新規ウイルスの分離方法
【課題】 感染性に欠けているウイルスであっても分離可能であり、かつ効率的な新規ウイルスの分離方法を提供する。
【解決手段】 環境試料からの新規ウイルスの分離方法であって、環境試料から抽出したウイルス画分または核酸を、遺伝子銃、エレクトロポレーションおよびポリエチレングリコール処理からなる群から選択される少なくとも一つの遺伝子導入方法により直接的に目的とする宿主細胞内に導入することを特徴とする新規ウイルスの分離方法。
【解決手段】 環境試料からの新規ウイルスの分離方法であって、環境試料から抽出したウイルス画分または核酸を、遺伝子銃、エレクトロポレーションおよびポリエチレングリコール処理からなる群から選択される少なくとも一つの遺伝子導入方法により直接的に目的とする宿主細胞内に導入することを特徴とする新規ウイルスの分離方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、環境中ゲノム（核酸）を直接的に宿主細胞に導入することで、従来の方法よりも効率的なウイルスの分離（単離）を可能にする方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
有害赤潮プランクトンや貝毒原因プランクトンをはじめとする産業上有害な生物を宿主とするウイルスは、それらの駆除を目的とした生物農薬的応用に供することが可能である。すなわち、目的に叶う宿主域を持つウイルスの単離は、様々な場面で産業支援に繋がる可能性が高い。また宿主生物の生態を理解する上でも、ウイルスは重要な研究対象になりうる。しかしながら現状では、ウイルスの単離試験は直接接種法にほぼ限定されており、効率性に欠ける。例えば従来の直接接種法では、正常なゲノムを有しながらもカプシドの損傷により感染性を欠く（すなわち宿主細胞への吸着能を欠く）ウイルスの場合、その単離は困難である（非特許文献１、２）。
【非特許文献１】Ｔｏｍａｒｕ， Ｙ．， Ｋａｔａｎｏｚａｋａ， Ｎ．， Ｎｉｓｈｉｄａ， Ｋ．， Ｓｈｉｒａｉ， Ｙ．， Ｔａｒｕｔａｎｉ， Ｋ．， Ｙａｍａｇｕｃｈｉ， Ｍ． Ｎａｇａｓａｋｉ， Ｋ． （２００４） Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｗｏ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｔｙｐｅｓ ｏｆ ＨｃＲＮＡＶ， ａ ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｎｇ ｔｈｅ ｂｉｖａｌｖｅ−ｋｉｌｌｉｎｇ ｍｉｃｒｏａｌｇａ Ｈｅｔｅｒｏｃａｐｓａ ｃｉｒｃｕｌａｒｉｓｑｕａｍａ． Ａｑｕａｔ． Ｍｉｃｒｏｂ． Ｅｃｏｌ．， ３４（３）： ２０７−２１８．
【非特許文献２】Ｔａｒｕｔａｎｉ， Ｋ．， Ｎａｇａｓａｋｉ， Ｋ．， Ｉｔａｋｕｒａ， Ｓ．， Ｙａｍａｇｕｃｈｉ， Ｍ． Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｎｇ ｔｈｅ ｎｏｖｅｌ ｓｈｅｌｌｆｉｓｈ−ｋｉｌｌｉｎｇ ｄｉｎｏｆｌａｇｅｌｌａｔｅ Ｈｅｔｅｒｏｃａｐｓａ ｃｉｒｃｕｌａｒｉｓｑｕａｍａ． Ａｑｕａｔ． Ｍｉｃｒｏｂ． Ｅｃｏｌ． ２３（２）， １０３−１１１ （２００１）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は、従来の方法では困難であった感染性を欠くウイルスであっても分離可能であり、かつ効率的な新規ウイルスの分離方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
前記目的を達成するために、本発明は、環境試料からの新規ウイルスの分離方法であって、環境試料から抽出したウイルス画分または核酸を、遺伝子銃、エレクトロポレーションおよびポリエチレングリコール処理からなる群から選択される少なくとも一つの遺伝子導入方法により直接的に目的とする宿主細胞内に導入することを特徴とする。
【発明の効果】
【０００５】
本発明者等は、前記目的を達成するために、一連の研究を重ねたところ、環境試料中の核酸を、宿主細胞に直接導入することで、感染性が欠けているウイルスであっても分離可能であることを突き止め、本発明を為すに至った。例えば、渦鞭毛藻感染性ウイルスＨｃＲＮＡＶより抽出したゲノムＲＮＡを金粒子に吸着させた後、同ウイルスの宿主であるヘテロカプサ・サーキュラリスカーマに遺伝子銃により打ち込むことにより、成熟した（感染性を有する）ＨｃＲＮＡＶ粒子を得ることが確認された。また、海底泥試料より抽出した渦鞭毛藻感染性ウイルスＨｃＲＮＡＶのゲノムＲＮＡを金粒子に吸着させた後、同様の操作を行った場合でも、ＨｃＲＮＡＶを複製させることが可能であると確認された。この原理を応用することで、Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ属やＰｆｉｅｓｔｅｒｉａ属など、産業被害・健康被害を引き起こす種でありながらそれらに感染するウイルスが未だ知られていない生物について、新規ウイルスの単離が可能となる。また、新規有害生物の発生時においても、それに対するウイルス単離が可能性となる。
【０００６】
すなわち、本発明は、例えば、環境中ウイルス画分または環境中ゲノム（核酸）を濾過、限外濾過、超遠心、またはエタノール沈殿等の方法で集めた後、遺伝子銃、エレクトロポレーション、またはポリエチレングリコール処理等の方法によりそれらを直接的に宿主培養に導入することで、効率的に目的とする新規ウイルスを得る技術を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明において、ウイルス画分または核酸の抽出対象は、例えば、動植物の死骸、土壌、陸水、海水および水圏の底性堆積物である。
【０００８】
本発明において、前記宿主細胞は、例えば、動物、植物、菌類、原生生物および原核生物である。
【０００９】
本発明において、前記宿主細胞は、例えば、人畜および植物に対して病原性を持つ生物、有毒アオコ原因藍藻、有害赤潮原因プランクトンおよび有毒プランクトンである。
【００１０】
本発明において、前記分離方法により得られたウイルス懸濁液をフィルターで濾過し、得られた濾液を、前記宿主細胞の培養に用いる培養液に接種して培養を行い、前記宿主細胞の死滅又は増殖阻害が観察された培養液を限界希釈することによりウイルスをクローニングする工程を含むことが好ましい。
【００１１】
以下、本発明を実施例により具体的に説明する。本発明の範囲はこれらの実施例により限定されるものではない。
【実施例】
【００１２】
〔実施例１〕
材料および方法
【００１３】
ウイルスからのＲＮＡ採取と宿主細胞への打ち込み
Ｈｅｔｅｒｏｃａｐｓａ ｃｉｒｃｕｌａｒｉｓｑｕａｍａ ＨＣＬＧ−１株感染性ウイルスＨｃＲＮＡＶ１０９（ＨｃＲＮＡＶに関する原記載は参考文献１を参照）からのＲＮＡ抽出は、ＲＮｅａｓｙ（登録商標） Ｐｌａｎｔ ｍｉｎｉ ｋｉｔ （Ｑｉａｇｅｎ）を用い、添付のプロトコルに従い行った。最終段階でカラムに吸着したＲＮＡは６０ｕｌのＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ ＤＷで溶出し、打ち込み試験まで−８０℃で保存した。Ｈｅｔｅｒｏｃａｐｓａ ｃｉｒｃｕｌａｒｉｓｑｕａｍａ ＨＣＬＧ−１株を５００ｍｌ改変ＳＷＭ−ＩＩＩ（０．１７ｇ ＮａＮＯ３， １５．６ｍｇ ＮａＨ２ＰＯ４−２Ｈ２Ｏ， ５６．８ｍｇ Ｎａ２ＳｉＯ３−９Ｈ２Ｏ， １１．２ｍｇ Ｎａ２ＥＤＴＡ， ０．８４ｍｇ Ｆｅ−ＥＤＴＡ， ０．３５ｍｇ Ｎａ２ＳｅＯ３， ５００ｍｇ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ， ６１．８ｍｇ Ｈ３ＢＯ３， ６．９ｍｇ ＭｎＣｌ２−４Ｈ２Ｏ， ０．５５ｍｇ ＺｎＣｌ２， ０．０２４ｍｇ ＣｏＣｌ２−６Ｈ２Ｏ， ０．０００１７ｍｇ ＣｕＣｌ２−２Ｈ２Ｏ， ０．５ｍｇ Ｔｈｉａｍｉｎｅ−ＨＣｌ， ０．１ｍｇ Ｎｏｃｏｔｉｎｉｃ ａｃｉｄ， ０．１ｍｇ Ｃａ−ｐａｎｔｏｔｈｅｎａｔｅ， ０．０１ｍｇ ｐ−ａｍｉｎｏｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ， ０．００１ｍｇ Ｂｉｏｔｉｎ， ５ｍｇ Ｉｎｏｓｉｔｏｌ， ０．００２ｍｇ Ｆｏｌｉｃ ａｃｉｄ， ３ｍｇ Ｔｈｙｍｉｎｅ， ０．００２ｍｇ ｖｉｔａｍｉｎｅ Ｂ１２をグラスファイバー濾過海水で１Ｌにメスアップし、ｐＨを７．７−７．８に調整後、オートクレーブしたもの）で、細胞密度が２×１０４ｃｅｌｌ／ｍｌから４×１０４ｃｅｌｌ／ｍｌになるまで２０℃で培養した。約２．５×１０６個の細胞を含む培養液を直径４７ｍｍの定量ろ紙 ＮＯ．３ （ＡＤＶＡＮＴＥＣ）を用いてろ過し、細胞をろ紙上に集めた。ろ紙は細胞を付着させた面を上にしてプラスチックシャーレ中央に置き、表面の水分が蒸発するまでクリーンベンチで静置した。
金粒子の打ち込みには、Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ（登録商標） ＰＤＳ−１０００／Ｈｅ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍを用いた。ヘリウムガス圧１３５０ｐｓｉに対応するＲｕｐｔｕｒｅ ｄｉｓｋをＲｕｐｔｕｒｅ ｄｉｓｋ ｒｅｔａｉｎｉｎｇ ｃａｐに設置した。金粒子を付着させたＭａｃｒｏｃａｒｒｉｅｒとＳｔｏｐｐｉｎｇ ｓｃｒｅｅｎをＭｉｃｒｏｃａｒｒｉｅｒ ｌａｕｎｃｈ ａｓｓｅｍｂｌｙに取り付け、Ｍｉｃｒｏｃａｒｒｉｅｒ ｌａｕｎｃｈ ａｓｓｅｍｂｌｙから６ｃｍの距離に上記のろ紙を入れたプラスチックシャーレを置いた。チャンバー内を２８．５ ｉｎｃｈｅｓ Ｈｇになるまで、バキュームで吸引した。目的の圧力に達したらただちに装置内にヘリウムガスを供給し、１３５０−１４５０ｐｓｉのガス圧で金粒子を細胞に打ち込んだ。打ち込み後ただちにチャンバー内を常圧に戻し、プラスチックシャーレを取り出した。クリーンベンチ内で細胞を付着させたろ紙の面を下にして５０ｍｌの改変ＳＷＭ−ＩＩＩ培地入りのフラスコに加え、良く攪拌した後、２０℃で培養した。
参考文献１：Ｔｏｍａｒｕ， Ｙ．， Ｋａｔａｎｏｚａｋａ， Ｎ．， Ｎｉｓｈｉｄａ， Ｋ．， Ｓｈｉｒａｉ， Ｙ．， Ｔａｒｕｔａｎｉ， Ｋ．， Ｙａｍａｇｕｃｈｉ， Ｍ． Ｎａｇａｓａｋｉ， Ｋ． （２００４） Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｗｏ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｔｙｐｅｓ ｏｆ ＨｃＲＮＡＶ， ａ ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｎｇ ｔｈｅ ｂｉｖａｌｖｅ−ｋｉｌｌｉｎｇ ｍｉｃｒｏａｌｇａ Ｈｅｔｅｒｏｃａｐｓａ ｃｉｒｃｕｌａｒｉｓｑｕａｍａ． Ａｑｕａｔ． Ｍｉｃｒｏｂ． Ｅｃｏｌ．， ３４（３）： ２０７−２１８．
【００１４】
ノザンハイブリダイゼーションによる宿主細胞内でのウイルス複製の確認
接種直後および接種４８時間後にサンプルを採取し、常法によりＲＮＡ抽出、電気泳動、メンブレンへの転写を行った。メンブレンはＨｃＲＮＡＶのマイナス鎖を特異的に検出する、ジゴキシゲニン標識ＲＮＡプローブとハイブリダイズした。ＲＮＡプローブの転写には、ＨｃＲＮＡＶのＯＲＦ−２の配列を保持するｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ＋ （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を制限酵素ＢａｍＨＩで切断後、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ）を用いてジゴキシゲニン−１１−ＵＴＰ（Ｒｏｃｈ）存在下でＲＮＡを転写し、添付のプロトコルに従い精製した。ジゴキシゲニン標識ＲＮＡプローブとハイブリダイズしたメンブレンは常法により洗浄し、抗ジコキシゲニン抗体と反応後、抗体に結合したアルカリフォスファターゼとＣＤＰ−Ｓｔａｒ （Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ−Ｌａｂ）の反応によって得られる化学発光を微弱発光検出装置ＬＡＳ−３０００ｍｉｎｉ（Ｆｕｊｉ Ｆｉｌｍ）を用いて検出した。
【００１５】
透過型電子顕微鏡観察による宿主細胞内でのウイルス複製の確認
打ち込みから約４８時間後にサンプルを採取し、常法により固定包埋処理後、ＪＥＯＬ社製ＪＥＭ−１０１０透過型電子顕微鏡による細胞断面の観察を行った。
【００１６】
ＭＰＮ法による宿主細胞内で複製したウイルスの感染性の確認
ウイルス力価の測定を目的とし、以下のようにＭＰＮ法による最確数の算定を行った。上述の培養で溶藻が確認された培養液を、改変ＳＷＭ−ＩＩＩ培地で１００−１０−６倍に段階希釈し、各希釈液１００μｌを対数増殖中のＨｅｔｅｒｏｃａｐｓａ ｃｉｒｃｕｌａｒｉｓｑｕａｍａ ＨＣＬＧ−１株の培養液１５０μｌに接種した。実験には９６穴マイクロプレートを使用し、各希釈段階につき８本立てで接種を行った。また、改変ＳＷＭ−ＩＩＩ培地のみを接種したものを対照区として設けた。これらを上述の条件下で１４日間培養した。各希釈段階で溶藻が起こったウェル数から西原らの計算ソフトを用いて最確数を算出した（西原力， 蔵野憲秀， 篠田純男． マイクロコンピュータによる最確数の計算． 衛生化学３２（３）： ２２６−２２８（１９８６））。
【００１７】
結果
ウイルス（ＨｃＲＮＡＶ１０９）からのＲＮＡ抽出操作により、タンパク質画分を完全に除ききったウイルスゲノム画分を得た。これを遺伝子銃により、Ｈｅｔｅｒｏｃａｐｓａ ｃｉｒｃｕｌａｒｉｓｑｕａｍａ ＨＣＬＧ−１株に打ち込んだ後、培養した結果、接種後４８時間には細胞内でＨｃＲＮＡＶ１０９のマイナス鎖の出現がノザンハイブリダイゼーションにより確認された（図１）。ＨｃＲＮＡＶはプラス鎖１本鎖ＲＮＡウイルスであることから、マイナス鎖の出現は、ＨｃＲＮＡＶ１０９が細胞内で複製されていた証左となる。すなわち、本実施例により、ＨｃＲＮＡＶ１０９のゲノム画分を遺伝子銃により打ち込んだＨｅｔｅｒｏｃａｐｓａ ｃｉｒｃｕｌａｒｉｓｑｕａｍａ ＨＣＬＧ−１株細胞内でＨｃＲＮＡＶ１０９が複製されていたことが示された。
接種後４８時間目の細胞を、固定・包埋・薄切後、透過型電子顕微鏡観察を行った結果、宿主細胞内でのウイルス複製が確認された（図２）。また、同じ試料の力価を未固定のままＭＰＮ法により測定した結果、約４×１０４感染単位／ｍｌと推算された。
以上の結果から、ＨｃＲＮＡＶ１０９のＲＮＡをＨｅｔｅｒｏｃａｐｓａ ｃｉｒｃｕｌａｒｉｓｑｕａｍａ ＨＣＬＧ−１株細胞内に接種することにより、成熟したＨｃＲＮＡＶ１０９を再生することができることが確認された。
【００１８】
〔実施例２〕
材料および方法
【００１９】
供試したウイルス単離源
２００１年６月２８日オホーツク海域（調査定点ＯＨ６）にて採取し、４℃で保存していた海底泥をオートクレーブ（１２１℃，１５分）により滅菌した。冷却後、５０ｍｌチューブに供試泥５ｇを計りとり、ウイルス懸濁液（ＨｃＲＮＡＶ１０９，タイター７．３×１０１０／ｍｌ）１ｍｌを添加して攪拌を行った。対照区にはウイルス懸濁液と等量の改変ＳＷＭ−ＩＩＩ培地を添加した。添加ウイルスを泥になじませるため、４℃で一晩をインキュベートした。
【００２０】
泥試料からのウイルス画分の精製
インキュベート後、２５ｍｌのＳＷＭ−ＩＩＩ培地を底泥入りのチューブに添加し、常温で４００ｒｐｍ，３０分間の攪拌を行った。攪拌にはＴＡＩＴＥＣ社製ＶｏｒｔｅｘＳｈａｋｅｒ ＶＲ−３６を使用した。攪拌後、２０００ｒｐｍ，４℃，１０分間の遠心処理を行い、上清画分を採取した（ウイルス添加区２３．５ｍｌ、対照区２４．５ｍｌ）。上清にＳＷＭ−ＩＩＩ培地を添加し、総量が７０．５ｍｌになるように調整した。このうち０．５ｍｌはタイター測定のためのＭＰＮアッセイに使用した。残りの７０ｍｌに対して７ｇのポリエチレングリコール（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ ６０００、和光純薬）を添加し、４℃で一晩インキュベートした。これに２２０００ｒｐｍ（５７，０００ × ｇ），４℃，１．５時間の遠心処理を施した後、上清を捨て、沈殿物をリン酸緩衝液（１０ ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１０ ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４）に懸濁して回収した。さらに３５０００ ｒｐｍ（２１７，０００ × ｇ），４℃，４時間の遠沈処理を行った後、上清を捨て沈殿物（ウイルスペレット）を得た。沈殿物はゲノム抽出まで−８０℃で保存した。
【００２１】
ＲＮＡ採取と宿主細胞への打ち込み
ＲＮＡ抽出および宿主細胞への打ち込み操作は、実施例１と同様の工程により行った。
【００２２】
ノザンハイブリダイゼーションによる宿主細胞内でのウイルス複製の確認
ノザンハイブリダイゼーションによる宿主細胞内でのウイルス複製の確認実験は、実施例１と同様の工程により行った。
【００２３】
結果
ウイルス（ＨｃＲＮＡＶ１０９）を添加した底泥試料からのＲＮＡ抽出操作により、タンパク質画分を完全に除ききった環境ゲノム画分を得た。これを遺伝子銃により、Ｈｅｔｅｒｏｃａｐｓａ ｃｉｒｃｕｌａｒｉｓｑｕａｍａ ＨＣＬＧ−１株に打ち込んだ後、培養した結果、接種から４８時間後には細胞内でのＨｃＲＮＡＶ１０９マイナス鎖の出現がノザンハイブリダイゼーションにより確認された（図３）。この結果は、ＨｃＲＮＡＶ１０９ゲノムＲＮＡが細胞内で複製されていたことを示す。すなわち、本方法により、環境中のウイルスの単離が可能であることを示すものである。
【００２４】
このように、本発明者らは、環境試料から抽出したウイルス画分または核酸を、遺伝子銃、エレクトロポレーション、またはポリエチレングリコール処理等の方法により直接的に目的とする宿主細胞内に導入することによる新規ウイルスの単離技術を開発した。ウイルス画分または核酸の抽出対象は、たとえば動植物の死骸、土壌、陸水、海水、または水圏の底性堆積物であればよい。また、ウイルスの単離を目的とする宿主細胞は、動物、植物、菌類、原生生物、および原核生物であるとよい。また、ウイルスの単離を目的とする宿主細胞は、人畜および植物に対して病原性を持つ生物、有毒アオコ原因藍藻、有害赤潮原因プランクトン、または有毒プランクトンであってもよい。また本発明は、上記の技術により得られたウイルス懸濁液をフィルターで濾過し、得られた濾液を該当する培養液に接種して培養を行い、宿主の死滅又は増殖阻害が観察された培養液を限界希釈することによりウイルスをクローニングする工程を含む（図４）。
【産業上の利用可能性】
【００２５】
本発明により、環境試料から抽出したウイルス画分または核酸を、遺伝子銃、エレクトロポレーション、またはポリエチレングリコール処理等の方法により直接的に目的とする宿主細胞内に導入することによる新規ウイルスの単離技術が開発された。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】ＨｃＲＮＡＶ１０９より抽出したゲノムＲＮＡをＨｅｔｅｒｏｃａｐｓａ ｃｉｒｃｕｌａｒｉｓｑｕａｍａ ＨＣＬＧ−１株に打ち込んだ実験区におけるＨｃＲＮＡＶ１０９マイナス鎖検出結果。打ち込み後２４時間目から４８時間目にかけてＨｃＲＮＡＶ１０９マイナス鎖の存在が確認できる。すなわちこの結果は、Ｈｅｔｅｒｏｃａｐｓａ ｃｉｒｃｕｌａｒｉｓｑｕａｍａ ＨＣＬＧ−１株細胞内においてＨｃＲＮＡＶ１０９ゲノムＲＮＡの転写によるマイナス鎖の出現がおき、ウイルスゲノムが複製されていたことを示す。
【図２】ＨｃＲＮＡＶ１０９より抽出したゲノムＲＮＡをＨｅｔｅｒｏｃａｐｓａ ｃｉｒｃｕｌａｒｉｓｑｕａｍａ ＨＣＬＧ−１株に打ち込んだ実験区における、打ち込み後４８時間目の細胞断面の透過型電子顕微鏡像。ウイルスの複製が確認される。これらのウイルス粒子は、接種試験の結果、感染性を有することが確認された。
【図３】ＨｃＲＮＡＶ１０９を含む底泥試料より抽出したゲノムＲＮＡをＨｅｔｅｒｏｃａｐｓａ ｃｉｒｃｕｌａｒｉｓｑｕａｍａ ＨＣＬＧ−１株に打ち込んだ実験区における打ち込み後４８時間目のＨｃＲＮＡＶ１０９マイナス鎖検出結果（５−４８）。１−０および５−０は打ち込み前、１−４８はＨｃＲＮＡＶ１０９を添加しなかった底泥試料より抽出したゲノムＲＮＡをＨｅｔｅｒｏｃａｐｓａ ｃｉｒｃｕｌａｒｉｓｑｕａｍａ ＨＣＬＧ−１株に打ち込んだ実験区における４８時間目のＨｃＲＮＡＶ１０９マイナス鎖検出結果。これらの結果から、底泥試料より抽出したゲノムＲＮＡをＨｅｔｅｒｏｃａｐｓａ ｃｉｒｃｕｌａｒｉｓｑｕａｍａ ＨＣＬＧ−１株に打ち込むことで、ウイルスを複製させることが可能であることが確認された。
【図４】本発明によるウイルス単離技術のスキーム。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、環境中ゲノム（核酸）を直接的に宿主細胞に導入することで、従来の方法よりも効率的なウイルスの分離（単離）を可能にする方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
有害赤潮プランクトンや貝毒原因プランクトンをはじめとする産業上有害な生物を宿主とするウイルスは、それらの駆除を目的とした生物農薬的応用に供することが可能である。すなわち、目的に叶う宿主域を持つウイルスの単離は、様々な場面で産業支援に繋がる可能性が高い。また宿主生物の生態を理解する上でも、ウイルスは重要な研究対象になりうる。しかしながら現状では、ウイルスの単離試験は直接接種法にほぼ限定されており、効率性に欠ける。例えば従来の直接接種法では、正常なゲノムを有しながらもカプシドの損傷により感染性を欠く（すなわち宿主細胞への吸着能を欠く）ウイルスの場合、その単離は困難である（非特許文献１、２）。
【非特許文献１】Ｔｏｍａｒｕ， Ｙ．， Ｋａｔａｎｏｚａｋａ， Ｎ．， Ｎｉｓｈｉｄａ， Ｋ．， Ｓｈｉｒａｉ， Ｙ．， Ｔａｒｕｔａｎｉ， Ｋ．， Ｙａｍａｇｕｃｈｉ， Ｍ． Ｎａｇａｓａｋｉ， Ｋ． （２００４） Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｗｏ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｔｙｐｅｓ ｏｆ ＨｃＲＮＡＶ， ａ ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｎｇ ｔｈｅ ｂｉｖａｌｖｅ−ｋｉｌｌｉｎｇ ｍｉｃｒｏａｌｇａ Ｈｅｔｅｒｏｃａｐｓａ ｃｉｒｃｕｌａｒｉｓｑｕａｍａ． Ａｑｕａｔ． Ｍｉｃｒｏｂ． Ｅｃｏｌ．， ３４（３）： ２０７−２１８．
【非特許文献２】Ｔａｒｕｔａｎｉ， Ｋ．， Ｎａｇａｓａｋｉ， Ｋ．， Ｉｔａｋｕｒａ， Ｓ．， Ｙａｍａｇｕｃｈｉ， Ｍ． Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｎｇ ｔｈｅ ｎｏｖｅｌ ｓｈｅｌｌｆｉｓｈ−ｋｉｌｌｉｎｇ ｄｉｎｏｆｌａｇｅｌｌａｔｅ Ｈｅｔｅｒｏｃａｐｓａ ｃｉｒｃｕｌａｒｉｓｑｕａｍａ． Ａｑｕａｔ． Ｍｉｃｒｏｂ． Ｅｃｏｌ． ２３（２）， １０３−１１１ （２００１）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は、従来の方法では困難であった感染性を欠くウイルスであっても分離可能であり、かつ効率的な新規ウイルスの分離方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
前記目的を達成するために、本発明は、環境試料からの新規ウイルスの分離方法であって、環境試料から抽出したウイルス画分または核酸を、遺伝子銃、エレクトロポレーションおよびポリエチレングリコール処理からなる群から選択される少なくとも一つの遺伝子導入方法により直接的に目的とする宿主細胞内に導入することを特徴とする。
【発明の効果】
【０００５】
本発明者等は、前記目的を達成するために、一連の研究を重ねたところ、環境試料中の核酸を、宿主細胞に直接導入することで、感染性が欠けているウイルスであっても分離可能であることを突き止め、本発明を為すに至った。例えば、渦鞭毛藻感染性ウイルスＨｃＲＮＡＶより抽出したゲノムＲＮＡを金粒子に吸着させた後、同ウイルスの宿主であるヘテロカプサ・サーキュラリスカーマに遺伝子銃により打ち込むことにより、成熟した（感染性を有する）ＨｃＲＮＡＶ粒子を得ることが確認された。また、海底泥試料より抽出した渦鞭毛藻感染性ウイルスＨｃＲＮＡＶのゲノムＲＮＡを金粒子に吸着させた後、同様の操作を行った場合でも、ＨｃＲＮＡＶを複製させることが可能であると確認された。この原理を応用することで、Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ属やＰｆｉｅｓｔｅｒｉａ属など、産業被害・健康被害を引き起こす種でありながらそれらに感染するウイルスが未だ知られていない生物について、新規ウイルスの単離が可能となる。また、新規有害生物の発生時においても、それに対するウイルス単離が可能性となる。
【０００６】
すなわち、本発明は、例えば、環境中ウイルス画分または環境中ゲノム（核酸）を濾過、限外濾過、超遠心、またはエタノール沈殿等の方法で集めた後、遺伝子銃、エレクトロポレーション、またはポリエチレングリコール処理等の方法によりそれらを直接的に宿主培養に導入することで、効率的に目的とする新規ウイルスを得る技術を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明において、ウイルス画分または核酸の抽出対象は、例えば、動植物の死骸、土壌、陸水、海水および水圏の底性堆積物である。
【０００８】
本発明において、前記宿主細胞は、例えば、動物、植物、菌類、原生生物および原核生物である。
【０００９】
本発明において、前記宿主細胞は、例えば、人畜および植物に対して病原性を持つ生物、有毒アオコ原因藍藻、有害赤潮原因プランクトンおよび有毒プランクトンである。
【００１０】
本発明において、前記分離方法により得られたウイルス懸濁液をフィルターで濾過し、得られた濾液を、前記宿主細胞の培養に用いる培養液に接種して培養を行い、前記宿主細胞の死滅又は増殖阻害が観察された培養液を限界希釈することによりウイルスをクローニングする工程を含むことが好ましい。
【００１１】
以下、本発明を実施例により具体的に説明する。本発明の範囲はこれらの実施例により限定されるものではない。
【実施例】
【００１２】
〔実施例１〕
材料および方法
【００１３】
ウイルスからのＲＮＡ採取と宿主細胞への打ち込み
Ｈｅｔｅｒｏｃａｐｓａ ｃｉｒｃｕｌａｒｉｓｑｕａｍａ ＨＣＬＧ−１株感染性ウイルスＨｃＲＮＡＶ１０９（ＨｃＲＮＡＶに関する原記載は参考文献１を参照）からのＲＮＡ抽出は、ＲＮｅａｓｙ（登録商標） Ｐｌａｎｔ ｍｉｎｉ ｋｉｔ （Ｑｉａｇｅｎ）を用い、添付のプロトコルに従い行った。最終段階でカラムに吸着したＲＮＡは６０ｕｌのＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ ＤＷで溶出し、打ち込み試験まで−８０℃で保存した。Ｈｅｔｅｒｏｃａｐｓａ ｃｉｒｃｕｌａｒｉｓｑｕａｍａ ＨＣＬＧ−１株を５００ｍｌ改変ＳＷＭ−ＩＩＩ（０．１７ｇ ＮａＮＯ３， １５．６ｍｇ ＮａＨ２ＰＯ４−２Ｈ２Ｏ， ５６．８ｍｇ Ｎａ２ＳｉＯ３−９Ｈ２Ｏ， １１．２ｍｇ Ｎａ２ＥＤＴＡ， ０．８４ｍｇ Ｆｅ−ＥＤＴＡ， ０．３５ｍｇ Ｎａ２ＳｅＯ３， ５００ｍｇ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ， ６１．８ｍｇ Ｈ３ＢＯ３， ６．９ｍｇ ＭｎＣｌ２−４Ｈ２Ｏ， ０．５５ｍｇ ＺｎＣｌ２， ０．０２４ｍｇ ＣｏＣｌ２−６Ｈ２Ｏ， ０．０００１７ｍｇ ＣｕＣｌ２−２Ｈ２Ｏ， ０．５ｍｇ Ｔｈｉａｍｉｎｅ−ＨＣｌ， ０．１ｍｇ Ｎｏｃｏｔｉｎｉｃ ａｃｉｄ， ０．１ｍｇ Ｃａ−ｐａｎｔｏｔｈｅｎａｔｅ， ０．０１ｍｇ ｐ−ａｍｉｎｏｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ， ０．００１ｍｇ Ｂｉｏｔｉｎ， ５ｍｇ Ｉｎｏｓｉｔｏｌ， ０．００２ｍｇ Ｆｏｌｉｃ ａｃｉｄ， ３ｍｇ Ｔｈｙｍｉｎｅ， ０．００２ｍｇ ｖｉｔａｍｉｎｅ Ｂ１２をグラスファイバー濾過海水で１Ｌにメスアップし、ｐＨを７．７−７．８に調整後、オートクレーブしたもの）で、細胞密度が２×１０４ｃｅｌｌ／ｍｌから４×１０４ｃｅｌｌ／ｍｌになるまで２０℃で培養した。約２．５×１０６個の細胞を含む培養液を直径４７ｍｍの定量ろ紙 ＮＯ．３ （ＡＤＶＡＮＴＥＣ）を用いてろ過し、細胞をろ紙上に集めた。ろ紙は細胞を付着させた面を上にしてプラスチックシャーレ中央に置き、表面の水分が蒸発するまでクリーンベンチで静置した。
金粒子の打ち込みには、Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ（登録商標） ＰＤＳ−１０００／Ｈｅ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍを用いた。ヘリウムガス圧１３５０ｐｓｉに対応するＲｕｐｔｕｒｅ ｄｉｓｋをＲｕｐｔｕｒｅ ｄｉｓｋ ｒｅｔａｉｎｉｎｇ ｃａｐに設置した。金粒子を付着させたＭａｃｒｏｃａｒｒｉｅｒとＳｔｏｐｐｉｎｇ ｓｃｒｅｅｎをＭｉｃｒｏｃａｒｒｉｅｒ ｌａｕｎｃｈ ａｓｓｅｍｂｌｙに取り付け、Ｍｉｃｒｏｃａｒｒｉｅｒ ｌａｕｎｃｈ ａｓｓｅｍｂｌｙから６ｃｍの距離に上記のろ紙を入れたプラスチックシャーレを置いた。チャンバー内を２８．５ ｉｎｃｈｅｓ Ｈｇになるまで、バキュームで吸引した。目的の圧力に達したらただちに装置内にヘリウムガスを供給し、１３５０−１４５０ｐｓｉのガス圧で金粒子を細胞に打ち込んだ。打ち込み後ただちにチャンバー内を常圧に戻し、プラスチックシャーレを取り出した。クリーンベンチ内で細胞を付着させたろ紙の面を下にして５０ｍｌの改変ＳＷＭ−ＩＩＩ培地入りのフラスコに加え、良く攪拌した後、２０℃で培養した。
参考文献１：Ｔｏｍａｒｕ， Ｙ．， Ｋａｔａｎｏｚａｋａ， Ｎ．， Ｎｉｓｈｉｄａ， Ｋ．， Ｓｈｉｒａｉ， Ｙ．， Ｔａｒｕｔａｎｉ， Ｋ．， Ｙａｍａｇｕｃｈｉ， Ｍ． Ｎａｇａｓａｋｉ， Ｋ． （２００４） Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｗｏ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｔｙｐｅｓ ｏｆ ＨｃＲＮＡＶ， ａ ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｎｇ ｔｈｅ ｂｉｖａｌｖｅ−ｋｉｌｌｉｎｇ ｍｉｃｒｏａｌｇａ Ｈｅｔｅｒｏｃａｐｓａ ｃｉｒｃｕｌａｒｉｓｑｕａｍａ． Ａｑｕａｔ． Ｍｉｃｒｏｂ． Ｅｃｏｌ．， ３４（３）： ２０７−２１８．
【００１４】
ノザンハイブリダイゼーションによる宿主細胞内でのウイルス複製の確認
接種直後および接種４８時間後にサンプルを採取し、常法によりＲＮＡ抽出、電気泳動、メンブレンへの転写を行った。メンブレンはＨｃＲＮＡＶのマイナス鎖を特異的に検出する、ジゴキシゲニン標識ＲＮＡプローブとハイブリダイズした。ＲＮＡプローブの転写には、ＨｃＲＮＡＶのＯＲＦ−２の配列を保持するｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ＋ （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を制限酵素ＢａｍＨＩで切断後、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ）を用いてジゴキシゲニン−１１−ＵＴＰ（Ｒｏｃｈ）存在下でＲＮＡを転写し、添付のプロトコルに従い精製した。ジゴキシゲニン標識ＲＮＡプローブとハイブリダイズしたメンブレンは常法により洗浄し、抗ジコキシゲニン抗体と反応後、抗体に結合したアルカリフォスファターゼとＣＤＰ−Ｓｔａｒ （Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ−Ｌａｂ）の反応によって得られる化学発光を微弱発光検出装置ＬＡＳ−３０００ｍｉｎｉ（Ｆｕｊｉ Ｆｉｌｍ）を用いて検出した。
【００１５】
透過型電子顕微鏡観察による宿主細胞内でのウイルス複製の確認
打ち込みから約４８時間後にサンプルを採取し、常法により固定包埋処理後、ＪＥＯＬ社製ＪＥＭ−１０１０透過型電子顕微鏡による細胞断面の観察を行った。
【００１６】
ＭＰＮ法による宿主細胞内で複製したウイルスの感染性の確認
ウイルス力価の測定を目的とし、以下のようにＭＰＮ法による最確数の算定を行った。上述の培養で溶藻が確認された培養液を、改変ＳＷＭ−ＩＩＩ培地で１００−１０−６倍に段階希釈し、各希釈液１００μｌを対数増殖中のＨｅｔｅｒｏｃａｐｓａ ｃｉｒｃｕｌａｒｉｓｑｕａｍａ ＨＣＬＧ−１株の培養液１５０μｌに接種した。実験には９６穴マイクロプレートを使用し、各希釈段階につき８本立てで接種を行った。また、改変ＳＷＭ−ＩＩＩ培地のみを接種したものを対照区として設けた。これらを上述の条件下で１４日間培養した。各希釈段階で溶藻が起こったウェル数から西原らの計算ソフトを用いて最確数を算出した（西原力， 蔵野憲秀， 篠田純男． マイクロコンピュータによる最確数の計算． 衛生化学３２（３）： ２２６−２２８（１９８６））。
【００１７】
結果
ウイルス（ＨｃＲＮＡＶ１０９）からのＲＮＡ抽出操作により、タンパク質画分を完全に除ききったウイルスゲノム画分を得た。これを遺伝子銃により、Ｈｅｔｅｒｏｃａｐｓａ ｃｉｒｃｕｌａｒｉｓｑｕａｍａ ＨＣＬＧ−１株に打ち込んだ後、培養した結果、接種後４８時間には細胞内でＨｃＲＮＡＶ１０９のマイナス鎖の出現がノザンハイブリダイゼーションにより確認された（図１）。ＨｃＲＮＡＶはプラス鎖１本鎖ＲＮＡウイルスであることから、マイナス鎖の出現は、ＨｃＲＮＡＶ１０９が細胞内で複製されていた証左となる。すなわち、本実施例により、ＨｃＲＮＡＶ１０９のゲノム画分を遺伝子銃により打ち込んだＨｅｔｅｒｏｃａｐｓａ ｃｉｒｃｕｌａｒｉｓｑｕａｍａ ＨＣＬＧ−１株細胞内でＨｃＲＮＡＶ１０９が複製されていたことが示された。
接種後４８時間目の細胞を、固定・包埋・薄切後、透過型電子顕微鏡観察を行った結果、宿主細胞内でのウイルス複製が確認された（図２）。また、同じ試料の力価を未固定のままＭＰＮ法により測定した結果、約４×１０４感染単位／ｍｌと推算された。
以上の結果から、ＨｃＲＮＡＶ１０９のＲＮＡをＨｅｔｅｒｏｃａｐｓａ ｃｉｒｃｕｌａｒｉｓｑｕａｍａ ＨＣＬＧ−１株細胞内に接種することにより、成熟したＨｃＲＮＡＶ１０９を再生することができることが確認された。
【００１８】
〔実施例２〕
材料および方法
【００１９】
供試したウイルス単離源
２００１年６月２８日オホーツク海域（調査定点ＯＨ６）にて採取し、４℃で保存していた海底泥をオートクレーブ（１２１℃，１５分）により滅菌した。冷却後、５０ｍｌチューブに供試泥５ｇを計りとり、ウイルス懸濁液（ＨｃＲＮＡＶ１０９，タイター７．３×１０１０／ｍｌ）１ｍｌを添加して攪拌を行った。対照区にはウイルス懸濁液と等量の改変ＳＷＭ−ＩＩＩ培地を添加した。添加ウイルスを泥になじませるため、４℃で一晩をインキュベートした。
【００２０】
泥試料からのウイルス画分の精製
インキュベート後、２５ｍｌのＳＷＭ−ＩＩＩ培地を底泥入りのチューブに添加し、常温で４００ｒｐｍ，３０分間の攪拌を行った。攪拌にはＴＡＩＴＥＣ社製ＶｏｒｔｅｘＳｈａｋｅｒ ＶＲ−３６を使用した。攪拌後、２０００ｒｐｍ，４℃，１０分間の遠心処理を行い、上清画分を採取した（ウイルス添加区２３．５ｍｌ、対照区２４．５ｍｌ）。上清にＳＷＭ−ＩＩＩ培地を添加し、総量が７０．５ｍｌになるように調整した。このうち０．５ｍｌはタイター測定のためのＭＰＮアッセイに使用した。残りの７０ｍｌに対して７ｇのポリエチレングリコール（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ ６０００、和光純薬）を添加し、４℃で一晩インキュベートした。これに２２０００ｒｐｍ（５７，０００ × ｇ），４℃，１．５時間の遠心処理を施した後、上清を捨て、沈殿物をリン酸緩衝液（１０ ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１０ ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４）に懸濁して回収した。さらに３５０００ ｒｐｍ（２１７，０００ × ｇ），４℃，４時間の遠沈処理を行った後、上清を捨て沈殿物（ウイルスペレット）を得た。沈殿物はゲノム抽出まで−８０℃で保存した。
【００２１】
ＲＮＡ採取と宿主細胞への打ち込み
ＲＮＡ抽出および宿主細胞への打ち込み操作は、実施例１と同様の工程により行った。
【００２２】
ノザンハイブリダイゼーションによる宿主細胞内でのウイルス複製の確認
ノザンハイブリダイゼーションによる宿主細胞内でのウイルス複製の確認実験は、実施例１と同様の工程により行った。
【００２３】
結果
ウイルス（ＨｃＲＮＡＶ１０９）を添加した底泥試料からのＲＮＡ抽出操作により、タンパク質画分を完全に除ききった環境ゲノム画分を得た。これを遺伝子銃により、Ｈｅｔｅｒｏｃａｐｓａ ｃｉｒｃｕｌａｒｉｓｑｕａｍａ ＨＣＬＧ−１株に打ち込んだ後、培養した結果、接種から４８時間後には細胞内でのＨｃＲＮＡＶ１０９マイナス鎖の出現がノザンハイブリダイゼーションにより確認された（図３）。この結果は、ＨｃＲＮＡＶ１０９ゲノムＲＮＡが細胞内で複製されていたことを示す。すなわち、本方法により、環境中のウイルスの単離が可能であることを示すものである。
【００２４】
このように、本発明者らは、環境試料から抽出したウイルス画分または核酸を、遺伝子銃、エレクトロポレーション、またはポリエチレングリコール処理等の方法により直接的に目的とする宿主細胞内に導入することによる新規ウイルスの単離技術を開発した。ウイルス画分または核酸の抽出対象は、たとえば動植物の死骸、土壌、陸水、海水、または水圏の底性堆積物であればよい。また、ウイルスの単離を目的とする宿主細胞は、動物、植物、菌類、原生生物、および原核生物であるとよい。また、ウイルスの単離を目的とする宿主細胞は、人畜および植物に対して病原性を持つ生物、有毒アオコ原因藍藻、有害赤潮原因プランクトン、または有毒プランクトンであってもよい。また本発明は、上記の技術により得られたウイルス懸濁液をフィルターで濾過し、得られた濾液を該当する培養液に接種して培養を行い、宿主の死滅又は増殖阻害が観察された培養液を限界希釈することによりウイルスをクローニングする工程を含む（図４）。
【産業上の利用可能性】
【００２５】
本発明により、環境試料から抽出したウイルス画分または核酸を、遺伝子銃、エレクトロポレーション、またはポリエチレングリコール処理等の方法により直接的に目的とする宿主細胞内に導入することによる新規ウイルスの単離技術が開発された。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】ＨｃＲＮＡＶ１０９より抽出したゲノムＲＮＡをＨｅｔｅｒｏｃａｐｓａ ｃｉｒｃｕｌａｒｉｓｑｕａｍａ ＨＣＬＧ−１株に打ち込んだ実験区におけるＨｃＲＮＡＶ１０９マイナス鎖検出結果。打ち込み後２４時間目から４８時間目にかけてＨｃＲＮＡＶ１０９マイナス鎖の存在が確認できる。すなわちこの結果は、Ｈｅｔｅｒｏｃａｐｓａ ｃｉｒｃｕｌａｒｉｓｑｕａｍａ ＨＣＬＧ−１株細胞内においてＨｃＲＮＡＶ１０９ゲノムＲＮＡの転写によるマイナス鎖の出現がおき、ウイルスゲノムが複製されていたことを示す。
【図２】ＨｃＲＮＡＶ１０９より抽出したゲノムＲＮＡをＨｅｔｅｒｏｃａｐｓａ ｃｉｒｃｕｌａｒｉｓｑｕａｍａ ＨＣＬＧ−１株に打ち込んだ実験区における、打ち込み後４８時間目の細胞断面の透過型電子顕微鏡像。ウイルスの複製が確認される。これらのウイルス粒子は、接種試験の結果、感染性を有することが確認された。
【図３】ＨｃＲＮＡＶ１０９を含む底泥試料より抽出したゲノムＲＮＡをＨｅｔｅｒｏｃａｐｓａ ｃｉｒｃｕｌａｒｉｓｑｕａｍａ ＨＣＬＧ−１株に打ち込んだ実験区における打ち込み後４８時間目のＨｃＲＮＡＶ１０９マイナス鎖検出結果（５−４８）。１−０および５−０は打ち込み前、１−４８はＨｃＲＮＡＶ１０９を添加しなかった底泥試料より抽出したゲノムＲＮＡをＨｅｔｅｒｏｃａｐｓａ ｃｉｒｃｕｌａｒｉｓｑｕａｍａ ＨＣＬＧ−１株に打ち込んだ実験区における４８時間目のＨｃＲＮＡＶ１０９マイナス鎖検出結果。これらの結果から、底泥試料より抽出したゲノムＲＮＡをＨｅｔｅｒｏｃａｐｓａ ｃｉｒｃｕｌａｒｉｓｑｕａｍａ ＨＣＬＧ−１株に打ち込むことで、ウイルスを複製させることが可能であることが確認された。
【図４】本発明によるウイルス単離技術のスキーム。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
環境試料からの新規ウイルスの分離方法であって、環境試料から抽出したウイルス画分または核酸を、遺伝子銃、エレクトロポレーションおよびポリエチレングリコール処理からなる群から選択される少なくとも一つの遺伝子導入方法により直接的に目的とする宿主細胞内に導入することを特徴とする新規ウイルスの分離方法。
【請求項２】
ウイルス画分または核酸の抽出対象が、動植物の死骸、土壌、陸水、海水および水圏の底性堆積物からなる群から選択される少なくとも一つである請求項１記載の新規ウイルスの分離方法。
【請求項３】
前記宿主細胞が、動物、植物、菌類、原生生物および原核生物からなる群から選択される少なくとも一つである請求項１または２記載の新規ウイルスの分離方法。
【請求項４】
前記宿主細胞が、人畜および植物に対して病原性を持つ生物、有毒アオコ原因藍藻、有害赤潮原因プランクトンおよび有毒プランクトンからなる群から選択される少なくとも一つである請求項１または２記載の新規ウイルスの分離方法。
【請求項５】
請求項１から４のいずれか一項に記載の分離方法により得られたウイルス懸濁液をフィルターで濾過し、得られた濾液を、前記宿主細胞の培養に用いる培養液に接種して培養を行い、前記宿主細胞の死滅又は増殖阻害が観察された培養液を限界希釈することによりウイルスをクローニングする工程を含む、新規ウイルスの分離方法。
【請求項１】
環境試料からの新規ウイルスの分離方法であって、環境試料から抽出したウイルス画分または核酸を、遺伝子銃、エレクトロポレーションおよびポリエチレングリコール処理からなる群から選択される少なくとも一つの遺伝子導入方法により直接的に目的とする宿主細胞内に導入することを特徴とする新規ウイルスの分離方法。
【請求項２】
ウイルス画分または核酸の抽出対象が、動植物の死骸、土壌、陸水、海水および水圏の底性堆積物からなる群から選択される少なくとも一つである請求項１記載の新規ウイルスの分離方法。
【請求項３】
前記宿主細胞が、動物、植物、菌類、原生生物および原核生物からなる群から選択される少なくとも一つである請求項１または２記載の新規ウイルスの分離方法。
【請求項４】
前記宿主細胞が、人畜および植物に対して病原性を持つ生物、有毒アオコ原因藍藻、有害赤潮原因プランクトンおよび有毒プランクトンからなる群から選択される少なくとも一つである請求項１または２記載の新規ウイルスの分離方法。
【請求項５】
請求項１から４のいずれか一項に記載の分離方法により得られたウイルス懸濁液をフィルターで濾過し、得られた濾液を、前記宿主細胞の培養に用いる培養液に接種して培養を行い、前記宿主細胞の死滅又は増殖阻害が観察された培養液を限界希釈することによりウイルスをクローニングする工程を含む、新規ウイルスの分離方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２００９−１６５３５４（Ｐ２００９−１６５３５４Ａ）
【公開日】平成２１年７月３０日（２００９．７．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−１２２１２２（Ｐ２００６−１２２１２２）
【出願日】平成１８年４月２６日（２００６．４．２６）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 発表した刊行物： 「第５３回日本ウイルス学会学術集会プログラム・抄録集」 発行者名：第５３回日本ウイルス学会学術集会 会長 野本 明男 発行年月日：平成１７年１１月１日 発表した刊行物： 「２００６年（平成１８年）度日本水産学会大会（日本農学大会水産部会）講演要旨集」 発行者名：２００６年（平成１８年）度日本水産学会大会 国立大学法人 高知大学 農学部 発行年月日：平成１８年３月３０日 発表した研究集会：第５３回日本ウイルス学会学術集会（年会） 主催者名：日本ウイルス学会 開催日：平成１７年１１月２０日〜平成１７年１１月２２日 発表日：平成１７年１１月２１日〜２２日 発表した研究集会：平成１８年度日本水産学会大会（日本農学大会水産部会） 主催者名：日本水産学会 開催日：平成１８年３月２９日〜平成１８年４月２日 発表日：平成１８年４月１日
【出願人】（５０６１４４２１５）
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年７月３０日（２００９．７．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年４月２６日（２００６．４．２６）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 発表した刊行物： 「第５３回日本ウイルス学会学術集会プログラム・抄録集」 発行者名：第５３回日本ウイルス学会学術集会 会長 野本 明男 発行年月日：平成１７年１１月１日 発表した刊行物： 「２００６年（平成１８年）度日本水産学会大会（日本農学大会水産部会）講演要旨集」 発行者名：２００６年（平成１８年）度日本水産学会大会 国立大学法人 高知大学 農学部 発行年月日：平成１８年３月３０日 発表した研究集会：第５３回日本ウイルス学会学術集会（年会） 主催者名：日本ウイルス学会 開催日：平成１７年１１月２０日〜平成１７年１１月２２日 発表日：平成１７年１１月２１日〜２２日 発表した研究集会：平成１８年度日本水産学会大会（日本農学大会水産部会） 主催者名：日本水産学会 開催日：平成１８年３月２９日〜平成１８年４月２日 発表日：平成１８年４月１日
【出願人】（５０６１４４２１５）
【Ｆターム（参考）】
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