新規アルドラーゼ及び４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンの製造方法
新規アルドラーゼについて記載する。４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンの合成における中間体として有用である４−ヒドロキシ−３−メチル−２−ケト−ペンタン酸は、アースロバクター属に由来する新規アルドラーゼを用いて、アセトアルデヒド及びα−ケト酪酸から合成することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物産業、詳しくは新規アルドラーゼ及び４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシン又はその塩の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンは、フェヌグリーク種子（コロハ（Trigonella foenum-graecum L. leguminosae））から抽出及び精製することができるアミノ酸である。４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンは、単離灌流ラット膵臓及びヒト膵島の両方で実証されているように、その促進効果が培地中の血漿グルコース濃度に明白に依存することから非常に興味深いインスリン分泌活性を示す（Sauvaire, Y.他, Diabetes, 47: 206-210 （1998））。このようなグルコース依存性は、２型糖尿病（すなわち、インスリン非依存性糖尿病（ＮＩＤＤ）、インスリン非依存性真性糖尿病（ＮＩＤＤＭ））の治療に現在用いられている唯一のインスリン分泌活性剤であるスルホニル尿素（Drucker, D. J., Diabetes
47: 159-169（1998））では確認されていない。その結果、低血糖症が、スルホニル尿素治療の依然として一般的に望ましくない副作用である（Jackson, J.及びBessler, R. Drugs, 22: 211-245; 295-320（1981）、Jennings, A.他, Diabetes Care, 12: 203-208（1989））。また、耐糖能の改善方法が知られている（Am. J. Physiol. Endocrinol., Vol. 287, E463-E471, 2004）。また、この糖代謝増強活性と医薬品及び健康食品への適用可能性とが報告されている（特開平６−１５７３０２号公報）。
【０００３】
植物でのみ発見されている４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンは、その特別なインスリン分泌作用のために、２型糖尿病の治療に対する新規の分泌促進剤であると考えられ得る。これは、２型糖尿病が様々な程度のインスリン耐性に関連するインスリン分泌不全を特徴とするためである（Broca, C.他, Am. J. Physiol. 277 （Endocrinol. Metab. 40）: E617-E623, （1999））。
【０００４】
フェヌグリーク抽出液中のジオキシゲナーゼ活性を利用することによる、鉄、アスコルビン酸、２−オキソグルタル酸、酸素依存性イソロイシンの水酸化法が４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンの製造方法として報告されている（Phytochemistry, Vol. 44, No. 4, pp. 563-566, 1997）。しかし、この方法は、２０ｍＭ以上のイソロイシン濃度で酵素活性が基質によって阻害されること、この酵素が同定されておらず、この酵素が植物の抽出液から誘導され、大量に得ることが容易ではないこと、またこの酵素が不安定であることから、４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンの製造方法としては不十分である。
【０００５】
全体的な収率が３９％である光学的に純粋な（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−４−ヒドロキシイソロイシンの効率的な８工程の合成が開示されている。この合成の重要な工程は、ゲオトリクム・カンジダム（Geotrichum candidum）を用いた２−メチルアセト酢酸エチルの（２Ｓ，３Ｓ）−２−メチル−３−ヒドロキシ酪酸エチルへの生物変換、及び不斉ストレッカー合成を伴う（Wang, Q.他, Eur. J. Org. Chem., 834-839（2002））。
【０００６】
最終工程がＥｕｐｅｒｇｉｔ Ｃ（Ｅ−ＰＡＣ）上に固定化された市販のペニシリンアシラーゼＧを用いた、Ｎ−フェニルアセチルラクトン誘導体の加水分解による酵素的分割法である、立体化学的に全体を制御した（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−４−ヒドロキシイソロイシンの短い６工程の化学酵素的合成も開示されている（Rolland-Fulcrand, V.他, J. Org. Chem., 873-877（2004））。
【０００７】
しかし、現在、４−ヒドロキシ−３−メチル−２−ケト−ペンタン酸の酵素的アミノ基
転移によって、又は任意の他の出発材料からの任意の他の酵素的変換によって４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンを生産したという報告はない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上記の課題を考慮して行われた広範な研究の結果、本発明者らは、好ましくは４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシン（その遊離形態及び塩形態、「４ＨＩＬ」と呼ぶこともある、以下同様）の所望の前駆体の合成に用いることができるアルドラーゼを発見した。この前駆体は、4−ヒドロキシ−３−メチル−２−ケト−ペンタン酸（その遊離形態及び塩形態、「ＨＭＫＰ」と呼ぶこともある、以下同様）であり、或る特定の微生物種に存在する。４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンが、アルドラーゼ酵素をアミノトランスフェラーゼ及び／又はデヒドロゲナーゼと組み合わせることによって生産されることも見出し、これにより本発明を完成させた。
【０００９】
本発明の目的は、新規のアルドラーゼ、及びアルドラーゼをコードするＤＮＡ、並びにアルドラーゼを用いて４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンを生産する方法を提供することを含む。上記の目的は、本発明の新規のアルドラーゼを発見することによって達成された。
【００１０】
したがって、本発明の目的は、
（ａ）配列番号１の塩基配列を含むＤＮＡ、
（ｂ）配列番号１の塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、アルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｄ）配列番号２のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加又は逆位を包含するアミノ酸配列を有し、アルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、および
（ｅ）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも７０％の相同性を有し、アルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
からなる群から選択されるＤＮＡを提供することである。
【００１１】
本発明のさらなる目的は、上記のＤＮＡとベクターＤＮＡとを含む組み換えＤＮＡを提供することである。
【００１２】
本発明のさらなる目的は、上記の組み換えＤＮＡで形質転換された単離細胞を提供することである。
【００１３】
本発明のまたさらなる目的は、培地中で細胞を培養すること、及び培地、細胞又はその両方においてアルドラーゼ活性を有するタンパク質を蓄積させることを含む、アルドラーゼ活性を有するタンパク質を製造する方法を提供することである。
【００１４】
本発明の別の目的は、
（ｆ）配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質、
（ｇ）配列番号２のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加又は逆位を包含するアミノ酸配列を有し、アルドラーゼ活性を有するタンパク質、および
（ｈ）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも７０％の相同性を有し、アルドラーゼ活性を有するタンパク質、
からなる群から選択されるタンパク質を提供することである。
【００１５】
本発明のさらなる目的は、以下の性質を有するタンパク質を提供することである
（Ａ）アセトアルデヒドとα−ケト酪酸からの４−ヒドロキシ−３−メチル−２−ケト−ペンタン酸の生成を触媒する活性を有する、
（Ｂ）該活性がＺｎ2+、Ｍｎ2+、及びＭｇ2+からなる群から選択される二価カチオンに依存する、
（Ｃ）ゲル濾過によって測定される分子量が約１８６ｋＤａ、
（Ｄ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって測定される１サブユニット当たりの分子量が２７ｋＤａ。
【００１６】
本発明の別の目的は、
（１）水性溶媒中で、
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質、
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸残基２の置換、欠失、挿入、付加又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、アルドラーゼ活性を有するタンパク質、および
（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも７０％の相同性を有し、アルドラーゼ活性を有するタンパク質、
からなる群から選択される少なくとも１つのアルドラーゼの存在下で、アセトアルデヒド及びα−ケト酪酸を反応させること、
（２）生成した４−ヒドロキシ−３−メチル−２−ケト−ペンタン酸を４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンに変換させること、並びに
（３）生成した４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンを単離すること
を含む、４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシン又はその塩を製造する方法を提供する。
【００１７】
本発明の目的は、４−ヒドロキシ−３−メチル−２−ケト−ペンタン酸が、アミノトランスフェラーゼ及び／又はデヒドロゲナーゼによって４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンに変換され、このアミノトランスフェラーゼ及び／又はデヒドロゲナーゼがアミノ基供与体の存在下でアミノ基転移活性を有する、上記の方法を提供することである。
【００１８】
本発明の目的は、
（１）水性溶媒中で、
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質、
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加又は逆位を包含するアミノ酸配列を有し、アルドラーゼ活性を有するタンパク質、および
（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも７０％の相同性を有し、アルドラーゼ活性を有するタンパク質、
からなる群から選択されるアルドラーゼを含有する細菌の存在下で、アセトアルデヒド及びα−ケト酪酸を反応させる工程であって、この水性溶媒がアミノ基供与体の存在下で、４−ヒドロキシ−３−メチル−２−ケト−ペンタン酸の４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンへの変換を触媒するアミノトランスフェラーゼ及び／又はデヒドロゲーゼも含有する、アセトアルデヒド及びα−ケト酪酸を反応させる工程、及び
（２）生成した４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンを単離する工程
を含む、４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシン又はその塩を製造する方法を提供することである。
【００１９】
本発明の目的は、アミノトランスフェラーゼが、分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼである、前記方法を提供することである。
【００２０】
本発明の目的は、分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼが、エシェリヒア及びバチ
ルスからなる群から選択される細菌に由来する、前記方法を提供することである。
【００２１】
本発明の目的は、アミノ基供与体がＬ−アミノ酸群から選択される、前記方法を提供することである。
【００２２】
本発明の目的は、分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼが、エシェリヒア及びバチルスからなる群から選択される細菌に由来する、前記方法を提供することである。
【００２３】
本発明の目的は、細菌がアルドラーゼ及び分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼの少なくとも１つの活性を高めるように修飾された、前記方法を提供することである。
【００２４】
本発明の目的は、アルドラーゼ及び分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼの活性が、アルドラーゼ及び／又は分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼの発現を増大させることによって高められた、前記方法を提供することである。
【００２５】
本発明の目的は、アルドラーゼ及び／又は分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼの発現が、アルドラーゼ及び／又は分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子の発現調節配列を改変すること、又はアルドラーゼ及び／又は分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子のコピー数を増加させることによって増大した、前記方法を提供することである。
【００２６】
本発明の目的は、細菌がエシェリヒア属、シュードモナス属、コリネバクテリウム属、アースロバクター属、アスペルギルス属又はバチルス属に属する、前記方法を提供することである。
【００２７】
本発明の目的は、細菌がエシェリヒア・コリ、アースロバクター・シンプレックス、コリネバクテリウム・グルタミカム、アースロバクター・グロビフォルミス、アースロバクター・スルフレウス、アースロバクター・ビスコーサス、又はバチルス・ズブチリスに属する、前記方法を提供することである。
【００２８】
本発明の目的は、細菌が細菌培養物、細胞、又は処理細胞である、前記方法を提供することである。
【００２９】
本発明の目的は、４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンが、（２Ｓ，３Ｓ，４Ｓ）−４−ヒドロキシイソロイシン、（２Ｓ，３Ｒ，４Ｒ）−４−ヒドロキシイソロイシン、（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−４−ヒドロキシイソロイシン、（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−４−ヒドロキシイソロイシン、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、前記方法を提供することである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
本明細書では、「４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシン」又は「４ＨＩＬ」という用語は、（２Ｓ，３Ｓ，４Ｓ）−４−ヒドロキシイソロイシン、（２Ｓ，３Ｒ，４Ｒ）−４−ヒドロキシイソロイシン、（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−４−ヒドロキシ−イソロイシン、及び／又は（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−４−ヒドロキシイソロイシンの単一の化合物若しくはジアステレオマー混合物、又はそれらの任意の組み合わせを表す。
【００３１】
本明細書で使用される「細菌」という用語は、酵素生成細菌、酵素活性が存在するか、又は高められているその細菌の突然変異体及び遺伝子組み換え体等を含む。
【００３２】
以下で、添付の図面を参照して、［Ｉ］アルドラーゼ、［ＩＩ］本発明のアルドラーゼ
を用いた４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンの製造方法について詳細に説明する。
【００３３】
［Ｉ］アルドラーゼ
本発明者らによる研究によれば、アースロバクター属において細菌株が４−ヒドロキシ−３−メチル−２−ケト−ペンタン酸を形成する能力を有するアルドラーゼを含有することが確認された。
【００３４】
本発明者らは、アースロバクター・シンプレックスが、４−ヒドロキシ−３−メチル−２−ケト−ペンタン酸をアセトアルデヒド及びα−ケト酪酸（遊離形態でも塩でもよい、以下同様）から生成する反応を触媒することができるアルドラーゼ活性を有していることを見出した。本発明者らは、培養した微生物細胞から新規のアルドラーゼを精製及び単離した。
【００３５】
さらに、本発明者らは、アースロバクター・シンプレックスＡＫＵ６２６株（ＮＢＲＣ１２０６９）（以下ａｓｉＨＰＡＬと略記する）から天然アルドラーゼを精製することによって、アルドラーゼのアミノ酸配列を決定した。さらに、本発明者らは、このアルドラーゼのアミノ酸配列から推測された約３０塩基対のＤＮＡ分子を合成し、このＤＮＡ分子を用いて、ＰＣＲによって、ａｓｉＨＰＡＬをコードする全長ＤＮＡを単離して得た。
【００３６】
ａｓｉＨＰＡＬをコードするＤＮＡは配列番号１で示される。さらに、配列番号１の塩基配列によってコードされたａｓｉＨＰＡＬのアミノ酸配列は配列番号２で示される。配列番号２は、配列番号１の塩基配列によってコードされたａｓｉＨＰＡＬのアミノ酸配列である。配列番号２のａｓｉＨＰＡＬはアルドラーゼ活性を有し、以下の式（ＩＩ）で示される４−ヒドロキシ−３−メチル−２−ケト−ペンタン酸（ＨＭＫＰ）が、１分子のアセトアルデヒドと１分子のα−ケト酪酸とから合成される反応を触媒する。
【００３７】
【化１】
【００３８】
次に、（１）アルドラーゼをコードするＤＮＡ、（２）アルドラーゼの特性、及び（３）アルドラーゼ生成プロセスをこの順に詳細に説明する。
【００３９】
（１）アルドラーゼをコードするＤＮＡ
配列番号１の塩基配列を有する本発明のアルドラーゼ遺伝子は、実施例の項で記載されるように、アースロバクター・シンプレックスＡＫＵ６２６株（ＮＢＲＣ１２０６９）の染色体ＤＮＡから単離された。配列番号２のアミノ酸配列は、ブレビバクテリウム・リネンスＢＬ２由来の既知のＨＨＤＥ−アルドラーゼ（２，４−ジヒドロキシヘプト−２−エン−１，７−ジオン酸アルドラーゼ）（国立バイオテクノロジー情報センター（National
Center for Biotechnology Information）（NIH, Bethesda, MD 20894, USA）に２００５年４月８日に提出された）と５５％の相同性を示す（図７）。
【００４０】
相同性は、「ベクターＮＴＩ」遺伝解析ソフトウェア（ｉｎｆｏｒｍａｘ（登録商標）, Invitrogen Life Science Software）を用いることによって算出された。
【００４１】
以下で、アルドラーゼをコードするＤＮＡをアルドラーゼ生成細菌から得る方法を説明する。
【００４２】
最初に、精製アルドラーゼの部分アミノ酸配列を決定した。４９１ｃＬＣタンパク質シークエンサー（Applied Biosystems, USA）を用いるEdmanの自動分解法（Edman, P., Acta Chem. Scand. 4, 227（1950））によって、アースロバクター・シンプレックスＡＫＵ６２６株（ＮＢＲＣ１２０６９）に由来するアルドラーゼの部分アミノ酸配列（配列番号３）を決定した。
【００４３】
このアミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列は、アミノ酸配列に基づき推測することができる。一般（Universal）コドンを利用して、このＤＮＡの塩基配列を推測する。
【００４４】
それから、推測塩基配列に基づき、約３０塩基対のＤＮＡ分子を合成した。ＤＮＡ分子を合成するのに用いた方法は、Tetrahedron Letters, 22, 1859（1981）で開示されている。Applied Biosystems製の合成装置を用いてＤＮＡ分子を合成することができる。ＤＮＡ分子をプローブとして用いて、アルドラーゼを生成する微生物の染色体ＤＮＡライブラリからアルドラーゼをコードする全長ＤＮＡを単離することができる。代替的に、ＤＮＡをプライマーとして用い、ＰＣＲによって、アルドラーゼをコードするＤＮＡを増幅することもできる。しかし、ＰＣＲによって増幅したＤＮＡはアルドラーゼの全長ＤＮＡを含有しないこともあるので、プローブとしてＰＣＲによって増幅したＤＮＡを用いてアルドラーゼを生成する微生物の染色体ＤＮＡライブラリから全長ＤＮＡが単離される。
【００４５】
ＰＣＲ手順は、White, T. J.他, Trends Genet. 5, 185（1989）等の刊行物に記載されている。染色体ＤＮＡの単離方法、及びプローブとしてＤＮＡ分子を用いて、所望のＤＮＡ分子を遺伝子ライブラリから単離する方法が、「Molecular Cloning第３版」（Cold Spring Harbor Laboratory Press（2001））等の刊行物に記載されている。
【００４６】
アルドラーゼをコードする単離ＤＮＡの塩基配列を決定する方法は、「A Practical Guide to Molecular Cloning」（John Wiley & Sons, Inc.（1985））に記載されている。さらに、塩基配列は、Applied Biosystems製のＤＮＡシークエンサーを用いることによって決定することができる。アースロバクター・シンプレックスＡＫＵ６２６株（ＮＢＲＣ１２０６９）由来のアルドラーゼをコードするＤＮＡは配列番号１で示される。
【００４７】
ＨＭＫＰをアセトアルデヒド及びα−ケト酪酸から形成する反応を触媒するアルドラーゼをコードするＤＮＡは、配列番号１で示されるＤＮＡだけではない。これは、アースロバクター種間のそれぞれの種及び株由来の塩基配列に差異が存在し得るためである。
【００４８】
したがって、本発明のＤＮＡは、単離されたアルドラーゼをコードするＤＮＡだけでなく、ＤＮＡが上記の反応を触媒することができるアルドラーゼをコードするかぎり、人工的に変異が導入されたアルドラーゼをコードするＤＮＡも含む。突然変異を人工的に誘導する方法は、Method. in Enzymol., 154（1987）で記載されるような部位特異的な突然変異を導入する等の一般的に用いられる方法を含む。
【００４９】
配列番号１の塩基配列と相補的であるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つアルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも本発明のＤＮＡに含まれる。本明細書で用いられるように、「ストリンジェントな条件」は、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリットは形成されない条件を表す。はっきりとした数値でこれらの条件を表すことは難しいが、例としては、例えば、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上及び特に好ましくは９５％以上の相同性の高いＤＮＡ分子が互いにハイブリダイズし、相同性の低いＤＮＡ分子は
互いにハイブリダイズしない条件、又はサザンハイブリダイゼーションにおける通常の洗浄条件、すなわち３７℃で０．１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳ、好ましくは６０℃で０．１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳ、さらに好ましくは６５℃で０．１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイゼーションが起こる条件が挙げられる。ハイブリダイゼーション条件によって、プローブの長さを好適に選択することができ、通常１００ｂｐ〜１ｋｂｐである。さらに、「アルドラーゼ活性」は、アセトアルデヒド及びα−ケト酪酸からのＨＭＫＰの合成活性を意味する。しかし、配列番号１の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列は、３７℃及びｐH８の条件下で、アルドラーゼ活性を１０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは５０％以上、及びさらに好ましくは７０％以上維持するアルドラーゼタンパク質をコードする。
【００５０】
さらに、配列番号１のＤＮＡによってコードされるアルドラーゼと実質的に同一であるタンパク質をコードするＤＮＡも、本発明のＤＮＡに含まれる。すなわち、以下のＤＮＡも本発明のＤＮＡに含まれる：
（ａ）配列番号１の塩基配列を有するＤＮＡ、
（ｂ）配列番号１の塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つアルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｄ）配列番号２のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、アルドラーゼ活性を保持するタンパク質をコードするＤＮＡ、並びに
（ｅ）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも７０％の相同性、好ましくは少なくとも８０％の相同性、より好ましくは少なくとも９０％の相同性、及びさらに好ましくは少なくとも９５％の相同性を有し、アルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【００５１】
本明細書で、「１又は数個」は、タンパク質の三次元構造又はアルドラーゼ活性が大きくは損なわれない範囲、より具体的には１〜７８、好ましくは１〜５２、より好ましくは１〜２６、及びさらにより好ましくは１〜１３、特に好ましくは１〜５の範囲を表す。
【００５２】
１又は数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加又は逆位は、活性を維持できるような保存的変異である。代表的な保存的変異は保存的置換である。保存的置換の例としては、ＡｌａのＳｅｒ又はＴｈｒへの置換、ＡｒｇのＧｌｎ、Ｈｉｓ又はＬｙｓへの置換、ＡｓｎのＧｌｕ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ又はＡｓｐへの置換、ＡｓｐのＡｓｎ、Ｇｌｕ又はＧｌｎへの置換、ＣｙｓのＳｅｒ又はＡｌａへの置換、ＧｌｎのＡｓｎ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ又はＡｒｇへの置換、ＧｌｕのＡｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ又はＡｓｐへの置換、ＧｌｙのＰｒｏへの置換、ＨｉｓのＡｓｎ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ又はＴｙｒへの置換、ＩｌｅのＬｅｕ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ又はＰｈｅへの置換、ＬｅｕのＩｌｅ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ又はＰｈｅへの置換、ＬｙｓのＡｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ又はＡｒｇへの置換、ＭｅｔのＩｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ又はＰｈｅへの置換、ＰｈｅのＴｒｐ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ又はＬｅｕへの置換、ＳｅｒのＴｈｒ又はＡｌａへの置換、ＴｈｒのＳｅｒ又はＡｌａへの置換、ＴｒｐのＰｈｅ又はＴｙｒへの置換、ＴｙｒのＨｉｓ、Ｐｈｅ又はＴｒｐへの置換、及びＶａｌのＭｅｔ、Ｉｌｅ又はＬｅｕへの置換が挙げられる。
【００５３】
さらに、「アルドラーゼ活性」は、上記のようなアセトアルデヒド及びα−ケト酪酸からのＨＭＫＰの合成を表す。しかし、アミノ酸配列が、配列番号２のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加又は逆位を包含する場合、このタンパク質は、３７℃及びｐH８の条件下でアルドラーゼ活性を、配列番号２のアミノ酸配
列を有するタンパク質の１０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは５０％以上、及びさらに好ましくは７０％以上維持することが望ましい。
【００５４】
（２）アルドラーゼの特性
次に、アースロバクター・シンプレックスＡＫＵ６２６株（ＮＢＲＣ１２０６９）（ａｓｉＨＰＡＬ）由来の精製アルドラーゼの特性について説明する。
【００５５】
本発明のａｓｉＨＰＡＬは、これまでに記載された遺伝子単離及び解析によって明らかなように、配列番号２のアミノ酸配列を有する。しかし、本発明は、配列番号２のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加又は逆位を包含するアミノ酸配列を有し、且つアルドラーゼ活性も有するタンパク質も含む。
【００５６】
すなわち、本発明のアルドラーゼは以下のタンパク質を含む：
（ｆ）配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質、
（ｇ）配列番号２のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加又は逆位を包含するアミノ酸配列を有し、アルドラーゼ活性を有するタンパク質、並びに
（ｈ）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも７０％の相同性、好ましくは少なくとも８０％の相同性、より好ましくは少なくとも９０％の相同性、さらに好ましくは少なくとも９５％の相同性を有し、アルドラーゼ活性を有するタンパク質。
【００５７】
本明細書で、「数個」及び「アルドラーゼ活性」の定義は（１）アルドラーゼをコードするＤＮＡの項で定義されたものと同じである。
【００５８】
本発明のアルドラーゼは、アセトアルデヒド及びα−ケト酪酸からのアルドール縮合反応による４−ヒドロキシ−３−メチル−２−ケト−ペンタン酸（ＨＭＫＰ）の合成を触媒する。
【００５９】
アルドラーゼ活性は、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）を用いることによる、アセトアルデヒド及びα−ケト酪酸からのＨＭＫＰ形成、又は続くＨＭＫＰからの４ＨＩＬへの変換後の４ＨＩＬ形成の検出によって測定することができる。
【００６０】
本発明のアルドラーゼは、アセトアルデヒド及びα−ケト酪酸からのアルドール縮合反応によってＨＭＫＰの合成を触媒することができる。基質として、２分子のα−ケト酸（又は置換α−ケト酸）を用いたアルドール縮合反応を触媒することができる２つの微生物酵素がこれまでに報告されている。この２つの微生物酵素は、エシェリヒア・コリ由来のＭｈｐＥアルドラーゼ（Appl. Environ. Microbiol., Vol. 64, No. 10, 4093-4094, 1998）及びSugiyama他（国際公開ＷＯ２００４／０１８６７２号）によって報告されたアルドラーゼである。しかし、生成したＨＭＫＰの量は、１μＭ未満であることが報告され、この量は４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンを生成するさらなるアミノ基転移プロセスで用いるのには十分な量ではない。したがって、産業上の利用可能性と共にＨＭＫＰの生成を記載している知見又は報告はなく、この酵素を用いてＨＭＫＰを合成することが可能であるか否かに関して完全には知られていない。すなわち、アセトアルデヒド及びα−ケト酪酸のアルドール縮合によるＨＭＫＰ合成を触媒することができるという点で、本発明のアルドラーゼはこれまでに報告されているアルドラーゼとは異なる。
【００６１】
次に、以下で精製ａｓｉＨＰＡＬの酵素特性を記載する。
【００６２】
ａｓｉＨＰＡＬは、アセトアルデヒド及びα−ケト酪酸からの以下の一般式（ＩＩ）：
【００６３】
【化２】
【００６４】
で表されるＨＭＫＰの形成を触媒する。このようにして、本発明のａｓｉＨＰＡＬを用いて、アセトアルデヒド及びα−ケト酪酸からＨＭＫＰを生産するプロセスも本明細書に記載される。
【００６５】
さらに、ａｓｉＨＰＡＬの活性は、Ｚｎ2+、Ｍｇ2+及びＭｎ2+イオンに強く依存し、ＥＤＴＡの存在下で完全に阻害される。つまり、ａｓｉＨＰＡＬは、２型アルドラーゼに属すると考えられる（表３を参照されたい）。
【００６６】
ａｓｉＨＰＡＬの分子量は、ゲル濾過で測定すると約１８６ｋＤａ、及びＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定すると約２７ｋＤａであるので、ａｓｉＨＰＡＬは六量体構造を有すると考えられる。
【００６７】
したがって、本発明は以下の特徴によって定義されるようなタンパク質も含む：
（Ａ）アセトアルデヒド及びα−ケト酪酸からの４−ヒドロキシ−３−メチル−２−ケト−ペンタン酸の生成を触媒する活性を有し、
（Ｂ）この活性がＺｎ2+、Ｍｎ2+及びＭｇ2+を含む１つ又は複数の二価カチオンに依存しており、
（Ｃ）ゲル濾過で測定した分子量が約１８６ｋＤａであり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定した１つのサブユニット当たりの分子量が約２７ｋＤａである。
【００６８】
（３）アルドラーゼ生成プロセス
次に、本発明のアルドラーゼ生成プロセスを記載する。本発明のアルドラーゼを生成するのに２つの方法が存在する：（ｉ）アルドラーゼ生成微生物を培養してアルドラーゼを生成すること、及び（ｉｉ）組み換えＤＮＡ技術によって形質転換体を調製し、この形質転換体を培養してアルドラーゼを生成すること。
【００６９】
（ｉ）微生物培養によるアルドラーゼ生成プロセス
天然のアルドラーゼ源である微生物には、アースロバクター属に属する微生物が含まれる。
【００７０】
アセトアルデヒド及びα−ケト酪酸からの前駆体ケト酸（ＨＭＫＰ）の合成を触媒するアルドラーゼを生成する微生物であればアースロバクター属に属する任意の微生物を本発明で用いることができる。好ましくは、これらの微生物としては、アースロバクター・シンプレックス（ＡＫＵ６２６、ＮＢＲＣ１２０６９）、アースロバクター・グロビフォルミス（ＡＫＵ６２５株、ＮＢＲＣ１２１４０株）、アースロバクター・スルフレウス（ＡＫＵ６３５株、ＮＢＲＣ１２６７８株）及びアースロバクター・ビスコーサス（ＡＫＵ６３６株、ＮＢＲＣ１３４９７株）が挙げられる。これらの中でも、アースロバクター・シンプレックス（ＡＫＵ６２６、ＮＢＲＣ１２０６９）が特に好ましい。これらの微生物の寄託についての詳細は以下に示される。
【００７１】
上記の細菌の中で、名称がＡＫＵから始まる株は、京都大学大学院農学研究科応用生命
科学科の発酵生理学及び醸造学研究室（the Laboratory of Fermentation Physiology and Applied Microbiology, Division of Applied Life Sciences, Faculty of Agriculture, Graduate School, Kyoto University）から得ることができる。
【００７２】
名称がＮＢＲＣ（前ＩＦＯ）から始まる株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構（the National Institute of Technology and Evaluation）（〒２９２−０８１８千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）から得ることができる。個々の株のアクセッション番号は、ＮＢＲＣカタログ：
（http://www.nbrc.nite.go.jp/NBRC2/NBRCDispSearchServlet?lang=en）
に記録されている。
【００７３】
微生物は液体培養及び／又は固体培養のいずれかで培養することができるが、産業的に有益な方法は、深部通気（deep-aerated）撹拌培養である。微生物培養に一般的に用いられる炭素源、窒素源、無機塩、及び他の微量栄養素を培地に用いることができる。選択された微生物株に利用可能であれば、どのような栄養源を用いてもよい。
【００７４】
培養は、振盪培養、深部通気（deep ventilation）撹拌培養等による好気条件下で行われる。温度は、微生物が生育し、且つアルドラーゼが生成される範囲内であればよい。したがって、条件は厳密ではないが、通常温度は１０〜５０℃であり、好ましくは１５〜４２℃である。培養時間は、他の培養条件に従って変わる。例えば、微生物はアルドラーゼが最大量生成されるまで培養することができ、これは通常約５時間〜７日間、好ましくは約１０時間〜９６時間である。
【００７５】
培養後、微生物細胞を遠心分離（例えば、１０分間１００００×ｇ）によって回収する。大部分のアルドラーゼが細胞に存在するので、アルドラーゼは微生物細胞を破砕又は溶解させることによって可溶化する。超音波破砕、フレンチプレス破砕、又はガラスビーズ破砕を用いて、微生物細胞を破砕することができる。細胞を溶解する場合、卵白リゾチーム、ペプチダーゼ処理、又はこれらの好適な組み合わせを用いてもよい。
【００７６】
アルドラーゼがアルドラーゼ生成微生物から精製される場合、細胞破砕液が用いられるが、非破砕又は非溶解の残渣又は残屑が残っている場合、可溶化溶液を再び遠心分離し、沈殿する全ての残渣又は残屑を取り除くことが精製には好ましい。
【００７７】
典型的な酵素を精製するのに一般的に用いられるあらゆる方法をアルドラーゼを精製するために使用することができ、この例としては、硫酸アンモニウム沈澱、ゲル濾過クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ及びヒドロキシアパタイトクロマトグラフィが挙げられる。その結果、比活性が高いアルドラーゼ含有画分を得ることができる。
【００７８】
（ｉｉ）組み換えＤＮＡ技術を用いた生成プロセス
次に、組み換えＤＮＡ技術を用いて、アルドラーゼを生成するプロセスを記載する。組み換えＤＮＡ技術を用いて、酵素及び生理学的に活性な物質等の有用なタンパク質を生成する方法が数多く知られている。この技術によって、自然状態では微量しか存在しない有用なタンパク質の大量生成が可能になる。
【００７９】
図１は本発明のアルドラーゼ生成プロセスのフローチャートである。
【００８０】
最初に、本発明のアルドラーゼをコードするＤＮＡを用意する（工程Ｓ１）。
【００８１】
次に、このＤＮＡをベクターＤＮＡと連結させ、組み換えＤＮＡを作製し（工程Ｓ２）
、細胞をこの組み換えＤＮＡで形質転換し、形質転換体を作製する（工程Ｓ３）。それから、形質転換体を培地中で培養し、アルドラーゼを生成させて、培地、細胞、又はその両方で蓄積させる（工程Ｓ４）。
【００８２】
続いて、アルドラーゼを回収及び精製する工程Ｓ５までプロセスを進める。
【００８３】
アルドール縮合反応（工程Ｓ６）において、工程Ｓ５で得られた精製アルドラーゼ、又はアルドラーゼを含有する培地及び／又は細胞（工程Ｓ４）を用いることによって、大量のＨＭＫＰを生成することができる。
【００８４】
アルドラーゼ遺伝子と連結したベクターＤＮＡによって、本発明のアルドラーゼが発現する。
【００８５】
ベクターＤＮＡに連結させるアルドラーゼ遺伝子には、［Ｉ］において記載されたＤＮＡが含まれる。
【００８６】
タンパク質の大量生成に組み換えＤＮＡ技術を用いる場合、細菌細胞、放線菌細胞、酵母細胞、糸状菌細胞、植物細胞、及び動物細胞等の細胞を宿主細胞として用いることができる。宿主ベクター系が確立している細菌細胞の例としては、エシェリヒア種、シュードモナス種、アースロバクター種、コルネバクテリウム種、アスペルギルス種、及びバチルス種が挙げられる。エシェリヒア・コリ又はコリネバクテリウム・グルタミカムを本発明に用いることが好ましい。これは、エシェリヒア・コリ又はコリネバクテリウム・グルタミカムを用いたタンパク質の大量生成に関してよく知られているためである。以下で、形質転換されたエシェリヒア・コリを用いてアルドラーゼを生成するプロセスを記載する。
【００８７】
エシェリヒア・コリにおける異種タンパク質生成に典型的に用いられるプロモーターを用いて、アルドラーゼをコードするＤＮＡを発現することができる。強力なプロモーターとしては、Ｔ７プロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、及びＰＬプロモーターが挙げられる。
【００８８】
融合タンパク質としてアルドラーゼを生成するために、アルドラーゼ遺伝子の上流又は下流のいずれかで別のタンパク質、好ましくは親水性ペプチドをコードする遺伝子を連結する。他のタンパク質をコードする遺伝子は、生成する融合タンパク質の量を増大させる、及び／又は変性工程及び再生工程後の融合タンパク質の可溶性を高めるように機能し得る。Ｔ７遺伝子１０、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、インターフェロン−γ遺伝子、インターロイキン−２遺伝子、ポリヒスチジン遺伝子、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ遺伝子、及びプロキモシン遺伝子は、アルドラーゼ遺伝子に融合することができる遺伝子の例である。
【００８９】
アルドラーゼ遺伝子と連結する場合、コドンのリーディングフレームを適合させる必要がある。この遺伝子は、好適な制限酵素部位で、又は適切な配列の合成ＤＮＡを用いて連結することができる。
【００９０】
生成する量を増大させるために、融合タンパク質遺伝子の下流にあるターミネーター等の転写終結配列を連結させることが好ましい。Ｔ７ターミネーター、ｆｄファージターミネーター、Ｔ４ターミネーター、テトラサイクリン耐性遺伝子ターミネーター、及びエシェリヒア・コリのｔｒｐＡ遺伝子ターミネーターを用いることができる。
【００９１】
多コピーベクターは、エシェリヒア・コリにアルドラーゼ又はアルドラーゼの融合タンパク質をコードする遺伝子を導入するのに好ましい。ｐＵＣプラスミド、ｐＢＲ３２２プ
ラスミド又はこれらの誘導体等のＣｏｌ Ｅ１由来の複製開始点を有するベクターを用いることができる。本明細書で「誘導体」は、置換、欠失、挿入、付加又は逆位等の塩基変化を有するプラスミドを表す。これらの変化には、突然変異原又はＵＶを用いた変異誘発処理、自然変異、又はランダム変異によって引き起こされるものが含まれ得る。
【００９２】
このベクターは、形質転換体が容易に選択できるようなアンピシリン耐性遺伝子等のマーカーを有することが好ましい。このようなプラスミドの例としては、強力なプロモーターを有する市販の発現ベクター（ｐＵＣ（タカラバイオ株式会社）、ｐＰＲＯＫ（Clontech）、及びｐＫＫ２３３−２（Clontech）等）が挙げられる。
【００９３】
ベクターＤＮＡを用いて、選択したプロモーター、アルドラーゼ又はアルドラーゼと別のタンパク質との融合タンパク質をコードする遺伝子、並びにターミネーターをこの順番で連結することによって組み換えＤＮＡが得られる。
【００９４】
エシェリヒア・コリを組み換えＤＮＡで形質転換した後に培養する場合、アルドラーゼ又はアルドラーゼと別のタンパク質との融合タンパク質が発現及び生成する。異種遺伝子の発現に典型的に用いられる株を形質転換宿主として用いることができ、エシェリヒア・コリＪＭ１０９（ＤＥ３）株及びエシェリヒア・コリＪＭ１０９株が特に好ましい。形質転換方法及び形質転換体の選択方法が、例えば「Molecular Cloning 第３版」（Cold Spring Harbor Laboratory Press（2001））に記載されている。
【００９５】
融合タンパク質を発現する場合、アルドラーゼは血液凝固因子Ｘａ又はカリクレイン等の制限プロテアーゼを用いて切断することができる。これらのプロテアーゼは、アルドラーゼに存在しない配列を認識する。
【００９６】
エシェリヒア・コリを培養するのに典型的に用いられる培地を生成培地として用いることができる。例としては、Ｍ９−カザミノ酸培地及びＬＢ培地が挙げられる。さらに、培養条件及び生成を誘導する条件は、用いるマーカー及びプロモーターの種類、並びに宿主微生物の種類に応じて適切に選択することができる。
【００９７】
以下の方法を用いて、アルドラーゼ又は融合タンパク質を回収することができる。アルドラーゼ又は融合タンパク質が微生物細胞内で可溶化される場合、回収細胞を破砕又は溶解した後に粗酵素溶液を用いることができる。さらに、アルドラーゼ又は融合タンパク質は必要に応じて、沈澱、濾過、カラムクロマトグラフィ、又は他の一般技法によっても精製することができる。アルドラーゼ又はその融合タンパク質の抗体を精製に用いることもできる。
【００９８】
タンパク質封入体が形成される場合、変性剤で可溶化することができる。タンパク質封入体は微生物細胞タンパク質で可溶化することができるが、続く精製手順を考慮すると、封入体を取り出した後に可溶化することが好ましい。技術分野で既知の方法を用いて、封入体を微生物細胞から回収することができる。例えば、封入体は、微生物細胞を破砕した後、遠心分離によって回収することができる。タンパク質封入体を可溶化する変性剤の例としては、塩酸グアニジン（例えば、６Ｍ、ｐＨ５〜８）及び尿素（例えば、８Ｍ）が挙げられる。
【００９９】
タンパク質封入体は、透析等の処理でこれらの変性剤を取り除くことによって活性タンパク質として再生することができる。トリス−ＨＣｌ緩衝液又はリン酸緩衝液等の透析溶液を透析に用いてもよく、濃度は２０ｍＭ〜０．５Ｍであり、ｐＨは５〜８であり得る。
【０１００】
巻き戻し工程中のタンパク質濃度は、約５００μｇ／ｍＬ以下に維持することが好まし
い。巻き戻ししたアルドラーゼが互いに架橋するのを防ぐために、透析温度は５℃以下であることが好ましい。さらに、活性は、透析の他に希釈及び限外濾過によって変性剤を取り除くことによって回復し得る。
【０１０１】
アルドラーゼ遺伝子が、アースロバクター属細菌に由来する場合、宿主としてアースロバクター種の細菌を用いて、アルドラーゼを発現及び生成することができる。本明細書で用いられるこのような宿主細胞及び組み換え発現系の例としては、アースロバクター種における組み換え発現方法（Shaw P. C.他, J Gen Micobiol. 134（1988） p.903-911）、アースロバクター・ニコチノボランスにおける組み換え発現方法（Sandu C.他, Appl Environ Microbiol. 71（2005） p8920-8924）、及びアースロバクター種における組み換え発現方法（Morikawa, M.他, Appl Microbiol Biotechnol., 42（1994）, p.300-303）が挙げられる。また、コリネ型細菌で発現された発現系もアースロバクター種で適用可能である（Sandu C.他）。しかし、本発明は本明細書に記載されたようなアルドラーゼに対するアースロバクター種の細菌の発現系に限定されない。
【０１０２】
［ＩＩ］４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンの製造方法
本発明の４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシン（４ＨＩＬ）の製造方法は、２つの工程からなる反応である：（１）アセトアルデヒドとα−ケト酪酸から４−ヒドロキシ−３−メチル−２−ケト−ペンタン酸（ＨＭＫＰ）を生成する酵素的アルドール縮合反応（以下の反応式（ＩＩＩ））、および（２）ＨＭＫＰから４ＨＩＬへの変換、すなわちＨＭＫＰから４ＨＩＬを生成する酵素的アミノ基転移（以下の反応式（ＩＶ））。
これらの工程はこの順番で連続して行うか、又は１つの容器でほとんど同時に行うことができる。それぞれの工程は以下に記載される。
【０１０３】
【化３】
【０１０４】
（１）４−ヒドロキシ−３−メチル−２−ケト−ペンタン酸（ＨＭＫＰ）の生成
ＨＭＫＰ（ＩＩ）：
【０１０５】
【化４】
【０１０６】
は、アセトアルデヒドとα−ケト酪酸とを反応させることによって生成され、この反応は反応を触媒するアルドラーゼの存在下で行われる。
【０１０７】
この反応を触媒するのに用いられるアルドラーゼには特に制限なく、アセトアルデヒド及びα−ケト酪酸のアルドール縮合によって一般式（ＩＩ）で表されるＨＭＫＰの合成を触媒することができれば、どのようなタンパク質を用いてもよい。
【０１０８】
このようなアルドラーゼの好ましい例は、［１］の項に記載されたアルドラーゼである。本発明の方法において、アルドラーゼは、ＨＭＫＰの生成を触媒することができれば、細菌（培養物、細菌細胞、又は細胞処理物を含む）、精製酵素、又は粗酵素等のいずれの形態で用いてもよい。細菌をアルドラーゼ源として用いる場合、アースロバクター属に属する微生物等の、アルドラーゼを自然状態で生成する細菌、及び［１］の項で記載されたような組み換えＤＮＡで形質転換された組み換え微生物の両方が包含される。
【０１０９】
例えば、アルドラーゼ生成細菌、又は組み換えＤＮＡで形質転換された細菌細胞を用いてＨＭＫＰを製造する場合、基質を培養中に培養培地に直接添加するか、又はこの基質は細菌細胞若しくは培養物から単離された洗浄細菌細胞であり得る。さらに、破砕又は溶解された細菌細胞を直接用いることもでき、又はアルドラーゼを処理細菌細胞から回収し、粗酵素溶液として用いることもでき、又は精製酵素を用いることもできる。すなわち、アルドラーゼ活性が存在する限り、アルドラーゼ活性含有画分を本発明の４ＨＩＬを製造するプロセスに用いることができる。
【０１１０】
アルドール縮合反応は、アセトアルデヒド、α−ケト酪酸、及びアルドラーゼ又はアルドラーゼ含有組成物を含有する反応溶液中で行い、２０〜５０℃の適温に調節し、静置させ、ｐＨを５〜１２に維持しながら３０分〜５日間振盪又は撹拌する。
【０１１１】
反応速度は、Ｍｇ2+、Ｍｎ2+、Ｆｅ2+、Ｚｎ2+又はＣｏ2+等の二価カチオンを反応混合物に添加することによっても増大させ得る。コスト等の点で、Ｚｎ2+を用いることが好ましい。
【０１１２】
これらの二価カチオンを反応溶液に添加する場合、反応を妨げなければ、どのような塩を用いてもよいが、ＺｎＣｌ2、ＺｎＳＯ4、ＭｇＳＯ4等を用いることが好ましい。これらの二価カチオンの濃度は、単純な予備研究によって好適に決定することができる。これらの二価カチオンは、０．０１ｍＭ〜１０ｍＭ、好ましくは０．１ｍＭ〜５ｍＭの範囲で添加し得る。
【０１１３】
ＨＭＫＰは、既知の技法に従って単離又は精製をすることができるが、特にアルドラーゼ及びアミノトランスフェラーゼの両方を発現する組み換え微生物によって製造する場合、単離又は精製をしなくともよい。単離及び精製の方法には、塩基性アミノ酸を吸収するイオン交換樹脂にＨＭＫＰを接触させた後に、溶離及び結晶化することが含まれる。別の精製方法は、溶離生成物が変色し、活性炭による濾過が必要な場合に、結晶化を行うことでＨＭＫＰを得ることを含む。
【０１１４】
本発明のＨＭＫＰの製造プロセスによって、アセトアルデヒド及びα−ケト酪酸から４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシン（４ＨＩＬ）の前駆体であるケト酸（ＨＭＫＰ）を製造することが可能になる。ＨＭＫＰを用いて、２位のアミノ化によって４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンを誘導することができるので、このＨＭＫＰは４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシン合成における中間体として有用である。ＨＭＫＰから４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンを生産するプロセスを次に記載する。
【０１１５】
（２）４−ヒドロキシ−３−メチル−２−ケト−ペンタン酸の４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンへの変換
ＨＭＫＰを上記の（１）に記載したように製造したのち、ＨＭＫＰを４ＨＩＬに変換する。
【０１１６】
ＨＭＫＰを４ＨＩＬに変換する方法は特に限定されず、化学的方法又は酵素的方法のいずれかを用いることができる。酵素的変換に関しては、酵素的アミノ基転移が好ましい。この工程では、「アミノ基転移」は、アミノ基が、供与体化合物、例えばＬ−グルタミン酸又はＬ−グルタミン酸塩からケト基を有する受容体化合物、例えば４−ヒドロキシ−３−メチル−２−ケト−ペンタン酸等に転移される反応を意味する。アミノ基供与体は、アミノ基を有してさえいれば特に限定されないが、Ｌ−グルタミン酸及び分岐鎖アミノ酸等のＬ−アミノ酸を用いることが好ましい。
【０１１７】
本発明において、「酵素的アミノ基転移」はアミノトランスフェラーゼ（トランスアミナーゼ）又はデヒドロゲナーゼによって行われるアミノ基転移反応を意味する。特に、細菌のアミノトランスフェラーゼ（トランスアミナーゼ）が好ましい。これらの酵素は、上記のアミノトランスフェラーゼ及び／又はデヒドロゲナーゼを組み込んでさえいれば、細菌（培養物、細菌細胞、又は細胞処理物を含む）、精製酵素、又は粗酵素等のいずれの形態で用いてもよい。プロセスを単純化することによって４ＨＩＬの生産コストを削減するために、培養溶液に直接、基質を添加することが最も好ましい。
【０１１８】
この工程で用いられるアミノトランスフェラーゼ及び／又はデヒドロゲナーゼは、ＨＭＫＰを４ＨＩＬに変換することができさえすれば、特に限定されない。分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼ（ＢＣＡＴ）が好ましい。例えば、ｉｌｖＥ遺伝子によってコードされるアミノトランスフェラーゼ、ｔｙｒＢ遺伝子によってコードされる芳香族アミノトランスフェラーゼ、ａｓｐＣ遺伝子によってコードされるアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、エシェリヒア・コリにおけるａｖｔＡ遺伝子によってコードされるバリン−ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ、バチルス・ズブチリスにおけるｙｗａＡ遺伝子によってコードされるアミノトランスフェラーゼ等が例示される。
【０１１９】
ＢＣＡＴの例示的なタンパク質配列はＣＯＧ０１１５（配列番号１３）である。また、ＢＣＡＴに属するタンパク質は、ＥＣ２．６．１．４２で示されている。
【０１２０】
実際には、分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼは全て、広い基質特異性を示すので、大抵のものは、アミノ基転移の基質としてＨＭＫＰを用いることができる。
【０１２１】
分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼは、Ｌ−グルタミン酸からのα−ケトイソ吉草酸、２−ケト−３−メチル吉草酸及び２−ケト−４−メチル−ペンタン酸等の様々なα−ケト酸へのアミノ基転移を触媒し、これによってそれぞれＬ−バリン、Ｌ−イソロイシン及びＬ−ロイシンが形成される。
【０１２２】
大多数の微生物由来の分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼが既知であり、これらのアミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子の塩基配列も開示されている。
【０１２３】
ｉｌｖＥ遺伝子は、エシェリヒア・コリ由来の分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼであるＩｌｖＥタンパク質（同意語はＢ３７７０、ＩｌｖＥ、分岐鎖アミノ酸：２−オキソグルタル酸アミノトランスフェラーゼ、ＢＣＡＴ、トランスアミナーゼＢ、ロイシントランスアミナーゼ、バリントランスアミナーゼ、及びイソロイシントランスアミナーゼを含む）をコードする。この分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼは、ｅｃｏＢＣＡＴと略記することができる。ｉｌｖＥ遺伝子は、エシェリヒア・コリＫ−１２株の染色体上のｉｌｖＭ遺伝子とｉｌｖＤ遺伝子との間に位置する。ｉｌｖＥ遺伝子の塩基配列は既知である（ヌクレオチド位置：３９５０５０７〜３９５１４３６、ＧｅｎＢａｎｋアクセ
ッション番号ＮＣ＿０００９１３．２、ｇｉ：４９１７５９９０）（配列番号１４）。ｉｌｖＥ遺伝子の塩基配列及びｉｌｖＥ遺伝子によってコードされるＩｌｖＥタンパク質のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１４及び配列番号１５に示される。
【０１２４】
ｙｗａＡ遺伝子は、バチルス・ズブチリス由来の分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼをコードする。この分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼは、ｂｓｕＢＣＡＴと略記することができる。ｙｗａＡ遺伝子は、バチルス・ズブチリス１６８株の染色体上のｄｌｔＥ遺伝子とｌｉｃＨ遺伝子との間に位置する。ｙｗａＡ遺伝子の塩基配列は既知である（ヌクレオチド位置：３９５６４１２〜３９５７５０３、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００９６４．２、ｇｉ：５０８１２１７３）（配列番号１６）。ｙｗａＡ遺伝子の塩基配列及びｙｗａＡ遺伝子によってコードされるＹｗａＡタンパク質のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１６及び配列番号１７に示される。
【０１２５】
他の微生物由来の分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼをコードする他の遺伝子は、分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼをコードする既知の遺伝子に対する相同性によって同定した後、この遺伝子によってコードされるタンパク質の活性を評価することができる。
【０１２６】
２つのアミノ酸配列間の相同性は、既知の方法、例えば、３つのパラメータ：スコア、同一性及び類似性を算出する、コンピュータプログラムＢＬＡＳＴ２．０を用いて決定することができる。
【０１２７】
したがって、エシェリヒア・コリ由来のｉｌｖＥ遺伝子及びバチルス・ズブチリス由来のｙｗａＡ遺伝子は、遺伝子の既知の塩基配列に基づいたプライマーを利用するＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応、White, T. J.他, Trends Genet., 5, 185（1989）を参照されたい）によって得ることができる。他の微生物由来の分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子も同様に得ることができる。
【０１２８】
細菌株間のＤＮＡ配列に幾つかの差異が存在し得るので、アルドラーゼ又はＢＣＡＴをコードする上記の遺伝子は、配列番号１、配列番号１４及び配列番号１６で示される塩基配列に限定されず、配列番号１、配列番号１４及び配列番号１６で示されるものと類似の塩基配列を含み得る。したがって、上記の遺伝子によってコードされるタンパク質変異体は、このタンパク質が反応を触媒することができさえすれば、配列番号２、配列番号１５及び配列番号１７で示されるアミノ酸配列全体と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、及び最も好ましくは９５％以上の相同性を有するものであってもよい。
【０１２９】
さらに、上記の遺伝子は、機能タンパク質をコードする場合、配列番号１、配列番号１４及び配列番号１６で示される塩基配列と、又はこれらの塩基配列に基づき調製されるプローブと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる変異体によって表される。本明細書で用いられる「ストリンジェントな条件」は、上記の［１］の（１）アルドラーゼをコードするＤＮＡの項と同じである。
【０１３０】
本発明で利用される細菌細胞処理物は、乾燥細菌塊（bacterial mass）、凍結乾燥細菌塊、界面活性剤又は有機溶媒による処理物、酵素処理物、超音波処理物、機械的粉砕物、溶媒処理物、細菌塊のタンパク質画分、細菌塊の固定生成物、及び処理細菌塊の形態であり得る。
【０１３１】
アミノ基転移によるＨＭＫＰからの４ＨＩＬの生成は、アルドール反応、とそれに続く生成ＨＭＫＰの単離及び／又は精製の後に連続して行うこともできるし、アルドラーゼ及
びアミノトランスフェラーゼを共存させることによって同じ反応溶液で同時に行うこともできる。反応を同じ反応溶液で行う場合（ワンポット反応）、アルドラーゼ及びアミノトランスフェラーゼを細菌中で同時に発現することができる。又は、これらの酵素は、上記のように別々に調製し、反応溶液に添加することができる。アルドラーゼをコードするＤＮＡとアミノトランスフェラーゼをコードするＤＮＡとを同時に発現する細菌（宿主細胞）は、それぞれアルドラーゼ及びアミノトランスフェラーゼのＤＮＡを含有する発現ベクターによる共トランスフェクション、又は宿主細胞で発現することができる形態でアルドラーゼ及びアミノトランスフェラーゼの両方のＤＮＡを含有する発現ベクターによる形質転換によって調製することができる。さらに、アルドラーゼ及び分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子の発現を増大させることが、アルドラーゼ及びアミノトランスフェラーゼの活性を高める好ましい方法である。
【０１３２】
「遺伝子の発現を増大させる」という語句は、遺伝子の発現が非改変株、例えば野生型株より高いことを意味する。このような改変の例としては、細胞１個当たりに発現する遺伝子のコピー数を増加させること、遺伝子の発現レベルを増大させること等が挙げられる。発現遺伝子のコピー数は、例えば、染色体ＤＮＡの制限酵素処理後、遺伝子配列に基いたプローブを用いたサザンブロッティング、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）等によって測定することができる。遺伝子発現レベルは、ノーザンブロッティング、定量的ＲＴ−ＰＣＲ等を含む様々な既知の方法によって測定することができる。発現されたタンパク質の量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、免疫ブロット法（ウェスタンブロッティング分析）等を含む既知の方法によって測定することができる。
【０１３３】
「タンパク質をコードするＤＮＡによる細菌の形質転換」とは、例えば、従来の方法によって細菌にＤＮＡを導入することを意味する。このＤＮＡの形質転換によって、本発明のタンパク質をコードする遺伝子の発現が増大され、細菌細胞におけるタンパク質の活性が高まる。形質転換の方法は、これまでに報告されている任意の既知の方法を含む。例えば、ＤＮＡに対する細胞の浸透性を増大させるように塩化カルシウムでレシピエント細胞を処理することがエシェリヒア・コリＫ−１２株で報告されており（Mandel, M.及びHiga, A., J. Mol. Biol., 53, 159（1970））、この方法を用いることができる。
【０１３４】
遺伝子発現を高める方法は、遺伝子コピー数を増加させることを含む。本発明の細菌で機能することができるベクターに遺伝子を導入することによって、遺伝子のコピー数が増加する。このような目的のために、好ましくは多コピーベクターを用いることができる。多コピーベクターは、ｐＢＲ３２２、ｐＭＷ１１９、ｐＵＣ１９、ｐＥＴ２２ｂ等で例示される。
【０１３５】
遺伝子発現の増強は、例えば相同組み換え、Ｍｕ融合等によって遺伝子の複数コピーを細菌染色体に導入することでも達成することができる。例えば、Ｍｕ融合の１回の実行によって、細菌の染色体に遺伝子のコピーを最大３個まで導入することができる。
【０１３６】
遺伝子のコピー数の増加は、遺伝子の複数コピーを細菌の染色体ＤＮＡに導入することによっても達成することができる。遺伝子の複数コピーを細菌の染色体に導入するためには、染色体ＤＮＡに複数コピー存在する標的配列を用いて、相同組み換えを行う。染色体ＤＮＡにおいて複数コピー存在する配列は、反復ＤＮＡ、又は転位因子の末端にある逆方向反復を含むが、これらに限定されない。また、米国特許第５，５９５，８８９号に開示されたように、遺伝子をトランスポゾンに組み込み、それを転移させ、遺伝子の多数のコピーを染色体ＤＮＡに導入することも可能である。
【０１３７】
遺伝子発現の増強は、強力なプロモーターの制御下に本発明のＤＮＡを置くことによっても達成することができる。例えば、Ｐｔａｃプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒ
ｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、λファージのＰＲプロモーター又はＰＬプロモーターは全て強力なプロモーターであることが知られている。強力なプロモーターは遺伝子コピーの増加と併せて用いることができる。
【０１３８】
代替的には、プロモーターの効果は、例えば、プロモーターの下流に位置する遺伝子の転写レベルを増加するように、突然変異をプロモーターに導入することによって高めることができる。さらに、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）と開始コドンとの間のスペーサ領域における幾つかのヌクレオチド、特に開始コドンのすぐ上流にある配列の置換がｍＲＮＡ翻訳能力に強く影響することが知られている。例えば、開始コドンに先行する３つのヌクレオチドの性質によって、２０倍の範囲の発現レベルが見出された（Gold他, Annu. Rev.
Microbiol., 35, 365-403, 1981、Hui他, EMBO J., 3, 623-629, 1984）。これまでに、ｒｈｔＡ２３突然変異は、ＡＴＧ開始コドンに対して−１位でＧをＡに置換することであることが示された（１９９７年のアメリカ生化学分子生物学学会総会主催の第１７回アメリカ生化学分子生物学学会国際会議の抄録（ABSTRACTS of 17th International Congress
of Biochemistry and Molecular Biology in conjugation with 1997 Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology）, San Francisco, California August 24-29, 1997, 抄録番号４５７）。
【０１３９】
さらに、ヌクレオチド置換を細菌染色体上の遺伝子のプロモーター領域に導入することも可能であり、これによりプロモーター機能が強められる。発現制御配列の改変は、例えば、国際公開ＷＯ００／１８９３５号及び特開平１−２１５２８０号公報に開示されたような温度感受性プラスミドを用いた遺伝子置換と同様に行うことができる。
【０１４０】
プラスミドＤＮＡの調製方法としては、ＤＮＡの消化及びライゲーション、形質転換、プライマーとしてのオリゴヌクレオチドの選択等、又は当業者に既知の他の方法が挙げられるが、これらに限定されない。これらの方法は、例えば「Molecular Cloning A Laboratory Manual, Third Edition」（Cold Spring Harbor Laboratory Press（2001））に記載されている。
【０１４１】
[実施例]
本発明は、以下で示される実施例を参照してさらに詳細に説明する。しかし、本発明は、これらに限定されない。
【実施例１】
【０１４２】
ａｓｉＨＰＡＬの精製
精製プロトコルは下記の手順を含む。
【０１４３】
工程１：アースロバクター・シンプレックスＡＫＵ６２６の一晩細菌培養物（３４℃で１２時間培養）１ｍＬを用いて、ＬＢ培地（８×（１Ｌフラスコ中に３７５ｍＬ））５Ｌを接種した。細胞を約２４時間最適温度で培養した。それから、細胞を４℃での遠心分離（１６０００×ｇ）によって回収し、１ｍＭのＰＭＳＦ（フッ化フェニルメチルスルホニル）を補充した緩衝液Ａ（５０ｍＭのＫＨ2ＰＯ4（ＫＯＨでｐＨ７．４に調節））３０ｍＬに再懸濁した。
【０１４４】
工程２：細胞を、フレンチプレス・セル（最高Ｐ＝２．５ｐｓｉ）に３〜５回通すことによって破砕した後、遠心分離によって残屑を取り除いた。タンパク質調製物は、緩衝液Ａで平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１５カラム（２．６×２８ｃｍ）に通した。
【０１４５】
工程３：アニオン交換クロマトグラフィ（ＡＥＣ１）は、ＤＥＡＥ（ファストフロー）カラム（ｄ＝１．６ｃｍ）５０ｍＬを備えたＡＫＴＡｂａｓｉｃ１００システムを用いて
行った。工程２で得られたタンパク質調製物４０〜５０ｍＬを緩衝液Ａで平衡化したカラムに加えた。溶離は、緩衝液Ａ（１０ＣＶ（カラム容積）：カラム容積の１０倍量））を用いて０〜０．５ＭのＮａＣｌの直線勾配で、流速２．５ｍＬ／分で行った。それぞれ１０ｍＬ分の画分を回収した。活性画分をプールし、「工程２」に記載されたようにして脱塩した。
【０１４６】
工程４：アニオン交換ＦＰＬＣ（ＡＥＣ２）はＡＫＴＡｂａｓｉｃ１００システムを用いて行い、「Ｓｏｕｒｓｅ１５Ｑ」カラム（Amersham Pharmacia Biotech）１．６ｍＬを補充した。工程３から得られたタンパク質調製物を、緩衝液Ａで平衡化したカラムに加えた。溶離は、緩衝液Ａ（４０ＣＶ）を用いて０〜０．５ＭのＮａＣｌの直線勾配で、流速１ｍＬ／分で行った。それぞれ２ｍＬ分の画分を回収した。活性画分をプールした（表１及び表２）。
【０１４７】
工程５：疎水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＣ）はＡＫＴＡｂａｓｉｃ１００システムを用いて行い、「ＲｅｓｏｕｒｃｅＰＨＥ」カラム（Amersham Pharmacia Biotech）１ｍＬを補充した。工程５で得られた調製物のタンパク質濃度を０．８ｍｇ／ｍＬに調節し、それから、硫酸アンモニウムを最終濃度が１．５Ｍになるまで添加した。タンパク質溶液は、１．５Ｍの硫酸アンモニウムを補充した緩衝液Ａで平衡化したカラムに加えた。溶離は、緩衝液Ａ（３０ＣＶ）を用いて１．５Ｍ〜０Ｍの硫酸アンモニウムの直線勾配で、流速１ｍＬ／分で行った。画分１ｍＬを回収した。活性画分をプールした（表１及び表２）。
【０１４８】
【表１】
1)比活性は、以下の組成物（１００ｍＭのＬ−グルタミン酸（ｐＨ８、ｐＨ８．０で調整）、１００ｍＭのα−ケト酪酸、１００ｍＭのアセトアルデヒド）と、１ｍＭのＺｎＣｌ2と、精製ｂｓｕＢＣＡＴ０．５μｇと、一定分量のａｓｉＨＰＡＬの活性画分とを用いたｂｓｕＢＣＡＴ／ａｓｉＨＰＡＬ二酵素反応における時間依存的な４ＨＩＬ生成をＨＰＬＣでモニタリングすることによって求めた。全ての反応を３７℃で行った。
2)（全タンパク質）×（比活性）として算出した。
3)１００％×（全活性／粗溶解物の全活性）として算出した。
4)（比活性／粗溶解物の比活性）として算出した。
【０１４９】
【表２】
【０１５０】
工程６：サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）はＳｕｐｅｒｄｅｘ（商標）２００ＨＲ １０／３０Ａ（Amersham Pharmacia Biotech）カラムを備えたＡＫＴＡｂａｓｉｃ１００システムを用いて行った。工程５で得られたタンパク質調製物を１００ｍＭのＮａＣｌを補充した緩衝液Ａで平衡化したカラムに加えた。０．５ｍＬ／分の流速で定組成溶離を行った。１ｍＬの画分を回収した。活性画分をプールした（表１、表２及び図１）。
【０１５１】
ａｓｉＨＰＡＬの比活性は、以下の組成物（１００ｍＭのＬ−グルタミン酸（ｐＨ８、ｐＨ８．０で調節）、１００ｍＭのα−ケト酪酸、１００ｍＭのアセトアルデヒド）と、１ｍＭのＺｎＣｌ2と、０．５μｇの精製Ｈｉｓ−タグ−ｂｓｕＢＣＡＴタンパク質（バチルス・ズブチリス由来の分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼ）と、一定分量の溶離画分とを含むｂｓｕＹｗａＡ／ａｓｉＨＰＡＬの二酵素反応における時間依存的な４ＨＩＬ形成をＨＰＬＣでモニタリングすることによって求めた。反応は全て３７℃で行った。バチルス・ズブチリス由来の分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼ（ｂｓｕＢＣＡＴ）をクローニングすること、及び４ＨＩＬ形成を測定するＨＰＬＣはそれぞれ、実施例５及び実施例６に記載される。
【０１５２】
ａｓｉＨＰＡＬモノマーの分子量をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図２Ａ）を用いて求めた。その平均値は２７ｋＤａと推定された。天然ａｓｉＨＰＡＬの分子量は、分子量タンパク質マーカー（Sigma）で較正したＳｕｐｅｒｄｅｘ（商標）２００ＨＲ １０／３０Ａ（Pharmacia）カラムで分析用ＳＥＣを用いて求めた（図２Ｂ）。その平均値は１８６ｋＤａと推定された。したがって、ａｓｉＨＰＡＬは六量体であると推測される。
【０１５３】
ＨＭＫＰ−アルドラーゼの金属イオン依存性を検討した。ａｓｉＨＰＡＬ活性がＺｎ2+、Ｍｇ2+及びＭｎ2+イオンに強く依存し、ＥＤＴＡの存在下で完全に阻害されることを確認した。したがって、ａｓｉＨＰＡＬは、２型アルドラーゼであると推測された（表３）。
【０１５４】
【表３】
【実施例２】
【０１５５】
ａｓｉＨＰＡＬのＮ末端配列の決定
２．１ ａｓｉＨＰＡＬのウェスタンブロッティング
ａｓｉＨＰＡＬは、トランスブロットＳＤセル（Bio-Rad）を用いて、Sequi-Blot ＰＶＤＦ膜（Bio-Rad）上に固定した。最適化ブロッティング条件は以下のようなものである：Ｄｕｎカーボネート移動緩衝液（メタノールを含まない１０ｍＭのＮａＣＨＯ3、３ｍＭのＮａ2ＣＯ3）、６片の極厚濾紙／膜サンドイッチ（起動電流５．５ｍＡ／ｃｍ2、移動時間１時間）。
【０１５６】
２．２ ａｓｉＨＰＡＬのＮ末端のシークエンシング
ａｓｉＨＰＡＬのＮ末端配列の決定は、４９１ｃＬＣタンパク質シーケンサ（Applied Biosystems, USA）を用いて行われた。２６サイクル行った。結果として、以下のアミノ酸配列を決定した：
ＮＨ2−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ．．−ＣＯＯＨ（配列番号３）。
【０１５７】
全て既知のタンパク質によるこのＮ末端配列のアラインメント（ＢＬＡＳＴ検索）によって、同様のＮ末端配列を有する単一タンパク質が明らかになった。これは、ブレビバクテリウム・リネンスＢＬ２由来のＨＨＤＥ−アルドラーゼ（２，４−ジヒドロキシヘプト−２−エン−１，７−ジオン酸アルドラーゼ）（ＨＨＤＥ＿ＢＬＩ）である（図３）。これは２型アルドラーゼであり、その天然基質である２，４−ジヒドロキシヘプト−２−エン−１，７−ジオン酸がＨＭＫＰと構造的に類似している（実際、両方ともＣ4位にヒドロキシル基、Ｃ2位にカルボニル基、Ｃ1位にカルボキシル基を有する）。さらに、ＨＨＤＥ＿ＢＬＩサブユニットのＭｗは２７ｋＤａであり、これは実験で得られたａｓｉＨＰＡＬのサブユニットのＭｗと一致している。ブレビバクテリウム・リネンスはアースロバクター・シンプレックスにも密接に関連している。
【０１５８】
したがって、アースロバクター・シンプレックスから精製したａｓｉＨＰＡＬはブレビバクテリウム・リネンスＢＬ２由来のＨＨＤＥアルドラーゼのホモログであると推定することができる。
【実施例３】
【０１５９】
アースロバクター・シンプレックス（ＮＢＲＣ１２０６９）由来のＨＭＫＰ−アルドラーゼをコードするａｓｉＨＰＡＬ遺伝子のクローニング
ａｓｉＨＰＡＬ遺伝子を含有するアースロバクター・シンプレックスの染色体からＤＮＡ断片を増幅するために、決定されたａｓｉＨＰＡＬのＮ末端のアミノ酸配列（図４）に基づき設計された縮重プライマーａｓｉＮ１０（配列番号４）を用いてＰＣＲを行った。プライマーａｓｉＮ１０は、その３’末端に縮重部を含有し、ａｓｉＨＰＡＬ遺伝子とは相補的ではない２１ヌクレオチドの配列を有する。これは、ＰＣＲ産物のさらなる増幅に必要である。アースロバクター・シンプレックスの染色体ＤＮＡ０．１μｇ及びプライマーａｓｉＮ１０（２０ｐｍｏｌ）によって４０μLの容量でＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は以下のようなものであった：９５℃で１０秒、５３℃で２０秒、７２℃で４０秒の５０サイクル。
【０１６０】
驚くべきことに、ＰＣＲの結果として、単一のＰＣＲ産物が得られた（図５のトラック３）。プライマーａｓｉＮ１０は、フォワードプライマー及びリバースプライマーとしての同時使用に好適であると考えられた。さらに、鋳型として１回目のＰＣＲからの反応混合物２μLを用い、非相補的な２１ヌクレオチドを含みａｓｉＮ１０の一部であるプライマーＳＶＳ８８（配列番号５）（１０ｐｍｏｌ）を用いた２回目のＰＣＲによって、このことが証明された。ＰＣＲ条件は以下のようなものであった：９５℃で１０秒、６５℃で
２０秒、７２℃で４０秒の２５サイクル。強い単一のＰＣＲ産物が観察された。
【０１６１】
ＰＣＲ産物の制限酵素分析によって、ＤＮＡ断片を２つの断片（０．６ｋｂの大きい断片及び０．３ｋｂの小さい断片）に分ける特有のＮｃｏＩ部位が明らかになった（図５のトラック２）。両方の断片は、ＳＶＳ８８プライマーを用いて別々にシークエンシングした。０．６ｋｂの断片で４７１ヌクレオチド及び０．３ｋｂの断片で２６２ヌクレオチドが求められた。
【０１６２】
次に、プライマーＳＶＳ＿１０８（配列番号６）及びＳＶＳ＿１０９（配列番号７）を用いて、全ＤＮＡ断片のシークエンシングを完了させた。増幅ＤＮＡ断片のシークエンシング戦略が図６に示される。塩基配列の分析によって、ａｓｉＨＰＡＬのＯＲＦによってコードされるＮ末端の２６アミノ酸残基が、実施例２で求められたａｓｉＨＰＡＬのＮ末端配列と同一であることが明らかにされた。
【０１６３】
ブレビバクテリウム・リネンスＢＬ２由来のＨＨＤＥアルドラーゼのアミノ酸配列によるＯＲＦのアラインメントによって、酵素間の高い相同性が明らかになった（図７）。
【実施例４】
【０１６４】
４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンの生成
４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシン生成におけるアースロバクター・シンプレックス由来のａｓｉＨＰＡＬ遺伝子によってコードされる組み換えａｓｉＨＰＡＬアルドラーゼの比活性を調べるために、プライマー１（配列番号８）、プライマー２（配列番号９）、及び鋳型としてアースロバクター・シンプレックスの染色体ＤＮＡを用いて、ａｓｉＨＰＡＬ遺伝子を増幅することができる。プライマー１は、５’末端にＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を含有し、プライマー２は、５’末端にＢａｍＨＩ制限部位を含有する。得られたＰＣＲ断片は、ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素及びＢａｍＨＩ制限酵素で消化し、同じ制限酵素で予め処理したプラスミドｐＭＷ１１９に連結することができる。このようにして、プラスミドｐＭＷ１１９−ａｓｉＨＰＡＬが得られた。それから、エシェリヒア・コリＢＷ２５１１３株は、プラスミドｐＭＷ１１９−ａｓｉＨＰＡＬで形質転換することができ、得られたＢＷ２５１１３／ｐＭＷ−ａｓｉＨＰＡＬ株はＩＰＴＧ（１ｍｍｏｌ）を含有するＬＢ培地で培養することができる。
【０１６５】
４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンの生成は、以下の組成物（１００ｍＭのＬ−グルタミン酸（ｐＨ８、ｐＨ８．０で調節）、１００ｍＭのα−ケト酪酸、１００ｍＭのアセトアルデヒド）と、１ｍＭのＺｎＣｌ2と、０．５μｇの精製Ｈｉｓ−タグ−ｂｓｕＢＣＡＴタンパク質（バチルス・ズブチリス由来の分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼ）と、一定分量のＢＷ２５１１３／ｐＭＷ−ａｓｉＨＰＡＬ細胞溶解物とを含むｂｓｕＹｗａＡ／ａｓｉＨＰＡＬの二酵素反応で調べることができる。全ての反応を３７℃で行うことができる。バチルス・ズブチリス由来の分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼ（ｂｓｕＢＣＡＴ）をクローニングすること、及び４ＨＩＬ形成を測定するＨＰＬＣはそれぞれ、実施例５及び実施例６に記載される。
【実施例５】
【０１６６】
バチルス・ズブチリス由来のＢＣＡＴのクローニング及び効率的な発現
バチルス・ズブチリス由来のＢＣＡＴは、ｈｉｓ6−タグ誘導体としてｐＥＴ発現系（Novagen, Madison, WI, USA）を用いてクローニングし発現させた。
【０１６７】
ｐＥＴ−ＨＴ−ＩｌｖＥ−ＢＳＵプラスミドを構築するために、ＢＣＡＴアミノトランスフェラーゼをコードするバチルス・ズブチリス由来のｙｗａＡ遺伝子（Berger, B. J.他, J Bacteriol., 185（8）, 2418-31（2003））は、鋳型としてバチルス・ズブチリス
１６８株の染色体ＤＮＡ、それぞれ「上流」プライマー及び「下流」プライマーとしてプライマーＰ３（配列番号１０）及びプライマーＰ４（配列番号１１）を用いたＰＣＲによって増幅した。プライマーＰ５は、５’末端にＮｃｏＩ制限部位及びヒスチジンをコードする６つのコドンを含有し、プライマーＰ６は５’末端にＮｏｔＩ制限部位を含有する。得られたＰＣＲ断片は、ＮｃｏＩ制限酵素で消化し、予め同じ制限酵素で処理したプラスミドｐＥＴ−１５（ｂ＋）に連結した。それから、線状にした連結ＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅用の鋳型として用い、オリゴヌクレオチドＴ７（Novagen、配列番号１２）及びオリゴヌクレオチドＰ４（配列番号１１）をプライマーとして用いた。得られたプラスミドｐＥＴ−１５（ｂ＋）のＴ７プロモーターの制御下にｙｗａＡ遺伝子を含有するＰＣＲ断片は、ＸｂａＩ制限酵素及びＮｏｔＩ制限酵素で消化し、予め同じ制限酵素で処理したｐＥＴ−２２（ｂ＋）ベクターに連結した。このようにして、プラスミドｐＥＴ−ＨＴ−ＩｌｖＥ−ＢＳＵが得られた。このプラスミドを用いてエシェリヒア・コリを形質転換し、Ｈｉｓ−タグ−ｂｓｕＢＣＡＴタンパク質を形質転換体から精製した。
【実施例６】
【０１６８】
４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンのＨＰＬＣ測定
ＨＰＬＣ分析：分光光度計１１００シリーズ（Agilent, USA）を備えた高速クロマトグラフィ（Agilent Technologies）を用いた。選択した検出波範囲は、２５０ｎｍの励起波長、３００〜５６０ｎｍの発光波長範囲であった。ａｃｃｑ−タグ法による分離は、Ｎｏｖａ−ＰａｋＣ１８（１５０×３．９ｍｍ、４μｍ）（Waters, USA）カラムにおいて、３７℃で行った。試料の注入量は５μLであった。アミノ酸誘導体の形成及びそれらの分離は、製造業者Watersの推奨（Liu, H.他, J. Chromatogr. A, 828, 383-395（1998）、Watersのａｃｃｑ−タグ化学パッケージの取扱説明書（accq-tag chemistry package. Instruction manual）Millipore Corporation, pp.1-9 （1993））に従って行った。６−アミノキノリル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバミン酸を含むアミノ酸誘導体を得るために、Ａｃｃｑ−Ｆｌｕｏｒ（商標）（Waters, USA）キットを用いた。ａｃｃｑ−タグ法による分析は、濃Ａｃｃｑ−タグ溶離液А（Waters, USA）を用いて行なった。溶液は全てＭｉｌｌｉ−Ｑ水を用いて調製し、標準液は＋４℃で貯蔵した。
【産業上の利用可能性】
【０１６９】
アセトアルデヒドとα−ケト酪酸とのアルドール縮合反応を触媒する新規のアルドラーゼが記載され、４−ヒドロキシ−３−メチル−２−ケト−ペンタン酸（ＨＭＫＰ）を合成するのに好ましく用いることができる。アルドラーゼは、４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシン合成における中間体としても有用である。
【図面の簡単な説明】
【０１７０】
【図１】アルドラーゼ生成プロセスのフローチャートである。
【図２】アースロバクター・シンプレックスＡＫＵ６２６（ＮＢＲＣ１２０６９）（以下、ａｓｉＨＰＡＬと略記する）からのＨＭＫＰ−アルドラーゼの精製を示す写真図である。レーン１、４：タンパク質分子量マーカー（Fermentas, Lithuania）、レーン２：粗細胞溶解物（４５μｇ添加）、レーン３：ａｓｉＨＰＡＬ調製物（０．５μｇ添加）。
【図３】ａｓｉＨＰＡＬオリゴマーの構造決定を示す図である。Ａ−較正ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを用いたａｓｉＨＰＡＬモノマーのＭｗの決定。ＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）タンパク質ラダー（Fermentas, Lithuania）をタンパク質マーカーとして用いた。実験データ（黒丸）はSigmaのＰｌｏｔ８ソフトウェアを用いて、線形回帰分析によって適合させた（黒線）。Ｂ−分子量タンパク質マーカー（Sigma）によって較正されたＳｕｐｅｒｄｅｘ（商標）２００ＨＲ １０／３０Ａ（Pharmacia）カラムとＳＥＣを用いたａｓｉＨＰＡＬの天然Ｍｗの決定。実験データ（黒丸）はSigmaのＰｌｏｔ８ソフトウェアを用いて、線形回帰分析によって適合させた（黒線）。
【図４】ＰＣＲ増幅に対するプライマー構造及びａｓｉＨＰＡＬ遺伝子のシークエンシングを示す図である。Ａ）アースロバクター・シンプレックス（ＮＢＲＣ１２０６９）由来のＨＭＫＰアルドラーゼのＮ末端配列。Ｂ）縮重プライマーａｓｉＮ１０、Ｉ＝デオキシイノシンリン酸。Ｃ）フランキングプライマーＳＶＳ８８。
【図５】ＨＭＫＰ−アルドラーゼをコードする遺伝子を含有するアースロバクター・シンプレックス染色体の０．９ｋｂのＤＮＡ断片の増幅を示す写真図である。増幅したＤＮＡ断片の電気泳動。トラック１：ＤＮＡのサイズマーカー、トラック３：定分量の反応混合物Ｂ、トラック２：得られたＮｃｏＩ制限酵素によって消化された０．９ｋｂのＤＮＡ断片。
【図６】増幅したＤＮＡ断片のシークエンシング戦略を示す図である。
【図７】ブレビバクテリウム・リネンスＢＬ２由来のａｓｉＨＰＡＬ及びＨＨＤＥアルドラーゼのアラインメントを示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物産業、詳しくは新規アルドラーゼ及び４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシン又はその塩の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンは、フェヌグリーク種子（コロハ（Trigonella foenum-graecum L. leguminosae））から抽出及び精製することができるアミノ酸である。４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンは、単離灌流ラット膵臓及びヒト膵島の両方で実証されているように、その促進効果が培地中の血漿グルコース濃度に明白に依存することから非常に興味深いインスリン分泌活性を示す（Sauvaire, Y.他, Diabetes, 47: 206-210 （1998））。このようなグルコース依存性は、２型糖尿病（すなわち、インスリン非依存性糖尿病（ＮＩＤＤ）、インスリン非依存性真性糖尿病（ＮＩＤＤＭ））の治療に現在用いられている唯一のインスリン分泌活性剤であるスルホニル尿素（Drucker, D. J., Diabetes
47: 159-169（1998））では確認されていない。その結果、低血糖症が、スルホニル尿素治療の依然として一般的に望ましくない副作用である（Jackson, J.及びBessler, R. Drugs, 22: 211-245; 295-320（1981）、Jennings, A.他, Diabetes Care, 12: 203-208（1989））。また、耐糖能の改善方法が知られている（Am. J. Physiol. Endocrinol., Vol. 287, E463-E471, 2004）。また、この糖代謝増強活性と医薬品及び健康食品への適用可能性とが報告されている（特開平６−１５７３０２号公報）。
【０００３】
植物でのみ発見されている４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンは、その特別なインスリン分泌作用のために、２型糖尿病の治療に対する新規の分泌促進剤であると考えられ得る。これは、２型糖尿病が様々な程度のインスリン耐性に関連するインスリン分泌不全を特徴とするためである（Broca, C.他, Am. J. Physiol. 277 （Endocrinol. Metab. 40）: E617-E623, （1999））。
【０００４】
フェヌグリーク抽出液中のジオキシゲナーゼ活性を利用することによる、鉄、アスコルビン酸、２−オキソグルタル酸、酸素依存性イソロイシンの水酸化法が４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンの製造方法として報告されている（Phytochemistry, Vol. 44, No. 4, pp. 563-566, 1997）。しかし、この方法は、２０ｍＭ以上のイソロイシン濃度で酵素活性が基質によって阻害されること、この酵素が同定されておらず、この酵素が植物の抽出液から誘導され、大量に得ることが容易ではないこと、またこの酵素が不安定であることから、４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンの製造方法としては不十分である。
【０００５】
全体的な収率が３９％である光学的に純粋な（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−４−ヒドロキシイソロイシンの効率的な８工程の合成が開示されている。この合成の重要な工程は、ゲオトリクム・カンジダム（Geotrichum candidum）を用いた２−メチルアセト酢酸エチルの（２Ｓ，３Ｓ）−２−メチル−３−ヒドロキシ酪酸エチルへの生物変換、及び不斉ストレッカー合成を伴う（Wang, Q.他, Eur. J. Org. Chem., 834-839（2002））。
【０００６】
最終工程がＥｕｐｅｒｇｉｔ Ｃ（Ｅ−ＰＡＣ）上に固定化された市販のペニシリンアシラーゼＧを用いた、Ｎ−フェニルアセチルラクトン誘導体の加水分解による酵素的分割法である、立体化学的に全体を制御した（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−４−ヒドロキシイソロイシンの短い６工程の化学酵素的合成も開示されている（Rolland-Fulcrand, V.他, J. Org. Chem., 873-877（2004））。
【０００７】
しかし、現在、４−ヒドロキシ−３−メチル−２−ケト−ペンタン酸の酵素的アミノ基
転移によって、又は任意の他の出発材料からの任意の他の酵素的変換によって４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンを生産したという報告はない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上記の課題を考慮して行われた広範な研究の結果、本発明者らは、好ましくは４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシン（その遊離形態及び塩形態、「４ＨＩＬ」と呼ぶこともある、以下同様）の所望の前駆体の合成に用いることができるアルドラーゼを発見した。この前駆体は、4−ヒドロキシ−３−メチル−２−ケト−ペンタン酸（その遊離形態及び塩形態、「ＨＭＫＰ」と呼ぶこともある、以下同様）であり、或る特定の微生物種に存在する。４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンが、アルドラーゼ酵素をアミノトランスフェラーゼ及び／又はデヒドロゲナーゼと組み合わせることによって生産されることも見出し、これにより本発明を完成させた。
【０００９】
本発明の目的は、新規のアルドラーゼ、及びアルドラーゼをコードするＤＮＡ、並びにアルドラーゼを用いて４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンを生産する方法を提供することを含む。上記の目的は、本発明の新規のアルドラーゼを発見することによって達成された。
【００１０】
したがって、本発明の目的は、
（ａ）配列番号１の塩基配列を含むＤＮＡ、
（ｂ）配列番号１の塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、アルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｄ）配列番号２のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加又は逆位を包含するアミノ酸配列を有し、アルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、および
（ｅ）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも７０％の相同性を有し、アルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
からなる群から選択されるＤＮＡを提供することである。
【００１１】
本発明のさらなる目的は、上記のＤＮＡとベクターＤＮＡとを含む組み換えＤＮＡを提供することである。
【００１２】
本発明のさらなる目的は、上記の組み換えＤＮＡで形質転換された単離細胞を提供することである。
【００１３】
本発明のまたさらなる目的は、培地中で細胞を培養すること、及び培地、細胞又はその両方においてアルドラーゼ活性を有するタンパク質を蓄積させることを含む、アルドラーゼ活性を有するタンパク質を製造する方法を提供することである。
【００１４】
本発明の別の目的は、
（ｆ）配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質、
（ｇ）配列番号２のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加又は逆位を包含するアミノ酸配列を有し、アルドラーゼ活性を有するタンパク質、および
（ｈ）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも７０％の相同性を有し、アルドラーゼ活性を有するタンパク質、
からなる群から選択されるタンパク質を提供することである。
【００１５】
本発明のさらなる目的は、以下の性質を有するタンパク質を提供することである
（Ａ）アセトアルデヒドとα−ケト酪酸からの４−ヒドロキシ−３−メチル−２−ケト−ペンタン酸の生成を触媒する活性を有する、
（Ｂ）該活性がＺｎ2+、Ｍｎ2+、及びＭｇ2+からなる群から選択される二価カチオンに依存する、
（Ｃ）ゲル濾過によって測定される分子量が約１８６ｋＤａ、
（Ｄ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって測定される１サブユニット当たりの分子量が２７ｋＤａ。
【００１６】
本発明の別の目的は、
（１）水性溶媒中で、
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質、
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸残基２の置換、欠失、挿入、付加又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、アルドラーゼ活性を有するタンパク質、および
（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも７０％の相同性を有し、アルドラーゼ活性を有するタンパク質、
からなる群から選択される少なくとも１つのアルドラーゼの存在下で、アセトアルデヒド及びα−ケト酪酸を反応させること、
（２）生成した４−ヒドロキシ−３−メチル−２−ケト−ペンタン酸を４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンに変換させること、並びに
（３）生成した４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンを単離すること
を含む、４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシン又はその塩を製造する方法を提供する。
【００１７】
本発明の目的は、４−ヒドロキシ−３−メチル−２−ケト−ペンタン酸が、アミノトランスフェラーゼ及び／又はデヒドロゲナーゼによって４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンに変換され、このアミノトランスフェラーゼ及び／又はデヒドロゲナーゼがアミノ基供与体の存在下でアミノ基転移活性を有する、上記の方法を提供することである。
【００１８】
本発明の目的は、
（１）水性溶媒中で、
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質、
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加又は逆位を包含するアミノ酸配列を有し、アルドラーゼ活性を有するタンパク質、および
（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも７０％の相同性を有し、アルドラーゼ活性を有するタンパク質、
からなる群から選択されるアルドラーゼを含有する細菌の存在下で、アセトアルデヒド及びα−ケト酪酸を反応させる工程であって、この水性溶媒がアミノ基供与体の存在下で、４−ヒドロキシ−３−メチル−２−ケト−ペンタン酸の４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンへの変換を触媒するアミノトランスフェラーゼ及び／又はデヒドロゲーゼも含有する、アセトアルデヒド及びα−ケト酪酸を反応させる工程、及び
（２）生成した４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンを単離する工程
を含む、４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシン又はその塩を製造する方法を提供することである。
【００１９】
本発明の目的は、アミノトランスフェラーゼが、分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼである、前記方法を提供することである。
【００２０】
本発明の目的は、分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼが、エシェリヒア及びバチ
ルスからなる群から選択される細菌に由来する、前記方法を提供することである。
【００２１】
本発明の目的は、アミノ基供与体がＬ−アミノ酸群から選択される、前記方法を提供することである。
【００２２】
本発明の目的は、分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼが、エシェリヒア及びバチルスからなる群から選択される細菌に由来する、前記方法を提供することである。
【００２３】
本発明の目的は、細菌がアルドラーゼ及び分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼの少なくとも１つの活性を高めるように修飾された、前記方法を提供することである。
【００２４】
本発明の目的は、アルドラーゼ及び分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼの活性が、アルドラーゼ及び／又は分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼの発現を増大させることによって高められた、前記方法を提供することである。
【００２５】
本発明の目的は、アルドラーゼ及び／又は分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼの発現が、アルドラーゼ及び／又は分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子の発現調節配列を改変すること、又はアルドラーゼ及び／又は分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子のコピー数を増加させることによって増大した、前記方法を提供することである。
【００２６】
本発明の目的は、細菌がエシェリヒア属、シュードモナス属、コリネバクテリウム属、アースロバクター属、アスペルギルス属又はバチルス属に属する、前記方法を提供することである。
【００２７】
本発明の目的は、細菌がエシェリヒア・コリ、アースロバクター・シンプレックス、コリネバクテリウム・グルタミカム、アースロバクター・グロビフォルミス、アースロバクター・スルフレウス、アースロバクター・ビスコーサス、又はバチルス・ズブチリスに属する、前記方法を提供することである。
【００２８】
本発明の目的は、細菌が細菌培養物、細胞、又は処理細胞である、前記方法を提供することである。
【００２９】
本発明の目的は、４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンが、（２Ｓ，３Ｓ，４Ｓ）−４−ヒドロキシイソロイシン、（２Ｓ，３Ｒ，４Ｒ）−４−ヒドロキシイソロイシン、（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−４−ヒドロキシイソロイシン、（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−４−ヒドロキシイソロイシン、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、前記方法を提供することである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
本明細書では、「４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシン」又は「４ＨＩＬ」という用語は、（２Ｓ，３Ｓ，４Ｓ）−４−ヒドロキシイソロイシン、（２Ｓ，３Ｒ，４Ｒ）−４−ヒドロキシイソロイシン、（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−４−ヒドロキシ−イソロイシン、及び／又は（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−４−ヒドロキシイソロイシンの単一の化合物若しくはジアステレオマー混合物、又はそれらの任意の組み合わせを表す。
【００３１】
本明細書で使用される「細菌」という用語は、酵素生成細菌、酵素活性が存在するか、又は高められているその細菌の突然変異体及び遺伝子組み換え体等を含む。
【００３２】
以下で、添付の図面を参照して、［Ｉ］アルドラーゼ、［ＩＩ］本発明のアルドラーゼ
を用いた４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンの製造方法について詳細に説明する。
【００３３】
［Ｉ］アルドラーゼ
本発明者らによる研究によれば、アースロバクター属において細菌株が４−ヒドロキシ−３−メチル−２−ケト−ペンタン酸を形成する能力を有するアルドラーゼを含有することが確認された。
【００３４】
本発明者らは、アースロバクター・シンプレックスが、４−ヒドロキシ−３−メチル−２−ケト−ペンタン酸をアセトアルデヒド及びα−ケト酪酸（遊離形態でも塩でもよい、以下同様）から生成する反応を触媒することができるアルドラーゼ活性を有していることを見出した。本発明者らは、培養した微生物細胞から新規のアルドラーゼを精製及び単離した。
【００３５】
さらに、本発明者らは、アースロバクター・シンプレックスＡＫＵ６２６株（ＮＢＲＣ１２０６９）（以下ａｓｉＨＰＡＬと略記する）から天然アルドラーゼを精製することによって、アルドラーゼのアミノ酸配列を決定した。さらに、本発明者らは、このアルドラーゼのアミノ酸配列から推測された約３０塩基対のＤＮＡ分子を合成し、このＤＮＡ分子を用いて、ＰＣＲによって、ａｓｉＨＰＡＬをコードする全長ＤＮＡを単離して得た。
【００３６】
ａｓｉＨＰＡＬをコードするＤＮＡは配列番号１で示される。さらに、配列番号１の塩基配列によってコードされたａｓｉＨＰＡＬのアミノ酸配列は配列番号２で示される。配列番号２は、配列番号１の塩基配列によってコードされたａｓｉＨＰＡＬのアミノ酸配列である。配列番号２のａｓｉＨＰＡＬはアルドラーゼ活性を有し、以下の式（ＩＩ）で示される４−ヒドロキシ−３−メチル−２−ケト−ペンタン酸（ＨＭＫＰ）が、１分子のアセトアルデヒドと１分子のα−ケト酪酸とから合成される反応を触媒する。
【００３７】
【化１】
【００３８】
次に、（１）アルドラーゼをコードするＤＮＡ、（２）アルドラーゼの特性、及び（３）アルドラーゼ生成プロセスをこの順に詳細に説明する。
【００３９】
（１）アルドラーゼをコードするＤＮＡ
配列番号１の塩基配列を有する本発明のアルドラーゼ遺伝子は、実施例の項で記載されるように、アースロバクター・シンプレックスＡＫＵ６２６株（ＮＢＲＣ１２０６９）の染色体ＤＮＡから単離された。配列番号２のアミノ酸配列は、ブレビバクテリウム・リネンスＢＬ２由来の既知のＨＨＤＥ−アルドラーゼ（２，４−ジヒドロキシヘプト−２−エン−１，７−ジオン酸アルドラーゼ）（国立バイオテクノロジー情報センター（National
Center for Biotechnology Information）（NIH, Bethesda, MD 20894, USA）に２００５年４月８日に提出された）と５５％の相同性を示す（図７）。
【００４０】
相同性は、「ベクターＮＴＩ」遺伝解析ソフトウェア（ｉｎｆｏｒｍａｘ（登録商標）, Invitrogen Life Science Software）を用いることによって算出された。
【００４１】
以下で、アルドラーゼをコードするＤＮＡをアルドラーゼ生成細菌から得る方法を説明する。
【００４２】
最初に、精製アルドラーゼの部分アミノ酸配列を決定した。４９１ｃＬＣタンパク質シークエンサー（Applied Biosystems, USA）を用いるEdmanの自動分解法（Edman, P., Acta Chem. Scand. 4, 227（1950））によって、アースロバクター・シンプレックスＡＫＵ６２６株（ＮＢＲＣ１２０６９）に由来するアルドラーゼの部分アミノ酸配列（配列番号３）を決定した。
【００４３】
このアミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列は、アミノ酸配列に基づき推測することができる。一般（Universal）コドンを利用して、このＤＮＡの塩基配列を推測する。
【００４４】
それから、推測塩基配列に基づき、約３０塩基対のＤＮＡ分子を合成した。ＤＮＡ分子を合成するのに用いた方法は、Tetrahedron Letters, 22, 1859（1981）で開示されている。Applied Biosystems製の合成装置を用いてＤＮＡ分子を合成することができる。ＤＮＡ分子をプローブとして用いて、アルドラーゼを生成する微生物の染色体ＤＮＡライブラリからアルドラーゼをコードする全長ＤＮＡを単離することができる。代替的に、ＤＮＡをプライマーとして用い、ＰＣＲによって、アルドラーゼをコードするＤＮＡを増幅することもできる。しかし、ＰＣＲによって増幅したＤＮＡはアルドラーゼの全長ＤＮＡを含有しないこともあるので、プローブとしてＰＣＲによって増幅したＤＮＡを用いてアルドラーゼを生成する微生物の染色体ＤＮＡライブラリから全長ＤＮＡが単離される。
【００４５】
ＰＣＲ手順は、White, T. J.他, Trends Genet. 5, 185（1989）等の刊行物に記載されている。染色体ＤＮＡの単離方法、及びプローブとしてＤＮＡ分子を用いて、所望のＤＮＡ分子を遺伝子ライブラリから単離する方法が、「Molecular Cloning第３版」（Cold Spring Harbor Laboratory Press（2001））等の刊行物に記載されている。
【００４６】
アルドラーゼをコードする単離ＤＮＡの塩基配列を決定する方法は、「A Practical Guide to Molecular Cloning」（John Wiley & Sons, Inc.（1985））に記載されている。さらに、塩基配列は、Applied Biosystems製のＤＮＡシークエンサーを用いることによって決定することができる。アースロバクター・シンプレックスＡＫＵ６２６株（ＮＢＲＣ１２０６９）由来のアルドラーゼをコードするＤＮＡは配列番号１で示される。
【００４７】
ＨＭＫＰをアセトアルデヒド及びα−ケト酪酸から形成する反応を触媒するアルドラーゼをコードするＤＮＡは、配列番号１で示されるＤＮＡだけではない。これは、アースロバクター種間のそれぞれの種及び株由来の塩基配列に差異が存在し得るためである。
【００４８】
したがって、本発明のＤＮＡは、単離されたアルドラーゼをコードするＤＮＡだけでなく、ＤＮＡが上記の反応を触媒することができるアルドラーゼをコードするかぎり、人工的に変異が導入されたアルドラーゼをコードするＤＮＡも含む。突然変異を人工的に誘導する方法は、Method. in Enzymol., 154（1987）で記載されるような部位特異的な突然変異を導入する等の一般的に用いられる方法を含む。
【００４９】
配列番号１の塩基配列と相補的であるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つアルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも本発明のＤＮＡに含まれる。本明細書で用いられるように、「ストリンジェントな条件」は、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリットは形成されない条件を表す。はっきりとした数値でこれらの条件を表すことは難しいが、例としては、例えば、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上及び特に好ましくは９５％以上の相同性の高いＤＮＡ分子が互いにハイブリダイズし、相同性の低いＤＮＡ分子は
互いにハイブリダイズしない条件、又はサザンハイブリダイゼーションにおける通常の洗浄条件、すなわち３７℃で０．１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳ、好ましくは６０℃で０．１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳ、さらに好ましくは６５℃で０．１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイゼーションが起こる条件が挙げられる。ハイブリダイゼーション条件によって、プローブの長さを好適に選択することができ、通常１００ｂｐ〜１ｋｂｐである。さらに、「アルドラーゼ活性」は、アセトアルデヒド及びα−ケト酪酸からのＨＭＫＰの合成活性を意味する。しかし、配列番号１の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列は、３７℃及びｐH８の条件下で、アルドラーゼ活性を１０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは５０％以上、及びさらに好ましくは７０％以上維持するアルドラーゼタンパク質をコードする。
【００５０】
さらに、配列番号１のＤＮＡによってコードされるアルドラーゼと実質的に同一であるタンパク質をコードするＤＮＡも、本発明のＤＮＡに含まれる。すなわち、以下のＤＮＡも本発明のＤＮＡに含まれる：
（ａ）配列番号１の塩基配列を有するＤＮＡ、
（ｂ）配列番号１の塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つアルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｄ）配列番号２のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、アルドラーゼ活性を保持するタンパク質をコードするＤＮＡ、並びに
（ｅ）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも７０％の相同性、好ましくは少なくとも８０％の相同性、より好ましくは少なくとも９０％の相同性、及びさらに好ましくは少なくとも９５％の相同性を有し、アルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【００５１】
本明細書で、「１又は数個」は、タンパク質の三次元構造又はアルドラーゼ活性が大きくは損なわれない範囲、より具体的には１〜７８、好ましくは１〜５２、より好ましくは１〜２６、及びさらにより好ましくは１〜１３、特に好ましくは１〜５の範囲を表す。
【００５２】
１又は数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加又は逆位は、活性を維持できるような保存的変異である。代表的な保存的変異は保存的置換である。保存的置換の例としては、ＡｌａのＳｅｒ又はＴｈｒへの置換、ＡｒｇのＧｌｎ、Ｈｉｓ又はＬｙｓへの置換、ＡｓｎのＧｌｕ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ又はＡｓｐへの置換、ＡｓｐのＡｓｎ、Ｇｌｕ又はＧｌｎへの置換、ＣｙｓのＳｅｒ又はＡｌａへの置換、ＧｌｎのＡｓｎ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ又はＡｒｇへの置換、ＧｌｕのＡｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ又はＡｓｐへの置換、ＧｌｙのＰｒｏへの置換、ＨｉｓのＡｓｎ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ又はＴｙｒへの置換、ＩｌｅのＬｅｕ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ又はＰｈｅへの置換、ＬｅｕのＩｌｅ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ又はＰｈｅへの置換、ＬｙｓのＡｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ又はＡｒｇへの置換、ＭｅｔのＩｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ又はＰｈｅへの置換、ＰｈｅのＴｒｐ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ又はＬｅｕへの置換、ＳｅｒのＴｈｒ又はＡｌａへの置換、ＴｈｒのＳｅｒ又はＡｌａへの置換、ＴｒｐのＰｈｅ又はＴｙｒへの置換、ＴｙｒのＨｉｓ、Ｐｈｅ又はＴｒｐへの置換、及びＶａｌのＭｅｔ、Ｉｌｅ又はＬｅｕへの置換が挙げられる。
【００５３】
さらに、「アルドラーゼ活性」は、上記のようなアセトアルデヒド及びα−ケト酪酸からのＨＭＫＰの合成を表す。しかし、アミノ酸配列が、配列番号２のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加又は逆位を包含する場合、このタンパク質は、３７℃及びｐH８の条件下でアルドラーゼ活性を、配列番号２のアミノ酸配
列を有するタンパク質の１０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは５０％以上、及びさらに好ましくは７０％以上維持することが望ましい。
【００５４】
（２）アルドラーゼの特性
次に、アースロバクター・シンプレックスＡＫＵ６２６株（ＮＢＲＣ１２０６９）（ａｓｉＨＰＡＬ）由来の精製アルドラーゼの特性について説明する。
【００５５】
本発明のａｓｉＨＰＡＬは、これまでに記載された遺伝子単離及び解析によって明らかなように、配列番号２のアミノ酸配列を有する。しかし、本発明は、配列番号２のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加又は逆位を包含するアミノ酸配列を有し、且つアルドラーゼ活性も有するタンパク質も含む。
【００５６】
すなわち、本発明のアルドラーゼは以下のタンパク質を含む：
（ｆ）配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質、
（ｇ）配列番号２のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加又は逆位を包含するアミノ酸配列を有し、アルドラーゼ活性を有するタンパク質、並びに
（ｈ）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも７０％の相同性、好ましくは少なくとも８０％の相同性、より好ましくは少なくとも９０％の相同性、さらに好ましくは少なくとも９５％の相同性を有し、アルドラーゼ活性を有するタンパク質。
【００５７】
本明細書で、「数個」及び「アルドラーゼ活性」の定義は（１）アルドラーゼをコードするＤＮＡの項で定義されたものと同じである。
【００５８】
本発明のアルドラーゼは、アセトアルデヒド及びα−ケト酪酸からのアルドール縮合反応による４−ヒドロキシ−３−メチル−２−ケト−ペンタン酸（ＨＭＫＰ）の合成を触媒する。
【００５９】
アルドラーゼ活性は、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）を用いることによる、アセトアルデヒド及びα−ケト酪酸からのＨＭＫＰ形成、又は続くＨＭＫＰからの４ＨＩＬへの変換後の４ＨＩＬ形成の検出によって測定することができる。
【００６０】
本発明のアルドラーゼは、アセトアルデヒド及びα−ケト酪酸からのアルドール縮合反応によってＨＭＫＰの合成を触媒することができる。基質として、２分子のα−ケト酸（又は置換α−ケト酸）を用いたアルドール縮合反応を触媒することができる２つの微生物酵素がこれまでに報告されている。この２つの微生物酵素は、エシェリヒア・コリ由来のＭｈｐＥアルドラーゼ（Appl. Environ. Microbiol., Vol. 64, No. 10, 4093-4094, 1998）及びSugiyama他（国際公開ＷＯ２００４／０１８６７２号）によって報告されたアルドラーゼである。しかし、生成したＨＭＫＰの量は、１μＭ未満であることが報告され、この量は４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンを生成するさらなるアミノ基転移プロセスで用いるのには十分な量ではない。したがって、産業上の利用可能性と共にＨＭＫＰの生成を記載している知見又は報告はなく、この酵素を用いてＨＭＫＰを合成することが可能であるか否かに関して完全には知られていない。すなわち、アセトアルデヒド及びα−ケト酪酸のアルドール縮合によるＨＭＫＰ合成を触媒することができるという点で、本発明のアルドラーゼはこれまでに報告されているアルドラーゼとは異なる。
【００６１】
次に、以下で精製ａｓｉＨＰＡＬの酵素特性を記載する。
【００６２】
ａｓｉＨＰＡＬは、アセトアルデヒド及びα−ケト酪酸からの以下の一般式（ＩＩ）：
【００６３】
【化２】
【００６４】
で表されるＨＭＫＰの形成を触媒する。このようにして、本発明のａｓｉＨＰＡＬを用いて、アセトアルデヒド及びα−ケト酪酸からＨＭＫＰを生産するプロセスも本明細書に記載される。
【００６５】
さらに、ａｓｉＨＰＡＬの活性は、Ｚｎ2+、Ｍｇ2+及びＭｎ2+イオンに強く依存し、ＥＤＴＡの存在下で完全に阻害される。つまり、ａｓｉＨＰＡＬは、２型アルドラーゼに属すると考えられる（表３を参照されたい）。
【００６６】
ａｓｉＨＰＡＬの分子量は、ゲル濾過で測定すると約１８６ｋＤａ、及びＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定すると約２７ｋＤａであるので、ａｓｉＨＰＡＬは六量体構造を有すると考えられる。
【００６７】
したがって、本発明は以下の特徴によって定義されるようなタンパク質も含む：
（Ａ）アセトアルデヒド及びα−ケト酪酸からの４−ヒドロキシ−３−メチル−２−ケト−ペンタン酸の生成を触媒する活性を有し、
（Ｂ）この活性がＺｎ2+、Ｍｎ2+及びＭｇ2+を含む１つ又は複数の二価カチオンに依存しており、
（Ｃ）ゲル濾過で測定した分子量が約１８６ｋＤａであり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定した１つのサブユニット当たりの分子量が約２７ｋＤａである。
【００６８】
（３）アルドラーゼ生成プロセス
次に、本発明のアルドラーゼ生成プロセスを記載する。本発明のアルドラーゼを生成するのに２つの方法が存在する：（ｉ）アルドラーゼ生成微生物を培養してアルドラーゼを生成すること、及び（ｉｉ）組み換えＤＮＡ技術によって形質転換体を調製し、この形質転換体を培養してアルドラーゼを生成すること。
【００６９】
（ｉ）微生物培養によるアルドラーゼ生成プロセス
天然のアルドラーゼ源である微生物には、アースロバクター属に属する微生物が含まれる。
【００７０】
アセトアルデヒド及びα−ケト酪酸からの前駆体ケト酸（ＨＭＫＰ）の合成を触媒するアルドラーゼを生成する微生物であればアースロバクター属に属する任意の微生物を本発明で用いることができる。好ましくは、これらの微生物としては、アースロバクター・シンプレックス（ＡＫＵ６２６、ＮＢＲＣ１２０６９）、アースロバクター・グロビフォルミス（ＡＫＵ６２５株、ＮＢＲＣ１２１４０株）、アースロバクター・スルフレウス（ＡＫＵ６３５株、ＮＢＲＣ１２６７８株）及びアースロバクター・ビスコーサス（ＡＫＵ６３６株、ＮＢＲＣ１３４９７株）が挙げられる。これらの中でも、アースロバクター・シンプレックス（ＡＫＵ６２６、ＮＢＲＣ１２０６９）が特に好ましい。これらの微生物の寄託についての詳細は以下に示される。
【００７１】
上記の細菌の中で、名称がＡＫＵから始まる株は、京都大学大学院農学研究科応用生命
科学科の発酵生理学及び醸造学研究室（the Laboratory of Fermentation Physiology and Applied Microbiology, Division of Applied Life Sciences, Faculty of Agriculture, Graduate School, Kyoto University）から得ることができる。
【００７２】
名称がＮＢＲＣ（前ＩＦＯ）から始まる株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構（the National Institute of Technology and Evaluation）（〒２９２−０８１８千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）から得ることができる。個々の株のアクセッション番号は、ＮＢＲＣカタログ：
（http://www.nbrc.nite.go.jp/NBRC2/NBRCDispSearchServlet?lang=en）
に記録されている。
【００７３】
微生物は液体培養及び／又は固体培養のいずれかで培養することができるが、産業的に有益な方法は、深部通気（deep-aerated）撹拌培養である。微生物培養に一般的に用いられる炭素源、窒素源、無機塩、及び他の微量栄養素を培地に用いることができる。選択された微生物株に利用可能であれば、どのような栄養源を用いてもよい。
【００７４】
培養は、振盪培養、深部通気（deep ventilation）撹拌培養等による好気条件下で行われる。温度は、微生物が生育し、且つアルドラーゼが生成される範囲内であればよい。したがって、条件は厳密ではないが、通常温度は１０〜５０℃であり、好ましくは１５〜４２℃である。培養時間は、他の培養条件に従って変わる。例えば、微生物はアルドラーゼが最大量生成されるまで培養することができ、これは通常約５時間〜７日間、好ましくは約１０時間〜９６時間である。
【００７５】
培養後、微生物細胞を遠心分離（例えば、１０分間１００００×ｇ）によって回収する。大部分のアルドラーゼが細胞に存在するので、アルドラーゼは微生物細胞を破砕又は溶解させることによって可溶化する。超音波破砕、フレンチプレス破砕、又はガラスビーズ破砕を用いて、微生物細胞を破砕することができる。細胞を溶解する場合、卵白リゾチーム、ペプチダーゼ処理、又はこれらの好適な組み合わせを用いてもよい。
【００７６】
アルドラーゼがアルドラーゼ生成微生物から精製される場合、細胞破砕液が用いられるが、非破砕又は非溶解の残渣又は残屑が残っている場合、可溶化溶液を再び遠心分離し、沈殿する全ての残渣又は残屑を取り除くことが精製には好ましい。
【００７７】
典型的な酵素を精製するのに一般的に用いられるあらゆる方法をアルドラーゼを精製するために使用することができ、この例としては、硫酸アンモニウム沈澱、ゲル濾過クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ及びヒドロキシアパタイトクロマトグラフィが挙げられる。その結果、比活性が高いアルドラーゼ含有画分を得ることができる。
【００７８】
（ｉｉ）組み換えＤＮＡ技術を用いた生成プロセス
次に、組み換えＤＮＡ技術を用いて、アルドラーゼを生成するプロセスを記載する。組み換えＤＮＡ技術を用いて、酵素及び生理学的に活性な物質等の有用なタンパク質を生成する方法が数多く知られている。この技術によって、自然状態では微量しか存在しない有用なタンパク質の大量生成が可能になる。
【００７９】
図１は本発明のアルドラーゼ生成プロセスのフローチャートである。
【００８０】
最初に、本発明のアルドラーゼをコードするＤＮＡを用意する（工程Ｓ１）。
【００８１】
次に、このＤＮＡをベクターＤＮＡと連結させ、組み換えＤＮＡを作製し（工程Ｓ２）
、細胞をこの組み換えＤＮＡで形質転換し、形質転換体を作製する（工程Ｓ３）。それから、形質転換体を培地中で培養し、アルドラーゼを生成させて、培地、細胞、又はその両方で蓄積させる（工程Ｓ４）。
【００８２】
続いて、アルドラーゼを回収及び精製する工程Ｓ５までプロセスを進める。
【００８３】
アルドール縮合反応（工程Ｓ６）において、工程Ｓ５で得られた精製アルドラーゼ、又はアルドラーゼを含有する培地及び／又は細胞（工程Ｓ４）を用いることによって、大量のＨＭＫＰを生成することができる。
【００８４】
アルドラーゼ遺伝子と連結したベクターＤＮＡによって、本発明のアルドラーゼが発現する。
【００８５】
ベクターＤＮＡに連結させるアルドラーゼ遺伝子には、［Ｉ］において記載されたＤＮＡが含まれる。
【００８６】
タンパク質の大量生成に組み換えＤＮＡ技術を用いる場合、細菌細胞、放線菌細胞、酵母細胞、糸状菌細胞、植物細胞、及び動物細胞等の細胞を宿主細胞として用いることができる。宿主ベクター系が確立している細菌細胞の例としては、エシェリヒア種、シュードモナス種、アースロバクター種、コルネバクテリウム種、アスペルギルス種、及びバチルス種が挙げられる。エシェリヒア・コリ又はコリネバクテリウム・グルタミカムを本発明に用いることが好ましい。これは、エシェリヒア・コリ又はコリネバクテリウム・グルタミカムを用いたタンパク質の大量生成に関してよく知られているためである。以下で、形質転換されたエシェリヒア・コリを用いてアルドラーゼを生成するプロセスを記載する。
【００８７】
エシェリヒア・コリにおける異種タンパク質生成に典型的に用いられるプロモーターを用いて、アルドラーゼをコードするＤＮＡを発現することができる。強力なプロモーターとしては、Ｔ７プロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、及びＰＬプロモーターが挙げられる。
【００８８】
融合タンパク質としてアルドラーゼを生成するために、アルドラーゼ遺伝子の上流又は下流のいずれかで別のタンパク質、好ましくは親水性ペプチドをコードする遺伝子を連結する。他のタンパク質をコードする遺伝子は、生成する融合タンパク質の量を増大させる、及び／又は変性工程及び再生工程後の融合タンパク質の可溶性を高めるように機能し得る。Ｔ７遺伝子１０、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、インターフェロン−γ遺伝子、インターロイキン−２遺伝子、ポリヒスチジン遺伝子、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ遺伝子、及びプロキモシン遺伝子は、アルドラーゼ遺伝子に融合することができる遺伝子の例である。
【００８９】
アルドラーゼ遺伝子と連結する場合、コドンのリーディングフレームを適合させる必要がある。この遺伝子は、好適な制限酵素部位で、又は適切な配列の合成ＤＮＡを用いて連結することができる。
【００９０】
生成する量を増大させるために、融合タンパク質遺伝子の下流にあるターミネーター等の転写終結配列を連結させることが好ましい。Ｔ７ターミネーター、ｆｄファージターミネーター、Ｔ４ターミネーター、テトラサイクリン耐性遺伝子ターミネーター、及びエシェリヒア・コリのｔｒｐＡ遺伝子ターミネーターを用いることができる。
【００９１】
多コピーベクターは、エシェリヒア・コリにアルドラーゼ又はアルドラーゼの融合タンパク質をコードする遺伝子を導入するのに好ましい。ｐＵＣプラスミド、ｐＢＲ３２２プ
ラスミド又はこれらの誘導体等のＣｏｌ Ｅ１由来の複製開始点を有するベクターを用いることができる。本明細書で「誘導体」は、置換、欠失、挿入、付加又は逆位等の塩基変化を有するプラスミドを表す。これらの変化には、突然変異原又はＵＶを用いた変異誘発処理、自然変異、又はランダム変異によって引き起こされるものが含まれ得る。
【００９２】
このベクターは、形質転換体が容易に選択できるようなアンピシリン耐性遺伝子等のマーカーを有することが好ましい。このようなプラスミドの例としては、強力なプロモーターを有する市販の発現ベクター（ｐＵＣ（タカラバイオ株式会社）、ｐＰＲＯＫ（Clontech）、及びｐＫＫ２３３−２（Clontech）等）が挙げられる。
【００９３】
ベクターＤＮＡを用いて、選択したプロモーター、アルドラーゼ又はアルドラーゼと別のタンパク質との融合タンパク質をコードする遺伝子、並びにターミネーターをこの順番で連結することによって組み換えＤＮＡが得られる。
【００９４】
エシェリヒア・コリを組み換えＤＮＡで形質転換した後に培養する場合、アルドラーゼ又はアルドラーゼと別のタンパク質との融合タンパク質が発現及び生成する。異種遺伝子の発現に典型的に用いられる株を形質転換宿主として用いることができ、エシェリヒア・コリＪＭ１０９（ＤＥ３）株及びエシェリヒア・コリＪＭ１０９株が特に好ましい。形質転換方法及び形質転換体の選択方法が、例えば「Molecular Cloning 第３版」（Cold Spring Harbor Laboratory Press（2001））に記載されている。
【００９５】
融合タンパク質を発現する場合、アルドラーゼは血液凝固因子Ｘａ又はカリクレイン等の制限プロテアーゼを用いて切断することができる。これらのプロテアーゼは、アルドラーゼに存在しない配列を認識する。
【００９６】
エシェリヒア・コリを培養するのに典型的に用いられる培地を生成培地として用いることができる。例としては、Ｍ９−カザミノ酸培地及びＬＢ培地が挙げられる。さらに、培養条件及び生成を誘導する条件は、用いるマーカー及びプロモーターの種類、並びに宿主微生物の種類に応じて適切に選択することができる。
【００９７】
以下の方法を用いて、アルドラーゼ又は融合タンパク質を回収することができる。アルドラーゼ又は融合タンパク質が微生物細胞内で可溶化される場合、回収細胞を破砕又は溶解した後に粗酵素溶液を用いることができる。さらに、アルドラーゼ又は融合タンパク質は必要に応じて、沈澱、濾過、カラムクロマトグラフィ、又は他の一般技法によっても精製することができる。アルドラーゼ又はその融合タンパク質の抗体を精製に用いることもできる。
【００９８】
タンパク質封入体が形成される場合、変性剤で可溶化することができる。タンパク質封入体は微生物細胞タンパク質で可溶化することができるが、続く精製手順を考慮すると、封入体を取り出した後に可溶化することが好ましい。技術分野で既知の方法を用いて、封入体を微生物細胞から回収することができる。例えば、封入体は、微生物細胞を破砕した後、遠心分離によって回収することができる。タンパク質封入体を可溶化する変性剤の例としては、塩酸グアニジン（例えば、６Ｍ、ｐＨ５〜８）及び尿素（例えば、８Ｍ）が挙げられる。
【００９９】
タンパク質封入体は、透析等の処理でこれらの変性剤を取り除くことによって活性タンパク質として再生することができる。トリス−ＨＣｌ緩衝液又はリン酸緩衝液等の透析溶液を透析に用いてもよく、濃度は２０ｍＭ〜０．５Ｍであり、ｐＨは５〜８であり得る。
【０１００】
巻き戻し工程中のタンパク質濃度は、約５００μｇ／ｍＬ以下に維持することが好まし
い。巻き戻ししたアルドラーゼが互いに架橋するのを防ぐために、透析温度は５℃以下であることが好ましい。さらに、活性は、透析の他に希釈及び限外濾過によって変性剤を取り除くことによって回復し得る。
【０１０１】
アルドラーゼ遺伝子が、アースロバクター属細菌に由来する場合、宿主としてアースロバクター種の細菌を用いて、アルドラーゼを発現及び生成することができる。本明細書で用いられるこのような宿主細胞及び組み換え発現系の例としては、アースロバクター種における組み換え発現方法（Shaw P. C.他, J Gen Micobiol. 134（1988） p.903-911）、アースロバクター・ニコチノボランスにおける組み換え発現方法（Sandu C.他, Appl Environ Microbiol. 71（2005） p8920-8924）、及びアースロバクター種における組み換え発現方法（Morikawa, M.他, Appl Microbiol Biotechnol., 42（1994）, p.300-303）が挙げられる。また、コリネ型細菌で発現された発現系もアースロバクター種で適用可能である（Sandu C.他）。しかし、本発明は本明細書に記載されたようなアルドラーゼに対するアースロバクター種の細菌の発現系に限定されない。
【０１０２】
［ＩＩ］４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンの製造方法
本発明の４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシン（４ＨＩＬ）の製造方法は、２つの工程からなる反応である：（１）アセトアルデヒドとα−ケト酪酸から４−ヒドロキシ−３−メチル−２−ケト−ペンタン酸（ＨＭＫＰ）を生成する酵素的アルドール縮合反応（以下の反応式（ＩＩＩ））、および（２）ＨＭＫＰから４ＨＩＬへの変換、すなわちＨＭＫＰから４ＨＩＬを生成する酵素的アミノ基転移（以下の反応式（ＩＶ））。
これらの工程はこの順番で連続して行うか、又は１つの容器でほとんど同時に行うことができる。それぞれの工程は以下に記載される。
【０１０３】
【化３】
【０１０４】
（１）４−ヒドロキシ−３−メチル−２−ケト−ペンタン酸（ＨＭＫＰ）の生成
ＨＭＫＰ（ＩＩ）：
【０１０５】
【化４】
【０１０６】
は、アセトアルデヒドとα−ケト酪酸とを反応させることによって生成され、この反応は反応を触媒するアルドラーゼの存在下で行われる。
【０１０７】
この反応を触媒するのに用いられるアルドラーゼには特に制限なく、アセトアルデヒド及びα−ケト酪酸のアルドール縮合によって一般式（ＩＩ）で表されるＨＭＫＰの合成を触媒することができれば、どのようなタンパク質を用いてもよい。
【０１０８】
このようなアルドラーゼの好ましい例は、［１］の項に記載されたアルドラーゼである。本発明の方法において、アルドラーゼは、ＨＭＫＰの生成を触媒することができれば、細菌（培養物、細菌細胞、又は細胞処理物を含む）、精製酵素、又は粗酵素等のいずれの形態で用いてもよい。細菌をアルドラーゼ源として用いる場合、アースロバクター属に属する微生物等の、アルドラーゼを自然状態で生成する細菌、及び［１］の項で記載されたような組み換えＤＮＡで形質転換された組み換え微生物の両方が包含される。
【０１０９】
例えば、アルドラーゼ生成細菌、又は組み換えＤＮＡで形質転換された細菌細胞を用いてＨＭＫＰを製造する場合、基質を培養中に培養培地に直接添加するか、又はこの基質は細菌細胞若しくは培養物から単離された洗浄細菌細胞であり得る。さらに、破砕又は溶解された細菌細胞を直接用いることもでき、又はアルドラーゼを処理細菌細胞から回収し、粗酵素溶液として用いることもでき、又は精製酵素を用いることもできる。すなわち、アルドラーゼ活性が存在する限り、アルドラーゼ活性含有画分を本発明の４ＨＩＬを製造するプロセスに用いることができる。
【０１１０】
アルドール縮合反応は、アセトアルデヒド、α−ケト酪酸、及びアルドラーゼ又はアルドラーゼ含有組成物を含有する反応溶液中で行い、２０〜５０℃の適温に調節し、静置させ、ｐＨを５〜１２に維持しながら３０分〜５日間振盪又は撹拌する。
【０１１１】
反応速度は、Ｍｇ2+、Ｍｎ2+、Ｆｅ2+、Ｚｎ2+又はＣｏ2+等の二価カチオンを反応混合物に添加することによっても増大させ得る。コスト等の点で、Ｚｎ2+を用いることが好ましい。
【０１１２】
これらの二価カチオンを反応溶液に添加する場合、反応を妨げなければ、どのような塩を用いてもよいが、ＺｎＣｌ2、ＺｎＳＯ4、ＭｇＳＯ4等を用いることが好ましい。これらの二価カチオンの濃度は、単純な予備研究によって好適に決定することができる。これらの二価カチオンは、０．０１ｍＭ〜１０ｍＭ、好ましくは０．１ｍＭ〜５ｍＭの範囲で添加し得る。
【０１１３】
ＨＭＫＰは、既知の技法に従って単離又は精製をすることができるが、特にアルドラーゼ及びアミノトランスフェラーゼの両方を発現する組み換え微生物によって製造する場合、単離又は精製をしなくともよい。単離及び精製の方法には、塩基性アミノ酸を吸収するイオン交換樹脂にＨＭＫＰを接触させた後に、溶離及び結晶化することが含まれる。別の精製方法は、溶離生成物が変色し、活性炭による濾過が必要な場合に、結晶化を行うことでＨＭＫＰを得ることを含む。
【０１１４】
本発明のＨＭＫＰの製造プロセスによって、アセトアルデヒド及びα−ケト酪酸から４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシン（４ＨＩＬ）の前駆体であるケト酸（ＨＭＫＰ）を製造することが可能になる。ＨＭＫＰを用いて、２位のアミノ化によって４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンを誘導することができるので、このＨＭＫＰは４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシン合成における中間体として有用である。ＨＭＫＰから４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンを生産するプロセスを次に記載する。
【０１１５】
（２）４−ヒドロキシ−３−メチル−２−ケト−ペンタン酸の４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンへの変換
ＨＭＫＰを上記の（１）に記載したように製造したのち、ＨＭＫＰを４ＨＩＬに変換する。
【０１１６】
ＨＭＫＰを４ＨＩＬに変換する方法は特に限定されず、化学的方法又は酵素的方法のいずれかを用いることができる。酵素的変換に関しては、酵素的アミノ基転移が好ましい。この工程では、「アミノ基転移」は、アミノ基が、供与体化合物、例えばＬ−グルタミン酸又はＬ−グルタミン酸塩からケト基を有する受容体化合物、例えば４−ヒドロキシ−３−メチル−２−ケト−ペンタン酸等に転移される反応を意味する。アミノ基供与体は、アミノ基を有してさえいれば特に限定されないが、Ｌ−グルタミン酸及び分岐鎖アミノ酸等のＬ−アミノ酸を用いることが好ましい。
【０１１７】
本発明において、「酵素的アミノ基転移」はアミノトランスフェラーゼ（トランスアミナーゼ）又はデヒドロゲナーゼによって行われるアミノ基転移反応を意味する。特に、細菌のアミノトランスフェラーゼ（トランスアミナーゼ）が好ましい。これらの酵素は、上記のアミノトランスフェラーゼ及び／又はデヒドロゲナーゼを組み込んでさえいれば、細菌（培養物、細菌細胞、又は細胞処理物を含む）、精製酵素、又は粗酵素等のいずれの形態で用いてもよい。プロセスを単純化することによって４ＨＩＬの生産コストを削減するために、培養溶液に直接、基質を添加することが最も好ましい。
【０１１８】
この工程で用いられるアミノトランスフェラーゼ及び／又はデヒドロゲナーゼは、ＨＭＫＰを４ＨＩＬに変換することができさえすれば、特に限定されない。分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼ（ＢＣＡＴ）が好ましい。例えば、ｉｌｖＥ遺伝子によってコードされるアミノトランスフェラーゼ、ｔｙｒＢ遺伝子によってコードされる芳香族アミノトランスフェラーゼ、ａｓｐＣ遺伝子によってコードされるアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、エシェリヒア・コリにおけるａｖｔＡ遺伝子によってコードされるバリン−ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ、バチルス・ズブチリスにおけるｙｗａＡ遺伝子によってコードされるアミノトランスフェラーゼ等が例示される。
【０１１９】
ＢＣＡＴの例示的なタンパク質配列はＣＯＧ０１１５（配列番号１３）である。また、ＢＣＡＴに属するタンパク質は、ＥＣ２．６．１．４２で示されている。
【０１２０】
実際には、分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼは全て、広い基質特異性を示すので、大抵のものは、アミノ基転移の基質としてＨＭＫＰを用いることができる。
【０１２１】
分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼは、Ｌ−グルタミン酸からのα−ケトイソ吉草酸、２−ケト−３−メチル吉草酸及び２−ケト−４−メチル−ペンタン酸等の様々なα−ケト酸へのアミノ基転移を触媒し、これによってそれぞれＬ−バリン、Ｌ−イソロイシン及びＬ−ロイシンが形成される。
【０１２２】
大多数の微生物由来の分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼが既知であり、これらのアミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子の塩基配列も開示されている。
【０１２３】
ｉｌｖＥ遺伝子は、エシェリヒア・コリ由来の分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼであるＩｌｖＥタンパク質（同意語はＢ３７７０、ＩｌｖＥ、分岐鎖アミノ酸：２−オキソグルタル酸アミノトランスフェラーゼ、ＢＣＡＴ、トランスアミナーゼＢ、ロイシントランスアミナーゼ、バリントランスアミナーゼ、及びイソロイシントランスアミナーゼを含む）をコードする。この分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼは、ｅｃｏＢＣＡＴと略記することができる。ｉｌｖＥ遺伝子は、エシェリヒア・コリＫ−１２株の染色体上のｉｌｖＭ遺伝子とｉｌｖＤ遺伝子との間に位置する。ｉｌｖＥ遺伝子の塩基配列は既知である（ヌクレオチド位置：３９５０５０７〜３９５１４３６、ＧｅｎＢａｎｋアクセ
ッション番号ＮＣ＿０００９１３．２、ｇｉ：４９１７５９９０）（配列番号１４）。ｉｌｖＥ遺伝子の塩基配列及びｉｌｖＥ遺伝子によってコードされるＩｌｖＥタンパク質のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１４及び配列番号１５に示される。
【０１２４】
ｙｗａＡ遺伝子は、バチルス・ズブチリス由来の分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼをコードする。この分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼは、ｂｓｕＢＣＡＴと略記することができる。ｙｗａＡ遺伝子は、バチルス・ズブチリス１６８株の染色体上のｄｌｔＥ遺伝子とｌｉｃＨ遺伝子との間に位置する。ｙｗａＡ遺伝子の塩基配列は既知である（ヌクレオチド位置：３９５６４１２〜３９５７５０３、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００９６４．２、ｇｉ：５０８１２１７３）（配列番号１６）。ｙｗａＡ遺伝子の塩基配列及びｙｗａＡ遺伝子によってコードされるＹｗａＡタンパク質のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１６及び配列番号１７に示される。
【０１２５】
他の微生物由来の分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼをコードする他の遺伝子は、分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼをコードする既知の遺伝子に対する相同性によって同定した後、この遺伝子によってコードされるタンパク質の活性を評価することができる。
【０１２６】
２つのアミノ酸配列間の相同性は、既知の方法、例えば、３つのパラメータ：スコア、同一性及び類似性を算出する、コンピュータプログラムＢＬＡＳＴ２．０を用いて決定することができる。
【０１２７】
したがって、エシェリヒア・コリ由来のｉｌｖＥ遺伝子及びバチルス・ズブチリス由来のｙｗａＡ遺伝子は、遺伝子の既知の塩基配列に基づいたプライマーを利用するＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応、White, T. J.他, Trends Genet., 5, 185（1989）を参照されたい）によって得ることができる。他の微生物由来の分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子も同様に得ることができる。
【０１２８】
細菌株間のＤＮＡ配列に幾つかの差異が存在し得るので、アルドラーゼ又はＢＣＡＴをコードする上記の遺伝子は、配列番号１、配列番号１４及び配列番号１６で示される塩基配列に限定されず、配列番号１、配列番号１４及び配列番号１６で示されるものと類似の塩基配列を含み得る。したがって、上記の遺伝子によってコードされるタンパク質変異体は、このタンパク質が反応を触媒することができさえすれば、配列番号２、配列番号１５及び配列番号１７で示されるアミノ酸配列全体と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、及び最も好ましくは９５％以上の相同性を有するものであってもよい。
【０１２９】
さらに、上記の遺伝子は、機能タンパク質をコードする場合、配列番号１、配列番号１４及び配列番号１６で示される塩基配列と、又はこれらの塩基配列に基づき調製されるプローブと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる変異体によって表される。本明細書で用いられる「ストリンジェントな条件」は、上記の［１］の（１）アルドラーゼをコードするＤＮＡの項と同じである。
【０１３０】
本発明で利用される細菌細胞処理物は、乾燥細菌塊（bacterial mass）、凍結乾燥細菌塊、界面活性剤又は有機溶媒による処理物、酵素処理物、超音波処理物、機械的粉砕物、溶媒処理物、細菌塊のタンパク質画分、細菌塊の固定生成物、及び処理細菌塊の形態であり得る。
【０１３１】
アミノ基転移によるＨＭＫＰからの４ＨＩＬの生成は、アルドール反応、とそれに続く生成ＨＭＫＰの単離及び／又は精製の後に連続して行うこともできるし、アルドラーゼ及
びアミノトランスフェラーゼを共存させることによって同じ反応溶液で同時に行うこともできる。反応を同じ反応溶液で行う場合（ワンポット反応）、アルドラーゼ及びアミノトランスフェラーゼを細菌中で同時に発現することができる。又は、これらの酵素は、上記のように別々に調製し、反応溶液に添加することができる。アルドラーゼをコードするＤＮＡとアミノトランスフェラーゼをコードするＤＮＡとを同時に発現する細菌（宿主細胞）は、それぞれアルドラーゼ及びアミノトランスフェラーゼのＤＮＡを含有する発現ベクターによる共トランスフェクション、又は宿主細胞で発現することができる形態でアルドラーゼ及びアミノトランスフェラーゼの両方のＤＮＡを含有する発現ベクターによる形質転換によって調製することができる。さらに、アルドラーゼ及び分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子の発現を増大させることが、アルドラーゼ及びアミノトランスフェラーゼの活性を高める好ましい方法である。
【０１３２】
「遺伝子の発現を増大させる」という語句は、遺伝子の発現が非改変株、例えば野生型株より高いことを意味する。このような改変の例としては、細胞１個当たりに発現する遺伝子のコピー数を増加させること、遺伝子の発現レベルを増大させること等が挙げられる。発現遺伝子のコピー数は、例えば、染色体ＤＮＡの制限酵素処理後、遺伝子配列に基いたプローブを用いたサザンブロッティング、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）等によって測定することができる。遺伝子発現レベルは、ノーザンブロッティング、定量的ＲＴ−ＰＣＲ等を含む様々な既知の方法によって測定することができる。発現されたタンパク質の量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、免疫ブロット法（ウェスタンブロッティング分析）等を含む既知の方法によって測定することができる。
【０１３３】
「タンパク質をコードするＤＮＡによる細菌の形質転換」とは、例えば、従来の方法によって細菌にＤＮＡを導入することを意味する。このＤＮＡの形質転換によって、本発明のタンパク質をコードする遺伝子の発現が増大され、細菌細胞におけるタンパク質の活性が高まる。形質転換の方法は、これまでに報告されている任意の既知の方法を含む。例えば、ＤＮＡに対する細胞の浸透性を増大させるように塩化カルシウムでレシピエント細胞を処理することがエシェリヒア・コリＫ−１２株で報告されており（Mandel, M.及びHiga, A., J. Mol. Biol., 53, 159（1970））、この方法を用いることができる。
【０１３４】
遺伝子発現を高める方法は、遺伝子コピー数を増加させることを含む。本発明の細菌で機能することができるベクターに遺伝子を導入することによって、遺伝子のコピー数が増加する。このような目的のために、好ましくは多コピーベクターを用いることができる。多コピーベクターは、ｐＢＲ３２２、ｐＭＷ１１９、ｐＵＣ１９、ｐＥＴ２２ｂ等で例示される。
【０１３５】
遺伝子発現の増強は、例えば相同組み換え、Ｍｕ融合等によって遺伝子の複数コピーを細菌染色体に導入することでも達成することができる。例えば、Ｍｕ融合の１回の実行によって、細菌の染色体に遺伝子のコピーを最大３個まで導入することができる。
【０１３６】
遺伝子のコピー数の増加は、遺伝子の複数コピーを細菌の染色体ＤＮＡに導入することによっても達成することができる。遺伝子の複数コピーを細菌の染色体に導入するためには、染色体ＤＮＡに複数コピー存在する標的配列を用いて、相同組み換えを行う。染色体ＤＮＡにおいて複数コピー存在する配列は、反復ＤＮＡ、又は転位因子の末端にある逆方向反復を含むが、これらに限定されない。また、米国特許第５，５９５，８８９号に開示されたように、遺伝子をトランスポゾンに組み込み、それを転移させ、遺伝子の多数のコピーを染色体ＤＮＡに導入することも可能である。
【０１３７】
遺伝子発現の増強は、強力なプロモーターの制御下に本発明のＤＮＡを置くことによっても達成することができる。例えば、Ｐｔａｃプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒ
ｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、λファージのＰＲプロモーター又はＰＬプロモーターは全て強力なプロモーターであることが知られている。強力なプロモーターは遺伝子コピーの増加と併せて用いることができる。
【０１３８】
代替的には、プロモーターの効果は、例えば、プロモーターの下流に位置する遺伝子の転写レベルを増加するように、突然変異をプロモーターに導入することによって高めることができる。さらに、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）と開始コドンとの間のスペーサ領域における幾つかのヌクレオチド、特に開始コドンのすぐ上流にある配列の置換がｍＲＮＡ翻訳能力に強く影響することが知られている。例えば、開始コドンに先行する３つのヌクレオチドの性質によって、２０倍の範囲の発現レベルが見出された（Gold他, Annu. Rev.
Microbiol., 35, 365-403, 1981、Hui他, EMBO J., 3, 623-629, 1984）。これまでに、ｒｈｔＡ２３突然変異は、ＡＴＧ開始コドンに対して−１位でＧをＡに置換することであることが示された（１９９７年のアメリカ生化学分子生物学学会総会主催の第１７回アメリカ生化学分子生物学学会国際会議の抄録（ABSTRACTS of 17th International Congress
of Biochemistry and Molecular Biology in conjugation with 1997 Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology）, San Francisco, California August 24-29, 1997, 抄録番号４５７）。
【０１３９】
さらに、ヌクレオチド置換を細菌染色体上の遺伝子のプロモーター領域に導入することも可能であり、これによりプロモーター機能が強められる。発現制御配列の改変は、例えば、国際公開ＷＯ００／１８９３５号及び特開平１−２１５２８０号公報に開示されたような温度感受性プラスミドを用いた遺伝子置換と同様に行うことができる。
【０１４０】
プラスミドＤＮＡの調製方法としては、ＤＮＡの消化及びライゲーション、形質転換、プライマーとしてのオリゴヌクレオチドの選択等、又は当業者に既知の他の方法が挙げられるが、これらに限定されない。これらの方法は、例えば「Molecular Cloning A Laboratory Manual, Third Edition」（Cold Spring Harbor Laboratory Press（2001））に記載されている。
【０１４１】
[実施例]
本発明は、以下で示される実施例を参照してさらに詳細に説明する。しかし、本発明は、これらに限定されない。
【実施例１】
【０１４２】
ａｓｉＨＰＡＬの精製
精製プロトコルは下記の手順を含む。
【０１４３】
工程１：アースロバクター・シンプレックスＡＫＵ６２６の一晩細菌培養物（３４℃で１２時間培養）１ｍＬを用いて、ＬＢ培地（８×（１Ｌフラスコ中に３７５ｍＬ））５Ｌを接種した。細胞を約２４時間最適温度で培養した。それから、細胞を４℃での遠心分離（１６０００×ｇ）によって回収し、１ｍＭのＰＭＳＦ（フッ化フェニルメチルスルホニル）を補充した緩衝液Ａ（５０ｍＭのＫＨ2ＰＯ4（ＫＯＨでｐＨ７．４に調節））３０ｍＬに再懸濁した。
【０１４４】
工程２：細胞を、フレンチプレス・セル（最高Ｐ＝２．５ｐｓｉ）に３〜５回通すことによって破砕した後、遠心分離によって残屑を取り除いた。タンパク質調製物は、緩衝液Ａで平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１５カラム（２．６×２８ｃｍ）に通した。
【０１４５】
工程３：アニオン交換クロマトグラフィ（ＡＥＣ１）は、ＤＥＡＥ（ファストフロー）カラム（ｄ＝１．６ｃｍ）５０ｍＬを備えたＡＫＴＡｂａｓｉｃ１００システムを用いて
行った。工程２で得られたタンパク質調製物４０〜５０ｍＬを緩衝液Ａで平衡化したカラムに加えた。溶離は、緩衝液Ａ（１０ＣＶ（カラム容積）：カラム容積の１０倍量））を用いて０〜０．５ＭのＮａＣｌの直線勾配で、流速２．５ｍＬ／分で行った。それぞれ１０ｍＬ分の画分を回収した。活性画分をプールし、「工程２」に記載されたようにして脱塩した。
【０１４６】
工程４：アニオン交換ＦＰＬＣ（ＡＥＣ２）はＡＫＴＡｂａｓｉｃ１００システムを用いて行い、「Ｓｏｕｒｓｅ１５Ｑ」カラム（Amersham Pharmacia Biotech）１．６ｍＬを補充した。工程３から得られたタンパク質調製物を、緩衝液Ａで平衡化したカラムに加えた。溶離は、緩衝液Ａ（４０ＣＶ）を用いて０〜０．５ＭのＮａＣｌの直線勾配で、流速１ｍＬ／分で行った。それぞれ２ｍＬ分の画分を回収した。活性画分をプールした（表１及び表２）。
【０１４７】
工程５：疎水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＣ）はＡＫＴＡｂａｓｉｃ１００システムを用いて行い、「ＲｅｓｏｕｒｃｅＰＨＥ」カラム（Amersham Pharmacia Biotech）１ｍＬを補充した。工程５で得られた調製物のタンパク質濃度を０．８ｍｇ／ｍＬに調節し、それから、硫酸アンモニウムを最終濃度が１．５Ｍになるまで添加した。タンパク質溶液は、１．５Ｍの硫酸アンモニウムを補充した緩衝液Ａで平衡化したカラムに加えた。溶離は、緩衝液Ａ（３０ＣＶ）を用いて１．５Ｍ〜０Ｍの硫酸アンモニウムの直線勾配で、流速１ｍＬ／分で行った。画分１ｍＬを回収した。活性画分をプールした（表１及び表２）。
【０１４８】
【表１】
1)比活性は、以下の組成物（１００ｍＭのＬ−グルタミン酸（ｐＨ８、ｐＨ８．０で調整）、１００ｍＭのα−ケト酪酸、１００ｍＭのアセトアルデヒド）と、１ｍＭのＺｎＣｌ2と、精製ｂｓｕＢＣＡＴ０．５μｇと、一定分量のａｓｉＨＰＡＬの活性画分とを用いたｂｓｕＢＣＡＴ／ａｓｉＨＰＡＬ二酵素反応における時間依存的な４ＨＩＬ生成をＨＰＬＣでモニタリングすることによって求めた。全ての反応を３７℃で行った。
2)（全タンパク質）×（比活性）として算出した。
3)１００％×（全活性／粗溶解物の全活性）として算出した。
4)（比活性／粗溶解物の比活性）として算出した。
【０１４９】
【表２】
【０１５０】
工程６：サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）はＳｕｐｅｒｄｅｘ（商標）２００ＨＲ １０／３０Ａ（Amersham Pharmacia Biotech）カラムを備えたＡＫＴＡｂａｓｉｃ１００システムを用いて行った。工程５で得られたタンパク質調製物を１００ｍＭのＮａＣｌを補充した緩衝液Ａで平衡化したカラムに加えた。０．５ｍＬ／分の流速で定組成溶離を行った。１ｍＬの画分を回収した。活性画分をプールした（表１、表２及び図１）。
【０１５１】
ａｓｉＨＰＡＬの比活性は、以下の組成物（１００ｍＭのＬ−グルタミン酸（ｐＨ８、ｐＨ８．０で調節）、１００ｍＭのα−ケト酪酸、１００ｍＭのアセトアルデヒド）と、１ｍＭのＺｎＣｌ2と、０．５μｇの精製Ｈｉｓ−タグ−ｂｓｕＢＣＡＴタンパク質（バチルス・ズブチリス由来の分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼ）と、一定分量の溶離画分とを含むｂｓｕＹｗａＡ／ａｓｉＨＰＡＬの二酵素反応における時間依存的な４ＨＩＬ形成をＨＰＬＣでモニタリングすることによって求めた。反応は全て３７℃で行った。バチルス・ズブチリス由来の分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼ（ｂｓｕＢＣＡＴ）をクローニングすること、及び４ＨＩＬ形成を測定するＨＰＬＣはそれぞれ、実施例５及び実施例６に記載される。
【０１５２】
ａｓｉＨＰＡＬモノマーの分子量をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図２Ａ）を用いて求めた。その平均値は２７ｋＤａと推定された。天然ａｓｉＨＰＡＬの分子量は、分子量タンパク質マーカー（Sigma）で較正したＳｕｐｅｒｄｅｘ（商標）２００ＨＲ １０／３０Ａ（Pharmacia）カラムで分析用ＳＥＣを用いて求めた（図２Ｂ）。その平均値は１８６ｋＤａと推定された。したがって、ａｓｉＨＰＡＬは六量体であると推測される。
【０１５３】
ＨＭＫＰ−アルドラーゼの金属イオン依存性を検討した。ａｓｉＨＰＡＬ活性がＺｎ2+、Ｍｇ2+及びＭｎ2+イオンに強く依存し、ＥＤＴＡの存在下で完全に阻害されることを確認した。したがって、ａｓｉＨＰＡＬは、２型アルドラーゼであると推測された（表３）。
【０１５４】
【表３】
【実施例２】
【０１５５】
ａｓｉＨＰＡＬのＮ末端配列の決定
２．１ ａｓｉＨＰＡＬのウェスタンブロッティング
ａｓｉＨＰＡＬは、トランスブロットＳＤセル（Bio-Rad）を用いて、Sequi-Blot ＰＶＤＦ膜（Bio-Rad）上に固定した。最適化ブロッティング条件は以下のようなものである：Ｄｕｎカーボネート移動緩衝液（メタノールを含まない１０ｍＭのＮａＣＨＯ3、３ｍＭのＮａ2ＣＯ3）、６片の極厚濾紙／膜サンドイッチ（起動電流５．５ｍＡ／ｃｍ2、移動時間１時間）。
【０１５６】
２．２ ａｓｉＨＰＡＬのＮ末端のシークエンシング
ａｓｉＨＰＡＬのＮ末端配列の決定は、４９１ｃＬＣタンパク質シーケンサ（Applied Biosystems, USA）を用いて行われた。２６サイクル行った。結果として、以下のアミノ酸配列を決定した：
ＮＨ2−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ．．−ＣＯＯＨ（配列番号３）。
【０１５７】
全て既知のタンパク質によるこのＮ末端配列のアラインメント（ＢＬＡＳＴ検索）によって、同様のＮ末端配列を有する単一タンパク質が明らかになった。これは、ブレビバクテリウム・リネンスＢＬ２由来のＨＨＤＥ−アルドラーゼ（２，４−ジヒドロキシヘプト−２−エン−１，７−ジオン酸アルドラーゼ）（ＨＨＤＥ＿ＢＬＩ）である（図３）。これは２型アルドラーゼであり、その天然基質である２，４−ジヒドロキシヘプト−２−エン−１，７−ジオン酸がＨＭＫＰと構造的に類似している（実際、両方ともＣ4位にヒドロキシル基、Ｃ2位にカルボニル基、Ｃ1位にカルボキシル基を有する）。さらに、ＨＨＤＥ＿ＢＬＩサブユニットのＭｗは２７ｋＤａであり、これは実験で得られたａｓｉＨＰＡＬのサブユニットのＭｗと一致している。ブレビバクテリウム・リネンスはアースロバクター・シンプレックスにも密接に関連している。
【０１５８】
したがって、アースロバクター・シンプレックスから精製したａｓｉＨＰＡＬはブレビバクテリウム・リネンスＢＬ２由来のＨＨＤＥアルドラーゼのホモログであると推定することができる。
【実施例３】
【０１５９】
アースロバクター・シンプレックス（ＮＢＲＣ１２０６９）由来のＨＭＫＰ−アルドラーゼをコードするａｓｉＨＰＡＬ遺伝子のクローニング
ａｓｉＨＰＡＬ遺伝子を含有するアースロバクター・シンプレックスの染色体からＤＮＡ断片を増幅するために、決定されたａｓｉＨＰＡＬのＮ末端のアミノ酸配列（図４）に基づき設計された縮重プライマーａｓｉＮ１０（配列番号４）を用いてＰＣＲを行った。プライマーａｓｉＮ１０は、その３’末端に縮重部を含有し、ａｓｉＨＰＡＬ遺伝子とは相補的ではない２１ヌクレオチドの配列を有する。これは、ＰＣＲ産物のさらなる増幅に必要である。アースロバクター・シンプレックスの染色体ＤＮＡ０．１μｇ及びプライマーａｓｉＮ１０（２０ｐｍｏｌ）によって４０μLの容量でＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は以下のようなものであった：９５℃で１０秒、５３℃で２０秒、７２℃で４０秒の５０サイクル。
【０１６０】
驚くべきことに、ＰＣＲの結果として、単一のＰＣＲ産物が得られた（図５のトラック３）。プライマーａｓｉＮ１０は、フォワードプライマー及びリバースプライマーとしての同時使用に好適であると考えられた。さらに、鋳型として１回目のＰＣＲからの反応混合物２μLを用い、非相補的な２１ヌクレオチドを含みａｓｉＮ１０の一部であるプライマーＳＶＳ８８（配列番号５）（１０ｐｍｏｌ）を用いた２回目のＰＣＲによって、このことが証明された。ＰＣＲ条件は以下のようなものであった：９５℃で１０秒、６５℃で
２０秒、７２℃で４０秒の２５サイクル。強い単一のＰＣＲ産物が観察された。
【０１６１】
ＰＣＲ産物の制限酵素分析によって、ＤＮＡ断片を２つの断片（０．６ｋｂの大きい断片及び０．３ｋｂの小さい断片）に分ける特有のＮｃｏＩ部位が明らかになった（図５のトラック２）。両方の断片は、ＳＶＳ８８プライマーを用いて別々にシークエンシングした。０．６ｋｂの断片で４７１ヌクレオチド及び０．３ｋｂの断片で２６２ヌクレオチドが求められた。
【０１６２】
次に、プライマーＳＶＳ＿１０８（配列番号６）及びＳＶＳ＿１０９（配列番号７）を用いて、全ＤＮＡ断片のシークエンシングを完了させた。増幅ＤＮＡ断片のシークエンシング戦略が図６に示される。塩基配列の分析によって、ａｓｉＨＰＡＬのＯＲＦによってコードされるＮ末端の２６アミノ酸残基が、実施例２で求められたａｓｉＨＰＡＬのＮ末端配列と同一であることが明らかにされた。
【０１６３】
ブレビバクテリウム・リネンスＢＬ２由来のＨＨＤＥアルドラーゼのアミノ酸配列によるＯＲＦのアラインメントによって、酵素間の高い相同性が明らかになった（図７）。
【実施例４】
【０１６４】
４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンの生成
４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシン生成におけるアースロバクター・シンプレックス由来のａｓｉＨＰＡＬ遺伝子によってコードされる組み換えａｓｉＨＰＡＬアルドラーゼの比活性を調べるために、プライマー１（配列番号８）、プライマー２（配列番号９）、及び鋳型としてアースロバクター・シンプレックスの染色体ＤＮＡを用いて、ａｓｉＨＰＡＬ遺伝子を増幅することができる。プライマー１は、５’末端にＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を含有し、プライマー２は、５’末端にＢａｍＨＩ制限部位を含有する。得られたＰＣＲ断片は、ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素及びＢａｍＨＩ制限酵素で消化し、同じ制限酵素で予め処理したプラスミドｐＭＷ１１９に連結することができる。このようにして、プラスミドｐＭＷ１１９−ａｓｉＨＰＡＬが得られた。それから、エシェリヒア・コリＢＷ２５１１３株は、プラスミドｐＭＷ１１９−ａｓｉＨＰＡＬで形質転換することができ、得られたＢＷ２５１１３／ｐＭＷ−ａｓｉＨＰＡＬ株はＩＰＴＧ（１ｍｍｏｌ）を含有するＬＢ培地で培養することができる。
【０１６５】
４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンの生成は、以下の組成物（１００ｍＭのＬ−グルタミン酸（ｐＨ８、ｐＨ８．０で調節）、１００ｍＭのα−ケト酪酸、１００ｍＭのアセトアルデヒド）と、１ｍＭのＺｎＣｌ2と、０．５μｇの精製Ｈｉｓ−タグ−ｂｓｕＢＣＡＴタンパク質（バチルス・ズブチリス由来の分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼ）と、一定分量のＢＷ２５１１３／ｐＭＷ−ａｓｉＨＰＡＬ細胞溶解物とを含むｂｓｕＹｗａＡ／ａｓｉＨＰＡＬの二酵素反応で調べることができる。全ての反応を３７℃で行うことができる。バチルス・ズブチリス由来の分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼ（ｂｓｕＢＣＡＴ）をクローニングすること、及び４ＨＩＬ形成を測定するＨＰＬＣはそれぞれ、実施例５及び実施例６に記載される。
【実施例５】
【０１６６】
バチルス・ズブチリス由来のＢＣＡＴのクローニング及び効率的な発現
バチルス・ズブチリス由来のＢＣＡＴは、ｈｉｓ6−タグ誘導体としてｐＥＴ発現系（Novagen, Madison, WI, USA）を用いてクローニングし発現させた。
【０１６７】
ｐＥＴ−ＨＴ−ＩｌｖＥ−ＢＳＵプラスミドを構築するために、ＢＣＡＴアミノトランスフェラーゼをコードするバチルス・ズブチリス由来のｙｗａＡ遺伝子（Berger, B. J.他, J Bacteriol., 185（8）, 2418-31（2003））は、鋳型としてバチルス・ズブチリス
１６８株の染色体ＤＮＡ、それぞれ「上流」プライマー及び「下流」プライマーとしてプライマーＰ３（配列番号１０）及びプライマーＰ４（配列番号１１）を用いたＰＣＲによって増幅した。プライマーＰ５は、５’末端にＮｃｏＩ制限部位及びヒスチジンをコードする６つのコドンを含有し、プライマーＰ６は５’末端にＮｏｔＩ制限部位を含有する。得られたＰＣＲ断片は、ＮｃｏＩ制限酵素で消化し、予め同じ制限酵素で処理したプラスミドｐＥＴ−１５（ｂ＋）に連結した。それから、線状にした連結ＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅用の鋳型として用い、オリゴヌクレオチドＴ７（Novagen、配列番号１２）及びオリゴヌクレオチドＰ４（配列番号１１）をプライマーとして用いた。得られたプラスミドｐＥＴ−１５（ｂ＋）のＴ７プロモーターの制御下にｙｗａＡ遺伝子を含有するＰＣＲ断片は、ＸｂａＩ制限酵素及びＮｏｔＩ制限酵素で消化し、予め同じ制限酵素で処理したｐＥＴ−２２（ｂ＋）ベクターに連結した。このようにして、プラスミドｐＥＴ−ＨＴ−ＩｌｖＥ−ＢＳＵが得られた。このプラスミドを用いてエシェリヒア・コリを形質転換し、Ｈｉｓ−タグ−ｂｓｕＢＣＡＴタンパク質を形質転換体から精製した。
【実施例６】
【０１６８】
４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンのＨＰＬＣ測定
ＨＰＬＣ分析：分光光度計１１００シリーズ（Agilent, USA）を備えた高速クロマトグラフィ（Agilent Technologies）を用いた。選択した検出波範囲は、２５０ｎｍの励起波長、３００〜５６０ｎｍの発光波長範囲であった。ａｃｃｑ−タグ法による分離は、Ｎｏｖａ−ＰａｋＣ１８（１５０×３．９ｍｍ、４μｍ）（Waters, USA）カラムにおいて、３７℃で行った。試料の注入量は５μLであった。アミノ酸誘導体の形成及びそれらの分離は、製造業者Watersの推奨（Liu, H.他, J. Chromatogr. A, 828, 383-395（1998）、Watersのａｃｃｑ−タグ化学パッケージの取扱説明書（accq-tag chemistry package. Instruction manual）Millipore Corporation, pp.1-9 （1993））に従って行った。６−アミノキノリル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバミン酸を含むアミノ酸誘導体を得るために、Ａｃｃｑ−Ｆｌｕｏｒ（商標）（Waters, USA）キットを用いた。ａｃｃｑ−タグ法による分析は、濃Ａｃｃｑ−タグ溶離液А（Waters, USA）を用いて行なった。溶液は全てＭｉｌｌｉ−Ｑ水を用いて調製し、標準液は＋４℃で貯蔵した。
【産業上の利用可能性】
【０１６９】
アセトアルデヒドとα−ケト酪酸とのアルドール縮合反応を触媒する新規のアルドラーゼが記載され、４−ヒドロキシ−３−メチル−２−ケト−ペンタン酸（ＨＭＫＰ）を合成するのに好ましく用いることができる。アルドラーゼは、４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシン合成における中間体としても有用である。
【図面の簡単な説明】
【０１７０】
【図１】アルドラーゼ生成プロセスのフローチャートである。
【図２】アースロバクター・シンプレックスＡＫＵ６２６（ＮＢＲＣ１２０６９）（以下、ａｓｉＨＰＡＬと略記する）からのＨＭＫＰ−アルドラーゼの精製を示す写真図である。レーン１、４：タンパク質分子量マーカー（Fermentas, Lithuania）、レーン２：粗細胞溶解物（４５μｇ添加）、レーン３：ａｓｉＨＰＡＬ調製物（０．５μｇ添加）。
【図３】ａｓｉＨＰＡＬオリゴマーの構造決定を示す図である。Ａ−較正ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを用いたａｓｉＨＰＡＬモノマーのＭｗの決定。ＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）タンパク質ラダー（Fermentas, Lithuania）をタンパク質マーカーとして用いた。実験データ（黒丸）はSigmaのＰｌｏｔ８ソフトウェアを用いて、線形回帰分析によって適合させた（黒線）。Ｂ−分子量タンパク質マーカー（Sigma）によって較正されたＳｕｐｅｒｄｅｘ（商標）２００ＨＲ １０／３０Ａ（Pharmacia）カラムとＳＥＣを用いたａｓｉＨＰＡＬの天然Ｍｗの決定。実験データ（黒丸）はSigmaのＰｌｏｔ８ソフトウェアを用いて、線形回帰分析によって適合させた（黒線）。
【図４】ＰＣＲ増幅に対するプライマー構造及びａｓｉＨＰＡＬ遺伝子のシークエンシングを示す図である。Ａ）アースロバクター・シンプレックス（ＮＢＲＣ１２０６９）由来のＨＭＫＰアルドラーゼのＮ末端配列。Ｂ）縮重プライマーａｓｉＮ１０、Ｉ＝デオキシイノシンリン酸。Ｃ）フランキングプライマーＳＶＳ８８。
【図５】ＨＭＫＰ−アルドラーゼをコードする遺伝子を含有するアースロバクター・シンプレックス染色体の０．９ｋｂのＤＮＡ断片の増幅を示す写真図である。増幅したＤＮＡ断片の電気泳動。トラック１：ＤＮＡのサイズマーカー、トラック３：定分量の反応混合物Ｂ、トラック２：得られたＮｃｏＩ制限酵素によって消化された０．９ｋｂのＤＮＡ断片。
【図６】増幅したＤＮＡ断片のシークエンシング戦略を示す図である。
【図７】ブレビバクテリウム・リネンスＢＬ２由来のａｓｉＨＰＡＬ及びＨＨＤＥアルドラーゼのアラインメントを示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号１の塩基配列を含むＤＮＡ、
（ｂ）配列番号１の塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、アルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｄ）配列番号２のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、アルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、および
（ｅ）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも７０％の相同性を有するアミノ酸配列を有し、アルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
からなる群から選択されるＤＮＡ。
【請求項２】
請求項１に記載のＤＮＡとベクターＤＮＡとを含む組み換えＤＮＡ。
【請求項３】
請求項２に記載の組み換えＤＮＡで形質転換された単離細胞。
【請求項４】
培地中で請求項３に記載の細胞を培養すること、及び該培地、細胞又はその両方においてアルドラーゼ活性を有するタンパク質を蓄積させることを含む、アルドラーゼ活性を有するタンパク質を製造する方法。
【請求項５】
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質、
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列において、１又数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、アルドラーゼ活性を有するタンパク質、及び
（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも７０％の相同性を有し、アルドラーゼ活性を有するタンパク質、
からなる群から選択されるタンパク質。
【請求項６】
下記性質を有するタンパク質：
（Ａ）アセトアルデヒドとα−ケト酪酸からの４−ヒドロキシ−３−メチル−２−ケト−ペンタン酸の生成を触媒する活性を有する、
（Ｂ）該活性がＺｎ2+、Ｍｎ2+、及びＭｇ2+からなる群から選択される二価カチオンに依存する、
（Ｃ）ゲル濾過によって測定される分子量が約１８６ｋＤａ、および
（Ｄ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって測定される１サブユニット当たりの分子量が約２７ｋＤａ。
【請求項７】
（１）水性溶媒中で、
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質、
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、アルドラーゼ活性を有するタンパク質、及び
（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも７０％の相同性を有し、アルドラーゼ活性を有するタンパク質、
からなる群から選択される少なくとも１つのアルドラーゼの存在下で、アセトアルデヒド及びα−ケト酪酸を反応させること、
（２）生成した４−ヒドロキシ−３−メチル−２−ケト−ペンタン酸を４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンに変換すること、並びに
（３）生成した４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンを単離すること
を含む、４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシン又はその塩を製造する方法。
【請求項８】
アミノ基供与体の存在下でアミノ基転移活性を有する、アミノトランスフェラーゼ及び／又はデヒドロゲナーゼによって、前記４−ヒドロキシ−３−メチル−２−ケト−ペンタン酸が４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンに変換される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
（１）水性溶媒中で、
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質、
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸残基２の置換、欠失、挿入、付加又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、アルドラーゼ活性を有するタンパク質、及び
（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも７０％の相同性を有し、アルドラーゼ活性を有するタンパク質、
からなる群から選択されるアルドラーゼを含有する細菌の存在下で、アセトアルデヒド及びα−ケト酪酸を反応させる工程であって、前記水性溶媒がアミノ基供与体の存在下で、４−ヒドロキシ−３−メチル−２−ケト−ペンタン酸の４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンへの変換を触媒するアミノトランスフェラーゼ及び／又はデヒドロゲーゼも含有する工程、並びに
（２）４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンを単離する工程、
を含む、４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシン又はその塩を製造する方法。
【請求項１０】
前記アミノトランスフェラーゼが、分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼである、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１１】
前記分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼが、エシェリヒア及びバチルスからなる群から選択される細菌に由来する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記アミノ基供与体がＬ−アミノ酸群から選択される、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１３】
前記分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼが、エシェリヒア及びバチルスからなる群から選択される細菌に由来する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記細菌が前記アルドラーゼ及び前記分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼの少なくとも１つの活性を高めるように修飾されている、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
前記アルドラーゼ及び前記分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼの活性が、該アルドラーゼ及び／又は該分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼの発現を増大させることによって高められた、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記アルドラーゼ及び／又は前記分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼの発現が、該アルドラーゼをコードする遺伝子及び／又は該分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子の発現調節配列を改変すること、又は該アルドラーゼをコードする遺伝子及び／又は分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子のコピー数を増加させることによって増大された、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記細菌がエシェリヒア属、シュードモナス属、コリネバクテリウム属、アースロバクター属、アスペルギルス属又はバチルス属に属する、請求項９〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記細菌がエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）、アースロバクター・シンプレッ
クス（Arthrobacter simplex）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）、アースロバクター・グロビフォルミス（Arthrobactor globiformis）、アースロバクター・スルフレウス（Arthrobactor sulfureus）、アースロバクター・ビスコーサス（Arthrobactor viscosus）、又はバチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）に属する、請求項９〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記細菌が細菌培養物、細胞、又は処理細胞である、請求項９〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンが、（２Ｓ，３Ｓ，４Ｓ）−４−ヒドロキシイソロイシン、（２Ｓ，３Ｒ，４Ｒ）−４−ヒドロキシイソロイシン、（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−４−ヒドロキシイソロイシン、（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−４−ヒドロキシイソロイシン、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項７〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１】
（ａ）配列番号１の塩基配列を含むＤＮＡ、
（ｂ）配列番号１の塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、アルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｄ）配列番号２のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、アルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、および
（ｅ）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも７０％の相同性を有するアミノ酸配列を有し、アルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
からなる群から選択されるＤＮＡ。
【請求項２】
請求項１に記載のＤＮＡとベクターＤＮＡとを含む組み換えＤＮＡ。
【請求項３】
請求項２に記載の組み換えＤＮＡで形質転換された単離細胞。
【請求項４】
培地中で請求項３に記載の細胞を培養すること、及び該培地、細胞又はその両方においてアルドラーゼ活性を有するタンパク質を蓄積させることを含む、アルドラーゼ活性を有するタンパク質を製造する方法。
【請求項５】
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質、
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列において、１又数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、アルドラーゼ活性を有するタンパク質、及び
（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも７０％の相同性を有し、アルドラーゼ活性を有するタンパク質、
からなる群から選択されるタンパク質。
【請求項６】
下記性質を有するタンパク質：
（Ａ）アセトアルデヒドとα−ケト酪酸からの４−ヒドロキシ−３−メチル−２−ケト−ペンタン酸の生成を触媒する活性を有する、
（Ｂ）該活性がＺｎ2+、Ｍｎ2+、及びＭｇ2+からなる群から選択される二価カチオンに依存する、
（Ｃ）ゲル濾過によって測定される分子量が約１８６ｋＤａ、および
（Ｄ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって測定される１サブユニット当たりの分子量が約２７ｋＤａ。
【請求項７】
（１）水性溶媒中で、
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質、
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、アルドラーゼ活性を有するタンパク質、及び
（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも７０％の相同性を有し、アルドラーゼ活性を有するタンパク質、
からなる群から選択される少なくとも１つのアルドラーゼの存在下で、アセトアルデヒド及びα−ケト酪酸を反応させること、
（２）生成した４−ヒドロキシ−３−メチル−２−ケト−ペンタン酸を４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンに変換すること、並びに
（３）生成した４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンを単離すること
を含む、４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシン又はその塩を製造する方法。
【請求項８】
アミノ基供与体の存在下でアミノ基転移活性を有する、アミノトランスフェラーゼ及び／又はデヒドロゲナーゼによって、前記４−ヒドロキシ−３−メチル−２−ケト−ペンタン酸が４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンに変換される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
（１）水性溶媒中で、
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質、
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸残基２の置換、欠失、挿入、付加又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、アルドラーゼ活性を有するタンパク質、及び
（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも７０％の相同性を有し、アルドラーゼ活性を有するタンパク質、
からなる群から選択されるアルドラーゼを含有する細菌の存在下で、アセトアルデヒド及びα−ケト酪酸を反応させる工程であって、前記水性溶媒がアミノ基供与体の存在下で、４−ヒドロキシ−３−メチル−２−ケト−ペンタン酸の４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンへの変換を触媒するアミノトランスフェラーゼ及び／又はデヒドロゲーゼも含有する工程、並びに
（２）４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンを単離する工程、
を含む、４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシン又はその塩を製造する方法。
【請求項１０】
前記アミノトランスフェラーゼが、分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼである、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１１】
前記分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼが、エシェリヒア及びバチルスからなる群から選択される細菌に由来する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記アミノ基供与体がＬ−アミノ酸群から選択される、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１３】
前記分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼが、エシェリヒア及びバチルスからなる群から選択される細菌に由来する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記細菌が前記アルドラーゼ及び前記分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼの少なくとも１つの活性を高めるように修飾されている、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
前記アルドラーゼ及び前記分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼの活性が、該アルドラーゼ及び／又は該分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼの発現を増大させることによって高められた、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記アルドラーゼ及び／又は前記分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼの発現が、該アルドラーゼをコードする遺伝子及び／又は該分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子の発現調節配列を改変すること、又は該アルドラーゼをコードする遺伝子及び／又は分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子のコピー数を増加させることによって増大された、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記細菌がエシェリヒア属、シュードモナス属、コリネバクテリウム属、アースロバクター属、アスペルギルス属又はバチルス属に属する、請求項９〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記細菌がエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）、アースロバクター・シンプレッ
クス（Arthrobacter simplex）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）、アースロバクター・グロビフォルミス（Arthrobactor globiformis）、アースロバクター・スルフレウス（Arthrobactor sulfureus）、アースロバクター・ビスコーサス（Arthrobactor viscosus）、又はバチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）に属する、請求項９〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記細菌が細菌培養物、細胞、又は処理細胞である、請求項９〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシンが、（２Ｓ，３Ｓ，４Ｓ）−４−ヒドロキシイソロイシン、（２Ｓ，３Ｒ，４Ｒ）−４−ヒドロキシイソロイシン、（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−４−ヒドロキシイソロイシン、（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−４−ヒドロキシイソロイシン、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項７〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公表番号】特表２００９−５２９８５６（Ｐ２００９−５２９８５６Ａ）
【公表日】平成２１年８月２７日（２００９．８．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５４４６８６（Ｐ２００８−５４４６８６）
【出願日】平成１９年３月２２日（２００７．３．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００７／０５６７５６
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１１９５７５
【国際公開日】平成１９年１０月２５日（２００７．１０．２５）
【出願人】（０００００００６６）味の素株式会社 (887)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年８月２７日（２００９．８．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年３月２２日（２００７．３．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００７／０５６７５６
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１１９５７５
【国際公開日】平成１９年１０月２５日（２００７．１０．２５）
【出願人】（０００００００６６）味の素株式会社 (887)
【Ｆターム（参考）】
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