核酸精製方法及び核酸精製器具
【課題】安全、且つ簡便な操作により、長鎖核酸と短鎖核酸を含む試料から長鎖核酸と短鎖核酸を分離し、精製すること。
【解決手段】核酸含有試料にカオトロピック剤を混合し、所定の孔径の通液孔を有する第１のシリカ含有固相に前記混合液を２回以上通液させ、次いで、前記第１のシリカ含有固相よりも小さい孔径の通液孔を有する第２のシリカ含有固相に前記混合液を２回以上通液させ、そして、前記第１及び第２のシリカ含有固相に結合した核酸をそれぞれ回収することにより、前記核酸含有試料より長鎖核酸と短鎖核酸を分離・精製する。
【解決手段】核酸含有試料にカオトロピック剤を混合し、所定の孔径の通液孔を有する第１のシリカ含有固相に前記混合液を２回以上通液させ、次いで、前記第１のシリカ含有固相よりも小さい孔径の通液孔を有する第２のシリカ含有固相に前記混合液を２回以上通液させ、そして、前記第１及び第２のシリカ含有固相に結合した核酸をそれぞれ回収することにより、前記核酸含有試料より長鎖核酸と短鎖核酸を分離・精製する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、長鎖核酸と短鎖核酸を含有する試料から、安全かつ簡便な操作により長鎖核酸と短鎖核酸を効率よく分離し、精製する技術に関する。本発明は、ゲノムDNAとトータルRNA（メッセンジャーRNA、リボソーマルRNA、トランスファーRNA等）、或いは、ゲノムDNAとプラスミドDNAを分離・精製する技術として利用できる。
【背景技術】
【０００２】
生物の遺伝子情報に関わる物質である核酸は、ゲノムDNA、プラスミドDNA、メッセンジャーRNA、リボソーマルRNA、トランスファーRNA等、機能の異なる様々な形態が存在する。
【０００３】
これら核酸の分析は、分子生物学的に極めて有用な情報を与えるものである。各種の核酸を分析する際においては、一般的に、複数種の核酸を含有する生物試料から、目的とする核酸を分離し、精製する前処理を行うことが望ましい。例えば、遺伝子発現解析を目的としてメッセンジャーRNAを分析する場合は、トータルRNAをメッセンジャーRNAの分析に対する阻害物質となり得るゲノムDNAから分離し、精製する。
【０００４】
生物材料からトータルRNAをゲノムDNAから分離して、精製する方法としては、一般にフェノール・クロロホルム抽出法が知られている（非特許文献１）。本方法は、（1）生物材料をチオシアン酸グアニジン溶液により溶解し、酸性緩衝溶液、フェノール溶液、クロロホルム溶液を順次添加、混合し、（2）遠心分離によりRNAを含む水相と、変性タンパク質と不溶化したDNAを含む有機溶媒相と水相の中間層に分離し、（3）RNAを含む水相にエタノールあるいはイソプロパノールを添加して、（4）不溶化したRNAを遠心分離により選択的に沈殿させる。この方法は従来の超遠心分離方法と比較すると、効率的にRNAを単離、精製できるが、有害性の強いフェノール、クロロホルムを使用しなければならないという問題がある。
【０００５】
フェノール、クロロホルム等を使用せず、且つ、エタノール沈殿、イソプロパノール沈殿等の操作を必要としない核酸の精製方法としては、カオトロピック剤の存在下における核酸とシリカ含有固相の結合特性を利用する方法（非特許文献２及び３）が知られている。後者の方法については、これを応用したRNAとDNAの分離、精製方法も報告されている（特許文献１〜５）が、RNAとDNAの分離は不十分であり、精製されるRNAには相当量のDNAが混在する。
【０００６】
【特許文献１】特開2004-340839号公報
【特許文献２】特開2002-187897号公報
【特許文献３】特表2000-505295号公報
【特許文献４】特表2002-534080号公報
【特許文献５】特開2004-201607号公報
【非特許文献１】Analytical Biochemistry, 162, 156-159 (1989)
【非特許文献２】B. Vogelstein and D. Gillespie, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76(2), 615−619 (1979)
【非特許文献３】R. Boom et al, J. Clin. Microbiol. 28(3), 495-503 (1990)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、長鎖核酸と短鎖核酸を含有する試料から、安全、且つ簡便な操作により長鎖核酸と短鎖核酸を効率よく分離し、精製することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは上記課題を解決するため鋭意検討した結果、長鎖核酸と短鎖核酸を含む試料とカオトロピック剤との混合液を、長鎖核酸との接触効率が高く、且つ短鎖核酸との接触効率が低い孔径の通液孔を有するシリカ含有固相に少なくとも２回以上通液することにより、長鎖核酸のみを効率的に結合させ、短鎖核酸と分離・精製し得ることを見出した。
【０００９】
すなわち本発明は、長鎖核酸と短鎖核酸を含有する試料にカオトロピック剤を混合し、
前記混合液を所定の孔径の通液孔を有する第１のシリカ含有固相に２回以上通液させ、次いで、前記第１のシリカ含有固相よりも小さい孔径の通液孔を有する第２のシリカ含有固相に前記混合液を２回以上通液させ、そして、前記第１及び第２のシリカ含有固相に結合した核酸をそれぞれ回収することを特徴とする核酸精製方法に関する。
【００１０】
前記方法において、第１及び第２のシリカ含有固相への通液は、いずれもシリカ含有固相に対して両方向から（例えば、上下両方向に）２回以上繰り返されることが好ましい。
【００１１】
本発明の方法において、第１のシリカ含有固相に結合する核酸は、20000個以上、好ましくは50000個以上のデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドから構成される長鎖核酸であり、第２のシリカ含有固相に結合する核酸は、10000個以下、好ましくは5000個以下のデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドから構成される短鎖核酸である。
【００１２】
この場合、第１のシリカ含有固相の通液孔の孔径は20〜25μmであることが好ましく、かつ第２のシリカ含有固相の通液孔の孔径は0.1〜10μmであることが好ましい。
【００１３】
ある実施形態において、前記第１のシリカ含有固相に結合する核酸はゲノムDNAであり、前記第２のシリカ含有固相に結合する核酸はRNAである。あるいは、前記第１のシリカ含有固相に結合する核酸はゲノムDNAであり、前記第２のシリカ含有固相に結合する核酸はプラスミドDNAである。これにより生物材料から効率よくトータルRNA、プラスミドDNAあるいはゲノムDNAだけを分離し、精製することができる。
【００１４】
本発明はまた、本発明の核酸精製方法に用いられる核酸精製器具を提供する。前記核酸精製器具は、核酸含有試料とカオトロピック剤の混合液を吸引及び吐出するための通液口と、シリカ含有固相を備え、混合液と核酸精製器具に隔てられる空間の圧力差によって混合液を前記通液口から吸引あるいは吐出して、前記シリカ含有固相で隔てられる一方の空間から他方の空間へと移動させることにより、前記シリカ含有固相に２回以上通液させることができる。
【００１５】
さらに本発明は、本発明の核酸精製器具、ならびにカオトロピック剤、有機溶媒、洗浄液、及び溶出液から選ばれる少なくとも１つ以上の試薬を含む、核酸精製のためのキットを提供する。
【００１６】
前記カオトロピック剤としては、例えば、チオシアン酸グアニジン、チオシアン酸ナトリウム、塩酸グアニジン、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウムが使用可能であり、前記有機溶媒としては、例えば、エタノールやジエチレングリコールジメチルエーテルが利用可能である。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、長鎖核酸と短鎖核酸を含む試料から、安全、且つ簡便な操作により長鎖核酸と短鎖核酸を効率よく分離し、精製することができる。これにより、例えば、ゲノムDNAとトータルRNA（メッセンジャーRNA、リボソーマルRNA、トランスファーRNA）、或いは、ゲノムDNAとプラスミドDNAを効率的に分離・精製することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下、本発明について詳述する。
本発明は、核酸をその鎖長に応じて（長鎖核酸と短鎖核酸に）効率よく分離し、精製する方法に関する。本発明では、まず精製対象である核酸含有試料をカオトロピック剤と混合し、その混合液を、長鎖核酸との接触効率が高く、且つ短鎖核酸との接触効率が低い孔径の通液孔を有する第１のシリカ含有固相に少なくとも２回以上通液し、長鎖核酸のみを効率的に第１のシリカ含有固相に結合させる。次いで、第１のシリカ含有固相を通過させた混合液を、短鎖核酸との接触効率が高い孔径の通液孔を有する第２のシリカ含有固相に少なくとも２回以上通液し、短鎖核酸を第２のシリカ含有固相に結合させる。こうして第１及び第２のシリカ含有固相に結合した核酸は、それぞれ溶出液で回収することにより、長鎖核酸と短鎖核酸に効率よく分離し、精製することができる。
【００１９】
本発明に適用される核酸含有試料は、鎖長の異なる２種以上の核酸（長鎖核酸と短鎖核酸）を含有する試料（特に、生物試料）であって、例えば、血液、生体組織、培養細胞、細菌等を挙げることができる。また、核酸とは、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドがホスホジエステル結合によって連結して構成される鎖状の高分子化合物、及びそれら化合物の水素結合等による複合体を意味し、２本鎖であっても１本鎖であってもよい。
【００２０】
本発明において、第１のシリカ含有固相に結合させる長鎖核酸としては、好ましくは20000個以上、より好ましくは50000個以上のデオキシリボヌクレオチド、又はリボヌクレオチドから構成される核酸であって、例えば、ゲノムDNA、ゲノムRNA、プラスミドDNA、又は、それらを断片化した核酸等を適用することができる。すなわち、ゲノムDNAであれば、好ましくは10kb以上、より好ましくは25kb以上のものを長鎖核酸として適応でき、ゲノムRNAであれば、好ましくは20kb、より好ましくは50kb以上のものを長鎖核酸として適応できる。
【００２１】
また、第２のシリカ含有固相に結合させる短鎖核酸としては、好ましくは10000個以下、より好ましくは5000個以下のデオキシリボヌクレオチド、又はリボヌクレオチドから構成される核酸であって、例えば、メッセンジャーRNA、リボソーマルRNA、トランスファーRNA、cDNA、プラスミドDNA、或いはPCRによる増幅DNA等を適用することができる。すなわち、2本鎖cDNAであれば、好ましくは5kb以下、より好ましくは2.5kb以下のものを短鎖核酸として適用でき、メッセンジャーRNAであれば、好ましくは10kb以下、より好ましくは5kb以下のものを短鎖核酸として適用できる。
【００２２】
核酸含有試料に添加するカオトロピック剤としては、チオシアン酸グアニジン、チオシアン酸ナトリウム、塩酸グアニジン、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウム等を使用できる。添加するカオトロピック剤の濃度は、有機溶媒を添加した後の混合液における濃度において、1.0〜4.0mol/lの範囲が好ましい（R. Boom et al., J. Clin. Microbiol. 28(3), 495-503 (1990)参照）。
【００２３】
なお、生物材料を試料とする場合は、カオトロピック剤に加えて、界面活性剤、タンパク質変性剤、タンパク質分解酵素等を添加し、さらに、混合液に対して攪拌機器、或いはホモジナイザー等による物理的処理等を施し、生物材料の溶解、及び核酸の遊離化を促進することが好ましい。
【００２４】
核酸含有試料とカオトロピック剤を含む混合液には、核酸とシリカ含有固相の結合を促進するために有機溶媒を添加することが好ましい。有機溶媒としては、脂肪族アルコール、脂肪族エーテル、脂肪族エステル、脂肪族ケトンの中から選ばれる化合物の1種又は2種以上を組み合わせたものを使用できる。
【００２５】
脂肪族アルコールとしては、メタノール、エタノール、2-プロパノール、2-ブタノール、ポリエチレングリコール等を使用できる。脂肪族エーテルとしては、ジエチレングリコールジメチルエーテル、ジエチレングリコールジエチルエーテル、エチレングリコールジメチルエーテル、エチレングリコールジエチルエーテル、プロピレングリコールジメチルエーテル、プロピレングリコールジエチルエーテル、テトラヒドロフラン等を使用できる。脂肪族エステルとしては、乳酸エチル、プロピレングリコールモノメチルエーテルアセテート等を使用できる。脂肪族ケトンとしては、アセトン、ヒドロキシアセトン、メチルケトン等を使用できる。特に、エタノールやジエチレングリコールジメチルエーテル等が好ましい。
【００２６】
本発明で用いられるシリカ含有固相は、ガラス粒子（微粒子）、シリカ粒子（微粒子）、ガラス繊維、シリカ繊維、ケイソウ土、又は、それら破砕物等の二酸化ケイ素を含有するシリカ系化合物からなり、通液可能なように、内部に複数の通液孔を有する。このような形態であれば、シリカ含有固相は、粒状物の集合体であっても、ディスク状であっても、線維状であってもその形態は限定されない。
【００２７】
第１のシリカ含有固相は、長鎖核酸との接触効率が高く、且つ短鎖核酸との接触効率が低いように、その通液孔の孔径を20〜25μmの範囲で有することが好ましい。該範囲よりも孔径が小さい場合は、短鎖核酸とシリカ含有固相の接触効率が増大し短鎖核酸が結合し、一方、該範囲よりも孔径が大きい場合は、長鎖核酸とシリカ含有固相の接触効率が低下し長鎖核酸の結合量が低下するからである。
【００２８】
第１のシリカ含有固相に対する混合液の通液回数は少なくとも２回以上であることが必要である。これは、１回のみではシリカ含有固相に対する長鎖核酸の結合効率が低く、長鎖核酸の十分な回収ができないからである。なお、第１のシリカ含有固相への通液回数を増加した場合、長鎖核酸の結合量は増加するが、短鎖核酸の結合量は殆ど増加しない。従って、第１のシリカ含有固相に混合液を２回以上通液することにより、長鎖核酸の結合量のみを増加させて、回収率を向上させることができる。
【００２９】
一方、第２のシリカ含有固相は、短鎖核酸との接触効率が高いように、0.1〜10μmの範囲で通液孔の孔径を有することが好ましい。シリカ含有固相に対する短鎖核酸の結合効率を向上させるためには、混合液のシリカ含有固相通液回数を増加し、通液孔径を目的とする核酸の大きさに適した範囲内でより小さくすることが好ましい。
【００３０】
前記した第１及び第２のシリカ含有固相は、各々別個のあるいは同一のチップ、シリンジ、又はカラム等の中空状の部材に固定される。前記部材は、混合液を吸入及び排出するための通液口と、中空内部を減圧及び加圧するための加減圧機器等を設置する接続口と、中空内部にシリカ含有固相を備える。この接続口に設置される加減圧機器により中空内部を減圧あるいは加圧させて、通液口から混合液を吸入あるいは排出し、混合液をシリカ含有固相で隔てられる一方の空間から他方の空間へと移動させることにより、シリカ含有固相に２回以上通液させることが可能なように設計される。
【００３１】
例えばシリカ含有固相を固定化したチップにおいては、接続口に接続したシリンジあるいはピペッターによりチップ内部を減圧して、混合液を吸引してシリカ含有固相に通液させ、次いでチップ内部を加圧して、混合液を排出してシリカ含有固相に通液させることを繰り返し、混合液をシリカ含有固相に２回以上通液させる。なお、加減圧機器を設置していない状態では、接続口から液体を投入することができ、液体を投入した後に加減圧機器を接続して、通液口から液体を排出することも可能である。
【００３２】
また、シリカ含有固相を固定化したシリンジにおいては、接続口に予め備えられているプランジャーによりチップ内部を減圧して、混合液を吸引してシリカ含有固相に通液させ、次いでチップ内部を加圧して、混合液を吐出してシリカ含有固相に通液させることを繰り返し、混合液をシリカ含有固相に２回以上通液させる。
【００３３】
同様の工程は、シリカ含有固相を固定化したスピンカラムにおいても実施することができる。例えば、シリカ含有固相を固定化したスピンカラムにおいては、公知のスピンカラム方式に準じて、シリカ含有固相により隔てられた一方の空間に混合液を投入し、遠心力により混合液を他方の空間へと移動させることで混合液をシリカ含有固相に通液させ、さらにこのシリカ含有固相を通過した混合液を再びスピンカラムにかける操作を繰り返すことで、混合液をシリカ含有固相に２回以上通液させる。
【００３４】
核酸を結合させた各シリカ含有固相は、当該シリカ含有固相に洗浄液を通液させることにより不純物を除去する。洗浄液は、シリカ含有固相と核酸の結合を維持し、且つ、シリカ含有固相に結合した不純物を除去し得るものであればよく、例えば、80%(v/v)エタノールを含む水溶液、又は80%(v/v)エタノールを含む低塩濃度の緩衝液を使用できる。
【００３５】
次いで、洗浄後のシリカ含有固相に溶出液を通液させることにより、各シリカ含有固相から結合した核酸を溶出させる。溶出液は、シリカ含有固相から核酸を溶離し得るものであればよく、例えば、ヌクレアーゼフリーの水、又はヌクレアーゼフリーの低塩濃度の緩衝液を使用できる。
【００３６】
本発明は、上記した核酸精製器具と、これを含む核酸精製のためのキットを提供する。キットには、核酸精製器具、ならびに上記したカオトロピック剤、有機溶媒、洗浄液、及び溶出液から選ばれる少なくとも１つ以上の試薬が含まれる。また、キットには、その包装あるいは添付文書に、上記した核酸精製方法（核酸精製器具の使用方法）や試薬の取扱い方法等が適宜表示される。
【実施例】
【００３７】
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００３８】
[A] 試料、試薬、及び器具
1.試料
1.1長鎖核酸
ゲノムDNA（ヒト血液からのQIAamp DNA Blood Mini Kit*による精製物）
*QIAamp DNA Blood Mini Kit (QIAGEN製：50kb（主として20-30kb）までのゲノムDNAが精製される)
1.2短鎖核酸
pBR322 DNA（鎖長：4361bp）（MBI Fermentas製）
1.3生物材料
ヒト血液（抗凝固剤EDTA-2Na添加）
【００３９】
2.試薬
2.1赤血球溶解液
155mM NH4Cl
10mM KHCO3
0.1mM EDTA・2Na
2.2カオトロピック溶液A
6M グアニジン塩酸塩
50mM MES
2.3カオトロピック溶液B
4M チオシアン酸グアニジン塩
25mM クエン酸ナトリウム (pH 7.5)
1% βメルカプトエタノール
2.4有機溶媒A
エタノール
2.5有機溶媒B
40%(v/v)ジエチレングリコールジメチルエーテル水溶液
2.6洗浄液
80%(v/v)エタノール水溶液
2.7溶出液A
TE（pH 8.0）（和光純薬製）
2.8溶出液B
ヌクレアーゼフリーH2O（和光純薬製）
【００４０】
3.長鎖核酸精製器具
3.1シリカ含有固相
ガラス繊維紙（Standard14）（孔径：約23μm）（Whatman社製）
3.2シリカ含有固相保持部材
ポリプロピレン粒子焼結板（孔径：約100μm）（厚さ1.5mm）
3.3精製器具
図1に、長鎖精製器具の構成例を示す。核酸精製器具10は、分注用チップのような外形であり、混合液を吸入及び排出するための通液口12と、チップ内部を減圧及び加圧するための加減圧機器等を接続する接続口11を備え、その内部にシリカ含有固相13を保有する。シリカ含有固相の両側には、円状のシリカ含有固相保持部材14が配置されている。これらのシリカ含有固相保持部材も液体及び気体の流通が自由な多数の小孔が形成されている。本器具は、通液口の先端部を液体に接続させた状態において、接続口に設置した加減圧機器により中空内部を減圧あるいは加圧することにより、通液口から液体を吸引あるいは排出し、シリカ含有固相に液体を通液させることができる。また、加減圧機器を設置していない状態では、接続口から液体を投入することができ、液体を投入した後に加減圧機器を接続して、通液口から液体を排出することも可能である。本実施例では直径4.2mmの円状に切り抜いたシリカ含有固相1枚を、直径4.1mmのシリカ含有固相保持部材2枚で挟んだ状態で、内径4mmの中空チップ内部に圧入したものを使用した。
【００４１】
4.短鎖核酸精製器具
4.1シリカ含有固相
ガラス繊維紙（GF/D）（孔径：約2.7μm）（Whatman社製）
4.2シリカ含有固相保持部材
ポリプロピレン粒子焼結板（孔径：約100μm）（厚さ1.5mm）
4.3 精製器具
長鎖核酸精製器具と同様の構造を有する。
【００４２】
[B] 核酸精製方法
1.核酸溶液からの核酸精製方法
(1) 核酸試料1μgを含むTE溶液10μlを調製する。
(2) カオトロピック溶液A 0.3mlを添加し、混合する。
(3) 有機溶媒A 0.3mlを添加し、混合する。
(4) 核酸精製器具の接続口にシリンジを装着して、核酸精製器具の通液口から混合液を所定回数、吸引・吐出する。但し、通液回数を1回とする場合は、シリンジを装着する前に、接続口から混合液を投入し、通液口から吐出することとする。
(5) 核酸精製器具の通液口から洗浄液1mlを1回、吸引・吐出する。
(6) (5)を3回繰り返し、洗浄液を完全に吐出する。
(7) 核酸精製器具の通液口から溶出液A0.05mlを10回、吸引・吐出する
(8) 溶出液を核酸精製溶液として回収する。
【００４３】
2.血液からの核酸精製方法
(1) 全血0.6mlに赤血球溶解液3mlを添加し混合する。
(2) 氷上で5分間インキュベートする。
(3) 400×gで10分間の遠心分離を行う。
(4) 上清を除去する。
(5) 赤血球溶解液1.2mlをペレットに添加し混合する。
(6) 400×gで10分間の遠心分離を行う。
(7) 上清を除去して白血球のペレットを得る。
(8) カオトロピック溶液B 0.3mlを白血球ペレットに添加し混合する。
(9) 混合液をホモジナイザー（QIA shredder homogenizer）（QAIGEN製）で均一化する。
(10) 有機溶媒B0.3mlを添加し混合する。
(11) 長鎖核酸精製器具の接続口にシリンジを装着して、核酸精製器具の通液口から混合液を3回、吸引・吐出する。
(12) 核酸精製器具の通液口から洗浄液1mlを1回、吸引・吐出する。
(13) (12)を3回繰り返し、洗浄液を完全に吐出する。
(14) 核酸精製器具の通液口から溶出液A 0.2mlを10回、吸引・吐出する。
(15) 溶出液を長鎖核酸精製溶液として回収する。
(16) 短鎖核酸精製器具の接続口にシリンジを装着して、核酸精製器具の通液口から(11)で吐出した混合液を10回、吸引・吐出する。
(17) 核酸精製器具の通液口から洗浄液1mlを1回、吸引・吐出する。
(18) (17)を3回繰り返し、洗浄液を完全に吐出する。
(19) 核酸精製器具の通液口から溶出液B 0.05mlを10回、吸引・吐出する。
(20) 溶出液を短鎖核酸精製溶液として回収する。
【００４４】
[C] 精製核酸の評価方法
1.核酸濃度定量
核酸溶液を適量に希釈して、分光光度計（GeneSpec I）（日立那珂インスツルメンツ製）により260nmの吸光度を測定し、50μｇ/ml のDNA溶液の260nmの吸光度を1としてDNAの濃度を算出した。
【００４５】
2.核酸電気泳動
ホルムアミドによる変性処理を行った核酸溶液を1.25%アガロースゲル（Reliant RNA Gel System）（FMC製）により電気泳動（10V/ｃm、40分間）を行った。電気泳動後のアガロースゲルはエチジウムブロマイドにより染色し、UV照射下において写真撮影した。
【００４６】
[D] 検証実験１
長鎖核酸試料としてゲノムDNA、短鎖核酸試料としてpBR322 DNAを使用し、上記した核酸溶液からの核酸精製方法に従って、長鎖核酸精製器具、及び短鎖核酸精製器具により核酸精製を行った。なお、結合工程における通液方法は、核酸精製器具の開口部から投入して通液口から吐出する一方向１回、及び通液口からの吸引・吐出１、５、１０回とした。
【００４７】
以下の表に核酸精製器具、核酸試料、及び通液回数の各組み合わせにおける核酸回収率を示す。また、図2に核酸精製器具と核酸試料の各組み合わせにおける通液方法と核酸回収率の関係を示す。なお、核酸回収効率は投入核酸量に対する精製核酸量の百分率とする。
【００４８】
【表１】
【００４９】
長鎖核酸精製器具において、長鎖核酸の回収率は通液回数に伴って増大したが、短鎖核酸の回収率は通液回数に依らず極めて低かった。一方、短鎖核酸精製器具においては、長鎖核酸、短鎖核酸ともに通液回数に伴って増大した。
【００５０】
この結果は、長鎖核酸精製器具が長鎖核酸のみを選択的に結合させ、且つ、短鎖核酸を結合させないことを示す。そして、短鎖核酸精製器具を用いることにより、長鎖核酸精製器具に結合しない短鎖核酸を結合させることができ、長鎖核酸と短鎖核酸を効率よく分離し、精製可能であることを示す。
【００５１】
[E] 検証実験２
生物試料としてヒト血液を使用し、血液からの核酸精製方法に従って、長鎖核酸精製器具、及び短鎖核酸精製器具により核酸精製を行った。
【００５２】
図3に、長鎖核酸精製器具により精製した核酸と、短鎖核酸精製器具により精製した核酸の電気泳動結果を示す。長鎖核酸精製器具により精製した核酸は、主にゲノムDNA（Genomic DNA）を含み、RNAを殆ど含まない。一方、短鎖核酸精製器具により精製した核酸は、約5000bのリボソーマルRNA（28S rRNA）と約1900bのリボソーマルRNA（18S rRNA）、及びメッセンジャーRNAを主に含み、ゲノムDNAを殆ど含まない。
【００５３】
この結果は、ゲノムDNAとトータルRNAを含む生物試料から、長鎖核酸精製器具と短鎖核酸精製器具を使用することにより、ゲノムDNAとトータルRNAを効率的に分離し、精製可能であることを示す。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】図１は、核酸精製器具の概略図である。
【図２】図２は、核酸精製器具と核酸試料の各組み合わせにおける通液回数と核酸回収率の関係を示す。
【図３】図３は、長鎖核酸精製器具と短鎖核酸精製器具により精製した核酸の電気泳動結果を示す。
【符号の説明】
【００５５】
10…核酸精製器具
11…接続口
12…通液口
13…シリカ含有固相
14…シリカ含有固相保持部材
【技術分野】
【０００１】
本発明は、長鎖核酸と短鎖核酸を含有する試料から、安全かつ簡便な操作により長鎖核酸と短鎖核酸を効率よく分離し、精製する技術に関する。本発明は、ゲノムDNAとトータルRNA（メッセンジャーRNA、リボソーマルRNA、トランスファーRNA等）、或いは、ゲノムDNAとプラスミドDNAを分離・精製する技術として利用できる。
【背景技術】
【０００２】
生物の遺伝子情報に関わる物質である核酸は、ゲノムDNA、プラスミドDNA、メッセンジャーRNA、リボソーマルRNA、トランスファーRNA等、機能の異なる様々な形態が存在する。
【０００３】
これら核酸の分析は、分子生物学的に極めて有用な情報を与えるものである。各種の核酸を分析する際においては、一般的に、複数種の核酸を含有する生物試料から、目的とする核酸を分離し、精製する前処理を行うことが望ましい。例えば、遺伝子発現解析を目的としてメッセンジャーRNAを分析する場合は、トータルRNAをメッセンジャーRNAの分析に対する阻害物質となり得るゲノムDNAから分離し、精製する。
【０００４】
生物材料からトータルRNAをゲノムDNAから分離して、精製する方法としては、一般にフェノール・クロロホルム抽出法が知られている（非特許文献１）。本方法は、（1）生物材料をチオシアン酸グアニジン溶液により溶解し、酸性緩衝溶液、フェノール溶液、クロロホルム溶液を順次添加、混合し、（2）遠心分離によりRNAを含む水相と、変性タンパク質と不溶化したDNAを含む有機溶媒相と水相の中間層に分離し、（3）RNAを含む水相にエタノールあるいはイソプロパノールを添加して、（4）不溶化したRNAを遠心分離により選択的に沈殿させる。この方法は従来の超遠心分離方法と比較すると、効率的にRNAを単離、精製できるが、有害性の強いフェノール、クロロホルムを使用しなければならないという問題がある。
【０００５】
フェノール、クロロホルム等を使用せず、且つ、エタノール沈殿、イソプロパノール沈殿等の操作を必要としない核酸の精製方法としては、カオトロピック剤の存在下における核酸とシリカ含有固相の結合特性を利用する方法（非特許文献２及び３）が知られている。後者の方法については、これを応用したRNAとDNAの分離、精製方法も報告されている（特許文献１〜５）が、RNAとDNAの分離は不十分であり、精製されるRNAには相当量のDNAが混在する。
【０００６】
【特許文献１】特開2004-340839号公報
【特許文献２】特開2002-187897号公報
【特許文献３】特表2000-505295号公報
【特許文献４】特表2002-534080号公報
【特許文献５】特開2004-201607号公報
【非特許文献１】Analytical Biochemistry, 162, 156-159 (1989)
【非特許文献２】B. Vogelstein and D. Gillespie, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76(2), 615−619 (1979)
【非特許文献３】R. Boom et al, J. Clin. Microbiol. 28(3), 495-503 (1990)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、長鎖核酸と短鎖核酸を含有する試料から、安全、且つ簡便な操作により長鎖核酸と短鎖核酸を効率よく分離し、精製することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは上記課題を解決するため鋭意検討した結果、長鎖核酸と短鎖核酸を含む試料とカオトロピック剤との混合液を、長鎖核酸との接触効率が高く、且つ短鎖核酸との接触効率が低い孔径の通液孔を有するシリカ含有固相に少なくとも２回以上通液することにより、長鎖核酸のみを効率的に結合させ、短鎖核酸と分離・精製し得ることを見出した。
【０００９】
すなわち本発明は、長鎖核酸と短鎖核酸を含有する試料にカオトロピック剤を混合し、
前記混合液を所定の孔径の通液孔を有する第１のシリカ含有固相に２回以上通液させ、次いで、前記第１のシリカ含有固相よりも小さい孔径の通液孔を有する第２のシリカ含有固相に前記混合液を２回以上通液させ、そして、前記第１及び第２のシリカ含有固相に結合した核酸をそれぞれ回収することを特徴とする核酸精製方法に関する。
【００１０】
前記方法において、第１及び第２のシリカ含有固相への通液は、いずれもシリカ含有固相に対して両方向から（例えば、上下両方向に）２回以上繰り返されることが好ましい。
【００１１】
本発明の方法において、第１のシリカ含有固相に結合する核酸は、20000個以上、好ましくは50000個以上のデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドから構成される長鎖核酸であり、第２のシリカ含有固相に結合する核酸は、10000個以下、好ましくは5000個以下のデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドから構成される短鎖核酸である。
【００１２】
この場合、第１のシリカ含有固相の通液孔の孔径は20〜25μmであることが好ましく、かつ第２のシリカ含有固相の通液孔の孔径は0.1〜10μmであることが好ましい。
【００１３】
ある実施形態において、前記第１のシリカ含有固相に結合する核酸はゲノムDNAであり、前記第２のシリカ含有固相に結合する核酸はRNAである。あるいは、前記第１のシリカ含有固相に結合する核酸はゲノムDNAであり、前記第２のシリカ含有固相に結合する核酸はプラスミドDNAである。これにより生物材料から効率よくトータルRNA、プラスミドDNAあるいはゲノムDNAだけを分離し、精製することができる。
【００１４】
本発明はまた、本発明の核酸精製方法に用いられる核酸精製器具を提供する。前記核酸精製器具は、核酸含有試料とカオトロピック剤の混合液を吸引及び吐出するための通液口と、シリカ含有固相を備え、混合液と核酸精製器具に隔てられる空間の圧力差によって混合液を前記通液口から吸引あるいは吐出して、前記シリカ含有固相で隔てられる一方の空間から他方の空間へと移動させることにより、前記シリカ含有固相に２回以上通液させることができる。
【００１５】
さらに本発明は、本発明の核酸精製器具、ならびにカオトロピック剤、有機溶媒、洗浄液、及び溶出液から選ばれる少なくとも１つ以上の試薬を含む、核酸精製のためのキットを提供する。
【００１６】
前記カオトロピック剤としては、例えば、チオシアン酸グアニジン、チオシアン酸ナトリウム、塩酸グアニジン、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウムが使用可能であり、前記有機溶媒としては、例えば、エタノールやジエチレングリコールジメチルエーテルが利用可能である。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、長鎖核酸と短鎖核酸を含む試料から、安全、且つ簡便な操作により長鎖核酸と短鎖核酸を効率よく分離し、精製することができる。これにより、例えば、ゲノムDNAとトータルRNA（メッセンジャーRNA、リボソーマルRNA、トランスファーRNA）、或いは、ゲノムDNAとプラスミドDNAを効率的に分離・精製することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下、本発明について詳述する。
本発明は、核酸をその鎖長に応じて（長鎖核酸と短鎖核酸に）効率よく分離し、精製する方法に関する。本発明では、まず精製対象である核酸含有試料をカオトロピック剤と混合し、その混合液を、長鎖核酸との接触効率が高く、且つ短鎖核酸との接触効率が低い孔径の通液孔を有する第１のシリカ含有固相に少なくとも２回以上通液し、長鎖核酸のみを効率的に第１のシリカ含有固相に結合させる。次いで、第１のシリカ含有固相を通過させた混合液を、短鎖核酸との接触効率が高い孔径の通液孔を有する第２のシリカ含有固相に少なくとも２回以上通液し、短鎖核酸を第２のシリカ含有固相に結合させる。こうして第１及び第２のシリカ含有固相に結合した核酸は、それぞれ溶出液で回収することにより、長鎖核酸と短鎖核酸に効率よく分離し、精製することができる。
【００１９】
本発明に適用される核酸含有試料は、鎖長の異なる２種以上の核酸（長鎖核酸と短鎖核酸）を含有する試料（特に、生物試料）であって、例えば、血液、生体組織、培養細胞、細菌等を挙げることができる。また、核酸とは、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドがホスホジエステル結合によって連結して構成される鎖状の高分子化合物、及びそれら化合物の水素結合等による複合体を意味し、２本鎖であっても１本鎖であってもよい。
【００２０】
本発明において、第１のシリカ含有固相に結合させる長鎖核酸としては、好ましくは20000個以上、より好ましくは50000個以上のデオキシリボヌクレオチド、又はリボヌクレオチドから構成される核酸であって、例えば、ゲノムDNA、ゲノムRNA、プラスミドDNA、又は、それらを断片化した核酸等を適用することができる。すなわち、ゲノムDNAであれば、好ましくは10kb以上、より好ましくは25kb以上のものを長鎖核酸として適応でき、ゲノムRNAであれば、好ましくは20kb、より好ましくは50kb以上のものを長鎖核酸として適応できる。
【００２１】
また、第２のシリカ含有固相に結合させる短鎖核酸としては、好ましくは10000個以下、より好ましくは5000個以下のデオキシリボヌクレオチド、又はリボヌクレオチドから構成される核酸であって、例えば、メッセンジャーRNA、リボソーマルRNA、トランスファーRNA、cDNA、プラスミドDNA、或いはPCRによる増幅DNA等を適用することができる。すなわち、2本鎖cDNAであれば、好ましくは5kb以下、より好ましくは2.5kb以下のものを短鎖核酸として適用でき、メッセンジャーRNAであれば、好ましくは10kb以下、より好ましくは5kb以下のものを短鎖核酸として適用できる。
【００２２】
核酸含有試料に添加するカオトロピック剤としては、チオシアン酸グアニジン、チオシアン酸ナトリウム、塩酸グアニジン、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウム等を使用できる。添加するカオトロピック剤の濃度は、有機溶媒を添加した後の混合液における濃度において、1.0〜4.0mol/lの範囲が好ましい（R. Boom et al., J. Clin. Microbiol. 28(3), 495-503 (1990)参照）。
【００２３】
なお、生物材料を試料とする場合は、カオトロピック剤に加えて、界面活性剤、タンパク質変性剤、タンパク質分解酵素等を添加し、さらに、混合液に対して攪拌機器、或いはホモジナイザー等による物理的処理等を施し、生物材料の溶解、及び核酸の遊離化を促進することが好ましい。
【００２４】
核酸含有試料とカオトロピック剤を含む混合液には、核酸とシリカ含有固相の結合を促進するために有機溶媒を添加することが好ましい。有機溶媒としては、脂肪族アルコール、脂肪族エーテル、脂肪族エステル、脂肪族ケトンの中から選ばれる化合物の1種又は2種以上を組み合わせたものを使用できる。
【００２５】
脂肪族アルコールとしては、メタノール、エタノール、2-プロパノール、2-ブタノール、ポリエチレングリコール等を使用できる。脂肪族エーテルとしては、ジエチレングリコールジメチルエーテル、ジエチレングリコールジエチルエーテル、エチレングリコールジメチルエーテル、エチレングリコールジエチルエーテル、プロピレングリコールジメチルエーテル、プロピレングリコールジエチルエーテル、テトラヒドロフラン等を使用できる。脂肪族エステルとしては、乳酸エチル、プロピレングリコールモノメチルエーテルアセテート等を使用できる。脂肪族ケトンとしては、アセトン、ヒドロキシアセトン、メチルケトン等を使用できる。特に、エタノールやジエチレングリコールジメチルエーテル等が好ましい。
【００２６】
本発明で用いられるシリカ含有固相は、ガラス粒子（微粒子）、シリカ粒子（微粒子）、ガラス繊維、シリカ繊維、ケイソウ土、又は、それら破砕物等の二酸化ケイ素を含有するシリカ系化合物からなり、通液可能なように、内部に複数の通液孔を有する。このような形態であれば、シリカ含有固相は、粒状物の集合体であっても、ディスク状であっても、線維状であってもその形態は限定されない。
【００２７】
第１のシリカ含有固相は、長鎖核酸との接触効率が高く、且つ短鎖核酸との接触効率が低いように、その通液孔の孔径を20〜25μmの範囲で有することが好ましい。該範囲よりも孔径が小さい場合は、短鎖核酸とシリカ含有固相の接触効率が増大し短鎖核酸が結合し、一方、該範囲よりも孔径が大きい場合は、長鎖核酸とシリカ含有固相の接触効率が低下し長鎖核酸の結合量が低下するからである。
【００２８】
第１のシリカ含有固相に対する混合液の通液回数は少なくとも２回以上であることが必要である。これは、１回のみではシリカ含有固相に対する長鎖核酸の結合効率が低く、長鎖核酸の十分な回収ができないからである。なお、第１のシリカ含有固相への通液回数を増加した場合、長鎖核酸の結合量は増加するが、短鎖核酸の結合量は殆ど増加しない。従って、第１のシリカ含有固相に混合液を２回以上通液することにより、長鎖核酸の結合量のみを増加させて、回収率を向上させることができる。
【００２９】
一方、第２のシリカ含有固相は、短鎖核酸との接触効率が高いように、0.1〜10μmの範囲で通液孔の孔径を有することが好ましい。シリカ含有固相に対する短鎖核酸の結合効率を向上させるためには、混合液のシリカ含有固相通液回数を増加し、通液孔径を目的とする核酸の大きさに適した範囲内でより小さくすることが好ましい。
【００３０】
前記した第１及び第２のシリカ含有固相は、各々別個のあるいは同一のチップ、シリンジ、又はカラム等の中空状の部材に固定される。前記部材は、混合液を吸入及び排出するための通液口と、中空内部を減圧及び加圧するための加減圧機器等を設置する接続口と、中空内部にシリカ含有固相を備える。この接続口に設置される加減圧機器により中空内部を減圧あるいは加圧させて、通液口から混合液を吸入あるいは排出し、混合液をシリカ含有固相で隔てられる一方の空間から他方の空間へと移動させることにより、シリカ含有固相に２回以上通液させることが可能なように設計される。
【００３１】
例えばシリカ含有固相を固定化したチップにおいては、接続口に接続したシリンジあるいはピペッターによりチップ内部を減圧して、混合液を吸引してシリカ含有固相に通液させ、次いでチップ内部を加圧して、混合液を排出してシリカ含有固相に通液させることを繰り返し、混合液をシリカ含有固相に２回以上通液させる。なお、加減圧機器を設置していない状態では、接続口から液体を投入することができ、液体を投入した後に加減圧機器を接続して、通液口から液体を排出することも可能である。
【００３２】
また、シリカ含有固相を固定化したシリンジにおいては、接続口に予め備えられているプランジャーによりチップ内部を減圧して、混合液を吸引してシリカ含有固相に通液させ、次いでチップ内部を加圧して、混合液を吐出してシリカ含有固相に通液させることを繰り返し、混合液をシリカ含有固相に２回以上通液させる。
【００３３】
同様の工程は、シリカ含有固相を固定化したスピンカラムにおいても実施することができる。例えば、シリカ含有固相を固定化したスピンカラムにおいては、公知のスピンカラム方式に準じて、シリカ含有固相により隔てられた一方の空間に混合液を投入し、遠心力により混合液を他方の空間へと移動させることで混合液をシリカ含有固相に通液させ、さらにこのシリカ含有固相を通過した混合液を再びスピンカラムにかける操作を繰り返すことで、混合液をシリカ含有固相に２回以上通液させる。
【００３４】
核酸を結合させた各シリカ含有固相は、当該シリカ含有固相に洗浄液を通液させることにより不純物を除去する。洗浄液は、シリカ含有固相と核酸の結合を維持し、且つ、シリカ含有固相に結合した不純物を除去し得るものであればよく、例えば、80%(v/v)エタノールを含む水溶液、又は80%(v/v)エタノールを含む低塩濃度の緩衝液を使用できる。
【００３５】
次いで、洗浄後のシリカ含有固相に溶出液を通液させることにより、各シリカ含有固相から結合した核酸を溶出させる。溶出液は、シリカ含有固相から核酸を溶離し得るものであればよく、例えば、ヌクレアーゼフリーの水、又はヌクレアーゼフリーの低塩濃度の緩衝液を使用できる。
【００３６】
本発明は、上記した核酸精製器具と、これを含む核酸精製のためのキットを提供する。キットには、核酸精製器具、ならびに上記したカオトロピック剤、有機溶媒、洗浄液、及び溶出液から選ばれる少なくとも１つ以上の試薬が含まれる。また、キットには、その包装あるいは添付文書に、上記した核酸精製方法（核酸精製器具の使用方法）や試薬の取扱い方法等が適宜表示される。
【実施例】
【００３７】
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００３８】
[A] 試料、試薬、及び器具
1.試料
1.1長鎖核酸
ゲノムDNA（ヒト血液からのQIAamp DNA Blood Mini Kit*による精製物）
*QIAamp DNA Blood Mini Kit (QIAGEN製：50kb（主として20-30kb）までのゲノムDNAが精製される)
1.2短鎖核酸
pBR322 DNA（鎖長：4361bp）（MBI Fermentas製）
1.3生物材料
ヒト血液（抗凝固剤EDTA-2Na添加）
【００３９】
2.試薬
2.1赤血球溶解液
155mM NH4Cl
10mM KHCO3
0.1mM EDTA・2Na
2.2カオトロピック溶液A
6M グアニジン塩酸塩
50mM MES
2.3カオトロピック溶液B
4M チオシアン酸グアニジン塩
25mM クエン酸ナトリウム (pH 7.5)
1% βメルカプトエタノール
2.4有機溶媒A
エタノール
2.5有機溶媒B
40%(v/v)ジエチレングリコールジメチルエーテル水溶液
2.6洗浄液
80%(v/v)エタノール水溶液
2.7溶出液A
TE（pH 8.0）（和光純薬製）
2.8溶出液B
ヌクレアーゼフリーH2O（和光純薬製）
【００４０】
3.長鎖核酸精製器具
3.1シリカ含有固相
ガラス繊維紙（Standard14）（孔径：約23μm）（Whatman社製）
3.2シリカ含有固相保持部材
ポリプロピレン粒子焼結板（孔径：約100μm）（厚さ1.5mm）
3.3精製器具
図1に、長鎖精製器具の構成例を示す。核酸精製器具10は、分注用チップのような外形であり、混合液を吸入及び排出するための通液口12と、チップ内部を減圧及び加圧するための加減圧機器等を接続する接続口11を備え、その内部にシリカ含有固相13を保有する。シリカ含有固相の両側には、円状のシリカ含有固相保持部材14が配置されている。これらのシリカ含有固相保持部材も液体及び気体の流通が自由な多数の小孔が形成されている。本器具は、通液口の先端部を液体に接続させた状態において、接続口に設置した加減圧機器により中空内部を減圧あるいは加圧することにより、通液口から液体を吸引あるいは排出し、シリカ含有固相に液体を通液させることができる。また、加減圧機器を設置していない状態では、接続口から液体を投入することができ、液体を投入した後に加減圧機器を接続して、通液口から液体を排出することも可能である。本実施例では直径4.2mmの円状に切り抜いたシリカ含有固相1枚を、直径4.1mmのシリカ含有固相保持部材2枚で挟んだ状態で、内径4mmの中空チップ内部に圧入したものを使用した。
【００４１】
4.短鎖核酸精製器具
4.1シリカ含有固相
ガラス繊維紙（GF/D）（孔径：約2.7μm）（Whatman社製）
4.2シリカ含有固相保持部材
ポリプロピレン粒子焼結板（孔径：約100μm）（厚さ1.5mm）
4.3 精製器具
長鎖核酸精製器具と同様の構造を有する。
【００４２】
[B] 核酸精製方法
1.核酸溶液からの核酸精製方法
(1) 核酸試料1μgを含むTE溶液10μlを調製する。
(2) カオトロピック溶液A 0.3mlを添加し、混合する。
(3) 有機溶媒A 0.3mlを添加し、混合する。
(4) 核酸精製器具の接続口にシリンジを装着して、核酸精製器具の通液口から混合液を所定回数、吸引・吐出する。但し、通液回数を1回とする場合は、シリンジを装着する前に、接続口から混合液を投入し、通液口から吐出することとする。
(5) 核酸精製器具の通液口から洗浄液1mlを1回、吸引・吐出する。
(6) (5)を3回繰り返し、洗浄液を完全に吐出する。
(7) 核酸精製器具の通液口から溶出液A0.05mlを10回、吸引・吐出する
(8) 溶出液を核酸精製溶液として回収する。
【００４３】
2.血液からの核酸精製方法
(1) 全血0.6mlに赤血球溶解液3mlを添加し混合する。
(2) 氷上で5分間インキュベートする。
(3) 400×gで10分間の遠心分離を行う。
(4) 上清を除去する。
(5) 赤血球溶解液1.2mlをペレットに添加し混合する。
(6) 400×gで10分間の遠心分離を行う。
(7) 上清を除去して白血球のペレットを得る。
(8) カオトロピック溶液B 0.3mlを白血球ペレットに添加し混合する。
(9) 混合液をホモジナイザー（QIA shredder homogenizer）（QAIGEN製）で均一化する。
(10) 有機溶媒B0.3mlを添加し混合する。
(11) 長鎖核酸精製器具の接続口にシリンジを装着して、核酸精製器具の通液口から混合液を3回、吸引・吐出する。
(12) 核酸精製器具の通液口から洗浄液1mlを1回、吸引・吐出する。
(13) (12)を3回繰り返し、洗浄液を完全に吐出する。
(14) 核酸精製器具の通液口から溶出液A 0.2mlを10回、吸引・吐出する。
(15) 溶出液を長鎖核酸精製溶液として回収する。
(16) 短鎖核酸精製器具の接続口にシリンジを装着して、核酸精製器具の通液口から(11)で吐出した混合液を10回、吸引・吐出する。
(17) 核酸精製器具の通液口から洗浄液1mlを1回、吸引・吐出する。
(18) (17)を3回繰り返し、洗浄液を完全に吐出する。
(19) 核酸精製器具の通液口から溶出液B 0.05mlを10回、吸引・吐出する。
(20) 溶出液を短鎖核酸精製溶液として回収する。
【００４４】
[C] 精製核酸の評価方法
1.核酸濃度定量
核酸溶液を適量に希釈して、分光光度計（GeneSpec I）（日立那珂インスツルメンツ製）により260nmの吸光度を測定し、50μｇ/ml のDNA溶液の260nmの吸光度を1としてDNAの濃度を算出した。
【００４５】
2.核酸電気泳動
ホルムアミドによる変性処理を行った核酸溶液を1.25%アガロースゲル（Reliant RNA Gel System）（FMC製）により電気泳動（10V/ｃm、40分間）を行った。電気泳動後のアガロースゲルはエチジウムブロマイドにより染色し、UV照射下において写真撮影した。
【００４６】
[D] 検証実験１
長鎖核酸試料としてゲノムDNA、短鎖核酸試料としてpBR322 DNAを使用し、上記した核酸溶液からの核酸精製方法に従って、長鎖核酸精製器具、及び短鎖核酸精製器具により核酸精製を行った。なお、結合工程における通液方法は、核酸精製器具の開口部から投入して通液口から吐出する一方向１回、及び通液口からの吸引・吐出１、５、１０回とした。
【００４７】
以下の表に核酸精製器具、核酸試料、及び通液回数の各組み合わせにおける核酸回収率を示す。また、図2に核酸精製器具と核酸試料の各組み合わせにおける通液方法と核酸回収率の関係を示す。なお、核酸回収効率は投入核酸量に対する精製核酸量の百分率とする。
【００４８】
【表１】
【００４９】
長鎖核酸精製器具において、長鎖核酸の回収率は通液回数に伴って増大したが、短鎖核酸の回収率は通液回数に依らず極めて低かった。一方、短鎖核酸精製器具においては、長鎖核酸、短鎖核酸ともに通液回数に伴って増大した。
【００５０】
この結果は、長鎖核酸精製器具が長鎖核酸のみを選択的に結合させ、且つ、短鎖核酸を結合させないことを示す。そして、短鎖核酸精製器具を用いることにより、長鎖核酸精製器具に結合しない短鎖核酸を結合させることができ、長鎖核酸と短鎖核酸を効率よく分離し、精製可能であることを示す。
【００５１】
[E] 検証実験２
生物試料としてヒト血液を使用し、血液からの核酸精製方法に従って、長鎖核酸精製器具、及び短鎖核酸精製器具により核酸精製を行った。
【００５２】
図3に、長鎖核酸精製器具により精製した核酸と、短鎖核酸精製器具により精製した核酸の電気泳動結果を示す。長鎖核酸精製器具により精製した核酸は、主にゲノムDNA（Genomic DNA）を含み、RNAを殆ど含まない。一方、短鎖核酸精製器具により精製した核酸は、約5000bのリボソーマルRNA（28S rRNA）と約1900bのリボソーマルRNA（18S rRNA）、及びメッセンジャーRNAを主に含み、ゲノムDNAを殆ど含まない。
【００５３】
この結果は、ゲノムDNAとトータルRNAを含む生物試料から、長鎖核酸精製器具と短鎖核酸精製器具を使用することにより、ゲノムDNAとトータルRNAを効率的に分離し、精製可能であることを示す。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】図１は、核酸精製器具の概略図である。
【図２】図２は、核酸精製器具と核酸試料の各組み合わせにおける通液回数と核酸回収率の関係を示す。
【図３】図３は、長鎖核酸精製器具と短鎖核酸精製器具により精製した核酸の電気泳動結果を示す。
【符号の説明】
【００５５】
10…核酸精製器具
11…接続口
12…通液口
13…シリカ含有固相
14…シリカ含有固相保持部材
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸精製方法であって：
核酸含有試料にカオトロピック剤を混合し、
前記混合液を所定の孔径の通液孔を有する第１のシリカ含有固相に２回以上通液させ、 次いで、前記第１のシリカ含有固相よりも小さい孔径の通液孔を有する第２のシリカ含有固相に前記混合液を２回以上通液させ、そして
前記第１及び第２のシリカ含有固相に結合した核酸をそれぞれ回収することを特徴とする前記方法。
【請求項２】
前記第１及び第２のシリカ含有固相への通液は、いずれもシリカ含有固相に対して両方向から２回以上繰り返されるものである、請求項１に記載の核酸精製方法。
【請求項３】
前記第１のシリカ含有固相の通液孔の孔径が20〜25μmであり、かつ前記第２のシリカ含有固相の通液孔の孔径が0.1〜10μmである、請求項１又は２に記載の核酸精製方法。
【請求項４】
前記第１のシリカ含有固相に結合する核酸が20000個以上のデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドから構成される核酸であり、前記第２のシリカ含有固相に結合する核酸が10000個以下のデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドから構成される核酸である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の核酸精製方法。
【請求項５】
前記第１のシリカ含有固相に結合する核酸が、50000個以上のデオキシリボヌクレオチド、又はリボヌクレオチドから構成される核酸である、請求項４に記載の核酸精製方法。
【請求項６】
前記第２のシリカ含有固相に結合する核酸が、5000個以下のデオキシリボヌクレオチド、又はリボヌクレオチドから構成される核酸である、請求項４又は５に記載の核酸精製方法。
【請求項７】
前記第１のシリカ含有固相に結合する核酸がゲノムDNAであり、前記第２のシリカ含有固相に結合する核酸がRNAである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の核酸精製方法。
【請求項８】
前記第１のシリカ含有固相に結合する核酸がゲノムDNAであり、前記第２のシリカ含有固相に結合する核酸がプラスミドDNAである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の核酸精製方法。
【請求項９】
核酸含有試料とカオトロピック剤の混合液を吸引及び吐出するための通液口と、シリカ含有固相を備えた核酸精製器具であって、
圧力差によって混合液を前記通液口から吸引あるいは吐出して、前記シリカ含有固相で隔てられる一方の空間から他方の空間へと移動させることにより、前記シリカ含有固相に２回以上通液させることを特徴とする前記核酸精製器具。
【請求項１０】
請求項９に記載の核酸精製器具、ならびにカオトロピック剤、有機溶媒、洗浄液、及び溶出液から選ばれる少なくとも１つ以上の試薬を含む、核酸精製のためのキット。
【請求項１１】
前記カオトロピック剤がチオシアン酸グアニジン、チオシアン酸ナトリウム、塩酸グアニジン、ヨウ化ナトリウム、及びヨウ化カリウムから選択される少なくとも１つ以上、前記有機溶媒がエタノール及び／又はジエチレングリコールジメチルエーテルである、請求項１０に記載のキット。
【請求項１】
核酸精製方法であって：
核酸含有試料にカオトロピック剤を混合し、
前記混合液を所定の孔径の通液孔を有する第１のシリカ含有固相に２回以上通液させ、 次いで、前記第１のシリカ含有固相よりも小さい孔径の通液孔を有する第２のシリカ含有固相に前記混合液を２回以上通液させ、そして
前記第１及び第２のシリカ含有固相に結合した核酸をそれぞれ回収することを特徴とする前記方法。
【請求項２】
前記第１及び第２のシリカ含有固相への通液は、いずれもシリカ含有固相に対して両方向から２回以上繰り返されるものである、請求項１に記載の核酸精製方法。
【請求項３】
前記第１のシリカ含有固相の通液孔の孔径が20〜25μmであり、かつ前記第２のシリカ含有固相の通液孔の孔径が0.1〜10μmである、請求項１又は２に記載の核酸精製方法。
【請求項４】
前記第１のシリカ含有固相に結合する核酸が20000個以上のデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドから構成される核酸であり、前記第２のシリカ含有固相に結合する核酸が10000個以下のデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドから構成される核酸である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の核酸精製方法。
【請求項５】
前記第１のシリカ含有固相に結合する核酸が、50000個以上のデオキシリボヌクレオチド、又はリボヌクレオチドから構成される核酸である、請求項４に記載の核酸精製方法。
【請求項６】
前記第２のシリカ含有固相に結合する核酸が、5000個以下のデオキシリボヌクレオチド、又はリボヌクレオチドから構成される核酸である、請求項４又は５に記載の核酸精製方法。
【請求項７】
前記第１のシリカ含有固相に結合する核酸がゲノムDNAであり、前記第２のシリカ含有固相に結合する核酸がRNAである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の核酸精製方法。
【請求項８】
前記第１のシリカ含有固相に結合する核酸がゲノムDNAであり、前記第２のシリカ含有固相に結合する核酸がプラスミドDNAである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の核酸精製方法。
【請求項９】
核酸含有試料とカオトロピック剤の混合液を吸引及び吐出するための通液口と、シリカ含有固相を備えた核酸精製器具であって、
圧力差によって混合液を前記通液口から吸引あるいは吐出して、前記シリカ含有固相で隔てられる一方の空間から他方の空間へと移動させることにより、前記シリカ含有固相に２回以上通液させることを特徴とする前記核酸精製器具。
【請求項１０】
請求項９に記載の核酸精製器具、ならびにカオトロピック剤、有機溶媒、洗浄液、及び溶出液から選ばれる少なくとも１つ以上の試薬を含む、核酸精製のためのキット。
【請求項１１】
前記カオトロピック剤がチオシアン酸グアニジン、チオシアン酸ナトリウム、塩酸グアニジン、ヨウ化ナトリウム、及びヨウ化カリウムから選択される少なくとも１つ以上、前記有機溶媒がエタノール及び／又はジエチレングリコールジメチルエーテルである、請求項１０に記載のキット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２００７−１２４９５２（Ｐ２００７−１２４９５２Ａ）
【公開日】平成１９年５月２４日（２００７．５．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−３２０７３３（Ｐ２００５−３２０７３３）
【出願日】平成１７年１１月４日（２００５．１１．４）
【出願人】（５０１３８７８３９）株式会社日立ハイテクノロジーズ (4,325)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年５月２４日（２００７．５．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１１月４日（２００５．１１．４）
【出願人】（５０１３８７８３９）株式会社日立ハイテクノロジーズ (4,325)
【Ｆターム（参考）】
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