体試薬の例としては、とりわけモノクローナル抗体４４Ｇ４、１Ｇ２、Ｅ−９及びＧＲＥ（Letarte et al. 1995. In: Leukocyte Typing V, ed. SF Schlossman etal., Oxford University Press, Oxford, p. 1756-1759）が挙げられ、ＣＤ９０の検出に利用可能な抗体試薬の例としては、とりわけモノクローナル抗体５Ｅ１０（Craig et al. 1993. J Exp Med 177: 1331）が挙げられ、ＣＤ７３の検出に利用可能な抗体試薬の例としては、とりわけモノクローナル抗体１Ｅ９及び７Ｇ２（Thompson et al. 1990、上掲）及び４Ｇ４（Airas et al.1993. J Immunol 151: 4228）が挙げられる。
【００６６】
一実施形態では、少なくとも１つの間葉系マーカーは、ＣＤ１０５、ＣＤ９０及びＣＤ７３から選択される。好ましくは、少なくとも１つの間葉系マーカーはＣＤ９０又はＣＤ１０５であり、より好ましくは、少なくとも１つの間葉系マーカーはＣＤ１０５である。本発明は、ＣＤ１０５とＣＤ３４とを共発現する細胞、特にＭＳＣ細胞又は骨形成性細胞、ＣＤ９０とＣＤ３４とを共発現する細胞、並びにＣＤ７３とＣＤ３４とを共発現する細胞を意図する。ＣＤ１０５、ＣＤ９０及びＣＤ７３のいずれか２つ又は３つ全てをＣＤ３４と共に共発現する細胞、特にＭＳＣ細胞又は骨形成性細胞、例えば、少なくともＣＤ１０５及びＣＤ９０をＣＤ３４と共に共発現する細胞、又は少なくともＣＤ１０５及びＣＤ７３をＣＤ３４と共に共発現する細胞等も包含される。
【００６７】
実施例に示すように、上記マーカープロファイルの細胞は、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）も共発現し得る。したがって、少なくとも１つの間葉系マーカーとＣＤ３４とを共発現し、かつＡＬＰ、より好ましくは骨−肝臓−腎臓型のＡＬＰ（ＡＬＰＬ）をさらに発現する細胞、特に本明細書で開示されるようなＭＳＣ細胞又は骨形成性細胞も提供される。後者の種類のヒトＡＬＰの例は、Weiss et al. 1986（PNAS 83: 7182-7186）に、Ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔアクセッション番号Ｐ０５１８６（配列バージョン４、エントリバージョン１１０）で記載されている。ＡＬＰは、その既知の配列及び標識抗体等の市販の検出試薬を用いて、基本的には上記で説明したように検出することができる。基質、例えば４−メチルウンベリフェリルリン酸（Fernley et al. 1965. Biochem J. 97: 95-103）又はｐ−ニトロフェニルリン酸等を用いた酵素ベースのアッセイも既知である。
【００６８】
上記マーカープロファイルのＭＳＣ細胞は、典型的には間葉系細胞の他の属性も示し得る。例えば、ＭＳＣ細胞は、ＣＤ１０６（ＶＣＡＭ）、ＣＤ１６６（ＡＬＣＡＭ）、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ５４及びＧＡＴＡ−４から選択される間葉系マーカーの１つ、複数又は全てをさらに発現し得る。ＭＳＣ細胞は、或る特定の形態学的特徴、例えば組織培養プラスチックへの接着性、単層での成長、及び顕著な核小体を有する円形〜楕円形の核を持った単核の卵形、星形又は紡錘形の形状のいずれか１つ又は複数をさらに示す場合がある。
【００６９】
本明細書中で使用される場合、「骨形成性細胞」という用語は概して、骨材料及び／又は骨マトリクスの形成に寄与することが可能な細胞を表し、特に部分的に又は完全に骨形成分化経路に沿って進行した単離細胞又は細胞集団を示す。限定するものではないが、骨形成性細胞は、骨芽前駆細胞、骨芽細胞、骨細胞、及び当該技術分野で既知の他の骨形成系列の細胞型を特に包含する。
【００７０】
したがって、当業者は概して、「骨形成性細胞」という用語の範囲を本明細書で意図されるように理解する。しかし、さらなる指針を用いると、限定するものではないが、本発明の骨形成性細胞は以下の特性のいずれか１つ、複数又は全てを示し得る：
ａ）細胞がアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、より具体的には骨−肝臓−腎臓型のＡＬＰの発現を有すること；
ｂ）細胞が１型プロコラーゲンアミノ末端プロペプチド（Ｐ１ＮＰ）、オステオネクチン（ＯＮ）、オステオポンチン（ＯＰ）、オステオカルシン（ＯＣＮ）及び骨シアロタンパク質（ＢＳＰ）のいずれか１つ又は複数の発現を有すること；
ｃ）細胞が外部環境を石灰化するか、又はカルシウム含有細胞外マトリクスを合成する能力の証拠を示すこと（例えば、骨形成培地に曝露された場合；Jaiswal et al. 1997. J Cell Biochem 64: 295-312を参照されたい）。カルシウムの細胞内での蓄積、及びマトリクスタンパク質中への沈着は、例えば４５Ｃａ２＋中で培養し、洗浄及び再培養し、そしてその後細胞内に存在する若しくは細胞外マトリクス中に沈着した放射活性を確定すること（米国特許第５，９７２，７０３号明細書）により、又はアリザリンレッドベースの石灰化アッセイ（例えば、Gregory et al. 2004. Analytical Biochemistry 329: 77-84を参照されたい）を用いて、従来のように測定することができる；
ｄ）細胞が、脂肪細胞系列（例えば脂肪細胞）又は軟骨細胞系列（例えば軟骨細胞）の細胞のいずれか一方に、好ましくはいずれにも実質的に分化しないこと。これらの細胞系列へ分化しないことは、当該技術分野で確立されている標準的な分化誘導条件（例えばPittenger et al. 1999. Science 284: 143-7を参照されたい）と、アッセイ方法（例えば誘導された場合、脂肪細胞は典型的には脂質蓄積を示すオイルレッドＯで染色され、軟骨細胞は典型的にはアルシアンブルー又はサフラニンＯで染色される）とを使用して試験することができる。脂肪生成分化及び／又は軟骨形成分化への傾向を実質的に欠くとは、典型的には、試験した細胞の５０％未満、又は３０％未満、又は５％未満、又は１％未満が、それぞれの試験に適用したときに、脂肪生成分化又は軟骨形成分化の徴候を示すことを意味し得る。
【００７１】
一実施形態では、骨形成性細胞は、上記ａ）、ｃ）及びｄ）で挙げた全ての特性を示し得る。
【００７２】
本明細書で開示されるような単離ＭＳＣ細胞若しくは骨形成性細胞を含むか、又は上記細胞型の両方を含む任意の細胞集団がさらに意図される。本明細書で開示されるような上記ＭＳＣ細胞若しくは骨形成性細胞は、又は上記細胞型の両方を一緒にして、このような細胞集団中に存在する細胞の少なくとも２％、好ましくは少なくとも５％、例えば少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２０％、例えば少なくとも３０％、さらにより好ましくは少なくとも４０％、例えば少なくとも５０％、又は非常に好ましくは少なくとも６０％、例えば少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は最大で１００％を構成し得る。
【００７３】
好ましくは、本明細書で開示されるようなＭＳＣ細胞又は骨形成性細胞、又はそれらを含む細胞集団は、動物起源、より好ましくは非ヒト哺乳動物起源又はヒト起源、さらにより好ましくはヒト起源である。
【００７４】
少なくとも１つの間葉系マーカー及びＣＤ３４、並びに任意で、本明細書で開示されるような任意の付加的な対象のマーカーを共発現するＭＳＣ細胞は、それ自体が既知の方法によって得ることができる。
【００７５】
例えば、従来の方法によって、被験体の生体試料からＭＳＣ又はＢＭＳＣ細胞を単離し、任意で増加させることが可能である。
【００７６】
本明細書中で使用される場合、「生体試料」又は「試料」という用語は概して、生物源、例えば個体、器官、組織又は細胞培養物等から得られる試料を表す。非ヒト哺乳動物被験体又はヒト被験体等の動物被験体の生体試料は、上記被験体から取り出され、その細胞を含む試料を表す。被験体の生体試料を得る方法は、例えば組織生検又は血液若しくは骨髄採取のように、当該技術分野で既知である。被験体の有用な試料は、そのＭＳＣ又はＢＭＳＣ細胞を含む。このような試料は、典型的には、被験体の骨髄から、例えば腸骨稜、大腿骨、脛骨、脊椎、肋骨又は他の髄空間から得ることができる。ＭＳＣを含むさらに有用な生体試料は、例えば被験体の血液、臍帯、胎盤、胎生卵黄嚢、皮膚、骨膜又は脂肪組織から得ることができる。
【００７７】
ＭＳＣ又はＢＭＳＣを、基板表面、特に組織培養プラスチック表面に接着することができる細胞から選択し、培養することによって、骨髄又は他の供給源から単離し、増加させることができることが記載されている。この原理に基づくプロトコルは、非特許文献１及び本明細書の他の部分で言及した関連の特許文献に詳述されており、Alhadlaq & Mao 2004（Stem Cells Dev 13:436-48）において概説されている。これらのプロトコルは本明細書に適用可能である。
【００７８】
所望のマーカータンパク質を共発現する細胞を、単離して任意で増加させたＭＳＣ又はＢＭＳＣ細胞の母集団から、それ自体が既知の方法、例えば蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）、又は親和性ベースの技術、とりわけ親和性クロマトグラフィー等を用いて選択、富化又は単離することができる。所望の発現プロファイルを有する生細胞を、それぞれのマーカーに特異的な試薬（最も一般的には免疫学的試薬、例えばモノクローナル抗体等）に結合させるが、上記試薬は、例えば上記試薬によって結合されている細胞を、そのように結合されていない細胞から選択又は捕捉するのを促進するために、（例えば、フルオロフォアによって、又は磁性粒子若しくは別の種類の固定相への固定化によって）修飾されている。
【００７９】
これらの方法に関する一般的な指針については、とりわけ、Flow Cytometry and Cell Sorting, 2nd ed., by Andreas Radbruch (ed.),Springer 1999（ＩＳＢＮ ３５４０６５６３０８）、In Living Color: Protocolsin Flow Cytometry and Cell Sorting, 1st ed., by RA Diamond and S Demaggio(eds.), Springer 2000（ＩＳＢＮ ３５４０６５１４９７）、Flow CytometryProtocols (Methods in Molecular Biology), 2nd ed., by TS Hawley and RG Hawley(eds.), Humana Press 2004（ＩＳＢＮ １５８８２９２３５５）、AffinitySeparations: A Practical Approach, P Matejtschuk (ed.), Oxford UniversityPress, 1997（ＩＳＢＮ ０１９９６３５５０１）、及びDainiak et al. 2007. AdvBiochem Eng Biotechnol 106: 1-18を参照されたい。
【００８０】
本発明者らはまた、ＭＳＣ細胞又は骨形成性細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ増加、特に少なくとも１つの間葉系マーカーとＣＤ３４とを共発現する、本明細書で規定されるような単離ＭＳＣ細胞又は骨形成性細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ増加に対して有利な条件を実現したが、これは比較的不均一性の高いＭＳＣ又は骨形成性細胞集団から、少なくとも１つの間葉系マーカーとＣＤ３４とを共発現するＭＳＣ細胞又は骨形成性細胞を富化するのにも適している可能性がある。
【００８１】
「富化する」という用語は、この文脈で使用される場合、細胞集団における所望の細胞型又は細胞表現型の相対的割合を増大させることを表す。例えば、上記ＣＤ３４陽性ＭＳＣ細胞又は骨形成性細胞は、富化を受ける出発細胞集団から、得られる細胞集団中に存在する細胞の少なくとも２％、好ましくは少なくとも５％、例えば少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２０％、例えば少なくとも３０％、さらにより好ましくは少なくとも４０％、例えば少なくとも５０％、又は非常に好ましくは少なくとも６０％、例えば少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は最大で１００％にまで富化され得る。ＭＳＣ細胞若しくはＭＳＣ細胞集団、又は骨形成性細胞若しくは骨形成性細胞集団を、造血成長因子、又は血管新生成長因子、又は造血成長因子及び血管新生成長因子の組み合わせに曝露するが、後者の組み合わせは細胞増加又は富化に対して相乗効果を達成する。造血成長因子及び血管新生成長因子は、同時に又は任意の順序で順次に、好ましくは同時に細胞と接触させることができる。有利には、細胞をＦＧＦ−２に曝露、好ましくは同時に曝露して、その増加及び／又は富化をさらに向上させてもよい。
【００８２】
一実施形態では、造血成長因子は、コロニー刺激因子２（ＣＳＦ２）、ＣＳＦ３、マクロファージＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球単球ＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）、ＩＦＮ−γを含むインターフェロン（ＩＦＮ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、及び造血活性のあるサイトカイン、例えばとりわけインターロイキン２（ＩＬ２）を含むか、又はこれらから成る群から選択される。より好ましくは、造血成長因子は、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＦＮ−γから選択され、さらにより好ましくはＩＦＮ−γであり得る。一実施形態では、血管新生成長因子は、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ１又はＶＥＧＦ２）、フォン・ヴィルブランド因子（ｖＷＦ）、アンジオポエチン２、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−３又は他のＦＧＦ因子）、及びエリスロポエチン（ＥＰＯ）を含むか、又はこれらから成る群から選択される。より好ましくは、血管新生成長因子は、ＰＤＧＦ、ＦＧＦ−１及びＦＧＦ−３、さらにより好ましくはＰＤＧＦ及びＦＧＦ−３から選択され、さらにより好ましくはＰＤＧＦであり得る。
【００８３】
「曝露する」という用語は、本明細書中で使用される場合、１つ又は複数の分子、成分又は材料と別の分子、成分又は材料とを直接的又は間接的に一緒にすること、すなわち接触させ、それによってそれらの間の相互作用を促進することを意味する。典型的には、成長因子（複数可）を、細胞を培養している培地に加えることによって、上記細胞と接触させることができる。本明細書で適用可能な培地、消耗品、及び細胞培養の条件は概して、当該技術分野、例えばＭＳＣ、ＢＭＳＣ及び骨形成性細胞を増殖及び分化させる技術分野において知られている。
【００８４】
骨形成性細胞は、当該技術分野で既知のように単離ＭＳＣ細胞から分化させることによって得ることができる。一例では、単離ＭＳＣ細胞を血清又は血漿、及び塩基性線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ−２）の存在下で培養する、国際公開第２００７／０９３４３１号パンフレットの方法を使用することができる。別の例では、骨形成系列細胞は、非特許文献１及びJaiswal et al. 1997（上掲）によって記載されるように、ＭＳＣ細胞を骨形成培地中で分化させることによって得ることができる。任意で、従来の骨形成培地にＦＧＦ−２を添加してもよい。骨形成性細胞はまた、Skjodt et al. 1985（J Endocrinol 105: 391-6）によって記載されるように、骨梁から直接単離して培養してもよい。
【００８５】
一実施形態では、骨形成性細胞は、少なくとも１つの間葉系マーカーとＣＤ３４とを共発現する単離ＭＳＣ細胞から分化させることができる。このような場合、そのように得られた骨形成性細胞集団を、上記少なくとも１つの間葉系マーカーとＣＤ３４とを共発現する骨形成性細胞に関して富化することができる。別の例では、骨形成性細胞は、少なくとも１つの間葉系マーカーとＣＤ３４とを共発現する細胞に関して富化されていないＭＳＣ細胞から得てもよく、又は被験体から直接単離してもよい。このような場合、そのように得られた骨形成性細胞集団は概して、上記少なくとも１つの間葉系マーカーとＣＤ３４とを共発現する骨形成性細胞に関して富化されていない。
【００８６】
これらの状況のどれにおいても、ＭＳＣ細胞に関して上記で記載されるような手法（例えばＦＡＣＳ、ＭＡＣＳ又は親和性ベースの技術等）を同様に用いて、比較的不均一性の高い骨細胞集団から、上記少なくとも１つの間葉系マーカーとＣＤ３４とを共発現する骨形成性細胞を選択、富化又は単離することができる。上記少なくとも１つの間葉系マーカーとＣＤ３４とを共発現する骨形成性細胞は、本明細書中で教示されるような造血成長因子及び／又は血管新生成長因子を用いて富化することもできる。
【００８７】
本発明の様々な態様との関連において、「骨関連障害」という用語は、その治療が、障害を有する被験体への骨形成系列細胞又は骨形成性細胞、例えば骨芽前駆細胞、骨芽細胞又は骨細胞の投与の利益を受け得る、任意の種類の骨疾患を表す。特に、このような障害は、例えば骨形成の減少、又は過剰な骨吸収により、骨中に存在する骨芽細胞又は骨細胞の数、生存度又は機能の減少、被験体中の骨量の減少、骨痩せ、骨の強度又は弾性の損失等により、特徴づけることができる。
【００８８】
例えば限定するものではないが、該用語は、局所性又は全身性の障害、例えば任意の種類の骨粗鬆症又は骨減少症、例えば原発性、閉経後、老人性、コルチコイド誘発性、任意の二次性の、単一性骨壊死又は多部位性骨壊死、任意の種類の骨折、例えば非癒合、変形癒合、遅延癒合の骨折又は圧迫、骨融合（例えば脊髄融合及び再建）を必要とする病状、顎顔面骨折、例えば外傷性傷害又は癌外科手術後の骨再構築、頭蓋顔面骨再構築、骨形成不全症、溶骨性骨癌、パジェット病、内分泌学的障害、低リン酸血症、低カルシウム血症、腎性骨異栄養症、骨軟化症、無形成骨症、関節リウマチ、副甲状腺機能亢進症、原発性副甲状腺機能亢進症、二次性副甲状腺機能亢進症、歯周疾患、ゴーハム病（Gorham-Stout disease）並びにマクキューン・オールブライト症候群を包含する。
【００８９】
本発明によって記載されるようなものを含むＭＳＣ、ＢＭＳＣ及び骨形成性細胞及び集団は、多岐にわたって、特に骨関連障害の研究、予防及び療法の分野で使用される。
【００９０】
一態様では、細胞又は細胞集団は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで骨マトリクスを産生するために使用することができる。上記骨マトリクスは、骨関連疾患の治療において、例えば細胞若しくは細胞集団と併用して、又は併用せずに利用され得る。
【００９１】
本発明の細胞又は細胞集団を被験体に導入することは、上記被験体における骨折及び骨関連障害の治療に有用であり得る。「被験体」又は「患者」という用語は、治療、観察又は実験の対象とした、好ましくは動物、より好ましくは温血動物、さらにより好ましくは脊椎動物、さらにより好ましくは哺乳動物、具体的にはヒト及び非ヒト哺乳動物を表す。「哺乳動物」という用語は、そのように分類されるいかなる動物をも含み、ヒト、家畜（domestic and farm animals）、動物園の動物、競技用動物、愛玩動物、伴侶動物及び実験動物、例えばマウス、ラット、ハムスター、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、畜牛、乳牛、ヒツジ、ウマ、ブタ、並びに霊長類、例えばサル及び類人猿が挙げられるが、これらに限定されない。性別及び年齢層を問わず、ヒト被験体が特に好ましい。
【００９２】
本発明の治療は、特に、それを必要とする被験体に対して行なわれるが、「それを必要とする被験体」という表現は骨折又は骨関連障害等の所与の病状の治療から利益を受け得る被験体を含む。このような被験体は、上記病状と診断された被験体、上記病状を発症しやすい被験体、及び／又は上記病状が予防されるべき被験体を含み得るが、これらに限定されない。
【００９３】
「治療する」又は「治療」という用語は、既に発症した障害の治療的処置、例えば既に発症した骨関連障害の療法、及び予防的（prophylactic or preventative）措置の両方を包含し、骨関連障害の罹患及び進行の機会を予防する等のように、望ましくない苦痛が発生する機会を予防するか又は減らすことを目的とする。有益な又は所望の臨床結果は、１つ又は複数の症状、又は１つ又は複数の生物学的マーカーの軽減、疾患の範囲の縮小、安定した（すなわち悪化しない）疾患状態、疾患の進行の遅延又は緩徐化、疾患状態の改善又は緩和等を含み得るが、これらに限定されない。「治療」は、治療を受けない場合の予想生存期間と比較して、生存期間を延長することも意味し得る。
【００９４】
「予防的に有効な量」という用語は、研究者、獣医、医師又は他の臨床家によって求められるような、被験体において障害の発症を阻止するか又は遅延させる活性化合物又は医薬品の量を表す。「治療的に有効な量」という用語は、本明細書中で使用される場合、研究者、獣医、医師又は他の臨床家によって求められる、被験体において生物学的反応又は薬理反応を誘発する活性化合物又は医薬品の量を表し、とりわけ治療中の疾患又は障害の症状の軽減を含み得る。治療的及び予防的に有効な用量を確定する方法は当該技術分野で既知である。
【００９５】
治療は、自家性（すなわち、治療を受ける被験体に由来する細胞）、同種（すなわち、治療を受ける被験体以外であるが、同じ種に属する被験体（複数可）に由来する細胞）、又は異種（すなわち、治療を受ける被験体以外の種に属する被験体（複数可）に由来する細胞）の本明細書で規定されるようなＭＳＣ、ＢＭＳＣ又は骨形成性細胞又は細胞集団を利用し得る。
【００９６】
特に、本明細書中で得られるようなヒト自家性又は同種ＭＳＣ、ＢＭＳＣ又は骨形成性細胞又は細胞集団を用いたヒト被験体の治療が想定される。
【００９７】
好適には、本明細書中で得られたＭＳＣ、ＢＭＳＣ又は骨形成性細胞及び細胞集団を、医薬組成物へと製剤化して、投与することができる。
【００９８】
医薬組成物は典型的には、活性成分としての本発明のＭＳＣ、ＢＭＳＣ又は骨形成性細胞又は細胞集団、及び１つ又は複数の薬学的に許容可能な担体／賦形剤を含む。本明細書中で使用される場合、「担体」又は「賦形剤」には、あらゆる溶媒、希釈剤、緩衝液（例えば中性緩衝食塩水又はリン酸緩衝食塩水）、可溶化剤、コロイド、分散媒、ビヒクル、増量剤、キレート剤（例えばＥＤＴＡ又はグルタチオン）、アミノ酸（例えばグリシン等）、タンパク質、崩壊剤、結合剤、滑剤、湿潤剤、乳化剤、甘味剤、着色剤、香味剤、芳香剤（aromatisers）、増粘剤、デポー効果（depot effect）を達成するための薬剤、コーティング剤、抗真菌剤、防腐剤、安定化剤、酸化防止剤、浸透圧調整剤、吸収遅延剤等が含まれる。このような媒体及び薬剤の医薬品活性物質への使用は、当該技術分野で既知である。このような材料は無毒性でなくてはならず、細胞の活性を妨げるものであってはならない。
【００９９】
担体又は賦形剤又は他の材料の正確な性質は、投与経路に応じて異なる。例えば、組成物は、発熱物質を含まず、かつ好適なｐＨ、等張性及び安定性を有する、非経口で許容可能な水溶液の形態であり得る。薬用製剤の一般的な原理に関しては、Cell Therapy: Stem Cell Transplantation, Gene Therapy, and CellularImmunotherapy, by G. Morstyn & W. Sheridan eds., Cambridge UniversityPress, 1996、及びHematopoietic Stem Cell Therapy, E. D.Ball, J. Lister & P. Law, Churchill Livingstone, 2000を参照されたい。
【０１００】
このような医薬組成物は、その中での細胞の生存度を確保するためのさらなる成分を含有していてもよい。例えば、組成物は、望ましいｐＨ、より通常は中性付近のｐＨを達成する好適な緩衝系（例えば、リン酸又は炭酸緩衝系）を含んでいてもよく、細胞に対する浸透圧ストレスを防ぐ等張条件を確保するための十分な塩を含んでいてもよい。例えば、これらの目的のための好適な溶液は、当該技術分野で既知の、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、塩化ナトリウム溶液、リンガー液又は乳酸加リンガー液であり得る。さらに組成物は、細胞の生存度を増大させ得る担体タンパク質、例えばアルブミンを含んでいてもよい。
【０１０１】
医薬組成物は、骨の創傷及び欠損の修復に有用なさらなる成分を含み得る。例えば、このような成分は、限定するものではないが、骨形態発生タンパク質、骨マトリクス（例えば、本発明の細胞又は他の方法によってｉｎ ｖｉｔｒｏで産生された骨マトリクス）、ヒドロキシアパタイト／リン酸三カルシウム粒子（ＨＡ／ＴＣＰ）、ゼラチン、ポリ乳酸、ポリ乳酸グリコール酸、ヒアルロン酸、キトサン、ポリ−Ｌ−リジン及びコラーゲンを含み得る。例えば、骨芽細胞は、脱灰骨マトリクス（ＤＢＭ）、又は複合体を骨形成性（それ自体で骨を形成する）及び骨誘導性にする他のマトリクスと組み合わせてもよい。自家性骨髄細胞と共に同種ＤＢＭを使用する同様の方法により、良好な結果が得られている（Connolly et al. 1995. Clin Orthop 313: 8-18）。
【０１０２】
医薬組成物は、補完的生物活性因子、例えば骨形態発生タンパク質、例えばＢＭＰ−２、ＢＭＰ−７若しくはＢＭＰ−４、又は任意の他の成長因子を、さらに含んでいてもよいし、又はそれらと同時投与してもよい。他の考え得る共存成分は、骨再生を補助するのに好適なカルシウム又はリン酸塩の無機源を含む（国際公開第００／０７６３９号パンフレット）。必要に応じて、細胞調製物を、担体マトリクス又は担体材料上で投与して、組織再生を向上させてもよい。例えば、材料は、粒状セラミック、又は生体高分子、例えばゼラチン、コラーゲン、オステオネクチン、フィブリノーゲン若しくはオステオカルシンであり得る。多孔質マトリクスは、標準的な手法に従って合成することができる（例えば、Mikos et al., Biomaterials 14:323, 1993；Mikoset al., Polymer 35:1068, 1994；Cook et al., J. Biomed.Mater. Res. 35:513, 1997）。
【０１０３】
代替的に又は付加的に、本発明の細胞は、被験体の骨病変、例えば外科手術又は骨折の部位への導入の前に、対象となる核酸で安定的に又は一過性に形質転換することができる。対象となる核酸配列は、骨芽細胞の成長、分化及び／又は石灰化を増強する遺伝子産物をコードするものを含むがこれらに限定されない。例えば、ＢＭＰ−２に関する発現系を、難治性骨折又は骨粗鬆症を治療する目的で、安定に又は一過性に導入することができる。細胞を形質転換する方法は、当業者に既知である。
【０１０４】
さらなる一態様では、本発明は、被験体に、例えば全身的に、局所的に、又は骨病変の部位に組成物を投与するための外科用器具を含み、かつ本発明の細胞若しくは細胞集団、又は上記細胞若しくは細胞集団を含む医薬組成物をさらに含む装置であって、例えば全身的な、局所的な、又は骨病変の部位での医薬組成物の投与に適している装置に関する。例えば、好適な外科用器具は、例えば全身的に、又は骨病変の部位に、本発明の細胞を含む液体組成物を注入することができるものであってもよい。
【０１０５】
細胞又は細胞集団は、目的の組織部位にそれらが移植され又は移動して、且つ機能が欠損した領域をそれらが再構成又は再生することができるように、投与してもよい。組成物の投与は、修復される筋骨格部位に応じて異なる。例えば、骨形成は、組織を再構築する、又は開裂、若しくは人工補装具、例えば人工股関節置換具を挿入する外科手順に従って促進することができる。他の状況では、侵襲的な外科手術は必要ではなく、組成物は、注入により、又は（例えば、脊柱の修復に）誘導型内視鏡を使用して、投与することができる。
【０１０６】
一実施形態では、上で規定した医薬細胞調製物は、液体組成物の形態で投与してもよい。複数の実施形態では、細胞、又は細胞を含む医薬組成物は、全身的に、局所的に、又は病変の部位で、投与してもよい。
【０１０７】
別の実施形態では、細胞又は細胞集団を、好適な基板に移して、及び／又は好適な基板上で培養して、移植部材を提供してもよい。細胞を適用及び培養することができる基板は、金属、例えばチタン、コバルト／クロム合金又はステンレス鋼、生物活性表面、例えばリン酸カルシウム、ポリマー表面、例えばポリエチレン等であり得る。あまり好ましくはないが、ケイ質材料、例えばガラスセラミックスも、基板として使用することができる。最も好ましくは、金属、例えばチタン、及び、リン酸カルシウムは基板の不可欠な成分ではないが、リン酸カルシウムである。基板は多孔質又は非多孔質であり得る。
【０１０８】
例えば、増殖した細胞、又は培養皿で分化させている細胞を、必要に応じて、本発明の液体栄養培地中で固体支持体をインキュベートすることにより、それらを増殖させ、及び／又は分化過程を継続させるために、三次元固体支持体上に移すことができる。細胞は、例えば、上記細胞を含有する液体懸濁液に上記支持体を含浸させることにより、三次元固体支持体上に移すことができる。このようにして得られた含浸支持体は、ヒト被験体に移植することができる。このような含浸支持体を、最終的に移植する前に、液体培養培地中に浸漬することにより、再培養することもできる。
【０１０９】
三次元固体支持体は、ヒトへのその移植を可能にするために、生体適合性を有することが必要である。三次元固体支持体は、任意の好適な形状、例えば円筒、球、平板、又は任意の形状の一部分のものであり得る。生体適合性を有する三次元固体支持体に好適な材料のうち、炭酸カルシウム、特にアラゴナイト、具体的にはサンゴ骨格の形態のアラゴナイト、アルミナ、ジルコニア、リン酸三カルシウムをベースとする多孔質セラミックス、及び／又はヒドロキシアパタイト、炭酸カルシウムをヒドロキシアパタイトに変換することができる水熱交換により得られる擬似サンゴ骨格、又は他にはアパタイト−珪灰石ガラスセラミックス、生物活性ガラスセラミックス、例えばＢｉｏｇｌａｓｓ（商標）ガラスに特に言及することができる。
【０１１０】
上述の態様及び実施形態を、以下の非限定的な例によりさらに裏づける。
【実施例】
【０１１１】
実施例では、骨形成性及び血管新生促進性が向上した、高レベルのＣＤ３４（造血−血管新生（haemato-angiogenic）特性）及びＣＤ１０５（間葉系特性）を共発現する間葉系間質細胞に由来する骨芽前駆細胞の新たな集団サブセットの単離を実証する。この集団は標準的に増加した間葉系間質細胞の１％未満を占めるにすぎない。しかしながら、この集団は、二重（dual）細胞選別によって及び／又は特別な条件下での培養によって最大で９０倍まで首尾よく富化することができる。このような（例えば５％〜５０％まで）富化したＣＤ１０５／ＣＤ３４＋細胞集団は、有意に高い増殖可能性及び有意に高い骨再構築性を有するため、骨疾患の治療に関して非常に重要である。加えて、その血管新生（ＣＤ３４＋）性は、血管再生誘導及び骨再構築の組み合わせが好ましい場合に、治療利益を増大させる。
【０１１２】
実施例１
骨髄ＭＳＣの単離及び培養
１００ｍｌのヘパリン処置した骨髄（ＢＭ）を、患者の腸骨稜、又は健康なボランティアから得た。ＢＭを、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、２ｖ：ｖ）と混合し、密度勾配フィコール溶液上に重層した。遠心分離後、単核細胞を界面から回収し、ＰＢＳ中で２回洗浄した。細胞を、２０％血漿を添加し、任意でＦＧＦ−２を添加したＤＭＥＭ培地中に再懸濁した。細胞を、１×１０７細胞／１７５ｃｍ２でフラスコにプレーティングし（試験範囲１×１０５〜１×１０９）、５％ＣＯ２を含有する３７℃加湿雰囲気中で維持した。細胞を１日〜４日間付着させた後、初期培地を交換し、続いて下記に定めた期間で培養した。
【０１１３】
ＣＤ３４陽性細胞の単離
１４日間の標準的な間葉培養（ＤＭＥＭ及び２０％血漿）後、約１×１０８個の細胞を回収し、ＰＢＳ中で維持した。次いで、全細胞集団を室温で１時間、ＡＰＣ標識抗ＣＤ３４モノクローナル抗体で標識した。ＰＢＳによる洗浄工程の後、細胞を遠心分離によって沈降させ、１ｍｌの脱気した（degasses）冷選別バッファー中に再懸濁した。
【０１１４】
細胞の精製を、Becton Dickinsonのイムノサイトメトリーシステム上で行った。細胞を６８０ｎｍでの緑色蛍光パラメータを用いて選別した後、蛍光細胞を含有する液滴を滅菌微小遠心管（Fisher scientific）に収集し、遠心分離によって沈降させ、割り当てられた（appropriated）フラスコに即座に播種した。
【０１１５】
培養による富化
２８日目に、３７℃で１分間〜５分間トリプシン溶液を使用して、ＭＳＣ細胞を剥がした。細胞を計数し、１×１０６細胞／１７５ｃｍ２でプレーティングし、実施例中で定めた成長因子を用いて又は用いずに、同じ標準的な条件でさらに１週間培養した。
【０１１６】
表現型分析
免疫生物学的細胞表面マーカーをフローサイトメトリーにより分析した。細胞を以下の標識モノクローナル抗体：ＣＤ１０５、ＣＤ９０及びＣＤ７３、並びにＣＤ３４と共に１５分間インキュベートし、その後ＰＢＳで洗浄した後、遠心分離し、０．３ｍｌのＰＢＳ中に再懸濁した。
【０１１７】
ＡＬＰ染色
２８日目又は３５日目に、細胞をＡＬＰ検出のために染色した。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、その後室温で３０秒間、６０％クエン酸緩衝アセトンで固定した後、再度蒸留水で４５秒間すすいだ。次いで、細胞を室温、暗所で３０分間、ファストブルーＲＲ／ナフトールＡＳ−ＭＸフォスフェート溶液を用いて染色した。細胞を蒸留水で２分間洗浄した後、Mayerのヘマトキシリン溶液中で１０分間対比染色した。最後に、細胞を蒸留水で３分間洗浄した。
【０１１８】
石灰化アッセイ
２８日目又は３５日目に、細胞をトリプシンと共にインキュベートすることによって培養物から回収し、６０〜１２００００細胞／ウェルで、６ウェルプレートの増加培地にプレーティングした（１２５００細胞／ｃｍ２）。翌日、培地を２．５ｍｌの骨形成培地と交換した。細胞を２週間、３週間又は４週間培養した。培地は３日〜４日毎に交換した。２週間の培養後、細胞を、３．７％ホルムアルデヒド／ＰＢＳ中で固定し、アリザリンレッドにより染色した。
【０１１９】
ネットワーク形成アッセイ
細胞集団が毛細血管様構造のネットワークを形成する能力を評価するために、マトリゲル管形成アッセイを行った。簡潔に述べると、２４ウェル培養プレートを、１ウェル当たり１０μｌ（３．５ｍｇ／ｍｌ）の純粋な成長因子低減マトリゲル（ＢＤ Ｍａｔｒｉｇｅｌ Ｂａｓｅｍｅｎｔ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｍａｔｒｉｘ、BD Biosciences、Erembodegem-Aalst、Belgium）を用いて、メーカーの使用説明書に従ってコーティングした後、３７℃で３０分間重合させた。合計で３０×１０３細胞／ウェルをマトリゲル上に播種し、３７℃で６時間インキュベートした。洗浄した後、倒立位相差顕微鏡を用いてネットワーク形成及び管形成を観察した。
【０１２０】
培地
デキサメタゾン希釈物：
Ｄｅｘ１（５×１０−４Ｍ）：２μｌのデキサメタゾン原液（５×１０−２Ｍ）＋１９８μｌのα−ＭＥＭ
Ｄｅｘ２（１０−６Ｍ）：２μｌのＤｅｘ１（５×１０−４Ｍ）＋９９８μｌのαＭＥＭ
骨形成培地（４０ｍｌ）
容量 最終濃度
αＭＥＭ ３１ｍｌ ／
ＦＣＳ ６ｍｌ １５％
ＰｅｎＳｔｒｅｐＧｌｕ（１００×） ４００μｌ １×
デキサメタゾン（Ｄｅｘ２） ４００μｌ １０−８Ｍ
アスコルビン酸 ２００μｌ ５０μｇ／ｍｌ
β−グリセロリン酸 ２ｍｌ １０ｍＭ
【０１２１】
実施例２
細胞表現型
実施例１（「骨髄ＭＳＣの単離及び培養」）で説明したように得られ、細胞選別又は成長因子刺激を行っていないＭＳＣ細胞集団は、その間葉系起源と一致して、高レベルの間葉系マーカー（ＣＤ９０、ＣＤ１０５及びＣＤ７３）を発現した。造血ＣＤ３４表面分子は低レベル（通常、全集団の５％〜１５％）で発現された。細胞の骨分化能（bone potential）を表すＡＬＰマーカーも高度に発現された（表１及び表２）。ＣＤ３４＋細胞の３分の１がＣＤ９０＋でもあった（図１−低レベル及び高レベルのＣＤ９０／ＣＤ３４＋発現）。
【０１２２】
【表１】
【０１２３】
【表２】
【０１２４】
実施例３
ＣＤ３４陽性細胞の単離
実施例１（「骨髄ＭＳＣの単離及び培養」）で説明したように行った、細胞選別前の第１の増加工程の終了時に、ＭＳＣ細胞をフラスコから回収した。ＣＤ９０／ＣＤ３４＋集団を単離するために、フローサイトメトリー選別による陽性選択の方法を用いた。細胞をまず、特異的ＡＰＣ結合抗ＣＤ３４抗体溶液で染色した。次いで、細胞集団をBecton Dickinsonの蛍光活性化細胞選別装置に注入し、ＣＤ３４標識細胞を集団から単離した。ＣＤ３４＋細胞を次に、リン酸緩衝食塩溶液中に収集した。
【０１２５】
細胞の一定分量を分析して、純度を確認した。１×１０８個の初期細胞から平均で約５０×１０６個の細胞を選別したが、その１５％〜９０％がＣＤ９０／ＣＤ３４＋骨芽前駆細胞であった。これは１０倍〜３０倍の富化に相当する。これらの細胞を同じ条件下でさらに培養した。
【０１２６】
実施例４
増加方法
実施例３で説明したように得られた単離ＣＤ３４＋細胞を、１週間の培養プロトコルで増加させた。単離画分のうち約７０％〜７５％が精製工程まで生存した。これらの細胞を、成長因子及びサイトカインを添加した、血漿を含有する標準培地中でインキュベートした。代替的に、選別していない細胞を同様に培養することができた。選別の有無にかかわらず同様の結果が得られた。
【０１２７】
単独の又は組み合わせた造血因子（例えばＣＳＦ２、ＣＳＦ３、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ、ＴＮＦ、又はＩＬ２等のサイトカイン）と共にインキュベートした細胞は、標準的な条件で成長させた細胞と同じ収率で成長させることが可能であった。しかしながら、単独の又は組み合わせた血管新生因子（例えばＦＬＴ１、ＰＤＧＦ、ＶＥＧＦ、ｖＷＦ、アンジオポエチン２、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−３及びＥＰＯ）と共にインキュベートした細胞の収率は、標準的な条件で得られる収率よりも平均で２５％高かった。より興味深いことに、造血因子及び血管新生因子両方の組み合わせは、５０％近くという最も高い増加収率の増大をもたすことが可能であった。これは、この組み合わせの相乗効果を示唆している。
【０１２８】
骨形成培地中でインキュベートした細胞を対照として使用したが、これはＣＤ９０／ＣＤ３４＋初期集団の中程度の増加率を示す。
【０１２９】
例えば、ＦＧＦ−２の存在下で造血因子ＧＭ−ＣＳＦと共にインキュベートした細胞は、その収率をＧＭ−ＣＳＦ又はＦＧＦ−２単独と比べて大幅に増大させた（表３）。
【０１３０】
【表３】
【０１３１】
さらに、１週間の培養後のＣＤ９０／ＣＤ３４＋細胞の形態は、初期骨形成性細胞と同じ紡錘状であった（図２）。
【０１３２】
これらの骨芽前駆細胞は、（培養期間中）常に接着したままであり、このことはこの新たな集団が循環することはなく、したがって循環骨芽細胞系列（例えば、Eghbali-Fatourechi et al. 2007. Bone 40: 1370-7の骨芽細胞）とは区別されることを示唆する。
【０１３３】
これらの細胞の増加終了時の表面マーカープロファイルを、標準的な培養条件で分析した。ＣＤ３４マーカーは高レベルで維持されたが、他の間葉系マーカー又は骨特異的マーカーは変化しなかった。これにより、骨形成特性（ＡＬＰ）及び造血特性（ＣＤ３４陽性）の両方を併せ持つ新たな集団の発見が支持される（表４及び図３）。
【０１３４】
【表４】
【０１３５】
実施例５
骨再構築性
この（ＧＭ−ＣＳＦ及びＦＧＦ−２の組み合わせの存在下で実施例３において得られるような）新たな集団の生物学的性質を、ＡＬＰ産生（ＡＬＰ染色）、並びに新たな骨マトリクスを形成及び石灰化するその能力を測定することによって評価した。ＣＤ３４＋細胞は、相当量の骨マトリクスを産生し（最大値２のスコアで２）、ＡＬＰ染色処置に対して有意に陽性であり（最大値２のスコアで２）、この細胞集団に高い骨再構築可能性があったことが示唆される（図４）。比較としては、標準的なＭＳＣ培養物の骨マトリクススコアは１〜１．５であり、ＡＬＰ染色スコアは１．５である。
【０１３６】
興味深いことに、集団中のＣＤ３４＋細胞の％が高いほど、石灰化能力も高くなることが示された（図５）。
【０１３７】
実施例６
ＭＳＣ及び骨形成性細胞の増加、富化及びその性質
造血成長因子及び／又は血管新生成長因子の存在下での増殖（表５）
細胞に対し、実施例１（「培養による富化」）で説明したような富化プロトコルを行った。
【０１３８】
表５（ｎ＝３）に示されるように、ＦＧＦ−２（２ｎｇ／ｍｌ）は、対照条件（ＦＢＳ１５％）と比較して、特異的骨形成性細胞集団の増殖及び増加を誘導した。本発明者らのデータによって、ＦＧＦ−２の存在下で、ＧＭ−ＣＳＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）又はＩＦＮ−γ（１０ｎｇ／ｍｌ）のいずれかを用いると、この骨形成性細胞集団の生成及び／又は増殖が得られ及び／又は維持され、ＦＧＦ−１（２ｎｇ／ｍｌ）、ＦＧＦ−３（２ｎｇ／ｍｌ）又はＰＤＧＦ（１ｎｇ／ｍｌ）の血管新生成長因子を用いると有意に増大することがさらに明らかになった。
【０１３９】
【表５】
【０１４０】
表現型特性化（表６）
増加させた骨形成性細胞のフローサイトメトリー分析（ｎ＝３）によって、この選択された細胞集団が、ＣＤ３４をＣＤ１０５、ＣＤ７３及びＣＤ９０等の典型的な間葉系細胞マーカーと共に発現するが、ＣＤ４５、ＣＤ１３３及びＣＤ３１抗原等の造血細胞表面マーカー及び内皮細胞表面マーカーを欠くという特異的な表現型プロファイルを示したことが実証された。
【０１４１】
【表６】
【０１４２】
骨形成性（表７、図６）
増加させた骨形成性細胞集団のフローサイトメトリー分析及びＡＬＰ染色によって、これらの細胞が強い骨形成性を示すことが示された（ｎ＝３）。さらに、興味深いことに、ＩＦＮ−γがＡＬＰ発現及び染色の両方を選択的かつ大幅に増大させ、それにより細胞の骨形成特性を向上させることが示された。
【０１４３】
【表７】
【０１４４】
血管新生促進性及び毛細血管様構造形成可能性（表７、図７）
増加させた骨形成性細胞のフローサイトメトリー分析によって、ｖＷＦ及びＶＥＧＦ分子発現の上方制御が実証された（ｎ＝３）。さらに、図７に示すように（ｎ＝１）、本発明者らのデータによって、この骨形成性細胞集団がマトリゲルモデルにおいて分岐した新生血管構造及び偽管へと分化及び組織化可能であることが示された。加えて、ＩＦＮ−γがこのネットワーク形成を、対照（及び他の造血因子及び／又は血管新生因子）と比較して明らかに向上させることが示された。これらのｉｎ ｖｉｔｒｏでの結果は、ＩＦＮ−γ及び増加させた骨形成性細胞集団の両方が、管形成及び毛細血管様構造の発生を促進する能力（血管新生促進効果）を有することを示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくともＣＤ１０５とＣＤ３４とを共発現することを特徴とする単離間葉系幹細胞（ＭＳＣ）。
【請求項２】
ＣＤ１０５、ＣＤ９０、ＣＤ７３及びＣＤ３４を共発現する、請求項１に記載の単離ＭＳＣ細胞。
【請求項３】
少なくともＣＤ１０５とＣＤ３４とを共発現するＭＳＣ細胞を得る方法であって、ＭＳＣ細胞集団から、少なくともＣＤ１０５とＣＤ３４とを共発現する細胞のサブセットを富化することを含む、方法。
【請求項４】
（ａ）被験体の試料からＭＳＣ細胞を単離すること、
（ｂ）任意で、該（ａ）のＭＳＣ細胞を富化する及び／又は増加させること、並びに
（ｃ）該（ａ）又は（ｂ）のＭＳＣ細胞から、少なくともＣＤ１０５とＣＤ３４とを共発現する細胞のサブセットを富化することを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ＭＳＣ細胞、好ましくは請求項１又は２に記載のＭＳＣ細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで増加させる方法であって、前記ＭＳＣ細胞を、１つ若しくは複数の造血成長因子、又は１つ若しくは複数の血管新生成長因子、又は１つ若しくは複数の造血成長因子及び１つ若しくは複数の血管新生成長因子に曝露することを含み、任意で、好ましくは前記ＭＳＣ細胞をＦＧＦ−２に曝露することをさらに含む、方法。
【請求項６】
請求項１又は２に規定されるＭＳＣ細胞をＭＳＣ集団からｉｎ ｖｉｔｒｏで得る、及び／又は請求項１又は２に規定されるＭＳＣ細胞に関してＭＳＣ集団を富化する方法であって、前記ＭＳＣ集団を、１つ若しくは複数の造血成長因子、又は１つ若しくは複数の血管新生成長因子、又は１つ若しくは複数の造血成長因子及び１つ若しくは複数の血管新生成長因子に曝露することを含み、任意で、好ましくは前記ＭＳＣ細胞をＦＧＦ−２に曝露することをさらに含む、方法。
【請求項７】
造血成長因子がコロニー刺激因子２（ＣＳＦ２）、ＣＳＦ３、マクロファージＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球単球ＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターフェロン（ＩＦＮ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）及び造血活性のあるサイトカインを含む群から選択され、且つ血管新生成長因子が血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、フォン・ヴィレブランド因子（ｖＷＦ）、アンジオポエチン１又は２、線維芽細胞成長因子及びエリスロポエチン（ＥＰＯ）を含む群から選択される、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項８】
造血成長因子がＧＭ−ＣＳＦ又はＩＦＮ−γ、より好ましくはＩＦＮ−γであり、且つ血管新生成長因子がＰＤＧＦ、ＦＧＦ−１又はＦＧＦ−３、より好ましくはＰＤＧＦ又はＦＧＦ−３である、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項９】
請求項３〜８のいずれか１項に記載の方法によって得ることができるＭＳＣ細胞。
【請求項１０】
請求項１、２又は９に記載のＭＳＣ細胞を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで骨形成性細胞に分化させることによって得ることができる骨形成性細胞。
【請求項１１】
ＣＤ１０５とＣＤ３４とを共発現することを特徴とする単離骨形成性細胞。
【請求項１２】
ＣＤ１０５、ＣＤ９０、ＣＤ７３及びＣＤ３４を共発現する、請求項１１に記載の単離骨形成性細胞。
【請求項１３】
骨形成性細胞、好ましくは請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の骨形成性細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで増加させる方法であって、前記骨形成性細胞を、１つ若しくは複数の造血成長因子、又は１つ若しくは複数の血管新生成長因子、又は１つ若しくは複数の造血成長因子及び１つ若しくは複数の血管新生成長因子に曝露することを含み、任意で、好ましくは前記骨形成性細胞をＦＧＦ−２に曝露することをさらに含む、方法。
【請求項１４】
請求項１０〜１２のいずれか１項に規定される骨形成性細胞を骨形成性細胞集団からｉｎ ｖｉｔｒｏで得る、及び／又は請求項１０〜１２のいずれか１項に規定される骨形成性細胞に関して骨形成性細胞集団を富化する方法であって、前記骨形成性細胞集団を、１つ若しくは複数の造血成長因子、又は１つ若しくは複数の血管新生成長因子、又は１つ若しくは複数の造血成長因子及び１つ若しくは複数の血管新生成長因子に曝露することを含み、任意で、好ましくは前記骨形成性細胞をＦＧＦ−２に曝露することをさらに含む、方法。
【請求項１５】
造血成長因子がコロニー刺激因子２（ＣＳＦ２）、ＣＳＦ３、マクロファージＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球単球ＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターフェロン（ＩＦＮ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）及び造血活性のあるサイトカインを含む群から選択され、且つ血管新生成長因子が血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、フォン・ヴィレブランド因子（ｖＷＦ）、アンジオポエチン１又は２、線維芽細胞成長因子及びエリスロポエチン（ＥＰＯ）を含む群から選択される、請求項１３又は１４に記載の方法。
【請求項１６】
造血成長因子がＧＭ−ＣＳＦ又はＩＦＮ−γ、より好ましくはＩＦＮ−γであり、且つ血管新生成長因子がＰＤＧＦ、ＦＧＦ−１又はＦＧＦ−３、より好ましくはＰＤＧＦ又はＦＧＦ−３である、請求項１３又は１４に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１３〜１６のいずれか１項に記載の方法によって得ることができる骨形成性細胞。
【請求項１８】
骨形成性及び血管新生促進性の両方を示す、請求項１、２若しくは９に記載のＭＳＣ細胞、又は請求項１０〜１２若しくは１７のいずれか１項に記載の骨形成性細胞。
【請求項１９】
ヒト起源である、請求項１、２、９若しくは１８に記載のＭＳＣ細胞、又は請求項１０〜１２、１７若しくは１８のいずれか１項に記載の骨形成性細胞。
【請求項２０】
請求項１、２、９、１８若しくは１９に記載のＭＳＣ細胞、及び／又は請求項１０〜１２、１７〜１９のいずれか１項に記載の骨形成性細胞を含む細胞集団。
【請求項２１】
骨関連障害の治療に使用される、請求項１、２、９、１８若しくは１９に記載のＭＳＣ細胞、及び／又は請求項１０〜１２、１７〜１９のいずれか１項に記載の骨形成性細胞、又は請求項２０に記載の細胞集団。
【請求項２２】
請求項１、２、９、１８若しくは１９に記載のＭＳＣ細胞、及び／又は請求項１０〜１２、１７〜１９のいずれか１項に記載の骨形成性細胞、又は請求項２０に記載の細胞集団、並びに１つ又は複数の薬学的に許容可能な担体／賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項２３】
請求項２１に記載の医薬品製剤を調製する方法であって、請求項１、２、９、１８若しくは１９に記載のＭＳＣ細胞、及び／又は請求項１０〜１２、１７〜１９のいずれか１項に記載の骨形成性細胞、又は請求項２０に記載の細胞集団を、１つ又は複数の薬学的に許容可能な担体／賦形剤と混合することを含む、方法。
【請求項１】
少なくともＣＤ１０５とＣＤ３４とを共発現することを特徴とする単離間葉系幹細胞（ＭＳＣ）。
【請求項２】
ＣＤ１０５、ＣＤ９０、ＣＤ７３及びＣＤ３４を共発現する、請求項１に記載の単離ＭＳＣ細胞。
【請求項３】
少なくともＣＤ１０５とＣＤ３４とを共発現するＭＳＣ細胞を得る方法であって、ＭＳＣ細胞集団から、少なくともＣＤ１０５とＣＤ３４とを共発現する細胞のサブセットを富化することを含む、方法。
【請求項４】
（ａ）被験体の試料からＭＳＣ細胞を単離すること、
（ｂ）任意で、該（ａ）のＭＳＣ細胞を富化する及び／又は増加させること、並びに
（ｃ）該（ａ）又は（ｂ）のＭＳＣ細胞から、少なくともＣＤ１０５とＣＤ３４とを共発現する細胞のサブセットを富化することを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ＭＳＣ細胞、好ましくは請求項１又は２に記載のＭＳＣ細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで増加させる方法であって、前記ＭＳＣ細胞を、１つ若しくは複数の造血成長因子、又は１つ若しくは複数の血管新生成長因子、又は１つ若しくは複数の造血成長因子及び１つ若しくは複数の血管新生成長因子に曝露することを含み、任意で、好ましくは前記ＭＳＣ細胞をＦＧＦ−２に曝露することをさらに含む、方法。
【請求項６】
請求項１又は２に規定されるＭＳＣ細胞をＭＳＣ集団からｉｎ ｖｉｔｒｏで得る、及び／又は請求項１又は２に規定されるＭＳＣ細胞に関してＭＳＣ集団を富化する方法であって、前記ＭＳＣ集団を、１つ若しくは複数の造血成長因子、又は１つ若しくは複数の血管新生成長因子、又は１つ若しくは複数の造血成長因子及び１つ若しくは複数の血管新生成長因子に曝露することを含み、任意で、好ましくは前記ＭＳＣ細胞をＦＧＦ−２に曝露することをさらに含む、方法。
【請求項７】
造血成長因子がコロニー刺激因子２（ＣＳＦ２）、ＣＳＦ３、マクロファージＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球単球ＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターフェロン（ＩＦＮ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）及び造血活性のあるサイトカインを含む群から選択され、且つ血管新生成長因子が血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、フォン・ヴィレブランド因子（ｖＷＦ）、アンジオポエチン１又は２、線維芽細胞成長因子及びエリスロポエチン（ＥＰＯ）を含む群から選択される、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項８】
造血成長因子がＧＭ−ＣＳＦ又はＩＦＮ−γ、より好ましくはＩＦＮ−γであり、且つ血管新生成長因子がＰＤＧＦ、ＦＧＦ−１又はＦＧＦ−３、より好ましくはＰＤＧＦ又はＦＧＦ−３である、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項９】
請求項３〜８のいずれか１項に記載の方法によって得ることができるＭＳＣ細胞。
【請求項１０】
請求項１、２又は９に記載のＭＳＣ細胞を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで骨形成性細胞に分化させることによって得ることができる骨形成性細胞。
【請求項１１】
ＣＤ１０５とＣＤ３４とを共発現することを特徴とする単離骨形成性細胞。
【請求項１２】
ＣＤ１０５、ＣＤ９０、ＣＤ７３及びＣＤ３４を共発現する、請求項１１に記載の単離骨形成性細胞。
【請求項１３】
骨形成性細胞、好ましくは請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の骨形成性細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで増加させる方法であって、前記骨形成性細胞を、１つ若しくは複数の造血成長因子、又は１つ若しくは複数の血管新生成長因子、又は１つ若しくは複数の造血成長因子及び１つ若しくは複数の血管新生成長因子に曝露することを含み、任意で、好ましくは前記骨形成性細胞をＦＧＦ−２に曝露することをさらに含む、方法。
【請求項１４】
請求項１０〜１２のいずれか１項に規定される骨形成性細胞を骨形成性細胞集団からｉｎ ｖｉｔｒｏで得る、及び／又は請求項１０〜１２のいずれか１項に規定される骨形成性細胞に関して骨形成性細胞集団を富化する方法であって、前記骨形成性細胞集団を、１つ若しくは複数の造血成長因子、又は１つ若しくは複数の血管新生成長因子、又は１つ若しくは複数の造血成長因子及び１つ若しくは複数の血管新生成長因子に曝露することを含み、任意で、好ましくは前記骨形成性細胞をＦＧＦ−２に曝露することをさらに含む、方法。
【請求項１５】
造血成長因子がコロニー刺激因子２（ＣＳＦ２）、ＣＳＦ３、マクロファージＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球単球ＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターフェロン（ＩＦＮ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）及び造血活性のあるサイトカインを含む群から選択され、且つ血管新生成長因子が血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、フォン・ヴィレブランド因子（ｖＷＦ）、アンジオポエチン１又は２、線維芽細胞成長因子及びエリスロポエチン（ＥＰＯ）を含む群から選択される、請求項１３又は１４に記載の方法。
【請求項１６】
造血成長因子がＧＭ−ＣＳＦ又はＩＦＮ−γ、より好ましくはＩＦＮ−γであり、且つ血管新生成長因子がＰＤＧＦ、ＦＧＦ−１又はＦＧＦ−３、より好ましくはＰＤＧＦ又はＦＧＦ−３である、請求項１３又は１４に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１３〜１６のいずれか１項に記載の方法によって得ることができる骨形成性細胞。
【請求項１８】
骨形成性及び血管新生促進性の両方を示す、請求項１、２若しくは９に記載のＭＳＣ細胞、又は請求項１０〜１２若しくは１７のいずれか１項に記載の骨形成性細胞。
【請求項１９】
ヒト起源である、請求項１、２、９若しくは１８に記載のＭＳＣ細胞、又は請求項１０〜１２、１７若しくは１８のいずれか１項に記載の骨形成性細胞。
【請求項２０】
請求項１、２、９、１８若しくは１９に記載のＭＳＣ細胞、及び／又は請求項１０〜１２、１７〜１９のいずれか１項に記載の骨形成性細胞を含む細胞集団。
【請求項２１】
骨関連障害の治療に使用される、請求項１、２、９、１８若しくは１９に記載のＭＳＣ細胞、及び／又は請求項１０〜１２、１７〜１９のいずれか１項に記載の骨形成性細胞、又は請求項２０に記載の細胞集団。
【請求項２２】
請求項１、２、９、１８若しくは１９に記載のＭＳＣ細胞、及び／又は請求項１０〜１２、１７〜１９のいずれか１項に記載の骨形成性細胞、又は請求項２０に記載の細胞集団、並びに１つ又は複数の薬学的に許容可能な担体／賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項２３】
請求項２１に記載の医薬品製剤を調製する方法であって、請求項１、２、９、１８若しくは１９に記載のＭＳＣ細胞、及び／又は請求項１０〜１２、１７〜１９のいずれか１項に記載の骨形成性細胞、又は請求項２０に記載の細胞集団を、１つ又は複数の薬学的に許容可能な担体／賦形剤と混合することを含む、方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公表番号】特表２０１１−５２０４３４（Ｐ２０１１−５２０４３４Ａ）
【公表日】平成２３年７月２１日（２０１１．７．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５０７９２５（Ｐ２０１１−５０７９２５）
【出願日】平成２１年５月７日（２００９．５．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０５５５４９
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１３５９０５
【国際公開日】平成２１年１１月１２日（２００９．１１．１２）
【出願人】（５１０１７２８２６）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年７月２１日（２０１１．７．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年５月７日（２００９．５．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０５５５４９
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１３５９０５
【国際公開日】平成２１年１１月１２日（２００９．１１．１２）
【出願人】（５１０１７２８２６）
【Ｆターム（参考）】
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