新規置換突然変異体受容体および核受容体−ベースの誘導性遺伝子発現システムにおけるその使用
【課題】置換突然変異を含む新規核受容体及び核受容体−ベースの誘導性遺伝子発現システムにおけるその使用ならびにこの誘導性遺伝子発現システムを用いて宿主細胞内で遺伝子の発現を変調する方法の提供。
【解決手段】新規な置換突然変異体レポーターおよびグループＨ核受容体−ベースの誘導性遺伝子発現システムにおけるその使用、ならびに遺伝子治療、蛋白質および抗体の大規模生産、細胞−ベースの高スループットスクリーニングアッセイ、機能的ゲノミクスおよびトランスジェニック生物における特性の調節の適用。
【解決手段】新規な置換突然変異体レポーターおよびグループＨ核受容体−ベースの誘導性遺伝子発現システムにおけるその使用、ならびに遺伝子治療、蛋白質および抗体の大規模生産、細胞−ベースの高スループットスクリーニングアッセイ、機能的ゲノミクスおよびトランスジェニック生物における特性の調節の適用。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉ）トランス活性化ドメイン；
ｉｉ）その発現を変調すべき遺伝子と関連した応答エレメントを認識するＤＮＡ−結合ドメイン；および
ｉｉｉ）置換突然変異を含むグループＨ核受容体リガンド結合ドメイン
を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、宿主細胞中で発現させることができる遺伝子発現カセットを含む遺伝子発現変調システム。
【請求項２】
さらに、脊椎動物レチノイドＸ受容体リガンド結合ドメイン、無脊椎動物レチノイドＸ受容体リガンド結合ドメイン、ウルトラスピラクル蛋白質リガンド結合ドメイン、および２つのポリペプチド断片（ここで、第１のポリペプチド断片は脊椎動物レチノイドＸ受容体リガンド結合ドメイン、無脊椎動物レチノイドＸ受容体リガンド結合ドメイン、またはウルトラスピラクル蛋白質リガンド結合ドメインからのものであり、第２のポリペプチド断片は異なる脊椎動物レチノイドＸ受容体リガンド結合ドメイン、無脊椎動物レチノイドＸ受容体リガンド結合ドメイン、またはウルトラスピラクル蛋白質リガンド結合ドメインからのものである）を含むキメラリガンド結合ドメインよりなる群から選択される第２の核受容体リガンド結合ドメインを含む請求項１に記載の遺伝子発現変調システム。
【請求項３】
ａ）ｉ）その発現を変調すべき遺伝子と関連した応答エレメントを認識するＤＮＡ−結合ドメイン；および
ｉｉ）核受容体リガンド結合ドメイン
を含む第１のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、宿主細胞中で発現させることができる第１の遺伝子発現カセット：および
ｂ）ｉ）トランス活性化ドメイン；および
ｉｉ）核受容体リガンド結合ドメイン
を含む第２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、宿主細胞中で発現させることができる第２の遺伝子発現カセット
を含み、核受容体リガンド結合ドメインのうちの１つは、置換突然変異を含むグループＨ核受容体リガンド結合ドメインであることを特徴とする遺伝子発現変調システム。
【請求項４】
該グループＨ核受容体リガンド結合ドメインがエクジソン受容体、ユビキタス受容体、オーファン受容体１、ＮＥＲ−１、ステロイドホルモン核受容体１、レチノイドＸ受容体相互作用蛋白質−１５、肝臓Ｘ受容体β、ステロイドホルモン受容体様蛋白質、肝臓Ｘ受容体、肝臓Ｘ受容体α、ファルネソイドＸ受容体、受容体相互作用蛋白質１４、およびファルネゾール受容体よりなる群から選択されるグループＨ核受容体からのものである請求項１または３に記載の遺伝子発現変調システム。
【請求項５】
該グループＨ核受容体リガンド結合ドメインが、アミノ酸残基の置換をもたらすコドン突然変異を含むポリヌクレオチドによってコードされ、該アミノ酸残基はａ）配列番号：１のアミノ酸残基２０、２１、４８、５１、５２、５５、５８、５９、６１、６２、９２、９３、９５、９６、１０７、１０９、１１０、１２０、１２３、１２５、１７５、２１８、２１９、２２３、２３０、２３４または２３８、ｂ）配列番号：１のアミノ酸残基９５および１１０、ｃ）配列番号：１のアミノ酸残基２１８および２１９、ｄ）配列番号：１のアミノ酸残基１０７および１７５、ｅ）配列番号：１のアミノ酸残基１２７および１７５、ｆ）配列番号：１のアミノ酸残基１０７および１２７、ｇ）アミノ酸残基１０７、１２７および１７５、ｈ）配列番号：１のアミノ酸残基５２、１０７および１７５、ｉ）配列番号：１のアミノ酸残基９６、１０７および１７５、ｊ）配列番号：１のアミノ酸残基１０７、１１０および１７５、ｋ）配列番号：２のアミノ酸残基１０７、１２１、２１３または２１７、あるいはｌ）配列番号：３のアミノ酸残基９１もしくは１０５、と同等または類似の位置におけるものである請求項４に記載の遺伝子発現変調システム。
【請求項６】
置換突然変異を含むグループＨ核受容体リガンド結合ドメインがエクジソン受容体リガンド結合ドメインである請求項５に記載の遺伝子発現変調システム。
【請求項７】
置換突然変異がａ）配列番号：１のＥ２０Ａ、Ｑ２１Ａ、Ｆ４８Ａ、Ｉ５１Ａ、Ｔ５２Ａ、Ｔ５２Ｖ、Ｔ５２Ｉ、Ｔ５２Ｌ、Ｔ５５Ａ、Ｔ５８Ａ、Ｖ５９Ａ、Ｌ６１Ａ、Ｉ６２Ａ、Ｍ９２Ａ、Ｍ９３Ａ、Ｒ９５Ａ、Ｖ９６Ａ、Ｖ９６Ｔ、Ｖ９６Ｄ、Ｖ９６Ｍ、Ｖ１０７Ｉ、Ｆ１０９Ａ、Ａ１１０Ｐ、Ａ１１０Ｓ、Ａ１１０Ｍ、Ａ１１０Ｌ、Ｙ１２０Ａ、Ａ１２３Ｆ、Ｍ１２５Ａ、Ｒ１７５Ｅ、Ｍ２１８Ａ、Ｃ２１９Ａ、Ｌ２２３Ａ、Ｌ２３０Ａ、Ｌ２３４Ａ、Ｗ２３８Ａ、Ｒ９５Ａ／Ａ１１０Ｐ、Ｍ２１８Ａ／Ｃ２１９Ａ、Ｖ１０７Ｉ／Ｒ１７５Ｅ、Ｙ１２７Ｅ／Ｒ１７５Ｅ、Ｖ１０７Ｉ／Ｙ１２７Ｅ、Ｖ１０７Ｉ／Ｙ１２７Ｅ／Ｒ１７５Ｅ、Ｔ５２Ｖ／Ｖ１０７Ｉ／Ｒ１７５Ｅ、Ｖ９６Ａ／Ｖ１０７Ｉ／Ｒ１７５Ｅ、Ｔ５２Ａ／Ｖ１０７Ｉ／Ｒ１７５Ｅ、Ｖ９６Ｔ／Ｖ１０７Ｉ／Ｒ１７５ＥまたはＶ１０７Ｉ／Ａ１１０Ｐ／Ｒ１７５Ｅ置換突然変異、ｂ）配列番号：２のＡ１０７Ｐ、Ｇ１２１Ｒ、Ｇ１２１Ｌ、Ｎ２１３Ａ、Ｃ２１７ＡまたはＣ２１７Ｓ置換突然変異、およびｃ）配列番号：３のＧ９１ＡまたはＡ１０５Ｐ置換突然変異よりなる群から選択される請求項６に記載の遺伝子発現変調システム。
【請求項８】
該ＤＮＡ−結合ドメインがエクジソン受容体ＤＮＡ−結合ドメイン、ＧＡＬ４ ＤＮＡ−結合ドメイン、およびＬｅｘＡ ＤＮＡ−結合ドメインよりなる群から選択される請求項１または３に記載の遺伝子発現変調システム。
【請求項９】
トランス活性化ドメインがエクジソン受容体トランス活性化ドメイン、ＶＰ１６トランス活性化ドメイン、Ｂ４２酸性アクチベータトランス活性化ドメイン、およびｐ６５トランス活性化ドメインよりなる群から選択される請求項１または３に記載の遺伝子発現変調システム。
【請求項１０】
ａ）トランス活性化ドメイン、ＤＮＡ−結合ドメイン、および置換突然変異を含むグループＨ核受容体リガンド結合ドメインを含むポリペプチド、
ｂ）ＤＮＡ−結合ドメイン、および置換突然変異を含むグループＨ核受容体リガンド結合ドメインを含むポリペプチド、および
ｃ）トランス活性化ドメイン、および置換突然変異を含むグループＨ核受容体リガンド結合ドメインを含むポリペプチド
よりなる群から選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子発現カセット。
【請求項１１】
置換突然変異を含むグループＨ核受容体リガンド結合ドメインをコードする単離されたポリヌクレオチドであって、ａ）配列番号：１のアミノ酸残基２０、２１、４８、５１、５２、５５、５８、５９、６１、６２、９２、９３、９５、９６、１０７、１０９、１１０、１２０、１２３、１２５、１７５、２１８、２１９、２２３、２３０、２３４または２３８、ｂ）配列番号：１のアミノ酸残基９５および１１０、ｃ）配列番号：１のアミノ酸残基２１８および２１９、ｄ）配列番号：１のアミノ酸残基１０７および１７５、ｅ）配列番号：１のアミノ酸残基１２７および１７５、ｆ）配列番号：１のアミノ酸残基１０７および１２７、ｇ）配列番号：１のアミノ酸残基１０７、１２７および１７５、ｈ）配列番号：１のアミノ酸残基５２、１０７および１７５、ｉ）配列番号：１のアミノ酸残基９６、１０７および１７５、ｊ）配列番号：１のアミノ酸残基１０７、１１０および１７５、ｋ）配列番号；２のアミノ酸残基１０７、１２１、２１３または２１７、あるいはｌ）配列番号：３のアミノ酸残基９１もしくは１０５、と同等または類似の位置におけるアミノ酸残基の置換をもたらすコドン突然変異を含む単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１２】
該コドン突然変異がａ）配列番号：１のＥ２０Ａ、Ｑ２１Ａ、Ｆ４８Ａ、Ｉ５１Ａ、Ｔ５２Ａ、Ｔ５２Ｖ、Ｔ５２Ｉ、Ｔ５２Ｌ、Ｔ５５Ａ、Ｔ５８Ａ、Ｖ５９Ａ、Ｌ６１Ａ、Ｉ６２Ａ、Ｍ９２Ａ、Ｍ９３Ａ、Ｒ９５Ａ、Ｖ９６Ａ、Ｖ９６Ｔ、Ｖ９６Ｄ、Ｖ９６Ｍ、Ｖ１０７Ｉ、Ｆ１０９Ａ、Ａ１１０Ｐ、Ａ１１０Ｓ、Ａ１１０Ｍ、Ａ１１０Ｌ、Ｙ１２０Ａ、Ａ１２３Ｆ、Ｍ１２５Ａ、Ｒ１７５Ｅ、Ｍ２１８Ａ、Ｃ２１９Ａ、Ｌ２２３Ａ、Ｌ２３０Ａ、Ｌ２３４Ａ、Ｗ２３８Ａ、Ｒ９５Ａ／Ａ１１０Ｐ、Ｍ２１８Ａ／Ｃ２１９Ａ、Ｖ１０７Ｉ／Ｒ１７５Ｅ、Ｙ１２７Ｅ／Ｒ１７５Ｅ、Ｖ１０７Ｉ／Ｙ１２７Ｅ、Ｖ１０７Ｉ／Ｙ１２７Ｅ／Ｒ１７５Ｅ、Ｔ５２Ｖ／Ｖ１０７Ｉ／Ｒ１７５Ｅ、Ｖ９６Ａ／Ｖ１０７Ｉ／Ｒ１７５Ｅ、Ｔ５２Ａ／Ｖ１０７Ｉ／Ｒ１７５Ｅ、Ｖ９６Ｔ／Ｖ１０７Ｉ／Ｒ１７５ＥまたはＶ１０７Ｉ／Ａ１１０Ｐ／Ｒ１７５Ｅ置換突然変異、ｂ）配列番号：２のＡ１０７Ｐ、Ｇ１２１Ｒ、Ｇ１２１Ｌ、Ｎ２１３Ａ、Ｃ２１７ＡまたはＣ２１７Ｓ置換突然変異、およびｃ）配列番号：３のＧ９１ＡまたはＡ１０５Ｐ置換突然変異よりなる群から選択される置換突然変異をもたらす請求項１１に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１３】
置換突然変異を含むエクジソン受容体リガンド結合ドメインをコードする単離されたポリヌクレオチドであって、該エクジソン受容体リガンド結合ドメインがエクジソン結合活性を欠き、置換突然変異がａ）配列番号：１のアミノ酸５８または１１０、ｂ）配列番号；１のアミノ酸１０７、１１０および１７５、ｃ）配列番号：２の１０７、またはｄ）配列番号：３の１０５、と同等または類似のアミノ酸位置におけるものである単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１４】
置換突然変異がａ）配列番号：１のＴ５８Ａ、Ａ１１０Ｐ、Ａ１１０Ｌ、Ａ１１０Ｓ、Ａ１１０ＭまたはＶ１０７Ｉ／Ａ１１０Ｐ／Ｒ１７５Ｅ、ｂ）配列番号：２のＡ１０７Ｐ、およびｃ）配列番号：３のＡ１０５Ｐよりなる群から選択される請求項１３に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１５】
置換突然変異を含むエクジソン受容体リガンド結合ドメインをコードする単離されたポリヌクレオチドであって、エクジソン受容体リガンド結合ドメインがステロイド結合活性を欠き、さらにエクジソン受容体リガンド結合ドメインをコードするポリヌクレオチドが、少なくとも３７℃における５００ｍＭ未満の塩でのハイブリダイゼーション工程、および少なくとも６３℃における２×ＳＳＰＥでの洗浄工程を含むハイブリダイゼーション条件下で、ａ）配列番号：１のＴ５８Ａ、Ａ１１０Ｐ、Ａ１１０Ｌ、Ａ１１０Ｓ、Ａ１１０ＭまたはＶ１０７Ｉ／Ａ１１０Ｐ／Ｒ１７５Ｅ置換突然変異、ｂ）配列番号：２のＡ１０７Ｐ、Ｇ１２１Ｒ、Ｇ１２１Ｌ、Ｎ２１３Ａ、Ｃ２１７ＡまたはＣ２１７Ｓ置換突然変異、およびｃ）配列番号：３のＡ１０５Ｐ置換突然変異よりなる群から選択される置換突然変異をもたらすコドン突然変異を含むポリヌクレオチドにハイブリダイズする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１６】
転写調節エレメントに作動可能に連結した請求項１１に記載の単離されたポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項１７】
該転写調節エレメントが宿主細胞中で作動する請求項１６に記載の発現ベクターを含む単離された宿主細胞。
【請求項１８】
請求項１１に記載の単離されたポリヌクレオチドによってコードされる単離されたポリペプチド。
【請求項１９】
置換突然変異を含むグループＨ核受容体リガンド結合ドメインを含む単離されたポリペプチドであって、該置換突然変異がａ）配列番号：１のアミノ酸残基２０、２１、４８、５１、５２、５５、５８、５９、６１、６２、９２、９３、９５、９６、１０７、１０９、１１０、１２０、１２３、１２５、１７５、２１８、２１９、２２３、２３０、２３４または２３８、ｂ）配列番号：１のアミノ酸残基９５および１１０、ｃ）配列番号：１のアミノ酸残基２１８および２１９、ｄ）配列番号：１のアミノ酸残基１０７および１７５、ｅ）配列番号：１のアミノ酸残基、１２７および１７５、ｆ）配列番号：１のアミノ酸残基１０７および１２７、ｇ）配列番号：１のアミノ酸残基１０７、１２７および１７５、ｈ）配列番号：１のアミノ酸残基５２、１０７および１７５、ｉ）配列番号：１のアミノ酸残基９６、１０７および１７５、ｊ）配列番号：１のアミノ酸残基１０７、１１０および１７５、ｋ）配列番号；２のアミノ酸残基１０７、１２１、２１３または２１７、あるいはｌ）配列番号：３のアミノ酸残基９１もしくは１０５、と同等または類似の位置におけるものである単離されたポリペプチド。
【請求項２０】
該置換突然変異がａ）配列番号：１のＥ２０Ａ、Ｑ２１Ａ、Ｆ４８Ａ、Ｉ５１Ａ、Ｔ５２Ａ、Ｔ５２Ｖ、Ｔ５２Ｉ、Ｔ５２Ｌ、Ｔ５５Ａ、Ｔ５８Ａ、Ｖ５９Ａ、Ｌ６１Ａ、Ｉ６２Ａ、Ｍ９２Ａ、Ｍ９３Ａ、Ｒ９５Ａ、Ｖ９６Ａ、Ｖ９６Ｔ、Ｖ９６Ｄ、Ｖ９６Ｍ、Ｖ１０７Ｉ、Ｆ１０９Ａ、Ａ１１０Ｐ、Ａ１１０Ｓ、Ａ１１０Ｍ、Ａ１１０Ｌ、Ｙ１２０Ａ、Ａ１２３Ｆ、Ｍ１２５Ａ、Ｒ１７５Ｅ、Ｍ２１８Ａ、Ｃ２１９Ａ、Ｌ２２３Ａ、Ｌ２３０Ａ、Ｌ２３４Ａ、Ｗ２３８Ａ、Ｒ９５Ａ／Ａ１１０Ｐ、Ｍ２１８Ａ／Ｃ２１９Ａ、Ｖ１０７Ｉ／Ｒ１７５Ｅ、Ｙ１２７Ｅ／Ｒ１７５Ｅ、Ｖ１０７Ｉ／Ｙ１２７Ｅ、Ｖ１０７Ｉ／Ｙ１２７Ｅ／Ｒ１７５Ｅ、Ｔ５２Ｖ／Ｖ１０７Ｉ／Ｒ１７５Ｅ、Ｖ９６Ａ／Ｖ１０７Ｉ／Ｒ１７５Ｅ、Ｔ５２Ａ／Ｖ１０７Ｉ／Ｒ１７５Ｅ、Ｖ９６Ｔ／Ｖ１０７Ｉ／Ｒ１７５ＥまたはＶ１０７Ｉ／Ａ１１０Ｐ／Ｒ１７５Ｅ置換突然変異、ｂ）配列番号：２のＡ１０７Ｐ、Ｇ１２１Ｒ、Ｇ１２１Ｌ、Ｎ２１３Ａ、Ｃ２１７ＡまたはＣ２１７Ｓ置換突然変異、およびｃ）配列番号：３のＧ９１ＡまたはＡ１０５Ｐ置換突然変異よりなる群から選択される請求項１９に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項２１】
ａ）請求項１または３に記載の遺伝子発現変調システムを宿主細胞に導入し；さらに、
ｂ）宿主細胞にリガンドを導入する；
工程を含み、
変調すべき遺伝子が：
ｉ）ＤＮＡ結合ドメインによって認識される応答エレメント；
ｉｉ）トランス活性化ドメインによって活性化されるプロモーター；および
ｉｉｉ）その発現が変調されるべき遺伝子
を含む遺伝子発現カセットの構成要素であり、
それにより、宿主細胞へのリガンドの導入に際して、ｂ）ｉｉｉ）の遺伝子の発現が変調されることを特徴とする、宿主細胞において遺伝子の発現を変調する方法。
【請求項２２】
該リガンドが、
ａ）式：
【化１】
（式中、Ｅは第三級炭素を含有する（Ｃ４−Ｃ６）アルキルまたは第三級炭素を含有するシアノ（Ｃ３−Ｃ５）アルキルであり；
Ｒ１はＨ、Ｍｅ、Ｅｔ、ｉ−Ｐｒ、Ｆ、ホルミル、ＣＦ３、ＣＨＦ２、ＣＨＣｌ２、ＣＨ２Ｆ、ＣＨ２Ｃｌ、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ２ＯＭｅ、ＣＨ２ＣＮ、ＣＮ、Ｃ０ＣＨ、１−プロピニル、２−プロピニル、ビニル、ＯＨ、ＯＭｅ、ＯＥｔ、シクロプロピル、ＣＦ２ＣＦ３、ＣＨ＝ＣＨＣＮ、アリル、アジド、ＳＣＮまたはＳＣＨＦ２であり；
Ｒ２はＨ、Ｍｅ、Ｅｔ、ｎ−Ｐｒ、ｉ−Ｐｒ、ホルミル、ＣＦ３、ＣＨＦ２、ＣＨＣｌ２、ＣＨ２Ｆ、ＣＨ２Ｃｌ、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ２ＯＭｅ、ＣＨ２ＣＮ、ＣＮ、Ｃ０ＣＨ、１−プロピニル、２−プロピニル、ビニル、Ａｃ、Ｆ、Ｃｌ、ＯＨ、ＯＭｅ、ＯＥｔ、Ｏ−ｎ−Ｐｒ、ＯＡｃ、ＮＭｅ２、ＮＥｔ２、ＳＭｅ、ＳＥｔ、ＳＯＣＦ３、ＯＣＦ２ＣＦ２Ｈ、ＣＯＥｔ、シクロプロピル、ＣＦ２ＣＦ３、ＣＨ＝ＣＨＣＮ、アリル、アジド、ＯＣＦ３、ＯＣＨＦ２、Ｏ−ｉ−Ｐｒ、ＳＣＮ、ＳＣＨＦ２、ＳＯＭｅ、ＮＨ−ＣＮであるか、またはＲ３、ならびにＲ２およびＲ３が結合したフェニル炭素と一緒になって、エチレンジオキシ、フェニル炭素に隣接した酸素を持つジヒドロフリル環、もしくはフェニル炭素に隣接した酸素を持つジヒドロピリル環を形成し；
Ｒ３はＨ、Ｅｔであるか、またはＲ２、ならびにＲ２およびＲ３が結合したフェニル炭素と一緒になって、エチレンジオキシ、フェニル炭素に隣接した酸素を持つジヒドロフリル環、もしくはフェニル炭素に隣接した酸素を持つジヒドロピリル環を形成し；
Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は独立してＨ、Ｍｅ、Ｅｔ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ホルミル、ＣＦ３、ＣＨＦ２、ＣＨＣｌ２、ＣＨ２Ｆ、ＣＨ２Ｃｌ、ＣＨ２ＯＨ、ＣＮ、Ｃ０ＣＨ、１−プロピニル、２−プロピニル、ビニル、ＯＭｅ、ＯＥｔ、ＳＭｅまたはＳＥｔである）
の化合物；または
ｂ）エクジソン、２０−ヒドロキシエクジソン、ポナステロンＡ、ムリステロンＡ、オキシステロール、２２（Ｒ）ヒドロキシコレステロール、２４（Ｓ）ヒドロキシコレステロール、２５−エポキシコレステロール、Ｔ０９０１３１７、５−アルファ−６−アルファ−エポキシコレステロール−３−スルフェート、７−ケトコレステロール−３−スルフェート、ファルネゾール、胆汁酸、１，１−ビスフォスフォネートエステル、または幼若ホルモンＩＩＩ
である請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
さらに、宿主細胞に第２のリガンドを導入することを含み、第２のリガンドが９−シス−レチノイン酸またはレチノイン酸の合成アナログである請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
請求項１または請求項３に記載の遺伝子発現変調システムを含む単離された宿主細胞。
【請求項２５】
請求項２４に記載の宿主細胞を含む非−ヒト生物。
【請求項１】
ｉ）トランス活性化ドメイン；
ｉｉ）その発現を変調すべき遺伝子と関連した応答エレメントを認識するＤＮＡ−結合ドメイン；および
ｉｉｉ）置換突然変異を含むグループＨ核受容体リガンド結合ドメイン
を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、宿主細胞中で発現させることができる遺伝子発現カセットを含む遺伝子発現変調システム。
【請求項２】
さらに、脊椎動物レチノイドＸ受容体リガンド結合ドメイン、無脊椎動物レチノイドＸ受容体リガンド結合ドメイン、ウルトラスピラクル蛋白質リガンド結合ドメイン、および２つのポリペプチド断片（ここで、第１のポリペプチド断片は脊椎動物レチノイドＸ受容体リガンド結合ドメイン、無脊椎動物レチノイドＸ受容体リガンド結合ドメイン、またはウルトラスピラクル蛋白質リガンド結合ドメインからのものであり、第２のポリペプチド断片は異なる脊椎動物レチノイドＸ受容体リガンド結合ドメイン、無脊椎動物レチノイドＸ受容体リガンド結合ドメイン、またはウルトラスピラクル蛋白質リガンド結合ドメインからのものである）を含むキメラリガンド結合ドメインよりなる群から選択される第２の核受容体リガンド結合ドメインを含む請求項１に記載の遺伝子発現変調システム。
【請求項３】
ａ）ｉ）その発現を変調すべき遺伝子と関連した応答エレメントを認識するＤＮＡ−結合ドメイン；および
ｉｉ）核受容体リガンド結合ドメイン
を含む第１のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、宿主細胞中で発現させることができる第１の遺伝子発現カセット：および
ｂ）ｉ）トランス活性化ドメイン；および
ｉｉ）核受容体リガンド結合ドメイン
を含む第２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、宿主細胞中で発現させることができる第２の遺伝子発現カセット
を含み、核受容体リガンド結合ドメインのうちの１つは、置換突然変異を含むグループＨ核受容体リガンド結合ドメインであることを特徴とする遺伝子発現変調システム。
【請求項４】
該グループＨ核受容体リガンド結合ドメインがエクジソン受容体、ユビキタス受容体、オーファン受容体１、ＮＥＲ−１、ステロイドホルモン核受容体１、レチノイドＸ受容体相互作用蛋白質−１５、肝臓Ｘ受容体β、ステロイドホルモン受容体様蛋白質、肝臓Ｘ受容体、肝臓Ｘ受容体α、ファルネソイドＸ受容体、受容体相互作用蛋白質１４、およびファルネゾール受容体よりなる群から選択されるグループＨ核受容体からのものである請求項１または３に記載の遺伝子発現変調システム。
【請求項５】
該グループＨ核受容体リガンド結合ドメインが、アミノ酸残基の置換をもたらすコドン突然変異を含むポリヌクレオチドによってコードされ、該アミノ酸残基はａ）配列番号：１のアミノ酸残基２０、２１、４８、５１、５２、５５、５８、５９、６１、６２、９２、９３、９５、９６、１０７、１０９、１１０、１２０、１２３、１２５、１７５、２１８、２１９、２２３、２３０、２３４または２３８、ｂ）配列番号：１のアミノ酸残基９５および１１０、ｃ）配列番号：１のアミノ酸残基２１８および２１９、ｄ）配列番号：１のアミノ酸残基１０７および１７５、ｅ）配列番号：１のアミノ酸残基１２７および１７５、ｆ）配列番号：１のアミノ酸残基１０７および１２７、ｇ）アミノ酸残基１０７、１２７および１７５、ｈ）配列番号：１のアミノ酸残基５２、１０７および１７５、ｉ）配列番号：１のアミノ酸残基９６、１０７および１７５、ｊ）配列番号：１のアミノ酸残基１０７、１１０および１７５、ｋ）配列番号：２のアミノ酸残基１０７、１２１、２１３または２１７、あるいはｌ）配列番号：３のアミノ酸残基９１もしくは１０５、と同等または類似の位置におけるものである請求項４に記載の遺伝子発現変調システム。
【請求項６】
置換突然変異を含むグループＨ核受容体リガンド結合ドメインがエクジソン受容体リガンド結合ドメインである請求項５に記載の遺伝子発現変調システム。
【請求項７】
置換突然変異がａ）配列番号：１のＥ２０Ａ、Ｑ２１Ａ、Ｆ４８Ａ、Ｉ５１Ａ、Ｔ５２Ａ、Ｔ５２Ｖ、Ｔ５２Ｉ、Ｔ５２Ｌ、Ｔ５５Ａ、Ｔ５８Ａ、Ｖ５９Ａ、Ｌ６１Ａ、Ｉ６２Ａ、Ｍ９２Ａ、Ｍ９３Ａ、Ｒ９５Ａ、Ｖ９６Ａ、Ｖ９６Ｔ、Ｖ９６Ｄ、Ｖ９６Ｍ、Ｖ１０７Ｉ、Ｆ１０９Ａ、Ａ１１０Ｐ、Ａ１１０Ｓ、Ａ１１０Ｍ、Ａ１１０Ｌ、Ｙ１２０Ａ、Ａ１２３Ｆ、Ｍ１２５Ａ、Ｒ１７５Ｅ、Ｍ２１８Ａ、Ｃ２１９Ａ、Ｌ２２３Ａ、Ｌ２３０Ａ、Ｌ２３４Ａ、Ｗ２３８Ａ、Ｒ９５Ａ／Ａ１１０Ｐ、Ｍ２１８Ａ／Ｃ２１９Ａ、Ｖ１０７Ｉ／Ｒ１７５Ｅ、Ｙ１２７Ｅ／Ｒ１７５Ｅ、Ｖ１０７Ｉ／Ｙ１２７Ｅ、Ｖ１０７Ｉ／Ｙ１２７Ｅ／Ｒ１７５Ｅ、Ｔ５２Ｖ／Ｖ１０７Ｉ／Ｒ１７５Ｅ、Ｖ９６Ａ／Ｖ１０７Ｉ／Ｒ１７５Ｅ、Ｔ５２Ａ／Ｖ１０７Ｉ／Ｒ１７５Ｅ、Ｖ９６Ｔ／Ｖ１０７Ｉ／Ｒ１７５ＥまたはＶ１０７Ｉ／Ａ１１０Ｐ／Ｒ１７５Ｅ置換突然変異、ｂ）配列番号：２のＡ１０７Ｐ、Ｇ１２１Ｒ、Ｇ１２１Ｌ、Ｎ２１３Ａ、Ｃ２１７ＡまたはＣ２１７Ｓ置換突然変異、およびｃ）配列番号：３のＧ９１ＡまたはＡ１０５Ｐ置換突然変異よりなる群から選択される請求項６に記載の遺伝子発現変調システム。
【請求項８】
該ＤＮＡ−結合ドメインがエクジソン受容体ＤＮＡ−結合ドメイン、ＧＡＬ４ ＤＮＡ−結合ドメイン、およびＬｅｘＡ ＤＮＡ−結合ドメインよりなる群から選択される請求項１または３に記載の遺伝子発現変調システム。
【請求項９】
トランス活性化ドメインがエクジソン受容体トランス活性化ドメイン、ＶＰ１６トランス活性化ドメイン、Ｂ４２酸性アクチベータトランス活性化ドメイン、およびｐ６５トランス活性化ドメインよりなる群から選択される請求項１または３に記載の遺伝子発現変調システム。
【請求項１０】
ａ）トランス活性化ドメイン、ＤＮＡ−結合ドメイン、および置換突然変異を含むグループＨ核受容体リガンド結合ドメインを含むポリペプチド、
ｂ）ＤＮＡ−結合ドメイン、および置換突然変異を含むグループＨ核受容体リガンド結合ドメインを含むポリペプチド、および
ｃ）トランス活性化ドメイン、および置換突然変異を含むグループＨ核受容体リガンド結合ドメインを含むポリペプチド
よりなる群から選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子発現カセット。
【請求項１１】
置換突然変異を含むグループＨ核受容体リガンド結合ドメインをコードする単離されたポリヌクレオチドであって、ａ）配列番号：１のアミノ酸残基２０、２１、４８、５１、５２、５５、５８、５９、６１、６２、９２、９３、９５、９６、１０７、１０９、１１０、１２０、１２３、１２５、１７５、２１８、２１９、２２３、２３０、２３４または２３８、ｂ）配列番号：１のアミノ酸残基９５および１１０、ｃ）配列番号：１のアミノ酸残基２１８および２１９、ｄ）配列番号：１のアミノ酸残基１０７および１７５、ｅ）配列番号：１のアミノ酸残基１２７および１７５、ｆ）配列番号：１のアミノ酸残基１０７および１２７、ｇ）配列番号：１のアミノ酸残基１０７、１２７および１７５、ｈ）配列番号：１のアミノ酸残基５２、１０７および１７５、ｉ）配列番号：１のアミノ酸残基９６、１０７および１７５、ｊ）配列番号：１のアミノ酸残基１０７、１１０および１７５、ｋ）配列番号；２のアミノ酸残基１０７、１２１、２１３または２１７、あるいはｌ）配列番号：３のアミノ酸残基９１もしくは１０５、と同等または類似の位置におけるアミノ酸残基の置換をもたらすコドン突然変異を含む単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１２】
該コドン突然変異がａ）配列番号：１のＥ２０Ａ、Ｑ２１Ａ、Ｆ４８Ａ、Ｉ５１Ａ、Ｔ５２Ａ、Ｔ５２Ｖ、Ｔ５２Ｉ、Ｔ５２Ｌ、Ｔ５５Ａ、Ｔ５８Ａ、Ｖ５９Ａ、Ｌ６１Ａ、Ｉ６２Ａ、Ｍ９２Ａ、Ｍ９３Ａ、Ｒ９５Ａ、Ｖ９６Ａ、Ｖ９６Ｔ、Ｖ９６Ｄ、Ｖ９６Ｍ、Ｖ１０７Ｉ、Ｆ１０９Ａ、Ａ１１０Ｐ、Ａ１１０Ｓ、Ａ１１０Ｍ、Ａ１１０Ｌ、Ｙ１２０Ａ、Ａ１２３Ｆ、Ｍ１２５Ａ、Ｒ１７５Ｅ、Ｍ２１８Ａ、Ｃ２１９Ａ、Ｌ２２３Ａ、Ｌ２３０Ａ、Ｌ２３４Ａ、Ｗ２３８Ａ、Ｒ９５Ａ／Ａ１１０Ｐ、Ｍ２１８Ａ／Ｃ２１９Ａ、Ｖ１０７Ｉ／Ｒ１７５Ｅ、Ｙ１２７Ｅ／Ｒ１７５Ｅ、Ｖ１０７Ｉ／Ｙ１２７Ｅ、Ｖ１０７Ｉ／Ｙ１２７Ｅ／Ｒ１７５Ｅ、Ｔ５２Ｖ／Ｖ１０７Ｉ／Ｒ１７５Ｅ、Ｖ９６Ａ／Ｖ１０７Ｉ／Ｒ１７５Ｅ、Ｔ５２Ａ／Ｖ１０７Ｉ／Ｒ１７５Ｅ、Ｖ９６Ｔ／Ｖ１０７Ｉ／Ｒ１７５ＥまたはＶ１０７Ｉ／Ａ１１０Ｐ／Ｒ１７５Ｅ置換突然変異、ｂ）配列番号：２のＡ１０７Ｐ、Ｇ１２１Ｒ、Ｇ１２１Ｌ、Ｎ２１３Ａ、Ｃ２１７ＡまたはＣ２１７Ｓ置換突然変異、およびｃ）配列番号：３のＧ９１ＡまたはＡ１０５Ｐ置換突然変異よりなる群から選択される置換突然変異をもたらす請求項１１に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１３】
置換突然変異を含むエクジソン受容体リガンド結合ドメインをコードする単離されたポリヌクレオチドであって、該エクジソン受容体リガンド結合ドメインがエクジソン結合活性を欠き、置換突然変異がａ）配列番号：１のアミノ酸５８または１１０、ｂ）配列番号；１のアミノ酸１０７、１１０および１７５、ｃ）配列番号：２の１０７、またはｄ）配列番号：３の１０５、と同等または類似のアミノ酸位置におけるものである単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１４】
置換突然変異がａ）配列番号：１のＴ５８Ａ、Ａ１１０Ｐ、Ａ１１０Ｌ、Ａ１１０Ｓ、Ａ１１０ＭまたはＶ１０７Ｉ／Ａ１１０Ｐ／Ｒ１７５Ｅ、ｂ）配列番号：２のＡ１０７Ｐ、およびｃ）配列番号：３のＡ１０５Ｐよりなる群から選択される請求項１３に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１５】
置換突然変異を含むエクジソン受容体リガンド結合ドメインをコードする単離されたポリヌクレオチドであって、エクジソン受容体リガンド結合ドメインがステロイド結合活性を欠き、さらにエクジソン受容体リガンド結合ドメインをコードするポリヌクレオチドが、少なくとも３７℃における５００ｍＭ未満の塩でのハイブリダイゼーション工程、および少なくとも６３℃における２×ＳＳＰＥでの洗浄工程を含むハイブリダイゼーション条件下で、ａ）配列番号：１のＴ５８Ａ、Ａ１１０Ｐ、Ａ１１０Ｌ、Ａ１１０Ｓ、Ａ１１０ＭまたはＶ１０７Ｉ／Ａ１１０Ｐ／Ｒ１７５Ｅ置換突然変異、ｂ）配列番号：２のＡ１０７Ｐ、Ｇ１２１Ｒ、Ｇ１２１Ｌ、Ｎ２１３Ａ、Ｃ２１７ＡまたはＣ２１７Ｓ置換突然変異、およびｃ）配列番号：３のＡ１０５Ｐ置換突然変異よりなる群から選択される置換突然変異をもたらすコドン突然変異を含むポリヌクレオチドにハイブリダイズする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１６】
転写調節エレメントに作動可能に連結した請求項１１に記載の単離されたポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項１７】
該転写調節エレメントが宿主細胞中で作動する請求項１６に記載の発現ベクターを含む単離された宿主細胞。
【請求項１８】
請求項１１に記載の単離されたポリヌクレオチドによってコードされる単離されたポリペプチド。
【請求項１９】
置換突然変異を含むグループＨ核受容体リガンド結合ドメインを含む単離されたポリペプチドであって、該置換突然変異がａ）配列番号：１のアミノ酸残基２０、２１、４８、５１、５２、５５、５８、５９、６１、６２、９２、９３、９５、９６、１０７、１０９、１１０、１２０、１２３、１２５、１７５、２１８、２１９、２２３、２３０、２３４または２３８、ｂ）配列番号：１のアミノ酸残基９５および１１０、ｃ）配列番号：１のアミノ酸残基２１８および２１９、ｄ）配列番号：１のアミノ酸残基１０７および１７５、ｅ）配列番号：１のアミノ酸残基、１２７および１７５、ｆ）配列番号：１のアミノ酸残基１０７および１２７、ｇ）配列番号：１のアミノ酸残基１０７、１２７および１７５、ｈ）配列番号：１のアミノ酸残基５２、１０７および１７５、ｉ）配列番号：１のアミノ酸残基９６、１０７および１７５、ｊ）配列番号：１のアミノ酸残基１０７、１１０および１７５、ｋ）配列番号；２のアミノ酸残基１０７、１２１、２１３または２１７、あるいはｌ）配列番号：３のアミノ酸残基９１もしくは１０５、と同等または類似の位置におけるものである単離されたポリペプチド。
【請求項２０】
該置換突然変異がａ）配列番号：１のＥ２０Ａ、Ｑ２１Ａ、Ｆ４８Ａ、Ｉ５１Ａ、Ｔ５２Ａ、Ｔ５２Ｖ、Ｔ５２Ｉ、Ｔ５２Ｌ、Ｔ５５Ａ、Ｔ５８Ａ、Ｖ５９Ａ、Ｌ６１Ａ、Ｉ６２Ａ、Ｍ９２Ａ、Ｍ９３Ａ、Ｒ９５Ａ、Ｖ９６Ａ、Ｖ９６Ｔ、Ｖ９６Ｄ、Ｖ９６Ｍ、Ｖ１０７Ｉ、Ｆ１０９Ａ、Ａ１１０Ｐ、Ａ１１０Ｓ、Ａ１１０Ｍ、Ａ１１０Ｌ、Ｙ１２０Ａ、Ａ１２３Ｆ、Ｍ１２５Ａ、Ｒ１７５Ｅ、Ｍ２１８Ａ、Ｃ２１９Ａ、Ｌ２２３Ａ、Ｌ２３０Ａ、Ｌ２３４Ａ、Ｗ２３８Ａ、Ｒ９５Ａ／Ａ１１０Ｐ、Ｍ２１８Ａ／Ｃ２１９Ａ、Ｖ１０７Ｉ／Ｒ１７５Ｅ、Ｙ１２７Ｅ／Ｒ１７５Ｅ、Ｖ１０７Ｉ／Ｙ１２７Ｅ、Ｖ１０７Ｉ／Ｙ１２７Ｅ／Ｒ１７５Ｅ、Ｔ５２Ｖ／Ｖ１０７Ｉ／Ｒ１７５Ｅ、Ｖ９６Ａ／Ｖ１０７Ｉ／Ｒ１７５Ｅ、Ｔ５２Ａ／Ｖ１０７Ｉ／Ｒ１７５Ｅ、Ｖ９６Ｔ／Ｖ１０７Ｉ／Ｒ１７５ＥまたはＶ１０７Ｉ／Ａ１１０Ｐ／Ｒ１７５Ｅ置換突然変異、ｂ）配列番号：２のＡ１０７Ｐ、Ｇ１２１Ｒ、Ｇ１２１Ｌ、Ｎ２１３Ａ、Ｃ２１７ＡまたはＣ２１７Ｓ置換突然変異、およびｃ）配列番号：３のＧ９１ＡまたはＡ１０５Ｐ置換突然変異よりなる群から選択される請求項１９に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項２１】
ａ）請求項１または３に記載の遺伝子発現変調システムを宿主細胞に導入し；さらに、
ｂ）宿主細胞にリガンドを導入する；
工程を含み、
変調すべき遺伝子が：
ｉ）ＤＮＡ結合ドメインによって認識される応答エレメント；
ｉｉ）トランス活性化ドメインによって活性化されるプロモーター；および
ｉｉｉ）その発現が変調されるべき遺伝子
を含む遺伝子発現カセットの構成要素であり、
それにより、宿主細胞へのリガンドの導入に際して、ｂ）ｉｉｉ）の遺伝子の発現が変調されることを特徴とする、宿主細胞において遺伝子の発現を変調する方法。
【請求項２２】
該リガンドが、
ａ）式：
【化１】
（式中、Ｅは第三級炭素を含有する（Ｃ４−Ｃ６）アルキルまたは第三級炭素を含有するシアノ（Ｃ３−Ｃ５）アルキルであり；
Ｒ１はＨ、Ｍｅ、Ｅｔ、ｉ−Ｐｒ、Ｆ、ホルミル、ＣＦ３、ＣＨＦ２、ＣＨＣｌ２、ＣＨ２Ｆ、ＣＨ２Ｃｌ、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ２ＯＭｅ、ＣＨ２ＣＮ、ＣＮ、Ｃ０ＣＨ、１−プロピニル、２−プロピニル、ビニル、ＯＨ、ＯＭｅ、ＯＥｔ、シクロプロピル、ＣＦ２ＣＦ３、ＣＨ＝ＣＨＣＮ、アリル、アジド、ＳＣＮまたはＳＣＨＦ２であり；
Ｒ２はＨ、Ｍｅ、Ｅｔ、ｎ−Ｐｒ、ｉ−Ｐｒ、ホルミル、ＣＦ３、ＣＨＦ２、ＣＨＣｌ２、ＣＨ２Ｆ、ＣＨ２Ｃｌ、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ２ＯＭｅ、ＣＨ２ＣＮ、ＣＮ、Ｃ０ＣＨ、１−プロピニル、２−プロピニル、ビニル、Ａｃ、Ｆ、Ｃｌ、ＯＨ、ＯＭｅ、ＯＥｔ、Ｏ−ｎ−Ｐｒ、ＯＡｃ、ＮＭｅ２、ＮＥｔ２、ＳＭｅ、ＳＥｔ、ＳＯＣＦ３、ＯＣＦ２ＣＦ２Ｈ、ＣＯＥｔ、シクロプロピル、ＣＦ２ＣＦ３、ＣＨ＝ＣＨＣＮ、アリル、アジド、ＯＣＦ３、ＯＣＨＦ２、Ｏ−ｉ−Ｐｒ、ＳＣＮ、ＳＣＨＦ２、ＳＯＭｅ、ＮＨ−ＣＮであるか、またはＲ３、ならびにＲ２およびＲ３が結合したフェニル炭素と一緒になって、エチレンジオキシ、フェニル炭素に隣接した酸素を持つジヒドロフリル環、もしくはフェニル炭素に隣接した酸素を持つジヒドロピリル環を形成し；
Ｒ３はＨ、Ｅｔであるか、またはＲ２、ならびにＲ２およびＲ３が結合したフェニル炭素と一緒になって、エチレンジオキシ、フェニル炭素に隣接した酸素を持つジヒドロフリル環、もしくはフェニル炭素に隣接した酸素を持つジヒドロピリル環を形成し；
Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は独立してＨ、Ｍｅ、Ｅｔ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ホルミル、ＣＦ３、ＣＨＦ２、ＣＨＣｌ２、ＣＨ２Ｆ、ＣＨ２Ｃｌ、ＣＨ２ＯＨ、ＣＮ、Ｃ０ＣＨ、１−プロピニル、２−プロピニル、ビニル、ＯＭｅ、ＯＥｔ、ＳＭｅまたはＳＥｔである）
の化合物；または
ｂ）エクジソン、２０−ヒドロキシエクジソン、ポナステロンＡ、ムリステロンＡ、オキシステロール、２２（Ｒ）ヒドロキシコレステロール、２４（Ｓ）ヒドロキシコレステロール、２５−エポキシコレステロール、Ｔ０９０１３１７、５−アルファ−６−アルファ−エポキシコレステロール−３−スルフェート、７−ケトコレステロール−３−スルフェート、ファルネゾール、胆汁酸、１，１−ビスフォスフォネートエステル、または幼若ホルモンＩＩＩ
である請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
さらに、宿主細胞に第２のリガンドを導入することを含み、第２のリガンドが９−シス−レチノイン酸またはレチノイン酸の合成アナログである請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
請求項１または請求項３に記載の遺伝子発現変調システムを含む単離された宿主細胞。
【請求項２５】
請求項２４に記載の宿主細胞を含む非−ヒト生物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２００９−１０６２９６（Ｐ２００９−１０６２９６Ａ）
【公開日】平成２１年５月２１日（２００９．５．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−３０４２９３（Ｐ２００８−３０４２９３）
【出願日】平成２０年１１月２８日（２００８．１１．２８）
【分割の表示】特願２００２−５６６３１９（Ｐ２００２−５６６３１９）の分割
【原出願日】平成１４年２月２０日（２００２．２．２０）
【出願人】（５０６１１９０６２）イントレクソン・コーポレイション (8)
【氏名又は名称原語表記】Ｉｎｔｒｅｘｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年５月２１日（２００９．５．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１１月２８日（２００８．１１．２８）
【分割の表示】特願２００２−５６６３１９（Ｐ２００２−５６６３１９）の分割
【原出願日】平成１４年２月２０日（２００２．２．２０）
【出願人】（５０６１１９０６２）イントレクソン・コーポレイション (8)
【氏名又は名称原語表記】Ｉｎｔｒｅｘｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ
【Ｆターム（参考）】
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