本態性振戦症が強化されたマウスモデル及びその製造方法
【課題】本態性振戦症（ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｔｒｅｍｏｒ）が誘発されたα１／ＣａＶ３．１二重ノックアウトマウスまたはα１−／−；Ｅｍｘ１−Ｃｒｅマウス及びそれらを用いた本態性振戦症治療剤のスクリーニング方法を提供する。
【解決手段】本発明が提供するα１／ＣａＶ３．１二重ノックアウトマウスまたはα１−／−；Ｅｍｘ１−Ｃｒｅマウスは、α１ノックアウトマウスと比較して、肉眼で確認することができる程度に強く明白な本態性振戦症の兆候を示すので、本態性振戦症に対する治療剤開発に有用に使用することができる。
【解決手段】本発明が提供するα１／ＣａＶ３．１二重ノックアウトマウスまたはα１−／−；Ｅｍｘ１−Ｃｒｅマウスは、α１ノックアウトマウスと比較して、肉眼で確認することができる程度に強く明白な本態性振戦症の兆候を示すので、本態性振戦症に対する治療剤開発に有用に使用することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、本態性振戦症（ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｔｒｅｍｏｒ）（または手震症）が強化されたマウスモデルを用いた治療剤のスクリーニング方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
本態性振戦症は、動作時振戦または姿勢振戦を示す代表的な病気である。動作時振戦または姿勢振戦というのは、動いたり（ｔｈｒｏｕｇｈｏｕｔ ａｃｔｉｖｅ ｍｏｖｅｍｅｎｔ）、“コップを持ったり”または“前にならえ”などのようにある姿勢を維持している時（ｄｕｒｉｎｇ ｐｏｓｔｕｒｉｎｇ）に、ひどくなる形態の振戦症を言う。これとは反対に、動かないで休息を取っている時にひどくなる振戦症を、安定型振戦症（ｒｅｓｔｉｎｇ ｔｒｅｍｏｒ）といい、これはパーキンソン病でよく現れる。本態性振戦症は、一種の遺伝病であり、常染色体優性遺伝で遺伝するので、家族の中に振戦症がある場合が多い。したがって、本態性振戦症を家族性振戦症とも言う。本態性振戦症の診断的特性は、ほとんどの場合、震えの振動数が、正常生理活動による生理的振戦症より若干遅くてさらに粗い。しかし、振戦の様相だけでは、他の形態の振戦と容易に区別することができない。歳をとるほど振戦の様相は、振動数が減少して振幅が大きくなる傾向がある。振戦は、上肢にのみ限って現れることもあり、頭に振戦があることもある。振戦がひどい場合には、あご、唇、舌、そして声帯にまで振戦が現れ、声帯に振戦が現れる場合は、音を出す時に震えた音を出すようになる。本態性振戦症の結果は、比較的良好な方であるが、人毎に多様で微細な震えが一方または両方で始まって、その震えの程度が徐々に進行する。体位や運動性変化にしたがって現れ、ひどく進行する場合でなければ、安定期にはみられない。全身性または神経系疾患と係わった他の神経学的異常はなく、家族歴があるという点が診断に役に立ち、たまに飲酒などが一時的に震えを緩和させることができる。
【０００３】
本態性振戦症を治療する方法は、薬物を用いる治療を原則とする。飲酒を通じてアルコールあるいはアルコール系列の化合物（ｏｃｔａｎｏｌ）を摂取する方法、抑制性神経伝達物質であるＧＡＢＡの受容体拮抗剤などの抑制性薬物を服用する方法などが用いられてきた。抑制性薬物としては、プリミドン（Ｐｒｉｍｉｄｏｎｅ）やベータ遮断剤の一種であるプロプラノロール（Ｐｒｏｐｒａｎｏｌｏｌ）という薬物が一次的に用いられる。前記薬物は、約６０〜７０％の患者に効果を示すが完治は難しい。期待しただけの効果がなければ、２次治療剤を使用したり物理的手術を受けたりする。しかし、前記ＧＡＢＡの受容体拮抗剤またはアルコール系列の化合物は、振戦症の他に多様な神経系機能を阻害するので、睡眠誘導などの副作用がひどく、視床破壊術（ｔｈａｌａｍｅｃｔｏｍｙ）または脳深部刺激療法（ｄｅｅｐ−ｂｒａｉｎ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ）は、最後の手段であり、危険な脳手術を施行しなければならない。また、最近、脳深部刺激療法は、比較的安全で効果が確かな方法として脚光を浴びているが、費用が多少多くかかるという短所がある。
【０００４】
ＧＡＢＡＡ（ｇａｍｍａ−ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ ｔｙｐｅ Ａ）受容体スーパーファミリーは、主要抑制性神経伝達物質であるγ−アミノブチル酸（ＧＡＢＡ）と相互作用する受容体である。広範囲的には、哺乳動物の脳全般に不均一に分布しているが、ＧＡＢＡは、ＧＡＢＡＡ受容体を通じてＧＡＢＡ作用の大部分を調節することで、塩素イオン伝導度及び膜の分極が変更される。前記ＧＡＢＡのような神経伝達物質以外にも、抗不安剤及び鎮静剤に使用されるベンゾジアゼピンを含む様々な薬物が前記受容体に結合される。一般的に、ＧＡＢＡＡ受容体は、ＧＡＢＡに対する反応を開始する塩素チャンネルを含むことで塩素を細胞内に流入させる。これによって、順次に細胞膜電位の過分極による神経活性が鈍化される。
【０００５】
ＧＡＢＡＡ受容体は、５個のタンパク質サブユニットで構成されていて、各サブユニットは、２個のα、２個のβ及び１個のγからなっている。各サブユニットには、α１−６、β１−３及びγ１−３が存在する（非特許文献１）。従来、前記ＧＡＢＡＡ受容体のα１サブユニットをノックアウトさせて、遺伝的に１７−２２Ｈｚの本態性振戦症を示すマウスモデル（ＧＡＢＡＡ受容体α１−／−マウス）が開発されたことがあるが（非特許文献２）、振戦の強さが微弱で本態性振戦症の研究及び治療剤開発に使用するのに限界があった（非特許文献３）。
【０００６】
電圧依存性カルシウムチャンネルは、神経細胞の活性によって細胞内カルシウム濃度を増加させる役割をするが（非特許文献４）、電圧依存度によって高電圧依存性及び低電圧依存性チャンネルに分類される（非特許文献５）。Ｔ−タイプカルシウムチャンネルは、代表的な低電圧依存性カルシウムチャンネルであり、哺乳類では、α１サブユニットに対する遺伝子型によって、Ｃａｖ３．１（α１Ｇ）、３．２（α１Ｈ）、３．３（α１Ｉ）の三つの種類が存在する（非特許文献６）。α１Ｇカルシウムチャンネルは、視床核で神経細胞のバースト発火の生成に関与し、最近、重要な病理学的機能が解明された（非特許文献７、 非特許文献８）。従来、本発明者等は、α１Ｇ Ｔ−タイプカルシウムチャンネルが欠乏したマウスが、薬物で誘導される本態性振戦症に対して抵抗性を有することを解明したことがある。
【０００７】
そこで、本発明者等は、本態性振戦症症状を示すＧＡＢＡＡ受容体α１−／−マウスと本態性振戦症に対する抵抗性を有する、α１Ｇ Ｔ−タイプカルシウムチャンネルをノックアウトさせたマウスを交配して、二重ノックアウトマウス（α１−／−／ＣａＶ３．１−／−）を製作し、前記二重ノックアウトマウスの本態性振戦症の兆候を研究中、本態性振戦症が好転するだろうという予想とは異なり、既存のＧＡＢＡＡ受容体α１−／−マウスより震えの強さが肉眼で確認することができる程度にひどくなって、本態性振戦症の治療剤開発モデルに使用できることを確認することによって本発明を完成した。
【０００８】
また、本発明者等は、ＧＡＢＡＡ受容体α１Ｆ／ＦマウスをＥｍｘ１−Ｃｒｅマウスと交配して、α１Ｆ／＋；Ｅｍｘ１−Ｃｒｅマウスを得た。また、これら同士交配して、α１−／−；Ｅｍｘ１−Ｃｒｅマウスを製作した。前記α１−／−；Ｅｍｘ１−Ｃｒｅマウスが、ＧＡＢＡＡ受容体α１−／−マウスより本態性振戦症の強さが強化されたことを確認することによって、本態性振戦症研究及び薬物スクリーニングに有用で、本態性振戦症の病因と関連して大脳皮質の役割を研究するモデルに使用できることを確認して本発明を完成した。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｍｏｈｌｅｒ，Ｈ．等，Ｎｅｕｒｏｃｈ．Ｒｅｓ，１９９５年，第２０巻，ｐ．６３１−６３６
【非特許文献２】Ｖｉｃｉｎｉ，Ｓ．等，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，２００１年，第２１巻，ｐ．３００９−３０１６
【非特許文献３】Ｋｒａｌｉｃ，Ｊ．Ｅ．等，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，２００５年，第１１５巻，ｐ．７７４−７７９
【非特許文献４】Ｔｓｉｅｎ，Ｒ．Ｗ．，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｐｈｙｓｉｏｌ，１９８３年，第４５巻，ｐ．３４１−３５８
【非特許文献５】Ｔｓｉｅｎ，Ｒ．Ｗ．等，Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，１９９５年，第１８巻，ｐ．５２−５４
【非特許文献６】Ｐｅｒｅｚ−Ｒｅｙｅｓ，Ｅ．，Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｖ，２００３年，第８３巻，ｐ．１１７−１６１
【非特許文献７】Ｋｉｍ，Ｄ．等，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００３年，第３０２巻，ｐ．１１７−１１９
【非特許文献８】Ｋｉｍ，Ｄ．等，Ｎｅｕｒｏｎ，２００１年，第３１巻，ｐ．３５−４５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、本態性振戦症が強化されたマウスモデルを提供することである。
【００１１】
また、本発明の目的は、前記本態性振戦症が強化されたマウスから由来した、マウス受精卵を提供することである。
【００１２】
また、本発明の目的は、前記本態性振戦症が強化されたマウスの製造方法を提供することである。
【００１３】
また、本発明の目的は、前記本態性振戦症が強化されたマウスを用いて本態性振戦症治療剤をスクリーニングする方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
前記目的を達成するために本発明は、ＧＡＢＡＡ受容体α１サブユニット（ＧＡＢＡＡ ｒｅｃｅｐｔｏｒ α１ ｓｕｂｕｎｉｔ，α１）及びＴ−類型Ｃａ２＋チャンネル（Ｔ−ｔｙｐｅ Ｃａ２＋ ｃｈａｎｎｅｌ，ＣａＶ３．１）がノックアウトされた、本態性振戦症が誘発された二重ノックアウトマウス（α１−／−／ＣａＶ３．１−／−）を提供する。
【００１５】
また、本発明は、前記二重ノックアウトマウスに由来した、本態性振戦症が誘発された二重ノックアウトマウスの受精卵を提供する。
【００１６】
また、本発明は、
１）ＧＡＢＡＡ受容体α１サブユニットノックアウトマウス（α１−／−）をＴ−類型Ｃａ２＋チャンネルノックアウトマウス（ＣａＶ３．１−／−）と交配する工程と、
２）前記工程１）の子孫の中で前記二つの遺伝子を異形接合体（ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｔｅ）状態で有しているマウス（α１＋／−／ＣａＶ３．１＋／−）を選別する工程と、
３）前記選別された成体α１＋／−／ＣａＶ３．１＋／−マウス同士交配する工程、及び
４）前記工程３）の子孫の中から前記工程１）の二つの遺伝子が両方欠乏した二重ノックアウトマウス（α１−／−／ＣａＶ３．１−／−）を選別する工程とを含む、本態性振戦症が誘発された二重ノックアウトマウスの製造方法を提供する。
【００１７】
同時に、本発明は、
１）前記本態性振戦症が誘発された二重ノックアウトマウス（α１−／−／ＣａＶ３．１−／−）に被検化合物を投与する工程と、
２）前記処理されたマウス（実験群）が動いたり姿勢を維持している時に、振動数または震動の強さを測定する工程、及び
３）被検化合物を未処理したマウス（対照群）と比較して振動数または震動の強さを減少させた被検化合物を選別する工程とを含む、本態性振戦症治療剤のスクリーニング方法を提供する。
【００１８】
また、本発明は、大脳皮質のみで特異的にＧＡＢＡＡ受容体α１サブユニット（ＧＡＢＡＡ ｒｅｃｅｐｔｏｒ α１ ｓｕｂｕｎｉｔ，α１）遺伝子がノックアウトされた、本態性振戦症が誘発されたマウス（α１−／−；Ｅｍｘ１−Ｃｒｅマウス）を提供する。
【００１９】
また、本発明は、α１−／−；Ｅｍｘ１−Ｃｒｅマウスに由来した、本態性振戦症が誘発された受精卵を提供する。
【００２０】
また、本発明は、
１）ＧＡＢＡＡ受容体α１サブユニットノックアウトマウス（α１Ｆ／Ｆ）をＥｍｘ１−Ｃｒｅマウスと交配する工程と、
２）前記工程１）の子孫の中で前記二つの遺伝子を異形接合体（ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｔｅ）状態で有しているマウス（α１Ｆ／＋；Ｅｍｘ１−Ｃｒｅ）を選別する工程と、
３）前記選別された成体α１Ｆ／＋；Ｅｍｘ１−Ｃｒｅマウス同士交配する工程、及び、
４）前記工程３）の子孫の中からα１−／−及びＥｍｘ１−Ｃｒｅ遺伝子を両方含むマウスを選別する工程とを含む、本態性振戦症が誘発されたα１−／−；Ｅｍｘ１−Ｃｒｅマウスの製造方法を提供する。
【００２１】
同時に、本発明は、
１）前記本態性振戦症が誘発されたα１−／−；Ｅｍｘ１−Ｃｒｅマウスに被検化合物を投与する工程と、
２）前記処理されたマウス（実験群）が動いたり姿勢を維持している時に、振動数または震動の強さを測定する工程、及び
３）被検化合物を未処理したマウス（対照群）と比較して振動数または震動の強さを減少させた被検化合物を選別する工程とを含む、本態性振戦症治療剤のスクリーニング方法を提供する。
【発明の効果】
【００２２】
本発明のα１／ＣａＶ３．１二重ノックアウトマウスまたはα１−／−；Ｅｍｘ１−Ｃｒｅマウスは、α１ノックアウトマウスと比較して、肉眼で確認することができる程度に強くて明確な本態性振戦症兆候を示すので、本態性振戦症に対する治療剤開発に有用に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】３０週齢のα１＋／＋／ＣａＶ３．１＋／＋及びα１−／−／ＣａＶ３．１−／−において、加速度センサー測定法で振戦の程度を測定した結果を示した図である。
【図２】３０週齢のα１＋／＋／ＣａＶ３．１＋／＋、α１−／−／ＣａＶ３．１＋／＋及びα１−／−／ＣａＶ３．１−／−において、加速度センサー測定法で振戦の程度を測定した結果を示した図である。
【図３】３０週齢のα１＋／＋／ＣａＶ３．１＋／＋、α１−／−／ＣａＶ３．１＋／＋及びα１−／−／ＣａＶ３．１−／−において、加速度センサー測定法で振戦の強さを測定した結果を示したグラフである。
【図４】２０週齢のα１＋／＋／Ｅｍｘｌ−Ｃｒｅ、α１＋／−／Ｅｍｘｌ−Ｃｒｅ及びα１−／−／Ｅｍｘｌ−Ｃｒｅにおいて、加速度センサー測定法で 振戦の強さを測定した結果を示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
以下、本発明を詳しく説明する。
【００２５】
本発明は、ＧＡＢＡＡ受容体α１サブユニット（ＧＡＢＡＡ ｒｅｃｅｐｔｏｒ α１ ｓｕｂｕｎｉｔ，α１）及びＴ−類型Ｃａ２＋チャンネル（Ｔ−ｔｙｐｅ Ｃａ２＋ ｃｈａｎｎｅｌ，ＣａＶ３．１）がノックアウトされた、本態性振戦症が誘発された二重ノックアウトマウス（α１−／−／ＣａＶ３．１−／−）を提供する。
【００２６】
本発明の具体的な実施例で、ＧＡＢＡＡ受容体α１サブユニットノックアウトマウス（α１−／−）とＣａＶ３．１チャンネルノックアウトマウス（ＣａＶ３．１−／−）を交配して二つの遺伝子を異形接合体の形態で有するマウス（α１＋／−／ＣａＶ３．１＋／−）を得て、これらの間の交配で、ＧＡＢＡＡ受容体α１サブユニット（α１−／−）とＣａＶ３．１チャンネル（ＣａＶ３．１−／−）が二重ノックアウトされたマウス（α１−／−／ＣａＶ３．１−／−）を得た。
【００２７】
前記二重ノックアウトマウスの振戦の震動の強さは、ＧＡＢＡＡ受容体α１サブユニットノックアウトマウスより３〜１２倍以上、好ましくは、５〜１０倍以上強い。
【００２８】
また、前記振戦の震動強さは、加速度センサーを用いて測定することができる。
【００２９】
また、本発明は、前記二重ノックアウトマウスに由来した、本態性振戦症が誘発された二重ノックアウトマウスの受精卵を提供する。
【００３０】
また、本発明は、
１）ＧＡＢＡＡ受容体α１サブユニットノックアウトマウス（α１−／−）をＴ−類型Ｃａ２＋チャンネルノックアウトマウス（ＣａＶ３．１−／−）と交配する工程と、
２）前記工程１）の子孫の中から前記二つの遺伝子を異形接合体状態で有しているマウス（α１＋／−／ＣａＶ３．１＋／−）を選別する工程と、
３）前記選別されたα１＋／−／ＣａＶ３．１＋／−の成体マウス同士を交配する工程、及 び
４）前記工程３）の子孫の中から前記工程１）の二つの遺伝子が両方欠乏した二重ノックアウトマウス（α１−／−／ＣａＶ３．１−／−）を選別する工程とを含む、本態性振戦症が誘発された二重ノックアウトマウスの製造方法を提供する。
【００３１】
本発明の具体的な実施例で、ＧＡＢＡＡ受容体α１サブユニットノックアウトマウス（α１−／−）とＣａＶ３．１チャンネルノックアウトマウス（ＣａＶ３．１−／−）を交配して、二つの遺伝子を異形接合体の形態で有するマウス（α１＋／−／ＣａＶ３．１＋／−）を得て、これらの間の交配によってＧＡＢＡＡ受容体α１サブユニット（α１−／−）とＣａＶ３．１チャンネル（ＣａＶ３．１−／−）が両方ノックアウトされた二重ノックアウトマウスを得た。
【００３２】
また、本発明の具体的な実施例では、α１−／−／ＣａＶ３．１＋／＋及びα１−／−／ＣａＶ３．１−／−マウスの本態性振戦症を比較することによって、α１−／−／ＣａＶ３．１＋／＋マウスにおいてＣａＶ３．１チャンネル遺伝子のノックアウトが及ぼす影響を確認した。加速度センサーを用いた分析の結果、α１−／−／ＣａＶ３．１−／−マウスとα１−／−／ＣａＶ３．１＋／＋マウスで２０〜２５Ｈｚの振戦症が測定されたが（図２参照）、α１−／−／ＣａＶ３．１−／−マウスにおいて震動の強さが５〜１０倍さらに強く測定され（図３参照）、ビデオ判読の結果によると、α１−／−／ＣａＶ３．１＋／＋マウスでは、特異的な振戦症関連震えが弱く観察された。したがって、ＣａＶ３．１チャンネル遺伝子のノックアウト導入によって、既存のＧＡＢＡＡ受容体α１サブユニットノックアウトによる本態性振戦症がさらに強化された。
【００３３】
前記工程に、追加で本態性振戦症誘発の有無を判定する工程を含むことができる。
【００３４】
前記判定方法は、ビデオ分析において動いたり姿勢を維持している時、正常マウスと比較して姿勢が不安定であるとかひどく震える症状が示されたことを確認する方法または加速度センサーで測定した結果、振動数及び／または震動の強さの増加有無を確認する方法で遂行することができる。本発明のα１−／−／ＣａＶ３．１−／−マウスは、ひどい振戦症の症状を示すが、この症状はマウスがじっとしている時は（ｒｅｓｔｉｎｇ）示されないで、主に動く時のみ（ｐｏｓｔｕｒａｌ／ｋｉｎｅｔｉｃ）に現れる本態性振戦症の特性を有している。
【００３５】
同時に、本発明は、
１）前記本態性振戦症が誘発された二重ノックアウトマウス（α１−／−／ＣａＶ３．１−／−）に被検化合物を投与する工程と、
２）前記処理されたマウス（実験群）が動いたり姿勢を維持している時に、振動数または震動の強さを測定する工程と、
３）被検化合物を未処理したマウス（対照群）と比較して振動数または震動の強さを減少させた被検化合物を選別する工程とを含む、本態性振戦症治療剤のスクリーニング方法を提供する。
【００３６】
本発明のマウス（α１−／−／ＣａＶ３．１−／−）は、従来のα１−／−／ＣａＶ３．１＋／＋マウスよりさらに強い本態性振戦症の兆候を示すので（図２参照）、本態性振戦症治療剤開発のためのマウスモデルとして使用することができる。
【００３７】
前記工程１）の被検化合物は、天然化合物、合成化合物、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ポリペプチド、酵素、タンパク質、リガンド、抗体、抗原、バクテリアまたは真菌の代謝産物及び生活性分子からなる群から選択されるいずれか一つであることができる。
【００３８】
また、前記工程１）の投与方法は、経口投与または非経口投与を通じて遂行することができ、前記非経口投与時、皮内注射、皮下注射、静脈注射、腹腔注射、筋肉注射からなる群から選択されるいずれか一つの注射投与、直腸投与、局所塗付、パッチテスト、及びイオントフォレーシス（Ｉｏｎｔｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）からなる群から選択されるいずれか一つの方法で遂行することができる。
【００３９】
ＧＡＢＡＡ受容体α１−／−マウスは、振戦症の強さが弱く、年齢が充分に高くなければ（＞８ヶ月）目で観察可能な程度にならないという短所があるので、振戦症研究及び薬物スクリーニングなどに使用するのに不便さがあった。本発明で製造されたα１−／−／ＣａＶ３．１−／−マウスは、幼い年齢から克明な振戦症を示してその強さも強いので、このような短所を克服できる重要なモデルになることができる。
【００４０】
また、本発明は、大脳皮質でのみ特異的にＧＡＢＡＡ受容体α１サブユニット（ＧＡＢＡＡ ｒｅｃｅｐｔｏｒ α１ ｓｕｂｕｎｉｔ，α１）遺伝子がノックアウトされた、本態性振戦症が誘発されたマウス（α１−／−；Ｅｍｘ１−Ｃｒｅマウス）を提供する。
【００４１】
また、本発明は、α１−／−；Ｅｍｘ１−Ｃｒｅマウスに由来した、本態性振戦症が誘発された受精卵を提供する。
【００４２】
本発明者等は、ＧＡＢＡＡ受容体α１サブユニット（ｓｕｂｕｎｉｔ）遺伝子の大脳皮質特異的除去を通じて本態性振戦症が強化されたモデルを製造した。具体的に、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ組換え技術を用いてマウス脳の特定地域（Ｄｏｒｓａｌ ｔｅｌｅｎｃｅｐｈａｌｏｎ）でのみＧＡＢＡＡ受容体α１サブユニットをノックアウトさせたマウス（α１−／−；Ｅｍｘ１−Ｃｒｅ）を製造した。前記製造されたα１−／−；Ｅｍｘ１−Ｃｒｅマウスは、振戦症症状を示し、この症状は、マウスがじっとしている時は（ｒｅｓｔｉｎｇ）示されないで、主に動く時のみ（ｐｏｓｔｕｒａｌ／ｋｉｎｅｔｉｃ）に現われる本態性振戦症の特性を有していることを確認した。
【００４３】
本発明者等は、α１−／−；Ｅｍｘ１−Ｃｒｅマウスを加速度センサーで測定してみた結果、２５〜３０Ｈｚの振戦症の強さを示し、前記振戦症の強さは、ＧＡＢＡＡ受容体α１−／−マウスと比較して、類似かまたは１．５〜２倍程度強かった。発病は、約３週齢から発生し、ＧＡＢＡＡ受容体α１−／−マウスと比較して、発病時期がずっと早いことを確認した。
【００４４】
したがって、α１−／−；Ｅｍｘ１−Ｃｒｅマウスは、ＧＡＢＡＡ受容体α１−／−マウスと比較して、発病時期が早くて振戦症の強さがさらに強いので、振戦症研究及び薬物スクリーニングなどに容易に使用することができ、本態性振戦症の病因と関連して、今まで相対的に進展していない大脳皮質（ｃｏｒｔｅｘ）の役割を研究するにおいて重要なモデルとして使用ができることが分かる。
【００４５】
また、本発明は、
１）ＧＡＢＡＡ受容体α１サブユニットノックアウトマウス（α１Ｆ／Ｆ）をＥｍｘ１−Ｃｒｅマウスと交配する工程と、
２）前記工程１）の子孫の中で前記二つの遺伝子を異形接合体（ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｔｅ）状態で有しているマウス（α１Ｆ／＋；Ｅｍｘ１−Ｃｒｅ）を選別する工程と、
３）前記選別された成体α１Ｆ／＋；Ｅｍｘ１−Ｃｒｅマウス同士交配する工程、及び、
４）前記工程３）の子孫の中からα１−／−及びＥｍｘ１−Ｃｒｅ遺伝子を両方含むマウスを選別する工程とを含む、本態性振戦症が誘発されたα１−／−；Ｅｍｘ１−Ｃｒｅマウスの製造方法を提供する。
【００４６】
同時に、本発明は、
１）前記本態性振戦症が誘発されたα１−／−；Ｅｍｘ１−Ｃｒｅマウスに被検化合物を投与する工程と、
２）前記処理されたマウス（実験群）が動いたり姿勢を維持している時に、振動数または震動の強さを測定する工程、及び
３）被検化合物を未処理したマウス（対照群）と比較して振動数または震動の強さを減少させた被検化合物を選別する工程とを含む、本態性振戦症治療剤のスクリーニング方法を提供する。
【実施例】
【００４７】
以下、本発明を実施例によって詳しく説明する。
【００４８】
但し、下記の実施例は、本発明を例示するだけのものであって、本発明の内容が下記の実施例によって限定されるのではない。
【００４９】
実施例１．二重ノックアウトマウスの製造及び選別
＜１−１＞α１−／−マウス及びＣａＶ３．１−／−マウスの製造
本発明者等は、参考文献（Ｖｉｃｉｎｉ等，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ．２００１年，第２１巻，ｐ．３００９）に記載された方法で製造されたＧＡＢＡＡ受容体α１−／−マウスを、Ｇ．Ｈｏｍａｎｉｃｓ（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ａｎａｅｓｔｈｅｓｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ １５２６１，米国）から供給を受けた。
【００５０】
一方、本発明者等は、参考文献８（Ｋｉｍ，Ｄ．等，Ｎｅｕｒｏｎ，２００１年，第３１巻，ｐ．３５−４５）に記載された方法で製造されたＣａＶ３．１チャンネルノックアウトマウスを保有している。具体的に、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの脳組織から得たｍＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲしてマウスＣａＶ３．１ｃＤＮＡを得た後、これをプローブに使用して、１２９／ｓｖマウスのｃＤＮＡをｌａｍｄａＧＴ１１ベクターに挿入して製造したゲノムライブラリで、ＣａＶ３．１位置を含むＣａＶ３．１遺伝子（ｃａｃｎａ１Ｇ）ゲノム断片を選別した。選別されたゲノム断片に、二重選別マーカー（ｎｅｏ及びＴＫ）を挿入して、１１．７ｋｂの相同化断片を含む標的ベクター（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒ）を製造した。標的ベクターをＪ１胚芽幹細胞株（Ｄｒ．Ｒ Ｊｅａｎｉｓｃｈ，Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ ０２１４２，米国．ｊｅａｎｉｓｃｈ＠ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ）に形質導入させた。前記標的ベクターが導入されたＥＳクローンをサザンブロット分析を通じて選別して、生殖系列キメラの製造に使用した。オス生殖系列キメラを、Ｆ１異形接合体（ＣａＶ３．１＋／−）形質のメスのＣ５７ＢＬ／６Ｊと交配した後、その子孫同士交配して同型接合体（ＣａＶ３．１−／−）形質のマウスを製造した。前記同型接合体形質のマウスの遺伝子型は、ＰＣＲを通じて確認した。
【００５１】
＜１−２＞α１−／−／ＣａＶ３．１−／−二重ノックアウトマウスの製造及び選別
前記ＧＡＢＡＡ受容体α１サブユニットノックアウトマウス（α１−／−）とＣａＶ３．１チャンネルノックアウトマウス（ＣａＶ３．１−／−）を交配した後、生まれた子孫の尾から得たゲノムＤＮＡを鋳型にして、ゲノムＰＣＲを遂行した後、電気泳動で遺伝子型を確認した。α１遺伝子は、配列番号１（５’−ＴＣＴＧＣＡＴＧＴＧＧＧＡＣＡＡＡＧＡＣ−３’）及び配列番号２（５’−ＡＣＧＣＡＴＡＣＣＣＴＣＴＣＴＴＧＧＴＧ−３’）で表わされるプライマー対を用いたＰＣＲで正常対立遺伝子を確認し、配列番号１及び配列番号３（５’−ＴＧＡＴＴＧＣＴＴＴＴＣＴＧＡＧＡＴＡＧＧＧ−３’）で表わされるプライマー対を用いたＰＣＲでノックアウト対立遺伝子を確認した。前記ＰＣＲは、９５℃で５分間変性させて、９５℃で３０秒、６２℃で３０秒、７２℃で４０秒の条件で２９サイクルを繰り返した後、７２℃で３分間延長させた後、４℃で冷却する手順で遂行した。また、ＣａＶ３．１遺伝子は、配列番号４（５−ＡＴＡＣＧＴＧＧＴＴＣＧＡＧＣＧＡＧＴＣ−３）及び配列番号５（５−ＣＧＡＡＧＧＣＣＴＧＡＣＧＴＡＧＡＡＡＧ−３）で表わされるプライマー対を用いたＰＣＲで正常対立遺伝子を確認し、配列番号４及び配列番号６（５−ＣＴＧＡＣＴＡＧＧＧＧＡＧＧＡＧＴＡＧＡＡＧ−３）で表わされるプライマー対を用いたＰＣＲでノックアウト対立遺伝子を確認した。前記ＰＣＲは、９４℃で５分間変性させて、９４℃で３０秒、５８℃で３０秒、７２℃で３０秒の条件で４０サイクル繰り返した後、７２℃で５分間延長させた後、４℃で冷却する手順で遂行した。前記確認の結果、α１遺伝子及びＣａＶ３．１遺伝子それぞれに対して、正常対立遺伝子及びノックアウト対立遺伝子をすべて有している子孫を異型接合体として選別した。前記選別された異型接合体同士交配した後、生まれた子孫の尾から得たゲノムＤＮＡを鋳型に、前記と同じ方法でゲノムＤＮＡ ＰＣＲを遂行し、α１遺伝子及びＣａＶ３．１遺伝子それぞれでノックアウト対立遺伝子のみを有している子孫を同型接合体として選別した。
【００５２】
このようにして、ＧＡＢＡＡ受容体α１サブユニット（α１−／−）とＣａＶ３．１チャンネル（ＣａＶ３．１−／−）が両方ノックアウトされた二重ノックアウトマウスを得た。
【００５３】
実施例２．α１−／−／ＣａＶ３．１−／−マウスでの振戦症測定
α１−／−／ＣａＶ３．１−／−マウスで示される振戦症を定量定性的に分析するために、加速度センサー（ａｃｃｅｌｅｒｏｍｅｔｅｒ）測定法とビデオ録画方法を使用した。実験群として、３０週齢になったα１−／−／ＣａＶ３．１−／−マウス２匹、対照群として３０週齢になった正常マウス（α１＋／＋／ＣａＶ３．１＋／＋）２匹を用いた。
【００５４】
底に加速計を付着した不透明な円筒（直径１０ｃｍ×高さ１５ｃｍ）を空中にぶら下げて測定プラットホームとして使用した。前記円筒にマウスを入れて動くようにしながら前記動きを加速度センサーを通じて電子信号で認識した。前記電子信号を増幅して記録することでマウスの振戦症有無、程度及び振動数などを定量的に判断した。また、前記プラットホーム上側にビデオカメラを設置してマウスがどのような状態（姿勢、動きなど）で振戦症を見せるのか定性的に確認した。マウスを測定プラットホームの中に入れた後、１０分間ビデオ録画と加速度センサーによる記録を行なった。
【００５５】
ビデオ分析の結果、α１−／−／ＣａＶ３．１−／−マウスはプラットホーム内での姿勢が不安定だったり（ｐｏｓｔｕｒａｌ）動く時（ｋｉｎｅｔｉｃ）にひどく震える振戦症の症状を示した。一方、同じ場所にじっと静止している時（ｒｅｓｔｉｎｇ）には、振戦症が弱いか、ほとんど示されなかった。このことから、α１−／−／ＣａＶ３．１−／−マウスで示される振戦症の特性が、本態性振戦症の特性と定性的に一致することを確認した。一方、正常マウスでは、いかなる振戦症関連の症状も現れなかった。
【００５６】
加速度センサーを用いた分析の結果、図１で示されたように正常マウスでは、動きによる５Ｈｚ未満の振動数のみ測定された。一方、α１−／−／ＣａＶ３．１−／−マウスでは、それとともに２０〜２５Ｈｚの震動数帯が測定されたが、ビデオ判読データと比較分析した結果、マウスが振戦症の症状を見せた時間の区間内でのみ、特徴的に測定されることが分かった。これを通じて、α１−／−／ＣａＶ３．１−／−マウスは、２０〜２５Ｈｚの本態性振戦症を有することを確認した。
【００５７】
実施例３．α１−／−マウスのＣａＶ３．１ノックアウトの影響分析
ＧＡＢＡＡ受容体α１−／−マウスで示される本態性振戦症にＣａＶ３．１チャンネルが及ぼす影響を確認するため、ＧＡＢＡＡ受容体α１−／−マウス（α１−／−／ＣａＶ３．１＋／＋）及びα１−／−／ＣａＶ３．１−／−マウスで示される振戦症を測定して比較した。
【００５８】
ＧＡＢＡＡ受容体α１−／−マウスで示される振戦症は、マウスの年令と比例関係にあり、特に３０週齢以上になったマウスで強く示されることが知られている。したがって、すべての実験は、３０週齢のマウスを用いて行なった。
【００５９】
対照群には、３０週齢になった正常マウス（α１＋／＋／ＣａＶ３．１＋／＋）３匹、実験群１には、ＧＡＢＡＡ受容体α１サブユニットノックアウトマウス（α１−／−／ＣａＶ３．１＋／＋）４匹、実験群２には、二重ノックアウトマウス（α１−／−／ＣａＶ３．１−／−）３匹を対象にビデオ録画、振戦周波数測定及び振戦の強さ測定を実施した。
【００６０】
ビデオ判読結果によると、α１−／−／ＣａＶ３．１−／−マウスを除いた残り二つの群のマウスでは、特異的な振戦症関連の震えが観察されなかった。
【００６１】
加速度センサーを用いた分析の結果、図２及び図３に示されたように、α１−／−／ＣａＶ３．１−／−マウスとα１−／−／ＣａＶ３．１＋／＋マウスでのみ２０〜２５Ｈｚの振戦症が測定されたが、α１−／−／ＣａＶ３．１−／−マウスで、震動の強さが５〜１０倍さらに強く測定された。
【００６２】
実施例４．ＧＡＢＡＡ受容体α１サブユニット遺伝子の大脳皮質特異的除去を通じて本態性振戦症が強化されたマウスの製造
＜４−１＞α１−／−；Ｅｍｘ１−Ｃｒｅマウスの製造
本発明者等は、参考文献（Ｖｉｃｉｎｉ等，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ．２００１年５月，第２１巻，ｐ．３００９ ）に記載された方法で製造されたＧＡＢＡＡ受容体α１Ｆ／ＦマウスをＧ．Ｈｏｍａｎｉｃｓから供給受けた。
【００６３】
一方、本発明者等は、参考文献（Ｔａｋｕｊｉ等，Ｇｅｎｅｓｉｓ．２００４年，第３８巻，ｐ．１３０ ）に記載された方法で製造されたＥｍｘ１−ＣｒｅマウスをＩｔｏｈａｒａ Ｓｈｉｇｅｙｏｓｈｉから供給受けた。
【００６４】
本発明者等は、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ組換え技術を用いてマウス大脳皮質（Ｄｏｒｓａｌ ｔｅｌｅｎｃｅｐｈａｌｏｎ）でのみＧＡＢＡＡ受容体α１サブユニット（ｓｕｂｕｎｉｔ）をノックアウトさせたマウス（α１−／−；Ｅｍｘ１−Ｃｒｅ）を製造した。詳細には、前記ＧＡＢＡＡ受容体α１Ｆ／ＦマウスをＥｍｘ１−Ｃｒｅマウスと交配して、α１Ｆ／＋；Ｅｍｘ１−Ｃｒｅマウスを得た。さらに、これら同士交配して、α１−／−；Ｅｍｘ１−Ｃｒｅマウスを製造した。
【００６５】
＜４−２＞α１−／−；Ｅｍｘ１−Ｃｒｅマウスの製造及び選別
ＧＡＢＡＡ受容体α１サブユニットＦｌｏｘｅｄマウス（α１Ｆ／Ｆ）とＥｍｘ１−Ｃｒｅトランスジェニックマウスを交配した後、生まれた子孫の尾から得たゲノムＤＮＡを鋳型にして、ゲノムＰＣＲを遂行した後、電気泳動で遺伝子型を確認した。α１遺伝子は、配列番号１（５’−ＴＣＴＧＣＡＴＧＴＧＧＧＡＣＡＡＡＧＡＣ−３’）及び配列番号２（５’−ＡＣＧＣＡＴＡＣＣＣＴＣＴＣＴＴＧＧＴＧ−３’）で表わされるプライマー対を用いたＰＣＲで異型接合体遺伝子（α１Ｆ／＋）を確認した。前記ＰＣＲは、９５℃で５分間変性させて、９５℃で３０秒、６２℃で３０秒、７２℃で４０秒の条件で２９サイクル繰り返した後、７２℃で３分間延長させた後、４℃で冷却する手順で遂行した。また、Ｅｍｘ１−Ｃｒｅ遺伝子は、配列番号７（５’−ＡＣＣＴＧＡＴＧＧＡＣＡＴＧＴＴＣＡＧＧＧＡＴＣＧ−３’）及び配列番号８（５’−ＴＣＣＧＧＴＴＡＴＴＣＡＡＣＴＴＧＣＡＣＣＡＴＧＣ−３’）で表わされるプライマー対を用いたＰＣＲでトランスジェニック遺伝子を確認した。前記ＰＣＲは、９４℃で３分間変性させて、９４℃で３０秒、６０℃で３０秒、７２℃で６０秒の条件で３５サイクル繰り返した後、７２℃で５分延長させた後、４℃で冷却する手順で遂行した。前記確認の結果、α１遺伝子に対してＦｌｏｘｅｄ対立遺伝子及び正常対立遺伝子を両方有していて、同時にＥｍｘ１−Ｃｒｅトランスジェニック遺伝子も有している子孫（α１Ｆ／＋；Ｅｍｘ１−Ｃｒｅ）を選別した。前記選別されたマウス同士交配した後、生まれた子孫の尾から得たゲノムＤＮＡを鋳型に、前記と同一方法でゲノムＤＮＡ ＰＣＲを遂行した。α１遺伝子の場合、配列番号１及び配列番号３（５’−ＴＧＡＴＴＧＣＴＴＴＴＣＴＧＡＧＡＴＡＧＧＧ−３’）で表わされるプライマー対を用いたＰＣＲも遂行してノックアウト対立遺伝子を確認した。これを通じて、α１ノックアウト対立遺伝子とＥｍｘ１−Ｃｒｅ遺伝子を有している子孫（α１−／−；Ｅｍｘ１−Ｃｒｅ）を選別した。
【００６６】
このようにして、ＧＡＢＡＡ受容体α１サブユニット（α１−／−）が大脳皮質でのみノックアウトされたマウス（α１−／−；Ｅｍｘ１−Ｃｒｅ）を得た。
【００６７】
実施例５．α１−／−；Ｅｍｘ１−Ｃｒｅマウスでの振戦症測定
前記α１−／−；Ｅｍｘ１−Ｃｒｅマウスで示される振戦症を定量定性的に分析するため、前記実施例２と同一方法で加速度センサー測定法とビデオ録画方法を使用した。実験群として、２０週齢になったα１−／−；Ｅｍｘ１−Ｃｒｅマウス２匹、対照群として同腹仔（ｌｉｔｔｅｒｍａｔｅ）の２０週齢になった他のマウス（α１＋／＋；Ｅｍｘ１−Ｃｒｅまたはα１＋／−；Ｅｍｘ１−Ｃｒｅ）５匹を用いて振戦症測定をした。
【００６８】
ビデオ分析の結果、α１−／−；Ｅｍｘ１−Ｃｒｅマウスは、プラットホーム内での姿勢が不安定だったり（ｐｏｓｔｕｒａｌ）動く時（ｋｉｎｅｔｉｃ）震える振戦症の症状がみられた。一方、同じ場所にじっと静止している時（ｒｅｓｔｉｎｇ）には、振戦症が弱いか、ほとんど示されなかった。このことから、α１−／−；Ｅｍｘ１−Ｃｒｅマウスで示される振戦症の特性が、本態性振戦症の特性と定性的に一致することを確認した。一方、他のマウスでは、いかなる振戦症に関連する症状も現われなかった。
【００６９】
加速度センサーを用いた分析の結果、α１−／−；Ｅｍｘ１−Ｃｒｅマウスでのみ２５〜３０Ｈｚの震動数帯が測定されたが、ビデオ判読データと比較分析した結果、マウスが振戦症症状を示した時間の区間内でのみ特徴的に測定されることが分かった。このことから、α１−／−；Ｅｍｘ１−Ｃｒｅマウスは、２５〜３０Ｈｚの振戦症を遺伝的に有することを確認した。α１−／−；Ｅｍｘ１−Ｃｒｅマウスの振戦症の強さは、ＧＡＢＡＡ受容体α１−／−マウスと比較して類似かまたは１．５〜２倍程度強かった。また、発病時期は、ＧＡＢＡＡ受容体α１−／−マウスと比較してずっと早かった（約３週齢から）。
【産業上の利用可能性】
【００７０】
本発明のα１／ＣａＶ３．１二重ノックアウトマウスまたはα１−／−；Ｅｍｘ１−Ｃｒｅマウス及びこれらを用いた用途発明は、本態性振戦症に対する治療剤開発に有用に使用することができる。
【配列表フリーテキスト】
【００７１】
配列番号１：ＧＡＢ２ ａ１フォワードプライマー
配列番号２：ＧＡＢ２ ａ１リバースプライマー
配列番号３：ＧＡＢ２ ａ１リバースプライマー２
配列番号４：Ｆ１ ａ１Ｇフォワードプライマー
配列番号５：Ｆ１ ａ１Ｇリバースプライマー
配列番号６：ＰＧＫ２２ ａ１Ｇリバースプライマー
配列番号７：Ｅｍｘ１‐Ｃｒｅフォワードプライマー
配列番号８：Ｅｍｘ１‐Ｃｒｅリバースプライマー
【技術分野】
【０００１】
本発明は、本態性振戦症（ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｔｒｅｍｏｒ）（または手震症）が強化されたマウスモデルを用いた治療剤のスクリーニング方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
本態性振戦症は、動作時振戦または姿勢振戦を示す代表的な病気である。動作時振戦または姿勢振戦というのは、動いたり（ｔｈｒｏｕｇｈｏｕｔ ａｃｔｉｖｅ ｍｏｖｅｍｅｎｔ）、“コップを持ったり”または“前にならえ”などのようにある姿勢を維持している時（ｄｕｒｉｎｇ ｐｏｓｔｕｒｉｎｇ）に、ひどくなる形態の振戦症を言う。これとは反対に、動かないで休息を取っている時にひどくなる振戦症を、安定型振戦症（ｒｅｓｔｉｎｇ ｔｒｅｍｏｒ）といい、これはパーキンソン病でよく現れる。本態性振戦症は、一種の遺伝病であり、常染色体優性遺伝で遺伝するので、家族の中に振戦症がある場合が多い。したがって、本態性振戦症を家族性振戦症とも言う。本態性振戦症の診断的特性は、ほとんどの場合、震えの振動数が、正常生理活動による生理的振戦症より若干遅くてさらに粗い。しかし、振戦の様相だけでは、他の形態の振戦と容易に区別することができない。歳をとるほど振戦の様相は、振動数が減少して振幅が大きくなる傾向がある。振戦は、上肢にのみ限って現れることもあり、頭に振戦があることもある。振戦がひどい場合には、あご、唇、舌、そして声帯にまで振戦が現れ、声帯に振戦が現れる場合は、音を出す時に震えた音を出すようになる。本態性振戦症の結果は、比較的良好な方であるが、人毎に多様で微細な震えが一方または両方で始まって、その震えの程度が徐々に進行する。体位や運動性変化にしたがって現れ、ひどく進行する場合でなければ、安定期にはみられない。全身性または神経系疾患と係わった他の神経学的異常はなく、家族歴があるという点が診断に役に立ち、たまに飲酒などが一時的に震えを緩和させることができる。
【０００３】
本態性振戦症を治療する方法は、薬物を用いる治療を原則とする。飲酒を通じてアルコールあるいはアルコール系列の化合物（ｏｃｔａｎｏｌ）を摂取する方法、抑制性神経伝達物質であるＧＡＢＡの受容体拮抗剤などの抑制性薬物を服用する方法などが用いられてきた。抑制性薬物としては、プリミドン（Ｐｒｉｍｉｄｏｎｅ）やベータ遮断剤の一種であるプロプラノロール（Ｐｒｏｐｒａｎｏｌｏｌ）という薬物が一次的に用いられる。前記薬物は、約６０〜７０％の患者に効果を示すが完治は難しい。期待しただけの効果がなければ、２次治療剤を使用したり物理的手術を受けたりする。しかし、前記ＧＡＢＡの受容体拮抗剤またはアルコール系列の化合物は、振戦症の他に多様な神経系機能を阻害するので、睡眠誘導などの副作用がひどく、視床破壊術（ｔｈａｌａｍｅｃｔｏｍｙ）または脳深部刺激療法（ｄｅｅｐ−ｂｒａｉｎ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ）は、最後の手段であり、危険な脳手術を施行しなければならない。また、最近、脳深部刺激療法は、比較的安全で効果が確かな方法として脚光を浴びているが、費用が多少多くかかるという短所がある。
【０００４】
ＧＡＢＡＡ（ｇａｍｍａ−ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ ｔｙｐｅ Ａ）受容体スーパーファミリーは、主要抑制性神経伝達物質であるγ−アミノブチル酸（ＧＡＢＡ）と相互作用する受容体である。広範囲的には、哺乳動物の脳全般に不均一に分布しているが、ＧＡＢＡは、ＧＡＢＡＡ受容体を通じてＧＡＢＡ作用の大部分を調節することで、塩素イオン伝導度及び膜の分極が変更される。前記ＧＡＢＡのような神経伝達物質以外にも、抗不安剤及び鎮静剤に使用されるベンゾジアゼピンを含む様々な薬物が前記受容体に結合される。一般的に、ＧＡＢＡＡ受容体は、ＧＡＢＡに対する反応を開始する塩素チャンネルを含むことで塩素を細胞内に流入させる。これによって、順次に細胞膜電位の過分極による神経活性が鈍化される。
【０００５】
ＧＡＢＡＡ受容体は、５個のタンパク質サブユニットで構成されていて、各サブユニットは、２個のα、２個のβ及び１個のγからなっている。各サブユニットには、α１−６、β１−３及びγ１−３が存在する（非特許文献１）。従来、前記ＧＡＢＡＡ受容体のα１サブユニットをノックアウトさせて、遺伝的に１７−２２Ｈｚの本態性振戦症を示すマウスモデル（ＧＡＢＡＡ受容体α１−／−マウス）が開発されたことがあるが（非特許文献２）、振戦の強さが微弱で本態性振戦症の研究及び治療剤開発に使用するのに限界があった（非特許文献３）。
【０００６】
電圧依存性カルシウムチャンネルは、神経細胞の活性によって細胞内カルシウム濃度を増加させる役割をするが（非特許文献４）、電圧依存度によって高電圧依存性及び低電圧依存性チャンネルに分類される（非特許文献５）。Ｔ−タイプカルシウムチャンネルは、代表的な低電圧依存性カルシウムチャンネルであり、哺乳類では、α１サブユニットに対する遺伝子型によって、Ｃａｖ３．１（α１Ｇ）、３．２（α１Ｈ）、３．３（α１Ｉ）の三つの種類が存在する（非特許文献６）。α１Ｇカルシウムチャンネルは、視床核で神経細胞のバースト発火の生成に関与し、最近、重要な病理学的機能が解明された（非特許文献７、 非特許文献８）。従来、本発明者等は、α１Ｇ Ｔ−タイプカルシウムチャンネルが欠乏したマウスが、薬物で誘導される本態性振戦症に対して抵抗性を有することを解明したことがある。
【０００７】
そこで、本発明者等は、本態性振戦症症状を示すＧＡＢＡＡ受容体α１−／−マウスと本態性振戦症に対する抵抗性を有する、α１Ｇ Ｔ−タイプカルシウムチャンネルをノックアウトさせたマウスを交配して、二重ノックアウトマウス（α１−／−／ＣａＶ３．１−／−）を製作し、前記二重ノックアウトマウスの本態性振戦症の兆候を研究中、本態性振戦症が好転するだろうという予想とは異なり、既存のＧＡＢＡＡ受容体α１−／−マウスより震えの強さが肉眼で確認することができる程度にひどくなって、本態性振戦症の治療剤開発モデルに使用できることを確認することによって本発明を完成した。
【０００８】
また、本発明者等は、ＧＡＢＡＡ受容体α１Ｆ／ＦマウスをＥｍｘ１−Ｃｒｅマウスと交配して、α１Ｆ／＋；Ｅｍｘ１−Ｃｒｅマウスを得た。また、これら同士交配して、α１−／−；Ｅｍｘ１−Ｃｒｅマウスを製作した。前記α１−／−；Ｅｍｘ１−Ｃｒｅマウスが、ＧＡＢＡＡ受容体α１−／−マウスより本態性振戦症の強さが強化されたことを確認することによって、本態性振戦症研究及び薬物スクリーニングに有用で、本態性振戦症の病因と関連して大脳皮質の役割を研究するモデルに使用できることを確認して本発明を完成した。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｍｏｈｌｅｒ，Ｈ．等，Ｎｅｕｒｏｃｈ．Ｒｅｓ，１９９５年，第２０巻，ｐ．６３１−６３６
【非特許文献２】Ｖｉｃｉｎｉ，Ｓ．等，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，２００１年，第２１巻，ｐ．３００９−３０１６
【非特許文献３】Ｋｒａｌｉｃ，Ｊ．Ｅ．等，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，２００５年，第１１５巻，ｐ．７７４−７７９
【非特許文献４】Ｔｓｉｅｎ，Ｒ．Ｗ．，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｐｈｙｓｉｏｌ，１９８３年，第４５巻，ｐ．３４１−３５８
【非特許文献５】Ｔｓｉｅｎ，Ｒ．Ｗ．等，Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，１９９５年，第１８巻，ｐ．５２−５４
【非特許文献６】Ｐｅｒｅｚ−Ｒｅｙｅｓ，Ｅ．，Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｖ，２００３年，第８３巻，ｐ．１１７−１６１
【非特許文献７】Ｋｉｍ，Ｄ．等，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００３年，第３０２巻，ｐ．１１７−１１９
【非特許文献８】Ｋｉｍ，Ｄ．等，Ｎｅｕｒｏｎ，２００１年，第３１巻，ｐ．３５−４５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、本態性振戦症が強化されたマウスモデルを提供することである。
【００１１】
また、本発明の目的は、前記本態性振戦症が強化されたマウスから由来した、マウス受精卵を提供することである。
【００１２】
また、本発明の目的は、前記本態性振戦症が強化されたマウスの製造方法を提供することである。
【００１３】
また、本発明の目的は、前記本態性振戦症が強化されたマウスを用いて本態性振戦症治療剤をスクリーニングする方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
前記目的を達成するために本発明は、ＧＡＢＡＡ受容体α１サブユニット（ＧＡＢＡＡ ｒｅｃｅｐｔｏｒ α１ ｓｕｂｕｎｉｔ，α１）及びＴ−類型Ｃａ２＋チャンネル（Ｔ−ｔｙｐｅ Ｃａ２＋ ｃｈａｎｎｅｌ，ＣａＶ３．１）がノックアウトされた、本態性振戦症が誘発された二重ノックアウトマウス（α１−／−／ＣａＶ３．１−／−）を提供する。
【００１５】
また、本発明は、前記二重ノックアウトマウスに由来した、本態性振戦症が誘発された二重ノックアウトマウスの受精卵を提供する。
【００１６】
また、本発明は、
１）ＧＡＢＡＡ受容体α１サブユニットノックアウトマウス（α１−／−）をＴ−類型Ｃａ２＋チャンネルノックアウトマウス（ＣａＶ３．１−／−）と交配する工程と、
２）前記工程１）の子孫の中で前記二つの遺伝子を異形接合体（ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｔｅ）状態で有しているマウス（α１＋／−／ＣａＶ３．１＋／−）を選別する工程と、
３）前記選別された成体α１＋／−／ＣａＶ３．１＋／−マウス同士交配する工程、及び
４）前記工程３）の子孫の中から前記工程１）の二つの遺伝子が両方欠乏した二重ノックアウトマウス（α１−／−／ＣａＶ３．１−／−）を選別する工程とを含む、本態性振戦症が誘発された二重ノックアウトマウスの製造方法を提供する。
【００１７】
同時に、本発明は、
１）前記本態性振戦症が誘発された二重ノックアウトマウス（α１−／−／ＣａＶ３．１−／−）に被検化合物を投与する工程と、
２）前記処理されたマウス（実験群）が動いたり姿勢を維持している時に、振動数または震動の強さを測定する工程、及び
３）被検化合物を未処理したマウス（対照群）と比較して振動数または震動の強さを減少させた被検化合物を選別する工程とを含む、本態性振戦症治療剤のスクリーニング方法を提供する。
【００１８】
また、本発明は、大脳皮質のみで特異的にＧＡＢＡＡ受容体α１サブユニット（ＧＡＢＡＡ ｒｅｃｅｐｔｏｒ α１ ｓｕｂｕｎｉｔ，α１）遺伝子がノックアウトされた、本態性振戦症が誘発されたマウス（α１−／−；Ｅｍｘ１−Ｃｒｅマウス）を提供する。
【００１９】
また、本発明は、α１−／−；Ｅｍｘ１−Ｃｒｅマウスに由来した、本態性振戦症が誘発された受精卵を提供する。
【００２０】
また、本発明は、
１）ＧＡＢＡＡ受容体α１サブユニットノックアウトマウス（α１Ｆ／Ｆ）をＥｍｘ１−Ｃｒｅマウスと交配する工程と、
２）前記工程１）の子孫の中で前記二つの遺伝子を異形接合体（ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｔｅ）状態で有しているマウス（α１Ｆ／＋；Ｅｍｘ１−Ｃｒｅ）を選別する工程と、
３）前記選別された成体α１Ｆ／＋；Ｅｍｘ１−Ｃｒｅマウス同士交配する工程、及び、
４）前記工程３）の子孫の中からα１−／−及びＥｍｘ１−Ｃｒｅ遺伝子を両方含むマウスを選別する工程とを含む、本態性振戦症が誘発されたα１−／−；Ｅｍｘ１−Ｃｒｅマウスの製造方法を提供する。
【００２１】
同時に、本発明は、
１）前記本態性振戦症が誘発されたα１−／−；Ｅｍｘ１−Ｃｒｅマウスに被検化合物を投与する工程と、
２）前記処理されたマウス（実験群）が動いたり姿勢を維持している時に、振動数または震動の強さを測定する工程、及び
３）被検化合物を未処理したマウス（対照群）と比較して振動数または震動の強さを減少させた被検化合物を選別する工程とを含む、本態性振戦症治療剤のスクリーニング方法を提供する。
【発明の効果】
【００２２】
本発明のα１／ＣａＶ３．１二重ノックアウトマウスまたはα１−／−；Ｅｍｘ１−Ｃｒｅマウスは、α１ノックアウトマウスと比較して、肉眼で確認することができる程度に強くて明確な本態性振戦症兆候を示すので、本態性振戦症に対する治療剤開発に有用に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】３０週齢のα１＋／＋／ＣａＶ３．１＋／＋及びα１−／−／ＣａＶ３．１−／−において、加速度センサー測定法で振戦の程度を測定した結果を示した図である。
【図２】３０週齢のα１＋／＋／ＣａＶ３．１＋／＋、α１−／−／ＣａＶ３．１＋／＋及びα１−／−／ＣａＶ３．１−／−において、加速度センサー測定法で振戦の程度を測定した結果を示した図である。
【図３】３０週齢のα１＋／＋／ＣａＶ３．１＋／＋、α１−／−／ＣａＶ３．１＋／＋及びα１−／−／ＣａＶ３．１−／−において、加速度センサー測定法で振戦の強さを測定した結果を示したグラフである。
【図４】２０週齢のα１＋／＋／Ｅｍｘｌ−Ｃｒｅ、α１＋／−／Ｅｍｘｌ−Ｃｒｅ及びα１−／−／Ｅｍｘｌ−Ｃｒｅにおいて、加速度センサー測定法で 振戦の強さを測定した結果を示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
以下、本発明を詳しく説明する。
【００２５】
本発明は、ＧＡＢＡＡ受容体α１サブユニット（ＧＡＢＡＡ ｒｅｃｅｐｔｏｒ α１ ｓｕｂｕｎｉｔ，α１）及びＴ−類型Ｃａ２＋チャンネル（Ｔ−ｔｙｐｅ Ｃａ２＋ ｃｈａｎｎｅｌ，ＣａＶ３．１）がノックアウトされた、本態性振戦症が誘発された二重ノックアウトマウス（α１−／−／ＣａＶ３．１−／−）を提供する。
【００２６】
本発明の具体的な実施例で、ＧＡＢＡＡ受容体α１サブユニットノックアウトマウス（α１−／−）とＣａＶ３．１チャンネルノックアウトマウス（ＣａＶ３．１−／−）を交配して二つの遺伝子を異形接合体の形態で有するマウス（α１＋／−／ＣａＶ３．１＋／−）を得て、これらの間の交配で、ＧＡＢＡＡ受容体α１サブユニット（α１−／−）とＣａＶ３．１チャンネル（ＣａＶ３．１−／−）が二重ノックアウトされたマウス（α１−／−／ＣａＶ３．１−／−）を得た。
【００２７】
前記二重ノックアウトマウスの振戦の震動の強さは、ＧＡＢＡＡ受容体α１サブユニットノックアウトマウスより３〜１２倍以上、好ましくは、５〜１０倍以上強い。
【００２８】
また、前記振戦の震動強さは、加速度センサーを用いて測定することができる。
【００２９】
また、本発明は、前記二重ノックアウトマウスに由来した、本態性振戦症が誘発された二重ノックアウトマウスの受精卵を提供する。
【００３０】
また、本発明は、
１）ＧＡＢＡＡ受容体α１サブユニットノックアウトマウス（α１−／−）をＴ−類型Ｃａ２＋チャンネルノックアウトマウス（ＣａＶ３．１−／−）と交配する工程と、
２）前記工程１）の子孫の中から前記二つの遺伝子を異形接合体状態で有しているマウス（α１＋／−／ＣａＶ３．１＋／−）を選別する工程と、
３）前記選別されたα１＋／−／ＣａＶ３．１＋／−の成体マウス同士を交配する工程、及 び
４）前記工程３）の子孫の中から前記工程１）の二つの遺伝子が両方欠乏した二重ノックアウトマウス（α１−／−／ＣａＶ３．１−／−）を選別する工程とを含む、本態性振戦症が誘発された二重ノックアウトマウスの製造方法を提供する。
【００３１】
本発明の具体的な実施例で、ＧＡＢＡＡ受容体α１サブユニットノックアウトマウス（α１−／−）とＣａＶ３．１チャンネルノックアウトマウス（ＣａＶ３．１−／−）を交配して、二つの遺伝子を異形接合体の形態で有するマウス（α１＋／−／ＣａＶ３．１＋／−）を得て、これらの間の交配によってＧＡＢＡＡ受容体α１サブユニット（α１−／−）とＣａＶ３．１チャンネル（ＣａＶ３．１−／−）が両方ノックアウトされた二重ノックアウトマウスを得た。
【００３２】
また、本発明の具体的な実施例では、α１−／−／ＣａＶ３．１＋／＋及びα１−／−／ＣａＶ３．１−／−マウスの本態性振戦症を比較することによって、α１−／−／ＣａＶ３．１＋／＋マウスにおいてＣａＶ３．１チャンネル遺伝子のノックアウトが及ぼす影響を確認した。加速度センサーを用いた分析の結果、α１−／−／ＣａＶ３．１−／−マウスとα１−／−／ＣａＶ３．１＋／＋マウスで２０〜２５Ｈｚの振戦症が測定されたが（図２参照）、α１−／−／ＣａＶ３．１−／−マウスにおいて震動の強さが５〜１０倍さらに強く測定され（図３参照）、ビデオ判読の結果によると、α１−／−／ＣａＶ３．１＋／＋マウスでは、特異的な振戦症関連震えが弱く観察された。したがって、ＣａＶ３．１チャンネル遺伝子のノックアウト導入によって、既存のＧＡＢＡＡ受容体α１サブユニットノックアウトによる本態性振戦症がさらに強化された。
【００３３】
前記工程に、追加で本態性振戦症誘発の有無を判定する工程を含むことができる。
【００３４】
前記判定方法は、ビデオ分析において動いたり姿勢を維持している時、正常マウスと比較して姿勢が不安定であるとかひどく震える症状が示されたことを確認する方法または加速度センサーで測定した結果、振動数及び／または震動の強さの増加有無を確認する方法で遂行することができる。本発明のα１−／−／ＣａＶ３．１−／−マウスは、ひどい振戦症の症状を示すが、この症状はマウスがじっとしている時は（ｒｅｓｔｉｎｇ）示されないで、主に動く時のみ（ｐｏｓｔｕｒａｌ／ｋｉｎｅｔｉｃ）に現れる本態性振戦症の特性を有している。
【００３５】
同時に、本発明は、
１）前記本態性振戦症が誘発された二重ノックアウトマウス（α１−／−／ＣａＶ３．１−／−）に被検化合物を投与する工程と、
２）前記処理されたマウス（実験群）が動いたり姿勢を維持している時に、振動数または震動の強さを測定する工程と、
３）被検化合物を未処理したマウス（対照群）と比較して振動数または震動の強さを減少させた被検化合物を選別する工程とを含む、本態性振戦症治療剤のスクリーニング方法を提供する。
【００３６】
本発明のマウス（α１−／−／ＣａＶ３．１−／−）は、従来のα１−／−／ＣａＶ３．１＋／＋マウスよりさらに強い本態性振戦症の兆候を示すので（図２参照）、本態性振戦症治療剤開発のためのマウスモデルとして使用することができる。
【００３７】
前記工程１）の被検化合物は、天然化合物、合成化合物、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ポリペプチド、酵素、タンパク質、リガンド、抗体、抗原、バクテリアまたは真菌の代謝産物及び生活性分子からなる群から選択されるいずれか一つであることができる。
【００３８】
また、前記工程１）の投与方法は、経口投与または非経口投与を通じて遂行することができ、前記非経口投与時、皮内注射、皮下注射、静脈注射、腹腔注射、筋肉注射からなる群から選択されるいずれか一つの注射投与、直腸投与、局所塗付、パッチテスト、及びイオントフォレーシス（Ｉｏｎｔｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）からなる群から選択されるいずれか一つの方法で遂行することができる。
【００３９】
ＧＡＢＡＡ受容体α１−／−マウスは、振戦症の強さが弱く、年齢が充分に高くなければ（＞８ヶ月）目で観察可能な程度にならないという短所があるので、振戦症研究及び薬物スクリーニングなどに使用するのに不便さがあった。本発明で製造されたα１−／−／ＣａＶ３．１−／−マウスは、幼い年齢から克明な振戦症を示してその強さも強いので、このような短所を克服できる重要なモデルになることができる。
【００４０】
また、本発明は、大脳皮質でのみ特異的にＧＡＢＡＡ受容体α１サブユニット（ＧＡＢＡＡ ｒｅｃｅｐｔｏｒ α１ ｓｕｂｕｎｉｔ，α１）遺伝子がノックアウトされた、本態性振戦症が誘発されたマウス（α１−／−；Ｅｍｘ１−Ｃｒｅマウス）を提供する。
【００４１】
また、本発明は、α１−／−；Ｅｍｘ１−Ｃｒｅマウスに由来した、本態性振戦症が誘発された受精卵を提供する。
【００４２】
本発明者等は、ＧＡＢＡＡ受容体α１サブユニット（ｓｕｂｕｎｉｔ）遺伝子の大脳皮質特異的除去を通じて本態性振戦症が強化されたモデルを製造した。具体的に、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ組換え技術を用いてマウス脳の特定地域（Ｄｏｒｓａｌ ｔｅｌｅｎｃｅｐｈａｌｏｎ）でのみＧＡＢＡＡ受容体α１サブユニットをノックアウトさせたマウス（α１−／−；Ｅｍｘ１−Ｃｒｅ）を製造した。前記製造されたα１−／−；Ｅｍｘ１−Ｃｒｅマウスは、振戦症症状を示し、この症状は、マウスがじっとしている時は（ｒｅｓｔｉｎｇ）示されないで、主に動く時のみ（ｐｏｓｔｕｒａｌ／ｋｉｎｅｔｉｃ）に現われる本態性振戦症の特性を有していることを確認した。
【００４３】
本発明者等は、α１−／−；Ｅｍｘ１−Ｃｒｅマウスを加速度センサーで測定してみた結果、２５〜３０Ｈｚの振戦症の強さを示し、前記振戦症の強さは、ＧＡＢＡＡ受容体α１−／−マウスと比較して、類似かまたは１．５〜２倍程度強かった。発病は、約３週齢から発生し、ＧＡＢＡＡ受容体α１−／−マウスと比較して、発病時期がずっと早いことを確認した。
【００４４】
したがって、α１−／−；Ｅｍｘ１−Ｃｒｅマウスは、ＧＡＢＡＡ受容体α１−／−マウスと比較して、発病時期が早くて振戦症の強さがさらに強いので、振戦症研究及び薬物スクリーニングなどに容易に使用することができ、本態性振戦症の病因と関連して、今まで相対的に進展していない大脳皮質（ｃｏｒｔｅｘ）の役割を研究するにおいて重要なモデルとして使用ができることが分かる。
【００４５】
また、本発明は、
１）ＧＡＢＡＡ受容体α１サブユニットノックアウトマウス（α１Ｆ／Ｆ）をＥｍｘ１−Ｃｒｅマウスと交配する工程と、
２）前記工程１）の子孫の中で前記二つの遺伝子を異形接合体（ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｔｅ）状態で有しているマウス（α１Ｆ／＋；Ｅｍｘ１−Ｃｒｅ）を選別する工程と、
３）前記選別された成体α１Ｆ／＋；Ｅｍｘ１−Ｃｒｅマウス同士交配する工程、及び、
４）前記工程３）の子孫の中からα１−／−及びＥｍｘ１−Ｃｒｅ遺伝子を両方含むマウスを選別する工程とを含む、本態性振戦症が誘発されたα１−／−；Ｅｍｘ１−Ｃｒｅマウスの製造方法を提供する。
【００４６】
同時に、本発明は、
１）前記本態性振戦症が誘発されたα１−／−；Ｅｍｘ１−Ｃｒｅマウスに被検化合物を投与する工程と、
２）前記処理されたマウス（実験群）が動いたり姿勢を維持している時に、振動数または震動の強さを測定する工程、及び
３）被検化合物を未処理したマウス（対照群）と比較して振動数または震動の強さを減少させた被検化合物を選別する工程とを含む、本態性振戦症治療剤のスクリーニング方法を提供する。
【実施例】
【００４７】
以下、本発明を実施例によって詳しく説明する。
【００４８】
但し、下記の実施例は、本発明を例示するだけのものであって、本発明の内容が下記の実施例によって限定されるのではない。
【００４９】
実施例１．二重ノックアウトマウスの製造及び選別
＜１−１＞α１−／−マウス及びＣａＶ３．１−／−マウスの製造
本発明者等は、参考文献（Ｖｉｃｉｎｉ等，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ．２００１年，第２１巻，ｐ．３００９）に記載された方法で製造されたＧＡＢＡＡ受容体α１−／−マウスを、Ｇ．Ｈｏｍａｎｉｃｓ（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ａｎａｅｓｔｈｅｓｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ １５２６１，米国）から供給を受けた。
【００５０】
一方、本発明者等は、参考文献８（Ｋｉｍ，Ｄ．等，Ｎｅｕｒｏｎ，２００１年，第３１巻，ｐ．３５−４５）に記載された方法で製造されたＣａＶ３．１チャンネルノックアウトマウスを保有している。具体的に、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの脳組織から得たｍＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲしてマウスＣａＶ３．１ｃＤＮＡを得た後、これをプローブに使用して、１２９／ｓｖマウスのｃＤＮＡをｌａｍｄａＧＴ１１ベクターに挿入して製造したゲノムライブラリで、ＣａＶ３．１位置を含むＣａＶ３．１遺伝子（ｃａｃｎａ１Ｇ）ゲノム断片を選別した。選別されたゲノム断片に、二重選別マーカー（ｎｅｏ及びＴＫ）を挿入して、１１．７ｋｂの相同化断片を含む標的ベクター（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒ）を製造した。標的ベクターをＪ１胚芽幹細胞株（Ｄｒ．Ｒ Ｊｅａｎｉｓｃｈ，Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ ０２１４２，米国．ｊｅａｎｉｓｃｈ＠ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ）に形質導入させた。前記標的ベクターが導入されたＥＳクローンをサザンブロット分析を通じて選別して、生殖系列キメラの製造に使用した。オス生殖系列キメラを、Ｆ１異形接合体（ＣａＶ３．１＋／−）形質のメスのＣ５７ＢＬ／６Ｊと交配した後、その子孫同士交配して同型接合体（ＣａＶ３．１−／−）形質のマウスを製造した。前記同型接合体形質のマウスの遺伝子型は、ＰＣＲを通じて確認した。
【００５１】
＜１−２＞α１−／−／ＣａＶ３．１−／−二重ノックアウトマウスの製造及び選別
前記ＧＡＢＡＡ受容体α１サブユニットノックアウトマウス（α１−／−）とＣａＶ３．１チャンネルノックアウトマウス（ＣａＶ３．１−／−）を交配した後、生まれた子孫の尾から得たゲノムＤＮＡを鋳型にして、ゲノムＰＣＲを遂行した後、電気泳動で遺伝子型を確認した。α１遺伝子は、配列番号１（５’−ＴＣＴＧＣＡＴＧＴＧＧＧＡＣＡＡＡＧＡＣ−３’）及び配列番号２（５’−ＡＣＧＣＡＴＡＣＣＣＴＣＴＣＴＴＧＧＴＧ−３’）で表わされるプライマー対を用いたＰＣＲで正常対立遺伝子を確認し、配列番号１及び配列番号３（５’−ＴＧＡＴＴＧＣＴＴＴＴＣＴＧＡＧＡＴＡＧＧＧ−３’）で表わされるプライマー対を用いたＰＣＲでノックアウト対立遺伝子を確認した。前記ＰＣＲは、９５℃で５分間変性させて、９５℃で３０秒、６２℃で３０秒、７２℃で４０秒の条件で２９サイクルを繰り返した後、７２℃で３分間延長させた後、４℃で冷却する手順で遂行した。また、ＣａＶ３．１遺伝子は、配列番号４（５−ＡＴＡＣＧＴＧＧＴＴＣＧＡＧＣＧＡＧＴＣ−３）及び配列番号５（５−ＣＧＡＡＧＧＣＣＴＧＡＣＧＴＡＧＡＡＡＧ−３）で表わされるプライマー対を用いたＰＣＲで正常対立遺伝子を確認し、配列番号４及び配列番号６（５−ＣＴＧＡＣＴＡＧＧＧＧＡＧＧＡＧＴＡＧＡＡＧ−３）で表わされるプライマー対を用いたＰＣＲでノックアウト対立遺伝子を確認した。前記ＰＣＲは、９４℃で５分間変性させて、９４℃で３０秒、５８℃で３０秒、７２℃で３０秒の条件で４０サイクル繰り返した後、７２℃で５分間延長させた後、４℃で冷却する手順で遂行した。前記確認の結果、α１遺伝子及びＣａＶ３．１遺伝子それぞれに対して、正常対立遺伝子及びノックアウト対立遺伝子をすべて有している子孫を異型接合体として選別した。前記選別された異型接合体同士交配した後、生まれた子孫の尾から得たゲノムＤＮＡを鋳型に、前記と同じ方法でゲノムＤＮＡ ＰＣＲを遂行し、α１遺伝子及びＣａＶ３．１遺伝子それぞれでノックアウト対立遺伝子のみを有している子孫を同型接合体として選別した。
【００５２】
このようにして、ＧＡＢＡＡ受容体α１サブユニット（α１−／−）とＣａＶ３．１チャンネル（ＣａＶ３．１−／−）が両方ノックアウトされた二重ノックアウトマウスを得た。
【００５３】
実施例２．α１−／−／ＣａＶ３．１−／−マウスでの振戦症測定
α１−／−／ＣａＶ３．１−／−マウスで示される振戦症を定量定性的に分析するために、加速度センサー（ａｃｃｅｌｅｒｏｍｅｔｅｒ）測定法とビデオ録画方法を使用した。実験群として、３０週齢になったα１−／−／ＣａＶ３．１−／−マウス２匹、対照群として３０週齢になった正常マウス（α１＋／＋／ＣａＶ３．１＋／＋）２匹を用いた。
【００５４】
底に加速計を付着した不透明な円筒（直径１０ｃｍ×高さ１５ｃｍ）を空中にぶら下げて測定プラットホームとして使用した。前記円筒にマウスを入れて動くようにしながら前記動きを加速度センサーを通じて電子信号で認識した。前記電子信号を増幅して記録することでマウスの振戦症有無、程度及び振動数などを定量的に判断した。また、前記プラットホーム上側にビデオカメラを設置してマウスがどのような状態（姿勢、動きなど）で振戦症を見せるのか定性的に確認した。マウスを測定プラットホームの中に入れた後、１０分間ビデオ録画と加速度センサーによる記録を行なった。
【００５５】
ビデオ分析の結果、α１−／−／ＣａＶ３．１−／−マウスはプラットホーム内での姿勢が不安定だったり（ｐｏｓｔｕｒａｌ）動く時（ｋｉｎｅｔｉｃ）にひどく震える振戦症の症状を示した。一方、同じ場所にじっと静止している時（ｒｅｓｔｉｎｇ）には、振戦症が弱いか、ほとんど示されなかった。このことから、α１−／−／ＣａＶ３．１−／−マウスで示される振戦症の特性が、本態性振戦症の特性と定性的に一致することを確認した。一方、正常マウスでは、いかなる振戦症関連の症状も現れなかった。
【００５６】
加速度センサーを用いた分析の結果、図１で示されたように正常マウスでは、動きによる５Ｈｚ未満の振動数のみ測定された。一方、α１−／−／ＣａＶ３．１−／−マウスでは、それとともに２０〜２５Ｈｚの震動数帯が測定されたが、ビデオ判読データと比較分析した結果、マウスが振戦症の症状を見せた時間の区間内でのみ、特徴的に測定されることが分かった。これを通じて、α１−／−／ＣａＶ３．１−／−マウスは、２０〜２５Ｈｚの本態性振戦症を有することを確認した。
【００５７】
実施例３．α１−／−マウスのＣａＶ３．１ノックアウトの影響分析
ＧＡＢＡＡ受容体α１−／−マウスで示される本態性振戦症にＣａＶ３．１チャンネルが及ぼす影響を確認するため、ＧＡＢＡＡ受容体α１−／−マウス（α１−／−／ＣａＶ３．１＋／＋）及びα１−／−／ＣａＶ３．１−／−マウスで示される振戦症を測定して比較した。
【００５８】
ＧＡＢＡＡ受容体α１−／−マウスで示される振戦症は、マウスの年令と比例関係にあり、特に３０週齢以上になったマウスで強く示されることが知られている。したがって、すべての実験は、３０週齢のマウスを用いて行なった。
【００５９】
対照群には、３０週齢になった正常マウス（α１＋／＋／ＣａＶ３．１＋／＋）３匹、実験群１には、ＧＡＢＡＡ受容体α１サブユニットノックアウトマウス（α１−／−／ＣａＶ３．１＋／＋）４匹、実験群２には、二重ノックアウトマウス（α１−／−／ＣａＶ３．１−／−）３匹を対象にビデオ録画、振戦周波数測定及び振戦の強さ測定を実施した。
【００６０】
ビデオ判読結果によると、α１−／−／ＣａＶ３．１−／−マウスを除いた残り二つの群のマウスでは、特異的な振戦症関連の震えが観察されなかった。
【００６１】
加速度センサーを用いた分析の結果、図２及び図３に示されたように、α１−／−／ＣａＶ３．１−／−マウスとα１−／−／ＣａＶ３．１＋／＋マウスでのみ２０〜２５Ｈｚの振戦症が測定されたが、α１−／−／ＣａＶ３．１−／−マウスで、震動の強さが５〜１０倍さらに強く測定された。
【００６２】
実施例４．ＧＡＢＡＡ受容体α１サブユニット遺伝子の大脳皮質特異的除去を通じて本態性振戦症が強化されたマウスの製造
＜４−１＞α１−／−；Ｅｍｘ１−Ｃｒｅマウスの製造
本発明者等は、参考文献（Ｖｉｃｉｎｉ等，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ．２００１年５月，第２１巻，ｐ．３００９ ）に記載された方法で製造されたＧＡＢＡＡ受容体α１Ｆ／ＦマウスをＧ．Ｈｏｍａｎｉｃｓから供給受けた。
【００６３】
一方、本発明者等は、参考文献（Ｔａｋｕｊｉ等，Ｇｅｎｅｓｉｓ．２００４年，第３８巻，ｐ．１３０ ）に記載された方法で製造されたＥｍｘ１−ＣｒｅマウスをＩｔｏｈａｒａ Ｓｈｉｇｅｙｏｓｈｉから供給受けた。
【００６４】
本発明者等は、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ組換え技術を用いてマウス大脳皮質（Ｄｏｒｓａｌ ｔｅｌｅｎｃｅｐｈａｌｏｎ）でのみＧＡＢＡＡ受容体α１サブユニット（ｓｕｂｕｎｉｔ）をノックアウトさせたマウス（α１−／−；Ｅｍｘ１−Ｃｒｅ）を製造した。詳細には、前記ＧＡＢＡＡ受容体α１Ｆ／ＦマウスをＥｍｘ１−Ｃｒｅマウスと交配して、α１Ｆ／＋；Ｅｍｘ１−Ｃｒｅマウスを得た。さらに、これら同士交配して、α１−／−；Ｅｍｘ１−Ｃｒｅマウスを製造した。
【００６５】
＜４−２＞α１−／−；Ｅｍｘ１−Ｃｒｅマウスの製造及び選別
ＧＡＢＡＡ受容体α１サブユニットＦｌｏｘｅｄマウス（α１Ｆ／Ｆ）とＥｍｘ１−Ｃｒｅトランスジェニックマウスを交配した後、生まれた子孫の尾から得たゲノムＤＮＡを鋳型にして、ゲノムＰＣＲを遂行した後、電気泳動で遺伝子型を確認した。α１遺伝子は、配列番号１（５’−ＴＣＴＧＣＡＴＧＴＧＧＧＡＣＡＡＡＧＡＣ−３’）及び配列番号２（５’−ＡＣＧＣＡＴＡＣＣＣＴＣＴＣＴＴＧＧＴＧ−３’）で表わされるプライマー対を用いたＰＣＲで異型接合体遺伝子（α１Ｆ／＋）を確認した。前記ＰＣＲは、９５℃で５分間変性させて、９５℃で３０秒、６２℃で３０秒、７２℃で４０秒の条件で２９サイクル繰り返した後、７２℃で３分間延長させた後、４℃で冷却する手順で遂行した。また、Ｅｍｘ１−Ｃｒｅ遺伝子は、配列番号７（５’−ＡＣＣＴＧＡＴＧＧＡＣＡＴＧＴＴＣＡＧＧＧＡＴＣＧ−３’）及び配列番号８（５’−ＴＣＣＧＧＴＴＡＴＴＣＡＡＣＴＴＧＣＡＣＣＡＴＧＣ−３’）で表わされるプライマー対を用いたＰＣＲでトランスジェニック遺伝子を確認した。前記ＰＣＲは、９４℃で３分間変性させて、９４℃で３０秒、６０℃で３０秒、７２℃で６０秒の条件で３５サイクル繰り返した後、７２℃で５分延長させた後、４℃で冷却する手順で遂行した。前記確認の結果、α１遺伝子に対してＦｌｏｘｅｄ対立遺伝子及び正常対立遺伝子を両方有していて、同時にＥｍｘ１−Ｃｒｅトランスジェニック遺伝子も有している子孫（α１Ｆ／＋；Ｅｍｘ１−Ｃｒｅ）を選別した。前記選別されたマウス同士交配した後、生まれた子孫の尾から得たゲノムＤＮＡを鋳型に、前記と同一方法でゲノムＤＮＡ ＰＣＲを遂行した。α１遺伝子の場合、配列番号１及び配列番号３（５’−ＴＧＡＴＴＧＣＴＴＴＴＣＴＧＡＧＡＴＡＧＧＧ−３’）で表わされるプライマー対を用いたＰＣＲも遂行してノックアウト対立遺伝子を確認した。これを通じて、α１ノックアウト対立遺伝子とＥｍｘ１−Ｃｒｅ遺伝子を有している子孫（α１−／−；Ｅｍｘ１−Ｃｒｅ）を選別した。
【００６６】
このようにして、ＧＡＢＡＡ受容体α１サブユニット（α１−／−）が大脳皮質でのみノックアウトされたマウス（α１−／−；Ｅｍｘ１−Ｃｒｅ）を得た。
【００６７】
実施例５．α１−／−；Ｅｍｘ１−Ｃｒｅマウスでの振戦症測定
前記α１−／−；Ｅｍｘ１−Ｃｒｅマウスで示される振戦症を定量定性的に分析するため、前記実施例２と同一方法で加速度センサー測定法とビデオ録画方法を使用した。実験群として、２０週齢になったα１−／−；Ｅｍｘ１−Ｃｒｅマウス２匹、対照群として同腹仔（ｌｉｔｔｅｒｍａｔｅ）の２０週齢になった他のマウス（α１＋／＋；Ｅｍｘ１−Ｃｒｅまたはα１＋／−；Ｅｍｘ１−Ｃｒｅ）５匹を用いて振戦症測定をした。
【００６８】
ビデオ分析の結果、α１−／−；Ｅｍｘ１−Ｃｒｅマウスは、プラットホーム内での姿勢が不安定だったり（ｐｏｓｔｕｒａｌ）動く時（ｋｉｎｅｔｉｃ）震える振戦症の症状がみられた。一方、同じ場所にじっと静止している時（ｒｅｓｔｉｎｇ）には、振戦症が弱いか、ほとんど示されなかった。このことから、α１−／−；Ｅｍｘ１−Ｃｒｅマウスで示される振戦症の特性が、本態性振戦症の特性と定性的に一致することを確認した。一方、他のマウスでは、いかなる振戦症に関連する症状も現われなかった。
【００６９】
加速度センサーを用いた分析の結果、α１−／−；Ｅｍｘ１−Ｃｒｅマウスでのみ２５〜３０Ｈｚの震動数帯が測定されたが、ビデオ判読データと比較分析した結果、マウスが振戦症症状を示した時間の区間内でのみ特徴的に測定されることが分かった。このことから、α１−／−；Ｅｍｘ１−Ｃｒｅマウスは、２５〜３０Ｈｚの振戦症を遺伝的に有することを確認した。α１−／−；Ｅｍｘ１−Ｃｒｅマウスの振戦症の強さは、ＧＡＢＡＡ受容体α１−／−マウスと比較して類似かまたは１．５〜２倍程度強かった。また、発病時期は、ＧＡＢＡＡ受容体α１−／−マウスと比較してずっと早かった（約３週齢から）。
【産業上の利用可能性】
【００７０】
本発明のα１／ＣａＶ３．１二重ノックアウトマウスまたはα１−／−；Ｅｍｘ１−Ｃｒｅマウス及びこれらを用いた用途発明は、本態性振戦症に対する治療剤開発に有用に使用することができる。
【配列表フリーテキスト】
【００７１】
配列番号１：ＧＡＢ２ ａ１フォワードプライマー
配列番号２：ＧＡＢ２ ａ１リバースプライマー
配列番号３：ＧＡＢ２ ａ１リバースプライマー２
配列番号４：Ｆ１ ａ１Ｇフォワードプライマー
配列番号５：Ｆ１ ａ１Ｇリバースプライマー
配列番号６：ＰＧＫ２２ ａ１Ｇリバースプライマー
配列番号７：Ｅｍｘ１‐Ｃｒｅフォワードプライマー
配列番号８：Ｅｍｘ１‐Ｃｒｅリバースプライマー
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＧＡＢＡＡ受容体α１サブユニット（ＧＡＢＡＡ ｒｅｃｅｐｔｏｒ α１ ｓｕｂｕｎｉｔ，α１）及びＴ−類型Ｃａ２＋チャンネル（Ｔ−ｔｙｐｅ Ｃａ２＋ ｃｈａｎｎｅｌ，ＣａＶ３．１）がノックアウトされた、本態性振戦症（ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｔｒｅｍｏｒ）が誘発された二重ノックアウトマウス。
【請求項２】
前記振戦症の震動の強さが、ＧＡＢＡＡ受容体α１サブユニットノックアウトマウスより３〜１２倍以上強いことを特徴とする請求項１に記載のマウス。
【請求項３】
前記振戦症の震動の強さが、ＧＡＢＡＡ受容体α１サブユニットノックアウトマウスより５〜１０倍以上強いことを特徴とする請求項２に記載のマウス。
【請求項４】
請求項１の二重ノックアウトマウスに由来した、本態性振戦症が誘発された二重ノックアウトマウスの受精卵。
【請求項５】
１）ＧＡＢＡＡ受容体α１サブユニットノックアウトマウス（α１−／−）をＴ−類型Ｃａ２＋チャンネルノックアウトマウス（ＣａＶ３．１−／−）と交配する工程と、
２）前記工程１）の子孫の中で前記二つの遺伝子を異形接合体（ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｔｅ）状態で有しているマウス（α１＋／−／ＣａＶ３．１＋／−）を選別する工程と、
３）前記選別された成体α１＋／−／ＣａＶ３．１＋／−マウス同士交配する工程、及び
４）前記工程３）の子孫の中で前記工程１）の二つの遺伝子が両方欠乏した二重ノックアウトマウス（α１−／−／ＣａＶ３．１−／−）を選別する工程とを含む本態性振戦症が誘発された二重ノックアウトマウスの製造方法。
【請求項６】
追加で本態性振戦症誘発の有無を判定する工程を含む請求項５に記載の製造方法。
【請求項７】
前記判定が、ビデオ分析によって、動いたり姿勢を維持したりしている時に、正常マウスと比較して姿勢が不安定だったり（ｐｏｓｔｕｒａｌ）ひどく震える症状が示されたことを確認する方法で遂行されることを特徴とする請求項６に記載の製造方法。
【請求項８】
前記判定が、加速度センサーで測定した結果、振動数及び／または震動の強さの増加有無を確認する方法で遂行されることを特徴とする請求項６に記載の製造方法。
【請求項９】
１）請求項１の本態性振戦症が誘発された二重ノックアウトマウス（α１−／−／ＣａＶ３．１−／−）に被検化合物を投与する工程と、
２）前記処理されたマウス（実験群）が動いたり姿勢を維持している時に、振動数または震動の強さを測定する工程、及び
３）被検化合物を未処理したマウス（対照群）と比較して振動数または震動の強さを減少させた被検化合物を選別する工程とを含む本態性振戦症治療剤のスクリーニング方法。
【請求項１０】
前記工程１）の被検化合物が、天然化合物、合成化合物、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ポリペプチド、酵素、タンパク質、リガンド、抗体、抗原、バクテリアまたは真菌の代謝産物及び生活性分子からなる群から選択されるいずれかひとつであることを特徴とする請求項９に記載のスクリーニング方法。
【請求項１１】
大脳皮質でのみ特異的にＧＡＢＡＡ受容体α１サブユニット（ＧＡＢＡＡ ｒｅｃｅｐｔｏｒ α１ ｓｕｂｕｎｉｔ，α１）遺伝子がノックアウトされた、本態性振戦症が誘発されたマウス（α１−／−；Ｅｍｘ１−Ｃｒｅマウス）。
【請求項１２】
前記振戦症の震動の強さがＧＡＢＡＡ受容体α１サブユニットノックアウトマウスより１〜２倍以上強いことを特徴とする請求項１１に記載のマウス。
【請求項１３】
請求項１１のα１−／−；Ｅｍｘ１−Ｃｒｅマウスに由来した、本態性振戦症が誘発された受精卵。
【請求項１４】
１）ＧＡＢＡＡ受容体α１サブユニットノックアウトマウス（α１Ｆ／Ｆ）をＥｍｘ１−Ｃｒｅマウスと交配する工程と、
２）前記工程１）の子孫の中で前記二つの遺伝子を異形接合体（ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｔｅ）状態で有しているマウス（α１Ｆ／＋；Ｅｍｘ１−Ｃｒｅ）を選別する工程と、
３）前記選別された成体α１Ｆ／＋；Ｅｍｘ１−Ｃｒｅマウス同士交配する工程、及び、
４）前記工程３）の子孫の中からα１−／−及びＥｍｘ１−Ｃｒｅ遺伝子を両方含むマウスを選別する工程とを含む、本態性振戦症が誘発されたα１−／−；Ｅｍｘ１−Ｃｒｅマウスの製造方法。
【請求項１５】
１）請求項１１の前記本態性振戦症が誘発されたα１−／−；Ｅｍｘ１−Ｃｒｅマウスに被検化合物を投与する工程と、
２）前記処理されたマウス（実験群）が動いたり姿勢を維持している時に、振動数または震動の強さを測定する工程、及び
３）被検化合物を未処理したマウス（対照群）と比較して振動数または震動の強さを減少させた被検化合物を選別する工程とを含む、本態性振戦症治療剤のスクリーニング方法。
【請求項１】
ＧＡＢＡＡ受容体α１サブユニット（ＧＡＢＡＡ ｒｅｃｅｐｔｏｒ α１ ｓｕｂｕｎｉｔ，α１）及びＴ−類型Ｃａ２＋チャンネル（Ｔ−ｔｙｐｅ Ｃａ２＋ ｃｈａｎｎｅｌ，ＣａＶ３．１）がノックアウトされた、本態性振戦症（ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｔｒｅｍｏｒ）が誘発された二重ノックアウトマウス。
【請求項２】
前記振戦症の震動の強さが、ＧＡＢＡＡ受容体α１サブユニットノックアウトマウスより３〜１２倍以上強いことを特徴とする請求項１に記載のマウス。
【請求項３】
前記振戦症の震動の強さが、ＧＡＢＡＡ受容体α１サブユニットノックアウトマウスより５〜１０倍以上強いことを特徴とする請求項２に記載のマウス。
【請求項４】
請求項１の二重ノックアウトマウスに由来した、本態性振戦症が誘発された二重ノックアウトマウスの受精卵。
【請求項５】
１）ＧＡＢＡＡ受容体α１サブユニットノックアウトマウス（α１−／−）をＴ−類型Ｃａ２＋チャンネルノックアウトマウス（ＣａＶ３．１−／−）と交配する工程と、
２）前記工程１）の子孫の中で前記二つの遺伝子を異形接合体（ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｔｅ）状態で有しているマウス（α１＋／−／ＣａＶ３．１＋／−）を選別する工程と、
３）前記選別された成体α１＋／−／ＣａＶ３．１＋／−マウス同士交配する工程、及び
４）前記工程３）の子孫の中で前記工程１）の二つの遺伝子が両方欠乏した二重ノックアウトマウス（α１−／−／ＣａＶ３．１−／−）を選別する工程とを含む本態性振戦症が誘発された二重ノックアウトマウスの製造方法。
【請求項６】
追加で本態性振戦症誘発の有無を判定する工程を含む請求項５に記載の製造方法。
【請求項７】
前記判定が、ビデオ分析によって、動いたり姿勢を維持したりしている時に、正常マウスと比較して姿勢が不安定だったり（ｐｏｓｔｕｒａｌ）ひどく震える症状が示されたことを確認する方法で遂行されることを特徴とする請求項６に記載の製造方法。
【請求項８】
前記判定が、加速度センサーで測定した結果、振動数及び／または震動の強さの増加有無を確認する方法で遂行されることを特徴とする請求項６に記載の製造方法。
【請求項９】
１）請求項１の本態性振戦症が誘発された二重ノックアウトマウス（α１−／−／ＣａＶ３．１−／−）に被検化合物を投与する工程と、
２）前記処理されたマウス（実験群）が動いたり姿勢を維持している時に、振動数または震動の強さを測定する工程、及び
３）被検化合物を未処理したマウス（対照群）と比較して振動数または震動の強さを減少させた被検化合物を選別する工程とを含む本態性振戦症治療剤のスクリーニング方法。
【請求項１０】
前記工程１）の被検化合物が、天然化合物、合成化合物、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ポリペプチド、酵素、タンパク質、リガンド、抗体、抗原、バクテリアまたは真菌の代謝産物及び生活性分子からなる群から選択されるいずれかひとつであることを特徴とする請求項９に記載のスクリーニング方法。
【請求項１１】
大脳皮質でのみ特異的にＧＡＢＡＡ受容体α１サブユニット（ＧＡＢＡＡ ｒｅｃｅｐｔｏｒ α１ ｓｕｂｕｎｉｔ，α１）遺伝子がノックアウトされた、本態性振戦症が誘発されたマウス（α１−／−；Ｅｍｘ１−Ｃｒｅマウス）。
【請求項１２】
前記振戦症の震動の強さがＧＡＢＡＡ受容体α１サブユニットノックアウトマウスより１〜２倍以上強いことを特徴とする請求項１１に記載のマウス。
【請求項１３】
請求項１１のα１−／−；Ｅｍｘ１−Ｃｒｅマウスに由来した、本態性振戦症が誘発された受精卵。
【請求項１４】
１）ＧＡＢＡＡ受容体α１サブユニットノックアウトマウス（α１Ｆ／Ｆ）をＥｍｘ１−Ｃｒｅマウスと交配する工程と、
２）前記工程１）の子孫の中で前記二つの遺伝子を異形接合体（ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｔｅ）状態で有しているマウス（α１Ｆ／＋；Ｅｍｘ１−Ｃｒｅ）を選別する工程と、
３）前記選別された成体α１Ｆ／＋；Ｅｍｘ１−Ｃｒｅマウス同士交配する工程、及び、
４）前記工程３）の子孫の中からα１−／−及びＥｍｘ１−Ｃｒｅ遺伝子を両方含むマウスを選別する工程とを含む、本態性振戦症が誘発されたα１−／−；Ｅｍｘ１−Ｃｒｅマウスの製造方法。
【請求項１５】
１）請求項１１の前記本態性振戦症が誘発されたα１−／−；Ｅｍｘ１−Ｃｒｅマウスに被検化合物を投与する工程と、
２）前記処理されたマウス（実験群）が動いたり姿勢を維持している時に、振動数または震動の強さを測定する工程、及び
３）被検化合物を未処理したマウス（対照群）と比較して振動数または震動の強さを減少させた被検化合物を選別する工程とを含む、本態性振戦症治療剤のスクリーニング方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２０１０−２４６５３６（Ｐ２０１０−２４６５３６Ａ）
【公開日】平成２２年１１月４日（２０１０．１１．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−８６６２８（Ｐ２０１０−８６６２８）
【出願日】平成２２年４月５日（２０１０．４．５）
【出願人】（５０８０４７６６８）コリア アドバンスド インスティチュート オブ サイエンス アンド テクノロジー (9)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１１月４日（２０１０．１１．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年４月５日（２０１０．４．５）
【出願人】（５０８０４７６６８）コリア アドバンスド インスティチュート オブ サイエンス アンド テクノロジー (9)
【Ｆターム（参考）】
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