核阻害剤Ｉ‐９２および医薬の製造のためのその使用
【構成】 ヒトパピローマウイルスのＤＮＡエンハンサー配列に特異的に結合することを特徴とするタンパク質の活性を特異的に阻害する核阻害剤であり、好ましくはヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）の特異的ＤＮＡエンハンサー配列に結合して、タンパク質ｐ９２の活性を特異的に阻害する核阻害剤。(a) ＤＮＡ結合タンパク質ｐ９２に可逆的に結合することによって、デオキシコール酸ナトリウム感受性複合体を形成し、(b) ＨＰＶのＤＮＡエンハンサー配列に対するｐ９２の結合活性を減少させることを特徴とする、核阻害剤Ｉ−９２。定常期としてｐ９２を用いるアフィニティクロマトグラフィによって得ることができる核阻害剤。
【効果】 上記核阻害剤は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）の配列特異的ＤＮＡエンハンサーに結合するタンパク質の活性を特異的に阻害し、ヒト子宮頸癌の治療用の医薬品を製造するために用いることができる。
【効果】 上記核阻害剤は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）の配列特異的ＤＮＡエンハンサーに結合するタンパク質の活性を特異的に阻害し、ヒト子宮頸癌の治療用の医薬品を製造するために用いることができる。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ヒトパピローマウイルスのＤＮＡエンハンサー配列に結合するタンパク質の活性を制御する化合物に関する。
【０００２】また、本発明は、ヒト子宮頸癌を治療するための医薬品を製造するためのこの化合物の使用、および子宮頸癌の診断用のキットを包含する。
【０００３】
【従来の技術】子宮頸癌は、世界的規模で女性に最も頻繁にみられる癌の内で二番目のものである。発癌性の高いヒトパピローマウイルスのＤＮＡは、子宮頸癌の生検の９０％以上で見出される。形質転換活性を有する２種類のタンパク質Ｅ６およびＥ７はウイルスの初期遺伝子によってコードされるが、それらの連続的発現には、増殖および形質転換した表現型を保持することが必要である（Cancer Res., 48, 3780-3786 (1988); EMBO J., 8, 513-519 (1989) ）。タンパク質Ｅ６およびＥ７の形質転換活性は、それらが腫瘍サプレッサー遺伝子ｐ１０５RBおよびｐ５３の生成物と特異的に相互作用するという事実によって少なくとも部分的に説明される。ｐ１０５RBは網膜芽細胞腫感受性遺伝子の生成物である（Cell, 60, 387-396 (1990)）。ＨＰＶ１８初期遺伝子の発現は、上流の調節領域（ＵＲＲ）であって、３つのドメインを有し、最も５′側のＬ１遺伝子に隣接した領域がＥ６に関与し、最も３′側の初期遺伝子プロモーターを含む領域がＥ２に関与しているものによって制御される（J. Virol., 62, 665-672 (1988) ）。パピローマウイルス１８型のエンハンサーは、２つの機能的に重複するドメインから成り、一方は部分的にＨＰＶ１８とＨＰＶ１６との間に保存され、いずれも強力な転写の促進を媒介する。このエンハンサーは２３０ヌクレオチドの長さのＲｓａＩ−ＲｓａＩフラグメント上に位置しており、同じ大きさの２つの機能的に重複したドメインに再分割することができるが、その活性は細胞のトランス調節ファクター(cellular transregulatory factors)によって変わる（EMBO J., 6, 1339-1344 (1987); J. Virol., 61, 134-142 (1987) ）。正常な細胞が感染を受けると、ウイルスＤＮＡはエピソーム性であり、極まれにはウイルスＤＮＡは宿主ゲノムに組み込まれる。この組込み体では、初期遺伝子は低い水準で発現する。これとは対照的に、子宮頸癌細胞では、ウイルスＤＮＡは通常は組込まれ、初期遺伝子Ｅ６およびＥ７は例外なしに高水準で発現する。ほとんどの場合には、ウイルスゲノムは、ウイルスのトランス調節タンパク質Ｅ２をコードするＥ２遺伝子の組込み事象コード配列を用いる（Nature, 314, 111-114 (1985) ）。Ｅ２コード配列に組込まれると、このタンパク質は不活性化し、初期遺伝子プロモーターは最早Ｅ２依存性ではなくなる。この初期遺伝子プロモーターが次に、主として宿主細胞ファクターによって制御されるものと考えられる（Cancer Cells, 1, 43-50 (1989) ）。形質転換遺伝子の発現を制御する機構を理解することは、子宮頸癌の発癌を理解する上で極めて重要であり、したがって子宮頸癌に有効な医薬品の製造に重要である。
【０００４】ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８のエンハンサーは、核因子Ｉ（ＮＦＩ）、アクチベータータンパク質ＡＰ１および糖質コルチコイドレセプターの認識部位を含んでいる（Nucl. Acids Res., 18, 465-470 (1990); EMBO J., 6, 3745-3753 (1987); New Biologist, 2, 450-463 (1990); J. Virol., 62, 4321-4330 (1988); Nucl. Acids Res., 17, 3519-3533 (1989) ）。それぞれのシス作用要素の活性は、全エンハンサー活性に寄与する。ＨＰＶエンハンサー機能は、このエンハンサーの短いセグメントが弱いトランス活性機能しか持たないので多因子の協同的相互作用によって変わるが、完全なエンハンサーは強力なトランス活性因子(transactivator)である。認識部位が多重タンパク質と結合し、個々の因子は別の認識配列と相互作用することができることがある（Genes Dev., 4, 43-51 (1990); Nature, 340, 3542 (1989); EMBO J., 8, 2001-2008 (1989); Annu. Rev. Biochem., 58, 799-839 (1989)）。
【０００５】これらの核因子の一つは、エンハンサー中の反復部位に結合しているタンパク質ｐ９２である（Nucleic Acids Research, 19 (9), 2363-2371, 1991 ）。ｐ９２の認識配列は、ＴＴＧＣＴＴＧＣＡＴＡＡ配列モチーフで同定された。ｐ９２タンパク質は、認識配列に類似のＯｃｔ−１の少なくとも１つのコピーを含むエンハンサーオリゴヌクレオチドに結合しており、これらのオリゴヌクレオチドはまた合成Ｏｃｔ−１タンパク質と結合している。抗−Ｏｃｔ−１抗血清を用いる細胞質抽出物のイムノブロットにより、ｐ９２は免疫学的にはＯｃｔ−１タンパク質には関係しないオクタマー結合因子であり、その細胞内分布は核−細胞質トランスロケーションにより細胞周期のＧ０／Ｇ１境界で調節されている。
【０００６】ｐ９２の濃度はある種の腫瘍および腫瘍細胞では高くなることを見出した。これとは対照的に、ＤＮＡ結合活性は、血清の饑餓の条件下では正常の形質転換していないヒト線維芽細胞では検出されなかった。血清饑餓の際または高飽和密度では、ｐ９２は核から細胞質へ移動し、その標的配列から物理的に隔離されているので最早活性はない。
【０００７】各種の腫瘍では、この制御機構は機能しない。場合によっては、細胞が例えば組込みＨＰＶゲノムを含み、同時にｐ９２の濃度増加を生じ、これによってエンハンサーが活性化される。したがって、これによって、ヒト細胞の形質転換に関与するタンパク質Ｅ６およびＥ７の形質転換をコードするｍＲＮＡの転写をさせることができる。
【０００８】ＨＰＶ関連の腫瘍の予防、診断および／または治療に有効な治療薬が必要とされている。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、子宮頸癌におけるＨＰＶの初期遺伝子の発現に影響を及ぼす因子を提供することである。もう一つの課題は、子宮頸癌の治療のためこのような因子を含む医薬品を提供することである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】この課題の解決法は、ヒトパピローマウイルスのＤＮＡエンハンサー配列に結合するタンパク質の活性を特異的に阻害する核阻害剤である。
【００１１】本発明の好ましい態様は、ヒトパピローマウイルス１８型に由来する配列に特異的なＤＮＡエンハンサー結合タンパク質ｐ９２の活性を特異的に阻害する核阻害剤Ｉ−９２と呼ばれる化合物である。
【００１２】化合物Ｉ−９２が、核タンパク質ｐ９２がＨＰＶのＤＮＡエンハンサー構造への結合するのを防止することを、意外にも見出した。Ｉ−９２の活性の重要な点は、ヒト細胞の形質転換に関与するＨＰＶタンパク質Ｅ６およびＥ７の発現を抑制することである。
【００１３】本発明は、Ｉ−９２に特異的な抗体を用いて子宮頸癌組織におけるＩ−９２を同定するための診断キットも包含する。
【００１４】核阻害剤と配列特異性ＤＮＡ結合タンパク質との周期的会合は、ＤＮＡ結合の細胞周期依存性の活性を調節する新規な原理である。阻害剤Ｉ−９２が細胞周期のＧ１およびＧ２におけるｐ９２と会合することにより、ｐ９２のＤＮＡ結合活性が不活性化される。Ｓ期では、細胞Ｉ−９２は活性を持たないので、ｐ９２は複合体を形成せず、細胞ゲノムおよびＨＰＶ制御領域に存在するオクタマー配列と結合することができる。活性なｐ９２は、デオキシコレート処理により不活性な複合体から放出することができる。この観察は、ｐ９２と阻害剤Ｉ−９２との会合が可逆的であることを示唆している。また、Ｉ−９２は、イン・ビトロでｐ９２と再会合して不活性な複合体を形成することができる。イン・ビトロでのＳ期の細胞からのｐ９２を用いる不活性なＩ−９２：ｐ９２複合体の形成は、阻害剤の活性が細胞周期によって制御されているらしいことを示唆している。ｐ９２自身がそのＩ−９２と会合する能力で制御されると、Ｓ期細胞からのｐ９２はインビトロではＩ−９２によって不活性化されない。
【００１５】細胞周期は細胞外信号に応答し、ｐ９２は、成長因子レセプター応答のようなｐ９２の不活性化および核輸入へと導く細胞外の信号の媒介物である。輸送の際に、ｐ９２は核に蓄積し、そこでその活性が細胞周期によって制御される。このタイプの制御により、細胞外信号が配列に特異的なＤＮＡ結合タンパク質のＳ期依存性活性へと導く機構が提供される。阻害剤Ｉ−９２は、潜在的腫瘍抑制タンパク質のような挙動を採る。
【００１６】制御されたタンパク質：ＤＮＡ複合体におけるオクタマー結合タンパク質ｐ９２の同定ｐ９２は、細胞周期のＧ０／Ｇ１境界で阻止される非腫瘍発生性のヒーラ−線維芽細胞ハイブリッド細胞のサイトゾルに見出される（Science, 215, 252-259(1982)）。細胞周期の阻止を生じる培養条件は、高飽和密度または血清饑餓までの成長である。オクタマー結合タンパク質ｐ９２は、ヒトパピローマウイルス１８型エンハンサー由来の合成の二本鎖オリゴヌクレオチドを用いる結合部位ブロッティングによって同定され、２つのオクタマー関連配列を含んでいた（Nucleic Acids Research, 19 (9), 2363-2371 (1991)）。結合部位ブロッティングによって同定されたタンパク質のＥＭＳＡにおける抑制されたＤＮＡ複合体への割当は、タンパク質の電荷が元のゲルにおけるそれらの移動度に影響を及ぼすので、容易には達成されない。それ故、所定のタンパク質の分子量とＥＭＳＡにおける抑制の程度とに相関を求めることはできない。
【００１７】ＥＭＳＡの感受性が大きいので、ＥＭＳＡを用いてｐ９２ＤＮＡ結合活性を検出した。ｐ９２タンパク質を含む抑制されたＤＮＡ−タンパク質複合体を同定するため、結合部位ブロッティングと組み合わせた調製用ＥＭＳＡを用いた。調製用ＥＭＳＡには、ｐ９２結合部位と高飽和密度の非腫瘍発生性ヒーラ−線維芽細胞ハイブリッド細胞由来のサイトゾルを含むオリゴヌクレオチドＲＰ３を用いた。分析ＥＭＳＡでは、新たな阻止されたＤＮＡ−タンパク質複合体が高飽和密度で現れた。本発明者らは、抑制された複合体Ａおよび調製用ＥＭＳＡによる抑制された複合体Ｂに存在するタンパク質を単離した。オートラジオグラフィの後に、抑制された複合体を溶出し、２０ｇのＢＳＡの存在下にて、９容のアセトンを用いて、タンパク質を４℃で一晩沈澱させた。オリゴヌクレオチドＲＰ３をプローブとして用いて、結合部位ブロッティングによって、タンパク質を分析した。抑制されたＤＮＡ−タンパク質複合体は、いずれもｐ９２を含んでいる。この実験では、ｐ９２が抑制された複合体Ａおよび複合体Ｂに含まれることを示している。キャリヤータンパク質であるウシ血清アルブミンは、ＤＮＡ結合活性を全く含まなかった。複合体Ｂにおいて、ｐ９２は二量体として結合しているのか、またはｐ９２が第二のタンパク質と相互作用するのかは、知られていない。
【００１８】サイトゾルｐ９２タンパク質は、ヒトパピローマウイルスエンハンサー由来のオクタマー関連の配列に結合する。サイトゾル性ｐ９２も、免疫グロブリンの重鎖プロモーターの高度に保存されたオクタマー配列に高い親和性で結合する（Nature, 336, 544-551 (1988) ）。重鎖プロモーター中にあるオクタマーコンセンサス配列は２７ヌクレオチドの長さであり、ヘプタマー配列も含んでいる。結合部位ブロッティングでは、この２７ヌクレオチドの長さの配列を二量体として合成した。このオリゴヌクレオチドは、細胞遺伝子の遺伝子制御領域の一部である特異的なＯｃｔ−１結合部位を表わしている。高密度細胞の各種の癌細胞系のサイトゾルにある細胞質ｐ９２は、結合部位ブロッティングにおいて、このオリゴヌクレオチドと高い親和性で結合する。この結果は、ｐ９２がコンセンサスオクタマー配列に結合し、ｐ９２がオクタマー結合タンパク質であることを示している。
【００１９】オクタマー結合タンパク質ｐ９２のＤＮＡ結合および核輸入は、細胞外信号によって制御される接触により阻害された、静止している線維芽細胞では、ｐ９２のＤＮＡ結合活性は、核にもサイトゾルにも検出されなかった。血清饑餓線維芽細胞（０．５％ＦＣＳを含む培地中、４０時間）では、抑制されたｐ９２−ＤＮＡ複合体は、細胞質画分のＥＭＳＡには検出することができない。１０％ウシ胎児血清を含む新鮮な培養液を添加したところ、サイトゾル中にｐ９２のＤＮＡ結合活性が３時間以内に現われ、５時間後には最大濃度となった。血清刺激から９時間後に、ｐ９２はサイトゾルから消失し始め、１２時間後にはほとんどのｐ９２が消失した。ｐ９２の核輸送は、血清刺激の７時間後に始まり、核輸入は１２時間後に完了する。血清饑餓線維芽細胞では、ｐ９２のＤＮＡ結合は血清刺激によって３時間以内に誘導される。
【００２０】非腫瘍発生性のヒーラ−線維芽細胞ハイブリッド細胞（４４４）では、ｐ９２のＤＮＡ結合活性はサイトゾル中に高い飽和密度で見出される。血清饑餓細胞においては、ｐ９２も細胞質性であり、ｐ９２のＤＮＡ結合活性は、細胞を０．５％ウシ胎児血清を含む培地に移してから４０時間後でも検出される。１０％ＦＣＳを含む培地を添加したところ、抑制されたｐ９２：ＤＮＡ複合体は検出可能なほどは変化しない。高血清（１０％ウシ胎児血清）中で５時間成長したところ、複合体Ｂに関連し、ｐ９２および可能なｐ９２の二量体を含む新規な抑制された複合体がサイトゾル中に出現する。次いで、ｐ９２の濃度が停止し、９時間後には、ｐ９２はサイトゾル中には最早検出されない。４４４細胞の核抽出物では、血清饑餓の後には、極微量のｐ９２しか存在しない。血清刺激を行ったところ、ｐ９２の核輸入が５時間以内に始まり、９時間後には最大になるが、これは、総てのサイトゾル性ｐ９２が消失してしまった時点である。ｐ９２の核輸入を制御するには、血清饑餓４４４細胞のサイトゾル中に活性なＤＮＡ結合ｐ９２があっても核トランスロケーションを生じないので、他の信号が必要である。それ故、ｐ９２の細胞内分布は、血清中に存在する成長因子（ＥＧＦ、ＰＤＧＦ）のような細胞外信号によってしっかりと制御される。
【００２１】核ｐ９２のＤＮＡ結合活性は細胞周期によって制御される細胞外信号は、ｐ９２のＤＮＡ結合活性および核輸入を制御する。核輸入の速度論は遅く、血清饑餓線維芽細胞に血清を添加してから１２時間後にｐ９２が核中に現われる。この速度論は、ｐ９２がＳ期の開始前に核に現われることを示唆している。集合に達していない非同時的に成長する細胞の核抽出物では、ｐ９２は核には見出されるが細胞質には見られない。細胞周期中の核ｐ９２の運命および活性を検討するため、非腫瘍発生性のヒーラ−線維芽細胞ハイブリッド細胞（４４４）と線維芽細胞との非同時的個体群を遠心傾瀉によって分離して、Ｇ１−、Ｓ−およびＧ２期細胞の画分とした。第一の画分および最後の画分は、それぞれ８２％のＧ１細胞および８５％のＧ２細胞を含んでいた。これらの分離した細胞の個体群から、核抽出物をｐ９２ＤＮＡ結合活性についてＥＭＳＡによって分析した。非腫瘍発生性のヒーラ−線維芽細胞のハイブリッド細胞由来の核抽出物のＥＭＳＡでは、ｐ９２のＤＮＡ結合活性は、Ｓ期のみに存在する。２つの抑制された複合体ＡおよびＢは４４４細胞のＳ期の核抽出物中に検出することができ、これらの複合体はいずれもｐ９２を含んでいる。同様な抑制された複合体を調製用ＥＭＳＡおよび結合部位ブロッティングによって分析したが、いずれもｐ９２を含んでいた。核輸入の後、ｐ９２のＤＮＡ結合活性はＳ期で残存し、Ｇ２ではなくなる。Ｇ１細胞では、ｐ９２は活性ではなく、ｐ９２はＳ期細胞で活性化されるものと思われる。
【００２３】Ｉ−９２はＳ相に依存するｐ９２のＤＮＡ結合活性を制御する遠心傾瀉によってＧ１−、Ｓ−およびＳ２−細胞に分離した非腫瘍発生性のヒーラ−線維芽細胞のハイブリッドの細胞質画分の細胞質性画分を遠心分離傾瀉によって分離して、Ｇ１−、Ｓ−およびＧ２−細胞とし、結合部位ブロッティングによって分析した。
【００２４】ＥＭＳＡに用いたオリゴヌクレオチドＲＰ３を、プローブとして用いた。結合部位のブロット（図１R>１）は、ｐ９２が細胞周期の初期のＳ−および後期のＳ−期細胞の核中に存在するが（レーン３および４）、Ｇ１およびＧ２でも、等量のｐ９２が同様に存在する（レーン２および５）ことを示している。Ｇ１、ＳまたはＧ２細胞のサイトゾルには、ｐ９２は見られない（レーン６、７、８、９）。これは、非同時的に培養されて成長する細胞中では、ｐ９２が核に位置することを示している。核ｐ９２のＤＮＡ結合活性は、Ｓ期細胞に存在するだけでなく、Ｇ１−およびＧ２−細胞にも存在する。これは、Ｇ１−、Ｓ−およびＧ２−細胞のＥＭＳＡによって得られた結果とは対照的である。この観察によって、ｐ９２のＤＮＡ結合活性自身が細胞周期によって制御されているという見方ができなくなる。ＤＮＡ結合活性のこの細胞周期の制御を説明する一つの可能性は、細胞周期のＧ１およびＧ２でのみ活性なｐ９２の核阻害剤の存在である。ｐ９２と、Ｇ１−およびＧ２−細胞中の推定上の阻害剤との会合は、ＥＭＳＡによって検出することができるが、結合部位ブロッティングのような変性処理によっては検出することができない。
【００２５】本発明者らは、Science, 242, 540-546 (1988)に記載の方法を用いて、Ｇ１−およびＧ２−細胞中に不活性なｐ９２複合体が存在するかどうかを決定した。ＥＭＳＡには、オリゴヌクレオチドＲＰ３を用い、遠心傾瀉によって分離してＧ１−およびＧ２−細胞の画分とした４４４細胞由来の核抽出物を用いた。０．２％ＤＯＣをＧ１の核抽出物に添加することによって、Ｓ期細胞におけるｐ９２：ＤＮＡ複合体Ａと同じ程度まで抑制される新規抑制された複合体が出現する（図２Ａ、レーン２および３）。これは、ｐ９２がＤＮＡ結合の阻害剤にＧ１細胞の粗抽出物中で複合体形成することを示している。Ｇ２の核抽出物をＤＯＣで処理すると、同様な抑制された複合体が放出される（図２Ｂ、レーン２）。これは、細胞周期のＧ１およびＧ２にある４４４細胞の核抽出物では、ｐ９２のＤＮＡ結合活性がｐ９２のＤＮＡ結合の核阻害剤に複合体形成されることを示している。この阻害剤の活性は、細胞周期によって制御される。この核阻害剤を、Ｉ−９２と呼ぶ。Ｓ期の活性を制御する機構は、ｐ９２と細胞周期のＧ１およびＧ２における阻害剤Ｉ−９２との環状会合である。ｐ９２とＩ−９２との会合は、不活性な複合体をＤＯＣ処理することによって活性なｐ９２を放出させることができるので、可逆的である。
【００２６】ヒト線維芽細胞において、ｐ９２のＤＮＡ結合もＳ期細胞に限定される。ヒト線維芽細胞を分離して、Ｇ１−、Ｓ−およびＧ２−細胞とし、核抽出物をＥＭＳＡによって分析した。線維芽細胞はヒーラ−線維芽細胞よりも付着性が強い傾向を示すので、極めて豊富なＧ１、ＳおよびＧ２集団への分離は余り良好ではない。ｐ９２の活性は、主としてＳ期に限定されている（図３Ａ、レーン２）。しかしながら、この調製では、Ｇ１細胞抽出物に低いｐ９２活性が観察され、Ｇ１画分に遊離の混入しているＧ２細胞核が見られたので、これは長時間のトリプシン処理の結果とも思われる。対照的に、Ｇ２線維芽細胞の核抽出物には、ｐ９２のＤＮＡ結合活性は見られない。Ｇ２線維芽細胞の核抽出物では、ｐ９２は複合体形成して、阻害剤Ｉ−９２とＤＯＣ感受性の複合体となる（図３ｂ、レーン２および３）。これは、正常なヒト細胞中に阻害剤Ｉ−９２が存在することを示しており、且つｐ９２と阻害剤Ｉ−９２との環状会合によるｐ９２のＤＮＡ結合の細胞周期制御がこれらの正常なヒト線維芽細胞で働いていることも示している。
【００２７】阻害剤Ｉ−９２はインビトロでｐ９２と会合し、そのＤＮＡ結合活性を不活性化するＩ−９２はＤＮＡ結合活性を持たない。これを試験するため、非腫瘍発生性のヒーラ−線維芽細胞ハイブリッド（４４４）の核抽出物を０．２％ＤＯＣで処理した後、７０ミリモルＮａＣｌ中ヘパリンセファロースカラムを通過させた。通過物を集めた。カラムを添加した緩衝液で洗浄した後、結合したタンパク質を６００ミリモルＮａＣｌで溶出した。ＥＭＳＡでは、通過物は抑制されたＤＮＡ−タンパク質複合体を誘導せず、６００ミリモルの溶出物は総てｐ９２結合活性を含んでいた。検出され得るＩ−９２活性を含まないＳ期細胞からのＥＭＳＡでは、３種類の抑制された複合体が形成されていた。上の２つの複合体は、ｐ９２：ＤＮＡ複合体ＡおよびＢに対応している（図４、レーン１）。複合体Ｃにおけるタンパク質の同一性は、現在検討中である。ヘパリンセファロース通過物中のＩ−９２を同定するため、Ｓ期の核抽出物およびｐ９２認識部位を含むオリゴヌクレオチドＲＰ３のＤＮＡ結合反応物に多量の通過物を添加する。５リットルの通過物を添加すると、複合体Ｂが著しく減少し、複合体Ａが幾分減少する（図４、レーン３）。１５リットルの通過物を添加すると、複合体Ｂの形成は完全に妨げられ、２０リットルの通過物を添加した場合には、複合体Ｂも複合体Ａも形成されない。複合体Ｃの形成は、通過物のＤＮＡ結合反応物への添加によっては影響を受けない。２０リットルの通過物を反応物へ添加した後の複合体Ｃが不変であることは、インビトロではＩ−９２はｐ９２と特異的に会合しており、それによってＤＮＡ結合活性が不活性化されることを示している。
【００２８】例１細胞培養および細胞系ヒーラ−線維芽細胞ハイブリッド細胞系（Science, 215, 252-259 (1982)）および正常なヒト線維芽細胞を、１０％ウシ胎児血清を補足したダルベッコの改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）に保持した。ヒーラ−線維芽細胞ハイブリッド細胞ラインは、スタンブリッジ(Stanbridge)博士から提供され、ヒト線維芽細胞はＤＫＦＺの同僚の研究者から提供を受けた。血清饑餓実験については、細胞を１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ中で半集合状態に成長させた後、細胞を０．５％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭに４０時間固定した。血清刺激実験では、細胞を最初に４０時間饑餓状態に置いた後、細胞を１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ中で成長させた。高飽和密度までの成長については、集合状態の細胞を１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ中に４８時間固定した。
【００２９】例２核および細胞質タンパク質の抽出子宮頸癌由来の細胞系およびヒト線維芽細胞の核抽出物は、公表された方法（Mol. Cell. Biol., 7, 787-798 (1987) ）に準じて調製した。０．６５％のＮＰ４０を用いて界面活性剤溶解を行った後、核を４℃で低速遠心分離によって調製し、タンパク質を緩やかに撹拌しながら５２０ミリモルＮａＣｌで溶出させる。保存には、溶出物を、５０％グリセロール、５０ミリモルＮａＣｌ、１０ミリモルヘーペス（ｐＨ７．９）、０．５ミリモルＰＭＳＦおよび０．５ミリモルＤＴＴを含む緩衝液に対して透析を行った。タンパク質濃度は、血清アルブミンを標準試料として用いて比色分析法（バイオラッド(Biorad)）によって測定した。ヒーラ細胞由来の核タンパク質およびＢリンパ芽球腫様系（Ｌａｚ５０９）を、前記の様にしてヘパリンセファロースクロマトグラフィによって濃度増加した（Nature, 317, 84-87 (1985) ）。細胞質タンパク質は、細胞を溶解し、核を低速遠心分離によって除去した後に調製した。細胞質タンパク質を、核タンパク質について、前記と同様にして透析した。
【００３０】例３合成オリゴヌクレオチド一本鎖オリゴヌクレオチドおよび相補性鎖を、アプライド・バイオシステムス(Applied Biosystems)製ＤＮＡシンセサイザーで合成し、調製用の変性アクリルアミドゲル電気泳動によって精製した（分子クローニング：実験室マニュアル(Molecular Cloning: A Laboratory Manual)（コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー(Cold Spring Harbor Laboratory) 、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク）（１９８２年））。全体の長さのバンドをＵＶで影像化し、掻き取り、５００ミリモル酢酸アンモニウムに拡散させることによって溶出させ、エタノールで沈澱させることによって同定した。二本鎖オリゴヌクレオチドを生成させるため、相補性鎖を特異的融解点（Ｔｍ）より低い−３℃の温度でアニールした。放射能標識した二本鎖オリゴヌクレオチドは、ポリヌクレオチドキナーゼと３２Ｐ−γＡＴＰを用いて調製した。ＡＰ２の認識部位の配列は、ヒトメタロチオネインＩＩＡ（ｈＭＴ−ＩＩＡ）遺伝子制御領域由来のものであった（Cell, 51, 251-260 (1987)）。ヒトパピローマウイルスエンハンサー配列（J.Virol., 61, 134-142 (1987) ）を用いて、エンハンサーオリゴヌクレオチドＲＰ２、ＲＰ３、ＲＰ３／４、ＲＰ４、ＲＰ５、Ｓ１ｔｅｔ及びＳ２ｔｅｔを合成した。これらの配列を、表１に示す。
【００３１】
【表１】
【００３２】例４結合部位ブロッティング核タンパク質を８％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上でサイズ分画し（Nature, 329, 680-685 (1970) ）、ＳＤＳなしのレムリの泳動用緩衝液中で水平式ブロッティングチャンバー（アイビーアイ(IBI) ）を用いて室温で一晩１５０ｍＡにおいてニトロセルロースへ移した。ブロッティングの後、結合タンパク質をその場で６モルの塩酸グアニジニウムによって変性し、既報の通りにグアニジニウムの連続希釈によって再結合した（Nucl. Acids Res., 17, 8891 (1989); Genes Dev., 2, 801-806 (1988)）。ニトロセルロース膜を５％の無脂肪乾燥ミルク（カーネーション(Carnation) ）で室温で３０分間ブロックした後、非特異的競合体として５ｇ／mlのポリ（ｄＩｄＣ）（ｄＩｄＣ）の存在下にて５×１０５ｃｐｍ／mlで末端を標識した二本鎖オリゴヌクレオチドと共にインキュベーションした。ＤＮＡ結合用の緩衝液および結合部位ブロットの洗浄条件は既報の通りであった（Nucl. Acids Res., 17, 8891 (1989) ）。
【００３３】例５電気泳動移動度のシフト分析（ＥＭＳＡ）
ＥＭＳＡは、既報の通りに行った（Nature, 319,154-158 (1986)）。エンハンサードメインＩのＥＭＳＡについては、ＨＰＶ１８エンハンサーの機能性ドメインＩをＨＰＶ１８の上流の制御領域を含むクローンであって、１０５０ｂｐのＢａｍＨＩフラグメント上にあるｐＵＲＲ１８から単離した。このフラグメントでは、エンハンサーはＲｓａＩ−ＲｓａＩフラグメント（ＮＴ５８２〜８１０）上に存在する。このフラグメントを、ＲｓａＩおよびＦｎｕ４ＨＩで消化した後、ポリアクリルアミドゲル電気泳動および電気溶出によって単離した。Ｆｎｕ４ＨＩによる消化（位置９１０）により、同時移動(comigrating) プロモーターフラグメントが除かれる。ＢｓｔＮｉ−ＲｓａＩフラグメント（ヌクレオチド６９７〜８１０）上に位置する一つの機能性ドメインのＥＭＳＡでは、ＲｓａＩ（５８２）〜ＲｓａＩ（８１０）フラグメントをＢｓｔＮＩで消化し、ポリヌクレオチドキナーゼで放射能標識した。エンハンサードメインＩを含むフラグメントは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動および電気溶出によって単離した。エンハンサードメインＩを核タンパク質と共にインキュベーションしたところ、５ｇの核抽出物と２．５ｇの非特異的競合体としてのポリ（ｄＩｄＣ）（ｄＩｄＣ）を含んでいた。ＥＭＳＡのために、ＤＮＡを結合用緩衝液中で２５分間室温でインキュベーションし（Nature, 319, 154-158 (1986) ）、低塩ポリアクリルアミドゲル（４％総モノマー、アクリルアミド／Ｎ，Ｎ′−メチレンビスアクリルアミド比＝３０：１）上に載せた。電気泳動は、室温で、１１Ｖ／cmで９０分間行った。ゲルを乾燥して、Ｘ線フィルムに一晩暴露した。
【００３４】例６調製用ＥＭＳＡ調製用ＥＭＳＡについては、１２０ｇの核抽出物に相当する個々の試料を、分析用ＥＭＳＡについてと同様に電気泳動を行った。ポリアクリルアミドゲルを４℃で一晩オートラジオグラフィを行った後、抑制された複合体を掻き取り、溶出用緩衝液（５０ミリモルトリスＨＣ（ｐＨ７．９）、０．１％ＳＤＳ、０．１mg／mlウシ血清アルブミン、１ミリモルＤＴＴ、０．２ミリモルＥＤＴＡ、０．１ミリモルＰＭＳＦ、２．５％グリセロール）でゲルから４℃で１２時間溶出を行った。抑制された複合体からのタンパク質を、アセトン９容で−２０℃で一晩沈澱させ、１３０００ｒｐｍで遠心分離によって回収した。結合部位ブロッティングには、ペレット化したタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用緩衝液で可溶化した。
【００３５】例７核抽出物のデオキシコール酸ナトリウム処理およびヘパリンセファロースクロマトグラフィ４４４細胞（１mg）からの核抽出物を、ＤＮＡ結合用緩衝液（２５ミリモルヘペス（ｐＨ７．９）、５０ミリモルＮａＣｌ、１０％グリセロール、０．０５％ＮＰ４０、１ミリモルＤＴＴ、１ミリモルＥＤＴＡ）２ml中で、０．４％デオキシコール酸ナトリウムで室温で１５分間処理した。ＤＯＣで処理した核抽出物をヘパリンセファロースカラム上に載せる前に、ＤＯＣを１．２％ＮＰ４０を添加することによって複合体形成させた。カラムに載せた後、通過物を再度カラムを通過させた。最終の通過物（２ml）は阻害剤の源として用いた。結合したタンパク質を、６００ミリモルＮａＣｌを含むＧ６００緩衝液を用いるＧ５０の洗浄段階の後ヘパリンセファロースカラムから溶出させた。Ｇ５０およびＧ６００緩衝液は、ＮａＣｌの外に、１０ミリモルトリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５０ミリモルＮａＣｌ、１ミリモルＥＤＴＡ、１ミリモルＤＴＴ、５％グリセロール、０．２％ＤＯＣ、０．２％ＮＰ４０、０．５％ＰＭＳＦを含んでいた。処理法は、既報の処理法にしたがって行った（Science, 242, 540-546 (1988)）。
【００３６】例８阻害用Ｉ−９２活性の検出Ｓ期の４４４細胞（５ｇ）由来の核抽出物を、増加量のヘパリンセファロースカラムを通過させＤＯＣ処理を行った４４４抽出物と共にインキュベーションした。阻害用Ｉ−９２の活性は、ヘパリンセファロース通過画分からのものであった。
【００３７】例９傾瀉による細胞の分離集密度が８０％に過ぎない細胞単層をトリプシンを用いて採取し、血清を含む培地に再懸濁し、傾瀉した。傾瀉のために、１０７〜１０８個の細胞を、マスターフレックス(Masterflex)ポンプヘッドに接続されたＪＥ−６Ｂベックマン(Beckman) 傾瀉ローターに導入した。傾瀉は、１０ミリモルのヘーペスで緩衝したエールのバランス塩溶液中で行った。ヒト胎児の肺線維芽細胞を２０００ｒｐｍで傾瀉した。載荷流速は１４ml／分であり、この検討に用いた画分を１５〜２０ml／分、２６〜２８ml／分、３５〜３８ml／分および４７〜５０ml／分で集めた。非腫瘍発生性のヒーラ−線維芽細胞ハイブリッド（４４４）細胞を、５ml／分で細胞を載荷した後に１６２０ｒｐｍで傾瀉した。画分を得るための流速は８〜１１ml／分、１５〜１８ml／分、２４〜３０ml／分、２４〜３０ml／分および３４〜３８ml／分であった。それぞれの画分の試料をエタノールで固定して、ＤＡＰＩ（４，６−ジ−アミジノ−２−フェニルインドール）で染色し、螢光により活性化した細胞ソーターによって相対的なＤＮＡ含量を分析した。
【図面の簡単な説明】
【図１】結合部位ブロッティングによる細胞周期中のｐ９２のＤＮＡ結合活性を示す説明図。細胞周期のＧ１、Ｓ期およびＧ２からの核および細胞質４４４抽出物の結合部位ブロットであって、ｐ９２のＤＮＡ結合活性が細胞周期の総ての期にあることを示している。Ｇ１（レーン２）、初期Ｓ期（レーン３）、後期Ｓ期（レーン４）およびＧ２（レーン５）における細胞の核抽出物におけるｐ９２のＤＮＡ結合活性。Ｇ１（レーン６）、初期Ｓ期（レーン７）、後期Ｓ期（レーン８）およびＧ２（レーン９）における細胞からの細胞質抽出物。
【図２】ｐ９２の新規な核阻害剤であるＩ−９２がＳ相依存性のｐ９２のＤＮＡ結合活性を制御することを示す説明図。
（Ａ） Ｇ１における４４４細胞からの核抽出物のＥＭＳＡ（レーン１）は、デオキシコール酸ナトリウムで処理することによってｐ９２のＤＮＡ結合活性を放出することができることを示している。０．２％ＤＯＣ（レーン２）、０．４％ＤＯＣ（レーン３）および０．６％ＤＯＣ（レーン４）。
（Ｂ） 核抽出物のＥＭＳＡ。Ｇ２における細胞のｐ９２のＤＮＡ結合活性（レーン１）は０．２％ＤＯＣ処理によって（レーン２）誘導することができる。０．４％ＤＯＣ（レーン３）で処理した後のおよび０．６％ＤＯＣで処理した後の核抽出物。オリゴヌクレオチドＲＰ３をＥＭＳＡに用いた。
【図３】阻害剤Ｉ−９２が正常なヒト線維芽細胞における細胞周期中にｐ９２のＳ期依存性のＤＮＡ結合活性を制御することを示す説明図。
（Ａ） 遠心傾瀉によってＧ１、ＳおよびＧ２細胞に分離したヒト線維芽細胞の核抽出物の核抽出物のＥＭＳＡ。Ｇ１細胞（レーン１）、初期Ｓ期細胞（レーン２）、後期Ｓ期（レーン３）およびＧ２細胞（レーン４）。ｐ９２によって抑制された複合体の位置を示している。
（Ｂ） Ｇ２細胞（レーン１）、０．２％ＤＯＣ（レーン２）および０．４％ＤＯＣ（レーン３）で処理した後の、線維芽細胞の核抽出物のＥＭＳＡ。
【図４】阻害剤Ｉ−９２がインビトロでｐ９２と会合して、ｐ９２のＤＮＡ結合を阻害することを示す説明図。集合した４４４細胞からの核抽出物を０．２％ＤＯＣで処理して、ヘパリンセファロースカラムを通過させた。通過物をＩ−９２の源として用いた。Ｓ期における４４４細胞からの核抽出物のＥＭＳＡであって、Ｉ−９２が不活性であるもの（レーン１）、５リットルのヘパリン−セファロース通過物を添加後のもの（レーン２）、１０リットルの通過物を添加後のもの（レーン３）および２０リットルの通過物を添加後のもの（レーン４）。
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ヒトパピローマウイルスのＤＮＡエンハンサー配列に結合するタンパク質の活性を制御する化合物に関する。
【０００２】また、本発明は、ヒト子宮頸癌を治療するための医薬品を製造するためのこの化合物の使用、および子宮頸癌の診断用のキットを包含する。
【０００３】
【従来の技術】子宮頸癌は、世界的規模で女性に最も頻繁にみられる癌の内で二番目のものである。発癌性の高いヒトパピローマウイルスのＤＮＡは、子宮頸癌の生検の９０％以上で見出される。形質転換活性を有する２種類のタンパク質Ｅ６およびＥ７はウイルスの初期遺伝子によってコードされるが、それらの連続的発現には、増殖および形質転換した表現型を保持することが必要である（Cancer Res., 48, 3780-3786 (1988); EMBO J., 8, 513-519 (1989) ）。タンパク質Ｅ６およびＥ７の形質転換活性は、それらが腫瘍サプレッサー遺伝子ｐ１０５RBおよびｐ５３の生成物と特異的に相互作用するという事実によって少なくとも部分的に説明される。ｐ１０５RBは網膜芽細胞腫感受性遺伝子の生成物である（Cell, 60, 387-396 (1990)）。ＨＰＶ１８初期遺伝子の発現は、上流の調節領域（ＵＲＲ）であって、３つのドメインを有し、最も５′側のＬ１遺伝子に隣接した領域がＥ６に関与し、最も３′側の初期遺伝子プロモーターを含む領域がＥ２に関与しているものによって制御される（J. Virol., 62, 665-672 (1988) ）。パピローマウイルス１８型のエンハンサーは、２つの機能的に重複するドメインから成り、一方は部分的にＨＰＶ１８とＨＰＶ１６との間に保存され、いずれも強力な転写の促進を媒介する。このエンハンサーは２３０ヌクレオチドの長さのＲｓａＩ−ＲｓａＩフラグメント上に位置しており、同じ大きさの２つの機能的に重複したドメインに再分割することができるが、その活性は細胞のトランス調節ファクター(cellular transregulatory factors)によって変わる（EMBO J., 6, 1339-1344 (1987); J. Virol., 61, 134-142 (1987) ）。正常な細胞が感染を受けると、ウイルスＤＮＡはエピソーム性であり、極まれにはウイルスＤＮＡは宿主ゲノムに組み込まれる。この組込み体では、初期遺伝子は低い水準で発現する。これとは対照的に、子宮頸癌細胞では、ウイルスＤＮＡは通常は組込まれ、初期遺伝子Ｅ６およびＥ７は例外なしに高水準で発現する。ほとんどの場合には、ウイルスゲノムは、ウイルスのトランス調節タンパク質Ｅ２をコードするＥ２遺伝子の組込み事象コード配列を用いる（Nature, 314, 111-114 (1985) ）。Ｅ２コード配列に組込まれると、このタンパク質は不活性化し、初期遺伝子プロモーターは最早Ｅ２依存性ではなくなる。この初期遺伝子プロモーターが次に、主として宿主細胞ファクターによって制御されるものと考えられる（Cancer Cells, 1, 43-50 (1989) ）。形質転換遺伝子の発現を制御する機構を理解することは、子宮頸癌の発癌を理解する上で極めて重要であり、したがって子宮頸癌に有効な医薬品の製造に重要である。
【０００４】ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８のエンハンサーは、核因子Ｉ（ＮＦＩ）、アクチベータータンパク質ＡＰ１および糖質コルチコイドレセプターの認識部位を含んでいる（Nucl. Acids Res., 18, 465-470 (1990); EMBO J., 6, 3745-3753 (1987); New Biologist, 2, 450-463 (1990); J. Virol., 62, 4321-4330 (1988); Nucl. Acids Res., 17, 3519-3533 (1989) ）。それぞれのシス作用要素の活性は、全エンハンサー活性に寄与する。ＨＰＶエンハンサー機能は、このエンハンサーの短いセグメントが弱いトランス活性機能しか持たないので多因子の協同的相互作用によって変わるが、完全なエンハンサーは強力なトランス活性因子(transactivator)である。認識部位が多重タンパク質と結合し、個々の因子は別の認識配列と相互作用することができることがある（Genes Dev., 4, 43-51 (1990); Nature, 340, 3542 (1989); EMBO J., 8, 2001-2008 (1989); Annu. Rev. Biochem., 58, 799-839 (1989)）。
【０００５】これらの核因子の一つは、エンハンサー中の反復部位に結合しているタンパク質ｐ９２である（Nucleic Acids Research, 19 (9), 2363-2371, 1991 ）。ｐ９２の認識配列は、ＴＴＧＣＴＴＧＣＡＴＡＡ配列モチーフで同定された。ｐ９２タンパク質は、認識配列に類似のＯｃｔ−１の少なくとも１つのコピーを含むエンハンサーオリゴヌクレオチドに結合しており、これらのオリゴヌクレオチドはまた合成Ｏｃｔ−１タンパク質と結合している。抗−Ｏｃｔ−１抗血清を用いる細胞質抽出物のイムノブロットにより、ｐ９２は免疫学的にはＯｃｔ−１タンパク質には関係しないオクタマー結合因子であり、その細胞内分布は核−細胞質トランスロケーションにより細胞周期のＧ０／Ｇ１境界で調節されている。
【０００６】ｐ９２の濃度はある種の腫瘍および腫瘍細胞では高くなることを見出した。これとは対照的に、ＤＮＡ結合活性は、血清の饑餓の条件下では正常の形質転換していないヒト線維芽細胞では検出されなかった。血清饑餓の際または高飽和密度では、ｐ９２は核から細胞質へ移動し、その標的配列から物理的に隔離されているので最早活性はない。
【０００７】各種の腫瘍では、この制御機構は機能しない。場合によっては、細胞が例えば組込みＨＰＶゲノムを含み、同時にｐ９２の濃度増加を生じ、これによってエンハンサーが活性化される。したがって、これによって、ヒト細胞の形質転換に関与するタンパク質Ｅ６およびＥ７の形質転換をコードするｍＲＮＡの転写をさせることができる。
【０００８】ＨＰＶ関連の腫瘍の予防、診断および／または治療に有効な治療薬が必要とされている。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、子宮頸癌におけるＨＰＶの初期遺伝子の発現に影響を及ぼす因子を提供することである。もう一つの課題は、子宮頸癌の治療のためこのような因子を含む医薬品を提供することである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】この課題の解決法は、ヒトパピローマウイルスのＤＮＡエンハンサー配列に結合するタンパク質の活性を特異的に阻害する核阻害剤である。
【００１１】本発明の好ましい態様は、ヒトパピローマウイルス１８型に由来する配列に特異的なＤＮＡエンハンサー結合タンパク質ｐ９２の活性を特異的に阻害する核阻害剤Ｉ−９２と呼ばれる化合物である。
【００１２】化合物Ｉ−９２が、核タンパク質ｐ９２がＨＰＶのＤＮＡエンハンサー構造への結合するのを防止することを、意外にも見出した。Ｉ−９２の活性の重要な点は、ヒト細胞の形質転換に関与するＨＰＶタンパク質Ｅ６およびＥ７の発現を抑制することである。
【００１３】本発明は、Ｉ−９２に特異的な抗体を用いて子宮頸癌組織におけるＩ−９２を同定するための診断キットも包含する。
【００１４】核阻害剤と配列特異性ＤＮＡ結合タンパク質との周期的会合は、ＤＮＡ結合の細胞周期依存性の活性を調節する新規な原理である。阻害剤Ｉ−９２が細胞周期のＧ１およびＧ２におけるｐ９２と会合することにより、ｐ９２のＤＮＡ結合活性が不活性化される。Ｓ期では、細胞Ｉ−９２は活性を持たないので、ｐ９２は複合体を形成せず、細胞ゲノムおよびＨＰＶ制御領域に存在するオクタマー配列と結合することができる。活性なｐ９２は、デオキシコレート処理により不活性な複合体から放出することができる。この観察は、ｐ９２と阻害剤Ｉ−９２との会合が可逆的であることを示唆している。また、Ｉ−９２は、イン・ビトロでｐ９２と再会合して不活性な複合体を形成することができる。イン・ビトロでのＳ期の細胞からのｐ９２を用いる不活性なＩ−９２：ｐ９２複合体の形成は、阻害剤の活性が細胞周期によって制御されているらしいことを示唆している。ｐ９２自身がそのＩ−９２と会合する能力で制御されると、Ｓ期細胞からのｐ９２はインビトロではＩ−９２によって不活性化されない。
【００１５】細胞周期は細胞外信号に応答し、ｐ９２は、成長因子レセプター応答のようなｐ９２の不活性化および核輸入へと導く細胞外の信号の媒介物である。輸送の際に、ｐ９２は核に蓄積し、そこでその活性が細胞周期によって制御される。このタイプの制御により、細胞外信号が配列に特異的なＤＮＡ結合タンパク質のＳ期依存性活性へと導く機構が提供される。阻害剤Ｉ−９２は、潜在的腫瘍抑制タンパク質のような挙動を採る。
【００１６】制御されたタンパク質：ＤＮＡ複合体におけるオクタマー結合タンパク質ｐ９２の同定ｐ９２は、細胞周期のＧ０／Ｇ１境界で阻止される非腫瘍発生性のヒーラ−線維芽細胞ハイブリッド細胞のサイトゾルに見出される（Science, 215, 252-259(1982)）。細胞周期の阻止を生じる培養条件は、高飽和密度または血清饑餓までの成長である。オクタマー結合タンパク質ｐ９２は、ヒトパピローマウイルス１８型エンハンサー由来の合成の二本鎖オリゴヌクレオチドを用いる結合部位ブロッティングによって同定され、２つのオクタマー関連配列を含んでいた（Nucleic Acids Research, 19 (9), 2363-2371 (1991)）。結合部位ブロッティングによって同定されたタンパク質のＥＭＳＡにおける抑制されたＤＮＡ複合体への割当は、タンパク質の電荷が元のゲルにおけるそれらの移動度に影響を及ぼすので、容易には達成されない。それ故、所定のタンパク質の分子量とＥＭＳＡにおける抑制の程度とに相関を求めることはできない。
【００１７】ＥＭＳＡの感受性が大きいので、ＥＭＳＡを用いてｐ９２ＤＮＡ結合活性を検出した。ｐ９２タンパク質を含む抑制されたＤＮＡ−タンパク質複合体を同定するため、結合部位ブロッティングと組み合わせた調製用ＥＭＳＡを用いた。調製用ＥＭＳＡには、ｐ９２結合部位と高飽和密度の非腫瘍発生性ヒーラ−線維芽細胞ハイブリッド細胞由来のサイトゾルを含むオリゴヌクレオチドＲＰ３を用いた。分析ＥＭＳＡでは、新たな阻止されたＤＮＡ−タンパク質複合体が高飽和密度で現れた。本発明者らは、抑制された複合体Ａおよび調製用ＥＭＳＡによる抑制された複合体Ｂに存在するタンパク質を単離した。オートラジオグラフィの後に、抑制された複合体を溶出し、２０ｇのＢＳＡの存在下にて、９容のアセトンを用いて、タンパク質を４℃で一晩沈澱させた。オリゴヌクレオチドＲＰ３をプローブとして用いて、結合部位ブロッティングによって、タンパク質を分析した。抑制されたＤＮＡ−タンパク質複合体は、いずれもｐ９２を含んでいる。この実験では、ｐ９２が抑制された複合体Ａおよび複合体Ｂに含まれることを示している。キャリヤータンパク質であるウシ血清アルブミンは、ＤＮＡ結合活性を全く含まなかった。複合体Ｂにおいて、ｐ９２は二量体として結合しているのか、またはｐ９２が第二のタンパク質と相互作用するのかは、知られていない。
【００１８】サイトゾルｐ９２タンパク質は、ヒトパピローマウイルスエンハンサー由来のオクタマー関連の配列に結合する。サイトゾル性ｐ９２も、免疫グロブリンの重鎖プロモーターの高度に保存されたオクタマー配列に高い親和性で結合する（Nature, 336, 544-551 (1988) ）。重鎖プロモーター中にあるオクタマーコンセンサス配列は２７ヌクレオチドの長さであり、ヘプタマー配列も含んでいる。結合部位ブロッティングでは、この２７ヌクレオチドの長さの配列を二量体として合成した。このオリゴヌクレオチドは、細胞遺伝子の遺伝子制御領域の一部である特異的なＯｃｔ−１結合部位を表わしている。高密度細胞の各種の癌細胞系のサイトゾルにある細胞質ｐ９２は、結合部位ブロッティングにおいて、このオリゴヌクレオチドと高い親和性で結合する。この結果は、ｐ９２がコンセンサスオクタマー配列に結合し、ｐ９２がオクタマー結合タンパク質であることを示している。
【００１９】オクタマー結合タンパク質ｐ９２のＤＮＡ結合および核輸入は、細胞外信号によって制御される接触により阻害された、静止している線維芽細胞では、ｐ９２のＤＮＡ結合活性は、核にもサイトゾルにも検出されなかった。血清饑餓線維芽細胞（０．５％ＦＣＳを含む培地中、４０時間）では、抑制されたｐ９２−ＤＮＡ複合体は、細胞質画分のＥＭＳＡには検出することができない。１０％ウシ胎児血清を含む新鮮な培養液を添加したところ、サイトゾル中にｐ９２のＤＮＡ結合活性が３時間以内に現われ、５時間後には最大濃度となった。血清刺激から９時間後に、ｐ９２はサイトゾルから消失し始め、１２時間後にはほとんどのｐ９２が消失した。ｐ９２の核輸送は、血清刺激の７時間後に始まり、核輸入は１２時間後に完了する。血清饑餓線維芽細胞では、ｐ９２のＤＮＡ結合は血清刺激によって３時間以内に誘導される。
【００２０】非腫瘍発生性のヒーラ−線維芽細胞ハイブリッド細胞（４４４）では、ｐ９２のＤＮＡ結合活性はサイトゾル中に高い飽和密度で見出される。血清饑餓細胞においては、ｐ９２も細胞質性であり、ｐ９２のＤＮＡ結合活性は、細胞を０．５％ウシ胎児血清を含む培地に移してから４０時間後でも検出される。１０％ＦＣＳを含む培地を添加したところ、抑制されたｐ９２：ＤＮＡ複合体は検出可能なほどは変化しない。高血清（１０％ウシ胎児血清）中で５時間成長したところ、複合体Ｂに関連し、ｐ９２および可能なｐ９２の二量体を含む新規な抑制された複合体がサイトゾル中に出現する。次いで、ｐ９２の濃度が停止し、９時間後には、ｐ９２はサイトゾル中には最早検出されない。４４４細胞の核抽出物では、血清饑餓の後には、極微量のｐ９２しか存在しない。血清刺激を行ったところ、ｐ９２の核輸入が５時間以内に始まり、９時間後には最大になるが、これは、総てのサイトゾル性ｐ９２が消失してしまった時点である。ｐ９２の核輸入を制御するには、血清饑餓４４４細胞のサイトゾル中に活性なＤＮＡ結合ｐ９２があっても核トランスロケーションを生じないので、他の信号が必要である。それ故、ｐ９２の細胞内分布は、血清中に存在する成長因子（ＥＧＦ、ＰＤＧＦ）のような細胞外信号によってしっかりと制御される。
【００２１】核ｐ９２のＤＮＡ結合活性は細胞周期によって制御される細胞外信号は、ｐ９２のＤＮＡ結合活性および核輸入を制御する。核輸入の速度論は遅く、血清饑餓線維芽細胞に血清を添加してから１２時間後にｐ９２が核中に現われる。この速度論は、ｐ９２がＳ期の開始前に核に現われることを示唆している。集合に達していない非同時的に成長する細胞の核抽出物では、ｐ９２は核には見出されるが細胞質には見られない。細胞周期中の核ｐ９２の運命および活性を検討するため、非腫瘍発生性のヒーラ−線維芽細胞ハイブリッド細胞（４４４）と線維芽細胞との非同時的個体群を遠心傾瀉によって分離して、Ｇ１−、Ｓ−およびＧ２期細胞の画分とした。第一の画分および最後の画分は、それぞれ８２％のＧ１細胞および８５％のＧ２細胞を含んでいた。これらの分離した細胞の個体群から、核抽出物をｐ９２ＤＮＡ結合活性についてＥＭＳＡによって分析した。非腫瘍発生性のヒーラ−線維芽細胞のハイブリッド細胞由来の核抽出物のＥＭＳＡでは、ｐ９２のＤＮＡ結合活性は、Ｓ期のみに存在する。２つの抑制された複合体ＡおよびＢは４４４細胞のＳ期の核抽出物中に検出することができ、これらの複合体はいずれもｐ９２を含んでいる。同様な抑制された複合体を調製用ＥＭＳＡおよび結合部位ブロッティングによって分析したが、いずれもｐ９２を含んでいた。核輸入の後、ｐ９２のＤＮＡ結合活性はＳ期で残存し、Ｇ２ではなくなる。Ｇ１細胞では、ｐ９２は活性ではなく、ｐ９２はＳ期細胞で活性化されるものと思われる。
【００２３】Ｉ−９２はＳ相に依存するｐ９２のＤＮＡ結合活性を制御する遠心傾瀉によってＧ１−、Ｓ−およびＳ２−細胞に分離した非腫瘍発生性のヒーラ−線維芽細胞のハイブリッドの細胞質画分の細胞質性画分を遠心分離傾瀉によって分離して、Ｇ１−、Ｓ−およびＧ２−細胞とし、結合部位ブロッティングによって分析した。
【００２４】ＥＭＳＡに用いたオリゴヌクレオチドＲＰ３を、プローブとして用いた。結合部位のブロット（図１R>１）は、ｐ９２が細胞周期の初期のＳ−および後期のＳ−期細胞の核中に存在するが（レーン３および４）、Ｇ１およびＧ２でも、等量のｐ９２が同様に存在する（レーン２および５）ことを示している。Ｇ１、ＳまたはＧ２細胞のサイトゾルには、ｐ９２は見られない（レーン６、７、８、９）。これは、非同時的に培養されて成長する細胞中では、ｐ９２が核に位置することを示している。核ｐ９２のＤＮＡ結合活性は、Ｓ期細胞に存在するだけでなく、Ｇ１−およびＧ２−細胞にも存在する。これは、Ｇ１−、Ｓ−およびＧ２−細胞のＥＭＳＡによって得られた結果とは対照的である。この観察によって、ｐ９２のＤＮＡ結合活性自身が細胞周期によって制御されているという見方ができなくなる。ＤＮＡ結合活性のこの細胞周期の制御を説明する一つの可能性は、細胞周期のＧ１およびＧ２でのみ活性なｐ９２の核阻害剤の存在である。ｐ９２と、Ｇ１−およびＧ２−細胞中の推定上の阻害剤との会合は、ＥＭＳＡによって検出することができるが、結合部位ブロッティングのような変性処理によっては検出することができない。
【００２５】本発明者らは、Science, 242, 540-546 (1988)に記載の方法を用いて、Ｇ１−およびＧ２−細胞中に不活性なｐ９２複合体が存在するかどうかを決定した。ＥＭＳＡには、オリゴヌクレオチドＲＰ３を用い、遠心傾瀉によって分離してＧ１−およびＧ２−細胞の画分とした４４４細胞由来の核抽出物を用いた。０．２％ＤＯＣをＧ１の核抽出物に添加することによって、Ｓ期細胞におけるｐ９２：ＤＮＡ複合体Ａと同じ程度まで抑制される新規抑制された複合体が出現する（図２Ａ、レーン２および３）。これは、ｐ９２がＤＮＡ結合の阻害剤にＧ１細胞の粗抽出物中で複合体形成することを示している。Ｇ２の核抽出物をＤＯＣで処理すると、同様な抑制された複合体が放出される（図２Ｂ、レーン２）。これは、細胞周期のＧ１およびＧ２にある４４４細胞の核抽出物では、ｐ９２のＤＮＡ結合活性がｐ９２のＤＮＡ結合の核阻害剤に複合体形成されることを示している。この阻害剤の活性は、細胞周期によって制御される。この核阻害剤を、Ｉ−９２と呼ぶ。Ｓ期の活性を制御する機構は、ｐ９２と細胞周期のＧ１およびＧ２における阻害剤Ｉ−９２との環状会合である。ｐ９２とＩ−９２との会合は、不活性な複合体をＤＯＣ処理することによって活性なｐ９２を放出させることができるので、可逆的である。
【００２６】ヒト線維芽細胞において、ｐ９２のＤＮＡ結合もＳ期細胞に限定される。ヒト線維芽細胞を分離して、Ｇ１−、Ｓ−およびＧ２−細胞とし、核抽出物をＥＭＳＡによって分析した。線維芽細胞はヒーラ−線維芽細胞よりも付着性が強い傾向を示すので、極めて豊富なＧ１、ＳおよびＧ２集団への分離は余り良好ではない。ｐ９２の活性は、主としてＳ期に限定されている（図３Ａ、レーン２）。しかしながら、この調製では、Ｇ１細胞抽出物に低いｐ９２活性が観察され、Ｇ１画分に遊離の混入しているＧ２細胞核が見られたので、これは長時間のトリプシン処理の結果とも思われる。対照的に、Ｇ２線維芽細胞の核抽出物には、ｐ９２のＤＮＡ結合活性は見られない。Ｇ２線維芽細胞の核抽出物では、ｐ９２は複合体形成して、阻害剤Ｉ−９２とＤＯＣ感受性の複合体となる（図３ｂ、レーン２および３）。これは、正常なヒト細胞中に阻害剤Ｉ−９２が存在することを示しており、且つｐ９２と阻害剤Ｉ−９２との環状会合によるｐ９２のＤＮＡ結合の細胞周期制御がこれらの正常なヒト線維芽細胞で働いていることも示している。
【００２７】阻害剤Ｉ−９２はインビトロでｐ９２と会合し、そのＤＮＡ結合活性を不活性化するＩ−９２はＤＮＡ結合活性を持たない。これを試験するため、非腫瘍発生性のヒーラ−線維芽細胞ハイブリッド（４４４）の核抽出物を０．２％ＤＯＣで処理した後、７０ミリモルＮａＣｌ中ヘパリンセファロースカラムを通過させた。通過物を集めた。カラムを添加した緩衝液で洗浄した後、結合したタンパク質を６００ミリモルＮａＣｌで溶出した。ＥＭＳＡでは、通過物は抑制されたＤＮＡ−タンパク質複合体を誘導せず、６００ミリモルの溶出物は総てｐ９２結合活性を含んでいた。検出され得るＩ−９２活性を含まないＳ期細胞からのＥＭＳＡでは、３種類の抑制された複合体が形成されていた。上の２つの複合体は、ｐ９２：ＤＮＡ複合体ＡおよびＢに対応している（図４、レーン１）。複合体Ｃにおけるタンパク質の同一性は、現在検討中である。ヘパリンセファロース通過物中のＩ−９２を同定するため、Ｓ期の核抽出物およびｐ９２認識部位を含むオリゴヌクレオチドＲＰ３のＤＮＡ結合反応物に多量の通過物を添加する。５リットルの通過物を添加すると、複合体Ｂが著しく減少し、複合体Ａが幾分減少する（図４、レーン３）。１５リットルの通過物を添加すると、複合体Ｂの形成は完全に妨げられ、２０リットルの通過物を添加した場合には、複合体Ｂも複合体Ａも形成されない。複合体Ｃの形成は、通過物のＤＮＡ結合反応物への添加によっては影響を受けない。２０リットルの通過物を反応物へ添加した後の複合体Ｃが不変であることは、インビトロではＩ−９２はｐ９２と特異的に会合しており、それによってＤＮＡ結合活性が不活性化されることを示している。
【００２８】例１細胞培養および細胞系ヒーラ−線維芽細胞ハイブリッド細胞系（Science, 215, 252-259 (1982)）および正常なヒト線維芽細胞を、１０％ウシ胎児血清を補足したダルベッコの改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）に保持した。ヒーラ−線維芽細胞ハイブリッド細胞ラインは、スタンブリッジ(Stanbridge)博士から提供され、ヒト線維芽細胞はＤＫＦＺの同僚の研究者から提供を受けた。血清饑餓実験については、細胞を１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ中で半集合状態に成長させた後、細胞を０．５％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭに４０時間固定した。血清刺激実験では、細胞を最初に４０時間饑餓状態に置いた後、細胞を１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ中で成長させた。高飽和密度までの成長については、集合状態の細胞を１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ中に４８時間固定した。
【００２９】例２核および細胞質タンパク質の抽出子宮頸癌由来の細胞系およびヒト線維芽細胞の核抽出物は、公表された方法（Mol. Cell. Biol., 7, 787-798 (1987) ）に準じて調製した。０．６５％のＮＰ４０を用いて界面活性剤溶解を行った後、核を４℃で低速遠心分離によって調製し、タンパク質を緩やかに撹拌しながら５２０ミリモルＮａＣｌで溶出させる。保存には、溶出物を、５０％グリセロール、５０ミリモルＮａＣｌ、１０ミリモルヘーペス（ｐＨ７．９）、０．５ミリモルＰＭＳＦおよび０．５ミリモルＤＴＴを含む緩衝液に対して透析を行った。タンパク質濃度は、血清アルブミンを標準試料として用いて比色分析法（バイオラッド(Biorad)）によって測定した。ヒーラ細胞由来の核タンパク質およびＢリンパ芽球腫様系（Ｌａｚ５０９）を、前記の様にしてヘパリンセファロースクロマトグラフィによって濃度増加した（Nature, 317, 84-87 (1985) ）。細胞質タンパク質は、細胞を溶解し、核を低速遠心分離によって除去した後に調製した。細胞質タンパク質を、核タンパク質について、前記と同様にして透析した。
【００３０】例３合成オリゴヌクレオチド一本鎖オリゴヌクレオチドおよび相補性鎖を、アプライド・バイオシステムス(Applied Biosystems)製ＤＮＡシンセサイザーで合成し、調製用の変性アクリルアミドゲル電気泳動によって精製した（分子クローニング：実験室マニュアル(Molecular Cloning: A Laboratory Manual)（コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー(Cold Spring Harbor Laboratory) 、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク）（１９８２年））。全体の長さのバンドをＵＶで影像化し、掻き取り、５００ミリモル酢酸アンモニウムに拡散させることによって溶出させ、エタノールで沈澱させることによって同定した。二本鎖オリゴヌクレオチドを生成させるため、相補性鎖を特異的融解点（Ｔｍ）より低い−３℃の温度でアニールした。放射能標識した二本鎖オリゴヌクレオチドは、ポリヌクレオチドキナーゼと３２Ｐ−γＡＴＰを用いて調製した。ＡＰ２の認識部位の配列は、ヒトメタロチオネインＩＩＡ（ｈＭＴ−ＩＩＡ）遺伝子制御領域由来のものであった（Cell, 51, 251-260 (1987)）。ヒトパピローマウイルスエンハンサー配列（J.Virol., 61, 134-142 (1987) ）を用いて、エンハンサーオリゴヌクレオチドＲＰ２、ＲＰ３、ＲＰ３／４、ＲＰ４、ＲＰ５、Ｓ１ｔｅｔ及びＳ２ｔｅｔを合成した。これらの配列を、表１に示す。
【００３１】
【表１】
【００３２】例４結合部位ブロッティング核タンパク質を８％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上でサイズ分画し（Nature, 329, 680-685 (1970) ）、ＳＤＳなしのレムリの泳動用緩衝液中で水平式ブロッティングチャンバー（アイビーアイ(IBI) ）を用いて室温で一晩１５０ｍＡにおいてニトロセルロースへ移した。ブロッティングの後、結合タンパク質をその場で６モルの塩酸グアニジニウムによって変性し、既報の通りにグアニジニウムの連続希釈によって再結合した（Nucl. Acids Res., 17, 8891 (1989); Genes Dev., 2, 801-806 (1988)）。ニトロセルロース膜を５％の無脂肪乾燥ミルク（カーネーション(Carnation) ）で室温で３０分間ブロックした後、非特異的競合体として５ｇ／mlのポリ（ｄＩｄＣ）（ｄＩｄＣ）の存在下にて５×１０５ｃｐｍ／mlで末端を標識した二本鎖オリゴヌクレオチドと共にインキュベーションした。ＤＮＡ結合用の緩衝液および結合部位ブロットの洗浄条件は既報の通りであった（Nucl. Acids Res., 17, 8891 (1989) ）。
【００３３】例５電気泳動移動度のシフト分析（ＥＭＳＡ）
ＥＭＳＡは、既報の通りに行った（Nature, 319,154-158 (1986)）。エンハンサードメインＩのＥＭＳＡについては、ＨＰＶ１８エンハンサーの機能性ドメインＩをＨＰＶ１８の上流の制御領域を含むクローンであって、１０５０ｂｐのＢａｍＨＩフラグメント上にあるｐＵＲＲ１８から単離した。このフラグメントでは、エンハンサーはＲｓａＩ−ＲｓａＩフラグメント（ＮＴ５８２〜８１０）上に存在する。このフラグメントを、ＲｓａＩおよびＦｎｕ４ＨＩで消化した後、ポリアクリルアミドゲル電気泳動および電気溶出によって単離した。Ｆｎｕ４ＨＩによる消化（位置９１０）により、同時移動(comigrating) プロモーターフラグメントが除かれる。ＢｓｔＮｉ−ＲｓａＩフラグメント（ヌクレオチド６９７〜８１０）上に位置する一つの機能性ドメインのＥＭＳＡでは、ＲｓａＩ（５８２）〜ＲｓａＩ（８１０）フラグメントをＢｓｔＮＩで消化し、ポリヌクレオチドキナーゼで放射能標識した。エンハンサードメインＩを含むフラグメントは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動および電気溶出によって単離した。エンハンサードメインＩを核タンパク質と共にインキュベーションしたところ、５ｇの核抽出物と２．５ｇの非特異的競合体としてのポリ（ｄＩｄＣ）（ｄＩｄＣ）を含んでいた。ＥＭＳＡのために、ＤＮＡを結合用緩衝液中で２５分間室温でインキュベーションし（Nature, 319, 154-158 (1986) ）、低塩ポリアクリルアミドゲル（４％総モノマー、アクリルアミド／Ｎ，Ｎ′−メチレンビスアクリルアミド比＝３０：１）上に載せた。電気泳動は、室温で、１１Ｖ／cmで９０分間行った。ゲルを乾燥して、Ｘ線フィルムに一晩暴露した。
【００３４】例６調製用ＥＭＳＡ調製用ＥＭＳＡについては、１２０ｇの核抽出物に相当する個々の試料を、分析用ＥＭＳＡについてと同様に電気泳動を行った。ポリアクリルアミドゲルを４℃で一晩オートラジオグラフィを行った後、抑制された複合体を掻き取り、溶出用緩衝液（５０ミリモルトリスＨＣ（ｐＨ７．９）、０．１％ＳＤＳ、０．１mg／mlウシ血清アルブミン、１ミリモルＤＴＴ、０．２ミリモルＥＤＴＡ、０．１ミリモルＰＭＳＦ、２．５％グリセロール）でゲルから４℃で１２時間溶出を行った。抑制された複合体からのタンパク質を、アセトン９容で−２０℃で一晩沈澱させ、１３０００ｒｐｍで遠心分離によって回収した。結合部位ブロッティングには、ペレット化したタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用緩衝液で可溶化した。
【００３５】例７核抽出物のデオキシコール酸ナトリウム処理およびヘパリンセファロースクロマトグラフィ４４４細胞（１mg）からの核抽出物を、ＤＮＡ結合用緩衝液（２５ミリモルヘペス（ｐＨ７．９）、５０ミリモルＮａＣｌ、１０％グリセロール、０．０５％ＮＰ４０、１ミリモルＤＴＴ、１ミリモルＥＤＴＡ）２ml中で、０．４％デオキシコール酸ナトリウムで室温で１５分間処理した。ＤＯＣで処理した核抽出物をヘパリンセファロースカラム上に載せる前に、ＤＯＣを１．２％ＮＰ４０を添加することによって複合体形成させた。カラムに載せた後、通過物を再度カラムを通過させた。最終の通過物（２ml）は阻害剤の源として用いた。結合したタンパク質を、６００ミリモルＮａＣｌを含むＧ６００緩衝液を用いるＧ５０の洗浄段階の後ヘパリンセファロースカラムから溶出させた。Ｇ５０およびＧ６００緩衝液は、ＮａＣｌの外に、１０ミリモルトリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５０ミリモルＮａＣｌ、１ミリモルＥＤＴＡ、１ミリモルＤＴＴ、５％グリセロール、０．２％ＤＯＣ、０．２％ＮＰ４０、０．５％ＰＭＳＦを含んでいた。処理法は、既報の処理法にしたがって行った（Science, 242, 540-546 (1988)）。
【００３６】例８阻害用Ｉ−９２活性の検出Ｓ期の４４４細胞（５ｇ）由来の核抽出物を、増加量のヘパリンセファロースカラムを通過させＤＯＣ処理を行った４４４抽出物と共にインキュベーションした。阻害用Ｉ−９２の活性は、ヘパリンセファロース通過画分からのものであった。
【００３７】例９傾瀉による細胞の分離集密度が８０％に過ぎない細胞単層をトリプシンを用いて採取し、血清を含む培地に再懸濁し、傾瀉した。傾瀉のために、１０７〜１０８個の細胞を、マスターフレックス(Masterflex)ポンプヘッドに接続されたＪＥ−６Ｂベックマン(Beckman) 傾瀉ローターに導入した。傾瀉は、１０ミリモルのヘーペスで緩衝したエールのバランス塩溶液中で行った。ヒト胎児の肺線維芽細胞を２０００ｒｐｍで傾瀉した。載荷流速は１４ml／分であり、この検討に用いた画分を１５〜２０ml／分、２６〜２８ml／分、３５〜３８ml／分および４７〜５０ml／分で集めた。非腫瘍発生性のヒーラ−線維芽細胞ハイブリッド（４４４）細胞を、５ml／分で細胞を載荷した後に１６２０ｒｐｍで傾瀉した。画分を得るための流速は８〜１１ml／分、１５〜１８ml／分、２４〜３０ml／分、２４〜３０ml／分および３４〜３８ml／分であった。それぞれの画分の試料をエタノールで固定して、ＤＡＰＩ（４，６−ジ−アミジノ−２−フェニルインドール）で染色し、螢光により活性化した細胞ソーターによって相対的なＤＮＡ含量を分析した。
【図面の簡単な説明】
【図１】結合部位ブロッティングによる細胞周期中のｐ９２のＤＮＡ結合活性を示す説明図。細胞周期のＧ１、Ｓ期およびＧ２からの核および細胞質４４４抽出物の結合部位ブロットであって、ｐ９２のＤＮＡ結合活性が細胞周期の総ての期にあることを示している。Ｇ１（レーン２）、初期Ｓ期（レーン３）、後期Ｓ期（レーン４）およびＧ２（レーン５）における細胞の核抽出物におけるｐ９２のＤＮＡ結合活性。Ｇ１（レーン６）、初期Ｓ期（レーン７）、後期Ｓ期（レーン８）およびＧ２（レーン９）における細胞からの細胞質抽出物。
【図２】ｐ９２の新規な核阻害剤であるＩ−９２がＳ相依存性のｐ９２のＤＮＡ結合活性を制御することを示す説明図。
（Ａ） Ｇ１における４４４細胞からの核抽出物のＥＭＳＡ（レーン１）は、デオキシコール酸ナトリウムで処理することによってｐ９２のＤＮＡ結合活性を放出することができることを示している。０．２％ＤＯＣ（レーン２）、０．４％ＤＯＣ（レーン３）および０．６％ＤＯＣ（レーン４）。
（Ｂ） 核抽出物のＥＭＳＡ。Ｇ２における細胞のｐ９２のＤＮＡ結合活性（レーン１）は０．２％ＤＯＣ処理によって（レーン２）誘導することができる。０．４％ＤＯＣ（レーン３）で処理した後のおよび０．６％ＤＯＣで処理した後の核抽出物。オリゴヌクレオチドＲＰ３をＥＭＳＡに用いた。
【図３】阻害剤Ｉ−９２が正常なヒト線維芽細胞における細胞周期中にｐ９２のＳ期依存性のＤＮＡ結合活性を制御することを示す説明図。
（Ａ） 遠心傾瀉によってＧ１、ＳおよびＧ２細胞に分離したヒト線維芽細胞の核抽出物の核抽出物のＥＭＳＡ。Ｇ１細胞（レーン１）、初期Ｓ期細胞（レーン２）、後期Ｓ期（レーン３）およびＧ２細胞（レーン４）。ｐ９２によって抑制された複合体の位置を示している。
（Ｂ） Ｇ２細胞（レーン１）、０．２％ＤＯＣ（レーン２）および０．４％ＤＯＣ（レーン３）で処理した後の、線維芽細胞の核抽出物のＥＭＳＡ。
【図４】阻害剤Ｉ−９２がインビトロでｐ９２と会合して、ｐ９２のＤＮＡ結合を阻害することを示す説明図。集合した４４４細胞からの核抽出物を０．２％ＤＯＣで処理して、ヘパリンセファロースカラムを通過させた。通過物をＩ−９２の源として用いた。Ｓ期における４４４細胞からの核抽出物のＥＭＳＡであって、Ｉ−９２が不活性であるもの（レーン１）、５リットルのヘパリン−セファロース通過物を添加後のもの（レーン２）、１０リットルの通過物を添加後のもの（レーン３）および２０リットルの通過物を添加後のもの（レーン４）。
【特許請求の範囲】
【請求項１】ヒトパピローマウイルスのＤＮＡエンハンサー配列に特異的に結合することを特徴とする、タンパク質の活性を特異的に阻害する核阻害剤。
【請求項２】ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）の特異的ＤＮＡエンハンサー配列に結合して、タンパク質ｐ９２の活性を特異的に阻害する、請求項１に記載の核阻害剤。
【請求項３】(a) ＤＮＡ結合タンパク質ｐ９２に可逆的に結合することによって、デオキシコール酸ナトリウム感受性複合体を形成し、(b) ＨＰＶのＤＮＡエンハンサー配列に対するｐ９２の結合活性を減少させることを特徴とする、核阻害剤Ｉ−９２。
【請求項４】ｐ９２に関する細胞周期のＧ１およびＧ２相の細胞の粗抽出物に存在する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の核阻害剤。
【請求項５】インビボでの阻害剤の活性を細胞周期によって調節する、請求項４に記載の核阻害剤。
【請求項６】形質転換していないヒーラ−線維芽細胞ハイブリッド細胞または正常なヒト線維芽細胞の粗抽出物中に存在する、請求項５に記載の核阻害剤。
【請求項７】定常期としてｐ９２を用いるアフィニティクロマトグラフィによって得ることができる核阻害剤。
【請求項８】ヒト子宮頸癌の治療のための医薬を製造するための、請求項１〜７のいずれか１項に記載の阻害剤の使用。
【請求項９】請求項１〜７のいずれか１項に記載の核阻害剤に対する多クローン性または単クローン性抗体を含む、子宮頸癌の存在および成長について試料を分析するための診断キット。
【請求項１】ヒトパピローマウイルスのＤＮＡエンハンサー配列に特異的に結合することを特徴とする、タンパク質の活性を特異的に阻害する核阻害剤。
【請求項２】ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）の特異的ＤＮＡエンハンサー配列に結合して、タンパク質ｐ９２の活性を特異的に阻害する、請求項１に記載の核阻害剤。
【請求項３】(a) ＤＮＡ結合タンパク質ｐ９２に可逆的に結合することによって、デオキシコール酸ナトリウム感受性複合体を形成し、(b) ＨＰＶのＤＮＡエンハンサー配列に対するｐ９２の結合活性を減少させることを特徴とする、核阻害剤Ｉ−９２。
【請求項４】ｐ９２に関する細胞周期のＧ１およびＧ２相の細胞の粗抽出物に存在する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の核阻害剤。
【請求項５】インビボでの阻害剤の活性を細胞周期によって調節する、請求項４に記載の核阻害剤。
【請求項６】形質転換していないヒーラ−線維芽細胞ハイブリッド細胞または正常なヒト線維芽細胞の粗抽出物中に存在する、請求項５に記載の核阻害剤。
【請求項７】定常期としてｐ９２を用いるアフィニティクロマトグラフィによって得ることができる核阻害剤。
【請求項８】ヒト子宮頸癌の治療のための医薬を製造するための、請求項１〜７のいずれか１項に記載の阻害剤の使用。
【請求項９】請求項１〜７のいずれか１項に記載の核阻害剤に対する多クローン性または単クローン性抗体を含む、子宮頸癌の存在および成長について試料を分析するための診断キット。
【図１】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開平６−２４５７８７
【公開日】平成６年（１９９４）９月６日
【国際特許分類】
【出願番号】特願平４−２９７９８８
【出願日】平成４年（１９９２）１０月９日
【出願人】（５９１０００８１６）ベーリングベルケ、アクチエンゲゼルシャフト (2)
【氏名又は名称原語表記】ＢＥＨＲＩＮＧＷＥＲＫＥ ＡＫＴＩＥＮＧＥＳＥＬＬＳＣＨＡＦＴ
【公開日】平成６年（１９９４）９月６日
【国際特許分類】
【出願日】平成４年（１９９２）１０月９日
【出願人】（５９１０００８１６）ベーリングベルケ、アクチエンゲゼルシャフト (2)
【氏名又は名称原語表記】ＢＥＨＲＩＮＧＷＥＲＫＥ ＡＫＴＩＥＮＧＥＳＥＬＬＳＣＨＡＦＴ
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