核酸増幅方法
【課題】オリゴヌクレオチドプライマーとＤＮＡポリメラーゼとを用いて実施可能な核酸の増幅方法を提供すること。
【解決手段】少なくとも１種のデオキシヌクレオチド３リン酸、少なくとも１種のＤＮＡポリメラーゼ、少なくとも２種のオリゴヌクレオチドプライマー、及び鋳型となる核酸断片を含む反応溶液をインキュベートすることによって前記プライマーの３’末端を起点とするポリメラーゼ反応を行い該核酸断片を増幅することを含む核酸の増幅方法であって、第一のオリゴヌクレオチドプライマーの５’末端側にタグ配列が付加されており、該タグ配列が、鋳型となる核酸断片の塩基配列上において、第一のオリゴヌクレオチドプライマーの３’末端側部分（第一のオリゴヌクレオチドが鋳型核酸とアニールする部分）と実質的に相同な配列の３’末端側に存在する塩基配列であることを特徴とする、核酸の増幅方法。
【解決手段】少なくとも１種のデオキシヌクレオチド３リン酸、少なくとも１種のＤＮＡポリメラーゼ、少なくとも２種のオリゴヌクレオチドプライマー、及び鋳型となる核酸断片を含む反応溶液をインキュベートすることによって前記プライマーの３’末端を起点とするポリメラーゼ反応を行い該核酸断片を増幅することを含む核酸の増幅方法であって、第一のオリゴヌクレオチドプライマーの５’末端側にタグ配列が付加されており、該タグ配列が、鋳型となる核酸断片の塩基配列上において、第一のオリゴヌクレオチドプライマーの３’末端側部分（第一のオリゴヌクレオチドが鋳型核酸とアニールする部分）と実質的に相同な配列の３’末端側に存在する塩基配列であることを特徴とする、核酸の増幅方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸の増幅方法に関する。より詳細には、本発明は、ＤＮＡポリメラーゼを用いて反応溶液をインキュベートすることによってポリメラーゼ反応を行うことを特徴とする核酸の増幅方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
分子生物学の研究においては、核酸の増幅は、一般的には、ＤＮＡポリメラーゼを利用した酵素的方法で行われている。核酸の増幅方法としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が広く知られている。ＰＣＲ法では、目的とする標的核酸配列を増幅させるために、鋳型である二本鎖ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに変性する工程（変性工程）、一本鎖ＤＮＡにプライマーをアニーリングさせる工程（アニーリング工程）、及びプライマーを起点として相補鎖を伸長する工程（伸長工程）の３つの工程から構成される。通常のＰＣＲ法においては、サーマルサイクラーを使用して、変性工程、アニーリング工程、伸長工程はそれぞれ異なる温度で行われている。しかし、３種類の異なる温度で核酸増幅反応を行うことは、温度制御が煩雑であり、またサイクル数に比例して時間のロスも増大していくという問題があった。
【０００３】
そこで、等温状態で実施することが可能な核酸増幅方法が開発されている。例えば、RCA（Rolling Circle Amplification:Proc.Natl.Acad.Sci,vol.92,4641-4645(1995)）、 ICAN(Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids)、LAMP(Loop-Mediated Isothermal Amplification of DNA；Bio Industry,第18巻、2号（2001）)、NASBA(Nucleic acid Sequence-based Amplification method;Nature,350,91〜(1991))、TMA(Transcription mediated amplification method;J.Clin Microbiol.第31巻、3270〜（1993）)等が挙げられる。
【０００４】
SDA法（特開平５−１３０８７０号）は、エクソヌクレアーゼを用いたサイクリングアッセイ法であり、ポリメラーゼ伸長反応を利用したターゲット核酸断片の目的部位の増幅法の一つである。この方法はターゲット核酸断片の目的部位に特異的にハイブリダイゼーションしたプライマーを起点とした、ポリメラーゼ伸長反応とともに、５’→３’エクソヌクレアーゼを作用させて、プライマーを逆方向から分解する方法である。分解したプライマーの代わりに新たなプライマーがハイブリダイゼーションし、再度ＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応が進行する。このポリメラーゼによる伸長反応と、この先に伸長した鎖を外すエクソヌクレア−ゼによる分解反応が順次、周期的に繰り返される。ここで、ポリメラーゼによる伸長反応とエクソヌクレア−ゼによる分解反応は等温条件で実施することが可能である。しかしながら、ポリメラーゼと共にエクソヌクレアーゼを用いる必要があり、コストがかかると共に、プライマーの設計を工夫する必要があった。
【０００５】
LAMP法は、近年開発されたターゲット核酸断片の目的部位の増幅法である。この方法は、ターゲット核酸断片の少なくとも6箇所の特定部位を相補的に認識する少なくとも4種のプライマーと、5’→3’方向へのヌクレアーゼ活性がなく、かつ鋳型上の２本鎖DNAを１本鎖DNAとして遊離させながら伸長反応を触媒する鎖置換型のBst DNAポリメラーゼを使用することで、等温条件でターゲット核酸断片の目的部位を、特別な構造として増幅する方法である。しかしながら、6箇所の特定部位を認識する少なくとも4種のプライマーを用いる必要があり、プライマー設計が非常に困難であった。
【０００６】
ICAN法も、近年開発されたターゲット核酸断片の目的部位の増幅法である。RNA-DNAキメラプライマー、鎖置換活性と鋳型交換活性を有するDNAポリメラーゼ、RNaseHを用いる等温の遺伝子増幅方法である。キメラプライマーが鋳型と結合した後、DNAポリメラーゼにより相補鎖が合成される。その後、RNaseHがキメラプライマー由来のRNA部分を切断し、切断部分から鎖置換反応と鋳型交換反応を伴った伸長反応が起きるこの反応が繰り返し起こることにより遺伝子が増幅される。しかしながら、この方法もキメラプライマーという特殊なプライマーを用いる必要がありプライマー設計が非常に困難である。
【０００７】
特表平１１−５０９４０６号公報には、鎖置換能を有するＤＮＡポリメラーゼ存在下、少なくとも１組のオリゴヌクレオチドプライマーにより目的とする領域のＤＮＡを等温における反応によって増幅する方法が記載されている。しかしながら、特表平１１−５０９４０６公報に記載の方法では比較的長い反応時間が必要であるなどの問題がある。
【０００８】
特開２００２−２３３３７９号公報には、鎖置換能を有するＤＮＡポリメラーゼ存在下、少なくとも１組のオリゴヌクレオチドプライマーにより目的とする領域のＤＮＡを等温における反応によって増幅する方法が記載されている。しかしながら、特開２００２−２３３３７９号公報に記載の方法では、非特異的な増幅産物の生成が顕著であるという問題があった。
【０００９】
【非特許文献１】Proc.Natl.Acad.Sci,vol.92,4641-4645(1995)
【非特許文献２】Bio Industry,第18巻、2号（2001）
【非特許文献３】Nature,350,91〜(1991)
【非特許文献４】J.Clin Microbiol.第31巻、3270〜（1993）
【特許文献１】特開平５−１３０８７０号公報
【特許文献２】特表平１１−５０９４０６号号公報
【特許文献３】特開２００２−２３３３７９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、オリゴヌクレオチドプライマーとＤＮＡポリメラーゼとを用いて実施可能な核酸の増幅方法を提供することを解決すべき課題とした。本発明はさらに、標的核酸配列を短時間で特異的に、高効率で増幅することができる、簡便かつ迅速な核酸の増幅方法を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、少なくとも１種のデオキシヌクレオチド３リン酸、少なくとも１種のＤＮＡポリメラーゼ、少なくとも２種のオリゴヌクレオチドプライマー、及び鋳型となる核酸断片を含む反応溶液をインキュベートすることによって前記プライマーの３’末端を起点とするポリメラーゼ反応を行い該核酸断片を増幅することを含む核酸の増幅方法において、第一のオリゴヌクレオチドプライマーの５’末端側に、鋳型となる核酸断片の塩基配列上において第一のオリゴヌクレオチドと実質的に相同な塩基配列よりも３’末端側に存在する塩基配列を付加することで、標的核酸配列のみを特異的に増幅することに成功した。
【００１２】
即ち、本発明によれば、少なくとも１種のデオキシヌクレオチド３リン酸、少なくとも１種のＤＮＡポリメラーゼ、少なくとも２種のオリゴヌクレオチドプライマー、及び鋳型となる核酸断片を含む反応溶液をインキュベートすることによって前記プライマーの３’末端を起点とするポリメラーゼ反応を行い、該核酸断片を増幅することを含む核酸の増幅方法であって、第一のオリゴヌクレオチドプライマーの５’末端側にタグ配列が付加されており、該タグ配列が、鋳型となる核酸断片の塩基配列上において、第一のオリゴヌクレオチドプライマーの３’末端側部分（第一のオリゴヌクレオチドが鋳型核酸とアニールする部分）と実質的に相同な配列の３’末端側に存在する塩基配列であることを特徴とする、核酸の増幅方法が提供される。図１に、第一のオリゴヌクレオチドプライマー、第二のオリゴヌクレオチドプライマー、タグ配列の位置関係の模式図を示す。
【００１３】
好ましくは、該タグ配列の３’末端の塩基は、鋳型となる核酸断片の塩基配列上において、第二のオリゴヌクレオチドプライマーの塩基配列に対して実質的に相補的な塩基配列よりも３’末端側に存在する塩基である。図２に、第一のオリゴヌクレオチドプライマー、第二のオリゴヌクレオチドプライマー、タグ配列の位置関係の模式図を示す。
好ましくは、該タグ配列は、鋳型となる核酸断片の塩基配列上において、第二のオリゴヌクレオチドプライマーの塩基配列に対して実質的に相補的な塩基配列よりも３’末端側に存在する塩基配列である。図３に、第一のオリゴヌクレオチドプライマー、第二のオリゴヌクレオチドプライマー、タグ配列の位置関係の模式図を示す。
【００１４】
好ましくは、第一のオリゴヌクレオチドプライマーの５’末端側に付加するタグ配列は、２塩基以上２０塩基以下である。
好ましくは、第一のオリゴヌクレオチドプライマーの５’末端側に付加するタグ配列は、鋳型となる核酸断片の塩基配列上において、第一のオリゴヌクレオチドプライマーの３’末端側部分（第一のオリゴヌクレオチドが鋳型核酸とアニールする部分）と実質的に相同な配列の３’末端側２００塩基以内に存在する塩基配列である。
【００１５】
好ましくは、反応溶液は、少なくとも０．０１％以上の界面活性剤をさらに含む。
好ましくは、界面活性剤は非イオン性界面活性剤である。
好ましくは、非イオン性界面活性剤は、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル系、ポリオキシエチレンアルキルフェノールエーテル系、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系から選ばれる。
好ましくは、反応溶液は、２価の陽イオンをさらに含む。
好ましくは、反応溶液は、融解温度調整剤をさらに含む。
好ましくは、融解温度調整剤は、ジメチルスルホキシド、ベタイン、ホルムアミドもしくはグリセロール、またはこれらの２種以上の混合物である。
【００１６】
好ましくは、少なくとも１種のＤＮＡポリメラーゼは、鎖置換機能を有するＤＮＡポリメラーゼである。
好ましくは、少なくとも１種の鎖置換能を有するＤＮＡポリメラーゼは、バチルス ステアロサーモフィラス由来の５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損Ｂｓｔ．ＤＮＡポリメラーゼ、及びバチルスカルドテナックス由来の５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損Ｂｃａ ＤＮＡポリメラーゼ 、サーモコッカス リトラリス由来の５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損Ｖｅｎｔ．ＤＮＡポリメラーゼ、アリサイクロバチルス アシドカルダリウス由来のＤＮＡポリメラーゼからなる群より選択されるポリメラーゼである。
【００１７】
好ましくは、核酸を増幅する工程は実質的に等温で行われる。
好ましくは、核酸を増幅する工程は５０℃以上１００℃以下で行われる。
好ましくは、核酸を増幅する工程は実質的に６０分以内で行われる。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、第一のオリゴヌクレオチドプライマーの５’末端側に付加するタグ配列（即ち、鋳型となる核酸断片の塩基配列上において第一のオリゴヌクレオチドプライマーの３’末端側部分（第一のオリゴヌクレオチドが鋳型核酸とアニールする部分）と実質的に相同な配列の３’末端側に存在する塩基配列）を介した高分子量産物の形成反応が非常に効率的に進むため、標的核酸配列のみを特異的に増幅することが可能である。しかも、本発明によれば、複雑な温度制御、特殊な酵素の使用、複雑なプライマー設計も必要とせずに標的核酸配列を増幅することが可能であるため、簡便、迅速、高感度な核酸の増幅方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下、本発明についてさらに詳細に説明する。
本発明による核酸の増幅方法は、少なくとも１種のデオキシヌクレオチド３リン酸、少なくとも１種のＤＮＡポリメラーゼ、２価の陽イオン、少なくとも２種のオリゴヌクレオチドプライマー、及び鋳型となる核酸断片を含む反応溶液をインキュベートすることによって前記プライマーの３’末端を起点とするポリメラーゼ反応を行い該核酸断片を増幅することを含む核酸の増幅方法であって、第一のオリゴヌクレオチドプライマーの５’末端側にタグ配列が付加されており、該タグ配列が、鋳型となる核酸断片の塩基配列上において第一のオリゴヌクレオチドプライマーの３’末端側部分（第一のオリゴヌクレオチドが鋳型核酸とアニールする部分）と実質的に相同な塩基配列よりも３’末端側に存在する塩基配列であることを特徴とする方法である。
【００２０】
本発明の一例である実施例１で用いたプライマーのβ２AR遺伝子に対する位置関係の詳細を図４に示す。この実施例１において、第一のオリゴヌクレオチドプライマー（配列番号１）の５’末端側に付加されているタグ配列は、５'−CCACGACG−３'である（配列番号１及び図４を参照）。鋳型となる核酸断片の塩基配列上において第一のオリゴヌクレオチドプライマーの３’末端側部分（第一のオリゴヌクレオチドが鋳型核酸とアニールする部分）と実質的に相同な塩基配列は、５’−CTTGCTGGCACCCAATA−３’に相当する。そして、鋳型となる核酸断片の塩基配列上において第一のオリゴヌクレオチドプライマーの３’末端側部分（第一のオリゴヌクレオチドが鋳型核酸とアニールする部分）と実質的に相同な塩基配列よりも３’末端側に存在する塩基配列は、５’−CCACGACG−３’（図４を参照）に相当し、当該塩基配列は、第一のオリゴヌクレオチドプライマー（配列番号１）の５’末端側に付加されているタグ配列に相当する。
【００２１】
本発明による核酸の増幅方法の概要を図１５に示す。鋳型となる核酸断片に対して第一のオリゴヌクレオチドプライマーがアニーリングして、当該オリゴヌクレオチドプライマーの３’末端を起点とするポリメラーゼ反応が進行する。その際、第一のオリゴヌクレオチドプライマーの５’末端側には、鋳型となる核酸断片の塩基配列上において第一のオリゴヌクレオチドプライマーの３’末端側部分（第一のオリゴヌクレオチドが鋳型核酸とアニールする部分）と実質的に相同な塩基配列よりも３’末端側に存在する塩基配列（タグ配列）が付加されていることから、第一のオリゴヌクレオチドプライマーを起点とするポリメラーゼ反応の増幅産物として、５’末端に、鋳型となる核酸断片の塩基配列上において第一のオリゴヌクレオチドプライマーの３’末端側部分（第一のオリゴヌクレオチドが鋳型核酸とアニールする部分）と実質的に相同な塩基配列よりも３’末端側に存在する塩基配列を含む増幅核酸断片（これを核酸断片Ａとする）が得られる。
【００２２】
次に、上記で得られた増幅核酸断片Ａに対して第二のオリゴヌクレオチドプライマーがアニーリングして、当該オリゴヌクレオチドプライマーの３’末端を起点とするポリメラーゼ反応が進行する。その際、鋳型となる増幅核酸断片Ａの５’末端に、タグ配列（鋳型となる核酸断片の塩基配列上において第一のオリゴヌクレオチドプライマーの３’末端側部分（第一のオリゴヌクレオチドが鋳型核酸とアニールする部分）と実質的に相同な塩基配列よりも３’末端側に存在する塩基配列）が存在するため、得られる増幅核酸断片（これを核酸断片Bとする）の３’末端には、タグ配列と実質的に相補的な配列（鋳型となる核酸断片の塩基配列上において第一のオリゴヌクレオチドプライマーの３’末端側部分（第一のオリゴヌクレオチドが鋳型核酸とアニールする部分）と実質的に相同な塩基配列よりも３’末端側に存在する塩基配列と実質的に相補的な配列）が含まれる。
【００２３】
核酸断片Bの３’末端の配列は、核酸断片Aに含まれる配列と2箇所で相補的である。核酸断片Bの３’末端が、核酸断片Aの３’末端側に存在する相補的な配列と二本鎖を形成し、それを起点としてポリメラーゼ反応が進行することで、高分子の増幅核酸断片が合成されることになる。
【００２４】
同様に、得られた高分子の増幅核酸断片が、核酸断片Aの３’末端側に存在する相補的な配列と二本鎖を形成し、それを起点としてポリメラーゼ反応が進行することで、さらなる高分子の増幅核酸断片が合成されうる。
【００２５】
以下、本発明で用いる成分について説明する。
（１）デオキシヌクレオチド３リン酸
伸長反応の基質として、デオキシヌクレオチド３リン酸を用いる。具体的には、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰの混合物を使用することが好ましい。デオキシヌクレオチド３リン酸としては、ｄＮＴＰのアナログ（例えば、７−デアザ−ｄＧＴＰ等）が含まれていてもよい。
【００２６】
また、デオキシヌクレオチド３リン酸（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ混合物）は、最終濃度で、それぞれ０．１ｍＭ〜３．０ｍＭ、好ましくは０．７５ｍＭ〜３．０ｍＭ、さらに好ましくは１．０ｍＭから２．０ｍＭ、特に好ましくは１．０ｍＭから１．５ｍＭの範囲である。
【００２７】
（２）ＤＮＡポリメラーゼ
本発明においては、鎖置換能を有するポリメラーゼを用いる。本明細書において「鎖置換能」とは、鋳型となる核酸配列に従ってＤＮＡ複製を行う際、ＤＮＡ鎖を置き換えながら進行し、鋳型鎖にアニーリングしている相補鎖を遊離させる、即ち鎖置換（strand displacement）することができる活性のことをいう。鎖置換能を有するポリメラーゼの具体例としては、バチルス ステアロサーモフィラス由来の５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損Ｂｓｔ．ＤＮＡポリメラーゼ、及びバチルスカルドテナックス由来の５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損Ｂｃａ ＤＮＡポリメラーゼ 、サーモコッカス リトラリス由来の５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損Ｖｅｎｔ．ＤＮＡポリメラーゼ、アリサイクロバチルス アシドカルダリウス由来のＤＮＡポリメラーゼなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。鎖置換能を有するポリメラーゼは、天然由来のものでもよいし、遺伝子工学的に製造した組み換え蛋白質でもよい。
【００２８】
（３）２価の陽イオン
本発明では、使用する酵素の金属要求性等に２価の陽イオンを用いる。２価の陽イオンとしては、マグネシウム塩、カルシウム塩やその他の金属塩を使用することができ、例えば、塩化マグネシウム、酢酸マグネシウム、硫酸マグネシウムなどを使用できる。２価の陽イオンの濃度は最終濃度で、好ましくは１ｍＭ〜２０ｍＭであり、さらに好ましくは２ｍＭ〜１０ｍＭの範囲である。
【００２９】
（４）界面活性剤
本発明では、反応溶液中に界面活性剤を添加してもよい。界面活性剤を使用することにより、非特異的な核酸の増幅を防止するという有利な効果を達成することができる。本発明で使用できる界面活性剤の種類は、特には限定されないが、アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、スルホコハク酸オクチルエステル塩、ステアリン酸石けんなどの陰イオン（アニオン）性界面活性剤、ショ糖脂肪酸エステル、ＰＯＥソルビタン脂肪酸エステル（Ｔｗｅｅｎ20、Ｔｗｅｅｎ40、Ｔｗｅｅｎ60、Ｔｗｅｅｎ80等）、脂肪酸アルカノールアミド、ＰＯＥアルキルエーテル（Ｂｒｉｊ35、Ｂｒｉｊ58、等）、ＰＯＥアルキルフェニルエーテル（ＴｒｉｔｏｎX-100、ＴｒｉｔｏｎX-114、Nonidet P40、等）、ノニルフェノール、ラウリルアルコール、ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレン・ポリオキシプロピレンブロックポリマー、ＰＯＥアルキルアミン、ＰＯＥ脂肪酸ビスフェニルエーテルなどの非イオン（ノニオン）性界面活性剤、そしてセチルピリジニウムクロライド、ラウリルジメチルベンジルアンモニウムクロライド、ステアリルトリメチルアンモニウムクロライドのような陽イオン（カチオン）性界面活性剤などを使用できる。界面活性剤の使用量は本発明の効果が達成できる限り特に限定されないが、好ましくは０．０１％以上、より好ましくは０．０５％以上、より好ましくは０．１％以上である。界面活性剤の使用量の上限は特に限定されないが、通常は１０％以下、好ましくは５％以下、より好ましくは１％以下である。
【００３０】
界面活性剤の中でも、非イオン性界面活性剤を使用することが特に好ましい。非イオン性界面活性剤の中でも、親水性がより強い界面活性剤が好ましく、ＨＬＢ価で示すと１２以上が好ましい。より好ましくは１４以上であり、上限は２０まで好ましく用いることができる。さらに好ましくは１７以下であり、より好ましくは１４以上１７以下である。構造的には、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル系、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系から選ばれることが好ましい。さらに、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルの中でも、脂肪酸エステルが一つだけのものが好ましい。例えば、以下の構造式で表すことができる。
【００３１】
【化１】
【００３２】
（式中、x + y + z + w = 20 であり、R：炭素数が12〜18のアルキル基であることを示す。）
【００３３】
アルキル基の位置は特に限定されず、以下のような構造でも好ましく用いることができる。
【００３４】
【化２】
【００３５】
このような界面活性剤として、物質名でポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル系の非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレート等が挙げられる。（商品名：Tween20、Tween40、Tween60、Tween80等）の界面活性剤が挙げられる。また、使用量も特に限定されないが、好ましくは０．０１％以上、より好ましくは０．０５％以上、より好ましくは０．１％以上である。
【００３６】
（５）オリゴヌクレオチドプライマー
本発明で使用するオリゴヌクレオチドプライマーは、鋳型ＤＮＡに実質的に相補的な塩基配列を有し、その３'末端よりＤＮＡ鎖の伸長が可能なものである。オリゴヌクレオチドプライマーは、鋳型ＤＮＡに実質的に相補的な塩基配列を有することにより、鋳型となるＤＮＡにアニーリングすることができる。本発明で使用されるオリゴヌクレオチドプライマーとしては、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドで構成されたものを使用することができ、さらに、修飾リボヌクレオチドあるいは修飾デオキシリボヌクレオチドを含有するものでもよい。
【００３７】
本発明では、第一のオリゴヌクレオチドプライマーの５’末端側に、タグ配列（即ち、鋳型となる核酸断片の塩基配列上において第一のオリゴヌクレオチドプライマーの３’末端側部分（第一のオリゴヌクレオチドが鋳型核酸とアニールする部分）と実質的に相同な塩基配列よりも３’末端側に存在する塩基配列）を付加する。
【００３８】
好ましくは、第一のオリゴヌクレオチドプライマーの５’末端側に付加するタグ配列は、２塩基以上２０塩基以下である。
好ましくは、第一のオリゴヌクレオチドプライマーの５’末端側に付加するタグ配列は、２塩基以上１６塩基以下である。
好ましくは、第一のオリゴヌクレオチドプライマーの５’末端側に付加するタグ配列は、４塩基以上１４塩基以下である。
【００３９】
好ましくは、第一のオリゴヌクレオチドプライマーの５’末端側に付加するタグ配列は、鋳型となる核酸断片の塩基配列上において、第一のオリゴヌクレオチドプライマーの３’末端側部分（第一のオリゴヌクレオチドが鋳型核酸とアニールする部分）と実質的に相同な塩基配列の３’末端側２００塩基以内の位置に存在する。
好ましくは、第一のオリゴヌクレオチドプライマーの５’末端側に付加するタグ配列は、鋳型となる核酸断片の塩基配列上において、第一のオリゴヌクレオチドプライマーの３’末端側部分（第一のオリゴヌクレオチドが鋳型核酸とアニールする部分）と実質的に相同な塩基配列の３’末端側１００塩基以内の位置に存在する。
好ましくは、第一のオリゴヌクレオチドプライマーの５’末端側に付加するタグ配列は、鋳型となる核酸断片の塩基配列上において、第一のオリゴヌクレオチドプライマーの３’末端側部分（第一のオリゴヌクレオチドが鋳型核酸とアニールする部分）と実質的に相同な塩基配列の３’末端側６０塩基以内の位置に存在する。
好ましくは、第一のオリゴヌクレオチドプライマーの５’末端側に付加するタグ配列は、鋳型となる核酸断片の塩基配列上において、第一のオリゴヌクレオチドプライマーの３’末端側部分（第一のオリゴヌクレオチドが鋳型核酸とアニールする部分）と実質的に相同な塩基配列の３’末端側５０塩基以内の位置に存在する。
【００４０】
オリゴヌクレオチドプライマーの長さは、特に限定されないが、一般的には、１０〜１００ヌクレオチド程度の長さであり、好ましくは１５〜５０ヌクレオチド程度の長さであり、さらに好ましくは１５〜４０ヌクレオチド程度の長さである。
【００４１】
オリゴヌクレオチドプライマーは、市販のＤＮＡ合成機（例えば、アプライド バイオシステムズ社（Applied Biosystem Inc.）のＤＮＡシンセサイザー３９４型など）を用いて、ホスホアミダイト法により合成できる。
【００４２】
オリゴヌクレオチドプライマーの使用量は、反応溶液中において０．１μＭ以上が好ましく、１μＭ以上がさらに好ましく、１．５μＭ以上が特に好ましい。
【００４３】
（６）鋳型となる核酸断片
本発明において鋳型となる核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、全ＲＮＡのいずれでもよい。鋳型となる核酸を含む可能性のある試料から調製した核酸を使用してもよいし、鋳型となる核酸を含む可能性のある試料をそのまま直接使用してもよい。鋳型となる核酸を含む試料の種類は特に限定されず、例えば、体液（例えば、全血、血清、尿、脳脊髄液、精液、唾液など）、組織（例えば、癌組織など）、スワブ、細胞培養物のような生体由来試料、ウイルス、細菌、カビ、酵母、植物及び動物のような核酸含有試料、微生物が混入している可能性のある試料（例えば、食品など）、あるいは土壌、排水のような環境中の試料が挙げられる。上記したような試料から核酸を調製する場合、その調製方法は特に限定されず、例えば、界面活性剤による処理、超音波処理、ガラスビーズを用いた精製など当業者に公知の方法を用いることができる。核酸の試料からの精製は、フェノール抽出、クロマトグラフィー、ゲル電気泳動または密度勾配遠心分離などにより行うことができる。
【００４４】
ＲＮＡ由来の配列を有する核酸を増幅したい場合には、当該ＲＮＡを鋳型とした逆転写反応によって合成されたｃＤＮＡを鋳型として本発明の方法を実施することができる。逆転写反応に使用されるプライマーは、特定の鋳型ＲＮＡに相補的な塩基配列を有するプライマーでもよいし、オリゴｄＴプライマーやランダムな配列を有するプライマーでもよい。逆転写用プライマーの長さは好ましくは６から１００ヌクレオチド程度であり、更に好ましくは９から５０ヌクレオチド程度である。逆転写反応に使用される酵素としては、ＲＮＡを鋳型としたｃＤＮＡ合成活性を有するものであれば特に限定はなく、例えばトリ骨髄芽球症ウイルス由来逆転写酵素（ＡＭＶ ＲＴａｓｅ）、モロニーネズミ白血病ウイルス由来逆転写酵素（ＭＭＬＶ ＲＴａｓｅ）、ラウス関連ウイルス２逆転写酵素（ＲＡＶ−２ ＲＴａｓｅ）などを使用することができる。また、逆転写活性を併せ持つ鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼを使用することもできる。
【００４５】
本発明においては、ゲノムＤＮＡや核酸増幅断片のような二本鎖ＤＮＡ、およびＲＮＡから逆転写反応で調製されたｃＤＮＡのような一本鎖ＤＮＡを、鋳型ＤＮＡとして使用できる。上記二本鎖ＤＮＡは、一本鎖ＤＮＡに変性してから本発明の方法に使用してもよいし、このような変性を行うことなく本発明の方法に使用することもできる。
【００４６】
（７）鋳型となる核酸断片の前処理
本発明において鋳型となる核酸は、前処理工程を経た後に増幅鋳型として用いても良い。
前処理用の試薬は、例えば、界面活性剤、血液凝固防止剤、タンパク分解酵素、脂質分解酵素を含んでいてもよい。液性としては、酸性あるいはアルカリ性であってもよい。
前処理工程としては、高温（例えば９８℃）に加熱することや変性処理剤で処理する工程を含んでよい。また、高温に加熱後、４℃以下に急冷する工程を含んでもよい。
【００４７】
（８）融解温度調整剤
本発明における反応溶液には、融解温度調整剤を添加することができる。融解温度調整剤の具体例としては、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ベタイン、ホルムアミドもしくはグリセロール、テトラアルキルアンモニウム塩、またはこれらの２種以上の混合物を挙げることができる。融解温度調整の使用量は特に限定されないが、ＤＭＳＯやホルムアミド、グリセロールの場合、通常は反応溶液中に１０％以下の量で含めることができる。
ベタインやテトラアルキルアンモニウム塩は、０．２〜３．０Ｍ、好ましくは０．５〜１．５Ｍ程度添加することができる。
【００４８】
（９）緩衝成分
本発明における反応溶液には、緩衝成分を含めることができる。緩衝成分としては、特に限定はないが、例えば、ビシン、トリシン、ヘペス、トリス、リン酸塩（リン酸ナトリウム、リン酸カリウム等）などを使用することができる。緩衝成分の最終濃度は５ｍＭ〜１００ｍＭの範囲、特に好ましくは１０ｍＭ〜５０ｍＭの範囲であり、またｐＨは、増幅反応に用いられる酵素の至適ｐＨにもよるが、一般的には６．０〜９．０、特に好ましくはｐＨ７．０〜９．０のものを使用できる。
【００４９】
（１０）蛍光色素
本発明における反応溶液には、蛍光色素を含めることができる。蛍光色素としては、特に限定はないが、例えばSYBR GreenIなどを使用することができる。
【００５０】
（１１）本発明による核酸の増幅方法
次に、本発明による核酸の増幅方法について説明する。本発明では、少なくとも１種のデオキシヌクレオチド３リン酸、少なくとも１種のＤＮＡポリメラーゼ、２価の陽イオン、少なくとも２種類のオリゴヌクレオチドプライマー、及び鋳型となる核酸断片を含む反応溶液をインキュベートする。これにより、前記プライマーの３’末端を起点とするポリメラーゼ反応を行い、該核酸断片を増幅することができる。本発明では、好ましくは、核酸を増幅する工程を実質的に等温で行うことができる。反応溶液をインキュベートする際の温度は好ましくは５０℃以上であり、より好ましくは５５℃以上であり、例えば、６０℃程度でインキュベートすることができる。好ましい温度範囲は、例えば、約５０℃から約７０℃であり、さらに好ましくは約５５℃から約６５℃である。この場合、プライマーの非特異的なアニーリングが抑制され、ＤＮＡ増幅の特異性が向上し、また鋳型ＤＮＡの二次構造が解消されることによりＤＮＡポリメラーゼの伸長性も向上する。本発明による核酸の増幅方法は、実質的に等温において実施すことができる。本発明において等温とは、各工程の反応温度を大きく変化することなく、各工程が実質的に一定の温度で行われることを意味する。
【００５１】
本発明において、反応溶液を実質的に等温でインキュベートする時間は、標的核酸断片が増幅できる限り特に限定されない。インキュベートする時間は、例えば、５分以上１２時間以内とすることができる。インキュベートする時間は、好ましくは、５分以上２時間以内であり、より好ましくは５分以上６０分以内であり、さらに好ましくは５分以上３０分以内であり、５分以上１５分以内とすることもできる。
【００５２】
核酸を増幅する工程を実質的に等温で行う場合は、温度を上昇させたり低下させる必要がないことが利点の一つになる。従来のＰＣＲ法では温度を上下させる必要があり、例えばサーマルサイクラーのような反応装置が必要であったが、核酸を増幅する工程を実質的に等温で行う場合は、一定温度を保持できる装置のみで実施が可能である。
【００５３】
（１２）本発明による核酸の増幅方法の利用
本発明による核酸の増幅方法は、核酸の検出、標識、塩基配列の決定、塩基の変異の検出（一塩基多型の検出などを含む）などに使用することができる。本発明の核酸の増幅方法には温度調節が可能な反応装置を使用する必要がないため、多量の反応液を使用して増幅反応を実施することができる。
【００５４】
本発明の核酸の増幅方法により得られる増幅物は、当業者に公知の方法により検出できる。例えば、ゲル電気泳動によれば、エチジウムブロマイドでゲルを染色することによって特定サイズの反応産物を検出することができる。増幅産物を検出するための検出系は、蛍光偏光、イムノアッセイ、蛍光エネルギー転移、酵素標識（例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなど）、蛍光標識（例えば、フルオレセイン、ローダミンなど）、ケミルミネッセンス、又はバイオルミネッセンスなどを用いることができる。TaqmanプローブやMolecular Beaconを利用して検出することもできる。ビオチンなどで標識した標識ヌクレオチドを使用することによって増幅物を検出することもできる。この場合、増幅産物中のビオチンは、蛍光標識アビジン又は酵素標識アビジンなどを用いて検出することができる。また、当業者に公知の酸化還元型インターカレーターを使用することで、電極により増幅産物を検出することもできる。また、SPRを用いて増幅産物を検出してもよい。
【００５５】
ピロリン酸マグネシウムを検出することによっても核酸増幅の検出を行うことができる。この場合、濁度による検出など、その他の当業者に公知の方法により検出できる。
【００５６】
本発明を実施例により更に具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００５７】
＜実施例１＞Ｔａｇつきプライマーによる核酸増幅（Ｔａｇ設計位置の影響）
（１）ターゲット核酸断片を含む核酸試料液の調整
ＨｕｍａｎＧｅｎｏｍｉｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）３．０ｎｇを９８℃で３ｍｉｎ．加熱を行い、１本鎖にしたのち、β２AR遺伝子中の配列の増幅を以下の条件で行った。
【００５８】
＜プライマー＞
プライマーは、β２AR遺伝子を標的に設計を行った。各プライマーの配列を以下に示す。
プライマー(1)(Ｆｏｒｗａｒｄ１)：
５'−CCACGACGCTTGCTGGCACCCAATA−３'（配列番号１）
プライマー(2)(Ｆｏｒｗａｒｄ２)：
５'−GGCAGGAACTTGCTGGCACCCAATA−３'（配列番号２）
プライマー(3)(Ｆｏｒｗａｒｄ３)：
５'−TGGGTGGTCTTGCTGGCACCCAATA−３'（配列番号３）
プライマー(4)(Ｒｅｖｅｒｓｅ):
５'−CCGGCGCATGGCTT−３' （配列番号４）
【００５９】
上記プライマーのβ２AR遺伝子に対する位置関係の詳細を図４に示した。
ここで、プライマー(1)、(2)、(3)の５'末端8塩基（Ｔａｇ）は、鋳型となる核酸断片の塩基配列上においてプライマー(1)、(2)、(3)の３’末端側部分（プライマーが鋳型核酸とアニールする部分）と実質的に相同な塩基配列よりも３’末端側に存在するそれぞれの配列と実質的に相同である。
【００６０】
（２）核酸増幅反応
以下に示す反応液の組成で、６０℃、６０分反応させることで増幅反応を実施した。酵素は、ＮＥＢ社のBst.DNA polymeraseを使用した。
＜反応液の組成＞
10×Bst Buffer(DF) １．０μＬ
100mM MgSO4 ０．６μＬ
10%(v/v) Tween20 ０．１μＬ
100% DMSO ０．５μＬ
25mM dNTP each ０．５６μＬ
SYBR GreenI（2000倍希釈） ０．２μＬ
50μM primer(1)又は(2)又は(3) ０．６４μＬ
50μM primer(4) ０．６４μＬ
Bst. Polymerase ０．４μＬ
１）で得た核酸断片試料 ３．０ｎｇ
精製水 ４．９６μＬ
１０．０μＬ
【００６１】
（３）増幅産物の検出
前記（２）における増幅反応を、リアルタイム蛍光検出装置（Ｍｘ３０００ｐ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いて蛍光検出を行った。結果を図５から７に示す。
【００６２】
核酸試料由来のサンプルからの核酸増幅反応をリアルタイムに検出できることがわかる。ここで、Ｍｘ３０００ｐの解析ソフトを用いて、上記のグラフにおいて蛍光量が２５０に到達したときの時間（Ct値）を算出したところ、表１のような結果になった。
【００６３】
【表１】
【００６４】
（４）増幅産物の電気泳動
３ｗｔ％のアガロースゲル、０．５ｘTBEバッファー（50mM Tris, 45mM Boric acid、0.5mM EDTA, pH8.4）を用い、100Vで60分の電気泳動を行った。結果を図８から１０に示す。
【００６５】
どのプライマーの組み合わせにおいても、ラダー状の規則的な電気泳動パターンが得られた。この結果より、ある規則性を有した増幅産物が得られることがわかり、即ち、増幅反応の制御ができていることがわかった。
【００６６】
（５）増幅産物の配列解析
増幅産物をNucleoSpin（登録商標） Extract II（MACHEREY-NAGEL製）精製し、TOPO TA Cloning Kit（Invitrogen製）を用いてベクターに組み込み、該ベクターにより大腸菌を形質転換した。形質転換した大腸菌を、アンピシリンを加えたLB培地中で培養した。
QIAprep Miniprep（Qiagen製）を使用して培養した大腸菌からプラスミドDNAを回収した。
回収したプラスミドDNAに対してシークエンスを行い、塩基配列を調べた。なお、シークエンスはABI PRISM 310 Genetic Analyzer（ABI社製）により行なった。プライマーにはM13 Reverse Primerを使用した。
M13 Reverse Primer
５'−CAGGAAACAGCTATGAC−３'（配列番号５）
シークエンスの結果、プライマー(1)とプライマー(4)の組み合わせよる増幅産物中には、以下の配列を有する核酸が存在することがわかった。
【００６７】
（１）
5'- CCACGACGTT CTTGCTGGCA CCCAATAGAA GCCATGCGCC GG -3'
3'- GGTGCTGCAA GAACGACCGT GGGTTATCTT CGGTACGCGG CC -5'
（42塩基対）（配列番号６）
【００６８】
（２）
5'- CCACGACGTT CTTGCTGGCA CCCAATAGAA GCCATGCGCC GGACCACGAC -3'
3'- GGTGCTGCAA GAACGACCGT GGGTTATCTT CGGTACGCGG CCTGGTGCTG -5'
5'- GTTCTTGCTG GCACCCAATA GAAGCCATGC GCCGG -3'
3'- CAAGAACGAC CGTGGGTTAT CTTCGGTACG CGGCC -5'
（85塩基対）（配列番号7）
【００６９】
（３）
5'- CCACGACGTT CTTGCTGGCA CCCAATAGAA GCCATGCGCC GGACCACGAC -3'
3'- GGTGCTGCAA GAACGACCGT GGGTTATCTT CGGTACGCGG CCTGGTGCTG -5'
5'- GTTCTTGCTG GCACCCAATA GAAGCCATGC GCCGGACCAC GACGTTCTTG -3'
3'- CAAGAACGAC CGTGGGTTAT CTTCGGTACG CGGCCTGGTG CTGCAAGAAC -5'
5'- CTGGCACCCA ATAGAAGCCA TGCGCCGG -3'
3'- GACCGTGGGT TATCTTCGGT ACGCGGCC -5'
（128塩基対）（配列番号8）
【００７０】
シークエンスで得られた増幅産物の鎖長は、図８の電気泳動結果とも一致した。
（１）の増幅産物は、２つのプライマーに挟まれる領域である。
（２）の増幅産物は、増幅産物同士がForward Primerの５'末端配列（Tag）とReverse Primerの５'末端側に存在する配列とのハイブリッド形成を介して生成された産物であり、“プライマーに挟まれる領域”＋“Reverse PrimerとTag配列の間の配列”＋“プライマーに挟まれた領域”という構造になっている。（以下、２倍体と表現する。）
（３）の増幅産物は、（２）の増幅産物と同様に、増幅産物同士がForward Primerの５'末端配列とReverse Primerの５'末端側の配列とのハイブリッド形成を介して生成された産物であり、“プライマーに挟まれる領域”＋“Reverse PrimerとTag配列の間の配列”＋“プライマーに挟まれた領域” ＋“Reverse PrimerとTag配列の間の配列”＋“プライマーに挟まれた領域”という構造になっている。（以下、３倍体と表現する。）
【００７１】
シークエンスの結果、プライマー(2)とプライマー(4)の組み合わせよる増幅産物中には、以下の配列を有する核酸が存在することがわかった。
【００７２】
（１）
5'- GGGACGAGTT CTTGCTGGCA CCCAATAGAA GCCATGCGCC GG -3'
3'- GGGACGAGAA GAACGACCGT GGGTTATCTT CGGTACGCGG CC -5'
（42塩基対）（配列番号9）
【００７３】
（２）
5'- GGGACGAGTT CTTGCTGGCA CCCAATAGAA GCCATGCGCC GGACCACGAC -3'
3'- CCCTGCTCAA GAACGACCGT GGGTTATCTT CGGTACGCGG CCTGGTGCTG -5'
5'- GTCACGCAGG AAAGGGACGA GTTCTTGCTG GCACCCAATA GAAGCCATGC -3'
3'- CAGTGCGTCC TTTCCCTGCT CAAGAACGAC CGTGGGTTAT CTTCGGTACG -5'
5'- GCCGG -3'
3'- CGGCC -5'
（105塩基対）（配列番号10）
【００７４】
（３）
5'- GGGACGAGTT CTTGCTGGCA CCCAATAGAA GCCATGCGCC GGACCACGAC -3'
3'- CCCTGCTCAA GAACGACCGT GGGTTATCTT CGGTACGCGG CCTGGTGCTG -5'
5'- GTCACGCAGG AAAGGGACGA GTTCTTGCTG GCACCCAATA GAAGCCATGC -3'
3'- CAGTGCGTCC TTTCCCTGCT CAAGAACGAC CGTGGGTTAT CTTCGGTACG -5'
5'- GCCGGACCAC GACGTCACGC AGGAAAGGGA CGAGTTCTTG CTGGCACCCA -3'
3'- CGGCCTGGTG CTGCAGTGCG TCCTTTCCCT GCTCAAGAAC GACCGTGGGT -5'
5'- ATAGAAGCCA TGCGCCGG -3'
3'- TATCTTCGGT ACGCGGCC -5'
（168塩基対）（配列番号11）
【００７５】
シークエンスで得られた増幅産物の鎖長は、図９の電気泳動結果とも一致した。
（１）の増幅産物は、２つのプライマーに挟まれる領域である。
（２）の増幅産物は、増幅産物同士がForward Primerの５'末端配列（Ｔａｇ）とReverse Primerの５'末端側に存在する配列とのハイブリッド形成を介して生成された産物であり、２倍体である。
（３）の増幅産物は、（２）の増幅産物と同様に、増幅産物同士がForward Primerの５'末端配列とReverse Primerの５'末端側の配列とのハイブリッド形成を介して生成された産物であり、３倍体である。
【００７６】
シークエンスの結果、プライマー(3)とプライマー(4)の組み合わせよる増幅産物中には、以下の配列を有する核酸が存在することがわかった。
【００７７】
（１）
5'- TGGGTGGTTT CTTGCTGGCA CCCAATAGAA GCCATGCGCC GG -3'
3'- ACCCACCAAA GAACGACCGT GGGTTATCTT CGGTACGCGG CC -5'
（42塩基対）（配列番号12）
【００７８】
（２）
5'- TGGGTGGTTT CTTGCTGGCA CCCAATAGAA GCCATGCGCC GGACCACGAC -3'
3'- ACCCACCAAA GAACGACCGT GGGTTATCTT CGGTACGCGG CCTGGTGCTG -5'
5'- GTCACGCAGG AAAGGGACGA GGTGTGGGTG GTTTCTTGCT GGCACCCAAT
3'- CAGTGCGTCC TTTCCCTGCT CCACACCCACCAAAGAACGAC CGTGGGTTA
5'- AGAAGCCATG CGCCGG -3'
3'- TCTTCGGTAC GCGGCC -5'
（116塩基対）（配列番号13）
【００７９】
（３）
5'- TGGGTGGTTT CTTGCTGGCA CCCAATAGAA GCCATGCGCC GGACCACGAC -3'
3'- ACCCACCAAA GAACGACCGT GGGTTATCTT CGGTACGCGG CCTGGTGCTG -5'
5'- GTCACGCAGG AAAGGGACGA GGTGTGGGTG GTTTCTTGCT GGCACCCAAT -3'
3'- CAGTGCGTCC TTTCCCTGCT CCACACCCAC CAAAGAACGA CCGTGGGTTA -5'
5'- AGAAGCCATG CGCCGGACCA CGACGTCACG CAGGAAAGGG ACGAGGTGTG -3'
3'- TCTTCGGTAC GCGGCCTGGT GCTGCAGTGC GTCCTTTCCC TGCTCCACAC -5'
5'- GGTGGTTTCT TGCTGGCACC CAATAGAAGC CATGCGCCGG -3'
3'- CCACCAAAGA ACGACCGTGG GTTATCTTCG GTACGCGGCC -5'
（190塩基対）（配列番号14）
【００８０】
シークエンスで得られた増幅産物の鎖長は、図１０の電気泳動結果とも一致した。
（１）の増幅産物は、２つのプライマーに挟まれる領域である。
（２）の増幅産物は、増幅産物同士がForward Primerの５'末端配列（Ｔａｇ）とReverse Primerの５'末端側に存在する配列とのハイブリッド形成を介して生成された産物であり、２倍体である。
（３）の増幅産物は、（２）の増幅産物と同様に、増幅産物同士がForward Primerの５'末端配列とReverse Primerの５'末端側の配列とのハイブリッド形成を介して生成された産物であり、３倍体である。
【００８１】
どの増幅産物においても、Ｔａｇを介した高分子量産物形成が起こっていることがわかった。つまり、第一のオリゴヌクレオチドプライマーの５’末端側に、鋳型となる核酸断片の塩基配列上において第一のオリゴヌクレオチドプライマーの３’末端側部分（第一のオリゴヌクレオチドが鋳型核酸とアニールする部分）と実質的に相同な配列の３’末端側に存在する塩基配列を付加することで、積極的に高分子量産物を形成させ、増幅反応を制御することが可能となった。
【００８２】
＜実施例２＞Ｔａｇつきプライマーによる核酸増幅（Ｔａｇの長さの影響）
（１）ターゲット核酸断片を含む核酸試料液の調整
ＨｕｍａｎＧｅｎｏｍｉｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）３．０ｎｇを９８℃で３ｍｉｎ．加熱を行い、１本鎖にしたのち、β２AR遺伝子中の配列の増幅を以下の条件で行った。
【００８３】
＜プライマー＞
プライマーは、β２AR遺伝子を標的に設計を行った。各プライマーの配列を以下に示す。
プライマー(5)(Ｆｏｒｗａｒｄ５)：
５'−TGGTCTTGCTGGCACCCAATA−３'（配列番号15）
プライマー(6)(Ｆｏｒｗａｒｄ６)：
５'−TGGGTGGTCTTGCTGGCACCCAATA−３'（配列番号16）
プライマー(7)(Ｆｏｒｗａｒｄ７)：
５'−TGGGTGGTGGGCCTTGCTGGCACCCAATA−３'（配列番号17）
プライマー(8)(Ｆｏｒｗａｒｄ８)：
５'−TGGGTGGTGGGCATCTTGCTGGCACCCAATA−３'（配列番号18）
プライマー(9)(Ｒｅｖｅｓｒｅ2)：
５'−TCCCTTTCCTGCGTGAC−３'（配列番号１９）
【００８４】
上記プライマーのβ２AR遺伝子に対する位置関係の詳細を図１１に示した。
ここで、プライマー(5)、(6)、(7)、(8)の５'末端には、鋳型となる核酸断片の塩基配列上においてプライマー(5)、(6)、(7)、(8)の３’末端側部分（プライマーが鋳型核酸とアニールする部分）と実質的に相同な塩基配列よりも３’末端側に存在する、それぞれ4塩基、8塩基、12塩基、14塩基の配列と実質的に相同な配列（Tag）が付加されている。
【００８５】
（２）核酸増幅反応
以下に示す反応液の組成で、６０℃、６０分反応させることで増幅反応を実施した。酵素は、ＮＥＢ社のBst.DNA polymeraseを使用した。
＜反応液の組成＞
10×Bst Buffer(DF) １．０μＬ
100mM MgSO4 ０．６μＬ
10%(v/v) Tween20 ０．１μＬ
100% DMSO ０．５μＬ
25mM dNTP each ０．５６μＬ
SYBR GreenI（2000倍希釈） ０．２μＬ
50μM primer(1)又は(2)又は(3) ０．６４μＬ
50μM primer(4) ０．６４μＬ
Bst. Polymerase ０．４μＬ
１）で得た核酸断片試料 ３．０ｎｇ
精製水 ４．９６μＬ
１０．０μＬ
【００８６】
（３）増幅産物の電気泳動
上記で得られた増幅産物について、３ｗｔ％のアガロースゲル、０．５ｘTBEバッファー（50mM Tris, 45mM Boric acid、0.5mM EDTA, pH8.4）を用い、100Vで60分の電気泳動を行った。結果を図１２に示す。
【００８７】
どのプライマーの組み合わせにおいても、ラダー状の規則的な電気泳動パターンが得られた。この結果より、ある規則性を有した増幅産物が得られることがわかり、実施例１と同様に、Tagを介した高分子量産物が形成していると考えられる。即ち、増幅反応の制御ができていることがわかった。
【００８８】
＜比較例１＞
第一のオリゴヌクレオチドプライマーの５’末端側に、鋳型となる核酸断片の塩基配列上において第二のオリゴヌクレオチドプライマーの塩基配列に対して実質的に相補的な塩基配列よりも３’末端側に存在する塩基配列を付加しない系での核酸の増幅反応を比較例として記述する。
【００８９】
（１）ターゲット核酸断片を含む核酸試料液の調整
ＨｕｍａｎＧｅｎｏｍｉｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）３．０ｎｇを前処理液（３０ｍＭ ＮａＯＨ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０）とともに９８℃で３ｍｉｎ．加熱を行い、１本鎖にしたのち、β２AR遺伝子中の配列の増幅を以下の条件で行った。
【００９０】
＜プライマー＞
プライマーは、β２AR遺伝子を標的に設計を行った。各プライマーの配列を以下に示す。
【００９１】
プライマー(1)(Ｆｏｒｗａｒｄ)：
５'−CTTGCTGGCACCCAATA−３'（配列番号２０）
プライマー(2)(Ｒｅｖｅｒｓｅ):
５'− CCGGCGCATGGCTT−３'（配列番号４）
【００９２】
上記プライマーのβ２AR遺伝子に対する位置関係の詳細を図１３に示した。
【００９３】
（２）核酸増幅反応
以下に示す反応液の組成で、６０℃、６０分反応させることで増幅反応を実施した。酵素は、ＮＥＢ社のBst.DNA polymeraseを使用した。
＜反応液の組成＞
10×Bst Buffer(DF) １．０μＬ
100mM MgSO4 ０．６μＬ
10%(v/v) Tween20 ０．１μＬ
100% DMSO ０．５μＬ
25mM dNTP each ０．５６μＬ
SYBR GreenI（2000倍希釈） ０．２μＬ
50μM primer(1) ０．６４μＬ
50μM primer(2) ０．６４μＬ
Bst. Polymerase ０．４μＬ
１）で得た核酸断片試料液(３．０ｎｇ) ０．４μＬ
精製水 ４．９６μＬ
１０．０μＬ
【００９４】
（３）増幅産物の電気泳動
上記で得られた増幅産物について、３ｗｔ％のアガロースゲル、０．５ｘTBEバッファー（50mM Tris, 45mM Boric acid、0.5mM EDTA, pH8.4）を用い、100Vで60分の電気泳動を行った。結果を図１４に示す。
若干の規則性はあるものの、基本的にスメア状の泳動パターンが得られた。即ち、高分子量形成反応の規則性が低いことがわかった。
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１】図１は、本発明におけるプライマーとタグ配列の位置関係の模式図を示す。
【図２】図２は、本発明におけるプライマーとタグ配列の位置関係の模式図を示す。
【図３】図３は、本発明におけるプライマーとタグ配列の位置関係の模式図を示す。
【図４】図４は、実施例で用いたプライマーのβ２AR遺伝子に対する位置関係の詳細を示す。
【図５】図５は、本発明による増幅反応で得られた増幅産物についての蛍光検出の結果を示す。
【図６】図６は、本発明による増幅反応で得られた増幅産物についての蛍光検出の結果を示す。
【図７】図７は、本発明による増幅反応で得られた増幅産物についての蛍光検出の結果を示す。
【図８】図８は、本発明による増幅反応で得られた増幅産物の電気泳動の結果を示す。
【図９】図９は、本発明による増幅反応で得られた増幅産物の電気泳動の結果を示す。
【図１０】図１０は、本発明による増幅反応で得られた増幅産物の電気泳動の結果を示す。
【図１１】図１１は、実施例で用いたプライマーのβ２AR遺伝子に対する位置関係の詳細を示す。
【図１２】図１２は、本発明による増幅反応で得られた増幅産物の電気泳動の結果を示す。
【図１３】図１３は、実施例で用いたプライマーのβ２AR遺伝子に対する位置関係の詳細を示す。
【図１４】図１４は、本発明による増幅反応で得られた増幅産物の電気泳動の結果を示す。
【図１５】図１５は、本発明における増幅産物の形成機構の詳細について示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸の増幅方法に関する。より詳細には、本発明は、ＤＮＡポリメラーゼを用いて反応溶液をインキュベートすることによってポリメラーゼ反応を行うことを特徴とする核酸の増幅方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
分子生物学の研究においては、核酸の増幅は、一般的には、ＤＮＡポリメラーゼを利用した酵素的方法で行われている。核酸の増幅方法としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が広く知られている。ＰＣＲ法では、目的とする標的核酸配列を増幅させるために、鋳型である二本鎖ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに変性する工程（変性工程）、一本鎖ＤＮＡにプライマーをアニーリングさせる工程（アニーリング工程）、及びプライマーを起点として相補鎖を伸長する工程（伸長工程）の３つの工程から構成される。通常のＰＣＲ法においては、サーマルサイクラーを使用して、変性工程、アニーリング工程、伸長工程はそれぞれ異なる温度で行われている。しかし、３種類の異なる温度で核酸増幅反応を行うことは、温度制御が煩雑であり、またサイクル数に比例して時間のロスも増大していくという問題があった。
【０００３】
そこで、等温状態で実施することが可能な核酸増幅方法が開発されている。例えば、RCA（Rolling Circle Amplification:Proc.Natl.Acad.Sci,vol.92,4641-4645(1995)）、 ICAN(Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids)、LAMP(Loop-Mediated Isothermal Amplification of DNA；Bio Industry,第18巻、2号（2001）)、NASBA(Nucleic acid Sequence-based Amplification method;Nature,350,91〜(1991))、TMA(Transcription mediated amplification method;J.Clin Microbiol.第31巻、3270〜（1993）)等が挙げられる。
【０００４】
SDA法（特開平５−１３０８７０号）は、エクソヌクレアーゼを用いたサイクリングアッセイ法であり、ポリメラーゼ伸長反応を利用したターゲット核酸断片の目的部位の増幅法の一つである。この方法はターゲット核酸断片の目的部位に特異的にハイブリダイゼーションしたプライマーを起点とした、ポリメラーゼ伸長反応とともに、５’→３’エクソヌクレアーゼを作用させて、プライマーを逆方向から分解する方法である。分解したプライマーの代わりに新たなプライマーがハイブリダイゼーションし、再度ＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応が進行する。このポリメラーゼによる伸長反応と、この先に伸長した鎖を外すエクソヌクレア−ゼによる分解反応が順次、周期的に繰り返される。ここで、ポリメラーゼによる伸長反応とエクソヌクレア−ゼによる分解反応は等温条件で実施することが可能である。しかしながら、ポリメラーゼと共にエクソヌクレアーゼを用いる必要があり、コストがかかると共に、プライマーの設計を工夫する必要があった。
【０００５】
LAMP法は、近年開発されたターゲット核酸断片の目的部位の増幅法である。この方法は、ターゲット核酸断片の少なくとも6箇所の特定部位を相補的に認識する少なくとも4種のプライマーと、5’→3’方向へのヌクレアーゼ活性がなく、かつ鋳型上の２本鎖DNAを１本鎖DNAとして遊離させながら伸長反応を触媒する鎖置換型のBst DNAポリメラーゼを使用することで、等温条件でターゲット核酸断片の目的部位を、特別な構造として増幅する方法である。しかしながら、6箇所の特定部位を認識する少なくとも4種のプライマーを用いる必要があり、プライマー設計が非常に困難であった。
【０００６】
ICAN法も、近年開発されたターゲット核酸断片の目的部位の増幅法である。RNA-DNAキメラプライマー、鎖置換活性と鋳型交換活性を有するDNAポリメラーゼ、RNaseHを用いる等温の遺伝子増幅方法である。キメラプライマーが鋳型と結合した後、DNAポリメラーゼにより相補鎖が合成される。その後、RNaseHがキメラプライマー由来のRNA部分を切断し、切断部分から鎖置換反応と鋳型交換反応を伴った伸長反応が起きるこの反応が繰り返し起こることにより遺伝子が増幅される。しかしながら、この方法もキメラプライマーという特殊なプライマーを用いる必要がありプライマー設計が非常に困難である。
【０００７】
特表平１１−５０９４０６号公報には、鎖置換能を有するＤＮＡポリメラーゼ存在下、少なくとも１組のオリゴヌクレオチドプライマーにより目的とする領域のＤＮＡを等温における反応によって増幅する方法が記載されている。しかしながら、特表平１１−５０９４０６公報に記載の方法では比較的長い反応時間が必要であるなどの問題がある。
【０００８】
特開２００２−２３３３７９号公報には、鎖置換能を有するＤＮＡポリメラーゼ存在下、少なくとも１組のオリゴヌクレオチドプライマーにより目的とする領域のＤＮＡを等温における反応によって増幅する方法が記載されている。しかしながら、特開２００２−２３３３７９号公報に記載の方法では、非特異的な増幅産物の生成が顕著であるという問題があった。
【０００９】
【非特許文献１】Proc.Natl.Acad.Sci,vol.92,4641-4645(1995)
【非特許文献２】Bio Industry,第18巻、2号（2001）
【非特許文献３】Nature,350,91〜(1991)
【非特許文献４】J.Clin Microbiol.第31巻、3270〜（1993）
【特許文献１】特開平５−１３０８７０号公報
【特許文献２】特表平１１−５０９４０６号号公報
【特許文献３】特開２００２−２３３３７９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、オリゴヌクレオチドプライマーとＤＮＡポリメラーゼとを用いて実施可能な核酸の増幅方法を提供することを解決すべき課題とした。本発明はさらに、標的核酸配列を短時間で特異的に、高効率で増幅することができる、簡便かつ迅速な核酸の増幅方法を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、少なくとも１種のデオキシヌクレオチド３リン酸、少なくとも１種のＤＮＡポリメラーゼ、少なくとも２種のオリゴヌクレオチドプライマー、及び鋳型となる核酸断片を含む反応溶液をインキュベートすることによって前記プライマーの３’末端を起点とするポリメラーゼ反応を行い該核酸断片を増幅することを含む核酸の増幅方法において、第一のオリゴヌクレオチドプライマーの５’末端側に、鋳型となる核酸断片の塩基配列上において第一のオリゴヌクレオチドと実質的に相同な塩基配列よりも３’末端側に存在する塩基配列を付加することで、標的核酸配列のみを特異的に増幅することに成功した。
【００１２】
即ち、本発明によれば、少なくとも１種のデオキシヌクレオチド３リン酸、少なくとも１種のＤＮＡポリメラーゼ、少なくとも２種のオリゴヌクレオチドプライマー、及び鋳型となる核酸断片を含む反応溶液をインキュベートすることによって前記プライマーの３’末端を起点とするポリメラーゼ反応を行い、該核酸断片を増幅することを含む核酸の増幅方法であって、第一のオリゴヌクレオチドプライマーの５’末端側にタグ配列が付加されており、該タグ配列が、鋳型となる核酸断片の塩基配列上において、第一のオリゴヌクレオチドプライマーの３’末端側部分（第一のオリゴヌクレオチドが鋳型核酸とアニールする部分）と実質的に相同な配列の３’末端側に存在する塩基配列であることを特徴とする、核酸の増幅方法が提供される。図１に、第一のオリゴヌクレオチドプライマー、第二のオリゴヌクレオチドプライマー、タグ配列の位置関係の模式図を示す。
【００１３】
好ましくは、該タグ配列の３’末端の塩基は、鋳型となる核酸断片の塩基配列上において、第二のオリゴヌクレオチドプライマーの塩基配列に対して実質的に相補的な塩基配列よりも３’末端側に存在する塩基である。図２に、第一のオリゴヌクレオチドプライマー、第二のオリゴヌクレオチドプライマー、タグ配列の位置関係の模式図を示す。
好ましくは、該タグ配列は、鋳型となる核酸断片の塩基配列上において、第二のオリゴヌクレオチドプライマーの塩基配列に対して実質的に相補的な塩基配列よりも３’末端側に存在する塩基配列である。図３に、第一のオリゴヌクレオチドプライマー、第二のオリゴヌクレオチドプライマー、タグ配列の位置関係の模式図を示す。
【００１４】
好ましくは、第一のオリゴヌクレオチドプライマーの５’末端側に付加するタグ配列は、２塩基以上２０塩基以下である。
好ましくは、第一のオリゴヌクレオチドプライマーの５’末端側に付加するタグ配列は、鋳型となる核酸断片の塩基配列上において、第一のオリゴヌクレオチドプライマーの３’末端側部分（第一のオリゴヌクレオチドが鋳型核酸とアニールする部分）と実質的に相同な配列の３’末端側２００塩基以内に存在する塩基配列である。
【００１５】
好ましくは、反応溶液は、少なくとも０．０１％以上の界面活性剤をさらに含む。
好ましくは、界面活性剤は非イオン性界面活性剤である。
好ましくは、非イオン性界面活性剤は、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル系、ポリオキシエチレンアルキルフェノールエーテル系、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系から選ばれる。
好ましくは、反応溶液は、２価の陽イオンをさらに含む。
好ましくは、反応溶液は、融解温度調整剤をさらに含む。
好ましくは、融解温度調整剤は、ジメチルスルホキシド、ベタイン、ホルムアミドもしくはグリセロール、またはこれらの２種以上の混合物である。
【００１６】
好ましくは、少なくとも１種のＤＮＡポリメラーゼは、鎖置換機能を有するＤＮＡポリメラーゼである。
好ましくは、少なくとも１種の鎖置換能を有するＤＮＡポリメラーゼは、バチルス ステアロサーモフィラス由来の５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損Ｂｓｔ．ＤＮＡポリメラーゼ、及びバチルスカルドテナックス由来の５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損Ｂｃａ ＤＮＡポリメラーゼ 、サーモコッカス リトラリス由来の５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損Ｖｅｎｔ．ＤＮＡポリメラーゼ、アリサイクロバチルス アシドカルダリウス由来のＤＮＡポリメラーゼからなる群より選択されるポリメラーゼである。
【００１７】
好ましくは、核酸を増幅する工程は実質的に等温で行われる。
好ましくは、核酸を増幅する工程は５０℃以上１００℃以下で行われる。
好ましくは、核酸を増幅する工程は実質的に６０分以内で行われる。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、第一のオリゴヌクレオチドプライマーの５’末端側に付加するタグ配列（即ち、鋳型となる核酸断片の塩基配列上において第一のオリゴヌクレオチドプライマーの３’末端側部分（第一のオリゴヌクレオチドが鋳型核酸とアニールする部分）と実質的に相同な配列の３’末端側に存在する塩基配列）を介した高分子量産物の形成反応が非常に効率的に進むため、標的核酸配列のみを特異的に増幅することが可能である。しかも、本発明によれば、複雑な温度制御、特殊な酵素の使用、複雑なプライマー設計も必要とせずに標的核酸配列を増幅することが可能であるため、簡便、迅速、高感度な核酸の増幅方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下、本発明についてさらに詳細に説明する。
本発明による核酸の増幅方法は、少なくとも１種のデオキシヌクレオチド３リン酸、少なくとも１種のＤＮＡポリメラーゼ、２価の陽イオン、少なくとも２種のオリゴヌクレオチドプライマー、及び鋳型となる核酸断片を含む反応溶液をインキュベートすることによって前記プライマーの３’末端を起点とするポリメラーゼ反応を行い該核酸断片を増幅することを含む核酸の増幅方法であって、第一のオリゴヌクレオチドプライマーの５’末端側にタグ配列が付加されており、該タグ配列が、鋳型となる核酸断片の塩基配列上において第一のオリゴヌクレオチドプライマーの３’末端側部分（第一のオリゴヌクレオチドが鋳型核酸とアニールする部分）と実質的に相同な塩基配列よりも３’末端側に存在する塩基配列であることを特徴とする方法である。
【００２０】
本発明の一例である実施例１で用いたプライマーのβ２AR遺伝子に対する位置関係の詳細を図４に示す。この実施例１において、第一のオリゴヌクレオチドプライマー（配列番号１）の５’末端側に付加されているタグ配列は、５'−CCACGACG−３'である（配列番号１及び図４を参照）。鋳型となる核酸断片の塩基配列上において第一のオリゴヌクレオチドプライマーの３’末端側部分（第一のオリゴヌクレオチドが鋳型核酸とアニールする部分）と実質的に相同な塩基配列は、５’−CTTGCTGGCACCCAATA−３’に相当する。そして、鋳型となる核酸断片の塩基配列上において第一のオリゴヌクレオチドプライマーの３’末端側部分（第一のオリゴヌクレオチドが鋳型核酸とアニールする部分）と実質的に相同な塩基配列よりも３’末端側に存在する塩基配列は、５’−CCACGACG−３’（図４を参照）に相当し、当該塩基配列は、第一のオリゴヌクレオチドプライマー（配列番号１）の５’末端側に付加されているタグ配列に相当する。
【００２１】
本発明による核酸の増幅方法の概要を図１５に示す。鋳型となる核酸断片に対して第一のオリゴヌクレオチドプライマーがアニーリングして、当該オリゴヌクレオチドプライマーの３’末端を起点とするポリメラーゼ反応が進行する。その際、第一のオリゴヌクレオチドプライマーの５’末端側には、鋳型となる核酸断片の塩基配列上において第一のオリゴヌクレオチドプライマーの３’末端側部分（第一のオリゴヌクレオチドが鋳型核酸とアニールする部分）と実質的に相同な塩基配列よりも３’末端側に存在する塩基配列（タグ配列）が付加されていることから、第一のオリゴヌクレオチドプライマーを起点とするポリメラーゼ反応の増幅産物として、５’末端に、鋳型となる核酸断片の塩基配列上において第一のオリゴヌクレオチドプライマーの３’末端側部分（第一のオリゴヌクレオチドが鋳型核酸とアニールする部分）と実質的に相同な塩基配列よりも３’末端側に存在する塩基配列を含む増幅核酸断片（これを核酸断片Ａとする）が得られる。
【００２２】
次に、上記で得られた増幅核酸断片Ａに対して第二のオリゴヌクレオチドプライマーがアニーリングして、当該オリゴヌクレオチドプライマーの３’末端を起点とするポリメラーゼ反応が進行する。その際、鋳型となる増幅核酸断片Ａの５’末端に、タグ配列（鋳型となる核酸断片の塩基配列上において第一のオリゴヌクレオチドプライマーの３’末端側部分（第一のオリゴヌクレオチドが鋳型核酸とアニールする部分）と実質的に相同な塩基配列よりも３’末端側に存在する塩基配列）が存在するため、得られる増幅核酸断片（これを核酸断片Bとする）の３’末端には、タグ配列と実質的に相補的な配列（鋳型となる核酸断片の塩基配列上において第一のオリゴヌクレオチドプライマーの３’末端側部分（第一のオリゴヌクレオチドが鋳型核酸とアニールする部分）と実質的に相同な塩基配列よりも３’末端側に存在する塩基配列と実質的に相補的な配列）が含まれる。
【００２３】
核酸断片Bの３’末端の配列は、核酸断片Aに含まれる配列と2箇所で相補的である。核酸断片Bの３’末端が、核酸断片Aの３’末端側に存在する相補的な配列と二本鎖を形成し、それを起点としてポリメラーゼ反応が進行することで、高分子の増幅核酸断片が合成されることになる。
【００２４】
同様に、得られた高分子の増幅核酸断片が、核酸断片Aの３’末端側に存在する相補的な配列と二本鎖を形成し、それを起点としてポリメラーゼ反応が進行することで、さらなる高分子の増幅核酸断片が合成されうる。
【００２５】
以下、本発明で用いる成分について説明する。
（１）デオキシヌクレオチド３リン酸
伸長反応の基質として、デオキシヌクレオチド３リン酸を用いる。具体的には、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰの混合物を使用することが好ましい。デオキシヌクレオチド３リン酸としては、ｄＮＴＰのアナログ（例えば、７−デアザ−ｄＧＴＰ等）が含まれていてもよい。
【００２６】
また、デオキシヌクレオチド３リン酸（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ混合物）は、最終濃度で、それぞれ０．１ｍＭ〜３．０ｍＭ、好ましくは０．７５ｍＭ〜３．０ｍＭ、さらに好ましくは１．０ｍＭから２．０ｍＭ、特に好ましくは１．０ｍＭから１．５ｍＭの範囲である。
【００２７】
（２）ＤＮＡポリメラーゼ
本発明においては、鎖置換能を有するポリメラーゼを用いる。本明細書において「鎖置換能」とは、鋳型となる核酸配列に従ってＤＮＡ複製を行う際、ＤＮＡ鎖を置き換えながら進行し、鋳型鎖にアニーリングしている相補鎖を遊離させる、即ち鎖置換（strand displacement）することができる活性のことをいう。鎖置換能を有するポリメラーゼの具体例としては、バチルス ステアロサーモフィラス由来の５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損Ｂｓｔ．ＤＮＡポリメラーゼ、及びバチルスカルドテナックス由来の５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損Ｂｃａ ＤＮＡポリメラーゼ 、サーモコッカス リトラリス由来の５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損Ｖｅｎｔ．ＤＮＡポリメラーゼ、アリサイクロバチルス アシドカルダリウス由来のＤＮＡポリメラーゼなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。鎖置換能を有するポリメラーゼは、天然由来のものでもよいし、遺伝子工学的に製造した組み換え蛋白質でもよい。
【００２８】
（３）２価の陽イオン
本発明では、使用する酵素の金属要求性等に２価の陽イオンを用いる。２価の陽イオンとしては、マグネシウム塩、カルシウム塩やその他の金属塩を使用することができ、例えば、塩化マグネシウム、酢酸マグネシウム、硫酸マグネシウムなどを使用できる。２価の陽イオンの濃度は最終濃度で、好ましくは１ｍＭ〜２０ｍＭであり、さらに好ましくは２ｍＭ〜１０ｍＭの範囲である。
【００２９】
（４）界面活性剤
本発明では、反応溶液中に界面活性剤を添加してもよい。界面活性剤を使用することにより、非特異的な核酸の増幅を防止するという有利な効果を達成することができる。本発明で使用できる界面活性剤の種類は、特には限定されないが、アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、スルホコハク酸オクチルエステル塩、ステアリン酸石けんなどの陰イオン（アニオン）性界面活性剤、ショ糖脂肪酸エステル、ＰＯＥソルビタン脂肪酸エステル（Ｔｗｅｅｎ20、Ｔｗｅｅｎ40、Ｔｗｅｅｎ60、Ｔｗｅｅｎ80等）、脂肪酸アルカノールアミド、ＰＯＥアルキルエーテル（Ｂｒｉｊ35、Ｂｒｉｊ58、等）、ＰＯＥアルキルフェニルエーテル（ＴｒｉｔｏｎX-100、ＴｒｉｔｏｎX-114、Nonidet P40、等）、ノニルフェノール、ラウリルアルコール、ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレン・ポリオキシプロピレンブロックポリマー、ＰＯＥアルキルアミン、ＰＯＥ脂肪酸ビスフェニルエーテルなどの非イオン（ノニオン）性界面活性剤、そしてセチルピリジニウムクロライド、ラウリルジメチルベンジルアンモニウムクロライド、ステアリルトリメチルアンモニウムクロライドのような陽イオン（カチオン）性界面活性剤などを使用できる。界面活性剤の使用量は本発明の効果が達成できる限り特に限定されないが、好ましくは０．０１％以上、より好ましくは０．０５％以上、より好ましくは０．１％以上である。界面活性剤の使用量の上限は特に限定されないが、通常は１０％以下、好ましくは５％以下、より好ましくは１％以下である。
【００３０】
界面活性剤の中でも、非イオン性界面活性剤を使用することが特に好ましい。非イオン性界面活性剤の中でも、親水性がより強い界面活性剤が好ましく、ＨＬＢ価で示すと１２以上が好ましい。より好ましくは１４以上であり、上限は２０まで好ましく用いることができる。さらに好ましくは１７以下であり、より好ましくは１４以上１７以下である。構造的には、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル系、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系から選ばれることが好ましい。さらに、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルの中でも、脂肪酸エステルが一つだけのものが好ましい。例えば、以下の構造式で表すことができる。
【００３１】
【化１】
【００３２】
（式中、x + y + z + w = 20 であり、R：炭素数が12〜18のアルキル基であることを示す。）
【００３３】
アルキル基の位置は特に限定されず、以下のような構造でも好ましく用いることができる。
【００３４】
【化２】
【００３５】
このような界面活性剤として、物質名でポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル系の非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレート等が挙げられる。（商品名：Tween20、Tween40、Tween60、Tween80等）の界面活性剤が挙げられる。また、使用量も特に限定されないが、好ましくは０．０１％以上、より好ましくは０．０５％以上、より好ましくは０．１％以上である。
【００３６】
（５）オリゴヌクレオチドプライマー
本発明で使用するオリゴヌクレオチドプライマーは、鋳型ＤＮＡに実質的に相補的な塩基配列を有し、その３'末端よりＤＮＡ鎖の伸長が可能なものである。オリゴヌクレオチドプライマーは、鋳型ＤＮＡに実質的に相補的な塩基配列を有することにより、鋳型となるＤＮＡにアニーリングすることができる。本発明で使用されるオリゴヌクレオチドプライマーとしては、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドで構成されたものを使用することができ、さらに、修飾リボヌクレオチドあるいは修飾デオキシリボヌクレオチドを含有するものでもよい。
【００３７】
本発明では、第一のオリゴヌクレオチドプライマーの５’末端側に、タグ配列（即ち、鋳型となる核酸断片の塩基配列上において第一のオリゴヌクレオチドプライマーの３’末端側部分（第一のオリゴヌクレオチドが鋳型核酸とアニールする部分）と実質的に相同な塩基配列よりも３’末端側に存在する塩基配列）を付加する。
【００３８】
好ましくは、第一のオリゴヌクレオチドプライマーの５’末端側に付加するタグ配列は、２塩基以上２０塩基以下である。
好ましくは、第一のオリゴヌクレオチドプライマーの５’末端側に付加するタグ配列は、２塩基以上１６塩基以下である。
好ましくは、第一のオリゴヌクレオチドプライマーの５’末端側に付加するタグ配列は、４塩基以上１４塩基以下である。
【００３９】
好ましくは、第一のオリゴヌクレオチドプライマーの５’末端側に付加するタグ配列は、鋳型となる核酸断片の塩基配列上において、第一のオリゴヌクレオチドプライマーの３’末端側部分（第一のオリゴヌクレオチドが鋳型核酸とアニールする部分）と実質的に相同な塩基配列の３’末端側２００塩基以内の位置に存在する。
好ましくは、第一のオリゴヌクレオチドプライマーの５’末端側に付加するタグ配列は、鋳型となる核酸断片の塩基配列上において、第一のオリゴヌクレオチドプライマーの３’末端側部分（第一のオリゴヌクレオチドが鋳型核酸とアニールする部分）と実質的に相同な塩基配列の３’末端側１００塩基以内の位置に存在する。
好ましくは、第一のオリゴヌクレオチドプライマーの５’末端側に付加するタグ配列は、鋳型となる核酸断片の塩基配列上において、第一のオリゴヌクレオチドプライマーの３’末端側部分（第一のオリゴヌクレオチドが鋳型核酸とアニールする部分）と実質的に相同な塩基配列の３’末端側６０塩基以内の位置に存在する。
好ましくは、第一のオリゴヌクレオチドプライマーの５’末端側に付加するタグ配列は、鋳型となる核酸断片の塩基配列上において、第一のオリゴヌクレオチドプライマーの３’末端側部分（第一のオリゴヌクレオチドが鋳型核酸とアニールする部分）と実質的に相同な塩基配列の３’末端側５０塩基以内の位置に存在する。
【００４０】
オリゴヌクレオチドプライマーの長さは、特に限定されないが、一般的には、１０〜１００ヌクレオチド程度の長さであり、好ましくは１５〜５０ヌクレオチド程度の長さであり、さらに好ましくは１５〜４０ヌクレオチド程度の長さである。
【００４１】
オリゴヌクレオチドプライマーは、市販のＤＮＡ合成機（例えば、アプライド バイオシステムズ社（Applied Biosystem Inc.）のＤＮＡシンセサイザー３９４型など）を用いて、ホスホアミダイト法により合成できる。
【００４２】
オリゴヌクレオチドプライマーの使用量は、反応溶液中において０．１μＭ以上が好ましく、１μＭ以上がさらに好ましく、１．５μＭ以上が特に好ましい。
【００４３】
（６）鋳型となる核酸断片
本発明において鋳型となる核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、全ＲＮＡのいずれでもよい。鋳型となる核酸を含む可能性のある試料から調製した核酸を使用してもよいし、鋳型となる核酸を含む可能性のある試料をそのまま直接使用してもよい。鋳型となる核酸を含む試料の種類は特に限定されず、例えば、体液（例えば、全血、血清、尿、脳脊髄液、精液、唾液など）、組織（例えば、癌組織など）、スワブ、細胞培養物のような生体由来試料、ウイルス、細菌、カビ、酵母、植物及び動物のような核酸含有試料、微生物が混入している可能性のある試料（例えば、食品など）、あるいは土壌、排水のような環境中の試料が挙げられる。上記したような試料から核酸を調製する場合、その調製方法は特に限定されず、例えば、界面活性剤による処理、超音波処理、ガラスビーズを用いた精製など当業者に公知の方法を用いることができる。核酸の試料からの精製は、フェノール抽出、クロマトグラフィー、ゲル電気泳動または密度勾配遠心分離などにより行うことができる。
【００４４】
ＲＮＡ由来の配列を有する核酸を増幅したい場合には、当該ＲＮＡを鋳型とした逆転写反応によって合成されたｃＤＮＡを鋳型として本発明の方法を実施することができる。逆転写反応に使用されるプライマーは、特定の鋳型ＲＮＡに相補的な塩基配列を有するプライマーでもよいし、オリゴｄＴプライマーやランダムな配列を有するプライマーでもよい。逆転写用プライマーの長さは好ましくは６から１００ヌクレオチド程度であり、更に好ましくは９から５０ヌクレオチド程度である。逆転写反応に使用される酵素としては、ＲＮＡを鋳型としたｃＤＮＡ合成活性を有するものであれば特に限定はなく、例えばトリ骨髄芽球症ウイルス由来逆転写酵素（ＡＭＶ ＲＴａｓｅ）、モロニーネズミ白血病ウイルス由来逆転写酵素（ＭＭＬＶ ＲＴａｓｅ）、ラウス関連ウイルス２逆転写酵素（ＲＡＶ−２ ＲＴａｓｅ）などを使用することができる。また、逆転写活性を併せ持つ鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼを使用することもできる。
【００４５】
本発明においては、ゲノムＤＮＡや核酸増幅断片のような二本鎖ＤＮＡ、およびＲＮＡから逆転写反応で調製されたｃＤＮＡのような一本鎖ＤＮＡを、鋳型ＤＮＡとして使用できる。上記二本鎖ＤＮＡは、一本鎖ＤＮＡに変性してから本発明の方法に使用してもよいし、このような変性を行うことなく本発明の方法に使用することもできる。
【００４６】
（７）鋳型となる核酸断片の前処理
本発明において鋳型となる核酸は、前処理工程を経た後に増幅鋳型として用いても良い。
前処理用の試薬は、例えば、界面活性剤、血液凝固防止剤、タンパク分解酵素、脂質分解酵素を含んでいてもよい。液性としては、酸性あるいはアルカリ性であってもよい。
前処理工程としては、高温（例えば９８℃）に加熱することや変性処理剤で処理する工程を含んでよい。また、高温に加熱後、４℃以下に急冷する工程を含んでもよい。
【００４７】
（８）融解温度調整剤
本発明における反応溶液には、融解温度調整剤を添加することができる。融解温度調整剤の具体例としては、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ベタイン、ホルムアミドもしくはグリセロール、テトラアルキルアンモニウム塩、またはこれらの２種以上の混合物を挙げることができる。融解温度調整の使用量は特に限定されないが、ＤＭＳＯやホルムアミド、グリセロールの場合、通常は反応溶液中に１０％以下の量で含めることができる。
ベタインやテトラアルキルアンモニウム塩は、０．２〜３．０Ｍ、好ましくは０．５〜１．５Ｍ程度添加することができる。
【００４８】
（９）緩衝成分
本発明における反応溶液には、緩衝成分を含めることができる。緩衝成分としては、特に限定はないが、例えば、ビシン、トリシン、ヘペス、トリス、リン酸塩（リン酸ナトリウム、リン酸カリウム等）などを使用することができる。緩衝成分の最終濃度は５ｍＭ〜１００ｍＭの範囲、特に好ましくは１０ｍＭ〜５０ｍＭの範囲であり、またｐＨは、増幅反応に用いられる酵素の至適ｐＨにもよるが、一般的には６．０〜９．０、特に好ましくはｐＨ７．０〜９．０のものを使用できる。
【００４９】
（１０）蛍光色素
本発明における反応溶液には、蛍光色素を含めることができる。蛍光色素としては、特に限定はないが、例えばSYBR GreenIなどを使用することができる。
【００５０】
（１１）本発明による核酸の増幅方法
次に、本発明による核酸の増幅方法について説明する。本発明では、少なくとも１種のデオキシヌクレオチド３リン酸、少なくとも１種のＤＮＡポリメラーゼ、２価の陽イオン、少なくとも２種類のオリゴヌクレオチドプライマー、及び鋳型となる核酸断片を含む反応溶液をインキュベートする。これにより、前記プライマーの３’末端を起点とするポリメラーゼ反応を行い、該核酸断片を増幅することができる。本発明では、好ましくは、核酸を増幅する工程を実質的に等温で行うことができる。反応溶液をインキュベートする際の温度は好ましくは５０℃以上であり、より好ましくは５５℃以上であり、例えば、６０℃程度でインキュベートすることができる。好ましい温度範囲は、例えば、約５０℃から約７０℃であり、さらに好ましくは約５５℃から約６５℃である。この場合、プライマーの非特異的なアニーリングが抑制され、ＤＮＡ増幅の特異性が向上し、また鋳型ＤＮＡの二次構造が解消されることによりＤＮＡポリメラーゼの伸長性も向上する。本発明による核酸の増幅方法は、実質的に等温において実施すことができる。本発明において等温とは、各工程の反応温度を大きく変化することなく、各工程が実質的に一定の温度で行われることを意味する。
【００５１】
本発明において、反応溶液を実質的に等温でインキュベートする時間は、標的核酸断片が増幅できる限り特に限定されない。インキュベートする時間は、例えば、５分以上１２時間以内とすることができる。インキュベートする時間は、好ましくは、５分以上２時間以内であり、より好ましくは５分以上６０分以内であり、さらに好ましくは５分以上３０分以内であり、５分以上１５分以内とすることもできる。
【００５２】
核酸を増幅する工程を実質的に等温で行う場合は、温度を上昇させたり低下させる必要がないことが利点の一つになる。従来のＰＣＲ法では温度を上下させる必要があり、例えばサーマルサイクラーのような反応装置が必要であったが、核酸を増幅する工程を実質的に等温で行う場合は、一定温度を保持できる装置のみで実施が可能である。
【００５３】
（１２）本発明による核酸の増幅方法の利用
本発明による核酸の増幅方法は、核酸の検出、標識、塩基配列の決定、塩基の変異の検出（一塩基多型の検出などを含む）などに使用することができる。本発明の核酸の増幅方法には温度調節が可能な反応装置を使用する必要がないため、多量の反応液を使用して増幅反応を実施することができる。
【００５４】
本発明の核酸の増幅方法により得られる増幅物は、当業者に公知の方法により検出できる。例えば、ゲル電気泳動によれば、エチジウムブロマイドでゲルを染色することによって特定サイズの反応産物を検出することができる。増幅産物を検出するための検出系は、蛍光偏光、イムノアッセイ、蛍光エネルギー転移、酵素標識（例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなど）、蛍光標識（例えば、フルオレセイン、ローダミンなど）、ケミルミネッセンス、又はバイオルミネッセンスなどを用いることができる。TaqmanプローブやMolecular Beaconを利用して検出することもできる。ビオチンなどで標識した標識ヌクレオチドを使用することによって増幅物を検出することもできる。この場合、増幅産物中のビオチンは、蛍光標識アビジン又は酵素標識アビジンなどを用いて検出することができる。また、当業者に公知の酸化還元型インターカレーターを使用することで、電極により増幅産物を検出することもできる。また、SPRを用いて増幅産物を検出してもよい。
【００５５】
ピロリン酸マグネシウムを検出することによっても核酸増幅の検出を行うことができる。この場合、濁度による検出など、その他の当業者に公知の方法により検出できる。
【００５６】
本発明を実施例により更に具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００５７】
＜実施例１＞Ｔａｇつきプライマーによる核酸増幅（Ｔａｇ設計位置の影響）
（１）ターゲット核酸断片を含む核酸試料液の調整
ＨｕｍａｎＧｅｎｏｍｉｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）３．０ｎｇを９８℃で３ｍｉｎ．加熱を行い、１本鎖にしたのち、β２AR遺伝子中の配列の増幅を以下の条件で行った。
【００５８】
＜プライマー＞
プライマーは、β２AR遺伝子を標的に設計を行った。各プライマーの配列を以下に示す。
プライマー(1)(Ｆｏｒｗａｒｄ１)：
５'−CCACGACGCTTGCTGGCACCCAATA−３'（配列番号１）
プライマー(2)(Ｆｏｒｗａｒｄ２)：
５'−GGCAGGAACTTGCTGGCACCCAATA−３'（配列番号２）
プライマー(3)(Ｆｏｒｗａｒｄ３)：
５'−TGGGTGGTCTTGCTGGCACCCAATA−３'（配列番号３）
プライマー(4)(Ｒｅｖｅｒｓｅ):
５'−CCGGCGCATGGCTT−３' （配列番号４）
【００５９】
上記プライマーのβ２AR遺伝子に対する位置関係の詳細を図４に示した。
ここで、プライマー(1)、(2)、(3)の５'末端8塩基（Ｔａｇ）は、鋳型となる核酸断片の塩基配列上においてプライマー(1)、(2)、(3)の３’末端側部分（プライマーが鋳型核酸とアニールする部分）と実質的に相同な塩基配列よりも３’末端側に存在するそれぞれの配列と実質的に相同である。
【００６０】
（２）核酸増幅反応
以下に示す反応液の組成で、６０℃、６０分反応させることで増幅反応を実施した。酵素は、ＮＥＢ社のBst.DNA polymeraseを使用した。
＜反応液の組成＞
10×Bst Buffer(DF) １．０μＬ
100mM MgSO4 ０．６μＬ
10%(v/v) Tween20 ０．１μＬ
100% DMSO ０．５μＬ
25mM dNTP each ０．５６μＬ
SYBR GreenI（2000倍希釈） ０．２μＬ
50μM primer(1)又は(2)又は(3) ０．６４μＬ
50μM primer(4) ０．６４μＬ
Bst. Polymerase ０．４μＬ
１）で得た核酸断片試料 ３．０ｎｇ
精製水 ４．９６μＬ
１０．０μＬ
【００６１】
（３）増幅産物の検出
前記（２）における増幅反応を、リアルタイム蛍光検出装置（Ｍｘ３０００ｐ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いて蛍光検出を行った。結果を図５から７に示す。
【００６２】
核酸試料由来のサンプルからの核酸増幅反応をリアルタイムに検出できることがわかる。ここで、Ｍｘ３０００ｐの解析ソフトを用いて、上記のグラフにおいて蛍光量が２５０に到達したときの時間（Ct値）を算出したところ、表１のような結果になった。
【００６３】
【表１】
【００６４】
（４）増幅産物の電気泳動
３ｗｔ％のアガロースゲル、０．５ｘTBEバッファー（50mM Tris, 45mM Boric acid、0.5mM EDTA, pH8.4）を用い、100Vで60分の電気泳動を行った。結果を図８から１０に示す。
【００６５】
どのプライマーの組み合わせにおいても、ラダー状の規則的な電気泳動パターンが得られた。この結果より、ある規則性を有した増幅産物が得られることがわかり、即ち、増幅反応の制御ができていることがわかった。
【００６６】
（５）増幅産物の配列解析
増幅産物をNucleoSpin（登録商標） Extract II（MACHEREY-NAGEL製）精製し、TOPO TA Cloning Kit（Invitrogen製）を用いてベクターに組み込み、該ベクターにより大腸菌を形質転換した。形質転換した大腸菌を、アンピシリンを加えたLB培地中で培養した。
QIAprep Miniprep（Qiagen製）を使用して培養した大腸菌からプラスミドDNAを回収した。
回収したプラスミドDNAに対してシークエンスを行い、塩基配列を調べた。なお、シークエンスはABI PRISM 310 Genetic Analyzer（ABI社製）により行なった。プライマーにはM13 Reverse Primerを使用した。
M13 Reverse Primer
５'−CAGGAAACAGCTATGAC−３'（配列番号５）
シークエンスの結果、プライマー(1)とプライマー(4)の組み合わせよる増幅産物中には、以下の配列を有する核酸が存在することがわかった。
【００６７】
（１）
5'- CCACGACGTT CTTGCTGGCA CCCAATAGAA GCCATGCGCC GG -3'
3'- GGTGCTGCAA GAACGACCGT GGGTTATCTT CGGTACGCGG CC -5'
（42塩基対）（配列番号６）
【００６８】
（２）
5'- CCACGACGTT CTTGCTGGCA CCCAATAGAA GCCATGCGCC GGACCACGAC -3'
3'- GGTGCTGCAA GAACGACCGT GGGTTATCTT CGGTACGCGG CCTGGTGCTG -5'
5'- GTTCTTGCTG GCACCCAATA GAAGCCATGC GCCGG -3'
3'- CAAGAACGAC CGTGGGTTAT CTTCGGTACG CGGCC -5'
（85塩基対）（配列番号7）
【００６９】
（３）
5'- CCACGACGTT CTTGCTGGCA CCCAATAGAA GCCATGCGCC GGACCACGAC -3'
3'- GGTGCTGCAA GAACGACCGT GGGTTATCTT CGGTACGCGG CCTGGTGCTG -5'
5'- GTTCTTGCTG GCACCCAATA GAAGCCATGC GCCGGACCAC GACGTTCTTG -3'
3'- CAAGAACGAC CGTGGGTTAT CTTCGGTACG CGGCCTGGTG CTGCAAGAAC -5'
5'- CTGGCACCCA ATAGAAGCCA TGCGCCGG -3'
3'- GACCGTGGGT TATCTTCGGT ACGCGGCC -5'
（128塩基対）（配列番号8）
【００７０】
シークエンスで得られた増幅産物の鎖長は、図８の電気泳動結果とも一致した。
（１）の増幅産物は、２つのプライマーに挟まれる領域である。
（２）の増幅産物は、増幅産物同士がForward Primerの５'末端配列（Tag）とReverse Primerの５'末端側に存在する配列とのハイブリッド形成を介して生成された産物であり、“プライマーに挟まれる領域”＋“Reverse PrimerとTag配列の間の配列”＋“プライマーに挟まれた領域”という構造になっている。（以下、２倍体と表現する。）
（３）の増幅産物は、（２）の増幅産物と同様に、増幅産物同士がForward Primerの５'末端配列とReverse Primerの５'末端側の配列とのハイブリッド形成を介して生成された産物であり、“プライマーに挟まれる領域”＋“Reverse PrimerとTag配列の間の配列”＋“プライマーに挟まれた領域” ＋“Reverse PrimerとTag配列の間の配列”＋“プライマーに挟まれた領域”という構造になっている。（以下、３倍体と表現する。）
【００７１】
シークエンスの結果、プライマー(2)とプライマー(4)の組み合わせよる増幅産物中には、以下の配列を有する核酸が存在することがわかった。
【００７２】
（１）
5'- GGGACGAGTT CTTGCTGGCA CCCAATAGAA GCCATGCGCC GG -3'
3'- GGGACGAGAA GAACGACCGT GGGTTATCTT CGGTACGCGG CC -5'
（42塩基対）（配列番号9）
【００７３】
（２）
5'- GGGACGAGTT CTTGCTGGCA CCCAATAGAA GCCATGCGCC GGACCACGAC -3'
3'- CCCTGCTCAA GAACGACCGT GGGTTATCTT CGGTACGCGG CCTGGTGCTG -5'
5'- GTCACGCAGG AAAGGGACGA GTTCTTGCTG GCACCCAATA GAAGCCATGC -3'
3'- CAGTGCGTCC TTTCCCTGCT CAAGAACGAC CGTGGGTTAT CTTCGGTACG -5'
5'- GCCGG -3'
3'- CGGCC -5'
（105塩基対）（配列番号10）
【００７４】
（３）
5'- GGGACGAGTT CTTGCTGGCA CCCAATAGAA GCCATGCGCC GGACCACGAC -3'
3'- CCCTGCTCAA GAACGACCGT GGGTTATCTT CGGTACGCGG CCTGGTGCTG -5'
5'- GTCACGCAGG AAAGGGACGA GTTCTTGCTG GCACCCAATA GAAGCCATGC -3'
3'- CAGTGCGTCC TTTCCCTGCT CAAGAACGAC CGTGGGTTAT CTTCGGTACG -5'
5'- GCCGGACCAC GACGTCACGC AGGAAAGGGA CGAGTTCTTG CTGGCACCCA -3'
3'- CGGCCTGGTG CTGCAGTGCG TCCTTTCCCT GCTCAAGAAC GACCGTGGGT -5'
5'- ATAGAAGCCA TGCGCCGG -3'
3'- TATCTTCGGT ACGCGGCC -5'
（168塩基対）（配列番号11）
【００７５】
シークエンスで得られた増幅産物の鎖長は、図９の電気泳動結果とも一致した。
（１）の増幅産物は、２つのプライマーに挟まれる領域である。
（２）の増幅産物は、増幅産物同士がForward Primerの５'末端配列（Ｔａｇ）とReverse Primerの５'末端側に存在する配列とのハイブリッド形成を介して生成された産物であり、２倍体である。
（３）の増幅産物は、（２）の増幅産物と同様に、増幅産物同士がForward Primerの５'末端配列とReverse Primerの５'末端側の配列とのハイブリッド形成を介して生成された産物であり、３倍体である。
【００７６】
シークエンスの結果、プライマー(3)とプライマー(4)の組み合わせよる増幅産物中には、以下の配列を有する核酸が存在することがわかった。
【００７７】
（１）
5'- TGGGTGGTTT CTTGCTGGCA CCCAATAGAA GCCATGCGCC GG -3'
3'- ACCCACCAAA GAACGACCGT GGGTTATCTT CGGTACGCGG CC -5'
（42塩基対）（配列番号12）
【００７８】
（２）
5'- TGGGTGGTTT CTTGCTGGCA CCCAATAGAA GCCATGCGCC GGACCACGAC -3'
3'- ACCCACCAAA GAACGACCGT GGGTTATCTT CGGTACGCGG CCTGGTGCTG -5'
5'- GTCACGCAGG AAAGGGACGA GGTGTGGGTG GTTTCTTGCT GGCACCCAAT
3'- CAGTGCGTCC TTTCCCTGCT CCACACCCACCAAAGAACGAC CGTGGGTTA
5'- AGAAGCCATG CGCCGG -3'
3'- TCTTCGGTAC GCGGCC -5'
（116塩基対）（配列番号13）
【００７９】
（３）
5'- TGGGTGGTTT CTTGCTGGCA CCCAATAGAA GCCATGCGCC GGACCACGAC -3'
3'- ACCCACCAAA GAACGACCGT GGGTTATCTT CGGTACGCGG CCTGGTGCTG -5'
5'- GTCACGCAGG AAAGGGACGA GGTGTGGGTG GTTTCTTGCT GGCACCCAAT -3'
3'- CAGTGCGTCC TTTCCCTGCT CCACACCCAC CAAAGAACGA CCGTGGGTTA -5'
5'- AGAAGCCATG CGCCGGACCA CGACGTCACG CAGGAAAGGG ACGAGGTGTG -3'
3'- TCTTCGGTAC GCGGCCTGGT GCTGCAGTGC GTCCTTTCCC TGCTCCACAC -5'
5'- GGTGGTTTCT TGCTGGCACC CAATAGAAGC CATGCGCCGG -3'
3'- CCACCAAAGA ACGACCGTGG GTTATCTTCG GTACGCGGCC -5'
（190塩基対）（配列番号14）
【００８０】
シークエンスで得られた増幅産物の鎖長は、図１０の電気泳動結果とも一致した。
（１）の増幅産物は、２つのプライマーに挟まれる領域である。
（２）の増幅産物は、増幅産物同士がForward Primerの５'末端配列（Ｔａｇ）とReverse Primerの５'末端側に存在する配列とのハイブリッド形成を介して生成された産物であり、２倍体である。
（３）の増幅産物は、（２）の増幅産物と同様に、増幅産物同士がForward Primerの５'末端配列とReverse Primerの５'末端側の配列とのハイブリッド形成を介して生成された産物であり、３倍体である。
【００８１】
どの増幅産物においても、Ｔａｇを介した高分子量産物形成が起こっていることがわかった。つまり、第一のオリゴヌクレオチドプライマーの５’末端側に、鋳型となる核酸断片の塩基配列上において第一のオリゴヌクレオチドプライマーの３’末端側部分（第一のオリゴヌクレオチドが鋳型核酸とアニールする部分）と実質的に相同な配列の３’末端側に存在する塩基配列を付加することで、積極的に高分子量産物を形成させ、増幅反応を制御することが可能となった。
【００８２】
＜実施例２＞Ｔａｇつきプライマーによる核酸増幅（Ｔａｇの長さの影響）
（１）ターゲット核酸断片を含む核酸試料液の調整
ＨｕｍａｎＧｅｎｏｍｉｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）３．０ｎｇを９８℃で３ｍｉｎ．加熱を行い、１本鎖にしたのち、β２AR遺伝子中の配列の増幅を以下の条件で行った。
【００８３】
＜プライマー＞
プライマーは、β２AR遺伝子を標的に設計を行った。各プライマーの配列を以下に示す。
プライマー(5)(Ｆｏｒｗａｒｄ５)：
５'−TGGTCTTGCTGGCACCCAATA−３'（配列番号15）
プライマー(6)(Ｆｏｒｗａｒｄ６)：
５'−TGGGTGGTCTTGCTGGCACCCAATA−３'（配列番号16）
プライマー(7)(Ｆｏｒｗａｒｄ７)：
５'−TGGGTGGTGGGCCTTGCTGGCACCCAATA−３'（配列番号17）
プライマー(8)(Ｆｏｒｗａｒｄ８)：
５'−TGGGTGGTGGGCATCTTGCTGGCACCCAATA−３'（配列番号18）
プライマー(9)(Ｒｅｖｅｓｒｅ2)：
５'−TCCCTTTCCTGCGTGAC−３'（配列番号１９）
【００８４】
上記プライマーのβ２AR遺伝子に対する位置関係の詳細を図１１に示した。
ここで、プライマー(5)、(6)、(7)、(8)の５'末端には、鋳型となる核酸断片の塩基配列上においてプライマー(5)、(6)、(7)、(8)の３’末端側部分（プライマーが鋳型核酸とアニールする部分）と実質的に相同な塩基配列よりも３’末端側に存在する、それぞれ4塩基、8塩基、12塩基、14塩基の配列と実質的に相同な配列（Tag）が付加されている。
【００８５】
（２）核酸増幅反応
以下に示す反応液の組成で、６０℃、６０分反応させることで増幅反応を実施した。酵素は、ＮＥＢ社のBst.DNA polymeraseを使用した。
＜反応液の組成＞
10×Bst Buffer(DF) １．０μＬ
100mM MgSO4 ０．６μＬ
10%(v/v) Tween20 ０．１μＬ
100% DMSO ０．５μＬ
25mM dNTP each ０．５６μＬ
SYBR GreenI（2000倍希釈） ０．２μＬ
50μM primer(1)又は(2)又は(3) ０．６４μＬ
50μM primer(4) ０．６４μＬ
Bst. Polymerase ０．４μＬ
１）で得た核酸断片試料 ３．０ｎｇ
精製水 ４．９６μＬ
１０．０μＬ
【００８６】
（３）増幅産物の電気泳動
上記で得られた増幅産物について、３ｗｔ％のアガロースゲル、０．５ｘTBEバッファー（50mM Tris, 45mM Boric acid、0.5mM EDTA, pH8.4）を用い、100Vで60分の電気泳動を行った。結果を図１２に示す。
【００８７】
どのプライマーの組み合わせにおいても、ラダー状の規則的な電気泳動パターンが得られた。この結果より、ある規則性を有した増幅産物が得られることがわかり、実施例１と同様に、Tagを介した高分子量産物が形成していると考えられる。即ち、増幅反応の制御ができていることがわかった。
【００８８】
＜比較例１＞
第一のオリゴヌクレオチドプライマーの５’末端側に、鋳型となる核酸断片の塩基配列上において第二のオリゴヌクレオチドプライマーの塩基配列に対して実質的に相補的な塩基配列よりも３’末端側に存在する塩基配列を付加しない系での核酸の増幅反応を比較例として記述する。
【００８９】
（１）ターゲット核酸断片を含む核酸試料液の調整
ＨｕｍａｎＧｅｎｏｍｉｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）３．０ｎｇを前処理液（３０ｍＭ ＮａＯＨ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０）とともに９８℃で３ｍｉｎ．加熱を行い、１本鎖にしたのち、β２AR遺伝子中の配列の増幅を以下の条件で行った。
【００９０】
＜プライマー＞
プライマーは、β２AR遺伝子を標的に設計を行った。各プライマーの配列を以下に示す。
【００９１】
プライマー(1)(Ｆｏｒｗａｒｄ)：
５'−CTTGCTGGCACCCAATA−３'（配列番号２０）
プライマー(2)(Ｒｅｖｅｒｓｅ):
５'− CCGGCGCATGGCTT−３'（配列番号４）
【００９２】
上記プライマーのβ２AR遺伝子に対する位置関係の詳細を図１３に示した。
【００９３】
（２）核酸増幅反応
以下に示す反応液の組成で、６０℃、６０分反応させることで増幅反応を実施した。酵素は、ＮＥＢ社のBst.DNA polymeraseを使用した。
＜反応液の組成＞
10×Bst Buffer(DF) １．０μＬ
100mM MgSO4 ０．６μＬ
10%(v/v) Tween20 ０．１μＬ
100% DMSO ０．５μＬ
25mM dNTP each ０．５６μＬ
SYBR GreenI（2000倍希釈） ０．２μＬ
50μM primer(1) ０．６４μＬ
50μM primer(2) ０．６４μＬ
Bst. Polymerase ０．４μＬ
１）で得た核酸断片試料液(３．０ｎｇ) ０．４μＬ
精製水 ４．９６μＬ
１０．０μＬ
【００９４】
（３）増幅産物の電気泳動
上記で得られた増幅産物について、３ｗｔ％のアガロースゲル、０．５ｘTBEバッファー（50mM Tris, 45mM Boric acid、0.5mM EDTA, pH8.4）を用い、100Vで60分の電気泳動を行った。結果を図１４に示す。
若干の規則性はあるものの、基本的にスメア状の泳動パターンが得られた。即ち、高分子量形成反応の規則性が低いことがわかった。
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１】図１は、本発明におけるプライマーとタグ配列の位置関係の模式図を示す。
【図２】図２は、本発明におけるプライマーとタグ配列の位置関係の模式図を示す。
【図３】図３は、本発明におけるプライマーとタグ配列の位置関係の模式図を示す。
【図４】図４は、実施例で用いたプライマーのβ２AR遺伝子に対する位置関係の詳細を示す。
【図５】図５は、本発明による増幅反応で得られた増幅産物についての蛍光検出の結果を示す。
【図６】図６は、本発明による増幅反応で得られた増幅産物についての蛍光検出の結果を示す。
【図７】図７は、本発明による増幅反応で得られた増幅産物についての蛍光検出の結果を示す。
【図８】図８は、本発明による増幅反応で得られた増幅産物の電気泳動の結果を示す。
【図９】図９は、本発明による増幅反応で得られた増幅産物の電気泳動の結果を示す。
【図１０】図１０は、本発明による増幅反応で得られた増幅産物の電気泳動の結果を示す。
【図１１】図１１は、実施例で用いたプライマーのβ２AR遺伝子に対する位置関係の詳細を示す。
【図１２】図１２は、本発明による増幅反応で得られた増幅産物の電気泳動の結果を示す。
【図１３】図１３は、実施例で用いたプライマーのβ２AR遺伝子に対する位置関係の詳細を示す。
【図１４】図１４は、本発明による増幅反応で得られた増幅産物の電気泳動の結果を示す。
【図１５】図１５は、本発明における増幅産物の形成機構の詳細について示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１種のデオキシヌクレオチド３リン酸、少なくとも１種のＤＮＡポリメラーゼ、少なくとも２種のオリゴヌクレオチドプライマー、及び鋳型となる核酸断片を含む反応溶液をインキュベートすることによって前記プライマーの３’末端を起点とするポリメラーゼ反応を行い、該核酸断片を増幅することを含む核酸の増幅方法であって、第一のオリゴヌクレオチドプライマーの５’末端側にタグ配列が付加されており、該タグ配列が、鋳型となる核酸断片の塩基配列上において、第一のオリゴヌクレオチドプライマーの３’末端側部分（第一のオリゴヌクレオチドが鋳型核酸とアニールする部分）と実質的に相同な配列の３’末端側に存在する塩基配列であることを特徴とする、核酸の増幅方法。
【請求項２】
該タグ配列の３’末端の塩基が、鋳型となる核酸断片の塩基配列上において、第二のオリゴヌクレオチドプライマーの塩基配列に対して実質的に相補的な塩基配列よりも３’末端側に存在する塩基である、請求項１に記載の核酸の増幅方法。
【請求項３】
第一のオリゴヌクレオチドプライマーの５’末端側に付加するタグ配列が、２塩基以上２０塩基以下である、請求項１又は２に記載の核酸の増幅方法。
【請求項４】
第一のオリゴヌクレオチドプライマーの５’末端側に付加するタグ配列が、鋳型となる核酸断片の塩基配列上において、第一のオリゴヌクレオチドプライマーの３’末端側部分（第一のオリゴヌクレオチドが鋳型核酸とアニールする部分）と実質的に相同な配列の３’末端側２００塩基以内に存在する塩基配列である、請求項１から３の何れかに記載の核酸の増幅方法。
【請求項５】
反応溶液が、少なくとも０．０１％以上の界面活性剤をさらに含む、請求項１から４の何れかに記載の核酸の増幅方法。
【請求項６】
界面活性剤が非イオン性界面活性剤である、請求項５に記載の核酸の増幅方法。
【請求項７】
非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル系、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系から選ばれることを特徴とする請求項６に記載の方法
【請求項８】
反応溶液が、２価の陽イオンをさらに含む、請求項１から７の何れかに記載の核酸の増幅方法。
【請求項９】
反応溶液が、融解温度調整剤をさらに含む、請求項１から８の何れかに記載の核酸の増幅方法。
【請求項１０】
融解温度調整剤が、ジメチルスルホキシド、ベタイン、ホルムアミドもしくはグリセロール、またはこれらの２種以上の混合物である、請求項９に記載の核酸の増幅方法。
【請求項１１】
少なくとも１種のＤＮＡポリメラーゼが、鎖置換機能を有するＤＮＡポリメラーゼである、請求項１から１０の何れかに記載の核酸の増幅方法。
【請求項１２】
少なくとも１種の鎖置換能を有するＤＮＡポリメラーゼが、バチルス ステアロサーモフィラス由来の５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損Ｂｓｔ．ＤＮＡポリメラーゼ、及びバチルスカルドテナックス由来の５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損Ｂｃａ ＤＮＡポリメラーゼ 、サーモコッカス リトラリス由来の５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損Ｖｅｎｔ．ＤＮＡポリメラーゼ、アリサイクロバチルス アシドカルダリウス由来のＤＮＡポリメラーゼからなる群より選択されるポリメラーゼである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
核酸を増幅する工程が実質的に等温で行われる、請求項１から１２の何れかに記載の核酸の増幅方法。
【請求項１４】
核酸を増幅する工程が５０℃以上１００℃以下で行われる、請求項１３に記載の核酸の増幅方法。
【請求項１５】
核酸を増幅する工程が実質的に６０分以内で行われる、請求項１から１４の何れかに記載の核酸の増幅方法。
【請求項１】
少なくとも１種のデオキシヌクレオチド３リン酸、少なくとも１種のＤＮＡポリメラーゼ、少なくとも２種のオリゴヌクレオチドプライマー、及び鋳型となる核酸断片を含む反応溶液をインキュベートすることによって前記プライマーの３’末端を起点とするポリメラーゼ反応を行い、該核酸断片を増幅することを含む核酸の増幅方法であって、第一のオリゴヌクレオチドプライマーの５’末端側にタグ配列が付加されており、該タグ配列が、鋳型となる核酸断片の塩基配列上において、第一のオリゴヌクレオチドプライマーの３’末端側部分（第一のオリゴヌクレオチドが鋳型核酸とアニールする部分）と実質的に相同な配列の３’末端側に存在する塩基配列であることを特徴とする、核酸の増幅方法。
【請求項２】
該タグ配列の３’末端の塩基が、鋳型となる核酸断片の塩基配列上において、第二のオリゴヌクレオチドプライマーの塩基配列に対して実質的に相補的な塩基配列よりも３’末端側に存在する塩基である、請求項１に記載の核酸の増幅方法。
【請求項３】
第一のオリゴヌクレオチドプライマーの５’末端側に付加するタグ配列が、２塩基以上２０塩基以下である、請求項１又は２に記載の核酸の増幅方法。
【請求項４】
第一のオリゴヌクレオチドプライマーの５’末端側に付加するタグ配列が、鋳型となる核酸断片の塩基配列上において、第一のオリゴヌクレオチドプライマーの３’末端側部分（第一のオリゴヌクレオチドが鋳型核酸とアニールする部分）と実質的に相同な配列の３’末端側２００塩基以内に存在する塩基配列である、請求項１から３の何れかに記載の核酸の増幅方法。
【請求項５】
反応溶液が、少なくとも０．０１％以上の界面活性剤をさらに含む、請求項１から４の何れかに記載の核酸の増幅方法。
【請求項６】
界面活性剤が非イオン性界面活性剤である、請求項５に記載の核酸の増幅方法。
【請求項７】
非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル系、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系から選ばれることを特徴とする請求項６に記載の方法
【請求項８】
反応溶液が、２価の陽イオンをさらに含む、請求項１から７の何れかに記載の核酸の増幅方法。
【請求項９】
反応溶液が、融解温度調整剤をさらに含む、請求項１から８の何れかに記載の核酸の増幅方法。
【請求項１０】
融解温度調整剤が、ジメチルスルホキシド、ベタイン、ホルムアミドもしくはグリセロール、またはこれらの２種以上の混合物である、請求項９に記載の核酸の増幅方法。
【請求項１１】
少なくとも１種のＤＮＡポリメラーゼが、鎖置換機能を有するＤＮＡポリメラーゼである、請求項１から１０の何れかに記載の核酸の増幅方法。
【請求項１２】
少なくとも１種の鎖置換能を有するＤＮＡポリメラーゼが、バチルス ステアロサーモフィラス由来の５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損Ｂｓｔ．ＤＮＡポリメラーゼ、及びバチルスカルドテナックス由来の５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損Ｂｃａ ＤＮＡポリメラーゼ 、サーモコッカス リトラリス由来の５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損Ｖｅｎｔ．ＤＮＡポリメラーゼ、アリサイクロバチルス アシドカルダリウス由来のＤＮＡポリメラーゼからなる群より選択されるポリメラーゼである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
核酸を増幅する工程が実質的に等温で行われる、請求項１から１２の何れかに記載の核酸の増幅方法。
【請求項１４】
核酸を増幅する工程が５０℃以上１００℃以下で行われる、請求項１３に記載の核酸の増幅方法。
【請求項１５】
核酸を増幅する工程が実質的に６０分以内で行われる、請求項１から１４の何れかに記載の核酸の増幅方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【公開番号】特開２００９−１３６２８４（Ｐ２００９−１３６２８４Ａ）
【公開日】平成２１年６月２５日（２００９．６．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２９２１５６（Ｐ２００８−２９２１５６）
【出願日】平成２０年１１月１４日（２００８．１１．１４）
【出願人】（３０６０３７３１１）富士フイルム株式会社 (25,513)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年６月２５日（２００９．６．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１１月１４日（２００８．１１．１４）
【出願人】（３０６０３７３１１）富士フイルム株式会社 (25,513)
【Ｆターム（参考）】
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