核酸の発現を改善するための新規配列
本発明は、ホスト細胞において核酸の発現を改善するのに有用な、新規な抗リプレッサー要素を提供するものである。関心のあるタンパク質を産生するための新規な抗リプレッサー要素の使用方法も提供される。本発明は抗リプレッサー要素を有する発現カセットの新たな構造も提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は分子生物学及び生命工学の分野に関するものである。特に、本発明はホスト細胞においてタンパク質をコードしうる１つ以上の核酸の生成を改善する手段及び方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質を様々なホスト細胞内において生成し、生物及び生命工学において、例えば生物薬剤として、幅広い範囲にわたって利用することができる。このような生成方法は十分に確立されており、関心のあるタンパク質をコードする核酸（「トランスジーン」とも呼ばれる）をホスト細胞において発現することが一般に必要となる。
【０００３】
トランスジーンの発現に関連した問題の一つに、遺伝子サイレンシングによりトランスジーンが不活性化する頻度が高いために（ＭｃＢｕｒｎｅｙ ｅｔ ａｌ．， ２００２）、トランスジーンの発現が予測不可能であり、このためトランスジーンを高度に発現するためには多くのホスト細胞クローンを試験する必要がある、ということがある。更に、そのようなクローンを一度確立しても、トランスジーンの発現はしばしば不安定であり、長期間ホスト細胞を培養する間にはトランスジーン発現のサイレンシングは一般的に観察される現象である。脊椎動物細胞において、このような現象はトランスジーン遺伝子座におけるヘテロクロマチン形成によって引き起こされうるものであり、トランスジーンの転写が阻害される（Ｗｈｉｔｅｌａｗ ｅｔ ａｌ．， ２００１）。トランスジーンサイレンシングは確率論的なものである。即ち、トランスジーンがゲノムに組み込まれた直後、又は多数の細胞分裂後のみに生じうるものである。このことにより長期間培養した後に不均一な細胞集団が生じ、この細胞集団において、高レベルの組換えタンパク質を発現する細胞もあれば、低レベル又は検出不可能なレベルでタンパク質を発現する細胞もある（Ｍａｒｔｉｎ ＆ Ｗｈｉｔｅｌａｗ， １９９６， ＭｃＢｕｒｎｅｙ ｅｔ ａｌ．， ２００２）。不均一なタンパク質生成に用いる細胞株は単一の細胞に由来しているが、しばしば大規模化されており、長期間にわたって維持されており、１，０００リットル以上の培地中でｍｌ当たり１０００万細胞を超える細胞密度となっている。このような大きな細胞集団（１０１４−１０１６細胞）はトランスジーンサイレンシングにより生産性が大きく低下してしまいやすい（Ｍｉｇｌｉａｃｃｉｏ ｅｔ ａｌ．， ２０００， Ｓｔｒｕｔｚｅｎｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９９）。
【０００４】
上記の問題を解決する可能性の一つに発現系においていわゆるＳＴＡＲ配列を用いる、というものがある。このようなＳＴＡＲ配列の様々なものがＷＯ ０３／００４７０４に記載されている。これらの配列は、様々なホスト細胞における発現コンストラクトを用いたタンパク質生成の予測可能性、収率又は安定性のいずれか又は任意の組み合わせを改善することができる（ＷＯ ０３／００４７０４；Ｋｗａｋｓ ｅｔ ａｌ．， ２００３）。
【０００５】
国際公開ＷＯ ０３／１０６６７４には様々な細胞株において組換えタンパク質をコードする核酸を発現するためのＳＴＡＲ配列の利用が記載されている。
【０００６】
国際公開ＷＯ ０３／１０６６８４には抗体のような多量体タンパク質をコードする核酸を発現するためのＳＴＡＲ配列の利用が記載されている。
【０００７】
本発明はタンパク質生成を改善するための別の手段及び方法を提供することを目的とするものである。
【発明の開示】
【０００８】
発明の概要
ある実施態様において、本発明は、ａ）配列番号６６，ｂ）配列番号６６の断片であって、抗リプレッサー活性を有する前記断片、ｃ）ヌクレオチド配列についてａ）又はｂ）に少なくとも７０％相同な配列であって、抗リプレッサー活性を有する前記配列、並びにｄ）ａ）〜ｃ）の任意の１つの相補体、よりなるグループから選択された抗リプレッサー活性を有する核酸配列を有する組換え核酸分子を提供し、前記組換え核酸分子は更に発現カセットを有しており、前記発現カセットは関心のある核酸と連結した異種プロモーターを有しており、関心のある前記核酸は好ましくは関心のあるタンパク質の全長又は一部をコードしている。好ましい実施態様において、抗リプレッサー活性を有する前記核酸配列は前記発現カセット内で前記プロモーターの上流に位置しており、特に好ましい実施態様において、抗リプレッサー活性を有する前記配列及び前記プロモーターは２ｋｂ未満離れている。特定の実施態様において、関心のあるタンパク質をコードする前記核酸は更に選択可能なマーカー遺伝子をコードする多シストロン遺伝子内に存在する。特定の実施態様において、前記分子は抗リプレッサー活性を有する少なくとも一つの他の配列を更に有しており、前記少なくとも一つの他の配列はａ）配列番号１〜６５のいずれか、ｂ）配列番号１〜６５のいずれかの断片であって、抗リプレッサー活性を有する前記断片、ｃ）ヌクレオチド配列についてａ）又はｂ）に少なくとも７０％相同な配列であって、抗リプレッサー活性を有する前記配列、並びにｄ）ａ）〜ｃ）の任意の１つの相補体、から選択されたものである。本発明は又、５‘−抗リプレッサー配列Ａ−プロモーター−関心のあるタンパク質の全長又は一部をコードする核酸−抗リプレッサー配列Ｂ−３’を含む発現カセットを有する核酸分子を提供するものであって、抗リプレッサー配列Ａ及びＢは同じものであっても異なるものであってもよく、（ｉ）配列番号１〜６５のいずれか、（ｉｉ）配列番号１〜６５のいずれかの断片であって、抗リプレッサー活性を有する前記断片、（ｉｉｉ）ヌクレオチド配列についてａ）又はｂ）に少なくとも７０％相同な配列であって、抗リプレッサー活性を有する前記配列、並びにｉｖ）（ｉ）〜（ｉｉｉ）の任意の１つの相補体であって、前記発現カセットは更に前記抗リプレッサー配列ＡとＢの間にａ）配列番号６６，ｂ）配列番号６６の断片であって、抗リプレッサー活性を有する前記断片、ｃ）ヌクレオチド配列についてａ）又はｂ）に少なくとも７０％相同な配列であって、抗リプレッサー活性を有する前記配列、並びにｄ）ａ）〜ｃ）の任意の１つの相補体、よりなるグループから選択された抗リプレッサー活性を有する配列を有するという特徴を備えている。
【０００９】
本発明は更に本発明に従う分子を有する細胞を提供する。好ましくは、前記細胞は哺乳類細胞であって、特定の実施態様において前記細胞はＣＨＯ細胞である。
【００１０】
本発明は更に関心のあるタンパク質を生成する方法を提供するものであり、この方法は関心のあるタンパク質をコードする組換え核酸分子を有する細胞を培養して前記細胞内で関心のあるタンパク質をコードする前記核酸を発現させるステップを有しており、前記組換え核酸分子はａ）配列番号６６，ｂ）配列番号６６の断片であって、抗リプレッサー活性を有する前記断片、ｃ）ヌクレオチド配列についてａ）又はｂ）に少なくとも７０％相同な配列であって、抗リプレッサー活性を有する前記配列、並びにｄ）ａ）〜ｃ）の任意の１つの相補体、よりなるグループから選択された抗リプレッサー活性を有する核酸配列を有するという特徴を備えている。好ましい実施態様において、この方法は関心のある前記タンパク質を単離するステップを更に有する。好ましい実施態様において、抗リプレッサー活性を有する前記核酸配列は、関心のあるタンパク質の発現を制御するプロモータの上流に位置している。その好ましい実施態様において、抗リプレッサー活性を有する前記配列と前記プロモーターは２ｋｂ未満離れている。特定の実施態様において、関心のあるタンパク質をコードする前記核酸は更に選択可能マーカー遺伝子をコードする多シストロン遺伝子内に存在する。特定の実施態様において、前記細胞は哺乳類細胞、例えばＣＨＯ細胞である。
【００１１】
本発明は又、ａ）配列番号６６，ｂ）配列番号６６の断片であって、抗リプレッサー活性を有する前記断片、ｃ）ヌクレオチド配列についてａ）又はｂ）に少なくとも７０％相同な配列であって、抗リプレッサー活性を有する前記配列、並びにｄ）ａ）〜ｃ）の任意の１つの相補体、よりなるグループから選択された抗リプレッサー活性を有する核酸配列の使用方法を提供し、関心のある核酸の発現を増加させる。
【００１２】
更に他の態様において、本発明は関心のある２種類のポリペプチドを発現するホスト細胞を生成する方法を提供する。この方法は、ａ）ホスト細胞内に１種類以上の核酸分子を導入するステップであって、この又はこれらの核酸分子はすべて、（ｉ）第１の関心のあるポリペプチドをコードする配列及び第１の選択可能マーカー遺伝子に機能的に連結したプロモーター、（ｉｉ）第２の関心のあるポリペプチドをコードする配列及び第２の選択可能マーカー遺伝子に機能的に連結したプロモーター、並びに（ｉｉｉ）ａ）配列番号１〜６６，ｂ）配列番号１〜６６の断片であって、抗リプレッサー活性を有する前記断片、ｃ）ヌクレオチド配列についてａ）又はｂ）に少なくとも７０％相同な配列であって、抗リプレッサー活性を有する前記配列、並びにｄ）ａ）〜ｃ）の任意の１つの相補体、よりなるグループから選択された少なくとも１つの抗リプレッサー活性を有する配列、を有している上記ステップ、及びｂ）前記第１及び第２の選択可能マーカー遺伝子についてほぼ同時に選択することによりホスト細胞を選択するステップを有する。本発明は又、関心のある２種類のポリペプチドを発現する方法を提供するものであり、この方法は本発明のこの観点に従う方法により得られたホスト細胞を培養して前記第１及び第２のポリペプチドを発現させるステップと、任意で前記ポリペプチドを単離するステップとを有する。ある実施態様において、抗リプレッサー活性を有する前記配列は、ａ）配列番号６６、ｂ）配列番号６６の断片であって、抗リプレッサー活性を有する前記配列、ｃ）ａ）又はｂ）に少なくとも７０％相同な配列であって、抗リプレッサー活性を有する前記配列、並びにｄ）ａ）〜ｃ）の任意の１つの相補体、よりなるグループから選択される。特定の実施態様において、前記２種類のポリペプチドは多量体タンパク質の一部である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
発明の詳細な説明
抗リプレッサー配列
本明細書に用いる抗リプレッサー活性を有する配列とは、ＨＰ１又はＨＰＣ２タンパク質の抑制効果を、これらのタンパク質をＤＮＡに結合させた際に少なくとも部分的に拮抗することができる配列である。本発明に好適な抗リプレッサー活性を有する配列（本明細書において抗リプレッサー配列又は抗リプレッサー要素と称することもある）は本明細書に参考として組み込んだＷＯ ０３／００４７０４に開示されており、ここでは「ＳＴＡＲ」配列という新しい言葉が作られている。（本明細書内においてある配列がＳＴＡＲ配列と呼ばれる場合には必ず、この配列は本明細書に従う抗リプレッサー活性を有する）限定されない具体例として、ＳＴＡＲ１〜６５（ＷＯ ０３／００４７０４参照）と名付けられた６５種類の抗リプレッサー要素の配列は本明細書においてはそれぞれ配列番号１〜６５として示されている。
【００１４】
本明細書に従って、所与の抗リプレッサー要素の機能的断片又は誘導体は、まだ抗リプレッサー活性を有している場合には、前記抗リプレッサー要素に相当すると考えられる。このような抗リプレッサー活性の有無は当業者により、例えば以下に記載した分析により容易に確認することができる。機能的断片又は誘導体は、分子生物学の当業者により、所与の抗リプレッサー配列から始め、欠失、付加、置換、転座などを行うことにより容易に得られる（例えば、ＷＯ ０３／００４７０４参照）。機能的断片又は誘導体は又、他の生物種からのオルソログを有しており、これは既知の抗リプレッサー配列を用いて当業者により知られている方法により見いだすことができる（例えば、ＷＯ ０３／００４７０４参照）。従って、本発明は抗リプレッサー配列の断片も含むものであって、前記断片はまだ抗リプレッサー活性を有している。所与の配列の断片について、相同率とは断片中に存在する参照とする元々の配列の割合のことを示す。ヌクレオチド配列について抗リプレッサー活性を有する前記配列に対して又は抗リプレッサー活性を有する配列の機能的断片に対して少なくとも７０％相同な配列についても、少なくとも７０％が相同なこれらの配列が本発明に従う抗リプレッサー活性を有する限り、本発明に含まれるものである。好ましくは、前記配列は参照とする元々の配列又はその機能的断片に対して少なくとも８０％が相同であり、更に好ましくは、少なくとも９０％が相同であり、より一層好ましくは少なくとも９５％が相同である。
【００１５】
本発明に従う抗リプレッサー活性を有する配列は様々な方法により得ることができるものであり、そのような方法にはヒトゲノム又は他の生物のゲノムからクローニングする、又は例えば配列がわかっていることを利用して既知の抗リプレッサー配列を直接そのようなゲノムから例えばＰＣＲにより増幅する、という方法が含まれるがこれらに限定されるものではなく、又は部分的に又は全長を化学的に合成することができる。
【００１６】
抗リプレッサー活性を有する配列並びにその機能的断片又は誘導体は本明細書においてその配列により構造的に定義され、加えて抗リプレッサー活性を有する配列として機能的に定義され、このような抗リプレッサー活性は以下に記載する分析により測定することができる。
【００１７】
本発明に従う抗リプレッサー活性を有するいかなる配列も少なくとも以下の機能的分析を通過することができなければならない（本明細書に参考として示したＯ ０３／００４７０４実施例１を参照）。ヒトＵ−２ ＯＳ細胞（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−９６）には、Ｔｅｔ−Ｏｆｆ転写制御システムの制御下で、ｐＴｅｔ−Ｏｆｆプラスミド（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｋ１６２０−Ａ）並びに、ＬｅｘＡ ＤＮＡ結合ドメイン及びＨＰ１又はＨＰＣ２（ＤＮＡに結合した際に遺伝子発現を抑制するショウジョウバエポリコームグループタンパク質；いずれかの融合タンパク質により分析がうまくいく）のいずれかのコード領域を含むＬｅｘＡ−リプレッサー融合タンパク質をコードする核酸を安定してトランスフェクションされる（Ｇｏｓｓｅｎ ａｎｄ Ｂｕｊａｒｄ， １９９２）。これらの細胞は以下で抗リプレッサー活性分析のレポーター細胞として称される。レポータープラスミドは、ハイグロマイシン抵抗性を提供するものであって、４つのＬｅｘＡ作用部位とゼオシン抵抗性遺伝子を制御するＳＶ４０プロモーターとの間にポリリンカー配列を有する。抗リプレッサー活性を試験する配列は前記ポリリンカー内にクローン化することができる。ｐＳｅｌｅｃｔのような好適なレポータープラスミドの作製は実施例１及びＷＯ ００／００４７０４の図１に記載されている。レポータープラスミドをレポーター細胞にトランスフェクションし、細胞をハイグロマイシン選択（２５μｇ／ｍｌ；レポータープラスミドの存在を選択する）及びテトラサイクリン抑制（ドキシサイクリン、１０ｎｇ／ｍｌ；ＬｅｘＡ−リプレッサー融合タンパク質の発現を阻害する）下で培養する。これらの条件下で１週間成長させた後、ドキシサイクリン濃度を０．１ｎｇ／ｍｌ（又は未満）まで下げてＬｅｘＡ−リプレッサー遺伝子を誘導し、２日後にゼオシンを２５０μｇ／ｍｌになるように加える。細胞を５週間、コントロール培養物（空レポータープラスミド、即ち、クローン化した抗リプレッサー配列をポリリンカー内に欠いたものでトランスフェクトされた）がゼオシンにより死滅するまで培養する（このコントロールプラスミドにおいて、ＳＶ４０プロモーターはＬｅｘＡ作用部位に結合するＬｅｘＡ−リプレッサー融合タンパク質により抑制されており、そのような細胞においてはゼオシン発現が不十分でありゼオシン選択で生存することができる）。配列が本発明に従う抗リプレッサー活性を有するとするのは、前記配列をレポータープラスミド内にクローン化した際に、レポーター細胞がゼオシン存在下の５週間の選択後も生存した場合である。このようなコロニーからの細胞は５週間のゼオシン選択後にゼオシンを含有する新たな培地でもまだ増殖することができるが、抗リプレッサー配列を持たないレポータープラスミドをトランスフェクションした細胞はゼオシンを含有する新たな培地では増殖することはできない。この分析においてゼオシン下において５週間後のこのような成長をさせることができない配列はいずれも、本発明に従う抗リプレッサー活性を有する配列、又はその機能的断片若しくは機能的誘導体としては認められない。例えば、ショウジョウバエｓｃｓ（Ｋｅｌｌｕｍ ａｎｄ Ｓｃｈｅｄｌ， １９９１）、トリβ−グロブリン遺伝子座の５‘−ＨＳ４（Ｃｈｕｎｇ ｅｔ ａｌ， １９９３， １９９７）又は基質接着領域（ＭＡＲｓ）（Ｐｈｉ-Ｖａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９０）といった、Ｖａｎ ｄｅｒ Ｖｌａｇら（２０００）により試験された既知の境界配列は、この分析では生存しない。
【００１８】
加えて、前記レポーター遺伝子が抗リプレッサー配列に隣接していない、又はショウジョウバエｓｃｓのようなより弱い抑制ブロッキング配列に隣接していない場合と比べ、Ｕ−２ ＯＳ又はＣＨＯ細胞のゲノムに組み込まれているレポーター遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ、ＧＦＰ）に隣接している場合には、抗リプレッサー配列又はその機能的断片若しくは誘導体がクローンを過剰発現しているレポーターがより高い割合を示すのが好ましい。このことはＷＯ ０３／００４７０４の実施例１及び図２に記載されているように、例えばｐＳＤＨベクター又は同様のベクターを用いることにより確認することができる。
【００１９】
本発明の抗リプレッサー要素はタンパク質の産生について、（１）ホスト細胞株が工業的に許容可能なレベルのタンパク質を発現していると同定できる予測可能性を向上させる、（２）ホスト細胞株のタンパク質収量を増加させる、および／または（３）ホスト細胞株が長期間の培養中により安定してタンパク質を産生する、の３つのうち少なくとも１つの結果を有することができる。各特性については以下に詳細を記す。
【００２０】
（１）予測可能性の向上：トランス遺伝子発現カセットの組込みはホスト細胞ゲノム内でランダムな位置で起こりうる。しかし、ゲノムの多くは転写されないヘテロクロマチンである。発現カセットがトランス遺伝子に隣接する抗リプレッサー要素を有している場合、その位置に組み込むことにより発現に対する効果が減弱される。抗リプレッサー要素は隣接するヘテロクロマチンがトランス遺伝子を不活化できなくさせる。結果として、許容可能な発現レベルを有しているトランス遺伝子を含んでいるホスト細胞の割合が増える。実際抗リプレッサー配列を組み込むことにより、等量のＤＮＡをトランスフェクションした場合、抗リプレッサー配列を有していない同一のトランス遺伝子と比べて、最大１０倍のコロニーが確立された。
【００２１】
（２）収量：組換えホスト細胞のはじめの集団におけるタンパク質の発現レベルを、トランス遺伝子を組み込んだ直後に調べた。集団における個々のクローンの発現レベルは様々である。しかし、トランス遺伝子が抗リプレッサー要素により保護されている場合には、そのばらつきは小さくなっている。このようなばらつきの減少は、発現レベルの低いより少ないクローンを回収した際に最も顕著となる。更に、抗リプレッサー要素を有する集団では一般に個々のクローンが顕著に高い発現を示していた。これらの高い収量のクローンは、タンパク質を回収する目的で、又は細胞又はそのような細胞を有する生物体の表現型を変える目的でタンパク質を産生するのに好ましい。
【００２２】
（３）安定性の向上：抗リプレッサー要素は、トランス遺伝子が長期間の培養中に転写が抑制されないようにすることにより、組換えホスト細胞株におけるトランス遺伝子の安定性を向上する。比較試験において、抗リプレッサー要素により保護されていないトランス遺伝子が徐々に抑制されていく条件下（培養中、５〜２５回継代）では、抗リプレッサー要素に保護されたトランス遺伝子は高いレベルで発現を維持した。このことは、細胞培養が数週間から何ヶ月という長期間にわたるたんぱく性分子の工業生産においては利点となる。同様に、長期間にわたる発現の安定性は、抗リプレッサー保護トランス遺伝子の組み換え発現により表現型が変化した植物又は動物において利点となりうる。
【００２３】
ＳＴＡＲ６７
本発明は抗リプレッサー活性を有し、ＳＴＡＲ６７（配列番号６６）と新たに命名された新規配列を提供する。この抗リプレッサー配列は、本明細書に示した実施例より明らかなように、関心のある遺伝子の発現を誘導するプロモーターの上流におかれた場合にのみ発現を顕著に向上させる。これに対し、ＳＴＡＲ６又はＳＴＡＲ７といったこれまで知られた抗リプレッサー配列はこの点において有利ではない（これらはトランス遺伝子に隣接している場合、即ち、トランス遺伝子の上流及び下流の両方に存在する場合に、特によく機能する）。従って、ＳＴＡＲ６７はすでに知られている抗リプレッサー配列の代わりとなり、このような既知の抗リプレッサー配列と比べてプロモーターの上流においた場合には利点を増強するように思われる。ＳＴＡＲ６７はエンハンサーブロッカーではなく、このことはこの特性について試験した他の抗リプレッサー配列とは対照的であり（Ｋｗａｋｓ ｅｔ ａｌ， ２００３）、ＳＴＡＲ６７とこれまで開示された他の抗リプレッサー配列とのもう一つの違いとなる。或いは又、ＳＴＡＲ６７は実施例７に示すとおり両方向性に作用することができる。本発明に従って、ＳＴＡＲ６７配列が発現カセット内に存在することにより、発現の予想可能性および／または収量および／または安定性が改善する。本明細書において、ＳＴＡＲは様々なプロモーターとの組み合わせにおいて、様々な細胞株において機能を有することが示されている。
【００２４】
発現カセット
本発明に記載のＳＴＡＲ６７を有する核酸分子は任意の形態をとることが可能であり、例えばＤＮＡ断片として、必要に応じてプラスミドのような、好ましくは発現ベクターのようなクローニングベクター上に存在しており、例えば標準的な組換えＤＮＡ技術を用いてクローニングする目的で用いることができる。本発明の好ましい実施態様において、核酸は発現カセットを有しており、これは例えばホスト細胞において関心のある配列を発現するのに有用である。
【００２５】
本明細書において用いる発現カセットとは、発現を期待する配列に機能的に連結したプロモーターを少なくとも有する核酸配列であり、この発現を期待する配列は好ましくは関心のあるタンパク質の全長又は一部をコードするオープンリーディングフレームである。プロモーターは関心のある前記核酸について異種のプロモーターであり、これによりこの異種のプロモーターは関心のある前記配列の天然のプロモーターではないプロモーターとして定義される。言い換えれば、例えば分子クローニングのようなある形での人間の介入をいずれかの時点で関心のある核酸と異種のプロモーターとの機能的な組み合わせをなすために用いるものであり、この関連から、異種のプロモーターを関心のある配列と同じ又は異なる生物体から得られるということが容易に理解されるであろう。好ましくは、発現カセットは更に転写集結及びポリアデニル化配列を有する。エンハンサーのような他の制御配列も含むことができる。本発明に従う発現単位は更に、ＳＴＡＲ６７のような抗リプレッサー配列を少なくとも１つ有する。特定の好ましい実施態様において、前記抗リプレッサー配列、好ましくはＳＴＡＲ６７は前記プロモーターの上流に位置しており、好ましくは抗リプレッサー配列の３‘末端とプロモーター配列の開始点の間には２ｋｂ未満存在するようになっている。好ましい実施態様において、１ｋｂ未満、より好ましくは５００ヌクレオチド（ｎｔ）未満、更により好ましくは約２００、１００、５０又は３０ｎｔ未満が、好ましくは抗リプレッサー配列の３‘末端とプロモーター配列の開始点の間に存在する。特定の好ましい実施態様において、抗リプレッサー配列はプロモーターの上流に直接クローニングされており、好ましくは抗リプレッサー配列の３‘末端とプロモーター配列の開始点の間には約０〜２０ｎｔしか存在しない。
【００２６】
組換えタンパク質をコードする核酸配列の発現を得るために、そのような発現を誘導することのできる配列を、タンパク質をコードする核酸配列に機能的に連結することができ、これにより組換えタンパク質をコードする組換え核酸配列が発現可能な形態となる、ということが当業者に周知されている。一般に、プロモーター配列は関心のあるタンパク質の上流に位置している。有用な発現ベクターは当該技術分野にて入手可能であり、例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のｐｃＤＮＡ及びｐＥＦ、ＢＤ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社のｐＭＳＣＶ及びｐＴＫ−Ｈｙｇ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社のｐＣＭＶ−Ｓｃｒｉｐｔなどがある。
【００２７】
関心のあるポリペプチドをコードする配列がコードするポリペプチドの転写及び翻訳を制御する配列に関して適切に挿入されている場合、できあがる発現カセットは、発現に関して、関心のあるタンパク質を産生するのに有用なものとなる。発現を誘導する配列には、プロモーター、エンハンサーなど、及びこれらの組み合わせが含まれうる。これらはホスト細胞内で機能し、それによって機能的に連結した核酸配列の発現を誘導することができる。当業者であれば、様々なプロモーターをホスト細胞において関心のあるタンパク質の発現を得るために用いることができる、ということを知っている。プロモーターは構成性であっても調節性であってもよく、ウイルス、原核生物、真核生物を含む様々なものに由来するものであっても、人工的に設計されたものであっても良い。関心のある核酸の発現は本来のプロモーター又はその誘導体に由来しても、完全に異種のプロモーターに由来してもよい（Ｋａｕｆｍａｎ， ２０００）。よく知られており、真核細胞における発現のためによく用いられるプロモーターには、例えばＥＩＡプロモーターなどのアデノウイルスのようなウイルスに由来するプロモーター、ＣＭＶ極早期（ＩＥ）プロモーター（本明細書においてＣＭＶプロモーターと称する）（例えば、ｐｃＤＮＡとしてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から入手可能）のようなサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）由来のプロモーター、Ｓｉｍｉａｎウイルス４０（ＳＶ４０）由来のプロモーター（Ｄａｓ ｅｔ ａｌ， １９８５）などがある。好適なプロモーターはメタロチオネイン（ＭＴ）プロモーター、伸長因子１ａ（ＥＦ−１α）プロモーター（Ｇｉｌｌ ｅｔ ａｌ．、 ２００１）、ユビキチンＣ又はＵＢ６プロモーター（Ｇｉｌｌ ｅｔ ａｌ．、 ２００１； Ｓｃｈｏｒｐｐ ｅｔ ａｌ．、 １９９６）、アクチンプロモーター、免疫グロブリンプロモーター、熱ショックプロモーターなどのような、真核生物に由来するものであっても良い。真核細胞における発現を得るのに好ましいプロモーターには、これらは本発明に好適なプロモーターであるのだが、ＣＭＶプロモーター、哺乳動物ＥＦ１−αプロモーター、ユビキチンＣプロモーターのような哺乳動物ユビキチンプロモーター、又はＳＶ４０プロモーター（例えば、ｐＩＲＥＳとしてカタログ番号６３１６０５にてＢＤ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社より入手可能）である。プロモーターとしての機能及びプロモーターの強さの試験は当業者にとっては日常的な事柄であり、一般には例えば、ＬａｃＺ、ルシフェラーゼ、ＧＦＰといった試験遺伝子をプロモーター配列の後部にクローニングする手順を含んでおり、テスト遺伝子の発現を試験する。もちろん、プロモーターを配列内で欠失、付加、変異により変化させ、機能を試験し、新規の減弱した、又は強化したプロモーター配列を見いだすことができる。
【００２８】
本発明に従う発現カセットは、単シストロンであっても、２シストロンであっても、又は多シストロンであっても良い。用語「２シストロン遺伝子」とは、２種類のタンパク質／ポリペプチドをコードするＲＮＡ分子を提供することができる遺伝子として定義される。用語「単シストロン遺伝子」とは、１種類のタンパク質／ポリペプチドをコードするＲＮＡ分子を提供することができる遺伝子として定義される。用語「多シストロン遺伝子」とは、２種類以上のタンパク質／ポリペプチドをコードするＲＮＡ分子を提供することができる遺伝子として定義され、２シストロン遺伝子は従って多シストロン遺伝子の定義に含まれる。本発明において用いる「遺伝子」とは染色体ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、人工ＤＮＡ、これらの組み合わせなどを含みうるものであり、例えばＲＮＡのような他の核酸の形態もとりうるものである。ある実施態様において、タンパク質発現単位は多シストロン遺伝子を有している。いくつかのシストロンを有する単位は１つのｍＲＮＡとして転写される。このＲＮＡ上に存在する２番目以降のコード領域は様々なやり方で翻訳されるが、そのやり方には翻訳再開部位又は内部リボソーム侵入部位を用いるやり方があるが、後者が好まれる。２又は多シストロン単位の一つの利点は、関心のあるタンパク質又はポリペプチドをコードする核酸の下流に選択可能なマーカータンパク質をコードする核酸を配置することにより、関心のあるタンパク質を発現するクローンを簡単に選択できることである。
【００２９】
多シストロンタンパク質の産生のために、２つ以上の発現カセットを用いることができる。この実施態様は、例えば抗体の重鎖及び軽鎖の発現について良好な結果が得られることが示されている。本発明に従い、これらの発現カセットのうち少なくとも１つが、好ましくはそれぞれがＳＴＡＲ配列を有する必要がある。他の実施態様において、多シストロンタンパク質の多種のサブユニット又は部分が単一の発現カセット上に存在する。
【００３０】
発現カセット内においてプロモーターの上流に配置された抗リプレッサー配列が存在する代わりに、又はそれに加えて、抗リプレッサー配列を発現カセットの両側に配置し、トランス遺伝子を有する発現カセットに２つの抗リプレッサー配列が隣接しているようにすることは非常に有用であることが証明されている。ここで、ある実施態様において、２つのリプレッサー配列は互いにほぼ同一のものである。もちろん、このことはＳＴＡＲ６７を用いて、発現カセットが２つのＳＴＡＲ６７配列に隣接するようにすることも可能である。発現カセット内において単一のＳＴＡＲ６７配列が他の位置をとること、例えば、トランス遺伝子の後ろ、好ましくは転写終止点及びポリアデニル化シグナルの後ろであって、ＳＴＡＲ６７配列の３‘末端がトランス遺伝子に接するようにする位置をとることも可能である。
【００３１】
本発明に従う発現カセットは任意で選択マーカー遺伝子を有することができる。用語「選択マーカー又は選択可能なマーカー」とは一般に、細胞内で直接的又は間接的に存在が検出できる遺伝子および／またはタンパク質、例えば、選択薬剤を不活性化し、ホスト細胞を薬剤の致死的又は成長抑制作用から保護する遺伝子および／またはタンパク質（例えば、抗生物質抵抗性遺伝子および／またはタンパク質）のことを指すために用いられる。他の可能性として、前記選択マーカーは蛍光物質又は色素沈着（例えば、緑色蛍光タンパク質及び誘導体、ルシフェラーゼ、ｌａｃＺ、アルカリフォスファターゼなど）を誘導する。ある実施態様において、本発明に用いる選択マーカーはゼオシンであり、第２発現カセットを選択するための選択マーカーにはピューロマイシンを用いる。当業者であれば、ネオマイシン、ブラストサイジン、ピューロマイシン、ブレオマイシン、ハイグロマイシン、ｄｈｆｒなどの他の選択マーカーも入手可能であり利用することができる、ということを知っているであろう。
【００３２】
用語「選択」とは一般に選択マーカー又は選択可能なマーカー、及び選択薬剤を用いて特定の遺伝的性質を有するホスト細胞（例えば、ホスト細胞がゲノムに組み込まれたトランス遺伝子を有していること）を同定する過程として定義される。選択マーカーの多様な組み合わせが可能であることが当業者には明らかである。使用可能な抗生剤の具体例は上に記した。特に有能な抗生剤の一つはゼオシンであり、これはゼオシン抵抗性タンパク質（ゼオシン−Ｒ）が薬剤に結合することにより作用し、ゼオシンを無毒化するからである。これにより、ゼオシン−Ｒの発現が低いレベルでの細胞を殺すが、発現量の多い細胞を生存させる薬剤の量を容易に測定することができる。他の抗生物質抵抗性タンパク質はすべて一般に酵素であり、従って触媒として作用する（薬剤と１：１ではない）。２段階の選択を行う際には従って、作用がこのような１：１で結合する型の抗生物質抵抗性タンパク質を用いるのが有用である。従って、抗生物質ゼオシンは好適な選択マーカーである。簡便にするために、例えば単シストロン遺伝子で存在しうる、例えばピューロマイシン、ブラストサイジン又はハイグロマイシンと組み合わせた２段階の選択方法においてゼオシン抗生物質を用いることができる。
【００３３】
抗生物質の選択マーカーと、蛍光物質の誘導を生じる又は色素沈着を生じる選択マーカーを組み合わせることも可能である。用いる細胞で機能するならば、様々なプロモーターを用いることが可能である。
【００３４】
ある実施態様において、発現カセットに、翻訳効率が低下したタンパク翻訳開始部位の具体例として（弱い）内部リボソーム結合部位（ＩＲＥＳ）を、例えば関心のあるタンパク質のオープンリーディングフレームと選択マーカーのオープンリーディングフレームとの間に入れる。ＩＲＥＳ要素からのタンパク質の翻訳はキャップ依存的翻訳と比べて効率が低い。ＩＲＥＳ依存的オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に由来するタンパク質量は第１のＯＲＦに由来する量の２０〜５０％未満である。更に、ＩＲＥＳ要素の変異によりその活性を弱め、ＩＲＥＳ依存的ＯＲＦからの発現を第１のＯＲＦの１０％未満に減らすことができる（Ｌｏｐｅｚ ｄｅ Ｑｕｉｎｔｏ ＆ Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｓａｌａｓ， １９９８， Ｒｅｅｓ ｅｔ ａｌ．， １９９６）。ＩＲＥＳ依存的ＯＲＦが選択可能マーカータンパク質をコードしている場合、翻訳の相対的レベルが低いということは、組換えホスト細胞が選択されるためには絶対的レベルで高い転写が起こっていなければならない、ということを意味している。従って、選択された組換えホスト細胞の分離株は必ず多量のトランス遺伝子ｍＲＮＡを発現していることになる。組換えタンパク質はキャップ依存的ＯＲＦから翻訳されるので、組換えタンパク質は大量に翻訳され高収量となる。
【００３５】
従来の発現システムは、組換えプラスミド又は組換えウイルスゲノムの形態のＤＮＡ分子であった。プラスミド又はウイルスゲノムは（真核ホスト）細胞に導入され、好ましくは当該技術分野で知られる方法によりこれらのゲノムに組み込まれる。好ましい実施態様において、本発明はこのような種類のＤＮＡ分子を用いて改善されたトランス遺伝子発現システムを運ぶこともある。本発明の好ましい実施態様は、プラスミドＤＮＡを用いて発現システムを運ぶというものである。プラスミドには多くの要素が含まれ：当業者に知られている従来の要素は、プラスミドが細菌細胞内で増殖するための複製開始点及び選択可能なマーカー；真核細胞内で機能し、組み込まれたトランス遺伝子発現システムを有するホスト細胞を同定し単離する選択可能なマーカー；関心のあるタンパク質をコードしている核酸であって、その高レベルの転写が真核細胞において機能するプロモーター（例えば、ヒトサイトメガロウイルス主要極早期プロモーター又はエンハンサー、ｐＣＭＶ（Ｂｏｓｈａｒｔ ｅｔ ａｌ．， １９８５））によりもたらされるもの；並びに関心のあるトランス遺伝子及び選択可能マーカーの転写終止点（例えば、ＳＶ４０ポリアデニル化部位（Ｋａｕｆｍａｎ ＆ Ｓｈａｒｐ， １９８２））などである。用いるベクターは、ＤＮＡのクローニングに好適で関心のある核酸の転写に用いることのできるものであればいかなるベクターであっても良い。ホスト細胞をもちいる場合には、ベクターを組み込みベクターとすることが好ましい。或いは又、ベクターはエピソームとして複製するベクターとすることができる。
【００３６】
発現カセットの可能な構造の概略図を図１に示すが、これに制限されるものではない。これはプラスミドにおける発現カセットのＤＮＡ要素の構造であるとともに、ゲノムに組み込まれた後のものでもある。コンストラクトＡはタンパク質をコードする発現ユニット（遺伝子）を有する。これは弱められたＥＭＣＶ ＩＲＥＳ（Martinez-Salas et al 1999; Mizuguchi et al）及び、ゼオシン抵抗性選択可能なマーカータンパク質（ｚｅｏ）をコードするオープンリーディングフレームの上流にある。遺伝子カセットはＳＶ４０転写終止点を３‘末端に有する（ｔ）。この２シストロンのトランス遺伝子はＣＭＶプロモーターから高いレベルで転写される。コンストラクトＢはコンストラクトＡに由来するものであるが、ここではＳＴＡＲ６７がＣＭＶプロモーターの上流にクローニングされている。コンストラクトＣはコンストラクトＢに由来するが、ここでは２つの抗リプレッサー要素（この場合にはＳＴＡＲ７）が全カセットに隣接してクローニングされている。
【００３７】
発現カセットにおける抗リプレッサー配列の組み合わせ
本明細書において、プロモーターの上流の第１の抗リプレッサー配列を配置することと発現カセットに２つの他の抗リプレッサー配列を隣接させることとを組み合わせることにより、最上の結果が得られることが示されている。特に、ＣＨＯ細胞においてＳＶ４０プロモーターを用いる場合には、抗リプレッサー配列がない場合であっても発現はすでに非常に高いものとなっているが、ＳＴＡＲ６７を前記プロモーターの上流に配置し、発現カセット全体を例えばＳＴＡＲβ、ＳＴＡＲ７又はＳＴＡＲ４０のような２つの抗リプレッサー配列により隣接させた場合には、発現は大幅に増加する。
【００３８】
従って本発明の目的は、（５‘から３’へ）抗リプレッサー配列Ａ−プロモーター−関心のあるタンパク質をコードする核酸−抗リプレッサー配列Ｂ、を有する発現カセットを有する組換え核酸分子を提供することであって、前記発現カセットは更に前記抗リプレッサー配列Ａ及びＢの間に抗リプレッサー配列Ｃを有することを特徴とするものである。好ましい実施態様において、前記抗リプレッサー配列Ｃは前記プロモーターの上流に存在しており、上記のように「発現カセット」の頭に位置する構造となっている。抗リプレッサー配列Ａ及びＢの間の発現カセットは更に上記のような発現カセットのための配列、例えば転写終止配列、ポリアデニル化シグナル、選択マーカー遺伝子、エンハンサーなどを有することができ、又上記の通り単シストロンであっても、２シストロンであっても、又は多シストロンであっても良い。
【００３９】
抗リプレッサー配列Ａ、Ｂ及びＣの内２又は３つすべてが同じものであってもよく、３つすべてが異なるものであっても良い。抗リプレッサー配列Ａ及びＢは抗リプレッサー配列Ｃと同じものであっても異なるものであっても良い。ある実施態様において、抗リプレッサー配列Ａ及びＢは互いに（実質的に）同一である。ある実施態様において、抗リプレッサー配列ＣはＳＴＡＲ６７、又はその機能的断片若しくは誘導体である。抗リプレッサー配列Ａ及びＢはいかなる抗リプレッサー配列であってもよく、ある実施態様においては、配列番号１〜６５のうちの一つ、又はその機能的断片若しくは誘導体を含む。ある実施態様において、発現カセットは多シストロン遺伝子を含んでおり、なかでもその好ましい実施態様において、前記多シストロン遺伝子は関心のあるタンパク質をコードする配列及び選択マーカー遺伝子を有する。或いは又、選択マーカー遺伝子は分離したプロモーターの制御下に存在する。
【００４０】
ある実施態様において、第４の抗リプレッサー配列ＤがＳＴＡＲ配列ＡとＢの間に存在することも可能である。このような実施態様において、前記抗リプレッサー配列Ｄは好ましくは関心のあるタンパク質をコードする核酸の下流に位置する。更に、この抗リプレッサー配列Ｄは組換え核酸分子における他の抗リプレッサー配列と同じものであっても異なるものであってもよく、それはいかなる抗リプレッサー配列であってもよく、ある実施態様においては配列番号１〜６６の任意の１つ、又はその機能的断片若しくは誘導体から選択される。
【００４１】
少なくともいくつかの抗リプレッサー配列は方向性を有している可能性があるので（ＷＯ ００／００４７０４）、発現カセットに隣接する抗リプレッサー配列（抗リプレッサー配列Ａ及びＢ）は互いに反対方向に配置されており、これらの抗リプレッサー配列の各々の３‘末端が発現カセットの内側に（そして、互いの方向に）面するようになっているのが有益であろう。従って、好ましい実施態様において、抗リプレッサー要素の５’側はＤＮＡ又はクロマチンに面しており、そのトランス遺伝子への影響は前記抗リプレッサー要素により減少している。発現カセットにおいてプロモーターの上流にある抗リプレッサー要素については、３‘末端はプロモーターに面している。配列表における抗リプレッサー要素（配列番号１〜６６）の配列は特に記載がない場合には５’から３‘方向に示されている。
【００４２】
本発明に従う細胞
ＳＴＡＲ配列および／または本発明に従う発現カセットの核酸分子を、好ましくはホスト細胞において核酸の発現を改善するために用いることができる。「細胞」’Ｖ’「ホスト細胞」と「細胞株」’Ｖ’「ホスト細胞株」はそれぞれ、典型的には、当該技術分野において知られる方法により細胞培養において維持することが可能であり、異種の又は同種のタンパク質を発現する能力を有する細胞及びその均一な集団として定義される。本発明に従うホスト細胞は好ましくは真核細胞であり、より好ましくは哺乳類細胞であって、齧歯類細胞又はヒト細胞又は異なる種類の細胞を融合したものなどである。ある非限定的な実施態様において前記ホスト細胞は、Ｕ−２ ＯＳ骨肉腫、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）、ＨＥＫ２９３、ＨｕＮＳ−Ｉ骨髄腫、ＷＥＲＩ−Ｒｂ−Ｉ網膜芽細胞腫、ＢＨＫ、Ｖｅｒｏ、非分泌型マウス骨髄腫Ｓｐ２／０−Ａｇ１４、非分泌型マウス骨髄腫ＮＳＯ、ＮＣＩ−Ｈ２９５Ｒ副腎癌又はＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞である。
【００４３】
本発明のある実施態様において、ホスト細胞は少なくともアデノウイルスのＥ１Ａを、好ましくはＥ１Ｂも発現している細胞である。非限定的な具体例として、そのような細胞は例えばヒト細胞から、例えば腎臓から（例えば、ＨＥＫ２９３細胞、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ， １９７７参照）、肺から（例えば、Ａ５４９、例えば、ＷＯ ９８／３９４１１参照）若しくは網膜から（例えば、登録商標ＰＥＲ．Ｃ６で市販されているＨＥＲ細胞、米国特許第５，９９４，１２８号参照）、又は臍帯細胞から（例えば、米国特許第６，５５８，９４８号に記載のＮ５２．Ｅ６）、及び同様に他の細胞から得ることができる。このような細胞を得る方法は例えば米国特許第５，９９４，１２８号及び米国特許第６，５５８，９４８号に記載されている。本出願の目的においてＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞は、ＥＣＡＣＣ第９６０２２９４０号として寄託されている細胞の上流若しくは下流の継代由来の細胞、又は上流若しくは下流の継代由来の子孫であることを意味する。このような細胞はタンパク質を高いレベルで発現することができると言うことが以前に示されている（例えば、ＷＯ ００／６３４０３、及びＪｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ， ２００３）。
【００４４】
本発明に従う所望のタンパク質を発現しているこのようなホスト細胞は、核酸分子、好ましくは本発明に従う発現カセットの形態をとっている核酸分子を細胞に導入することにより得られる。他の実施態様において、ＳＴＡＲ６７配列を標的して染色体領域に組み込むことにより、すでにゲノムに組み込まれた関心のある遺伝子、例えば天然由来の遺伝子を、必要に応じて前記遺伝子の発現を制御するために前記遺伝子の上流に標的化した異種プロモーターの制御のもとに、発現を改善させる。
【００４５】
好ましくは、ホスト細胞は当業者に知られた標準的手順に従って選択し増殖することのできる安定なクローンに由来する。このようなクローンの培養物は、関心のある組換えタンパク質を生成することが可能である。本発明に従う細胞は好ましくは無血清培地中で懸濁培養により成長することができる。
【００４６】
本発明に従う関心のあるタンパク質はいかなるタンパク質であってもよく、単量体タンパク質であっても多量体タンパク質であっても良い。多量体タンパク質は少なくとも２種類のポリペプチド鎖を有するものである。本発明に従う関心のあるタンパク質の具体例は、それに限定されるものではないが、酵素、ホルモン、免疫グロブリン鎖、抗癌タンパク質のような治療タンパク質、第８因子のような血液凝固タンパク質、エリスロポイエチンのような多機能タンパク質、診断用タンパク質、又はワクチン用途に有用なタンパク質若しくはその断片であり、これらはすべて当業者に知られているものである。
【００４７】
ある実施態様において、本発明の発現カセットは免疫グロブリンの重鎖又は軽鎖又は抗原結合部位、これらの誘導体及び類似体のいずれか又は任意の組み合わせをコードしている。好ましい実施態様において、本発明に従うタンパク質発現ユニットが提供され、ここで前記関心のあるタンパク質は免疫グロブリン重鎖である、更に他の好ましい実施態様において、本発明に従うタンパク質発現ユニットが提供され、ここで前記関心のあるタンパク質は免疫グロブリン軽鎖である。これら２種類のタンパク質発現ユニットが同一（ホスト）細胞内に存在する場合、多量体タンパク質、より特異的には抗体が構成される。従ってある実施態様において、関心のあるタンパク質は抗体のような免疫グロブリンであり、これは多量体タンパク質である。好ましくは、このような抗体はヒトの抗体又はヒト化された抗体である。ある実施態様において、それはＩｇＧ、ＩｇＡ又はＩｇＭ抗体である。免疫グロブリンは別々の発現カセット上で重鎖と軽鎖によりコードされてもよく、又は単一の発現カセットにコードされていてもよい。ここで個々の鎖をコードする遺伝子は単シストロン転写ユニット内の別々のプロモーターにより制御されていてもよく、或いは又両方の鎖が多シストロン遺伝子上にコードされていても良い。
【００４８】
関心のあるタンパク質はいかなるものに由来するものであってもよく、ある実施態様においては、哺乳動物のタンパク質、人工タンパク質（例えば、融合タンパク質又は変異タンパク質）であり、好ましくはヒトタンパク質である。
【００４９】
明らかに、本発明の抗リプレッサー配列及び発現カセットの構造は、最終目標がタンパク質の生産ではなく、ＲＮＡそのものである場合にも用いることができる。それは例えば発現カセットからより多くのＲＮＡを生成するためであって、他の遺伝子を制御するために（例えば、ＲＮＡｉ、アンチセンスＲＮＡ）、遺伝子治療のために、試験管内でのタンパク質生成などのために使うことができる。
【００５０】
関心のあるタンパク質を生成する方法
ある態様において、本発明は関心のある配列、好ましくは関心のあるタンパク質をコードする配列を、本発明に従う核酸分子又は発現カセットをホスト細胞に提供し、この細胞を培養してこの関心のある配列を発現させることにより、発現させるための方法を提供する。
【００５１】
用語「発現」は典型的には、特定のＲＮＡ産物又は特定のタンパク質を細胞内において生成することを意味する。ＲＮＡ産物の場合には、これは転写する過程を意味する。タンパク質産物の場合には、これは転写、翻訳及び必要に応じて翻訳後修飾（例えば、糖鎖付加、ジスルフィド結合形成など）の過程を意味する。分泌タンパク質の場合には、転写、翻訳、及び必要に応じて翻訳後修飾をし、その後に分泌することを意味する。
【００５２】
細胞内で発現させる核酸の導入は、いくつかの方法のうち一つを用いて行うことができるが、この方法は当業者には知られているものであって、導入するべき核酸の形態にも依存するものである。前記方法には、トランスフェクション、感染、インジェクション、形質転換などが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００５３】
細胞を培養することにより、細胞は代謝、および／または成長、および／または分裂、および／または関心のある組換えタンパク質の生成を行うことができるようになる。これは当業者によく知られた方法で達成できるものであり、細胞に栄養を与えることが含まれるが、これに限定されるものではない。この方法には表面に接着した成長、懸濁液中での成長、又はこの組み合わせが含まれる。培養は例えばディッシュ、回転ボトル又は生物反応器内で、バッチ、栄養バッチ、還流システムのような持続的システムなどを用いて行うことができる。組換えタンパク質を細胞培養により大規模な（持続的に）生成を達成するためには、当該技術分野においては懸濁液中で成長することのできる細胞であるのが好ましく、動物若しくはヒト由来の血清、又は動物若しくはヒト由来の血清成分なしに細胞を培養できることが好ましい。
【００５４】
細胞を成長又は増殖させる条件（例えば、Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｋｒｕｓｅ ａｎｄ Ｐａｔｅｒｏｎｓ， ｅｄｉｔｏｒｓ （１９７３）参照）及び組換え産物を発現させる条件は当業者によく知られている。一般に、哺乳類細胞培養の生産性を最大化するための原理、プロトコール、及び実際の技術は、Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ ｂｉｏｔｅｃｈｏｎｏｌｏｇｙ： ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ （Ｍ． Ｂｕｔｌｅｒ， ｅｄ．， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， １９９１）に見いだすことができる。
【００５５】
好ましい実施態様において、発現したタンパク質を細胞又は培養液又は両者から回収（単離）する。このタンパク質は次に、フィルター、カラムクロマトグラフィーなどの既知の方法を用いて、当業者に一般的に知られている方法により更に精製される。
【００５６】
新規選択方法
本発明は、関心のある２種類のポリペプチドを発現しているホスト細胞を生成する新規方法を開示するものであり、この方法は、抗リプレッサー配列を用いなければほとんど又は全くコロニーが現れないのに対し、抗リプレッサー配列が存在すればコロニーは選択を生き延び、これらのコロニーは一般に２種類の関心のあるポリペプチドを高いレベルで発現している、という点で驚くべき良好な結果をもたらす（実施例７、図１１）。従って本発明は、２種類の関心のあるポリペプチドを発現しているホスト細胞を生成する方法を提供するものであって、この方法は ａ）ホスト細胞内に１種類以上の核酸分子を導入するステップであって、この又はこれらの核酸分子はすべて（ｉ）第１の関心のあるポリペプチドをコードする配列及び第１の選択可能マーカー遺伝子に機能的に連結したプロモーター、（ｉｉ）第２の関心のあるポリペプチドをコードする配列及び第２の選択可能マーカー遺伝子に機能的に連結したプロモーター、並びに（ｉｉｉ）ａ）配列番号１〜６６のいずれか１つ、ｂ）配列番号１〜６６のいずれか１つの断片であって、抗リプレッサー活性を有する前記断片、ｃ）ａ）又はｂ）に少なくとも７０％相同な配列であって、抗リプレッサー活性を有する配列、並びにｄ）ａ）〜ｃ）のいずれか１つの相補体、よりなるグループから選択された少なくとも１つの抗リプレッサー活性を有する配列、を有している上記ステップ；並びにｂ）前記第１及び第２の選択可能なマーカー遺伝子についてほぼ同時に選択することによりホスト細胞を選択するステップを有する。選択されたホスト細胞は、前記選択されたホスト細胞を培養することにより、前記２種類のポリペプチドを発現するために便利に用いることができる。ひとつの実施態様において、１つが（ｉ）を有しており、他方が（ｉｉ）を有している２つの核酸分子を、ホスト細胞内に導入するために用いることができる。この実施態様において、各核酸分子は好ましくは少なくとも１つの前記抗リプレッサー配列を含んでいる。他の実施態様において、（ｉ）及び（ｉｉ）の両方を有する単一の核酸分子を用いるが、この核酸分子はこの場合は前記抗リプレッサー配列を少なくとも１つ有していなければならない。単一核酸分子上に両者のポリペプチドをコードする領域が存在する利点の一つは、核酸を細胞に導入する前に１種類の核酸だけを調製すればよい、ということである。更にこのような実施態様においては、１回の組換え事象で両ポリペプチドのコード領域について十分であるので、これにより、第１のポリペプチドをコードする核酸が組み込まれる場所又はコピー数が第２のポリペプチドと異なっている、という可能性がなくなる。好ましい実施態様において、前記２つのポリペプチドは免疫グロブリンのような多量体タンパク質の部分を形成する。従ってこの方法は抗体の発現に特に適している。２つのプロモーターは同じものであっても異なるものであってもよく、上記のいかなるプロモーターであっても良い。１つの核酸分子が（ｉ）及び（ｉｉ）の両方を含んでいる実施態様を用いる場合には、単一の核酸分子上における２つの転写ユニットの方向は、例えば両者が同じであっても、互いに向き合う反対方向であっても、互いに外側を向いている反対方向であってもよい。後者のばあいには、抗リプレッサー配列は２つのプロモーターの間に配置することができる（例えば、図ＨＢ参照）。本発明のこの態様について１つの好適な抗リプレッサー配列は配列番号６６（実施例７参照）であるが、他の抗リプレッサー配列も同様に機能しうる。このことは当業者により本明細書の開示を用いることで容易に確かめられるものであり、従ってこの本発明のこの観点に従う他の抗リプレッサー配列を使用することも、本発明に含まれるものである。更に、抗リプレッサー配列を１つ又は両方の転写ユニットに隣接するように付加することができる。マーカー遺伝子は互いに異なるものでなくてはならず、例えば上記のマーカー遺伝子から選択することができる。ある実施態様において、一方の選択可能マーカーはゼオシンであり、他方の選択可能なマーカー例えばピューロマイシンである。しかし、他の組み合わせを用いることができることは明らかであり、それも本発明のこの観点の範囲内に含まれる。マーカーの発現は好ましくは関心のあるポリペプチドの発現に依存しているべきである。これは、マーカー遺伝子の発現を関心のあるポリペプチドの発現と連結させることにより達成でき、これは、例えば他シストロン遺伝子を用いて、例えば上記で議論したようにＩＲＥＳ配列により達成できる。「ほぼ同時に」選択するとは、少なくとも一部の時間に、好ましくは少なくとも１日間、より好ましくは２日間、更により好ましくは５日間、両選択薬剤が存在することを意味し、これは、両選択薬剤を同時に培地に加えるか、又は両選択薬剤を含む培養培地を加えることによってなされる（たとえば、実施例７）。第１の選択薬剤がすでに存在する培地に、第２の選択薬剤をほんの数時間又は数日後に加える場合にも、本発明の意味におけるほぼ同時に選択することになるということは明らかであろう。このような状態は細胞をまず第１の選択薬剤で選択し、一度コロニーを形成してから、第２の選択薬剤を加えて第１の選択薬剤を加えなかった新しい培地で選択する、という状況とは区別される（連続選択、例えば、実施例５及びＷＯ ０３／１０６６８４）。両選択可能マーカーによりほぼ同時に選択することにより、驚くべきことに、迅速で強力な選択が行われ、多数の低生産性コロニーが除去されることで、所望の発現特性を有するコロニーを見つけるための仕事量が非常に少なくすむ、ということが本明細書に開示されている。このことは特に、高い発現レベルを有する所望のクローンが同定されるまでに、多くの、通常は何百更には何千ものコロニーをスクリーニングしなくてはならない生物技術産業において有用である。
【００５７】
更に本システムは、この状況で機能する場合には、抗リプレッサー要素の部分について、少なくともＳＴＡＲ６７の、さらには他の抗リプレッサー配列の部分について、機能性について試験することを可能にしている。この簡便なスクリーニング法は、多くの場合にほぼ又はむしろ完全に白黒のはっきりした差異を与えるものであり、従って、抗リプレッサー配列からの機能的部分又は誘導体を同定するのに貢献するか、および／または新たな抗リプレッサー配列の特徴を明らかにするのに役立つであろう。このスクリーニング法は、新たな抗リプレッサー配列、および／または発現促進配列を見出すのにも使用できるであろう（この種のスクリーニング法は文字通り抗リプレッサー活性により選択するのではなく、発現強化活性について選択するものであるので、後者の活性を有し前者の活性を有していない配列を見いだす可能性もある）。従って本発明の他の観点は、抗リプレッサーおよび／または発現強化配列、またはその断片または誘導体を同定する方法であって、ａ）ホスト細胞内に１種類以上の核酸分子を導入するステップであって、この又はこれらの核酸分子はすべて（ｉ）第１の選択可能マーカー遺伝子をコードする配列に機能的に連結したプロモーター、（ｉｉ）第２の選択可能マーカー遺伝子をコードする配列に機能的に連結したプロモーター、並びに（ｉｉｉ）抗リプレッサー活性および／または発現強化活性について試験する少なくとも１つの配列、を有している上記ステップ、並びにｂ）前記第１及び第２の選択可能なマーカー遺伝子の発現についてほぼ同時に選択することによりホスト細胞を選択するステップ、を有する方法を提供する。このスクリーニング法で生存したホスト細胞は、機能的な抗リプレッサーおよび／または発現強化要素を有していると思われるであろう。これは更に、例えば配列を決定すること、および／または上記で述べたように抗リプレッサー活性について他の機能的試験を行うことにより、更に容易に分析することができる。本発明の１つの実施態様において、（ｉ）及び（ｉｉ）の両者は一つの核酸分子上にあって、例えば分かれているプロモーターを有し（第１及び第２の選択可能なマーカーは外側に面している）、その間に試験するべき配列を解析するためにクローニングできるようにしてある。例えば選択可能なマーカー遺伝子を直接促進する比較的に弱いプロモーターを用いることにより（この比較的弱いプロモーターは当業者に知られているもの、および／または当業者により通常の分析によって同定しうるものである）、又は例えばマーカー遺伝子の転写には強いプロモーター、及び翻訳には上記のＩＲＥＳ、好ましくは比較的弱いＩＲＥＳを用いることにより、好ましくは、前記選択可能マーカー遺伝子の発現は高くない。またマーカー遺伝子を簡便に、ポリペプチドをコードする核酸配列の下流に配置し、多シストロン遺伝子内において、例えばＩＲＥＳにより、その発現に結びつけることもできる（例えば、実施例７、可能な構造は図１１）。このようなポリペプチドを更に、関心のあるポリペプチドとして、関心のある前記ポリペプチドを発現する有用なクローンが直接得られるようにすることもできるが、スクリーニングの目的のために、例えばＧＦＰ又はその誘導体、ＳＥＡＰ、ｌａｃＺ、ルシフェラーゼのような発現を容易に定量できるようなマーカーとすることもできる。このような組み合わせでは、ポリペプチドの発現を直接定量することができ、同時選択において十分なクローンを提供し、かつ高い転写レベルを提供する抗リプレッサー要素および／または発現強化要素、若しくはその断片を選び出すことができる。「ランダム」核酸（即ち、抗リプレッサー活性又は発現強化活性を有しているかまだ知られていない核酸）を、例えばゲノム断片の形態で抗リプレッサー活性および／または発現強化活性について試験する配列として用いれば、新たな抗リプレッサー配列および／または発現強化配列を見いだしうる。既知の抗リプレッサー配列を試験する場合には、この分析法をこれらの特徴をより明らかにするのに使用できる。既知の抗リプレッサー配列の断片を試験する場合には、この分析法はこのような既知の抗リプレッサー配列の機能的断片を提供するであろう。
【００５８】
本発明を実施するに当たって、そのように記載した場合以外では、免疫学、分子生物学、微生物学、細胞生物学及び組換えＤＮＡの従来の技術を用いるが、これらは当該技術分野の技術の範囲内である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， １９８９； Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ａｕｓｕｂｅｌ ＦＭ， ｅｔ ａｌ， ｅｄｓ， １９８７； ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．）； ＰＣＲ２： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｒｒｏａｃｈ， ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ ＭＪ， Ｈａｍｓ ＢＤ， Ｔａｙｌｏｒ ＧＲ， ｅｄｓ， １９９５； Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ， ｅｄｓ， １９８８を参照されたい。
【００５９】
本発明を以下の実施例により詳しく説明する。これらの実施例は本発明をいかなる形においても制限するものではない。これらは本発明を明確にするためだけに使われる。
【実施例】
【００６０】
実施例
実施例１：ＳＴＡＲ６７ベクターの作成
新規抗リプレッサー配列はＷＯ ０３／００４７０４に記載の遺伝子スクリーニング法を用いて単離され、この新規配列はＳＴＡＲ６７（配列番号６６）と新たに命名された。ＳＴＡＲ６７の哺乳類細胞株におけるトランス遺伝子の発現に対する効果を調べた。ここでは様々なコンストラクトの作成について説明する。
【００６１】
材料及び方法
以下の３種類のプラスミドを作成した（図１）。
Ａ） ＣＭＶ−ｄ２ＥＧＦＰ−ｉｒｅｓ−Ｚｅｏ （ＣＭＶ コントロール）
Ｂ） ＳＴＡＲ６７−ＣＭＶ−ｄ２ＥＧＦＰ−ｉｒｅｓ−Ｚｅｏ （ＣＮＶ−ＳＴＡＲ６７）
Ｃ） ＳＴＡＲ７−ＳＴＡＲ６７−ＣＭＶ−ｄ２ＥＧＦＰ−ｉｒｅｓ−Ｚｅｏ−ＳＴＡＲ７ （ＣＭＶ−ＳＴＡＲ６７ ７／７）
【００６２】
コンストラクトＡの構築方法を以下に説明する。プラスミドｐｄ２ＥＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ ６０１０−１）を、ＢｓｉＷＩ部位にリンカーを挿入して修飾し、ｐｄ２ＥＧＦＰ−ｌｉｎｋを得た。リンカーは、オリゴヌクレオチドＧＴＡＣＧＧＡＴＡＴＣＡＧＡＴＣＴＴＴＡＡＴＴＡＡＧ（配列番号６７）及びＧＴＡＣＣＴＴＡＡＴＴＡＡＡＧＡＴＣＴＧＡＴＡＴ（配列番号６８）をアニーリングして作成し、Ｐａｄ、ＢｇｌＩＩ及びＥｃｏＲＶ制限エンドヌクレアーゼのための部位を導入した。これによりＳＴＡＲ要素を挿入するためのマルチクローニングサイトＭＣＳＩＩが作製された。次に、プライマーＧＡＴＣＡＧＡＴＣＴＧＧＣＧＣＧＣＣＡＴＴＴＡＡＡＴＣＧＴＣＴＣＧＣＧＣＧＴＴＴＣＧＧＴＧＡＴＧＡＣＧＧ（配列番号６９）及びＡＧＧＣＧＧＡＴＣＣＧＡＡＴＧＴＡＴＴＴＡＧＡＡＡＡＡＴＡＡＡＣＡＡＡＴＡＧＧＧＧ（配列番号７０）を用いてｐｄ２ＥＧＦＰから０．３７ｋｂの領域を増幅し、これをｐＩＲＥＳ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ ６０２８−１）のＢｇｌＩＩ部位に挿入してｐＩＲＥＳ−ｓｔｕｆを作成した。これによりＭＣＳＩにＡｓｃＩ及びＳｗａＩ制限エンドヌクレアーゼのための部位を挿入し、「詰込み断片（stuffer fragment）」として機能することでＳＴＡＲ要素と近接するプロモーターとの間の起こりうる相互作用をさける。ｐＩＲＥＳ−ｓｔｕｆをＢｇｌＩＩ及びＦｓｐＩで消化し、詰め込み断片、ＣＭＶプロモーター、ＩＲＥＳ要素（マルチクローニング部位ＭＣＳＡ及びＭＣＳＢが隣接している）、及びＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを有するＤＮＡ断片が遊離する。この断片を、ＢａｍＲＩ及びＳｔｕＩで消化して生成したベクターバックボーンに結合させ、ｐＩＲＥ−ｌｉｎｋを作成した。
【００６３】
ゼオシン抵抗性遺伝子のオープンリーディングフレームをｐＩＲＥＳの下流のＢａｍＨＩ／ＮｏｔＩ部位に以下のように挿入した。ゼオシン抵抗性ＯＲＦを、プライマーＧＡＴＣＧＧＡＴＣＣＴＴＣＧＡＡＡＴＧＧＣＣＡＡＧＴＴＧＡＣＣＡＧＴＧＣ（配列番号７１）及びＡＧＧＣＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＴＴＣＴＣＡＧＴＣＣＴＧＣＴＣＣＴＣ（配列番号７２）を用いてプラスミドｐＣＭＶ／ｚｅｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｖ５０１２０）からＰＣＲにより増幅し、ＢａｍＷＩ及びＮｏｔＩにより消化し、ＢａＭＨ／ＮｏｔＩ消化ｐＩＲＥＳ−ｌｉｎｋに結合させてｐＩＲＥＳ−ｌｉｎｋ−ｚｅｏを作成した。ｐｄ２ＥＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ ６０１０−１）をプライマーＧＡＴＣＧＡＡＴＴＣＴＣＧＣＧＡＡＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧＣＡＧＡＴＣＣＴＧＡＡＧ（配列番号７３）及びＡＧＧＣＧＡＡＴＴＣＡＣＣＧＧＴＧＴＴＴＡＡＡＣＴＴＡＣＡＣＣＣＡＣＴＣＧＴＧＣＡＧＧＣＴＧＣＣＣＡＧＧ（配列番号７４）により増幅し、ＥｃｏＲＩ消化ｄ２ＥＧＦＰカセットをｐＩＲＥＳ−ｌｉｎｋ−ｚｅｏプラスミドのＥｃｏＲＩ部位に挿入することにより、ｄ２ＥＧＦＰレポーターＯＲＦをｐＩＲＥＳ−ｌｉｎｋ−ｚｅｏに導入した。これによりコンストラクトＡ、ＣＭＶ−ｄ２ＥＧＦＰ−ｉｒｅｓ−Ｚｅｏ （ＣＭＶ コントロール）を作成した。
【００６４】
ＳＴＡＲ６７をＣＭＶプロモーターの上流に、ＡｓｃＩ部位（ＳＴＡＲ６７とプロモーターの間に残された約１５ｎｔ）にクローニングした。これによりコンストラクトＢ、ＳＴＡＲ６７−ＣＭＶ−ｄ２ＥＧＦＰ−ｉｒｅｓ−Ｚｅｏ （ＣＮＶ−ＳＴＡＲ６７）を作成した。
【００６５】
ＳＴＡＲ６７を、５‘ＳａｉＩ及びＸａｂａＩ部位並びに３’ＢｇｌＩＩ及びＰａｄ部位に方向性を有してクローニングし、全カセットにＳＴＡＲ７に隣接するようにしてあるＳＴＡＲ７（配列番号１）もまた含んでいるカセットとの関連においても試験した。これがコンストラクトＣ（ＣＭＶ−ＳＴＡＲ６７ ７／７）である。
【００６６】
実施例２：ＳＴＡＲ６７は安定にトランスフェクションされたβｄＣＨＯ細胞においてＣＭＶ、ＥＦ１α及びＵＢ６プロモーター由来の発現レベルを増加させる。
ＳＴＡＲ６７がＣＭＶ、ＥＦ１α及びＵＢ６プロモーターに隣接して存在することによりＣＨＯ細胞におけるこれらのプロモーターの発現レベルに影響があるかを調べた。実施例１に記載のコンストラクトＡ及びＢ（図１）を各プロモーターに関して以下のように修飾してこの目的で使用した。
１ ＣＭＶ−ｄ２ＥＧＦＰ−ｉｒｅｓ−Ｚｅｏ （ＣＶＭ コントロール）
２ ＳＴＡＲ６７−ＣＭＶ−ｄ２ＥＧＦＰ−ｉｒｅｓ−Ｚｅｏ （ＣＶＭ−ＳＴＡＲ６７）
３ ＥＦ１α−ｄ２ＥＧＦＰ−ｉｒｅｓ−Ｚｅｏ （ＥＦ１α コントロール）
４ ＳＴＡＲ６７−ＥＦ１α−ｄ２ＥＧＦＰ−ｉｒｅｓ−Ｚｅｏ （ＥＦ１α−ＳＴＡＲ６７）
５ ＵＢ６−ｄ２ＥＧＦＰ−ｉｒｅｓ−Ｚｅｏ （ＵＢ６ コントロール）
６ ＳＴＡＲ６７−ＵＢ６−ｄ２ＥＧＦＰ−ｉｒｅｓ−Ｚｅｏ （ＵＢ６−ＳＴＡＲ６７）
【００６７】
材料及び方法
ＵＢ６及びＥＦ１αプロモーターを図１に記載のプラスミドにおいてＣＭＶプロモーターと入れ替えた。ＵＢ６プロモーターを以下のようにクローニングした。実施例１に記載したように、ｐｄ２ＥＧＦＰプラスミド由来の詰込みＤＮＡ０．３７ｋｂを、配列番号６９及び７０により認識されるプライマーを用いてＰＣＲにより増幅した。得られた詰込みＤＮＡをｐＵＢ６−Ｖ５−Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｖ２５０−２０）のＢｇｌＩＩ部位にクローニングし、ｐＵＢ６−ｓｔｕｆを作製した。ｐＵＢ６−ｓｔｕｆからＡｓｃＩ−ＳａｃＩ断片をＣＭＶ−ｄ２ＥＧＦＰ−ＩＲＥＳ−Ｚｅｏ内にクローニングし、ここからＣＭＶプロモーターを除去した。
【００６８】
ＥＦ１αプロモーターをＰＣＲによりｐＥＦ１α／Ｖ５−Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｖ９２０−２０）を鋳型として、プライマーＧＡＴＣＧＧＣＧＣＧＣＣＡＴＴＴＡＡＡＴＣＣＧＡＡＡＡＧＴＧＣＣＡＣＣＴＧＡＣＧ（配列番号７９）及びＡＧＧＣＧＧＧＡＣＣＣＣＣＧＣＡＣＧＡＣＡＣＣＴＧＡＡＡＴＧＧＡＡＧ（配列番号８０）を用いて増幅した。このＰＣＲ断片をＣＭＶ−ｄ２ＥＧＦＰ−ＩＲＥＳ−ＺｅｏのＡｓｃＩ及びＰｐｕＭＩ部位にクローニングし、ここからＣＭＶプロモーターを除去した。
【００６９】
チャイニーズハムスター卵巣細胞株ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ ＣＬＬ−６１）を２ｍＭグルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含有するＨＡＭＳ−Ｆ１２培地＋１０％ウシ胎児血清中で、３７℃／５％ＣＯ２にて培養した。細胞にプラスミドをＳｕｐｅｒＦｅｃｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて製造者の記載の通りにトランスフェクションした。簡単にいうと、細胞を培養容器にまき、一晩培養して７０〜９０％コンフルエントにする。ＳｕｐｅｒＦｅｃｔ薬剤をプラスミドＤＮＡとμｇあたり６μｌの比で組み合わせ（例えば、１０ｃｍペトリ皿では、２０μｇＤＮＡと１２０μｌＳｕｐｅｒＦｅｃｔ）、そして細胞に加える。一晩培養した後、トランスフェクション混合液を新しい培地に置換し、トランスフェクションされた細胞を更に培養する。一晩培養した後、細胞をトリプシン処理して新たな培地の入った新しい培養容器にまく。更に一晩培養した後、ゼオシンが５０μｇ／ｍｌの濃度になるまで加え、細胞を更に培養する。更に３日間後、培地をゼオシン（１００μｇ／ｍｌ）を含有する新しい培地に置換し、更に培養する。個々のコロニーが見えるようになったら（トランスフェクションしてから約１０日）、培地を除き、ゼオシンを含有していない新しい培地に置換する。個々のコロニーを単離し、２４ウェルプレートへゼオシンを含有していない培地に移す。コロニーを単離してから１日後にゼオシンを培地に加える。ｄ２ＥＧＦＰレポーター遺伝子の発現をトランスフェクションしてから約３週間後に調べる。コロニーにおけるｄ２ＥＧＦＰ発現レベルを２週間後に調べる。トランスフェクションして初めの２週間で１回目のｄ２ＥＧＦＰの測定を行った後、コロニーをゼオシン及び他の抗生物質を含有しない培地中で培養する。これを残りの実験でも継続した。
【００７０】
結果
図２はＣＭＶプロモーターの上流にクローニングしたＳＴＡＲ６７を含有するコンストラクトをトランスフェクションすると、ＳＴＡＲ６７を有していない「空」コントロールであるＣＭＶコントロールと比べて、有意に高いレベルのｄ２ＥＧＦＰタンパク質を発現するＣＨＯコロニーが多く得られたことを示している。ＣＭＶコントロールプラスミドをトランスフェクションした１０コロニーのｄ２ＥＧＦＰシグナルの平均は、トランスフェクション後２５日で測定したところ、３４であった。トランスフェクション後６０日では、これら１０コロニーのｄ２ＥＧＦＰシグナルの平均は１３に減少しており、長期にわたると発現が安定でないことを示している。これに対して、ＳＴＡＲ６７−ＣＭＶプラスミドをトランスフェクションした１０コロニーのｄ２ＥＧＦＰシグナルの平均は、トランスフェクション後２５日で測定すると４２であり、６０日で測定すると３２であった。従って、トランスフェクションしてから６０日後では、安定にトランスフェクションされたクローンにおいて、ＳＴＡＲ６を有するＣＭＶコンストラクトはＣＭＶプロモーターに促進され、レポータータンパク質の発現レベルを２．５倍高めることになる。重要なことは、トランスフェクションして２５日後は、１回目の測定後であり、ゼオシンを含有しない培地でコロニーを培養することにより選択圧はなくなっている。従ってＳＴＡＲ６７を有するコロニーは、ＳＴＡＲ６７コンストラクトを有していないコロニーと比較して、選択圧非存在下で長期にわたってより安定である。
【００７１】
図３はＥＦ１ＣＣ−プロモーターの上流にクローニングしたＳＴＡＲ６７を有するコンストラクトをトランスフェクションすると、ＳＴＡＲ６７を有していない「空」コントロールであるＥＦ１αコントロールと比べて、有意に高いレベルのｄ２ＥＧＦＰタンパク質を発現するＣＨＯコロニーが多く得られたことを示している。ＥＦ１αコントロールプラスミドをトランスフェクションした１０コロニーのｄ２ＥＧＦＰシグナルの平均は、トランスフェクション後２５日で測定したところ、３１であった。トランスフェクション後６０日では、これら１０コロニーのｄ２ＥＧＦＰシグナルの平均は２６であった。これに対して、ＥＦ１α−ＳＴＡＲ６７プラスミドをトランスフェクションした１０コロニーのｄ２ＥＧＦＰシグナルの平均は、トランスフェクション後２５日で測定すると６０であり、６０日で測定すると７６であった。従って、トランスフェクションしてから２５日後及び６０日後の両方において、安定にトランスフェクションされたクローンにおいてＳＴＡＲ６を有するＥＦ１αコンストラクトは、ＥＦ１αプロモーターに促進され、レポータータンパク質の発現レベルを２．９倍高めることになる。
【００７２】
図４は、ＵＢ６プロモーターの上流にクローニングしたＳＴＡＲ６７を有するコンストラクトをトランスフェクションすると、ＳＴＡＲ６７を有していない「空」コントロールであるＵＢ６コントロールと比べて、有意に高いレベルのｄ２ＥＧＦＰタンパク質を発現するＣＨＯコロニーが多く得られたことを示している。ＵＢ６コントロールプラスミドをトランスフェクションした１０コロニーのｄ２ＥＧＦＰシグナルの平均は、トランスフェクション後２５日で測定したところ、５１であった。トランスフェクション後６０日では、これら１０コロニーのｄ２ＥＧＦＰシグナルの平均は２９であり、長期にわたると発現が安定でないことを示している。これに対して、ＵＢ６−ＳＴＡＲ６７プラスミドをトランスフェクションした１０コロニーのｄ２ＥＧＦＰシグナルの平均は、トランスフェクション後２５日で測定すると２１８であり、６０日で測定すると２２４であった。従って、トランスフェクションしてから２５日後では、安定にトランスフェクションされたクローンにおいてＳＴＡＲ６を有するＵＢ６コンストラクトは、ＵＢ６プロモーターに促進され、レポータータンパク質の発現レベルを４．３倍高めることになる。６０日後にはこの倍率は７．７になっており、これはコントロールコロニーにおける発現の不安定性及びＵＢ６−ＳＴＡＲ６７コロニーにおける安定性によるものである。重要なことは、トランスフェクションして２５日後は、１回目の測定後であり、ゼオシンを含有しない培地でコロニーを培養することにより選択圧はなくなっている。従って、ＳＴＡＲ６７を有するコロニーはＳＴＡＲ６７コンストラクトを有していないコロニーと比較して選択圧非存在下で長期にわたってより安定である。
【００７３】
結論として、ＳＴＡＲ６７は３つの異なった関連のないプロモーター由来の発現を増加させる。
【００７４】
実施例３：ＳＴＡＲ６７は安定にトランスフェクションしたＰＥＲ．Ｃ６細胞においてＣＭＶ、ＥＦ１α及びＵＢ６プロモーター由来の発現レベルを増加させる。
ＳＴＡＲ６７がＣＭＶ、ＥＦ１α及びＵＢ６プロモーターに隣接して存在することにより、ＣＨＯ以外の細胞種、即ちヒトＰＥＲ．Ｃ６細胞におけるこれらのプロモーターの発現レベルに影響があるかを調べた。実施例１と同じコンストラクトを用いた
【００７５】
材料及び方法
ＰＥＲ．Ｃ６細胞のトランスフェクション、培養及び分析
ＰＥＲ．Ｃβ細胞（登録商標）を、８．９ｍＭ ＭｇＣｌ２、１００Ｕ／ｍｌペニシリン及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ培地＋ピリドキシン＋９％ウシ胎児血清（熱不活性化していない）中で３７℃／５％ＣＯ２にて培養した。Ｌｉｐｏｆｅｋｕｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）製造者の記載の通りに用いて、細胞にプラスミドでトランスフェクションした。簡単にいうと、細胞を６ウェルプレートにまき、一晩培養して７０〜９０％コンフルエントにした。Ｌｉｐｏｆｅｋｕｔａｍｉｎｅ薬剤をプラスミドＤＮＡと、３μｇあたり１５μｌの比で組み合わせ（例えば、１０ｃｍペトリ皿では、２０μｇＤＮＡと１２０μｌ Ｌｉｐｏｆｅｋｕｔａｍｉｎｅ）、３０分間インキュベーションした後に細胞に加えた。β時間培養した後、トランスフェクション混合液を新しい培地に置換し、トランスフェクションされた細胞を更にインキュベートした。一晩培養した後、細胞をトリプシン処理して、ゼオシンを１００μｇ／ｍｌの濃度になるまで加えた新しい培地の入った新しいペトリ皿（９０ｍｍ）にまき（１：１５、１：３０、１：６０、１：１２０希釈）、細胞を更に培養した。コロニーが見えるようになったら、個々のコロニーを剥がして単離し、２４ウェルプレートのゼオシンを含有していない培地の中に移す。〜７０％コンフルエントまで成長したら、細胞を６ウェルプレートに移した。安定なコロニーを６ウェルプレートで２週間増殖させた後、ｄ２ＥＧＦＰシグナルをＸＬ−ＭＣＬ Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｅｒで測定した。ｄ２ＥＧＦＰシグナルの平均値をｄ２ＥＧＦＰ発現レベルの指標とした。２週間後にコロニーの２回目の測定した。その後、ゼオシン非存在下でコロニーを更に培養した。
【００７６】
結果
図５はＣＭＶプロモーターの上流にクローニングしたＳＴＡＲ６７を含むコンストラクトをトランスフェクションすると、ＳＴＡＲ６７を有していない「空」コントロールであるＣＭＶコントロールと比べて、有意に高いレベルのｄ２ＥＧＦＰタンパク質を発現するＰＥＲ．Ｃ６コロニーが多く得られたことを示している。ＣＭＶコントロールプラスミドをトランスフェクションした１０コロニーのｄ２ＥＧＦＰシグナルの平均は、トランスフェクション後３０日で測定したところ、３７であった。トランスフェクション後６０日では、これら１０コロニーのｄ２ＥＧＦＰシグナルの平均は１４に減少しており、長期にわたると発現が安定でないことを示している。これに対して、ＳＴＡＲ６７−ＣＭＶプラスミドをトランスフェクションした１０コロニーのｄ２ＥＧＦＰシグナルの平均は、トランスフェクション後３０日で測定すると１０１あり、６０日で測定すると４５であった。従って、トランスフェクションしてから６０日後では、安定にトランスフェクションされたクローンにおいてＳＴＡＲ６を有するＣＭＶコンストラクトは、ＣＭＶプロモーターに促進され、レポータータンパク質の発現レベルが３．２倍高くなる。
【００７７】
図６はＥＦ１ＯＣ−プロモーターの上流にクローニングしたＳＴＡＲ６７を含むコンストラクトをトランスフェクションすると、ＳＴＡＲ６７を有していない「空」コントロールであるＥＦ１αコントロールと比べて、有意に高いレベルのｄ２ＥＧＦＰタンパク質を発現するＰＥＲ．Ｃ６コロニーが多く得られたことを示している。ＥＦ１αコントロールプラスミドをトランスフェクションした１０コロニーのｄ２ＥＧＦＰシグナルの平均は、トランスフェクション後３０日で測定したところ、５であった。トランスフェクション後６０日では、これら１０コロニーにおけるｄ２ＥＧＦＰシグナルの平均は６であった。これに対して、ＥＦ１Ｃｔ−ＳＴＡＲ６７プラスミドをトランスフェクションした１０コロニーのｄ２ＥＧＦＰシグナルの平均は、トランスフェクション後３０日で測定すると２５であり、６０日で測定すると２０であった。従って、トランスフェクションしてから３０日後及び６０日後の両方において、安定にトランスフェクションされたクローンにおいて、ＳＴＡＲ６７を有するＥＦ１αコンストラクトはＥＦ１αプロモーターに促進され、レポータータンパク質の発現レベルが４倍高くなる。
【００７８】
図７はＵＢ６プロモーターの上流にクローニングしたＳＴＡＲ６７を含むコンストラクトをトランスフェクションすると、ＳＴＡＲ６７を有していない「空」コントロールであるＵＢ６コントロールと比べて、有意に高いレベルのｄ２ＥＧＦＰタンパク質を発現するＰＥＲ．Ｃ６コロニーが多く得られたことを示している。ＵＢ６コントロールプラスミドをトランスフェクションした１０コロニーのｄ２ＥＧＦＰシグナルの平均は、トランスフェクション後３０日で測定したところ、４であった。トランスフェクション後６０日では、これら１０コロニーのｄ２ＥＧＦＰシグナルの平均は２であった。これに対して、ＵＢ６−ＳＴＡＲ６７プラスミドをトランスフェクションした１０コロニーのｄ２ＥＧＦＰシグナルの平均は、トランスフェクション後３０日で測定すると２７であり、６０日で測定すると１８であった。従って、トランスフェクションしてから３０日後及び６０日後の両方において、安定にトランスフェクションされたクローンにおいて、ＳＴＡＲ６７を有するＵＢ６コンストラクトはＵＢ６プロモーターに促進され、レポータータンパク質の発現レベルが７〜９倍高くなる。
【００７９】
従って、ＰＥＲ．Ｃ６細胞においても、ＳＴＡＲ６７をプロモーターの上流に配置することにより、ＳＴＡＲ６７を有さないコンストラクトに比べて有意に高いタンパク質発現レベルが得られる。従って、ＳＴＡＲ６７は異なった関連のない細胞種において機能する。
【００８０】
実施例４：他の抗リプレッサー要素と組み合わせてＣＨＯ細胞においてＳＶ４０プロモーターを強化するＳＴＡＲ６７の新しい構造
ＳＴＡＲ６７がＳＶ４０プロモーターに隣接して存在する際に、単独で又は他の抗リプレッサー要素（この実施例ではＳＴＡＲ７）と組み合わせた際に、このプロモーターの発現レベルに影響を与えるかを調べた。この目的で用いたコンストラクトは以下の通りである。
１ ＳＶ４０−ｄ２ＥＧＦＰ−ｉｒｅｓ−Ｚｅｏ （ＳＶ４０ コントロール）
２ ＳＴＡＲ６７−ＳＶ４０−ｄ２ＥＧＦＰ−ｉｒｅｓ−Ｚｅｏ （ＳＶ４０−ＳＴＡＲ６７）
３ ＳＴＡＲ７−ＳＶ４０−ｄ２ＥＧＦＰ−ｉｒｅｓ−Ｚｅｏ−ＳＴＡＲ７ （ＳＶ４０−ＳＴＡＲ７／７）
４ ＳＴＡＲ７−ＳＴＡＲ６７−ＳＶ４０−ｄ２ＥＧＦＰ−ｉｒｅｓ−Ｚｅｏ−ＳＴＡＲ７ （ＳＶ４０−ＳＴＡＲ６７ ７／７）
【００８１】
材料及び方法
ＳＶ４０プロモーターは、ｐＩＲＥＳを鋳型として、プライマーＴＴＧＧＴＴＧＧＧＧＣＧＣＧＣＣＧＣＡＴＣＡＣＣＡＴＧＧＣＣＴＧＡＡＡＴＡＡＣＣＴＣＴＧＡＡＡＧＡＧＧ（配列番号８１）及びＴＴＧＧＴＴＧＧＧＡＧＣＴＣＡＡＧＣＴＴＴＴＴＧＣＡＡＡＡＧＣＣＴＡＧＧＣＣＴＣＣＡＡＡＡＡＡＧＣＣＴＣＣＴＣ（配列番号８２)を用いて増幅した。ＰＣＲ断片をＣＶＭ−ｄ２ＥＧＦＰ−ＩＲＥＳ−ＺｅｏのＡｓｃＩ及びＳａｄ部位にクローニングし、ここからＣＭＶプロモーターを取り除いた。実施例２と同様に、ＣＨＯ細胞にトランスフェクションし、コロニーを単離し、増殖し、分析した。
【００８２】
結果
図８は、抗リプレッサー要素を有していない「空」コントロール（ＳＶ４０コントロール）と比較して、ＳＶ４０プロモーターの上流にクローニングしたＳＴＡＲ６７を有するコンストラクト（ＳＶ４０−ＳＴＡＲ６７）又は全コンストラクトに隣接してクローニングしたＳＴＡＲ７を含むコンストラクト（ＳＶ４０−ＳＴＡＲ ７／７）をトランスフェクションしても、有意に高いレベルのｄ２ＥＧＦＰタンパク質を発現するＣＨＯコロニーが得られなかったことを示している。ＳＶ４０コントロールプラスミドをトランスフェクションした１８コロニーにおけるｄ２ＥＧＦＰシグナルの平均は、トランスフェクションしてから４０日で測定したところ８６であった。これに対して、トランスフェクション後４０日で測定したＳＶ４０−ＳＴＡＲ６７プラスミドをトランスフェクションした１８コロニーにおけるｄ２ＥＧＦＰシグナルの平均は８２であり、トランスフェクション後４０日で測定したＳＶ４０−ＳＴＡＲ ７／７プラスミドをトランスフェクション下１８コロニーにおけるｄ２ＥＧＦＰシグナルの平均は９１であった。従って、これらの抗リプレッサー要素のＣＨＯ細胞におけるＳＶ４０プロモーターにおける有意な影響は観察されなかった。
【００８３】
これらの細胞におけるＳＶ４０プロモーターからの発現レベルはすでに極めて高く、非常に強力なプロモーターとして考えられているＣＭＶプロモーターで見られたよりも遙かに高いものですらあるように思われる。抗リプレッサー要素の非存在下でＳＶ４０プロモーターをＣＨＯ細胞において用いた際のバックグラウンド発現がこのように高いということは、ＳＴＡＲ６７単独又はトランス遺伝子に隣接したＳＴＡＲ７の有意な影響が観察されなかった理由を説明しうるものである。
【００８４】
しかし、ＳＶ４０−ＳＴＡＲ６７ ７／７プラスミドをトランスフェクションした１８コロニーにおけるｄ２ＥＧＦＰシグナルの平均は、４０日後に測定したところ２０９であり、これは１８コントロールコロニーの平均（８６）に対して２．４倍高い。従って、他の抗リプレッサー要素と組み合わせてＳＴＡＲ６７要素を用いると、有意に高いｄ２ＥＧＦＰ発現レベルを示し、安定してトランスフェクションされたＣＨＯコロニーが多く得られる。
【００８５】
従って、この様な新しい構造（５‘−ＳＴＡＲ配列Ａ−ＳＴＡＲ配列Ｃ−プロモーター−関心のあるタンパクをコードする核酸−ＳＴＡＲ配列Ｂ−３’、なお本実施例においてはＳＴＡＲ配列Ａ及びＢはＳＴＡＲ７であり、ＳＴＡＲ配列ＣはＳＴＡＲ６７である）において、ＳＴＡＲ要素はこれまで開示されていた構造よりも遙かによく機能するように思われる。
【００８６】
隣接するＳＴＡＲ７要素を、隣接するＳＴＡＲ６（配列番号６）要素又は隣接するＳＴＡＲ４（配列番号４）要素により置換して、ＳＶ４０プロモーターの上流のＳＴＡＲ６７と組み合わせて（それぞれＳＶ４０−ＳＴＡＲ６７ ６／６及びＳＶ４０−ＳＴＡＲ６７ ４／４であり、上記と同じ命名法を用いた）実験を行い、これらの組み合わせによっても発現が改善することが観察された。このことは、隣接するＳＴＡＲ７要素は他のＳＴＡＲ配列と交換することが可能であることが示し、さらにＳＴＡＲ配列を有する発現カセットの新しい構造の改善が観察された。
【００８７】
実施例５：ＳＴＡＲ６７とＳＴＡＲ７とを組み合わせることにより安定してトランスフェクションされたＣＨＯ細胞においてＵＢ６に促進された抗体発現レベルの促進
実施例４において、ＳＴＡＲ６７とＳＴＡＲ７を組み合わせることによりＣＨＯ細胞におけるｄ２ＥＧＦＰタンパク質の発現レベルが高められることを示した。ここでは、ＳＴＡＲ６７とＳＴＡＲ７の組み合わせを抗体の産生に用いることができるかを調べた。ＥｐＣＡＭ分子に対する抗体（Ｈｕｌｓ ｅｔ ａｌ．， １９９９）を試験タンパク質として選択し、ＵＢ６プロモーターを用いた。
【００８８】
材料及び方法
プラスミド
重鎖ｃＤＮＡ（ＨＣ−ＥｐＣＡＭ）を、ＵＢ６プロモーターを有するコンストラクト内にクローニングした。ＨＣ−ＥｐＣＡＭはＩＲＥＳ配列によりゼオシン抵抗性遺伝子に連結している。軽鎖ｃＤＮＡ（ＬＣ−ＥｐＣＡＭ）もまたＵＢ６プロモーターを有するコンストラクト内にクローニングした。ＬＣ−ＥｐＣＡＭはＩＲＥＳ配列によりピューロマイシン抵抗性遺伝子に連結している。これら２種類のプラスミドはともにＵＢ６（ＨＣ＋ＬＣ）コントロールを表す（図９）。
【００８９】
ＳＴＡＲ６７及びＳＴＡＲ７の効果を試験するために、ＳＴＡＲ６７をＨＣ＋ＬＣの両者のコンストラクトのＵＢ６プロモーターの上流にクローニングした。ＳＴＡＲ７を全カセットに隣接するように、５‘末端及び３’末端の両方にクローニングした（図９）。これら２種類のプラスミドはＳＴＡＲ７−ＳＴＡＲ６７−ＵＢ６（ＨＣ＋ＬＣ） ＳＴＡＲ７を表す。
【００９０】
ＣＨＯ細胞のトランスフェクション及び培養
チャイニーズハムスター卵巣細胞株ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−６１）を実施例２と同様にトランスフェクションして培養し、ここで選択のためにゼオシン（１００μｇ／ｍｌ）及びピューロマイシン（２．５μｇ／ｍｌ）を用いた。トランスフェクションの１日後、ゼオシンを培地に加えた。第１のコロニーが見えるようになったとき（ゼオシンを加えて約７日後）、培地を除いてピューロマイシンを含有する培地に置換した。約７日後にコロニーを単離して２４ウェルプレートのゼオシンのみを含有する培地に移した。
【００９１】
結果
図９は、ＵＢ６プロモーターの上流にクローニングしたＳＴＡＲ６７要素及び全カセットに隣接するようにクローニングした２つのＳＴＡＲ７要素を有する抗体コンストラクトをトランスフェクションすることにより、ＳＴＡＲ６７及びＳＴＡＲ７を有していない「空」コントロールであるＵＢ６（ＨＣ＋ＬＣ）コントロールと比較して、有意に高いレベルのＥｐＣＡＭ抗体を発現している（抗ヒトＩｇＧ抗体を用いてＥＬＩＳＡ法により測定）ＣＨＯコロニーが多く得られた、ということを示している。ＵＢ６（ＨＣ＋ＬＣ）コントロールプラスミドをトランスフェクションした１８コロニーにおけるＥｐＣＡＭ産生の平均は、トランスフェクション後２５日で測定したところ、２．７ｐｇ／細胞／日であった。選択薬剤であるゼオシン及びピューロマイシンは２５日後に除去した。トランスフェクション後４５日では、これら１８コロニーにおけるＥｐＣＡＭ産生の平均は２．７ｐｇ／細胞／日であった。これに対して、ＳＴＡＲ７−ＳＴＡＲ６７−ＵＢ６（ＨＣ＋ＬＣ）−ＳＴＡＲ７をトランスフェクションした１８コロニーにおけるＥｐＣＡＭ産生シグナルの平均を２７日後に測定したところ、６．７ｐｇ／細胞／日であり、トランスフェクション後４５日に測定したところ７．７ｐｇ／細胞／日であった。従って、トランスフェクション後３０日及び４５日の両方において、安定にトランスフェクションされたクローンにおいて、ＳＴＡＲ６７／ＳＴＡＲ７を有するＵＢ６コンストラクトは、ＵＢ６プロモーターに促進され、レポータータンパク質の発現レベルが２．５〜２．９倍高くなる。
【００９２】
従って、ＳＴＡＲ６７をプロモーターの上流に、２つのＳＴＡＲ７要素をカセットに隣接するように配置することにより、ＳＴＡＲ６７／ＳＴＡＲ７を有していないコンストラクトに比較して、ＣＨＯ細胞において有意に高いＥｐＣＡＭ抗体発現レベルが得られた。
【００９３】
実施例６：ＳＴＡＲ６及びＳＴＡＲ７がエンハンサーブロッカーであるのに対して、ＳＴＡＲ６７はエンハンサーブロッカーではない。
特性が調べられたこれまで既知のＳＴＡＲ配列はすべて、ＳＴＡＲ６及びＳＴＡＲ７を含め、エンハンサーブロッカーである（ＷＯ ０３／００４７０４、Ｋｗａｋｓ ｅｔ ａｌ， ２００３）。エンハンサーブロッカー活性は、ＳＴＡＲ要素を強力なエンハンサーとプロモーターとの間に配置することにより試験される。ここでは、ＳＴＡＲ６７もまたエンハンサーブロッカーであるかどうかを調べた。
【００９４】
材料及び方法
ｄ２ＥＧＦＰ遺伝子をプライマーＴＴＧＧＴＴＧＧＴＣＡＴＧＡＡＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＧＡＧＣＴＧＴＴＣ（配列番号７５）及びＡＴＴＣＴＣＴＡＧＡＣＴＡＣＡＣＡＴＴＧＡＴＣＣＴＡＧＣＡＧＡＡＧＣＡＧ（配列番号７６）用いてＰＣＲで増幅し、Ｎｃｏ１及びＸｂａＩ制限酵素部位を用いてプラスミドｐＧＬ３−プロモーター（Ｐｒｏｍｅｇａ）にクローニングし、ルシフェラーゼ遺伝子を置換してプラスミドｐＧＬ３−プロモーター−ＧＦＰを作製した。リンカー（オリゴＣＧＡＴＡＴＣＴＴＧＧＡＧＡＴＣＴＡＣＴＡＧＴＧＧＣＧＣＧＣＣＴＴＧＧＧＣＴＡＧＣＴ（配列番号７７）及びＧＡＴＣＡＧＣＴＡＧＣＣＣＡＡＧＧＣＧＣＧＣＣＡＣＴＡＧＴＡＧＡＴＣＴＣＣＡＡＧＡＴＡＴＣＧＡＧＣＴ（配列番号７８）をアニーリングして作成した）をＳａｄ及びＢｇｌＩＩ部位にクローニングしてマルチクローニング部位を作製した。リンカーのライゲーションにより元々のＢｇｌＩＩ部位を破壊し、リンカーＤＮＡ内に固有のＢｇｌＩＩ部位を作製した。ＢｓａＢＩ及びＢａｍＨＩを用いて、ＳＶ４０エンハンサーをプラスミドｐＧＬ３−ｂａｓｉｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ）から切り出し、ＥｃｏＲＶ及びＢｇｌＩＩ部位を用いてｐＧＬ３−リンカー−プロモーター−ＧＦＰにクローニングし、プラスミドｐＧＬ３−エンハンサー−プロモーター−ＧＦＰを作製した。ＳＴＡＲ４０要素（配列番号４０）をＫｐｎＩ及びＳａｄ部位を用いてＳＶ４０エンハンサーの上流に配置し、エンハンサーの上流配列に対する作用を阻害した。最後に、抗リプレッサー要素ＳＴＡＲ６、ＳＴＡＲ７及びＳＴＡＲ６７を、ＳＶ４０エンハンサーとＳＶ４０最小プロモーターとの間にＳｐｅＩ及びＡｓｃＩ制限酵素部位を用いて配置した。
【００９５】
ＣＨＯ細胞のトランスフェクション及び培養
チャイニーズハムスター卵巣細胞株ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−６１）に実施例２と同様にトランスフェクションした。トランスフェクションの１日後に、ｄ２ＥＧＦＰレベルをＥｐｉｃｓ ＸＬフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社製）にて測定した。
【００９６】
結果
図１０は、ＳＴＡＲ６及びＳＴＡＲ７が同じ分析法においてエンハンサーブロッカーとして作用するのに対し、ＳＴＡＲ６７がエンハンサーブロッカーではないことを示している。ＳＴＡＲ６、ＳＴＡＲ７及びＳＴＡＲ６７はｄ２ＥＧＦＰ遺伝子の上流にあるＳＶ４０エンハンサーと最小ＳＶ４０プロモーターの間にクローニングした。ＳＴＡＲ要素をエンハンサーとプロモーターの間にクローニングしなかった場合には、強力な転写活性化がおきた（これを任意に１００％と設定した）。ＳＴＡＲ６又はＳＴＡＲ６７をエンハンサーとプロモーターの間に配置した場合には、転写はバックグラウンドレベルまで低下し、このことはＳＴＡＲ６及びＳＴＡＲ７が強力なエンハンサーブロッカーであることを示している。これに対して、ＳＴＡＲ６７をエンハンサーとプロモーターの間にクローニングした場合には、相対的転写レベルはまだコントロールに対して８０パーセントであり、このことはＳＴＡＲ６７が良いエンハンサーブロッカーではないことを示しており、これはＳＴＡＲ６及びＳＴＡＲ７だけでなく、以前に記載されている（ＷＯ ０３／００４７０４、Ｋｗａｋｓ ｅｔ ａｌ， ２００３）他の抗リプレッサー要素と対照的である。
【００９７】
実施例７：ＳＴＡＲ６７は安定にトランスフェクションされたＣＨＯ細胞においてＵＢ６及びＣＭＶに促進された抗体発現レベルを増加させる
実施例５において、ＳＴＡＲ６７及びＳＴＡＲ７を組み合わせることによりＣＨＯ細胞におけるＥｐＣＡＭ抗体の発現レベルが強化されることを、重鎖と軽鎖を含む２つの異なるプラスミドの関係において示した。本実施例では、ＳＴＡＲ６７が、重鎖及び軽鎖が１つのプラスミド上にある場合にＥｐＣＡＭ抗体の産生に用いることができるかどうかを調べた。各選択可能なマーカーについて同時選択法を用いた。
【００９８】
材料及び方法
重鎖ｃＤＮＡ（ＨＣ−ＥｐＣＡＭ）をＵＢ６プロモーターの制御下におき、ＩＲＥＳ配列によりゼオシン抵抗性遺伝子に連結した。軽鎖ｃＤＮＡ（ＬＣ−ＥｐＣＡＭ）をＣＭＶプロモーターの制御下におき、ＩＲＥＳ配列によりピューロマイシン抵抗性遺伝子に連結した。基本的に、これらは実施例５において用いたコンストラクトである。これら２つの発現カセットを１つのプラスミド上に、２つの発現ユニットの転写が反対方向になるように配置した。コントロールプラスミドにおいて、ＵＢ６とＣＭＶプロモーターは５００ｂｐの詰めもの（stuffer）で分離した（ＥｐＣＡＭコントロール）（図１０）。他のプラスミドにおいて、ＳＴＡＲ６７をＵＢβプロモーターとＣＭＶプロモーターの間に配置した（ＥｐＣＡＭ ＳＴＡＲ６７）（図１０）。
【００９９】
ＣＨＯ細胞の転写及び培養
チャイニーズハムスター卵巣細胞株ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−６１）を実施例２と同様にトランスフェクションして培養し、選択にはゼオシン（１００μｇ／ｍｌ）及びピューロマイシン（２．５μｇ／ｍｌ）を用いた。実施例５において、両方の選択マーカーについて連続選択を用いた。これに対して本実施例においては、両方の選択薬剤を同時に培地中に存在させた。トランスフェクション後１日で、ゼオシン及びピューロマイシンを培地中に加えた。選択培地はコロニーを単離する（トランスフェクション後約１４日）まで存在させた。コロニーを単離し２４ウェルプレートに移した後、細胞をゼオシン及びピューロマイシン存在下で培養した。
【０１００】
結果
図１１はＵＢβプロモーターとＣＭＶプロモーターの間にクローニングしたＳＴＡＲ６７を有する抗体コンストラクトをトランスフェクションすると、ＥｐＣＡＭ抗体を発現する（抗ヒトＩｇＧ抗体を用いてＥＬＩＳＡ法により測定）ＣＨＯコロニーが多く得られるということを示している。ＥｐＣＡＭ ＳＴＡＲ６７プラスミドをトランスフェクションした１９コロニーにおいてＥｐＣＡＭ産生の平均は、トランスフェクション後２５日において測定すると９．８ｐｇ／細胞／日であった。
【０１０１】
これに対して、驚くべきことにＥｐＣＡＭコントロールプラスミドをトランスフェクションするとコロニーは全く生存しなかった。ゼオシン又はピューロマイシン一方のみで選択を行った場合、ＥｐＣＡＭコントロールコロニーは生存した。しかし、選択圧を重鎖及び軽鎖の両方にかけることによって選択圧を強めた場合、このような条件ではトランスフェクションしたプラスミド中に存在するＳＴＡＲ６７を有するコロニーしか生き残ることができなくなった。
【０１０２】
この結果は、ＳＴＡＲ６７の導入が１つのＳＴＡＲ６７要素の上流及び下流に配置された２つのプロモーター、ＵＢ６プロモーター及びＣＭＶプロモーターに有益な影響を与える、ということも示している。このことはＳＴＡＲ６７が両方向性に作用しうるということを示している。
【０１０３】
ＥｐＣＡＭコントロールとＥｐＣＡＭ ＳＴＡＲ６７プラスミドとの違いは、選択圧を高くした場合にＥｐＣＡＭ ＳＴＡＲ６７のトランスフェクションだけがコロニーの形成をもたらす、という点においてはっきりしている。これにより、このプラスミドの構造を、この効果を媒介する責任を担っている領域をＳＴＡＲ６７内に同定するために用いる機会が開かれる。ＳＴＡＲ６７のより小さな重複部分を、ＥｐＣＡＭ分子を促進するＵＢ６プロモーターとＣＭＶプロモーターとの間に配置する。ＳＴＡＲ６７の部分が機能を有するならば、ゼオシン及びピューロマイシンの両方を同時に選択薬剤として用いた際にコロニーは生存するであろう。ＳＴＡＲ６７の部分が機能を有さないないならば、同様の選択条件下ではコロニーは生存しないはずである。
【０１０４】
従って、プロモーターの上流にＳＴＡＲ３７を配置することにより、そのような抗リプレッサー要素を有していないコンストラクトと比較して、ＣＨＯ細胞において有意に高いＥｐＣＡＭ抗体発現レベルがもたらされた。同様の実験を、抗ＥｐＣＡＭ抗体の重鎖及び軽鎖の発現を促進するＳＶ４０プロモーターについても行った。他の実験において、ＳＴＡＲ６７を他のＳＴＡＲ配列に交換した。更なる実験において、重鎖及び軽鎖をコードする２つの発現単位の方向を、両方が同じ方向になるように改変した。他の実験において、重鎖及び軽鎖の発現ユニットをそれぞれ異なる核酸分子上に配置し（実施例５のように）、得られたクローンを両者の選択可能マーカーについて同時に選択した。他の実験において、ホスト細胞の種類を変更した。これらの変更の組み合わせを実行した。
【図面の簡単な説明】
【０１０５】
【図１】発明の概略図である。Ａ）トランス遺伝子（例えばｄ２ＥＧＦＰ遺伝子をコードする）、ＩＲＥＳ、及び選択可能なマーカー（ｚｅｏ、ゼオシン耐性を与える）をＣＭＶプロモーターの制御下に有する（５‘から３’方向）２シストロン遺伝子。発現ユニットはＳＶ４０転写終結部位を３‘末端に有する（ｔ）。コンストラクト名はＣＭＶ−ｄ２ＥＧＦＰ−ｉｒｅｓ−Ｚｅｏ（ＣＶＭコントロール）である。 Ｂ）Ａと同様のコンストラクトであるが、ＳＴＡＲ６７がＣＭＶプロモーターの上流にクローニングされている。コンストラクト名はＳＴＡＲ６７−ＣＭＶ−ｄ２ＥＧＦＰ−ｉｒｅｓ−Ｚｅｏ（ＣＭＶ−ＳＴＡＲ６７）である。 Ｃ）Ｂと同様のコンストラクトであるが、上流及び下流のＳＴＡＲ７要素が全コンストラクトに隣接するようにクローニングされている。コンストラクト名はＳＴＡＲ７−ＳＴＡＲ６７−ＣＭＶ−ｄ２ＥＧＦＰ−ｉｒｅｓ−Ｚｅｏ−ＳＴＡＲ７（ＣＭＶ−ＳＴＡＲ６７ ７／７）である。
【図２】ＳＴＡＲ６７はＣＨＯ細胞においてＣＭＶに促進されたｄ２ＥＧＦＰの発現を改善する。１０個の独立で安定なコロニーについてｄ２ＥＧＦＰシグナルの平均をＣＨＯ細胞において示されたコンストラクトについてプロットした。Ａ）ＣＭＶコントロール；Ｂ）ＳＴＡＲ６７−ＣＭＶ、Ｘ（ＩＯ）；１０個のコロニーのｄ２ＥＧＦＰ発現レベルの平均。詳細は実施例２を参照されたい。
【図３】ＳＴＡＲ６７はＣＨＯ細胞においてＥＦ１αに促進されたｄ２ＥＧＦＰ発現を改善する。図２と同様であるが、これはＥＦ１αについてである。Ａ）ＥＦ１αコントロール；Ｂ）ＳＴＡＲ６７−ＥＦ１α。
【図４】ＳＴＡＲ６７はＣＨＯ細胞においてＵＢ６に促進されたｄ２ＥＧＦＰ発現を改善する。図２と同様であるが、これはＵＢ６についてである。Ａ）ＵＢ６コントロール；Ｂ）ＳＴＡＲ６７−ＵＢ６。
【図５】ＳＴＡＲ６７はＰＥＲ．Ｃ６細胞においてＣＭＶに促進されたｄ２ＥＧＦＰ発現を改善する。図２と同様であるが、これはＰＥＲ．Ｃ６細胞についてである。Ａ）ＣＭＶコントロール；Ｂ）ＳＴＡＲ６７−ＣＭＶ。
【図６】ＳＴＡＲ６７はＰＥＲ．Ｃ６細胞においてＥＦ１αに促進されたｄ２ＥＧＦＰ発現を改善する。図３と同様であるが、これはＰＥＲ．Ｃ６細胞についてである。Ａ）ＥＦ１αコントロール；Ｂ）ＳＴＡＲ６７−ＥＦ１α。
【図７】ＳＴＡＲ６７はＰＥＲ．Ｃβ細胞におけるＵＢ６に促進されたｄ２ＥＧＦＰ発現を改善する。図４と同様であるが、これはＰＥＲ．Ｃ６細胞についてである。Ａ）ＵＢβコントロール；Ｂ）ＳＴＡＲ６７−ＵＢ６。
【図８】ＳＴＡＲ６７はＣＨＯ−Ｋ１細胞において他のＳＴＡＲ要素と組み合わせてＳＶ４０に促進されたｄ２ＥＧＦＰ発現を改善する。図２と同様であるが、ここではＣＨＯ細胞においてＳＶ４０プロモーターと、示したコンストラクトを使用した。ｄ２ＥＧＦＰシグナルの平均をトランスフェクションして６０日後に、１８〜２０個の独立で安定したコロニーについてプロットした。Ａ）ＳＶ４０コントロール、ＳＶ４０−ＳＴＡＲ６７、ＳＶ４０−ＳＴＡＲ７／７；Ｂ）ＳＶ４０コントロール及びＳＶ４０−ＳＴＡＲ６７ ７／７。詳細は実施例４を参照されたい。
【図９】ＳＴＡＲ６７はＣＨＯ−Ｋ１細胞においてＵＢ６に促進されたＥｐＣＡＭ抗体の発現を改善する。詳細は実施例５を参照されたい。Ａ）ＳＴＡＲ要素を有していないコンストラクト；Ｂ）プロモーターの上流にあるＳＴＡＲ６７及び隣接するＳＴＡＲ７要素を有するコンストラクト。抗ＥｐＣＡＭ抗体の濃度はｐｇ／細胞／日で示した。Ｘ（１８）：１８コロニーの平均産生レベル。
【図１０】ＳＴＡＲ６及び７がエンハンサーブロッカーであるのに対して、ＳＴＡＲ６７はエンハンサーブロッカーではない。詳細は実施例６を参照されたい。
【図１１】ＳＴＡＲ６７は安定にトランスフェクションしたＣＨＯ細胞においてＵＢ６及びＣＭＶに促進された抗体発現レベルを増加させる。詳細は実施例７を参照されたい。Ａ）抗ＥｐＣＡＭ重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）をそれぞれプロモーターの後ろに含んでおり、それぞれが異なった選択可能なマーカー遺伝子に連結している単一ＤＮＡ分子（）両者のマーカーについて同時選択を使用した）：ＳＴＡＲ要素を有していないコンストラクト。コロニーは全く見いだされなかった；Ｂ）ＳＴＡＲ６７を２つのプロモーターの間に有する同じコンストラクト。抗ＥｐＣＡＭ抗体の濃度はｐｇ／細胞／日で示した。Ｘ（１９）：１９コロニーの平均産生レベル。
【０１０６】
参考文献
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【技術分野】
【０００１】
本発明は分子生物学及び生命工学の分野に関するものである。特に、本発明はホスト細胞においてタンパク質をコードしうる１つ以上の核酸の生成を改善する手段及び方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質を様々なホスト細胞内において生成し、生物及び生命工学において、例えば生物薬剤として、幅広い範囲にわたって利用することができる。このような生成方法は十分に確立されており、関心のあるタンパク質をコードする核酸（「トランスジーン」とも呼ばれる）をホスト細胞において発現することが一般に必要となる。
【０００３】
トランスジーンの発現に関連した問題の一つに、遺伝子サイレンシングによりトランスジーンが不活性化する頻度が高いために（ＭｃＢｕｒｎｅｙ ｅｔ ａｌ．， ２００２）、トランスジーンの発現が予測不可能であり、このためトランスジーンを高度に発現するためには多くのホスト細胞クローンを試験する必要がある、ということがある。更に、そのようなクローンを一度確立しても、トランスジーンの発現はしばしば不安定であり、長期間ホスト細胞を培養する間にはトランスジーン発現のサイレンシングは一般的に観察される現象である。脊椎動物細胞において、このような現象はトランスジーン遺伝子座におけるヘテロクロマチン形成によって引き起こされうるものであり、トランスジーンの転写が阻害される（Ｗｈｉｔｅｌａｗ ｅｔ ａｌ．， ２００１）。トランスジーンサイレンシングは確率論的なものである。即ち、トランスジーンがゲノムに組み込まれた直後、又は多数の細胞分裂後のみに生じうるものである。このことにより長期間培養した後に不均一な細胞集団が生じ、この細胞集団において、高レベルの組換えタンパク質を発現する細胞もあれば、低レベル又は検出不可能なレベルでタンパク質を発現する細胞もある（Ｍａｒｔｉｎ ＆ Ｗｈｉｔｅｌａｗ， １９９６， ＭｃＢｕｒｎｅｙ ｅｔ ａｌ．， ２００２）。不均一なタンパク質生成に用いる細胞株は単一の細胞に由来しているが、しばしば大規模化されており、長期間にわたって維持されており、１，０００リットル以上の培地中でｍｌ当たり１０００万細胞を超える細胞密度となっている。このような大きな細胞集団（１０１４−１０１６細胞）はトランスジーンサイレンシングにより生産性が大きく低下してしまいやすい（Ｍｉｇｌｉａｃｃｉｏ ｅｔ ａｌ．， ２０００， Ｓｔｒｕｔｚｅｎｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９９）。
【０００４】
上記の問題を解決する可能性の一つに発現系においていわゆるＳＴＡＲ配列を用いる、というものがある。このようなＳＴＡＲ配列の様々なものがＷＯ ０３／００４７０４に記載されている。これらの配列は、様々なホスト細胞における発現コンストラクトを用いたタンパク質生成の予測可能性、収率又は安定性のいずれか又は任意の組み合わせを改善することができる（ＷＯ ０３／００４７０４；Ｋｗａｋｓ ｅｔ ａｌ．， ２００３）。
【０００５】
国際公開ＷＯ ０３／１０６６７４には様々な細胞株において組換えタンパク質をコードする核酸を発現するためのＳＴＡＲ配列の利用が記載されている。
【０００６】
国際公開ＷＯ ０３／１０６６８４には抗体のような多量体タンパク質をコードする核酸を発現するためのＳＴＡＲ配列の利用が記載されている。
【０００７】
本発明はタンパク質生成を改善するための別の手段及び方法を提供することを目的とするものである。
【発明の開示】
【０００８】
発明の概要
ある実施態様において、本発明は、ａ）配列番号６６，ｂ）配列番号６６の断片であって、抗リプレッサー活性を有する前記断片、ｃ）ヌクレオチド配列についてａ）又はｂ）に少なくとも７０％相同な配列であって、抗リプレッサー活性を有する前記配列、並びにｄ）ａ）〜ｃ）の任意の１つの相補体、よりなるグループから選択された抗リプレッサー活性を有する核酸配列を有する組換え核酸分子を提供し、前記組換え核酸分子は更に発現カセットを有しており、前記発現カセットは関心のある核酸と連結した異種プロモーターを有しており、関心のある前記核酸は好ましくは関心のあるタンパク質の全長又は一部をコードしている。好ましい実施態様において、抗リプレッサー活性を有する前記核酸配列は前記発現カセット内で前記プロモーターの上流に位置しており、特に好ましい実施態様において、抗リプレッサー活性を有する前記配列及び前記プロモーターは２ｋｂ未満離れている。特定の実施態様において、関心のあるタンパク質をコードする前記核酸は更に選択可能なマーカー遺伝子をコードする多シストロン遺伝子内に存在する。特定の実施態様において、前記分子は抗リプレッサー活性を有する少なくとも一つの他の配列を更に有しており、前記少なくとも一つの他の配列はａ）配列番号１〜６５のいずれか、ｂ）配列番号１〜６５のいずれかの断片であって、抗リプレッサー活性を有する前記断片、ｃ）ヌクレオチド配列についてａ）又はｂ）に少なくとも７０％相同な配列であって、抗リプレッサー活性を有する前記配列、並びにｄ）ａ）〜ｃ）の任意の１つの相補体、から選択されたものである。本発明は又、５‘−抗リプレッサー配列Ａ−プロモーター−関心のあるタンパク質の全長又は一部をコードする核酸−抗リプレッサー配列Ｂ−３’を含む発現カセットを有する核酸分子を提供するものであって、抗リプレッサー配列Ａ及びＢは同じものであっても異なるものであってもよく、（ｉ）配列番号１〜６５のいずれか、（ｉｉ）配列番号１〜６５のいずれかの断片であって、抗リプレッサー活性を有する前記断片、（ｉｉｉ）ヌクレオチド配列についてａ）又はｂ）に少なくとも７０％相同な配列であって、抗リプレッサー活性を有する前記配列、並びにｉｖ）（ｉ）〜（ｉｉｉ）の任意の１つの相補体であって、前記発現カセットは更に前記抗リプレッサー配列ＡとＢの間にａ）配列番号６６，ｂ）配列番号６６の断片であって、抗リプレッサー活性を有する前記断片、ｃ）ヌクレオチド配列についてａ）又はｂ）に少なくとも７０％相同な配列であって、抗リプレッサー活性を有する前記配列、並びにｄ）ａ）〜ｃ）の任意の１つの相補体、よりなるグループから選択された抗リプレッサー活性を有する配列を有するという特徴を備えている。
【０００９】
本発明は更に本発明に従う分子を有する細胞を提供する。好ましくは、前記細胞は哺乳類細胞であって、特定の実施態様において前記細胞はＣＨＯ細胞である。
【００１０】
本発明は更に関心のあるタンパク質を生成する方法を提供するものであり、この方法は関心のあるタンパク質をコードする組換え核酸分子を有する細胞を培養して前記細胞内で関心のあるタンパク質をコードする前記核酸を発現させるステップを有しており、前記組換え核酸分子はａ）配列番号６６，ｂ）配列番号６６の断片であって、抗リプレッサー活性を有する前記断片、ｃ）ヌクレオチド配列についてａ）又はｂ）に少なくとも７０％相同な配列であって、抗リプレッサー活性を有する前記配列、並びにｄ）ａ）〜ｃ）の任意の１つの相補体、よりなるグループから選択された抗リプレッサー活性を有する核酸配列を有するという特徴を備えている。好ましい実施態様において、この方法は関心のある前記タンパク質を単離するステップを更に有する。好ましい実施態様において、抗リプレッサー活性を有する前記核酸配列は、関心のあるタンパク質の発現を制御するプロモータの上流に位置している。その好ましい実施態様において、抗リプレッサー活性を有する前記配列と前記プロモーターは２ｋｂ未満離れている。特定の実施態様において、関心のあるタンパク質をコードする前記核酸は更に選択可能マーカー遺伝子をコードする多シストロン遺伝子内に存在する。特定の実施態様において、前記細胞は哺乳類細胞、例えばＣＨＯ細胞である。
【００１１】
本発明は又、ａ）配列番号６６，ｂ）配列番号６６の断片であって、抗リプレッサー活性を有する前記断片、ｃ）ヌクレオチド配列についてａ）又はｂ）に少なくとも７０％相同な配列であって、抗リプレッサー活性を有する前記配列、並びにｄ）ａ）〜ｃ）の任意の１つの相補体、よりなるグループから選択された抗リプレッサー活性を有する核酸配列の使用方法を提供し、関心のある核酸の発現を増加させる。
【００１２】
更に他の態様において、本発明は関心のある２種類のポリペプチドを発現するホスト細胞を生成する方法を提供する。この方法は、ａ）ホスト細胞内に１種類以上の核酸分子を導入するステップであって、この又はこれらの核酸分子はすべて、（ｉ）第１の関心のあるポリペプチドをコードする配列及び第１の選択可能マーカー遺伝子に機能的に連結したプロモーター、（ｉｉ）第２の関心のあるポリペプチドをコードする配列及び第２の選択可能マーカー遺伝子に機能的に連結したプロモーター、並びに（ｉｉｉ）ａ）配列番号１〜６６，ｂ）配列番号１〜６６の断片であって、抗リプレッサー活性を有する前記断片、ｃ）ヌクレオチド配列についてａ）又はｂ）に少なくとも７０％相同な配列であって、抗リプレッサー活性を有する前記配列、並びにｄ）ａ）〜ｃ）の任意の１つの相補体、よりなるグループから選択された少なくとも１つの抗リプレッサー活性を有する配列、を有している上記ステップ、及びｂ）前記第１及び第２の選択可能マーカー遺伝子についてほぼ同時に選択することによりホスト細胞を選択するステップを有する。本発明は又、関心のある２種類のポリペプチドを発現する方法を提供するものであり、この方法は本発明のこの観点に従う方法により得られたホスト細胞を培養して前記第１及び第２のポリペプチドを発現させるステップと、任意で前記ポリペプチドを単離するステップとを有する。ある実施態様において、抗リプレッサー活性を有する前記配列は、ａ）配列番号６６、ｂ）配列番号６６の断片であって、抗リプレッサー活性を有する前記配列、ｃ）ａ）又はｂ）に少なくとも７０％相同な配列であって、抗リプレッサー活性を有する前記配列、並びにｄ）ａ）〜ｃ）の任意の１つの相補体、よりなるグループから選択される。特定の実施態様において、前記２種類のポリペプチドは多量体タンパク質の一部である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
発明の詳細な説明
抗リプレッサー配列
本明細書に用いる抗リプレッサー活性を有する配列とは、ＨＰ１又はＨＰＣ２タンパク質の抑制効果を、これらのタンパク質をＤＮＡに結合させた際に少なくとも部分的に拮抗することができる配列である。本発明に好適な抗リプレッサー活性を有する配列（本明細書において抗リプレッサー配列又は抗リプレッサー要素と称することもある）は本明細書に参考として組み込んだＷＯ ０３／００４７０４に開示されており、ここでは「ＳＴＡＲ」配列という新しい言葉が作られている。（本明細書内においてある配列がＳＴＡＲ配列と呼ばれる場合には必ず、この配列は本明細書に従う抗リプレッサー活性を有する）限定されない具体例として、ＳＴＡＲ１〜６５（ＷＯ ０３／００４７０４参照）と名付けられた６５種類の抗リプレッサー要素の配列は本明細書においてはそれぞれ配列番号１〜６５として示されている。
【００１４】
本明細書に従って、所与の抗リプレッサー要素の機能的断片又は誘導体は、まだ抗リプレッサー活性を有している場合には、前記抗リプレッサー要素に相当すると考えられる。このような抗リプレッサー活性の有無は当業者により、例えば以下に記載した分析により容易に確認することができる。機能的断片又は誘導体は、分子生物学の当業者により、所与の抗リプレッサー配列から始め、欠失、付加、置換、転座などを行うことにより容易に得られる（例えば、ＷＯ ０３／００４７０４参照）。機能的断片又は誘導体は又、他の生物種からのオルソログを有しており、これは既知の抗リプレッサー配列を用いて当業者により知られている方法により見いだすことができる（例えば、ＷＯ ０３／００４７０４参照）。従って、本発明は抗リプレッサー配列の断片も含むものであって、前記断片はまだ抗リプレッサー活性を有している。所与の配列の断片について、相同率とは断片中に存在する参照とする元々の配列の割合のことを示す。ヌクレオチド配列について抗リプレッサー活性を有する前記配列に対して又は抗リプレッサー活性を有する配列の機能的断片に対して少なくとも７０％相同な配列についても、少なくとも７０％が相同なこれらの配列が本発明に従う抗リプレッサー活性を有する限り、本発明に含まれるものである。好ましくは、前記配列は参照とする元々の配列又はその機能的断片に対して少なくとも８０％が相同であり、更に好ましくは、少なくとも９０％が相同であり、より一層好ましくは少なくとも９５％が相同である。
【００１５】
本発明に従う抗リプレッサー活性を有する配列は様々な方法により得ることができるものであり、そのような方法にはヒトゲノム又は他の生物のゲノムからクローニングする、又は例えば配列がわかっていることを利用して既知の抗リプレッサー配列を直接そのようなゲノムから例えばＰＣＲにより増幅する、という方法が含まれるがこれらに限定されるものではなく、又は部分的に又は全長を化学的に合成することができる。
【００１６】
抗リプレッサー活性を有する配列並びにその機能的断片又は誘導体は本明細書においてその配列により構造的に定義され、加えて抗リプレッサー活性を有する配列として機能的に定義され、このような抗リプレッサー活性は以下に記載する分析により測定することができる。
【００１７】
本発明に従う抗リプレッサー活性を有するいかなる配列も少なくとも以下の機能的分析を通過することができなければならない（本明細書に参考として示したＯ ０３／００４７０４実施例１を参照）。ヒトＵ−２ ＯＳ細胞（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−９６）には、Ｔｅｔ−Ｏｆｆ転写制御システムの制御下で、ｐＴｅｔ−Ｏｆｆプラスミド（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｋ１６２０−Ａ）並びに、ＬｅｘＡ ＤＮＡ結合ドメイン及びＨＰ１又はＨＰＣ２（ＤＮＡに結合した際に遺伝子発現を抑制するショウジョウバエポリコームグループタンパク質；いずれかの融合タンパク質により分析がうまくいく）のいずれかのコード領域を含むＬｅｘＡ−リプレッサー融合タンパク質をコードする核酸を安定してトランスフェクションされる（Ｇｏｓｓｅｎ ａｎｄ Ｂｕｊａｒｄ， １９９２）。これらの細胞は以下で抗リプレッサー活性分析のレポーター細胞として称される。レポータープラスミドは、ハイグロマイシン抵抗性を提供するものであって、４つのＬｅｘＡ作用部位とゼオシン抵抗性遺伝子を制御するＳＶ４０プロモーターとの間にポリリンカー配列を有する。抗リプレッサー活性を試験する配列は前記ポリリンカー内にクローン化することができる。ｐＳｅｌｅｃｔのような好適なレポータープラスミドの作製は実施例１及びＷＯ ００／００４７０４の図１に記載されている。レポータープラスミドをレポーター細胞にトランスフェクションし、細胞をハイグロマイシン選択（２５μｇ／ｍｌ；レポータープラスミドの存在を選択する）及びテトラサイクリン抑制（ドキシサイクリン、１０ｎｇ／ｍｌ；ＬｅｘＡ−リプレッサー融合タンパク質の発現を阻害する）下で培養する。これらの条件下で１週間成長させた後、ドキシサイクリン濃度を０．１ｎｇ／ｍｌ（又は未満）まで下げてＬｅｘＡ−リプレッサー遺伝子を誘導し、２日後にゼオシンを２５０μｇ／ｍｌになるように加える。細胞を５週間、コントロール培養物（空レポータープラスミド、即ち、クローン化した抗リプレッサー配列をポリリンカー内に欠いたものでトランスフェクトされた）がゼオシンにより死滅するまで培養する（このコントロールプラスミドにおいて、ＳＶ４０プロモーターはＬｅｘＡ作用部位に結合するＬｅｘＡ−リプレッサー融合タンパク質により抑制されており、そのような細胞においてはゼオシン発現が不十分でありゼオシン選択で生存することができる）。配列が本発明に従う抗リプレッサー活性を有するとするのは、前記配列をレポータープラスミド内にクローン化した際に、レポーター細胞がゼオシン存在下の５週間の選択後も生存した場合である。このようなコロニーからの細胞は５週間のゼオシン選択後にゼオシンを含有する新たな培地でもまだ増殖することができるが、抗リプレッサー配列を持たないレポータープラスミドをトランスフェクションした細胞はゼオシンを含有する新たな培地では増殖することはできない。この分析においてゼオシン下において５週間後のこのような成長をさせることができない配列はいずれも、本発明に従う抗リプレッサー活性を有する配列、又はその機能的断片若しくは機能的誘導体としては認められない。例えば、ショウジョウバエｓｃｓ（Ｋｅｌｌｕｍ ａｎｄ Ｓｃｈｅｄｌ， １９９１）、トリβ−グロブリン遺伝子座の５‘−ＨＳ４（Ｃｈｕｎｇ ｅｔ ａｌ， １９９３， １９９７）又は基質接着領域（ＭＡＲｓ）（Ｐｈｉ-Ｖａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９０）といった、Ｖａｎ ｄｅｒ Ｖｌａｇら（２０００）により試験された既知の境界配列は、この分析では生存しない。
【００１８】
加えて、前記レポーター遺伝子が抗リプレッサー配列に隣接していない、又はショウジョウバエｓｃｓのようなより弱い抑制ブロッキング配列に隣接していない場合と比べ、Ｕ−２ ＯＳ又はＣＨＯ細胞のゲノムに組み込まれているレポーター遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ、ＧＦＰ）に隣接している場合には、抗リプレッサー配列又はその機能的断片若しくは誘導体がクローンを過剰発現しているレポーターがより高い割合を示すのが好ましい。このことはＷＯ ０３／００４７０４の実施例１及び図２に記載されているように、例えばｐＳＤＨベクター又は同様のベクターを用いることにより確認することができる。
【００１９】
本発明の抗リプレッサー要素はタンパク質の産生について、（１）ホスト細胞株が工業的に許容可能なレベルのタンパク質を発現していると同定できる予測可能性を向上させる、（２）ホスト細胞株のタンパク質収量を増加させる、および／または（３）ホスト細胞株が長期間の培養中により安定してタンパク質を産生する、の３つのうち少なくとも１つの結果を有することができる。各特性については以下に詳細を記す。
【００２０】
（１）予測可能性の向上：トランス遺伝子発現カセットの組込みはホスト細胞ゲノム内でランダムな位置で起こりうる。しかし、ゲノムの多くは転写されないヘテロクロマチンである。発現カセットがトランス遺伝子に隣接する抗リプレッサー要素を有している場合、その位置に組み込むことにより発現に対する効果が減弱される。抗リプレッサー要素は隣接するヘテロクロマチンがトランス遺伝子を不活化できなくさせる。結果として、許容可能な発現レベルを有しているトランス遺伝子を含んでいるホスト細胞の割合が増える。実際抗リプレッサー配列を組み込むことにより、等量のＤＮＡをトランスフェクションした場合、抗リプレッサー配列を有していない同一のトランス遺伝子と比べて、最大１０倍のコロニーが確立された。
【００２１】
（２）収量：組換えホスト細胞のはじめの集団におけるタンパク質の発現レベルを、トランス遺伝子を組み込んだ直後に調べた。集団における個々のクローンの発現レベルは様々である。しかし、トランス遺伝子が抗リプレッサー要素により保護されている場合には、そのばらつきは小さくなっている。このようなばらつきの減少は、発現レベルの低いより少ないクローンを回収した際に最も顕著となる。更に、抗リプレッサー要素を有する集団では一般に個々のクローンが顕著に高い発現を示していた。これらの高い収量のクローンは、タンパク質を回収する目的で、又は細胞又はそのような細胞を有する生物体の表現型を変える目的でタンパク質を産生するのに好ましい。
【００２２】
（３）安定性の向上：抗リプレッサー要素は、トランス遺伝子が長期間の培養中に転写が抑制されないようにすることにより、組換えホスト細胞株におけるトランス遺伝子の安定性を向上する。比較試験において、抗リプレッサー要素により保護されていないトランス遺伝子が徐々に抑制されていく条件下（培養中、５〜２５回継代）では、抗リプレッサー要素に保護されたトランス遺伝子は高いレベルで発現を維持した。このことは、細胞培養が数週間から何ヶ月という長期間にわたるたんぱく性分子の工業生産においては利点となる。同様に、長期間にわたる発現の安定性は、抗リプレッサー保護トランス遺伝子の組み換え発現により表現型が変化した植物又は動物において利点となりうる。
【００２３】
ＳＴＡＲ６７
本発明は抗リプレッサー活性を有し、ＳＴＡＲ６７（配列番号６６）と新たに命名された新規配列を提供する。この抗リプレッサー配列は、本明細書に示した実施例より明らかなように、関心のある遺伝子の発現を誘導するプロモーターの上流におかれた場合にのみ発現を顕著に向上させる。これに対し、ＳＴＡＲ６又はＳＴＡＲ７といったこれまで知られた抗リプレッサー配列はこの点において有利ではない（これらはトランス遺伝子に隣接している場合、即ち、トランス遺伝子の上流及び下流の両方に存在する場合に、特によく機能する）。従って、ＳＴＡＲ６７はすでに知られている抗リプレッサー配列の代わりとなり、このような既知の抗リプレッサー配列と比べてプロモーターの上流においた場合には利点を増強するように思われる。ＳＴＡＲ６７はエンハンサーブロッカーではなく、このことはこの特性について試験した他の抗リプレッサー配列とは対照的であり（Ｋｗａｋｓ ｅｔ ａｌ， ２００３）、ＳＴＡＲ６７とこれまで開示された他の抗リプレッサー配列とのもう一つの違いとなる。或いは又、ＳＴＡＲ６７は実施例７に示すとおり両方向性に作用することができる。本発明に従って、ＳＴＡＲ６７配列が発現カセット内に存在することにより、発現の予想可能性および／または収量および／または安定性が改善する。本明細書において、ＳＴＡＲは様々なプロモーターとの組み合わせにおいて、様々な細胞株において機能を有することが示されている。
【００２４】
発現カセット
本発明に記載のＳＴＡＲ６７を有する核酸分子は任意の形態をとることが可能であり、例えばＤＮＡ断片として、必要に応じてプラスミドのような、好ましくは発現ベクターのようなクローニングベクター上に存在しており、例えば標準的な組換えＤＮＡ技術を用いてクローニングする目的で用いることができる。本発明の好ましい実施態様において、核酸は発現カセットを有しており、これは例えばホスト細胞において関心のある配列を発現するのに有用である。
【００２５】
本明細書において用いる発現カセットとは、発現を期待する配列に機能的に連結したプロモーターを少なくとも有する核酸配列であり、この発現を期待する配列は好ましくは関心のあるタンパク質の全長又は一部をコードするオープンリーディングフレームである。プロモーターは関心のある前記核酸について異種のプロモーターであり、これによりこの異種のプロモーターは関心のある前記配列の天然のプロモーターではないプロモーターとして定義される。言い換えれば、例えば分子クローニングのようなある形での人間の介入をいずれかの時点で関心のある核酸と異種のプロモーターとの機能的な組み合わせをなすために用いるものであり、この関連から、異種のプロモーターを関心のある配列と同じ又は異なる生物体から得られるということが容易に理解されるであろう。好ましくは、発現カセットは更に転写集結及びポリアデニル化配列を有する。エンハンサーのような他の制御配列も含むことができる。本発明に従う発現単位は更に、ＳＴＡＲ６７のような抗リプレッサー配列を少なくとも１つ有する。特定の好ましい実施態様において、前記抗リプレッサー配列、好ましくはＳＴＡＲ６７は前記プロモーターの上流に位置しており、好ましくは抗リプレッサー配列の３‘末端とプロモーター配列の開始点の間には２ｋｂ未満存在するようになっている。好ましい実施態様において、１ｋｂ未満、より好ましくは５００ヌクレオチド（ｎｔ）未満、更により好ましくは約２００、１００、５０又は３０ｎｔ未満が、好ましくは抗リプレッサー配列の３‘末端とプロモーター配列の開始点の間に存在する。特定の好ましい実施態様において、抗リプレッサー配列はプロモーターの上流に直接クローニングされており、好ましくは抗リプレッサー配列の３‘末端とプロモーター配列の開始点の間には約０〜２０ｎｔしか存在しない。
【００２６】
組換えタンパク質をコードする核酸配列の発現を得るために、そのような発現を誘導することのできる配列を、タンパク質をコードする核酸配列に機能的に連結することができ、これにより組換えタンパク質をコードする組換え核酸配列が発現可能な形態となる、ということが当業者に周知されている。一般に、プロモーター配列は関心のあるタンパク質の上流に位置している。有用な発現ベクターは当該技術分野にて入手可能であり、例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のｐｃＤＮＡ及びｐＥＦ、ＢＤ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社のｐＭＳＣＶ及びｐＴＫ−Ｈｙｇ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社のｐＣＭＶ−Ｓｃｒｉｐｔなどがある。
【００２７】
関心のあるポリペプチドをコードする配列がコードするポリペプチドの転写及び翻訳を制御する配列に関して適切に挿入されている場合、できあがる発現カセットは、発現に関して、関心のあるタンパク質を産生するのに有用なものとなる。発現を誘導する配列には、プロモーター、エンハンサーなど、及びこれらの組み合わせが含まれうる。これらはホスト細胞内で機能し、それによって機能的に連結した核酸配列の発現を誘導することができる。当業者であれば、様々なプロモーターをホスト細胞において関心のあるタンパク質の発現を得るために用いることができる、ということを知っている。プロモーターは構成性であっても調節性であってもよく、ウイルス、原核生物、真核生物を含む様々なものに由来するものであっても、人工的に設計されたものであっても良い。関心のある核酸の発現は本来のプロモーター又はその誘導体に由来しても、完全に異種のプロモーターに由来してもよい（Ｋａｕｆｍａｎ， ２０００）。よく知られており、真核細胞における発現のためによく用いられるプロモーターには、例えばＥＩＡプロモーターなどのアデノウイルスのようなウイルスに由来するプロモーター、ＣＭＶ極早期（ＩＥ）プロモーター（本明細書においてＣＭＶプロモーターと称する）（例えば、ｐｃＤＮＡとしてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から入手可能）のようなサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）由来のプロモーター、Ｓｉｍｉａｎウイルス４０（ＳＶ４０）由来のプロモーター（Ｄａｓ ｅｔ ａｌ， １９８５）などがある。好適なプロモーターはメタロチオネイン（ＭＴ）プロモーター、伸長因子１ａ（ＥＦ−１α）プロモーター（Ｇｉｌｌ ｅｔ ａｌ．、 ２００１）、ユビキチンＣ又はＵＢ６プロモーター（Ｇｉｌｌ ｅｔ ａｌ．、 ２００１； Ｓｃｈｏｒｐｐ ｅｔ ａｌ．、 １９９６）、アクチンプロモーター、免疫グロブリンプロモーター、熱ショックプロモーターなどのような、真核生物に由来するものであっても良い。真核細胞における発現を得るのに好ましいプロモーターには、これらは本発明に好適なプロモーターであるのだが、ＣＭＶプロモーター、哺乳動物ＥＦ１−αプロモーター、ユビキチンＣプロモーターのような哺乳動物ユビキチンプロモーター、又はＳＶ４０プロモーター（例えば、ｐＩＲＥＳとしてカタログ番号６３１６０５にてＢＤ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社より入手可能）である。プロモーターとしての機能及びプロモーターの強さの試験は当業者にとっては日常的な事柄であり、一般には例えば、ＬａｃＺ、ルシフェラーゼ、ＧＦＰといった試験遺伝子をプロモーター配列の後部にクローニングする手順を含んでおり、テスト遺伝子の発現を試験する。もちろん、プロモーターを配列内で欠失、付加、変異により変化させ、機能を試験し、新規の減弱した、又は強化したプロモーター配列を見いだすことができる。
【００２８】
本発明に従う発現カセットは、単シストロンであっても、２シストロンであっても、又は多シストロンであっても良い。用語「２シストロン遺伝子」とは、２種類のタンパク質／ポリペプチドをコードするＲＮＡ分子を提供することができる遺伝子として定義される。用語「単シストロン遺伝子」とは、１種類のタンパク質／ポリペプチドをコードするＲＮＡ分子を提供することができる遺伝子として定義される。用語「多シストロン遺伝子」とは、２種類以上のタンパク質／ポリペプチドをコードするＲＮＡ分子を提供することができる遺伝子として定義され、２シストロン遺伝子は従って多シストロン遺伝子の定義に含まれる。本発明において用いる「遺伝子」とは染色体ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、人工ＤＮＡ、これらの組み合わせなどを含みうるものであり、例えばＲＮＡのような他の核酸の形態もとりうるものである。ある実施態様において、タンパク質発現単位は多シストロン遺伝子を有している。いくつかのシストロンを有する単位は１つのｍＲＮＡとして転写される。このＲＮＡ上に存在する２番目以降のコード領域は様々なやり方で翻訳されるが、そのやり方には翻訳再開部位又は内部リボソーム侵入部位を用いるやり方があるが、後者が好まれる。２又は多シストロン単位の一つの利点は、関心のあるタンパク質又はポリペプチドをコードする核酸の下流に選択可能なマーカータンパク質をコードする核酸を配置することにより、関心のあるタンパク質を発現するクローンを簡単に選択できることである。
【００２９】
多シストロンタンパク質の産生のために、２つ以上の発現カセットを用いることができる。この実施態様は、例えば抗体の重鎖及び軽鎖の発現について良好な結果が得られることが示されている。本発明に従い、これらの発現カセットのうち少なくとも１つが、好ましくはそれぞれがＳＴＡＲ配列を有する必要がある。他の実施態様において、多シストロンタンパク質の多種のサブユニット又は部分が単一の発現カセット上に存在する。
【００３０】
発現カセット内においてプロモーターの上流に配置された抗リプレッサー配列が存在する代わりに、又はそれに加えて、抗リプレッサー配列を発現カセットの両側に配置し、トランス遺伝子を有する発現カセットに２つの抗リプレッサー配列が隣接しているようにすることは非常に有用であることが証明されている。ここで、ある実施態様において、２つのリプレッサー配列は互いにほぼ同一のものである。もちろん、このことはＳＴＡＲ６７を用いて、発現カセットが２つのＳＴＡＲ６７配列に隣接するようにすることも可能である。発現カセット内において単一のＳＴＡＲ６７配列が他の位置をとること、例えば、トランス遺伝子の後ろ、好ましくは転写終止点及びポリアデニル化シグナルの後ろであって、ＳＴＡＲ６７配列の３‘末端がトランス遺伝子に接するようにする位置をとることも可能である。
【００３１】
本発明に従う発現カセットは任意で選択マーカー遺伝子を有することができる。用語「選択マーカー又は選択可能なマーカー」とは一般に、細胞内で直接的又は間接的に存在が検出できる遺伝子および／またはタンパク質、例えば、選択薬剤を不活性化し、ホスト細胞を薬剤の致死的又は成長抑制作用から保護する遺伝子および／またはタンパク質（例えば、抗生物質抵抗性遺伝子および／またはタンパク質）のことを指すために用いられる。他の可能性として、前記選択マーカーは蛍光物質又は色素沈着（例えば、緑色蛍光タンパク質及び誘導体、ルシフェラーゼ、ｌａｃＺ、アルカリフォスファターゼなど）を誘導する。ある実施態様において、本発明に用いる選択マーカーはゼオシンであり、第２発現カセットを選択するための選択マーカーにはピューロマイシンを用いる。当業者であれば、ネオマイシン、ブラストサイジン、ピューロマイシン、ブレオマイシン、ハイグロマイシン、ｄｈｆｒなどの他の選択マーカーも入手可能であり利用することができる、ということを知っているであろう。
【００３２】
用語「選択」とは一般に選択マーカー又は選択可能なマーカー、及び選択薬剤を用いて特定の遺伝的性質を有するホスト細胞（例えば、ホスト細胞がゲノムに組み込まれたトランス遺伝子を有していること）を同定する過程として定義される。選択マーカーの多様な組み合わせが可能であることが当業者には明らかである。使用可能な抗生剤の具体例は上に記した。特に有能な抗生剤の一つはゼオシンであり、これはゼオシン抵抗性タンパク質（ゼオシン−Ｒ）が薬剤に結合することにより作用し、ゼオシンを無毒化するからである。これにより、ゼオシン−Ｒの発現が低いレベルでの細胞を殺すが、発現量の多い細胞を生存させる薬剤の量を容易に測定することができる。他の抗生物質抵抗性タンパク質はすべて一般に酵素であり、従って触媒として作用する（薬剤と１：１ではない）。２段階の選択を行う際には従って、作用がこのような１：１で結合する型の抗生物質抵抗性タンパク質を用いるのが有用である。従って、抗生物質ゼオシンは好適な選択マーカーである。簡便にするために、例えば単シストロン遺伝子で存在しうる、例えばピューロマイシン、ブラストサイジン又はハイグロマイシンと組み合わせた２段階の選択方法においてゼオシン抗生物質を用いることができる。
【００３３】
抗生物質の選択マーカーと、蛍光物質の誘導を生じる又は色素沈着を生じる選択マーカーを組み合わせることも可能である。用いる細胞で機能するならば、様々なプロモーターを用いることが可能である。
【００３４】
ある実施態様において、発現カセットに、翻訳効率が低下したタンパク翻訳開始部位の具体例として（弱い）内部リボソーム結合部位（ＩＲＥＳ）を、例えば関心のあるタンパク質のオープンリーディングフレームと選択マーカーのオープンリーディングフレームとの間に入れる。ＩＲＥＳ要素からのタンパク質の翻訳はキャップ依存的翻訳と比べて効率が低い。ＩＲＥＳ依存的オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に由来するタンパク質量は第１のＯＲＦに由来する量の２０〜５０％未満である。更に、ＩＲＥＳ要素の変異によりその活性を弱め、ＩＲＥＳ依存的ＯＲＦからの発現を第１のＯＲＦの１０％未満に減らすことができる（Ｌｏｐｅｚ ｄｅ Ｑｕｉｎｔｏ ＆ Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｓａｌａｓ， １９９８， Ｒｅｅｓ ｅｔ ａｌ．， １９９６）。ＩＲＥＳ依存的ＯＲＦが選択可能マーカータンパク質をコードしている場合、翻訳の相対的レベルが低いということは、組換えホスト細胞が選択されるためには絶対的レベルで高い転写が起こっていなければならない、ということを意味している。従って、選択された組換えホスト細胞の分離株は必ず多量のトランス遺伝子ｍＲＮＡを発現していることになる。組換えタンパク質はキャップ依存的ＯＲＦから翻訳されるので、組換えタンパク質は大量に翻訳され高収量となる。
【００３５】
従来の発現システムは、組換えプラスミド又は組換えウイルスゲノムの形態のＤＮＡ分子であった。プラスミド又はウイルスゲノムは（真核ホスト）細胞に導入され、好ましくは当該技術分野で知られる方法によりこれらのゲノムに組み込まれる。好ましい実施態様において、本発明はこのような種類のＤＮＡ分子を用いて改善されたトランス遺伝子発現システムを運ぶこともある。本発明の好ましい実施態様は、プラスミドＤＮＡを用いて発現システムを運ぶというものである。プラスミドには多くの要素が含まれ：当業者に知られている従来の要素は、プラスミドが細菌細胞内で増殖するための複製開始点及び選択可能なマーカー；真核細胞内で機能し、組み込まれたトランス遺伝子発現システムを有するホスト細胞を同定し単離する選択可能なマーカー；関心のあるタンパク質をコードしている核酸であって、その高レベルの転写が真核細胞において機能するプロモーター（例えば、ヒトサイトメガロウイルス主要極早期プロモーター又はエンハンサー、ｐＣＭＶ（Ｂｏｓｈａｒｔ ｅｔ ａｌ．， １９８５））によりもたらされるもの；並びに関心のあるトランス遺伝子及び選択可能マーカーの転写終止点（例えば、ＳＶ４０ポリアデニル化部位（Ｋａｕｆｍａｎ ＆ Ｓｈａｒｐ， １９８２））などである。用いるベクターは、ＤＮＡのクローニングに好適で関心のある核酸の転写に用いることのできるものであればいかなるベクターであっても良い。ホスト細胞をもちいる場合には、ベクターを組み込みベクターとすることが好ましい。或いは又、ベクターはエピソームとして複製するベクターとすることができる。
【００３６】
発現カセットの可能な構造の概略図を図１に示すが、これに制限されるものではない。これはプラスミドにおける発現カセットのＤＮＡ要素の構造であるとともに、ゲノムに組み込まれた後のものでもある。コンストラクトＡはタンパク質をコードする発現ユニット（遺伝子）を有する。これは弱められたＥＭＣＶ ＩＲＥＳ（Martinez-Salas et al 1999; Mizuguchi et al）及び、ゼオシン抵抗性選択可能なマーカータンパク質（ｚｅｏ）をコードするオープンリーディングフレームの上流にある。遺伝子カセットはＳＶ４０転写終止点を３‘末端に有する（ｔ）。この２シストロンのトランス遺伝子はＣＭＶプロモーターから高いレベルで転写される。コンストラクトＢはコンストラクトＡに由来するものであるが、ここではＳＴＡＲ６７がＣＭＶプロモーターの上流にクローニングされている。コンストラクトＣはコンストラクトＢに由来するが、ここでは２つの抗リプレッサー要素（この場合にはＳＴＡＲ７）が全カセットに隣接してクローニングされている。
【００３７】
発現カセットにおける抗リプレッサー配列の組み合わせ
本明細書において、プロモーターの上流の第１の抗リプレッサー配列を配置することと発現カセットに２つの他の抗リプレッサー配列を隣接させることとを組み合わせることにより、最上の結果が得られることが示されている。特に、ＣＨＯ細胞においてＳＶ４０プロモーターを用いる場合には、抗リプレッサー配列がない場合であっても発現はすでに非常に高いものとなっているが、ＳＴＡＲ６７を前記プロモーターの上流に配置し、発現カセット全体を例えばＳＴＡＲβ、ＳＴＡＲ７又はＳＴＡＲ４０のような２つの抗リプレッサー配列により隣接させた場合には、発現は大幅に増加する。
【００３８】
従って本発明の目的は、（５‘から３’へ）抗リプレッサー配列Ａ−プロモーター−関心のあるタンパク質をコードする核酸−抗リプレッサー配列Ｂ、を有する発現カセットを有する組換え核酸分子を提供することであって、前記発現カセットは更に前記抗リプレッサー配列Ａ及びＢの間に抗リプレッサー配列Ｃを有することを特徴とするものである。好ましい実施態様において、前記抗リプレッサー配列Ｃは前記プロモーターの上流に存在しており、上記のように「発現カセット」の頭に位置する構造となっている。抗リプレッサー配列Ａ及びＢの間の発現カセットは更に上記のような発現カセットのための配列、例えば転写終止配列、ポリアデニル化シグナル、選択マーカー遺伝子、エンハンサーなどを有することができ、又上記の通り単シストロンであっても、２シストロンであっても、又は多シストロンであっても良い。
【００３９】
抗リプレッサー配列Ａ、Ｂ及びＣの内２又は３つすべてが同じものであってもよく、３つすべてが異なるものであっても良い。抗リプレッサー配列Ａ及びＢは抗リプレッサー配列Ｃと同じものであっても異なるものであっても良い。ある実施態様において、抗リプレッサー配列Ａ及びＢは互いに（実質的に）同一である。ある実施態様において、抗リプレッサー配列ＣはＳＴＡＲ６７、又はその機能的断片若しくは誘導体である。抗リプレッサー配列Ａ及びＢはいかなる抗リプレッサー配列であってもよく、ある実施態様においては、配列番号１〜６５のうちの一つ、又はその機能的断片若しくは誘導体を含む。ある実施態様において、発現カセットは多シストロン遺伝子を含んでおり、なかでもその好ましい実施態様において、前記多シストロン遺伝子は関心のあるタンパク質をコードする配列及び選択マーカー遺伝子を有する。或いは又、選択マーカー遺伝子は分離したプロモーターの制御下に存在する。
【００４０】
ある実施態様において、第４の抗リプレッサー配列ＤがＳＴＡＲ配列ＡとＢの間に存在することも可能である。このような実施態様において、前記抗リプレッサー配列Ｄは好ましくは関心のあるタンパク質をコードする核酸の下流に位置する。更に、この抗リプレッサー配列Ｄは組換え核酸分子における他の抗リプレッサー配列と同じものであっても異なるものであってもよく、それはいかなる抗リプレッサー配列であってもよく、ある実施態様においては配列番号１〜６６の任意の１つ、又はその機能的断片若しくは誘導体から選択される。
【００４１】
少なくともいくつかの抗リプレッサー配列は方向性を有している可能性があるので（ＷＯ ００／００４７０４）、発現カセットに隣接する抗リプレッサー配列（抗リプレッサー配列Ａ及びＢ）は互いに反対方向に配置されており、これらの抗リプレッサー配列の各々の３‘末端が発現カセットの内側に（そして、互いの方向に）面するようになっているのが有益であろう。従って、好ましい実施態様において、抗リプレッサー要素の５’側はＤＮＡ又はクロマチンに面しており、そのトランス遺伝子への影響は前記抗リプレッサー要素により減少している。発現カセットにおいてプロモーターの上流にある抗リプレッサー要素については、３‘末端はプロモーターに面している。配列表における抗リプレッサー要素（配列番号１〜６６）の配列は特に記載がない場合には５’から３‘方向に示されている。
【００４２】
本発明に従う細胞
ＳＴＡＲ配列および／または本発明に従う発現カセットの核酸分子を、好ましくはホスト細胞において核酸の発現を改善するために用いることができる。「細胞」’Ｖ’「ホスト細胞」と「細胞株」’Ｖ’「ホスト細胞株」はそれぞれ、典型的には、当該技術分野において知られる方法により細胞培養において維持することが可能であり、異種の又は同種のタンパク質を発現する能力を有する細胞及びその均一な集団として定義される。本発明に従うホスト細胞は好ましくは真核細胞であり、より好ましくは哺乳類細胞であって、齧歯類細胞又はヒト細胞又は異なる種類の細胞を融合したものなどである。ある非限定的な実施態様において前記ホスト細胞は、Ｕ−２ ＯＳ骨肉腫、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）、ＨＥＫ２９３、ＨｕＮＳ−Ｉ骨髄腫、ＷＥＲＩ−Ｒｂ−Ｉ網膜芽細胞腫、ＢＨＫ、Ｖｅｒｏ、非分泌型マウス骨髄腫Ｓｐ２／０−Ａｇ１４、非分泌型マウス骨髄腫ＮＳＯ、ＮＣＩ−Ｈ２９５Ｒ副腎癌又はＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞である。
【００４３】
本発明のある実施態様において、ホスト細胞は少なくともアデノウイルスのＥ１Ａを、好ましくはＥ１Ｂも発現している細胞である。非限定的な具体例として、そのような細胞は例えばヒト細胞から、例えば腎臓から（例えば、ＨＥＫ２９３細胞、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ， １９７７参照）、肺から（例えば、Ａ５４９、例えば、ＷＯ ９８／３９４１１参照）若しくは網膜から（例えば、登録商標ＰＥＲ．Ｃ６で市販されているＨＥＲ細胞、米国特許第５，９９４，１２８号参照）、又は臍帯細胞から（例えば、米国特許第６，５５８，９４８号に記載のＮ５２．Ｅ６）、及び同様に他の細胞から得ることができる。このような細胞を得る方法は例えば米国特許第５，９９４，１２８号及び米国特許第６，５５８，９４８号に記載されている。本出願の目的においてＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞は、ＥＣＡＣＣ第９６０２２９４０号として寄託されている細胞の上流若しくは下流の継代由来の細胞、又は上流若しくは下流の継代由来の子孫であることを意味する。このような細胞はタンパク質を高いレベルで発現することができると言うことが以前に示されている（例えば、ＷＯ ００／６３４０３、及びＪｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ， ２００３）。
【００４４】
本発明に従う所望のタンパク質を発現しているこのようなホスト細胞は、核酸分子、好ましくは本発明に従う発現カセットの形態をとっている核酸分子を細胞に導入することにより得られる。他の実施態様において、ＳＴＡＲ６７配列を標的して染色体領域に組み込むことにより、すでにゲノムに組み込まれた関心のある遺伝子、例えば天然由来の遺伝子を、必要に応じて前記遺伝子の発現を制御するために前記遺伝子の上流に標的化した異種プロモーターの制御のもとに、発現を改善させる。
【００４５】
好ましくは、ホスト細胞は当業者に知られた標準的手順に従って選択し増殖することのできる安定なクローンに由来する。このようなクローンの培養物は、関心のある組換えタンパク質を生成することが可能である。本発明に従う細胞は好ましくは無血清培地中で懸濁培養により成長することができる。
【００４６】
本発明に従う関心のあるタンパク質はいかなるタンパク質であってもよく、単量体タンパク質であっても多量体タンパク質であっても良い。多量体タンパク質は少なくとも２種類のポリペプチド鎖を有するものである。本発明に従う関心のあるタンパク質の具体例は、それに限定されるものではないが、酵素、ホルモン、免疫グロブリン鎖、抗癌タンパク質のような治療タンパク質、第８因子のような血液凝固タンパク質、エリスロポイエチンのような多機能タンパク質、診断用タンパク質、又はワクチン用途に有用なタンパク質若しくはその断片であり、これらはすべて当業者に知られているものである。
【００４７】
ある実施態様において、本発明の発現カセットは免疫グロブリンの重鎖又は軽鎖又は抗原結合部位、これらの誘導体及び類似体のいずれか又は任意の組み合わせをコードしている。好ましい実施態様において、本発明に従うタンパク質発現ユニットが提供され、ここで前記関心のあるタンパク質は免疫グロブリン重鎖である、更に他の好ましい実施態様において、本発明に従うタンパク質発現ユニットが提供され、ここで前記関心のあるタンパク質は免疫グロブリン軽鎖である。これら２種類のタンパク質発現ユニットが同一（ホスト）細胞内に存在する場合、多量体タンパク質、より特異的には抗体が構成される。従ってある実施態様において、関心のあるタンパク質は抗体のような免疫グロブリンであり、これは多量体タンパク質である。好ましくは、このような抗体はヒトの抗体又はヒト化された抗体である。ある実施態様において、それはＩｇＧ、ＩｇＡ又はＩｇＭ抗体である。免疫グロブリンは別々の発現カセット上で重鎖と軽鎖によりコードされてもよく、又は単一の発現カセットにコードされていてもよい。ここで個々の鎖をコードする遺伝子は単シストロン転写ユニット内の別々のプロモーターにより制御されていてもよく、或いは又両方の鎖が多シストロン遺伝子上にコードされていても良い。
【００４８】
関心のあるタンパク質はいかなるものに由来するものであってもよく、ある実施態様においては、哺乳動物のタンパク質、人工タンパク質（例えば、融合タンパク質又は変異タンパク質）であり、好ましくはヒトタンパク質である。
【００４９】
明らかに、本発明の抗リプレッサー配列及び発現カセットの構造は、最終目標がタンパク質の生産ではなく、ＲＮＡそのものである場合にも用いることができる。それは例えば発現カセットからより多くのＲＮＡを生成するためであって、他の遺伝子を制御するために（例えば、ＲＮＡｉ、アンチセンスＲＮＡ）、遺伝子治療のために、試験管内でのタンパク質生成などのために使うことができる。
【００５０】
関心のあるタンパク質を生成する方法
ある態様において、本発明は関心のある配列、好ましくは関心のあるタンパク質をコードする配列を、本発明に従う核酸分子又は発現カセットをホスト細胞に提供し、この細胞を培養してこの関心のある配列を発現させることにより、発現させるための方法を提供する。
【００５１】
用語「発現」は典型的には、特定のＲＮＡ産物又は特定のタンパク質を細胞内において生成することを意味する。ＲＮＡ産物の場合には、これは転写する過程を意味する。タンパク質産物の場合には、これは転写、翻訳及び必要に応じて翻訳後修飾（例えば、糖鎖付加、ジスルフィド結合形成など）の過程を意味する。分泌タンパク質の場合には、転写、翻訳、及び必要に応じて翻訳後修飾をし、その後に分泌することを意味する。
【００５２】
細胞内で発現させる核酸の導入は、いくつかの方法のうち一つを用いて行うことができるが、この方法は当業者には知られているものであって、導入するべき核酸の形態にも依存するものである。前記方法には、トランスフェクション、感染、インジェクション、形質転換などが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００５３】
細胞を培養することにより、細胞は代謝、および／または成長、および／または分裂、および／または関心のある組換えタンパク質の生成を行うことができるようになる。これは当業者によく知られた方法で達成できるものであり、細胞に栄養を与えることが含まれるが、これに限定されるものではない。この方法には表面に接着した成長、懸濁液中での成長、又はこの組み合わせが含まれる。培養は例えばディッシュ、回転ボトル又は生物反応器内で、バッチ、栄養バッチ、還流システムのような持続的システムなどを用いて行うことができる。組換えタンパク質を細胞培養により大規模な（持続的に）生成を達成するためには、当該技術分野においては懸濁液中で成長することのできる細胞であるのが好ましく、動物若しくはヒト由来の血清、又は動物若しくはヒト由来の血清成分なしに細胞を培養できることが好ましい。
【００５４】
細胞を成長又は増殖させる条件（例えば、Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｋｒｕｓｅ ａｎｄ Ｐａｔｅｒｏｎｓ， ｅｄｉｔｏｒｓ （１９７３）参照）及び組換え産物を発現させる条件は当業者によく知られている。一般に、哺乳類細胞培養の生産性を最大化するための原理、プロトコール、及び実際の技術は、Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ ｂｉｏｔｅｃｈｏｎｏｌｏｇｙ： ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ （Ｍ． Ｂｕｔｌｅｒ， ｅｄ．， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， １９９１）に見いだすことができる。
【００５５】
好ましい実施態様において、発現したタンパク質を細胞又は培養液又は両者から回収（単離）する。このタンパク質は次に、フィルター、カラムクロマトグラフィーなどの既知の方法を用いて、当業者に一般的に知られている方法により更に精製される。
【００５６】
新規選択方法
本発明は、関心のある２種類のポリペプチドを発現しているホスト細胞を生成する新規方法を開示するものであり、この方法は、抗リプレッサー配列を用いなければほとんど又は全くコロニーが現れないのに対し、抗リプレッサー配列が存在すればコロニーは選択を生き延び、これらのコロニーは一般に２種類の関心のあるポリペプチドを高いレベルで発現している、という点で驚くべき良好な結果をもたらす（実施例７、図１１）。従って本発明は、２種類の関心のあるポリペプチドを発現しているホスト細胞を生成する方法を提供するものであって、この方法は ａ）ホスト細胞内に１種類以上の核酸分子を導入するステップであって、この又はこれらの核酸分子はすべて（ｉ）第１の関心のあるポリペプチドをコードする配列及び第１の選択可能マーカー遺伝子に機能的に連結したプロモーター、（ｉｉ）第２の関心のあるポリペプチドをコードする配列及び第２の選択可能マーカー遺伝子に機能的に連結したプロモーター、並びに（ｉｉｉ）ａ）配列番号１〜６６のいずれか１つ、ｂ）配列番号１〜６６のいずれか１つの断片であって、抗リプレッサー活性を有する前記断片、ｃ）ａ）又はｂ）に少なくとも７０％相同な配列であって、抗リプレッサー活性を有する配列、並びにｄ）ａ）〜ｃ）のいずれか１つの相補体、よりなるグループから選択された少なくとも１つの抗リプレッサー活性を有する配列、を有している上記ステップ；並びにｂ）前記第１及び第２の選択可能なマーカー遺伝子についてほぼ同時に選択することによりホスト細胞を選択するステップを有する。選択されたホスト細胞は、前記選択されたホスト細胞を培養することにより、前記２種類のポリペプチドを発現するために便利に用いることができる。ひとつの実施態様において、１つが（ｉ）を有しており、他方が（ｉｉ）を有している２つの核酸分子を、ホスト細胞内に導入するために用いることができる。この実施態様において、各核酸分子は好ましくは少なくとも１つの前記抗リプレッサー配列を含んでいる。他の実施態様において、（ｉ）及び（ｉｉ）の両方を有する単一の核酸分子を用いるが、この核酸分子はこの場合は前記抗リプレッサー配列を少なくとも１つ有していなければならない。単一核酸分子上に両者のポリペプチドをコードする領域が存在する利点の一つは、核酸を細胞に導入する前に１種類の核酸だけを調製すればよい、ということである。更にこのような実施態様においては、１回の組換え事象で両ポリペプチドのコード領域について十分であるので、これにより、第１のポリペプチドをコードする核酸が組み込まれる場所又はコピー数が第２のポリペプチドと異なっている、という可能性がなくなる。好ましい実施態様において、前記２つのポリペプチドは免疫グロブリンのような多量体タンパク質の部分を形成する。従ってこの方法は抗体の発現に特に適している。２つのプロモーターは同じものであっても異なるものであってもよく、上記のいかなるプロモーターであっても良い。１つの核酸分子が（ｉ）及び（ｉｉ）の両方を含んでいる実施態様を用いる場合には、単一の核酸分子上における２つの転写ユニットの方向は、例えば両者が同じであっても、互いに向き合う反対方向であっても、互いに外側を向いている反対方向であってもよい。後者のばあいには、抗リプレッサー配列は２つのプロモーターの間に配置することができる（例えば、図ＨＢ参照）。本発明のこの態様について１つの好適な抗リプレッサー配列は配列番号６６（実施例７参照）であるが、他の抗リプレッサー配列も同様に機能しうる。このことは当業者により本明細書の開示を用いることで容易に確かめられるものであり、従ってこの本発明のこの観点に従う他の抗リプレッサー配列を使用することも、本発明に含まれるものである。更に、抗リプレッサー配列を１つ又は両方の転写ユニットに隣接するように付加することができる。マーカー遺伝子は互いに異なるものでなくてはならず、例えば上記のマーカー遺伝子から選択することができる。ある実施態様において、一方の選択可能マーカーはゼオシンであり、他方の選択可能なマーカー例えばピューロマイシンである。しかし、他の組み合わせを用いることができることは明らかであり、それも本発明のこの観点の範囲内に含まれる。マーカーの発現は好ましくは関心のあるポリペプチドの発現に依存しているべきである。これは、マーカー遺伝子の発現を関心のあるポリペプチドの発現と連結させることにより達成でき、これは、例えば他シストロン遺伝子を用いて、例えば上記で議論したようにＩＲＥＳ配列により達成できる。「ほぼ同時に」選択するとは、少なくとも一部の時間に、好ましくは少なくとも１日間、より好ましくは２日間、更により好ましくは５日間、両選択薬剤が存在することを意味し、これは、両選択薬剤を同時に培地に加えるか、又は両選択薬剤を含む培養培地を加えることによってなされる（たとえば、実施例７）。第１の選択薬剤がすでに存在する培地に、第２の選択薬剤をほんの数時間又は数日後に加える場合にも、本発明の意味におけるほぼ同時に選択することになるということは明らかであろう。このような状態は細胞をまず第１の選択薬剤で選択し、一度コロニーを形成してから、第２の選択薬剤を加えて第１の選択薬剤を加えなかった新しい培地で選択する、という状況とは区別される（連続選択、例えば、実施例５及びＷＯ ０３／１０６６８４）。両選択可能マーカーによりほぼ同時に選択することにより、驚くべきことに、迅速で強力な選択が行われ、多数の低生産性コロニーが除去されることで、所望の発現特性を有するコロニーを見つけるための仕事量が非常に少なくすむ、ということが本明細書に開示されている。このことは特に、高い発現レベルを有する所望のクローンが同定されるまでに、多くの、通常は何百更には何千ものコロニーをスクリーニングしなくてはならない生物技術産業において有用である。
【００５７】
更に本システムは、この状況で機能する場合には、抗リプレッサー要素の部分について、少なくともＳＴＡＲ６７の、さらには他の抗リプレッサー配列の部分について、機能性について試験することを可能にしている。この簡便なスクリーニング法は、多くの場合にほぼ又はむしろ完全に白黒のはっきりした差異を与えるものであり、従って、抗リプレッサー配列からの機能的部分又は誘導体を同定するのに貢献するか、および／または新たな抗リプレッサー配列の特徴を明らかにするのに役立つであろう。このスクリーニング法は、新たな抗リプレッサー配列、および／または発現促進配列を見出すのにも使用できるであろう（この種のスクリーニング法は文字通り抗リプレッサー活性により選択するのではなく、発現強化活性について選択するものであるので、後者の活性を有し前者の活性を有していない配列を見いだす可能性もある）。従って本発明の他の観点は、抗リプレッサーおよび／または発現強化配列、またはその断片または誘導体を同定する方法であって、ａ）ホスト細胞内に１種類以上の核酸分子を導入するステップであって、この又はこれらの核酸分子はすべて（ｉ）第１の選択可能マーカー遺伝子をコードする配列に機能的に連結したプロモーター、（ｉｉ）第２の選択可能マーカー遺伝子をコードする配列に機能的に連結したプロモーター、並びに（ｉｉｉ）抗リプレッサー活性および／または発現強化活性について試験する少なくとも１つの配列、を有している上記ステップ、並びにｂ）前記第１及び第２の選択可能なマーカー遺伝子の発現についてほぼ同時に選択することによりホスト細胞を選択するステップ、を有する方法を提供する。このスクリーニング法で生存したホスト細胞は、機能的な抗リプレッサーおよび／または発現強化要素を有していると思われるであろう。これは更に、例えば配列を決定すること、および／または上記で述べたように抗リプレッサー活性について他の機能的試験を行うことにより、更に容易に分析することができる。本発明の１つの実施態様において、（ｉ）及び（ｉｉ）の両者は一つの核酸分子上にあって、例えば分かれているプロモーターを有し（第１及び第２の選択可能なマーカーは外側に面している）、その間に試験するべき配列を解析するためにクローニングできるようにしてある。例えば選択可能なマーカー遺伝子を直接促進する比較的に弱いプロモーターを用いることにより（この比較的弱いプロモーターは当業者に知られているもの、および／または当業者により通常の分析によって同定しうるものである）、又は例えばマーカー遺伝子の転写には強いプロモーター、及び翻訳には上記のＩＲＥＳ、好ましくは比較的弱いＩＲＥＳを用いることにより、好ましくは、前記選択可能マーカー遺伝子の発現は高くない。またマーカー遺伝子を簡便に、ポリペプチドをコードする核酸配列の下流に配置し、多シストロン遺伝子内において、例えばＩＲＥＳにより、その発現に結びつけることもできる（例えば、実施例７、可能な構造は図１１）。このようなポリペプチドを更に、関心のあるポリペプチドとして、関心のある前記ポリペプチドを発現する有用なクローンが直接得られるようにすることもできるが、スクリーニングの目的のために、例えばＧＦＰ又はその誘導体、ＳＥＡＰ、ｌａｃＺ、ルシフェラーゼのような発現を容易に定量できるようなマーカーとすることもできる。このような組み合わせでは、ポリペプチドの発現を直接定量することができ、同時選択において十分なクローンを提供し、かつ高い転写レベルを提供する抗リプレッサー要素および／または発現強化要素、若しくはその断片を選び出すことができる。「ランダム」核酸（即ち、抗リプレッサー活性又は発現強化活性を有しているかまだ知られていない核酸）を、例えばゲノム断片の形態で抗リプレッサー活性および／または発現強化活性について試験する配列として用いれば、新たな抗リプレッサー配列および／または発現強化配列を見いだしうる。既知の抗リプレッサー配列を試験する場合には、この分析法をこれらの特徴をより明らかにするのに使用できる。既知の抗リプレッサー配列の断片を試験する場合には、この分析法はこのような既知の抗リプレッサー配列の機能的断片を提供するであろう。
【００５８】
本発明を実施するに当たって、そのように記載した場合以外では、免疫学、分子生物学、微生物学、細胞生物学及び組換えＤＮＡの従来の技術を用いるが、これらは当該技術分野の技術の範囲内である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， １９８９； Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ａｕｓｕｂｅｌ ＦＭ， ｅｔ ａｌ， ｅｄｓ， １９８７； ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．）； ＰＣＲ２： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｒｒｏａｃｈ， ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ ＭＪ， Ｈａｍｓ ＢＤ， Ｔａｙｌｏｒ ＧＲ， ｅｄｓ， １９９５； Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ， ｅｄｓ， １９８８を参照されたい。
【００５９】
本発明を以下の実施例により詳しく説明する。これらの実施例は本発明をいかなる形においても制限するものではない。これらは本発明を明確にするためだけに使われる。
【実施例】
【００６０】
実施例
実施例１：ＳＴＡＲ６７ベクターの作成
新規抗リプレッサー配列はＷＯ ０３／００４７０４に記載の遺伝子スクリーニング法を用いて単離され、この新規配列はＳＴＡＲ６７（配列番号６６）と新たに命名された。ＳＴＡＲ６７の哺乳類細胞株におけるトランス遺伝子の発現に対する効果を調べた。ここでは様々なコンストラクトの作成について説明する。
【００６１】
材料及び方法
以下の３種類のプラスミドを作成した（図１）。
Ａ） ＣＭＶ−ｄ２ＥＧＦＰ−ｉｒｅｓ−Ｚｅｏ （ＣＭＶ コントロール）
Ｂ） ＳＴＡＲ６７−ＣＭＶ−ｄ２ＥＧＦＰ−ｉｒｅｓ−Ｚｅｏ （ＣＮＶ−ＳＴＡＲ６７）
Ｃ） ＳＴＡＲ７−ＳＴＡＲ６７−ＣＭＶ−ｄ２ＥＧＦＰ−ｉｒｅｓ−Ｚｅｏ−ＳＴＡＲ７ （ＣＭＶ−ＳＴＡＲ６７ ７／７）
【００６２】
コンストラクトＡの構築方法を以下に説明する。プラスミドｐｄ２ＥＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ ６０１０−１）を、ＢｓｉＷＩ部位にリンカーを挿入して修飾し、ｐｄ２ＥＧＦＰ−ｌｉｎｋを得た。リンカーは、オリゴヌクレオチドＧＴＡＣＧＧＡＴＡＴＣＡＧＡＴＣＴＴＴＡＡＴＴＡＡＧ（配列番号６７）及びＧＴＡＣＣＴＴＡＡＴＴＡＡＡＧＡＴＣＴＧＡＴＡＴ（配列番号６８）をアニーリングして作成し、Ｐａｄ、ＢｇｌＩＩ及びＥｃｏＲＶ制限エンドヌクレアーゼのための部位を導入した。これによりＳＴＡＲ要素を挿入するためのマルチクローニングサイトＭＣＳＩＩが作製された。次に、プライマーＧＡＴＣＡＧＡＴＣＴＧＧＣＧＣＧＣＣＡＴＴＴＡＡＡＴＣＧＴＣＴＣＧＣＧＣＧＴＴＴＣＧＧＴＧＡＴＧＡＣＧＧ（配列番号６９）及びＡＧＧＣＧＧＡＴＣＣＧＡＡＴＧＴＡＴＴＴＡＧＡＡＡＡＡＴＡＡＡＣＡＡＡＴＡＧＧＧＧ（配列番号７０）を用いてｐｄ２ＥＧＦＰから０．３７ｋｂの領域を増幅し、これをｐＩＲＥＳ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ ６０２８−１）のＢｇｌＩＩ部位に挿入してｐＩＲＥＳ−ｓｔｕｆを作成した。これによりＭＣＳＩにＡｓｃＩ及びＳｗａＩ制限エンドヌクレアーゼのための部位を挿入し、「詰込み断片（stuffer fragment）」として機能することでＳＴＡＲ要素と近接するプロモーターとの間の起こりうる相互作用をさける。ｐＩＲＥＳ−ｓｔｕｆをＢｇｌＩＩ及びＦｓｐＩで消化し、詰め込み断片、ＣＭＶプロモーター、ＩＲＥＳ要素（マルチクローニング部位ＭＣＳＡ及びＭＣＳＢが隣接している）、及びＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを有するＤＮＡ断片が遊離する。この断片を、ＢａｍＲＩ及びＳｔｕＩで消化して生成したベクターバックボーンに結合させ、ｐＩＲＥ−ｌｉｎｋを作成した。
【００６３】
ゼオシン抵抗性遺伝子のオープンリーディングフレームをｐＩＲＥＳの下流のＢａｍＨＩ／ＮｏｔＩ部位に以下のように挿入した。ゼオシン抵抗性ＯＲＦを、プライマーＧＡＴＣＧＧＡＴＣＣＴＴＣＧＡＡＡＴＧＧＣＣＡＡＧＴＴＧＡＣＣＡＧＴＧＣ（配列番号７１）及びＡＧＧＣＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＴＴＣＴＣＡＧＴＣＣＴＧＣＴＣＣＴＣ（配列番号７２）を用いてプラスミドｐＣＭＶ／ｚｅｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｖ５０１２０）からＰＣＲにより増幅し、ＢａｍＷＩ及びＮｏｔＩにより消化し、ＢａＭＨ／ＮｏｔＩ消化ｐＩＲＥＳ−ｌｉｎｋに結合させてｐＩＲＥＳ−ｌｉｎｋ−ｚｅｏを作成した。ｐｄ２ＥＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ ６０１０−１）をプライマーＧＡＴＣＧＡＡＴＴＣＴＣＧＣＧＡＡＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧＣＡＧＡＴＣＣＴＧＡＡＧ（配列番号７３）及びＡＧＧＣＧＡＡＴＴＣＡＣＣＧＧＴＧＴＴＴＡＡＡＣＴＴＡＣＡＣＣＣＡＣＴＣＧＴＧＣＡＧＧＣＴＧＣＣＣＡＧＧ（配列番号７４）により増幅し、ＥｃｏＲＩ消化ｄ２ＥＧＦＰカセットをｐＩＲＥＳ−ｌｉｎｋ−ｚｅｏプラスミドのＥｃｏＲＩ部位に挿入することにより、ｄ２ＥＧＦＰレポーターＯＲＦをｐＩＲＥＳ−ｌｉｎｋ−ｚｅｏに導入した。これによりコンストラクトＡ、ＣＭＶ−ｄ２ＥＧＦＰ−ｉｒｅｓ−Ｚｅｏ （ＣＭＶ コントロール）を作成した。
【００６４】
ＳＴＡＲ６７をＣＭＶプロモーターの上流に、ＡｓｃＩ部位（ＳＴＡＲ６７とプロモーターの間に残された約１５ｎｔ）にクローニングした。これによりコンストラクトＢ、ＳＴＡＲ６７−ＣＭＶ−ｄ２ＥＧＦＰ−ｉｒｅｓ−Ｚｅｏ （ＣＮＶ−ＳＴＡＲ６７）を作成した。
【００６５】
ＳＴＡＲ６７を、５‘ＳａｉＩ及びＸａｂａＩ部位並びに３’ＢｇｌＩＩ及びＰａｄ部位に方向性を有してクローニングし、全カセットにＳＴＡＲ７に隣接するようにしてあるＳＴＡＲ７（配列番号１）もまた含んでいるカセットとの関連においても試験した。これがコンストラクトＣ（ＣＭＶ−ＳＴＡＲ６７ ７／７）である。
【００６６】
実施例２：ＳＴＡＲ６７は安定にトランスフェクションされたβｄＣＨＯ細胞においてＣＭＶ、ＥＦ１α及びＵＢ６プロモーター由来の発現レベルを増加させる。
ＳＴＡＲ６７がＣＭＶ、ＥＦ１α及びＵＢ６プロモーターに隣接して存在することによりＣＨＯ細胞におけるこれらのプロモーターの発現レベルに影響があるかを調べた。実施例１に記載のコンストラクトＡ及びＢ（図１）を各プロモーターに関して以下のように修飾してこの目的で使用した。
１ ＣＭＶ−ｄ２ＥＧＦＰ−ｉｒｅｓ−Ｚｅｏ （ＣＶＭ コントロール）
２ ＳＴＡＲ６７−ＣＭＶ−ｄ２ＥＧＦＰ−ｉｒｅｓ−Ｚｅｏ （ＣＶＭ−ＳＴＡＲ６７）
３ ＥＦ１α−ｄ２ＥＧＦＰ−ｉｒｅｓ−Ｚｅｏ （ＥＦ１α コントロール）
４ ＳＴＡＲ６７−ＥＦ１α−ｄ２ＥＧＦＰ−ｉｒｅｓ−Ｚｅｏ （ＥＦ１α−ＳＴＡＲ６７）
５ ＵＢ６−ｄ２ＥＧＦＰ−ｉｒｅｓ−Ｚｅｏ （ＵＢ６ コントロール）
６ ＳＴＡＲ６７−ＵＢ６−ｄ２ＥＧＦＰ−ｉｒｅｓ−Ｚｅｏ （ＵＢ６−ＳＴＡＲ６７）
【００６７】
材料及び方法
ＵＢ６及びＥＦ１αプロモーターを図１に記載のプラスミドにおいてＣＭＶプロモーターと入れ替えた。ＵＢ６プロモーターを以下のようにクローニングした。実施例１に記載したように、ｐｄ２ＥＧＦＰプラスミド由来の詰込みＤＮＡ０．３７ｋｂを、配列番号６９及び７０により認識されるプライマーを用いてＰＣＲにより増幅した。得られた詰込みＤＮＡをｐＵＢ６−Ｖ５−Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｖ２５０−２０）のＢｇｌＩＩ部位にクローニングし、ｐＵＢ６−ｓｔｕｆを作製した。ｐＵＢ６−ｓｔｕｆからＡｓｃＩ−ＳａｃＩ断片をＣＭＶ−ｄ２ＥＧＦＰ−ＩＲＥＳ−Ｚｅｏ内にクローニングし、ここからＣＭＶプロモーターを除去した。
【００６８】
ＥＦ１αプロモーターをＰＣＲによりｐＥＦ１α／Ｖ５−Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｖ９２０−２０）を鋳型として、プライマーＧＡＴＣＧＧＣＧＣＧＣＣＡＴＴＴＡＡＡＴＣＣＧＡＡＡＡＧＴＧＣＣＡＣＣＴＧＡＣＧ（配列番号７９）及びＡＧＧＣＧＧＧＡＣＣＣＣＣＧＣＡＣＧＡＣＡＣＣＴＧＡＡＡＴＧＧＡＡＧ（配列番号８０）を用いて増幅した。このＰＣＲ断片をＣＭＶ−ｄ２ＥＧＦＰ−ＩＲＥＳ−ＺｅｏのＡｓｃＩ及びＰｐｕＭＩ部位にクローニングし、ここからＣＭＶプロモーターを除去した。
【００６９】
チャイニーズハムスター卵巣細胞株ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ ＣＬＬ−６１）を２ｍＭグルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含有するＨＡＭＳ−Ｆ１２培地＋１０％ウシ胎児血清中で、３７℃／５％ＣＯ２にて培養した。細胞にプラスミドをＳｕｐｅｒＦｅｃｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて製造者の記載の通りにトランスフェクションした。簡単にいうと、細胞を培養容器にまき、一晩培養して７０〜９０％コンフルエントにする。ＳｕｐｅｒＦｅｃｔ薬剤をプラスミドＤＮＡとμｇあたり６μｌの比で組み合わせ（例えば、１０ｃｍペトリ皿では、２０μｇＤＮＡと１２０μｌＳｕｐｅｒＦｅｃｔ）、そして細胞に加える。一晩培養した後、トランスフェクション混合液を新しい培地に置換し、トランスフェクションされた細胞を更に培養する。一晩培養した後、細胞をトリプシン処理して新たな培地の入った新しい培養容器にまく。更に一晩培養した後、ゼオシンが５０μｇ／ｍｌの濃度になるまで加え、細胞を更に培養する。更に３日間後、培地をゼオシン（１００μｇ／ｍｌ）を含有する新しい培地に置換し、更に培養する。個々のコロニーが見えるようになったら（トランスフェクションしてから約１０日）、培地を除き、ゼオシンを含有していない新しい培地に置換する。個々のコロニーを単離し、２４ウェルプレートへゼオシンを含有していない培地に移す。コロニーを単離してから１日後にゼオシンを培地に加える。ｄ２ＥＧＦＰレポーター遺伝子の発現をトランスフェクションしてから約３週間後に調べる。コロニーにおけるｄ２ＥＧＦＰ発現レベルを２週間後に調べる。トランスフェクションして初めの２週間で１回目のｄ２ＥＧＦＰの測定を行った後、コロニーをゼオシン及び他の抗生物質を含有しない培地中で培養する。これを残りの実験でも継続した。
【００７０】
結果
図２はＣＭＶプロモーターの上流にクローニングしたＳＴＡＲ６７を含有するコンストラクトをトランスフェクションすると、ＳＴＡＲ６７を有していない「空」コントロールであるＣＭＶコントロールと比べて、有意に高いレベルのｄ２ＥＧＦＰタンパク質を発現するＣＨＯコロニーが多く得られたことを示している。ＣＭＶコントロールプラスミドをトランスフェクションした１０コロニーのｄ２ＥＧＦＰシグナルの平均は、トランスフェクション後２５日で測定したところ、３４であった。トランスフェクション後６０日では、これら１０コロニーのｄ２ＥＧＦＰシグナルの平均は１３に減少しており、長期にわたると発現が安定でないことを示している。これに対して、ＳＴＡＲ６７−ＣＭＶプラスミドをトランスフェクションした１０コロニーのｄ２ＥＧＦＰシグナルの平均は、トランスフェクション後２５日で測定すると４２であり、６０日で測定すると３２であった。従って、トランスフェクションしてから６０日後では、安定にトランスフェクションされたクローンにおいて、ＳＴＡＲ６を有するＣＭＶコンストラクトはＣＭＶプロモーターに促進され、レポータータンパク質の発現レベルを２．５倍高めることになる。重要なことは、トランスフェクションして２５日後は、１回目の測定後であり、ゼオシンを含有しない培地でコロニーを培養することにより選択圧はなくなっている。従ってＳＴＡＲ６７を有するコロニーは、ＳＴＡＲ６７コンストラクトを有していないコロニーと比較して、選択圧非存在下で長期にわたってより安定である。
【００７１】
図３はＥＦ１ＣＣ−プロモーターの上流にクローニングしたＳＴＡＲ６７を有するコンストラクトをトランスフェクションすると、ＳＴＡＲ６７を有していない「空」コントロールであるＥＦ１αコントロールと比べて、有意に高いレベルのｄ２ＥＧＦＰタンパク質を発現するＣＨＯコロニーが多く得られたことを示している。ＥＦ１αコントロールプラスミドをトランスフェクションした１０コロニーのｄ２ＥＧＦＰシグナルの平均は、トランスフェクション後２５日で測定したところ、３１であった。トランスフェクション後６０日では、これら１０コロニーのｄ２ＥＧＦＰシグナルの平均は２６であった。これに対して、ＥＦ１α−ＳＴＡＲ６７プラスミドをトランスフェクションした１０コロニーのｄ２ＥＧＦＰシグナルの平均は、トランスフェクション後２５日で測定すると６０であり、６０日で測定すると７６であった。従って、トランスフェクションしてから２５日後及び６０日後の両方において、安定にトランスフェクションされたクローンにおいてＳＴＡＲ６を有するＥＦ１αコンストラクトは、ＥＦ１αプロモーターに促進され、レポータータンパク質の発現レベルを２．９倍高めることになる。
【００７２】
図４は、ＵＢ６プロモーターの上流にクローニングしたＳＴＡＲ６７を有するコンストラクトをトランスフェクションすると、ＳＴＡＲ６７を有していない「空」コントロールであるＵＢ６コントロールと比べて、有意に高いレベルのｄ２ＥＧＦＰタンパク質を発現するＣＨＯコロニーが多く得られたことを示している。ＵＢ６コントロールプラスミドをトランスフェクションした１０コロニーのｄ２ＥＧＦＰシグナルの平均は、トランスフェクション後２５日で測定したところ、５１であった。トランスフェクション後６０日では、これら１０コロニーのｄ２ＥＧＦＰシグナルの平均は２９であり、長期にわたると発現が安定でないことを示している。これに対して、ＵＢ６−ＳＴＡＲ６７プラスミドをトランスフェクションした１０コロニーのｄ２ＥＧＦＰシグナルの平均は、トランスフェクション後２５日で測定すると２１８であり、６０日で測定すると２２４であった。従って、トランスフェクションしてから２５日後では、安定にトランスフェクションされたクローンにおいてＳＴＡＲ６を有するＵＢ６コンストラクトは、ＵＢ６プロモーターに促進され、レポータータンパク質の発現レベルを４．３倍高めることになる。６０日後にはこの倍率は７．７になっており、これはコントロールコロニーにおける発現の不安定性及びＵＢ６−ＳＴＡＲ６７コロニーにおける安定性によるものである。重要なことは、トランスフェクションして２５日後は、１回目の測定後であり、ゼオシンを含有しない培地でコロニーを培養することにより選択圧はなくなっている。従って、ＳＴＡＲ６７を有するコロニーはＳＴＡＲ６７コンストラクトを有していないコロニーと比較して選択圧非存在下で長期にわたってより安定である。
【００７３】
結論として、ＳＴＡＲ６７は３つの異なった関連のないプロモーター由来の発現を増加させる。
【００７４】
実施例３：ＳＴＡＲ６７は安定にトランスフェクションしたＰＥＲ．Ｃ６細胞においてＣＭＶ、ＥＦ１α及びＵＢ６プロモーター由来の発現レベルを増加させる。
ＳＴＡＲ６７がＣＭＶ、ＥＦ１α及びＵＢ６プロモーターに隣接して存在することにより、ＣＨＯ以外の細胞種、即ちヒトＰＥＲ．Ｃ６細胞におけるこれらのプロモーターの発現レベルに影響があるかを調べた。実施例１と同じコンストラクトを用いた
【００７５】
材料及び方法
ＰＥＲ．Ｃ６細胞のトランスフェクション、培養及び分析
ＰＥＲ．Ｃβ細胞（登録商標）を、８．９ｍＭ ＭｇＣｌ２、１００Ｕ／ｍｌペニシリン及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ培地＋ピリドキシン＋９％ウシ胎児血清（熱不活性化していない）中で３７℃／５％ＣＯ２にて培養した。Ｌｉｐｏｆｅｋｕｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）製造者の記載の通りに用いて、細胞にプラスミドでトランスフェクションした。簡単にいうと、細胞を６ウェルプレートにまき、一晩培養して７０〜９０％コンフルエントにした。Ｌｉｐｏｆｅｋｕｔａｍｉｎｅ薬剤をプラスミドＤＮＡと、３μｇあたり１５μｌの比で組み合わせ（例えば、１０ｃｍペトリ皿では、２０μｇＤＮＡと１２０μｌ Ｌｉｐｏｆｅｋｕｔａｍｉｎｅ）、３０分間インキュベーションした後に細胞に加えた。β時間培養した後、トランスフェクション混合液を新しい培地に置換し、トランスフェクションされた細胞を更にインキュベートした。一晩培養した後、細胞をトリプシン処理して、ゼオシンを１００μｇ／ｍｌの濃度になるまで加えた新しい培地の入った新しいペトリ皿（９０ｍｍ）にまき（１：１５、１：３０、１：６０、１：１２０希釈）、細胞を更に培養した。コロニーが見えるようになったら、個々のコロニーを剥がして単離し、２４ウェルプレートのゼオシンを含有していない培地の中に移す。〜７０％コンフルエントまで成長したら、細胞を６ウェルプレートに移した。安定なコロニーを６ウェルプレートで２週間増殖させた後、ｄ２ＥＧＦＰシグナルをＸＬ−ＭＣＬ Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｅｒで測定した。ｄ２ＥＧＦＰシグナルの平均値をｄ２ＥＧＦＰ発現レベルの指標とした。２週間後にコロニーの２回目の測定した。その後、ゼオシン非存在下でコロニーを更に培養した。
【００７６】
結果
図５はＣＭＶプロモーターの上流にクローニングしたＳＴＡＲ６７を含むコンストラクトをトランスフェクションすると、ＳＴＡＲ６７を有していない「空」コントロールであるＣＭＶコントロールと比べて、有意に高いレベルのｄ２ＥＧＦＰタンパク質を発現するＰＥＲ．Ｃ６コロニーが多く得られたことを示している。ＣＭＶコントロールプラスミドをトランスフェクションした１０コロニーのｄ２ＥＧＦＰシグナルの平均は、トランスフェクション後３０日で測定したところ、３７であった。トランスフェクション後６０日では、これら１０コロニーのｄ２ＥＧＦＰシグナルの平均は１４に減少しており、長期にわたると発現が安定でないことを示している。これに対して、ＳＴＡＲ６７−ＣＭＶプラスミドをトランスフェクションした１０コロニーのｄ２ＥＧＦＰシグナルの平均は、トランスフェクション後３０日で測定すると１０１あり、６０日で測定すると４５であった。従って、トランスフェクションしてから６０日後では、安定にトランスフェクションされたクローンにおいてＳＴＡＲ６を有するＣＭＶコンストラクトは、ＣＭＶプロモーターに促進され、レポータータンパク質の発現レベルが３．２倍高くなる。
【００７７】
図６はＥＦ１ＯＣ−プロモーターの上流にクローニングしたＳＴＡＲ６７を含むコンストラクトをトランスフェクションすると、ＳＴＡＲ６７を有していない「空」コントロールであるＥＦ１αコントロールと比べて、有意に高いレベルのｄ２ＥＧＦＰタンパク質を発現するＰＥＲ．Ｃ６コロニーが多く得られたことを示している。ＥＦ１αコントロールプラスミドをトランスフェクションした１０コロニーのｄ２ＥＧＦＰシグナルの平均は、トランスフェクション後３０日で測定したところ、５であった。トランスフェクション後６０日では、これら１０コロニーにおけるｄ２ＥＧＦＰシグナルの平均は６であった。これに対して、ＥＦ１Ｃｔ−ＳＴＡＲ６７プラスミドをトランスフェクションした１０コロニーのｄ２ＥＧＦＰシグナルの平均は、トランスフェクション後３０日で測定すると２５であり、６０日で測定すると２０であった。従って、トランスフェクションしてから３０日後及び６０日後の両方において、安定にトランスフェクションされたクローンにおいて、ＳＴＡＲ６７を有するＥＦ１αコンストラクトはＥＦ１αプロモーターに促進され、レポータータンパク質の発現レベルが４倍高くなる。
【００７８】
図７はＵＢ６プロモーターの上流にクローニングしたＳＴＡＲ６７を含むコンストラクトをトランスフェクションすると、ＳＴＡＲ６７を有していない「空」コントロールであるＵＢ６コントロールと比べて、有意に高いレベルのｄ２ＥＧＦＰタンパク質を発現するＰＥＲ．Ｃ６コロニーが多く得られたことを示している。ＵＢ６コントロールプラスミドをトランスフェクションした１０コロニーのｄ２ＥＧＦＰシグナルの平均は、トランスフェクション後３０日で測定したところ、４であった。トランスフェクション後６０日では、これら１０コロニーのｄ２ＥＧＦＰシグナルの平均は２であった。これに対して、ＵＢ６−ＳＴＡＲ６７プラスミドをトランスフェクションした１０コロニーのｄ２ＥＧＦＰシグナルの平均は、トランスフェクション後３０日で測定すると２７であり、６０日で測定すると１８であった。従って、トランスフェクションしてから３０日後及び６０日後の両方において、安定にトランスフェクションされたクローンにおいて、ＳＴＡＲ６７を有するＵＢ６コンストラクトはＵＢ６プロモーターに促進され、レポータータンパク質の発現レベルが７〜９倍高くなる。
【００７９】
従って、ＰＥＲ．Ｃ６細胞においても、ＳＴＡＲ６７をプロモーターの上流に配置することにより、ＳＴＡＲ６７を有さないコンストラクトに比べて有意に高いタンパク質発現レベルが得られる。従って、ＳＴＡＲ６７は異なった関連のない細胞種において機能する。
【００８０】
実施例４：他の抗リプレッサー要素と組み合わせてＣＨＯ細胞においてＳＶ４０プロモーターを強化するＳＴＡＲ６７の新しい構造
ＳＴＡＲ６７がＳＶ４０プロモーターに隣接して存在する際に、単独で又は他の抗リプレッサー要素（この実施例ではＳＴＡＲ７）と組み合わせた際に、このプロモーターの発現レベルに影響を与えるかを調べた。この目的で用いたコンストラクトは以下の通りである。
１ ＳＶ４０−ｄ２ＥＧＦＰ−ｉｒｅｓ−Ｚｅｏ （ＳＶ４０ コントロール）
２ ＳＴＡＲ６７−ＳＶ４０−ｄ２ＥＧＦＰ−ｉｒｅｓ−Ｚｅｏ （ＳＶ４０−ＳＴＡＲ６７）
３ ＳＴＡＲ７−ＳＶ４０−ｄ２ＥＧＦＰ−ｉｒｅｓ−Ｚｅｏ−ＳＴＡＲ７ （ＳＶ４０−ＳＴＡＲ７／７）
４ ＳＴＡＲ７−ＳＴＡＲ６７−ＳＶ４０−ｄ２ＥＧＦＰ−ｉｒｅｓ−Ｚｅｏ−ＳＴＡＲ７ （ＳＶ４０−ＳＴＡＲ６７ ７／７）
【００８１】
材料及び方法
ＳＶ４０プロモーターは、ｐＩＲＥＳを鋳型として、プライマーＴＴＧＧＴＴＧＧＧＧＣＧＣＧＣＣＧＣＡＴＣＡＣＣＡＴＧＧＣＣＴＧＡＡＡＴＡＡＣＣＴＣＴＧＡＡＡＧＡＧＧ（配列番号８１）及びＴＴＧＧＴＴＧＧＧＡＧＣＴＣＡＡＧＣＴＴＴＴＴＧＣＡＡＡＡＧＣＣＴＡＧＧＣＣＴＣＣＡＡＡＡＡＡＧＣＣＴＣＣＴＣ（配列番号８２)を用いて増幅した。ＰＣＲ断片をＣＶＭ−ｄ２ＥＧＦＰ−ＩＲＥＳ−ＺｅｏのＡｓｃＩ及びＳａｄ部位にクローニングし、ここからＣＭＶプロモーターを取り除いた。実施例２と同様に、ＣＨＯ細胞にトランスフェクションし、コロニーを単離し、増殖し、分析した。
【００８２】
結果
図８は、抗リプレッサー要素を有していない「空」コントロール（ＳＶ４０コントロール）と比較して、ＳＶ４０プロモーターの上流にクローニングしたＳＴＡＲ６７を有するコンストラクト（ＳＶ４０−ＳＴＡＲ６７）又は全コンストラクトに隣接してクローニングしたＳＴＡＲ７を含むコンストラクト（ＳＶ４０−ＳＴＡＲ ７／７）をトランスフェクションしても、有意に高いレベルのｄ２ＥＧＦＰタンパク質を発現するＣＨＯコロニーが得られなかったことを示している。ＳＶ４０コントロールプラスミドをトランスフェクションした１８コロニーにおけるｄ２ＥＧＦＰシグナルの平均は、トランスフェクションしてから４０日で測定したところ８６であった。これに対して、トランスフェクション後４０日で測定したＳＶ４０−ＳＴＡＲ６７プラスミドをトランスフェクションした１８コロニーにおけるｄ２ＥＧＦＰシグナルの平均は８２であり、トランスフェクション後４０日で測定したＳＶ４０−ＳＴＡＲ ７／７プラスミドをトランスフェクション下１８コロニーにおけるｄ２ＥＧＦＰシグナルの平均は９１であった。従って、これらの抗リプレッサー要素のＣＨＯ細胞におけるＳＶ４０プロモーターにおける有意な影響は観察されなかった。
【００８３】
これらの細胞におけるＳＶ４０プロモーターからの発現レベルはすでに極めて高く、非常に強力なプロモーターとして考えられているＣＭＶプロモーターで見られたよりも遙かに高いものですらあるように思われる。抗リプレッサー要素の非存在下でＳＶ４０プロモーターをＣＨＯ細胞において用いた際のバックグラウンド発現がこのように高いということは、ＳＴＡＲ６７単独又はトランス遺伝子に隣接したＳＴＡＲ７の有意な影響が観察されなかった理由を説明しうるものである。
【００８４】
しかし、ＳＶ４０−ＳＴＡＲ６７ ７／７プラスミドをトランスフェクションした１８コロニーにおけるｄ２ＥＧＦＰシグナルの平均は、４０日後に測定したところ２０９であり、これは１８コントロールコロニーの平均（８６）に対して２．４倍高い。従って、他の抗リプレッサー要素と組み合わせてＳＴＡＲ６７要素を用いると、有意に高いｄ２ＥＧＦＰ発現レベルを示し、安定してトランスフェクションされたＣＨＯコロニーが多く得られる。
【００８５】
従って、この様な新しい構造（５‘−ＳＴＡＲ配列Ａ−ＳＴＡＲ配列Ｃ−プロモーター−関心のあるタンパクをコードする核酸−ＳＴＡＲ配列Ｂ−３’、なお本実施例においてはＳＴＡＲ配列Ａ及びＢはＳＴＡＲ７であり、ＳＴＡＲ配列ＣはＳＴＡＲ６７である）において、ＳＴＡＲ要素はこれまで開示されていた構造よりも遙かによく機能するように思われる。
【００８６】
隣接するＳＴＡＲ７要素を、隣接するＳＴＡＲ６（配列番号６）要素又は隣接するＳＴＡＲ４（配列番号４）要素により置換して、ＳＶ４０プロモーターの上流のＳＴＡＲ６７と組み合わせて（それぞれＳＶ４０−ＳＴＡＲ６７ ６／６及びＳＶ４０−ＳＴＡＲ６７ ４／４であり、上記と同じ命名法を用いた）実験を行い、これらの組み合わせによっても発現が改善することが観察された。このことは、隣接するＳＴＡＲ７要素は他のＳＴＡＲ配列と交換することが可能であることが示し、さらにＳＴＡＲ配列を有する発現カセットの新しい構造の改善が観察された。
【００８７】
実施例５：ＳＴＡＲ６７とＳＴＡＲ７とを組み合わせることにより安定してトランスフェクションされたＣＨＯ細胞においてＵＢ６に促進された抗体発現レベルの促進
実施例４において、ＳＴＡＲ６７とＳＴＡＲ７を組み合わせることによりＣＨＯ細胞におけるｄ２ＥＧＦＰタンパク質の発現レベルが高められることを示した。ここでは、ＳＴＡＲ６７とＳＴＡＲ７の組み合わせを抗体の産生に用いることができるかを調べた。ＥｐＣＡＭ分子に対する抗体（Ｈｕｌｓ ｅｔ ａｌ．， １９９９）を試験タンパク質として選択し、ＵＢ６プロモーターを用いた。
【００８８】
材料及び方法
プラスミド
重鎖ｃＤＮＡ（ＨＣ−ＥｐＣＡＭ）を、ＵＢ６プロモーターを有するコンストラクト内にクローニングした。ＨＣ−ＥｐＣＡＭはＩＲＥＳ配列によりゼオシン抵抗性遺伝子に連結している。軽鎖ｃＤＮＡ（ＬＣ−ＥｐＣＡＭ）もまたＵＢ６プロモーターを有するコンストラクト内にクローニングした。ＬＣ−ＥｐＣＡＭはＩＲＥＳ配列によりピューロマイシン抵抗性遺伝子に連結している。これら２種類のプラスミドはともにＵＢ６（ＨＣ＋ＬＣ）コントロールを表す（図９）。
【００８９】
ＳＴＡＲ６７及びＳＴＡＲ７の効果を試験するために、ＳＴＡＲ６７をＨＣ＋ＬＣの両者のコンストラクトのＵＢ６プロモーターの上流にクローニングした。ＳＴＡＲ７を全カセットに隣接するように、５‘末端及び３’末端の両方にクローニングした（図９）。これら２種類のプラスミドはＳＴＡＲ７−ＳＴＡＲ６７−ＵＢ６（ＨＣ＋ＬＣ） ＳＴＡＲ７を表す。
【００９０】
ＣＨＯ細胞のトランスフェクション及び培養
チャイニーズハムスター卵巣細胞株ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−６１）を実施例２と同様にトランスフェクションして培養し、ここで選択のためにゼオシン（１００μｇ／ｍｌ）及びピューロマイシン（２．５μｇ／ｍｌ）を用いた。トランスフェクションの１日後、ゼオシンを培地に加えた。第１のコロニーが見えるようになったとき（ゼオシンを加えて約７日後）、培地を除いてピューロマイシンを含有する培地に置換した。約７日後にコロニーを単離して２４ウェルプレートのゼオシンのみを含有する培地に移した。
【００９１】
結果
図９は、ＵＢ６プロモーターの上流にクローニングしたＳＴＡＲ６７要素及び全カセットに隣接するようにクローニングした２つのＳＴＡＲ７要素を有する抗体コンストラクトをトランスフェクションすることにより、ＳＴＡＲ６７及びＳＴＡＲ７を有していない「空」コントロールであるＵＢ６（ＨＣ＋ＬＣ）コントロールと比較して、有意に高いレベルのＥｐＣＡＭ抗体を発現している（抗ヒトＩｇＧ抗体を用いてＥＬＩＳＡ法により測定）ＣＨＯコロニーが多く得られた、ということを示している。ＵＢ６（ＨＣ＋ＬＣ）コントロールプラスミドをトランスフェクションした１８コロニーにおけるＥｐＣＡＭ産生の平均は、トランスフェクション後２５日で測定したところ、２．７ｐｇ／細胞／日であった。選択薬剤であるゼオシン及びピューロマイシンは２５日後に除去した。トランスフェクション後４５日では、これら１８コロニーにおけるＥｐＣＡＭ産生の平均は２．７ｐｇ／細胞／日であった。これに対して、ＳＴＡＲ７−ＳＴＡＲ６７−ＵＢ６（ＨＣ＋ＬＣ）−ＳＴＡＲ７をトランスフェクションした１８コロニーにおけるＥｐＣＡＭ産生シグナルの平均を２７日後に測定したところ、６．７ｐｇ／細胞／日であり、トランスフェクション後４５日に測定したところ７．７ｐｇ／細胞／日であった。従って、トランスフェクション後３０日及び４５日の両方において、安定にトランスフェクションされたクローンにおいて、ＳＴＡＲ６７／ＳＴＡＲ７を有するＵＢ６コンストラクトは、ＵＢ６プロモーターに促進され、レポータータンパク質の発現レベルが２．５〜２．９倍高くなる。
【００９２】
従って、ＳＴＡＲ６７をプロモーターの上流に、２つのＳＴＡＲ７要素をカセットに隣接するように配置することにより、ＳＴＡＲ６７／ＳＴＡＲ７を有していないコンストラクトに比較して、ＣＨＯ細胞において有意に高いＥｐＣＡＭ抗体発現レベルが得られた。
【００９３】
実施例６：ＳＴＡＲ６及びＳＴＡＲ７がエンハンサーブロッカーであるのに対して、ＳＴＡＲ６７はエンハンサーブロッカーではない。
特性が調べられたこれまで既知のＳＴＡＲ配列はすべて、ＳＴＡＲ６及びＳＴＡＲ７を含め、エンハンサーブロッカーである（ＷＯ ０３／００４７０４、Ｋｗａｋｓ ｅｔ ａｌ， ２００３）。エンハンサーブロッカー活性は、ＳＴＡＲ要素を強力なエンハンサーとプロモーターとの間に配置することにより試験される。ここでは、ＳＴＡＲ６７もまたエンハンサーブロッカーであるかどうかを調べた。
【００９４】
材料及び方法
ｄ２ＥＧＦＰ遺伝子をプライマーＴＴＧＧＴＴＧＧＴＣＡＴＧＡＡＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＧＡＧＣＴＧＴＴＣ（配列番号７５）及びＡＴＴＣＴＣＴＡＧＡＣＴＡＣＡＣＡＴＴＧＡＴＣＣＴＡＧＣＡＧＡＡＧＣＡＧ（配列番号７６）用いてＰＣＲで増幅し、Ｎｃｏ１及びＸｂａＩ制限酵素部位を用いてプラスミドｐＧＬ３−プロモーター（Ｐｒｏｍｅｇａ）にクローニングし、ルシフェラーゼ遺伝子を置換してプラスミドｐＧＬ３−プロモーター−ＧＦＰを作製した。リンカー（オリゴＣＧＡＴＡＴＣＴＴＧＧＡＧＡＴＣＴＡＣＴＡＧＴＧＧＣＧＣＧＣＣＴＴＧＧＧＣＴＡＧＣＴ（配列番号７７）及びＧＡＴＣＡＧＣＴＡＧＣＣＣＡＡＧＧＣＧＣＧＣＣＡＣＴＡＧＴＡＧＡＴＣＴＣＣＡＡＧＡＴＡＴＣＧＡＧＣＴ（配列番号７８）をアニーリングして作成した）をＳａｄ及びＢｇｌＩＩ部位にクローニングしてマルチクローニング部位を作製した。リンカーのライゲーションにより元々のＢｇｌＩＩ部位を破壊し、リンカーＤＮＡ内に固有のＢｇｌＩＩ部位を作製した。ＢｓａＢＩ及びＢａｍＨＩを用いて、ＳＶ４０エンハンサーをプラスミドｐＧＬ３−ｂａｓｉｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ）から切り出し、ＥｃｏＲＶ及びＢｇｌＩＩ部位を用いてｐＧＬ３−リンカー−プロモーター−ＧＦＰにクローニングし、プラスミドｐＧＬ３−エンハンサー−プロモーター−ＧＦＰを作製した。ＳＴＡＲ４０要素（配列番号４０）をＫｐｎＩ及びＳａｄ部位を用いてＳＶ４０エンハンサーの上流に配置し、エンハンサーの上流配列に対する作用を阻害した。最後に、抗リプレッサー要素ＳＴＡＲ６、ＳＴＡＲ７及びＳＴＡＲ６７を、ＳＶ４０エンハンサーとＳＶ４０最小プロモーターとの間にＳｐｅＩ及びＡｓｃＩ制限酵素部位を用いて配置した。
【００９５】
ＣＨＯ細胞のトランスフェクション及び培養
チャイニーズハムスター卵巣細胞株ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−６１）に実施例２と同様にトランスフェクションした。トランスフェクションの１日後に、ｄ２ＥＧＦＰレベルをＥｐｉｃｓ ＸＬフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社製）にて測定した。
【００９６】
結果
図１０は、ＳＴＡＲ６及びＳＴＡＲ７が同じ分析法においてエンハンサーブロッカーとして作用するのに対し、ＳＴＡＲ６７がエンハンサーブロッカーではないことを示している。ＳＴＡＲ６、ＳＴＡＲ７及びＳＴＡＲ６７はｄ２ＥＧＦＰ遺伝子の上流にあるＳＶ４０エンハンサーと最小ＳＶ４０プロモーターの間にクローニングした。ＳＴＡＲ要素をエンハンサーとプロモーターの間にクローニングしなかった場合には、強力な転写活性化がおきた（これを任意に１００％と設定した）。ＳＴＡＲ６又はＳＴＡＲ６７をエンハンサーとプロモーターの間に配置した場合には、転写はバックグラウンドレベルまで低下し、このことはＳＴＡＲ６及びＳＴＡＲ７が強力なエンハンサーブロッカーであることを示している。これに対して、ＳＴＡＲ６７をエンハンサーとプロモーターの間にクローニングした場合には、相対的転写レベルはまだコントロールに対して８０パーセントであり、このことはＳＴＡＲ６７が良いエンハンサーブロッカーではないことを示しており、これはＳＴＡＲ６及びＳＴＡＲ７だけでなく、以前に記載されている（ＷＯ ０３／００４７０４、Ｋｗａｋｓ ｅｔ ａｌ， ２００３）他の抗リプレッサー要素と対照的である。
【００９７】
実施例７：ＳＴＡＲ６７は安定にトランスフェクションされたＣＨＯ細胞においてＵＢ６及びＣＭＶに促進された抗体発現レベルを増加させる
実施例５において、ＳＴＡＲ６７及びＳＴＡＲ７を組み合わせることによりＣＨＯ細胞におけるＥｐＣＡＭ抗体の発現レベルが強化されることを、重鎖と軽鎖を含む２つの異なるプラスミドの関係において示した。本実施例では、ＳＴＡＲ６７が、重鎖及び軽鎖が１つのプラスミド上にある場合にＥｐＣＡＭ抗体の産生に用いることができるかどうかを調べた。各選択可能なマーカーについて同時選択法を用いた。
【００９８】
材料及び方法
重鎖ｃＤＮＡ（ＨＣ−ＥｐＣＡＭ）をＵＢ６プロモーターの制御下におき、ＩＲＥＳ配列によりゼオシン抵抗性遺伝子に連結した。軽鎖ｃＤＮＡ（ＬＣ−ＥｐＣＡＭ）をＣＭＶプロモーターの制御下におき、ＩＲＥＳ配列によりピューロマイシン抵抗性遺伝子に連結した。基本的に、これらは実施例５において用いたコンストラクトである。これら２つの発現カセットを１つのプラスミド上に、２つの発現ユニットの転写が反対方向になるように配置した。コントロールプラスミドにおいて、ＵＢ６とＣＭＶプロモーターは５００ｂｐの詰めもの（stuffer）で分離した（ＥｐＣＡＭコントロール）（図１０）。他のプラスミドにおいて、ＳＴＡＲ６７をＵＢβプロモーターとＣＭＶプロモーターの間に配置した（ＥｐＣＡＭ ＳＴＡＲ６７）（図１０）。
【００９９】
ＣＨＯ細胞の転写及び培養
チャイニーズハムスター卵巣細胞株ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−６１）を実施例２と同様にトランスフェクションして培養し、選択にはゼオシン（１００μｇ／ｍｌ）及びピューロマイシン（２．５μｇ／ｍｌ）を用いた。実施例５において、両方の選択マーカーについて連続選択を用いた。これに対して本実施例においては、両方の選択薬剤を同時に培地中に存在させた。トランスフェクション後１日で、ゼオシン及びピューロマイシンを培地中に加えた。選択培地はコロニーを単離する（トランスフェクション後約１４日）まで存在させた。コロニーを単離し２４ウェルプレートに移した後、細胞をゼオシン及びピューロマイシン存在下で培養した。
【０１００】
結果
図１１はＵＢβプロモーターとＣＭＶプロモーターの間にクローニングしたＳＴＡＲ６７を有する抗体コンストラクトをトランスフェクションすると、ＥｐＣＡＭ抗体を発現する（抗ヒトＩｇＧ抗体を用いてＥＬＩＳＡ法により測定）ＣＨＯコロニーが多く得られるということを示している。ＥｐＣＡＭ ＳＴＡＲ６７プラスミドをトランスフェクションした１９コロニーにおいてＥｐＣＡＭ産生の平均は、トランスフェクション後２５日において測定すると９．８ｐｇ／細胞／日であった。
【０１０１】
これに対して、驚くべきことにＥｐＣＡＭコントロールプラスミドをトランスフェクションするとコロニーは全く生存しなかった。ゼオシン又はピューロマイシン一方のみで選択を行った場合、ＥｐＣＡＭコントロールコロニーは生存した。しかし、選択圧を重鎖及び軽鎖の両方にかけることによって選択圧を強めた場合、このような条件ではトランスフェクションしたプラスミド中に存在するＳＴＡＲ６７を有するコロニーしか生き残ることができなくなった。
【０１０２】
この結果は、ＳＴＡＲ６７の導入が１つのＳＴＡＲ６７要素の上流及び下流に配置された２つのプロモーター、ＵＢ６プロモーター及びＣＭＶプロモーターに有益な影響を与える、ということも示している。このことはＳＴＡＲ６７が両方向性に作用しうるということを示している。
【０１０３】
ＥｐＣＡＭコントロールとＥｐＣＡＭ ＳＴＡＲ６７プラスミドとの違いは、選択圧を高くした場合にＥｐＣＡＭ ＳＴＡＲ６７のトランスフェクションだけがコロニーの形成をもたらす、という点においてはっきりしている。これにより、このプラスミドの構造を、この効果を媒介する責任を担っている領域をＳＴＡＲ６７内に同定するために用いる機会が開かれる。ＳＴＡＲ６７のより小さな重複部分を、ＥｐＣＡＭ分子を促進するＵＢ６プロモーターとＣＭＶプロモーターとの間に配置する。ＳＴＡＲ６７の部分が機能を有するならば、ゼオシン及びピューロマイシンの両方を同時に選択薬剤として用いた際にコロニーは生存するであろう。ＳＴＡＲ６７の部分が機能を有さないないならば、同様の選択条件下ではコロニーは生存しないはずである。
【０１０４】
従って、プロモーターの上流にＳＴＡＲ３７を配置することにより、そのような抗リプレッサー要素を有していないコンストラクトと比較して、ＣＨＯ細胞において有意に高いＥｐＣＡＭ抗体発現レベルがもたらされた。同様の実験を、抗ＥｐＣＡＭ抗体の重鎖及び軽鎖の発現を促進するＳＶ４０プロモーターについても行った。他の実験において、ＳＴＡＲ６７を他のＳＴＡＲ配列に交換した。更なる実験において、重鎖及び軽鎖をコードする２つの発現単位の方向を、両方が同じ方向になるように改変した。他の実験において、重鎖及び軽鎖の発現ユニットをそれぞれ異なる核酸分子上に配置し（実施例５のように）、得られたクローンを両者の選択可能マーカーについて同時に選択した。他の実験において、ホスト細胞の種類を変更した。これらの変更の組み合わせを実行した。
【図面の簡単な説明】
【０１０５】
【図１】発明の概略図である。Ａ）トランス遺伝子（例えばｄ２ＥＧＦＰ遺伝子をコードする）、ＩＲＥＳ、及び選択可能なマーカー（ｚｅｏ、ゼオシン耐性を与える）をＣＭＶプロモーターの制御下に有する（５‘から３’方向）２シストロン遺伝子。発現ユニットはＳＶ４０転写終結部位を３‘末端に有する（ｔ）。コンストラクト名はＣＭＶ−ｄ２ＥＧＦＰ−ｉｒｅｓ−Ｚｅｏ（ＣＶＭコントロール）である。 Ｂ）Ａと同様のコンストラクトであるが、ＳＴＡＲ６７がＣＭＶプロモーターの上流にクローニングされている。コンストラクト名はＳＴＡＲ６７−ＣＭＶ−ｄ２ＥＧＦＰ−ｉｒｅｓ−Ｚｅｏ（ＣＭＶ−ＳＴＡＲ６７）である。 Ｃ）Ｂと同様のコンストラクトであるが、上流及び下流のＳＴＡＲ７要素が全コンストラクトに隣接するようにクローニングされている。コンストラクト名はＳＴＡＲ７−ＳＴＡＲ６７−ＣＭＶ−ｄ２ＥＧＦＰ−ｉｒｅｓ−Ｚｅｏ−ＳＴＡＲ７（ＣＭＶ−ＳＴＡＲ６７ ７／７）である。
【図２】ＳＴＡＲ６７はＣＨＯ細胞においてＣＭＶに促進されたｄ２ＥＧＦＰの発現を改善する。１０個の独立で安定なコロニーについてｄ２ＥＧＦＰシグナルの平均をＣＨＯ細胞において示されたコンストラクトについてプロットした。Ａ）ＣＭＶコントロール；Ｂ）ＳＴＡＲ６７−ＣＭＶ、Ｘ（ＩＯ）；１０個のコロニーのｄ２ＥＧＦＰ発現レベルの平均。詳細は実施例２を参照されたい。
【図３】ＳＴＡＲ６７はＣＨＯ細胞においてＥＦ１αに促進されたｄ２ＥＧＦＰ発現を改善する。図２と同様であるが、これはＥＦ１αについてである。Ａ）ＥＦ１αコントロール；Ｂ）ＳＴＡＲ６７−ＥＦ１α。
【図４】ＳＴＡＲ６７はＣＨＯ細胞においてＵＢ６に促進されたｄ２ＥＧＦＰ発現を改善する。図２と同様であるが、これはＵＢ６についてである。Ａ）ＵＢ６コントロール；Ｂ）ＳＴＡＲ６７−ＵＢ６。
【図５】ＳＴＡＲ６７はＰＥＲ．Ｃ６細胞においてＣＭＶに促進されたｄ２ＥＧＦＰ発現を改善する。図２と同様であるが、これはＰＥＲ．Ｃ６細胞についてである。Ａ）ＣＭＶコントロール；Ｂ）ＳＴＡＲ６７−ＣＭＶ。
【図６】ＳＴＡＲ６７はＰＥＲ．Ｃ６細胞においてＥＦ１αに促進されたｄ２ＥＧＦＰ発現を改善する。図３と同様であるが、これはＰＥＲ．Ｃ６細胞についてである。Ａ）ＥＦ１αコントロール；Ｂ）ＳＴＡＲ６７−ＥＦ１α。
【図７】ＳＴＡＲ６７はＰＥＲ．Ｃβ細胞におけるＵＢ６に促進されたｄ２ＥＧＦＰ発現を改善する。図４と同様であるが、これはＰＥＲ．Ｃ６細胞についてである。Ａ）ＵＢβコントロール；Ｂ）ＳＴＡＲ６７−ＵＢ６。
【図８】ＳＴＡＲ６７はＣＨＯ−Ｋ１細胞において他のＳＴＡＲ要素と組み合わせてＳＶ４０に促進されたｄ２ＥＧＦＰ発現を改善する。図２と同様であるが、ここではＣＨＯ細胞においてＳＶ４０プロモーターと、示したコンストラクトを使用した。ｄ２ＥＧＦＰシグナルの平均をトランスフェクションして６０日後に、１８〜２０個の独立で安定したコロニーについてプロットした。Ａ）ＳＶ４０コントロール、ＳＶ４０−ＳＴＡＲ６７、ＳＶ４０−ＳＴＡＲ７／７；Ｂ）ＳＶ４０コントロール及びＳＶ４０−ＳＴＡＲ６７ ７／７。詳細は実施例４を参照されたい。
【図９】ＳＴＡＲ６７はＣＨＯ−Ｋ１細胞においてＵＢ６に促進されたＥｐＣＡＭ抗体の発現を改善する。詳細は実施例５を参照されたい。Ａ）ＳＴＡＲ要素を有していないコンストラクト；Ｂ）プロモーターの上流にあるＳＴＡＲ６７及び隣接するＳＴＡＲ７要素を有するコンストラクト。抗ＥｐＣＡＭ抗体の濃度はｐｇ／細胞／日で示した。Ｘ（１８）：１８コロニーの平均産生レベル。
【図１０】ＳＴＡＲ６及び７がエンハンサーブロッカーであるのに対して、ＳＴＡＲ６７はエンハンサーブロッカーではない。詳細は実施例６を参照されたい。
【図１１】ＳＴＡＲ６７は安定にトランスフェクションしたＣＨＯ細胞においてＵＢ６及びＣＭＶに促進された抗体発現レベルを増加させる。詳細は実施例７を参照されたい。Ａ）抗ＥｐＣＡＭ重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）をそれぞれプロモーターの後ろに含んでおり、それぞれが異なった選択可能なマーカー遺伝子に連結している単一ＤＮＡ分子（）両者のマーカーについて同時選択を使用した）：ＳＴＡＲ要素を有していないコンストラクト。コロニーは全く見いだされなかった；Ｂ）ＳＴＡＲ６７を２つのプロモーターの間に有する同じコンストラクト。抗ＥｐＣＡＭ抗体の濃度はｐｇ／細胞／日で示した。Ｘ（１９）：１９コロニーの平均産生レベル。
【０１０６】
参考文献
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）配列番号６６、
ｂ）配列番号６６の断片であって、抗リプレッサー活性を有する前記断片、
ｃ）ヌクレオチド配列についてａ）又はｂ）に少なくとも７０％相同な配列であって、抗リプレッサー活性を有する前記配列、並びに
ｄ）ａ）〜ｃ）の任意の１つの相補体；
よりなるグループから選択された抗リプレッサー活性を有する核酸配列を有する組換え核酸分子であって、
前記組換え核酸分子は更に発現カセットを有しており、前記発現カセットは関心のある核酸と連結した異種プロモーターを有しており、関心のある前記核酸は好ましくは関心のあるタンパク質の全長又は一部をコードしている、上記組換え核酸分子。
【請求項２】
抗リプレッサー活性を有する前記核酸配列が前記発現カセット内において前記プロモーターの上流に位置している請求項１に記載の分子。
【請求項３】
抗リプレッサー活性を有する前記配列と前記プロモーターとが２ｋｂ未満離れている請求項２に記載の分子。
【請求項４】
関心のあるタンパク質をコードする前記核酸が更に選択可能なマーカー遺伝子をコードする多シストロン遺伝子内に存在する、請求項１から請求項３のいずれか１つの請求項に記載の分子。
【請求項５】
抗リプレッサー活性を有する少なくとも一つの他の配列を更に有しており、前記少なくとも一つの他の配列が
ａ）配列番号１〜６５のいずれか、
ｂ）配列番号１〜６５のいずれかの断片であって、抗リプレッサー活性を有する前記断片、
ｃ）ヌクレオチド配列についてａ）又はｂ）に少なくとも７０％相同な配列であって、抗リプレッサー活性を有する前記配列、並びに
ｄ）ａ）〜ｃ）の任意の１つの相補体、
から選択されたものである、請求項１から請求項４のいずれか１つの請求項に記載の分子。
【請求項６】
発現カセットを有する組換え核酸分子であって、
前記発現カセットは５‘−抗リプレッサー配列Ａ−プロモーター−関心のあるタンパク質の全長又は一部をコードする核酸−抗リプレッサー配列Ｂ−３’を有しており、抗リプレッサー配列Ａ及びＢは同じものであっても異なるものであってもよく、
（ｉ）配列番号１〜６５のいずれか、
（ｉｉ）配列番号１〜６５のいずれかの断片であって、抗リプレッサー活性を有する前記断片、
（ｉｉｉ）ヌクレオチド配列についてａ）又はｂ）に少なくとも７０％相同な配列であって、抗リプレッサー活性を有する前記配列、並びに
（ｉｖ）（ｉ）〜（ｉｉｉ）の任意の１つの相補体
からなるグループより選択されており、
前記発現カセットは更に前記抗リプレッサー配列ＡとＢの間に
ａ）配列番号６６、
ｂ）配列番号６６の断片であって、抗リプレッサー活性を有する前記断片、
ｃ）ヌクレオチド配列についてａ）又はｂ）に少なくとも７０％相同な配列であって、抗リプレッサー活性を有する前記配列、並びに
ｄ）ａ）〜ｃ）の任意の１つの相補体、
よりなるグループから選択された抗リプレッサー活性を有する配列を有しているという特徴を備えている組換え核酸分子。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１つに記載の分子を有する細胞。
【請求項８】
哺乳類細胞である請求項７に記載の細胞。
【請求項９】
ＣＨＯ細胞である請求項８に記載の細胞。
【請求項１０】
関心のあるタンパク質を生成する方法であって、関心のあるタンパク質をコードする組換え核酸分子を有する細胞を培養して前記細胞内で関心のあるタンパク質をコードする前記核酸を発現させるステップを有しており、
前記組換え核酸分子が
ａ）配列番号６６、
ｂ）配列番号６６の断片であって、抗リプレッサー活性を有する前記断片、
ｃ）ヌクレオチド配列についてａ）又はｂ）に少なくとも７０％相同な配列であって、抗リプレッサー活性を有する前記配列、並びに
ｄ）ａ）〜ｃ）の任意の１つの相補体、よりなるグループから選択された抗リプレッサー活性を有する核酸配列を有しているという特徴を備える、前記方法。
【請求項１１】
更に関心のある前記タンパク質を単離するステップを有する請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
抗リプレッサー活性を有する前記核酸配列が関心のあるタンパク質の発現を制御するプロモーターの上流に位置している請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１３】
抗リプレッサー活性を有する前記配列と前記プロモーターとが２ｋｂ未満離れている請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
関心のあるタンパク質をコードする前記核酸が更に選択可能なマーカー遺伝子をコードする多シストロン遺伝子内に存在する請求項１０〜１３のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１５】
前記細胞が哺乳類細胞である請求項１０〜１４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１６】
前記細胞がＣＨＯ細胞である請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ａ）配列番号６６、
ｂ）配列番号６６の断片であって、抗リプレッサー活性を有する前記断片、
ｃ）ヌクレオチド配列についてａ）又はｂ）に少なくとも７０％相同な配列であって、抗リプレッサー活性を有する前記配列、並びに
ｄ）ａ）〜ｃ）の任意の１つの相補体、
からなるグループから選択された抗リプレッサー活性を有する核酸配列を、関心のある核酸の発現を上昇させるために使用する方法。
【請求項１８】
関心のある２種類のポリペプチドを発現するホスト細胞を生成する方法であって、
ａ）ホスト細胞内に１種類以上の核酸分子を導入するステップであって、この又はこれらの核酸分子はすべて
（ｉ）第１の関心のあるポリペプチドをコードする配列及び第１の選択可能なマーカー遺伝子に機能的に連結したプロモーター、
（ｉｉ）第２の関心のあるポリペプチドをコードする配列及び第２の選択可能なマーカー遺伝子に機能的に連結したプロモーター、並びに
（ｉｉｉ）ａ）配列番号１〜６６のいずれか１つ、ｂ）配列番号１〜６６のいずれか１つの断片であって、抗リプレッサー活性を有する前記断片、ｃ）ａ）又はｂ）に少なくとも７０％相同な配列であって、抗リプレッサー活性を有する配列、並びにｄ）ａ）〜ｃ）の任意の１つの相補体、よりなるグループから選択された少なくとも１つの抗リプレッサー活性を有する配列、
を有している上記ステップ、並びに
ｂ）前記第１及び第２の選択可能なマーカー遺伝子の発現についてほぼ同時に選択することによりホスト細胞を選択するステップ
を有する上記方法。
【請求項１９】
請求項１８に記載の方法により得られたホスト細胞を培養して前記第１及び第２のポリペプチドを発現させるステップと、任意で前記ポリペプチドを単離するステップとを有する、関心のある２種類のポリペプチドを発現させる方法。
【請求項２０】
抗リプレッサー活性を有する前記配列が、
ａ）配列番号６６、
ｂ）配列番号６６の断片であって、抗リプレッサー活性を有する前記断片、
ｃ）ヌクレオチド配列についてａ）又はｂ）に少なくとも７０％相同な配列であって、抗リプレッサー活性を有する前記配列、並びに
ｄ）ａ）〜ｃ）の任意の１つの相補体；
よりなるグループから選択された請求項１８または請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
請求項１８から２０のいずれか１つの請求項に記載に方法であって、前記２種類のポリペプチドが多量体タンパク質の一部である方法。
【請求項１】
ａ）配列番号６６、
ｂ）配列番号６６の断片であって、抗リプレッサー活性を有する前記断片、
ｃ）ヌクレオチド配列についてａ）又はｂ）に少なくとも７０％相同な配列であって、抗リプレッサー活性を有する前記配列、並びに
ｄ）ａ）〜ｃ）の任意の１つの相補体；
よりなるグループから選択された抗リプレッサー活性を有する核酸配列を有する組換え核酸分子であって、
前記組換え核酸分子は更に発現カセットを有しており、前記発現カセットは関心のある核酸と連結した異種プロモーターを有しており、関心のある前記核酸は好ましくは関心のあるタンパク質の全長又は一部をコードしている、上記組換え核酸分子。
【請求項２】
抗リプレッサー活性を有する前記核酸配列が前記発現カセット内において前記プロモーターの上流に位置している請求項１に記載の分子。
【請求項３】
抗リプレッサー活性を有する前記配列と前記プロモーターとが２ｋｂ未満離れている請求項２に記載の分子。
【請求項４】
関心のあるタンパク質をコードする前記核酸が更に選択可能なマーカー遺伝子をコードする多シストロン遺伝子内に存在する、請求項１から請求項３のいずれか１つの請求項に記載の分子。
【請求項５】
抗リプレッサー活性を有する少なくとも一つの他の配列を更に有しており、前記少なくとも一つの他の配列が
ａ）配列番号１〜６５のいずれか、
ｂ）配列番号１〜６５のいずれかの断片であって、抗リプレッサー活性を有する前記断片、
ｃ）ヌクレオチド配列についてａ）又はｂ）に少なくとも７０％相同な配列であって、抗リプレッサー活性を有する前記配列、並びに
ｄ）ａ）〜ｃ）の任意の１つの相補体、
から選択されたものである、請求項１から請求項４のいずれか１つの請求項に記載の分子。
【請求項６】
発現カセットを有する組換え核酸分子であって、
前記発現カセットは５‘−抗リプレッサー配列Ａ−プロモーター−関心のあるタンパク質の全長又は一部をコードする核酸−抗リプレッサー配列Ｂ−３’を有しており、抗リプレッサー配列Ａ及びＢは同じものであっても異なるものであってもよく、
（ｉ）配列番号１〜６５のいずれか、
（ｉｉ）配列番号１〜６５のいずれかの断片であって、抗リプレッサー活性を有する前記断片、
（ｉｉｉ）ヌクレオチド配列についてａ）又はｂ）に少なくとも７０％相同な配列であって、抗リプレッサー活性を有する前記配列、並びに
（ｉｖ）（ｉ）〜（ｉｉｉ）の任意の１つの相補体
からなるグループより選択されており、
前記発現カセットは更に前記抗リプレッサー配列ＡとＢの間に
ａ）配列番号６６、
ｂ）配列番号６６の断片であって、抗リプレッサー活性を有する前記断片、
ｃ）ヌクレオチド配列についてａ）又はｂ）に少なくとも７０％相同な配列であって、抗リプレッサー活性を有する前記配列、並びに
ｄ）ａ）〜ｃ）の任意の１つの相補体、
よりなるグループから選択された抗リプレッサー活性を有する配列を有しているという特徴を備えている組換え核酸分子。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１つに記載の分子を有する細胞。
【請求項８】
哺乳類細胞である請求項７に記載の細胞。
【請求項９】
ＣＨＯ細胞である請求項８に記載の細胞。
【請求項１０】
関心のあるタンパク質を生成する方法であって、関心のあるタンパク質をコードする組換え核酸分子を有する細胞を培養して前記細胞内で関心のあるタンパク質をコードする前記核酸を発現させるステップを有しており、
前記組換え核酸分子が
ａ）配列番号６６、
ｂ）配列番号６６の断片であって、抗リプレッサー活性を有する前記断片、
ｃ）ヌクレオチド配列についてａ）又はｂ）に少なくとも７０％相同な配列であって、抗リプレッサー活性を有する前記配列、並びに
ｄ）ａ）〜ｃ）の任意の１つの相補体、よりなるグループから選択された抗リプレッサー活性を有する核酸配列を有しているという特徴を備える、前記方法。
【請求項１１】
更に関心のある前記タンパク質を単離するステップを有する請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
抗リプレッサー活性を有する前記核酸配列が関心のあるタンパク質の発現を制御するプロモーターの上流に位置している請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１３】
抗リプレッサー活性を有する前記配列と前記プロモーターとが２ｋｂ未満離れている請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
関心のあるタンパク質をコードする前記核酸が更に選択可能なマーカー遺伝子をコードする多シストロン遺伝子内に存在する請求項１０〜１３のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１５】
前記細胞が哺乳類細胞である請求項１０〜１４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１６】
前記細胞がＣＨＯ細胞である請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ａ）配列番号６６、
ｂ）配列番号６６の断片であって、抗リプレッサー活性を有する前記断片、
ｃ）ヌクレオチド配列についてａ）又はｂ）に少なくとも７０％相同な配列であって、抗リプレッサー活性を有する前記配列、並びに
ｄ）ａ）〜ｃ）の任意の１つの相補体、
からなるグループから選択された抗リプレッサー活性を有する核酸配列を、関心のある核酸の発現を上昇させるために使用する方法。
【請求項１８】
関心のある２種類のポリペプチドを発現するホスト細胞を生成する方法であって、
ａ）ホスト細胞内に１種類以上の核酸分子を導入するステップであって、この又はこれらの核酸分子はすべて
（ｉ）第１の関心のあるポリペプチドをコードする配列及び第１の選択可能なマーカー遺伝子に機能的に連結したプロモーター、
（ｉｉ）第２の関心のあるポリペプチドをコードする配列及び第２の選択可能なマーカー遺伝子に機能的に連結したプロモーター、並びに
（ｉｉｉ）ａ）配列番号１〜６６のいずれか１つ、ｂ）配列番号１〜６６のいずれか１つの断片であって、抗リプレッサー活性を有する前記断片、ｃ）ａ）又はｂ）に少なくとも７０％相同な配列であって、抗リプレッサー活性を有する配列、並びにｄ）ａ）〜ｃ）の任意の１つの相補体、よりなるグループから選択された少なくとも１つの抗リプレッサー活性を有する配列、
を有している上記ステップ、並びに
ｂ）前記第１及び第２の選択可能なマーカー遺伝子の発現についてほぼ同時に選択することによりホスト細胞を選択するステップ
を有する上記方法。
【請求項１９】
請求項１８に記載の方法により得られたホスト細胞を培養して前記第１及び第２のポリペプチドを発現させるステップと、任意で前記ポリペプチドを単離するステップとを有する、関心のある２種類のポリペプチドを発現させる方法。
【請求項２０】
抗リプレッサー活性を有する前記配列が、
ａ）配列番号６６、
ｂ）配列番号６６の断片であって、抗リプレッサー活性を有する前記断片、
ｃ）ヌクレオチド配列についてａ）又はｂ）に少なくとも７０％相同な配列であって、抗リプレッサー活性を有する前記配列、並びに
ｄ）ａ）〜ｃ）の任意の１つの相補体；
よりなるグループから選択された請求項１８または請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
請求項１８から２０のいずれか１つの請求項に記載に方法であって、前記２種類のポリペプチドが多量体タンパク質の一部である方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【公表番号】特表２００８−５０５６２６（Ｐ２００８−５０５６２６Ａ）
【公表日】平成２０年２月２８日（２００８．２．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５１９８０５（Ｐ２００７−５１９８０５）
【出願日】平成１７年７月７日（２００５．７．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００５／０５３２５１
【国際公開番号】ＷＯ２００６／００５７１８
【国際公開日】平成１８年１月１９日（２００６．１．１９）
【出願人】（５０７００６２８２）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年２月２８日（２００８．２．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年７月７日（２００５．７．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００５／０５３２５１
【国際公開番号】ＷＯ２００６／００５７１８
【国際公開日】平成１８年１月１９日（２００６．１．１９）
【出願人】（５０７００６２８２）
【Ｆターム（参考）】
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