新規ベクター及びその利用
遺伝子を宿主で組換え発現して蛋白質を得る作業の手間を軽減させるためのツールを提供する。 第一の制限酵素によって認識される塩基配列の異なる２つの切断認識配列を持ち、そのうち一方の切断認識配列は第一の制限酵素とは異なる第二の制限酵素によって認識される切断認識配列の一部を含むが、他方の切断認識配列は前記の第二の制限酵素によって認識される切断認識配列の一部を含まないことを特徴とするベクター。前記ベクターを利用して蛋白質及び／又は蛋白質ドメインを製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規ベクター及びその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般的にポストゲノム研究といわれている構造プロテオミクス・機能プロテオミクスと言われる学問分野において、さまざまな遺伝子産物を同時並行的に大腸菌で組換え発現して蛋白質試料を取得する技術は非常に重要である。
【０００３】
従来、目的遺伝子を使って蛋白質試料を取得するには、まず、目的遺伝子をＰＣＲ法で増幅し、ＰＣＲ産物をサブクローニング用ベクターに組み込み、これで宿主を形質転換させ、形質転換した宿主の単コロニーを形成させ、各コロニー由来の宿主からプラスミドを精製し、プラスミドの塩基配列を決定することにより、目的遺伝子が挿入されているクローンを選択していた。その後、選択したクローンから、制限酵素により目的遺伝子を含むＤＮＡ断片を切り出し、切り出したＤＮＡ断片を精製してから、融合蛋白質発現ベクターに組み込み、これで宿主を形質転換させ、形質転換した宿主の単コロニーを形成させ、各コロニー由来の宿主からプラスミドを精製し、精製したプラスミドで発現用宿主を形質転換して、目的遺伝子がコードする蛋白質を発現させていた。以上の操作は最速で９日という時間を要するものであり、かつ、制限酵素によりサブクローニング用ベクターから目的遺伝子を含むＤＮＡ断片を切り出す工程及び切り出したＤＮＡ断片を精製する工程は熟練を要するものであった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、遺伝子を宿主で組換え発現して蛋白質を得る作業の手間を軽減させるためのツールを提供することを目的とする。
【０００５】
また、本発明は、上記のツールを利用して、遺伝子がコードする蛋白質を製造する方法を提供することも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
ＰＣＲ法に用いられる酵素のうち、もっとも代表的なＴａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ／Ｔｔｈ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅなどでは、複製されたＤＮＡ産物の３’末端に鋳型に依存せずにｄＡを一残基付加するという副反応の活性があることが知られている。そのため、ＰＣＲ法を用いて増幅させた二本鎖ＤＮＡ断片の大部分にはｄＡが一残基付加した３’端突出構造を有する。
【０００７】
ここで、ｄＡと相補な塩基対を形成するｄＴを３’端に突出させた構造をもつｐｌａｓｍｉｄ ｖｅｃｔｏｒを用意して、上記ＰＣＲ増幅産物と混合すると、速やかに１塩基の突出末端を利用した塩基対生成がおこり、そこにＤＮＡ ｌｉｇａｓｅを混合してやるとｖｅｃｔｏｒとＰＣＲ増幅産物のｌｉｇａｔｉｏｎ反応が起こる。一方でＤＮＡ ｌｉｇａｓｅはミスマッチを有するＤＮＡ末端同士のｌｉｇａｔｉｏｎ反応をおこなわないため、ＰＣＲ増幅産物を含まずにｐｌａｓｍｉｄ ｖｅｃｔｏｒ単体のみでｌｉｇａｔｉｏｎして自己環化してしまう産物はきわめて生成しにくい、という現象が知られている。
【０００８】
この性質を利用して３’−ｄＴ突出構造を持つ開環ｖｅｃｔｏｒ（Ｔ−ｖｅｃｔｏｒ）をあらかじめ作成しておき、それにＰＣＲ産物を制限酵素による処理や末端の平滑化処理を行うことなく、混合してｌｉｇａｔｉｏｎを行う方法を、ＴＡ−ｃｌｏｎｉｎｇ法と呼ぶ。
【０００９】
Ｔ−ｖｅｃｔｏｒ作成法には原理的に３種類が知られている。
【００１０】
第一の方法は、ＴｄＴを用いる方法である。ＴｄＴ（Ｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｅｏｘｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）はＤＮＡ末端に鋳型非依存的に任意のｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅを付加する酵素である。したがって、ｐｌａｓｍｉｄをまず平滑末端を与える制限酵素で切断し、次にｄＴＴＰ存在下ＴｄＴを作用させれば、３’にｄＴが１個ないし複数個付加したベクターが作成できる。ただし、この方法でＴ−ｖｅｃｔｏｒが作成された報告例はないようだ。
【００１１】
第二の方法は、Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅのＴｄＴ活性を用いる方法である。上述のようにＰＣＲ反応液中ではＴａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅはＤＮＡの平滑末端に１分子だけｄＡを付加する。ところがＭｇ２＋過剰量存在下、ｄＮＴＰのうちｄＴＴＰのみ存在下の条件でＤＮＡの平滑末端にＴａｑを作用させると、ＤＮＡに１残基のｄＴを付加するのでこの性質を用いてＴ−ｖｅｃｔｏｒを作製することが可能である。したがって、ｐｌａｓｍｉｄを平滑末端を与える制限酵素で切断し、そこにｄＴＴＰ・Ｍｇ２＋存在下Ｔａｑを作用させれば、３’にｄＴが１個付加したベクターが作成できる。この方法では平滑末端を生成するときに用いる制限酵素の認識配列によって、Ｔ突出末端の生成効率が著しく変わるようである。報告されている例のほとんどはＥｃｏ ＲＶを使用した例であり、ＳｍａＩを利用した場合は効率が悪いことが知られている。それを回避する方法がＷＷＷ上で公開されている。
【００１２】
第三の方法は、Ｔ−突出末端を直接生成する制限酵素部位を二ヶ所もっている「カセット」ＤＮＡ配列を設計して、それを制限酵素で消化する方法である。３’−Ｔ−残基突出末端を生成しうるような制限酵素を実際のＴ−ｖｅｃｔｏｒに用いた例としてはＸｃｍＩ、Ｅａｍ１１０５１、ＡｈｄＩの例がそれぞれ論文にて報告されている。この方法では、上記制限酵素サイトを二ヶ所含む「カセット」ＤＮＡ配列を設計し、目的とするｐｌａｓｍｉｄに上記カセットを挿入した後、上記ｐｌａｓｍｉｄを当該制限酵素で切断すると、両側がｄＴ突出末端となった開環状ｐｌａｓｍｉｄが作製できる。（今回、本発明者らはＡｈｄＩを用いてＴ−ｖｅｃｔｏｒを作製した。この方法を用いると、「非対称的な」ｄＴ突出末端となった開環状ｐｌａｓｍｉｄをデザインすることができる。また、この方法では得られた開環状ｐｌａｓｍｉｄはほぼ１００％がｄＴ突出末端となっていることが期待され、非常に高品質である。）
【００１３】
しかし、従来のＴＡ−ｃｌｏｎｉｎｇ法には欠点がある。それはベクターに挿入される目的遺伝子の方向性が、制御できないことである。その結果、たとえばいままでＴ−ｖｅｃｔｏｒとして作製されてきたｐｌａｓｍｉｄのほとんどは（１）未知遺伝子クローニング（またはサブクローニング）用のベクター、（２）新規プロモーター活性を有する遺伝子のクローニング用ベクターの二種類のみの応用が主であり、蛋白質として発現する領域（ＯＲＦ）を直接発現ベクターにＴＡ−ｃｌｏｎｉｎｇするためのＴ−ｖｅｃｔｏｒは例が少なかった。上記の利用法ではＯＲＦの方向性は問題にならない。蛋白質発現実験を行う場合にのみ、ＯＲＦの方向性が問題になるのである。（今回、本発明者らは、順方向のみに外来遺伝子（ＰＣＲ産物）が挿入されたｐｌａｓｍｉｄを簡便に選択するために、逆方向に外来遺伝子が挿入された場合にのみ制限酵素ＮｃｏＩまたはＮｄｅＩの切断配列が出現するような配列をデザインした。これにより順方向でグルタチオンＳ転移酵素［ＧＳＴ］などとの融合蛋白質を発現するｐｌａｓｍｉｄのみを選択的に大腸菌に形質転換することが可能となる。）
【００１４】
ところで、外来遺伝子をＧＳＴ融合蛋白質として大腸菌で発現させるためのｖｅｃｔｏｒは市販品としてＳｊｉｓｔｏｓｏｍａ Ｊａｐｏｎｉｃｕｍ由来ＧＳＴのコード領域の後ろにプロテアーゼ認識切断配列・マルチクローニングサイトを備えたｐＧＥＸシリーズがアマシャムファルマシアバイオテク社より市販されている。ＧＳＴ融合蛋白質は、比較的溶解度が高く、大腸菌内での蛋白質発現量が良好であること、グルタチオン固定化担体（ビーズ）を利用したアフィニティークロマトグラフィーを持ちいればほぼ１ステップで蛋白質が精製可能であること、グルタチオンビーズ上に目的融合蛋白質を固定化した状態で、さらにその標的分子（蛋白質・核酸・低分子など）との相互作用を容易に観察する方法があること（ｐｕｌｌ−ｄｏｗｎ ａｓｓａｙ）、タグを持たない蛋白質よりも表面プラズモン共鳴による分子間相互作用実験の計測チップに固定化する際に機能を損ないにくいこと、などから、生化学・分子生物学などで非常に汎用されている発現ベクターの一つである。このベクターをＴＡ−ｖｅｃｔｏｒに改良することで、多くの種類・長さの蛋白質や蛋白質断片を発現する発現系を、並行で作製することは、非常に有用であると考えた。
【００１５】
ゲノムプロジェクトの終了後、機能性蛋白質ならびに蛋白質の機能ドメインを同定して、それを産業に応用するために、その立体構造の決定と分子機能の決定の双方の高速化が重要となってきている。そのためには一連の研究に使用可能な活性を保持した蛋白質試料を、可溶性の蛋白質として得る必要がある。一般にヒトあるいは哺乳類・植物由来の蛋白質の全長または一部分の遺伝子を大腸菌で発現させる場合に、蛋白質が不溶化して構造・機能解析の試料調製に困難をきたすケースが非常に多い。そのような場合、蛋白質として発現させる領域・長さを変えたり（この手法をドメインマッピングまたはドメイン化と呼ぶ）、アミノ酸の部位特異的変異を一ヶ所あるいは数ヶ所導入することで溶解度が劇的に向上する例が知られている。同じ手法はまた、可溶性として得られた蛋白質に対して、その立体構造決定を目的としたＮＭＲ試料作成や結晶化の際の溶解度向上や結晶性改善の過程においても用いられる。このうち、多種類の遺伝子断片を並行して取得する過程は、ＰＣＲ法の進歩と、ＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒの化学合成の価格の低減によって、短期間・低コストで可能になった。従って現時点での技術的課題は、発現系を作製する際の人的・時間的コストと、目的の当該蛋白質が可溶性かどうかを迅速に区別する方法である。ＧＳＴ融合蛋白質をこの目的に用いるメリットは、ＧＳＴ融合蛋白質を含む大腸菌破砕物を遠心操作により可溶性・不溶性画分に分けた後、大腸菌粗蛋白質混合物中で、ＧＳＴ融合蛋白質の量をＧＳＴの酵素活性を指標に発色反応を行うことで、たとえば９６穴ｐｌａｔｅ上で並行で短時間に比色定量測定することが可能な点である。
【００１６】
以上のことを踏まえ、本発明者らは以下のことを試みた。
１．ＧＳＴ−Ｔ ｖｅｃｔｏｒの作製を上述の「ＳｍａＩ／Ｔａｑ」を用いた方法を用いて試作した。一応それらしきものの完成をみるが、再現性がなく、またＰＣＲ産物のサブクローニングの効率も悪いため実用性がなかった。
２．ＳｍａＩ／Ｔａｑで行った場合の効率を改善するための改良法をＷＷＷ上の文書から取得したのでそれを試したが、改善は見られなかった。
３．ＳｍａＩにより切断された平滑末端の塩基配列が低い効率の原因ではないかと考え、ＢａｍＨＩ切断による突出末端をＫｌｅｎｏｗ ｆｒａｇｍｅｎｔで平滑化したのち、ＴａｑでｄＴを付加するという独自の改良法も試みたが改善しなかった。
４．上述の「制限酵素カセットを用いる方法」に戦略変更し、制限酵素としてＡｈｄＩを用いることにした。
５．ｐＧＥＸ−２Ｔ／ｐＧＥＸ−４Ｔ３（ＧＳＴ融合ベクター）に限らず、抗生物質耐性を持っているｐｌａｓｍｉｄにＡｈｄＩを作用させると、そのａｍｐｉｃｉｌｉｎ耐性遺伝子が切断されることが判明した。そこでサイレントな部位特異的変異を導入してＡｍｐ耐性遺伝子に含まれるＡｈｄＩ切断部位を変異させたｐＧＥＸ−４Ｔ３を作製した。（部位特異的変異の導入に使用したｐｒｉｍｅｒ＝Ａｎｔｉ ＡｈｄＩの配列を配列表の配列番号２１に示した）。
６．ＡｈｄＩ−ｌｉｎｋｅｒを作製した。すなわち、配列番号２２及び２３の配列のＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒを利用して、鋳型としてｐＥＴ３２ａ（Ｎｏｖａｇｅｎｅ社製）の誘導体ｐＥＴ３２ａＰＡＣＡＰを用いてＰＣＲを行い、約５００ｂｐの断片を得て、これを既存のＴＡ−ｖｅｃｔｏｒ（今回はＰｒｏｍｅｇａ製品ｐＧＥＭ−Ｔ）に定法により組み込み、配列を確認したのちクローンを増幅して、精製したｐｌａｓｍｉｄを得、このｐｌａｓｍｉｄにＢａｍＨＩを作用させるとＡｈｄ−Ｉ ｌｉｎｋｅｒ（約５００ｂｐ）ができた。
７．ＧＳＴ−Ｔ ｖｅｃｔｏｒ（ＧＳＴ−Ｔ ｖｅｃｔｏｒ：ＧＳＴ融合のＴＡ−ｖｅｃｔｏｒの意）の母体となるｖｅｃｔｏｒを作製した。すなわち、５によって得たｐＧＥＸ−４Ｔ３の変異体を増幅し、ＢａｍＨＩで切断し、そのＢａｍＨＩサイトに６で得たＡｈｄＩ ｌｉｎｋｅｒを挿入し、ｌｉｇａｔｉｏｎにより閉環させた。正しく作製されたクローンを単離し、増幅した。なおこの段階のＡｈｄＩ ｌｉｎｋｅｒには原理上、方向性は存在しない（どちら向きで入っていてもかまわない）
８．ＧＳＴ−Ｔ ｖｅｃｔｏｒを作製した。すなわち、７をＡｈｄＩで切断して、開環状ｐｌａｓｍｉｄをａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌで分離精製した。このベクターは、３’にｄＴ突出末端を有するため、ＴＡ−ｃｌｏｎｉｎｇに利用できる。
９．ＮｃｏＩを作用させた時に、逆方向に外来遺伝子が挿入されたベクター（例えば、プラスミド）が切断され、該ベクターが導入された宿主は生育できず、その結果、順方向で外来遺伝子が挿入されたベクターが導入された宿主のみの選択をすること（ＮｃｏＩ ＯＲＦ選択法）に利用可能なＡｈｄＩ ｌｉｎｋｅｒを作製した。作製法は６と同じであるが、ｐｒｉｍｅｒに配列番号２２及び２４の配列の組を用いた。作製されたＮｃｏＩ ＯＲＦ選択法適用可能なＡｈｄＩ ｌｉｎｋｅｒの配列を配列番号２６及び２７に示す。配列番号２６の配列を有するＤＮＡ鎖と配列番号２７の配列を有するＤＮＡ鎖とが会合して形成する２本鎖ＤＮＡがＡｈｄＩ ｌｉｎｋｅｒである。
１０．ＮｃｏＩ ＯＲＦ選択法が可能なｄＧＳＴ−Ｔ ｖｅｃｔｏｒ（ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ＧＳＴ−Ｔ ｖｅｃｔｏｒ：ＯＲＦの方向選択が可能なＧＳＴ−Ｔ ｖｅｃｔｏｒの意）を作製した。作製法は上記７・８と同じである。ただし７に対応するときの配列確認時に、ＧＳＴとの融合部分でｐｒｉｍｅｒの配列番号２２に相当する配列が５’側（ＧＳＴ側）に来ているものを選択して、ＮｃｏＩ ＯＲＦ選択法の可能なベクターの母体となる閉環状ベクターを得た。また、このベクターは、挿入される外来遺伝子を増幅するＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒの設計を変更すれば、ＮｃｏＩの代わりにＮｄｅＩを作用させて、逆方向に外来遺伝子が挿入されたベクター（例えば、プラスミド）が切断され、該ベクターが導入された宿主は生育できず、その結果、順方向で外来遺伝子が挿入されたベクターが導入された宿主のみの選択（ＮｄｅＩ ＯＲＦ選択法）も可能であった。
【００１７】
本発明は以上の実験の経緯および結果に基づいて完成されたものである。
本願の第１発明は、第一の制限酵素によって認識される塩基配列の異なる２つの切断認識配列を持ち、そのうち一方の切断認識配列は第一の制限酵素とは異なる第二の制限酵素によって認識される切断認識配列の一部を含むが、他方の切断認識配列は前記の第二の制限酵素によって認識される切断認識配列の一部を含まないことを特徴とするベクターを提供する。
第一の制限酵素は、切断したＤＮＡに３’突出末端を生成する制限酵素であるとよく、３’突出末端の塩基としてはチミンを例示することができる。
第一の制限酵素はＡｈｄＩまたはそのイソスキゾマー、ＸｃｍＩまたはそのイソスキゾマー、およびその組み合わせからなる群より選択されるとよい。
第一の制限酵素がＡｈｄＩまたはそのイソスキゾマーである場合、ＡｈｄＩによって認識される塩基配列の異なる２つの切断認識配列の一方が下記の配列（Ｉ）及び（ＩＩ）で表され、他方が下記の配列（ＩＩＩ）及び（ＩＶ）で表されることが好ましい。
５’−ＧＡＣＸ１ａＸ２ａＴＸ３ａＸ４ａＧＴＣ−３’（Ｉ）
３’−ＣＴＧＸ１ｂＸ２ｂＡＸ３ｂＸ４ｂＣＡＧ−５’（ＩＩ）
５’−ＧＡＣＸ５ａＸ６ａＡＸ７ａＸ８ａＧＴＣ−３’（ＩＩＩ）
３’−ＣＴＧＸ５ｂＸ６ｂＴＸ７ｂＸ８ｂＣＡＧ−５’（ＩＶ）
（配列（Ｉ）〜（ＩＶ）中、Ｇはグアニン、Ａはアデニン、Ｃはシトシン、Ｔはチミンであり、
Ｘ１ａ〜Ｘ８ａ及びＸ１ｂ〜Ｘ８ｂはそれぞれ独立にグアニン、アデニン、シトシンまたはチミンのいずれかの塩基であり、Ｘ１ａとＸ１ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｘ２ａとＸ２ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｘ３ａとＸ３ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｘ４ａとＸ４ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｘ５ａとＸ５ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｘ６ａとＸ６ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｘ７ａとＸ７ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｘ８ａとＸ８ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、
配列ＣＸ１ａＸ２ａＴは第二の制限酵素の切断認識配列の５’側の部分配列を含む塩基配列であり、
配列ＣＸ８ｂＸ７ｂＴは配列ＣＸ１ａＸ２ａＴに含まれるところの第二の制限酵素の切断認識配列の部分配列を含まない塩基配列であり、
５’−及び３’−は２本鎖ＤＮＡのそれぞれの末端を示す。）
第一の制限酵素がＸｃｍＩまたはそのイソスキゾマーである場合、ＸｃｍＩによって認識される塩基配列の異なる２つの切断認識配列の一方が下記の配列（Ｖ）及び（ＶＩ）で表され、他方が下記の配列（ＶＩＩ）及び（ＶＩＩＩ）で表されることが好ましい。
５’−ＣＣＡＹ１ａＹ２ａＹ３ａＹ４ａＴＹ５ａＹ６ａＹ７ａＹ８ａＴＧＧ−３’（Ｖ）
３’−ＧＧＴＹ１ｂＹ２ｂＹ３ｂＹ４ｂＡＹ５ｂＹ６ｂＹ７ｂＹ８ｂＡＣＣ−５’（ＶＩ）
５’−ＣＣＡＹ９ａＹ１０ａＹ１１ａＹ１２ａＡＹ１３ａＹ１４ａＹ１５ａＹ１６ａＴＧＧ−３’（ＶＩＩ）
３’−ＧＧＴＹ９ｂＹ１０ｂＹ１１ｂＹ１２ｂＴＹ１３ｂＹ１４ｂＹ１５ｂＹ１６ｂＡＣＣ−５’（ＶＩＩＩ）
（配列（Ｖ）〜（ＶＩＩＩ）中、Ｇはグアニン、Ａはアデニン、Ｃはシトシン、Ｔはチミンであり、
Ｙ１ａ〜Ｙ１６ａ及びＹ１ｂ〜Ｙ１６ｂはそれぞれ独立にグアニン、アデニン、シトシンまたはチミンのいずれかの塩基であり、Ｙ１ａとＹ１ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ２ａとＹ２ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ３ａとＹ３ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ４ａとＹ４ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ５ａとＹ５ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ６ａとＹ６ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ７ａとＹ７ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ８ａとＹ８ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ９ａとＹ９ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ１０ａとＹ１０ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ１１ａとＹ１１ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ１２ａとＹ１２ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ１３ａとＹ１３ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ１４ａとＹ１４ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ１５ａとＹ１５ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ１６ａとＹ１６ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、
配列Ｙ１ａＹ２ａＹ３ａＹ４ａＴは第二の制限酵素の切断認識配列の５’側の部分配列を含む塩基配列であり、
配列Ｙ１６ｂＹ１５ｂＹ１４ｂＹ１３ｂＴは配列Ｙ１ａＹ２ａＹ３ａＹ４ａＴに含まれるところの第二の制限酵素の切断認識配列の部分配列を含まない塩基配列であり、
５’−及び３’−は２本鎖ＤＮＡのそれぞれの末端を示す。）
第一の制限酵素がＡｈｄＩまたはそのイソスキゾマーとＸｃｍＩまたはそのイソスキゾマーとの組み合わせである場合、第一の制限酵素によって認識される塩基配列の異なる２つの切断認識配列のうちの一方がＡｈｄＩまたはそのイソスキゾマーによって認識される切断認識配列であり、かつＡｈｄＩまたはそのイソスキゾマーとは異なる第二の制限酵素によって認識される切断配列の一部を含むものとし、他方の切断認識配列がＸｃｍＩまたはそのイソスキゾマーによって認識される切断認識配列であり、かつ前記の第二の制限酵素によって認識される切断認識配列の一部を含まないものとしてもよい。ＡｈｄＩまたはそのイソスキゾマーによって認識される切断認識配列であり、かつＡｈｄＩまたはそのイソスキゾマーとは異なる第二の制限酵素によって認識される切断配列の一部を含む切断認識配列は、下記の配列（Ｉ）及び（ＩＩ）で表されることが好ましい。ＸｃｍＩまたはそのイソスキゾマーによって認識される切断認識配列であり、かつ第二の制限酵素によって認識される切断認識配列の一部を含まない切断認識配列は、下記の配列（ＶＩＩ）及び（ＶＩＩＩ）で表されることが好ましい。
５’−ＧＡＣＸ１ａＸ２ａＴＸ３ａＸ４ａＧＴＣ−３’（Ｉ）
３’−ＣＴＧＸ１ｂＸ２ｂＡＸ３ｂＸ４ｂＣＡＧ−５’（ＩＩ）
（配列（Ｉ）及び（ＩＩ）中、Ｇはグアニン、Ａはアデニン、Ｃはシトシン、Ｔはチミンであり、
Ｘ１ａ〜Ｘ４ａ及びＸ１ｂ〜Ｘ４ｂはそれぞれ独立にグアニン、アデニン、シトシンまたはチミンのいずれかの塩基であり、Ｘ１ａとＸ１ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｘ２ａとＸ２ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｘ３ａとＸ３ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｘ４ａとＸ４ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、
配列ＣＸ１ａＸ２ａＴは第二の制限酵素の切断認識配列の５’側の部分配列を含む塩基配列であり、
５’−及び３’−は２本鎖ＤＮＡのそれぞれの末端を示す。）
５’−ＣＣＡＹ９ａＹ１０ａＹ１１ａＹ１２ａＡＹ１３ａＹ１４ａＹ１５ａＹ１６ａＴＧＧ−３’（ＶＩＩ）
３’−ＧＧＴＹ９ｂＹ１０ｂＹ１１ｂＹ１２ｂＴＹ１３ｂＹ１４ｂＹ１５ｂＹ１６ｂＡＣＣ−５’（ＶＩＩＩ）
（配列（ＶＩＩ）及び（ＶＩＩＩ）中、Ｇはグアニン、Ａはアデニン、Ｃはシトシン、Ｔはチミンであり、
Ｙ９ａ〜Ｙ１６ａ及びＹ９ｂ〜Ｙ１６ｂはそれぞれ独立にグアニン、アデニン、シトシンまたはチミンのいずれかの塩基であり、Ｙ９ａとＹ９ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ１０ａとＹ１０ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ１１ａとＹ１１ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ１２ａとＹ１２ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ１３ａとＹ１３ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ１４ａとＹ１４ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ１５ａとＹ１５ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ１６ａとＹ１６ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、
配列Ｙ１６ｂＹ１５ｂＹ１４ｂＹ１３ｂＴは配列ＣＸ１ａＸ２ａＴに含まれるところの第二の制限酵素の切断認識配列の部分配列を含まない塩基配列であり、
５’−及び３’−は２本鎖ＤＮＡのそれぞれの末端を示す。）
第一の制限酵素がＡｈｄＩまたはそのイソスキゾマー、ＸｃｍＩまたはそのイソスキゾマー、およびその組み合わせからなる群より選択される場合、第二の制限酵素は、ＮｃｏＩ，ＤｓａＩ，ＥｃｏＴ１４Ｉ，ＮｄｅＩ，ＳｆｅＩ，ＡｖａＩ，ＳｍｌＩ，ＸｈｏＩ，ＰｓｔＩ，ＥｃｏＴ２２Ｉ，ＰｓｈＢＩ，ＡｃｃＩ，ＡｐａＬＩ，ＰｓｉＩ，ＳｃａＩ，ＳｐｌＩ，Ｂｓｐ１１０７Ｉ，Ｂｓｐ１２８６Ｉ，ＢｓｐＴ１０７Ｉ，Ｂｓｐ１４０７Ｉ，ＴａｔＩ，ＨｇｉＣＩ，ＫｐｎＩ，ＳｐｅＩ，ＢｌｎＩ，ＮｈｅＩ，ＸｂａＩ，ＳｓｐＩ，ＥｃｏＲＶおよびそれらのイソスキゾマーからなる群より選択されることが好ましい。
第一の制限酵素がＸｃｍＩまたはそのイソスキゾマーである場合、第二の制限酵素が、ＡｆｌＩＩＩ，ＢｓｐＬＵ１１Ｉ，ＮｓｐＩ，ＳｐｈＩ，ＢｓｐＨＩ，ＢｓａＡＩ，ＰｍａＣＩ，ＳｎａＢＩ，ＮｓｐＢＩＩ、ＰｖｕＩＩ，ＢａｎＩＩ，ＨｇｉＡＩ，ＳａｃＩおよびそれらのイソスキゾマーからなる群より選択されることが好ましい。
第一の制限酵素によって認識される塩基配列の異なる２つの切断認識配列はマルチクローニングサイトに挿入されているとよい。
第一の制限酵素がＡｈｄＩまたはそのイソスキゾマーである場合、下記の配列（ＩＸ）及び（Ｘ）で表される二本鎖ＤＮＡがマルチクローニングサイトに挿入されていることが好ましい。
５’−ＧＡＣＸ１ａＸ２ａＴＸ３ａＸ４ａＧＴＣ−Ｎ１−ＧＡＣＸ５ａＸ６ａＡＸ７ａＸ８ａＧＴＣ−３’（ＩＸ）
３’−ＣＴＧＸ１ｂＸ２ｂＡＸ３ｂＸ４ｂＣＡＧ−Ｎ２−ＣＴＧＸ５ｂＸ６ｂＴＸ７ｂＸ８ｂＣＡＧ−５’（Ｘ）
（配列（ＩＸ）及び（Ｘ）中、Ｇはグアニン、Ａはアデニン、Ｃはシトシン、Ｔはチミンであり、
Ｘ１ａ〜Ｘ８ａ及びＸ１ｂ〜Ｘ８ｂはそれぞれ独立にグアニン、アデニン、シトシンまたはチミンのいずれかの塩基であり、Ｘ１ａとＸ１ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｘ２ａとＸ２ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｘ３ａとＸ３ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｘ４ａとＸ４ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｘ５ａとＸ５ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｘ６ａとＸ６ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｘ７ａとＸ７ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｘ８ａとＸ８ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、
配列ＣＸ１ａＸ２ａＴは第二の制限酵素の切断認識配列の５’側の部分配列を含む塩基配列であり、
配列ＣＸ８ｂＸ７ｂＴは配列ＣＸ１ａＸ２ａＴに含まれるところの第二の制限酵素の切断認識配列の部分配列を含まない塩基配列であり、
５’−及び３’−は２本鎖ＤＮＡのそれぞれの末端を示し、
Ｎ１は存在しなくともよいが、存在する場合には、１〜１０００塩基の任意のヌクレオチド配列であり、
Ｎ２は存在しなくともよいが、存在する場合には、Ｎ１のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列である。）
第一の制限酵素がＸｃｍＩまたはそのイソスキゾマーである場合、下記の配列（ＸＩ）及び（ＸＩＩ）で表される二本鎖ＤＮＡがマルチクローニングサイトに挿入されていることが好ましい。
５’−ＣＣＡＹ１ａＹ２ａＹ３ａＹ４ａＴＹ５ａＹ６ａＹ７ａＹ８ａＴＧＧ−Ｎ１−ＣＣＡＹ９ａＹ１０ａＹ１１ａＹ１２ａＡＹ１３ａＹ１４ａＹ１５ａＹ１６ａＴＧＧ−３’（ＸＩ）
３’−ＧＧＴＹ１ｂＹ２ｂＹ３ｂＹ４ｂＡＹ５ｂＹ６ｂＹ７ｂＹ８ｂＡＣＣ−Ｎ２−ＧＧＴＹ９ｂＹ１０ｂＹ１１ｂＹ１２ｂＴＹ１３ｂＹ１４ｂＹ１５ｂＹ１６ｂＡＣＣ−５’（ＸＩＩ）
（配列（ＸＩ）及び（ＸＩＩ）中、Ｇはグアニン、Ａはアデニン、Ｃはシトシン、Ｔはチミンであり、
Ｙ１ａ〜Ｙ１６ａ及びＹ１ｂ〜Ｙ１６ｂはそれぞれ独立にグアニン、アデニン、シトシンまたはチミンのいずれかの塩基であり、Ｙ１ａとＹ１ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ２ａとＹ２ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ３ａとＹ３ｂｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ４ａとＹ４ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ５ａとＹ５ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ６ａとＹ６ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ７ａとＹ７ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ８ａとＹ８ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ９ａとＹ９ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ１０ａとＹ１０ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ１１ａとＹ１１ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ１２ａとＹ１２ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ１３ａとＹ１３ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ１４ａとＹ１４ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ１５ａとＹ１５ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ１６ａとＹ１６ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、
配列Ｙ１ａＹ２ａＹ３ａＹ４ａＴは第二の制限酵素の切断認識配列の５’側の部分配列を含む塩基配列であり、
配列Ｙ１６ｂＹ１５ｂＹ１４ｂＹ１３ｂＴは配列Ｙ１ａＹ２ａＹ３ａＹ４ａＴに含まれるところの第二の制限酵素の切断認識配列の部分配列を含まない塩基配列であり、
５’−及び３’−は２本鎖ＤＮＡのそれぞれの末端を示し、
Ｎ１は存在しなくともよいが、存在する場合には、１〜１０００塩基の任意のヌクレオチド配列であり、
Ｎ２は存在しなくともよいが、存在する場合には、Ｎ１のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列である。）
第一の制限酵素がＡｈｄＩまたはそのイソスキゾマーとＸｃｍＩまたはそのイソスキゾマーの組み合わせである場合、下記の配列（ＸＩＩＩ）及び（ＸＩＶ）で表される二本鎖ＤＮＡがマルチクローニングサイトに挿入されていることが好ましい。
５’−ＧＡＣＸ１ａＸ２ａＴＸ３ａＸ４ａＧＴＣ−Ｎ１−ＣＣＡＹ９ａＹ１０ａＹ１１ａＹ１２ａＡＹ１３ａＹ１４ａＹ１５ａＹ１６ａＴＧＧ−３’（ＸＩＩＩ）
３’−ＣＴＧＸ１ｂＸ２ｂＡＸ３ｂＸ４ｂＣＡＧ−Ｎ２−ＧＧＴＹ９ｂＹ１０ｂＹ１１ｂＹ１２ｂＴＹ１３ｂＹ１４ｂＹ１５ｂＹ１６ｂＡＣＣ−５’（ＸＩＶ）
（配列（ＸＩＩＩ）及び（ＸＩＶ）中、Ｇはグアニン、Ａはアデニン、Ｃはシトシン、Ｔはチミンであり、
Ｘ１ａ〜Ｘ４ａ及びＸ１ｂ〜Ｘ４ｂはそれぞれ独立にグアニン、アデニン、シトシンまたはチミンのいずれかの塩基であり、Ｘ１ａとＸ１ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｘ２ａとＸ２ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｘ３ａとＸ３ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｘ４ａとＸ４ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、
Ｙ９ａ〜Ｙ１６ａ及びＹ９ｂ〜Ｙ１６ｂはそれぞれ独立にグアニン、アデニン、シトシンまたはチミンのいずれかの塩基であり、Ｙ９ａとＹ９ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ１０ａとＹ１０ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ１１ａとＹ１１ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ１２ａとＹ１２ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ１３ａとＹ１３ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ１４ａとＹ１４ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ１５ａとＹ１５ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ１６ａとＹ１６ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、
配列ＣＸ１ａＸ２ａＴは第二の制限酵素の切断認識配列の５’側の部分配列を含む塩基配列であり、
配列Ｙ１６ｂＹ１５ｂＹ１４ｂＹ１３ｂＴは配列ＣＸ１ａＸ２ａＴに含まれるところの第二の制限酵素の切断認識配列の部分配列を含まない塩基配列であり、
５’−及び３’−は２本鎖ＤＮＡのそれぞれの末端を示し、
Ｎ１は存在しなくともよいが、存在する場合には、１〜１０００塩基の任意のヌクレオチド配列であり、
Ｎ２は存在しなくともよいが、存在する場合には、Ｎ１のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列である。）
配列（ＩＸ）〜（ＸＩＶ）において、Ｎ１は、例えば、市販のベクター（例えば、ｐＥＴ２１ｂ、ｐＥＴ３２ａなど）の適当な制限酵素サイトに遺伝子（例えば、チオレドキシン遺伝子）と人工遺伝子（例えば、ＰＡＣＡＰなど）を挿入して作成した誘導体に由来する配列であるとよい。Ｎ１配列の一部には、第二の制限酵素サイトが含まれていることが好ましいことがある。この場合は、本発明のベクター（以下、「ＰＲＥＳＡＴ−ｖｅｃｔｏｒ」ということもある。）を第一の制限酵素で処理することにより得られる開環状ベクター（以下、「開環状ＰＲＥＳＡＴ−ｖｅｃｔｏｒ」ということもある。）の精製が不完全であった場合でも、そこから自己ライゲーションで出てくる「空の」ＰＲＥＳＡＴ−ｖｅｃｔｏｒは、第二の制限酵素消化により切断されてしまうために、ＯＲＦ選択後にコロニーにならない。したがって、開環状ＰＲＥＳＡＴ−ｖｅｃｔｏｒの精製が不完全であっても、バックグラウンドが上昇しないというメリットをもたらす。
Ｎ１の一例としては、以下の配列を挙げることができる。
５’−ＣＡＣＣＴＧＡＣＴＧＡＣＧＡＣＡＧＴＴＴＴＧＡＣＡＣＧＧＡＴＧＴＡＣＴＣＡＡＡＧＣＧＧＡＣＧＧＧＧＣＧＡＴＣＣＴＣＧＴＣＧＡＴＴＴＣＴＧＧＧＣＡＧＡＧＴＧＧＴＧＣＧＧＴＣＣＧＴＧＣＡＡＡＡＴＧＡＴＣＧＣＣＣＣＧＡＴＴＣＴＧＧＡＴＧＡＡＡＴＣＧＣＴＧＡＣＧＡＡＴＡＴＣＡＧＧＧＣＡＡＡＣＴＧＡＣＣＧＴＴＧＣＡＡＡＡＣＴＧＡＡＣＡＴＣＧＡＴＣＡＡＡＡＣＣＣＴＧＧＣＡＣＴＧＣＧＣＣＧＡＡＡＴＡＴＧＧＣＡＴＣＣＧＴＧＧＴＡＴＣＣＣＧＡＣＴＣＴＧＣＴＧＣＴＧＴＴＣＡＡＡＡＡＣＧＧＴＧＡＡＧＴＧＧＣＧＧＣＡＡＣＣＡＡＡＧＴＧＧＧＴＧＣＡＣＴＧＴＣＴＡＡＡＧＧＴＣＡＧＴＴＧＡＡＡＧＡＧＴＴＣＣＴＣＧＡＣＧＣＴＡＡＣＣＴＧＧＣＣＧＧＴＴＣＴＧＧＴＴＣＴＧＧＣＣＡＴＡＴＧＧＣＴＡＧＣＣＡＴＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＡＧＣＡＧＣＧＧＣＡＴＴＧＡＣＧＧＣＣＧＧＣＡＴＡＧＣＧＡＴＧＧＣＡＴＣＴＴＴＡＣＣＧＡＴＡＧＣＴＡＴＡＧＣＣＧＣＴＡＴＣＧＣＡＡＡＣＡＧＡＴＧＧＣＧＧＴＧＡＡＡＡＡＧＴＡＴＣＴＧＧＣＧＧＣＧＧＴＧＣＴＧＧＧＣＴＡＡＴＡＡ−３’（配列番号５５）
配列番号５５の配列は、ｐＥＴ２１ｂのＮｄｅＩサイトに、ｐＥＴ３２ａに由来するチオレドキシン遺伝子を含むＮｄｅＩ断片と、同じｐＥＴ２１ｂのＮｈｅＩサイトに、ＰＡＣＡＰの人工遺伝子を挿入して作成した、ｐＥＴ３２ａの誘導体ｐＥＴ３２ａＰＡＣＡＰに由来する配列である。
配列（ＩＸ）〜（ＸＩＶ）において、Ｎ２は、Ｎ１のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列である。Ｎ２の一例としては、以下の配列を挙げることができる。
３’−ＧＴＧＧＡＣＴＧＡＣＴＧＣＴＧＴＣＡＡＡＡＣＴＧＴＧＣＣＴＡＣＡＴＧＡＧＴＴＴＣＧＣＣＴＧＣＣＣＣＧＣＴＡＧＧＡＧＣＡＧＣＴＡＡＡＧＡＣＣＣＧＴＣＴＣＡＣＣＡＣＧＣＣＡＧＧＣＡＣＧＴＴＴＴＡＣＴＡＧＣＧＧＧＧＣＴＡＡＧＡＣＣＴＡＣＴＴＴＡＧＣＧＡＣＴＧＣＴＴＡＴＡＧＴＣＣＣＧＴＴＴＧＡＣＴＧＧＣＡＡＣＧＴＴＴＴＧＡＣＴＴＧＴＡＧＣＴＡＧＴＴＴＴＧＧＧＡＣＣＧＴＧＡＣＧＣＧＧＣＴＴＴＡＴＡＣＣＧＴＡＧＧＣＡＣＣＡＴＡＧＧＧＣＴＧＡＧＡＣＧＡＣＧＡＣＡＡＧＴＴＴＴＴＧＣＣＡＣＴＴＣＡＣＣＧＣＣＧＴＴＧＧＴＴＴＣＡＣＣＣＡＣＧＴＧＡＣＡＧＡＴＴＴＣＣＡＧＴＣＡＡＣＴＴＴＣＴＣＡＡＧＧＡＧＣＴＧＣＧＡＴＴＧＧＡＣＣＧＧＣＣＡＡＧＡＣＣＡＡＧＡＣＣＧＧＴＡＴＡＣＣＧＡＴＣＧＧＴＡＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＴＣＧＴＣＧＣＣＧＴＡＡＣＴＧＣＣＧＧＣＣＧＴＡＴＣＧＣＴＡＣＣＧＴＡＧＡＡＡＴＧＧＣＴＡＴＣＧＡＴＡＴＣＧＧＣＧＡＴＡＧＣＧＴＴＴＧＴＣＴＡＣＣＧＣＣＡＣＴＴＴＴＴＣＡＴＡＧＡＣＣＧＣＣＧＣＣＡＣＧＡＣＣＣＧＡＴＴＡＴＴ−５’（配列番号５６）
配列番号５６の配列は、配列番号５５の配列に相補的な配列である。
本願の第１発明のベクターは、ある蛋白質（例えば、哺乳類、ジストマジャポニクスまたは大腸菌に由来するグルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、チオレドキシン（ＴＲＸ）、Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ（Ｈｉｓ６）、ｌａｎｔｈａｎｉｄｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔａｇ（ＬＢＴ）、Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ（ＰＬＡＧ（登録商標））、ｅｎｈａｎｃｅｄ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓｅ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＥＧＦＰ）など）のコード領域を含んでおり、蛋白質及び／又は蛋白質ドメインをコードする外来遺伝子を組み込んだときに、前記外来遺伝子がコードする蛋白質及び／又は蛋白質ドメインを前記領域がコードする蛋白質と結合した融合蛋白質の形態で発現することができるものであってもよい。この場合、ある蛋白質のコード領域のカルボキシ末端側に、第一の制限酵素によって認識される塩基配列の異なる２つの切断認識配列を持ち、そのうち前記蛋白質のコード領域に近い側の切断認識配列は第一の制限酵素とは異なる第二の制限酵素によって認識される切断認識配列の一部を含むが、前記蛋白質のコード領域に遠い側の切断認識配列は前記の第二の制限酵素によって認識される切断認識配列の一部を含まないようにするとよい。
本願の第２発明は、本願の第１発明のベクターを第一の制限酵素で処理することにより得られる二本鎖ＤＮＡからなる開環状ベクターを提供する。
本発明の開環状ベクターとしては、下記の配列（ＸＶ）及び（ＸＶＩ）で表される二本鎖ＤＮＡからなる開環状ベクターを例示することができる。
５’−Ｘ７ａＸ８ａＧＴＣ−Ｎ３−ＧＡＣＸ１ａＸ２ａＴ−３’（ＸＶ）
３’−ＴＸ７ｂＸ８ｂＣＡＧ−Ｎ４−ＣＴＧＸ１ｂＸ２ｂ−５’（ＸＶＩ）
（配列（ＸＶ）及び（ＸＶＩ）中、Ｇはグアニン、Ａはアデニン、Ｃはシトシン、Ｔはチミンであり、
Ｘ７ａ、Ｘ８ａ、Ｘ７ｂ及びＸ８ｂはそれぞれ独立にグアニン、アデニン、シトシンまたはチミンのいずれかの塩基であるが、Ｘ７ａとＸ７ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｘ８ａとＸ８ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、
Ｘ１ａ、Ｘ２ａ、Ｘ１ｂ及びＸ２ｂはそれぞれ独立にグアニン、アデニン、シトシンまたはチミンのいずれかの塩基であるが、Ｘ１ａとＸ１ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｘ２ａとＸ２ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、
配列ＣＸ１ａＸ２ａＴはＮｃｏＩ，ＤｓａＩ，ＥｃｏＴ１４Ｉ，ＮｄｅＩ，ＳｆｅＩ，ＡｖａＩ，ＳｍｌＩ，ＸｈｏＩ，ＰｓｔＩ，ＥｃｏＴ２２Ｉ，ＰｓｈＢＩ，ＡｃｃＩ，ＡｐａＬＩ，ＰｓｉＩ，ＳｃａＩ，ＳｐｌＩ，Ｂｓｐ１１０７Ｉ，Ｂｓｐ１２８６Ｉ，ＢｓｐＴ１０７Ｉ，Ｂｓｐ１４０７Ｉ，ＴａｔＩ，ＨｇｉＣＩ，ＫｐｎＩ，ＳｐｅＩ，ＢｌｎＩ，ＮｈｅＩ，ＸｂａＩ，ＳｓｐＩ，ＥｃｏＲＶまたはそれらのイソスキゾマーの切断認識配列の５’側の部分配列を含む塩基配列であり、
配列ＣＸ８ｂＸ７ｂＴは配列ＣＸ１ａＸ２ａＴに含まれるところのＮｃｏＩ，ＤｓａＩ，ＥｃｏＴ１４Ｉ，ＮｄｅＩ，ＳｆｅＩ，ＡｖａＩ，ＳｍｌＩ，ＸｈｏＩ，ＰｓｔＩ，ＥｃｏＴ２２Ｉ，ＰｓｈＢＩ，ＡｃｃＩ，ＡｐａＬＩ，ＰｓｉＩ，ＳｃａＩ，ＳｐｌＩ，Ｂｓｐ１１０７Ｉ，Ｂｓｐ１２８６Ｉ，ＢｓｐＴ１０７Ｉ，Ｂｓｐ１４０７Ｉ，ＴａｔＩ，ＨｇｉＣＩ，ＫｐｎＩ，ＳｐｅＩ，ＢｌｎＩ，ＮｈｅＩ，ＸｂａＩ，ＳｓｐＩ，ＥｃｏＲＶまたはそれらのイソスキゾマーの切断認識配列の部分配列を含まない配列であり、
−５’及び−３’は２本鎖ＤＮＡのそれぞれの末端を示し、
Ｎ３は２０００〜７０００塩基の任意のヌクレオチド配列であり、Ｎ４はＮ３のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列である。）
配列（ＸＶ）及び（ＸＶＩ）において、Ｘ７ａがＡであり、Ｘ８ａがＴであり、Ｘ１ａがＣであり、Ｘ２ａがＡであり、Ｘ７ｂがＴであり、Ｘ８ｂがＡであり、Ｘ１ｂがＧであり、Ｘ２ｂがＴであることが好ましい。
また、本発明の開環状ベクターとして、下記の配列（ＸＶＩＩ）及び（ＸＶＩＩＩ）で表される二本鎖ＤＮＡからなる開環状ベクターを例示することができる。
５’−Ｙ１３ａＹ１４ａＹ１５ａＹ１６ａＴＧＧ−Ｎ３−ＣＣＡＹ１ａＹ２ａＹ３ａＹ４ａＴ−３’（ＸＶＩＩ）
３’−ＴＹ１３ｂＹ１４ｂＹ１５ｂＹ１６ｂＡＣＣ−Ｎ４−ＧＧＴＹ１ｂＹ２ｂＹ３ｂＹ４ｂ−５’（ＸＶＩＩＩ）
（配列（ＸＶＩＩ）及び（ＸＶＩＩＩ）中、Ｇはグアニン、Ａはアデニン、Ｃはシトシン、Ｔはチミンであり、
Ｙ１ａ、Ｙ２ａ、Ｙ３ａ、Ｙ４ａ、Ｙ１ｂ、Ｙ２ｂ、Ｙ３ｂ、及びＹ４ｂはそれぞれ独立にグアニン、アデニン、シトシンまたはチミンのいずれかの塩基であるが、Ｙ１ａとＹ１ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ２ａとＹ２ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ３ａとＹ３ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ４ａとＹ４ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、
配列Ｙ１ａＹ２ａＹ３ａＹ４ａＴはＮｃｏＩ，ＤｓａＩ，ＥｃｏＴ１４Ｉ，ＮｄｅＩ，ＳｆｅＩ，ＡｖａＩ，ＳｍｌＩ，ＸｈｏＩ，ＰｓｔＩ，ＥｃｏＴ２２Ｉ，ＰｓｈＢＩ，ＡｃｃＩ，ＡｐａＬＩ，ＰｓｉＩ，ＳｃａＩ，ＳｐｌＩ，Ｂｓｐ１１０７Ｉ，Ｂｓｐ１２８６Ｉ，ＢｓｐＴ１０７Ｉ，Ｂｓｐ１４０７Ｉ，ＴａｔＩ，ＨｇｉＣＩ，ＫｐｎＩ，ＳｐｅＩ，ＢｌｎＩ，ＮｈｅＩ，ＸｂａＩ，ＳｓｐＩ，ＥｃｏＲＶ，ＡｆｌＩＩＩ，ＢｓｐＬＵ１１Ｉ，ＮｓｐＩ，ＳｐｈＩ，ＢｓｐＨＩ，ＢｓａＡＩ，ＰｍａＣＩ，ＳｎａＢＩ，ＮｓｐＢＩＩ、ＰｖｕＩＩ，ＢａｎＩＩ，ＨｇｉＡＩ，ＳａｃＩまたはそれらのイソスキゾマーの切断認識配列の５’側の部分配列を含む塩基配列であり、
Ｙ１３ａ、Ｙ１４ａ、Ｙ１５ａ、Ｙ１６ａ、Ｙ１３ｂ、Ｙ１４ｂ、Ｙ１５ｂ及びＹ１６ｂはそれぞれ独立にグアニン、アデニン、シトシンまたはチミンのいずれかの塩基であるが、Ｙ１３ａとＹ１３ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ１４ａとＹ１４ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ１５ａとＹ１５ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ１６ａとＹ１６ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、
配列Ｙ１６ｂＹ１５ｂＹ１４ｂＹ１３ｂＴは配列Ｙ１ａＹ２ａＹ３ａＹ４ａＴに含まれるところのＮｃｏＩ，ＤｓａＩ，ＥｃｏＴ１４Ｉ，ＮｄｅＩ，ＳｆｅＩ，ＡｖａＩ，ＳｍｌＩ，ＸｈｏＩ，ＰｓｔＩ，ＥｃｏＴ２２Ｉ，ＰｓｈＢＩ，ＡｃｃＩ，ＡｐａＬＩ，ＰｓｉＩ，ＳｃａＩ，ＳｐｌＩ，Ｂｓｐ１１０７Ｉ，Ｂｓｐ１２８６Ｉ，ＢｓｐＴ１０７Ｉ，Ｂｓｐ１４０７Ｉ，ＴａｔＩ，ＨｇｉＣＩ，ＫｐｎＩ，ＳｐｅＩ，ＢｌｎＩ，ＮｈｅＩ，ＸｂａＩ，ＳｓｐＩ，ＥｃｏＲＶ，ＡｆｌＩＩＩ，ＢｓｐＬＵ１１Ｉ，ＮｓｐＩ，ＳｐｈＩ，ＢｓｐＨＩ，ＢｓａＡＩ，ＰｍａＣＩ，ＳｎａＢＩ，ＮｓｐＢＩＩ、ＰｖｕＩＩ，ＢａｎＩＩ，ＨｇｉＡＩ，ＳａｃＩまたはそれらのイソスキゾマーの切断認識配列の部分配列を含まない塩基配列であり、
−５’及び−３’は２本鎖ＤＮＡのそれぞれの末端を示し、
Ｎ３は２０００〜７０００塩基の任意のヌクレオチド配列であり、Ｎ４はＮ３のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列である。）
配列（ＸＶＩＩ）及び（ＸＶＩＩＩ）において、Ｙ２ａがＣであり、Ｙ３ａがでＣあり、Ｙ４ａがＡであり、Ｙ２ｂがＧであり、Ｙ３ｂがＧであり、Ｙ４ｂがＴであり、Ｙ１３ａがＴであり、Ｙ１４ａがＧであり、Ｙ１５ａがＴであり、Ｙ１３ｂがＡであり、Ｙ１４ｂがＣであり、Ｙ１５ｂがＡであることが好ましい。
さらに、本発明の開環状ベクターとして、下記の配列（ＸＩＸ）及び（ＸＸ）で表される二本鎖ＤＮＡからなる開環状ベクターを例示することができる。
５’−Ｙ１３ａＹ１４ａＹ１５ａＹ１６ａＴＧＧ−Ｎ３−ＧＡＣＸ１ａＸ２ａＴ−３’（ＸＩＸ）
３’−ＴＹ１３ｂＹ１４ｂＹ１５ｂＹ１６ｂＡＣＣ−５’Ｎ４−ＣＴＧＸ１ｂＸ２ｂ−５’（ＸＸ）
（配列（ＸＩＸ）及び（ＸＸ）中、Ｇはグアニン、Ａはアデニン、Ｃはシトシン、Ｔはチミンであり、
Ｙ１３ａ、Ｙ１４ａ、Ｙ１５ａ、Ｙ１６ａ、Ｙ１３ｂ、Ｙ１４ｂ、Ｙ１５ｂ及びＹ１６ｂはそれぞれ独立にグアニン、アデニン、シトシンまたはチミンのいずれかの塩基であるが、Ｙ１３ａとＹ１３ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ１４ａとＹ１４ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ１５ａとＹ１５ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ１６ａとＹ１６ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、
Ｘ１ａ、Ｘ２ａ、Ｘ１ｂ及びＸ２ｂはそれぞれ独立にグアニン、アデニン、シトシンまたはチミンのいずれかの塩基であるが、Ｘ１ａとＸ１ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｘ２ａとＸ２ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、
配列ＣＸ１ａＸ２ａＴはＮｃｏＩ，ＤｓａＩ，ＥｃｏＴ１４Ｉ，ＮｄｅＩ，ＳｆｅＩ，ＡｖａＩ，ＳｍｌＩ，ＸｈｏＩ，ＰｓｔＩ，ＥｃｏＴ２２Ｉ，ＰｓｈＢＩ，ＡｃｃＩ，ＡｐａＬＩ，ＰｓｉＩ，ＳｃａＩ，ＳｐｌＩ，Ｂｓｐ１１０７Ｉ，Ｂｓｐ１２８６Ｉ，ＢｓｐＴ１０７Ｉ，Ｂｓｐ１４０７Ｉ，ＴａｔＩ，ＨｇｉＣＩ，ＫｐｎＩ，ＳｐｅＩ，ＢｌｎＩ，ＮｈｅＩ，ＸｂａＩ，ＳｓｐＩ，ＥｃｏＲＶまたはそれらのイソスキゾマーの切断認識配列の５’側の部分配列を含む塩基配列であり、
配列Ｙ１４ｂＹ１３ｂＴは配列ＣＸ１ａＸ２ａＴに含まれるところのＮｃｏＩ，ＤｓａＩ，ＥｃｏＴ１４Ｉ，ＮｄｅＩ，ＳｆｅＩ，ＡｖａＩ，ＳｍｌＩ，ＸｈｏＩ，ＰｓｔＩ，ＥｃｏＴ２２Ｉ，ＰｓｈＢＩ，ＡｃｃＩ，ＡｐａＬＩ，ＰｓｉＩ，ＳｃａＩ，ＳｐｌＩ，Ｂｓｐ１１０７Ｉ，Ｂｓｐ１２８６Ｉ，ＢｓｐＴ１０７Ｉ，Ｂｓｐ１４０７Ｉ，ＴａｔＩ，ＨｇｉＣＩ，ＫｐｎＩ，ＳｐｅＩ，ＢｌｎＩ，ＮｈｅＩ，ＸｂａＩ，ＳｓｐＩ，ＥｃｏＲＶまたはそれらのイソスキゾマーの切断認識配列の部分配列を含まない塩基配列であり、
−５’及び−３’は２本鎖ＤＮＡのそれぞれの末端を示し、
Ｎ３は２０００〜７０００塩基の任意のヌクレオチド配列であり、Ｎ４はＮ３のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列である。）
配列（ＸＩＸ）及び（ＸＸ）において、Ｘ１ａがＣであり、Ｘ２ａがＡであり、Ｘ１ｂがＧであり、Ｘ２ｂがＴであり、Ｙ１３ａがＴであり、Ｙ１４ａがＧであり、Ｙ１５ａがＴであり、Ｙ１３ｂがＡであり、Ｙ１４ｂがＣであり、Ｙ１５ｂがＡであることが好ましい。
配列（ＸＶ）〜（ＸＸ）において、Ｎ３は、例えば、市販のベクター（例えば、ｐＧＥＸ−４Ｔ３、ｐＧＥＸ−２Ｔ、ｐＧＥＸ−３Ｘ、ｐＥＴ２１ｂ、ｐＥＴ３２ａなど）に由来する配列であるとよい。Ｎ３の一例としては、以下の配列を挙げることができる。
５’−ＧＧＡＴＣＣＣＣＧＡＡＴＴＣＣＣＧＧＧＴＣＧＡＣＴＣＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡＴＣＧＴＧＡＣＴＧＡＣＴＧＡＣＧＡＴＣＴＧＣＣＴＣＧＣＧＣＧＴＴＴＣＧＧＴＧＡＴＧＡＣＧＧＴＧＡＡＡＡＣＣＴＣＴＧＡＣＡＣＡＴＧＣＡＧＣＴＣＣＣＧＧＡＧＡＣＧＧＴＣＡＣＡＧＣＴＴＧＴＣＴＧＴＡＡＧＣＧＧＡＴＧＣＣＧＧＧＡＧＣＡＧＡＣＡＡＧＣＣＣＧＴＣＡＧＧＧＣＧＣＧＴＣＡＧＣＧＧＧＴＧＴＴＧＧＣＧＧＧＴＧＴＣＧＧＧＧＣＧＣＡＧＣＣＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＴＡＧＣＧＡＴＡＧＣＧＧＡＧＴＧＴＡＴＡＡＴＴＣＴＴＧＡＡＧＡＣＧＡＡＡＧＧＧＣＣＴＣＧＴＧＡＴＡＣＧＣＣＴＡＴＴＴＴＴＡＴＡＧＧＴＴＡＡＴＧＴＣＡＴＧＡＴＡＡＴＡＡＴＧＧＴＴＴＣＴＴＡＧＡＣＧＴＣＡＧＧＴＧＧＣＡＣＴＴＴＴＣＧＧＧＧＡＡＡＴＧＴＧＣＧＣＧＧＡＡＣＣＣＣＴＡＴＴＴＧＴＴＴＡＴＴＴＴＴＣＴＡＡＡＴＡＣＡＴＴＣＡＡＡＴＡＴＧＴＡＴＣＣＧＣＴＣＡＴＧＡＧＡＣＡＡＴＡＡＣＣＣＴＧＡＴＡＡＡＴＧＣＴＴＣＡＡＴＡＡＴＡＴＴＧＡＡＡＡＡＧＧＡＡＧＡＧＴＡＴＧＡＧＴＡＴＴＣＡＡＣＡＴＴＴＣＣＧＴＧＴＣＧＣＣＣＴＴＡＴＴＣＣＣＴＴＴＴＴＴＧＣＧＧＣＡＴＴＴＴＧＣＣＴＴＣＣＴＧＴＴＴＴＴＧＣＴＣＡＣＣＣＡＧＡＡＡＣＧＣＴＧＧＴＧＡＡＡＧＴＡＡＡＡＧＡＴＧＣＴＧＡＡＧＡＴＣＡＧＴＴＧＧＧＴＧＣＡＣＧＡＧＴＧＧＧＴＴＡＣＡＴＣＧＡＡＣＴＧＧＡＴＣＴＣＡＡＣＡＧＣＧＧＴＡＡＧＡＴＣＣＴＴＧＡＧＡＧＴＴＴＴＣＧＣＣＣＣＧＡＡＧＡＡＣＧＴＴＴＴＣＣＡＡＴＧＡＴＧＡＧＣＡＣＴＴＴＴＡＡＡＧＴＴＣＴＧＣＴＡＴＧＴＧＧＣＧＣＧＧＴＡＴＴＡＴＣＣＣＧＴＧＴＴＧＡＣＧＣＣＧＧＧＣＡＡＧＡＧＣＡＡＣＴＣＧＧＴＣＧＣＣＧＣＡＴＡＣＡＣＴＡＴＴＣＴＣＡＧＡＡＴＧＡＣＴＴＧＧＴＴＧＡＧＴＡＣＴＣＡＣＣＡＧＴＣＡＣＡＧＡＡＡＡＧＣＡＴＣＴＴＡＣＧＧＡＴＧＧＣＡＴＧＡＣＡＧＴＡＡＧＡＧＡＡＴＴＡＴＧＣＡＧＴＧＣＴＧＣＣＡＴＡＡＣＣＡＴＧＡＧＴＧＡＴＡＡＣＡＣＴＧＣＧＧＣＣＡＡＣＴＴＡＣＴＴＣＴＧＡＣＡＡＣＧＡＴＣＧＧＡＧＧＡＣＣＧＡＡＧＧＡＧＣＴＡＡＣＣＧＣＴＴＴＴＴＴＧＣＡＣＡＡＣＡＴＧＧＧＧＧＡＴＣＡＴＧＴＡＡＣＴＣＧＣＣＴＴＧＡＴＣＧＴＴＧＧＧＡＡＣＣＧＧＡＧＣＴＧＡＡＴＧＡＡＧＣＣＡＴＡＣＣＡＡＡＣＧＡＣＧＡＧＣＴＧＡＣＡＣＣＡＣＧＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＣＡＡＴＧＧＣＡＡＣＡＡＣＧＴＴＧＣＧＣＡＡＡＣＴＡＴＴＡＡＣＴＧＧＣＧＡＡＣＴＡＣＴＴＡＣＴＣＴＡＧＣＴＴＣＣＣＧＧＣＡＡＣＡＡＴＴＡＡＴＡＧＡＣＴＧＧＡＴＧＧＡＧＧＣＧＧＡＴＡＡＡＧＴＴＧＣＡＧＧＡＣＣＡＣＴＴＣＴＧＣＧＣＴＣＧＧＣＣＣＴＴＣＣＧＧＣＴＧＧＣＴＧＧＴＴＴＡＴＴＧＣＴＧＡＴＡＡＡＴＣＴＧＧＡＧＣＣＧＧＴＧＡＧＣＧＴＧＧＧＴＣＴＣＧＣＧＧＴＡＴＣＡＴＴＧＣＡＧＣＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＡＴＧＧＴＡＡＧＣＣＣＴＣＣＣＧＴＡＴＣＧＴＡＧＴＴＡＴＣＴＡＣＡＣＣＡＣＧＧＧＧＡＧＣＣＡＧＧＣＡＡＣＴＡＴＧＧＡＴＧＡＡＣＧＡＡＡＴＡＧＡＣＡＧＡＴＣＧＣＴＧＡＧＡＴＡＧＧＴＧＣＣＴＣＡＣＴＧＡＴＴＡＡＧＣＡＴＴＧＧＴＡＡＣＴＧＴＣＡＧＡＣＣＡＡＧＴＴＴＡＣＴＣＡＴＡＴＡＴＡＣＴＴＴＡＧＡＴＴＧＡＴＴＴＡＡＡＡＣＴＴＣＡＴＴＴＴＴＡＡＴＴＴＡＡＡＡＧＧＡＴＣＴＡＧＧＴＧＡＡＧＡＴＣＣＴＴＴＴＴＧＡＴＡＡＴＣＴＣＡＴＧＡＣＣＡＡＡＡＴＣＣＣＴＴＡＡＣＧＴＧＡＧＴＴＴＴＣＧＴＴＣＣＡＣＴＧＡＧＣＧＴＣＡＧＡＣＣＣＣＧＴＡＧＡＡＡＡＧＡＴＣＡＡＡＧＧＡＴＣＴＴＣＴＴＧＡＧＡＴＣＣＴＴＴＴＴＴＴＣＴＧＣＧＣＧＴＡＡＴＣＴＧＣＴＧＣＴＴＧＣＡＡＡＣＡＡＡＡＡＡＡＣＣＡＣＣＧＣＴＡＣＣＡＧＣＧＧＴＧＧＴＴＴＧＴＴＴＧＣＣＧＧＡＴＣＡＡＧＡＧＣＴＡＣＣＡＡＣＴＣＴＴＴＴＴＣＣＧＡＡＧＧＴＡＡＣＴＧＧＣＴＴＣＡＧＣＡＧＡＧＣＧＣＡＧＡＴＡＣＣＡＡＡＴＡＣＴＧＴＣＣＴＴＣＴＡＧＴＧＴＡＧＣＣＧＴＡＧＴＴＡＧＧＣＣＡＣＣＡＣＴＴＣＡＡＧＡＡＣＴＣＴＧＴＡＧＣＡＣＣＧＣＣＴＡＣＡＴＡＣＣＴＣＧＣＴＣＴＧＣＴＡＡＴＣＣＴＧＴＴＡＣＣＡＧＴＧＧＣＴＧＣＴＧＣＣＡＧＴＧＧＣＧＡＴＡＡＧＴＣＧＴＧＴＣＴＴＡＣＣＧＧＧＴＴＧＧＡＣＴＣＡＡＧＡＣＧＡＴＡＧＴＴＡＣＣＧＧＡＴＡＡＧＧＣＧＣＡＧＣＧＧＴＣＧＧＧＣＴＧＡＡＣＧＧＧＧＧＧＴＴＣＧＴＧＣＡＣＡＣＡＧＣＣＣＡＧＣＴＴＧＧＡＧＣＧＡＡＣＧＡＣＣＴＡＣＡＣＣＧＡＡＣＴＧＡＧＡＴＡＣＣＴＡＣＡＧＣＧＴＧＡＧＣＴＡＴＧＡＧＡＡＡＧＣＧＣＣＡＣＧＣＴＴＣＣＣＧＡＡＧＧＧＡＧＡＡＡＧＧＣＧＧＡＣＡＧＧＴＡＴＣＣＧＧＴＡＡＧＣＧＧＣＡＧＧＧＴＣＧＧＡＡＣＡＧＧＡＧＡＧＣＧＣＡＣＧＡＧＧＧＡＧＣＴＴＣＣＡＧＧＧＧＧＡＡＡＣＧＣＣＴＧＧＴＡＴＣＴＴＴＡＴＡＧＴＣＣＴＧＴＣＧＧＧＴＴＴＣＧＣＣＡＣＣＴＣＴＧＡＣＴＴＧＡＧＣＧＴＣＧＡＴＴＴＴＴＧＴＧＡＴＧＣＴＣＧＴＣＡＧＧＧＧＧＧＣＧＧＡＧＣＣＴＡＴＧＧＡＡＡＡＡＣＧＣＣＡＧＣＡＡＣＧＣＧＧＣＣＴＴＴＴＴＡＣＧＧＴＴＣＣＴＧＧＣＣＴＴＴＴＧＣＴＧＧＣＣＴＴＴＴＧＣＴＣＡＣＡＴＧＴＴＣＴＴＴＣＣＴＧＣＧＴＴＡＴＣＣＣＣＴＧＡＴＴＣＴＧＴＧＧＡＴＡＡＣＣＧＴＡＴＴＡＣＣＧＣＣＴＴＴＧＡＧＴＧＡＧＣＴＧＡＴＡＣＣＧＣＴＣＧＣＣＧＣＡＧＣＣＧＡＡＣＧＡＣＣＧＡＧＣＧＣＡＧＣＧＡＧＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡＧＧＡＡＧＣＧＧＡＡＧＡＧＣＧＣＣＴＧＡＴＧＣＧＧＴＡＴＴＴＴＣＴＣＣＴＴＡＣＧＣＡＴＣＴＧＴＧＣＧＧＴＡＴＴＴＣＡＣＡＣＣＧＣＡＴＡＡＡＴＴＣＣＧＡＣＡＣＣＡＴＣＧＡＡＴＧＧＴＧＣＡＡＡＡＣＣＴＴＴＣＧＣＧＧＴＡＴＧＧＣＡＴＧＡＴＡＧＣＧＣＣＣＧＧＡＡＧＡＧＡＧＴＣＡＡＴＴＣＡＧＧＧＴＧＧＴＧＡＡＴＧＴＧＡＡＡＣＣＡＧＴＡＡＣＧＴＴＡＴＡＣＧＡＴＧＴＣＧＣＡＧＡＧＴＡＴＧＣＣＧＧＴＧＴＣＴＣＴＴＡＴＣＡＧＡＣＣＧＴＴＴＣＣＣＧＣＧＴＧＧＴＧＡＡＣＣＡＧＧＣＣＡＧＣＣＡＣＧＴＴＴＣＴＧＣＧＡＡＡＡＣＧＣＧＧＧＡＡＡＡＡＧＴＧＧＡＡＧＣＧＧＣＧＡＴＧＧＣＧＧＡＧＣＴＧＡＡＴＴＡＣＡＴＴＣＣＣＡＡＣＣＧＣＧＴＧＧＣＡＣＡＡＣＡＡＣＴＧＧＣＧＧＧＣＡＡＡＣＡＧＴＣＧＴＴＧＣＴＧＡＴＴＧＧＣＧＴＴＧＣＣＡＣＣＴＣＣＡＧＴＣＴＧＧＣＣＣＴＧＣＡＣＧＣＧＣＣＧＴＣＧＣＡＡＡＴＴＧＴＣＧＣＧＧＣＧＡＴＴＡＡＡＴＣＴＣＧＣＧＣＣＧＡＴＣＡＡＣＴＧＧＧＴＧＣＣＡＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＴＣＧＡＴＧＧＴＡＧＡＡＣＧＡＡＧＣＧＧＣＧＴＣＧＡＡＧＣＣＴＧＴＡＡＡＧＣＧＧＣＧＧＴＧＣＡＣＡＡＴＣＴＴＣＴＣＧＣＧＣＡＡＣＧＣＧＴＣＡＧＴＧＧＧＣＴＧＡＴＣＡＴＴＡＡＣＴＡＴＣＣＧＣＴＧＧＡＴＧＡＣＣＡＧＧＡＴＧＣＣＡＴＴＧＣＴＧＴＧＧＡＡＧＣＴＧＣＣＴＧＣＡＣＴＡＡＴＧＴＴＣＣＧＧＣＧＴＴＡＴＴＴＣＴＴＧＡＴＧＴＣＴＣＴＧＡＣＣＡＧＡＣＡＣＣＣＡＴＣＡＡＣＡＧＴＡＴＴＡＴＴＴＴＣＴＣＣＣＡＴＧＡＡＧＡＣＧＧＴＡＣＧＣＧＡＣＴＧＧＧＣＧＴＧＧＡＧＣＡＴＣＴＧＧＴＣＧＣＡＴＴＧＧＧＴＣＡＣＣＡＧＣＡＡＡＴＣＧＣＧＣＴＧＴＴＡＧＣＧＧＧＣＣＣＡＴＴＡＡＧＴＴＣＴＧＴＣＴＣＧＧＣＧＣＧＴＣＴＧＣＧＴＣＴＧＧＣＴＧＧＣＴＧＧＣＡＴＡＡＡＴＡＴＣＴＣＡＣＴＣＧＣＡＡＴＣＡＡＡＴＴＣＡＧＣＧＡＴＡＧＣＧＧＡＡＣＧＧＧＡＡＧＧＣＧＡＣＴＧＧＡＧＴＧＣＣＡＴＧＴＣＣＧＧＴＴＴＴＣＡＡＣＡＡＡＣＣＡＴＧＣＡＡＡＴＧＣＴＧＡＡＴＧＡＧＧＧＣＡＴＣＧＴＴＣＣＣＡＣＴＧＣＧＡＴＧＣＴＧＧＴＴＧＣＣＡＡＣＧＡＴＣＡＧＡＴＧＧＣＧＣＴＧＧＧＣＧＣＡＡＴＧＣＧＣＧＣＣＡＴＴＡＣＣＧＡＧＴＣＣＧＧＧＣＴＧＣＧＣＧＴＴＧＧＴＧＣＧＧＡＴＡＴＣＴＣＧＧＴＡＧＴＧＧＧＡＴＡＣＧＡＣＧＡＴＡＣＣＧＡＡＧＡＣＡＧＣＴＣＡＴＧＴＴＡＴＡＴＣＣＣＧＣＣＧＴＴＡＡＣＣＡＣＣＡＴＣＡＡＡＣＡＧＧＡＴＴＴＴＣＧＣＣＴＧＣＴＧＧＧＧＣＡＡＡＣＣＡＧＣＧＴＧＧＡＣＣＧＣＴＴＧＣＴＧＣＡＡＣＴＣＴＣＴＣＡＧＧＧＣＣＡＧＧＣＧＧＴＧＡＡＧＧＧＣＡＡＴＣＡＧＣＴＧＴＴＧＣＣＣＧＴＣＴＣＡＣＴＧＧＴＧＡＡＡＡＧＡＡＡＡＡＣＣＡＣＣＣＴＧＧＣＧＣＣＣＡＡＴＡＣＧＣＡＡＡＣＣＧＣＣＴＣＴＣＣＣＣＧＣＧＣＧＴＴＧＧＣＣＧＡＴＴＣＡＴＴＡＡＴＧＣＡＧＣＴＧＧＣＡＣＧＡＣＡＧＧＴＴＴＣＣＣＧＡＣＴＧＧＡＡＡＧＣＧＧＧＣＡＧＴＧＡＧＣＧＣＡＡＣＧＣＡＡＴＴＡＡＴＧＴＧＡＧＴＴＡＧＣＴＣＡＣＴＣＡＴＴＡＧＧＣＡＣＣＣＣＡＧＧＣＴＴＴＡＣＡＣＴＴＴＡＴＧＣＴＴＣＣＧＧＣＴＣＧＴＡＴＧＴＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＧＡＴＴＣＡＣＴＧＧＣＣＧＴＣＧＴＴＴＴＡＣＡＡＣＧＴＣＧＴＧＡＣＴＧＧＧＡＡＡＡＣＣＣＴＧＧＣＧＴＴＡＣＣＣＡＡＣＴＴＡＡＴＣＧＣＣＴＴＧＣＡＧＣＡＣＡＴＣＣＣＣＣＴＴＴＣＧＣＣＡＧＣＴＧＧＣＧＴＡＡＴＡＧＣＧＡＡＧＡＧＧＣＣＣＧＣＡＣＣＧＡＴＣＧＣＣＣＴＴＣＣＣＡＡＣＡＧＴＴＧＣＧＣＡＧＣＣＴＧＡＡＴＧＧＣＧＡＡＴＧＧＣＧＣＴＴＴＧＣＣＴＧＧＴＴＴＣＣＧＧＣＡＣＣＡＧＡＡＧＣＧＧＴＧＣＣＧＧＡＡＡＧＣＴＧＧＣＴＧＧＡＧＴＧＣＧＡＴＣＴＴＣＣＴＧＡＧＧＣＣＧＡＴＡＣＴＧＴＣＧＴＣＧＴＣＣＣＣＴＣＡＡＡＣＴＧＧＣＡＧＡＴＧＣＡＣＧＧＴＴＡＣＧＡＴＧＣＧＣＣＣＡＴＣＴＡＣＡＣＣＡＡＣＧＴＡＡＣＣＴＡＴＣＣＣＡＴＴＡＣＧＧＴＣＡＡＴＣＣＧＣＣＧＴＴＴＧＴＴＣＣＣＡＣＧＧＡＧＡＡＴＣＣＧＡＣＧＧＧＴＴＧＴＴＡＣＴＣＧＣＴＣＡＣＡＴＴＴＡＡＴＧＴＴＧＡＴＧＡＡＡＧＣＴＧＧＣＴＡＣＡＧＧＡＡＧＧＣＣＡＧＡＣＧＣＧＡＡＴＴＡＴＴＴＴＴＧＡＴＧＧＣＧＴＴＧＧＡＡＴＴＡＣＧＴＴＡＴＣＧＡＣＴＧＣＡＣＧＧＴＧＣＡＣＣＡＡＴＧＣＴＴＣＴＧＧＣＧＴＣＡＧＧＣＡＧＣＣＡＴＣＧＧＡＡＧＣＴＧＴＧＧＴＡＴＧＧＣＴＧＴＧＣＡＧＧＴＣＧＴＡＡＡＴＣＡＣＴＧＣＡＴＡＡＴＴＣＧＴＧＴＣＧＣＴＣＡＡＧＧＣＧＣＡＣＴＣＣＣＧＴＴＣＴＧＧＡＴＡＡＴＧＴＴＴＴＴＴＧＣＧＣＣＧＡＣＡＴＣＡＴＡＡＣＧＧＴＴＣＴＧＧＣＡＡＡＴＡＴＴＣＴＧＡＡＡＴＧＡＧＣＴＧＴＴＧＡＣＡＡＴＴＡＡＴＣＡＴＣＧＧＣＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＴＡＴＴＣＡＴＧＴＣＣＣＣＴＡＴＡＣＴＡＧＧＴＴＡＴＴＧＧＡＡＡＡＴＴＡＡＧＧＧＣＣＴＴＧＴＧＣＡＡＣＣＣＡＣＴＣＧＡＣＴＴＣＴＴＴＴＧＧＡＡＴＡＴＣＴＴＧＡＡＧＡＡＡＡＡＴＡＴＧＡＡＧＡＧＣＡＴＴＴＧＴＡＴＧＡＧＣＧＣＧＡＴＧＡＡＧＧＴＧＡＴＡＡＡＴＧＧＣＧＡＡＡＣＡＡＡＡＡＧＴＴＴＧＡＡＴＴＧＧＧＴＴＴＧＧＡＧＴＴＴＣＣＣＡＡＴＣＴＴＣＣＴＴＡＴＴＡＴＡＴＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＴＴＡＡＡＴＴＡＡＣＡＣＡＧＴＣＴＡＴＧＧＣＣＡＴＣＡＴＡＣＧＴＴＡＴＡＴＡＧＣＴＧＡＣＡＡＧＣＡＣＡＡＣＡＴＧＴＴＧＧＧＴＧＧＴＴＧＴＣＣＡＡＡＡＧＡＧＣＧＴＧＣＡＧＡＧＡＴＴＴＣＡＡＴＧＣＴＴＧＡＡＧＧＡＧＣＧＧＴＴＴＴＧＧＡＴＡＴＴＡＧＡＴＡＣＧＧＴＧＴＴＴＣＧＡＧＡＡＴＴＧＣＡＴＡＴＡＧＴＡＡＡＧＡＣＴＴＴＧＡＡＡＣＴＣＴＣＡＡＡＧＴＴＧＡＴＴＴＴＣＴＴＡＧＣＡＡＧＣＴＡＣＣＴＧＡＡＡＴＧＣＴＧＡＡＡＡＴＧＴＴＣＧＡＡＧＡＴＣＧＴＴＴＡＴＧＴＣＡＴＡＡＡＡＣＡＴＡＴＴＴＡＡＡＴＧＧＴＧＡＴＣＡＴＧＴＡＡＣＣＣＡＴＣＣＴＧＡＣＴＴＣＡＴＧＴＴＧＴＡＴＧＡＣＧＣＴＣＴＴＧＡＴＧＴＴＧＴＴＴＴＡＴＡＣＡＴＧＧＡＣＣＣＡＡＴＧＴＧＣＣＴＧＧＡＴＧＣＧＴＴＣＣＣＡＡＡＡＴＴＡＧＴＴＴＧＴＴＴＴＡＡＡＡＡＡＣＧＴＡＴＴＧＡＡＧＣＴＡＴＣＣＣＡＣＡＡＡＴＴＧＡＴＡＡＧＴＡＣＴＴＧＡＡＡＴＣＣＡＧＣＡＡＧＴＡＴＡＴＡＧＣＡＴＧＧＣＣＴＴＴＧＣＡＧＧＧＣＴＧＧＣＡＡＧＣＣＡＣＧＴＴＴＧＧＴＧＧＴＧＧＣＧＡＣＣＡＴＣＣＴＣＣＡＡＡＡＴＣＧＧＡＴＣＴＧＧＴＴＣＣＧＣＧＴＧＧＡＴＣＣ−３’（配列番号５７）
配列番号５７の配列は、ｐＧＥＸ−４Ｔ３に由来する配列である。
配列（ＸＶ）〜（ＸＸ）において、Ｎ４は、Ｎ３のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列である。Ｎ４の一例としては、以下の配列を挙げることができる。
３’−ＣＣＴＡＧＧＧＧＣＴＴＡＡＧＧＧＣＣＣＡＧＣＴＧＡＧＣＴＣＧＣＣＧＧＣＧＴＡＧＣＡＣＴＧＡＣＴＧＡＣＴＧＣＴＡＧＡＣＧＧＡＧＣＧＣＧＣＡＡＡＧＣＣＡＣＴＡＣＴＧＣＣＡＣＴＴＴＴＧＧＡＧＡＣＴＧＴＧＴＡＣＧＴＣＧＡＧＧＧＣＣＴＣＴＧＣＣＡＧＴＧＴＣＧＡＡＣＡＧＡＣＡＴＴＣＧＣＣＴＡＣＧＧＣＣＣＴＣＧＴＣＴＧＴＴＣＧＧＧＣＡＧＴＣＣＣＧＣＧＣＡＧＴＣＧＣＣＣＡＣＡＡＣＣＧＣＣＣＡＣＡＧＣＣＣＣＧＣＧＴＣＧＧＴＡＣＴＧＧＧＴＣＡＧＴＧＣＡＴＣＧＣＴＡＴＣＧＣＣＴＣＡＣＡＴＡＴＴＡＡＧＡＡＣＴＴＣＴＧＣＴＴＴＣＣＣＧＧＡＧＣＡＣＴＡＴＧＣＧＧＡＴＡＡＡＡＡＴＡＴＣＣＡＡＴＴＡＣＡＧＴＡＣＴＡＴＴＡＴＴＡＣＣＡＡＡＧＡＡＴＣＴＧＣＡＧＴＣＣＡＣＣＧＴＧＡＡＡＡＧＣＣＣＣＴＴＴＡＣＡＣＧＣＧＣＣＴＴＧＧＧＧＡＴＡＡＡＣＡＡＡＴＡＡＡＡＡＧＡＴＴＴＡＴＧＴＡＡＧＴＴＴＡＴＡＣＡＴＡＧＧＣＧＡＧＴＡＣＴＣＴＧＴＴＡＴＴＧＧＧＡＣＴＡＴＴＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴＴＡＴＡＡＣＴＴＴＴＴＣＣＴＴＣＴＣＡＴＡＣＴＣＡＴＡＡＧＴＴＧＴＡＡＡＧＧＣＡＣＡＧＣＧＧＧＡＡＴＡＡＧＧＧＡＡＡＡＡＡＣＧＣＣＧＴＡＡＡＡＣＧＧＡＡＧＧＡＣＡＡＡＡＡＣＧＡＧＴＧＧＧＴＣＴＴＴＧＣＧＡＣＣＡＣＴＴＴＣＡＴＴＴＴＣＴＡＣＧＡＣＴＴＣＴＡＧＴＣＡＡＣＣＣＡＣＧＴＧＣＴＣＡＣＣＣＡＡＴＧＴＡＧＣＴＴＧＡＣＣＴＡＧＡＧＴＴＧＴＣＧＣＣＡＴＴＣＴＡＧＧＡＡＣＴＣＴＣＡＡＡＡＧＣＧＧＧＧＣＴＴＣＴＴＧＣＡＡＡＡＧＧＴＴＡＣＴＡＣＴＣＧＴＧＡＡＡＡＴＴＴＣＡＡＧＡＣＧＡＴＡＣＡＣＣＧＣＧＣＣＡＴＡＡＴＡＧＧＧＣＡＣＡＡＣＴＧＣＧＧＣＣＣＧＴＴＣＴＣＧＴＴＧＡＧＣＣＡＧＣＧＧＣＧＴＡＴＧＴＧＡＴＡＡＧＡＧＴＣＴＴＡＣＴＧＡＡＣＣＡＡＣＴＣＡＴＧＡＧＴＧＧＴＣＡＧＴＧＴＣＴＴＴＴＣＧＴＡＧＡＡＴＧＣＣＴＡＣＣＧＴＡＣＴＧＴＣＡＴＴＣＴＣＴＴＡＡＴＡＣＧＴＣＡＣＧＡＣＧＧＴＡＴＴＧＧＴＡＣＴＣＡＣＴＡＴＴＧＴＧＡＣＧＣＣＧＧＴＴＧＡＡＴＧＡＡＧＡＣＴＧＴＴＧＣＴＡＧＣＣＴＣＣＴＧＧＣＴＴＣＣＴＣＧＡＴＴＧＧＣＧＡＡＡＡＡＡＣＧＴＧＴＴＧＴＡＣＣＣＣＣＴＡＧＴＡＣＡＴＴＧＡＧＣＧＧＡＡＣＴＡＧＣＡＡＣＣＣＴＴＧＧＣＣＴＣＧＡＣＴＴＡＣＴＴＣＧＧＴＡＴＧＧＴＴＴＧＣＴＧＣＴＣＧＣＡＣＴＧＴＧＧＴＧＣＴＡＣＧＧＡＣＧＴＣＧＴＴＡＣＣＧＴＴＧＴＴＧＣＡＡＣＧＣＧＴＴＴＧＡＴＡＡＴＴＧＡＣＣＧＣＴＴＧＡＴＧＡＡＴＧＡＧＡＴＣＧＡＡＧＧＧＣＣＧＴＴＧＴＴＡＡＴＴＡＴＣＴＧＡＣＣＴＡＣＣＴＣＣＧＣＣＴＡＴＴＴＣＡＡＣＧＴＣＣＴＧＧＴＧＡＡＧＡＣＧＣＧＡＧＣＣＧＧＧＡＡＧＧＣＣＧＡＣＣＧＡＣＣＡＡＡＴＡＡＣＧＡＣＴＡＴＴＴＡＧＡＣＣＴＣＧＧＣＣＡＣＴＣＧＣＡＣＣＣＡＧＡＧＣＧＣＣＡＴＡＧＴＡＡＣＧＴＣＧＴＧＡＣＣＣＣＧＧＴＣＴＡＣＣＡＴＴＣＧＧＧＡＧＧＧＣＡＴＡＧＣＡＴＣＡＡＴＡＧＡＴＧＴＧＧＴＧＣＣＣＣＴＣＧＧＴＣＣＧＴＴＧＡＴＡＣＣＴＡＣＴＴＧＣＴＴＴＡＴＣＴＧＴＣＴＡＧＣＧＡＣＴＣＴＡＴＣＣＡＣＧＧＡＧＴＧＡＣＴＡＡＴＴＣＧＴＡＡＣＣＡＴＴＧＡＣＡＧＴＣＴＧＧＴＴＣＡＡＡＴＧＡＧＴＡＴＡＴＡＴＧＡＡＡＴＣＴＡＡＣＴＡＡＡＴＴＴＴＧＡＡＧＴＡＡＡＡＡＴＴＡＡＡＴＴＴＴＣＣＴＡＧＡＴＣＣＡＣＴＴＣＴＡＧＧＡＡＡＡＡＣＴＡＴＴＡＧＡＧＴＡＣＴＧＧＴＴＴＴＡＧＧＧＡＡＴＴＧＣＡＣＴＣＡＡＡＡＧＣＡＡＧＧＴＧＡＣＴＣＧＣＡＧＴＣＴＧＧＧＧＣＡＴＣＴＴＴＴＣＴＡＧＴＴＴＣＣＴＡＧＡＡＧＡＡＣＴＣＴＡＧＧＡＡＡＡＡＡＡＧＡＣＧＣＧＣＡＴＴＡＧＡＣＧＡＣＧＡＡＣＧＴＴＴＧＴＴＴＴＴＴＴＧＧＴＧＧＣＧＡＴＧＧＴＣＧＣＣＡＣＣＡＡＡＣＡＡＡＣＧＧＣＣＴＡＧＴＴＣＴＣＧＡＴＧＧＴＴＧＡＧＡＡＡＡＡＧＧＣＴＴＣＣＡＴＴＧＡＣＣＧＡＡＧＴＣＧＴＣＴＣＧＣＧＴＣＴＡＴＧＧＴＴＴＡＴＧＡＣＡＧＧＡＡＧＡＴＣＡＣＡＴＣＧＧＣＡＴＣＡＡＴＣＣＧＧＴＧＧＴＧＡＡＧＴＴＣＴＴＧＡＧＡＣＡＴＣＧＴＧＧＣＧＧＡＴＧＴＡＴＧＧＡＧＣＧＡＧＡＣＧＡＴＴＡＧＧＡＣＡＡＴＧＧＴＣＡＣＣＧＡＣＧＡＣＧＧＴＣＡＣＣＧＣＴＡＴＴＣＡＧＣＡＣＡＧＡＡＴＧＧＣＣＣＡＡＣＣＴＧＡＧＴＴＣＴＧＣＴＡＴＣＡＡＴＧＧＣＣＴＡＴＴＣＣＧＣＧＴＣＧＣＣＡＧＣＣＣＧＡＣＴＴＧＣＣＣＣＣＣＡＡＧＣＡＣＧＴＧＴＧＴＣＧＧＧＴＣＧＡＡＣＣＴＣＧＣＴＴＧＣＴＧＧＡＴＧＴＧＧＣＴＴＧＡＣＴＣＴＡＴＧＧＡＴＧＴＣＧＣＡＣＴＣＧＡＴＡＣＴＣＴＴＴＣＧＣＧＧＴＧＣＧＡＡＧＧＧＣＴＴＣＣＣＴＣＴＴＴＣＣＧＣＣＴＧＴＣＣＡＴＡＧＧＣＣＡＴＴＣＧＣＣＧＴＣＣＣＡＧＣＣＴＴＧＴＣＣＴＣＴＣＧＣＧＴＧＣＴＣＣＣＴＣＧＡＡＧＧＴＣＣＣＣＣＴＴＴＧＣＧＧＡＣＣＡＴＡＧＡＡＡＴＡＴＣＡＧＧＡＣＡＧＣＣＣＡＡＡＧＣＧＧＴＧＧＡＧＡＣＴＧＡＡＣＴＣＧＣＡＧＣＴＡＡＡＡＡＣＡＣＴＡＣＧＡＧＣＡＧＴＣＣＣＣＣＣＧＣＣＴＣＧＧＡＴＡＣＣＴＴＴＴＴＧＣＧＧＴＣＧＴＴＧＣＧＣＣＧＧＡＡＡＡＡＴＧＣＣＡＡＧＧＡＣＣＧＧＡＡＡＡＣＧＡＣＣＧＧＡＡＡＡＣＧＡＧＴＧＴＡＣＡＡＧＡＡＡＧＧＡＣＧＣＡＡＴＡＧＧＧＧＡＣＴＡＡＧＡＣＡＣＣＴＡＴＴＧＧＣＡＴＡＡＴＧＧＣＧＧＡＡＡＣＴＣＡＣＴＣＧＡＣＴＡＴＧＧＣＧＡＧＣＧＧＣＧＴＣＧＧＣＴＴＧＣＴＧＧＣＴＣＧＣＧＴＣＧＣＴＣＡＧＴＣＡＣＴＣＧＣＴＣＣＴＴＣＧＣＣＴＴＣＴＣＧＣＧＧＡＣＴＡＣＧＣＣＡＴＡＡＡＡＧＡＧＧＡＡＴＧＣＧＴＡＧＡＣＡＣＧＣＣＡＴＡＡＡＧＴＧＴＧＧＣＧＴＡＴＴＴＡＡＧＧＣＴＧＴＧＧＴＡＧＣＴＴＡＣＣＡＣＧＴＴＴＴＧＧＡＡＡＧＣＧＣＣＡＴＡＣＣＧＴＡＣＴＡＴＣＧＣＧＧＧＣＣＴＴＣＴＣＴＣＡＧＴＴＡＡＧＴＣＣＣＡＣＣＡＣＴＴＡＣＡＣＴＴＴＧＧＴＣＡＴＴＧＣＡＡＴＡＴＧＣＴＡＣＡＧＣＧＴＣＴＣＡＴＡＣＧＧＣＣＡＣＡＧＡＧＡＡＴＡＧＴＣＴＧＧＣＡＡＡＧＧＧＣＧＣＡＣＣＡＣＴＴＧＧＴＣＣＧＧＴＣＧＧＴＧＣＡＡＡＧＡＣＧＣＴＴＴＴＧＣＧＣＣＣＴＴＴＴＴＣＡＣＣＴＴＣＧＣＣＧＣＴＡＣＣＧＣＣＴＣＧＡＣＴＴＡＡＴＧＴＡＡＧＧＧＴＴＧＧＣＧＣＡＣＣＧＴＧＴＴＧＴＴＧＡＣＣＧＣＣＣＧＴＴＴＧＴＣＡＧＣＡＡＣＧＡＣＴＡＡＣＣＧＣＡＡＣＧＧＴＧＧＡＧＧＴＣＡＧＡＣＣＧＧＧＡＣＧＴＧＣＧＣＧＧＣＡＧＣＧＴＴＴＡＡＣＡＧＣＧＣＣＧＣＴＡＡＴＴＴＡＧＡＧＣＧＣＧＧＣＴＡＧＴＴＧＡＣＣＣＡＣＧＧＴＣＧＣＡＣＣＡＣＣＡＣＡＧＣＴＡＣＣＡＴＣＴＴＧＣＴＴＣＧＣＣＧＣＡＧＣＴＴＣＧＧＡＣＡＴＴＴＣＧＣＣＧＣＣＡＣＧＴＧＴＴＡＧＡＡＧＡＧＣＧＣＧＴＴＧＣＧＣＡＧＴＣＡＣＣＣＧＡＣＴＡＧＴＡＡＴＴＧＡＴＡＧＧＣＧＡＣＣＴＡＣＴＧＧＴＣＣＴＡＣＧＧＴＡＡＣＧＡＣＡＣＣＴＴＣＧＡＣＧＧＡＣＧＴＧＡＴＴＡＣＡＡＧＧＣＣＧＣＡＡＴＡＡＡＧＡＡＣＴＡＣＡＧＡＧＡＣＴＧＧＴＣＴＧＴＧＧＧＴＡＧＴＴＧＴＣＡＴＡＡＴＡＡＡＡＧＡＧＧＧＴＡＣＴＴＣＴＧＣＣＡＴＧＣＧＣＴＧＡＣＣＣＧＣＡＣＣＴＣＧＴＡＧＡＣＣＡＧＣＧＴＡＡＣＣＣＡＧＴＧＧＴＣＧＴＴＴＡＧＣＧＣＧＡＣＡＡＴＣＧＣＣＣＧＧＧＴＡＡＴＴＣＡＡＧＡＣＡＧＡＧＣＣＧＣＧＣＡＧＡＣＧＣＡＧＡＣＣＧＡＣＣＧＡＣＣＧＴＡＴＴＴＡＴＡＧＡＧＴＧＡＧＣＧＴＴＡＧＴＴＴＡＡＧＴＣＧＧＣＴＡＴＣＧＣＣＴＴＧＣＣＣＴＴＣＣＧＣＴＧＡＣＣＴＣＡＣＧＧＴＡＣＡＧＧＣＣＡＡＡＡＧＴＴＧＴＴＴＧＧＴＡＣＧＴＴＴＡＣＧＡＣＴＴＡＣＴＣＣＣＧＴＡＧＣＡＡＧＧＧＴＧＡＣＧＣＴＡＣＧＡＣＣＡＡＣＧＧＴＴＧＣＴＡＧＴＣＴＡＣＣＧＣＧＡＣＣＣＧＣＧＴＴＡＣＧＣＧＣＧＧＴＡＡＴＧＧＣＴＣＡＧＧＣＣＣＧＡＣＧＣＧＣＡＡＣＣＡＣＧＣＣＴＡＴＡＧＡＧＣＣＡＴＣＡＣＣＣＴＡＴＧＣＴＧＣＴＡＴＧＧＣＴＴＣＴＧＴＣＧＡＧＴＡＣＡＡＴＡＴＡＧＧＧＣＧＧＣＡＡＴＴＧＧＴＧＧＴＡＧＴＴＴＧＴＣＣＴＡＡＡＡＧＣＧＧＡＣＧＡＣＣＣＣＧＴＴＴＧＧＴＣＧＣＡＣＣＴＧＧＣＧＡＡＣＧＡＣＧＴＴＧＡＧＡＧＡＧＴＣＣＣＧＧＴＣＣＧＣＣＡＣＴＴＣＣＣＧＴＴＡＧＴＣＧＡＣＡＡＣＧＧＧＣＡＧＡＧＴＧＡＣＣＡＣＴＴＴＴＣＴＴＴＴＴＧＧＴＧＧＧＡＣＣＧＣＧＧＧＴＴＡＴＧＣＧＴＴＴＧＧＣＧＧＡＧＡＧＧＧＧＣＧＣＧＣＡＡＣＣＧＧＣＴＡＡＧＴＡＡＴＴＡＣＧＴＣＧＡＣＣＧＴＧＣＴＧＴＣＣＡＡＡＧＧＧＣＴＧＡＣＣＴＴＴＣＧＣＣＣＧＴＣＡＣＴＣＧＣＧＴＴＧＣＧＴＴＡＡＴＴＡＣＡＣＴＣＡＡＴＣＧＡＧＴＧＡＧＴＡＡＴＣＣＧＴＧＧＧＧＴＣＣＧＡＡＡＴＧＴＧＡＡＡＴＡＣＧＡＡＧＧＣＣＧＡＧＣＡＴＡＣＡＡＣＡＣＡＣＣＴＴＡＡＣＡＣＴＣＧＣＣＴＡＴＴＧＴＴＡＡＡＧＴＧＴＧＴＣＣＴＴＴＧＴＣＧＡＴＡＣＴＧＧＴＡＣＴＡＡＴＧＣＣＴＡＡＧＴＧＡＣＣＧＧＣＡＧＣＡＡＡＡＴＧＴＴＧＣＡＧＣＡＣＴＧＡＣＣＣＴＴＴＴＧＧＧＡＣＣＧＣＡＡＴＧＧＧＴＴＧＡＡＴＴＡＧＣＧＧＡＡＣＧＴＣＧＴＧＴＡＧＧＧＧＧＡＡＡＧＣＧＧＴＣＧＡＣＣＧＣＡＴＴＡＴＣＧＣＴＴＣＴＣＣＧＧＧＣＧＴＧＧＣＴＡＧＣＧＧＧＡＡＧＧＧＴＴＧＴＣＡＡＣＧＣＧＴＣＧＧＡＣＴＴＡＣＣＧＣＴＴＡＣＣＧＣＧＡＡＡＣＧＧＡＣＣＡＡＡＧＧＣＣＧＴＧＧＴＣＴＴＣＧＣＣＡＣＧＧＣＣＴＴＴＣＧＡＣＣＧＡＣＣＴＣＡＣＧＣＴＡＧＡＡＧＧＡＣＴＣＣＧＧＣＴＡＴＧＡＣＡＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＡＧＴＴＴＧＡＣＣＧＴＣＴＡＣＧＴＧＣＣＡＡＴＧＣＴＡＣＧＣＧＧＧＴＡＧＡＴＧＴＧＧＴＴＧＣＡＴＴＧＧＡＴＡＧＧＧＴＡＡＴＧＣＣＡＧＴＴＡＧＧＣＧＧＣＡＡＡＣＡＡＧＧＧＴＧＣＣＴＣＴＴＡＧＧＣＴＧＣＣＣＡＡＣＡＡＴＧＡＧＣＧＡＧＴＧＴＡＡＡＴＴＡＣＡＡＣＴＡＣＴＴＴＣＧＡＣＣＧＡＴＧＴＣＣＴＴＣＣＧＧＴＣＴＧＣＧＣＴＴＡＡＴＡＡＡＡＡＣＴＡＣＣＧＣＡＡＣＣＴＴＡＡＴＧＣＡＡＴＡＧＣＴＧＡＣＧＴＧＣＣＡＣＧＴＧＧＴＴＡＣＧＡＡＧＡＣＣＧＣＡＧＴＣＣＧＴＣＧＧＴＡＧＣＣＴＴＣＧＡＣＡＣＣＡＴＡＣＣＧＡＣＡＣＧＴＣＣＡＧＣＡＴＴＴＡＧＴＧＡＣＧＴＡＴＴＡＡＧＣＡＣＡＧＣＧＡＧＴＴＣＣＧＣＧＴＧＡＧＧＧＣＡＡＧＡＣＣＴＡＴＴＡＣＡＡＡＡＡＡＣＧＣＧＧＣＴＧＴＡＧＴＡＴＴＧＣＣＡＡＧＡＣＣＧＴＴＴＡＴＡＡＧＡＣＴＴＴＡＣＴＣＧＡＣＡＡＣＴＧＴＴＡＡＴＴＡＧＴＡＧＣＣＧＡＧＣＡＴＡＴＴＡＣＡＣＡＣＣＴＴＡＡＣＡＣＴＣＧＣＣＴＡＴＴＧＴＴＡＡＡＧＴＧＴＧＴＣＣＴＴＴＧＴＣＡＴＡＡＧＴＡＣＡＧＧＧＧＡＴＡＴＧＡＴＣＣＡＡＴＡＡＣＣＴＴＴＴＡＡＴＴＣＣＣＧＧＡＡＣＡＣＧＴＴＧＧＧＴＧＡＧＣＴＧＡＡＧＡＡＡＡＣＣＴＴＡＴＡＧＡＡＣＴＴＣＴＴＴＴＴＡＴＡＣＴＴＣＴＣＧＴＡＡＡＣＡＴＡＣＴＣＧＣＧＣＴＡＣＴＴＣＣＡＣＴＡＴＴＴＡＣＣＧＣＴＴＴＧＴＴＴＴＴＣＡＡＡＣＴＴＡＡＣＣＣＡＡＡＣＣＴＣＡＡＡＧＧＧＴＴＡＧＡＡＧＧＡＡＴＡＡＴＡＴＡＡＣＴＡＣＣＡＣＴＡＣＡＡＴＴＴＡＡＴＴＧＴＧＴＣＡＧＡＴＡＣＣＧＧＴＡＧＴＡＴＧＣＡＡＴＡＴＡＴＣＧＡＣＴＧＴＴＣＧＴＧＴＴＧＴＡＣＡＡＣＣＣＡＣＣＡＡＣＡＧＧＴＴＴＴＣＴＣＧＣＡＣＧＴＣＴＣＴＡＡＡＧＴＴＡＣＧＡＡＣＴＴＣＣＴＣＧＣＣＡＡＡＡＣＣＴＡＴＡＡＴＣＴＡＴＧＣＣＡＣＡＡＡＧＣＴＣＴＴＡＡＣＧＴＡＴＡＴＣＡＴＴＴＣＴＧＡＡＡＣＴＴＴＧＡＧＡＧＴＴＴＣＡＡＣＴＡＡＡＡＧＡＡＴＣＧＴＴＣＧＡＴＧＧＡＣＴＴＴＡＣＧＡＣＴＴＴＴＡＣＡＡＧＣＴＴＣＴＡＧＣＡＡＡＴＡＣＡＧＴＡＴＴＴＴＧＴＡＴＡＡＡＴＴＴＡＣＣＡＣＴＡＧＴＡＣＡＴＴＧＧＧＴＡＧＧＡＣＴＧＡＡＧＴＡＣＡＡＣＡＴＡＣＴＧＣＧＡＧＡＡＣＴＡＣＡＡＣＡＡＡＡＴＡＴＧＴＡＣＣＴＧＧＧＴＴＡＣＡＣＧＧＡＣＣＴＡＣＧＣＡＡＧＧＧＴＴＴＴＡＡＴＣＡＡＡＣＡＡＡＡＴＴＴＴＴＴＧＣＡＴＡＡＣＴＴＣＧＡＴＡＧＧＧＴＧＴＴＴＡＡＣＴＡＴＴＣＡＴＧＡＡＣＴＴＴＡＧＧＴＣＧＴＴＣＡＴＡＴＡＴＣＧＴＡＣＣＧＧＡＡＡＣＧＴＣＣＣＧＡＣＣＧＴＴＣＧＧＴＧＣＡＡＡＣＣＡＣＣＡＣＣＧＣＴＧＧＴＡＧＧＡＧＧＴＴＴＴＡＧＣＣＴＡＧＡＣＣＡＡＧＧＣＧＣＡＣＣＴＡＧＧ−５’（配列番号５８）
配列番号５８の配列は、配列番号５７の配列に相補的な配列である。
本願の第３発明は、本願の第１発明のベクターを第一の制限酵素で処理したものに順方向で挿入された場合には第二の制限酵素の切断認識配列が出現しないが、逆方向で挿入された場合には第二の制限酵素の切断認識配列が出現するように設計された配列を含む外来遺伝子を本願の第１発明のベクターに組み込んだ組換えベクターを提供する。本願の第１発明のベクターを第一の制限酵素で処理したものに外来遺伝子が順方向で挿入された組換えベクターが好ましい。外来遺伝子は蛋白質及び／又は蛋白質ドメインをコードするとよい。
本願の第４発明は、本願の第３発明の組換えベクターを含む形質転換体またはその子孫を提供する。
本願の第５発明は、第一の制限酵素によって認識される塩基配列の異なる２つの切断認識配列であって、そのうち一方の切断認識配列は第一の制限酵素とは異なる第二の制限酵素によって認識される切断認識配列の一部を含むが、他方の切断認識配列は前記の第二の制限酵素によって認識される切断認識配列の一部を含まない前記の２つの切断認識配列を含む二本鎖ＤＮＡをプラスミド、ファージ、コスミド、Ｐ１ベクター、細菌人工染色体ベクターまたは酵母人工染色体ベクターのマルチクローニングサイトに導入することを含む、本願の第１発明のベクターの製造方法を提供する。
本願の第６発明は、第一の制限酵素によって認識される塩基配列の異なる２つの切断認識配列であって、そのうち一方の切断認識配列は第一の制限酵素とは異なる第二の制限酵素によって認識される切断認識配列の一部を含むが、他方の切断認識配列は前記の第二の制限酵素によって認識される切断認識配列の一部を含まない前記の２つの切断認識配列を含む二本鎖ＤＮＡを提供する。
本願の第６発明の二本鎖ＤＮＡとしては、下記の配列（ＩＸ）及び（Ｘ）で表される二本鎖ＤＮＡを例示することができる。。
５’−ＧＡＣＸ１ａＸ２ａＴＸ３ａＸ４ａＧＴＣ−Ｎ１−ＧＡＣＸ５ａＸ６ａＡＸ７ａＸ８ａＧＴＣ−３’（ＩＸ）
３’−ＣＴＧＸ１ｂＸ２ｂＡＸ３ｂＸ４ｂＣＡＧ−Ｎ２−ＣＴＧＸ５ｂＸ６ｂＴＸ７ｂＸ８ｂＣＡＧ−５’（Ｘ）
（配列（ＩＸ）及び（Ｘ）中、Ｇはグアニン、Ａはアデニン、Ｃはシトシン、Ｔはチミンであり、
Ｘ１ａ〜Ｘ８ａ及びＸ１ｂ〜Ｘ８ｂはそれぞれ独立にグアニン、アデニン、シトシンまたはチミンのいずれかの塩基であり、Ｘ１ａとＸ１ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｘ２ａとＸ２ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｘ３ａとＸ３ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｘ４ａとＸ４ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｘ５ａとＸ５ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｘ６ａとＸ６ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｘ７ａとＸ７ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｘ８ａとＸ８ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、
配列ＣＸ１ａＸ２ａＴはＮｃｏＩ，ＤｓａＩ，ＥｃｏＴ１４Ｉ，ＮｄｅＩ，ＳｆｅＩ，ＡｖａＩ，ＳｍｌＩ，ＸｈｏＩ，ＰｓｔＩ，ＥｃｏＴ２２Ｉ，ＰｓｈＢＩ，ＡｃｃＩ，ＡｐａＬＩ，ＰｓｉＩ，ＳｃａＩ，ＳｐｌＩ，Ｂｓｐ１１０７Ｉ，Ｂｓｐ１２８６Ｉ，ＢｓｐＴ１０７Ｉ，Ｂｓｐ１４０７Ｉ，ＴａｔＩ，ＨｇｉＣＩ，ＫｐｎＩ，ＳｐｅＩ，ＢｌｎＩ，ＮｈｅＩ，ＸｂａＩ，ＳｓｐＩ，ＥｃｏＲＶまたはそれらのイソスキゾマーの切断認識配列の５’側の部分配列を含む塩基配列であり、
配列ＣＸ８ｂＸ７ｂＴは配列ＣＸ１ａＸ２ａＴに含まれるところのＮｃｏＩ，ＤｓａＩ，ＥｃｏＴ１４Ｉ，ＮｄｅＩ，ＳｆｅＩ，ＡｖａＩ，ＳｍｌＩ，ＸｈｏＩ，ＰｓｔＩ，ＥｃｏＴ２２Ｉ，ＰｓｈＢＩ，ＡｃｃＩ，ＡｐａＬＩ，ＰｓｉＩ，ＳｃａＩ，ＳｐｌＩ，Ｂｓｐ１１０７Ｉ，Ｂｓｐ１２８６Ｉ，ＢｓｐＴ１０７Ｉ，Ｂｓｐ１４０７Ｉ，ＴａｔＩ，ＨｇｉＣＩ，ＫｐｎＩ，ＳｐｅＩ，ＢｌｎＩ，ＮｈｅＩ，ＸｂａＩ，ＳｓｐＩ，ＥｃｏＲＶまたはそれらのイソスキゾマーの切断認識配列の部分配列を含まない塩基配列であり、
５’−及び３’−は２本鎖ＤＮＡのそれぞれの末端を示し、
Ｎ１は存在しなくともよいが、存在する場合には、１〜１０００塩基の任意のヌクレオチド配列であり、
Ｎ２は存在しなくともよいが、存在する場合には、Ｎ１のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列である。）
また、本願の第６発明の二本鎖ＤＮＡとして、下記の配列（ＸＩ）及び（ＸＩＩ）で表される二本鎖ＤＮＡを例示することができる。
５’−ＣＣＡＹ１ａＹ２ａＹ３ａＹ４ａＴＹ５ａＹ６ａＹ７ａＹ８ａＴＧＧ−Ｎ１−ＣＣＡＹ９ａＹ１０Ｙ１１ａＹ１２ａＡＹ１３ａＹ１４ａＹ１５ａＹ１６ａＴＧＧ−３’（ＸＩ）
３’−ＧＧＴＹ１ｂＹ２ｂＹ３ｂＹ４ｂＡＹ５ｂＹ６ｂＹ７ｂＹ８ｂＡＣＣ−Ｎ２−ＧＧＴＹ９ｂＹ１０ｂＹ１１ｂＹ１２ｂＴＹ１３ｂＹ１４ｂＹ１５ｂＹ１６ｂＡＣＣ−５’（ＸＩＩ）
（配列（ＸＩ）及び（ＸＩＩ）中、Ｇはグアニン、Ａはアデニン、Ｃはシトシン、Ｔはチミンであり、
Ｙ１ａ〜Ｙ１６ａ及びＹ１ｂ〜Ｙ１６ｂはそれぞれ独立にグアニン、アデニン、シトシンまたはチミンのいずれかの塩基であり、Ｙ１ａとＹ１ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ２ａとＹ２ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ３ａとＹ３ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ４ａとＹ４ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ５ａとＹ５ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ６ａとＹ６ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ７ａとＹ７ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ８ａとＹ８ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ９ａとＹ９ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ１０ａとＹ１０ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ１１ａとＹ１１ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ１２ａとＹ１２ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ１３ａとＹ１３ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ１４ａとＹ１４ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ１５ａとＹ１５ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ１６ａとＹ１６ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、
配列Ｙ１ａＹ２ａＹ３ａＹ４ａＴはＮｃｏＩ，ＤｓａＩ，ＥｃｏＴ１４Ｉ，ＮｄｅＩ，ＳｆｅＩ，ＡｖａＩ，ＳｍｌＩ，ＸｈｏＩ，ＰｓｔＩ，ＥｃｏＴ２２Ｉ，ＰｓｈＢＩ，ＡｃｃＩ，ＡｐａＬＩ，ＰｓｉＩ，ＳｃａＩ，ＳｐｌＩ，Ｂｓｐ１１０７Ｉ，Ｂｓｐ１２８６Ｉ，ＢｓｐＴ１０７Ｉ，Ｂｓｐ１４０７Ｉ，ＴａｔＩ，ＨｇｉＣＩ，ＫｐｎＩ，ＳｐｅＩ，ＢｌｎＩ，ＮｈｅＩ，ＸｂａＩ，ＳｓｐＩ，ＥｃｏＲＶ，ＡｆｌＩＩＩ，ＢｓｐＬＵ１１Ｉ，ＮｓｐＩ，ＳｐｈＩ，ＢｓｐＨＩ，ＢｓａＡＩ，ＰｍａＣＩ，ＳｎａＢＩ，ＮｓｐＢＩＩ、ＰｖｕＩＩ，ＢａｎＩＩ，ＨｇｉＡＩ，ＳａｃＩまたはそれらのイソスキゾマーの切断認識配列の５’側の部分配列を含む塩基配列であり、
配列Ｙ１６ｂＹ１５ｂＹ１４ｂＹ１３ｂＴは配列Ｙ１ａＹ２ａＹ３ａＹ４ａＴに含まれるところのＮｃｏＩ，ＤｓａＩ，ＥｃｏＴ１４Ｉ，ＮｄｅＩ，ＳｆｅＩ，ＡｖａＩ，ＳｍｌＩ，ＸｈｏＩ，ＰｓｔＩ，ＥｃｏＴ２２Ｉ，ＰｓｈＢＩ，ＡｃｃＩ，ＡｐａＬＩ，ＰｓｉＩ，ＳｃａＩ，ＳｐｌＩ，Ｂｓｐ１１０７Ｉ，Ｂｓｐ１２８６Ｉ，ＢｓｐＴ１０７Ｉ，Ｂｓｐ１４０７Ｉ，ＴａｔＩ，ＨｇｉＣＩ，ＫｐｎＩ，ＳｐｅＩ，ＢｌｎＩ，ＮｈｅＩ，ＸｂａＩ，ＳｓｐＩ，ＥｃｏＲＶ，ＡｆｌＩＩＩ，ＢｓｐＬＵ１１Ｉ，ＮｓｐＩ，ＳｐｈＩ，ＢｓｐＨＩ，ＢｓａＡＩ，ＰｍａＣＩ，ＳｎａＢＩ，ＮｓｐＢＩＩ、ＰｖｕＩＩ，ＢａｎＩＩ，ＨｇｉＡＩ，ＳａｃＩまたはそれらのイソスキゾマーの切断認識配列の部分配列を含まない塩基配列であり、
５’−及び３’−は２本鎖ＤＮＡのそれぞれの末端を示し、
Ｎ１は存在しなくともよいが、存在する場合には、１〜１０００塩基の任意のヌクレオチド配列であり、
Ｎ２は存在しなくともよいが、存在する場合には、Ｎ１のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列である。）
さらに、本願の第６発明の二本鎖ＤＮＡとして、下記の配列（ＸＩＩＩ）及び（ＸＩＶ）で表される二本鎖ＤＮＡを例示することができる。
５’−ＧＡＣＸ１ａＸ２ａＴＸ３ａＸ４ａＧＴＣ−Ｎ１−ＣＣＡＹ９ａＹ１０ａＹ１１ａＹ１２ａＡＹ１３ａＹ１４ａＹ１５ａＹ１６ａＴＧＧ−３’（ＸＩＩＩ）
３’−ＣＴＧＸ１ｂＸ２ｂＡＸ３ｂＸ４ｂＣＡＧ−Ｎ２−ＧＧＴＹ９ｂＹ１０ｂＹ１１ｂＹ１２ｂＴＹ１３ｂＹ１４ｂＹ１５ｂＹ１６ｂＡＣＣ−５’（ＸＩＶ）
（配列（ＸＩＩＩ）及び（ＸＩＶ）中、Ｇはグアニン、Ａはアデニン、Ｃはシトシン、Ｔはチミンであり、
Ｘ１ａ〜Ｘ４ａ及びＸ１ｂ〜Ｘ４ｂはそれぞれ独立にグアニン、アデニン、シトシンまたはチミンのいずれかの塩基であり、Ｘ１ａとＸ１ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｘ２ａとＸ２ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｘ３ａとＸ３ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｘ４ａとＸ４ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、
Ｙ９ａ〜Ｙ１６ａ及びＹ９ｂ〜Ｙ１６ｂはそれぞれ独立にグアニン、アデニン、シトシンまたはチミンのいずれかの塩基であり、Ｙ９ａとＹ９ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ１０ａとＹ１０ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ１１ａとＹ１１ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ１２ａとＹ１２ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ１３ａとＹ１３ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ１４ａとＹ１４ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ１５ａとＹ１５ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ１６ａとＹ１６ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、
配列ＣＸ１ａＸ２ａＴはＮｃｏＩ，ＤｓａＩ，ＥｃｏＴ１４Ｉ，ＮｄｅＩ，ＳｆｅＩ，ＡｖａＩ，ＳｍｌＩ，ＸｈｏＩ，ＰｓｔＩ，ＥｃｏＴ２２Ｉ，ＰｓｈＢＩ，ＡｃｃＩ，ＡｐａＬＩ，ＰｓｉＩ，ＳｃａＩ，ＳｐｌＩ，Ｂｓｐ１１０７Ｉ，Ｂｓｐ１２８６Ｉ，ＢｓｐＴ１０７Ｉ，Ｂｓｐ１４０７Ｉ，ＴａｔＩ，ＨｇｉＣＩ，ＫｐｎＩ，ＳｐｅＩ，ＢｌｎＩ，ＮｈｅＩ，ＸｂａＩ，ＳｓｐＩ，ＥｃｏＲＶまたはそれらのイソスキゾマーの切断認識配列の５’側の部分配列を含む塩基配列であり、
配列Ｙ１４ｂＹ１３ｂＴは配列ＣＸ１ａＸ２ａＴに含まれるところのＮｃｏＩ，ＤｓａＩ，ＥｃｏＴ１４Ｉ，ＮｄｅＩ，ＳｆｅＩ，ＡｖａＩ，ＳｍｌＩ，ＸｈｏＩ，ＰｓｔＩ，ＥｃｏＴ２２Ｉ，ＰｓｈＢＩ，ＡｃｃＩ，ＡｐａＬＩ，ＰｓｉＩ，ＳｃａＩ，ＳｐｌＩ，Ｂｓｐ１１０７Ｉ，Ｂｓｐ１２８６Ｉ，ＢｓｐＴ１０７Ｉ，Ｂｓｐ１４０７Ｉ，ＴａｔＩ，ＨｇｉＣＩ，ＫｐｎＩ，ＳｐｅＩ，ＢｌｎＩ，ＮｈｅＩ，ＸｂａＩ，ＳｓｐＩ，ＥｃｏＲＶまたはそれらのイソスキゾマーの切断認識配列の５’側の部分配列を含まない塩基配列であり、
５’−及び３’−は２本鎖ＤＮＡのそれぞれの末端を示し、
Ｎ１は存在しなくともよいが、存在する場合には、１〜１０００塩基の任意のヌクレオチド配列であり、
Ｎ２は存在しなくともよいが、存在する場合には、Ｎ１のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列である。）
本願の第７発明は、本願の第１発明のベクターを用いて、外来遺伝子がコードする蛋白質及び／又は蛋白質ドメインを製造する方法を提供する。
本願の第７発明の１態様においては、蛋白質及び／又は蛋白質ドメインをコードする外来遺伝子であって、本願の第１発明のベクターを第一の制限酵素で処理したものに順方向で挿入された場合には第二の制限酵素の切断認識配列が出現しないが、逆方向で挿入された場合には第二の制限酵素の切断認識配列が出現するように設計された配列を含む前記外来遺伝子を本願の第１発明のベクターに組み込んだ組換えベクターを作製し、この組換えベクターを第二の制限酵素で処理した後、宿主に導入し、宿主の単コロニーを形成させ、単コロニー由来の宿主を培養することにより、外来遺伝子がコードする蛋白質及び／又は蛋白質ドメインを発現させることができる。
本願の第７発明の別の態様においては、本願の第１発明のベクターを第一の制限酵素で処理したものに順方向で挿入された場合には第二の制限酵素の切断認識配列が出現しないが、逆方向で挿入された場合には第二の制限酵素の切断認識配列が出現するように設計された配列を含むプライマーであって、蛋白質及び／又は蛋白質ドメインをコードする外来遺伝子のｃＤＮＡを増幅することができる前記プライマーを用いて、ｃＤＮＡを鋳型として、ｃＤＮＡにおける位置及び／又は長さ及び／又は配列の一部が異なるｃＤＮＡの部分配列に相当するＤＮＡの混合物を増幅し、混合物の各々を第一の制限酵素で処理した本願の第１発明のベクターに組み込んだ組換えベクターを作製し、第二の制限酵素で組換えベクターを処理した後、宿主に導入し、宿主の単コロニーを形成させ、単コロニー由来の宿主を培養することにより、外来遺伝子がコードする蛋白質及び／又は蛋白質ドメインを発現させることができる。
本願の第８発明は、本願の第１発明のベクターを用いて、外来遺伝子がベクターに逆方向で挿入された組換えベクターを開環させ、外来遺伝子がベクターに順方向で挿入された組換えベクターを閉環したままの状態で残す方法を提供する。
本願の第８発明の１態様においては、本願の第３発明の組換えベクターを第二の制限酵素で処理することにより、外来遺伝子がベクターに逆方向で挿入された組換えベクターを開環させ、外来遺伝子がベクターに順方向で挿入された組換えベクターを閉環したままの状態で残すことができる。
本願の第９発明は、本願の第１発明のベクターを用いて、外来遺伝子がコードする蛋白質及び／又は蛋白質ドメインの発現量及び／又は溶解度を試験する方法を提供する。
本願の第９発明の１態様においては、蛋白質及び／又は蛋白質ドメインをコードする外来遺伝子であって、本願の第１発明のベクターを第一の制限酵素で処理したものに順方向で挿入された場合には第二の制限酵素の切断認識配列が出現しないが、逆方向で挿入された場合には第二の制限酵素の切断認識配列が出現するように設計された配列を含む前記外来遺伝子を本願の第１発明のベクターに組み込んだ組換えベクターを作製し、この組換えベクターを第二の制限酵素で処理した後、宿主に導入し、宿主及び／又はその子孫を培養することにより、外来遺伝子がコードする蛋白質及び／又は蛋白質ドメインを発現させ、発現した蛋白質及び／又は蛋白質ドメインの量及び／又は溶解度を調べることができる。
配列（Ｉ）を配列表の配列番号１に示す。
【００１８】
配列（ＩＩ）を配列表の配列番号２に示す。
【００１９】
配列（ＩＩＩ）を配列表の配列番号３に示す。
【００２０】
配列（ＩＶ）を配列表の配列番号４に示す。
【００２１】
配列（Ｖ）を配列表の配列番号５に示す。
【００２２】
配列（ＶＩ）を配列表の配列番号６に示す。
【００２３】
配列（ＶＩＩ）を配列表の配列番号７に示す。
【００２４】
配列（ＶＩＩＩ）を配列表の配列番号８に示す。
【００２５】
配列（ＩＸ）の一例（Ｎ１が１塩基である場合）を配列表の配列番号９に示す。
【００２６】
配列（Ｘ）の一例（Ｎ２が１塩基である場合）を配列表の配列番号１０に示す。
【００２７】
配列（ＸＩ）の一例（Ｎ１が１塩基である場合）を配列表の配列番号１１に示す。
【００２８】
配列（ＸＩＩ）の一例（Ｎ２が１塩基である場合）を配列表の配列番号１２に示す。
【００２９】
配列（ＸＩＩＩ）の一例（Ｎ３が１塩基である場合）を配列表の配列番号１３に示す。
【００３０】
配列（ＸＩＶ）の一例（Ｎ４が１塩基である場合）を配列表の配列番号１４に示す。
【００３１】
配列（ＸＶ）の一例（Ｎ３が１塩基である場合）を配列表の配列番号１５に示す。
【００３２】
配列（ＸＶＩ）の一例（Ｎ４が１塩基である場合）を配列表の配列番号１６に示す。
【００３３】
配列（ＸＶＩＩ）の一例（Ｎ３が１塩基である場合）を配列表の配列番号１７に示す。
【００３４】
配列（ＸＶＩＩＩ）の一例（Ｎ４が１塩基である場合）を配列表の配列番号１８に示す。
【００３５】
配列（ＸＩＸ）の一例（Ｎ３が１塩基である場合）を配列表の配列番号１９に示す。
【００３６】
配列（ＸＸ）の一例（Ｎ４が１塩基である場合）を配列表の配列番号２０に示す。
【００３７】
本明細書において、「蛋白質ドメイン」とは、蛋白質の部分配列であり、その部分だけでなんらかの生理活性、生化学的な機能、特徴的な物理化学的性質、または立体構造のいずれかを有するポリペプチドをいう。
【００３８】
「（外来遺伝子が）順方向で挿入された」とは、該遺伝子に含まれるＯＲＦがｐｌａｓｍｉｄの翻訳方向に対して正しい向きで挿入されたことをいう。
【００３９】
「（外来遺伝子が）逆方向で挿入された」とは、該遺伝子に含まれるＯＲＦがｐｌａｓｍｉｄの翻訳方向に対して正しい向きとは反対の向きで挿入されたことをいう。
【００４０】
「切断認識配列」とは、それぞれの制限酵素に固有の、その制限酵素が認識してそれを切断する、二本鎖ＤＮＡの塩基配列をいう。
【００４１】
「制限酵素サイドとは、特定の制限酵素の「切断認識配列」のことをいう。
【００４２】
「マルチクローニングサイト」とは複数の制限酵素サイトが連続して出現するように設計されているベクター中の塩基配列をいう。
【００４３】
「形質転換体」とは、細胞から外部に遺伝子（ＤＮＡ）が導入された結果、細胞が新しい形質を獲得し、さらにその形質が子孫の細胞にも受け継がれるようになったものをいう。
【００４４】
「宿主」とは、組換えＤＮＡ実験において、ＤＮＡの組換え分子を導入される生細胞をいう。
【００４５】
「ベクター」とは、組換えＤＮＡ実験において、宿主に異種のＤＮＡを運ぶＤＮＡをいう。
【００４６】
「単コロニー由来の宿主（または形質転換体）」とは、生細胞を十分希釈してから培地に接種し、培養してコロニーを形成させた後に、単一のコロニーを分離してさらに培養した宿主（または形質転換体）をいう。
【発明の効果】
【００４７】
本発明により、簡便な操作により、短時間で、蛋白質及び／又は蛋白質ドメインを発現させることができるベクターが提供された。
【００４８】
また、本発明により、簡便な操作により、短時間で、蛋白質及び／又は蛋白質ドメインを発現させる方法が提供された。
【００４９】
さらに、本発明により、簡便な操作により、短時間で、蛋白質及び／又は蛋白質ドメインの発現量と溶解度を試験する方法が提供された。
本明細書は、本願の優先権の基礎である日本国特許出願、特願２００３−３０８７７３号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】ｄＧＳＴ−Ｔベクター（ｐＧＥＸ−４Ｔ３−ＰＲＥＳＡＴ）の構築を示す。
【図２】ＯＲＦ方向性選択の原理を示す。図２は、第二の制限酵素がＮｃｏＩである場合を示しており、リアＰＣＲプライマーは５’−ＧＧを持つように設計されている。このプライマーで増幅されたインサートが逆方向でプラスミドに挿入されると、Ｔ／ＡクローニングサイトにＮｃｏＩ部位が出現する。第二の制限酵素がＮｄｅＩである場合には、リアＰＣＲプライマーは５’−ＧＧの代わりに５’−ＡＴＧを持つように設計するとよい。
【図３】ｄＧＳＴ−Ｔベクターを利用した可溶性蛋白質ドメインのドメイン境界の高速決定法の概念図である。（ｉ）種々のＰＣＲプライマーを設計し、一連の目的とする部分ｃＤＮＡフラグメントを増幅する。この部分ｃＤＮＡフラグメントは蛋白質ドメインを含むと推定されるものである。（ｉｉ）このフラグメントをｐＧＥＸ−４Ｔ３−ＰＲＥＳＡＴに挿入し、ＮｃｏＩまたはＮｄｅＩ選択を行い、大腸菌に形質転換し、大腸菌のコロニーを分離する。（ｉｉｉ）９６穴プレートを用いて個々のコロニーを培養し、種々のフラグメント長の標的蛋白質及び／又は蛋白質ドメインのＧＳＴ融合蛋白質を発現させる。（ｉｖ）ＣＤＮＢ発色反応により融合蛋白質の量を定量し、ＧＳＴ融合蛋白質を高発現しているクローンを選択して、さらなる解析に利用する。
【図４】ＧＳＴ融合蛋白質の発現を１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果を示す。レーンＭは分子量標準を、レーンａ１−ａ５は酵母Ｖｐｓ４を、レーンｂ１−ｂ５はヒトＶｐｓ４を、レーンｃ１−ｃ５はマウスＶｐｓ４を、レーンｄ１−ｄ５はヒトＳｎｘ１５ａを、レーンｅ１−ｅ５はマウスＳｎｘ１５ａを示す。
【図５】ＧＳＴ融合蛋白質の菌体破砕直後の溶解度を１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果を示す。レーンＭは分子量標準を、レーンｉ１−ｓ１は酵母Ｖｐｓ４を、レーンｉ２−ｓ２はヒトＶｐｓ４を、レーンｉ３−ｓ３はマウスＶｐｓ４を、レーンｉ４−ｓ４はヒトＳｎｘ１５ａを、レーンｉ５−ｓ５はマウスＳｎｘ１５ａを示す。また各レーンのｉは不溶性画分を、ｓは可溶性画分を示す。
【図６】ＧＳＴ融合蛋白質の菌体破砕直後の溶解度をＧＳＴの酵素活性の測定法である１−クロロ−２、４−ジニトロベンゼンを用いたアッセイで測定した結果を示す。図中横軸は反応開始からの時間（単位：分）、縦軸は３５０ｎｍでの紫外線の吸光度を示す。またグラフは△は酵母Ｖｐｓ４を、○はヒトＶｐｓ４を、●はマウスＶｐｓ４を、□はヒトＳｎｘ１５ａを、▲はマウスＳｎｘ１５ａを示す。
【図７】ｄＧＳＴ−Ｔベクターを利用した蛋白質ドメインの高速可溶性試験法の概念図である。〔〕内はそこで記された操作に必要とされるおおよその時間である。（ｉ）特定のＰＣＲプライマーを設計し、目的とする部分ｃＤＮＡフラグメントを増幅する。この部分ｃＤＮＡフラグメントは蛋白質全体または蛋白質ドメインを含むと推定される部分配列のいずれでもよい。（ｉｉ）このフラグメントをｐＧＥＸ−４Ｔ３−ＰＲＥＳＡＴに挿入しｌｉｇａｔｉｏｎ反応を行う。（ｉｉｉ）大腸菌ＤＨ５ａに形質転換する。（ｉｖ）液体培養を行う。（ｖ）プラスミドを単離精製する。（ｖｉ）ＮｃｏＩまたはＮｄｅＩで切断しＯＲＦ選択を行う。（ｖｉｉ）大腸菌ＢＬ２１に形質転換し、（ｖｉｉｉ）大腸菌のコロニーを形成させる。（ｉｘ）ＩＰＴＧ溶液を噴霧し、蛋白質の発現を誘導する。（ｘ）寒天培地上の大腸菌を懸濁して集める。（ｘｉ）菌体を破砕し、全菌体・可溶性画分・不溶性画分を得る。（ｘｉｉ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を行い、ゲル上のバンドの濃さよりＧＳＴ融合蛋白質が可溶性画分に含まれる量を判定する。（ｉ）−（ｘｉｉ）の全ての工程に必要とされる時間の合計はおよそ４８時間である。
【図８】ｐＧＳＴ−４Ｔ３−ＰＲＥＳＡＴにｍＶｐｓ４ｂとｍＳＮＸ１５ａのドメインをコードするｃＤＮＡをＴＡ−ｃｌｏｎｉｎｇ法で組み込み、ＮｃｏＩ ＯＲＦ選択法を経て寒天培地上でコロニー形成させたものを、単コロニー化せずに寒天培地上で発現誘導を行い、可溶性試験を行った結果を示す。レーンＭは分子量マーカーを、レーンｔ１、ｓ１、ｉ１はＧＳＴ−マウスＶｐｓ４融合蛋白質の発現の誘導を行わなかった試料を、レーンｔ２、ｓ２、ｉ２は同じくＩＰＴＧ噴霧により蛋白質発現を誘導した試料を、レーンｔ３、ｓ３、ｉ３はＧＳＴ−マウスＳＮＸ１５融合蛋白質の発現の誘導を行わなかった試料を、レーンｔ４、ｓ４、ｉ４は同じくＩＰＴＧ噴霧により蛋白質発現を誘導した試料を泳動したものであり、ｔ、ｉ、ｓはそれぞれ全菌体、不溶性画分、可溶性画分を示す。また図中矢印は発現が確認された融合蛋白質のバンドを、△はＧＳＴのみと思われるバンドを示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５１】
以下、本発明の好ましい実施態様について詳細に説明する。
１．ベクターの調製
まず、ベクターを用意する。例えば、市販のベクターを購入し、このベクターが第一及び第二の制限酵素により認識される切断認識配列を有する場合には、この切断認識配列に変異を導入するとよい。このベクターが融合蛋白質発現ベクターであると、目的蛋白質及び／又は蛋白質ドメインの発現量・溶解性を検出・測定するのが容易である点、目的蛋白質及び／又は蛋白質ドメインの精製が容易である点、目的蛋白質の機能解析・相互作用解析のための生化学実験を行う際に有利である点から便利である。後述の実施例１では、ｐＧＥＸ−４Ｔ３ベクターに、配列番号２１の配列で表されるＤＮＡを５’リン酸化したものを用いて、ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ法を用いて変異を導入した。これによりｐＧＥＸ−４Ｔ３がもともとの配列中に持っていたＡｈｄＩサイトが切断されなくなる。
【００５２】
次いで、前記ベクターに、第一の制限酵素によって認識される塩基配列の異なる２つの切断認識配列（そのうち一方の切断認識配列のみが第一の制限酵素とは異なる第二の制限酵素によって認識される切断認識配列の一部を含む）を導入するためのリンカーを用意する。このリンカーは、ベクターのマルチクローニングサイトに導入するための制限酵素部位（２箇所）を両末端に有し、第一の制限酵素によって認識される塩基配列の異なる２つの切断認識配列（そのうち一方の切断認識配列のみが第一の制限酵素とは異なる第二の制限酵素によって認識される切断認識配列の一部を含む）を持つように設計する。後述の実施例１では、ｐＥＴ３２ａベクターの誘導体ｐＥＴ３２ａＰＡＣＡＰを鋳型として配列番号２２及び２４の配列で表されるプライマーの対でＰＣＲ反応を行うことにより、両末端にＢａｍＨＩ部位を有し、この２つのＢａｍＨＩ部位の各々にＡｈｄＩ部位が結合しているＰＣＲ産物を得た。このＰＣＲ産物をＴＡクローニングベクターｐＧＥＭ−Ｔにサブクローニングして、その配列を確認した後、プラスミドを調製精製し、精製したプラスミドを制限酵素ＢａｍＨＩで切断し、約５００ｂａｓｅの断片（ＡｈｄＩリンカー）を精製した。
【００５３】
上記のベクター（後述の実施例１では、変異を導入したｐＧＥＸ−４Ｔ３ベクター）を制限酵素（後述の実施例１では、ＢａｍＨＩ）で開環し、脱リン酸化処理した後、上記のリンカー（後述の実施例１では、ＡｈｄＩリンカー）をｌｉｇａｔｉｏｎし、大腸菌に形質転換する。その後、複数の単コロニー由来の形質転換体からプラスミドを調製精製し、その塩基配列を確認して、正しい向きでリンカーが導入されたベクターを選択し、これを第一の制限酵素（後述の実施例１では、ＡｈｄＩ）で処理すると、開環状ベクター（後述の実施例１では、ｐＧＥＸ−４Ｔ３−ＰＲＥＳＡＴ）が得られる。
【００５４】
２．外来遺伝子の調製
外来遺伝子を調製する。外来遺伝子は、１で用意したベクターに順方向で挿入された場合には第二の制限酵素の切断認識配列が出現しないが、逆方向で挿入された場合には第二の制限酵素の切断認識配列が出現するように設計された配列を含む。また、外来遺伝子は、蛋白質及び／又は蛋白質ドメインをコードしているとよい。
【００５５】
外来遺伝子は、例えば、ＰＣＲ法で調製することができる。鋳型としては、目的遺伝子を含むｃＤＮＡ、プラスミド、合成ＤＮＡ、ＲＮＡなどを例示することができる。プライマーとしては、増幅したい目的遺伝子の両末端のＤＮＡ配列に相補的な２種のオリゴヌクレオチドを用いればよいが、一方のプライマーはベクターに挿入後に翻訳の読み枠がずれないように、またもう一方のプライマーは、その５’−末端に１〜１０残基の目的遺伝子には含まれない配列が付加されるように、あらかじめ正しく設計しておく必要がある。
【００５６】
ＰＣＲ反応は、ＤＮＡ二本鎖の解離、オリゴヌクレオチドとのアニーリング、及びＤＮＡポリメラーゼによる相補鎖の合成の３反応を通常２０〜４０回繰り返すことにより行われる。第１回目の反応にＤＮＡの逆転写活性を有する酵素を用いることにより、ＲＮＡからのＤＮＡ増幅も行える。
【００５７】
プライマーの塩基配列は、１で用意したベクターに順方向で挿入された場合には第二の制限酵素の切断認識配列が出現しないが、逆方向で挿入された場合には第二の制限酵素の切断認識配列が出現するように設計する。後述の実施例２では、フロントプライマー（該ｃＤＮＡのＯＲＦのＮ末端に相当する側のプライマー）は、先行するＧＳＴと読み枠が合うように最初のアミノ酸のコドンで始まり、５’末端の塩基は５’−ＧＧで始まらないように設計した。リアプライマー（ＯＲＦのＣ末端側のプライマー）は、蛋白質ドメインのＣ末端と推定される領域の境界の後にストップコドンを含むように設計し、さらにそのプライマーの５’末端の塩基が５’−ＧＧで始まるように設計した。そうすることによって、これらのプライマーで増幅されたＰＣＲ産物は、逆方向でｐＧＥＸ−４Ｔ３−ＰＲＥＳＡＴにｌｉｇａｔｉｏｎしたときにのみＮｃｏＩ部位が形成されることになる。この新たに生じたＮｃｏＩ部位は続く選択工程に利用される。
【００５８】
その他、ｐＧＥＸ−４Ｔ３−ＰＲＥＳＡＴに導入して組換え蛋白質を生産するのに用いるための、ＤＮＡを増幅するのに用いるＰＣＲプライマーを設計する場合の注意点を以下に説明する。
（１）第一の制限酵素がＡｈｄＩであり、第二の制限酵素がＮｃｏＩである場合（ＮｃｏＩ選択）
ＯＲＦのＮ末端側のプライマーを設計するには、以下の４つの規則に従うとよい。
（ｉａ）プライマー配列の１塩基目がアミノ酸コドン一文字目に対応して先行するＧＳＴとフレームが合うようにする。
（ｉｉａ）５’末端の塩基をＧまたはＡとする。（必要ならば少数のアミノ酸をコードするＤＮＡ配列の挿入を行う）。
（ｉｉｉａ）５’末端の配列をＧＧにしない。
（ｉｖａ）ＰＣＲ増幅断片内にＮｃｏＩ制限酵素サイトを含まない。
【００５９】
ＯＲＦのＣ末端側のプライマーは、以下の２つの規則に従うとよい。
（ｖａ）５’末端の塩基をＧＧとする。
（ｖｉａ）目的蛋白質ドメインが停止コドンを含まないときは、５’末端の配列をＧＧ−Ｘｎ−ＴＴＡ（Ｘｎは任意のｎ個（ｎは０〜３０のいずれかの整数）の塩基でよく、例えば、Ａとする。）（ｎが５の場合の配列を配列番号５３に示す。）ではじまるようにする。
（２）第一の制限酵素がＡｈｄＩであり、第二の制限酵素がＮｄｅＩである場合（ＮｄｅＩ選択）
ＯＲＦのＮ末端側のプライマーを設計するには、以下の４つの規則に従うとよい。
（ｉｂ）プライマー配列の１塩基目がアミノ酸コドン一文字目に対応して先行するＧＳＴとフレームが合うようにする。
（ｉｉｂ）５’末端の塩基をＧまたはＡとする。（必要ならば少数のアミノ酸をコードするＤＮＡ配列の挿入を行う）。
（ｉｉｉｂ）５’末端をＡＴＧにしない。
（ｉｖｂ）ＰＣＲ増幅断片内にＮｄｅＩ制限酵素サイトを含まない。
【００６０】
ＯＲＦのＣ末端側のプライマーは、以下の２つの規則に従うとよい。
（ｖｂ）５’末端の塩基をＡＴＧとする。
（ｖｉｂ）目的蛋白質ドメインが停止コドンを含まないときは、５’末端の配列をＡＴＧ−Ｘｎ−ＴＴＡ（Ｘｎは任意のｎ個（ｎは０〜３０のいずれかの整数）の塩基でよく、例えば、Ａとする。）（ｎが４の場合の配列を配列番号５４に示す。）ではじまるようにする。
【００６１】
３．クローニング
２で用意した外来遺伝子を１で用意したベクター（後述の実施例２では、ｐＧＥＸ−４Ｔ３−ＰＲＥＳＡＴベクター）とｌｉｇａｔｉｏｎ反応させ、大腸菌に形質転換する。形質転換した大腸菌は寒天培地には接種せず、また単コロニー化はせずに液体培地で培養を行った後、そこからプラスミド混合物を精製する。このプラスミド混合物を第二の制限酵素（後述の実施例２では、ＮｃｏＩ）で処理すると、外来遺伝子がベクターに逆方向で挿入されたプラスミドは、新たに出現した第二の制限酵素切断部位で切断されて開環する。一方、外来遺伝子がベクターに順方向で挿入されたプラスミドは閉環したままの状態で残る。したがって、第二の制限酵素処理したプラスミド混合物を発現用大腸菌宿主に形質転換して寒天培地に播種すると、外来遺伝子がベクターに順方向で挿入されたプラスミドを含む大腸菌のみがコロニーを形成する。その単コロニーを形成させた寒天培地のおのおののコロニーから大腸菌を採取して培養し、融合蛋白質を発現させる。発現の終えた大腸菌を集菌し、超音波などで菌体を破砕後、全菌体画分とする。また全菌体画分を遠心分離し、上清を可溶化画分とする。沈殿物を可溶化画分と同じ容量のＳＤＳを含む緩衝液で完全に溶解し、不要化画分とする。全菌体画分のみ、または全菌体画分・可溶化画分・不要化画分のそれぞれをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより泳動し、目的融合蛋白質のバンドをゲル上で確認する。その後、該融合蛋白質のゲル上のバンドの濃度から、可溶化画分と不要化画分の比率を求め、目的融合蛋白質の溶解度の指標とする（可溶性試験）。必要ならばデンシトメトリーなどを利用してゲル上の蛋白質バンドを定量し数値化するとなおよい。
【００６２】
ＧＳＴの酵素活性を利用した可溶性試験は、アマシャムファルマシア社のｐＧＥＸシリーズベクター取扱説明書記載の方法に準じて行う。すなわち、適当な緩衝液に希釈した目的融合蛋白質を含む大腸菌の可溶性画分を紫外分光光度計のキュベットに入れて、１−クロロ−２、４ジニトロベンゼン）と還元型グルタチオンを加えてよく撹拌した後、３４０ｎｍの紫外吸光度の経時変化を５〜１０分まで連続的に測定し、その傾きを目的融合蛋白質の量の指標とする。多検体を並行で処理する場合にはマイクロプレートリーダーを利用すると便利である。
【００６３】
以上の操作を行った後、目的融合蛋白質の発現量・溶解度のよいクローンを選択し、プラスミド精製し、塩基配列を決定する。目的の外来遺伝子を含むプラスミドを蛋白質及び／又は蛋白質ドメイン発現ベクターとして採用し、以後の蛋白質及び／又は蛋白質ドメインの大量調製実験に用いる。この方法により、従来法と比較して、蛋白質及び／又は蛋白質ドメイン発現ベクターを作製する期間が約３割短縮できるようになった。
【００６４】
４．蛋白質及び／又は蛋白質ドメインの大量発現
３で採用した蛋白質及び／又は蛋白質ドメイン発現ベクターを発現用大腸菌宿主に形質転換し、大腸菌を培養して、蛋白質及び／又は蛋白質ドメインを発現させる。蛋白質及び／又は蛋白質ドメイン発現ベクターが融合蛋白質発現ベクターであると、目的蛋白質及び／又は蛋白質ドメインの発現量・溶解性を検出・測定する（例えば、蛍光で検出、ＧＳＴの酵素活性を指標にした比色定量など）のが容易である点、目的蛋白質及び／又は蛋白質ドメインの精製が容易である（例えば、ＧＳＨ固定化ビーズを利用した一段階の精製が可能）点、目的蛋白質の機能解析・相互作用解析のための生化学実験（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥを利用した試験管内結合実験、プルダウンアッセイを利用した試験管内結合実験など）を行う際に有利である点から便利である。
【００６５】
発現した蛋白質及び／又は蛋白質ドメインの分離及び精製は、公知の方法により行うことができる。公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーや疎水クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。
【００６６】
以上、本発明について、宿主として大腸菌を用いる場合について説明したが、本発明に用いる宿主は大腸菌に限定されるわけではなく、宿主としては、細菌細胞（例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、枯草菌など）、真菌細胞（例えば、出芽酵母、分裂酵母、アスペルギルスなど）、昆虫細胞（例えば、Ｓ２細胞、Ｓｆ細胞など）、動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｃ１２７細胞、３Ｔ３細胞、ＢＨＫ細胞、ＨＥＫ２９３細胞など）、植物細胞などを例示することができる。
【００６７】
また、本発明に用いる第一の制限酵素、第二の制限酵素、第一の制限酵素によって認識される塩基配列の異なる２つの切断認識配列（第二の制限酵素によって認識される切断認識配列の一部を含むものと含まないもの）、外来遺伝子を作製するためのプライマー対は上記のものに限定されるわけではなく、以下の表にまとめたものを利用することが可能である。表中、Ｇはグアニン、Ａはアデニン、Ｃはシトシン、Ｔはチミン、Ｘは任意の塩基であり、Ｘｎはｎ個（ｎは１〜３０のいずれかの整数である）の任意の塩基である。表１には表２及び３が続き、表４には表５及び６が続き、表７には表８〜１１が続く。
【００６８】
【表１】
【００６９】
【表２】
【００７０】
【表３】
【００７１】
【表４】
【００７２】
【表５】
【００７３】
【表６】
【００７４】
【表７】
【００７５】
【表８】
【００７６】
【表９】
【００７７】
【表１０】
【００７８】
【表１１】
【００７９】
第一の制限酵素が、ＡｈｄＩ若しくはそのイソスキゾマー、ＸｃｍＩ若しくはそのイソスキゾマー、またはそれらの組合せである場合、第二の制限酵素がＮｃｏＩ、ＮｄｅＩまたはそのイソスキゾマーであると効果的である。
【００８０】
本発明のベクターを利用することにより、例えば混合プライマーを設計し、それを用いて目的とする蛋白質のｃＤＮＡを鋳型に用いて増幅させた、任意の蛋白質の部分配列をコードするＤＮＡ断片の混合物を別の蛋白質の下流にｌｉｇａｔｉｏｎさせた、もとの蛋白質における位置及び／または長さの異なる部分配列の融合蛋白質を発現させることのできる、ライブラリーを作製することができる（例えば、図３を参照のこと）。
【００８１】
また、本発明のベクターを利用することにより、例えば９６穴マイクロタイタープレートを用いて複数の蛋白質及び／又は蛋白質ドメインの発現系を網羅的に作製し、かつその発現系によって生産される蛋白質及び／又は蛋白質ドメインの溶解度を網羅的にアッセイしたり、溶解度の高い蛋白質及び／又は蛋白質ドメインのみを高速で選別することが可能となる（例えば、図３を参照のこと）。
【００８２】
また、本発明のベクターと９６穴マイクロタイタープレートを用いる前述の方法は、自動コロニー単離装置や、９６穴マイクロタイタープレートを取り扱うことのできる自動試薬分注洗浄装置、ラボラトリーオートメーション装置を用いることで、多数の蛋白質及び／又は蛋白質ドメインの発現系を網羅的に作製し、かつその発現系によって生産される溶解度の高い蛋白質及び／又は蛋白質ドメインの選別を、高速に全自動で行うことができる。
【００８３】
さらに、本発明のベクターを利用することにより、単一の蛋白質及び／又は蛋白質ドメインを対象として、それを含む融合蛋白質が大腸菌で発現可能かどうかの判定及び、それを含む融合蛋白質が可溶性かどうかの判定を、ＰＣＲ反応からはじめて最短で４８時間で判別することが可能となる（例えば、図７を参照のこと）。
【実施例】
【００８４】
以下、本発明を実施例によって具体的に説明する。なお、これらの実施例は、本発明を説明するためのものであって、本発明の範囲を限定するものではない。
【００８５】
制限酵素ＮｃｏＩ、ＮｄｅＩ、ＡｈｄＩ及びＡｆｌＩＩはＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社から購入した。ＫｐｎＩとＢａｍＨＩは東洋紡社から購入した。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ、Ｗｉｚａｒｄ ｐｌａｓｍｉｄ ｍｉｎｉｐｒｅｐキット及びＷｉｚａｒｄ ＳＶ ＤＮＡ ｇｅｌ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキットはＰｒｏｍｅｇａ社から購入した。ｐＧＥＭ−Ｔ、ｐＧＥＸ−４Ｔ３とｐＧＥＸ−３Ｘ、ｐＥＴ３２ａとｐＥＴ２１ｂは、それぞれ、Ｐｒｏｍｅｇａ社、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社及びＮｏｖａｇｅｎ社から購入した。またｐＥＴ３２ａＰＡＣＡＰはｐＥＴ２１ｂのＮｄｅＩサイトに、ｐＥＴ３２ａ由来のチオレドキシン遺伝子を含むＮｄｅＩ断片と、同じｐＥＴ２１ｂのＮｈｅＩサイトに、ＰＡＣＡＰの人工遺伝子を挿入して作成したｐＥＴ３２ａの誘導体である。ＰＣＲクローニングのための鋳型に用いるｃＤＮＡとして、マウス脾臓、マウス胎児及びヒトＨｅＬａ細胞のＱＵＩＣＫ−Ｃｌｏｎｅ ｃＤＮＡはＣｌｏｎｔｅｃｈ社から購入した。
【００８６】
［実施例１］ｄＧＳＴ−Ｔベクターの作製（図１）
ｐＧＥＸ−４Ｔ３ベクターに、配列番号２１の配列で表されるＤＮＡを５’リン酸化したものを用いて、ｓｉｔｅ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ法を用いて変異を導入した。これによりｐＧＥＸ−４Ｔ３がもともとの配列中に持っていたＡｈｄＩ制限酵素サイトが切断されなくなる。次いで、ｐＥＴ３２ａＰＡＣＡＰベクターを鋳型として配列番号２２及び２４の配列で表されるプライマーの対でＰＣＲ反応を行った。得られたＰＣＲ産物（約５００ｂｐ、二本鎖ＤＮＡの一方の鎖の配列を配列番号２５に示す。）は２つのＢａｍＨＩ部位のそれぞれにＡｈｄＩ部位が結合していた（図１）。このＰＣＲ産物をＴＡクローニングベクターｐＧＥＭ−Ｔにサブクローニングして、その配列を確認した後、プラスミドを調製精製した。精製したプラスミドを制限酵素ＢａｍＨＩで切断し、約５００ｂａｓｅの断片（ＡｈｄＩリンカー、配列番号２６及び２７）を精製した。上記の変異を導入したｐＧＥＸ−４Ｔ３をＢａｍＨＩで開環し、脱リン酸化処理したものと、上記のＡｈｄＩリンカーをｌｉｇａｔｉｏｎして、大腸菌に形質転換した。配列を確認して、正しい向きでＡｈｄＩリンカーがＧＳＴ遺伝子下流に導入したものを選択した。正しい向きでＡｈｄＩリンカーがＧＳＴ遺伝子下流に導入されベクター（約２マイクログラム）を、２５ユニットのＡｈｄＩ制限酵素で３７℃で３時間処理して切断し、１％アガロースゲルを用いて精製した。Ｗｉｚａｒｄ ＳＶ ｇｅｌ／ＰＣＲ ｃｌｅａｎ−ｕｐシステムを用いて約５ｋｂの開環状ベクター（ｐＧＥＸ−４Ｔ３−ＰＲＥＳＡＴ、図１）を精製して、以下の実施例に用いた。
【００８７】
［実施例２］新規発現系の並行操作による調製（図２）
まず、ＮｃｏＩ−選択法対応のプライマーを利用して、５種類の遺伝子（ヒト・マウスのＳＮＸ１５ａ由来及び酵母・マウス・ヒト由来のＶｐｓ４ｂの５つのＭＩＴドメインを含む領域、配列番号２８，３０，３２，３４，３６）を、同時並行でヒトマウスなどのｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲで増幅した。使用したプライマー（配列番号３８〜４７）は、当該遺伝子のｃＤＮＡのうち蛋白質として発現を計画している領域に相補的な配列と、終止コドンの相補配列、および５’末端にＮｃｏＩ選択を行うためのＧＧ残基を含むように適宜設計したものである。すなわち、フロントプライマーは、先行するＧＳＴと読み枠が合うように最初のアミノ酸のコドンで始まり、５’末端の塩基は５’−ＧＧで始まってはならない。リアプライマーは当該ドメインの推定Ｃ末端境界後のストップコドンを含み、５’末端の塩基は５’−ＧＧで始まらなければならない。そうすることによって、これらのプライマーで増幅されたＰＣＲ産物は、逆方向でｐＧＥＸ−４Ｔ３−ＰＲＥＳＡＴにｌｉｇａｔｉｏｎしたときにのみ第二のＮｃｏＩ部位が形成されることになる。この新たに生じたＮｃｏＩ部位は続く選択工程に利用される。
【００８８】
当該遺伝子はいずれも２００−２３０ｂｐのｃＤＮＡであり、新規の蛋白質ドメインで、約７０アミノ酸残基をコードする。
【００８９】
ＰＣＲ産物が増幅していることを電気泳動により確認後、その産物を未精製のままｐＧＥＸ−４Ｔ３−ＰＲＥＳＡＴベクターとｌｉｇａｔｉｏｎ反応させ、大腸菌ＤＨ５ａに形質転換した。形質転換したＤＨ５ａは単コロニー化せずに終夜液体培養を行い、翌日そこから１−３μｇのプラスミドを精製した。このプラスミドをＮｃｏＩ制限酵素で切断したものを、発現用大腸菌宿主ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、単コロニー化した。そのコロニー化したプレートからおのおの３個ずつを（３ｘ５＝１５）、ＬＢ培地で液体培養し、ＯＤ＝０．５付近になったところでＩＰＴＧを終濃度１ｍＭに加え、さらに４時間培養した。発現の終えた大腸菌を集菌し、超音波破砕後、全菌体をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより泳動し、目的融合蛋白質のバンド（約３３−３５ｋＤ）をゲル上で確認した（図４）（発現性試験）。得られたコロニーのうち、予測した分子量の目的融合蛋白質を発現していたコロニーの割合は、約９０％以上（１４／１５）と非常に効率が高かった。
【００９０】
さらに目的分子量の融合蛋白質の発現が確認されたコロニー由来の菌体破砕液を遠心分離により可溶化画分、不溶化画分に分離し、全菌体とともに、それぞれをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより泳動し、目的とする融合蛋白質が可溶性かどうかを調べた（図５）（可溶性試験）。
【００９１】
また、目的分子量の融合蛋白質の発現が確認されたコロニー由来の蛋白質の可溶化画分の一部に１−クロロ−２、４ジニトロベンゼンとグルタチオンの混合液よりなるＧＳＴ活性測定液を加え、ＧＳＴによる反応を開始させ、その反応初速度を３５０ｎｍの紫外部吸光度の増大を分光光度計で計測した（図６）（ＣＤＮＢアッセイ）。グラフの直線の傾きは、目的の融合蛋白質の可溶化画分における量におよそ比例することが確かめられ、分光光度計による半定量的な可溶性試験が可能であることがわかった。
【００９２】
それとは独立に、同じプレートのコロニーを８個ずつ、コロニーＰＣＲを用いてそれぞれのクローンに含まれるプラスミドに目的の遺伝子が含まれる割合（サブクローニングの効率）を検討した。３７／４０の確率（９２．５％）で、標的遺伝子から予測される正しい長さの遺伝子が組み込まれていたを確認した。
【００９３】
正しい長さの蛋白質を発現しているクローンから２つを選びＤＮＡ塩基配列を決定確認した。配列は全て正しく、またＧＳＴと読み枠がずれていないことを確認した。
【００９４】
以上の操作全工程に要した日数は約６日間であり、有意に短縮されている。
【００９５】
［実施例３］ＮｃｏＩ選択法とＮｄｅＩ選択法の効率の比較
ユビキチンと相互作用するモチーフ（ＵＩＭ：ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｍｏｔｉｆ）を含む蛋白質断片のＧＳＴ融合蛋白質発現系作製を行う際に、ＮｃｏＩ選択とＮｄｅＩ選択とで、実施上の発現系構築の効率に違いがあるかどうか、比較実験を行った。
【００９６】
ＮｃｏＩ−選択法対応のプライマーの組（配列番号４８及び４５）およびＮｄｅＩ選択法対応のプライマーの組（配列番号４８及び５０）を利用し、ヒトのｃＤＮＡより、ＵＩＭ配列を含むヒトＨｒｓ遺伝子の約２００ｂｐの断片（コード鎖の配列を配列番号５１に示す。）をＰＣＲで増幅した。使用したプライマーは、当該遺伝子のｃＤＮＡに相補的な配列と、終止コドンの相補配列、およびＮｃｏＩ選択を行うため５’末端にＧＧ残基を含むように適宜設計した。ＮｄｅＩ選択を行うためのプライマーは終止コドンの相補配列、及び５’末端にＡＴＧ残基を含むように適宜設計したものである。当該断片は２００ｂｐのｃＤＮＡであり、新規の蛋白質ドメインで、約７０アミノ酸残基をコードする。
【００９７】
ＰＣＲ産物が増幅していることを電気泳動により確認後、その産物を未精製のままｄＧＳＴ−Ｔベクターとｌｉｇａｔｉｏｎ反応させ、大腸菌ＤＨ５ａに形質転換した。形質転換したＤＨ５ａは単コロニー化せずに終夜液体培養を行い、翌日そこから１−３μｇのプラスミドを精製した。このプラスミドをＮｃｏＩ制限酵素またはＮｄｅＩ制限酵素で切断したものを、発現用大腸菌宿主ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、単コロニー化した。反応条件は、ｐｌａｓｍｉｄ２００ｎｇあたり、ＮｃｏＩは１０ｕｎｉｔ、ＮｄｅＩは２０ｕｎｉｔを用い、３７℃でいずれも一時間反応した。そのコロニー化したプレートからおのおの３個ずつを（３ｘ５＝１５）、ＬＢ培地で液体培養し、ＯＤ＝０．５付近になったところでＩＰＴＧを終濃度１ｍＭに加え、さらに４時間培養した（発現実験）。発現の終えた大腸菌を集菌し、超音波破砕後、全菌体、可溶化画分、不要化画分のそれぞれをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより泳動し、目的融合蛋白質のバンド（約３１ｋＤ）をゲル上で確認した。得られたコロニーのうち、予測した分子量の目的融合蛋白質を発現していたコロニーの割合は、ＮｃｏＩ選択のときに１４／１５、ＮｄｅＩ選択で３／３といずれも約９０％以上（１４／１５）と非常に効率が高かった。
【００９８】
それとは独立に、同じプレートのコロニーを数個、コロニーＰＣＲを用いてそれぞれのクローンに含まれるプラスミドに目的の遺伝子が含まれる割合（サブクローニングの効率）を検討した。ＮｃｏＩ選択では９／１０の確率（９０．０％）で、ＮｄｅＩ選択では７／８（８８％）と、ほぼ同程度の効率で標的遺伝子から予測される正しい長さの遺伝子が組み込まれていたを確認した。
【００９９】
以上の実験により、ＮｃｏＩ／ＮｄｅＩいずれもＯＲＦ方向の選択に利用可能であることがわかった。
【０１００】
［実施例４］ｄＧＳＴ−Ｔベクターを利用して作製された融合蛋白質の大腸菌における発現量および溶解度を短時間で試験する方法（図７）
実施例２で作製したヒトＶｐｓ４ｂの遺伝子を挿入されたＮｃｏＩ処理によるＯＲＦ選択の終了した開環状ベクター混合物約０．２μｇを用いて、そのなかに出来あがっていると考えられるＧＳＴ−Ｖｐｓ４ｂの発現性試験ならびに溶解度試験を短時間で行うための条件を決定した。
【０１０１】
すでに実施例２に記載してある、既にＮｃｏＩで処理して開環状になっているヒトＶｐｓ４ｂの遺伝子を含むｐＧＥＸ−４Ｔ３−ＰＲＥＳＡＴを約０．２μｇを発現用大腸菌宿主ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、ＬＢプレート培地上で３７℃で１４時間かけてコロニーを形成させた。そのコロニーを形成させたプレートに、０．１ＭのＩＰＴＧ溶液を２００μｌ噴霧し、さらに３７℃で３時間コロニーを成長させプレート上で蛋白質を発現させた。プレート上の大腸菌コロニーに１８０μｌの０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）（以下ＴＢＳ緩衝液と呼ぶ）を加えて懸濁し、その菌体を超音波破砕して全菌体画分、可溶化画分、不要化画分を実施例２と同様にＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動で分析した（図８）。大腸菌の懸濁からＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析に要した時間は約３時間であった。
【０１０２】
この方法でも実施例２と同様、目的とする分子量約３２ＫＤａの融合蛋白質のバンドがＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で確認され、発現量ならびに可溶性が今後の実験に十分であることがわかった。
【０１０３】
この実験では目的とする融合蛋白質を含む大腸菌を単コロニー化しないで、混合物のまま発現性試験ならびに溶解度試験を行っているが、実施例２で示したようにＮｃｏＩによるＯＲＦ選択を行った場合には、目的とする融合蛋白質を含まない大腸菌はプレート培地上にコロニー形成している大腸菌の１０％以下であるため、電気泳動による発現性試験・可溶性試験による判定が可能であることがわかった。
【０１０４】
以上の操作全工程に要した時間はおよそ２１時間であり、有意に短縮されている。その前段階であるＰＣＲからＮｃｏＩによるＯＲＦ処理に要する時間は最短で２７時間で可能であり、単一の蛋白質及び／または蛋白質ドメインの発現系構築と可溶性試験の全工程を、最短４８時間で行うことが可能であることがわかった。
本発明者らが作製したベクターの名称、ベクター作製の基となった市販のプラスミドの名称、タグの名称、第一の制限酵素、第二の制限酵素、リンカーの配列及び参考文献を以下の表にまとめる。
【０１０５】
【表１２】
＊タグおよびタグと目的蛋白質を切り離すときのプロテアーゼ切断配列の名称を含む
略号
ＧＳＴ：ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）
ＴＲＸ：ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎｅ（Ｅ．ｃｏｌｉ）
Ｈｉｓ６：Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ
ＬＢＴ：ｌａｎｔｈａｎｉｄｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔａｇ
ＦＬＡＧ（登録商標）：Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ
ＥＧＦＰ：ｅｎｈａｎｃｅｄ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓｅ ｐｒｏｔｅｉｎ（オワンクラゲ）
リンカーの配列（下線部の配列が、ＡｈｄＩでの切断サイト）
Ｉ（４８７ｂｐ）説明：Ｔｒｘ遺伝子と−ＰＡＣＡＰ人工遺伝子の一部
ＧＡＣＣＡＴＴＧＧＴＣＣＡＣＣＴＧＡＣＴＧＡＣＧＡＣＡＧＴＴＴＴＧＡＣＡＣＧＧＡＴＧＴＡＣＴＣＡＡＡＧＣＧＧＡＣＧＧＧＧＣ
ＧＡＴＣＣＴＣＧＴＣＧＡＴＴＴＣＴＧＧＧＣＡＧＡＧＴＧＧＴＧＣＧＧＴＣＣＧＴＧＣＡＡＡＡＴＧＡＴＣＧＣＣＣＣＧＡＴＴＣＴＧ
ＧＡＴＧＡＡＡＴＣＧＣＴＧＡＣＧＡＡＴＡＴＣＡＧＧＧＣＡＡＡＣＴＧＡＣＣＧＴＴＧＣＡＡＡＡＣＴＧＡＡＣＡＴＣＧＡＴＣＡＡＡＡ
ＣＣＣＴＧＧＣＡＣＴＧＣＧＣＣＧＡＡＡＴＡＴＧＧＣＡＴＣＣＧＴＧＧＴＡＴＣＣＣＧＡＣＴＣＴＧＣＴＧＣＴＧＴＴＣＡＡＡＡＡＣ
ＧＧＴＧＡＡＧＴＧＧＣＧＧＣＡＡＣＣＡＡＡＧＴＧＧＧＴＧＣＡＣＴＧＴＣＴＡＡＡＧＧＴＣＡＧＴＴＧＡＡＡＧＡＧＴＴＣＣＴＣＧ
ＡＣＧＣＴＡＡＣＣＴＧＧＣＣＧＧＴＴＣＴＧＧＴＴＣＴＧＧＣＣＡＴＡＴＧＧＣＴＡＧＣＣＡＴＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＡＧ
ＣＡＧＣＧＧＣＡＴＴＧＡＣＧＧＣＣＧＧＣＡＴＡＧＣＧＡＴＧＧＣＡＴＣＴＴＴＡＣＣＧＡＴＡＧＣＴＡＴＡＧＣＣＧＣＴＡＴＣＧＣ
ＡＡＡＣＡＧＡＴＧＧＣＧＧＴＧＡＡＡＡＡＧＴＡＴＣＴＧＧＣＧＧＣＧＧＴＧＣＴＧＧＧＣＴＡＡＴＡＡＧＡＣＣＡＡＡＴＧＴＣ（配列番号５９）
ＩＩ（１１０ｂｐ）説明：ＰＡＣＡＰ人工遺伝子
ＧＡＣＧＧＴＣＧＧＴＣＴＡＧＣＧＡＴＧＧＣＡＴＣＴＴＴＡＣＣＧＡＴＡＧＣＴＡＴＡＧＣＣＧＣＴＡＴＣＧＣＡＡＡＣＡＧＡＴＧＧＣ
ＧＧＴＧＡＡＡＡＡＧＴＡＴＣＴＧＧＣＧＧＣＧＧＴＧＣＴＧＧＧＣＴＡＡＴＡＡＧＡＣＣＡＡＴＧＧＴＣ（配列番号６０）
ＩＩＩ（２５９ｂｐ）説明：ヒトユビキチン遺伝子
ＧＡＣＧＡＴＡＡＧＴＣＴＣＡＴＡＴＧＣＡＧＡＴＴＴＴＣＧＴＧＡＡＡＡＣＣＣＴＧＡＣＣＧＧＣＡＡＡＡＣＣＡＴＣＡＣＣＣＴＧＧＡ
ＡＧＴＧＧＡＡＣＣＧＴＣＣＧＡＣＡＣＣＡＴＣＧＡＡＡＡＣＧＴＴＡＡＡＧＣＧＡＡＡＡＴＣＣＡＧＧＡＣＡＡＡＧＡＡＧＧＣＡＴＣ
ＣＣＧＣＣＧＧＡＴＣＡＧＣＡＧＣＧＴＣＴＧＡＴＣＴＴＣＧＣＧＧＧＣＡＡＡＣＡＧＣＴＧＧＡＡＧＡＣＧＧＣＣＧＴＡＣＣＣＴＧ
ＴＣＣＧＡＴＴＡＣＡＡＣＡＴＣＣＡＧＡＡＡＧＡＡＴＣＴＡＣＣＣＴＧＣＡＣＣＴＧＧＴＧＣＴＧＣＧＴＣＴＧＣＧＴＧＧＣＧＧＣＴ
ＡＡＴＡＧＡＣＴＴＡＡＧＧＴＣ（配列番号６１）
参考文献
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２ ＬａＶａｌｌｉｅ，Ｅ．Ｒ，ＤｉＢｌａｓｉｏ，Ｅ．Ａ，Ｋｏｖａｃｉｃ，Ｓ，Ｇｒａｎｔ，Ｋ．Ｌ，Ｓｃｈｅｎｄｅｌ，Ｐ．Ｆ．ａｎｄ ＭｃＣｏｙ，Ｊ．Ｍ．（１９９３）Ａ ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ ｇｅｎｅ ｆｕｓｉｏｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｔｈａｔ ｃｉｒｃｕｍｖｅｎｔｓ ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｂｏｄｙ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ Ｅ．ｃｏｌｉ ｃｙｔｏｐｌａｓｍ．Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １１，１８７−１９３
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５ Ｗｏｈｎｅｒｔ Ｊ，Ｆｒａｎｚ ＫＪ，Ｎｉｔｚ Ｍ，Ｉｍｐｅｒｉａｌｉ Ｂ，Ｓｃｈｗａｌｂｅ Ｈ．（２００３）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｂｙ ａ Ｃｏｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｌａｎｔｈａｎｉｄｅ−Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｔａｇ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｒｅｓｉｄｕａｌ Ｄｉｐｏｒ Ｃｏｕｐｌｉｎｇｓ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２５，１３３３８−１３３３９
６ Ｗａｌｄｏ ＧＳ，Ｓｔａｎｄｉｓｈ ＢＭ，Ｂｅｒｅｎｄｚｅｎ Ｊ，Ｔｅｒｗｉｌｌｉｇｅｒ ＴＣ．（１９９９）Ｒａｐｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｆｏｌｄｉｎｇ ａｓｓａｙ ｕｓｉｎｇ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７，６９１−６９５．
７ Ｇｏｄａ Ｎ，Ｔｅｎｎｏ Ｔ，Ｔａｋａｓｕ Ｈ，Ｈｉｒｏａｋｉ Ｈ，ａｎｄ Ｓｈｉｒａｋａｗａ Ｍ．（２００４）Ｔｈｅ ＰＲＥＳＡＴ−ｖｅｃｔｏｒ：Ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ Ｔ−ｖｅｃｔｏｒ ｆｏｒ ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ ｓｏｌｕｂｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｏｍａｉｎｓ ｆｏｒ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ １３，６５２−６５８
８ Ｔｅｎｎｏ Ｔ，Ｇｏｄａ Ｎ，Ｔａｔｅｉｓｈｉ Ｙ，Ｔｏｃｈｉｏ Ｈ，Ｍｉｓｈｉｍａ Ｍ，Ｈａｙａｓｈｉ Ｈ，Ｓｈｉｒａｋａｗａ Ｍ，ａｎｄ Ｈｉｒｏａｋｉ Ｈ．（２００４）Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ＮＭＲ ｓｔｕｄｙ ｓｕｉｔｅｄ ｆｏｒ ｉｓｏｔｏｐｉｃ ｌａｂｅｌｉｎｇ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ １７，３０５−３１４
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【産業上の利用可能性】
【０１０６】
本発明により、蛋白質及び／または蛋白質ドメインの発現系構築と可溶性試験の全工程に要する時間を大幅に短縮することが可能となった。
【配列表フリーテキスト】
【０１０７】
＜配列番号１＞
配列番号１は、配列（Ｉ）の塩基配列を示す。
＜配列番号２＞
配列番号２は、配列（ＩＩ）の塩基配列を示す。
＜配列番号３＞
配列番号３は、配列（ＩＩＩ）の塩基配列を示す。
＜配列番号４＞
配列番号４は、配列（ＩＶ）の塩基配列を示す。
＜配列番号５＞
配列番号５は、配列（Ｖ）の塩基配列を示す。
＜配列番号６＞
配列番号６は、配列（ＶＩ）の塩基配列を示す。
＜配列番号７＞
配列番号７は、配列（ＶＩＩ）の塩基配列を示す。
＜配列番号８＞
配列番号８は、配列（ＶＩＩＩ）の塩基配列を示す。
＜配列番号９＞
配列番号９は、配列（ＩＸ）の一例（Ｎ１が１塩基である場合）の塩基配列を示す。
＜配列番号１０＞
配列番号１０は、配列（Ｘ）の一例（Ｎ２が１塩基である場合）の塩基配列を示す。
＜配列番号１１＞
配列番号１１は、配列（ＸＩ）の一例（Ｎ１が１塩基である場合）の塩基配列を示す。
＜配列番号１２＞
配列番号１２は、配列（ＸＩＩ）の一例（Ｎ２が１塩基である場合）の塩基配列を示す。
＜配列番号１３＞
配列番号１３は、配列（ＸＩＩＩ）の一例（Ｎ１が１塩基である場合）の塩基配列を示す。
＜配列番号１４＞
配列番号１４は、配列（ＸＩＶ）の一例（Ｎ２が１塩基である場合）の塩基配列を示す。
＜配列番号１５＞
配列番号１５は、配列（ＸＶ）の一例（Ｎ３が１塩基である場合）の塩基配列を示す。
＜配列番号１６＞
配列番号１６は、配列（ＸＶＩ）の一例（Ｎ４が１塩基である場合）の塩基配列を示す。
＜配列番号１７＞
配列番号１７は、配列（ＸＶＩＩ）の一例（Ｎ３が１塩基である場合）の塩基配列を示す。
＜配列番号１８＞
配列番号１８は、配列（ＸＶＩＩＩ）の一例（Ｎ４が１塩基である場合）の塩基配列を示す。
＜配列番号１９＞
配列番号１９は、配列（ＸＩＸ）の一例（Ｎ３が１塩基である場合）の塩基配列を示す。
＜配列番号２０＞
配列番号２０は、配列（ＸＸ）の一例（Ｎ４が１塩基である場合）の塩基配列を示す。
＜配列番号２１＞
配列番号２１は、ｐＧＥＸ−４Ｔ３の部位特異的変異法に用いたＤＮＡの配列を示す。
＜配列番号２２＞
配列番号２２は、ｐＥＴ３２ａＰＡＣＡＰを鋳型とするＰＣＲ反応に用いたプライマー（フロント）の塩基配列を示す。
＜配列番号２３＞
配列番号２３は、ｐＥＴ３２ａＰＡＣＡＰを鋳型とするＰＣＲ反応に用いたプライマー（リア）の塩基配列を示す。
＜配列番号２４＞
配列番号２４は、ｐＥＴ３２ａＰＡＣＡＰを鋳型とするＰＣＲ反応に用いたプライマー（ＮｃｏＩ選択法対応のリア）の塩基配列を示す。
＜配列番号２５＞
配列番号２５は、実施例１の約５００ｂｐのＰＣＲ産物の一方のＤＮＡ鎖の塩基配列を示す。他方のＤＮＡ鎖はこれの相補鎖であった。
＜配列番号２６＞
配列番号２６は、実施例１のＡｈｄＩリンカーである二本鎖ＤＮＡの一方の鎖の塩基配列を示す。
＜配列番号２７＞
配列番号２７は、実施例１のＡｈｄＩリンカーである二本鎖ＤＮＡの他方の鎖の塩基配列を示す。
＜配列番号２８＞
配列番号２８は、ＰＣＲの鋳型となる、ＭＩＴドメインを含む遺伝子（ヒトＳＮＸ１５ａ）の約２２０ｂｐの断片（コード鎖）の塩基配列を示す。プライマーにより付加される配列は含まない。
＜配列番号２９＞
配列番号２９は、ＰＣＲの鋳型となる、ＭＩＴドメインを含む遺伝子（ヒトＳＮＸ１５ａ）の約２２０ｂｐの断片（コード鎖）がコードしているアミノ酸配列を示す。
＜配列番号３０＞
配列番号３０は、ＰＣＲの鋳型となる、ＭＩＴドメインを含む遺伝子（マウスＳＮＸ１５ａ）の約２２０ｂｐの断片（コード鎖）の塩基配列を示す。プライマーにより付加される配列は含まない。
＜配列番号３１＞
配列番号３１は、ＰＣＲの鋳型となる、ＭＩＴドメインを含む遺伝子（マウスＳＮＸ１５ａ）の約２２０ｂｐの断片（コード鎖）がコードしているアミノ酸配列を示す。
＜配列番号３２＞
配列番号３２は、ＰＣＲの鋳型となる、ＭＩＴドメインを含む遺伝子（酵母Ｖｐｓ４）の約２２０ｂｐの断片（コード鎖）の塩基配列を示す。プライマーにより付加される配列は含まない。
＜配列番号３３＞
配列番号３３は、ＰＣＲの鋳型となる、ＭＩＴドメインを含む遺伝子（酵母Ｖｐｓ４）の約２２０ｂｐの断片（コード鎖）がコードしているアミノ酸配列を示す。
＜配列番号３４＞
配列番号３４は、ＰＣＲの鋳型となる、ＭＩＴドメインを含む遺伝子（ヒトＶｐｓ４ｂ）の約２２０ｂｐの断片（コード鎖）の塩基配列を示す。プライマーにより付加される配列は含まない。
＜配列番号３５＞
配列番号３５は、ＰＣＲの鋳型となる、ＭＩＴドメインを含む遺伝子（ヒトＶｐｓ４ｂ）の約２２０ｂｐの断片（コード鎖）がコードしているアミノ酸配列を示す。
＜配列番号３６＞
配列番号３６は、ＰＣＲの鋳型となる、ＭＩＴドメインを含む遺伝子（マウスＶｐｓ４ｂ）の約２２０ｂｐの断片（コード鎖）の塩基配列を示す。プライマーにより付加される配列は含まない。
＜配列番号３７＞
配列番号３７は、ＰＣＲの鋳型となる、ＭＩＴドメインを含む遺伝子（マウスＶｐｓ４ｂ）の約２２０ｂｐの断片（コード鎖）がコードしているアミノ酸配列を示す。
＜配列番号３８＞
配列番号３８は、プライマー（ＨＳＳ１５Ｆ）の塩基配列を示す。
＜配列番号３９＞
配列番号３９は、プライマー（ＨＳＳ１５Ｒ）の塩基配列を示す。
＜配列番号４０＞
配列番号４０は、プライマー（ＭＭＳ１５Ｆ）の塩基配列を示す。
＜配列番号４１＞
配列番号４１は、プライマー（ＭＭＳ１５Ｒ）の塩基配列を示す。
＜配列番号４２＞
配列番号４２は、プライマー（ＳｃＶＰＳ４Ｆ）の塩基配列を示す。
＜配列番号４３＞
配列番号４３は、プライマー（ＳｃＶＰＳ４Ｒ）の塩基配列を示す。
＜配列番号４４＞
配列番号４４は、プライマー（ＨｓＶＰＳ４Ｆ）の塩基配列を示す。
＜配列番号４５＞
配列番号４５は、プライマー（ＨｓＶＰＳ４Ｒ）の塩基配列を示す。
＜配列番号４６＞
配列番号４６は、プライマー（ＭｍＶＰＳ４Ｆ）の塩基配列を示す。
＜配列番号４７＞
配列番号４７は、プライマー（ＭｍＶＰＳ４Ｒ）の塩基配列を示す。
略号 Ｓｃ：ｙｅａｓｔ Ｈｓ：ｈｕｍａｎ Ｍｍ：ｍｏｕｓｅ：ＶＰＳ４：ＶＰＳ４，Ｓ１５：ＳＮＸ１５Ｆ：ＦＯＲＷＡＲＤ Ｒ：ＲＥＶＥＲＳＥ
＜配列番号４８＞
配列番号４８は、プライマー（ＨｒｓＦ）の塩基配列を示す。
＜配列番号４９＞
配列番号４９は、ＮｃｏＩ選択対応のプライマー（ＨｒｓＲ−Ｎｃｏ）の塩基配列を示す。
＜配列番号５０＞
配列番号５０は、ＮｄｅＩ選択対応のプライマー（ＨｒｓＲ−Ｎｄｅ）の塩基配列を示す。
＜配列番号５１＞
配列番号５１は、ＰＣＲの鋳型となる、ＵＩＭ配列を含むヒトＨｒｓ遺伝子の約２００ｂｐの断片（コード鎖）の塩基配列を示す。プライマーにより付加される配列は含まない。
＜配列番号５２＞
配列番号５２は、ＰＣＲの鋳型となる、ＵＩＭ配列を含むヒトＨｒｓ遺伝子の約２００ｂｐの断片（コード鎖）がコードしているアミノ酸配列を示す。
＜配列番号５３＞
配列番号５３は、第一の制限酵素がＡｈｄＩであり、第二の制限酵素がＮｃｏＩである場合のＯＲＦのＣ末端側のプライマーの塩基配列（目的蛋白質ドメインが停止コドンを含まないとき）を示す。
＜配列番号５４＞
配列番号５４は、第一の制限酵素がＡｈｄＩであり、第二の制限酵素がＮｄｅＩである場合のＯＲＦのＣ末端側のプライマーの塩基配列（目的蛋白質ドメインが停止コドンを含まないとき）を示す。
＜配列番号５５＞
配列番号５５は、配列（ＩＸ）〜（ＸＩＶ）におけるＮ１の塩基配列の一例を示す。
＜配列番号５６＞
配列番号５６は、配列（ＩＸ）〜（ＸＩＶ）におけるＮ２の塩基配列の一例を示す。
＜配列番号５７＞
配列番号５７は、配列（ＸＶ）〜（ＸＸ）におけるＮ３の塩基配列の一例を示す。
＜配列番号５８＞
配列番号５８は、配列（ＸＶ）〜（ＸＸ）におけるＮ４の塩基配列の一例を示す。
＜配列番号５９＞
配列番号５９は、リンカーＩの塩基配列を示す。
＜配列番号６０＞
配列番号６０は、リンカーＩＩの塩基配列を示す。
＜配列番号６１＞
配列番号６１は、リンカーＩＩＩの塩基配列を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規ベクター及びその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般的にポストゲノム研究といわれている構造プロテオミクス・機能プロテオミクスと言われる学問分野において、さまざまな遺伝子産物を同時並行的に大腸菌で組換え発現して蛋白質試料を取得する技術は非常に重要である。
【０００３】
従来、目的遺伝子を使って蛋白質試料を取得するには、まず、目的遺伝子をＰＣＲ法で増幅し、ＰＣＲ産物をサブクローニング用ベクターに組み込み、これで宿主を形質転換させ、形質転換した宿主の単コロニーを形成させ、各コロニー由来の宿主からプラスミドを精製し、プラスミドの塩基配列を決定することにより、目的遺伝子が挿入されているクローンを選択していた。その後、選択したクローンから、制限酵素により目的遺伝子を含むＤＮＡ断片を切り出し、切り出したＤＮＡ断片を精製してから、融合蛋白質発現ベクターに組み込み、これで宿主を形質転換させ、形質転換した宿主の単コロニーを形成させ、各コロニー由来の宿主からプラスミドを精製し、精製したプラスミドで発現用宿主を形質転換して、目的遺伝子がコードする蛋白質を発現させていた。以上の操作は最速で９日という時間を要するものであり、かつ、制限酵素によりサブクローニング用ベクターから目的遺伝子を含むＤＮＡ断片を切り出す工程及び切り出したＤＮＡ断片を精製する工程は熟練を要するものであった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、遺伝子を宿主で組換え発現して蛋白質を得る作業の手間を軽減させるためのツールを提供することを目的とする。
【０００５】
また、本発明は、上記のツールを利用して、遺伝子がコードする蛋白質を製造する方法を提供することも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
ＰＣＲ法に用いられる酵素のうち、もっとも代表的なＴａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ／Ｔｔｈ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅなどでは、複製されたＤＮＡ産物の３’末端に鋳型に依存せずにｄＡを一残基付加するという副反応の活性があることが知られている。そのため、ＰＣＲ法を用いて増幅させた二本鎖ＤＮＡ断片の大部分にはｄＡが一残基付加した３’端突出構造を有する。
【０００７】
ここで、ｄＡと相補な塩基対を形成するｄＴを３’端に突出させた構造をもつｐｌａｓｍｉｄ ｖｅｃｔｏｒを用意して、上記ＰＣＲ増幅産物と混合すると、速やかに１塩基の突出末端を利用した塩基対生成がおこり、そこにＤＮＡ ｌｉｇａｓｅを混合してやるとｖｅｃｔｏｒとＰＣＲ増幅産物のｌｉｇａｔｉｏｎ反応が起こる。一方でＤＮＡ ｌｉｇａｓｅはミスマッチを有するＤＮＡ末端同士のｌｉｇａｔｉｏｎ反応をおこなわないため、ＰＣＲ増幅産物を含まずにｐｌａｓｍｉｄ ｖｅｃｔｏｒ単体のみでｌｉｇａｔｉｏｎして自己環化してしまう産物はきわめて生成しにくい、という現象が知られている。
【０００８】
この性質を利用して３’−ｄＴ突出構造を持つ開環ｖｅｃｔｏｒ（Ｔ−ｖｅｃｔｏｒ）をあらかじめ作成しておき、それにＰＣＲ産物を制限酵素による処理や末端の平滑化処理を行うことなく、混合してｌｉｇａｔｉｏｎを行う方法を、ＴＡ−ｃｌｏｎｉｎｇ法と呼ぶ。
【０００９】
Ｔ−ｖｅｃｔｏｒ作成法には原理的に３種類が知られている。
【００１０】
第一の方法は、ＴｄＴを用いる方法である。ＴｄＴ（Ｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｅｏｘｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）はＤＮＡ末端に鋳型非依存的に任意のｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅを付加する酵素である。したがって、ｐｌａｓｍｉｄをまず平滑末端を与える制限酵素で切断し、次にｄＴＴＰ存在下ＴｄＴを作用させれば、３’にｄＴが１個ないし複数個付加したベクターが作成できる。ただし、この方法でＴ−ｖｅｃｔｏｒが作成された報告例はないようだ。
【００１１】
第二の方法は、Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅのＴｄＴ活性を用いる方法である。上述のようにＰＣＲ反応液中ではＴａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅはＤＮＡの平滑末端に１分子だけｄＡを付加する。ところがＭｇ２＋過剰量存在下、ｄＮＴＰのうちｄＴＴＰのみ存在下の条件でＤＮＡの平滑末端にＴａｑを作用させると、ＤＮＡに１残基のｄＴを付加するのでこの性質を用いてＴ−ｖｅｃｔｏｒを作製することが可能である。したがって、ｐｌａｓｍｉｄを平滑末端を与える制限酵素で切断し、そこにｄＴＴＰ・Ｍｇ２＋存在下Ｔａｑを作用させれば、３’にｄＴが１個付加したベクターが作成できる。この方法では平滑末端を生成するときに用いる制限酵素の認識配列によって、Ｔ突出末端の生成効率が著しく変わるようである。報告されている例のほとんどはＥｃｏ ＲＶを使用した例であり、ＳｍａＩを利用した場合は効率が悪いことが知られている。それを回避する方法がＷＷＷ上で公開されている。
【００１２】
第三の方法は、Ｔ−突出末端を直接生成する制限酵素部位を二ヶ所もっている「カセット」ＤＮＡ配列を設計して、それを制限酵素で消化する方法である。３’−Ｔ−残基突出末端を生成しうるような制限酵素を実際のＴ−ｖｅｃｔｏｒに用いた例としてはＸｃｍＩ、Ｅａｍ１１０５１、ＡｈｄＩの例がそれぞれ論文にて報告されている。この方法では、上記制限酵素サイトを二ヶ所含む「カセット」ＤＮＡ配列を設計し、目的とするｐｌａｓｍｉｄに上記カセットを挿入した後、上記ｐｌａｓｍｉｄを当該制限酵素で切断すると、両側がｄＴ突出末端となった開環状ｐｌａｓｍｉｄが作製できる。（今回、本発明者らはＡｈｄＩを用いてＴ−ｖｅｃｔｏｒを作製した。この方法を用いると、「非対称的な」ｄＴ突出末端となった開環状ｐｌａｓｍｉｄをデザインすることができる。また、この方法では得られた開環状ｐｌａｓｍｉｄはほぼ１００％がｄＴ突出末端となっていることが期待され、非常に高品質である。）
【００１３】
しかし、従来のＴＡ−ｃｌｏｎｉｎｇ法には欠点がある。それはベクターに挿入される目的遺伝子の方向性が、制御できないことである。その結果、たとえばいままでＴ−ｖｅｃｔｏｒとして作製されてきたｐｌａｓｍｉｄのほとんどは（１）未知遺伝子クローニング（またはサブクローニング）用のベクター、（２）新規プロモーター活性を有する遺伝子のクローニング用ベクターの二種類のみの応用が主であり、蛋白質として発現する領域（ＯＲＦ）を直接発現ベクターにＴＡ−ｃｌｏｎｉｎｇするためのＴ−ｖｅｃｔｏｒは例が少なかった。上記の利用法ではＯＲＦの方向性は問題にならない。蛋白質発現実験を行う場合にのみ、ＯＲＦの方向性が問題になるのである。（今回、本発明者らは、順方向のみに外来遺伝子（ＰＣＲ産物）が挿入されたｐｌａｓｍｉｄを簡便に選択するために、逆方向に外来遺伝子が挿入された場合にのみ制限酵素ＮｃｏＩまたはＮｄｅＩの切断配列が出現するような配列をデザインした。これにより順方向でグルタチオンＳ転移酵素［ＧＳＴ］などとの融合蛋白質を発現するｐｌａｓｍｉｄのみを選択的に大腸菌に形質転換することが可能となる。）
【００１４】
ところで、外来遺伝子をＧＳＴ融合蛋白質として大腸菌で発現させるためのｖｅｃｔｏｒは市販品としてＳｊｉｓｔｏｓｏｍａ Ｊａｐｏｎｉｃｕｍ由来ＧＳＴのコード領域の後ろにプロテアーゼ認識切断配列・マルチクローニングサイトを備えたｐＧＥＸシリーズがアマシャムファルマシアバイオテク社より市販されている。ＧＳＴ融合蛋白質は、比較的溶解度が高く、大腸菌内での蛋白質発現量が良好であること、グルタチオン固定化担体（ビーズ）を利用したアフィニティークロマトグラフィーを持ちいればほぼ１ステップで蛋白質が精製可能であること、グルタチオンビーズ上に目的融合蛋白質を固定化した状態で、さらにその標的分子（蛋白質・核酸・低分子など）との相互作用を容易に観察する方法があること（ｐｕｌｌ−ｄｏｗｎ ａｓｓａｙ）、タグを持たない蛋白質よりも表面プラズモン共鳴による分子間相互作用実験の計測チップに固定化する際に機能を損ないにくいこと、などから、生化学・分子生物学などで非常に汎用されている発現ベクターの一つである。このベクターをＴＡ−ｖｅｃｔｏｒに改良することで、多くの種類・長さの蛋白質や蛋白質断片を発現する発現系を、並行で作製することは、非常に有用であると考えた。
【００１５】
ゲノムプロジェクトの終了後、機能性蛋白質ならびに蛋白質の機能ドメインを同定して、それを産業に応用するために、その立体構造の決定と分子機能の決定の双方の高速化が重要となってきている。そのためには一連の研究に使用可能な活性を保持した蛋白質試料を、可溶性の蛋白質として得る必要がある。一般にヒトあるいは哺乳類・植物由来の蛋白質の全長または一部分の遺伝子を大腸菌で発現させる場合に、蛋白質が不溶化して構造・機能解析の試料調製に困難をきたすケースが非常に多い。そのような場合、蛋白質として発現させる領域・長さを変えたり（この手法をドメインマッピングまたはドメイン化と呼ぶ）、アミノ酸の部位特異的変異を一ヶ所あるいは数ヶ所導入することで溶解度が劇的に向上する例が知られている。同じ手法はまた、可溶性として得られた蛋白質に対して、その立体構造決定を目的としたＮＭＲ試料作成や結晶化の際の溶解度向上や結晶性改善の過程においても用いられる。このうち、多種類の遺伝子断片を並行して取得する過程は、ＰＣＲ法の進歩と、ＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒの化学合成の価格の低減によって、短期間・低コストで可能になった。従って現時点での技術的課題は、発現系を作製する際の人的・時間的コストと、目的の当該蛋白質が可溶性かどうかを迅速に区別する方法である。ＧＳＴ融合蛋白質をこの目的に用いるメリットは、ＧＳＴ融合蛋白質を含む大腸菌破砕物を遠心操作により可溶性・不溶性画分に分けた後、大腸菌粗蛋白質混合物中で、ＧＳＴ融合蛋白質の量をＧＳＴの酵素活性を指標に発色反応を行うことで、たとえば９６穴ｐｌａｔｅ上で並行で短時間に比色定量測定することが可能な点である。
【００１６】
以上のことを踏まえ、本発明者らは以下のことを試みた。
１．ＧＳＴ−Ｔ ｖｅｃｔｏｒの作製を上述の「ＳｍａＩ／Ｔａｑ」を用いた方法を用いて試作した。一応それらしきものの完成をみるが、再現性がなく、またＰＣＲ産物のサブクローニングの効率も悪いため実用性がなかった。
２．ＳｍａＩ／Ｔａｑで行った場合の効率を改善するための改良法をＷＷＷ上の文書から取得したのでそれを試したが、改善は見られなかった。
３．ＳｍａＩにより切断された平滑末端の塩基配列が低い効率の原因ではないかと考え、ＢａｍＨＩ切断による突出末端をＫｌｅｎｏｗ ｆｒａｇｍｅｎｔで平滑化したのち、ＴａｑでｄＴを付加するという独自の改良法も試みたが改善しなかった。
４．上述の「制限酵素カセットを用いる方法」に戦略変更し、制限酵素としてＡｈｄＩを用いることにした。
５．ｐＧＥＸ−２Ｔ／ｐＧＥＸ−４Ｔ３（ＧＳＴ融合ベクター）に限らず、抗生物質耐性を持っているｐｌａｓｍｉｄにＡｈｄＩを作用させると、そのａｍｐｉｃｉｌｉｎ耐性遺伝子が切断されることが判明した。そこでサイレントな部位特異的変異を導入してＡｍｐ耐性遺伝子に含まれるＡｈｄＩ切断部位を変異させたｐＧＥＸ−４Ｔ３を作製した。（部位特異的変異の導入に使用したｐｒｉｍｅｒ＝Ａｎｔｉ ＡｈｄＩの配列を配列表の配列番号２１に示した）。
６．ＡｈｄＩ−ｌｉｎｋｅｒを作製した。すなわち、配列番号２２及び２３の配列のＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒを利用して、鋳型としてｐＥＴ３２ａ（Ｎｏｖａｇｅｎｅ社製）の誘導体ｐＥＴ３２ａＰＡＣＡＰを用いてＰＣＲを行い、約５００ｂｐの断片を得て、これを既存のＴＡ−ｖｅｃｔｏｒ（今回はＰｒｏｍｅｇａ製品ｐＧＥＭ−Ｔ）に定法により組み込み、配列を確認したのちクローンを増幅して、精製したｐｌａｓｍｉｄを得、このｐｌａｓｍｉｄにＢａｍＨＩを作用させるとＡｈｄ−Ｉ ｌｉｎｋｅｒ（約５００ｂｐ）ができた。
７．ＧＳＴ−Ｔ ｖｅｃｔｏｒ（ＧＳＴ−Ｔ ｖｅｃｔｏｒ：ＧＳＴ融合のＴＡ−ｖｅｃｔｏｒの意）の母体となるｖｅｃｔｏｒを作製した。すなわち、５によって得たｐＧＥＸ−４Ｔ３の変異体を増幅し、ＢａｍＨＩで切断し、そのＢａｍＨＩサイトに６で得たＡｈｄＩ ｌｉｎｋｅｒを挿入し、ｌｉｇａｔｉｏｎにより閉環させた。正しく作製されたクローンを単離し、増幅した。なおこの段階のＡｈｄＩ ｌｉｎｋｅｒには原理上、方向性は存在しない（どちら向きで入っていてもかまわない）
８．ＧＳＴ−Ｔ ｖｅｃｔｏｒを作製した。すなわち、７をＡｈｄＩで切断して、開環状ｐｌａｓｍｉｄをａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌで分離精製した。このベクターは、３’にｄＴ突出末端を有するため、ＴＡ−ｃｌｏｎｉｎｇに利用できる。
９．ＮｃｏＩを作用させた時に、逆方向に外来遺伝子が挿入されたベクター（例えば、プラスミド）が切断され、該ベクターが導入された宿主は生育できず、その結果、順方向で外来遺伝子が挿入されたベクターが導入された宿主のみの選択をすること（ＮｃｏＩ ＯＲＦ選択法）に利用可能なＡｈｄＩ ｌｉｎｋｅｒを作製した。作製法は６と同じであるが、ｐｒｉｍｅｒに配列番号２２及び２４の配列の組を用いた。作製されたＮｃｏＩ ＯＲＦ選択法適用可能なＡｈｄＩ ｌｉｎｋｅｒの配列を配列番号２６及び２７に示す。配列番号２６の配列を有するＤＮＡ鎖と配列番号２７の配列を有するＤＮＡ鎖とが会合して形成する２本鎖ＤＮＡがＡｈｄＩ ｌｉｎｋｅｒである。
１０．ＮｃｏＩ ＯＲＦ選択法が可能なｄＧＳＴ−Ｔ ｖｅｃｔｏｒ（ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ＧＳＴ−Ｔ ｖｅｃｔｏｒ：ＯＲＦの方向選択が可能なＧＳＴ−Ｔ ｖｅｃｔｏｒの意）を作製した。作製法は上記７・８と同じである。ただし７に対応するときの配列確認時に、ＧＳＴとの融合部分でｐｒｉｍｅｒの配列番号２２に相当する配列が５’側（ＧＳＴ側）に来ているものを選択して、ＮｃｏＩ ＯＲＦ選択法の可能なベクターの母体となる閉環状ベクターを得た。また、このベクターは、挿入される外来遺伝子を増幅するＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒの設計を変更すれば、ＮｃｏＩの代わりにＮｄｅＩを作用させて、逆方向に外来遺伝子が挿入されたベクター（例えば、プラスミド）が切断され、該ベクターが導入された宿主は生育できず、その結果、順方向で外来遺伝子が挿入されたベクターが導入された宿主のみの選択（ＮｄｅＩ ＯＲＦ選択法）も可能であった。
【００１７】
本発明は以上の実験の経緯および結果に基づいて完成されたものである。
本願の第１発明は、第一の制限酵素によって認識される塩基配列の異なる２つの切断認識配列を持ち、そのうち一方の切断認識配列は第一の制限酵素とは異なる第二の制限酵素によって認識される切断認識配列の一部を含むが、他方の切断認識配列は前記の第二の制限酵素によって認識される切断認識配列の一部を含まないことを特徴とするベクターを提供する。
第一の制限酵素は、切断したＤＮＡに３’突出末端を生成する制限酵素であるとよく、３’突出末端の塩基としてはチミンを例示することができる。
第一の制限酵素はＡｈｄＩまたはそのイソスキゾマー、ＸｃｍＩまたはそのイソスキゾマー、およびその組み合わせからなる群より選択されるとよい。
第一の制限酵素がＡｈｄＩまたはそのイソスキゾマーである場合、ＡｈｄＩによって認識される塩基配列の異なる２つの切断認識配列の一方が下記の配列（Ｉ）及び（ＩＩ）で表され、他方が下記の配列（ＩＩＩ）及び（ＩＶ）で表されることが好ましい。
５’−ＧＡＣＸ１ａＸ２ａＴＸ３ａＸ４ａＧＴＣ−３’（Ｉ）
３’−ＣＴＧＸ１ｂＸ２ｂＡＸ３ｂＸ４ｂＣＡＧ−５’（ＩＩ）
５’−ＧＡＣＸ５ａＸ６ａＡＸ７ａＸ８ａＧＴＣ−３’（ＩＩＩ）
３’−ＣＴＧＸ５ｂＸ６ｂＴＸ７ｂＸ８ｂＣＡＧ−５’（ＩＶ）
（配列（Ｉ）〜（ＩＶ）中、Ｇはグアニン、Ａはアデニン、Ｃはシトシン、Ｔはチミンであり、
Ｘ１ａ〜Ｘ８ａ及びＸ１ｂ〜Ｘ８ｂはそれぞれ独立にグアニン、アデニン、シトシンまたはチミンのいずれかの塩基であり、Ｘ１ａとＸ１ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｘ２ａとＸ２ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｘ３ａとＸ３ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｘ４ａとＸ４ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｘ５ａとＸ５ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｘ６ａとＸ６ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｘ７ａとＸ７ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｘ８ａとＸ８ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、
配列ＣＸ１ａＸ２ａＴは第二の制限酵素の切断認識配列の５’側の部分配列を含む塩基配列であり、
配列ＣＸ８ｂＸ７ｂＴは配列ＣＸ１ａＸ２ａＴに含まれるところの第二の制限酵素の切断認識配列の部分配列を含まない塩基配列であり、
５’−及び３’−は２本鎖ＤＮＡのそれぞれの末端を示す。）
第一の制限酵素がＸｃｍＩまたはそのイソスキゾマーである場合、ＸｃｍＩによって認識される塩基配列の異なる２つの切断認識配列の一方が下記の配列（Ｖ）及び（ＶＩ）で表され、他方が下記の配列（ＶＩＩ）及び（ＶＩＩＩ）で表されることが好ましい。
５’−ＣＣＡＹ１ａＹ２ａＹ３ａＹ４ａＴＹ５ａＹ６ａＹ７ａＹ８ａＴＧＧ−３’（Ｖ）
３’−ＧＧＴＹ１ｂＹ２ｂＹ３ｂＹ４ｂＡＹ５ｂＹ６ｂＹ７ｂＹ８ｂＡＣＣ−５’（ＶＩ）
５’−ＣＣＡＹ９ａＹ１０ａＹ１１ａＹ１２ａＡＹ１３ａＹ１４ａＹ１５ａＹ１６ａＴＧＧ−３’（ＶＩＩ）
３’−ＧＧＴＹ９ｂＹ１０ｂＹ１１ｂＹ１２ｂＴＹ１３ｂＹ１４ｂＹ１５ｂＹ１６ｂＡＣＣ−５’（ＶＩＩＩ）
（配列（Ｖ）〜（ＶＩＩＩ）中、Ｇはグアニン、Ａはアデニン、Ｃはシトシン、Ｔはチミンであり、
Ｙ１ａ〜Ｙ１６ａ及びＹ１ｂ〜Ｙ１６ｂはそれぞれ独立にグアニン、アデニン、シトシンまたはチミンのいずれかの塩基であり、Ｙ１ａとＹ１ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ２ａとＹ２ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ３ａとＹ３ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ４ａとＹ４ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ５ａとＹ５ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ６ａとＹ６ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ７ａとＹ７ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ８ａとＹ８ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ９ａとＹ９ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ１０ａとＹ１０ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ１１ａとＹ１１ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ１２ａとＹ１２ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ１３ａとＹ１３ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ１４ａとＹ１４ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ１５ａとＹ１５ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ１６ａとＹ１６ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、
配列Ｙ１ａＹ２ａＹ３ａＹ４ａＴは第二の制限酵素の切断認識配列の５’側の部分配列を含む塩基配列であり、
配列Ｙ１６ｂＹ１５ｂＹ１４ｂＹ１３ｂＴは配列Ｙ１ａＹ２ａＹ３ａＹ４ａＴに含まれるところの第二の制限酵素の切断認識配列の部分配列を含まない塩基配列であり、
５’−及び３’−は２本鎖ＤＮＡのそれぞれの末端を示す。）
第一の制限酵素がＡｈｄＩまたはそのイソスキゾマーとＸｃｍＩまたはそのイソスキゾマーとの組み合わせである場合、第一の制限酵素によって認識される塩基配列の異なる２つの切断認識配列のうちの一方がＡｈｄＩまたはそのイソスキゾマーによって認識される切断認識配列であり、かつＡｈｄＩまたはそのイソスキゾマーとは異なる第二の制限酵素によって認識される切断配列の一部を含むものとし、他方の切断認識配列がＸｃｍＩまたはそのイソスキゾマーによって認識される切断認識配列であり、かつ前記の第二の制限酵素によって認識される切断認識配列の一部を含まないものとしてもよい。ＡｈｄＩまたはそのイソスキゾマーによって認識される切断認識配列であり、かつＡｈｄＩまたはそのイソスキゾマーとは異なる第二の制限酵素によって認識される切断配列の一部を含む切断認識配列は、下記の配列（Ｉ）及び（ＩＩ）で表されることが好ましい。ＸｃｍＩまたはそのイソスキゾマーによって認識される切断認識配列であり、かつ第二の制限酵素によって認識される切断認識配列の一部を含まない切断認識配列は、下記の配列（ＶＩＩ）及び（ＶＩＩＩ）で表されることが好ましい。
５’−ＧＡＣＸ１ａＸ２ａＴＸ３ａＸ４ａＧＴＣ−３’（Ｉ）
３’−ＣＴＧＸ１ｂＸ２ｂＡＸ３ｂＸ４ｂＣＡＧ−５’（ＩＩ）
（配列（Ｉ）及び（ＩＩ）中、Ｇはグアニン、Ａはアデニン、Ｃはシトシン、Ｔはチミンであり、
Ｘ１ａ〜Ｘ４ａ及びＸ１ｂ〜Ｘ４ｂはそれぞれ独立にグアニン、アデニン、シトシンまたはチミンのいずれかの塩基であり、Ｘ１ａとＸ１ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｘ２ａとＸ２ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｘ３ａとＸ３ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｘ４ａとＸ４ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、
配列ＣＸ１ａＸ２ａＴは第二の制限酵素の切断認識配列の５’側の部分配列を含む塩基配列であり、
５’−及び３’−は２本鎖ＤＮＡのそれぞれの末端を示す。）
５’−ＣＣＡＹ９ａＹ１０ａＹ１１ａＹ１２ａＡＹ１３ａＹ１４ａＹ１５ａＹ１６ａＴＧＧ−３’（ＶＩＩ）
３’−ＧＧＴＹ９ｂＹ１０ｂＹ１１ｂＹ１２ｂＴＹ１３ｂＹ１４ｂＹ１５ｂＹ１６ｂＡＣＣ−５’（ＶＩＩＩ）
（配列（ＶＩＩ）及び（ＶＩＩＩ）中、Ｇはグアニン、Ａはアデニン、Ｃはシトシン、Ｔはチミンであり、
Ｙ９ａ〜Ｙ１６ａ及びＹ９ｂ〜Ｙ１６ｂはそれぞれ独立にグアニン、アデニン、シトシンまたはチミンのいずれかの塩基であり、Ｙ９ａとＹ９ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ１０ａとＹ１０ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ１１ａとＹ１１ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ１２ａとＹ１２ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ１３ａとＹ１３ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ１４ａとＹ１４ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ１５ａとＹ１５ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ１６ａとＹ１６ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、
配列Ｙ１６ｂＹ１５ｂＹ１４ｂＹ１３ｂＴは配列ＣＸ１ａＸ２ａＴに含まれるところの第二の制限酵素の切断認識配列の部分配列を含まない塩基配列であり、
５’−及び３’−は２本鎖ＤＮＡのそれぞれの末端を示す。）
第一の制限酵素がＡｈｄＩまたはそのイソスキゾマー、ＸｃｍＩまたはそのイソスキゾマー、およびその組み合わせからなる群より選択される場合、第二の制限酵素は、ＮｃｏＩ，ＤｓａＩ，ＥｃｏＴ１４Ｉ，ＮｄｅＩ，ＳｆｅＩ，ＡｖａＩ，ＳｍｌＩ，ＸｈｏＩ，ＰｓｔＩ，ＥｃｏＴ２２Ｉ，ＰｓｈＢＩ，ＡｃｃＩ，ＡｐａＬＩ，ＰｓｉＩ，ＳｃａＩ，ＳｐｌＩ，Ｂｓｐ１１０７Ｉ，Ｂｓｐ１２８６Ｉ，ＢｓｐＴ１０７Ｉ，Ｂｓｐ１４０７Ｉ，ＴａｔＩ，ＨｇｉＣＩ，ＫｐｎＩ，ＳｐｅＩ，ＢｌｎＩ，ＮｈｅＩ，ＸｂａＩ，ＳｓｐＩ，ＥｃｏＲＶおよびそれらのイソスキゾマーからなる群より選択されることが好ましい。
第一の制限酵素がＸｃｍＩまたはそのイソスキゾマーである場合、第二の制限酵素が、ＡｆｌＩＩＩ，ＢｓｐＬＵ１１Ｉ，ＮｓｐＩ，ＳｐｈＩ，ＢｓｐＨＩ，ＢｓａＡＩ，ＰｍａＣＩ，ＳｎａＢＩ，ＮｓｐＢＩＩ、ＰｖｕＩＩ，ＢａｎＩＩ，ＨｇｉＡＩ，ＳａｃＩおよびそれらのイソスキゾマーからなる群より選択されることが好ましい。
第一の制限酵素によって認識される塩基配列の異なる２つの切断認識配列はマルチクローニングサイトに挿入されているとよい。
第一の制限酵素がＡｈｄＩまたはそのイソスキゾマーである場合、下記の配列（ＩＸ）及び（Ｘ）で表される二本鎖ＤＮＡがマルチクローニングサイトに挿入されていることが好ましい。
５’−ＧＡＣＸ１ａＸ２ａＴＸ３ａＸ４ａＧＴＣ−Ｎ１−ＧＡＣＸ５ａＸ６ａＡＸ７ａＸ８ａＧＴＣ−３’（ＩＸ）
３’−ＣＴＧＸ１ｂＸ２ｂＡＸ３ｂＸ４ｂＣＡＧ−Ｎ２−ＣＴＧＸ５ｂＸ６ｂＴＸ７ｂＸ８ｂＣＡＧ−５’（Ｘ）
（配列（ＩＸ）及び（Ｘ）中、Ｇはグアニン、Ａはアデニン、Ｃはシトシン、Ｔはチミンであり、
Ｘ１ａ〜Ｘ８ａ及びＸ１ｂ〜Ｘ８ｂはそれぞれ独立にグアニン、アデニン、シトシンまたはチミンのいずれかの塩基であり、Ｘ１ａとＸ１ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｘ２ａとＸ２ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｘ３ａとＸ３ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｘ４ａとＸ４ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｘ５ａとＸ５ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｘ６ａとＸ６ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｘ７ａとＸ７ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｘ８ａとＸ８ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、
配列ＣＸ１ａＸ２ａＴは第二の制限酵素の切断認識配列の５’側の部分配列を含む塩基配列であり、
配列ＣＸ８ｂＸ７ｂＴは配列ＣＸ１ａＸ２ａＴに含まれるところの第二の制限酵素の切断認識配列の部分配列を含まない塩基配列であり、
５’−及び３’−は２本鎖ＤＮＡのそれぞれの末端を示し、
Ｎ１は存在しなくともよいが、存在する場合には、１〜１０００塩基の任意のヌクレオチド配列であり、
Ｎ２は存在しなくともよいが、存在する場合には、Ｎ１のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列である。）
第一の制限酵素がＸｃｍＩまたはそのイソスキゾマーである場合、下記の配列（ＸＩ）及び（ＸＩＩ）で表される二本鎖ＤＮＡがマルチクローニングサイトに挿入されていることが好ましい。
５’−ＣＣＡＹ１ａＹ２ａＹ３ａＹ４ａＴＹ５ａＹ６ａＹ７ａＹ８ａＴＧＧ−Ｎ１−ＣＣＡＹ９ａＹ１０ａＹ１１ａＹ１２ａＡＹ１３ａＹ１４ａＹ１５ａＹ１６ａＴＧＧ−３’（ＸＩ）
３’−ＧＧＴＹ１ｂＹ２ｂＹ３ｂＹ４ｂＡＹ５ｂＹ６ｂＹ７ｂＹ８ｂＡＣＣ−Ｎ２−ＧＧＴＹ９ｂＹ１０ｂＹ１１ｂＹ１２ｂＴＹ１３ｂＹ１４ｂＹ１５ｂＹ１６ｂＡＣＣ−５’（ＸＩＩ）
（配列（ＸＩ）及び（ＸＩＩ）中、Ｇはグアニン、Ａはアデニン、Ｃはシトシン、Ｔはチミンであり、
Ｙ１ａ〜Ｙ１６ａ及びＹ１ｂ〜Ｙ１６ｂはそれぞれ独立にグアニン、アデニン、シトシンまたはチミンのいずれかの塩基であり、Ｙ１ａとＹ１ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ２ａとＹ２ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ３ａとＹ３ｂｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ４ａとＹ４ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ５ａとＹ５ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ６ａとＹ６ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ７ａとＹ７ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ８ａとＹ８ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ９ａとＹ９ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ１０ａとＹ１０ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ１１ａとＹ１１ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ１２ａとＹ１２ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ１３ａとＹ１３ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ１４ａとＹ１４ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ１５ａとＹ１５ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ１６ａとＹ１６ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、
配列Ｙ１ａＹ２ａＹ３ａＹ４ａＴは第二の制限酵素の切断認識配列の５’側の部分配列を含む塩基配列であり、
配列Ｙ１６ｂＹ１５ｂＹ１４ｂＹ１３ｂＴは配列Ｙ１ａＹ２ａＹ３ａＹ４ａＴに含まれるところの第二の制限酵素の切断認識配列の部分配列を含まない塩基配列であり、
５’−及び３’−は２本鎖ＤＮＡのそれぞれの末端を示し、
Ｎ１は存在しなくともよいが、存在する場合には、１〜１０００塩基の任意のヌクレオチド配列であり、
Ｎ２は存在しなくともよいが、存在する場合には、Ｎ１のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列である。）
第一の制限酵素がＡｈｄＩまたはそのイソスキゾマーとＸｃｍＩまたはそのイソスキゾマーの組み合わせである場合、下記の配列（ＸＩＩＩ）及び（ＸＩＶ）で表される二本鎖ＤＮＡがマルチクローニングサイトに挿入されていることが好ましい。
５’−ＧＡＣＸ１ａＸ２ａＴＸ３ａＸ４ａＧＴＣ−Ｎ１−ＣＣＡＹ９ａＹ１０ａＹ１１ａＹ１２ａＡＹ１３ａＹ１４ａＹ１５ａＹ１６ａＴＧＧ−３’（ＸＩＩＩ）
３’−ＣＴＧＸ１ｂＸ２ｂＡＸ３ｂＸ４ｂＣＡＧ−Ｎ２−ＧＧＴＹ９ｂＹ１０ｂＹ１１ｂＹ１２ｂＴＹ１３ｂＹ１４ｂＹ１５ｂＹ１６ｂＡＣＣ−５’（ＸＩＶ）
（配列（ＸＩＩＩ）及び（ＸＩＶ）中、Ｇはグアニン、Ａはアデニン、Ｃはシトシン、Ｔはチミンであり、
Ｘ１ａ〜Ｘ４ａ及びＸ１ｂ〜Ｘ４ｂはそれぞれ独立にグアニン、アデニン、シトシンまたはチミンのいずれかの塩基であり、Ｘ１ａとＸ１ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｘ２ａとＸ２ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｘ３ａとＸ３ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｘ４ａとＸ４ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、
Ｙ９ａ〜Ｙ１６ａ及びＹ９ｂ〜Ｙ１６ｂはそれぞれ独立にグアニン、アデニン、シトシンまたはチミンのいずれかの塩基であり、Ｙ９ａとＹ９ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ１０ａとＹ１０ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ１１ａとＹ１１ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ１２ａとＹ１２ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ１３ａとＹ１３ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ１４ａとＹ１４ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ１５ａとＹ１５ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ１６ａとＹ１６ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、
配列ＣＸ１ａＸ２ａＴは第二の制限酵素の切断認識配列の５’側の部分配列を含む塩基配列であり、
配列Ｙ１６ｂＹ１５ｂＹ１４ｂＹ１３ｂＴは配列ＣＸ１ａＸ２ａＴに含まれるところの第二の制限酵素の切断認識配列の部分配列を含まない塩基配列であり、
５’−及び３’−は２本鎖ＤＮＡのそれぞれの末端を示し、
Ｎ１は存在しなくともよいが、存在する場合には、１〜１０００塩基の任意のヌクレオチド配列であり、
Ｎ２は存在しなくともよいが、存在する場合には、Ｎ１のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列である。）
配列（ＩＸ）〜（ＸＩＶ）において、Ｎ１は、例えば、市販のベクター（例えば、ｐＥＴ２１ｂ、ｐＥＴ３２ａなど）の適当な制限酵素サイトに遺伝子（例えば、チオレドキシン遺伝子）と人工遺伝子（例えば、ＰＡＣＡＰなど）を挿入して作成した誘導体に由来する配列であるとよい。Ｎ１配列の一部には、第二の制限酵素サイトが含まれていることが好ましいことがある。この場合は、本発明のベクター（以下、「ＰＲＥＳＡＴ−ｖｅｃｔｏｒ」ということもある。）を第一の制限酵素で処理することにより得られる開環状ベクター（以下、「開環状ＰＲＥＳＡＴ−ｖｅｃｔｏｒ」ということもある。）の精製が不完全であった場合でも、そこから自己ライゲーションで出てくる「空の」ＰＲＥＳＡＴ−ｖｅｃｔｏｒは、第二の制限酵素消化により切断されてしまうために、ＯＲＦ選択後にコロニーにならない。したがって、開環状ＰＲＥＳＡＴ−ｖｅｃｔｏｒの精製が不完全であっても、バックグラウンドが上昇しないというメリットをもたらす。
Ｎ１の一例としては、以下の配列を挙げることができる。
５’−ＣＡＣＣＴＧＡＣＴＧＡＣＧＡＣＡＧＴＴＴＴＧＡＣＡＣＧＧＡＴＧＴＡＣＴＣＡＡＡＧＣＧＧＡＣＧＧＧＧＣＧＡＴＣＣＴＣＧＴＣＧＡＴＴＴＣＴＧＧＧＣＡＧＡＧＴＧＧＴＧＣＧＧＴＣＣＧＴＧＣＡＡＡＡＴＧＡＴＣＧＣＣＣＣＧＡＴＴＣＴＧＧＡＴＧＡＡＡＴＣＧＣＴＧＡＣＧＡＡＴＡＴＣＡＧＧＧＣＡＡＡＣＴＧＡＣＣＧＴＴＧＣＡＡＡＡＣＴＧＡＡＣＡＴＣＧＡＴＣＡＡＡＡＣＣＣＴＧＧＣＡＣＴＧＣＧＣＣＧＡＡＡＴＡＴＧＧＣＡＴＣＣＧＴＧＧＴＡＴＣＣＣＧＡＣＴＣＴＧＣＴＧＣＴＧＴＴＣＡＡＡＡＡＣＧＧＴＧＡＡＧＴＧＧＣＧＧＣＡＡＣＣＡＡＡＧＴＧＧＧＴＧＣＡＣＴＧＴＣＴＡＡＡＧＧＴＣＡＧＴＴＧＡＡＡＧＡＧＴＴＣＣＴＣＧＡＣＧＣＴＡＡＣＣＴＧＧＣＣＧＧＴＴＣＴＧＧＴＴＣＴＧＧＣＣＡＴＡＴＧＧＣＴＡＧＣＣＡＴＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＡＧＣＡＧＣＧＧＣＡＴＴＧＡＣＧＧＣＣＧＧＣＡＴＡＧＣＧＡＴＧＧＣＡＴＣＴＴＴＡＣＣＧＡＴＡＧＣＴＡＴＡＧＣＣＧＣＴＡＴＣＧＣＡＡＡＣＡＧＡＴＧＧＣＧＧＴＧＡＡＡＡＡＧＴＡＴＣＴＧＧＣＧＧＣＧＧＴＧＣＴＧＧＧＣＴＡＡＴＡＡ−３’（配列番号５５）
配列番号５５の配列は、ｐＥＴ２１ｂのＮｄｅＩサイトに、ｐＥＴ３２ａに由来するチオレドキシン遺伝子を含むＮｄｅＩ断片と、同じｐＥＴ２１ｂのＮｈｅＩサイトに、ＰＡＣＡＰの人工遺伝子を挿入して作成した、ｐＥＴ３２ａの誘導体ｐＥＴ３２ａＰＡＣＡＰに由来する配列である。
配列（ＩＸ）〜（ＸＩＶ）において、Ｎ２は、Ｎ１のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列である。Ｎ２の一例としては、以下の配列を挙げることができる。
３’−ＧＴＧＧＡＣＴＧＡＣＴＧＣＴＧＴＣＡＡＡＡＣＴＧＴＧＣＣＴＡＣＡＴＧＡＧＴＴＴＣＧＣＣＴＧＣＣＣＣＧＣＴＡＧＧＡＧＣＡＧＣＴＡＡＡＧＡＣＣＣＧＴＣＴＣＡＣＣＡＣＧＣＣＡＧＧＣＡＣＧＴＴＴＴＡＣＴＡＧＣＧＧＧＧＣＴＡＡＧＡＣＣＴＡＣＴＴＴＡＧＣＧＡＣＴＧＣＴＴＡＴＡＧＴＣＣＣＧＴＴＴＧＡＣＴＧＧＣＡＡＣＧＴＴＴＴＧＡＣＴＴＧＴＡＧＣＴＡＧＴＴＴＴＧＧＧＡＣＣＧＴＧＡＣＧＣＧＧＣＴＴＴＡＴＡＣＣＧＴＡＧＧＣＡＣＣＡＴＡＧＧＧＣＴＧＡＧＡＣＧＡＣＧＡＣＡＡＧＴＴＴＴＴＧＣＣＡＣＴＴＣＡＣＣＧＣＣＧＴＴＧＧＴＴＴＣＡＣＣＣＡＣＧＴＧＡＣＡＧＡＴＴＴＣＣＡＧＴＣＡＡＣＴＴＴＣＴＣＡＡＧＧＡＧＣＴＧＣＧＡＴＴＧＧＡＣＣＧＧＣＣＡＡＧＡＣＣＡＡＧＡＣＣＧＧＴＡＴＡＣＣＧＡＴＣＧＧＴＡＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＴＣＧＴＣＧＣＣＧＴＡＡＣＴＧＣＣＧＧＣＣＧＴＡＴＣＧＣＴＡＣＣＧＴＡＧＡＡＡＴＧＧＣＴＡＴＣＧＡＴＡＴＣＧＧＣＧＡＴＡＧＣＧＴＴＴＧＴＣＴＡＣＣＧＣＣＡＣＴＴＴＴＴＣＡＴＡＧＡＣＣＧＣＣＧＣＣＡＣＧＡＣＣＣＧＡＴＴＡＴＴ−５’（配列番号５６）
配列番号５６の配列は、配列番号５５の配列に相補的な配列である。
本願の第１発明のベクターは、ある蛋白質（例えば、哺乳類、ジストマジャポニクスまたは大腸菌に由来するグルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、チオレドキシン（ＴＲＸ）、Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ（Ｈｉｓ６）、ｌａｎｔｈａｎｉｄｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔａｇ（ＬＢＴ）、Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ（ＰＬＡＧ（登録商標））、ｅｎｈａｎｃｅｄ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓｅ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＥＧＦＰ）など）のコード領域を含んでおり、蛋白質及び／又は蛋白質ドメインをコードする外来遺伝子を組み込んだときに、前記外来遺伝子がコードする蛋白質及び／又は蛋白質ドメインを前記領域がコードする蛋白質と結合した融合蛋白質の形態で発現することができるものであってもよい。この場合、ある蛋白質のコード領域のカルボキシ末端側に、第一の制限酵素によって認識される塩基配列の異なる２つの切断認識配列を持ち、そのうち前記蛋白質のコード領域に近い側の切断認識配列は第一の制限酵素とは異なる第二の制限酵素によって認識される切断認識配列の一部を含むが、前記蛋白質のコード領域に遠い側の切断認識配列は前記の第二の制限酵素によって認識される切断認識配列の一部を含まないようにするとよい。
本願の第２発明は、本願の第１発明のベクターを第一の制限酵素で処理することにより得られる二本鎖ＤＮＡからなる開環状ベクターを提供する。
本発明の開環状ベクターとしては、下記の配列（ＸＶ）及び（ＸＶＩ）で表される二本鎖ＤＮＡからなる開環状ベクターを例示することができる。
５’−Ｘ７ａＸ８ａＧＴＣ−Ｎ３−ＧＡＣＸ１ａＸ２ａＴ−３’（ＸＶ）
３’−ＴＸ７ｂＸ８ｂＣＡＧ−Ｎ４−ＣＴＧＸ１ｂＸ２ｂ−５’（ＸＶＩ）
（配列（ＸＶ）及び（ＸＶＩ）中、Ｇはグアニン、Ａはアデニン、Ｃはシトシン、Ｔはチミンであり、
Ｘ７ａ、Ｘ８ａ、Ｘ７ｂ及びＸ８ｂはそれぞれ独立にグアニン、アデニン、シトシンまたはチミンのいずれかの塩基であるが、Ｘ７ａとＸ７ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｘ８ａとＸ８ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、
Ｘ１ａ、Ｘ２ａ、Ｘ１ｂ及びＸ２ｂはそれぞれ独立にグアニン、アデニン、シトシンまたはチミンのいずれかの塩基であるが、Ｘ１ａとＸ１ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｘ２ａとＸ２ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、
配列ＣＸ１ａＸ２ａＴはＮｃｏＩ，ＤｓａＩ，ＥｃｏＴ１４Ｉ，ＮｄｅＩ，ＳｆｅＩ，ＡｖａＩ，ＳｍｌＩ，ＸｈｏＩ，ＰｓｔＩ，ＥｃｏＴ２２Ｉ，ＰｓｈＢＩ，ＡｃｃＩ，ＡｐａＬＩ，ＰｓｉＩ，ＳｃａＩ，ＳｐｌＩ，Ｂｓｐ１１０７Ｉ，Ｂｓｐ１２８６Ｉ，ＢｓｐＴ１０７Ｉ，Ｂｓｐ１４０７Ｉ，ＴａｔＩ，ＨｇｉＣＩ，ＫｐｎＩ，ＳｐｅＩ，ＢｌｎＩ，ＮｈｅＩ，ＸｂａＩ，ＳｓｐＩ，ＥｃｏＲＶまたはそれらのイソスキゾマーの切断認識配列の５’側の部分配列を含む塩基配列であり、
配列ＣＸ８ｂＸ７ｂＴは配列ＣＸ１ａＸ２ａＴに含まれるところのＮｃｏＩ，ＤｓａＩ，ＥｃｏＴ１４Ｉ，ＮｄｅＩ，ＳｆｅＩ，ＡｖａＩ，ＳｍｌＩ，ＸｈｏＩ，ＰｓｔＩ，ＥｃｏＴ２２Ｉ，ＰｓｈＢＩ，ＡｃｃＩ，ＡｐａＬＩ，ＰｓｉＩ，ＳｃａＩ，ＳｐｌＩ，Ｂｓｐ１１０７Ｉ，Ｂｓｐ１２８６Ｉ，ＢｓｐＴ１０７Ｉ，Ｂｓｐ１４０７Ｉ，ＴａｔＩ，ＨｇｉＣＩ，ＫｐｎＩ，ＳｐｅＩ，ＢｌｎＩ，ＮｈｅＩ，ＸｂａＩ，ＳｓｐＩ，ＥｃｏＲＶまたはそれらのイソスキゾマーの切断認識配列の部分配列を含まない配列であり、
−５’及び−３’は２本鎖ＤＮＡのそれぞれの末端を示し、
Ｎ３は２０００〜７０００塩基の任意のヌクレオチド配列であり、Ｎ４はＮ３のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列である。）
配列（ＸＶ）及び（ＸＶＩ）において、Ｘ７ａがＡであり、Ｘ８ａがＴであり、Ｘ１ａがＣであり、Ｘ２ａがＡであり、Ｘ７ｂがＴであり、Ｘ８ｂがＡであり、Ｘ１ｂがＧであり、Ｘ２ｂがＴであることが好ましい。
また、本発明の開環状ベクターとして、下記の配列（ＸＶＩＩ）及び（ＸＶＩＩＩ）で表される二本鎖ＤＮＡからなる開環状ベクターを例示することができる。
５’−Ｙ１３ａＹ１４ａＹ１５ａＹ１６ａＴＧＧ−Ｎ３−ＣＣＡＹ１ａＹ２ａＹ３ａＹ４ａＴ−３’（ＸＶＩＩ）
３’−ＴＹ１３ｂＹ１４ｂＹ１５ｂＹ１６ｂＡＣＣ−Ｎ４−ＧＧＴＹ１ｂＹ２ｂＹ３ｂＹ４ｂ−５’（ＸＶＩＩＩ）
（配列（ＸＶＩＩ）及び（ＸＶＩＩＩ）中、Ｇはグアニン、Ａはアデニン、Ｃはシトシン、Ｔはチミンであり、
Ｙ１ａ、Ｙ２ａ、Ｙ３ａ、Ｙ４ａ、Ｙ１ｂ、Ｙ２ｂ、Ｙ３ｂ、及びＹ４ｂはそれぞれ独立にグアニン、アデニン、シトシンまたはチミンのいずれかの塩基であるが、Ｙ１ａとＹ１ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ２ａとＹ２ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ３ａとＹ３ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ４ａとＹ４ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、
配列Ｙ１ａＹ２ａＹ３ａＹ４ａＴはＮｃｏＩ，ＤｓａＩ，ＥｃｏＴ１４Ｉ，ＮｄｅＩ，ＳｆｅＩ，ＡｖａＩ，ＳｍｌＩ，ＸｈｏＩ，ＰｓｔＩ，ＥｃｏＴ２２Ｉ，ＰｓｈＢＩ，ＡｃｃＩ，ＡｐａＬＩ，ＰｓｉＩ，ＳｃａＩ，ＳｐｌＩ，Ｂｓｐ１１０７Ｉ，Ｂｓｐ１２８６Ｉ，ＢｓｐＴ１０７Ｉ，Ｂｓｐ１４０７Ｉ，ＴａｔＩ，ＨｇｉＣＩ，ＫｐｎＩ，ＳｐｅＩ，ＢｌｎＩ，ＮｈｅＩ，ＸｂａＩ，ＳｓｐＩ，ＥｃｏＲＶ，ＡｆｌＩＩＩ，ＢｓｐＬＵ１１Ｉ，ＮｓｐＩ，ＳｐｈＩ，ＢｓｐＨＩ，ＢｓａＡＩ，ＰｍａＣＩ，ＳｎａＢＩ，ＮｓｐＢＩＩ、ＰｖｕＩＩ，ＢａｎＩＩ，ＨｇｉＡＩ，ＳａｃＩまたはそれらのイソスキゾマーの切断認識配列の５’側の部分配列を含む塩基配列であり、
Ｙ１３ａ、Ｙ１４ａ、Ｙ１５ａ、Ｙ１６ａ、Ｙ１３ｂ、Ｙ１４ｂ、Ｙ１５ｂ及びＹ１６ｂはそれぞれ独立にグアニン、アデニン、シトシンまたはチミンのいずれかの塩基であるが、Ｙ１３ａとＹ１３ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ１４ａとＹ１４ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ１５ａとＹ１５ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ１６ａとＹ１６ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、
配列Ｙ１６ｂＹ１５ｂＹ１４ｂＹ１３ｂＴは配列Ｙ１ａＹ２ａＹ３ａＹ４ａＴに含まれるところのＮｃｏＩ，ＤｓａＩ，ＥｃｏＴ１４Ｉ，ＮｄｅＩ，ＳｆｅＩ，ＡｖａＩ，ＳｍｌＩ，ＸｈｏＩ，ＰｓｔＩ，ＥｃｏＴ２２Ｉ，ＰｓｈＢＩ，ＡｃｃＩ，ＡｐａＬＩ，ＰｓｉＩ，ＳｃａＩ，ＳｐｌＩ，Ｂｓｐ１１０７Ｉ，Ｂｓｐ１２８６Ｉ，ＢｓｐＴ１０７Ｉ，Ｂｓｐ１４０７Ｉ，ＴａｔＩ，ＨｇｉＣＩ，ＫｐｎＩ，ＳｐｅＩ，ＢｌｎＩ，ＮｈｅＩ，ＸｂａＩ，ＳｓｐＩ，ＥｃｏＲＶ，ＡｆｌＩＩＩ，ＢｓｐＬＵ１１Ｉ，ＮｓｐＩ，ＳｐｈＩ，ＢｓｐＨＩ，ＢｓａＡＩ，ＰｍａＣＩ，ＳｎａＢＩ，ＮｓｐＢＩＩ、ＰｖｕＩＩ，ＢａｎＩＩ，ＨｇｉＡＩ，ＳａｃＩまたはそれらのイソスキゾマーの切断認識配列の部分配列を含まない塩基配列であり、
−５’及び−３’は２本鎖ＤＮＡのそれぞれの末端を示し、
Ｎ３は２０００〜７０００塩基の任意のヌクレオチド配列であり、Ｎ４はＮ３のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列である。）
配列（ＸＶＩＩ）及び（ＸＶＩＩＩ）において、Ｙ２ａがＣであり、Ｙ３ａがでＣあり、Ｙ４ａがＡであり、Ｙ２ｂがＧであり、Ｙ３ｂがＧであり、Ｙ４ｂがＴであり、Ｙ１３ａがＴであり、Ｙ１４ａがＧであり、Ｙ１５ａがＴであり、Ｙ１３ｂがＡであり、Ｙ１４ｂがＣであり、Ｙ１５ｂがＡであることが好ましい。
さらに、本発明の開環状ベクターとして、下記の配列（ＸＩＸ）及び（ＸＸ）で表される二本鎖ＤＮＡからなる開環状ベクターを例示することができる。
５’−Ｙ１３ａＹ１４ａＹ１５ａＹ１６ａＴＧＧ−Ｎ３−ＧＡＣＸ１ａＸ２ａＴ−３’（ＸＩＸ）
３’−ＴＹ１３ｂＹ１４ｂＹ１５ｂＹ１６ｂＡＣＣ−５’Ｎ４−ＣＴＧＸ１ｂＸ２ｂ−５’（ＸＸ）
（配列（ＸＩＸ）及び（ＸＸ）中、Ｇはグアニン、Ａはアデニン、Ｃはシトシン、Ｔはチミンであり、
Ｙ１３ａ、Ｙ１４ａ、Ｙ１５ａ、Ｙ１６ａ、Ｙ１３ｂ、Ｙ１４ｂ、Ｙ１５ｂ及びＹ１６ｂはそれぞれ独立にグアニン、アデニン、シトシンまたはチミンのいずれかの塩基であるが、Ｙ１３ａとＹ１３ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ１４ａとＹ１４ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ１５ａとＹ１５ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ１６ａとＹ１６ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、
Ｘ１ａ、Ｘ２ａ、Ｘ１ｂ及びＸ２ｂはそれぞれ独立にグアニン、アデニン、シトシンまたはチミンのいずれかの塩基であるが、Ｘ１ａとＸ１ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｘ２ａとＸ２ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、
配列ＣＸ１ａＸ２ａＴはＮｃｏＩ，ＤｓａＩ，ＥｃｏＴ１４Ｉ，ＮｄｅＩ，ＳｆｅＩ，ＡｖａＩ，ＳｍｌＩ，ＸｈｏＩ，ＰｓｔＩ，ＥｃｏＴ２２Ｉ，ＰｓｈＢＩ，ＡｃｃＩ，ＡｐａＬＩ，ＰｓｉＩ，ＳｃａＩ，ＳｐｌＩ，Ｂｓｐ１１０７Ｉ，Ｂｓｐ１２８６Ｉ，ＢｓｐＴ１０７Ｉ，Ｂｓｐ１４０７Ｉ，ＴａｔＩ，ＨｇｉＣＩ，ＫｐｎＩ，ＳｐｅＩ，ＢｌｎＩ，ＮｈｅＩ，ＸｂａＩ，ＳｓｐＩ，ＥｃｏＲＶまたはそれらのイソスキゾマーの切断認識配列の５’側の部分配列を含む塩基配列であり、
配列Ｙ１４ｂＹ１３ｂＴは配列ＣＸ１ａＸ２ａＴに含まれるところのＮｃｏＩ，ＤｓａＩ，ＥｃｏＴ１４Ｉ，ＮｄｅＩ，ＳｆｅＩ，ＡｖａＩ，ＳｍｌＩ，ＸｈｏＩ，ＰｓｔＩ，ＥｃｏＴ２２Ｉ，ＰｓｈＢＩ，ＡｃｃＩ，ＡｐａＬＩ，ＰｓｉＩ，ＳｃａＩ，ＳｐｌＩ，Ｂｓｐ１１０７Ｉ，Ｂｓｐ１２８６Ｉ，ＢｓｐＴ１０７Ｉ，Ｂｓｐ１４０７Ｉ，ＴａｔＩ，ＨｇｉＣＩ，ＫｐｎＩ，ＳｐｅＩ，ＢｌｎＩ，ＮｈｅＩ，ＸｂａＩ，ＳｓｐＩ，ＥｃｏＲＶまたはそれらのイソスキゾマーの切断認識配列の部分配列を含まない塩基配列であり、
−５’及び−３’は２本鎖ＤＮＡのそれぞれの末端を示し、
Ｎ３は２０００〜７０００塩基の任意のヌクレオチド配列であり、Ｎ４はＮ３のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列である。）
配列（ＸＩＸ）及び（ＸＸ）において、Ｘ１ａがＣであり、Ｘ２ａがＡであり、Ｘ１ｂがＧであり、Ｘ２ｂがＴであり、Ｙ１３ａがＴであり、Ｙ１４ａがＧであり、Ｙ１５ａがＴであり、Ｙ１３ｂがＡであり、Ｙ１４ｂがＣであり、Ｙ１５ｂがＡであることが好ましい。
配列（ＸＶ）〜（ＸＸ）において、Ｎ３は、例えば、市販のベクター（例えば、ｐＧＥＸ−４Ｔ３、ｐＧＥＸ−２Ｔ、ｐＧＥＸ−３Ｘ、ｐＥＴ２１ｂ、ｐＥＴ３２ａなど）に由来する配列であるとよい。Ｎ３の一例としては、以下の配列を挙げることができる。
５’−ＧＧＡＴＣＣＣＣＧＡＡＴＴＣＣＣＧＧＧＴＣＧＡＣＴＣＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡＴＣＧＴＧＡＣＴＧＡＣＴＧＡＣＧＡＴＣＴＧＣＣＴＣＧＣＧＣＧＴＴＴＣＧＧＴＧＡＴＧＡＣＧＧＴＧＡＡＡＡＣＣＴＣＴＧＡＣＡＣＡＴＧＣＡＧＣＴＣＣＣＧＧＡＧＡＣＧＧＴＣＡＣＡＧＣＴＴＧＴＣＴＧＴＡＡＧＣＧＧＡＴＧＣＣＧＧＧＡＧＣＡＧＡＣＡＡＧＣＣＣＧＴＣＡＧＧＧＣＧＣＧＴＣＡＧＣＧＧＧＴＧＴＴＧＧＣＧＧＧＴＧＴＣＧＧＧＧＣＧＣＡＧＣＣＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＴＡＧＣＧＡＴＡＧＣＧＧＡＧＴＧＴＡＴＡＡＴＴＣＴＴＧＡＡＧＡＣＧＡＡＡＧＧＧＣＣＴＣＧＴＧＡＴＡＣＧＣＣＴＡＴＴＴＴＴＡＴＡＧＧＴＴＡＡＴＧＴＣＡＴＧＡＴＡＡＴＡＡＴＧＧＴＴＴＣＴＴＡＧＡＣＧＴＣＡＧＧＴＧＧＣＡＣＴＴＴＴＣＧＧＧＧＡＡＡＴＧＴＧＣＧＣＧＧＡＡＣＣＣＣＴＡＴＴＴＧＴＴＴＡＴＴＴＴＴＣＴＡＡＡＴＡＣＡＴＴＣＡＡＡＴＡＴＧＴＡＴＣＣＧＣＴＣＡＴＧＡＧＡＣＡＡＴＡＡＣＣＣＴＧＡＴＡＡＡＴＧＣＴＴＣＡＡＴＡＡＴＡＴＴＧＡＡＡＡＡＧＧＡＡＧＡＧＴＡＴＧＡＧＴＡＴＴＣＡＡＣＡＴＴＴＣＣＧＴＧＴＣＧＣＣＣＴＴＡＴＴＣＣＣＴＴＴＴＴＴＧＣＧＧＣＡＴＴＴＴＧＣＣＴＴＣＣＴＧＴＴＴＴＴＧＣＴＣＡＣＣＣＡＧＡＡＡＣＧＣＴＧＧＴＧＡＡＡＧＴＡＡＡＡＧＡＴＧＣＴＧＡＡＧＡＴＣＡＧＴＴＧＧＧＴＧＣＡＣＧＡＧＴＧＧＧＴＴＡＣＡＴＣＧＡＡＣＴＧＧＡＴＣＴＣＡＡＣＡＧＣＧＧＴＡＡＧＡＴＣＣＴＴＧＡＧＡＧＴＴＴＴＣＧＣＣＣＣＧＡＡＧＡＡＣＧＴＴＴＴＣＣＡＡＴＧＡＴＧＡＧＣＡＣＴＴＴＴＡＡＡＧＴＴＣＴＧＣＴＡＴＧＴＧＧＣＧＣＧＧＴＡＴＴＡＴＣＣＣＧＴＧＴＴＧＡＣＧＣＣＧＧＧＣＡＡＧＡＧＣＡＡＣＴＣＧＧＴＣＧＣＣＧＣＡＴＡＣＡＣＴＡＴＴＣＴＣＡＧＡＡＴＧＡＣＴＴＧＧＴＴＧＡＧＴＡＣＴＣＡＣＣＡＧＴＣＡＣＡＧＡＡＡＡＧＣＡＴＣＴＴＡＣＧＧＡＴＧＧＣＡＴＧＡＣＡＧＴＡＡＧＡＧＡＡＴＴＡＴＧＣＡＧＴＧＣＴＧＣＣＡＴＡＡＣＣＡＴＧＡＧＴＧＡＴＡＡＣＡＣＴＧＣＧＧＣＣＡＡＣＴＴＡＣＴＴＣＴＧＡＣＡＡＣＧＡＴＣＧＧＡＧＧＡＣＣＧＡＡＧＧＡＧＣＴＡＡＣＣＧＣＴＴＴＴＴＴＧＣＡＣＡＡＣＡＴＧＧＧＧＧＡＴＣＡＴＧＴＡＡＣＴＣＧＣＣＴＴＧＡＴＣＧＴＴＧＧＧＡＡＣＣＧＧＡＧＣＴＧＡＡＴＧＡＡＧＣＣＡＴＡＣＣＡＡＡＣＧＡＣＧＡＧＣＴＧＡＣＡＣＣＡＣＧＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＣＡＡＴＧＧＣＡＡＣＡＡＣＧＴＴＧＣＧＣＡＡＡＣＴＡＴＴＡＡＣＴＧＧＣＧＡＡＣＴＡＣＴＴＡＣＴＣＴＡＧＣＴＴＣＣＣＧＧＣＡＡＣＡＡＴＴＡＡＴＡＧＡＣＴＧＧＡＴＧＧＡＧＧＣＧＧＡＴＡＡＡＧＴＴＧＣＡＧＧＡＣＣＡＣＴＴＣＴＧＣＧＣＴＣＧＧＣＣＣＴＴＣＣＧＧＣＴＧＧＣＴＧＧＴＴＴＡＴＴＧＣＴＧＡＴＡＡＡＴＣＴＧＧＡＧＣＣＧＧＴＧＡＧＣＧＴＧＧＧＴＣＴＣＧＣＧＧＴＡＴＣＡＴＴＧＣＡＧＣＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＡＴＧＧＴＡＡＧＣＣＣＴＣＣＣＧＴＡＴＣＧＴＡＧＴＴＡＴＣＴＡＣＡＣＣＡＣＧＧＧＧＡＧＣＣＡＧＧＣＡＡＣＴＡＴＧＧＡＴＧＡＡＣＧＡＡＡＴＡＧＡＣＡＧＡＴＣＧＣＴＧＡＧＡＴＡＧＧＴＧＣＣＴＣＡＣＴＧＡＴＴＡＡＧＣＡＴＴＧＧＴＡＡＣＴＧＴＣＡＧＡＣＣＡＡＧＴＴＴＡＣＴＣＡＴＡＴＡＴＡＣＴＴＴＡＧＡＴＴＧＡＴＴＴＡＡＡＡＣＴＴＣＡＴＴＴＴＴＡＡＴＴＴＡＡＡＡＧＧＡＴＣＴＡＧＧＴＧＡＡＧＡＴＣＣＴＴＴＴＴＧＡＴＡＡＴＣＴＣＡＴＧＡＣＣＡＡＡＡＴＣＣＣＴＴＡＡＣＧＴＧＡＧＴＴＴＴＣＧＴＴＣＣＡＣＴＧＡＧＣＧＴＣＡＧＡＣＣＣＣＧＴＡＧＡＡＡＡＧＡＴＣＡＡＡＧＧＡＴＣＴＴＣＴＴＧＡＧＡＴＣＣＴＴＴＴＴＴＴＣＴＧＣＧＣＧＴＡＡＴＣＴＧＣＴＧＣＴＴＧＣＡＡＡＣＡＡＡＡＡＡＡＣＣＡＣＣＧＣＴＡＣＣＡＧＣＧＧＴＧＧＴＴＴＧＴＴＴＧＣＣＧＧＡＴＣＡＡＧＡＧＣＴＡＣＣＡＡＣＴＣＴＴＴＴＴＣＣＧＡＡＧＧＴＡＡＣＴＧＧＣＴＴＣＡＧＣＡＧＡＧＣＧＣＡＧＡＴＡＣＣＡＡＡＴＡＣＴＧＴＣＣＴＴＣＴＡＧＴＧＴＡＧＣＣＧＴＡＧＴＴＡＧＧＣＣＡＣＣＡＣＴＴＣＡＡＧＡＡＣＴＣＴＧＴＡＧＣＡＣＣＧＣＣＴＡＣＡＴＡＣＣＴＣＧＣＴＣＴＧＣＴＡＡＴＣＣＴＧＴＴＡＣＣＡＧＴＧＧＣＴＧＣＴＧＣＣＡＧＴＧＧＣＧＡＴＡＡＧＴＣＧＴＧＴＣＴＴＡＣＣＧＧＧＴＴＧＧＡＣＴＣＡＡＧＡＣＧＡＴＡＧＴＴＡＣＣＧＧＡＴＡＡＧＧＣＧＣＡＧＣＧＧＴＣＧＧＧＣＴＧＡＡＣＧＧＧＧＧＧＴＴＣＧＴＧＣＡＣＡＣＡＧＣＣＣＡＧＣＴＴＧＧＡＧＣＧＡＡＣＧＡＣＣＴＡＣＡＣＣＧＡＡＣＴＧＡＧＡＴＡＣＣＴＡＣＡＧＣＧＴＧＡＧＣＴＡＴＧＡＧＡＡＡＧＣＧＣＣＡＣＧＣＴＴＣＣＣＧＡＡＧＧＧＡＧＡＡＡＧＧＣＧＧＡＣＡＧＧＴＡＴＣＣＧＧＴＡＡＧＣＧＧＣＡＧＧＧＴＣＧＧＡＡＣＡＧＧＡＧＡＧＣＧＣＡＣＧＡＧＧＧＡＧＣＴＴＣＣＡＧＧＧＧＧＡＡＡＣＧＣＣＴＧＧＴＡＴＣＴＴＴＡＴＡＧＴＣＣＴＧＴＣＧＧＧＴＴＴＣＧＣＣＡＣＣＴＣＴＧＡＣＴＴＧＡＧＣＧＴＣＧＡＴＴＴＴＴＧＴＧＡＴＧＣＴＣＧＴＣＡＧＧＧＧＧＧＣＧＧＡＧＣＣＴＡＴＧＧＡＡＡＡＡＣＧＣＣＡＧＣＡＡＣＧＣＧＧＣＣＴＴＴＴＴＡＣＧＧＴＴＣＣＴＧＧＣＣＴＴＴＴＧＣＴＧＧＣＣＴＴＴＴＧＣＴＣＡＣＡＴＧＴＴＣＴＴＴＣＣＴＧＣＧＴＴＡＴＣＣＣＣＴＧＡＴＴＣＴＧＴＧＧＡＴＡＡＣＣＧＴＡＴＴＡＣＣＧＣＣＴＴＴＧＡＧＴＧＡＧＣＴＧＡＴＡＣＣＧＣＴＣＧＣＣＧＣＡＧＣＣＧＡＡＣＧＡＣＣＧＡＧＣＧＣＡＧＣＧＡＧＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡＧＧＡＡＧＣＧＧＡＡＧＡＧＣＧＣＣＴＧＡＴＧＣＧＧＴＡＴＴＴＴＣＴＣＣＴＴＡＣＧＣＡＴＣＴＧＴＧＣＧＧＴＡＴＴＴＣＡＣＡＣＣＧＣＡＴＡＡＡＴＴＣＣＧＡＣＡＣＣＡＴＣＧＡＡＴＧＧＴＧＣＡＡＡＡＣＣＴＴＴＣＧＣＧＧＴＡＴＧＧＣＡＴＧＡＴＡＧＣＧＣＣＣＧＧＡＡＧＡＧＡＧＴＣＡＡＴＴＣＡＧＧＧＴＧＧＴＧＡＡＴＧＴＧＡＡＡＣＣＡＧＴＡＡＣＧＴＴＡＴＡＣＧＡＴＧＴＣＧＣＡＧＡＧＴＡＴＧＣＣＧＧＴＧＴＣＴＣＴＴＡＴＣＡＧＡＣＣＧＴＴＴＣＣＣＧＣＧＴＧＧＴＧＡＡＣＣＡＧＧＣＣＡＧＣＣＡＣＧＴＴＴＣＴＧＣＧＡＡＡＡＣＧＣＧＧＧＡＡＡＡＡＧＴＧＧＡＡＧＣＧＧＣＧＡＴＧＧＣＧＧＡＧＣＴＧＡＡＴＴＡＣＡＴＴＣＣＣＡＡＣＣＧＣＧＴＧＧＣＡＣＡＡＣＡＡＣＴＧＧＣＧＧＧＣＡＡＡＣＡＧＴＣＧＴＴＧＣＴＧＡＴＴＧＧＣＧＴＴＧＣＣＡＣＣＴＣＣＡＧＴＣＴＧＧＣＣＣＴＧＣＡＣＧＣＧＣＣＧＴＣＧＣＡＡＡＴＴＧＴＣＧＣＧＧＣＧＡＴＴＡＡＡＴＣＴＣＧＣＧＣＣＧＡＴＣＡＡＣＴＧＧＧＴＧＣＣＡＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＴＣＧＡＴＧＧＴＡＧＡＡＣＧＡＡＧＣＧＧＣＧＴＣＧＡＡＧＣＣＴＧＴＡＡＡＧＣＧＧＣＧＧＴＧＣＡＣＡＡＴＣＴＴＣＴＣＧＣＧＣＡＡＣＧＣＧＴＣＡＧＴＧＧＧＣＴＧＡＴＣＡＴＴＡＡＣＴＡＴＣＣＧＣＴＧＧＡＴＧＡＣＣＡＧＧＡＴＧＣＣＡＴＴＧＣＴＧＴＧＧＡＡＧＣＴＧＣＣＴＧＣＡＣＴＡＡＴＧＴＴＣＣＧＧＣＧＴＴＡＴＴＴＣＴＴＧＡＴＧＴＣＴＣＴＧＡＣＣＡＧＡＣＡＣＣＣＡＴＣＡＡＣＡＧＴＡＴＴＡＴＴＴＴＣＴＣＣＣＡＴＧＡＡＧＡＣＧＧＴＡＣＧＣＧＡＣＴＧＧＧＣＧＴＧＧＡＧＣＡＴＣＴＧＧＴＣＧＣＡＴＴＧＧＧＴＣＡＣＣＡＧＣＡＡＡＴＣＧＣＧＣＴＧＴＴＡＧＣＧＧＧＣＣＣＡＴＴＡＡＧＴＴＣＴＧＴＣＴＣＧＧＣＧＣＧＴＣＴＧＣＧＴＣＴＧＧＣＴＧＧＣＴＧＧＣＡＴＡＡＡＴＡＴＣＴＣＡＣＴＣＧＣＡＡＴＣＡＡＡＴＴＣＡＧＣＧＡＴＡＧＣＧＧＡＡＣＧＧＧＡＡＧＧＣＧＡＣＴＧＧＡＧＴＧＣＣＡＴＧＴＣＣＧＧＴＴＴＴＣＡＡＣＡＡＡＣＣＡＴＧＣＡＡＡＴＧＣＴＧＡＡＴＧＡＧＧＧＣＡＴＣＧＴＴＣＣＣＡＣＴＧＣＧＡＴＧＣＴＧＧＴＴＧＣＣＡＡＣＧＡＴＣＡＧＡＴＧＧＣＧＣＴＧＧＧＣＧＣＡＡＴＧＣＧＣＧＣＣＡＴＴＡＣＣＧＡＧＴＣＣＧＧＧＣＴＧＣＧＣＧＴＴＧＧＴＧＣＧＧＡＴＡＴＣＴＣＧＧＴＡＧＴＧＧＧＡＴＡＣＧＡＣＧＡＴＡＣＣＧＡＡＧＡＣＡＧＣＴＣＡＴＧＴＴＡＴＡＴＣＣＣＧＣＣＧＴＴＡＡＣＣＡＣＣＡＴＣＡＡＡＣＡＧＧＡＴＴＴＴＣＧＣＣＴＧＣＴＧＧＧＧＣＡＡＡＣＣＡＧＣＧＴＧＧＡＣＣＧＣＴＴＧＣＴＧＣＡＡＣＴＣＴＣＴＣＡＧＧＧＣＣＡＧＧＣＧＧＴＧＡＡＧＧＧＣＡＡＴＣＡＧＣＴＧＴＴＧＣＣＣＧＴＣＴＣＡＣＴＧＧＴＧＡＡＡＡＧＡＡＡＡＡＣＣＡＣＣＣＴＧＧＣＧＣＣＣＡＡＴＡＣＧＣＡＡＡＣＣＧＣＣＴＣＴＣＣＣＣＧＣＧＣＧＴＴＧＧＣＣＧＡＴＴＣＡＴＴＡＡＴＧＣＡＧＣＴＧＧＣＡＣＧＡＣＡＧＧＴＴＴＣＣＣＧＡＣＴＧＧＡＡＡＧＣＧＧＧＣＡＧＴＧＡＧＣＧＣＡＡＣＧＣＡＡＴＴＡＡＴＧＴＧＡＧＴＴＡＧＣＴＣＡＣＴＣＡＴＴＡＧＧＣＡＣＣＣＣＡＧＧＣＴＴＴＡＣＡＣＴＴＴＡＴＧＣＴＴＣＣＧＧＣＴＣＧＴＡＴＧＴＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＧＡＴＴＣＡＣＴＧＧＣＣＧＴＣＧＴＴＴＴＡＣＡＡＣＧＴＣＧＴＧＡＣＴＧＧＧＡＡＡＡＣＣＣＴＧＧＣＧＴＴＡＣＣＣＡＡＣＴＴＡＡＴＣＧＣＣＴＴＧＣＡＧＣＡＣＡＴＣＣＣＣＣＴＴＴＣＧＣＣＡＧＣＴＧＧＣＧＴＡＡＴＡＧＣＧＡＡＧＡＧＧＣＣＣＧＣＡＣＣＧＡＴＣＧＣＣＣＴＴＣＣＣＡＡＣＡＧＴＴＧＣＧＣＡＧＣＣＴＧＡＡＴＧＧＣＧＡＡＴＧＧＣＧＣＴＴＴＧＣＣＴＧＧＴＴＴＣＣＧＧＣＡＣＣＡＧＡＡＧＣＧＧＴＧＣＣＧＧＡＡＡＧＣＴＧＧＣＴＧＧＡＧＴＧＣＧＡＴＣＴＴＣＣＴＧＡＧＧＣＣＧＡＴＡＣＴＧＴＣＧＴＣＧＴＣＣＣＣＴＣＡＡＡＣＴＧＧＣＡＧＡＴＧＣＡＣＧＧＴＴＡＣＧＡＴＧＣＧＣＣＣＡＴＣＴＡＣＡＣＣＡＡＣＧＴＡＡＣＣＴＡＴＣＣＣＡＴＴＡＣＧＧＴＣＡＡＴＣＣＧＣＣＧＴＴＴＧＴＴＣＣＣＡＣＧＧＡＧＡＡＴＣＣＧＡＣＧＧＧＴＴＧＴＴＡＣＴＣＧＣＴＣＡＣＡＴＴＴＡＡＴＧＴＴＧＡＴＧＡＡＡＧＣＴＧＧＣＴＡＣＡＧＧＡＡＧＧＣＣＡＧＡＣＧＣＧＡＡＴＴＡＴＴＴＴＴＧＡＴＧＧＣＧＴＴＧＧＡＡＴＴＡＣＧＴＴＡＴＣＧＡＣＴＧＣＡＣＧＧＴＧＣＡＣＣＡＡＴＧＣＴＴＣＴＧＧＣＧＴＣＡＧＧＣＡＧＣＣＡＴＣＧＧＡＡＧＣＴＧＴＧＧＴＡＴＧＧＣＴＧＴＧＣＡＧＧＴＣＧＴＡＡＡＴＣＡＣＴＧＣＡＴＡＡＴＴＣＧＴＧＴＣＧＣＴＣＡＡＧＧＣＧＣＡＣＴＣＣＣＧＴＴＣＴＧＧＡＴＡＡＴＧＴＴＴＴＴＴＧＣＧＣＣＧＡＣＡＴＣＡＴＡＡＣＧＧＴＴＣＴＧＧＣＡＡＡＴＡＴＴＣＴＧＡＡＡＴＧＡＧＣＴＧＴＴＧＡＣＡＡＴＴＡＡＴＣＡＴＣＧＧＣＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＴＡＴＴＣＡＴＧＴＣＣＣＣＴＡＴＡＣＴＡＧＧＴＴＡＴＴＧＧＡＡＡＡＴＴＡＡＧＧＧＣＣＴＴＧＴＧＣＡＡＣＣＣＡＣＴＣＧＡＣＴＴＣＴＴＴＴＧＧＡＡＴＡＴＣＴＴＧＡＡＧＡＡＡＡＡＴＡＴＧＡＡＧＡＧＣＡＴＴＴＧＴＡＴＧＡＧＣＧＣＧＡＴＧＡＡＧＧＴＧＡＴＡＡＡＴＧＧＣＧＡＡＡＣＡＡＡＡＡＧＴＴＴＧＡＡＴＴＧＧＧＴＴＴＧＧＡＧＴＴＴＣＣＣＡＡＴＣＴＴＣＣＴＴＡＴＴＡＴＡＴＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＴＴＡＡＡＴＴＡＡＣＡＣＡＧＴＣＴＡＴＧＧＣＣＡＴＣＡＴＡＣＧＴＴＡＴＡＴＡＧＣＴＧＡＣＡＡＧＣＡＣＡＡＣＡＴＧＴＴＧＧＧＴＧＧＴＴＧＴＣＣＡＡＡＡＧＡＧＣＧＴＧＣＡＧＡＧＡＴＴＴＣＡＡＴＧＣＴＴＧＡＡＧＧＡＧＣＧＧＴＴＴＴＧＧＡＴＡＴＴＡＧＡＴＡＣＧＧＴＧＴＴＴＣＧＡＧＡＡＴＴＧＣＡＴＡＴＡＧＴＡＡＡＧＡＣＴＴＴＧＡＡＡＣＴＣＴＣＡＡＡＧＴＴＧＡＴＴＴＴＣＴＴＡＧＣＡＡＧＣＴＡＣＣＴＧＡＡＡＴＧＣＴＧＡＡＡＡＴＧＴＴＣＧＡＡＧＡＴＣＧＴＴＴＡＴＧＴＣＡＴＡＡＡＡＣＡＴＡＴＴＴＡＡＡＴＧＧＴＧＡＴＣＡＴＧＴＡＡＣＣＣＡＴＣＣＴＧＡＣＴＴＣＡＴＧＴＴＧＴＡＴＧＡＣＧＣＴＣＴＴＧＡＴＧＴＴＧＴＴＴＴＡＴＡＣＡＴＧＧＡＣＣＣＡＡＴＧＴＧＣＣＴＧＧＡＴＧＣＧＴＴＣＣＣＡＡＡＡＴＴＡＧＴＴＴＧＴＴＴＴＡＡＡＡＡＡＣＧＴＡＴＴＧＡＡＧＣＴＡＴＣＣＣＡＣＡＡＡＴＴＧＡＴＡＡＧＴＡＣＴＴＧＡＡＡＴＣＣＡＧＣＡＡＧＴＡＴＡＴＡＧＣＡＴＧＧＣＣＴＴＴＧＣＡＧＧＧＣＴＧＧＣＡＡＧＣＣＡＣＧＴＴＴＧＧＴＧＧＴＧＧＣＧＡＣＣＡＴＣＣＴＣＣＡＡＡＡＴＣＧＧＡＴＣＴＧＧＴＴＣＣＧＣＧＴＧＧＡＴＣＣ−３’（配列番号５７）
配列番号５７の配列は、ｐＧＥＸ−４Ｔ３に由来する配列である。
配列（ＸＶ）〜（ＸＸ）において、Ｎ４は、Ｎ３のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列である。Ｎ４の一例としては、以下の配列を挙げることができる。
３’−ＣＣＴＡＧＧＧＧＣＴＴＡＡＧＧＧＣＣＣＡＧＣＴＧＡＧＣＴＣＧＣＣＧＧＣＧＴＡＧＣＡＣＴＧＡＣＴＧＡＣＴＧＣＴＡＧＡＣＧＧＡＧＣＧＣＧＣＡＡＡＧＣＣＡＣＴＡＣＴＧＣＣＡＣＴＴＴＴＧＧＡＧＡＣＴＧＴＧＴＡＣＧＴＣＧＡＧＧＧＣＣＴＣＴＧＣＣＡＧＴＧＴＣＧＡＡＣＡＧＡＣＡＴＴＣＧＣＣＴＡＣＧＧＣＣＣＴＣＧＴＣＴＧＴＴＣＧＧＧＣＡＧＴＣＣＣＧＣＧＣＡＧＴＣＧＣＣＣＡＣＡＡＣＣＧＣＣＣＡＣＡＧＣＣＣＣＧＣＧＴＣＧＧＴＡＣＴＧＧＧＴＣＡＧＴＧＣＡＴＣＧＣＴＡＴＣＧＣＣＴＣＡＣＡＴＡＴＴＡＡＧＡＡＣＴＴＣＴＧＣＴＴＴＣＣＣＧＧＡＧＣＡＣＴＡＴＧＣＧＧＡＴＡＡＡＡＡＴＡＴＣＣＡＡＴＴＡＣＡＧＴＡＣＴＡＴＴＡＴＴＡＣＣＡＡＡＧＡＡＴＣＴＧＣＡＧＴＣＣＡＣＣＧＴＧＡＡＡＡＧＣＣＣＣＴＴＴＡＣＡＣＧＣＧＣＣＴＴＧＧＧＧＡＴＡＡＡＣＡＡＡＴＡＡＡＡＡＧＡＴＴＴＡＴＧＴＡＡＧＴＴＴＡＴＡＣＡＴＡＧＧＣＧＡＧＴＡＣＴＣＴＧＴＴＡＴＴＧＧＧＡＣＴＡＴＴＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴＴＡＴＡＡＣＴＴＴＴＴＣＣＴＴＣＴＣＡＴＡＣＴＣＡＴＡＡＧＴＴＧＴＡＡＡＧＧＣＡＣＡＧＣＧＧＧＡＡＴＡＡＧＧＧＡＡＡＡＡＡＣＧＣＣＧＴＡＡＡＡＣＧＧＡＡＧＧＡＣＡＡＡＡＡＣＧＡＧＴＧＧＧＴＣＴＴＴＧＣＧＡＣＣＡＣＴＴＴＣＡＴＴＴＴＣＴＡＣＧＡＣＴＴＣＴＡＧＴＣＡＡＣＣＣＡＣＧＴＧＣＴＣＡＣＣＣＡＡＴＧＴＡＧＣＴＴＧＡＣＣＴＡＧＡＧＴＴＧＴＣＧＣＣＡＴＴＣＴＡＧＧＡＡＣＴＣＴＣＡＡＡＡＧＣＧＧＧＧＣＴＴＣＴＴＧＣＡＡＡＡＧＧＴＴＡＣＴＡＣＴＣＧＴＧＡＡＡＡＴＴＴＣＡＡＧＡＣＧＡＴＡＣＡＣＣＧＣＧＣＣＡＴＡＡＴＡＧＧＧＣＡＣＡＡＣＴＧＣＧＧＣＣＣＧＴＴＣＴＣＧＴＴＧＡＧＣＣＡＧＣＧＧＣＧＴＡＴＧＴＧＡＴＡＡＧＡＧＴＣＴＴＡＣＴＧＡＡＣＣＡＡＣＴＣＡＴＧＡＧＴＧＧＴＣＡＧＴＧＴＣＴＴＴＴＣＧＴＡＧＡＡＴＧＣＣＴＡＣＣＧＴＡＣＴＧＴＣＡＴＴＣＴＣＴＴＡＡＴＡＣＧＴＣＡＣＧＡＣＧＧＴＡＴＴＧＧＴＡＣＴＣＡＣＴＡＴＴＧＴＧＡＣＧＣＣＧＧＴＴＧＡＡＴＧＡＡＧＡＣＴＧＴＴＧＣＴＡＧＣＣＴＣＣＴＧＧＣＴＴＣＣＴＣＧＡＴＴＧＧＣＧＡＡＡＡＡＡＣＧＴＧＴＴＧＴＡＣＣＣＣＣＴＡＧＴＡＣＡＴＴＧＡＧＣＧＧＡＡＣＴＡＧＣＡＡＣＣＣＴＴＧＧＣＣＴＣＧＡＣＴＴＡＣＴＴＣＧＧＴＡＴＧＧＴＴＴＧＣＴＧＣＴＣＧＣＡＣＴＧＴＧＧＴＧＣＴＡＣＧＧＡＣＧＴＣＧＴＴＡＣＣＧＴＴＧＴＴＧＣＡＡＣＧＣＧＴＴＴＧＡＴＡＡＴＴＧＡＣＣＧＣＴＴＧＡＴＧＡＡＴＧＡＧＡＴＣＧＡＡＧＧＧＣＣＧＴＴＧＴＴＡＡＴＴＡＴＣＴＧＡＣＣＴＡＣＣＴＣＣＧＣＣＴＡＴＴＴＣＡＡＣＧＴＣＣＴＧＧＴＧＡＡＧＡＣＧＣＧＡＧＣＣＧＧＧＡＡＧＧＣＣＧＡＣＣＧＡＣＣＡＡＡＴＡＡＣＧＡＣＴＡＴＴＴＡＧＡＣＣＴＣＧＧＣＣＡＣＴＣＧＣＡＣＣＣＡＧＡＧＣＧＣＣＡＴＡＧＴＡＡＣＧＴＣＧＴＧＡＣＣＣＣＧＧＴＣＴＡＣＣＡＴＴＣＧＧＧＡＧＧＧＣＡＴＡＧＣＡＴＣＡＡＴＡＧＡＴＧＴＧＧＴＧＣＣＣＣＴＣＧＧＴＣＣＧＴＴＧＡＴＡＣＣＴＡＣＴＴＧＣＴＴＴＡＴＣＴＧＴＣＴＡＧＣＧＡＣＴＣＴＡＴＣＣＡＣＧＧＡＧＴＧＡＣＴＡＡＴＴＣＧＴＡＡＣＣＡＴＴＧＡＣＡＧＴＣＴＧＧＴＴＣＡＡＡＴＧＡＧＴＡＴＡＴＡＴＧＡＡＡＴＣＴＡＡＣＴＡＡＡＴＴＴＴＧＡＡＧＴＡＡＡＡＡＴＴＡＡＡＴＴＴＴＣＣＴＡＧＡＴＣＣＡＣＴＴＣＴＡＧＧＡＡＡＡＡＣＴＡＴＴＡＧＡＧＴＡＣＴＧＧＴＴＴＴＡＧＧＧＡＡＴＴＧＣＡＣＴＣＡＡＡＡＧＣＡＡＧＧＴＧＡＣＴＣＧＣＡＧＴＣＴＧＧＧＧＣＡＴＣＴＴＴＴＣＴＡＧＴＴＴＣＣＴＡＧＡＡＧＡＡＣＴＣＴＡＧＧＡＡＡＡＡＡＡＧＡＣＧＣＧＣＡＴＴＡＧＡＣＧＡＣＧＡＡＣＧＴＴＴＧＴＴＴＴＴＴＴＧＧＴＧＧＣＧＡＴＧＧＴＣＧＣＣＡＣＣＡＡＡＣＡＡＡＣＧＧＣＣＴＡＧＴＴＣＴＣＧＡＴＧＧＴＴＧＡＧＡＡＡＡＡＧＧＣＴＴＣＣＡＴＴＧＡＣＣＧＡＡＧＴＣＧＴＣＴＣＧＣＧＴＣＴＡＴＧＧＴＴＴＡＴＧＡＣＡＧＧＡＡＧＡＴＣＡＣＡＴＣＧＧＣＡＴＣＡＡＴＣＣＧＧＴＧＧＴＧＡＡＧＴＴＣＴＴＧＡＧＡＣＡＴＣＧＴＧＧＣＧＧＡＴＧＴＡＴＧＧＡＧＣＧＡＧＡＣＧＡＴＴＡＧＧＡＣＡＡＴＧＧＴＣＡＣＣＧＡＣＧＡＣＧＧＴＣＡＣＣＧＣＴＡＴＴＣＡＧＣＡＣＡＧＡＡＴＧＧＣＣＣＡＡＣＣＴＧＡＧＴＴＣＴＧＣＴＡＴＣＡＡＴＧＧＣＣＴＡＴＴＣＣＧＣＧＴＣＧＣＣＡＧＣＣＣＧＡＣＴＴＧＣＣＣＣＣＣＡＡＧＣＡＣＧＴＧＴＧＴＣＧＧＧＴＣＧＡＡＣＣＴＣＧＣＴＴＧＣＴＧＧＡＴＧＴＧＧＣＴＴＧＡＣＴＣＴＡＴＧＧＡＴＧＴＣＧＣＡＣＴＣＧＡＴＡＣＴＣＴＴＴＣＧＣＧＧＴＧＣＧＡＡＧＧＧＣＴＴＣＣＣＴＣＴＴＴＣＣＧＣＣＴＧＴＣＣＡＴＡＧＧＣＣＡＴＴＣＧＣＣＧＴＣＣＣＡＧＣＣＴＴＧＴＣＣＴＣＴＣＧＣＧＴＧＣＴＣＣＣＴＣＧＡＡＧＧＴＣＣＣＣＣＴＴＴＧＣＧＧＡＣＣＡＴＡＧＡＡＡＴＡＴＣＡＧＧＡＣＡＧＣＣＣＡＡＡＧＣＧＧＴＧＧＡＧＡＣＴＧＡＡＣＴＣＧＣＡＧＣＴＡＡＡＡＡＣＡＣＴＡＣＧＡＧＣＡＧＴＣＣＣＣＣＣＧＣＣＴＣＧＧＡＴＡＣＣＴＴＴＴＴＧＣＧＧＴＣＧＴＴＧＣＧＣＣＧＧＡＡＡＡＡＴＧＣＣＡＡＧＧＡＣＣＧＧＡＡＡＡＣＧＡＣＣＧＧＡＡＡＡＣＧＡＧＴＧＴＡＣＡＡＧＡＡＡＧＧＡＣＧＣＡＡＴＡＧＧＧＧＡＣＴＡＡＧＡＣＡＣＣＴＡＴＴＧＧＣＡＴＡＡＴＧＧＣＧＧＡＡＡＣＴＣＡＣＴＣＧＡＣＴＡＴＧＧＣＧＡＧＣＧＧＣＧＴＣＧＧＣＴＴＧＣＴＧＧＣＴＣＧＣＧＴＣＧＣＴＣＡＧＴＣＡＣＴＣＧＣＴＣＣＴＴＣＧＣＣＴＴＣＴＣＧＣＧＧＡＣＴＡＣＧＣＣＡＴＡＡＡＡＧＡＧＧＡＡＴＧＣＧＴＡＧＡＣＡＣＧＣＣＡＴＡＡＡＧＴＧＴＧＧＣＧＴＡＴＴＴＡＡＧＧＣＴＧＴＧＧＴＡＧＣＴＴＡＣＣＡＣＧＴＴＴＴＧＧＡＡＡＧＣＧＣＣＡＴＡＣＣＧＴＡＣＴＡＴＣＧＣＧＧＧＣＣＴＴＣＴＣＴＣＡＧＴＴＡＡＧＴＣＣＣＡＣＣＡＣＴＴＡＣＡＣＴＴＴＧＧＴＣＡＴＴＧＣＡＡＴＡＴＧＣＴＡＣＡＧＣＧＴＣＴＣＡＴＡＣＧＧＣＣＡＣＡＧＡＧＡＡＴＡＧＴＣＴＧＧＣＡＡＡＧＧＧＣＧＣＡＣＣＡＣＴＴＧＧＴＣＣＧＧＴＣＧＧＴＧＣＡＡＡＧＡＣＧＣＴＴＴＴＧＣＧＣＣＣＴＴＴＴＴＣＡＣＣＴＴＣＧＣＣＧＣＴＡＣＣＧＣＣＴＣＧＡＣＴＴＡＡＴＧＴＡＡＧＧＧＴＴＧＧＣＧＣＡＣＣＧＴＧＴＴＧＴＴＧＡＣＣＧＣＣＣＧＴＴＴＧＴＣＡＧＣＡＡＣＧＡＣＴＡＡＣＣＧＣＡＡＣＧＧＴＧＧＡＧＧＴＣＡＧＡＣＣＧＧＧＡＣＧＴＧＣＧＣＧＧＣＡＧＣＧＴＴＴＡＡＣＡＧＣＧＣＣＧＣＴＡＡＴＴＴＡＧＡＧＣＧＣＧＧＣＴＡＧＴＴＧＡＣＣＣＡＣＧＧＴＣＧＣＡＣＣＡＣＣＡＣＡＧＣＴＡＣＣＡＴＣＴＴＧＣＴＴＣＧＣＣＧＣＡＧＣＴＴＣＧＧＡＣＡＴＴＴＣＧＣＣＧＣＣＡＣＧＴＧＴＴＡＧＡＡＧＡＧＣＧＣＧＴＴＧＣＧＣＡＧＴＣＡＣＣＣＧＡＣＴＡＧＴＡＡＴＴＧＡＴＡＧＧＣＧＡＣＣＴＡＣＴＧＧＴＣＣＴＡＣＧＧＴＡＡＣＧＡＣＡＣＣＴＴＣＧＡＣＧＧＡＣＧＴＧＡＴＴＡＣＡＡＧＧＣＣＧＣＡＡＴＡＡＡＧＡＡＣＴＡＣＡＧＡＧＡＣＴＧＧＴＣＴＧＴＧＧＧＴＡＧＴＴＧＴＣＡＴＡＡＴＡＡＡＡＧＡＧＧＧＴＡＣＴＴＣＴＧＣＣＡＴＧＣＧＣＴＧＡＣＣＣＧＣＡＣＣＴＣＧＴＡＧＡＣＣＡＧＣＧＴＡＡＣＣＣＡＧＴＧＧＴＣＧＴＴＴＡＧＣＧＣＧＡＣＡＡＴＣＧＣＣＣＧＧＧＴＡＡＴＴＣＡＡＧＡＣＡＧＡＧＣＣＧＣＧＣＡＧＡＣＧＣＡＧＡＣＣＧＡＣＣＧＡＣＣＧＴＡＴＴＴＡＴＡＧＡＧＴＧＡＧＣＧＴＴＡＧＴＴＴＡＡＧＴＣＧＧＣＴＡＴＣＧＣＣＴＴＧＣＣＣＴＴＣＣＧＣＴＧＡＣＣＴＣＡＣＧＧＴＡＣＡＧＧＣＣＡＡＡＡＧＴＴＧＴＴＴＧＧＴＡＣＧＴＴＴＡＣＧＡＣＴＴＡＣＴＣＣＣＧＴＡＧＣＡＡＧＧＧＴＧＡＣＧＣＴＡＣＧＡＣＣＡＡＣＧＧＴＴＧＣＴＡＧＴＣＴＡＣＣＧＣＧＡＣＣＣＧＣＧＴＴＡＣＧＣＧＣＧＧＴＡＡＴＧＧＣＴＣＡＧＧＣＣＣＧＡＣＧＣＧＣＡＡＣＣＡＣＧＣＣＴＡＴＡＧＡＧＣＣＡＴＣＡＣＣＣＴＡＴＧＣＴＧＣＴＡＴＧＧＣＴＴＣＴＧＴＣＧＡＧＴＡＣＡＡＴＡＴＡＧＧＧＣＧＧＣＡＡＴＴＧＧＴＧＧＴＡＧＴＴＴＧＴＣＣＴＡＡＡＡＧＣＧＧＡＣＧＡＣＣＣＣＧＴＴＴＧＧＴＣＧＣＡＣＣＴＧＧＣＧＡＡＣＧＡＣＧＴＴＧＡＧＡＧＡＧＴＣＣＣＧＧＴＣＣＧＣＣＡＣＴＴＣＣＣＧＴＴＡＧＴＣＧＡＣＡＡＣＧＧＧＣＡＧＡＧＴＧＡＣＣＡＣＴＴＴＴＣＴＴＴＴＴＧＧＴＧＧＧＡＣＣＧＣＧＧＧＴＴＡＴＧＣＧＴＴＴＧＧＣＧＧＡＧＡＧＧＧＧＣＧＣＧＣＡＡＣＣＧＧＣＴＡＡＧＴＡＡＴＴＡＣＧＴＣＧＡＣＣＧＴＧＣＴＧＴＣＣＡＡＡＧＧＧＣＴＧＡＣＣＴＴＴＣＧＣＣＣＧＴＣＡＣＴＣＧＣＧＴＴＧＣＧＴＴＡＡＴＴＡＣＡＣＴＣＡＡＴＣＧＡＧＴＧＡＧＴＡＡＴＣＣＧＴＧＧＧＧＴＣＣＧＡＡＡＴＧＴＧＡＡＡＴＡＣＧＡＡＧＧＣＣＧＡＧＣＡＴＡＣＡＡＣＡＣＡＣＣＴＴＡＡＣＡＣＴＣＧＣＣＴＡＴＴＧＴＴＡＡＡＧＴＧＴＧＴＣＣＴＴＴＧＴＣＧＡＴＡＣＴＧＧＴＡＣＴＡＡＴＧＣＣＴＡＡＧＴＧＡＣＣＧＧＣＡＧＣＡＡＡＡＴＧＴＴＧＣＡＧＣＡＣＴＧＡＣＣＣＴＴＴＴＧＧＧＡＣＣＧＣＡＡＴＧＧＧＴＴＧＡＡＴＴＡＧＣＧＧＡＡＣＧＴＣＧＴＧＴＡＧＧＧＧＧＡＡＡＧＣＧＧＴＣＧＡＣＣＧＣＡＴＴＡＴＣＧＣＴＴＣＴＣＣＧＧＧＣＧＴＧＧＣＴＡＧＣＧＧＧＡＡＧＧＧＴＴＧＴＣＡＡＣＧＣＧＴＣＧＧＡＣＴＴＡＣＣＧＣＴＴＡＣＣＧＣＧＡＡＡＣＧＧＡＣＣＡＡＡＧＧＣＣＧＴＧＧＴＣＴＴＣＧＣＣＡＣＧＧＣＣＴＴＴＣＧＡＣＣＧＡＣＣＴＣＡＣＧＣＴＡＧＡＡＧＧＡＣＴＣＣＧＧＣＴＡＴＧＡＣＡＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＡＧＴＴＴＧＡＣＣＧＴＣＴＡＣＧＴＧＣＣＡＡＴＧＣＴＡＣＧＣＧＧＧＴＡＧＡＴＧＴＧＧＴＴＧＣＡＴＴＧＧＡＴＡＧＧＧＴＡＡＴＧＣＣＡＧＴＴＡＧＧＣＧＧＣＡＡＡＣＡＡＧＧＧＴＧＣＣＴＣＴＴＡＧＧＣＴＧＣＣＣＡＡＣＡＡＴＧＡＧＣＧＡＧＴＧＴＡＡＡＴＴＡＣＡＡＣＴＡＣＴＴＴＣＧＡＣＣＧＡＴＧＴＣＣＴＴＣＣＧＧＴＣＴＧＣＧＣＴＴＡＡＴＡＡＡＡＡＣＴＡＣＣＧＣＡＡＣＣＴＴＡＡＴＧＣＡＡＴＡＧＣＴＧＡＣＧＴＧＣＣＡＣＧＴＧＧＴＴＡＣＧＡＡＧＡＣＣＧＣＡＧＴＣＣＧＴＣＧＧＴＡＧＣＣＴＴＣＧＡＣＡＣＣＡＴＡＣＣＧＡＣＡＣＧＴＣＣＡＧＣＡＴＴＴＡＧＴＧＡＣＧＴＡＴＴＡＡＧＣＡＣＡＧＣＧＡＧＴＴＣＣＧＣＧＴＧＡＧＧＧＣＡＡＧＡＣＣＴＡＴＴＡＣＡＡＡＡＡＡＣＧＣＧＧＣＴＧＴＡＧＴＡＴＴＧＣＣＡＡＧＡＣＣＧＴＴＴＡＴＡＡＧＡＣＴＴＴＡＣＴＣＧＡＣＡＡＣＴＧＴＴＡＡＴＴＡＧＴＡＧＣＣＧＡＧＣＡＴＡＴＴＡＣＡＣＡＣＣＴＴＡＡＣＡＣＴＣＧＣＣＴＡＴＴＧＴＴＡＡＡＧＴＧＴＧＴＣＣＴＴＴＧＴＣＡＴＡＡＧＴＡＣＡＧＧＧＧＡＴＡＴＧＡＴＣＣＡＡＴＡＡＣＣＴＴＴＴＡＡＴＴＣＣＣＧＧＡＡＣＡＣＧＴＴＧＧＧＴＧＡＧＣＴＧＡＡＧＡＡＡＡＣＣＴＴＡＴＡＧＡＡＣＴＴＣＴＴＴＴＴＡＴＡＣＴＴＣＴＣＧＴＡＡＡＣＡＴＡＣＴＣＧＣＧＣＴＡＣＴＴＣＣＡＣＴＡＴＴＴＡＣＣＧＣＴＴＴＧＴＴＴＴＴＣＡＡＡＣＴＴＡＡＣＣＣＡＡＡＣＣＴＣＡＡＡＧＧＧＴＴＡＧＡＡＧＧＡＡＴＡＡＴＡＴＡＡＣＴＡＣＣＡＣＴＡＣＡＡＴＴＴＡＡＴＴＧＴＧＴＣＡＧＡＴＡＣＣＧＧＴＡＧＴＡＴＧＣＡＡＴＡＴＡＴＣＧＡＣＴＧＴＴＣＧＴＧＴＴＧＴＡＣＡＡＣＣＣＡＣＣＡＡＣＡＧＧＴＴＴＴＣＴＣＧＣＡＣＧＴＣＴＣＴＡＡＡＧＴＴＡＣＧＡＡＣＴＴＣＣＴＣＧＣＣＡＡＡＡＣＣＴＡＴＡＡＴＣＴＡＴＧＣＣＡＣＡＡＡＧＣＴＣＴＴＡＡＣＧＴＡＴＡＴＣＡＴＴＴＣＴＧＡＡＡＣＴＴＴＧＡＧＡＧＴＴＴＣＡＡＣＴＡＡＡＡＧＡＡＴＣＧＴＴＣＧＡＴＧＧＡＣＴＴＴＡＣＧＡＣＴＴＴＴＡＣＡＡＧＣＴＴＣＴＡＧＣＡＡＡＴＡＣＡＧＴＡＴＴＴＴＧＴＡＴＡＡＡＴＴＴＡＣＣＡＣＴＡＧＴＡＣＡＴＴＧＧＧＴＡＧＧＡＣＴＧＡＡＧＴＡＣＡＡＣＡＴＡＣＴＧＣＧＡＧＡＡＣＴＡＣＡＡＣＡＡＡＡＴＡＴＧＴＡＣＣＴＧＧＧＴＴＡＣＡＣＧＧＡＣＣＴＡＣＧＣＡＡＧＧＧＴＴＴＴＡＡＴＣＡＡＡＣＡＡＡＡＴＴＴＴＴＴＧＣＡＴＡＡＣＴＴＣＧＡＴＡＧＧＧＴＧＴＴＴＡＡＣＴＡＴＴＣＡＴＧＡＡＣＴＴＴＡＧＧＴＣＧＴＴＣＡＴＡＴＡＴＣＧＴＡＣＣＧＧＡＡＡＣＧＴＣＣＣＧＡＣＣＧＴＴＣＧＧＴＧＣＡＡＡＣＣＡＣＣＡＣＣＧＣＴＧＧＴＡＧＧＡＧＧＴＴＴＴＡＧＣＣＴＡＧＡＣＣＡＡＧＧＣＧＣＡＣＣＴＡＧＧ−５’（配列番号５８）
配列番号５８の配列は、配列番号５７の配列に相補的な配列である。
本願の第３発明は、本願の第１発明のベクターを第一の制限酵素で処理したものに順方向で挿入された場合には第二の制限酵素の切断認識配列が出現しないが、逆方向で挿入された場合には第二の制限酵素の切断認識配列が出現するように設計された配列を含む外来遺伝子を本願の第１発明のベクターに組み込んだ組換えベクターを提供する。本願の第１発明のベクターを第一の制限酵素で処理したものに外来遺伝子が順方向で挿入された組換えベクターが好ましい。外来遺伝子は蛋白質及び／又は蛋白質ドメインをコードするとよい。
本願の第４発明は、本願の第３発明の組換えベクターを含む形質転換体またはその子孫を提供する。
本願の第５発明は、第一の制限酵素によって認識される塩基配列の異なる２つの切断認識配列であって、そのうち一方の切断認識配列は第一の制限酵素とは異なる第二の制限酵素によって認識される切断認識配列の一部を含むが、他方の切断認識配列は前記の第二の制限酵素によって認識される切断認識配列の一部を含まない前記の２つの切断認識配列を含む二本鎖ＤＮＡをプラスミド、ファージ、コスミド、Ｐ１ベクター、細菌人工染色体ベクターまたは酵母人工染色体ベクターのマルチクローニングサイトに導入することを含む、本願の第１発明のベクターの製造方法を提供する。
本願の第６発明は、第一の制限酵素によって認識される塩基配列の異なる２つの切断認識配列であって、そのうち一方の切断認識配列は第一の制限酵素とは異なる第二の制限酵素によって認識される切断認識配列の一部を含むが、他方の切断認識配列は前記の第二の制限酵素によって認識される切断認識配列の一部を含まない前記の２つの切断認識配列を含む二本鎖ＤＮＡを提供する。
本願の第６発明の二本鎖ＤＮＡとしては、下記の配列（ＩＸ）及び（Ｘ）で表される二本鎖ＤＮＡを例示することができる。。
５’−ＧＡＣＸ１ａＸ２ａＴＸ３ａＸ４ａＧＴＣ−Ｎ１−ＧＡＣＸ５ａＸ６ａＡＸ７ａＸ８ａＧＴＣ−３’（ＩＸ）
３’−ＣＴＧＸ１ｂＸ２ｂＡＸ３ｂＸ４ｂＣＡＧ−Ｎ２−ＣＴＧＸ５ｂＸ６ｂＴＸ７ｂＸ８ｂＣＡＧ−５’（Ｘ）
（配列（ＩＸ）及び（Ｘ）中、Ｇはグアニン、Ａはアデニン、Ｃはシトシン、Ｔはチミンであり、
Ｘ１ａ〜Ｘ８ａ及びＸ１ｂ〜Ｘ８ｂはそれぞれ独立にグアニン、アデニン、シトシンまたはチミンのいずれかの塩基であり、Ｘ１ａとＸ１ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｘ２ａとＸ２ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｘ３ａとＸ３ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｘ４ａとＸ４ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｘ５ａとＸ５ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｘ６ａとＸ６ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｘ７ａとＸ７ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｘ８ａとＸ８ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、
配列ＣＸ１ａＸ２ａＴはＮｃｏＩ，ＤｓａＩ，ＥｃｏＴ１４Ｉ，ＮｄｅＩ，ＳｆｅＩ，ＡｖａＩ，ＳｍｌＩ，ＸｈｏＩ，ＰｓｔＩ，ＥｃｏＴ２２Ｉ，ＰｓｈＢＩ，ＡｃｃＩ，ＡｐａＬＩ，ＰｓｉＩ，ＳｃａＩ，ＳｐｌＩ，Ｂｓｐ１１０７Ｉ，Ｂｓｐ１２８６Ｉ，ＢｓｐＴ１０７Ｉ，Ｂｓｐ１４０７Ｉ，ＴａｔＩ，ＨｇｉＣＩ，ＫｐｎＩ，ＳｐｅＩ，ＢｌｎＩ，ＮｈｅＩ，ＸｂａＩ，ＳｓｐＩ，ＥｃｏＲＶまたはそれらのイソスキゾマーの切断認識配列の５’側の部分配列を含む塩基配列であり、
配列ＣＸ８ｂＸ７ｂＴは配列ＣＸ１ａＸ２ａＴに含まれるところのＮｃｏＩ，ＤｓａＩ，ＥｃｏＴ１４Ｉ，ＮｄｅＩ，ＳｆｅＩ，ＡｖａＩ，ＳｍｌＩ，ＸｈｏＩ，ＰｓｔＩ，ＥｃｏＴ２２Ｉ，ＰｓｈＢＩ，ＡｃｃＩ，ＡｐａＬＩ，ＰｓｉＩ，ＳｃａＩ，ＳｐｌＩ，Ｂｓｐ１１０７Ｉ，Ｂｓｐ１２８６Ｉ，ＢｓｐＴ１０７Ｉ，Ｂｓｐ１４０７Ｉ，ＴａｔＩ，ＨｇｉＣＩ，ＫｐｎＩ，ＳｐｅＩ，ＢｌｎＩ，ＮｈｅＩ，ＸｂａＩ，ＳｓｐＩ，ＥｃｏＲＶまたはそれらのイソスキゾマーの切断認識配列の部分配列を含まない塩基配列であり、
５’−及び３’−は２本鎖ＤＮＡのそれぞれの末端を示し、
Ｎ１は存在しなくともよいが、存在する場合には、１〜１０００塩基の任意のヌクレオチド配列であり、
Ｎ２は存在しなくともよいが、存在する場合には、Ｎ１のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列である。）
また、本願の第６発明の二本鎖ＤＮＡとして、下記の配列（ＸＩ）及び（ＸＩＩ）で表される二本鎖ＤＮＡを例示することができる。
５’−ＣＣＡＹ１ａＹ２ａＹ３ａＹ４ａＴＹ５ａＹ６ａＹ７ａＹ８ａＴＧＧ−Ｎ１−ＣＣＡＹ９ａＹ１０Ｙ１１ａＹ１２ａＡＹ１３ａＹ１４ａＹ１５ａＹ１６ａＴＧＧ−３’（ＸＩ）
３’−ＧＧＴＹ１ｂＹ２ｂＹ３ｂＹ４ｂＡＹ５ｂＹ６ｂＹ７ｂＹ８ｂＡＣＣ−Ｎ２−ＧＧＴＹ９ｂＹ１０ｂＹ１１ｂＹ１２ｂＴＹ１３ｂＹ１４ｂＹ１５ｂＹ１６ｂＡＣＣ−５’（ＸＩＩ）
（配列（ＸＩ）及び（ＸＩＩ）中、Ｇはグアニン、Ａはアデニン、Ｃはシトシン、Ｔはチミンであり、
Ｙ１ａ〜Ｙ１６ａ及びＹ１ｂ〜Ｙ１６ｂはそれぞれ独立にグアニン、アデニン、シトシンまたはチミンのいずれかの塩基であり、Ｙ１ａとＹ１ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ２ａとＹ２ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ３ａとＹ３ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ４ａとＹ４ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ５ａとＹ５ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ６ａとＹ６ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ７ａとＹ７ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ８ａとＹ８ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ９ａとＹ９ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ１０ａとＹ１０ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ１１ａとＹ１１ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ１２ａとＹ１２ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ１３ａとＹ１３ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ１４ａとＹ１４ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ１５ａとＹ１５ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ１６ａとＹ１６ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、
配列Ｙ１ａＹ２ａＹ３ａＹ４ａＴはＮｃｏＩ，ＤｓａＩ，ＥｃｏＴ１４Ｉ，ＮｄｅＩ，ＳｆｅＩ，ＡｖａＩ，ＳｍｌＩ，ＸｈｏＩ，ＰｓｔＩ，ＥｃｏＴ２２Ｉ，ＰｓｈＢＩ，ＡｃｃＩ，ＡｐａＬＩ，ＰｓｉＩ，ＳｃａＩ，ＳｐｌＩ，Ｂｓｐ１１０７Ｉ，Ｂｓｐ１２８６Ｉ，ＢｓｐＴ１０７Ｉ，Ｂｓｐ１４０７Ｉ，ＴａｔＩ，ＨｇｉＣＩ，ＫｐｎＩ，ＳｐｅＩ，ＢｌｎＩ，ＮｈｅＩ，ＸｂａＩ，ＳｓｐＩ，ＥｃｏＲＶ，ＡｆｌＩＩＩ，ＢｓｐＬＵ１１Ｉ，ＮｓｐＩ，ＳｐｈＩ，ＢｓｐＨＩ，ＢｓａＡＩ，ＰｍａＣＩ，ＳｎａＢＩ，ＮｓｐＢＩＩ、ＰｖｕＩＩ，ＢａｎＩＩ，ＨｇｉＡＩ，ＳａｃＩまたはそれらのイソスキゾマーの切断認識配列の５’側の部分配列を含む塩基配列であり、
配列Ｙ１６ｂＹ１５ｂＹ１４ｂＹ１３ｂＴは配列Ｙ１ａＹ２ａＹ３ａＹ４ａＴに含まれるところのＮｃｏＩ，ＤｓａＩ，ＥｃｏＴ１４Ｉ，ＮｄｅＩ，ＳｆｅＩ，ＡｖａＩ，ＳｍｌＩ，ＸｈｏＩ，ＰｓｔＩ，ＥｃｏＴ２２Ｉ，ＰｓｈＢＩ，ＡｃｃＩ，ＡｐａＬＩ，ＰｓｉＩ，ＳｃａＩ，ＳｐｌＩ，Ｂｓｐ１１０７Ｉ，Ｂｓｐ１２８６Ｉ，ＢｓｐＴ１０７Ｉ，Ｂｓｐ１４０７Ｉ，ＴａｔＩ，ＨｇｉＣＩ，ＫｐｎＩ，ＳｐｅＩ，ＢｌｎＩ，ＮｈｅＩ，ＸｂａＩ，ＳｓｐＩ，ＥｃｏＲＶ，ＡｆｌＩＩＩ，ＢｓｐＬＵ１１Ｉ，ＮｓｐＩ，ＳｐｈＩ，ＢｓｐＨＩ，ＢｓａＡＩ，ＰｍａＣＩ，ＳｎａＢＩ，ＮｓｐＢＩＩ、ＰｖｕＩＩ，ＢａｎＩＩ，ＨｇｉＡＩ，ＳａｃＩまたはそれらのイソスキゾマーの切断認識配列の部分配列を含まない塩基配列であり、
５’−及び３’−は２本鎖ＤＮＡのそれぞれの末端を示し、
Ｎ１は存在しなくともよいが、存在する場合には、１〜１０００塩基の任意のヌクレオチド配列であり、
Ｎ２は存在しなくともよいが、存在する場合には、Ｎ１のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列である。）
さらに、本願の第６発明の二本鎖ＤＮＡとして、下記の配列（ＸＩＩＩ）及び（ＸＩＶ）で表される二本鎖ＤＮＡを例示することができる。
５’−ＧＡＣＸ１ａＸ２ａＴＸ３ａＸ４ａＧＴＣ−Ｎ１−ＣＣＡＹ９ａＹ１０ａＹ１１ａＹ１２ａＡＹ１３ａＹ１４ａＹ１５ａＹ１６ａＴＧＧ−３’（ＸＩＩＩ）
３’−ＣＴＧＸ１ｂＸ２ｂＡＸ３ｂＸ４ｂＣＡＧ−Ｎ２−ＧＧＴＹ９ｂＹ１０ｂＹ１１ｂＹ１２ｂＴＹ１３ｂＹ１４ｂＹ１５ｂＹ１６ｂＡＣＣ−５’（ＸＩＶ）
（配列（ＸＩＩＩ）及び（ＸＩＶ）中、Ｇはグアニン、Ａはアデニン、Ｃはシトシン、Ｔはチミンであり、
Ｘ１ａ〜Ｘ４ａ及びＸ１ｂ〜Ｘ４ｂはそれぞれ独立にグアニン、アデニン、シトシンまたはチミンのいずれかの塩基であり、Ｘ１ａとＸ１ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｘ２ａとＸ２ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｘ３ａとＸ３ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｘ４ａとＸ４ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、
Ｙ９ａ〜Ｙ１６ａ及びＹ９ｂ〜Ｙ１６ｂはそれぞれ独立にグアニン、アデニン、シトシンまたはチミンのいずれかの塩基であり、Ｙ９ａとＹ９ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ１０ａとＹ１０ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ１１ａとＹ１１ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ１２ａとＹ１２ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ１３ａとＹ１３ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ１４ａとＹ１４ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ１５ａとＹ１５ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、Ｙ１６ａとＹ１６ｂは互いに対合を形成しうる塩基であり、
配列ＣＸ１ａＸ２ａＴはＮｃｏＩ，ＤｓａＩ，ＥｃｏＴ１４Ｉ，ＮｄｅＩ，ＳｆｅＩ，ＡｖａＩ，ＳｍｌＩ，ＸｈｏＩ，ＰｓｔＩ，ＥｃｏＴ２２Ｉ，ＰｓｈＢＩ，ＡｃｃＩ，ＡｐａＬＩ，ＰｓｉＩ，ＳｃａＩ，ＳｐｌＩ，Ｂｓｐ１１０７Ｉ，Ｂｓｐ１２８６Ｉ，ＢｓｐＴ１０７Ｉ，Ｂｓｐ１４０７Ｉ，ＴａｔＩ，ＨｇｉＣＩ，ＫｐｎＩ，ＳｐｅＩ，ＢｌｎＩ，ＮｈｅＩ，ＸｂａＩ，ＳｓｐＩ，ＥｃｏＲＶまたはそれらのイソスキゾマーの切断認識配列の５’側の部分配列を含む塩基配列であり、
配列Ｙ１４ｂＹ１３ｂＴは配列ＣＸ１ａＸ２ａＴに含まれるところのＮｃｏＩ，ＤｓａＩ，ＥｃｏＴ１４Ｉ，ＮｄｅＩ，ＳｆｅＩ，ＡｖａＩ，ＳｍｌＩ，ＸｈｏＩ，ＰｓｔＩ，ＥｃｏＴ２２Ｉ，ＰｓｈＢＩ，ＡｃｃＩ，ＡｐａＬＩ，ＰｓｉＩ，ＳｃａＩ，ＳｐｌＩ，Ｂｓｐ１１０７Ｉ，Ｂｓｐ１２８６Ｉ，ＢｓｐＴ１０７Ｉ，Ｂｓｐ１４０７Ｉ，ＴａｔＩ，ＨｇｉＣＩ，ＫｐｎＩ，ＳｐｅＩ，ＢｌｎＩ，ＮｈｅＩ，ＸｂａＩ，ＳｓｐＩ，ＥｃｏＲＶまたはそれらのイソスキゾマーの切断認識配列の５’側の部分配列を含まない塩基配列であり、
５’−及び３’−は２本鎖ＤＮＡのそれぞれの末端を示し、
Ｎ１は存在しなくともよいが、存在する場合には、１〜１０００塩基の任意のヌクレオチド配列であり、
Ｎ２は存在しなくともよいが、存在する場合には、Ｎ１のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列である。）
本願の第７発明は、本願の第１発明のベクターを用いて、外来遺伝子がコードする蛋白質及び／又は蛋白質ドメインを製造する方法を提供する。
本願の第７発明の１態様においては、蛋白質及び／又は蛋白質ドメインをコードする外来遺伝子であって、本願の第１発明のベクターを第一の制限酵素で処理したものに順方向で挿入された場合には第二の制限酵素の切断認識配列が出現しないが、逆方向で挿入された場合には第二の制限酵素の切断認識配列が出現するように設計された配列を含む前記外来遺伝子を本願の第１発明のベクターに組み込んだ組換えベクターを作製し、この組換えベクターを第二の制限酵素で処理した後、宿主に導入し、宿主の単コロニーを形成させ、単コロニー由来の宿主を培養することにより、外来遺伝子がコードする蛋白質及び／又は蛋白質ドメインを発現させることができる。
本願の第７発明の別の態様においては、本願の第１発明のベクターを第一の制限酵素で処理したものに順方向で挿入された場合には第二の制限酵素の切断認識配列が出現しないが、逆方向で挿入された場合には第二の制限酵素の切断認識配列が出現するように設計された配列を含むプライマーであって、蛋白質及び／又は蛋白質ドメインをコードする外来遺伝子のｃＤＮＡを増幅することができる前記プライマーを用いて、ｃＤＮＡを鋳型として、ｃＤＮＡにおける位置及び／又は長さ及び／又は配列の一部が異なるｃＤＮＡの部分配列に相当するＤＮＡの混合物を増幅し、混合物の各々を第一の制限酵素で処理した本願の第１発明のベクターに組み込んだ組換えベクターを作製し、第二の制限酵素で組換えベクターを処理した後、宿主に導入し、宿主の単コロニーを形成させ、単コロニー由来の宿主を培養することにより、外来遺伝子がコードする蛋白質及び／又は蛋白質ドメインを発現させることができる。
本願の第８発明は、本願の第１発明のベクターを用いて、外来遺伝子がベクターに逆方向で挿入された組換えベクターを開環させ、外来遺伝子がベクターに順方向で挿入された組換えベクターを閉環したままの状態で残す方法を提供する。
本願の第８発明の１態様においては、本願の第３発明の組換えベクターを第二の制限酵素で処理することにより、外来遺伝子がベクターに逆方向で挿入された組換えベクターを開環させ、外来遺伝子がベクターに順方向で挿入された組換えベクターを閉環したままの状態で残すことができる。
本願の第９発明は、本願の第１発明のベクターを用いて、外来遺伝子がコードする蛋白質及び／又は蛋白質ドメインの発現量及び／又は溶解度を試験する方法を提供する。
本願の第９発明の１態様においては、蛋白質及び／又は蛋白質ドメインをコードする外来遺伝子であって、本願の第１発明のベクターを第一の制限酵素で処理したものに順方向で挿入された場合には第二の制限酵素の切断認識配列が出現しないが、逆方向で挿入された場合には第二の制限酵素の切断認識配列が出現するように設計された配列を含む前記外来遺伝子を本願の第１発明のベクターに組み込んだ組換えベクターを作製し、この組換えベクターを第二の制限酵素で処理した後、宿主に導入し、宿主及び／又はその子孫を培養することにより、外来遺伝子がコードする蛋白質及び／又は蛋白質ドメインを発現させ、発現した蛋白質及び／又は蛋白質ドメインの量及び／又は溶解度を調べることができる。
配列（Ｉ）を配列表の配列番号１に示す。
【００１８】
配列（ＩＩ）を配列表の配列番号２に示す。
【００１９】
配列（ＩＩＩ）を配列表の配列番号３に示す。
【００２０】
配列（ＩＶ）を配列表の配列番号４に示す。
【００２１】
配列（Ｖ）を配列表の配列番号５に示す。
【００２２】
配列（ＶＩ）を配列表の配列番号６に示す。
【００２３】
配列（ＶＩＩ）を配列表の配列番号７に示す。
【００２４】
配列（ＶＩＩＩ）を配列表の配列番号８に示す。
【００２５】
配列（ＩＸ）の一例（Ｎ１が１塩基である場合）を配列表の配列番号９に示す。
【００２６】
配列（Ｘ）の一例（Ｎ２が１塩基である場合）を配列表の配列番号１０に示す。
【００２７】
配列（ＸＩ）の一例（Ｎ１が１塩基である場合）を配列表の配列番号１１に示す。
【００２８】
配列（ＸＩＩ）の一例（Ｎ２が１塩基である場合）を配列表の配列番号１２に示す。
【００２９】
配列（ＸＩＩＩ）の一例（Ｎ３が１塩基である場合）を配列表の配列番号１３に示す。
【００３０】
配列（ＸＩＶ）の一例（Ｎ４が１塩基である場合）を配列表の配列番号１４に示す。
【００３１】
配列（ＸＶ）の一例（Ｎ３が１塩基である場合）を配列表の配列番号１５に示す。
【００３２】
配列（ＸＶＩ）の一例（Ｎ４が１塩基である場合）を配列表の配列番号１６に示す。
【００３３】
配列（ＸＶＩＩ）の一例（Ｎ３が１塩基である場合）を配列表の配列番号１７に示す。
【００３４】
配列（ＸＶＩＩＩ）の一例（Ｎ４が１塩基である場合）を配列表の配列番号１８に示す。
【００３５】
配列（ＸＩＸ）の一例（Ｎ３が１塩基である場合）を配列表の配列番号１９に示す。
【００３６】
配列（ＸＸ）の一例（Ｎ４が１塩基である場合）を配列表の配列番号２０に示す。
【００３７】
本明細書において、「蛋白質ドメイン」とは、蛋白質の部分配列であり、その部分だけでなんらかの生理活性、生化学的な機能、特徴的な物理化学的性質、または立体構造のいずれかを有するポリペプチドをいう。
【００３８】
「（外来遺伝子が）順方向で挿入された」とは、該遺伝子に含まれるＯＲＦがｐｌａｓｍｉｄの翻訳方向に対して正しい向きで挿入されたことをいう。
【００３９】
「（外来遺伝子が）逆方向で挿入された」とは、該遺伝子に含まれるＯＲＦがｐｌａｓｍｉｄの翻訳方向に対して正しい向きとは反対の向きで挿入されたことをいう。
【００４０】
「切断認識配列」とは、それぞれの制限酵素に固有の、その制限酵素が認識してそれを切断する、二本鎖ＤＮＡの塩基配列をいう。
【００４１】
「制限酵素サイドとは、特定の制限酵素の「切断認識配列」のことをいう。
【００４２】
「マルチクローニングサイト」とは複数の制限酵素サイトが連続して出現するように設計されているベクター中の塩基配列をいう。
【００４３】
「形質転換体」とは、細胞から外部に遺伝子（ＤＮＡ）が導入された結果、細胞が新しい形質を獲得し、さらにその形質が子孫の細胞にも受け継がれるようになったものをいう。
【００４４】
「宿主」とは、組換えＤＮＡ実験において、ＤＮＡの組換え分子を導入される生細胞をいう。
【００４５】
「ベクター」とは、組換えＤＮＡ実験において、宿主に異種のＤＮＡを運ぶＤＮＡをいう。
【００４６】
「単コロニー由来の宿主（または形質転換体）」とは、生細胞を十分希釈してから培地に接種し、培養してコロニーを形成させた後に、単一のコロニーを分離してさらに培養した宿主（または形質転換体）をいう。
【発明の効果】
【００４７】
本発明により、簡便な操作により、短時間で、蛋白質及び／又は蛋白質ドメインを発現させることができるベクターが提供された。
【００４８】
また、本発明により、簡便な操作により、短時間で、蛋白質及び／又は蛋白質ドメインを発現させる方法が提供された。
【００４９】
さらに、本発明により、簡便な操作により、短時間で、蛋白質及び／又は蛋白質ドメインの発現量と溶解度を試験する方法が提供された。
本明細書は、本願の優先権の基礎である日本国特許出願、特願２００３−３０８７７３号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】ｄＧＳＴ−Ｔベクター（ｐＧＥＸ−４Ｔ３−ＰＲＥＳＡＴ）の構築を示す。
【図２】ＯＲＦ方向性選択の原理を示す。図２は、第二の制限酵素がＮｃｏＩである場合を示しており、リアＰＣＲプライマーは５’−ＧＧを持つように設計されている。このプライマーで増幅されたインサートが逆方向でプラスミドに挿入されると、Ｔ／ＡクローニングサイトにＮｃｏＩ部位が出現する。第二の制限酵素がＮｄｅＩである場合には、リアＰＣＲプライマーは５’−ＧＧの代わりに５’−ＡＴＧを持つように設計するとよい。
【図３】ｄＧＳＴ−Ｔベクターを利用した可溶性蛋白質ドメインのドメイン境界の高速決定法の概念図である。（ｉ）種々のＰＣＲプライマーを設計し、一連の目的とする部分ｃＤＮＡフラグメントを増幅する。この部分ｃＤＮＡフラグメントは蛋白質ドメインを含むと推定されるものである。（ｉｉ）このフラグメントをｐＧＥＸ−４Ｔ３−ＰＲＥＳＡＴに挿入し、ＮｃｏＩまたはＮｄｅＩ選択を行い、大腸菌に形質転換し、大腸菌のコロニーを分離する。（ｉｉｉ）９６穴プレートを用いて個々のコロニーを培養し、種々のフラグメント長の標的蛋白質及び／又は蛋白質ドメインのＧＳＴ融合蛋白質を発現させる。（ｉｖ）ＣＤＮＢ発色反応により融合蛋白質の量を定量し、ＧＳＴ融合蛋白質を高発現しているクローンを選択して、さらなる解析に利用する。
【図４】ＧＳＴ融合蛋白質の発現を１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果を示す。レーンＭは分子量標準を、レーンａ１−ａ５は酵母Ｖｐｓ４を、レーンｂ１−ｂ５はヒトＶｐｓ４を、レーンｃ１−ｃ５はマウスＶｐｓ４を、レーンｄ１−ｄ５はヒトＳｎｘ１５ａを、レーンｅ１−ｅ５はマウスＳｎｘ１５ａを示す。
【図５】ＧＳＴ融合蛋白質の菌体破砕直後の溶解度を１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果を示す。レーンＭは分子量標準を、レーンｉ１−ｓ１は酵母Ｖｐｓ４を、レーンｉ２−ｓ２はヒトＶｐｓ４を、レーンｉ３−ｓ３はマウスＶｐｓ４を、レーンｉ４−ｓ４はヒトＳｎｘ１５ａを、レーンｉ５−ｓ５はマウスＳｎｘ１５ａを示す。また各レーンのｉは不溶性画分を、ｓは可溶性画分を示す。
【図６】ＧＳＴ融合蛋白質の菌体破砕直後の溶解度をＧＳＴの酵素活性の測定法である１−クロロ−２、４−ジニトロベンゼンを用いたアッセイで測定した結果を示す。図中横軸は反応開始からの時間（単位：分）、縦軸は３５０ｎｍでの紫外線の吸光度を示す。またグラフは△は酵母Ｖｐｓ４を、○はヒトＶｐｓ４を、●はマウスＶｐｓ４を、□はヒトＳｎｘ１５ａを、▲はマウスＳｎｘ１５ａを示す。
【図７】ｄＧＳＴ−Ｔベクターを利用した蛋白質ドメインの高速可溶性試験法の概念図である。〔〕内はそこで記された操作に必要とされるおおよその時間である。（ｉ）特定のＰＣＲプライマーを設計し、目的とする部分ｃＤＮＡフラグメントを増幅する。この部分ｃＤＮＡフラグメントは蛋白質全体または蛋白質ドメインを含むと推定される部分配列のいずれでもよい。（ｉｉ）このフラグメントをｐＧＥＸ−４Ｔ３−ＰＲＥＳＡＴに挿入しｌｉｇａｔｉｏｎ反応を行う。（ｉｉｉ）大腸菌ＤＨ５ａに形質転換する。（ｉｖ）液体培養を行う。（ｖ）プラスミドを単離精製する。（ｖｉ）ＮｃｏＩまたはＮｄｅＩで切断しＯＲＦ選択を行う。（ｖｉｉ）大腸菌ＢＬ２１に形質転換し、（ｖｉｉｉ）大腸菌のコロニーを形成させる。（ｉｘ）ＩＰＴＧ溶液を噴霧し、蛋白質の発現を誘導する。（ｘ）寒天培地上の大腸菌を懸濁して集める。（ｘｉ）菌体を破砕し、全菌体・可溶性画分・不溶性画分を得る。（ｘｉｉ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を行い、ゲル上のバンドの濃さよりＧＳＴ融合蛋白質が可溶性画分に含まれる量を判定する。（ｉ）−（ｘｉｉ）の全ての工程に必要とされる時間の合計はおよそ４８時間である。
【図８】ｐＧＳＴ−４Ｔ３−ＰＲＥＳＡＴにｍＶｐｓ４ｂとｍＳＮＸ１５ａのドメインをコードするｃＤＮＡをＴＡ−ｃｌｏｎｉｎｇ法で組み込み、ＮｃｏＩ ＯＲＦ選択法を経て寒天培地上でコロニー形成させたものを、単コロニー化せずに寒天培地上で発現誘導を行い、可溶性試験を行った結果を示す。レーンＭは分子量マーカーを、レーンｔ１、ｓ１、ｉ１はＧＳＴ−マウスＶｐｓ４融合蛋白質の発現の誘導を行わなかった試料を、レーンｔ２、ｓ２、ｉ２は同じくＩＰＴＧ噴霧により蛋白質発現を誘導した試料を、レーンｔ３、ｓ３、ｉ３はＧＳＴ−マウスＳＮＸ１５融合蛋白質の発現の誘導を行わなかった試料を、レーンｔ４、ｓ４、ｉ４は同じくＩＰＴＧ噴霧により蛋白質発現を誘導した試料を泳動したものであり、ｔ、ｉ、ｓはそれぞれ全菌体、不溶性画分、可溶性画分を示す。また図中矢印は発現が確認された融合蛋白質のバンドを、△はＧＳＴのみと思われるバンドを示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５１】
以下、本発明の好ましい実施態様について詳細に説明する。
１．ベクターの調製
まず、ベクターを用意する。例えば、市販のベクターを購入し、このベクターが第一及び第二の制限酵素により認識される切断認識配列を有する場合には、この切断認識配列に変異を導入するとよい。このベクターが融合蛋白質発現ベクターであると、目的蛋白質及び／又は蛋白質ドメインの発現量・溶解性を検出・測定するのが容易である点、目的蛋白質及び／又は蛋白質ドメインの精製が容易である点、目的蛋白質の機能解析・相互作用解析のための生化学実験を行う際に有利である点から便利である。後述の実施例１では、ｐＧＥＸ−４Ｔ３ベクターに、配列番号２１の配列で表されるＤＮＡを５’リン酸化したものを用いて、ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ法を用いて変異を導入した。これによりｐＧＥＸ−４Ｔ３がもともとの配列中に持っていたＡｈｄＩサイトが切断されなくなる。
【００５２】
次いで、前記ベクターに、第一の制限酵素によって認識される塩基配列の異なる２つの切断認識配列（そのうち一方の切断認識配列のみが第一の制限酵素とは異なる第二の制限酵素によって認識される切断認識配列の一部を含む）を導入するためのリンカーを用意する。このリンカーは、ベクターのマルチクローニングサイトに導入するための制限酵素部位（２箇所）を両末端に有し、第一の制限酵素によって認識される塩基配列の異なる２つの切断認識配列（そのうち一方の切断認識配列のみが第一の制限酵素とは異なる第二の制限酵素によって認識される切断認識配列の一部を含む）を持つように設計する。後述の実施例１では、ｐＥＴ３２ａベクターの誘導体ｐＥＴ３２ａＰＡＣＡＰを鋳型として配列番号２２及び２４の配列で表されるプライマーの対でＰＣＲ反応を行うことにより、両末端にＢａｍＨＩ部位を有し、この２つのＢａｍＨＩ部位の各々にＡｈｄＩ部位が結合しているＰＣＲ産物を得た。このＰＣＲ産物をＴＡクローニングベクターｐＧＥＭ−Ｔにサブクローニングして、その配列を確認した後、プラスミドを調製精製し、精製したプラスミドを制限酵素ＢａｍＨＩで切断し、約５００ｂａｓｅの断片（ＡｈｄＩリンカー）を精製した。
【００５３】
上記のベクター（後述の実施例１では、変異を導入したｐＧＥＸ−４Ｔ３ベクター）を制限酵素（後述の実施例１では、ＢａｍＨＩ）で開環し、脱リン酸化処理した後、上記のリンカー（後述の実施例１では、ＡｈｄＩリンカー）をｌｉｇａｔｉｏｎし、大腸菌に形質転換する。その後、複数の単コロニー由来の形質転換体からプラスミドを調製精製し、その塩基配列を確認して、正しい向きでリンカーが導入されたベクターを選択し、これを第一の制限酵素（後述の実施例１では、ＡｈｄＩ）で処理すると、開環状ベクター（後述の実施例１では、ｐＧＥＸ−４Ｔ３−ＰＲＥＳＡＴ）が得られる。
【００５４】
２．外来遺伝子の調製
外来遺伝子を調製する。外来遺伝子は、１で用意したベクターに順方向で挿入された場合には第二の制限酵素の切断認識配列が出現しないが、逆方向で挿入された場合には第二の制限酵素の切断認識配列が出現するように設計された配列を含む。また、外来遺伝子は、蛋白質及び／又は蛋白質ドメインをコードしているとよい。
【００５５】
外来遺伝子は、例えば、ＰＣＲ法で調製することができる。鋳型としては、目的遺伝子を含むｃＤＮＡ、プラスミド、合成ＤＮＡ、ＲＮＡなどを例示することができる。プライマーとしては、増幅したい目的遺伝子の両末端のＤＮＡ配列に相補的な２種のオリゴヌクレオチドを用いればよいが、一方のプライマーはベクターに挿入後に翻訳の読み枠がずれないように、またもう一方のプライマーは、その５’−末端に１〜１０残基の目的遺伝子には含まれない配列が付加されるように、あらかじめ正しく設計しておく必要がある。
【００５６】
ＰＣＲ反応は、ＤＮＡ二本鎖の解離、オリゴヌクレオチドとのアニーリング、及びＤＮＡポリメラーゼによる相補鎖の合成の３反応を通常２０〜４０回繰り返すことにより行われる。第１回目の反応にＤＮＡの逆転写活性を有する酵素を用いることにより、ＲＮＡからのＤＮＡ増幅も行える。
【００５７】
プライマーの塩基配列は、１で用意したベクターに順方向で挿入された場合には第二の制限酵素の切断認識配列が出現しないが、逆方向で挿入された場合には第二の制限酵素の切断認識配列が出現するように設計する。後述の実施例２では、フロントプライマー（該ｃＤＮＡのＯＲＦのＮ末端に相当する側のプライマー）は、先行するＧＳＴと読み枠が合うように最初のアミノ酸のコドンで始まり、５’末端の塩基は５’−ＧＧで始まらないように設計した。リアプライマー（ＯＲＦのＣ末端側のプライマー）は、蛋白質ドメインのＣ末端と推定される領域の境界の後にストップコドンを含むように設計し、さらにそのプライマーの５’末端の塩基が５’−ＧＧで始まるように設計した。そうすることによって、これらのプライマーで増幅されたＰＣＲ産物は、逆方向でｐＧＥＸ−４Ｔ３−ＰＲＥＳＡＴにｌｉｇａｔｉｏｎしたときにのみＮｃｏＩ部位が形成されることになる。この新たに生じたＮｃｏＩ部位は続く選択工程に利用される。
【００５８】
その他、ｐＧＥＸ−４Ｔ３−ＰＲＥＳＡＴに導入して組換え蛋白質を生産するのに用いるための、ＤＮＡを増幅するのに用いるＰＣＲプライマーを設計する場合の注意点を以下に説明する。
（１）第一の制限酵素がＡｈｄＩであり、第二の制限酵素がＮｃｏＩである場合（ＮｃｏＩ選択）
ＯＲＦのＮ末端側のプライマーを設計するには、以下の４つの規則に従うとよい。
（ｉａ）プライマー配列の１塩基目がアミノ酸コドン一文字目に対応して先行するＧＳＴとフレームが合うようにする。
（ｉｉａ）５’末端の塩基をＧまたはＡとする。（必要ならば少数のアミノ酸をコードするＤＮＡ配列の挿入を行う）。
（ｉｉｉａ）５’末端の配列をＧＧにしない。
（ｉｖａ）ＰＣＲ増幅断片内にＮｃｏＩ制限酵素サイトを含まない。
【００５９】
ＯＲＦのＣ末端側のプライマーは、以下の２つの規則に従うとよい。
（ｖａ）５’末端の塩基をＧＧとする。
（ｖｉａ）目的蛋白質ドメインが停止コドンを含まないときは、５’末端の配列をＧＧ−Ｘｎ−ＴＴＡ（Ｘｎは任意のｎ個（ｎは０〜３０のいずれかの整数）の塩基でよく、例えば、Ａとする。）（ｎが５の場合の配列を配列番号５３に示す。）ではじまるようにする。
（２）第一の制限酵素がＡｈｄＩであり、第二の制限酵素がＮｄｅＩである場合（ＮｄｅＩ選択）
ＯＲＦのＮ末端側のプライマーを設計するには、以下の４つの規則に従うとよい。
（ｉｂ）プライマー配列の１塩基目がアミノ酸コドン一文字目に対応して先行するＧＳＴとフレームが合うようにする。
（ｉｉｂ）５’末端の塩基をＧまたはＡとする。（必要ならば少数のアミノ酸をコードするＤＮＡ配列の挿入を行う）。
（ｉｉｉｂ）５’末端をＡＴＧにしない。
（ｉｖｂ）ＰＣＲ増幅断片内にＮｄｅＩ制限酵素サイトを含まない。
【００６０】
ＯＲＦのＣ末端側のプライマーは、以下の２つの規則に従うとよい。
（ｖｂ）５’末端の塩基をＡＴＧとする。
（ｖｉｂ）目的蛋白質ドメインが停止コドンを含まないときは、５’末端の配列をＡＴＧ−Ｘｎ−ＴＴＡ（Ｘｎは任意のｎ個（ｎは０〜３０のいずれかの整数）の塩基でよく、例えば、Ａとする。）（ｎが４の場合の配列を配列番号５４に示す。）ではじまるようにする。
【００６１】
３．クローニング
２で用意した外来遺伝子を１で用意したベクター（後述の実施例２では、ｐＧＥＸ−４Ｔ３−ＰＲＥＳＡＴベクター）とｌｉｇａｔｉｏｎ反応させ、大腸菌に形質転換する。形質転換した大腸菌は寒天培地には接種せず、また単コロニー化はせずに液体培地で培養を行った後、そこからプラスミド混合物を精製する。このプラスミド混合物を第二の制限酵素（後述の実施例２では、ＮｃｏＩ）で処理すると、外来遺伝子がベクターに逆方向で挿入されたプラスミドは、新たに出現した第二の制限酵素切断部位で切断されて開環する。一方、外来遺伝子がベクターに順方向で挿入されたプラスミドは閉環したままの状態で残る。したがって、第二の制限酵素処理したプラスミド混合物を発現用大腸菌宿主に形質転換して寒天培地に播種すると、外来遺伝子がベクターに順方向で挿入されたプラスミドを含む大腸菌のみがコロニーを形成する。その単コロニーを形成させた寒天培地のおのおののコロニーから大腸菌を採取して培養し、融合蛋白質を発現させる。発現の終えた大腸菌を集菌し、超音波などで菌体を破砕後、全菌体画分とする。また全菌体画分を遠心分離し、上清を可溶化画分とする。沈殿物を可溶化画分と同じ容量のＳＤＳを含む緩衝液で完全に溶解し、不要化画分とする。全菌体画分のみ、または全菌体画分・可溶化画分・不要化画分のそれぞれをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより泳動し、目的融合蛋白質のバンドをゲル上で確認する。その後、該融合蛋白質のゲル上のバンドの濃度から、可溶化画分と不要化画分の比率を求め、目的融合蛋白質の溶解度の指標とする（可溶性試験）。必要ならばデンシトメトリーなどを利用してゲル上の蛋白質バンドを定量し数値化するとなおよい。
【００６２】
ＧＳＴの酵素活性を利用した可溶性試験は、アマシャムファルマシア社のｐＧＥＸシリーズベクター取扱説明書記載の方法に準じて行う。すなわち、適当な緩衝液に希釈した目的融合蛋白質を含む大腸菌の可溶性画分を紫外分光光度計のキュベットに入れて、１−クロロ−２、４ジニトロベンゼン）と還元型グルタチオンを加えてよく撹拌した後、３４０ｎｍの紫外吸光度の経時変化を５〜１０分まで連続的に測定し、その傾きを目的融合蛋白質の量の指標とする。多検体を並行で処理する場合にはマイクロプレートリーダーを利用すると便利である。
【００６３】
以上の操作を行った後、目的融合蛋白質の発現量・溶解度のよいクローンを選択し、プラスミド精製し、塩基配列を決定する。目的の外来遺伝子を含むプラスミドを蛋白質及び／又は蛋白質ドメイン発現ベクターとして採用し、以後の蛋白質及び／又は蛋白質ドメインの大量調製実験に用いる。この方法により、従来法と比較して、蛋白質及び／又は蛋白質ドメイン発現ベクターを作製する期間が約３割短縮できるようになった。
【００６４】
４．蛋白質及び／又は蛋白質ドメインの大量発現
３で採用した蛋白質及び／又は蛋白質ドメイン発現ベクターを発現用大腸菌宿主に形質転換し、大腸菌を培養して、蛋白質及び／又は蛋白質ドメインを発現させる。蛋白質及び／又は蛋白質ドメイン発現ベクターが融合蛋白質発現ベクターであると、目的蛋白質及び／又は蛋白質ドメインの発現量・溶解性を検出・測定する（例えば、蛍光で検出、ＧＳＴの酵素活性を指標にした比色定量など）のが容易である点、目的蛋白質及び／又は蛋白質ドメインの精製が容易である（例えば、ＧＳＨ固定化ビーズを利用した一段階の精製が可能）点、目的蛋白質の機能解析・相互作用解析のための生化学実験（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥを利用した試験管内結合実験、プルダウンアッセイを利用した試験管内結合実験など）を行う際に有利である点から便利である。
【００６５】
発現した蛋白質及び／又は蛋白質ドメインの分離及び精製は、公知の方法により行うことができる。公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーや疎水クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。
【００６６】
以上、本発明について、宿主として大腸菌を用いる場合について説明したが、本発明に用いる宿主は大腸菌に限定されるわけではなく、宿主としては、細菌細胞（例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、枯草菌など）、真菌細胞（例えば、出芽酵母、分裂酵母、アスペルギルスなど）、昆虫細胞（例えば、Ｓ２細胞、Ｓｆ細胞など）、動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｃ１２７細胞、３Ｔ３細胞、ＢＨＫ細胞、ＨＥＫ２９３細胞など）、植物細胞などを例示することができる。
【００６７】
また、本発明に用いる第一の制限酵素、第二の制限酵素、第一の制限酵素によって認識される塩基配列の異なる２つの切断認識配列（第二の制限酵素によって認識される切断認識配列の一部を含むものと含まないもの）、外来遺伝子を作製するためのプライマー対は上記のものに限定されるわけではなく、以下の表にまとめたものを利用することが可能である。表中、Ｇはグアニン、Ａはアデニン、Ｃはシトシン、Ｔはチミン、Ｘは任意の塩基であり、Ｘｎはｎ個（ｎは１〜３０のいずれかの整数である）の任意の塩基である。表１には表２及び３が続き、表４には表５及び６が続き、表７には表８〜１１が続く。
【００６８】
【表１】
【００６９】
【表２】
【００７０】
【表３】
【００７１】
【表４】
【００７２】
【表５】
【００７３】
【表６】
【００７４】
【表７】
【００７５】
【表８】
【００７６】
【表９】
【００７７】
【表１０】
【００７８】
【表１１】
【００７９】
第一の制限酵素が、ＡｈｄＩ若しくはそのイソスキゾマー、ＸｃｍＩ若しくはそのイソスキゾマー、またはそれらの組合せである場合、第二の制限酵素がＮｃｏＩ、ＮｄｅＩまたはそのイソスキゾマーであると効果的である。
【００８０】
本発明のベクターを利用することにより、例えば混合プライマーを設計し、それを用いて目的とする蛋白質のｃＤＮＡを鋳型に用いて増幅させた、任意の蛋白質の部分配列をコードするＤＮＡ断片の混合物を別の蛋白質の下流にｌｉｇａｔｉｏｎさせた、もとの蛋白質における位置及び／または長さの異なる部分配列の融合蛋白質を発現させることのできる、ライブラリーを作製することができる（例えば、図３を参照のこと）。
【００８１】
また、本発明のベクターを利用することにより、例えば９６穴マイクロタイタープレートを用いて複数の蛋白質及び／又は蛋白質ドメインの発現系を網羅的に作製し、かつその発現系によって生産される蛋白質及び／又は蛋白質ドメインの溶解度を網羅的にアッセイしたり、溶解度の高い蛋白質及び／又は蛋白質ドメインのみを高速で選別することが可能となる（例えば、図３を参照のこと）。
【００８２】
また、本発明のベクターと９６穴マイクロタイタープレートを用いる前述の方法は、自動コロニー単離装置や、９６穴マイクロタイタープレートを取り扱うことのできる自動試薬分注洗浄装置、ラボラトリーオートメーション装置を用いることで、多数の蛋白質及び／又は蛋白質ドメインの発現系を網羅的に作製し、かつその発現系によって生産される溶解度の高い蛋白質及び／又は蛋白質ドメインの選別を、高速に全自動で行うことができる。
【００８３】
さらに、本発明のベクターを利用することにより、単一の蛋白質及び／又は蛋白質ドメインを対象として、それを含む融合蛋白質が大腸菌で発現可能かどうかの判定及び、それを含む融合蛋白質が可溶性かどうかの判定を、ＰＣＲ反応からはじめて最短で４８時間で判別することが可能となる（例えば、図７を参照のこと）。
【実施例】
【００８４】
以下、本発明を実施例によって具体的に説明する。なお、これらの実施例は、本発明を説明するためのものであって、本発明の範囲を限定するものではない。
【００８５】
制限酵素ＮｃｏＩ、ＮｄｅＩ、ＡｈｄＩ及びＡｆｌＩＩはＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社から購入した。ＫｐｎＩとＢａｍＨＩは東洋紡社から購入した。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ、Ｗｉｚａｒｄ ｐｌａｓｍｉｄ ｍｉｎｉｐｒｅｐキット及びＷｉｚａｒｄ ＳＶ ＤＮＡ ｇｅｌ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキットはＰｒｏｍｅｇａ社から購入した。ｐＧＥＭ−Ｔ、ｐＧＥＸ−４Ｔ３とｐＧＥＸ−３Ｘ、ｐＥＴ３２ａとｐＥＴ２１ｂは、それぞれ、Ｐｒｏｍｅｇａ社、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社及びＮｏｖａｇｅｎ社から購入した。またｐＥＴ３２ａＰＡＣＡＰはｐＥＴ２１ｂのＮｄｅＩサイトに、ｐＥＴ３２ａ由来のチオレドキシン遺伝子を含むＮｄｅＩ断片と、同じｐＥＴ２１ｂのＮｈｅＩサイトに、ＰＡＣＡＰの人工遺伝子を挿入して作成したｐＥＴ３２ａの誘導体である。ＰＣＲクローニングのための鋳型に用いるｃＤＮＡとして、マウス脾臓、マウス胎児及びヒトＨｅＬａ細胞のＱＵＩＣＫ−Ｃｌｏｎｅ ｃＤＮＡはＣｌｏｎｔｅｃｈ社から購入した。
【００８６】
［実施例１］ｄＧＳＴ−Ｔベクターの作製（図１）
ｐＧＥＸ−４Ｔ３ベクターに、配列番号２１の配列で表されるＤＮＡを５’リン酸化したものを用いて、ｓｉｔｅ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ法を用いて変異を導入した。これによりｐＧＥＸ−４Ｔ３がもともとの配列中に持っていたＡｈｄＩ制限酵素サイトが切断されなくなる。次いで、ｐＥＴ３２ａＰＡＣＡＰベクターを鋳型として配列番号２２及び２４の配列で表されるプライマーの対でＰＣＲ反応を行った。得られたＰＣＲ産物（約５００ｂｐ、二本鎖ＤＮＡの一方の鎖の配列を配列番号２５に示す。）は２つのＢａｍＨＩ部位のそれぞれにＡｈｄＩ部位が結合していた（図１）。このＰＣＲ産物をＴＡクローニングベクターｐＧＥＭ−Ｔにサブクローニングして、その配列を確認した後、プラスミドを調製精製した。精製したプラスミドを制限酵素ＢａｍＨＩで切断し、約５００ｂａｓｅの断片（ＡｈｄＩリンカー、配列番号２６及び２７）を精製した。上記の変異を導入したｐＧＥＸ−４Ｔ３をＢａｍＨＩで開環し、脱リン酸化処理したものと、上記のＡｈｄＩリンカーをｌｉｇａｔｉｏｎして、大腸菌に形質転換した。配列を確認して、正しい向きでＡｈｄＩリンカーがＧＳＴ遺伝子下流に導入したものを選択した。正しい向きでＡｈｄＩリンカーがＧＳＴ遺伝子下流に導入されベクター（約２マイクログラム）を、２５ユニットのＡｈｄＩ制限酵素で３７℃で３時間処理して切断し、１％アガロースゲルを用いて精製した。Ｗｉｚａｒｄ ＳＶ ｇｅｌ／ＰＣＲ ｃｌｅａｎ−ｕｐシステムを用いて約５ｋｂの開環状ベクター（ｐＧＥＸ−４Ｔ３−ＰＲＥＳＡＴ、図１）を精製して、以下の実施例に用いた。
【００８７】
［実施例２］新規発現系の並行操作による調製（図２）
まず、ＮｃｏＩ−選択法対応のプライマーを利用して、５種類の遺伝子（ヒト・マウスのＳＮＸ１５ａ由来及び酵母・マウス・ヒト由来のＶｐｓ４ｂの５つのＭＩＴドメインを含む領域、配列番号２８，３０，３２，３４，３６）を、同時並行でヒトマウスなどのｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲで増幅した。使用したプライマー（配列番号３８〜４７）は、当該遺伝子のｃＤＮＡのうち蛋白質として発現を計画している領域に相補的な配列と、終止コドンの相補配列、および５’末端にＮｃｏＩ選択を行うためのＧＧ残基を含むように適宜設計したものである。すなわち、フロントプライマーは、先行するＧＳＴと読み枠が合うように最初のアミノ酸のコドンで始まり、５’末端の塩基は５’−ＧＧで始まってはならない。リアプライマーは当該ドメインの推定Ｃ末端境界後のストップコドンを含み、５’末端の塩基は５’−ＧＧで始まらなければならない。そうすることによって、これらのプライマーで増幅されたＰＣＲ産物は、逆方向でｐＧＥＸ−４Ｔ３−ＰＲＥＳＡＴにｌｉｇａｔｉｏｎしたときにのみ第二のＮｃｏＩ部位が形成されることになる。この新たに生じたＮｃｏＩ部位は続く選択工程に利用される。
【００８８】
当該遺伝子はいずれも２００−２３０ｂｐのｃＤＮＡであり、新規の蛋白質ドメインで、約７０アミノ酸残基をコードする。
【００８９】
ＰＣＲ産物が増幅していることを電気泳動により確認後、その産物を未精製のままｐＧＥＸ−４Ｔ３−ＰＲＥＳＡＴベクターとｌｉｇａｔｉｏｎ反応させ、大腸菌ＤＨ５ａに形質転換した。形質転換したＤＨ５ａは単コロニー化せずに終夜液体培養を行い、翌日そこから１−３μｇのプラスミドを精製した。このプラスミドをＮｃｏＩ制限酵素で切断したものを、発現用大腸菌宿主ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、単コロニー化した。そのコロニー化したプレートからおのおの３個ずつを（３ｘ５＝１５）、ＬＢ培地で液体培養し、ＯＤ＝０．５付近になったところでＩＰＴＧを終濃度１ｍＭに加え、さらに４時間培養した。発現の終えた大腸菌を集菌し、超音波破砕後、全菌体をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより泳動し、目的融合蛋白質のバンド（約３３−３５ｋＤ）をゲル上で確認した（図４）（発現性試験）。得られたコロニーのうち、予測した分子量の目的融合蛋白質を発現していたコロニーの割合は、約９０％以上（１４／１５）と非常に効率が高かった。
【００９０】
さらに目的分子量の融合蛋白質の発現が確認されたコロニー由来の菌体破砕液を遠心分離により可溶化画分、不溶化画分に分離し、全菌体とともに、それぞれをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより泳動し、目的とする融合蛋白質が可溶性かどうかを調べた（図５）（可溶性試験）。
【００９１】
また、目的分子量の融合蛋白質の発現が確認されたコロニー由来の蛋白質の可溶化画分の一部に１−クロロ−２、４ジニトロベンゼンとグルタチオンの混合液よりなるＧＳＴ活性測定液を加え、ＧＳＴによる反応を開始させ、その反応初速度を３５０ｎｍの紫外部吸光度の増大を分光光度計で計測した（図６）（ＣＤＮＢアッセイ）。グラフの直線の傾きは、目的の融合蛋白質の可溶化画分における量におよそ比例することが確かめられ、分光光度計による半定量的な可溶性試験が可能であることがわかった。
【００９２】
それとは独立に、同じプレートのコロニーを８個ずつ、コロニーＰＣＲを用いてそれぞれのクローンに含まれるプラスミドに目的の遺伝子が含まれる割合（サブクローニングの効率）を検討した。３７／４０の確率（９２．５％）で、標的遺伝子から予測される正しい長さの遺伝子が組み込まれていたを確認した。
【００９３】
正しい長さの蛋白質を発現しているクローンから２つを選びＤＮＡ塩基配列を決定確認した。配列は全て正しく、またＧＳＴと読み枠がずれていないことを確認した。
【００９４】
以上の操作全工程に要した日数は約６日間であり、有意に短縮されている。
【００９５】
［実施例３］ＮｃｏＩ選択法とＮｄｅＩ選択法の効率の比較
ユビキチンと相互作用するモチーフ（ＵＩＭ：ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｍｏｔｉｆ）を含む蛋白質断片のＧＳＴ融合蛋白質発現系作製を行う際に、ＮｃｏＩ選択とＮｄｅＩ選択とで、実施上の発現系構築の効率に違いがあるかどうか、比較実験を行った。
【００９６】
ＮｃｏＩ−選択法対応のプライマーの組（配列番号４８及び４５）およびＮｄｅＩ選択法対応のプライマーの組（配列番号４８及び５０）を利用し、ヒトのｃＤＮＡより、ＵＩＭ配列を含むヒトＨｒｓ遺伝子の約２００ｂｐの断片（コード鎖の配列を配列番号５１に示す。）をＰＣＲで増幅した。使用したプライマーは、当該遺伝子のｃＤＮＡに相補的な配列と、終止コドンの相補配列、およびＮｃｏＩ選択を行うため５’末端にＧＧ残基を含むように適宜設計した。ＮｄｅＩ選択を行うためのプライマーは終止コドンの相補配列、及び５’末端にＡＴＧ残基を含むように適宜設計したものである。当該断片は２００ｂｐのｃＤＮＡであり、新規の蛋白質ドメインで、約７０アミノ酸残基をコードする。
【００９７】
ＰＣＲ産物が増幅していることを電気泳動により確認後、その産物を未精製のままｄＧＳＴ−Ｔベクターとｌｉｇａｔｉｏｎ反応させ、大腸菌ＤＨ５ａに形質転換した。形質転換したＤＨ５ａは単コロニー化せずに終夜液体培養を行い、翌日そこから１−３μｇのプラスミドを精製した。このプラスミドをＮｃｏＩ制限酵素またはＮｄｅＩ制限酵素で切断したものを、発現用大腸菌宿主ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、単コロニー化した。反応条件は、ｐｌａｓｍｉｄ２００ｎｇあたり、ＮｃｏＩは１０ｕｎｉｔ、ＮｄｅＩは２０ｕｎｉｔを用い、３７℃でいずれも一時間反応した。そのコロニー化したプレートからおのおの３個ずつを（３ｘ５＝１５）、ＬＢ培地で液体培養し、ＯＤ＝０．５付近になったところでＩＰＴＧを終濃度１ｍＭに加え、さらに４時間培養した（発現実験）。発現の終えた大腸菌を集菌し、超音波破砕後、全菌体、可溶化画分、不要化画分のそれぞれをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより泳動し、目的融合蛋白質のバンド（約３１ｋＤ）をゲル上で確認した。得られたコロニーのうち、予測した分子量の目的融合蛋白質を発現していたコロニーの割合は、ＮｃｏＩ選択のときに１４／１５、ＮｄｅＩ選択で３／３といずれも約９０％以上（１４／１５）と非常に効率が高かった。
【００９８】
それとは独立に、同じプレートのコロニーを数個、コロニーＰＣＲを用いてそれぞれのクローンに含まれるプラスミドに目的の遺伝子が含まれる割合（サブクローニングの効率）を検討した。ＮｃｏＩ選択では９／１０の確率（９０．０％）で、ＮｄｅＩ選択では７／８（８８％）と、ほぼ同程度の効率で標的遺伝子から予測される正しい長さの遺伝子が組み込まれていたを確認した。
【００９９】
以上の実験により、ＮｃｏＩ／ＮｄｅＩいずれもＯＲＦ方向の選択に利用可能であることがわかった。
【０１００】
［実施例４］ｄＧＳＴ−Ｔベクターを利用して作製された融合蛋白質の大腸菌における発現量および溶解度を短時間で試験する方法（図７）
実施例２で作製したヒトＶｐｓ４ｂの遺伝子を挿入されたＮｃｏＩ処理によるＯＲＦ選択の終了した開環状ベクター混合物約０．２μｇを用いて、そのなかに出来あがっていると考えられるＧＳＴ−Ｖｐｓ４ｂの発現性試験ならびに溶解度試験を短時間で行うための条件を決定した。
【０１０１】
すでに実施例２に記載してある、既にＮｃｏＩで処理して開環状になっているヒトＶｐｓ４ｂの遺伝子を含むｐＧＥＸ−４Ｔ３−ＰＲＥＳＡＴを約０．２μｇを発現用大腸菌宿主ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、ＬＢプレート培地上で３７℃で１４時間かけてコロニーを形成させた。そのコロニーを形成させたプレートに、０．１ＭのＩＰＴＧ溶液を２００μｌ噴霧し、さらに３７℃で３時間コロニーを成長させプレート上で蛋白質を発現させた。プレート上の大腸菌コロニーに１８０μｌの０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）（以下ＴＢＳ緩衝液と呼ぶ）を加えて懸濁し、その菌体を超音波破砕して全菌体画分、可溶化画分、不要化画分を実施例２と同様にＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動で分析した（図８）。大腸菌の懸濁からＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析に要した時間は約３時間であった。
【０１０２】
この方法でも実施例２と同様、目的とする分子量約３２ＫＤａの融合蛋白質のバンドがＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で確認され、発現量ならびに可溶性が今後の実験に十分であることがわかった。
【０１０３】
この実験では目的とする融合蛋白質を含む大腸菌を単コロニー化しないで、混合物のまま発現性試験ならびに溶解度試験を行っているが、実施例２で示したようにＮｃｏＩによるＯＲＦ選択を行った場合には、目的とする融合蛋白質を含まない大腸菌はプレート培地上にコロニー形成している大腸菌の１０％以下であるため、電気泳動による発現性試験・可溶性試験による判定が可能であることがわかった。
【０１０４】
以上の操作全工程に要した時間はおよそ２１時間であり、有意に短縮されている。その前段階であるＰＣＲからＮｃｏＩによるＯＲＦ処理に要する時間は最短で２７時間で可能であり、単一の蛋白質及び／または蛋白質ドメインの発現系構築と可溶性試験の全工程を、最短４８時間で行うことが可能であることがわかった。
本発明者らが作製したベクターの名称、ベクター作製の基となった市販のプラスミドの名称、タグの名称、第一の制限酵素、第二の制限酵素、リンカーの配列及び参考文献を以下の表にまとめる。
【０１０５】
【表１２】
＊タグおよびタグと目的蛋白質を切り離すときのプロテアーゼ切断配列の名称を含む
略号
ＧＳＴ：ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）
ＴＲＸ：ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎｅ（Ｅ．ｃｏｌｉ）
Ｈｉｓ６：Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ
ＬＢＴ：ｌａｎｔｈａｎｉｄｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔａｇ
ＦＬＡＧ（登録商標）：Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ
ＥＧＦＰ：ｅｎｈａｎｃｅｄ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓｅ ｐｒｏｔｅｉｎ（オワンクラゲ）
リンカーの配列（下線部の配列が、ＡｈｄＩでの切断サイト）
Ｉ（４８７ｂｐ）説明：Ｔｒｘ遺伝子と−ＰＡＣＡＰ人工遺伝子の一部
ＧＡＣＣＡＴＴＧＧＴＣＣＡＣＣＴＧＡＣＴＧＡＣＧＡＣＡＧＴＴＴＴＧＡＣＡＣＧＧＡＴＧＴＡＣＴＣＡＡＡＧＣＧＧＡＣＧＧＧＧＣ
ＧＡＴＣＣＴＣＧＴＣＧＡＴＴＴＣＴＧＧＧＣＡＧＡＧＴＧＧＴＧＣＧＧＴＣＣＧＴＧＣＡＡＡＡＴＧＡＴＣＧＣＣＣＣＧＡＴＴＣＴＧ
ＧＡＴＧＡＡＡＴＣＧＣＴＧＡＣＧＡＡＴＡＴＣＡＧＧＧＣＡＡＡＣＴＧＡＣＣＧＴＴＧＣＡＡＡＡＣＴＧＡＡＣＡＴＣＧＡＴＣＡＡＡＡ
ＣＣＣＴＧＧＣＡＣＴＧＣＧＣＣＧＡＡＡＴＡＴＧＧＣＡＴＣＣＧＴＧＧＴＡＴＣＣＣＧＡＣＴＣＴＧＣＴＧＣＴＧＴＴＣＡＡＡＡＡＣ
ＧＧＴＧＡＡＧＴＧＧＣＧＧＣＡＡＣＣＡＡＡＧＴＧＧＧＴＧＣＡＣＴＧＴＣＴＡＡＡＧＧＴＣＡＧＴＴＧＡＡＡＧＡＧＴＴＣＣＴＣＧ
ＡＣＧＣＴＡＡＣＣＴＧＧＣＣＧＧＴＴＣＴＧＧＴＴＣＴＧＧＣＣＡＴＡＴＧＧＣＴＡＧＣＣＡＴＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＡＧ
ＣＡＧＣＧＧＣＡＴＴＧＡＣＧＧＣＣＧＧＣＡＴＡＧＣＧＡＴＧＧＣＡＴＣＴＴＴＡＣＣＧＡＴＡＧＣＴＡＴＡＧＣＣＧＣＴＡＴＣＧＣ
ＡＡＡＣＡＧＡＴＧＧＣＧＧＴＧＡＡＡＡＡＧＴＡＴＣＴＧＧＣＧＧＣＧＧＴＧＣＴＧＧＧＣＴＡＡＴＡＡＧＡＣＣＡＡＡＴＧＴＣ（配列番号５９）
ＩＩ（１１０ｂｐ）説明：ＰＡＣＡＰ人工遺伝子
ＧＡＣＧＧＴＣＧＧＴＣＴＡＧＣＧＡＴＧＧＣＡＴＣＴＴＴＡＣＣＧＡＴＡＧＣＴＡＴＡＧＣＣＧＣＴＡＴＣＧＣＡＡＡＣＡＧＡＴＧＧＣ
ＧＧＴＧＡＡＡＡＡＧＴＡＴＣＴＧＧＣＧＧＣＧＧＴＧＣＴＧＧＧＣＴＡＡＴＡＡＧＡＣＣＡＡＴＧＧＴＣ（配列番号６０）
ＩＩＩ（２５９ｂｐ）説明：ヒトユビキチン遺伝子
ＧＡＣＧＡＴＡＡＧＴＣＴＣＡＴＡＴＧＣＡＧＡＴＴＴＴＣＧＴＧＡＡＡＡＣＣＣＴＧＡＣＣＧＧＣＡＡＡＡＣＣＡＴＣＡＣＣＣＴＧＧＡ
ＡＧＴＧＧＡＡＣＣＧＴＣＣＧＡＣＡＣＣＡＴＣＧＡＡＡＡＣＧＴＴＡＡＡＧＣＧＡＡＡＡＴＣＣＡＧＧＡＣＡＡＡＧＡＡＧＧＣＡＴＣ
ＣＣＧＣＣＧＧＡＴＣＡＧＣＡＧＣＧＴＣＴＧＡＴＣＴＴＣＧＣＧＧＧＣＡＡＡＣＡＧＣＴＧＧＡＡＧＡＣＧＧＣＣＧＴＡＣＣＣＴＧ
ＴＣＣＧＡＴＴＡＣＡＡＣＡＴＣＣＡＧＡＡＡＧＡＡＴＣＴＡＣＣＣＴＧＣＡＣＣＴＧＧＴＧＣＴＧＣＧＴＣＴＧＣＧＴＧＧＣＧＧＣＴ
ＡＡＴＡＧＡＣＴＴＡＡＧＧＴＣ（配列番号６１）
参考文献
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２ ＬａＶａｌｌｉｅ，Ｅ．Ｒ，ＤｉＢｌａｓｉｏ，Ｅ．Ａ，Ｋｏｖａｃｉｃ，Ｓ，Ｇｒａｎｔ，Ｋ．Ｌ，Ｓｃｈｅｎｄｅｌ，Ｐ．Ｆ．ａｎｄ ＭｃＣｏｙ，Ｊ．Ｍ．（１９９３）Ａ ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ ｇｅｎｅ ｆｕｓｉｏｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｔｈａｔ ｃｉｒｃｕｍｖｅｎｔｓ ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｂｏｄｙ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ Ｅ．ｃｏｌｉ ｃｙｔｏｐｌａｓｍ．Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １１，１８７−１９３
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５ Ｗｏｈｎｅｒｔ Ｊ，Ｆｒａｎｚ ＫＪ，Ｎｉｔｚ Ｍ，Ｉｍｐｅｒｉａｌｉ Ｂ，Ｓｃｈｗａｌｂｅ Ｈ．（２００３）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｂｙ ａ Ｃｏｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｌａｎｔｈａｎｉｄｅ−Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｔａｇ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｒｅｓｉｄｕａｌ Ｄｉｐｏｒ Ｃｏｕｐｌｉｎｇｓ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２５，１３３３８−１３３３９
６ Ｗａｌｄｏ ＧＳ，Ｓｔａｎｄｉｓｈ ＢＭ，Ｂｅｒｅｎｄｚｅｎ Ｊ，Ｔｅｒｗｉｌｌｉｇｅｒ ＴＣ．（１９９９）Ｒａｐｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｆｏｌｄｉｎｇ ａｓｓａｙ ｕｓｉｎｇ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７，６９１−６９５．
７ Ｇｏｄａ Ｎ，Ｔｅｎｎｏ Ｔ，Ｔａｋａｓｕ Ｈ，Ｈｉｒｏａｋｉ Ｈ，ａｎｄ Ｓｈｉｒａｋａｗａ Ｍ．（２００４）Ｔｈｅ ＰＲＥＳＡＴ−ｖｅｃｔｏｒ：Ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ Ｔ−ｖｅｃｔｏｒ ｆｏｒ ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ ｓｏｌｕｂｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｏｍａｉｎｓ ｆｏｒ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ １３，６５２−６５８
８ Ｔｅｎｎｏ Ｔ，Ｇｏｄａ Ｎ，Ｔａｔｅｉｓｈｉ Ｙ，Ｔｏｃｈｉｏ Ｈ，Ｍｉｓｈｉｍａ Ｍ，Ｈａｙａｓｈｉ Ｈ，Ｓｈｉｒａｋａｗａ Ｍ，ａｎｄ Ｈｉｒｏａｋｉ Ｈ．（２００４）Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ＮＭＲ ｓｔｕｄｙ ｓｕｉｔｅｄ ｆｏｒ ｉｓｏｔｏｐｉｃ ｌａｂｅｌｉｎｇ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ １７，３０５−３１４
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【産業上の利用可能性】
【０１０６】
本発明により、蛋白質及び／または蛋白質ドメインの発現系構築と可溶性試験の全工程に要する時間を大幅に短縮することが可能となった。
【配列表フリーテキスト】
【０１０７】
＜配列番号１＞
配列番号１は、配列（Ｉ）の塩基配列を示す。
＜配列番号２＞
配列番号２は、配列（ＩＩ）の塩基配列を示す。
＜配列番号３＞
配列番号３は、配列（ＩＩＩ）の塩基配列を示す。
＜配列番号４＞
配列番号４は、配列（ＩＶ）の塩基配列を示す。
＜配列番号５＞
配列番号５は、配列（Ｖ）の塩基配列を示す。
＜配列番号６＞
配列番号６は、配列（ＶＩ）の塩基配列を示す。
＜配列番号７＞
配列番号７は、配列（ＶＩＩ）の塩基配列を示す。
＜配列番号８＞
配列番号８は、配列（ＶＩＩＩ）の塩基配列を示す。
＜配列番号９＞
配列番号９は、配列（ＩＸ）の一例（Ｎ１が１塩基である場合）の塩基配列を示す。
＜配列番号１０＞
配列番号１０は、配列（Ｘ）の一例（Ｎ２が１塩基である場合）の塩基配列を示す。
＜配列番号１１＞
配列番号１１は、配列（ＸＩ）の一例（Ｎ１が１塩基である場合）の塩基配列を示す。
＜配列番号１２＞
配列番号１２は、配列（ＸＩＩ）の一例（Ｎ２が１塩基である場合）の塩基配列を示す。
＜配列番号１３＞
配列番号１３は、配列（ＸＩＩＩ）の一例（Ｎ１が１塩基である場合）の塩基配列を示す。
＜配列番号１４＞
配列番号１４は、配列（ＸＩＶ）の一例（Ｎ２が１塩基である場合）の塩基配列を示す。
＜配列番号１５＞
配列番号１５は、配列（ＸＶ）の一例（Ｎ３が１塩基である場合）の塩基配列を示す。
＜配列番号１６＞
配列番号１６は、配列（ＸＶＩ）の一例（Ｎ４が１塩基である場合）の塩基配列を示す。
＜配列番号１７＞
配列番号１７は、配列（ＸＶＩＩ）の一例（Ｎ３が１塩基である場合）の塩基配列を示す。
＜配列番号１８＞
配列番号１８は、配列（ＸＶＩＩＩ）の一例（Ｎ４が１塩基である場合）の塩基配列を示す。
＜配列番号１９＞
配列番号１９は、配列（ＸＩＸ）の一例（Ｎ３が１塩基である場合）の塩基配列を示す。
＜配列番号２０＞
配列番号２０は、配列（ＸＸ）の一例（Ｎ４が１塩基である場合）の塩基配列を示す。
＜配列番号２１＞
配列番号２１は、ｐＧＥＸ−４Ｔ３の部位特異的変異法に用いたＤＮＡの配列を示す。
＜配列番号２２＞
配列番号２２は、ｐＥＴ３２ａＰＡＣＡＰを鋳型とするＰＣＲ反応に用いたプライマー（フロント）の塩基配列を示す。
＜配列番号２３＞
配列番号２３は、ｐＥＴ３２ａＰＡＣＡＰを鋳型とするＰＣＲ反応に用いたプライマー（リア）の塩基配列を示す。
＜配列番号２４＞
配列番号２４は、ｐＥＴ３２ａＰＡＣＡＰを鋳型とするＰＣＲ反応に用いたプライマー（ＮｃｏＩ選択法対応のリア）の塩基配列を示す。
＜配列番号２５＞
配列番号２５は、実施例１の約５００ｂｐのＰＣＲ産物の一方のＤＮＡ鎖の塩基配列を示す。他方のＤＮＡ鎖はこれの相補鎖であった。
＜配列番号２６＞
配列番号２６は、実施例１のＡｈｄＩリンカーである二本鎖ＤＮＡの一方の鎖の塩基配列を示す。
＜配列番号２７＞
配列番号２７は、実施例１のＡｈｄＩリンカーである二本鎖ＤＮＡの他方の鎖の塩基配列を示す。
＜配列番号２８＞
配列番号２８は、ＰＣＲの鋳型となる、ＭＩＴドメインを含む遺伝子（ヒトＳＮＸ１５ａ）の約２２０ｂｐの断片（コード鎖）の塩基配列を示す。プライマーにより付加される配列は含まない。
＜配列番号２９＞
配列番号２９は、ＰＣＲの鋳型となる、ＭＩＴドメインを含む遺伝子（ヒトＳＮＸ１５ａ）の約２２０ｂｐの断片（コード鎖）がコードしているアミノ酸配列を示す。
＜配列番号３０＞
配列番号３０は、ＰＣＲの鋳型となる、ＭＩＴドメインを含む遺伝子（マウスＳＮＸ１５ａ）の約２２０ｂｐの断片（コード鎖）の塩基配列を示す。プライマーにより付加される配列は含まない。
＜配列番号３１＞
配列番号３１は、ＰＣＲの鋳型となる、ＭＩＴドメインを含む遺伝子（マウスＳＮＸ１５ａ）の約２２０ｂｐの断片（コード鎖）がコードしているアミノ酸配列を示す。
＜配列番号３２＞
配列番号３２は、ＰＣＲの鋳型となる、ＭＩＴドメインを含む遺伝子（酵母Ｖｐｓ４）の約２２０ｂｐの断片（コード鎖）の塩基配列を示す。プライマーにより付加される配列は含まない。
＜配列番号３３＞
配列番号３３は、ＰＣＲの鋳型となる、ＭＩＴドメインを含む遺伝子（酵母Ｖｐｓ４）の約２２０ｂｐの断片（コード鎖）がコードしているアミノ酸配列を示す。
＜配列番号３４＞
配列番号３４は、ＰＣＲの鋳型となる、ＭＩＴドメインを含む遺伝子（ヒトＶｐｓ４ｂ）の約２２０ｂｐの断片（コード鎖）の塩基配列を示す。プライマーにより付加される配列は含まない。
＜配列番号３５＞
配列番号３５は、ＰＣＲの鋳型となる、ＭＩＴドメインを含む遺伝子（ヒトＶｐｓ４ｂ）の約２２０ｂｐの断片（コード鎖）がコードしているアミノ酸配列を示す。
＜配列番号３６＞
配列番号３６は、ＰＣＲの鋳型となる、ＭＩＴドメインを含む遺伝子（マウスＶｐｓ４ｂ）の約２２０ｂｐの断片（コード鎖）の塩基配列を示す。プライマーにより付加される配列は含まない。
＜配列番号３７＞
配列番号３７は、ＰＣＲの鋳型となる、ＭＩＴドメインを含む遺伝子（マウスＶｐｓ４ｂ）の約２２０ｂｐの断片（コード鎖）がコードしているアミノ酸配列を示す。
＜配列番号３８＞
配列番号３８は、プライマー（ＨＳＳ１５Ｆ）の塩基配列を示す。
＜配列番号３９＞
配列番号３９は、プライマー（ＨＳＳ１５Ｒ）の塩基配列を示す。
＜配列番号４０＞
配列番号４０は、プライマー（ＭＭＳ１５Ｆ）の塩基配列を示す。
＜配列番号４１＞
配列番号４１は、プライマー（ＭＭＳ１５Ｒ）の塩基配列を示す。
＜配列番号４２＞
配列番号４２は、プライマー（ＳｃＶＰＳ４Ｆ）の塩基配列を示す。
＜配列番号４３＞
配列番号４３は、プライマー（ＳｃＶＰＳ４Ｒ）の塩基配列を示す。
＜配列番号４４＞
配列番号４４は、プライマー（ＨｓＶＰＳ４Ｆ）の塩基配列を示す。
＜配列番号４５＞
配列番号４５は、プライマー（ＨｓＶＰＳ４Ｒ）の塩基配列を示す。
＜配列番号４６＞
配列番号４６は、プライマー（ＭｍＶＰＳ４Ｆ）の塩基配列を示す。
＜配列番号４７＞
配列番号４７は、プライマー（ＭｍＶＰＳ４Ｒ）の塩基配列を示す。
略号 Ｓｃ：ｙｅａｓｔ Ｈｓ：ｈｕｍａｎ Ｍｍ：ｍｏｕｓｅ：ＶＰＳ４：ＶＰＳ４，Ｓ１５：ＳＮＸ１５Ｆ：ＦＯＲＷＡＲＤ Ｒ：ＲＥＶＥＲＳＥ
＜配列番号４８＞
配列番号４８は、プライマー（ＨｒｓＦ）の塩基配列を示す。
＜配列番号４９＞
配列番号４９は、ＮｃｏＩ選択対応のプライマー（ＨｒｓＲ−Ｎｃｏ）の塩基配列を示す。
＜配列番号５０＞
配列番号５０は、ＮｄｅＩ選択対応のプライマー（ＨｒｓＲ−Ｎｄｅ）の塩基配列を示す。
＜配列番号５１＞
配列番号５１は、ＰＣＲの鋳型となる、ＵＩＭ配列を含むヒトＨｒｓ遺伝子の約２００ｂｐの断片（コード鎖）の塩基配列を示す。プライマーにより付加される配列は含まない。
＜配列番号５２＞
配列番号５２は、ＰＣＲの鋳型となる、ＵＩＭ配列を含むヒトＨｒｓ遺伝子の約２００ｂｐの断片（コード鎖）がコードしているアミノ酸配列を示す。
＜配列番号５３＞
配列番号５３は、第一の制限酵素がＡｈｄＩであり、第二の制限酵素がＮｃｏＩである場合のＯＲＦのＣ末端側のプライマーの塩基配列（目的蛋白質ドメインが停止コドンを含まないとき）を示す。
＜配列番号５４＞
配列番号５４は、第一の制限酵素がＡｈｄＩであり、第二の制限酵素がＮｄｅＩである場合のＯＲＦのＣ末端側のプライマーの塩基配列（目的蛋白質ドメインが停止コドンを含まないとき）を示す。
＜配列番号５５＞
配列番号５５は、配列（ＩＸ）〜（ＸＩＶ）におけるＮ１の塩基配列の一例を示す。
＜配列番号５６＞
配列番号５６は、配列（ＩＸ）〜（ＸＩＶ）におけるＮ２の塩基配列の一例を示す。
＜配列番号５７＞
配列番号５７は、配列（ＸＶ）〜（ＸＸ）におけるＮ３の塩基配列の一例を示す。
＜配列番号５８＞
配列番号５８は、配列（ＸＶ）〜（ＸＸ）におけるＮ４の塩基配列の一例を示す。
＜配列番号５９＞
配列番号５９は、リンカーＩの塩基配列を示す。
＜配列番号６０＞
配列番号６０は、リンカーＩＩの塩基配列を示す。
＜配列番号６１＞
配列番号６１は、リンカーＩＩＩの塩基配列を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第一の制限酵素によって認識される塩基配列の異なる２つの切断認識配列を持ち、そのうち一方の切断認識配列は第一の制限酵素とは異なる第二の制限酵素によって認識される切断認識配列の一部を含むが、他方の切断認識配列は前記の第二の制限酵素によって認識される切断認識配列の一部を含まないことを特徴とするベクター。
【請求項２】
第一の制限酵素が、切断したＤＮＡに３’突出末端を生成する制限酵素である請求項１記載のベクター。
【請求項３】
３’突出末端の塩基がチミンである請求項２記載のベクター。
【請求項４】
第一の制限酵素がＡｈｄＩまたはそのイソスキゾマー、ＸｃｍＩまたはそのイソスキゾマー、およびその組み合わせからなる群より選択される請求項１〜３のいずれかに記載のベクター。
【請求項５】
第一の制限酵素がＡｈｄＩまたはそのイソスキゾマー、ＸｃｍＩまたはそのイソスキゾマー、およびその組み合わせからなる群より選択され、第二の制限酵素が、ＮｃｏＩ，ＤｓａＩ，ＥｃｏＴ１４Ｉ，ＮｄｅＩ，ＳｆｅＩ，ＡｖａＩ，ＳｍｌＩ，ＸｈｏＩ，ＰｓｔＩ，ＥｃｏＴ２２Ｉ，ＰｓｈＢＩ，ＡｃｃＩ，ＡｐａＬＩ，ＰｓｉＩ，ＳｃａＩ，ＳｐｌＩ，Ｂｓｐ１１０７Ｉ，Ｂｓｐ１２８６Ｉ，ＢｓｐＴ１０７Ｉ，Ｂｓｐ１４０７Ｉ，ＴａｔＩ，ＨｇｉＣＩ，ＫｐｎＩ，ＳｐｅＩ，ＢｌｎＩ，ＮｈｅＩ，ＸｂａＩ，ＳｓｐＩ，ＥｃｏＲＶおよびそれらのイソスキゾマーからなる群より選択される請求項４記載のベクター。
【請求項６】
第一の制限酵素がＸｃｍＩまたはそのイソスキゾマーであり、第二の制限酵素が、ＡｆｌＩＩＩ，ＢｓｐＬＵ１１Ｉ，ＮｓｐＩ，ＳｐｈＩ，ＢｓｐＨＩ，ＢｓａＡＩ，ＰｍａＣＩ，ＳｎａＢＩ，ＮｓｐＢＩＩ、ＰｖｕＩＩ，ＢａｎＩＩ，ＨｇｉＡＩ，ＳａｃＩおよびそれらのイソスキゾマーからなる群より選択される請求項４記載のベクター。
【請求項７】
第一の制限酵素によって認識される塩基配列の異なる２つの切断認識配列がマルチクローニングサイトに挿入されている請求項１〜６のいずれかに記載のベクター。
【請求項８】
ベクターがある蛋白質のコード領域を含んでおり、蛋白質及び／又は蛋白質ドメインをコードする外来遺伝子を組み込んだときに、前記外来遺伝子がコードする蛋白質及び／又は蛋白質ドメインを前記領域がコードする蛋白質と結合した融合蛋白質の形態で発現することができる請求項１〜７のいずれかに記載のベクター。
【請求項９】
ある蛋白質のコード領域のカルボキシ末端側に、第一の制限酵素によって認識される塩基配列の異なる２つの切断認識配列を持ち、そのうち前記蛋白質のコード領域に近い側の切断認識配列は第一の制限酵素とは異なる第二の制限酵素によって認識される切断認識配列の一部を含むが、前記蛋白質のコード領域に遠い側の切断認識配列は前記の第二の制限酵素によって認識される切断認識配列の一部を含まない請求項８記載のベクター。
【請求項１０】
グルタチオンＳトランスフェラーゼのコード領域を含んでおり、蛋白質及び／又は蛋白質ドメインをコードする外来遺伝子を組み込んだときに、前記外来遺伝子がコードする蛋白質及び／又は蛋白質ドメインをグルタチオンＳトランスフェラーゼと結合した融合蛋白質の形態で発現することができる請求項８または９記載のベクター。
【請求項１１】
グルタチオンＳトランスフェラーゼが哺乳類、ジストマジャポニクスまたは大腸菌に由来する請求項１０記載のベクター。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれかに記載のベクターを第一の制限酵素で処理することにより得られる二本鎖ＤＮＡからなる開環状ベクター。
【請求項１３】
請求項１記載のベクターを第一の制限酵素で処理したものに順方向で挿入された場合には第二の制限酵素の切断認識配列が出現しないが、逆方向で挿入された場合には第二の制限酵素の切断認識配列が出現するように設計された配列を含む外来遺伝子を請求項１記載のベクターに組み込んだ組換えベクター。
【請求項１４】
請求項１記載のベクターを第一の制限酵素で処理したものに外来遺伝子が順方向で挿入された請求項１３記載の組換えベクター。
【請求項１５】
外来遺伝子が蛋白質及び／又は蛋白質ドメインをコードする請求項１３または１４記載の組換えベクター。
【請求項１６】
請求項１３記載の組換えベクターを含む形質転換体またはその子孫。
【請求項１７】
第一の制限酵素によって認識される塩基配列の異なる２つの切断認識配列であって、そのうち一方の切断認識配列は第一の制限酵素とは異なる第二の制限酵素によって認識される切断認識配列の一部を含むが、他方の切断認識配列は前記の第二の制限酵素によって認識される切断認識配列の一部を含まない前記の２つの切断認識配列を含む二本鎖ＤＮＡをプラスミド、ファージ、コスミド、Ｐ１ベクター、細菌人工染色体ベクターまたは酵母人工染色体ベクターのマルチクローニングサイトに導入することを含む、請求項１記載のベクターの製造方法。
【請求項１８】
第一の制限酵素によって認識される塩基配列の異なる２つの切断認識配列であって、そのうち一方の切断認識配列は第一の制限酵素とは異なる第二の制限酵素によって認識される切断認識配列の一部を含むが、他方の切断認識配列は前記の第二の制限酵素によって認識される切断認識配列の一部を含まない前記の２つの切断認識配列を含む二本鎖ＤＮＡ。
【請求項１９】
請求項１記載のベクターを用いて、外来遺伝子がコードする蛋白質及び／又は蛋白質ドメインを製造する方法。
【請求項２０】
請求項１記載のベクターを用いて、外来遺伝子がベクターに逆方向で挿入された組換えベクターを開環させ、外来遺伝子がベクターに順方向で挿入された組換えベクターを閉環したままの状態で残す方法。
【請求項２１】
請求項１記載のベクターを用いて、外来遺伝子がコードする蛋白質及び／又は蛋白質ドメインの発現量及び／又は溶解度を試験する方法。
【請求項１】
第一の制限酵素によって認識される塩基配列の異なる２つの切断認識配列を持ち、そのうち一方の切断認識配列は第一の制限酵素とは異なる第二の制限酵素によって認識される切断認識配列の一部を含むが、他方の切断認識配列は前記の第二の制限酵素によって認識される切断認識配列の一部を含まないことを特徴とするベクター。
【請求項２】
第一の制限酵素が、切断したＤＮＡに３’突出末端を生成する制限酵素である請求項１記載のベクター。
【請求項３】
３’突出末端の塩基がチミンである請求項２記載のベクター。
【請求項４】
第一の制限酵素がＡｈｄＩまたはそのイソスキゾマー、ＸｃｍＩまたはそのイソスキゾマー、およびその組み合わせからなる群より選択される請求項１〜３のいずれかに記載のベクター。
【請求項５】
第一の制限酵素がＡｈｄＩまたはそのイソスキゾマー、ＸｃｍＩまたはそのイソスキゾマー、およびその組み合わせからなる群より選択され、第二の制限酵素が、ＮｃｏＩ，ＤｓａＩ，ＥｃｏＴ１４Ｉ，ＮｄｅＩ，ＳｆｅＩ，ＡｖａＩ，ＳｍｌＩ，ＸｈｏＩ，ＰｓｔＩ，ＥｃｏＴ２２Ｉ，ＰｓｈＢＩ，ＡｃｃＩ，ＡｐａＬＩ，ＰｓｉＩ，ＳｃａＩ，ＳｐｌＩ，Ｂｓｐ１１０７Ｉ，Ｂｓｐ１２８６Ｉ，ＢｓｐＴ１０７Ｉ，Ｂｓｐ１４０７Ｉ，ＴａｔＩ，ＨｇｉＣＩ，ＫｐｎＩ，ＳｐｅＩ，ＢｌｎＩ，ＮｈｅＩ，ＸｂａＩ，ＳｓｐＩ，ＥｃｏＲＶおよびそれらのイソスキゾマーからなる群より選択される請求項４記載のベクター。
【請求項６】
第一の制限酵素がＸｃｍＩまたはそのイソスキゾマーであり、第二の制限酵素が、ＡｆｌＩＩＩ，ＢｓｐＬＵ１１Ｉ，ＮｓｐＩ，ＳｐｈＩ，ＢｓｐＨＩ，ＢｓａＡＩ，ＰｍａＣＩ，ＳｎａＢＩ，ＮｓｐＢＩＩ、ＰｖｕＩＩ，ＢａｎＩＩ，ＨｇｉＡＩ，ＳａｃＩおよびそれらのイソスキゾマーからなる群より選択される請求項４記載のベクター。
【請求項７】
第一の制限酵素によって認識される塩基配列の異なる２つの切断認識配列がマルチクローニングサイトに挿入されている請求項１〜６のいずれかに記載のベクター。
【請求項８】
ベクターがある蛋白質のコード領域を含んでおり、蛋白質及び／又は蛋白質ドメインをコードする外来遺伝子を組み込んだときに、前記外来遺伝子がコードする蛋白質及び／又は蛋白質ドメインを前記領域がコードする蛋白質と結合した融合蛋白質の形態で発現することができる請求項１〜７のいずれかに記載のベクター。
【請求項９】
ある蛋白質のコード領域のカルボキシ末端側に、第一の制限酵素によって認識される塩基配列の異なる２つの切断認識配列を持ち、そのうち前記蛋白質のコード領域に近い側の切断認識配列は第一の制限酵素とは異なる第二の制限酵素によって認識される切断認識配列の一部を含むが、前記蛋白質のコード領域に遠い側の切断認識配列は前記の第二の制限酵素によって認識される切断認識配列の一部を含まない請求項８記載のベクター。
【請求項１０】
グルタチオンＳトランスフェラーゼのコード領域を含んでおり、蛋白質及び／又は蛋白質ドメインをコードする外来遺伝子を組み込んだときに、前記外来遺伝子がコードする蛋白質及び／又は蛋白質ドメインをグルタチオンＳトランスフェラーゼと結合した融合蛋白質の形態で発現することができる請求項８または９記載のベクター。
【請求項１１】
グルタチオンＳトランスフェラーゼが哺乳類、ジストマジャポニクスまたは大腸菌に由来する請求項１０記載のベクター。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれかに記載のベクターを第一の制限酵素で処理することにより得られる二本鎖ＤＮＡからなる開環状ベクター。
【請求項１３】
請求項１記載のベクターを第一の制限酵素で処理したものに順方向で挿入された場合には第二の制限酵素の切断認識配列が出現しないが、逆方向で挿入された場合には第二の制限酵素の切断認識配列が出現するように設計された配列を含む外来遺伝子を請求項１記載のベクターに組み込んだ組換えベクター。
【請求項１４】
請求項１記載のベクターを第一の制限酵素で処理したものに外来遺伝子が順方向で挿入された請求項１３記載の組換えベクター。
【請求項１５】
外来遺伝子が蛋白質及び／又は蛋白質ドメインをコードする請求項１３または１４記載の組換えベクター。
【請求項１６】
請求項１３記載の組換えベクターを含む形質転換体またはその子孫。
【請求項１７】
第一の制限酵素によって認識される塩基配列の異なる２つの切断認識配列であって、そのうち一方の切断認識配列は第一の制限酵素とは異なる第二の制限酵素によって認識される切断認識配列の一部を含むが、他方の切断認識配列は前記の第二の制限酵素によって認識される切断認識配列の一部を含まない前記の２つの切断認識配列を含む二本鎖ＤＮＡをプラスミド、ファージ、コスミド、Ｐ１ベクター、細菌人工染色体ベクターまたは酵母人工染色体ベクターのマルチクローニングサイトに導入することを含む、請求項１記載のベクターの製造方法。
【請求項１８】
第一の制限酵素によって認識される塩基配列の異なる２つの切断認識配列であって、そのうち一方の切断認識配列は第一の制限酵素とは異なる第二の制限酵素によって認識される切断認識配列の一部を含むが、他方の切断認識配列は前記の第二の制限酵素によって認識される切断認識配列の一部を含まない前記の２つの切断認識配列を含む二本鎖ＤＮＡ。
【請求項１９】
請求項１記載のベクターを用いて、外来遺伝子がコードする蛋白質及び／又は蛋白質ドメインを製造する方法。
【請求項２０】
請求項１記載のベクターを用いて、外来遺伝子がベクターに逆方向で挿入された組換えベクターを開環させ、外来遺伝子がベクターに順方向で挿入された組換えベクターを閉環したままの状態で残す方法。
【請求項２１】
請求項１記載のベクターを用いて、外来遺伝子がコードする蛋白質及び／又は蛋白質ドメインの発現量及び／又は溶解度を試験する方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０２１７４７
【国際公開日】平成１７年３月１０日（２００５．３．１０）
【発行日】平成１９年１１月１日（２００７．１１．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５１３５０４（Ｐ２００５−５１３５０４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１２５２３
【国際出願日】平成１６年８月３１日（２００４．８．３１）
【出願人】（５０５１５５５２８）公立大学法人横浜市立大学 (101)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１７年３月１０日（２００５．３．１０）
【発行日】平成１９年１１月１日（２００７．１１．１）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１２５２３
【国際出願日】平成１６年８月３１日（２００４．８．３１）
【出願人】（５０５１５５５２８）公立大学法人横浜市立大学 (101)
【Ｆターム（参考）】
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