核移植卵、単為発生胚および単為発生哺乳動物の作出方法
【課題】本発明の目的は、哺乳動物の卵子由来の半数ゲノムを２セット有する核移植卵であって、成体の作出効率に優れた核移植卵を提供することにある。
【解決手段】本発明は、（１）除核した卵核胞期卵（ＧＶ期卵）に、非成長期卵（ｎｇ卵子）を導入した後、体外成熟培養しＭＩＩ期（第２減数分裂中期）まで移行させ第１核移植卵とする工程、（２）該第１核移植卵からＭＩＩ期染色体を取り出し、別のＭＩＩ期卵（ｆｇ卵子）に導入し第２核移植卵とする工程からなる、ｎｇ卵子およびｆｇ卵子由来の半数体ゲノムセットを有する核移植卵を作出する方法において、ｎｇ卵子またはｆｇ卵子として、（Ａ）Ｈ１９遺伝子およびＩｇｆ２遺伝子の発現を制御する領域（領域Ａ）並びに（Ｂ）Ｇｔｌ２遺伝子およびＤｌｋ１遺伝子を発現制御する（領域Ｂ）の双方を欠損する卵子を用い、従来法よりも成体発生率を格段に向上させたものである。
【解決手段】本発明は、（１）除核した卵核胞期卵（ＧＶ期卵）に、非成長期卵（ｎｇ卵子）を導入した後、体外成熟培養しＭＩＩ期（第２減数分裂中期）まで移行させ第１核移植卵とする工程、（２）該第１核移植卵からＭＩＩ期染色体を取り出し、別のＭＩＩ期卵（ｆｇ卵子）に導入し第２核移植卵とする工程からなる、ｎｇ卵子およびｆｇ卵子由来の半数体ゲノムセットを有する核移植卵を作出する方法において、ｎｇ卵子またはｆｇ卵子として、（Ａ）Ｈ１９遺伝子およびＩｇｆ２遺伝子の発現を制御する領域（領域Ａ）並びに（Ｂ）Ｇｔｌ２遺伝子およびＤｌｋ１遺伝子を発現制御する（領域Ｂ）の双方を欠損する卵子を用い、従来法よりも成体発生率を格段に向上させたものである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核移植卵の作出方法に関する。さらに詳しくは、雌ゲノムのみから構成される核移植卵の作出方法に関する。また本発明は、核移植卵から単為発生胚を作出する方法に関する。さらに本発明は、該単為発生胚から単為発生哺乳動物を作出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
哺乳動物では、精子と卵子の受精により個体発生が行われ、決して卵子のみでは個体発生を完了することはない。これは、精子と卵子のゲノムの機能が決定的に異なっていることを意味する。この機能差は生殖細胞が形成される過程で後天的に刷り込まれる化学的なＤＮＡ修飾の結果、同一遺伝子の発現が精子に由来するものと、卵子に由来するものとで全く異なる遺伝子群（インプリント遺伝子）が存在するためであると考えられている。事実、新生仔の卵母細胞はこの遺伝子修飾を受けておらず、あたかも精子由来の遺伝子発現パターンを示す遺伝子が多数存在する。
このようなインプリント遺伝子の発現パターンを解析するため、本発明者は、マウスの新生仔卵母細胞由来のゲノムと成熟雌由来の卵子ゲノムから核移植卵を作出する方法を提案した（非特許文献１参照）。かかる方法は、（１）除核した卵核胞期（ＧＶ期）卵に、新生仔卵母細胞（ｎｇ卵子）を導入した後、体外成熟培養しＭＩＩ期（第２減数分裂中期）まで移行させ第１核移植卵とする工程、（２）該第１核移植卵からＭＩＩ期染色体を取り出し、別のＭＩＩ期卵（ｆｇ卵子）に導入し第２核移植卵とする工程からなる。この方法で得られる第２核移植卵は、ｎｇ卵子由来の半数体ゲノムセットおよびｆｇ卵子由来の半数体ゲノムセットを有する。
本来、新生仔卵母細胞（ｎｇ卵子）は、卵子成長過程の後期（マウスでは卵子の直径がおよそ６０μｍ）になるまでは減数分裂を再開することがなく、第１減数分裂前期のディプロテン期で細胞周期を停止している。本発明者は、この細胞周期を停止している新生仔卵母細胞（ｎｇ卵子）を、十分に成長した卵母細胞の細胞質へ導入すると、減数分裂を再開することを見出し、上記方法を提案した。
【０００３】
導入されたｎｇ卵子由来の遺伝子は、卵子成長期に後天的に刷り込まれる化学的なＤＮＡ修飾を受けておらず、第２核移植卵はインプリント遺伝子の発現制御を解析する上で、有用な材料となることが期待される。かかる第２核移植卵からの単為発生胚は、形態的には受精卵由来の胎仔と比べ遜色のない妊娠１３．５日目の胎仔まで発生することを確認したが、それ以上の成長は確認できなかった。
その後の研究により、本発明者は、上記方法においてｎｇ卵子またはｆｇ卵子として精子形成過程で後天的遺伝子修飾をうけるインプリント遺伝子、特にＨ１９遺伝子を欠損する卵子を用いると、成体までの発育能を有する核移植卵が得られることを見出し、特許出願し（特許文献１）、文献に発表した（非特許文献２）。この方法は、成体までの発育能を有する核移植卵が得られる点において優れた方法であるが、成体は単為発生胚に対して１．５％程度しか作出せず、成体の作出効率の向上が望まれていた。
【非特許文献１】河野友宏著、「卵子形成過程におけるゲノム刷込みと胚発生」、蛋白質 核酸 酵素Ｖｏｌ．４３ Ｎｏ．４（１９９８），ｐ２６７−２７４
【非特許文献２】Tomohiro Kono et al, Nature Vol.428, No.6985, pp.860-864, 22 April 2004
【特許文献１】国際公開ＷＯ２００５／０１１３７１号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
そこで本発明の目的は、哺乳動物の卵子由来の半数ゲノムを２セット有する核移植卵であって、成体の作出効率に優れた核移植卵を提供することにある。また本発明は、該核移植卵からの単為発生胚の作出方法、該単為発生胚からの単為発生哺乳動物の作出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
特許文献１に記載の方法に使用するｆｇ卵子またはｎｇ卵子は、インプリント遺伝子、特にＨ１９遺伝子が欠損されている点で、精子由来の遺伝子に近いものであるが、精子由来の遺伝子とは相違し、得られた核移植卵からの成体の作出効率は低い。
そこで、本発明者は、卵子由来の半数ゲノム２セットを有する第２核移植卵のゲノム遺伝子を、より精子と卵子の生殖におけるゲノム遺伝子に近づけるべく、遺伝子の父方発現と母方発現に着目して検討した。
その結果、特許文献１記載の方法において、ｎｇ卵子またはｆｇ卵子として、（Ａ）Ｈ１９遺伝子およびＩｇｆ２遺伝子の発現を制御するＤＮＡメチル化インプリント領域（領域Ａ）並びに（Ｂ）Ｇｔｌ２遺伝子およびＤｌｋ１遺伝子の発現を制御するＤＮＡメチル化インプリント領域（領域Ｂ）の双方を欠損する卵子を用いると、成体の作出効率を格段に向上させることができることを見出し、本発明を完成した。
【０００６】
即ち、本発明は、哺乳動物の核移植卵を作出する方法であって、
（１）除核した卵核胞期卵（ＧＶ期卵）に、非成長期卵（ｎｇ卵子）を導入した後、体外成熟培養しＭＩＩ期（第２減数分裂中期）まで移行させ第１核移植卵とする工程、
（２）該第１核移植卵からＭＩＩ期染色体を取り出し、別のＭＩＩ期卵（ｆｇ卵子）に導入し第２核移植卵とする工程、
からなる、ｎｇ卵子由来の半数体ゲノムセットおよびｆｇ卵子由来の半数体ゲノムセットを有する核移植卵を作出する方法において、ｎｇ卵子またはｆｇ卵子として、（Ａ）Ｈ１９遺伝子およびＩｇｆ２遺伝子の発現を制御するＤＮＡメチル化インプリント領域（領域Ａ）並びに（Ｂ）Ｇｔｌ２遺伝子およびＤｌｋ１遺伝子の発現を制御するＤＮＡメチル化インプリント領域（領域Ｂ）の双方を欠損する卵子を用いることを特徴とする、前記核移植卵の作出方法である。
【０００７】
また本発明は、該第２核移植卵を活性化処理した後、体外発生培養することからなる単為発生胚の作出方法を包含する。
【０００８】
さらに本発明は、該単為発生胚を雌哺乳動物の子宮に移植し成長させることからなる単為発生哺乳動物の作出方法を包含する。
【０００９】
本発明において成体の作出効率を向上させることができる理由は以下のように推定できる。即ち、哺乳動物では、父方および母方から由来している相同染色体上に、同じ遺伝子あるいはその対立遺伝子が同一順列で配列されており、両親のアレルから同等に遺伝子発現が行われ個体の形質発現に携わっている。
しかし、一部の遺伝子には父方発現するものと母方発現するものがある。例えば、胚成長因子Ｉｇｆ２(Insulin like growth factor II)遺伝子は、父方遺伝子座（精子由来）で発現するが、母方遺伝子座（卵子由来）では発現しない。逆に、Ｉｇｆ２遺伝子の下流に位置するＨ１９遺伝子は、母方遺伝子座からのみ発現する。このような遺伝子をインプリント遺伝子と呼ぶ。これはＩｇｆ２遺伝子とＨ１９遺伝子が、Ｈ１９遺伝子の下流に存在するエンハンサー（遺伝子発現増強配列）を共有しているためである。このエンハンサーは、通常Ｈ１９遺伝子に対して優位に機能するが、Ｈ１９遺伝子上流の発現調節領域（領域Ａ）が精子形成過程で後天的遺伝子修飾（ＤＮＡメチル化）を受けるとＨ１９遺伝子に対して機能することができなくなり、Ｉｇｆ２遺伝子に対して機能するようになる。その結果、Ｈ１９遺伝子は父方での発現が抑制され、Ｉｇｆ２遺伝子は父方で発現するといった相互関係が成り立つ。
【００１０】
同様にＤｌｋ１遺伝子とＧｔｌ２遺伝子は、それぞれ父方および母方遺伝子座から発現するインプリント遺伝子である。Ｇｔｌ２遺伝子の上流にある発現調節領域（領域Ｂ）は精子形成過程でメチル化を受け、発現調節が成立する。
即ち、通常の精子と卵子による生殖においては、母方でＨ１９およびＧｔｌ２遺伝子が発現し、父方でＩｇｆ２およびＤｌｋ１遺伝子が発現することにより、正常な胚成形が行われている（表１参照）。卵子同士の単為生殖では、双方の遺伝子が母方に由来するため、母方で発現するＨ１９およびＧｔｌ２遺伝子が過剰発現され、父方で発現するＩｇｆ２およびＤｌｋ１遺伝子の発現が生じないことが予想される（表２参照）。そこで、本発明のように、ｎｇ卵子またはｆｇ卵子として、領域Ａおよび領域Ｂの双方を欠損する卵子を用いると、通常の精子と卵子による生殖に近い発現調節が行なわれ、成体発生率を格段に向上させることができるものと推定される（表３参照）。
【００１１】
【表１】
【００１２】
【表２】
【００１３】
【表３】
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、哺乳動物の卵子由来の半数ゲノムを２セット有する核移植卵であって、成体の作出効率に優れた核移植卵の作出方法が提供される。また本発明によれば、該核移植卵からの単為発生胚の作出方法、該単為発生胚からの単為発生哺乳動物の作出方法が提供される。本発明により得られる哺乳動物は、正常な繁殖能力を有する。
特に本発明によれば、単為発生胚に対する成体の作出効率が７％程度となり、作出効率が１．５％程度の従来法（特許文献１）に比べその技術的意義は大きい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
（第１核移植工程）
除核した卵核胞期卵（ＧＶ期卵）に、非成長期卵（ｎｇ卵子）を導入した後、体外成熟培養し、ＭＩＩ期（第２減数分裂中期）まで移行させる工程である。
ＧＶ期卵は、成熟した哺乳動物に妊馬絨毛性性腺刺激ホルモンなどを投与し、過排卵処理により得られる体内成長卵子や、成熟した哺乳動物の卵巣から無処理で得られる体内成長卵子を用いることが出来る。かかる体内成長卵子は、過排卵処理、あるいは無処理により得られる雌哺乳動物の卵巣からＰＢＳ溶液等を用いて注射針等で卵胞を切り裂いたり、注射針等で卵胞から吸引することにより採取することができる。卵丘細胞が付着しているＧＶ期卵はガラスピペットなどによるピペッティングや、トリプシン・ＥＤＴＡ等の酵素処理によって卵丘細胞を除去することが好ましい。
ＧＶ期卵は、透明帯の切断および除核を行いレシピエント卵とする。透明帯は、顕微鏡で観察しながらガラスナイフなどで切断することができる。除核は、除核ピペットを透明帯の切断部から挿入し、少量の細胞質とともに除去して行うことができる。
【００１６】
ｎｇ卵子は、胎生期の卵母細胞または新生仔の卵母細胞であることが好ましいが、成熟した哺乳動物の卵巣から採取することもできる。
導入は、細胞融合により行うことが好ましい。レシピエント卵の囲卵腔内にｎｇ卵子をセンダイウイルス（ＨＶＪ）とともに注入し融合させることが好ましい。
その後、体外成熟培養し、ＭＩＩ期（第２減数分裂中期）まで移行させる。体外成熟培養は、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を５％添加したαＭＥＭ培地等により、炭酸ガス培養器中で培養することができる。またウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を５％添加したＭ１６培地を用いることができる。体外成熟培養により、卵は核膜の崩壊、分裂装置の形成、減数分裂、第１極体の放出を行いＭＩＩ期に達した第１核移植卵を得ることができる。
哺乳動物としては、マウス、豚、牛、ヒツジ、ヤギ、ラット、ウサギ等の非ヒト動物が好ましい。
【００１７】
（第２核移植工程）
第１核移植卵からＭＩＩ期染色体を取り出し、別のＭＩＩ期卵（ｆｇ卵子）に導入し第２核移植卵とする工程である。
ｆｇ卵子は、雌成熟哺乳動物からの排卵卵子であることが好ましい。かかる排卵卵子は、成熟した哺乳動物に妊馬絨毛性性腺刺激ホルモンやヒト絨毛性性腺刺激ホルモンなどを投与し、過排卵処理により排卵卵子を得ることが出来る。一方、成熟した哺乳動物の卵巣から無処理で得られる体内成長卵子を卵丘細胞に覆われた状態で体外成熟培養しＭＩＩ期に達した卵をｆｇ卵子として用いることも出来る。ｆｇ卵子は透明帯の一部を切断しておくことが好ましい。
【００１８】
導入は以下の方法で行うことができる。第１核移植卵の透明帯切断部から除核用ピペットでＭＩＩ期染色体（分裂装置）を吸引する。ついで、ピペット先端にセンダイウイルスを吸引し、ｆｇ卵子の透明帯切断部から挿入してＭＩＩ染色体を注入することができる。これらの操作はＭ２培地等の核移植用培地中で行うことが好ましい。その後、Ｍ２培地中で所定の時間、培養して融合させ第２核移植卵を得ることができる。第２核移植卵は、ｎｇ卵子由来の半数ゲノムセットとｆｇ卵子由来の半数ゲノムセットを有する。
【００１９】
（領域Ａ、領域Ｂ）
本発明においては、ｎｇ卵子またはｆｇ卵子は、領域Ａおよび領域Ｂの双方を欠損する卵子である。
領域Ａは、Ｈ１９遺伝子およびＩｇｆ２遺伝子の発現を制御するＤＮＡメチル化インプリント領域である。領域Ａは、マウスでは、Ｉｇｆ２遺伝子とＨ１９遺伝子との間にある、長さ１０ｋｂの領域である。Ｈ１９遺伝子の５’側の直近のＥｃｏＲＩ制限酵素切断部位から約１０ｋｂ上流のＥｃｏＲＩ制限酵素切断部位までの領域である。
Ｈ１９遺伝子は、Leighton P.A.et al,Nature 375,34-39,1995に記載されている。Ｈ１９遺伝子の長さは３ｋｂである。Ｉｇｆ２遺伝子は、Leighton et al,Nature 375,34-39,1995に記載されている。
【００２０】
領域Ｂは、Ｇｔｌ２遺伝子およびＤｌｋ１遺伝子を発現制御するＤＮＡメチル化インプリント領域である。領域Ｂは、マウスでは、Ｄｌｋ１遺伝子とＧｔｌ２遺伝子との間にある、長さ４．２ｋｂの領域である。Ｇｔｌ２遺伝子の５’側の直近のＳｃａ１制限酵素切断部位から約４．２ｋｂ上流のＳａｃ１制限酵素切断部位までの領域である。
Ｇｔｌ２遺伝子は、maternally expressed gene 3/gene-trap locus 2,Schmidt,J.V.et al,Genes Dev.14,1997-2002,2000に記載されている。Ｄｌｋ１遺伝子は、Schmidt,J.V.et al,Genes Dev.14,1997-2002,2000) に記載されている。
領域ＡおよびＢの双方を欠損する卵子は、それぞれの遺伝子欠損哺乳動物の交配により誕生した産子から得ることができる。
遺伝子欠損哺乳動物は、公知の標的遺伝子組換え法(ジーン・ターゲティング:例えば、Methods in Enzymology 225:803-890,1993)を用いることにより、例えばマウスの場合、以下のとおりに作成することができる。
【００２１】
先ず、単離した領域ＡおよびＢの標的配列をネオマイシン耐性遺伝子（Ｎｅｏｒ遺伝子）と置換し、また領域ＡおよびＢの端部にヘルペスウイルスのサイミジンカイネース遺伝子（ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子）を付加してターゲティング・ベクターを作成する。このターゲティング・ベクターをマウスの胚性幹細胞（ＥＳ細胞）に導入し、細胞ゲノムＤＮＡの領域ＡおよびＢがターゲティング・ベクター中の変異配列に相同組換えされた細胞を選択する。
このような遺伝子組換え細胞の選択は、Ｇ４１８を細胞培地に添加してＮｅｏｒ遺伝子を持たない非組換え細胞を除去し、さらにガンシクロビルを添加してＨＳＶ−ｔｋ遺伝子が残存するランダムな組換え細胞を除去することによって行うことができる。選択された遺伝子組換え細胞の領域ＡおよびＢは、そのコード配列中にＮｅｏｒ遺伝子が挿入された変異配列であり、発現することはできない。
【００２２】
次いで、この遺伝子組換えされたＥＳ細胞をマウスの初期胚（胚盤胞）に注入し、この初期胚を雌マウスの体内で個体へと発生させ、キメラマウスを産出させる。そして、このキメラマウスと野生型マウスとを交配して子孫マウスを産出させ、これらの子孫マウスの中から、領域ＡおよびＢの双方に変異配列を有するマウス個体を選別することによって、遺伝子欠損マウスを得ることができる。
本発明においては、発現制御領域である領域ＡおよびＢの双方を欠損する卵子を用いればよいが、領域ＡおよびＢに加えてＨ１９遺伝子自体を欠損する卵子を用いてもよい。
【００２３】
（単為発生胚の作出）
本発明は、上記第２核移植卵を活性化処理した後、体外発生培養することからなる単為発生胚の作出方法を包含する。卵子の活性化は、ストロンチウムで行うことが好ましい。具体的には、１０ｍＭのＳｒＣｌ２を含むＭ１６培地で培養して活性化させることができる。また、電気パルスやエタノール等によっても卵子を活性化することが出来る。体外発生培養は、５％ＣＯ２、５％Ｏ２、９０％Ｎ２の気相、３７〜３９℃の条件で行うことができる。
【００２４】
（単為発生哺乳動物の作出）
本発明は、上記単為発生胚を哺乳動物の子宮に移植し成長させることからなる単為発生哺乳動物の作出方法を包含する。移植する哺乳動物としては、特に制限されるものではないが、人工授精させた後の妊娠初期にプロスタグランジンＦ２α等を用いて人工流産させ、同期化を行った哺乳動物を用いることが好ましい。哺乳動物としては、マウス、豚、牛ヒツジ、ヤギ、ラット、ウサギ等の非ヒト哺乳動物が好ましい。
【実施例】
【００２５】
以下、実施例により本発明を説明する。実施例では、哺乳動物としてマウスを用いた。
【００２６】
実施例１
（ｎｇ卵子の採取）
標的遺伝子組換え法(Methods in Enzymology 225:803-890,1993)によりＨ１９遺伝子（３ｋｂ）およびその上流（１０ｋｂ）を合わせて１３Ｋｂ（Ｈ１９遺伝子および領域Ａ）を欠損したマウス(Leighton et al.,Nature375:34-39,1995)およびＤｌｋ１−Ｇｔｌ２発現調節領域（領域Ｂ、長さ４．１５Ｋｂ、Ｇｔｌ２遺伝子上流）を欠損したマウス(Schmidt,J.V.et al,Genes Dev.14,1997-2002,2000)を交配して得られた雌の生後１日の新生仔の卵巣を採取した。採取した卵巣を０．０２％ＥＤＴＡ溶液中に移し３７℃で１０分間培養した。ついで、注射針にて卵巣を切り裂き解離してきた非成長期卵子を採取した。得られた卵子の内、領域Ａおよび領域Ｂの双方が欠損した卵子を選択しドナー用ｎｇ卵子とした。
【００２７】
（ＧＶ期卵の採取）
成熟したマウス（８〜１２週齢、Ｂ６Ｄ２Ｆ１、チャールズリバー／クレア）に妊馬絨毛性性腺刺激ホルモンを５〜７．５ＩＵ投与した後、卵巣中の発育した卵胞を２７ゲージ注射針にて裂き卵丘細胞に包まれたＧＶ期卵を採取した。卵丘細胞をピペッティングにより除去した後、ＧＶ期卵をＭ２培地（２４０μＭ ｄｂｃＡＭＰおよび５％ＦＢＳを添加）で３７℃にて２時間培養した。
【００２８】
（除核）
倒立顕微鏡にマイクロマニピュレーター（成茂社製）を取り付け実施した。まず、ＧＶ期卵の透明帯をガラスナイフを用いて１５〜２０％切断した。ついで、ＧＶ期卵を核移植用Ｍ２培地（１０μｇ／ｍｌ サイトカラシンＢ、１００ｎｇ／ｍｌ コルセミド、２４０μＭ ｄｂｃＡＭＰおよび５％ＦＢＳを添加）に移し、１５分間３７℃で培養した。顕微操作により除核ピペット（直径が２５μｍ）を透明帯の切断部から挿入し、ＧＶ期卵の核を少量の細胞質とともに除去しレシピエント卵とした。
【００２９】
（第１核移植工程）
次いで、ｎｇ卵子を移植用ピペット（直径が１５μｍ）に吸引したのち、センダイウイルス（ＨＶＪ：コスモバイオ）をピペットの先端に吸引した。ピペットをレシピエント卵の透明帯の切断部から挿入しレシピエント卵に押し付けながら注入した。得られた核移植卵を５％ ＦＣＳ添加αＭＥＭ培地に移し、炭酸ガス培養器中で３７℃にて１４時間、培養した。核移植卵は、核膜の崩壊、分裂装置の形成、減数分裂、第１極体の放出の各工程を経て、第２減数分裂中期（ＭＩＩ期）に達し、第１核移植卵を得た。
【００３０】
（第２核移植工程）
雌成熟マウス（８〜１２週齢、Ｂ６Ｄ２Ｆ１、チャールズリバー／クレア）に妊馬絨毛性性腺刺激ホルモンおよびヒト絨毛性性腺刺激ホルモンを４８時間間隔でそれぞれ５〜７．５ ＩＵ投与し、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン投与１４時間後に卵管を採取した。卵管より卵丘細胞に包まれた排卵卵子の塊を採取した後、３００μｇ／ｍｌヒアルロニダーゼを含むＭ２培地中で卵丘細胞をピペッティングにより除去した後、排卵卵子（ｆｇ卵子）を採取した。顕微操作により透明帯の一部を切断した。排卵卵子および第１核移植卵を核移植用Ｍ２培地（５μｇ／ｍｌサイトカラシンＢを添加）に移した。上述の第１核移植卵の透明帯切断部から除核用ピペット（直径２５μｍ）を挿入し、ＭＩＩ期染色体（分裂装置）を吸引した。ついで、ピペット先端にセンダイウイルスを吸引し、ｆｇ卵子の透明帯切断部にピペットを挿入して、ＭＩＩ期染色体を注入した。Ｍ２培地中に移し、３７℃で３０分間培養して両者を融合させ第２核移植卵を得た。
下記表４に核移植卵の生産効率を示す。
【００３１】
【表４】
【００３２】
実施例２
（単為発生胚の作出）
得られた２３８個の第２核移植卵を、１０Ｍ塩化ストロンチウムを含むＭ１６培地にて３７℃で３時間培養し、人為的に卵子の活性化を誘起させた。その結果２２１個の卵子が活性化され、それらをＭ１６培地にて３７℃で３日間体外培養した。その結果、２０６個の胚盤胞が作出された。
【００３３】
実施例３
（単為発生マウスの作出）
得られた２０６個の胚盤胞を偽妊娠２．５日目の雌マウス（定法に従い、精管結紮雄交配させ膣栓を確認した日を偽妊娠０．５日目とした雌マウス）の子宮に移植したところ、１４匹の正常雌産子が誕生し、すべて成体にまで発育した。したがって、作出効率は７％と高率である。これらの遺伝子を解析した結果、Ｈ１９−ＩＧＦ２遺伝子およびＧＴＬ−ＤＬＫ１遺伝子の発現調節メチル化領域（領域ＡおよびＢ）の欠損をそれぞれヘテロに持つことが確認できたことから、第２核移植卵由来の産子であることが確認された。
これら１４匹の単為発生マウスうち５匹に関して繁殖能力を調べた結果、試験した全ての単為発生マウスは正常に交配、妊娠および出産することが判明し、正常な繁殖能力を持つことが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００３４】
本発明によれば、卵子由来の半数ゲノムを２セット有する成体の単為発生哺乳動物が作出できる。かかる哺乳動物は遺伝子の働きを解析する実験用動物として有用である。本発明によれば、作出される哺乳動物は全て雌なので、例えば、優秀な遺伝子を有し遺伝的に均一な乳牛を効率よく生産することが可能となる。また、優れた肉牛を作出する雌牛を効率よく生産することが可能となる。このように本発明は畜産業において利用が期待される。本発明により単為発生哺乳動物を作出する場合は非ヒト哺乳動物を主たる対象とするが、本発明は医療分野における移植用の臓器の生産にも応用することが期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】発明の核移植卵を作出する方法の概略を示した図である。
【００３６】
【図２】本発明より得られた単為発生マウスとその産子の写真である。
【符号の説明】
【００３７】
ａ：新生児由来ｎｇ卵子
ｂ：成熟雌由来ｆｇ卵子
ｃ：核移植
ｄ：体外成熟培養
ｅ：成熟した核置換卵子
ｆ：排卵卵子
ｇ：ＭＩＩ期分裂装置の移植
ｈ：卵子の人為的活性化
ｉ：再構築されたｎｇ／ｆｇ単為発生胚
ａ〜ｅは、本発明の第１核移植工程に対応する。ｆ〜ｉは、本発明の第２核移植工程に対応する。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核移植卵の作出方法に関する。さらに詳しくは、雌ゲノムのみから構成される核移植卵の作出方法に関する。また本発明は、核移植卵から単為発生胚を作出する方法に関する。さらに本発明は、該単為発生胚から単為発生哺乳動物を作出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
哺乳動物では、精子と卵子の受精により個体発生が行われ、決して卵子のみでは個体発生を完了することはない。これは、精子と卵子のゲノムの機能が決定的に異なっていることを意味する。この機能差は生殖細胞が形成される過程で後天的に刷り込まれる化学的なＤＮＡ修飾の結果、同一遺伝子の発現が精子に由来するものと、卵子に由来するものとで全く異なる遺伝子群（インプリント遺伝子）が存在するためであると考えられている。事実、新生仔の卵母細胞はこの遺伝子修飾を受けておらず、あたかも精子由来の遺伝子発現パターンを示す遺伝子が多数存在する。
このようなインプリント遺伝子の発現パターンを解析するため、本発明者は、マウスの新生仔卵母細胞由来のゲノムと成熟雌由来の卵子ゲノムから核移植卵を作出する方法を提案した（非特許文献１参照）。かかる方法は、（１）除核した卵核胞期（ＧＶ期）卵に、新生仔卵母細胞（ｎｇ卵子）を導入した後、体外成熟培養しＭＩＩ期（第２減数分裂中期）まで移行させ第１核移植卵とする工程、（２）該第１核移植卵からＭＩＩ期染色体を取り出し、別のＭＩＩ期卵（ｆｇ卵子）に導入し第２核移植卵とする工程からなる。この方法で得られる第２核移植卵は、ｎｇ卵子由来の半数体ゲノムセットおよびｆｇ卵子由来の半数体ゲノムセットを有する。
本来、新生仔卵母細胞（ｎｇ卵子）は、卵子成長過程の後期（マウスでは卵子の直径がおよそ６０μｍ）になるまでは減数分裂を再開することがなく、第１減数分裂前期のディプロテン期で細胞周期を停止している。本発明者は、この細胞周期を停止している新生仔卵母細胞（ｎｇ卵子）を、十分に成長した卵母細胞の細胞質へ導入すると、減数分裂を再開することを見出し、上記方法を提案した。
【０００３】
導入されたｎｇ卵子由来の遺伝子は、卵子成長期に後天的に刷り込まれる化学的なＤＮＡ修飾を受けておらず、第２核移植卵はインプリント遺伝子の発現制御を解析する上で、有用な材料となることが期待される。かかる第２核移植卵からの単為発生胚は、形態的には受精卵由来の胎仔と比べ遜色のない妊娠１３．５日目の胎仔まで発生することを確認したが、それ以上の成長は確認できなかった。
その後の研究により、本発明者は、上記方法においてｎｇ卵子またはｆｇ卵子として精子形成過程で後天的遺伝子修飾をうけるインプリント遺伝子、特にＨ１９遺伝子を欠損する卵子を用いると、成体までの発育能を有する核移植卵が得られることを見出し、特許出願し（特許文献１）、文献に発表した（非特許文献２）。この方法は、成体までの発育能を有する核移植卵が得られる点において優れた方法であるが、成体は単為発生胚に対して１．５％程度しか作出せず、成体の作出効率の向上が望まれていた。
【非特許文献１】河野友宏著、「卵子形成過程におけるゲノム刷込みと胚発生」、蛋白質 核酸 酵素Ｖｏｌ．４３ Ｎｏ．４（１９９８），ｐ２６７−２７４
【非特許文献２】Tomohiro Kono et al, Nature Vol.428, No.6985, pp.860-864, 22 April 2004
【特許文献１】国際公開ＷＯ２００５／０１１３７１号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
そこで本発明の目的は、哺乳動物の卵子由来の半数ゲノムを２セット有する核移植卵であって、成体の作出効率に優れた核移植卵を提供することにある。また本発明は、該核移植卵からの単為発生胚の作出方法、該単為発生胚からの単為発生哺乳動物の作出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
特許文献１に記載の方法に使用するｆｇ卵子またはｎｇ卵子は、インプリント遺伝子、特にＨ１９遺伝子が欠損されている点で、精子由来の遺伝子に近いものであるが、精子由来の遺伝子とは相違し、得られた核移植卵からの成体の作出効率は低い。
そこで、本発明者は、卵子由来の半数ゲノム２セットを有する第２核移植卵のゲノム遺伝子を、より精子と卵子の生殖におけるゲノム遺伝子に近づけるべく、遺伝子の父方発現と母方発現に着目して検討した。
その結果、特許文献１記載の方法において、ｎｇ卵子またはｆｇ卵子として、（Ａ）Ｈ１９遺伝子およびＩｇｆ２遺伝子の発現を制御するＤＮＡメチル化インプリント領域（領域Ａ）並びに（Ｂ）Ｇｔｌ２遺伝子およびＤｌｋ１遺伝子の発現を制御するＤＮＡメチル化インプリント領域（領域Ｂ）の双方を欠損する卵子を用いると、成体の作出効率を格段に向上させることができることを見出し、本発明を完成した。
【０００６】
即ち、本発明は、哺乳動物の核移植卵を作出する方法であって、
（１）除核した卵核胞期卵（ＧＶ期卵）に、非成長期卵（ｎｇ卵子）を導入した後、体外成熟培養しＭＩＩ期（第２減数分裂中期）まで移行させ第１核移植卵とする工程、
（２）該第１核移植卵からＭＩＩ期染色体を取り出し、別のＭＩＩ期卵（ｆｇ卵子）に導入し第２核移植卵とする工程、
からなる、ｎｇ卵子由来の半数体ゲノムセットおよびｆｇ卵子由来の半数体ゲノムセットを有する核移植卵を作出する方法において、ｎｇ卵子またはｆｇ卵子として、（Ａ）Ｈ１９遺伝子およびＩｇｆ２遺伝子の発現を制御するＤＮＡメチル化インプリント領域（領域Ａ）並びに（Ｂ）Ｇｔｌ２遺伝子およびＤｌｋ１遺伝子の発現を制御するＤＮＡメチル化インプリント領域（領域Ｂ）の双方を欠損する卵子を用いることを特徴とする、前記核移植卵の作出方法である。
【０００７】
また本発明は、該第２核移植卵を活性化処理した後、体外発生培養することからなる単為発生胚の作出方法を包含する。
【０００８】
さらに本発明は、該単為発生胚を雌哺乳動物の子宮に移植し成長させることからなる単為発生哺乳動物の作出方法を包含する。
【０００９】
本発明において成体の作出効率を向上させることができる理由は以下のように推定できる。即ち、哺乳動物では、父方および母方から由来している相同染色体上に、同じ遺伝子あるいはその対立遺伝子が同一順列で配列されており、両親のアレルから同等に遺伝子発現が行われ個体の形質発現に携わっている。
しかし、一部の遺伝子には父方発現するものと母方発現するものがある。例えば、胚成長因子Ｉｇｆ２(Insulin like growth factor II)遺伝子は、父方遺伝子座（精子由来）で発現するが、母方遺伝子座（卵子由来）では発現しない。逆に、Ｉｇｆ２遺伝子の下流に位置するＨ１９遺伝子は、母方遺伝子座からのみ発現する。このような遺伝子をインプリント遺伝子と呼ぶ。これはＩｇｆ２遺伝子とＨ１９遺伝子が、Ｈ１９遺伝子の下流に存在するエンハンサー（遺伝子発現増強配列）を共有しているためである。このエンハンサーは、通常Ｈ１９遺伝子に対して優位に機能するが、Ｈ１９遺伝子上流の発現調節領域（領域Ａ）が精子形成過程で後天的遺伝子修飾（ＤＮＡメチル化）を受けるとＨ１９遺伝子に対して機能することができなくなり、Ｉｇｆ２遺伝子に対して機能するようになる。その結果、Ｈ１９遺伝子は父方での発現が抑制され、Ｉｇｆ２遺伝子は父方で発現するといった相互関係が成り立つ。
【００１０】
同様にＤｌｋ１遺伝子とＧｔｌ２遺伝子は、それぞれ父方および母方遺伝子座から発現するインプリント遺伝子である。Ｇｔｌ２遺伝子の上流にある発現調節領域（領域Ｂ）は精子形成過程でメチル化を受け、発現調節が成立する。
即ち、通常の精子と卵子による生殖においては、母方でＨ１９およびＧｔｌ２遺伝子が発現し、父方でＩｇｆ２およびＤｌｋ１遺伝子が発現することにより、正常な胚成形が行われている（表１参照）。卵子同士の単為生殖では、双方の遺伝子が母方に由来するため、母方で発現するＨ１９およびＧｔｌ２遺伝子が過剰発現され、父方で発現するＩｇｆ２およびＤｌｋ１遺伝子の発現が生じないことが予想される（表２参照）。そこで、本発明のように、ｎｇ卵子またはｆｇ卵子として、領域Ａおよび領域Ｂの双方を欠損する卵子を用いると、通常の精子と卵子による生殖に近い発現調節が行なわれ、成体発生率を格段に向上させることができるものと推定される（表３参照）。
【００１１】
【表１】
【００１２】
【表２】
【００１３】
【表３】
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、哺乳動物の卵子由来の半数ゲノムを２セット有する核移植卵であって、成体の作出効率に優れた核移植卵の作出方法が提供される。また本発明によれば、該核移植卵からの単為発生胚の作出方法、該単為発生胚からの単為発生哺乳動物の作出方法が提供される。本発明により得られる哺乳動物は、正常な繁殖能力を有する。
特に本発明によれば、単為発生胚に対する成体の作出効率が７％程度となり、作出効率が１．５％程度の従来法（特許文献１）に比べその技術的意義は大きい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
（第１核移植工程）
除核した卵核胞期卵（ＧＶ期卵）に、非成長期卵（ｎｇ卵子）を導入した後、体外成熟培養し、ＭＩＩ期（第２減数分裂中期）まで移行させる工程である。
ＧＶ期卵は、成熟した哺乳動物に妊馬絨毛性性腺刺激ホルモンなどを投与し、過排卵処理により得られる体内成長卵子や、成熟した哺乳動物の卵巣から無処理で得られる体内成長卵子を用いることが出来る。かかる体内成長卵子は、過排卵処理、あるいは無処理により得られる雌哺乳動物の卵巣からＰＢＳ溶液等を用いて注射針等で卵胞を切り裂いたり、注射針等で卵胞から吸引することにより採取することができる。卵丘細胞が付着しているＧＶ期卵はガラスピペットなどによるピペッティングや、トリプシン・ＥＤＴＡ等の酵素処理によって卵丘細胞を除去することが好ましい。
ＧＶ期卵は、透明帯の切断および除核を行いレシピエント卵とする。透明帯は、顕微鏡で観察しながらガラスナイフなどで切断することができる。除核は、除核ピペットを透明帯の切断部から挿入し、少量の細胞質とともに除去して行うことができる。
【００１６】
ｎｇ卵子は、胎生期の卵母細胞または新生仔の卵母細胞であることが好ましいが、成熟した哺乳動物の卵巣から採取することもできる。
導入は、細胞融合により行うことが好ましい。レシピエント卵の囲卵腔内にｎｇ卵子をセンダイウイルス（ＨＶＪ）とともに注入し融合させることが好ましい。
その後、体外成熟培養し、ＭＩＩ期（第２減数分裂中期）まで移行させる。体外成熟培養は、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を５％添加したαＭＥＭ培地等により、炭酸ガス培養器中で培養することができる。またウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を５％添加したＭ１６培地を用いることができる。体外成熟培養により、卵は核膜の崩壊、分裂装置の形成、減数分裂、第１極体の放出を行いＭＩＩ期に達した第１核移植卵を得ることができる。
哺乳動物としては、マウス、豚、牛、ヒツジ、ヤギ、ラット、ウサギ等の非ヒト動物が好ましい。
【００１７】
（第２核移植工程）
第１核移植卵からＭＩＩ期染色体を取り出し、別のＭＩＩ期卵（ｆｇ卵子）に導入し第２核移植卵とする工程である。
ｆｇ卵子は、雌成熟哺乳動物からの排卵卵子であることが好ましい。かかる排卵卵子は、成熟した哺乳動物に妊馬絨毛性性腺刺激ホルモンやヒト絨毛性性腺刺激ホルモンなどを投与し、過排卵処理により排卵卵子を得ることが出来る。一方、成熟した哺乳動物の卵巣から無処理で得られる体内成長卵子を卵丘細胞に覆われた状態で体外成熟培養しＭＩＩ期に達した卵をｆｇ卵子として用いることも出来る。ｆｇ卵子は透明帯の一部を切断しておくことが好ましい。
【００１８】
導入は以下の方法で行うことができる。第１核移植卵の透明帯切断部から除核用ピペットでＭＩＩ期染色体（分裂装置）を吸引する。ついで、ピペット先端にセンダイウイルスを吸引し、ｆｇ卵子の透明帯切断部から挿入してＭＩＩ染色体を注入することができる。これらの操作はＭ２培地等の核移植用培地中で行うことが好ましい。その後、Ｍ２培地中で所定の時間、培養して融合させ第２核移植卵を得ることができる。第２核移植卵は、ｎｇ卵子由来の半数ゲノムセットとｆｇ卵子由来の半数ゲノムセットを有する。
【００１９】
（領域Ａ、領域Ｂ）
本発明においては、ｎｇ卵子またはｆｇ卵子は、領域Ａおよび領域Ｂの双方を欠損する卵子である。
領域Ａは、Ｈ１９遺伝子およびＩｇｆ２遺伝子の発現を制御するＤＮＡメチル化インプリント領域である。領域Ａは、マウスでは、Ｉｇｆ２遺伝子とＨ１９遺伝子との間にある、長さ１０ｋｂの領域である。Ｈ１９遺伝子の５’側の直近のＥｃｏＲＩ制限酵素切断部位から約１０ｋｂ上流のＥｃｏＲＩ制限酵素切断部位までの領域である。
Ｈ１９遺伝子は、Leighton P.A.et al,Nature 375,34-39,1995に記載されている。Ｈ１９遺伝子の長さは３ｋｂである。Ｉｇｆ２遺伝子は、Leighton et al,Nature 375,34-39,1995に記載されている。
【００２０】
領域Ｂは、Ｇｔｌ２遺伝子およびＤｌｋ１遺伝子を発現制御するＤＮＡメチル化インプリント領域である。領域Ｂは、マウスでは、Ｄｌｋ１遺伝子とＧｔｌ２遺伝子との間にある、長さ４．２ｋｂの領域である。Ｇｔｌ２遺伝子の５’側の直近のＳｃａ１制限酵素切断部位から約４．２ｋｂ上流のＳａｃ１制限酵素切断部位までの領域である。
Ｇｔｌ２遺伝子は、maternally expressed gene 3/gene-trap locus 2,Schmidt,J.V.et al,Genes Dev.14,1997-2002,2000に記載されている。Ｄｌｋ１遺伝子は、Schmidt,J.V.et al,Genes Dev.14,1997-2002,2000) に記載されている。
領域ＡおよびＢの双方を欠損する卵子は、それぞれの遺伝子欠損哺乳動物の交配により誕生した産子から得ることができる。
遺伝子欠損哺乳動物は、公知の標的遺伝子組換え法(ジーン・ターゲティング:例えば、Methods in Enzymology 225:803-890,1993)を用いることにより、例えばマウスの場合、以下のとおりに作成することができる。
【００２１】
先ず、単離した領域ＡおよびＢの標的配列をネオマイシン耐性遺伝子（Ｎｅｏｒ遺伝子）と置換し、また領域ＡおよびＢの端部にヘルペスウイルスのサイミジンカイネース遺伝子（ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子）を付加してターゲティング・ベクターを作成する。このターゲティング・ベクターをマウスの胚性幹細胞（ＥＳ細胞）に導入し、細胞ゲノムＤＮＡの領域ＡおよびＢがターゲティング・ベクター中の変異配列に相同組換えされた細胞を選択する。
このような遺伝子組換え細胞の選択は、Ｇ４１８を細胞培地に添加してＮｅｏｒ遺伝子を持たない非組換え細胞を除去し、さらにガンシクロビルを添加してＨＳＶ−ｔｋ遺伝子が残存するランダムな組換え細胞を除去することによって行うことができる。選択された遺伝子組換え細胞の領域ＡおよびＢは、そのコード配列中にＮｅｏｒ遺伝子が挿入された変異配列であり、発現することはできない。
【００２２】
次いで、この遺伝子組換えされたＥＳ細胞をマウスの初期胚（胚盤胞）に注入し、この初期胚を雌マウスの体内で個体へと発生させ、キメラマウスを産出させる。そして、このキメラマウスと野生型マウスとを交配して子孫マウスを産出させ、これらの子孫マウスの中から、領域ＡおよびＢの双方に変異配列を有するマウス個体を選別することによって、遺伝子欠損マウスを得ることができる。
本発明においては、発現制御領域である領域ＡおよびＢの双方を欠損する卵子を用いればよいが、領域ＡおよびＢに加えてＨ１９遺伝子自体を欠損する卵子を用いてもよい。
【００２３】
（単為発生胚の作出）
本発明は、上記第２核移植卵を活性化処理した後、体外発生培養することからなる単為発生胚の作出方法を包含する。卵子の活性化は、ストロンチウムで行うことが好ましい。具体的には、１０ｍＭのＳｒＣｌ２を含むＭ１６培地で培養して活性化させることができる。また、電気パルスやエタノール等によっても卵子を活性化することが出来る。体外発生培養は、５％ＣＯ２、５％Ｏ２、９０％Ｎ２の気相、３７〜３９℃の条件で行うことができる。
【００２４】
（単為発生哺乳動物の作出）
本発明は、上記単為発生胚を哺乳動物の子宮に移植し成長させることからなる単為発生哺乳動物の作出方法を包含する。移植する哺乳動物としては、特に制限されるものではないが、人工授精させた後の妊娠初期にプロスタグランジンＦ２α等を用いて人工流産させ、同期化を行った哺乳動物を用いることが好ましい。哺乳動物としては、マウス、豚、牛ヒツジ、ヤギ、ラット、ウサギ等の非ヒト哺乳動物が好ましい。
【実施例】
【００２５】
以下、実施例により本発明を説明する。実施例では、哺乳動物としてマウスを用いた。
【００２６】
実施例１
（ｎｇ卵子の採取）
標的遺伝子組換え法(Methods in Enzymology 225:803-890,1993)によりＨ１９遺伝子（３ｋｂ）およびその上流（１０ｋｂ）を合わせて１３Ｋｂ（Ｈ１９遺伝子および領域Ａ）を欠損したマウス(Leighton et al.,Nature375:34-39,1995)およびＤｌｋ１−Ｇｔｌ２発現調節領域（領域Ｂ、長さ４．１５Ｋｂ、Ｇｔｌ２遺伝子上流）を欠損したマウス(Schmidt,J.V.et al,Genes Dev.14,1997-2002,2000)を交配して得られた雌の生後１日の新生仔の卵巣を採取した。採取した卵巣を０．０２％ＥＤＴＡ溶液中に移し３７℃で１０分間培養した。ついで、注射針にて卵巣を切り裂き解離してきた非成長期卵子を採取した。得られた卵子の内、領域Ａおよび領域Ｂの双方が欠損した卵子を選択しドナー用ｎｇ卵子とした。
【００２７】
（ＧＶ期卵の採取）
成熟したマウス（８〜１２週齢、Ｂ６Ｄ２Ｆ１、チャールズリバー／クレア）に妊馬絨毛性性腺刺激ホルモンを５〜７．５ＩＵ投与した後、卵巣中の発育した卵胞を２７ゲージ注射針にて裂き卵丘細胞に包まれたＧＶ期卵を採取した。卵丘細胞をピペッティングにより除去した後、ＧＶ期卵をＭ２培地（２４０μＭ ｄｂｃＡＭＰおよび５％ＦＢＳを添加）で３７℃にて２時間培養した。
【００２８】
（除核）
倒立顕微鏡にマイクロマニピュレーター（成茂社製）を取り付け実施した。まず、ＧＶ期卵の透明帯をガラスナイフを用いて１５〜２０％切断した。ついで、ＧＶ期卵を核移植用Ｍ２培地（１０μｇ／ｍｌ サイトカラシンＢ、１００ｎｇ／ｍｌ コルセミド、２４０μＭ ｄｂｃＡＭＰおよび５％ＦＢＳを添加）に移し、１５分間３７℃で培養した。顕微操作により除核ピペット（直径が２５μｍ）を透明帯の切断部から挿入し、ＧＶ期卵の核を少量の細胞質とともに除去しレシピエント卵とした。
【００２９】
（第１核移植工程）
次いで、ｎｇ卵子を移植用ピペット（直径が１５μｍ）に吸引したのち、センダイウイルス（ＨＶＪ：コスモバイオ）をピペットの先端に吸引した。ピペットをレシピエント卵の透明帯の切断部から挿入しレシピエント卵に押し付けながら注入した。得られた核移植卵を５％ ＦＣＳ添加αＭＥＭ培地に移し、炭酸ガス培養器中で３７℃にて１４時間、培養した。核移植卵は、核膜の崩壊、分裂装置の形成、減数分裂、第１極体の放出の各工程を経て、第２減数分裂中期（ＭＩＩ期）に達し、第１核移植卵を得た。
【００３０】
（第２核移植工程）
雌成熟マウス（８〜１２週齢、Ｂ６Ｄ２Ｆ１、チャールズリバー／クレア）に妊馬絨毛性性腺刺激ホルモンおよびヒト絨毛性性腺刺激ホルモンを４８時間間隔でそれぞれ５〜７．５ ＩＵ投与し、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン投与１４時間後に卵管を採取した。卵管より卵丘細胞に包まれた排卵卵子の塊を採取した後、３００μｇ／ｍｌヒアルロニダーゼを含むＭ２培地中で卵丘細胞をピペッティングにより除去した後、排卵卵子（ｆｇ卵子）を採取した。顕微操作により透明帯の一部を切断した。排卵卵子および第１核移植卵を核移植用Ｍ２培地（５μｇ／ｍｌサイトカラシンＢを添加）に移した。上述の第１核移植卵の透明帯切断部から除核用ピペット（直径２５μｍ）を挿入し、ＭＩＩ期染色体（分裂装置）を吸引した。ついで、ピペット先端にセンダイウイルスを吸引し、ｆｇ卵子の透明帯切断部にピペットを挿入して、ＭＩＩ期染色体を注入した。Ｍ２培地中に移し、３７℃で３０分間培養して両者を融合させ第２核移植卵を得た。
下記表４に核移植卵の生産効率を示す。
【００３１】
【表４】
【００３２】
実施例２
（単為発生胚の作出）
得られた２３８個の第２核移植卵を、１０Ｍ塩化ストロンチウムを含むＭ１６培地にて３７℃で３時間培養し、人為的に卵子の活性化を誘起させた。その結果２２１個の卵子が活性化され、それらをＭ１６培地にて３７℃で３日間体外培養した。その結果、２０６個の胚盤胞が作出された。
【００３３】
実施例３
（単為発生マウスの作出）
得られた２０６個の胚盤胞を偽妊娠２．５日目の雌マウス（定法に従い、精管結紮雄交配させ膣栓を確認した日を偽妊娠０．５日目とした雌マウス）の子宮に移植したところ、１４匹の正常雌産子が誕生し、すべて成体にまで発育した。したがって、作出効率は７％と高率である。これらの遺伝子を解析した結果、Ｈ１９−ＩＧＦ２遺伝子およびＧＴＬ−ＤＬＫ１遺伝子の発現調節メチル化領域（領域ＡおよびＢ）の欠損をそれぞれヘテロに持つことが確認できたことから、第２核移植卵由来の産子であることが確認された。
これら１４匹の単為発生マウスうち５匹に関して繁殖能力を調べた結果、試験した全ての単為発生マウスは正常に交配、妊娠および出産することが判明し、正常な繁殖能力を持つことが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００３４】
本発明によれば、卵子由来の半数ゲノムを２セット有する成体の単為発生哺乳動物が作出できる。かかる哺乳動物は遺伝子の働きを解析する実験用動物として有用である。本発明によれば、作出される哺乳動物は全て雌なので、例えば、優秀な遺伝子を有し遺伝的に均一な乳牛を効率よく生産することが可能となる。また、優れた肉牛を作出する雌牛を効率よく生産することが可能となる。このように本発明は畜産業において利用が期待される。本発明により単為発生哺乳動物を作出する場合は非ヒト哺乳動物を主たる対象とするが、本発明は医療分野における移植用の臓器の生産にも応用することが期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】発明の核移植卵を作出する方法の概略を示した図である。
【００３６】
【図２】本発明より得られた単為発生マウスとその産子の写真である。
【符号の説明】
【００３７】
ａ：新生児由来ｎｇ卵子
ｂ：成熟雌由来ｆｇ卵子
ｃ：核移植
ｄ：体外成熟培養
ｅ：成熟した核置換卵子
ｆ：排卵卵子
ｇ：ＭＩＩ期分裂装置の移植
ｈ：卵子の人為的活性化
ｉ：再構築されたｎｇ／ｆｇ単為発生胚
ａ〜ｅは、本発明の第１核移植工程に対応する。ｆ〜ｉは、本発明の第２核移植工程に対応する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物の核移植卵を作出する方法であって、
（１）除核した卵核胞期卵（ＧＶ期卵）に、非成長期卵（ｎｇ卵子）を導入した後、体外成熟培養しＭＩＩ期（第２減数分裂中期）まで移行させ第１核移植卵とする工程、
（２）該第１核移植卵からＭＩＩ期染色体を取り出し、別のＭＩＩ期卵（ｆｇ卵子）に導入し第２核移植卵とする工程、
からなる、ｎｇ卵子由来の半数体ゲノムセットおよびｆｇ卵子由来の半数体ゲノムセットを有する核移植卵を作出する方法において、ｎｇ卵子またはｆｇ卵子として、（Ａ）Ｈ１９遺伝子およびＩｇｆ２遺伝子の発現を制御するＤＮＡメチル化インプリント領域（領域Ａ）並びに（Ｂ）Ｇｔｌ２遺伝子およびＤｌｋ１遺伝子の発現を制御するＤＮＡメチル化インプリント領域（領域Ｂ）の双方を欠損する卵子を用いることを特徴とする、前記核移植卵の作出方法。
【請求項２】
非成長期卵（ｎｇ卵子）は、新生仔の卵母細胞である請求項１記載の方法。
【請求項３】
別のＭＩＩ期卵（ｆｇ卵子）は、排卵卵子である請求項１記載の方法。
【請求項４】
領域Ａおよび領域Ｂの双方を欠損する卵子は、遺伝子欠損哺乳動物由来である請求項１記載の方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法で得られた第２核移植卵を活性化処理した後、体外発生培養することからなる単為発生胚の作出方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法で得られた単為発生胚を哺乳動物の子宮に移植し成長させることからなる単為発生哺乳動物の作出方法。
【請求項１】
哺乳動物の核移植卵を作出する方法であって、
（１）除核した卵核胞期卵（ＧＶ期卵）に、非成長期卵（ｎｇ卵子）を導入した後、体外成熟培養しＭＩＩ期（第２減数分裂中期）まで移行させ第１核移植卵とする工程、
（２）該第１核移植卵からＭＩＩ期染色体を取り出し、別のＭＩＩ期卵（ｆｇ卵子）に導入し第２核移植卵とする工程、
からなる、ｎｇ卵子由来の半数体ゲノムセットおよびｆｇ卵子由来の半数体ゲノムセットを有する核移植卵を作出する方法において、ｎｇ卵子またはｆｇ卵子として、（Ａ）Ｈ１９遺伝子およびＩｇｆ２遺伝子の発現を制御するＤＮＡメチル化インプリント領域（領域Ａ）並びに（Ｂ）Ｇｔｌ２遺伝子およびＤｌｋ１遺伝子の発現を制御するＤＮＡメチル化インプリント領域（領域Ｂ）の双方を欠損する卵子を用いることを特徴とする、前記核移植卵の作出方法。
【請求項２】
非成長期卵（ｎｇ卵子）は、新生仔の卵母細胞である請求項１記載の方法。
【請求項３】
別のＭＩＩ期卵（ｆｇ卵子）は、排卵卵子である請求項１記載の方法。
【請求項４】
領域Ａおよび領域Ｂの双方を欠損する卵子は、遺伝子欠損哺乳動物由来である請求項１記載の方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法で得られた第２核移植卵を活性化処理した後、体外発生培養することからなる単為発生胚の作出方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法で得られた単為発生胚を哺乳動物の子宮に移植し成長させることからなる単為発生哺乳動物の作出方法。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２００９−５６４９（Ｐ２００９−５６４９Ａ）
【公開日】平成２１年１月１５日（２００９．１．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−１７１７０７（Ｐ２００７−１７１７０７）
【出願日】平成１９年６月２９日（２００７．６．２９）
【出願人】（５９８０９６９９１）学校法人東京農業大学 (85)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１月１５日（２００９．１．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年６月２９日（２００７．６．２９）
【出願人】（５９８０９６９９１）学校法人東京農業大学 (85)
【Ｆターム（参考）】
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