栄養源
【課題】ウレアーゼ活性が高くなり、ウレアーゼを生産する微生物に対して効果的な栄養源を提供する。
【解決手段】スクロース、グルコース、マルトース、セロビオース、でんぷん、ガラクトース、フルクトース、ラクトース、ソルビトール、マンニトール、糖蜜、酢酸塩、プロピオン酸塩、酪酸塩、乳酸塩、エタノール、プロパノール、ブタノール、カゼイン、乳清粉末、酵母、酵母エキス、ペプトン、トリプトン、トリプトファン、肉エキス、牛肉エキスのいずれか一つ以上を含む。
【解決手段】スクロース、グルコース、マルトース、セロビオース、でんぷん、ガラクトース、フルクトース、ラクトース、ソルビトール、マンニトール、糖蜜、酢酸塩、プロピオン酸塩、酪酸塩、乳酸塩、エタノール、プロパノール、ブタノール、カゼイン、乳清粉末、酵母、酵母エキス、ペプトン、トリプトン、トリプトファン、肉エキス、牛肉エキスのいずれか一つ以上を含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウレアーゼを産生する微生物のための安価な栄養源に関し、特にはウレアーゼ活性を高め、カルサイトの生成に効果的な微生物のための栄養源に関する。
【背景技術】
【０００２】
特許文献１には土圧密方法に関し、石灰化細菌と脱窒細菌との組み合わせが使用され、ａ）石灰化細菌の１つ以上の溶液を土に導入する工程；ｂ）土中で前記溶液を循環させる工程；ｃ）石灰化細菌のための１つ以上の栄養溶液を土に導入し、次いで土中で前記溶液を循環させる工程；並びにｄ）脱窒細菌の１つ以上の溶液を土に導入し、次いで土中で前記溶液を循環させる工程；を含む土圧密方法が開示された。
【０００３】
ところで、尿素は、肥料や窒素サイクルにおける微生物の代謝における中間生成物として重要であり、この尿素をアンモニアや二酸化炭素に加水分解する際の触媒となる酵素であるウレアーゼは、多くの土着微生物、地下細菌によって生産される。
【０００４】
ウレアーゼを合成する微生物、糸状菌類あるいは放線菌類などは、成長や増殖のための窒素源として尿素を利用する。こうしたウレアーゼを合成する微生物として、非特許文献２にはＢａｃｉｌｌｕｓ， Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ， Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ， Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ， Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ， Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ が報告されている。これらの微生物において確認されたウレアーゼは、細胞体外で観察されている。
【０００５】
これらのウレアーゼ生産微生物は、例えば、土壌など媒体の表面、あるいは透過性媒体を改質するために利用される。この改質プロセスによって、処理媒体の透過性、多孔性を低くし流体の移動性を低減することが可能であり、石油工業において油が漏出した現場において油を回収したり、油汚染の拡大を抑制するためのミネラルによる閉塞を行う方法として知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表２００８−５０８４５０号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献２】（ａｒｔｉｎ Ａｌｅｘａｎｄｅｒ， Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｓｏｉｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｋｒｉｅｇｅｒ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｆｌｏｒｉｄａ， １９７７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ウレアーゼ生産微生物を利用した各種の処理効率を向上するためにウレアーゼ活性を高くする必要がある。
本発明の目的は、ウレアーゼ活性が高くなり、ウレアーゼを生産する微生物に対して効果的な栄養源を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
ウレアーゼ活性は、栄養源の種類と配合により決定づけられる。本発明においては、ウレアーゼ活性が高くなるような物質の組み合わせを見出し、さらにウレアーゼを生産する微生物に対して効果的な配合比を決定した。
【００１０】
本発明のウレアーゼ生産微生物のための栄養源は、スクロース、グルコース、マルトース、セロビオース、でんぷん、ガラクトース、フルクトース、ラクトース、ソルビトール、マンニトール、糖蜜、酢酸塩、プロピオン酸塩、酪酸塩、乳酸塩、エタノール、プロパノール、ブタノール、カゼイン、乳清粉末、酵母、酵母エキス、ペプトン、トリプトン、トリプトファン、肉エキス、牛肉エキスのいずれか一つ以上を含むことを特徴とする。
【００１１】
また本発明のウレアーゼ生産微生物のための栄養源は、スクロース、グルコース、マルトース、セロビオース、でんぷん、ガラクトース、フルクトース、ラクトース、ソルビトール、マンニトール、糖蜜、酢酸塩、プロピオン酸塩、酪酸塩、乳酸塩、エタノール、プロパノール、ブタノール、カゼイン、乳清粉末のうちの少なくとも一つ以上を含み、かつ酵母、酵母エキス、ペプトン、トリプトン、トリプトファン、肉エキス、牛肉エキスのいずれか一つ以上を含むことを特徴とする。
【００１２】
さらに本発明のウレアーゼ生産微生物のための栄養源は、スクロース、グルコース、マルトース、セロビオース、でんぷん、ガラクトース、フルクトース、ラクトース、ソルビトール、マンニトール、糖蜜、酢酸塩、プロピオン酸塩、酪酸塩、乳酸塩、エタノール、プロパノール、ブタノール、カゼイン、乳清粉末のうちの少なくとも一つ以上を重量比で50%以上含み、かつ酵母、酵母エキス、ペプトン、トリプトン、トリプトファン、肉エキス、牛肉エキスのいずれか一つ以上を重量比で50%未満含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の栄養源により微生物によってウレアーゼを効果的に生産させ、尿素、カルシウムイオンにより、カルサイトの生成を促す事ができる。
【００１４】
本発明栄養源の利点として、水との親和性の高い物質を利用しており、一般的に不可欠である対象の媒体との混合攪拌をせずとも適用してカルサイトの生成が可能で、原位置利用がしやすい。
【００１５】
また本発明の方法は、カルサイトの結晶構造の中に汚染物質を取り込むなどしての環境における汚染物質の固定化や除去、沿岸部や河川などにおいて浸食からの表面保護や制御などの応用が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明の実施例１として行った予備試験の結果を示すグラフである。
【図２】本発明の実施例２の結果を示すグラフである。
【図３】本発明の実施例２の結果を示し、各種栄養源材料におけるＳ．ｐａｓｔｅｕｒｉｉのウレアーゼ活性を示すグラフである。
【図４】本発明の実施例３によるＳｐｏｒｏｓａｒｃｉｎａ ｐａｓｔｅｕｒｉｉの増殖効果の試験結果を示すグラフである。
【図５】本発明の実施例３によるウレアーゼ活性効果についての試験結果を示すグラフである。
【図６】本発明の実施例４として５種の栄養源培地において培養をし、生成されるカルサイト量を測定した結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明の実施の形態を説明する。
ウレアーゼ生産微生物のための栄養源が適用されるウレアーゼ生産微生物としては、必要とされるウレアーゼ活性を示すことのできる微生物であればよく特には限定されない。すなわち斯かる微生物としては、求めるウレアーゼを生産する能力を有していればよく、真正細菌のような原核生物でもよく、細菌、酵母、植物、動物の細胞といったような単細胞性の真核生物でもよい。
【００１８】
以下に本発明において利用することのできる、ウレアーゼを生産可能な微生物の一部について例示する。
Ｓｐｏｒｏｓａｒｃｉｎａ ｓｐ．， Ｓｐｏｒｏｓａｒｃｉｎａ ｐａｓｔｅｕｒｉｉ， Ｓｐｏｒｏｓａｒｃｉｎａ ｓｏｌｉ， Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏ ｂａｃｉｌｌｕｓ， Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｉｓ， Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｒｙｓｔａｌｌｏｐｏｉｅｔｅｓ， Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓ， Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ Ｘａｎｔｈｕｓ， Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．， Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ， Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ， Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｆａｃｉｅｎｓ， Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｎｄ Ｄｅｓｕｌｆｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ， Ｄｅｌｅｙａ ｈａｌｏｐｈｉｌａ， Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｅｕｒｉｈａｌｉｎａなどがウレアーゼ生産能力を有する微生物である。しかし本発明では、これらに限定されず、微生物全般においてウレアーゼを生産する微生物を利用することができる。
【００１９】
本発明の栄養源に関してカルサイト生成により評価をする場合、カルサイトの含有量を測定する方法の一つは、対象の物質を酸処理することによって生成する二酸化炭素量を測定する方法である。
二酸化炭素量は、マノメトリック法やガス容量によりガス圧を測定することにより決定される。既知のサンプル量とガス容量とから最終的にサンプル中のカルサイト量が算出される。カルサイト量を測定する方法については、“Ｓｏｉｌ Ｃａｒｂｏｎａｔｅｓ” ｉｎ “Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｓｏｉｌ ａｎｄ Ｗａｔｅｒ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ”の１９章、ｂｙ Ｇ．Ｅ．Ｒａｙｍｅｎｔ ＆ Ｆ．Ｒ．Ｈｉｇｇｉｎｓｏｎ， Ｉｎｋａｔａ Ｐｒｅｓｓ， Ｓｙｄｎｅｙ， １９９２， ｐａｇｅｓ ２０６−２１０ に２つの方法が記載されている。
【００２０】
栄養源の例として、スクロース、グルコース、マルトース、セロビオース、でんぷん、ガラクトース、フルクトース、ラクトース、ソルビトール、マンニトール、糖蜜、酢酸塩、プロピオン酸塩、酪酸塩、乳酸塩、エタノール、プロパノール、ブタノール、カゼイン、乳清粉末、酵母、酵母エキス、ペプトン、トリプトン、トリプトファン、肉エキス、牛肉エキス、さらには尿素、塩化カルシウム、塩化ナトリウムなどが挙げられる。
【００２１】
さらに栄養源として利用可能な物質としては、前記の物質の他にコーンシロップ、ペントース（五炭糖）、ヘキソース（六炭糖）、豆乳、クレアチニン、プロテイン粉末、グアーガム、キサンタンゴム、エチレングリコール類、ショ糖乳酸エステル類、ベータグルカン、カザミノ酸、及びアンモニア、カルシウム、マグネシウム、ナトリウムの塩を使用することができる。
【００２２】
本発明の栄養源における各物質の有効な量とその組み合わせについては、実際に利用する状況・用途に応じて、少なくともウレアーゼ生産微生物の利用性に基づいて決定される。その決定においては、各原料の種類とそれらの配合について種々の条件を設定することが望ましく、また微生物に関する専門知識を有する熟練した技術者が実施することが望ましい。
【００２３】
実際の適用においては、とりわけウレアーゼ活性レベルが高く、尿素源を利用する微生物が多く確認される方法が望ましい。この点で、実際の適用における反応物の所定量は、事前検討の結果において高いウレアーゼ活性が得られた試験パターンに基づいて決定されることが望ましい。
重要な点として、本発明の栄養源における使用物質及び比率などの構成については、使用者の方で目的や用途に応じてウレアーゼ活性が好適となる方法を選択することが可能である。これにより、本発明の適用範囲は極めて広くなる。
【００２４】
各種の物質を添加した培地におけるＳ．ｐａｓｔｅｕｒｉｉの増殖について２４時間以上の検証を実施した結果、スクロースと酵母エキスなどを含む栄養源において良好な増殖が観察された。
さらに栄養源に尿素、塩化カルシウム、アンモニウムイオン、塩化物を含むことが増殖に役立つ。
微生物は、周辺環境のｐＨを高め、窒素源やエネルギー源として利用するためにウレアーゼにより尿素を加水分解することが知られている。
【００２５】
通性嫌気性微生物であるＳ．ｐａｒｔｅｕｒｉｉは、酸素の存在下で速やかに増殖し、その結果、炭酸カルシウムの沈殿反応を示す。
尿素を含む栄養源培地における生化学反応は、以下のように纏められる。
Ｈ２ＮＣＯＮＨ２ ＋ ３Ｈ２Ｏ → ２ＮＨ４＋ ＋ ＨＣＯ３− ＋ ＯＨ− 尿素の加水分解
Ｃａ２＋ ＋ Ｃｅｌｌ → Ｃｅｌｌ−Ｃａ２＋
Ｃｌ− ＋ ＨＣＯ３− ＋ ＮＨ３ → ＮＨ４Ｃｌ ＋ ＣＯ３２−
【００２６】
微生物反応によって進む炭酸カルシウムの沈殿の作用は、化学的な沈殿作用と比較しても、さほど複雑なわけではない。Ｂ． ｐａｓｔｅｕｒｉｉとしても知られるＳｐｏｒｏｓａｒｃｉｎａ ｐａｓｔｅｕｒｉｉは、微生物によるカルサイト生成に最もふさわしい微生物である。
【００２７】
微生物系において多くの石灰質生物が代謝同化プロセスにおいて水素（陽子）を除去するために石灰化をする。このプロセスにおいて酵素による尿素の加水分解によりアンモニアとさらに二酸化炭素が生成し、周辺環境におけるｐＨが高くなることによってウレアーゼによるカルサイトの沈殿生成がより加速される。このようにウレアーゼ活性が生化学反応によるカルサイト沈殿の必須要素である。
【００２８】
バチルス属は、多量のウレアーゼを産生する微生物として知られており、土壌環境における砂の閉塞のためのカルサイト沈殿などに利用される。
以下に本発明の栄養源について具体的な実施内容を例示するが、実際の適用方法、適用範囲については、これらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００２９】
実施例１として予備試験を行った。
５ｇの塩化ナトリウム（０．５％）、２％の尿素、２５ミリモルの塩化カルシウム、１００ミリモルのミネラル混合液（マグネシウム、亜鉛、鉄など含む）の培地におけるスクロース濃度を２．５、５．０、７．５、１０％とし、Ｓｐｏｒｏｓａｒｃｉｎａ ｐａｓｔｅｕｒｉｉの増殖試験を実施した。培地に尿素、塩化カルシウムを添加して培養を開始する前に１Ｍの塩酸により培地のｐＨを６．５に調整した。また、尿素と塩化カルシウムについてはフィルター滅菌して加えた。そして、Ｂ． ｐａｓｔｅｕｒｉｉとしても知られるＳｐｏｒｏｓａｒｃｉｎａ ｐａｓｔｅｕｒｉｉの培地における増殖については、摂氏３７度において一夜培養し、定期的に吸光度（ＯＤ６００）を測定し、菌数ｃｆｕ／ｍｌを求めて評価した。
【００３０】
その結果、図１に示すようにいずれの濃度でも効果が認められた。スクロース添加濃度が高いほどＳｐｏｒｏｓａｒｃｉｎａ ｐａｓｔｅｕｒｉｉの増殖の効果が高いが、５〜１０％の間では効果の差が大きくない。この結果に基づき実施例２以降の試験における材料添加濃度（対培地）を５％に決定した。
【実施例２】
【００３１】
下記の５つの培地にてＳｐｏｒｏｓａｒｃｉｎａ ｐａｓｔｅｕｒｉｉの増殖、ウレアーゼ活性について試験を実施した。
ｉ）スクロース培地：スクロース５％、塩化ナトリウム０．５％（５ｇ）、尿素２％、２５ｍｍｏｌ／Ｌ塩化カルシウム
ｉｉ）ラクトース培地：ラクトース５％、塩化ナトリウム０．５％（５ｇ）、尿素２％、２５ｍｍｏｌ／Ｌ塩化カルシウム
ｉｉｉ）乳酸ナトリウム培地：乳酸ナトリウム５％、塩化ナトリウム０．５％（５ｇ）、尿素２％、２５ｍｍｏｌ／Ｌ塩化カルシウム
ｉｖ）乳清培地：乳清５％、塩化ナトリウム０．５％（５ｇ）、尿素２％、２５ｍｍｏｌ／Ｌ塩化カルシウム
ｖ）糖蜜培地：糖蜜５％、塩化ナトリウム０．５％（５ｇ）、尿素２％、２５ｍｍｏｌ／Ｌ塩化カルシウム
【００３２】
５ｇの塩化ナトリウム（０．５％）、２％の尿素、２５ミリモルの塩化カルシウム、１００ミリモルのミネラル混合液（マグネシウム、亜鉛、鉄など含む）の培地において上記５種の栄養源を加え、Ｓｐｏｒｏｓａｒｃｉｎａ ｐａｓｔｅｕｒｉｉの増殖試験を実施した。培地に尿素、塩化カルシウムを添加して培養を開始する前に１Ｍの塩酸により培地のｐＨを６．５に調整した。また、尿素と塩化カルシウムについてはフィルター滅菌して加えた。そして、Ｂ． ｐａｓｔｅｕｒｉｉとしても知られるＳｐｏｒｏｓａｒｃｉｎａ ｐａｓｔｅｕｒｉｉの培地における増殖については、摂氏３７度において一夜培養し、定期的に吸光度（ＯＤ６００）を測定し、菌数ｃｆｕ／ｍｌを求めて評価した。
【００３３】
その結果を図２に示す。いずれの物質でもＳｐｏｒｏｓａｒｃｉｎａ ｐａｓｔｅｕｒｉｉの増殖効果が認められた。さらには、同一濃度で添加した場合、スクロース、乳清、ラクトース、乳酸ナトリウム、糖蜜の順で増殖効果が高い。
ウレアーゼ活性は、Ｋ．Ｒ． Ｎａｔａｒａｊａｎ “Ｋｉｎｅｔｉｃ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅ ｕｒｅａｓｅ ｆｒｏｍ Ｄｏｌｉｃｈｏｓ ｂｉｆｌｏｒｕｓ”， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ， １９９５ ７２， ５５６−５７に記載のｐｈｅｎｏｌ−ｈｙｐｏｃｈｌｏｒｉｔｅ ａｓｓａｙ ｍｅｔｈｏｄにより決定した。５０から１，０００マイクロモルの塩化アンモニウムを標準として使用した。
【００３４】
各種栄養源を使用して一定時間培養後の培地１ミリリットルを遠心して、菌を沈殿させる。菌を沈殿させた後、上澄み（培地）を取り除いた。その後、沈殿した菌を生理食塩水で懸濁し、再度遠心し、菌を沈殿させ、上澄み液を取り除くことにより、培地成分を取り除き、菌を洗浄した。０．１Ｍの尿素０．７ミリリットルにｐＨ８の０．１Ｍのリン酸カルシウム０．３ミリリットルで懸濁した菌を加えた。３７℃で２５分間反応させた後、波長６２６ナノメートルの吸光度を測定しウレアーゼ活性を求めた。１分間当たり、１マイクロモルの尿素をアンモニアに変換する酵素量を１ユニット（Ｕ）とした。その結果を図３に示す。
本発明栄養源に使用する各種の安価な材料において添加によるウレアーゼ活性が認められた。
【実施例３】
【００３５】
実施例３として実施例１と同様の手順で、下記の５つの栄養源培地においてＳｐｏｒｏｓａｒｃｉｎａ ｐａｓｔｅｕｒｉｉの増殖ならびにウレアーゼ活性について検証した。
ｉ）スクロース培地：スクロース５％、塩化ナトリウム０．５％（５ｇ）、尿素２％、２５ｍｍｏｌ／Ｌ塩化カルシウム
ｉｉ）酵母エキス培地：酵母エキス５％、塩化ナトリウム０．５％（５ｇ）、尿素２％、２５ｍｍｏｌ／Ｌ塩化カルシウム
ｉｉｉ）ペプトン培地：ペプトン５％、塩化ナトリウム０．５％（５ｇ）、尿素２％、２５ｍｍｏｌ／Ｌ塩化カルシウム
ｉｖ）スクロース＋酵母エキス培地：スクロース４％、酵母エキス１％、塩化ナトリウム０．５％（５ｇ）、尿素２％、２５ｍｍｏｌ／Ｌ塩化カルシウム
ｖ）スクロース＋ペプトン培地：スクロース４％、ペプトン１％、塩化ナトリウム０．５％（５ｇ）、尿素２％、２５ｍｍｏｌ／Ｌ塩化カルシウム
【００３６】
Ｓｐｏｒｏｓａｒｃｉｎａ ｐａｓｔｅｕｒｉｉの増殖効果の試験結果を図４に示す。ウレアーゼ活性効果については、図５に示す。
その結果、酵母エキス、ペプトンなど高価な材料のみでのＳｐｏｒｏｓａｒｃｉｎａ ｐａｓｔｅｕｒｉｉ増殖効果が最も高いが、それらと比較して前記物質の一部を安価なスクロースに振り替えたものの効果も高いことが示された。また、ウレアーゼ活性についても、酵母エキス、ペプトンなど高価な材料のみでのウレアーゼ活性が最も高いが、それらと比較して前記物質の一部を安価なスクロースに振り替えたものの効果も十分に高いことが示された。
【実施例４】
【００３７】
実施例４として実施例２において使用した５種の栄養源培地において培養をし、生成されるカルサイト量を測定した。その結果を図６に示す。
結果としてカルサイト生成に関しては、５種の栄養源のうち酵母エキス、ペプトンなど高価な材料のみでの効果が最も高いが、前記物質の一部を安価なスクロースに振り替えたものの効果も十分に高いことが示された。
以上の試験結果より酵母エキスやペプトンなどの一部をスクロース等の安価な原料で振り替えた材料によりウレアーゼ生産及びカルサイト生成に寄与する微生物の栄養源として効果が示された。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウレアーゼを産生する微生物のための安価な栄養源に関し、特にはウレアーゼ活性を高め、カルサイトの生成に効果的な微生物のための栄養源に関する。
【背景技術】
【０００２】
特許文献１には土圧密方法に関し、石灰化細菌と脱窒細菌との組み合わせが使用され、ａ）石灰化細菌の１つ以上の溶液を土に導入する工程；ｂ）土中で前記溶液を循環させる工程；ｃ）石灰化細菌のための１つ以上の栄養溶液を土に導入し、次いで土中で前記溶液を循環させる工程；並びにｄ）脱窒細菌の１つ以上の溶液を土に導入し、次いで土中で前記溶液を循環させる工程；を含む土圧密方法が開示された。
【０００３】
ところで、尿素は、肥料や窒素サイクルにおける微生物の代謝における中間生成物として重要であり、この尿素をアンモニアや二酸化炭素に加水分解する際の触媒となる酵素であるウレアーゼは、多くの土着微生物、地下細菌によって生産される。
【０００４】
ウレアーゼを合成する微生物、糸状菌類あるいは放線菌類などは、成長や増殖のための窒素源として尿素を利用する。こうしたウレアーゼを合成する微生物として、非特許文献２にはＢａｃｉｌｌｕｓ， Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ， Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ， Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ， Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ， Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ が報告されている。これらの微生物において確認されたウレアーゼは、細胞体外で観察されている。
【０００５】
これらのウレアーゼ生産微生物は、例えば、土壌など媒体の表面、あるいは透過性媒体を改質するために利用される。この改質プロセスによって、処理媒体の透過性、多孔性を低くし流体の移動性を低減することが可能であり、石油工業において油が漏出した現場において油を回収したり、油汚染の拡大を抑制するためのミネラルによる閉塞を行う方法として知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表２００８−５０８４５０号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献２】（ａｒｔｉｎ Ａｌｅｘａｎｄｅｒ， Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｓｏｉｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｋｒｉｅｇｅｒ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｆｌｏｒｉｄａ， １９７７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ウレアーゼ生産微生物を利用した各種の処理効率を向上するためにウレアーゼ活性を高くする必要がある。
本発明の目的は、ウレアーゼ活性が高くなり、ウレアーゼを生産する微生物に対して効果的な栄養源を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
ウレアーゼ活性は、栄養源の種類と配合により決定づけられる。本発明においては、ウレアーゼ活性が高くなるような物質の組み合わせを見出し、さらにウレアーゼを生産する微生物に対して効果的な配合比を決定した。
【００１０】
本発明のウレアーゼ生産微生物のための栄養源は、スクロース、グルコース、マルトース、セロビオース、でんぷん、ガラクトース、フルクトース、ラクトース、ソルビトール、マンニトール、糖蜜、酢酸塩、プロピオン酸塩、酪酸塩、乳酸塩、エタノール、プロパノール、ブタノール、カゼイン、乳清粉末、酵母、酵母エキス、ペプトン、トリプトン、トリプトファン、肉エキス、牛肉エキスのいずれか一つ以上を含むことを特徴とする。
【００１１】
また本発明のウレアーゼ生産微生物のための栄養源は、スクロース、グルコース、マルトース、セロビオース、でんぷん、ガラクトース、フルクトース、ラクトース、ソルビトール、マンニトール、糖蜜、酢酸塩、プロピオン酸塩、酪酸塩、乳酸塩、エタノール、プロパノール、ブタノール、カゼイン、乳清粉末のうちの少なくとも一つ以上を含み、かつ酵母、酵母エキス、ペプトン、トリプトン、トリプトファン、肉エキス、牛肉エキスのいずれか一つ以上を含むことを特徴とする。
【００１２】
さらに本発明のウレアーゼ生産微生物のための栄養源は、スクロース、グルコース、マルトース、セロビオース、でんぷん、ガラクトース、フルクトース、ラクトース、ソルビトール、マンニトール、糖蜜、酢酸塩、プロピオン酸塩、酪酸塩、乳酸塩、エタノール、プロパノール、ブタノール、カゼイン、乳清粉末のうちの少なくとも一つ以上を重量比で50%以上含み、かつ酵母、酵母エキス、ペプトン、トリプトン、トリプトファン、肉エキス、牛肉エキスのいずれか一つ以上を重量比で50%未満含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の栄養源により微生物によってウレアーゼを効果的に生産させ、尿素、カルシウムイオンにより、カルサイトの生成を促す事ができる。
【００１４】
本発明栄養源の利点として、水との親和性の高い物質を利用しており、一般的に不可欠である対象の媒体との混合攪拌をせずとも適用してカルサイトの生成が可能で、原位置利用がしやすい。
【００１５】
また本発明の方法は、カルサイトの結晶構造の中に汚染物質を取り込むなどしての環境における汚染物質の固定化や除去、沿岸部や河川などにおいて浸食からの表面保護や制御などの応用が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明の実施例１として行った予備試験の結果を示すグラフである。
【図２】本発明の実施例２の結果を示すグラフである。
【図３】本発明の実施例２の結果を示し、各種栄養源材料におけるＳ．ｐａｓｔｅｕｒｉｉのウレアーゼ活性を示すグラフである。
【図４】本発明の実施例３によるＳｐｏｒｏｓａｒｃｉｎａ ｐａｓｔｅｕｒｉｉの増殖効果の試験結果を示すグラフである。
【図５】本発明の実施例３によるウレアーゼ活性効果についての試験結果を示すグラフである。
【図６】本発明の実施例４として５種の栄養源培地において培養をし、生成されるカルサイト量を測定した結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明の実施の形態を説明する。
ウレアーゼ生産微生物のための栄養源が適用されるウレアーゼ生産微生物としては、必要とされるウレアーゼ活性を示すことのできる微生物であればよく特には限定されない。すなわち斯かる微生物としては、求めるウレアーゼを生産する能力を有していればよく、真正細菌のような原核生物でもよく、細菌、酵母、植物、動物の細胞といったような単細胞性の真核生物でもよい。
【００１８】
以下に本発明において利用することのできる、ウレアーゼを生産可能な微生物の一部について例示する。
Ｓｐｏｒｏｓａｒｃｉｎａ ｓｐ．， Ｓｐｏｒｏｓａｒｃｉｎａ ｐａｓｔｅｕｒｉｉ， Ｓｐｏｒｏｓａｒｃｉｎａ ｓｏｌｉ， Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏ ｂａｃｉｌｌｕｓ， Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｉｓ， Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｒｙｓｔａｌｌｏｐｏｉｅｔｅｓ， Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓ， Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ Ｘａｎｔｈｕｓ， Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．， Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ， Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ， Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｆａｃｉｅｎｓ， Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｎｄ Ｄｅｓｕｌｆｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ， Ｄｅｌｅｙａ ｈａｌｏｐｈｉｌａ， Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｅｕｒｉｈａｌｉｎａなどがウレアーゼ生産能力を有する微生物である。しかし本発明では、これらに限定されず、微生物全般においてウレアーゼを生産する微生物を利用することができる。
【００１９】
本発明の栄養源に関してカルサイト生成により評価をする場合、カルサイトの含有量を測定する方法の一つは、対象の物質を酸処理することによって生成する二酸化炭素量を測定する方法である。
二酸化炭素量は、マノメトリック法やガス容量によりガス圧を測定することにより決定される。既知のサンプル量とガス容量とから最終的にサンプル中のカルサイト量が算出される。カルサイト量を測定する方法については、“Ｓｏｉｌ Ｃａｒｂｏｎａｔｅｓ” ｉｎ “Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｓｏｉｌ ａｎｄ Ｗａｔｅｒ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ”の１９章、ｂｙ Ｇ．Ｅ．Ｒａｙｍｅｎｔ ＆ Ｆ．Ｒ．Ｈｉｇｇｉｎｓｏｎ， Ｉｎｋａｔａ Ｐｒｅｓｓ， Ｓｙｄｎｅｙ， １９９２， ｐａｇｅｓ ２０６−２１０ に２つの方法が記載されている。
【００２０】
栄養源の例として、スクロース、グルコース、マルトース、セロビオース、でんぷん、ガラクトース、フルクトース、ラクトース、ソルビトール、マンニトール、糖蜜、酢酸塩、プロピオン酸塩、酪酸塩、乳酸塩、エタノール、プロパノール、ブタノール、カゼイン、乳清粉末、酵母、酵母エキス、ペプトン、トリプトン、トリプトファン、肉エキス、牛肉エキス、さらには尿素、塩化カルシウム、塩化ナトリウムなどが挙げられる。
【００２１】
さらに栄養源として利用可能な物質としては、前記の物質の他にコーンシロップ、ペントース（五炭糖）、ヘキソース（六炭糖）、豆乳、クレアチニン、プロテイン粉末、グアーガム、キサンタンゴム、エチレングリコール類、ショ糖乳酸エステル類、ベータグルカン、カザミノ酸、及びアンモニア、カルシウム、マグネシウム、ナトリウムの塩を使用することができる。
【００２２】
本発明の栄養源における各物質の有効な量とその組み合わせについては、実際に利用する状況・用途に応じて、少なくともウレアーゼ生産微生物の利用性に基づいて決定される。その決定においては、各原料の種類とそれらの配合について種々の条件を設定することが望ましく、また微生物に関する専門知識を有する熟練した技術者が実施することが望ましい。
【００２３】
実際の適用においては、とりわけウレアーゼ活性レベルが高く、尿素源を利用する微生物が多く確認される方法が望ましい。この点で、実際の適用における反応物の所定量は、事前検討の結果において高いウレアーゼ活性が得られた試験パターンに基づいて決定されることが望ましい。
重要な点として、本発明の栄養源における使用物質及び比率などの構成については、使用者の方で目的や用途に応じてウレアーゼ活性が好適となる方法を選択することが可能である。これにより、本発明の適用範囲は極めて広くなる。
【００２４】
各種の物質を添加した培地におけるＳ．ｐａｓｔｅｕｒｉｉの増殖について２４時間以上の検証を実施した結果、スクロースと酵母エキスなどを含む栄養源において良好な増殖が観察された。
さらに栄養源に尿素、塩化カルシウム、アンモニウムイオン、塩化物を含むことが増殖に役立つ。
微生物は、周辺環境のｐＨを高め、窒素源やエネルギー源として利用するためにウレアーゼにより尿素を加水分解することが知られている。
【００２５】
通性嫌気性微生物であるＳ．ｐａｒｔｅｕｒｉｉは、酸素の存在下で速やかに増殖し、その結果、炭酸カルシウムの沈殿反応を示す。
尿素を含む栄養源培地における生化学反応は、以下のように纏められる。
Ｈ２ＮＣＯＮＨ２ ＋ ３Ｈ２Ｏ → ２ＮＨ４＋ ＋ ＨＣＯ３− ＋ ＯＨ− 尿素の加水分解
Ｃａ２＋ ＋ Ｃｅｌｌ → Ｃｅｌｌ−Ｃａ２＋
Ｃｌ− ＋ ＨＣＯ３− ＋ ＮＨ３ → ＮＨ４Ｃｌ ＋ ＣＯ３２−
【００２６】
微生物反応によって進む炭酸カルシウムの沈殿の作用は、化学的な沈殿作用と比較しても、さほど複雑なわけではない。Ｂ． ｐａｓｔｅｕｒｉｉとしても知られるＳｐｏｒｏｓａｒｃｉｎａ ｐａｓｔｅｕｒｉｉは、微生物によるカルサイト生成に最もふさわしい微生物である。
【００２７】
微生物系において多くの石灰質生物が代謝同化プロセスにおいて水素（陽子）を除去するために石灰化をする。このプロセスにおいて酵素による尿素の加水分解によりアンモニアとさらに二酸化炭素が生成し、周辺環境におけるｐＨが高くなることによってウレアーゼによるカルサイトの沈殿生成がより加速される。このようにウレアーゼ活性が生化学反応によるカルサイト沈殿の必須要素である。
【００２８】
バチルス属は、多量のウレアーゼを産生する微生物として知られており、土壌環境における砂の閉塞のためのカルサイト沈殿などに利用される。
以下に本発明の栄養源について具体的な実施内容を例示するが、実際の適用方法、適用範囲については、これらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００２９】
実施例１として予備試験を行った。
５ｇの塩化ナトリウム（０．５％）、２％の尿素、２５ミリモルの塩化カルシウム、１００ミリモルのミネラル混合液（マグネシウム、亜鉛、鉄など含む）の培地におけるスクロース濃度を２．５、５．０、７．５、１０％とし、Ｓｐｏｒｏｓａｒｃｉｎａ ｐａｓｔｅｕｒｉｉの増殖試験を実施した。培地に尿素、塩化カルシウムを添加して培養を開始する前に１Ｍの塩酸により培地のｐＨを６．５に調整した。また、尿素と塩化カルシウムについてはフィルター滅菌して加えた。そして、Ｂ． ｐａｓｔｅｕｒｉｉとしても知られるＳｐｏｒｏｓａｒｃｉｎａ ｐａｓｔｅｕｒｉｉの培地における増殖については、摂氏３７度において一夜培養し、定期的に吸光度（ＯＤ６００）を測定し、菌数ｃｆｕ／ｍｌを求めて評価した。
【００３０】
その結果、図１に示すようにいずれの濃度でも効果が認められた。スクロース添加濃度が高いほどＳｐｏｒｏｓａｒｃｉｎａ ｐａｓｔｅｕｒｉｉの増殖の効果が高いが、５〜１０％の間では効果の差が大きくない。この結果に基づき実施例２以降の試験における材料添加濃度（対培地）を５％に決定した。
【実施例２】
【００３１】
下記の５つの培地にてＳｐｏｒｏｓａｒｃｉｎａ ｐａｓｔｅｕｒｉｉの増殖、ウレアーゼ活性について試験を実施した。
ｉ）スクロース培地：スクロース５％、塩化ナトリウム０．５％（５ｇ）、尿素２％、２５ｍｍｏｌ／Ｌ塩化カルシウム
ｉｉ）ラクトース培地：ラクトース５％、塩化ナトリウム０．５％（５ｇ）、尿素２％、２５ｍｍｏｌ／Ｌ塩化カルシウム
ｉｉｉ）乳酸ナトリウム培地：乳酸ナトリウム５％、塩化ナトリウム０．５％（５ｇ）、尿素２％、２５ｍｍｏｌ／Ｌ塩化カルシウム
ｉｖ）乳清培地：乳清５％、塩化ナトリウム０．５％（５ｇ）、尿素２％、２５ｍｍｏｌ／Ｌ塩化カルシウム
ｖ）糖蜜培地：糖蜜５％、塩化ナトリウム０．５％（５ｇ）、尿素２％、２５ｍｍｏｌ／Ｌ塩化カルシウム
【００３２】
５ｇの塩化ナトリウム（０．５％）、２％の尿素、２５ミリモルの塩化カルシウム、１００ミリモルのミネラル混合液（マグネシウム、亜鉛、鉄など含む）の培地において上記５種の栄養源を加え、Ｓｐｏｒｏｓａｒｃｉｎａ ｐａｓｔｅｕｒｉｉの増殖試験を実施した。培地に尿素、塩化カルシウムを添加して培養を開始する前に１Ｍの塩酸により培地のｐＨを６．５に調整した。また、尿素と塩化カルシウムについてはフィルター滅菌して加えた。そして、Ｂ． ｐａｓｔｅｕｒｉｉとしても知られるＳｐｏｒｏｓａｒｃｉｎａ ｐａｓｔｅｕｒｉｉの培地における増殖については、摂氏３７度において一夜培養し、定期的に吸光度（ＯＤ６００）を測定し、菌数ｃｆｕ／ｍｌを求めて評価した。
【００３３】
その結果を図２に示す。いずれの物質でもＳｐｏｒｏｓａｒｃｉｎａ ｐａｓｔｅｕｒｉｉの増殖効果が認められた。さらには、同一濃度で添加した場合、スクロース、乳清、ラクトース、乳酸ナトリウム、糖蜜の順で増殖効果が高い。
ウレアーゼ活性は、Ｋ．Ｒ． Ｎａｔａｒａｊａｎ “Ｋｉｎｅｔｉｃ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅ ｕｒｅａｓｅ ｆｒｏｍ Ｄｏｌｉｃｈｏｓ ｂｉｆｌｏｒｕｓ”， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ， １９９５ ７２， ５５６−５７に記載のｐｈｅｎｏｌ−ｈｙｐｏｃｈｌｏｒｉｔｅ ａｓｓａｙ ｍｅｔｈｏｄにより決定した。５０から１，０００マイクロモルの塩化アンモニウムを標準として使用した。
【００３４】
各種栄養源を使用して一定時間培養後の培地１ミリリットルを遠心して、菌を沈殿させる。菌を沈殿させた後、上澄み（培地）を取り除いた。その後、沈殿した菌を生理食塩水で懸濁し、再度遠心し、菌を沈殿させ、上澄み液を取り除くことにより、培地成分を取り除き、菌を洗浄した。０．１Ｍの尿素０．７ミリリットルにｐＨ８の０．１Ｍのリン酸カルシウム０．３ミリリットルで懸濁した菌を加えた。３７℃で２５分間反応させた後、波長６２６ナノメートルの吸光度を測定しウレアーゼ活性を求めた。１分間当たり、１マイクロモルの尿素をアンモニアに変換する酵素量を１ユニット（Ｕ）とした。その結果を図３に示す。
本発明栄養源に使用する各種の安価な材料において添加によるウレアーゼ活性が認められた。
【実施例３】
【００３５】
実施例３として実施例１と同様の手順で、下記の５つの栄養源培地においてＳｐｏｒｏｓａｒｃｉｎａ ｐａｓｔｅｕｒｉｉの増殖ならびにウレアーゼ活性について検証した。
ｉ）スクロース培地：スクロース５％、塩化ナトリウム０．５％（５ｇ）、尿素２％、２５ｍｍｏｌ／Ｌ塩化カルシウム
ｉｉ）酵母エキス培地：酵母エキス５％、塩化ナトリウム０．５％（５ｇ）、尿素２％、２５ｍｍｏｌ／Ｌ塩化カルシウム
ｉｉｉ）ペプトン培地：ペプトン５％、塩化ナトリウム０．５％（５ｇ）、尿素２％、２５ｍｍｏｌ／Ｌ塩化カルシウム
ｉｖ）スクロース＋酵母エキス培地：スクロース４％、酵母エキス１％、塩化ナトリウム０．５％（５ｇ）、尿素２％、２５ｍｍｏｌ／Ｌ塩化カルシウム
ｖ）スクロース＋ペプトン培地：スクロース４％、ペプトン１％、塩化ナトリウム０．５％（５ｇ）、尿素２％、２５ｍｍｏｌ／Ｌ塩化カルシウム
【００３６】
Ｓｐｏｒｏｓａｒｃｉｎａ ｐａｓｔｅｕｒｉｉの増殖効果の試験結果を図４に示す。ウレアーゼ活性効果については、図５に示す。
その結果、酵母エキス、ペプトンなど高価な材料のみでのＳｐｏｒｏｓａｒｃｉｎａ ｐａｓｔｅｕｒｉｉ増殖効果が最も高いが、それらと比較して前記物質の一部を安価なスクロースに振り替えたものの効果も高いことが示された。また、ウレアーゼ活性についても、酵母エキス、ペプトンなど高価な材料のみでのウレアーゼ活性が最も高いが、それらと比較して前記物質の一部を安価なスクロースに振り替えたものの効果も十分に高いことが示された。
【実施例４】
【００３７】
実施例４として実施例２において使用した５種の栄養源培地において培養をし、生成されるカルサイト量を測定した。その結果を図６に示す。
結果としてカルサイト生成に関しては、５種の栄養源のうち酵母エキス、ペプトンなど高価な材料のみでの効果が最も高いが、前記物質の一部を安価なスクロースに振り替えたものの効果も十分に高いことが示された。
以上の試験結果より酵母エキスやペプトンなどの一部をスクロース等の安価な原料で振り替えた材料によりウレアーゼ生産及びカルサイト生成に寄与する微生物の栄養源として効果が示された。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
スクロース、グルコース、マルトース、セロビオース、でんぷん、ガラクトース、フルクトース、ラクトース、ソルビトール、マンニトール、糖蜜、酢酸塩、プロピオン酸塩、酪酸塩、乳酸塩、エタノール、プロパノール、ブタノール、カゼイン、乳清粉末、酵母、酵母エキス、ペプトン、トリプトン、トリプトファン、肉エキス、牛肉エキスのいずれか一つ以上を含むことを特徴とするウレアーゼ生産微生物のための栄養源。
【請求項２】
スクロース、グルコース、マルトース、セロビオース、でんぷん、ガラクトース、フルクトース、ラクトース、ソルビトール、マンニトール、糖蜜、酢酸塩、プロピオン酸塩、酪酸塩、乳酸塩、エタノール、プロパノール、ブタノール、カゼイン、乳清粉末のうちの少なくとも一つ以上を含み、かつ酵母、酵母エキス、ペプトン、トリプトン、トリプトファン、肉エキス、牛肉エキスのいずれか一つ以上を含むことを特徴とするウレアーゼ生産微生物のための栄養源。
【請求項３】
スクロース、グルコース、マルトース、セロビオース、でんぷん、ガラクトース、フルクトース、ラクトース、ソルビトール、マンニトール、糖蜜、酢酸塩、プロピオン酸塩、酪酸塩、乳酸塩、エタノール、プロパノール、ブタノール、カゼイン、乳清粉末のうちの少なくとも一つ以上を重量比で50%以上含み、かつ酵母、酵母エキス、ペプトン、トリプトン、トリプトファン、肉エキス、牛肉エキスのいずれか一つ以上を重量比で50%未満含むことを特徴とするウレアーゼ生産微生物のための栄養源。
【請求項１】
スクロース、グルコース、マルトース、セロビオース、でんぷん、ガラクトース、フルクトース、ラクトース、ソルビトール、マンニトール、糖蜜、酢酸塩、プロピオン酸塩、酪酸塩、乳酸塩、エタノール、プロパノール、ブタノール、カゼイン、乳清粉末、酵母、酵母エキス、ペプトン、トリプトン、トリプトファン、肉エキス、牛肉エキスのいずれか一つ以上を含むことを特徴とするウレアーゼ生産微生物のための栄養源。
【請求項２】
スクロース、グルコース、マルトース、セロビオース、でんぷん、ガラクトース、フルクトース、ラクトース、ソルビトール、マンニトール、糖蜜、酢酸塩、プロピオン酸塩、酪酸塩、乳酸塩、エタノール、プロパノール、ブタノール、カゼイン、乳清粉末のうちの少なくとも一つ以上を含み、かつ酵母、酵母エキス、ペプトン、トリプトン、トリプトファン、肉エキス、牛肉エキスのいずれか一つ以上を含むことを特徴とするウレアーゼ生産微生物のための栄養源。
【請求項３】
スクロース、グルコース、マルトース、セロビオース、でんぷん、ガラクトース、フルクトース、ラクトース、ソルビトール、マンニトール、糖蜜、酢酸塩、プロピオン酸塩、酪酸塩、乳酸塩、エタノール、プロパノール、ブタノール、カゼイン、乳清粉末のうちの少なくとも一つ以上を重量比で50%以上含み、かつ酵母、酵母エキス、ペプトン、トリプトン、トリプトファン、肉エキス、牛肉エキスのいずれか一つ以上を重量比で50%未満含むことを特徴とするウレアーゼ生産微生物のための栄養源。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２０１２−１９７５１（Ｐ２０１２−１９７５１Ａ）
【公開日】平成２４年２月２日（２０１２．２．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１６１２５９（Ｐ２０１０−１６１２５９）
【出願日】平成２２年７月１６日（２０１０．７．１６）
【出願人】（３０２００８４６７）エコサイクル株式会社 (9)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年２月２日（２０１２．２．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年７月１６日（２０１０．７．１６）
【出願人】（３０２００８４６７）エコサイクル株式会社 (9)
【Ｆターム（参考）】
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