昆虫細胞での外来タンパク質発現のための昆虫由来プロモーター
昆虫細胞での外来タンパク質発現のための昆虫由来プロモーター。幼虫の特定の発生段階で主要な昆虫タンパク質（ヘキサメリン）の発現を促進する調節ポリヌクレオチド配列を、昆虫（イラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ））から単離した。この調節ポリヌクレオチド配列は、従来のポリヘドリンプロモーターよりも強いバキュロウイルス系での外来遺伝子発現を促進する。更に、新しい幼虫由来プロモーターとｐＬプロモーターとの組合せは、バイオテクノロジー産業で使用される従来のバキュロウイルスに対してバキュロウイルス発現レベルを（感染時間に応じて）６１〜３７５％まで増加させる。プロモーターｐＢ２はまた、ポリヘドリンプロモーターよりも早い時点で遺伝子発現を促進するが、この特徴は正確なタンパク質フォールディングと翻訳後修飾のための大きな利点である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオテクノロジーの分野に含まれる。昆虫のヘキサメリンファミリー遺伝子に由来する調節ポリヌクレオチド配列（例えば、プロモーター）と、例えば、バキュロウイルス発現ベクターを用いた、昆虫細胞及び昆虫の幼虫での外来タンパク質発現のためのその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
バキュロウイルス−昆虫細胞発現系は、汎用性があり、（ネイティブと組換えの両方の）異種タンパク質を産生するために広く用いられている。この系は、任意のサイズの組換えタンパク質を産生するための最も強力でかつ汎用性のあるものの１つとして一般に認識されている。これは、２つの主な特徴、すなわち、高レベルのタンパク質発現が達成されることと、生体活性をもつようになるようタンパク質が正確にフォールディングされ、同時に哺乳動物細胞の主な翻訳後修飾が起こることとに基づく。更に、この系の発達時間は比較的短く、組換えウイルスの遺伝的安定性は非常に高い。
バキュロウイルスゲノムは、ポリヘドリンプロモーター（ｐＬ）（これは、高等生物で知られている最も強力なプロモーターである）及びプロモーターｐ１０（ｐ１０タンパク質）と呼ばれる２つの強力なプロモーターを含む。ｐＬプロモーターは、ほとんど全ての遺伝子の発現を制御するために使用することができる。タンパク質産生のためにバキュロウイルスを操作するのは、形質転換動物細胞またはトランスジェニック動物に基づく任意の他の高度な産生系よりもはるかに速くかつ安価である。
【０００３】
それにもかかわらず、これまでの市販のプロモーターには、極後期に遺伝子発現を促進することなどの不利な点がいくつかある。その時点で、細胞機構は大きく影響を受けていて、その結果、不完全なプロセッシングや凝集のために、昆虫細胞で発現される異種タンパク質の産出量が減る可能性がある。これらの制約は、ウイルス感染が進むにつれて、宿主細胞因子が劣化することによる可能性がある。
この問題を解決するために、本発明では、宿主細胞悪化の効果を弱め、同時に異種タンパク質の高い発現レベルを達成するための非常に興味深い選択肢として、ポリヘドリンプロモーターと少なくとも同じ程度に強力な初期プロモーターを安定発現とともに使用することを提案する。本発明は、幼虫（未成熟）形態から成虫（成熟）形態への移行が、様々な組織におけるいくつかの遺伝子の活性化と抑制によって達成される（昆虫変態発生）という事実に対する注意を喚起することを望むものである。
【０００４】
変態関連タンパク質の中に、終齢期に非常に高いレベルで発現されるヘキサメリンとして知られるファミリーがある。これらのタンパク質は、大部分は、後幼生発生期に使用される血リンパ貯蔵タンパク質である。ヘキサメリンの最大レベルは、５齢の最初の４８時間に認められ、このレベルは、この期間の後、約４倍に増える（図１）。上述の幼虫タンパク質のファミリーをコードする配列から出発して、外来タンパク質発現に使用されるプロモーターのファミリーが本発明で開発される。そのため、本発明は、当該技術水準で使用されるプロモーターと比較してより初期の、かつより強力なプロモーターであるｐＢ１（配列番号１）及びｐＢ２（配列番号２）を提供する。
特定の幼虫発達段階で主要な昆虫タンパク質の発現を促進し得るプロモーターが、本発明で単離される。これらは、幼虫のタンパク質ヘキサメリンをコードする配列に由来していて、いくつかの昆虫細胞、好ましくはヨウトガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）由来のｓｆ９またはｓｆ２１細胞で異種タンパク質を発現させるための任意の発現ベクター（例えば、バキュロウイルス発現ベクター）を構築するために使用し得る。これらの新しいプロモーターを構成する調節配列と同様の調節配列が鱗翅目の幼虫で既に特徴付けされているが、バキュロウイルス発現系で使用されたことはこれまで一度もない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｉｌ’ｉｃｈｅｖ ＡＡ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｋａ．１９８７ ２３：１９７−２０１；Ｋａｙ Ｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９８７ Ｊｕｎ ５；２３６（４８０６）：１２９９−１３０２
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、ヘキサメリンファミリー遺伝子発現を調節する配列に由来する、ｐＢ１（配列番号１）及び／またはｐＢ２（配列番号２）などの、調節ポリヌクレオチド配列を提供する。これらのタンパク質は５齢期に最大発現を示すが、発現の割合は、この幼虫発生期の最初の４８時間を過ぎた後に非常に高く、これは、このタンパク質が短期間に非常に速やかに蓄積されることを示している（図１）。これらの特徴は、これらのタンパク質の発現が、より効率的なバキュロウイルスまたは任意の他の発現ベクターを作製するために、異種タンパク質の発現を最適化するために使用し得る強力なプロモーターによって促進されることを示唆する。バキュロウイルス発現系の場合、より初期のプロモーター活性は、分泌経路に局在化されるタンパク質の場合に特に重要であり、これらのタンパク質は、より初期のプロモーター活性がなければ、バキュロウイルス感染の非常に遅い段階で細胞の翻訳後修飾機構と分泌経路の両方の変化によって影響を受ける可能性がある。
【０００７】
本発明のプロモーターの配列は、ヘキサメリンファミリー遺伝子（ＢＪＨＳＰ１及びＢＪＨＳＰ２）発現を調節する配列に由来するが、このヘキサメリンファミリー遺伝子のもとの調節ヌクレオチド配列には含まれないいくつかの突然変異を有する。このヘキサメリンは、イラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ）（Ｔ．ｎｉ）の幼虫から単離され、マススペクトロメトリー分析によって８０ＫＤａのバンドとして同定された（図２）。
タンパク質が同定された後すぐに、これらをコードする遺伝子及びそのそれぞれのプロモーターを含む上流配列が単離された。各々のもとのプロモーターを増幅するために使用されるプライマーを明記する。配列番号３及び４によって特徴付けられるプライマーは、もとのプロモーター（これは、最終的にはプロモーターｐＢ１（配列番号１）に帰する）を増幅するために使用された。配列番号５及び６によって特徴付けられるプライマーは、もとのプロモーター（これは、最終的にはプロモーターｐＢ２に帰する）を増幅するために使用された。
【０００８】
本発明のプロモーター、特にｐＢ２の主な利点は、今日バキュロウイルス発現系で使用されている既知の極後期プロモーターと比較したときに、それがより初期の、かつより強力な目的のタンパク質の発現をもたらすということである。
【０００９】
好ましい一実施形態では、本発明は、本発明のプロモーターｐＢ１及びｐＢ２（好ましくはｐＢ２）と任意の他のプロモーター、例えば、ｐＬまたはｐ１０（好ましくはｐＬ）との組合せも含む。驚くべきことに、このような組合せを行なったとき、相乗効果が得られた。ｐＬｐＢ２プロモーターを含むバキュロウイルス発現ベクターを試験したとき、目的のタンパク質の発現レベルは、ｐＬプロモーターのみの使用に対して（感染時間に応じて）６１〜３７５％まで増加した。今日一般に、プロモーターｐＬがバイオテクノロジー産業で使用されているので、この実施形態は、本発明の目的のために非常に重要である。
【００１０】
他の実施形態では、本発明は、本発明のプロモーター（ｐＢ１及びｐＢ２）の組合せ、すなわち、ｐＢ１−ｐＢ１、ｐＢ２−ｐＢ２及びｐＢ１−ｐＢ２に関する。
【００１１】
哺乳動物細胞では、本発明のプロモーターの活性が検出されなかった。そこで、本発明は、組換えバキュロウイルスの開発のための２つの安全なプロモーターを提供するものでもある。
【００１２】
従って、本発明は、当該技術水準に含まれるものよりも効果的な調節ポリヌクレオチド配列（プロモーター）を、ヘキサメリンファミリータンパク質をコードする遺伝子のオープンリーディングフレームの上流にある任意のポリヌクレオチド配列から得ることができることを明らかにするものである（発明を実施するための形態を参照）。それゆえ、ヘキサメリンファミリータンパク質をコードする遺伝子のオープンリーディングフレームの上流にある任意のポリヌクレオチド配列に由来する任意の調節ポリヌクレオチド配列が本発明に含まれる。
【００１３】
本発明の目的のためだけに、以下の用語を定義する：
・調節ポリヌクレオチド配列：遺伝子の転写を可能にする通常は遺伝子の（センス鎖の５’領域に向かって）上流にあるＤＮＡの領域である。
・ベクター発現：細胞内部に外因性の遺伝物質を移すために使用される「媒体」。このベクターは、クローニングされた遺伝子（１つまたは複数）の転写や翻訳の促進、そしてＤＮＡの転写やクローニングのために必要な調節配列を含む。バキュロウイルス発現ベクターは本発明で好ましく使用された。
・バキュロウイルス：主に昆虫や節足動物に感染する、無脊椎動物の感染性ウイルスのファミリーである。
・組換えＤＮＡ：１以上のＤＮＡ鎖を組み合わせるかまたは挿入し、それにより、通常は一緒に存在しないＤＮＡを組み合わせることによって人為的に作製された人工ＤＮＡの一形態である。組換えＤＮＡは、関連するＤＮＡを既存の生物ゲノムに付加することによって産生される。
・組換えタンパク質：組換えＤＮＡによってコードされるタンパク質。
・初期発現：プロモーターが目的のタンパク質を発現し始める時間を指す。本発明では、この時間は、感染後１６時間から始まる。
・より強力な発現：従来のバキュロウイルスプロモーターｐ１０またはｐＬによって達成される発現のレベルと比較して同等かまたはより高いレベルでの任意の目的のタンパク質の発現を指す。
・目的のタンパク質：ヒトや動物の利益のために使用することができ、かつ産業上、商業上または治療上の用途を有し得るタンパク質。
・生物工場：治療目的を含むいくつかの用途を有する産業的規模の割合のタンパク質（阻害剤、酵素、抗体、抗原など）または商業目的の主産物もしくは副産物を産生することができる、遺伝子改変されているかまたは遺伝子改変されていない、細胞または生物。
・部分断片：本発明の調節ポリヌクレオチド配列に由来し、当該技術分野に含まれるものと比較してより初期及びより強力という同じ改善された特性を有する任意の部分断片を指す。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】イラクサギンウワバ幼虫の最初の４つの発達段階において、以下でヘキサメリンと同定される８０ｋＤａバンドが存在しないこと（Ａ）と、２日後の第５幼虫齢でそれが存在すること（Ｂ）とを示す写真。（Ｃ）は、第５幼虫齢の最初の６日間のこのバンドのデンシトメトリー定量を示すグラフ。
【図２】８０ＫＤａのバンドのマススペクトロメトリー分析による同定のスキーム図。
【図３】プロモーター配列のｐＢ１もしくはｐＢ２のみまたはｐＬ配列と組み合わせたｐＢ２（ｐＬｐＢ２）を担持する作製された発現ベクターの説明図。
【図４】様々な時点で組換えバキュロウイルスを感染させた後、様々なプロモーター（ｐＢ１、ｐＢ２、ｐＬ及びｐＬｐＢ２）の制御下で緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現する昆虫ｓｆ２１細胞及び昆虫の幼虫、並びに、感染７２時間後の幼虫の写真。
【図５】バキュロウイルスベクターに挿入された様々なプロモーター（ｐＢ１、ｐＢ２、ｐＬ及びｐＬｐＢ２）を感染後の様々な時点（１６〜７２時間）で使用することにより、かつウェスタンブロットにより検出されたＧＦＰの発現を示す写真（Ａ）。組換えタンパク質を定量した、ＧＦＰバンドのデンシトメトリーのグラフ（Ｂ）、または細胞抽出物のフルオロメトリーのグラフ（Ｃ）。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、配列番号１及び配列番号２によってそれぞれ特徴付けられ、かつ昆虫の幼虫のヘキサメリンファミリータンパク質をコードする遺伝子のオープンリーディングフレームの上流にあるポリヌクレオチド配列に由来する、プロモーターｐＢ１及びｐＢ２などの、調節ポリヌクレオチド配列を提供する。
本発明は更に、バキュロウイルスなどの昆虫発現ベクターを構築するための及び細胞、好ましくは昆虫細胞で異種タンパク質を発現させるためのそのような調節ポリヌクレオチド配列の使用に言及するものである。
プロモーターｐＢ１及びｐＢ２の配列は、それぞれ、イラクサギンウワバのヘキサメリンＢＪＨＳＰ１及びＢＪＨＳＰ２に由来し、これらのヘキサメリンは、５齢期に最高レベルで発現し、この時期の最初の４８時間に非常に高い転写活性を有する（図１）。
【００１６】
ｐＢ１配列は１０５７ヌクレオチド（配列番号１）で構成され、幼若ホルモンで抑制される塩基性タンパク質１であるＢＪＨＳＰ１タンパク質をコードする遺伝子の開始コドンの上流の５’領域に由来する。この配列を、２つの特異的プライマー：配列番号３及び配列番号４を用いてイラクサギンウワバのゲノムＤＮＡから増幅した。その後、この断片を市販ベクターのｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）にクローニングした。
【００１７】
ｐＢ２配列は１０４１ヌクレオチド（配列番号２）で構成され、幼若ホルモンで抑制される塩基性タンパク質２であるＢＪＨＳＰ２タンパク質をコードする遺伝子の開始コドンの上流の５’領域に由来する。この配列を、２つの特異的プライマー：配列番号５及び配列番号６を用いてイラクサギンウワバのゲノムＤＮＡから増幅した。その後、この断片を市販ベクターのｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）にクローニングした。
【００１８】
ｐＢ１配列とｐＢ２配列をＢａｍＨＩ酵素とＳｐｈＩ酵素を用いてｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙから抜き出し、市販プラスミドのｐＦａｓＴＢａｃデュアル（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）中のこれらの部位にクローニングした。記載した酵素で開環されたこのｐＦａｓＴＢａｃデュアルベクターからは、バキュロウイルスプロモーター配列が除去されている（得られたベクターをｐＦＢｐＢ１及びｐＦＢｐＢ２と名付けた）。
これらの得られたベクターは全て、目的のｃＤＮＡを導入するためのクローニング部位を提供する。これらを用いて、昆虫細胞や昆虫の幼虫に感染しかつそれらの中で複製することができる組換えバキュロウイルスを作製した。
更に、制限酵素のＮｏｔＩとＰｓｔＩ（両制限部位ともｐＧｅｍＴ ｅａｓｙベクターに由来する）で消化することによってｐＢ２配列を抜き出し、市販ベクターのｐＦａｓＴＢａｃ１（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）中の、ｐＬプロモーター配列の後ろにある同じ部位にクローニングした。得られたベクターをｐＦＢｐＬｐＢ２と名付けた。
【００１９】
それゆえ、本発明の第１の実施形態は、発現調節ポリヌクレオチド配列：配列番号１（ｐＢ１）及び配列番号２（ｐＢ２）を開発するための方法に言及するものである。この方法は、ヘキサメリンファミリータンパク質をコードする遺伝子のオープンリーディングフレームの上流にある任意のポリヌクレオチド配列の単離を含む。調節ポリヌクレオチド配列の配列が決定された後すぐに、それらは常法によって増幅された。
【００２０】
本発明の好ましい一実施形態では、ヘキサメリンのオープンリーディングフレームの上流ポリヌクレオチド配列は、昆虫、好ましくはイラクサギンウワバに属する。
【００２１】
本発明の第２の実施形態は、調節ポリヌクレオチド配列：配列番号１（ｐＢ１）、配列番号２（ｐＢ２）、またはヘキサメリンファミリータンパク質をコードする遺伝子のオープンリーディングフレームの上流にある任意の調節ヌクレオチド領域に由来する任意の配列を含むことを特徴とする、任意のその部分断片に言及するものである。これらのプロモーター配列は、転写活性の調節に関与する調節ＤＮＡモチーフを示す。それゆえ、これらの配列は、幼虫発生期にホルモンにより調節され得るが、他のシグナルにより、そして、発現ベクターとの関連では細胞培養物において調節される可能性もある。
【００２２】
好ましい一実施形態では、本発明の調節ポリヌクレオチド配列：配列番号１（ｐＢ１）及び配列番号２（ｐＢ２）を任意の他の調節ポリヌクレオチド配列、好ましくはプロモーターｐＬ（タンパク質ポリヘドリンのプロモーター）またはｐ１０（タンパク質ｐ１０のプロモーター）と組み合わせて、様々な組合せ：ｐＬｐＢ２、ｐＬｐＢ１、ｐ１０ｐＢ２及びｐ１０ｐＢ１を生じさせる。本発明は、ｐＬ配列（ポリヘドリンプロモーター）をｐＢ２配列と組み合わせたときに、非常に強力なプロモーター配列を提供する。
【００２３】
他の好ましい実施形態では、本発明の調節ポリヌクレオチド配列：配列番号１（ｐＢ１）及び配列番号２（ｐＢ２）をそれら同士と組み合わせて、様々な組合せ：ｐＢ１ｐＢ２、ｐＢ１ｐＢ１（少なくとも２回反復したもの）及びｐＢ２ｐＢ２（少なくとも２回反復したもの）を生じさせる。タンデムに置かれたプロモーターが、細菌や植物における組換えタンパク質発現の効率を増加させることが示されている（非特許文献１）。
【００２４】
本発明の第３の実施形態は、発現ベクター、好ましくはバキュロウイルスまたはプラスミドを構築するための上述の調節ポリヌクレオチド配列のいずれかの使用に言及するものである。
【００２５】
本発明の第４の実施形態は、上で説明した調節ポリヌクレオチド配列のいずれかと、少なくとも目的のタンパク質をコードする配列とを含むことを特徴とする発現ベクターに言及するものである。好ましい一実施形態では、ベクターは、バキュロウイルスまたはプラスミドである。
【００２６】
本発明の第５の実施形態は、発現ベクターにより形質転換されたか、トランスフェクトされたか、または先の段落で記載されたベクターとして使用された組換えウイルスに感染させられた細胞に言及するものである。好ましい一実施形態では、細胞は昆虫細胞、好ましくは、ヨウトガ由来のｓｆ９またはｓｆ２１である。
【００２７】
本発明の第６の実施形態は、上述の発現ベクターで形質転換されたか、トランスフェクトされたか、または感染させられた昆虫の幼虫に言及するものである。
【００２８】
本発明の第７の実施形態は、上述の発現ベクターを用いて昆虫細胞または昆虫の幼虫の中で組換えタンパク質を産生するための方法と、常法による目的の組換えタンパク質の抽出及び精製とに言及するものである。
【００２９】
本発明の第８の実施形態は、組換えタンパク質を産生するためのこの発現ベクターの使用に言及するものである。
【００３０】
本発明の第９の実施形態は、組換えタンパク質を産生するためのこの細胞の使用に言及するものである。
【００３１】
本発明の最後の実施形態は、組換えタンパク質を産生するための生物工場としてのこの昆虫の幼虫の使用に言及するものである。
【００３２】
ブダペスト条約に準じた微生物の寄託；
プラスミドは、２００８年７月２日付けで、受託番号ＣＥＣＴ ７４３１として、スペイン、バレンシア大学のスペイン微生物株保護機関（Ｓｐａｎｉｓｈ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＣＥＣＴ）に寄託された。
【実施例】
【００３３】
本発明は、以下の実施例により詳しく説明されるが、その範囲に限定されず、本発明の趣旨を逸脱することなく、他の実施形態、修正形態及びそれらの等価物を使用することができ、これらはこの説明によって当業者に示唆され得る。
【００３４】
本発明の実施例は、従来のプロモーターを使用した場合と比較して、タンパク質発現が、感染後のより早い時点で起こることを示している。更に、ｐＢ２及びｐＬｐＢ２というプロモーター配列の場合、発現レベルは、感染後の早い時点と遅い時点の両方で、当該技術水準（プロモーターｐＬ）で達成されるものと比較してより高かった。
【００３５】
実施例１：
緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）が、本発明の昆虫プロモーターにより発現される。
ＧＦＰのクローニング
ＳｐｈＩ制限酵素によってｐＦＢｐＬＧＦＰプラスミドから抜き出されたＧＦＰをｐＦＢｐＢ１またはｐＦＢｐＢ２プラスミドのＳｐｈＩ制限部位にクローニングした。得られたドナー発現プラスミドは、それぞれ、ｐＦＢｐＢ１ＧＦＰ及びｐＦＢｐＢ２ＧＦＰと命名された。全ての場合において、ｐＬ配列が取り除かれていたので、ＧＦＰ発現は、様々な昆虫プロモーターそれ自体の活性のみによるものであった（図３）。
【００３６】
他方、ＮｏｔＩ制限部位とＰｓｔＩ制限部位が両側にあるｐＢ２プロモーターを、これも同じ制限酵素で開環されたｐＦＢｐＬＧＦＰに連結した。得られたドナー発現プラスミドはｐＦＢｐＬｐＢ２ＧＦＰと命名され、ｐＬ及びｐＢ２という２つのプロモーターの制御下にＧＦＰコード遺伝子を含んでいた（図３）。
【００３７】
ＧＦＰ−バキュロウイルス発現ベクターの構築
得られたプラスミドを自動配列決定で特徴付けし、製造元の指示に従ってＢａｃ−ｔｏ−Ｂａｃ（登録商標）バキュロウイルス発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）を用いて、組換えバキュロウイルスＢａｃｐＢ２ＧＦＰ、ＢａｃｐＢ１ＧＦＰ及びＢａｃｐＬｐＢ２ＧＦＰを作製するために使用した。簡潔に述べると、得られたドナー発現プラスミドを用いて、ＤＨ１０Ｂａｃ（商標）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を形質転換し、転移によって組換えバックミドに移した。各バックミド１μｇを用いて、１×１０６個のヨウトガｓｆ２１細胞にセルフェクチン（登録商標）試薬を用いてトランスフェクトした。２７℃で７２時間インキュベートした後、Ｐ１ウイルスストックが得られた。製造元の指示に従って、バキュロウイルスを増幅させた。５０ｍｇ／ｍＬのゲンタマイシンを補充したＢＤ ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ（商標）ＴＮＭ−ＦＨ昆虫培地（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で、ｓｆ２１昆虫細胞を増殖させた。バキュロウイルスＢａｃｐＬＧＦＰは、本発明者らの研究室で以前に作製されたものであるが、これは、ｐＦＢｐＬＧＦＰプラスミドを用いて同一のプロトコルに従って得られた。
【００３８】
昆虫細胞への接種
次に、感染多重度０．１ｐｆｕで細胞を感染させ、感染後１６時間、２４時間、４８時間または７２時間で、２０００ｒｐｍ、５分間の遠心分離によって細胞をペレット化した。
【００３９】
また、感染後の様々な時点で、感染細胞の蛍光顕微鏡写真を撮影した。これらの写真を図４に示す。注目すべきは、ｐＬプロモーターと比較したとき、ｐＢ２プロモーター配列とｐＬｐＢ２プロモーター配列の活性がより初期に見られること（感染１６時間後から始まる）、更に、両配列が、感染の後期（感染４８時間後及び７２時間後）でさえも強力であることである。ｐＢ１プロモーターも活性を示すが、ｐＢ２プロモーターまたはｐＬプロモーターほど強力ではない。
【００４０】
昆虫の成長条件と接種
５齢のイラクサギンウワバ幼虫の（体腔前方の）腹脚付近に、１０４〜１０５ｐｆｕ／幼虫の用量を用いて組換えバキュロウイルスを注射した。感染した幼虫を２８℃の成長室に入れ、７２時間で回収した。図４の下のパネルは、ｐＢ１（低い）、ｐＢ２及びｐＬプロモーターとｐＢ２プロモーターの組合せが、幼虫組織でＧＦＰタンパク質を発現することによって昆虫の幼虫での活性を示すことを示している。
【００４１】
タンパク質抽出物の調製
Ｐ６ウェルプレート（２×１０６細胞／ウェルに０．１ｐｆｕ／ウェルで感染させた）からのペレット化した細胞を、３０μｌの１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ ＮＰ−４０、０．１％ ＳＤＳ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８、プロテアーゼインヒビター（コンプリート（登録商標），Ｒｏｃｈｅ）、２−メルカプトエタノール（ＲＩＰＡ緩衝液）に再懸濁し、氷上に３０分間保持し、２０００ｇ、５分間、４℃の遠心分離により清澄化して、細胞破片を除去した。
【００４２】
タンパク質抽出物の解析
４０μｇの全可溶性タンパク質（ＴＳＰ）を１２％ ＳＤＳ（ｗ／ｖ）ポリアクリルアミドゲル上で分離した。タンパク質をクマシーブリリアントブルーＧ−２５０（ＢｉｏＲａｄ）で染色したかまたはニトロセルロースメンブレン（Ｈｙｂｏｎｄ Ｃ，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に転写し、０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）＋４％スキムミルク（ＰＢＳ−ＴＭ）で一晩ブロッキングし、ＰＢＳ−ＴＭに１：１０００希釈したＧＦＰ一次抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）及び１：５００希釈したアクチン一次抗体（Ｓｉｇｍａ）とともに１時間インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔ中で１０分間２回洗浄した後、メンブレンを、ＰＢＳ−ＴＭに希釈したペルオキシダーゼコンジュゲート抗マウスＩｇＧまたは抗ウサギＩｇＧ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の１：２０００希釈液とともに１時間インキュベートした。洗浄後、製造元の指示に従ってＡｄｖａｎｃｅｄ ＥＣＬシステム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、特異的シグナルを検出した。
【００４３】
ウェスタンブロットで行なわれた解析により、図５に示す結果が得られた。この場合もやはり、ｐＢ２プロモーターとｐＬｐＢ２プロモーターが、ｐＬプロモーターよりも初期の、かつ強力な活性を示すことが示された（図５）。ＧＦＰの特異的バンドのデンシトメトリーは、ＴＩＮＡ ２．０プログラムを用いて、かつ結果を標準化するためにアクチンバンドを用いて測定された。
【００４４】
フルオリメトリーアッセイ
ＧＥＮＩＯＳフルオリメーターを用いて４８５ｎｍで励起した後、４０μｇのＴＳＰの放出を５３５ｎｍで測定した。各抽出物を３回測定して、各値を取得した。結果を図５Ｃに示す。この場合もやはり、ｐＢ２プロモーターの５’上流に置かれたｐＬ配列の相乗効果がはっきりと認められ、タンパク質産生の増加は、ｐＬプロモーターのみに対して、感染後の時間に応じて６１〜３７５％であった（図５）。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオテクノロジーの分野に含まれる。昆虫のヘキサメリンファミリー遺伝子に由来する調節ポリヌクレオチド配列（例えば、プロモーター）と、例えば、バキュロウイルス発現ベクターを用いた、昆虫細胞及び昆虫の幼虫での外来タンパク質発現のためのその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
バキュロウイルス−昆虫細胞発現系は、汎用性があり、（ネイティブと組換えの両方の）異種タンパク質を産生するために広く用いられている。この系は、任意のサイズの組換えタンパク質を産生するための最も強力でかつ汎用性のあるものの１つとして一般に認識されている。これは、２つの主な特徴、すなわち、高レベルのタンパク質発現が達成されることと、生体活性をもつようになるようタンパク質が正確にフォールディングされ、同時に哺乳動物細胞の主な翻訳後修飾が起こることとに基づく。更に、この系の発達時間は比較的短く、組換えウイルスの遺伝的安定性は非常に高い。
バキュロウイルスゲノムは、ポリヘドリンプロモーター（ｐＬ）（これは、高等生物で知られている最も強力なプロモーターである）及びプロモーターｐ１０（ｐ１０タンパク質）と呼ばれる２つの強力なプロモーターを含む。ｐＬプロモーターは、ほとんど全ての遺伝子の発現を制御するために使用することができる。タンパク質産生のためにバキュロウイルスを操作するのは、形質転換動物細胞またはトランスジェニック動物に基づく任意の他の高度な産生系よりもはるかに速くかつ安価である。
【０００３】
それにもかかわらず、これまでの市販のプロモーターには、極後期に遺伝子発現を促進することなどの不利な点がいくつかある。その時点で、細胞機構は大きく影響を受けていて、その結果、不完全なプロセッシングや凝集のために、昆虫細胞で発現される異種タンパク質の産出量が減る可能性がある。これらの制約は、ウイルス感染が進むにつれて、宿主細胞因子が劣化することによる可能性がある。
この問題を解決するために、本発明では、宿主細胞悪化の効果を弱め、同時に異種タンパク質の高い発現レベルを達成するための非常に興味深い選択肢として、ポリヘドリンプロモーターと少なくとも同じ程度に強力な初期プロモーターを安定発現とともに使用することを提案する。本発明は、幼虫（未成熟）形態から成虫（成熟）形態への移行が、様々な組織におけるいくつかの遺伝子の活性化と抑制によって達成される（昆虫変態発生）という事実に対する注意を喚起することを望むものである。
【０００４】
変態関連タンパク質の中に、終齢期に非常に高いレベルで発現されるヘキサメリンとして知られるファミリーがある。これらのタンパク質は、大部分は、後幼生発生期に使用される血リンパ貯蔵タンパク質である。ヘキサメリンの最大レベルは、５齢の最初の４８時間に認められ、このレベルは、この期間の後、約４倍に増える（図１）。上述の幼虫タンパク質のファミリーをコードする配列から出発して、外来タンパク質発現に使用されるプロモーターのファミリーが本発明で開発される。そのため、本発明は、当該技術水準で使用されるプロモーターと比較してより初期の、かつより強力なプロモーターであるｐＢ１（配列番号１）及びｐＢ２（配列番号２）を提供する。
特定の幼虫発達段階で主要な昆虫タンパク質の発現を促進し得るプロモーターが、本発明で単離される。これらは、幼虫のタンパク質ヘキサメリンをコードする配列に由来していて、いくつかの昆虫細胞、好ましくはヨウトガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）由来のｓｆ９またはｓｆ２１細胞で異種タンパク質を発現させるための任意の発現ベクター（例えば、バキュロウイルス発現ベクター）を構築するために使用し得る。これらの新しいプロモーターを構成する調節配列と同様の調節配列が鱗翅目の幼虫で既に特徴付けされているが、バキュロウイルス発現系で使用されたことはこれまで一度もない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｉｌ’ｉｃｈｅｖ ＡＡ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｋａ．１９８７ ２３：１９７−２０１；Ｋａｙ Ｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９８７ Ｊｕｎ ５；２３６（４８０６）：１２９９−１３０２
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、ヘキサメリンファミリー遺伝子発現を調節する配列に由来する、ｐＢ１（配列番号１）及び／またはｐＢ２（配列番号２）などの、調節ポリヌクレオチド配列を提供する。これらのタンパク質は５齢期に最大発現を示すが、発現の割合は、この幼虫発生期の最初の４８時間を過ぎた後に非常に高く、これは、このタンパク質が短期間に非常に速やかに蓄積されることを示している（図１）。これらの特徴は、これらのタンパク質の発現が、より効率的なバキュロウイルスまたは任意の他の発現ベクターを作製するために、異種タンパク質の発現を最適化するために使用し得る強力なプロモーターによって促進されることを示唆する。バキュロウイルス発現系の場合、より初期のプロモーター活性は、分泌経路に局在化されるタンパク質の場合に特に重要であり、これらのタンパク質は、より初期のプロモーター活性がなければ、バキュロウイルス感染の非常に遅い段階で細胞の翻訳後修飾機構と分泌経路の両方の変化によって影響を受ける可能性がある。
【０００７】
本発明のプロモーターの配列は、ヘキサメリンファミリー遺伝子（ＢＪＨＳＰ１及びＢＪＨＳＰ２）発現を調節する配列に由来するが、このヘキサメリンファミリー遺伝子のもとの調節ヌクレオチド配列には含まれないいくつかの突然変異を有する。このヘキサメリンは、イラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ）（Ｔ．ｎｉ）の幼虫から単離され、マススペクトロメトリー分析によって８０ＫＤａのバンドとして同定された（図２）。
タンパク質が同定された後すぐに、これらをコードする遺伝子及びそのそれぞれのプロモーターを含む上流配列が単離された。各々のもとのプロモーターを増幅するために使用されるプライマーを明記する。配列番号３及び４によって特徴付けられるプライマーは、もとのプロモーター（これは、最終的にはプロモーターｐＢ１（配列番号１）に帰する）を増幅するために使用された。配列番号５及び６によって特徴付けられるプライマーは、もとのプロモーター（これは、最終的にはプロモーターｐＢ２に帰する）を増幅するために使用された。
【０００８】
本発明のプロモーター、特にｐＢ２の主な利点は、今日バキュロウイルス発現系で使用されている既知の極後期プロモーターと比較したときに、それがより初期の、かつより強力な目的のタンパク質の発現をもたらすということである。
【０００９】
好ましい一実施形態では、本発明は、本発明のプロモーターｐＢ１及びｐＢ２（好ましくはｐＢ２）と任意の他のプロモーター、例えば、ｐＬまたはｐ１０（好ましくはｐＬ）との組合せも含む。驚くべきことに、このような組合せを行なったとき、相乗効果が得られた。ｐＬｐＢ２プロモーターを含むバキュロウイルス発現ベクターを試験したとき、目的のタンパク質の発現レベルは、ｐＬプロモーターのみの使用に対して（感染時間に応じて）６１〜３７５％まで増加した。今日一般に、プロモーターｐＬがバイオテクノロジー産業で使用されているので、この実施形態は、本発明の目的のために非常に重要である。
【００１０】
他の実施形態では、本発明は、本発明のプロモーター（ｐＢ１及びｐＢ２）の組合せ、すなわち、ｐＢ１−ｐＢ１、ｐＢ２−ｐＢ２及びｐＢ１−ｐＢ２に関する。
【００１１】
哺乳動物細胞では、本発明のプロモーターの活性が検出されなかった。そこで、本発明は、組換えバキュロウイルスの開発のための２つの安全なプロモーターを提供するものでもある。
【００１２】
従って、本発明は、当該技術水準に含まれるものよりも効果的な調節ポリヌクレオチド配列（プロモーター）を、ヘキサメリンファミリータンパク質をコードする遺伝子のオープンリーディングフレームの上流にある任意のポリヌクレオチド配列から得ることができることを明らかにするものである（発明を実施するための形態を参照）。それゆえ、ヘキサメリンファミリータンパク質をコードする遺伝子のオープンリーディングフレームの上流にある任意のポリヌクレオチド配列に由来する任意の調節ポリヌクレオチド配列が本発明に含まれる。
【００１３】
本発明の目的のためだけに、以下の用語を定義する：
・調節ポリヌクレオチド配列：遺伝子の転写を可能にする通常は遺伝子の（センス鎖の５’領域に向かって）上流にあるＤＮＡの領域である。
・ベクター発現：細胞内部に外因性の遺伝物質を移すために使用される「媒体」。このベクターは、クローニングされた遺伝子（１つまたは複数）の転写や翻訳の促進、そしてＤＮＡの転写やクローニングのために必要な調節配列を含む。バキュロウイルス発現ベクターは本発明で好ましく使用された。
・バキュロウイルス：主に昆虫や節足動物に感染する、無脊椎動物の感染性ウイルスのファミリーである。
・組換えＤＮＡ：１以上のＤＮＡ鎖を組み合わせるかまたは挿入し、それにより、通常は一緒に存在しないＤＮＡを組み合わせることによって人為的に作製された人工ＤＮＡの一形態である。組換えＤＮＡは、関連するＤＮＡを既存の生物ゲノムに付加することによって産生される。
・組換えタンパク質：組換えＤＮＡによってコードされるタンパク質。
・初期発現：プロモーターが目的のタンパク質を発現し始める時間を指す。本発明では、この時間は、感染後１６時間から始まる。
・より強力な発現：従来のバキュロウイルスプロモーターｐ１０またはｐＬによって達成される発現のレベルと比較して同等かまたはより高いレベルでの任意の目的のタンパク質の発現を指す。
・目的のタンパク質：ヒトや動物の利益のために使用することができ、かつ産業上、商業上または治療上の用途を有し得るタンパク質。
・生物工場：治療目的を含むいくつかの用途を有する産業的規模の割合のタンパク質（阻害剤、酵素、抗体、抗原など）または商業目的の主産物もしくは副産物を産生することができる、遺伝子改変されているかまたは遺伝子改変されていない、細胞または生物。
・部分断片：本発明の調節ポリヌクレオチド配列に由来し、当該技術分野に含まれるものと比較してより初期及びより強力という同じ改善された特性を有する任意の部分断片を指す。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】イラクサギンウワバ幼虫の最初の４つの発達段階において、以下でヘキサメリンと同定される８０ｋＤａバンドが存在しないこと（Ａ）と、２日後の第５幼虫齢でそれが存在すること（Ｂ）とを示す写真。（Ｃ）は、第５幼虫齢の最初の６日間のこのバンドのデンシトメトリー定量を示すグラフ。
【図２】８０ＫＤａのバンドのマススペクトロメトリー分析による同定のスキーム図。
【図３】プロモーター配列のｐＢ１もしくはｐＢ２のみまたはｐＬ配列と組み合わせたｐＢ２（ｐＬｐＢ２）を担持する作製された発現ベクターの説明図。
【図４】様々な時点で組換えバキュロウイルスを感染させた後、様々なプロモーター（ｐＢ１、ｐＢ２、ｐＬ及びｐＬｐＢ２）の制御下で緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現する昆虫ｓｆ２１細胞及び昆虫の幼虫、並びに、感染７２時間後の幼虫の写真。
【図５】バキュロウイルスベクターに挿入された様々なプロモーター（ｐＢ１、ｐＢ２、ｐＬ及びｐＬｐＢ２）を感染後の様々な時点（１６〜７２時間）で使用することにより、かつウェスタンブロットにより検出されたＧＦＰの発現を示す写真（Ａ）。組換えタンパク質を定量した、ＧＦＰバンドのデンシトメトリーのグラフ（Ｂ）、または細胞抽出物のフルオロメトリーのグラフ（Ｃ）。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、配列番号１及び配列番号２によってそれぞれ特徴付けられ、かつ昆虫の幼虫のヘキサメリンファミリータンパク質をコードする遺伝子のオープンリーディングフレームの上流にあるポリヌクレオチド配列に由来する、プロモーターｐＢ１及びｐＢ２などの、調節ポリヌクレオチド配列を提供する。
本発明は更に、バキュロウイルスなどの昆虫発現ベクターを構築するための及び細胞、好ましくは昆虫細胞で異種タンパク質を発現させるためのそのような調節ポリヌクレオチド配列の使用に言及するものである。
プロモーターｐＢ１及びｐＢ２の配列は、それぞれ、イラクサギンウワバのヘキサメリンＢＪＨＳＰ１及びＢＪＨＳＰ２に由来し、これらのヘキサメリンは、５齢期に最高レベルで発現し、この時期の最初の４８時間に非常に高い転写活性を有する（図１）。
【００１６】
ｐＢ１配列は１０５７ヌクレオチド（配列番号１）で構成され、幼若ホルモンで抑制される塩基性タンパク質１であるＢＪＨＳＰ１タンパク質をコードする遺伝子の開始コドンの上流の５’領域に由来する。この配列を、２つの特異的プライマー：配列番号３及び配列番号４を用いてイラクサギンウワバのゲノムＤＮＡから増幅した。その後、この断片を市販ベクターのｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）にクローニングした。
【００１７】
ｐＢ２配列は１０４１ヌクレオチド（配列番号２）で構成され、幼若ホルモンで抑制される塩基性タンパク質２であるＢＪＨＳＰ２タンパク質をコードする遺伝子の開始コドンの上流の５’領域に由来する。この配列を、２つの特異的プライマー：配列番号５及び配列番号６を用いてイラクサギンウワバのゲノムＤＮＡから増幅した。その後、この断片を市販ベクターのｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）にクローニングした。
【００１８】
ｐＢ１配列とｐＢ２配列をＢａｍＨＩ酵素とＳｐｈＩ酵素を用いてｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙから抜き出し、市販プラスミドのｐＦａｓＴＢａｃデュアル（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）中のこれらの部位にクローニングした。記載した酵素で開環されたこのｐＦａｓＴＢａｃデュアルベクターからは、バキュロウイルスプロモーター配列が除去されている（得られたベクターをｐＦＢｐＢ１及びｐＦＢｐＢ２と名付けた）。
これらの得られたベクターは全て、目的のｃＤＮＡを導入するためのクローニング部位を提供する。これらを用いて、昆虫細胞や昆虫の幼虫に感染しかつそれらの中で複製することができる組換えバキュロウイルスを作製した。
更に、制限酵素のＮｏｔＩとＰｓｔＩ（両制限部位ともｐＧｅｍＴ ｅａｓｙベクターに由来する）で消化することによってｐＢ２配列を抜き出し、市販ベクターのｐＦａｓＴＢａｃ１（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）中の、ｐＬプロモーター配列の後ろにある同じ部位にクローニングした。得られたベクターをｐＦＢｐＬｐＢ２と名付けた。
【００１９】
それゆえ、本発明の第１の実施形態は、発現調節ポリヌクレオチド配列：配列番号１（ｐＢ１）及び配列番号２（ｐＢ２）を開発するための方法に言及するものである。この方法は、ヘキサメリンファミリータンパク質をコードする遺伝子のオープンリーディングフレームの上流にある任意のポリヌクレオチド配列の単離を含む。調節ポリヌクレオチド配列の配列が決定された後すぐに、それらは常法によって増幅された。
【００２０】
本発明の好ましい一実施形態では、ヘキサメリンのオープンリーディングフレームの上流ポリヌクレオチド配列は、昆虫、好ましくはイラクサギンウワバに属する。
【００２１】
本発明の第２の実施形態は、調節ポリヌクレオチド配列：配列番号１（ｐＢ１）、配列番号２（ｐＢ２）、またはヘキサメリンファミリータンパク質をコードする遺伝子のオープンリーディングフレームの上流にある任意の調節ヌクレオチド領域に由来する任意の配列を含むことを特徴とする、任意のその部分断片に言及するものである。これらのプロモーター配列は、転写活性の調節に関与する調節ＤＮＡモチーフを示す。それゆえ、これらの配列は、幼虫発生期にホルモンにより調節され得るが、他のシグナルにより、そして、発現ベクターとの関連では細胞培養物において調節される可能性もある。
【００２２】
好ましい一実施形態では、本発明の調節ポリヌクレオチド配列：配列番号１（ｐＢ１）及び配列番号２（ｐＢ２）を任意の他の調節ポリヌクレオチド配列、好ましくはプロモーターｐＬ（タンパク質ポリヘドリンのプロモーター）またはｐ１０（タンパク質ｐ１０のプロモーター）と組み合わせて、様々な組合せ：ｐＬｐＢ２、ｐＬｐＢ１、ｐ１０ｐＢ２及びｐ１０ｐＢ１を生じさせる。本発明は、ｐＬ配列（ポリヘドリンプロモーター）をｐＢ２配列と組み合わせたときに、非常に強力なプロモーター配列を提供する。
【００２３】
他の好ましい実施形態では、本発明の調節ポリヌクレオチド配列：配列番号１（ｐＢ１）及び配列番号２（ｐＢ２）をそれら同士と組み合わせて、様々な組合せ：ｐＢ１ｐＢ２、ｐＢ１ｐＢ１（少なくとも２回反復したもの）及びｐＢ２ｐＢ２（少なくとも２回反復したもの）を生じさせる。タンデムに置かれたプロモーターが、細菌や植物における組換えタンパク質発現の効率を増加させることが示されている（非特許文献１）。
【００２４】
本発明の第３の実施形態は、発現ベクター、好ましくはバキュロウイルスまたはプラスミドを構築するための上述の調節ポリヌクレオチド配列のいずれかの使用に言及するものである。
【００２５】
本発明の第４の実施形態は、上で説明した調節ポリヌクレオチド配列のいずれかと、少なくとも目的のタンパク質をコードする配列とを含むことを特徴とする発現ベクターに言及するものである。好ましい一実施形態では、ベクターは、バキュロウイルスまたはプラスミドである。
【００２６】
本発明の第５の実施形態は、発現ベクターにより形質転換されたか、トランスフェクトされたか、または先の段落で記載されたベクターとして使用された組換えウイルスに感染させられた細胞に言及するものである。好ましい一実施形態では、細胞は昆虫細胞、好ましくは、ヨウトガ由来のｓｆ９またはｓｆ２１である。
【００２７】
本発明の第６の実施形態は、上述の発現ベクターで形質転換されたか、トランスフェクトされたか、または感染させられた昆虫の幼虫に言及するものである。
【００２８】
本発明の第７の実施形態は、上述の発現ベクターを用いて昆虫細胞または昆虫の幼虫の中で組換えタンパク質を産生するための方法と、常法による目的の組換えタンパク質の抽出及び精製とに言及するものである。
【００２９】
本発明の第８の実施形態は、組換えタンパク質を産生するためのこの発現ベクターの使用に言及するものである。
【００３０】
本発明の第９の実施形態は、組換えタンパク質を産生するためのこの細胞の使用に言及するものである。
【００３１】
本発明の最後の実施形態は、組換えタンパク質を産生するための生物工場としてのこの昆虫の幼虫の使用に言及するものである。
【００３２】
ブダペスト条約に準じた微生物の寄託；
プラスミドは、２００８年７月２日付けで、受託番号ＣＥＣＴ ７４３１として、スペイン、バレンシア大学のスペイン微生物株保護機関（Ｓｐａｎｉｓｈ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＣＥＣＴ）に寄託された。
【実施例】
【００３３】
本発明は、以下の実施例により詳しく説明されるが、その範囲に限定されず、本発明の趣旨を逸脱することなく、他の実施形態、修正形態及びそれらの等価物を使用することができ、これらはこの説明によって当業者に示唆され得る。
【００３４】
本発明の実施例は、従来のプロモーターを使用した場合と比較して、タンパク質発現が、感染後のより早い時点で起こることを示している。更に、ｐＢ２及びｐＬｐＢ２というプロモーター配列の場合、発現レベルは、感染後の早い時点と遅い時点の両方で、当該技術水準（プロモーターｐＬ）で達成されるものと比較してより高かった。
【００３５】
実施例１：
緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）が、本発明の昆虫プロモーターにより発現される。
ＧＦＰのクローニング
ＳｐｈＩ制限酵素によってｐＦＢｐＬＧＦＰプラスミドから抜き出されたＧＦＰをｐＦＢｐＢ１またはｐＦＢｐＢ２プラスミドのＳｐｈＩ制限部位にクローニングした。得られたドナー発現プラスミドは、それぞれ、ｐＦＢｐＢ１ＧＦＰ及びｐＦＢｐＢ２ＧＦＰと命名された。全ての場合において、ｐＬ配列が取り除かれていたので、ＧＦＰ発現は、様々な昆虫プロモーターそれ自体の活性のみによるものであった（図３）。
【００３６】
他方、ＮｏｔＩ制限部位とＰｓｔＩ制限部位が両側にあるｐＢ２プロモーターを、これも同じ制限酵素で開環されたｐＦＢｐＬＧＦＰに連結した。得られたドナー発現プラスミドはｐＦＢｐＬｐＢ２ＧＦＰと命名され、ｐＬ及びｐＢ２という２つのプロモーターの制御下にＧＦＰコード遺伝子を含んでいた（図３）。
【００３７】
ＧＦＰ−バキュロウイルス発現ベクターの構築
得られたプラスミドを自動配列決定で特徴付けし、製造元の指示に従ってＢａｃ−ｔｏ−Ｂａｃ（登録商標）バキュロウイルス発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）を用いて、組換えバキュロウイルスＢａｃｐＢ２ＧＦＰ、ＢａｃｐＢ１ＧＦＰ及びＢａｃｐＬｐＢ２ＧＦＰを作製するために使用した。簡潔に述べると、得られたドナー発現プラスミドを用いて、ＤＨ１０Ｂａｃ（商標）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を形質転換し、転移によって組換えバックミドに移した。各バックミド１μｇを用いて、１×１０６個のヨウトガｓｆ２１細胞にセルフェクチン（登録商標）試薬を用いてトランスフェクトした。２７℃で７２時間インキュベートした後、Ｐ１ウイルスストックが得られた。製造元の指示に従って、バキュロウイルスを増幅させた。５０ｍｇ／ｍＬのゲンタマイシンを補充したＢＤ ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ（商標）ＴＮＭ−ＦＨ昆虫培地（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で、ｓｆ２１昆虫細胞を増殖させた。バキュロウイルスＢａｃｐＬＧＦＰは、本発明者らの研究室で以前に作製されたものであるが、これは、ｐＦＢｐＬＧＦＰプラスミドを用いて同一のプロトコルに従って得られた。
【００３８】
昆虫細胞への接種
次に、感染多重度０．１ｐｆｕで細胞を感染させ、感染後１６時間、２４時間、４８時間または７２時間で、２０００ｒｐｍ、５分間の遠心分離によって細胞をペレット化した。
【００３９】
また、感染後の様々な時点で、感染細胞の蛍光顕微鏡写真を撮影した。これらの写真を図４に示す。注目すべきは、ｐＬプロモーターと比較したとき、ｐＢ２プロモーター配列とｐＬｐＢ２プロモーター配列の活性がより初期に見られること（感染１６時間後から始まる）、更に、両配列が、感染の後期（感染４８時間後及び７２時間後）でさえも強力であることである。ｐＢ１プロモーターも活性を示すが、ｐＢ２プロモーターまたはｐＬプロモーターほど強力ではない。
【００４０】
昆虫の成長条件と接種
５齢のイラクサギンウワバ幼虫の（体腔前方の）腹脚付近に、１０４〜１０５ｐｆｕ／幼虫の用量を用いて組換えバキュロウイルスを注射した。感染した幼虫を２８℃の成長室に入れ、７２時間で回収した。図４の下のパネルは、ｐＢ１（低い）、ｐＢ２及びｐＬプロモーターとｐＢ２プロモーターの組合せが、幼虫組織でＧＦＰタンパク質を発現することによって昆虫の幼虫での活性を示すことを示している。
【００４１】
タンパク質抽出物の調製
Ｐ６ウェルプレート（２×１０６細胞／ウェルに０．１ｐｆｕ／ウェルで感染させた）からのペレット化した細胞を、３０μｌの１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ ＮＰ−４０、０．１％ ＳＤＳ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８、プロテアーゼインヒビター（コンプリート（登録商標），Ｒｏｃｈｅ）、２−メルカプトエタノール（ＲＩＰＡ緩衝液）に再懸濁し、氷上に３０分間保持し、２０００ｇ、５分間、４℃の遠心分離により清澄化して、細胞破片を除去した。
【００４２】
タンパク質抽出物の解析
４０μｇの全可溶性タンパク質（ＴＳＰ）を１２％ ＳＤＳ（ｗ／ｖ）ポリアクリルアミドゲル上で分離した。タンパク質をクマシーブリリアントブルーＧ−２５０（ＢｉｏＲａｄ）で染色したかまたはニトロセルロースメンブレン（Ｈｙｂｏｎｄ Ｃ，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に転写し、０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）＋４％スキムミルク（ＰＢＳ−ＴＭ）で一晩ブロッキングし、ＰＢＳ−ＴＭに１：１０００希釈したＧＦＰ一次抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）及び１：５００希釈したアクチン一次抗体（Ｓｉｇｍａ）とともに１時間インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔ中で１０分間２回洗浄した後、メンブレンを、ＰＢＳ−ＴＭに希釈したペルオキシダーゼコンジュゲート抗マウスＩｇＧまたは抗ウサギＩｇＧ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の１：２０００希釈液とともに１時間インキュベートした。洗浄後、製造元の指示に従ってＡｄｖａｎｃｅｄ ＥＣＬシステム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、特異的シグナルを検出した。
【００４３】
ウェスタンブロットで行なわれた解析により、図５に示す結果が得られた。この場合もやはり、ｐＢ２プロモーターとｐＬｐＢ２プロモーターが、ｐＬプロモーターよりも初期の、かつ強力な活性を示すことが示された（図５）。ＧＦＰの特異的バンドのデンシトメトリーは、ＴＩＮＡ ２．０プログラムを用いて、かつ結果を標準化するためにアクチンバンドを用いて測定された。
【００４４】
フルオリメトリーアッセイ
ＧＥＮＩＯＳフルオリメーターを用いて４８５ｎｍで励起した後、４０μｇのＴＳＰの放出を５３５ｎｍで測定した。各抽出物を３回測定して、各値を取得した。結果を図５Ｃに示す。この場合もやはり、ｐＢ２プロモーターの５’上流に置かれたｐＬ配列の相乗効果がはっきりと認められ、タンパク質産生の増加は、ｐＬプロモーターのみに対して、感染後の時間に応じて６１〜３７５％であった（図５）。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）ヘキサメリンファミリータンパク質をコードする遺伝子のオープンリーディングフレームの上流にあり、その対応する調節ポリヌクレオチド配列を含む任意のポリヌクレオチド配列を単離するステップと、
ｂ）常法による工程ａ）の調節ポリヌクレオチド配列を増幅するステップと、を有する
ことを特徴とする発現調節ポリヌクレオチド配列を開発する方法。
【請求項２】
開発された最終的な調節ポリヌクレオチド配列が、配列番号１（ｐＢ１）及び配列番号２（ｐＢ２）によって特徴付けられる
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記増幅が、ｐＢ１を開発するためのプライマーである配列番号３及び配列番号４を用いて、並びに、ｐＢ２を開発するためのプライマーである配列番号５及び配列番号６を用いて行なわれる
請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記調節ポリヌクレオチド配列が、昆虫の幼虫に属する
請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記昆虫の幼虫が、イラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ）である
請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ヘキサメリンファミリータンパク質をコードする遺伝子のオープンリーディングフレームの上流にある任意のポリヌクレオチド配列に由来する
ことを特徴とする調節ポリヌクレオチド配列。
【請求項７】
前記配列がプロモーターである
請求項６に記載の調節ポリヌクレオチド配列。
【請求項８】
配列番号１（ｐＢ１）、配列番号２（ｐＢ２）またはヘキサメリンファミリータンパク質をコードする遺伝子のオープンリーディングフレームの上流にある任意のポリヌクレオチド配列に由来する任意のその部分断片から選択される
請求項６または７に記載の調節ポリヌクレオチド配列。
【請求項９】
請求項６ないし８のいずれかに記載の調節ポリヌクレオチド配列のいずれかと、任意の他の調節ポリヌクレオチド配列の配列とを含む
調節ポリヌクレオチド配列。
【請求項１０】
前記他の調節ポリヌクレオチド配列が、タンパク質ポリヘドリンのプロモーターまたはタンパク質ｐ１０のプロモーターである
請求項９に記載の調節ポリヌクレオチド配列。
【請求項１１】
ｐＢ２（配列番号２）の配列とタンパク質ポリヘドリンのプロモーターの配列とを含む
請求項９または１０に記載の調節ポリヌクレオチド配列。
【請求項１２】
ｐＢ１（配列番号１）の配列とタンパク質ポリヘドリンのプロモーターの配列とを含む
請求項９または１０に記載の調節ポリヌクレオチド配列。
【請求項１３】
ｐＢ２（配列番号２）の配列とタンパク質ｐ１０のプロモーターの配列とを含む
請求項９または１０に記載の調節ポリヌクレオチド配列。
【請求項１４】
ｐＢ１（配列番号１）の配列とタンパク質ｐ１０のプロモーターの配列とを含む
請求項９または１０に記載の調節ポリヌクレオチド配列。
【請求項１５】
それら同士と組み合わせた請求項８に記載の配列のいずれかを含む
調節ポリヌクレオチド配列。
【請求項１６】
ｐＢ１（配列番号１）の配列とｐＢ２（配列番号２）の配列とを含む
請求項１５に記載の調節ポリヌクレオチド配列。
【請求項１７】
少なくとも２回反復したｐＢ１（配列番号１）の配列を含む
請求項１５に記載の調節ポリヌクレオチド配列。
【請求項１８】
少なくとも２回反復したｐＢ２（配列番号２）の配列を含む
請求項１５に記載の調節ポリヌクレオチド配列。
【請求項１９】
発現ベクターを構築するための請求項６ないし１８のいずれかに記載の調節ポリヌクレオチド配列の使用。
【請求項２０】
前記発現ベクターがウイルス、好ましくはバキュロウイルスである
請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
前記発現ベクターがプラスミドである
請求項１９に記載の使用。
【請求項２２】
請求項６ないし１８のいずれかに記載の調節ポリヌクレオチド配列のいずれかと、少なくとも目的のタンパク質をコードする配列とを含む
ことを特徴とする発現ベクター。
【請求項２３】
前記ベクターが、ウイルス、好ましくはバキュロウイルスである
請求項２２に記載の発現ベクター。
【請求項２４】
前記ベクターが、プラスミドである
請求項２２に記載の発現ベクター。
【請求項２５】
請求項２２ないし２４のいずれかに記載の発現ベクターによって形質転換またはトランスフェクトされた
ことを特徴とする細胞。
【請求項２６】
前記細胞が、昆虫細胞、好ましくはヨウトガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）由来のｓｆ９またはｓｆ２１である
請求項２５に記載の細胞。
【請求項２７】
請求項２２ないし２４のいずれかに記載の発現ベクターでトランスフェクトされたか、感染させられたかまたは形質転換された
ことを特徴とする昆虫の幼虫。
【請求項２８】
請求項２２ないし２４のいずれかに記載の発現ベクターによる昆虫細胞または昆虫の幼虫の接種またはトランスフェクションと、常法による目的の組換えタンパク質の抽出及び精製とを含む
ことを特徴とする組換えタンパク質を産生する方法。
【請求項２９】
組換えタンパク質を産生するための請求項２２ないし２４のいずれかに記載の発現ベクターの使用。
【請求項３０】
組換えタンパク質を産生するための請求項２５または２６に記載の細胞の使用。
【請求項３１】
組換えタンパク質を産生するための生物工場としての請求項２７に記載の昆虫の幼虫の使用。
【請求項１】
ａ）ヘキサメリンファミリータンパク質をコードする遺伝子のオープンリーディングフレームの上流にあり、その対応する調節ポリヌクレオチド配列を含む任意のポリヌクレオチド配列を単離するステップと、
ｂ）常法による工程ａ）の調節ポリヌクレオチド配列を増幅するステップと、を有する
ことを特徴とする発現調節ポリヌクレオチド配列を開発する方法。
【請求項２】
開発された最終的な調節ポリヌクレオチド配列が、配列番号１（ｐＢ１）及び配列番号２（ｐＢ２）によって特徴付けられる
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記増幅が、ｐＢ１を開発するためのプライマーである配列番号３及び配列番号４を用いて、並びに、ｐＢ２を開発するためのプライマーである配列番号５及び配列番号６を用いて行なわれる
請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記調節ポリヌクレオチド配列が、昆虫の幼虫に属する
請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記昆虫の幼虫が、イラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ）である
請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ヘキサメリンファミリータンパク質をコードする遺伝子のオープンリーディングフレームの上流にある任意のポリヌクレオチド配列に由来する
ことを特徴とする調節ポリヌクレオチド配列。
【請求項７】
前記配列がプロモーターである
請求項６に記載の調節ポリヌクレオチド配列。
【請求項８】
配列番号１（ｐＢ１）、配列番号２（ｐＢ２）またはヘキサメリンファミリータンパク質をコードする遺伝子のオープンリーディングフレームの上流にある任意のポリヌクレオチド配列に由来する任意のその部分断片から選択される
請求項６または７に記載の調節ポリヌクレオチド配列。
【請求項９】
請求項６ないし８のいずれかに記載の調節ポリヌクレオチド配列のいずれかと、任意の他の調節ポリヌクレオチド配列の配列とを含む
調節ポリヌクレオチド配列。
【請求項１０】
前記他の調節ポリヌクレオチド配列が、タンパク質ポリヘドリンのプロモーターまたはタンパク質ｐ１０のプロモーターである
請求項９に記載の調節ポリヌクレオチド配列。
【請求項１１】
ｐＢ２（配列番号２）の配列とタンパク質ポリヘドリンのプロモーターの配列とを含む
請求項９または１０に記載の調節ポリヌクレオチド配列。
【請求項１２】
ｐＢ１（配列番号１）の配列とタンパク質ポリヘドリンのプロモーターの配列とを含む
請求項９または１０に記載の調節ポリヌクレオチド配列。
【請求項１３】
ｐＢ２（配列番号２）の配列とタンパク質ｐ１０のプロモーターの配列とを含む
請求項９または１０に記載の調節ポリヌクレオチド配列。
【請求項１４】
ｐＢ１（配列番号１）の配列とタンパク質ｐ１０のプロモーターの配列とを含む
請求項９または１０に記載の調節ポリヌクレオチド配列。
【請求項１５】
それら同士と組み合わせた請求項８に記載の配列のいずれかを含む
調節ポリヌクレオチド配列。
【請求項１６】
ｐＢ１（配列番号１）の配列とｐＢ２（配列番号２）の配列とを含む
請求項１５に記載の調節ポリヌクレオチド配列。
【請求項１７】
少なくとも２回反復したｐＢ１（配列番号１）の配列を含む
請求項１５に記載の調節ポリヌクレオチド配列。
【請求項１８】
少なくとも２回反復したｐＢ２（配列番号２）の配列を含む
請求項１５に記載の調節ポリヌクレオチド配列。
【請求項１９】
発現ベクターを構築するための請求項６ないし１８のいずれかに記載の調節ポリヌクレオチド配列の使用。
【請求項２０】
前記発現ベクターがウイルス、好ましくはバキュロウイルスである
請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
前記発現ベクターがプラスミドである
請求項１９に記載の使用。
【請求項２２】
請求項６ないし１８のいずれかに記載の調節ポリヌクレオチド配列のいずれかと、少なくとも目的のタンパク質をコードする配列とを含む
ことを特徴とする発現ベクター。
【請求項２３】
前記ベクターが、ウイルス、好ましくはバキュロウイルスである
請求項２２に記載の発現ベクター。
【請求項２４】
前記ベクターが、プラスミドである
請求項２２に記載の発現ベクター。
【請求項２５】
請求項２２ないし２４のいずれかに記載の発現ベクターによって形質転換またはトランスフェクトされた
ことを特徴とする細胞。
【請求項２６】
前記細胞が、昆虫細胞、好ましくはヨウトガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）由来のｓｆ９またはｓｆ２１である
請求項２５に記載の細胞。
【請求項２７】
請求項２２ないし２４のいずれかに記載の発現ベクターでトランスフェクトされたか、感染させられたかまたは形質転換された
ことを特徴とする昆虫の幼虫。
【請求項２８】
請求項２２ないし２４のいずれかに記載の発現ベクターによる昆虫細胞または昆虫の幼虫の接種またはトランスフェクションと、常法による目的の組換えタンパク質の抽出及び精製とを含む
ことを特徴とする組換えタンパク質を産生する方法。
【請求項２９】
組換えタンパク質を産生するための請求項２２ないし２４のいずれかに記載の発現ベクターの使用。
【請求項３０】
組換えタンパク質を産生するための請求項２５または２６に記載の細胞の使用。
【請求項３１】
組換えタンパク質を産生するための生物工場としての請求項２７に記載の昆虫の幼虫の使用。
【図１】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【公表番号】特表２０１２−５０１１７１（Ｐ２０１２−５０１１７１Ａ）
【公表日】平成２４年１月１９日（２０１２．１．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５２４２０３（Ｐ２０１１−５２４２０３）
【出願日】平成２０年９月２日（２００８．９．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０６１５８０
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０２５７６４
【国際公開日】平成２２年３月１１日（２０１０．３．１１）
【出願人】（５１１０５３１９３）オルタナティブ ジェネ エクスプレッション エス．エル． （アルヘネクス） (1)
【氏名又は名称原語表記】ＡＬＴＥＲＮＡＴＩＶＥ ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ Ｓ．Ｌ．（ＡＬＧＥＮＥＸ）
【住所又は居所原語表記】ＩＮＩＡ，Ａｕｔｏｖｉａ Ａ６ Ｋｍ．７，Ｅ−２８０４０ Ｍａｄｒｉｄ，Ｓｐａｉｎ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年１月１９日（２０１２．１．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年９月２日（２００８．９．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０６１５８０
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０２５７６４
【国際公開日】平成２２年３月１１日（２０１０．３．１１）
【出願人】（５１１０５３１９３）オルタナティブ ジェネ エクスプレッション エス．エル． （アルヘネクス） (1)
【氏名又は名称原語表記】ＡＬＴＥＲＮＡＴＩＶＥ ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ Ｓ．Ｌ．（ＡＬＧＥＮＥＸ）
【住所又は居所原語表記】ＩＮＩＡ，Ａｕｔｏｖｉａ Ａ６ Ｋｍ．７，Ｅ−２８０４０ Ｍａｄｒｉｄ，Ｓｐａｉｎ
【Ｆターム（参考）】
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