有用物質の製造方法
【課題】コリネ型細菌のアルカリ性感受性を相補する活性を有する蛋白質、該蛋白質をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡ、該組換え体ＤＮＡで形質転換されたコリネ型細菌、または有用物質の製造方法を提供する。
【解決手段】配列番号１または３で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質。該蛋白質をコードするＤＮＡ。該ＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡ。該該組換え体ＤＮＡで形質転換されたコリネ型細菌。該形質転換されたコリネ型細菌を培地に培養し、培養物中に有用物質を生成、蓄積させ、該培養物から該有用物質を採取する有用物質の製造方法。有用物質としては、たとえば、グルタミン、アルギニン等のアミノ酸、核酸等があげられる。
【解決手段】配列番号１または３で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質。該蛋白質をコードするＤＮＡ。該ＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡ。該該組換え体ＤＮＡで形質転換されたコリネ型細菌。該形質転換されたコリネ型細菌を培地に培養し、培養物中に有用物質を生成、蓄積させ、該培養物から該有用物質を採取する有用物質の製造方法。有用物質としては、たとえば、グルタミン、アルギニン等のアミノ酸、核酸等があげられる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルカリ性感受性のコリネ型細菌のアルカリ性感受性を回復させる活性を有する蛋白質、該蛋白質をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡ、該組換え体ＤＮＡで形質転換されたコリネ型細菌、および有用物質の製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
工業レベルでのアミノ酸、核酸等の有用物質の発酵生産は、容積が数百キロリットルという大型の発酵槽を用いて行われる。しかし、このような大規模な製造現場では、生産菌株の能力が最大限に発揮されず、小型の設備を用いた予備検討の結果が再現されないことが多い。
【０００３】
このようなスケールアップにともなう有用物質の生産性の低下は、主として培養液量に比例した撹拌効率の低下によるものと考えられている。たとえば、撹拌効率の低下によって生じるpHの分布は細胞生理に少なからぬストレスを与え、成績低下や成績不安定性の大きな要因となっている。
【０００４】
この問題に対処する方法としては、発酵槽内の液の混合効率を上げることがあげられるが、設備面での改良が必要になり、コストがかかるという問題がある。設備に頼らない、菌株面からの対応が可能になれば、発酵生産性を改善する新しい技術になる。
【０００５】
大腸菌等においては、pH恒常性に関与するＮａ＋／Ｈ＋アンチポーターをコードする遺伝子が同定されており、それらの遺伝子を増強した大腸菌（特許文献１参照）を用いる方法が知られている。しかし、有用物質の製造に有用なコリネ型細菌においては、このような検討は行われておらず、どのような機能がpH恒常性を司っているかについての報告もない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００７−１８５１８４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、コリネ型細菌のアルカリ性感受性を相補する活性を有する蛋白質、該蛋白質をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡ、該組換え体ＤＮＡで形質転換されたコリネ型細菌、または有用物質の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は以下の（１）〜（６）に関する。
（１）アルカリ性感受性のコリネ型細菌のアルカリ性感受性を回復させる活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡをコリネ型細菌に組み込んで得られ、かつ有用物質の生産能を有する形質転換体。
（２）アルカリ性感受性のコリネ型細菌のアルカリ性感受性を回復させる活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡが、以下の［１］〜［３］のいずれか１つのＤＮＡである、上記（１）の形質転換体。
［１］配列番号１または３で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
［２］配列番号２または４で表される塩基配列を有するＤＮＡ
［３］配列番号２または４で表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアルカリ性感受性のコリネ型細菌のアルカリ性感受性を回復させる活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
（３）上記（１）または（２）の形質転換体を培地に培養し、培養物中に有用物質を生成、蓄積させ、該培養物から該有用物質を採取することを特徴とする有用物質の製造法。
（４）以下の［１］〜［３］のいずれか１つの蛋白質。
［１］配列番号１または３で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
［２］配列番号１または３で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつアルカリ性感受性のコリネ型細菌のアルカリ性感受性を回復させる活性を有する蛋白質
［３］配列番号１または３で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性ないし同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつアルカリ性感受性のコリネ型細菌のアルカリ性感受性を回復させる活性を有する蛋白質
（５）以下の［１］〜［３］のいずれか１つのＤＮＡ。
［１］配列番号１または３で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
［２］配列番号２または４で表される塩基配列を有するＤＮＡ
［３］配列番号２または４で表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアルカリ性感受性のコリネ型細菌のアルカリ性感受性を回復させる活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
（６）上記（５）のＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡ。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、アルカリ性感受性のコリネ型細菌のアルカリ性感受性を回復させる活性を有する蛋白質、該蛋白質をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡ、該組換え体ＤＮＡで形質転換されたコリネ型細菌、または有用物質の製造方法を提供することができる。
【００１０】
本発明の形質転換体を使用した場合、有用物質の生産性ないし収量が向上する。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明に用いられるコリネ型細菌の形質転換体としては、アルカリ性感受性のコリネ型細菌のアルカリ性感受性を回復させる活性を有する蛋白質（以下、本発明の蛋白質ともいう）をコードするＤＮＡ（以下、本発明のＤＮＡともいう）をコリネ型細菌に組み込んで得られ、かつアミノ酸、核酸等の有用物質の生産能を有する形質転換体（以下、本発明の形質転換体ともいう）があげられる。
【００１２】
コリネ型細菌としては、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属、ミクロバクテリウム（Microbacterium）属に属する微生物があげられるが、コリネバクテリウム属に属する微生物が好ましく用いられる。
【００１３】
コリネバクテリウム属に属する微生物としては、コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム（Corynebacterium acetoacidophilum）ATCC13870等のコリネバクテリウム・アセトアシドフィラム、コリネバクテリウム・アセトグルタミカム(Corynebacteriumacetoglutamicum)ATCC15806等のコリネバクテリウム・アセトグルタミカム、コリネバクテリウム・カルナエ(Corynebacteriumcallunae)ATCC15991等のコリネバクテリウム・カルナエ、コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacteriumglutamicum) ATCC13032、コリネバクテリウム・グルタミカム ATCC13060、コリネバクテリウム・グルタミカム ATCC13826、コリネバクテリウム・グルタミカム ATCC14020、コリネバクテリウム・グルタミカム ATCC13869、コリネバクテリウム グルタミカムAHP-3株（FERM BP-7382）、コリネバクテリウム・グルタミカムRB26I株（WO2006/035831）、コリネバクテリウム・グルタミカムATCC31833株、コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032株等のコリネバクテリウム・グルタミカム、コリネバクテリウム・ハーキュリス(Corynebacteriumherculis) ATCC13868等のコリネバクテリウム・ハーキュリス、コリネバクテリウム・リリアム(Corynebacteriumlilium) ATCC15990等のコリネバクテリウム・リリアム、コリネバクテリウム・メラセコラ(Corynebacteriummelassecola) ATCC17965等のコリネバクテリウム・メラセコラ、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス(Corynebacteriumthermoaminogenes)ATCC9244等のコリネバクテリウム・サーモアミノゲネス等に属する微生物があげられる。
【００１４】
ブレビバクテリウム属に属する微生物としては、ブレビバクテリウム・サッカロリティカム(Brevibacterium saccharolyticum)ATCC14066等のブレビバクテリウム・サッカロリティカム、ブレビバクテリウム・イマリオフィラム(Brevibacteriumimmariophilum)ATCC14068等のブレビバクテリウム・イマリオフィラム、ブレビバクテリウム・ローゼアム(Brevibacteriumroseum)等のATCC13825ブレビバクテリウム・ローゼアム、ブレビバクテリウム・チオゲニタリス(Brevibacteriumthiogenitalis)ATCC19240等のブレビバクテリウム・チオゲニタリス等に属する微生物があげられる。
【００１５】
ミクロバクテリウム属に属する微生物としては、ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム(Microbacterium ammoniaphilum)ATCC15354等のミクロバクテリウム・アンモニアフィラム等をあげることができる。
【００１６】
本発明により製造することができる有用物質としては、コリネ型細菌に属する微生物が生産することができる工業上有用とされている物質であればいずれでもよく、アミノ酸、核酸、ビタミン、各種酵素等のタンパク質、グルタチオン等のペプチド、キシロース等の糖、キシリトール等の糖アルコール、エタノール等のアルコール、乳酸、コハク酸等の有機酸および脂質等をあげることができ、好ましくはアミノ酸、核酸およびビタミン、特に好ましくはアミノ酸があげられる。
【００１７】
アミノ酸としては、Ｌ−アラニン、グリシン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−バリン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−プロリン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−セリン、Ｌ−システイン、Ｌ−３−ヒドロキシプロリン、Ｌ−４−ヒドロキシプロリン等があげられ、核酸としては、イノシン、グアノシン、イノシン酸、グアニル酸等があげられ、ビタミンとしては、リボフラビン、チアミン、アスコルビン酸等があげられる。
【００１８】
本発明においてコリネ型細菌が「アルカリ性感受性である」とは、野生型のコリネ型細菌、好ましくはコリネバクテリウム・グルタミカムATCC31833株またはコリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032株、さらに好ましくはコリネバクテリウム・グルタミカムATCC31833株は生育可能なアルカリ性の培地(ｐＨ８〜１０、たとえばｐＨ８，９，９．２５，９．５、９．７５、１０など)において該コリネ型細菌は生育できないか、または生育できたとしても生育速度が野生型株の通常５０％以下、好ましくは２０％以下、より好ましくは１０％以下に低下していることをいう。
【００１９】
コリネ型細菌がアルカリ性感受性であるか否かを判定する培地において、炭素源としては、グルコース、果糖、シュークロース、マルトース、でんぷん加水分解物等の糖類、エタノールなどのアルコール類、酢酸、乳酸、コハク酸等の有機酸類があげられる。
【００２０】
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、酢酸アンモニウム等の各種無機および有機アンモニウム塩類、尿素、その他窒素含有化合物、ならびに肉エキス、酵母エキス、コーン・スティープ・リカー、大豆加水分解物等の窒素含有有機物があげられる。
【００２１】
無機塩としてはリン酸第一水素カリウム、リン酸第二水素カリウム、硫酸アンモニウム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム、炭酸カルシウム等があげられる。
【００２２】
その他、必要に応じて、ビオチン、チアミン等の微量栄養源を含有してもよい。これら微量栄養源は、肉エキス、酵母エキス、コーン・スティープ・リカー、大豆加水分解物、カザミノ酸等の培地添加物で代用することもできる。
【００２３】
上記のアルカリ性の培地で、コリネ型細菌を２０〜４２℃、好ましくは３０℃〜４０℃で１〜６日間培養し、生育速度を調べることで、該コリネ型細菌のアルカリ性感受性の有無を調べることができる。
【００２４】
本発明のＤＮＡとしては、アルカリ性感受性のコリネ型細菌に導入した場合、得られる形質転換体の上記アルカリ性培地における生育速度が野生型株の８０％以上、好ましくは９０％以上となるまで回復させる活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡがあげられる。生育速度は、培養時間と生育菌数の関係から、常法に従って求めることができる。なお、本発明のＤＮＡを有するコリネ型細菌における該ＤＮＡを常法に従って破壊するなどして、該蛋白質の活性を低下または消失させた場合、該コリネ型細菌にはアルカリ性感受性が付与される。
【００２５】
このような活性を有する本発明の蛋白質としては、例えば以下の蛋白質があげられる。
［１］配列番号１または３で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
［２］配列番号１または３で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつコリネ型細菌のアルカリ性感受性を回復させる活性を有する蛋白質
［３］配列番号１または３で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性ないし同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつコリネ型細菌のアルカリ性感受性を回復させる活性を有する蛋白質
【００２６】
上記において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつコリネ型細菌のアルカリ性感受性を回復させる活性を有する蛋白質は、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)（以下、モレキュラー・クローニング第２版と略す）、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997)（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）、Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409(1982)、Gene, 34, 315 (1985)、Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、例えば配列番号１または３で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡ（例えば、配列番号２または４で表される塩基配列を有するＤＮＡ）に部位特異的変異を導入することにより、取得することができる。
【００２７】
欠失、置換または付加されるアミノ酸の数は特に限定されないが、上記の部位特異的変異法等の周知の方法により欠失、置換または付加できる程度の数であり、１個から数十個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個である。
【００２８】
配列番号１または３で表されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたとは、同一配列中の任意の位置において、１または複数のアミノ酸が欠失、置換または付加されていてもよい。
【００２９】
アミノ酸の欠失または付加が可能なアミノ酸の位置としては、例えば配列番号１または３で表されるアミノ酸配列のＮ末端側およびＣ末端側の１〜数個のアミノ酸をあげることができる。
【００３０】
欠失、置換または付加は同時に生じてもよく、置換または付加されるアミノ酸は天然型と非天然型とを問わない。天然型アミノ酸としては、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、Ｌ−システインなどがあげられる。
【００３１】
以下に、相互に置換可能なアミノ酸の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸は相互に置換可能である。
【００３２】
Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、2-アミノブタン酸、メチオニン、Ｏ-メチルセリン、t-ブチルグリシン、t-ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン
Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、2-アミノアジピン酸、2-アミノスベリン酸
Ｃ群：アスパラギン、グルタミン
Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、2,4-ジアミノブタン酸、2,3-ジアミノプロピオン酸
Ｅ群：プロリン、3-ヒドロキシプロリン、4-ヒドロキシプロリン
Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリン
Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン
【００３３】
また、本発明の蛋白質がコリネ型細菌のアルカリ性感受性を回復させる活性を有するためには、配列番号１または３で表されるアミノ酸配列との相同性ないし同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性ないし同一性を有していることが望ましい。
【００３４】
アミノ酸配列や塩基配列の相同性ないし同一性は、Karlin and AltschulによるアルゴリズムBLAST[Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993)]やFASTA[Methods Enzymol., 183, 63 (1990)]を用いて決定することができる。このアルゴリズムBLASTに基づいて、BLASTNやBLASTXとよばれるプログラムが開発されている［J. Mol. Biol., 215, 403(1990)］。BLASTに基づいてBLASTNによって塩基配列を解析する場合には、パラメータは例えばScore＝100、wordlength＝12とする。また、BLASTに基づいてBLASTXによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメータは例えばscore＝50、wordlength＝3とする。gapped alignmentを得るために、Altschulら(1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402)に記載されるようにGapped BLASTを利用することができる。あるいは、PSI-BlastまたはPHI-Blastを用いて、分子間の位置関係（Id.）および共通パターンを共有する分子間の関係を検出する繰返し検索を行うことができる。BLAST、Gapped BLAST、PSI-Blast、およびPHI-Blastプログラムを利用する場合、それぞれのプログラムのデフォルトパラメータを用いることができる。http://www.ncbi.nlm.nih.gov.を参照されたい。
【００３５】
配列番号１または３で表されるアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性ないし同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつコリネ型細菌のアルカリ性感受性を回復させる活性を有する蛋白質もまた本発明の蛋白質である。
【００３６】
本発明の蛋白質が、コリネ型細菌のアルカリ性感受性を回復させる活性を有する蛋白質であることは、該蛋白質を発現させたアルカリ性感受性のコリネ型細菌の上記アルカリ性培地における生育速度が野生型株の８０％以上、好ましくは９０％以上となるまで回復することで確認できる。
【００３７】
コリネ型細菌に導入する本発明のＤＮＡとしては、以下の[４]〜[６]のＤＮＡがあげられる。
［４］上記の［１］〜［３］の本発明の蛋白質をコードするＤＮＡ、
［５］配列番号２または４で表される塩基配列を有するＤＮＡ、および
［６］配列番号２または４で表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつコリネ型細菌のアルカリ性感受性を回復させる活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
【００３８】
なお、配列番号２および４記載の塩基配列を有するＤＮＡは、DDBJ/GenBank/EMBLに、それぞれ、Cgl1281 (NCgl1232)およびCgl1434 (NCgl1379)として登録されているＤＮＡであり、それぞれ、該データベースにおいてコバルト／亜鉛／カドミウム排出システムに係ると記載されている配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質および亜鉛トランスポーターに係ると記載されている配列番号３で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードしている。
【００３９】
ここでいう「ハイブリダイズする」とは、特定の条件下で特定の塩基配列を有するＤＮＡまたは該ＤＮＡの一部にＤＮＡがハイブリダイズすることをいう。したがって、該特定の塩基配列を有するＤＮＡまたは該ＤＮＡの一部の塩基配列は、ノーザンまたはサザンブロット解析のプローブとして有用であるか、またはＰＣＲ解析のオリゴヌクレオチドプライマーとして使用できる長さのＤＮＡであってもよい。プローブとして用いるＤＮＡとしては、少なくとも１００塩基以上、好ましくは２００塩基以上、より好ましくは５００塩基以上のＤＮＡをあげることができるが、少なくとも１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上のＤＮＡであってもよい。
【００４０】
ＤＮＡのハイブリダイゼーション実験の方法はよく知られており、例えばモレキュラー・クローニング第２版、第３版（２００１年）、Methods for General and Molecular Bacteriolgy, ASM Press（1994）、Immunology methods manual, Academic press(Molecular)に記載の他、多数の他の標準的な教科書に従ってハイブリダイゼーションの条件を決定し、実験を行うことができる。
【００４１】
上記のストリンジェントな条件とは、例えばＤＮＡを固定化したフィルターとプローブＤＮＡとを50％ホルムアミド、5×SSC（750ｍMの塩化ナトリウム、75mMのクエン酸ナトリウム）、50mMのリン酸ナトリウム（pH7.6）、5×デンハルト溶液、10％の硫酸デキストラン、および20μg/lの変性させたサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で42℃で一晩、インキュベートした後、例えば約65℃の0.2×SSC溶液中で該フィルターを洗浄する条件をあげることができるが、より低いストリンジェント条件を用いることもできる。ストリンジェントな条件の変更は、ホルムアミドの濃度調整（ホルムアミドの濃度を下げるほど低ストリンジェントになる）、塩濃度および温度条件の変更により可能である。低ストリンジェント条件としては、例えば6×SSCE（20×SSCEは、3mol/lの塩化ナトリウム、0.2mol/lのリン酸二水素ナトリウム、0.02mol/lのEDTA、pH7.4）、0.5％のSDS、30％のホルムアミド、100μg/lの変性させたサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で、37℃で一晩インキュベートした後、50℃の1×SSC、0.1％SDS溶液を用いて洗浄する条件をあげることができる。また、さらに低いストリンジェントな条件としては、上記した低ストリンジェント条件において、高塩濃度（例えば5×SSC）の溶液を用いてハイブリダイゼーションを行った後、洗浄する条件をあげることができる。
【００４２】
上記した様々な条件は、ハイブリダイゼーション実験のバックグラウンドを抑えるために用いるブロッキング試薬を添加、または変更することにより設定することもできる。上記したブロッキング試薬の添加は、条件を適合させるために、ハイブリダイゼーション条件の変更を伴ってもよい。
【００４３】
上記したストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、例えば上記したBLASTおよびFASTA等のプログラムを用いて、上記パラメーターに基づいて計算したときに、配列番号２または４で表される塩基配列と少なくとも８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性ないし同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡをあげることができる。
【００４４】
上記したＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡが、コリネ型細菌のアルカリ性感受性を回復させる活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡであることは、アルカリ性感受性のコリネ型細菌を宿主とし、該ＤＮＡを導入して得られる形質転換体の上記アルカリ性培地における生育速度が野生型株の８０％以上、好ましくは９０％以上となることで確認できる。
【００４５】
本発明のＤＮＡは、例えばコリネ型細菌に属する微生物から斎藤らの方法〔Biochim. Biophys. Acta, 72, 619 (1963)〕に従い調製した染色体ＤＮＡを鋳型として、配列番号２または４で表される塩基配列に基づき設計、合成したプライマーＤＮＡを用いてＰＣＲにより取得することができる。
【００４６】
例えば、コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032株またはATCC31833株から染色体ＤＮＡを調製し、該ＤＮＡを鋳型として、配列番号２または４で表されるそれぞれの塩基配列の５’末端および３’末端領域の配列を有するＤＮＡをプライマーセットとして用いたＰＣＲにより本発明のＤＮＡを取得することができる。
【００４７】
取得できる具体的なＤＮＡとしては、配列番号２で表される塩基配列を有するCgl1281 (NCgl1232)および配列番号４で表される塩基配列を有するCgl1434 (NCgl1379)等をあげることができる。
【００４８】
また、配列番号２または配列番号４で表される塩基配列からなるＤＮＡの一部、または全部をプローブとしたハイブリダイゼーション法、または配列番号２または配列番号４で表される塩基配列に基づき、公知の方法で該塩基配列を有するＤＮＡを化学合成する方法等によっても取得することができる。
【００４９】
また、各種の遺伝子配列データベースに対して配列番号１または３で表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列と８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性ないし同一性を有する配列を検索し、該検索によって得られた塩基配列に基づき、該塩基配列を有する生物の染色体ＤＮＡ、ｃＤＮＡライブラリー等から上記した方法により本発明のＤＮＡ、または本発明の製造法に用いられるＤＮＡを取得することもできる。
【００５０】
ＤＮＡの塩基配列は、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばジデオキシ法 [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74, 5463 (1977)]、373A・ＤＮＡシークエンサー（パーキン・エルマー社製）等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより決定することができる。
【００５１】
塩基配列を決定した結果、取得されたＤＮＡが部分長であった場合は、該部分長ＤＮＡをプローブに用いた、染色体ＤＮＡライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーション法等により、全長ＤＮＡを取得することができる。
【００５２】
取得したＤＮＡをそのまま、または必要に応じてコリネ型細菌の発現に最適なコドンとなるように塩基を置換したＤＮＡを調製し、さらに必要に応じて該蛋白質をコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片とし、コリネ型細菌に適した発現ベクターのプロモーターの下流に挿入して組換え体ＤＮＡを調製する。
【００５３】
ベクターとしては、コリネ型細菌において自律複製可能または染色体中への組み込みが可能で、本発明のＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが好ましく用いられる。
【００５４】
例えば、pCG1（特開昭57-134500）、pCG2（特開昭58-35197）、pCG4（特開昭57-183799）、pCG11（特開昭57-134500）、pCG116、pCE54、pCB101（いずれも特開昭58-105999）、pCE51、pCE52、pCE53〔いずれもMolecular and General Genetics, 196, 175 (1984)〕等が好適に用いられる。
【００５５】
ベクターに本発明のＤＮＡを組み込んで得られる組換え体ＤＮＡは、プロモーター、リボソーム結合配列、本発明のＤＮＡ、転写終結配列、より構成されることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
【００５６】
プロモーターとしては、宿主細胞(コリネ型細菌)中で機能するものであればいかなるものでもよい。例えば、trpプロモーター（Ptrp）、lacプロモーター、PLプロモーター、PRプロモーター、T7プロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーターをあげることができる。またPtrpを２つ直列させたプロモーター（Ptrp×２）、tacプロモーター、lacT7プロモーター、let Iプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。
【００５７】
このようなプロモーターとして好ましくは、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属に属する微生物中で発現させるためのP54-6プロモーター［Appl. Microbiol. Biotechnol., 53, 674-679 (2000)］を用いることができる。
【００５８】
リボソーム結合配列であるシャイン−ダルガノ（Shine-Dalgarno）配列と開始コドンとの間は適当な距離（例えば６〜18塩基）に調節されていることが好ましい。転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列が配置されていることが好ましい。
【００５９】
得られた組換え体ＤＮＡを宿主となるコリネ型細菌に導入する。
【００６０】
組換え体ＤＮＡの導入方法としては、コリネ型細菌へＤＮＡを導入できる方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法[Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69, 2110 (1972)]、プロトプラスト法（特開昭63-248394）、エレクトロポレーション法[Nucleic Acids Res., 16, 6127 (1988)]等をあげることができる。
【００６１】
本発明の微生物における有用物質を生産する能力は、１種以上の有用物質を生産する能力であればよく、育種の過程において、必要に応じて公知の方法により所望の有用物質を生産する能力を人為的に付与または増強してもよい。
【００６２】
当該公知の方法としては、
（ａ）有用物質の生合成を制御する機構の少なくとも１つを緩和または解除する方法、
（ｂ）有用物質の生合成に関与する酵素の少なくとも１つを発現強化する方法、
（ｃ）有用物質の生合成に関与する酵素遺伝子の少なくとも１つのコピー数を増加させる方法、
（ｄ）有用物質の生合成経路から該有用物質以外の代謝産物へ分岐する代謝経路の少なくとも１つを弱化または遮断する方法、および
（ｅ）野生型株に比べ、有用物質のアナログに対する耐性度が高い細胞株を選択する方法、
などをあげることができ、上記公知の方法は単独または組み合わせて用いることができる。
【００６３】
上記（ａ）〜（ｅ）の具体的な方法は、例えば有用物質がアミノ酸である場合については、上記（ａ）の方法に関してはAgric. Biol. Chem., 43, 105-111(1979)、J. Bacteriol., 110, 761-763(1972)およびAppl. Microbiol. Biotechnol., 39, 318-323(1993)などに記載されている。上記（ｂ）の方法に関しては、Agric. Biol. Chem., 43, 105-111(1979)およびJ. Bacteriol., 110, 761-763(1972)などに記載されている。上記（ｃ）の方法に関しては、Appl. Microbiol. Biotechnol., 39, 318-323(1993)およびAgric. Biol. Chem., 39, 371-377(1987)などに記載されている。上記（ｄ）の方法に関しては、Appl. Environ. Micribiol., 38, 181-190(1979)およびAgric. Biol. Chem., 42, 1773-1778(1978)などに記載されている。上記（ｅ）の方法に関しては、Agric. Biol. Chem., 36, 1675-1684(1972)、Agric. Biol. Chem., 41, 109-116(1977)、Agric. Biol. Chem., 37, 2013-2023(1973)およびAgric. Biol. Chem., 51, 2089-2094(1987)などに記載されている。上記文献等を参考に各種アミノ酸を生成、蓄積する能力を有する微生物を調製することができる。
【００６４】
さらに上記（ａ）〜（ｅ）のいずれかまたは組み合わせた方法によるアミノ酸を生成、蓄積する能力を有する微生物の調製方法については、Biotechnology 2nd ed., Vol.6, Products of Primary Metabolism (VCH Verlagsgesellschaft mbH, Weinheim, 1996) section 14a, 14bやAdvances in Biochemical Engineering/ Biotechnology 79, 1-35 (2003)、アミノ酸発酵、学会出版センター、相田 浩ら（1986）に多くの例が記載されている。また、上記以外にも具体的なアミノ酸を生成、蓄積する能力を有する微生物の調製方法は、特開2003-164297、Agric. Biol. Chem., 39, 153-160 (1975)、Agric. Biol. Chem., 39, 1149-1153(1975)、特開昭58-13599、J. Gen. Appl. Microbiol., 4, 272-283(1958)、特開昭63-94985、Agric. Biol. Chem., 37, 2013-2023(1973)、WO97/15673、特開昭56-18596、特開昭56-144092および特表2003-511086など数多くの報告があり、上記文献等を参照することにより１種以上のアミノ酸を生産する能力を有する微生物を調製することができる。
【００６５】
アミノ酸以外の有用物質を生産する能力を微生物に付与する方法もまた、多くの報告があり、従来知られているすべての方法は、本発明の製造法に用いられる微生物の調製に用いることができる。
【００６６】
アルカリ性感受性を回復させる活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡは、コリネ型細菌の染色体に組み込んでもよく、プラスミドとしてコリネ型細菌に導入して形質転換体としてもよい。また、アルカリ性感受性を回復させる活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡは、コリネ型細菌由来のＤＮＡが好ましく使用される。
【００６７】
なお、宿主として用いるコリネ型細菌として、アミノ酸、核酸等の有用物質の生産能を有しているものを用いた場合、得られる形質転換体は、そのまま有用物質の製造に用いることができるが、有用物質の生産能を有していないものを用いた場合においては、得られた形質転換体に、さらに有用物質に係る他の遺伝子を導入する方法、突然変異処理による栄養要求性変異の導入、アミノ酸アナログ耐性変異の導入等の方法によって有用物質の生産能を付与して、本発明の形質転換体として用いることができる。
【００６８】
本発明の形質転換体の培養は、コリネ型細菌の通常の培養法によって行う。
【００６９】
形質転換体の培養のための培地の炭素源、窒素源、無機塩、その他の添加剤は、アルカリ性感受性を判定するための培地と同じものを使用できる。
【００７０】
形質転換体の培養は、振とう培養、深部通気撹拌培養等の好気的条件下で行う。培養温度は通常２０℃〜４２℃であり、３０℃〜４０℃が好ましい。培地中のｐＨは、５〜９に維持することが好ましい。ｐＨの調整は、無機あるいは有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニアなどを用いて行う。
【００７１】
培養期間は通常１〜６日間である。また、培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００７２】
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた組換え体ＤＮＡで形質転換したコリネ型細菌を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、lacプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、trpプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
【００７３】
本発明の蛋白質の生産方法としては、宿主細胞内に生産させる方法、宿主細胞外に分泌させる方法、あるいは宿主細胞外膜上に生産させる方法があり、使用する宿主細胞や、生産させる蛋白質の構造を変えることにより、該方法を選択することができる。
【００７４】
本発明の蛋白質が宿主細胞内あるいは宿主細胞外膜上に生産される場合、ポールソンらの方法〔J. Biol. Chem.，264, 17619 (1989)〕、ロウらの方法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 8227 (1989)、Genes Develop., 4, 1288（1990)〕、または特開平5-336963、WO94/23021等に記載の方法を準用することにより、該蛋白質を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。すなわち、遺伝子組換えの手法を用いて、本発明の蛋白質の活性部位を含むポリペプチドの手前にシグナルペプチドを付加した形で発現させることにより、本発明の蛋白質を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。また、特開平2-227075に記載されている方法に準じて、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子等を用いた遺伝子増幅系を利用して生産量を上昇させることもできる。
【００７５】
有用物質の製造は、本発明の形質転換体を培地に培養して得られる培養物中に生成蓄積した有用物質を採取することにより行う。
【００７６】
培養方法は、上記本発明の蛋白質の製造方法と同様の方法を用いることができるが、製造する有用物質により最適な条件とすることが好ましい。
【００７７】
培養物中に生成、蓄積した有用物質は、菌体などの沈殿物を除去し、活性炭処理、イオン交換樹脂処理などの公知の方法を併用することにより回収することができる。
【００７８】
以下に本発明の実施例を示すが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００７９】
（１）コリネバクテリウム・グルタミカムATCC31833株（以下、単にATCC31833株ともいう）を常法によりニトロソグアニジンで変異処理した。
【００８０】
処理後のATCC31833株をpH 7.0のＭＭ寒天培地（グルコース 10g、硫酸マグネシウム７水和物0.4g、塩化アンモニウム 4g、尿素2g、リン酸一水素カリウム３g、リン酸二水素カリウム １g、硫酸鉄７水和物10 mg、硫酸マンガン５水和物1 mg、ニコチン酸 5 mg、ビオチン 0.1 mg、チアミン塩酸塩 5 mg、CAPS 0.1molおよびバクトアガー20gを水1リットルに含み、水酸化ナトリウム水溶液によりpHを調整した培地）に塗布した。一方、pH 9.5のＭＭ寒天培地を調製し、レプリカ法により、 pH 9.5のＭＭ寒天培地では生育が悪化する株、および生育できない株をアルカリ感受性株として選択した。これらの選択株の中から、アルカリ性感受性の度合いの異なる２種の変異株を代表株として選抜し、それぞれAL-43株、AL-77株と命名した。
【００８１】
第１表に示すpHに調整したＭＭ寒天培地を調製し、30℃で一日間培養した。これら２株の該寒天培地上での生育を第１表に示す。
【００８２】
【表１】
【００８３】
第１表に示すとおり、AL-43株およびAL-77株は、アルカリ性感受性を示した。
（２）ATCC31833株の染色体ＤＮＡを、特開平6-169785記載の方法に準じて調製した。
【００８４】
一方、コリネバクテリウム・グルタミカムで複製可能なプラスミドpCSEK20（再公表特許WO01/021774）およびpCS299P[Appl. Microbiol. Biotech., 63, 592 (2004)]を、これらを保有するコリネバクテリウム・グルタミカムATCC31833株の培養菌体から特開平6-169785記載のベクターの調製方法に従って調製した。
【００８５】
なお、プラスミドpCSEK20は、コリネバクテリウム・グルタミカム由来のプラスミドpCG2(特開昭58-35197)の複製開始点、コリネバクテリウム・グルタミカム由来のプラスミドpCG4(特開昭57-183799)のスペクチノマイシンおよびストレプトマイシン耐性遺伝子、およびエシェリヒア・コリ(Escherichiacoli)の一般的ベクターpCG22[J.Bacteriol., 140, 400 (1979)]のカナマイシン耐性遺伝子から成るプラスミドである。
【００８６】
また、プラスミドpCS299Pは、コリネバクテリウム・グルタミカム由来のプラスミドpCG116[Bio/Technology, 11, 921(1993)]の複製開始点、およびエシェリヒア・コリの一般的ベクターpHSG299[Gene, 61, 63 (1987)]のカナマイシン耐性遺伝子から成るプラスミドである。
【００８７】
ATCC31833株の染色体ＤＮＡとプラスミドpCSEK20を各々EcoRIで切断し、両切断物をライゲーションキットにより連結した。一方、ATCC31833株の染色体ＤＮＡとプラスミドpCS299Pを各々BamHIで切断し、両切断物をライゲーションキットにより連結した。
【００８８】
このようにして構築した２種類のゲノムライブラリを用いて、（１）で得たアルカリ性感受性株AL-43株およびAL-77株を、特開平6-169785記載の方法に従って形質転換した。
【００８９】
得られた形質転換体の中から、カナマイシン20μg/mlを含有するpH9.5のＭＭ寒天培地で生育可能な株を、アルカリ性感受性が回復した形質転換株として選択した。選択した形質転換株から、特開平6-169785記載のベクターの調製方法に従ってプラスミドＤＮＡを単離した。
【００９０】
得られたプラスミドＤＮＡを各制限酵素で切断し、解析して、AL-43株のアルカリ性感受性を回復させるＤＮＡ断片として4.0KbのEcoRI切断断片を取得し、AL-77株のアルカリ性感受性を回復させるＤＮＡ断片として2.8KbのBamHI切断断片を取得した。このようにして得られた4.0KbのEcoRI断片を含有するプラスミドをpEco4.0、一方、2.8KbのBamHI断片を含有するプラスミドをpBam2.8と命名した。
【００９１】
pEco4.0およびpBam2.8に挿入された各ＤＮＡ断片の塩基配列を再公表特許WO01/021774に記載のジデオキシヌクレオチド酵素法により決定した。
【００９２】
決定した塩基配列を、コリネバクテリウム・グルタミカムの全ゲノム情報（アクセッションナンバーBA000036）に基づいて解析した結果、pEco4.0が含有する4.0KbのEcoRI断片にはCgl1278、Cgl1279、Cgl1280およびCgl1281の４つの遺伝子が存在していた。一方、pBam2.8が含有する2.8KbのBamHI断片にはCgl1434が存在していた。
【００９３】
pEco4.0から種々のＤＮＡ断片を常法によりサブクローニングしてAL-43株のアルカリ感受性の回復能を調べた結果、Cgl1281遺伝子のみを含有するプラスミドpCgl1281がAL-43株のアルカリ性感受性を回復させた。
【００９４】
なお、プラスミドpCgl1281は、プラスミドpEco4.0を鋳型として用いて配列番号５および６で表される塩基配列を有するＤＮＡをプライマーとして用いてＰＣＲを行って得られた1.9 kbのＤＮＡ断片およびベクターpCSEK20をEcoRIで制限酵素処理し、両者を連結して得られたプラスミドである。
【００９５】
Cgl1281遺伝子の塩基配列から推測されるアミノ酸配列を配列番号１に、塩基配列を配列番号２に示す。
【００９６】
また、AL-77株を相補するCgl1434遺伝子の塩基配列から推測されるアミノ酸配列を配列番号３に、塩基配列を配列番号４に示す。
（３）AL-43株、AL-43株にプラスミドpCgl1281を導入して得られたAL-43/ pCgl1281 株、AL-77株およびAL-77株にプラスミドpBam2.8を導入して得られたAL-77/ pBam2.8株を、第２表に示したｐHに調製したＭＭ寒天培地に塗布し、３０℃で１日間培養し、各菌株の生育を調べた。
【００９７】
結果を第２表に示す。
【００９８】
【表２】
【００９９】
第２表に示すとおり、AL-43/ pCgl1281 株およびAL-77/ pBam2.8株では、宿主株と比較してアルカリ感受性が回復していた。
【実施例２】
【０１００】
実施例１で取得したプラスミドpCgl1281およびpBam2.8を用い、特開平6-169785記載の方法に従ってＬ−グルタミン生産菌を形質転換する。Ｌ−グルタミン生産菌としては、たとえばコリネバクテリウム・グルタミカムの野生型菌株であるATCC14752株（特公昭62-51112）を用いる。
【０１０１】
得られた各形質転換体を、たとえばBYG寒天培地（グルコース 10g、肉エキス 7g、ペプトン 10g、塩化ナトリウム 3g、酵母エキス 5g、バクトアガー 18ｇを水１Lに含みpH7.2に調整した培地）で28℃で24時間培養した培養菌体１白金を、生産培地（グルコース 150g、塩化アンモニウム 50g、リン酸一水素カリウム 0.7g、リン酸二水素カリウム 0.7g、硫酸マグネシウム７水和物 0.5g、硫酸鉄７水和物 20mg、硫酸マンガン５水和物 20mg、硫酸亜鉛７水和物 10mg、ビオチン 6μg、チアミン塩酸塩 1mg、肉エキス 5gを水1Lに含みpH7.2に調整後、炭酸カルシウムを 50g加えた培地）20mlを含む 300ml容三角フラスコに接種し、28℃で96時間、培養する。
【０１０２】
遠心分離により培養物から菌体を除去し、上清中のＬ−グルタミンを回収する。
【実施例３】
【０１０３】
実施例１で取得したプラスミドpCgl1281およびpBam2.8を用い、特開平6-169785記載の方法に従っL-アルギニン生産菌を形質転換する。L-アルギニン生産菌としては、例えばコリネバクテリウム・グルタミカムのRB26I株（WO2006/035831）を用いる。
【０１０４】
得られた形質転換体をBYG寒天培地上で30℃、24時間培養した培養菌体１白金耳を、種培地（ショ糖 25g、コーン・スティープ・リカー 20g、ペプトン 20g、酵母エキス 10g、硫酸マグネシウム7水和物 0.5g、リン酸二水素カリウム 2g、尿素 3g、硫酸アンモニウム 8g、塩化ナトリウム 1g、ニコチン酸 20mg、硫酸鉄7水和物 10mg、パントテン酸カルシウム 10mg、硫酸亜鉛7水和物 1mg、硫酸銅5水和物 1mg、チアミン塩酸塩 1mg、ビオチン 100μgを水 1Lに含み水酸化ナトリウム水溶液によりpH7.2に調整後、炭酸カルシウムを10g加えた培地）6mlを含む太型試験管に植菌して32℃で24時間培養する。
【０１０５】
得られた種培養液 2mlを本培養培地（グルコース 60g、コーン・スティープ・リカー 5g、硫酸アンモニウム 30g、塩化カリウム 8g、尿素 2g、リン酸二水素カリウム 0.5g、リン酸水素二カリウム 0.5g、硫酸マグネシウム7水和物 1g、塩化ナトリウム 1g、硫酸鉄7水和物 20mg、ニコチン酸 20mg、ベーターアラニン 20mg、硫酸マンガン5水和物 10mg、チアミン塩酸塩 10mg、ビオチン 200μgを水 1Lに含み水酸化ナトリウム水溶液によりpH7.7に調整後、炭酸カルシウムを30g加えた培地) 20mlを含む300ml容三角フラスコに接種し、32℃で48時間培養する。遠心分離により培養物から菌体を除去し、上清中のL-アルギニンを回収する。
【実施例４】
【０１０６】
実施例１で取得したプラスミドpCgl1281およびpBam2.8を用い、特開平6-169785記載の方法に従ってL-リジン生産菌であるコリネバクテリウム グルタミカムAHP-3株（FERM BP-7382）を形質転換した。得られた形質転換株はそれぞれAHP-3/pCgl1281、AHP-3/pBam2.8と命名した
これら各形質転換株と親株のL-リジン生産能を以下のような試験管培養を行うことにより評価した。BY寒天培地（肉エキス 7g、ペプトン 10g、塩化ナトリウム 3g、酵母エキス 5g、バクトアガー 15ｇを水1Lに含み、pH7.2に調整した培地）で30℃、24時間培養した培養菌体１白金耳を、種培地（グルコース 20g、肉エキス 7g、ペプトン 10g、塩化ナトリウム 3g、酵母エキス 5gを水１Lに含みpH7.2に調整後、炭酸カルシウムを10g加えた培地）5mlを含む太型試験管に植菌して30℃で13時間培養した。この種培養液 0.5mlを本培養培地（グルコース 50g、コーンスティープリカー 10g、硫酸アンモニウム 45g、尿素 4g、リン酸二水素カリウム 0.5g、硫酸マグネシウム7水和物 0.5g、ビオチン 0.3mgを水 1Lに含みpH7.0に調整後、炭酸カルシウムを30g加えた培地) 5mlを含む太型試験管に接種し、30℃で72時間振とう培養した。遠心分離により培養物から菌体を除去し、上清中のL-リジン塩酸塩の蓄積量を高速液体クロマトグラフィー（HPLC）により定量した。結果を第３表に示す。
【０１０７】
【表３】
【０１０８】
第３表から明らかなように、本発明の遺伝子を含むプラスミドを導入したAHP-3株では、菌体あたりのL-リジンの生産量が親株AHP-3に比べて向上していた。
【実施例５】
【０１０９】
実施例１で取得したプラスミドpCgl1281およびpBam2.8を用い、特開平6-169785記載の方法に従ってL-アルギニン生産菌を形質転換した。L-アルギニン生産菌としては、コリネバクテリウム・グルタミカムのRB26I株（WO2006/035831）を用いた。
【０１１０】
これら各形質転換株と親株のL-アルギニン生産試験を三角フラスコ培養により次のように行った。BY寒天培地上で30℃、24時間培養した培養菌体１白金耳を、種培地（ショ糖 25g、コーンスティープリカー 20g、ペプトン 20g、酵母エキス 10g、硫酸マグネシウム7水和物 0.5g、リン酸二水素カリウム 2g、尿素 3g、硫酸アンモニウム 8g、塩化ナトリウム 1g、ニコチン酸 20mg、硫酸鉄7水和物 10mg、パントテン酸カルシウム 10mg、硫酸亜鉛7水和物 1mg、硫酸銅5水和物 1mg、チアミン塩酸塩 1mg、ビオチン 100μgを水 1Lに含みpH7.2に調整後、炭酸カルシウムを10g加えた培地）6mlを含む太型試験管に植菌して32℃で24時間培養した。この種培養液 2mlを本培養培地（グルコース 60g、コーンスティープリカー 5g、硫酸アンモニウム 30g、塩化カリウム 8g、尿素 4g、リン酸二水素カリウム 0.5g、リン酸水素二カリウム 0.5g、硫酸マグネシウム7水和物 1g、塩化ナトリウム 1g、硫酸鉄7水和物 20mg、ニコチン酸 20mg、ベーターアラニン 20mg、硫酸マンガン5水和物 10mg、チアミン塩酸塩 10mg、ビオチン 200μgを水 1Lに含みpH7.7に調整後、炭酸カルシウムを30g加えた培地) 20mlを含む300ml容三角フラスコに接種し、32℃で48時間培養した。遠心分離により培養物から菌体を除去し、上清中のL-アルギニンの蓄積量を高速液体クロマトグラフィー（HPLC）により定量した。結果を第４表に示す。
【０１１１】
【表４】
【０１１２】
第４表から明らかなように、本発明の遺伝子を含むプラスミドを導入したRB26I株では、菌体あたりのL-アルギニンの生産量が親株RB26Iに比べて向上していた。
【産業上の利用可能性】
【０１１３】
本発明によれば、アルカリ性感受性のコリネ型細菌のアルカリ性感受性を回復させる活性を有する蛋白質、該蛋白質をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡ、該組換え体ＤＮＡで形質転換されたコリネ型細菌、または有用物質の製造方法を提供することができる。
【０１１４】
本発明のコリネ型細菌の形質転換体は、有用物質の生産性が向上する。
【配列表フリーテキスト】
【０１１５】
配列番号５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルカリ性感受性のコリネ型細菌のアルカリ性感受性を回復させる活性を有する蛋白質、該蛋白質をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡ、該組換え体ＤＮＡで形質転換されたコリネ型細菌、および有用物質の製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
工業レベルでのアミノ酸、核酸等の有用物質の発酵生産は、容積が数百キロリットルという大型の発酵槽を用いて行われる。しかし、このような大規模な製造現場では、生産菌株の能力が最大限に発揮されず、小型の設備を用いた予備検討の結果が再現されないことが多い。
【０００３】
このようなスケールアップにともなう有用物質の生産性の低下は、主として培養液量に比例した撹拌効率の低下によるものと考えられている。たとえば、撹拌効率の低下によって生じるpHの分布は細胞生理に少なからぬストレスを与え、成績低下や成績不安定性の大きな要因となっている。
【０００４】
この問題に対処する方法としては、発酵槽内の液の混合効率を上げることがあげられるが、設備面での改良が必要になり、コストがかかるという問題がある。設備に頼らない、菌株面からの対応が可能になれば、発酵生産性を改善する新しい技術になる。
【０００５】
大腸菌等においては、pH恒常性に関与するＮａ＋／Ｈ＋アンチポーターをコードする遺伝子が同定されており、それらの遺伝子を増強した大腸菌（特許文献１参照）を用いる方法が知られている。しかし、有用物質の製造に有用なコリネ型細菌においては、このような検討は行われておらず、どのような機能がpH恒常性を司っているかについての報告もない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００７−１８５１８４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、コリネ型細菌のアルカリ性感受性を相補する活性を有する蛋白質、該蛋白質をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡ、該組換え体ＤＮＡで形質転換されたコリネ型細菌、または有用物質の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は以下の（１）〜（６）に関する。
（１）アルカリ性感受性のコリネ型細菌のアルカリ性感受性を回復させる活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡをコリネ型細菌に組み込んで得られ、かつ有用物質の生産能を有する形質転換体。
（２）アルカリ性感受性のコリネ型細菌のアルカリ性感受性を回復させる活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡが、以下の［１］〜［３］のいずれか１つのＤＮＡである、上記（１）の形質転換体。
［１］配列番号１または３で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
［２］配列番号２または４で表される塩基配列を有するＤＮＡ
［３］配列番号２または４で表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアルカリ性感受性のコリネ型細菌のアルカリ性感受性を回復させる活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
（３）上記（１）または（２）の形質転換体を培地に培養し、培養物中に有用物質を生成、蓄積させ、該培養物から該有用物質を採取することを特徴とする有用物質の製造法。
（４）以下の［１］〜［３］のいずれか１つの蛋白質。
［１］配列番号１または３で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
［２］配列番号１または３で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつアルカリ性感受性のコリネ型細菌のアルカリ性感受性を回復させる活性を有する蛋白質
［３］配列番号１または３で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性ないし同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつアルカリ性感受性のコリネ型細菌のアルカリ性感受性を回復させる活性を有する蛋白質
（５）以下の［１］〜［３］のいずれか１つのＤＮＡ。
［１］配列番号１または３で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
［２］配列番号２または４で表される塩基配列を有するＤＮＡ
［３］配列番号２または４で表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアルカリ性感受性のコリネ型細菌のアルカリ性感受性を回復させる活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
（６）上記（５）のＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡ。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、アルカリ性感受性のコリネ型細菌のアルカリ性感受性を回復させる活性を有する蛋白質、該蛋白質をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡ、該組換え体ＤＮＡで形質転換されたコリネ型細菌、または有用物質の製造方法を提供することができる。
【００１０】
本発明の形質転換体を使用した場合、有用物質の生産性ないし収量が向上する。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明に用いられるコリネ型細菌の形質転換体としては、アルカリ性感受性のコリネ型細菌のアルカリ性感受性を回復させる活性を有する蛋白質（以下、本発明の蛋白質ともいう）をコードするＤＮＡ（以下、本発明のＤＮＡともいう）をコリネ型細菌に組み込んで得られ、かつアミノ酸、核酸等の有用物質の生産能を有する形質転換体（以下、本発明の形質転換体ともいう）があげられる。
【００１２】
コリネ型細菌としては、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属、ミクロバクテリウム（Microbacterium）属に属する微生物があげられるが、コリネバクテリウム属に属する微生物が好ましく用いられる。
【００１３】
コリネバクテリウム属に属する微生物としては、コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム（Corynebacterium acetoacidophilum）ATCC13870等のコリネバクテリウム・アセトアシドフィラム、コリネバクテリウム・アセトグルタミカム(Corynebacteriumacetoglutamicum)ATCC15806等のコリネバクテリウム・アセトグルタミカム、コリネバクテリウム・カルナエ(Corynebacteriumcallunae)ATCC15991等のコリネバクテリウム・カルナエ、コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacteriumglutamicum) ATCC13032、コリネバクテリウム・グルタミカム ATCC13060、コリネバクテリウム・グルタミカム ATCC13826、コリネバクテリウム・グルタミカム ATCC14020、コリネバクテリウム・グルタミカム ATCC13869、コリネバクテリウム グルタミカムAHP-3株（FERM BP-7382）、コリネバクテリウム・グルタミカムRB26I株（WO2006/035831）、コリネバクテリウム・グルタミカムATCC31833株、コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032株等のコリネバクテリウム・グルタミカム、コリネバクテリウム・ハーキュリス(Corynebacteriumherculis) ATCC13868等のコリネバクテリウム・ハーキュリス、コリネバクテリウム・リリアム(Corynebacteriumlilium) ATCC15990等のコリネバクテリウム・リリアム、コリネバクテリウム・メラセコラ(Corynebacteriummelassecola) ATCC17965等のコリネバクテリウム・メラセコラ、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス(Corynebacteriumthermoaminogenes)ATCC9244等のコリネバクテリウム・サーモアミノゲネス等に属する微生物があげられる。
【００１４】
ブレビバクテリウム属に属する微生物としては、ブレビバクテリウム・サッカロリティカム(Brevibacterium saccharolyticum)ATCC14066等のブレビバクテリウム・サッカロリティカム、ブレビバクテリウム・イマリオフィラム(Brevibacteriumimmariophilum)ATCC14068等のブレビバクテリウム・イマリオフィラム、ブレビバクテリウム・ローゼアム(Brevibacteriumroseum)等のATCC13825ブレビバクテリウム・ローゼアム、ブレビバクテリウム・チオゲニタリス(Brevibacteriumthiogenitalis)ATCC19240等のブレビバクテリウム・チオゲニタリス等に属する微生物があげられる。
【００１５】
ミクロバクテリウム属に属する微生物としては、ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム(Microbacterium ammoniaphilum)ATCC15354等のミクロバクテリウム・アンモニアフィラム等をあげることができる。
【００１６】
本発明により製造することができる有用物質としては、コリネ型細菌に属する微生物が生産することができる工業上有用とされている物質であればいずれでもよく、アミノ酸、核酸、ビタミン、各種酵素等のタンパク質、グルタチオン等のペプチド、キシロース等の糖、キシリトール等の糖アルコール、エタノール等のアルコール、乳酸、コハク酸等の有機酸および脂質等をあげることができ、好ましくはアミノ酸、核酸およびビタミン、特に好ましくはアミノ酸があげられる。
【００１７】
アミノ酸としては、Ｌ−アラニン、グリシン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−バリン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−プロリン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−セリン、Ｌ−システイン、Ｌ−３−ヒドロキシプロリン、Ｌ−４−ヒドロキシプロリン等があげられ、核酸としては、イノシン、グアノシン、イノシン酸、グアニル酸等があげられ、ビタミンとしては、リボフラビン、チアミン、アスコルビン酸等があげられる。
【００１８】
本発明においてコリネ型細菌が「アルカリ性感受性である」とは、野生型のコリネ型細菌、好ましくはコリネバクテリウム・グルタミカムATCC31833株またはコリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032株、さらに好ましくはコリネバクテリウム・グルタミカムATCC31833株は生育可能なアルカリ性の培地(ｐＨ８〜１０、たとえばｐＨ８，９，９．２５，９．５、９．７５、１０など)において該コリネ型細菌は生育できないか、または生育できたとしても生育速度が野生型株の通常５０％以下、好ましくは２０％以下、より好ましくは１０％以下に低下していることをいう。
【００１９】
コリネ型細菌がアルカリ性感受性であるか否かを判定する培地において、炭素源としては、グルコース、果糖、シュークロース、マルトース、でんぷん加水分解物等の糖類、エタノールなどのアルコール類、酢酸、乳酸、コハク酸等の有機酸類があげられる。
【００２０】
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、酢酸アンモニウム等の各種無機および有機アンモニウム塩類、尿素、その他窒素含有化合物、ならびに肉エキス、酵母エキス、コーン・スティープ・リカー、大豆加水分解物等の窒素含有有機物があげられる。
【００２１】
無機塩としてはリン酸第一水素カリウム、リン酸第二水素カリウム、硫酸アンモニウム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム、炭酸カルシウム等があげられる。
【００２２】
その他、必要に応じて、ビオチン、チアミン等の微量栄養源を含有してもよい。これら微量栄養源は、肉エキス、酵母エキス、コーン・スティープ・リカー、大豆加水分解物、カザミノ酸等の培地添加物で代用することもできる。
【００２３】
上記のアルカリ性の培地で、コリネ型細菌を２０〜４２℃、好ましくは３０℃〜４０℃で１〜６日間培養し、生育速度を調べることで、該コリネ型細菌のアルカリ性感受性の有無を調べることができる。
【００２４】
本発明のＤＮＡとしては、アルカリ性感受性のコリネ型細菌に導入した場合、得られる形質転換体の上記アルカリ性培地における生育速度が野生型株の８０％以上、好ましくは９０％以上となるまで回復させる活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡがあげられる。生育速度は、培養時間と生育菌数の関係から、常法に従って求めることができる。なお、本発明のＤＮＡを有するコリネ型細菌における該ＤＮＡを常法に従って破壊するなどして、該蛋白質の活性を低下または消失させた場合、該コリネ型細菌にはアルカリ性感受性が付与される。
【００２５】
このような活性を有する本発明の蛋白質としては、例えば以下の蛋白質があげられる。
［１］配列番号１または３で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
［２］配列番号１または３で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつコリネ型細菌のアルカリ性感受性を回復させる活性を有する蛋白質
［３］配列番号１または３で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性ないし同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつコリネ型細菌のアルカリ性感受性を回復させる活性を有する蛋白質
【００２６】
上記において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつコリネ型細菌のアルカリ性感受性を回復させる活性を有する蛋白質は、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)（以下、モレキュラー・クローニング第２版と略す）、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997)（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）、Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409(1982)、Gene, 34, 315 (1985)、Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、例えば配列番号１または３で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡ（例えば、配列番号２または４で表される塩基配列を有するＤＮＡ）に部位特異的変異を導入することにより、取得することができる。
【００２７】
欠失、置換または付加されるアミノ酸の数は特に限定されないが、上記の部位特異的変異法等の周知の方法により欠失、置換または付加できる程度の数であり、１個から数十個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個である。
【００２８】
配列番号１または３で表されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたとは、同一配列中の任意の位置において、１または複数のアミノ酸が欠失、置換または付加されていてもよい。
【００２９】
アミノ酸の欠失または付加が可能なアミノ酸の位置としては、例えば配列番号１または３で表されるアミノ酸配列のＮ末端側およびＣ末端側の１〜数個のアミノ酸をあげることができる。
【００３０】
欠失、置換または付加は同時に生じてもよく、置換または付加されるアミノ酸は天然型と非天然型とを問わない。天然型アミノ酸としては、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、Ｌ−システインなどがあげられる。
【００３１】
以下に、相互に置換可能なアミノ酸の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸は相互に置換可能である。
【００３２】
Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、2-アミノブタン酸、メチオニン、Ｏ-メチルセリン、t-ブチルグリシン、t-ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン
Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、2-アミノアジピン酸、2-アミノスベリン酸
Ｃ群：アスパラギン、グルタミン
Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、2,4-ジアミノブタン酸、2,3-ジアミノプロピオン酸
Ｅ群：プロリン、3-ヒドロキシプロリン、4-ヒドロキシプロリン
Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリン
Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン
【００３３】
また、本発明の蛋白質がコリネ型細菌のアルカリ性感受性を回復させる活性を有するためには、配列番号１または３で表されるアミノ酸配列との相同性ないし同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性ないし同一性を有していることが望ましい。
【００３４】
アミノ酸配列や塩基配列の相同性ないし同一性は、Karlin and AltschulによるアルゴリズムBLAST[Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993)]やFASTA[Methods Enzymol., 183, 63 (1990)]を用いて決定することができる。このアルゴリズムBLASTに基づいて、BLASTNやBLASTXとよばれるプログラムが開発されている［J. Mol. Biol., 215, 403(1990)］。BLASTに基づいてBLASTNによって塩基配列を解析する場合には、パラメータは例えばScore＝100、wordlength＝12とする。また、BLASTに基づいてBLASTXによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメータは例えばscore＝50、wordlength＝3とする。gapped alignmentを得るために、Altschulら(1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402)に記載されるようにGapped BLASTを利用することができる。あるいは、PSI-BlastまたはPHI-Blastを用いて、分子間の位置関係（Id.）および共通パターンを共有する分子間の関係を検出する繰返し検索を行うことができる。BLAST、Gapped BLAST、PSI-Blast、およびPHI-Blastプログラムを利用する場合、それぞれのプログラムのデフォルトパラメータを用いることができる。http://www.ncbi.nlm.nih.gov.を参照されたい。
【００３５】
配列番号１または３で表されるアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性ないし同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつコリネ型細菌のアルカリ性感受性を回復させる活性を有する蛋白質もまた本発明の蛋白質である。
【００３６】
本発明の蛋白質が、コリネ型細菌のアルカリ性感受性を回復させる活性を有する蛋白質であることは、該蛋白質を発現させたアルカリ性感受性のコリネ型細菌の上記アルカリ性培地における生育速度が野生型株の８０％以上、好ましくは９０％以上となるまで回復することで確認できる。
【００３７】
コリネ型細菌に導入する本発明のＤＮＡとしては、以下の[４]〜[６]のＤＮＡがあげられる。
［４］上記の［１］〜［３］の本発明の蛋白質をコードするＤＮＡ、
［５］配列番号２または４で表される塩基配列を有するＤＮＡ、および
［６］配列番号２または４で表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつコリネ型細菌のアルカリ性感受性を回復させる活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
【００３８】
なお、配列番号２および４記載の塩基配列を有するＤＮＡは、DDBJ/GenBank/EMBLに、それぞれ、Cgl1281 (NCgl1232)およびCgl1434 (NCgl1379)として登録されているＤＮＡであり、それぞれ、該データベースにおいてコバルト／亜鉛／カドミウム排出システムに係ると記載されている配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質および亜鉛トランスポーターに係ると記載されている配列番号３で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードしている。
【００３９】
ここでいう「ハイブリダイズする」とは、特定の条件下で特定の塩基配列を有するＤＮＡまたは該ＤＮＡの一部にＤＮＡがハイブリダイズすることをいう。したがって、該特定の塩基配列を有するＤＮＡまたは該ＤＮＡの一部の塩基配列は、ノーザンまたはサザンブロット解析のプローブとして有用であるか、またはＰＣＲ解析のオリゴヌクレオチドプライマーとして使用できる長さのＤＮＡであってもよい。プローブとして用いるＤＮＡとしては、少なくとも１００塩基以上、好ましくは２００塩基以上、より好ましくは５００塩基以上のＤＮＡをあげることができるが、少なくとも１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上のＤＮＡであってもよい。
【００４０】
ＤＮＡのハイブリダイゼーション実験の方法はよく知られており、例えばモレキュラー・クローニング第２版、第３版（２００１年）、Methods for General and Molecular Bacteriolgy, ASM Press（1994）、Immunology methods manual, Academic press(Molecular)に記載の他、多数の他の標準的な教科書に従ってハイブリダイゼーションの条件を決定し、実験を行うことができる。
【００４１】
上記のストリンジェントな条件とは、例えばＤＮＡを固定化したフィルターとプローブＤＮＡとを50％ホルムアミド、5×SSC（750ｍMの塩化ナトリウム、75mMのクエン酸ナトリウム）、50mMのリン酸ナトリウム（pH7.6）、5×デンハルト溶液、10％の硫酸デキストラン、および20μg/lの変性させたサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で42℃で一晩、インキュベートした後、例えば約65℃の0.2×SSC溶液中で該フィルターを洗浄する条件をあげることができるが、より低いストリンジェント条件を用いることもできる。ストリンジェントな条件の変更は、ホルムアミドの濃度調整（ホルムアミドの濃度を下げるほど低ストリンジェントになる）、塩濃度および温度条件の変更により可能である。低ストリンジェント条件としては、例えば6×SSCE（20×SSCEは、3mol/lの塩化ナトリウム、0.2mol/lのリン酸二水素ナトリウム、0.02mol/lのEDTA、pH7.4）、0.5％のSDS、30％のホルムアミド、100μg/lの変性させたサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で、37℃で一晩インキュベートした後、50℃の1×SSC、0.1％SDS溶液を用いて洗浄する条件をあげることができる。また、さらに低いストリンジェントな条件としては、上記した低ストリンジェント条件において、高塩濃度（例えば5×SSC）の溶液を用いてハイブリダイゼーションを行った後、洗浄する条件をあげることができる。
【００４２】
上記した様々な条件は、ハイブリダイゼーション実験のバックグラウンドを抑えるために用いるブロッキング試薬を添加、または変更することにより設定することもできる。上記したブロッキング試薬の添加は、条件を適合させるために、ハイブリダイゼーション条件の変更を伴ってもよい。
【００４３】
上記したストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、例えば上記したBLASTおよびFASTA等のプログラムを用いて、上記パラメーターに基づいて計算したときに、配列番号２または４で表される塩基配列と少なくとも８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性ないし同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡをあげることができる。
【００４４】
上記したＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡが、コリネ型細菌のアルカリ性感受性を回復させる活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡであることは、アルカリ性感受性のコリネ型細菌を宿主とし、該ＤＮＡを導入して得られる形質転換体の上記アルカリ性培地における生育速度が野生型株の８０％以上、好ましくは９０％以上となることで確認できる。
【００４５】
本発明のＤＮＡは、例えばコリネ型細菌に属する微生物から斎藤らの方法〔Biochim. Biophys. Acta, 72, 619 (1963)〕に従い調製した染色体ＤＮＡを鋳型として、配列番号２または４で表される塩基配列に基づき設計、合成したプライマーＤＮＡを用いてＰＣＲにより取得することができる。
【００４６】
例えば、コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032株またはATCC31833株から染色体ＤＮＡを調製し、該ＤＮＡを鋳型として、配列番号２または４で表されるそれぞれの塩基配列の５’末端および３’末端領域の配列を有するＤＮＡをプライマーセットとして用いたＰＣＲにより本発明のＤＮＡを取得することができる。
【００４７】
取得できる具体的なＤＮＡとしては、配列番号２で表される塩基配列を有するCgl1281 (NCgl1232)および配列番号４で表される塩基配列を有するCgl1434 (NCgl1379)等をあげることができる。
【００４８】
また、配列番号２または配列番号４で表される塩基配列からなるＤＮＡの一部、または全部をプローブとしたハイブリダイゼーション法、または配列番号２または配列番号４で表される塩基配列に基づき、公知の方法で該塩基配列を有するＤＮＡを化学合成する方法等によっても取得することができる。
【００４９】
また、各種の遺伝子配列データベースに対して配列番号１または３で表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列と８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性ないし同一性を有する配列を検索し、該検索によって得られた塩基配列に基づき、該塩基配列を有する生物の染色体ＤＮＡ、ｃＤＮＡライブラリー等から上記した方法により本発明のＤＮＡ、または本発明の製造法に用いられるＤＮＡを取得することもできる。
【００５０】
ＤＮＡの塩基配列は、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばジデオキシ法 [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74, 5463 (1977)]、373A・ＤＮＡシークエンサー（パーキン・エルマー社製）等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより決定することができる。
【００５１】
塩基配列を決定した結果、取得されたＤＮＡが部分長であった場合は、該部分長ＤＮＡをプローブに用いた、染色体ＤＮＡライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーション法等により、全長ＤＮＡを取得することができる。
【００５２】
取得したＤＮＡをそのまま、または必要に応じてコリネ型細菌の発現に最適なコドンとなるように塩基を置換したＤＮＡを調製し、さらに必要に応じて該蛋白質をコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片とし、コリネ型細菌に適した発現ベクターのプロモーターの下流に挿入して組換え体ＤＮＡを調製する。
【００５３】
ベクターとしては、コリネ型細菌において自律複製可能または染色体中への組み込みが可能で、本発明のＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが好ましく用いられる。
【００５４】
例えば、pCG1（特開昭57-134500）、pCG2（特開昭58-35197）、pCG4（特開昭57-183799）、pCG11（特開昭57-134500）、pCG116、pCE54、pCB101（いずれも特開昭58-105999）、pCE51、pCE52、pCE53〔いずれもMolecular and General Genetics, 196, 175 (1984)〕等が好適に用いられる。
【００５５】
ベクターに本発明のＤＮＡを組み込んで得られる組換え体ＤＮＡは、プロモーター、リボソーム結合配列、本発明のＤＮＡ、転写終結配列、より構成されることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
【００５６】
プロモーターとしては、宿主細胞(コリネ型細菌)中で機能するものであればいかなるものでもよい。例えば、trpプロモーター（Ptrp）、lacプロモーター、PLプロモーター、PRプロモーター、T7プロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーターをあげることができる。またPtrpを２つ直列させたプロモーター（Ptrp×２）、tacプロモーター、lacT7プロモーター、let Iプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。
【００５７】
このようなプロモーターとして好ましくは、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属に属する微生物中で発現させるためのP54-6プロモーター［Appl. Microbiol. Biotechnol., 53, 674-679 (2000)］を用いることができる。
【００５８】
リボソーム結合配列であるシャイン−ダルガノ（Shine-Dalgarno）配列と開始コドンとの間は適当な距離（例えば６〜18塩基）に調節されていることが好ましい。転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列が配置されていることが好ましい。
【００５９】
得られた組換え体ＤＮＡを宿主となるコリネ型細菌に導入する。
【００６０】
組換え体ＤＮＡの導入方法としては、コリネ型細菌へＤＮＡを導入できる方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法[Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69, 2110 (1972)]、プロトプラスト法（特開昭63-248394）、エレクトロポレーション法[Nucleic Acids Res., 16, 6127 (1988)]等をあげることができる。
【００６１】
本発明の微生物における有用物質を生産する能力は、１種以上の有用物質を生産する能力であればよく、育種の過程において、必要に応じて公知の方法により所望の有用物質を生産する能力を人為的に付与または増強してもよい。
【００６２】
当該公知の方法としては、
（ａ）有用物質の生合成を制御する機構の少なくとも１つを緩和または解除する方法、
（ｂ）有用物質の生合成に関与する酵素の少なくとも１つを発現強化する方法、
（ｃ）有用物質の生合成に関与する酵素遺伝子の少なくとも１つのコピー数を増加させる方法、
（ｄ）有用物質の生合成経路から該有用物質以外の代謝産物へ分岐する代謝経路の少なくとも１つを弱化または遮断する方法、および
（ｅ）野生型株に比べ、有用物質のアナログに対する耐性度が高い細胞株を選択する方法、
などをあげることができ、上記公知の方法は単独または組み合わせて用いることができる。
【００６３】
上記（ａ）〜（ｅ）の具体的な方法は、例えば有用物質がアミノ酸である場合については、上記（ａ）の方法に関してはAgric. Biol. Chem., 43, 105-111(1979)、J. Bacteriol., 110, 761-763(1972)およびAppl. Microbiol. Biotechnol., 39, 318-323(1993)などに記載されている。上記（ｂ）の方法に関しては、Agric. Biol. Chem., 43, 105-111(1979)およびJ. Bacteriol., 110, 761-763(1972)などに記載されている。上記（ｃ）の方法に関しては、Appl. Microbiol. Biotechnol., 39, 318-323(1993)およびAgric. Biol. Chem., 39, 371-377(1987)などに記載されている。上記（ｄ）の方法に関しては、Appl. Environ. Micribiol., 38, 181-190(1979)およびAgric. Biol. Chem., 42, 1773-1778(1978)などに記載されている。上記（ｅ）の方法に関しては、Agric. Biol. Chem., 36, 1675-1684(1972)、Agric. Biol. Chem., 41, 109-116(1977)、Agric. Biol. Chem., 37, 2013-2023(1973)およびAgric. Biol. Chem., 51, 2089-2094(1987)などに記載されている。上記文献等を参考に各種アミノ酸を生成、蓄積する能力を有する微生物を調製することができる。
【００６４】
さらに上記（ａ）〜（ｅ）のいずれかまたは組み合わせた方法によるアミノ酸を生成、蓄積する能力を有する微生物の調製方法については、Biotechnology 2nd ed., Vol.6, Products of Primary Metabolism (VCH Verlagsgesellschaft mbH, Weinheim, 1996) section 14a, 14bやAdvances in Biochemical Engineering/ Biotechnology 79, 1-35 (2003)、アミノ酸発酵、学会出版センター、相田 浩ら（1986）に多くの例が記載されている。また、上記以外にも具体的なアミノ酸を生成、蓄積する能力を有する微生物の調製方法は、特開2003-164297、Agric. Biol. Chem., 39, 153-160 (1975)、Agric. Biol. Chem., 39, 1149-1153(1975)、特開昭58-13599、J. Gen. Appl. Microbiol., 4, 272-283(1958)、特開昭63-94985、Agric. Biol. Chem., 37, 2013-2023(1973)、WO97/15673、特開昭56-18596、特開昭56-144092および特表2003-511086など数多くの報告があり、上記文献等を参照することにより１種以上のアミノ酸を生産する能力を有する微生物を調製することができる。
【００６５】
アミノ酸以外の有用物質を生産する能力を微生物に付与する方法もまた、多くの報告があり、従来知られているすべての方法は、本発明の製造法に用いられる微生物の調製に用いることができる。
【００６６】
アルカリ性感受性を回復させる活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡは、コリネ型細菌の染色体に組み込んでもよく、プラスミドとしてコリネ型細菌に導入して形質転換体としてもよい。また、アルカリ性感受性を回復させる活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡは、コリネ型細菌由来のＤＮＡが好ましく使用される。
【００６７】
なお、宿主として用いるコリネ型細菌として、アミノ酸、核酸等の有用物質の生産能を有しているものを用いた場合、得られる形質転換体は、そのまま有用物質の製造に用いることができるが、有用物質の生産能を有していないものを用いた場合においては、得られた形質転換体に、さらに有用物質に係る他の遺伝子を導入する方法、突然変異処理による栄養要求性変異の導入、アミノ酸アナログ耐性変異の導入等の方法によって有用物質の生産能を付与して、本発明の形質転換体として用いることができる。
【００６８】
本発明の形質転換体の培養は、コリネ型細菌の通常の培養法によって行う。
【００６９】
形質転換体の培養のための培地の炭素源、窒素源、無機塩、その他の添加剤は、アルカリ性感受性を判定するための培地と同じものを使用できる。
【００７０】
形質転換体の培養は、振とう培養、深部通気撹拌培養等の好気的条件下で行う。培養温度は通常２０℃〜４２℃であり、３０℃〜４０℃が好ましい。培地中のｐＨは、５〜９に維持することが好ましい。ｐＨの調整は、無機あるいは有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニアなどを用いて行う。
【００７１】
培養期間は通常１〜６日間である。また、培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００７２】
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた組換え体ＤＮＡで形質転換したコリネ型細菌を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、lacプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、trpプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
【００７３】
本発明の蛋白質の生産方法としては、宿主細胞内に生産させる方法、宿主細胞外に分泌させる方法、あるいは宿主細胞外膜上に生産させる方法があり、使用する宿主細胞や、生産させる蛋白質の構造を変えることにより、該方法を選択することができる。
【００７４】
本発明の蛋白質が宿主細胞内あるいは宿主細胞外膜上に生産される場合、ポールソンらの方法〔J. Biol. Chem.，264, 17619 (1989)〕、ロウらの方法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 8227 (1989)、Genes Develop., 4, 1288（1990)〕、または特開平5-336963、WO94/23021等に記載の方法を準用することにより、該蛋白質を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。すなわち、遺伝子組換えの手法を用いて、本発明の蛋白質の活性部位を含むポリペプチドの手前にシグナルペプチドを付加した形で発現させることにより、本発明の蛋白質を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。また、特開平2-227075に記載されている方法に準じて、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子等を用いた遺伝子増幅系を利用して生産量を上昇させることもできる。
【００７５】
有用物質の製造は、本発明の形質転換体を培地に培養して得られる培養物中に生成蓄積した有用物質を採取することにより行う。
【００７６】
培養方法は、上記本発明の蛋白質の製造方法と同様の方法を用いることができるが、製造する有用物質により最適な条件とすることが好ましい。
【００７７】
培養物中に生成、蓄積した有用物質は、菌体などの沈殿物を除去し、活性炭処理、イオン交換樹脂処理などの公知の方法を併用することにより回収することができる。
【００７８】
以下に本発明の実施例を示すが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００７９】
（１）コリネバクテリウム・グルタミカムATCC31833株（以下、単にATCC31833株ともいう）を常法によりニトロソグアニジンで変異処理した。
【００８０】
処理後のATCC31833株をpH 7.0のＭＭ寒天培地（グルコース 10g、硫酸マグネシウム７水和物0.4g、塩化アンモニウム 4g、尿素2g、リン酸一水素カリウム３g、リン酸二水素カリウム １g、硫酸鉄７水和物10 mg、硫酸マンガン５水和物1 mg、ニコチン酸 5 mg、ビオチン 0.1 mg、チアミン塩酸塩 5 mg、CAPS 0.1molおよびバクトアガー20gを水1リットルに含み、水酸化ナトリウム水溶液によりpHを調整した培地）に塗布した。一方、pH 9.5のＭＭ寒天培地を調製し、レプリカ法により、 pH 9.5のＭＭ寒天培地では生育が悪化する株、および生育できない株をアルカリ感受性株として選択した。これらの選択株の中から、アルカリ性感受性の度合いの異なる２種の変異株を代表株として選抜し、それぞれAL-43株、AL-77株と命名した。
【００８１】
第１表に示すpHに調整したＭＭ寒天培地を調製し、30℃で一日間培養した。これら２株の該寒天培地上での生育を第１表に示す。
【００８２】
【表１】
【００８３】
第１表に示すとおり、AL-43株およびAL-77株は、アルカリ性感受性を示した。
（２）ATCC31833株の染色体ＤＮＡを、特開平6-169785記載の方法に準じて調製した。
【００８４】
一方、コリネバクテリウム・グルタミカムで複製可能なプラスミドpCSEK20（再公表特許WO01/021774）およびpCS299P[Appl. Microbiol. Biotech., 63, 592 (2004)]を、これらを保有するコリネバクテリウム・グルタミカムATCC31833株の培養菌体から特開平6-169785記載のベクターの調製方法に従って調製した。
【００８５】
なお、プラスミドpCSEK20は、コリネバクテリウム・グルタミカム由来のプラスミドpCG2(特開昭58-35197)の複製開始点、コリネバクテリウム・グルタミカム由来のプラスミドpCG4(特開昭57-183799)のスペクチノマイシンおよびストレプトマイシン耐性遺伝子、およびエシェリヒア・コリ(Escherichiacoli)の一般的ベクターpCG22[J.Bacteriol., 140, 400 (1979)]のカナマイシン耐性遺伝子から成るプラスミドである。
【００８６】
また、プラスミドpCS299Pは、コリネバクテリウム・グルタミカム由来のプラスミドpCG116[Bio/Technology, 11, 921(1993)]の複製開始点、およびエシェリヒア・コリの一般的ベクターpHSG299[Gene, 61, 63 (1987)]のカナマイシン耐性遺伝子から成るプラスミドである。
【００８７】
ATCC31833株の染色体ＤＮＡとプラスミドpCSEK20を各々EcoRIで切断し、両切断物をライゲーションキットにより連結した。一方、ATCC31833株の染色体ＤＮＡとプラスミドpCS299Pを各々BamHIで切断し、両切断物をライゲーションキットにより連結した。
【００８８】
このようにして構築した２種類のゲノムライブラリを用いて、（１）で得たアルカリ性感受性株AL-43株およびAL-77株を、特開平6-169785記載の方法に従って形質転換した。
【００８９】
得られた形質転換体の中から、カナマイシン20μg/mlを含有するpH9.5のＭＭ寒天培地で生育可能な株を、アルカリ性感受性が回復した形質転換株として選択した。選択した形質転換株から、特開平6-169785記載のベクターの調製方法に従ってプラスミドＤＮＡを単離した。
【００９０】
得られたプラスミドＤＮＡを各制限酵素で切断し、解析して、AL-43株のアルカリ性感受性を回復させるＤＮＡ断片として4.0KbのEcoRI切断断片を取得し、AL-77株のアルカリ性感受性を回復させるＤＮＡ断片として2.8KbのBamHI切断断片を取得した。このようにして得られた4.0KbのEcoRI断片を含有するプラスミドをpEco4.0、一方、2.8KbのBamHI断片を含有するプラスミドをpBam2.8と命名した。
【００９１】
pEco4.0およびpBam2.8に挿入された各ＤＮＡ断片の塩基配列を再公表特許WO01/021774に記載のジデオキシヌクレオチド酵素法により決定した。
【００９２】
決定した塩基配列を、コリネバクテリウム・グルタミカムの全ゲノム情報（アクセッションナンバーBA000036）に基づいて解析した結果、pEco4.0が含有する4.0KbのEcoRI断片にはCgl1278、Cgl1279、Cgl1280およびCgl1281の４つの遺伝子が存在していた。一方、pBam2.8が含有する2.8KbのBamHI断片にはCgl1434が存在していた。
【００９３】
pEco4.0から種々のＤＮＡ断片を常法によりサブクローニングしてAL-43株のアルカリ感受性の回復能を調べた結果、Cgl1281遺伝子のみを含有するプラスミドpCgl1281がAL-43株のアルカリ性感受性を回復させた。
【００９４】
なお、プラスミドpCgl1281は、プラスミドpEco4.0を鋳型として用いて配列番号５および６で表される塩基配列を有するＤＮＡをプライマーとして用いてＰＣＲを行って得られた1.9 kbのＤＮＡ断片およびベクターpCSEK20をEcoRIで制限酵素処理し、両者を連結して得られたプラスミドである。
【００９５】
Cgl1281遺伝子の塩基配列から推測されるアミノ酸配列を配列番号１に、塩基配列を配列番号２に示す。
【００９６】
また、AL-77株を相補するCgl1434遺伝子の塩基配列から推測されるアミノ酸配列を配列番号３に、塩基配列を配列番号４に示す。
（３）AL-43株、AL-43株にプラスミドpCgl1281を導入して得られたAL-43/ pCgl1281 株、AL-77株およびAL-77株にプラスミドpBam2.8を導入して得られたAL-77/ pBam2.8株を、第２表に示したｐHに調製したＭＭ寒天培地に塗布し、３０℃で１日間培養し、各菌株の生育を調べた。
【００９７】
結果を第２表に示す。
【００９８】
【表２】
【００９９】
第２表に示すとおり、AL-43/ pCgl1281 株およびAL-77/ pBam2.8株では、宿主株と比較してアルカリ感受性が回復していた。
【実施例２】
【０１００】
実施例１で取得したプラスミドpCgl1281およびpBam2.8を用い、特開平6-169785記載の方法に従ってＬ−グルタミン生産菌を形質転換する。Ｌ−グルタミン生産菌としては、たとえばコリネバクテリウム・グルタミカムの野生型菌株であるATCC14752株（特公昭62-51112）を用いる。
【０１０１】
得られた各形質転換体を、たとえばBYG寒天培地（グルコース 10g、肉エキス 7g、ペプトン 10g、塩化ナトリウム 3g、酵母エキス 5g、バクトアガー 18ｇを水１Lに含みpH7.2に調整した培地）で28℃で24時間培養した培養菌体１白金を、生産培地（グルコース 150g、塩化アンモニウム 50g、リン酸一水素カリウム 0.7g、リン酸二水素カリウム 0.7g、硫酸マグネシウム７水和物 0.5g、硫酸鉄７水和物 20mg、硫酸マンガン５水和物 20mg、硫酸亜鉛７水和物 10mg、ビオチン 6μg、チアミン塩酸塩 1mg、肉エキス 5gを水1Lに含みpH7.2に調整後、炭酸カルシウムを 50g加えた培地）20mlを含む 300ml容三角フラスコに接種し、28℃で96時間、培養する。
【０１０２】
遠心分離により培養物から菌体を除去し、上清中のＬ−グルタミンを回収する。
【実施例３】
【０１０３】
実施例１で取得したプラスミドpCgl1281およびpBam2.8を用い、特開平6-169785記載の方法に従っL-アルギニン生産菌を形質転換する。L-アルギニン生産菌としては、例えばコリネバクテリウム・グルタミカムのRB26I株（WO2006/035831）を用いる。
【０１０４】
得られた形質転換体をBYG寒天培地上で30℃、24時間培養した培養菌体１白金耳を、種培地（ショ糖 25g、コーン・スティープ・リカー 20g、ペプトン 20g、酵母エキス 10g、硫酸マグネシウム7水和物 0.5g、リン酸二水素カリウム 2g、尿素 3g、硫酸アンモニウム 8g、塩化ナトリウム 1g、ニコチン酸 20mg、硫酸鉄7水和物 10mg、パントテン酸カルシウム 10mg、硫酸亜鉛7水和物 1mg、硫酸銅5水和物 1mg、チアミン塩酸塩 1mg、ビオチン 100μgを水 1Lに含み水酸化ナトリウム水溶液によりpH7.2に調整後、炭酸カルシウムを10g加えた培地）6mlを含む太型試験管に植菌して32℃で24時間培養する。
【０１０５】
得られた種培養液 2mlを本培養培地（グルコース 60g、コーン・スティープ・リカー 5g、硫酸アンモニウム 30g、塩化カリウム 8g、尿素 2g、リン酸二水素カリウム 0.5g、リン酸水素二カリウム 0.5g、硫酸マグネシウム7水和物 1g、塩化ナトリウム 1g、硫酸鉄7水和物 20mg、ニコチン酸 20mg、ベーターアラニン 20mg、硫酸マンガン5水和物 10mg、チアミン塩酸塩 10mg、ビオチン 200μgを水 1Lに含み水酸化ナトリウム水溶液によりpH7.7に調整後、炭酸カルシウムを30g加えた培地) 20mlを含む300ml容三角フラスコに接種し、32℃で48時間培養する。遠心分離により培養物から菌体を除去し、上清中のL-アルギニンを回収する。
【実施例４】
【０１０６】
実施例１で取得したプラスミドpCgl1281およびpBam2.8を用い、特開平6-169785記載の方法に従ってL-リジン生産菌であるコリネバクテリウム グルタミカムAHP-3株（FERM BP-7382）を形質転換した。得られた形質転換株はそれぞれAHP-3/pCgl1281、AHP-3/pBam2.8と命名した
これら各形質転換株と親株のL-リジン生産能を以下のような試験管培養を行うことにより評価した。BY寒天培地（肉エキス 7g、ペプトン 10g、塩化ナトリウム 3g、酵母エキス 5g、バクトアガー 15ｇを水1Lに含み、pH7.2に調整した培地）で30℃、24時間培養した培養菌体１白金耳を、種培地（グルコース 20g、肉エキス 7g、ペプトン 10g、塩化ナトリウム 3g、酵母エキス 5gを水１Lに含みpH7.2に調整後、炭酸カルシウムを10g加えた培地）5mlを含む太型試験管に植菌して30℃で13時間培養した。この種培養液 0.5mlを本培養培地（グルコース 50g、コーンスティープリカー 10g、硫酸アンモニウム 45g、尿素 4g、リン酸二水素カリウム 0.5g、硫酸マグネシウム7水和物 0.5g、ビオチン 0.3mgを水 1Lに含みpH7.0に調整後、炭酸カルシウムを30g加えた培地) 5mlを含む太型試験管に接種し、30℃で72時間振とう培養した。遠心分離により培養物から菌体を除去し、上清中のL-リジン塩酸塩の蓄積量を高速液体クロマトグラフィー（HPLC）により定量した。結果を第３表に示す。
【０１０７】
【表３】
【０１０８】
第３表から明らかなように、本発明の遺伝子を含むプラスミドを導入したAHP-3株では、菌体あたりのL-リジンの生産量が親株AHP-3に比べて向上していた。
【実施例５】
【０１０９】
実施例１で取得したプラスミドpCgl1281およびpBam2.8を用い、特開平6-169785記載の方法に従ってL-アルギニン生産菌を形質転換した。L-アルギニン生産菌としては、コリネバクテリウム・グルタミカムのRB26I株（WO2006/035831）を用いた。
【０１１０】
これら各形質転換株と親株のL-アルギニン生産試験を三角フラスコ培養により次のように行った。BY寒天培地上で30℃、24時間培養した培養菌体１白金耳を、種培地（ショ糖 25g、コーンスティープリカー 20g、ペプトン 20g、酵母エキス 10g、硫酸マグネシウム7水和物 0.5g、リン酸二水素カリウム 2g、尿素 3g、硫酸アンモニウム 8g、塩化ナトリウム 1g、ニコチン酸 20mg、硫酸鉄7水和物 10mg、パントテン酸カルシウム 10mg、硫酸亜鉛7水和物 1mg、硫酸銅5水和物 1mg、チアミン塩酸塩 1mg、ビオチン 100μgを水 1Lに含みpH7.2に調整後、炭酸カルシウムを10g加えた培地）6mlを含む太型試験管に植菌して32℃で24時間培養した。この種培養液 2mlを本培養培地（グルコース 60g、コーンスティープリカー 5g、硫酸アンモニウム 30g、塩化カリウム 8g、尿素 4g、リン酸二水素カリウム 0.5g、リン酸水素二カリウム 0.5g、硫酸マグネシウム7水和物 1g、塩化ナトリウム 1g、硫酸鉄7水和物 20mg、ニコチン酸 20mg、ベーターアラニン 20mg、硫酸マンガン5水和物 10mg、チアミン塩酸塩 10mg、ビオチン 200μgを水 1Lに含みpH7.7に調整後、炭酸カルシウムを30g加えた培地) 20mlを含む300ml容三角フラスコに接種し、32℃で48時間培養した。遠心分離により培養物から菌体を除去し、上清中のL-アルギニンの蓄積量を高速液体クロマトグラフィー（HPLC）により定量した。結果を第４表に示す。
【０１１１】
【表４】
【０１１２】
第４表から明らかなように、本発明の遺伝子を含むプラスミドを導入したRB26I株では、菌体あたりのL-アルギニンの生産量が親株RB26Iに比べて向上していた。
【産業上の利用可能性】
【０１１３】
本発明によれば、アルカリ性感受性のコリネ型細菌のアルカリ性感受性を回復させる活性を有する蛋白質、該蛋白質をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡ、該組換え体ＤＮＡで形質転換されたコリネ型細菌、または有用物質の製造方法を提供することができる。
【０１１４】
本発明のコリネ型細菌の形質転換体は、有用物質の生産性が向上する。
【配列表フリーテキスト】
【０１１５】
配列番号５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルカリ性感受性のコリネ型細菌のアルカリ性感受性を回復させる活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡをコリネ型細菌に組み込んで得られ、かつ有用物質の生産能を有する形質転換体を培地に培養し、培養物中に有用物質を生成、蓄積させ、該培養物から該有用物質を採取することを特徴とする有用物質の製造法。
【請求項２】
アルカリ性感受性のコリネ型細菌のアルカリ性感受性を回復させる活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡが、以下の［１］〜［３］のいずれかに記載のＤＮＡである、請求項１記載の有用物質の製造法。
［１］配列番号１または３で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
［２］配列番号２または４で表される塩基配列を有するＤＮＡ
［３］配列番号２または４で表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアルカリ性感受性のコリネ型細菌のアルカリ性感受性を回復させる活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
【請求項１】
アルカリ性感受性のコリネ型細菌のアルカリ性感受性を回復させる活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡをコリネ型細菌に組み込んで得られ、かつ有用物質の生産能を有する形質転換体を培地に培養し、培養物中に有用物質を生成、蓄積させ、該培養物から該有用物質を採取することを特徴とする有用物質の製造法。
【請求項２】
アルカリ性感受性のコリネ型細菌のアルカリ性感受性を回復させる活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡが、以下の［１］〜［３］のいずれかに記載のＤＮＡである、請求項１記載の有用物質の製造法。
［１］配列番号１または３で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
［２］配列番号２または４で表される塩基配列を有するＤＮＡ
［３］配列番号２または４で表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアルカリ性感受性のコリネ型細菌のアルカリ性感受性を回復させる活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
【公開番号】特開２００９−２３２８４０（Ｐ２００９−２３２８４０Ａ）
【公開日】平成２１年１０月１５日（２００９．１０．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−３３２５１（Ｐ２００９−３３２５１）
【出願日】平成２１年２月１６日（２００９．２．１６）
【出願人】（５０４１８０２３９）国立大学法人信州大学 (759)
【出願人】（３０８０３２６６６）協和発酵バイオ株式会社 (41)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１０月１５日（２００９．１０．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年２月１６日（２００９．２．１６）
【出願人】（５０４１８０２３９）国立大学法人信州大学 (759)
【出願人】（３０８０３２６６６）協和発酵バイオ株式会社 (41)
【Ｆターム（参考）】
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