植物における異種タンパク質の改善された発現のための、５’（５’−ＵＴＲ）における最適化されたリーダー機能を有する人工ＤＮＡ配列
ＣＡＡトリヌクレオチドエレメント繰返しとＣＴジヌクレオチドエレメント繰返しとの組合せ等の、遺伝子発現に有利なエレメントを含むヌクレオチドリーダー配列５’−ＵＴＲ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物における異種タンパク質発現を改善するための人工ＤＮＡ配列に関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオテクノロジー分野において、生物に導入した遺伝子の当該生物内での発現レベルを上げる必要が高まっている。この発現レベルは多くの場合満足のいくものではなく、植物や動物のバイオテクノロジーにおける技術革新を産業に利用する際の障害となっている。遺伝子発現レベルの調節能力を特徴付ける多様な構造要素が存在するが、多くのデータが遺伝子発現レベルの調節におけるリーダー領域の重要性を支持している。
【０００３】
この場合、広く普及したベクター（例えば、ｐＢＩ１２１とその派生物や、ｐＣＡＭＢＩＡとその派生物）において提案されている、５’（５’−ＵＴＲ）における非翻訳リーダー配列は、遺伝子組み換え生物における適切な遺伝子発現レベルを目的とするには不適切な多くの問題を抱えている。特に、最大限の収量を確保しなければならない場合（例えば、ヒトにとって有用な化合物の生産のために植物を細胞工場として使用する場合）、５’−ＵＴＲ配列からくる生産関連の制約を取り除くことが必要とされる。この目的のため、リーダーΩ（タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）に元来存在する配列）の使用が植物において提案された。しかしこれもまた不完全で余分なものを含み、改良の余地がある。
【０００４】
ＴＭＶのリーダーΩに存在する翻訳エンハンサーにおけるｐｏｌｙ（ＣＡＡ）領域（Gallie and Walbot 1992 Nucleic Acids Res., 20, 4631-4638(非特許文献１)）は、発現レベルを有意に高める（即ち、in vitro及びin vivoの異種タンパク質翻訳レベルにおけるポジティブな効果がある）ことが知られている（Gallie et al. 1988a Nucleic Acids Res., 16, 883-893(非特許文献２), Gallie et al. 1988b Nucleic Acids Res., 16, 8675-8694(非特許文献３), Gallie 2002 Nucleic Acids Res., 30, 3401-3411(非特許文献４)）。リーダーΩにおいて、ｐｏｌｙ（ＣＡＡ）配列はＡＣＡＡＴＴＡＣ配列の３回繰返しと関連があるが（非特許文献２）、デリーション実験により、発現レベルの増強に関与する調節エレメントはＡＣＡＡＴＴＡＣ配列の単一コピーと（ＣＡＡ）ｎモチーフの組合せで成り立っている可能性が示された（非特許文献１）。
【０００５】
また、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター（Guilley et al. 1982 Cell, 30, 763-773(非特許文献５)）の転写開始部位（Ｉｎｒ）は、ｍＲＮＡの効率的なキャッピングを有利に行うことも知られている。
【０００６】
更に、多くの植物のリーダー（Bolle et al. 1996 Plant Mol. Biol. 32, 861-868(非特許文献６)）はＣＴエレメントに富む配列を有し、このＣＴリッチ配列は転写レベルを変化させることができることが知られている（Chen et al. 1996 J. Virol., 70, 8411-8421(非特許文献７)）。
【０００７】
４１ヌクレオチド以上の長さの配列は、最初のＡＵＧを真正の翻訳開始コドンとして認識させることを促すことも知られている（Kozak 1989 J. Cell. Biol., 108, 229-241(非特許文献８)）。例えば、リーダーを２９ｎｔから７４ｎｔに延長すると、in vitro（Kozak 1991, J. Biol. Chem., 266, 19867-19870(非特許文献９)）及びin vivo（非特許文献１）におけるｍＲＮＡ翻訳レベルの上昇が観察されている。Ａ／Ｔ含量がより多いリーダー配列は発現レベルを向上させるが、これは２本鎖ｍＲＮＡ部分の形成（分子がそれ自身の上に折り畳まれることによってもたらされる）が妨げられるからである。実際、この様な二次構造には確かに翻訳効率を抑制する効果がある（Pelletier and Sonenberg 1985 Cell, 40, 515-526(非特許文献１０)及びKozak 1986 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 2850-2854(非特許文献１１)）。更に、ウイルス由来の５’−ＵＴＲの一部を植物リーダーに導入すると、レポータータンパク質の発現レベルの上昇が反映されることが知られている（Dowson Day et al. 1993 Plant Mol. Biol., 23, 97-109(非特許文献１２)）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Gallie and Walbot 1992 Nucleic Acids Res., 20, 4631-4638
【非特許文献２】Gallie et al. 1988a Nucleic Acids Res., 16, 883-893
【非特許文献３】Gallie et al. 1988b Nucleic Acids Res., 16, 8675-8694
【非特許文献４】Gallie 2002 Nucleic Acids Res., 30, 3401-3411
【非特許文献５】Guilley et al. 1982 Cell, 30, 763-773
【非特許文献６】Bolle et al. 1996 Plant Mol. Biol. 32, 861-868
【非特許文献７】Chen et al. 1996 J. Virol., 70, 8411-8421
【非特許文献８】Kozak 1989 J. Cell. Biol., 108, 229-241
【非特許文献９】Kozak 1991, J. Biol. Chem., 266, 19867-19870
【非特許文献１０】Pelletier and Sonenberg 1985 Cell, 40, 515-526
【非特許文献１１】Kozak 1986 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 2850-2854
【非特許文献１２】Dowson Day et al. 1993 Plant Mol. Biol., 23, 97-109
【非特許文献１３】Tyc et al. 1984 Eur. J. Biochem., 140, 503-511
【非特許文献１４】Schmitz et al. 1996 Nucleic Acids Res., 24, 257-263
【非特許文献１５】Jefferson et al. 1987 EMBO J., 6, 3901-3907
【非特許文献１６】Podromou and Pearl 1992 Protein Eng., 5, 827-829
【非特許文献１７】Wheeler et al. 1996 Gene, 169, 251-255
【非特許文献１８】Prytulla et al. 1996 FEBS Letters, 399, 283-289
【非特許文献１９】Doyle and Doyle 1990
【非特許文献２０】Jefferson 1989
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
従って、本発明の目的は、現在の技術水準の問題点を取り除き、植物における組み換えタンパク質の発現レベルを上昇させるリーダー配列を得ることである。
【００１０】
本出願人は現在の技術水準の問題点を克服し、上述の目的や利点及びその他の目的や利点を得るため、本発明を創出し、試験し、具現化した。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は独立クレームに記述され特徴付けられており、一方、従属クレームは本発明の他の特徴或いは主たる発明思想の変形態様を記述している。
【００１２】
前述の目的を達成するために、本発明に係るリーダー機能を有する５’（５’−ＵＴＲ）人工ＤＮＡ配列（以後、ＬＬ−ＴＣＫと表す）は、ＣＡＡトリヌクレオチドエレメントの繰返しとＣＴジヌクレオチドエレメントの繰返しの組合せ等の、遺伝子発現に有利なエレメントも含む。
【００１３】
本発明に係るＬＬ−ＴＣＫ配列は人工合成により得られた。この配列は自然には存在しないため、知的活動の成果である。
【００１４】
有利な一解決法においては、本発明に係るＬＬ−ＴＣＫ配列は、ＣＡＡトリヌクレオチドエレメントとＣＴジヌクレオチドエレメントの組合せと、リーダーΩ配列に存在する翻訳を活性化する配列の改変物とを提供する。
【００１５】
本発明の一変形態様によれば、本発明に係る配列はｐｏｌｙ（ＣＡＡ）領域（即ち、必須ではないが好ましくは互いに隣接する、２コピー以上のＣＡＡエレメントからなるオリゴヌクレオチド）を含む。
【００１６】
本発明の他の変形態様においては、本発明に係る配列はｐｏｌｙ（ＣＴ）領域（即ち、必須ではないが好ましくは互いに隣接する、２コピー以上のＣＴエレメントからなるオリゴヌクレオチド）を含む。
【００１７】
本発明の一変形態様においては、配列が１コピー以上のＡＣＡＡＴＴＡＣオクタマーを含むものとして提供される。
【００１８】
ｐｏｌｙ（ＣＡＡ）領域の配列とｐｏｌｙ（ＣＴ）領域の配列の組合せから得られる配列もまた、本発明の範囲に含まれる。
【００１９】
ｐｏｌｙ（ＣＡＡ）領域の配列と１コピー以上のＡＣＡＡＴＴＡＣＣオクタマーの配列の組合せから得られる配列もまた、本発明の範囲に含まれる。
【００２０】
更に、ｐｏｌｙ（ＣＴ）領域の配列と１コピー以上のＡＣＡＡＴＴＡＣＣオクタマーの配列の組合せから得られる配列もまた、本発明の範囲に含まれる。
【００２１】
本発明においては、ｐｏｌｙ（ＣＡＡ）領域の配列、ｐｏｌｙ（ＣＴ）領域の配列及び１コピー以上のＡＣＡＡＴＴＡＣＣオクタマーの配列の組合せから得られる配列を提供することが可能である。
【００２２】
更にまた本発明においては、前記配列の内の１以上の配列と、ＣａＭＶ３５ＳのＩｎｒ部位（即ち、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターの転写開始部位）との組合せから得られる配列を提供することが可能である。
【００２３】
従って、本発明に係るＬＬ−ＴＣＫ配列は、トランスジェニック植物における異種タンパク質の発現レベルを上昇させることができる。本発明の有利な解決法においては、その種類独自の本来のパターンに従って次のエレメントの組合せが創出されるよう、新規のＬＬ−ＴＣＫ配列が合成される：
（１）効率的なｍＲＮＡキャッピングのための、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの転写開始部位（Ｉｎｒ）；
（２）ＴＭＶリーダーΩに存在する翻訳エンハンサーと同様のｐｏｌｙ（ＣＡＡ）領域；
（３）多くの植物リーダーと同様のＣＴエレメントリッチ配列。
【００２４】
更に、ＬＬ−ＴＣＫ配列は、最初のＡＵＧを真正の翻訳開始コドンとして認識させることを促すため（非特許文献８）、４１ヌクレオチド以上の長さを有し、全体のＧ＋Ｃ含量は４０％未満である。
【００２５】
本発明における特定の一解決法においては、ＬＬ−ＴＣＫ配列は配列番号１（５’−３’）に示される配列である。
【００２６】
ＬＬ−ＴＣＫに僅かな変異が入っても、その効果に変化がないことは予想できる。この理由から本発明はまた、本配列に由来するリーダー配列（例えば、ＣＡＡトリプレットの欠失や重複、単一の塩基の置換や欠失等の結果生じる配列等）に係るものでもある。
【００２７】
ＬＬ−ＴＣＫの技術革新は、単一のリーダー中に、修飾ｐｏｌｙ（ＣＡＡ）エレメント、ＴＭＶリーダーΩ由来のオクタマー及び植物由来のＣＴリッチ配列を合せ加えたものであるという点にある。
【００２８】
従って、本発明の有利な解決法におけるＬＬ−ＴＣＫ人工配列は、単一のＡＣＡＡＴＴＡＣオクタマーと、該オクタマーに対して５’位置に配されたＣＡＡ９回繰返しとの存在を提供する。
【００２９】
ＡＣＡＡＴＴＡＣエレメント内のＡＴＴトリプレットが標準的でない翻訳開始部位を表し得るため（Tyc et al. 1984 Eur. J. Biochem., 140, 503-511(非特許文献１３)及びSchmitz et al. 1996 Nucleic Acids Res., 24, 257-263(非特許文献１４)）、ＬＬ−ＴＣＫリーダーにおいてこのトリプレットは終止コドンと共にフレーム中に挿入された。
【００３０】
更に、人工ＬＬ−ＴＣＫリーダーにおいて、（ＣＴ）4エレメントはＡＣＡＡＴＴＡＣオクタマーとｐｏｌｙ（ＣＡＡ）配列の結合によって得られる調節エレメントの３’末端に付加された。これら２種のエレメントの組合せ（両者どちらも遺伝子発現においてポジティブな効果を有することが知られている）は、自然界には発見されておらず、またこれまでに人間の手によって作成されたことはない。
【００３１】
これら２種のエレメントの組合せであるＬＬ−ＴＣＫリーダーは、対象遺伝子の翻訳レベルと転写レベルの両方を増強させることができる。
【００３２】
３５Ｓ−ＬＬ−ＴＣＫ：：ｕｉｄＡ（ｐＳＴＡＲＴ）コンストラクトと３５Ｓ：：ｕｉｄＡコンストラクト（元来のリーダーｐＢＩ１２１）をそれぞれ用いて形質転換したタバコ植物体（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｃｕｍ）から得られるｕｉｄＡ遺伝子の発現レベルを比較することにより、その効果が示された。ｐＳＴＡＲＴベクターはｐＢＩ１２１（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））中のリーダー配列をＬＬ−ＴＣＫに置換することにより得られた。特に、置換及び操作の対象は、Ｉｎｒ（ＡＣＡＣＧ）と制限酵素認識部位ＸｂａＩ（ＴＣＴＡＧＡ）との間に含まれるｐＢＩ１２１配列であった。ＡＵＧコドンの認識の可変性を抑制するため、ｕｉｄＡの翻訳開始コドンに隣接する塩基配列は、両コンストラクトにおいて変化させなかった。
【００３３】
レポータータンパク質として、ｕｉｄＡ遺伝子によりコードされる酵素β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）を用いるという選択は、タバコには本来のＧＵＳ様活性が観察されず、ｕｉｄＡ導入遺伝子の発現レベルを、感度、正確性、速度に優れ、容易に実行できるという特徴を有する蛍光定量的検定により測定することができる（Jefferson et al. 1987 EMBO J., 6, 3901-3907(非特許文献１５)）という事実により決定された。
【００３４】
Jefferson（１９８７；非特許文献１５）の記載に従って測定された、形質転換の後に再生した植物体（Ｔ1世代）におけるＧＵＳ酵素活性に関する蛍光定量的測定値は、ＬＬ−ＴＣＫリーダーの存在が、元来のコンストラクトと比べてどの様にｕｉｄＡ遺伝子発現レベルの大幅な増加（１５倍まで）を引き起こすかを示した。
【００３５】
分散分析の結果、検討対象であるタバコ２個体群（ｐＳＴＡＲＴ及びｐＢＩ１２１で形質転換されたもの）に見られる相違は、これら２群における最良発現個体間の差の場合と同様、統計的に有意であることが立証された。
【００３６】
エピジェネティックな変化に由来する効果を除外するため、最初の形質転換の中で最良の個体を自家受精させて得られた後代のＴ2を用いて解析を繰返した。この場合もまた、ｐＳＴＡＲＴで形質転換した植物体は、ｐＢＩ１２１のものよりも非常に高いｕｉｄＡ遺伝子発現レベルを示した。特に、全ての植物体を全体として考慮した場合、８．６倍相当の活性の増加が観察され、上記の平均的な発現個体のみを考慮した場合は１２．５倍相当の増加が観察された。
【００３７】
ｕｉｄＡ遺伝子の転写におけるＬＬ−ＴＣＫの効果を決定するため、Ｔ2植物体を選択（ｐＢＩ１２１から１０個体、ｐＳＴＡＲＴから１３個体）し、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを用いる転写レベル解析のために、中間物ＧＵＳのレベルによって特徴付けた。各植物体から抽出した全ＲＮＡから、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲのテンプレートに用いるｃＤＮＡを合成した。２組のプライマー（１組はｕｉｄＡ遺伝子、もう１組は内在性遺伝子の１８Ｓ ＲＮＡに特異的）と、ＳＹＢＲ−Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（アプライドバイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））を使用した。コントロールプラスミドを連続希釈したものを用いて２本の検量線（１本は導入遺伝子、もう１本は内在性遺伝子）を作成することにより、正確な定量が可能となった。次に各サンプルにおいて、ｕｉｄＡ遺伝子の転写レベルを、導入遺伝子について検出されたｍＲＮＡ量とリボソーマル１８Ｓ ＲＮＡの対応する量との間の％比によって、相対値として算出した。
【００３８】
この解析により、ｐＳＴＡＲＴ植物体におけるｕｉｄＡ遺伝子の平均転写レベルが、ｐＢＩ１２１植物体で観察されたものよりも１．７倍高かったことを証明できた。
【００３９】
同様の転写値によって特徴付けられる７対のｐＳＴＡＲＴとｐＢＩ１２１植物体に対してＴＥＩ（翻訳効率指数）を計算した。ＴＥＩは蛍光定量アッセイで測定したＧＵＳタンパク質の値と、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲで決定した相対的に標準化されたｍＲＮＡの値との比率に等しい。ＴＥＩを比較することによって、新規のＬＬ−ＴＣＫリーダーがｍＲＮＡレベルに効果があるだけではなく、ｍＲＮＡの翻訳効率を増加させることもできることが明らかになった。
【００４０】
ＬＬ−ＴＣＫ配列は、対象遺伝子に関するｍＲＮＡ含有量レベルと、存在するタンパク質の最終量レベルの両方に作用することによって、異種タンパク質の発現レベルを増加させることができる。
【００４１】
構成要素であるＣａＭＶ３５Ｓプロモーターと酵素β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）をコードするｕｉｄＡ遺伝子とを用いてＬＬ−ＴＣＫの効果をタバコで研究したが、他のプロモーターや他の遺伝子を組合せれば、他の用途も可能である。
【００４２】
本明細書で報告される実施例において、ＬＬ−ＴＣＫリーダーはタバコ植物体においてｕｉｄＡの発現を増強するためＣａＭＶ３５Ｓプロモーターと組合せて用いられるが、該リーダーはまたタバコ及びジャガイモにおいて、光誘導可能なｒｂｃＳ１プロモーター（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＡＹ１６３９０４）の下流や、イネにおいて胚乳特異的、フェーズ依存的なｇｌｕｂ４プロモーター（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＡＹ４２７５７１）の下流にも良好に用いられる。これらの実験に用いられる遺伝子は、マウスＢＣＬ１抗体、ヒトβ−グルコシダーゼ及び合成エラスチン様ポリマーをコードする遺伝子であった。異なる長さ、塩基組成、構造によって特徴付けられる関連のない遺伝子を、本質的に異なる活性のプロモーターの制御下に置き、単子葉だけでなく双子葉でも発現させる実験を行った。この実験において機能の欠失は記録されなかったため、ＬＬ−ＴＣＫリーダー又は同様に構成された５’−ＵＴＲの有用性は、非特異的（即ち、特定のプロモーター及び／又はコード配列との組合せに限定されず、特定の宿主生物種に限定されない）であると言える。従って、本発明の好ましい実施形態は、バイオテクノロジーへの応用を含み、これらは生物的／非生物的ストレス及び除草剤に対する抵抗性；バイオ燃料、バイオプラスチック、合成ポリマー及び工業用酵素の生産；バイオ医薬品（例えば、抗体及びその断片、ワクチン、ヒト酵素、サイトカイン及び成長因子）の分子農業；食料、飼料及び繊維の品質改良；レポーター及びマーカー遺伝子システムの開発を含む。
【００４３】
更に、植物の発現ベクター内に次のエレメント、即ち、ＣａＭＶ３５ＳのＩｎｒ部位、ｐｏｌｙ（ＣＡＡ）ｎ、ＡＣＡＡＴＴＡＣオクタマー、ｐｏｌｙ（ＣＴ）ｎ（ｎは２以上のいかなる数字であっても良い）、が同時に存在する５’−ＵＴＲを構築することは、本発明の範囲に含まれる：
【００４４】
上述の様に発現する５’−ＵＴＲリーダー配列を構成するエレメントの全ての可能な組合せ又は関連する変種（その相対的な５’−３’位置に関係なく）は、本発明の範囲に含まれる。
【００４５】
更に本発明はまた、前記配列又はその変種に相補的な配列にも関する。
【００４６】
本発明の一変形態様においては、本発明に係る配列は、２０〜２００ヌクレオチド、好ましくは４０〜１５０ヌクレオチドの長さを有する。
【００４７】
本発明の一変形態様においては、本発明に係る配列は６０％未満、好ましくは５０％未満のＧ＋Ｃ含量を有する。
【００４８】
配列番号２〜７に示されるヌクレオチド配列又はそれらの相補配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む１種以上の増幅プライマーもまた、本発明の範囲に含まれる。
【００４９】
本発明の他の実施形態においては、本発明の配列は：
ａ）人工合成；
ｂ）自然又は人工の配列内における、自然又は誘導される組み換え又は突然変異；
により得ることができる。
【００５０】
本発明の一特徴はまた、１種以上の該増幅プライマーを用いた、前述の配列の人工合成法に関する。
【００５１】
本発明に係る配列の自然界に発見される可能性のある、且つ、当業者には重要でない(non-significant)変種とも思われる５’−ＵＴＲリーダー配列も、機能的に類似であるならば、本発明の範囲に含まれる。
【００５２】
本発明に係る配列の突然変異プロセスに由来する配列であって、且つ、当業者には重要でない変種と思われる配列であっても、機能的に類似であるならば、本発明の一部である。この突然変異は、本発明に係る配列又はその相補的な配列における１以上のヌクレオチドの欠失、挿入、トランジション、トランスバージョンのいずれかに関する。
【００５３】
本発明はまた、本発明に係る配列を含むプラスミドを運ぶ細菌株（特に、Escherichia coli、Agrobacterium tumefaciens及びAgrobacterium rhizogenesの種に関連する）に関する。
【００５４】
本発明はまた、宿主生物の種類を問わず、本発明に係る配列を含む人工の細菌株に関する。
【００５５】
更に、構成プロモーターの制御下にある、本発明に係る配列を含む発現ベクターで形質転換した植物細胞もまた、本発明の範囲に含まれる。
【００５６】
本発明は次のものも含む：
− 組織特異的プロモーター、特に種子特異的プロモーターの制御下にある、本発明に係る配列を含む発現ベクターで形質転換した植物細胞；
− 誘導可能なプロモーターの制御下にある、本発明に係る配列を含む発現ベクターで形質転換した植物細胞；
− フェーズ依存的転写活性を有するプロモーターの制御下にある、本発明に係る配列を含む発現ベクターで形質転換した植物細胞；
− 葉緑体で活性を有するプロモーターの制御下にある、本発明に係る配列を含む発現ベクターで形質転換した植物細胞；
− ミトコンドリアで活性を有するプロモーターの制御下にある、本発明に係る配列を含む発現ベクターで形質転換した植物細胞。
【００５７】
本発明はまた、そのメッセンジャーＲＮＡが本発明に係る配列を含む、あらゆるタンパク質を一過的に発現することを特徴とする植物を含む。一過的な発現とは、ウイルスベクター、アグロ浸潤法（agroinfiltration）、エレクトロポレーション、粒子を用いた導入法（particle delivery）による該タンパク質の生産を意味すると解釈されたい。
【００５８】
本発明はまた、本発明に係る配列を含む発現ベクターで安定的に形質転換した双子葉植物（特に、ナス科（Solanaceae）、マメ科（Papilonaceae）、アブラナ科（Cruciferae）に属する種に関連するが、これらに限定されない）と、該双子葉植物の後代に関する。
【００５９】
本発明はまた、本発明に係る配列を含む発現ベクターで形質転換した単子葉植物（特に、イネ科（Graminaceae（Poaceae））に属する種に関連するが、これに限定されない）と、該単子葉植物の後代に関する。
【００６０】
本発明は、次の活動の内のいずれかのために本発明に係る配列を使用することにも関するため、産業的に有利な用途を提供する。
− バイオテクノロジーによる分子の生産；
− 組み換えタンパク質の合成；
− ウイルス性、細菌性又は真菌性の病原体に対する抵抗性を誘導することを目的とする組み換えタンパク質の合成；
− 除草剤に対する抵抗性を誘導することを目的とする組み換えタンパク質の合成；
− 原料とそれに由来する製品において脂肪酸の組成を変えることを目的とする組み換えタンパク質の合成；
− 原料とそれに由来する製品において栄養価を変えることを目的とする組み換えタンパク質の合成；
− 燃料、ゴム及びバイオプラスチックの生産を目的とする組み換えタンパク質の合成；
− 工業用酵素と商業用タンパク質の合成；
− 医薬用タンパク質の合成；
− ヒト又は動物を対象とする経口投与ワクチンの合成；
− ヒト又は動物を対象とする注射可能なワクチンの合成；
− 好ましくはイディオタイプ特異的でリンパ系腫瘍の治療に用いられる、患者特異的で注射可能なワクチンの合成；
− 二次代謝産物の生成に関わるタンパク質の合成；及び
− 形質転換細胞を同定及び／又は選抜する因子として、直接的又は間接的に用いられるタンパク質の合成。
本発明のこれら及び他の特徴は、以下、添付図面を参照しつつ、数例の好ましい実施形態の説明により明らかとなるが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】ｐＢＩ１２１のリーダー配列とｐＳＴＡＲＴのリーダー配列との比較である。図中の下線は、転写開始部位を示す。ＥｃｏＲＶ部位と転写開始部位との間の配列と、ＸｂａＩ部位とｕｉｄＡのＡＴＧトリプレットとの間の配列は、ｐＳＴＡＲＴとｐＢＩ１２１で同一であり、これら配列は一部省略する（ドット）。
【図２】トランスジェニックＴ1植物体におけるβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）の発現レベルを示す。
【図３】トランスジェニックＴ2植物体におけるβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）の発現レベルを示す。植物体は、各群が最良のＴ1形質転換体に由来する姉妹植物体を表すよう４群に分けられる。最少の有意差（Ｐ＝０．０１）は、４．７Ｕ／ｍｇ（全タンパク質）である。
【図４】図４ａは、中間β−グルクロニダーゼ発現レベルにより特徴付けられ、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより決定される、ｐＳＴＡＲＴ及びｐＢＩ１２１により得られるＴ2植物体におけるｕｉｄＡ（ｇｕｓＡ）の相対転写レベルを示す。類似の転写レベルの７対の植物体が同定されている。図４ｂは、類似の転写レベルのＴ2植物体の翻訳効率指数（ＴＥＩ）の値を示す。ＴＥＩは次のように計算される。各形質転換体に関して、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）濃度［Ｕ／ｍｇ（全タンパク質）］をｍＲＮＡの相対標準化レベルで割る。最大のＴＥＩは１．００相当と考えられ、各トランスジェニック植物で記録される値はそれに従って表わされる。
【図５】繰返しＰＣＲ(recursive PCR)によるＬＬ−ＴＣＫ合成のためのリバースプライマーとフォワードプライマーが重なっている図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６２】
Ａ）配列番号１に示されるＬＬ−ＴＣＫ人工リーダー配列の合成
【００６３】
Ａ．１）ＬＬ−ＴＣＫ配列又は同様に構成された５’−ＵＴＲの合成を達成するには、市販の特注サービスを利用した人工合成によるのが非常に便利である。長さが制限された配列であるため、プロモーター配列（５’フランキング領域の場合）とコード配列（３’フランキング領域の場合）に元来存在する制限酵素認識部位を末端に有するフランキング領域をリーダーの両側に付加する方法が特に有用である。プロモーター及び／又はコード配列の修飾を同時に計画しているのでなければ、これらフランキング領域がそれぞれ開始部位（Ｉｎｒ）の上流配列とコード配列を正確に再生するであろうことは、当業者には明らかである。
【００６４】
Ａ．２）前記リーダー配列を得るための他の手続きとして繰返しＰＣＲがある（Podromou and Pearl 1992 Protein Eng., 5, 827-829(非特許文献１６)、Wheeler et al. 1996 Gene, 169, 251-255(非特許文献１７)及びPrytulla et al. 1996 FEBS Letters, 399, 283-289(非特許文献１８)）。
【００６５】
いずれかの方法によって、ＬＬ−ＴＣＫ配列又は同様に構成された５’−ＵＴＲが得られれば、ＰＣＲ又はランダム若しくはin situ突然変異誘発のために開発された他の手続きによって、容易にリーダーの変種を作成することができる。
【００６６】
本実施例では、ｐＢＩ１２１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ４８５７８３）に挿入（特に、ＣａＭＶ３５ＳプロモーターとｕｉｄＡコード配列の間に）するための、繰返しＰＣＲによるＬＬ−ＴＣＫ合成について報告する。
【００６７】
４２〜５４ｎｔの間の長さで且つ２４ｎｔ相当の部分重複を有する、プライマーとして用いられる５本の合成オリゴヌクレオチドと、１９ｎｔの末端リバースプライマーをそれぞれ配列番号２、３、４、５、６及び７の配列として示す。
【００６８】
全プライマーは５’−３’方向で記される。配列番号２、４及び６の配列はフォワードプライマー、配列番号３、５及び７はリバースプライマーである。図５によると、フォワードプライマーとリバースプライマーは互いにオーバーラップする。
【００６９】
ＬＬ−ＴＣＫの操作と、対象ベクター配列への挿入を容易にするため、ＥｃｏＲＶ部位で始まる末端部を５’側に付加し、単一のＸｂａＩ部位を３’末端に付加した。
【００７０】
従って、３５Ｓプロモーターの３’末端部（ＥｃｏＲＶ部位からＩｎｒ領域の間）の改造を提供するようプライマーを設計し、続くｐＢＩ１２１ベクター（クロンテック）への挿入を容易にした。
【００７１】
外側のリバースプライマーの３’末端にＸｂａＩ部位を導入し、一方５’にはＥｃｏＲＶ部位が用いられる。
【００７２】
ｐＢＩ１２１においてこれらの部位はそれぞれＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの内側とｕｉｄＡの翻訳開始シグナルの近傍に存在する。従ってこの合成には、所望の配列と、［ＥｃｏＲＶ−ＸｂａＩ］断片を置換するためのクローニングとが提供された。
【００７３】
ＣａＭＶ３５ＳのＥｃｏＲＶ部位と開始部位との間の領域におけるプロモーター配列を確認するため、またＬＬ−ＴＣＫを合成し、クローニング用に３’末端に分子フックを提供するため、配列番号２〜７に示されるヌクレオチド配列を含むプライマーを設計、作成した。
【００７４】
ＬＬ−ＴＣＫ合成は１回のＰＣＲによって行われた。該ＰＣＲは、外側のプライマーである配列番号２と７（合成部位の両末端に対応する）の濃度が、内側のプライマーである配列番号３、４、５及び６の濃度よりも１００倍濃いＰＣＲ反応液を用いた。
【００７５】
より厳密なＤＮＡ合成を行うため、５０％減少させた濃度のｄＮＴＰと共に、プルーフリーディングＤＮＡポリメラーゼを用いた。
【００７６】
ＰＣＲ反応液は次の通りである：
１０×Ｐｆｕバッファー（１５ｍＭ Ｍｇ2+含有）：１０μＬ
配列番号２ プライマー［１０μＭ］：２μＬ
配列番号３ プライマー［０．１μＭ］：２μＬ
配列番号４ プライマー［０．１μＭ］：２μＬ
配列番号５ プライマー［０．１μＭ］：２μＬ
配列番号６ プライマー［０．１μＭ］：２μＬ
配列番号７ プライマー［１０μＭ］：２μＬ
Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ［３Ｕ／μＬ］：０．８μＬ
ｄＮＴＰ［各２．５ｍＭ］：４μＬ
最終量１００μＬになるよう水を加える。
【００７７】
特に、ＤＮＡの合成と増幅のために、ＴａｑポリメラーゼＰｆｕ（プロメガ（Promega））を用いて次のサイクルに付した（１×（９５℃、５分間）；４０×（９５℃、１５秒間；４８℃、３０秒間；７２℃、２０秒間）；１×（７２℃、７分間））。
【００７８】
ＰＣＲ産物をエタノール沈澱により精製し、ＴＡＥバッファー中で１％アガロースゲル電気泳動し、市販のキットを利用してゲルから回収し、ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ（商標）でＡテールを付加し、両方のＤＮＡ鎖のシーケンス解析のため、ｐＧＥＭ(登録商標)−Ｔ（プロメガ）にライゲーションした。
【００７９】
ライゲーション反応液を用いて大腸菌（Escherichia coli）ＪＭ１０１株のコンピテントセルを形質転換した。二本鎖のシーケンス解析によって、クローニングした配列と設計した配列との間に不一致が全くないことを証明した。
【００８０】
Ｂ）ＬＬ−ＴＣＫ配列を含む植物の発現ベクターの構築
ＬＬ−ＴＣＫ配列又は同様に構成された５’−ＵＴＲに、可能なフランキング領域又は分子フックを付加することにより、異なる種類の発現ベクターにおける広範囲のクローニングの解決法を提供する。本実施例においては、ｐＢＩ１２１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ４８５７８３）中の［ＥｃｏＲＶ−ＸｂａＩ］断片の代わりに、実施例１の［ＥｃｏＲＶ−ＸｂａＩ］断片をクローニングするのに用いる方法を説明する。ｐＢＩ１２１はＣａＭＶ３５Ｓプロモーター内部の外に複数のＥｃｏＲＶ部位を有するため、ＨｉｎｄＩＩＩとＸｂａＩの制限酵素の使用によって後者のプロモーターをｐＢＩ１２１（クロンテック）から切り出した（非特許文献１５）。
【００８１】
ＴＡＥバッファー中の１％アガロースゲルから断片を回収し、前もって同じ酵素を用いて消化したｐＵＣ１８（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｌ０８７５２）にサブクローニングした。
【００８２】
前述の通り、ｐＢＩ１２１が複数のＥｃｏＲＶ部位を有するため、この過程が必要とされる。得られたｐＵＣ１８／３５Ｓベクターを、３５Ｓプロモーター−ＬＬ−ＴＣＫリーダーの新規の組合せを作成するために使用した。
【００８３】
ＥｃｏＲＶとＸｂａＩ（ＮＥＢ）の消化によって、ｐＧＥＭ−ＴベクターからＬＬ−ＴＣＫ配列を切り出し、アガロースゲル電気泳動を用いてベクター配列から分離し、次に市販のキットを利用してゲルから回収した。次にｐＵＣ１８／３５Ｓベクターを同じ酵素で消化し、アルカリホスファターゼ（ファルマシア）で処理し、電気泳動し、上記の通りにゲルから回収した。続いてＴ４ＤＮＡライゲース（プロメガ）の存在下４℃で１６時間ライゲーション反応を行った。特に、適切な反応バッファーを含む１０μＬ容量中、Ｔ４ＤＮＡライゲース（１Ｕ）の存在下、［ＥｃｏＲＶ−ＸｂａＩ］断片（３．５ｎｇ）をベクター（２５ｎｇ）に組み込んだ。
【００８４】
ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターを除去するため、ｐＢＩ１２１ベクター（クロンテック）をＸｂａＩとＨｉｎｄＩＩＩ（ＮＥＢ）で消化した。次に同じ酵素を用いて、３５Ｓ−ＬＬ−ＴＣＫ複合体をクローニングベクターｐＵＣ１８から切り出した。上述の様にｐＢＩ１２１ベクターフレームと３５Ｓ−ＬＬ−ＴＣＫインサートを電気泳動し、ゲルから回収した。最後に、ｐＢＩ１２１フレームワークに３５Ｓ−ＬＬ−ＴＣＫをライゲーションし、得られたｐＢＩ１２１／３５Ｓ−ＬＬ−ＴＣＫ：：ｕｉｄＡ：：ＮＯＳベクターをｐＳＴＡＲＴ（図１）と命名した。
【００８５】
Ｃ）ＬＬ−ＴＣＫ配列を含む発現ベクターによる植物の形質転換
ＬＬ−ＴＣＫ又は同様に構成された５’−ＵＴＲを含むトランスジェニック植物は、Agrobacterium spp.人工株による重感染、フィトウイルス人工株による感染又はトランスフェクション、エレクトロポレーション、粒子を用いた導入、ＤＮＡマイクロインジェクションを含む一連の方法によって作出できる。
【００８６】
ｐＳＴＡＲＴ発現ベクターをアグロバクテリウム（Agrobacterium tumefaciens）ＥＨＡ１０５株にエレクトロポレーションし、形質転換したアグロバクテリウム細胞をタバコ（Nicotiana tabacum L., cv. Xanthi）の形質転換に用いた。即ち、カナマイシン（５０ｍｇ／Ｌ）含有ＬＢ培地（２ｍＬ）に、形質転換したアグロバクテリウム細胞を植菌した。細菌培養液を２９℃で１６時間インキュベートした。無菌培養した３０日目の実生又は後期ロゼットの植物体の成熟葉から、コルクボーラーを用いてリーフディスク（直径７ｍｍ）を得た。後者の場合、タバコの葉を蒸留水でリンスし、１％次亜塩素酸ナトリウムで５分間、９５％エタノールで３０秒表面殺菌し、層流フード下無菌ろ紙上で水気を拭き取った。
【００８７】
ナフタレン酢酸（ＮＡＡ；０．１ｍｇ／Ｌ）、６−ベンジルアデニン（ＢＡ；１ｍｇ／Ｌ）、ショ糖（３０ｇ／Ｌ）を含み、寒天（８ｇ／Ｌ）で固めたムラシゲ・スクーグ培地（１５ｍＬ）の入ったペトリ皿にリーフディスクを置いた。この移動の後すぐに前記アグロバクテリウム培養液（２ｍＬ）をペトリ皿に注ぎ、リーフディスクを均一に湿らせた。余剰のＬＢ培地を取り除いた後ペトリ皿を密封し、２５℃明条件（３０．５μＥ／平方メートル／秒）で２４時間インキュベートした。
【００８８】
ナフタレン酢酸（ＮＡＡ；０．１ｍｇ／Ｌ）、６−ベンジルアデニン（ＢＡ；１ｍｇ／Ｌ）、セフォタキシム（５００ｍｇ／Ｌ）、ショ糖（３０ｇ／Ｌ）を含み、寒天（８ｇ／Ｌ）で固めたムラシゲ・スクーグ培地（１５ｍＬ）の入った新しいペトリ皿に、リーフディスクを移した。これを２８℃、１６時間／日の照明で１週間インキュベートした；これを、カナマイシン（２００ｍｇ／Ｌ）が加わる以外は前述の基質と同じ培地に最終的に移した。外植片を３週間毎に継代培養し、再生したシュートをカルス組織から分離し、インドール−３−酪酸（２ｍｇ／Ｌ）、セフォタキシム（５００ｍｇ／Ｌ）、カナマイシン（２００ｍｇ／Ｌ）、ショ糖（３０ｇ／Ｌ）を含む半固体のムラシゲ・スクーグ培地に植え付けた。
【００８９】
推定トランスジェニック植物体をピートの鉢に植え、Ｐｏｗｅｒｓｔａｒ ＨＱＩ−Ｔランプ（Ｏｓｒａｍ）（天蓋レベルにおいて２００ｍＭフォトン／平方メートル／秒）照明を１６時間／日、２５℃／１９℃（明／暗）の温室で育成した。
【００９０】
本実施例において、ＰＣＲとβ−グルクロニダーゼアッセイにより形質転換の確認を行った。ＰＣＲアッセイにおいては、Doyle and Doyle (1990)(非特許文献１９)に従って全ＤＮＡを抽出し、次のプライマーを使用した。
フォワード ５’−ＡＣＡＡＴＴＡＣＧＴＡＴＴＴＣＴＣＴＣＴＣＴＡＧＡ−３’
リバース ５’−ＣＧＡＴＣＧＧＧＧＡＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣ−３’
【００９１】
フォワードプライマーとリバースプライマーは、それぞれＬＬ−ＴＣＫ配列の末端と、ＮＯＳターミネーターの一部にアニーリングし、形質転換していないＸａｎｔｈｉ植物体では増幅産物を生じない（トランスジェニック植物体では複製配列の長さは予想通り１９３６ｂｐである）。
【００９２】
標準的な反応液を作成し、次の温度サイクルを用いた場合、再生した植物体の約９３％がトランスジェニックであることが判明した。
サイクル：１×（９４℃、５分間）；４０×（９４℃、１分間１５秒間；６０℃、４５秒間；７２℃、２分間）；１×（７２℃、５分間）。
【００９３】
植物の形質転換は、ＧＵＳ組織化学的アッセイ（非特許文献１５）とＧＵＳ活性の蛍光定量的測定により更に示された。コントロールは、感染していないディスクからin vitroで育成したＸａｎｔｈｉ植物体からなる。蛍光定量的アッセイの方法と得られた結果とをポイントＤで更に詳しく報告する。
【００９４】
同様の手順に従って、元来のリーダー配列を含むトランスジェニック植物体を作成し、特徴付けた。他の条件が同じであれば、ＬＬ−ＴＣＫ配列は再生と形質転換の比率に影響がないことを記す。
【００９５】
Ｄ）導入遺伝子発現レベルにおけるＬＬ−ＴＣＫ配列の影響
前記の通り、ｐＢＩ１２１プラスミドとｐＳＴＡＲＴプラスミドのそれぞれを、アグロバクテリウムを介したタバコリーフディスクの形質転換に用いた。いずれの場合にも、制御される遺伝子はｕｉｄＡ（ｇｕｓＡとしても知られる）であるため、ＬＬ−ＴＣＫと広く普及したｐＢＩ１２１リーダーとで得られる導入遺伝子の発現レベルは、ｕｉｄＡがコードするβ−グルクロニダーゼ（ＥＣ３．２．１．３１）酵素活性の測定により直接的に比較することができる。各個体群から約２０個体の第一の形質転換体（第一世代Ｔ1に属するトランスジェニック植物体）についてＰＣＲにより導入遺伝子の有無をアッセイし、続いてβ−グルクロニダーゼ活性を解析した（図２）。ロゼット後期に達したら（硬化３０日）各植物体から最も若い葉３枚を採取し、押しつぶすことにより粗サップを得た（エリッヒ・ポレーネ）；粗サップ（１００μＬ）を、高分子ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）（１２ｍｇ）を含む２容量の抽出液（Jefferson 1989(非特許文献２０)）と混合した。１１，５００×ｇで１５分間遠心分離した後、上清を集め、４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルクロニド（ＭＵＧ；シグマアルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ））を基質に用いて２回蛍光定量的に解析した（Ｄｙｎａ Ｑｕａｎｔ２００フルオロメーター；ＧＥヘルスケア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））。サンプルの内因性蛍光、消光及び組み換え酵素以外の要因による基質の分解によるバックグラウンドノイズを測定するための試行を行った。導入遺伝子発現レベルを、粗サップ１ｍＬ当たりのβ−グルクロニダーゼユニットとして測定した。１ユニットは前記（非特許文献２０）と同じアッセイ条件を用いた際、１分間当たり１ｎＭの４−メチルウンベリフェロン（４−ＭＵ）を放出する酵素量によって定義された。分散と平均との間の相互関連を避けるため、データをログ変換して提供した。コロモゴロフ−スミルノフテストによってログデータ分散の正規性を、バートレット検定式によって分散の均一性をチェックした後、分散分析を行った。ダンカンの多重範囲検定法により確率水準Ｐ＝０．０５で平均を比較した。
【００９６】
蛍光データについて行わった分散分析は、同一植物体の若い葉の間では有意な分散はないが、植物体間には大きな差があることを示した。特に、合成リーダーはｕｉｄＡ発現において非常に大きな増加（１５倍まで）を測定した（表１）。
【００９７】
【表１】
【００９８】
エピジェネティックな変化によってこれらの結果が偏向していないことを示すため、分析をＴ2後代で繰返した。特に、各個体群から最良のＴ1を４個体自家受粉し、得られた種子を、選抜のためカナマイシンリッチ培地に蒔いた。各後代から抵抗性のある５〜７個体のＴ2植物体をランダムに選択し、ＰＣＲによる遺伝子導入の確認と蛍光定量的アッセイによるβ−グルクロニダーゼ活性の測定のために、ロゼット後期まで育成した。酵素レベルは先の粗サップ１ｍＬ当たりのユニットに加えて、植物間の代謝の変化を評価するために全タンパク質１ｍｇ当たりのユニット（ブラッドフォードアッセイによって測定）でも示した。
【００９９】
Ｔ1世代における観察と同様に、新規のリーダーを含むＴ2トランスジェニック植物体は有意により高いｕｉｄＡ発現レベルを示した（図３）；ｐＢＩ１２１リーダーと比較した場合、８．６倍と１２．５倍の活性増加が、それぞれ全植物個体群又は前記平均的な発現個体の評価によって見積もられた（表２）。
【０１００】
【表２】
【０１０１】
Ｅ）遺伝子の転写及び翻訳におけるＬＬ−ＴＣＫ配列の効果
ＬＬ−ＴＣＫ又は同様に構成された５’−ＵＴＲにおける、異なるエレメントの組合せは、得られた導入遺伝子の翻訳効率だけでなく、転写における測定可能な改善として反映される。本実施例においてこの様な改善は、前述の通りｐＢＩ１２１とｐＳＴＡＲＴで得られたＴ2タバコトランスジェニック植物体において観察される。その証拠を集めるため、ｐＢＩ１２１群又はｐＳＴＡＲＴ群に属する植物体（それぞれ１０個体と１３個体のＴ2）を中間ｕｉｄＡ発現レベルによって特徴付け、次のことを決定するため解析した。
ｉ．ｕｉｄＡの平均転写レベル；
ｉｉ．１８Ｓ ＲＮＡの平均転写レベル；及び
ｉｉｉ．実際に生産されたβ−グルクロニダーゼの量。
【０１０２】
実験上のエラーを最小にするため、各植物体から１枚の若い葉を採取し、２分割し、半分をＲＮＡ分離に用い、もう半分をβ−グルクロニダーゼアッセイに用いた。
【０１０３】
ＲＮＡｇｅｎｔｓ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ）を用いて全ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡ（１μｇ）からＡＭＶ逆転写酵素（プロメガ）を用いてランダムプライマーの存在下ファーストストランドｃＤＮＡを合成した。ｃＤＮＡ合成反応液を１：５に希釈し、１μＬをリアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）に用いた。
【０１０４】
ＳＹＢＲ−Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（アプライドバイオシステムズ）と特異的プライマー（各０．３μＭ最終濃度）を用いてｑＲＴ−ＰＣＲを行った。全ての反応は、ｉＣｙｃｌｅｒ ｉＱマルチカラーリアルタイムＰＣＲデテクションシステム（バイオラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ））を用いて、次のプログラムに従って行った。
プログラム：１×（９５℃、１０分間）；５０×（９５℃、１５秒間；６２℃、３０秒間；７２℃、３０秒）。
ｕｉｄＡ転写産物を増幅するため、次のプライマーを用いた：
フォワード ５’−ＴＴＡＣＧＣＴＧＡＡＧＡＧＡＴＧＣＴＣＧＡＣ−３’
リバース ５’−ＣＣＴＡＡＡＧＡＧＡＧＧＴＴＡＡＡＧＣＣＧＡＣＡＧ−３’
【０１０５】
１８Ｓ ＲＮＡ標的配列のため、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＪ２３６０１６を元にプライマーを設計した：
フォワード ５’−ＡＣＡＴＣＣＡＡＧＧＡＡＧＧＣＡＧＣＡＧ−３’
リバース ５’−ＧＡＣＴＣＡＴＡＧＡＧＣＣＣＧＧＴＡＴＴＧＴＴＡＴＴ−３’
【０１０６】
いずれの場合にも、複製配列の長さは９０ｂｐであった。各ＰＣＲにおいて、コントロールプラスミドの連続希釈を既知量のインプットコピー数に応じて加え、標準検量線を引いた。特に、１０倍連続希釈（１０5〜１０2コピー）のｕｉｄＡ含有ｐＢＩ１２１プラスミドをテンプレートに用いた。同様の目的のため、１８Ｓ ＲＮＡ遺伝子（ＡＪ２３６０１６）の５５０ｂｐ断片をｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ（プロメガ）にクローニングし、１０8〜１０5コピーの範囲内で使用した。
【０１０７】
ＩＣｙｃｌｅｒ ＩＱリアルタイムデテクションシステムソフトウエアver.3.0を用いてｕｉｄＡ転写産物とコントロールＲＮＡの開始時の量を測定した。各サンプルに対して、少なくとも３回の独立した測定を行った。全てのケースにおいて、変動係数（ＶＣ＝ＳＤ／平均）の最大値は、２０％に固定された。ｕｉｄＡと１８Ｓ ＲＮＡの間の平均転写レベルの％比を各サンプルに対して計算した。データを標準化するため、最大ｕｉｄＡ転写レベルは、１．００相当と考えられ、各トランスジェニック植物体で記録される値は、それに従って発現した。
【０１０８】
ｑＲＴ−ＰＣＲで得られた結果は、ｐＢＩ１２１リーダーをＬＬ−ＴＣＫに置換すると、平均ｕｉｄＡ転写レベルの明らかな増加が測定されることを示した。特に、転写効率はＬＬ−ＴＣＫリーダーを含む植物で、１．７倍高いことが判明した（表３）。
【０１０９】
【表３】
【０１１０】
加えて、ｕｉｄＡ転写レベルがほぼ同等の７組の植物体を同定した後（図４ａ）、β−グルクロニダーゼ濃度と相対標準化ｕｉｄＡ転写レベルとの間の比をなす翻訳効率指数（ＴＥＩ）を各植物体で算出した（図４ｂ）。ＴＥＩ値を比較することにより、２種のリーダーは、ｕｉｄＡ転写産物の翻訳効率において明らかに異なることが判明し、その翻訳効率は本発明によるリーダーを用いた場合の方が高かった（表４）。
【０１１１】
【表４】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物における異種タンパク質発現を改善するための人工ＤＮＡ配列に関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオテクノロジー分野において、生物に導入した遺伝子の当該生物内での発現レベルを上げる必要が高まっている。この発現レベルは多くの場合満足のいくものではなく、植物や動物のバイオテクノロジーにおける技術革新を産業に利用する際の障害となっている。遺伝子発現レベルの調節能力を特徴付ける多様な構造要素が存在するが、多くのデータが遺伝子発現レベルの調節におけるリーダー領域の重要性を支持している。
【０００３】
この場合、広く普及したベクター（例えば、ｐＢＩ１２１とその派生物や、ｐＣＡＭＢＩＡとその派生物）において提案されている、５’（５’−ＵＴＲ）における非翻訳リーダー配列は、遺伝子組み換え生物における適切な遺伝子発現レベルを目的とするには不適切な多くの問題を抱えている。特に、最大限の収量を確保しなければならない場合（例えば、ヒトにとって有用な化合物の生産のために植物を細胞工場として使用する場合）、５’−ＵＴＲ配列からくる生産関連の制約を取り除くことが必要とされる。この目的のため、リーダーΩ（タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）に元来存在する配列）の使用が植物において提案された。しかしこれもまた不完全で余分なものを含み、改良の余地がある。
【０００４】
ＴＭＶのリーダーΩに存在する翻訳エンハンサーにおけるｐｏｌｙ（ＣＡＡ）領域（Gallie and Walbot 1992 Nucleic Acids Res., 20, 4631-4638(非特許文献１)）は、発現レベルを有意に高める（即ち、in vitro及びin vivoの異種タンパク質翻訳レベルにおけるポジティブな効果がある）ことが知られている（Gallie et al. 1988a Nucleic Acids Res., 16, 883-893(非特許文献２), Gallie et al. 1988b Nucleic Acids Res., 16, 8675-8694(非特許文献３), Gallie 2002 Nucleic Acids Res., 30, 3401-3411(非特許文献４)）。リーダーΩにおいて、ｐｏｌｙ（ＣＡＡ）配列はＡＣＡＡＴＴＡＣ配列の３回繰返しと関連があるが（非特許文献２）、デリーション実験により、発現レベルの増強に関与する調節エレメントはＡＣＡＡＴＴＡＣ配列の単一コピーと（ＣＡＡ）ｎモチーフの組合せで成り立っている可能性が示された（非特許文献１）。
【０００５】
また、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター（Guilley et al. 1982 Cell, 30, 763-773(非特許文献５)）の転写開始部位（Ｉｎｒ）は、ｍＲＮＡの効率的なキャッピングを有利に行うことも知られている。
【０００６】
更に、多くの植物のリーダー（Bolle et al. 1996 Plant Mol. Biol. 32, 861-868(非特許文献６)）はＣＴエレメントに富む配列を有し、このＣＴリッチ配列は転写レベルを変化させることができることが知られている（Chen et al. 1996 J. Virol., 70, 8411-8421(非特許文献７)）。
【０００７】
４１ヌクレオチド以上の長さの配列は、最初のＡＵＧを真正の翻訳開始コドンとして認識させることを促すことも知られている（Kozak 1989 J. Cell. Biol., 108, 229-241(非特許文献８)）。例えば、リーダーを２９ｎｔから７４ｎｔに延長すると、in vitro（Kozak 1991, J. Biol. Chem., 266, 19867-19870(非特許文献９)）及びin vivo（非特許文献１）におけるｍＲＮＡ翻訳レベルの上昇が観察されている。Ａ／Ｔ含量がより多いリーダー配列は発現レベルを向上させるが、これは２本鎖ｍＲＮＡ部分の形成（分子がそれ自身の上に折り畳まれることによってもたらされる）が妨げられるからである。実際、この様な二次構造には確かに翻訳効率を抑制する効果がある（Pelletier and Sonenberg 1985 Cell, 40, 515-526(非特許文献１０)及びKozak 1986 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 2850-2854(非特許文献１１)）。更に、ウイルス由来の５’−ＵＴＲの一部を植物リーダーに導入すると、レポータータンパク質の発現レベルの上昇が反映されることが知られている（Dowson Day et al. 1993 Plant Mol. Biol., 23, 97-109(非特許文献１２)）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Gallie and Walbot 1992 Nucleic Acids Res., 20, 4631-4638
【非特許文献２】Gallie et al. 1988a Nucleic Acids Res., 16, 883-893
【非特許文献３】Gallie et al. 1988b Nucleic Acids Res., 16, 8675-8694
【非特許文献４】Gallie 2002 Nucleic Acids Res., 30, 3401-3411
【非特許文献５】Guilley et al. 1982 Cell, 30, 763-773
【非特許文献６】Bolle et al. 1996 Plant Mol. Biol. 32, 861-868
【非特許文献７】Chen et al. 1996 J. Virol., 70, 8411-8421
【非特許文献８】Kozak 1989 J. Cell. Biol., 108, 229-241
【非特許文献９】Kozak 1991, J. Biol. Chem., 266, 19867-19870
【非特許文献１０】Pelletier and Sonenberg 1985 Cell, 40, 515-526
【非特許文献１１】Kozak 1986 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 2850-2854
【非特許文献１２】Dowson Day et al. 1993 Plant Mol. Biol., 23, 97-109
【非特許文献１３】Tyc et al. 1984 Eur. J. Biochem., 140, 503-511
【非特許文献１４】Schmitz et al. 1996 Nucleic Acids Res., 24, 257-263
【非特許文献１５】Jefferson et al. 1987 EMBO J., 6, 3901-3907
【非特許文献１６】Podromou and Pearl 1992 Protein Eng., 5, 827-829
【非特許文献１７】Wheeler et al. 1996 Gene, 169, 251-255
【非特許文献１８】Prytulla et al. 1996 FEBS Letters, 399, 283-289
【非特許文献１９】Doyle and Doyle 1990
【非特許文献２０】Jefferson 1989
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
従って、本発明の目的は、現在の技術水準の問題点を取り除き、植物における組み換えタンパク質の発現レベルを上昇させるリーダー配列を得ることである。
【００１０】
本出願人は現在の技術水準の問題点を克服し、上述の目的や利点及びその他の目的や利点を得るため、本発明を創出し、試験し、具現化した。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は独立クレームに記述され特徴付けられており、一方、従属クレームは本発明の他の特徴或いは主たる発明思想の変形態様を記述している。
【００１２】
前述の目的を達成するために、本発明に係るリーダー機能を有する５’（５’−ＵＴＲ）人工ＤＮＡ配列（以後、ＬＬ−ＴＣＫと表す）は、ＣＡＡトリヌクレオチドエレメントの繰返しとＣＴジヌクレオチドエレメントの繰返しの組合せ等の、遺伝子発現に有利なエレメントも含む。
【００１３】
本発明に係るＬＬ−ＴＣＫ配列は人工合成により得られた。この配列は自然には存在しないため、知的活動の成果である。
【００１４】
有利な一解決法においては、本発明に係るＬＬ−ＴＣＫ配列は、ＣＡＡトリヌクレオチドエレメントとＣＴジヌクレオチドエレメントの組合せと、リーダーΩ配列に存在する翻訳を活性化する配列の改変物とを提供する。
【００１５】
本発明の一変形態様によれば、本発明に係る配列はｐｏｌｙ（ＣＡＡ）領域（即ち、必須ではないが好ましくは互いに隣接する、２コピー以上のＣＡＡエレメントからなるオリゴヌクレオチド）を含む。
【００１６】
本発明の他の変形態様においては、本発明に係る配列はｐｏｌｙ（ＣＴ）領域（即ち、必須ではないが好ましくは互いに隣接する、２コピー以上のＣＴエレメントからなるオリゴヌクレオチド）を含む。
【００１７】
本発明の一変形態様においては、配列が１コピー以上のＡＣＡＡＴＴＡＣオクタマーを含むものとして提供される。
【００１８】
ｐｏｌｙ（ＣＡＡ）領域の配列とｐｏｌｙ（ＣＴ）領域の配列の組合せから得られる配列もまた、本発明の範囲に含まれる。
【００１９】
ｐｏｌｙ（ＣＡＡ）領域の配列と１コピー以上のＡＣＡＡＴＴＡＣＣオクタマーの配列の組合せから得られる配列もまた、本発明の範囲に含まれる。
【００２０】
更に、ｐｏｌｙ（ＣＴ）領域の配列と１コピー以上のＡＣＡＡＴＴＡＣＣオクタマーの配列の組合せから得られる配列もまた、本発明の範囲に含まれる。
【００２１】
本発明においては、ｐｏｌｙ（ＣＡＡ）領域の配列、ｐｏｌｙ（ＣＴ）領域の配列及び１コピー以上のＡＣＡＡＴＴＡＣＣオクタマーの配列の組合せから得られる配列を提供することが可能である。
【００２２】
更にまた本発明においては、前記配列の内の１以上の配列と、ＣａＭＶ３５ＳのＩｎｒ部位（即ち、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターの転写開始部位）との組合せから得られる配列を提供することが可能である。
【００２３】
従って、本発明に係るＬＬ−ＴＣＫ配列は、トランスジェニック植物における異種タンパク質の発現レベルを上昇させることができる。本発明の有利な解決法においては、その種類独自の本来のパターンに従って次のエレメントの組合せが創出されるよう、新規のＬＬ−ＴＣＫ配列が合成される：
（１）効率的なｍＲＮＡキャッピングのための、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの転写開始部位（Ｉｎｒ）；
（２）ＴＭＶリーダーΩに存在する翻訳エンハンサーと同様のｐｏｌｙ（ＣＡＡ）領域；
（３）多くの植物リーダーと同様のＣＴエレメントリッチ配列。
【００２４】
更に、ＬＬ−ＴＣＫ配列は、最初のＡＵＧを真正の翻訳開始コドンとして認識させることを促すため（非特許文献８）、４１ヌクレオチド以上の長さを有し、全体のＧ＋Ｃ含量は４０％未満である。
【００２５】
本発明における特定の一解決法においては、ＬＬ−ＴＣＫ配列は配列番号１（５’−３’）に示される配列である。
【００２６】
ＬＬ−ＴＣＫに僅かな変異が入っても、その効果に変化がないことは予想できる。この理由から本発明はまた、本配列に由来するリーダー配列（例えば、ＣＡＡトリプレットの欠失や重複、単一の塩基の置換や欠失等の結果生じる配列等）に係るものでもある。
【００２７】
ＬＬ−ＴＣＫの技術革新は、単一のリーダー中に、修飾ｐｏｌｙ（ＣＡＡ）エレメント、ＴＭＶリーダーΩ由来のオクタマー及び植物由来のＣＴリッチ配列を合せ加えたものであるという点にある。
【００２８】
従って、本発明の有利な解決法におけるＬＬ−ＴＣＫ人工配列は、単一のＡＣＡＡＴＴＡＣオクタマーと、該オクタマーに対して５’位置に配されたＣＡＡ９回繰返しとの存在を提供する。
【００２９】
ＡＣＡＡＴＴＡＣエレメント内のＡＴＴトリプレットが標準的でない翻訳開始部位を表し得るため（Tyc et al. 1984 Eur. J. Biochem., 140, 503-511(非特許文献１３)及びSchmitz et al. 1996 Nucleic Acids Res., 24, 257-263(非特許文献１４)）、ＬＬ−ＴＣＫリーダーにおいてこのトリプレットは終止コドンと共にフレーム中に挿入された。
【００３０】
更に、人工ＬＬ−ＴＣＫリーダーにおいて、（ＣＴ）4エレメントはＡＣＡＡＴＴＡＣオクタマーとｐｏｌｙ（ＣＡＡ）配列の結合によって得られる調節エレメントの３’末端に付加された。これら２種のエレメントの組合せ（両者どちらも遺伝子発現においてポジティブな効果を有することが知られている）は、自然界には発見されておらず、またこれまでに人間の手によって作成されたことはない。
【００３１】
これら２種のエレメントの組合せであるＬＬ−ＴＣＫリーダーは、対象遺伝子の翻訳レベルと転写レベルの両方を増強させることができる。
【００３２】
３５Ｓ−ＬＬ−ＴＣＫ：：ｕｉｄＡ（ｐＳＴＡＲＴ）コンストラクトと３５Ｓ：：ｕｉｄＡコンストラクト（元来のリーダーｐＢＩ１２１）をそれぞれ用いて形質転換したタバコ植物体（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｃｕｍ）から得られるｕｉｄＡ遺伝子の発現レベルを比較することにより、その効果が示された。ｐＳＴＡＲＴベクターはｐＢＩ１２１（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））中のリーダー配列をＬＬ−ＴＣＫに置換することにより得られた。特に、置換及び操作の対象は、Ｉｎｒ（ＡＣＡＣＧ）と制限酵素認識部位ＸｂａＩ（ＴＣＴＡＧＡ）との間に含まれるｐＢＩ１２１配列であった。ＡＵＧコドンの認識の可変性を抑制するため、ｕｉｄＡの翻訳開始コドンに隣接する塩基配列は、両コンストラクトにおいて変化させなかった。
【００３３】
レポータータンパク質として、ｕｉｄＡ遺伝子によりコードされる酵素β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）を用いるという選択は、タバコには本来のＧＵＳ様活性が観察されず、ｕｉｄＡ導入遺伝子の発現レベルを、感度、正確性、速度に優れ、容易に実行できるという特徴を有する蛍光定量的検定により測定することができる（Jefferson et al. 1987 EMBO J., 6, 3901-3907(非特許文献１５)）という事実により決定された。
【００３４】
Jefferson（１９８７；非特許文献１５）の記載に従って測定された、形質転換の後に再生した植物体（Ｔ1世代）におけるＧＵＳ酵素活性に関する蛍光定量的測定値は、ＬＬ−ＴＣＫリーダーの存在が、元来のコンストラクトと比べてどの様にｕｉｄＡ遺伝子発現レベルの大幅な増加（１５倍まで）を引き起こすかを示した。
【００３５】
分散分析の結果、検討対象であるタバコ２個体群（ｐＳＴＡＲＴ及びｐＢＩ１２１で形質転換されたもの）に見られる相違は、これら２群における最良発現個体間の差の場合と同様、統計的に有意であることが立証された。
【００３６】
エピジェネティックな変化に由来する効果を除外するため、最初の形質転換の中で最良の個体を自家受精させて得られた後代のＴ2を用いて解析を繰返した。この場合もまた、ｐＳＴＡＲＴで形質転換した植物体は、ｐＢＩ１２１のものよりも非常に高いｕｉｄＡ遺伝子発現レベルを示した。特に、全ての植物体を全体として考慮した場合、８．６倍相当の活性の増加が観察され、上記の平均的な発現個体のみを考慮した場合は１２．５倍相当の増加が観察された。
【００３７】
ｕｉｄＡ遺伝子の転写におけるＬＬ−ＴＣＫの効果を決定するため、Ｔ2植物体を選択（ｐＢＩ１２１から１０個体、ｐＳＴＡＲＴから１３個体）し、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを用いる転写レベル解析のために、中間物ＧＵＳのレベルによって特徴付けた。各植物体から抽出した全ＲＮＡから、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲのテンプレートに用いるｃＤＮＡを合成した。２組のプライマー（１組はｕｉｄＡ遺伝子、もう１組は内在性遺伝子の１８Ｓ ＲＮＡに特異的）と、ＳＹＢＲ−Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（アプライドバイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））を使用した。コントロールプラスミドを連続希釈したものを用いて２本の検量線（１本は導入遺伝子、もう１本は内在性遺伝子）を作成することにより、正確な定量が可能となった。次に各サンプルにおいて、ｕｉｄＡ遺伝子の転写レベルを、導入遺伝子について検出されたｍＲＮＡ量とリボソーマル１８Ｓ ＲＮＡの対応する量との間の％比によって、相対値として算出した。
【００３８】
この解析により、ｐＳＴＡＲＴ植物体におけるｕｉｄＡ遺伝子の平均転写レベルが、ｐＢＩ１２１植物体で観察されたものよりも１．７倍高かったことを証明できた。
【００３９】
同様の転写値によって特徴付けられる７対のｐＳＴＡＲＴとｐＢＩ１２１植物体に対してＴＥＩ（翻訳効率指数）を計算した。ＴＥＩは蛍光定量アッセイで測定したＧＵＳタンパク質の値と、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲで決定した相対的に標準化されたｍＲＮＡの値との比率に等しい。ＴＥＩを比較することによって、新規のＬＬ−ＴＣＫリーダーがｍＲＮＡレベルに効果があるだけではなく、ｍＲＮＡの翻訳効率を増加させることもできることが明らかになった。
【００４０】
ＬＬ−ＴＣＫ配列は、対象遺伝子に関するｍＲＮＡ含有量レベルと、存在するタンパク質の最終量レベルの両方に作用することによって、異種タンパク質の発現レベルを増加させることができる。
【００４１】
構成要素であるＣａＭＶ３５Ｓプロモーターと酵素β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）をコードするｕｉｄＡ遺伝子とを用いてＬＬ−ＴＣＫの効果をタバコで研究したが、他のプロモーターや他の遺伝子を組合せれば、他の用途も可能である。
【００４２】
本明細書で報告される実施例において、ＬＬ−ＴＣＫリーダーはタバコ植物体においてｕｉｄＡの発現を増強するためＣａＭＶ３５Ｓプロモーターと組合せて用いられるが、該リーダーはまたタバコ及びジャガイモにおいて、光誘導可能なｒｂｃＳ１プロモーター（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＡＹ１６３９０４）の下流や、イネにおいて胚乳特異的、フェーズ依存的なｇｌｕｂ４プロモーター（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＡＹ４２７５７１）の下流にも良好に用いられる。これらの実験に用いられる遺伝子は、マウスＢＣＬ１抗体、ヒトβ−グルコシダーゼ及び合成エラスチン様ポリマーをコードする遺伝子であった。異なる長さ、塩基組成、構造によって特徴付けられる関連のない遺伝子を、本質的に異なる活性のプロモーターの制御下に置き、単子葉だけでなく双子葉でも発現させる実験を行った。この実験において機能の欠失は記録されなかったため、ＬＬ−ＴＣＫリーダー又は同様に構成された５’−ＵＴＲの有用性は、非特異的（即ち、特定のプロモーター及び／又はコード配列との組合せに限定されず、特定の宿主生物種に限定されない）であると言える。従って、本発明の好ましい実施形態は、バイオテクノロジーへの応用を含み、これらは生物的／非生物的ストレス及び除草剤に対する抵抗性；バイオ燃料、バイオプラスチック、合成ポリマー及び工業用酵素の生産；バイオ医薬品（例えば、抗体及びその断片、ワクチン、ヒト酵素、サイトカイン及び成長因子）の分子農業；食料、飼料及び繊維の品質改良；レポーター及びマーカー遺伝子システムの開発を含む。
【００４３】
更に、植物の発現ベクター内に次のエレメント、即ち、ＣａＭＶ３５ＳのＩｎｒ部位、ｐｏｌｙ（ＣＡＡ）ｎ、ＡＣＡＡＴＴＡＣオクタマー、ｐｏｌｙ（ＣＴ）ｎ（ｎは２以上のいかなる数字であっても良い）、が同時に存在する５’−ＵＴＲを構築することは、本発明の範囲に含まれる：
【００４４】
上述の様に発現する５’−ＵＴＲリーダー配列を構成するエレメントの全ての可能な組合せ又は関連する変種（その相対的な５’−３’位置に関係なく）は、本発明の範囲に含まれる。
【００４５】
更に本発明はまた、前記配列又はその変種に相補的な配列にも関する。
【００４６】
本発明の一変形態様においては、本発明に係る配列は、２０〜２００ヌクレオチド、好ましくは４０〜１５０ヌクレオチドの長さを有する。
【００４７】
本発明の一変形態様においては、本発明に係る配列は６０％未満、好ましくは５０％未満のＧ＋Ｃ含量を有する。
【００４８】
配列番号２〜７に示されるヌクレオチド配列又はそれらの相補配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む１種以上の増幅プライマーもまた、本発明の範囲に含まれる。
【００４９】
本発明の他の実施形態においては、本発明の配列は：
ａ）人工合成；
ｂ）自然又は人工の配列内における、自然又は誘導される組み換え又は突然変異；
により得ることができる。
【００５０】
本発明の一特徴はまた、１種以上の該増幅プライマーを用いた、前述の配列の人工合成法に関する。
【００５１】
本発明に係る配列の自然界に発見される可能性のある、且つ、当業者には重要でない(non-significant)変種とも思われる５’−ＵＴＲリーダー配列も、機能的に類似であるならば、本発明の範囲に含まれる。
【００５２】
本発明に係る配列の突然変異プロセスに由来する配列であって、且つ、当業者には重要でない変種と思われる配列であっても、機能的に類似であるならば、本発明の一部である。この突然変異は、本発明に係る配列又はその相補的な配列における１以上のヌクレオチドの欠失、挿入、トランジション、トランスバージョンのいずれかに関する。
【００５３】
本発明はまた、本発明に係る配列を含むプラスミドを運ぶ細菌株（特に、Escherichia coli、Agrobacterium tumefaciens及びAgrobacterium rhizogenesの種に関連する）に関する。
【００５４】
本発明はまた、宿主生物の種類を問わず、本発明に係る配列を含む人工の細菌株に関する。
【００５５】
更に、構成プロモーターの制御下にある、本発明に係る配列を含む発現ベクターで形質転換した植物細胞もまた、本発明の範囲に含まれる。
【００５６】
本発明は次のものも含む：
− 組織特異的プロモーター、特に種子特異的プロモーターの制御下にある、本発明に係る配列を含む発現ベクターで形質転換した植物細胞；
− 誘導可能なプロモーターの制御下にある、本発明に係る配列を含む発現ベクターで形質転換した植物細胞；
− フェーズ依存的転写活性を有するプロモーターの制御下にある、本発明に係る配列を含む発現ベクターで形質転換した植物細胞；
− 葉緑体で活性を有するプロモーターの制御下にある、本発明に係る配列を含む発現ベクターで形質転換した植物細胞；
− ミトコンドリアで活性を有するプロモーターの制御下にある、本発明に係る配列を含む発現ベクターで形質転換した植物細胞。
【００５７】
本発明はまた、そのメッセンジャーＲＮＡが本発明に係る配列を含む、あらゆるタンパク質を一過的に発現することを特徴とする植物を含む。一過的な発現とは、ウイルスベクター、アグロ浸潤法（agroinfiltration）、エレクトロポレーション、粒子を用いた導入法（particle delivery）による該タンパク質の生産を意味すると解釈されたい。
【００５８】
本発明はまた、本発明に係る配列を含む発現ベクターで安定的に形質転換した双子葉植物（特に、ナス科（Solanaceae）、マメ科（Papilonaceae）、アブラナ科（Cruciferae）に属する種に関連するが、これらに限定されない）と、該双子葉植物の後代に関する。
【００５９】
本発明はまた、本発明に係る配列を含む発現ベクターで形質転換した単子葉植物（特に、イネ科（Graminaceae（Poaceae））に属する種に関連するが、これに限定されない）と、該単子葉植物の後代に関する。
【００６０】
本発明は、次の活動の内のいずれかのために本発明に係る配列を使用することにも関するため、産業的に有利な用途を提供する。
− バイオテクノロジーによる分子の生産；
− 組み換えタンパク質の合成；
− ウイルス性、細菌性又は真菌性の病原体に対する抵抗性を誘導することを目的とする組み換えタンパク質の合成；
− 除草剤に対する抵抗性を誘導することを目的とする組み換えタンパク質の合成；
− 原料とそれに由来する製品において脂肪酸の組成を変えることを目的とする組み換えタンパク質の合成；
− 原料とそれに由来する製品において栄養価を変えることを目的とする組み換えタンパク質の合成；
− 燃料、ゴム及びバイオプラスチックの生産を目的とする組み換えタンパク質の合成；
− 工業用酵素と商業用タンパク質の合成；
− 医薬用タンパク質の合成；
− ヒト又は動物を対象とする経口投与ワクチンの合成；
− ヒト又は動物を対象とする注射可能なワクチンの合成；
− 好ましくはイディオタイプ特異的でリンパ系腫瘍の治療に用いられる、患者特異的で注射可能なワクチンの合成；
− 二次代謝産物の生成に関わるタンパク質の合成；及び
− 形質転換細胞を同定及び／又は選抜する因子として、直接的又は間接的に用いられるタンパク質の合成。
本発明のこれら及び他の特徴は、以下、添付図面を参照しつつ、数例の好ましい実施形態の説明により明らかとなるが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】ｐＢＩ１２１のリーダー配列とｐＳＴＡＲＴのリーダー配列との比較である。図中の下線は、転写開始部位を示す。ＥｃｏＲＶ部位と転写開始部位との間の配列と、ＸｂａＩ部位とｕｉｄＡのＡＴＧトリプレットとの間の配列は、ｐＳＴＡＲＴとｐＢＩ１２１で同一であり、これら配列は一部省略する（ドット）。
【図２】トランスジェニックＴ1植物体におけるβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）の発現レベルを示す。
【図３】トランスジェニックＴ2植物体におけるβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）の発現レベルを示す。植物体は、各群が最良のＴ1形質転換体に由来する姉妹植物体を表すよう４群に分けられる。最少の有意差（Ｐ＝０．０１）は、４．７Ｕ／ｍｇ（全タンパク質）である。
【図４】図４ａは、中間β−グルクロニダーゼ発現レベルにより特徴付けられ、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより決定される、ｐＳＴＡＲＴ及びｐＢＩ１２１により得られるＴ2植物体におけるｕｉｄＡ（ｇｕｓＡ）の相対転写レベルを示す。類似の転写レベルの７対の植物体が同定されている。図４ｂは、類似の転写レベルのＴ2植物体の翻訳効率指数（ＴＥＩ）の値を示す。ＴＥＩは次のように計算される。各形質転換体に関して、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）濃度［Ｕ／ｍｇ（全タンパク質）］をｍＲＮＡの相対標準化レベルで割る。最大のＴＥＩは１．００相当と考えられ、各トランスジェニック植物で記録される値はそれに従って表わされる。
【図５】繰返しＰＣＲ(recursive PCR)によるＬＬ−ＴＣＫ合成のためのリバースプライマーとフォワードプライマーが重なっている図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６２】
Ａ）配列番号１に示されるＬＬ−ＴＣＫ人工リーダー配列の合成
【００６３】
Ａ．１）ＬＬ−ＴＣＫ配列又は同様に構成された５’−ＵＴＲの合成を達成するには、市販の特注サービスを利用した人工合成によるのが非常に便利である。長さが制限された配列であるため、プロモーター配列（５’フランキング領域の場合）とコード配列（３’フランキング領域の場合）に元来存在する制限酵素認識部位を末端に有するフランキング領域をリーダーの両側に付加する方法が特に有用である。プロモーター及び／又はコード配列の修飾を同時に計画しているのでなければ、これらフランキング領域がそれぞれ開始部位（Ｉｎｒ）の上流配列とコード配列を正確に再生するであろうことは、当業者には明らかである。
【００６４】
Ａ．２）前記リーダー配列を得るための他の手続きとして繰返しＰＣＲがある（Podromou and Pearl 1992 Protein Eng., 5, 827-829(非特許文献１６)、Wheeler et al. 1996 Gene, 169, 251-255(非特許文献１７)及びPrytulla et al. 1996 FEBS Letters, 399, 283-289(非特許文献１８)）。
【００６５】
いずれかの方法によって、ＬＬ−ＴＣＫ配列又は同様に構成された５’−ＵＴＲが得られれば、ＰＣＲ又はランダム若しくはin situ突然変異誘発のために開発された他の手続きによって、容易にリーダーの変種を作成することができる。
【００６６】
本実施例では、ｐＢＩ１２１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ４８５７８３）に挿入（特に、ＣａＭＶ３５ＳプロモーターとｕｉｄＡコード配列の間に）するための、繰返しＰＣＲによるＬＬ−ＴＣＫ合成について報告する。
【００６７】
４２〜５４ｎｔの間の長さで且つ２４ｎｔ相当の部分重複を有する、プライマーとして用いられる５本の合成オリゴヌクレオチドと、１９ｎｔの末端リバースプライマーをそれぞれ配列番号２、３、４、５、６及び７の配列として示す。
【００６８】
全プライマーは５’−３’方向で記される。配列番号２、４及び６の配列はフォワードプライマー、配列番号３、５及び７はリバースプライマーである。図５によると、フォワードプライマーとリバースプライマーは互いにオーバーラップする。
【００６９】
ＬＬ−ＴＣＫの操作と、対象ベクター配列への挿入を容易にするため、ＥｃｏＲＶ部位で始まる末端部を５’側に付加し、単一のＸｂａＩ部位を３’末端に付加した。
【００７０】
従って、３５Ｓプロモーターの３’末端部（ＥｃｏＲＶ部位からＩｎｒ領域の間）の改造を提供するようプライマーを設計し、続くｐＢＩ１２１ベクター（クロンテック）への挿入を容易にした。
【００７１】
外側のリバースプライマーの３’末端にＸｂａＩ部位を導入し、一方５’にはＥｃｏＲＶ部位が用いられる。
【００７２】
ｐＢＩ１２１においてこれらの部位はそれぞれＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの内側とｕｉｄＡの翻訳開始シグナルの近傍に存在する。従ってこの合成には、所望の配列と、［ＥｃｏＲＶ−ＸｂａＩ］断片を置換するためのクローニングとが提供された。
【００７３】
ＣａＭＶ３５ＳのＥｃｏＲＶ部位と開始部位との間の領域におけるプロモーター配列を確認するため、またＬＬ−ＴＣＫを合成し、クローニング用に３’末端に分子フックを提供するため、配列番号２〜７に示されるヌクレオチド配列を含むプライマーを設計、作成した。
【００７４】
ＬＬ−ＴＣＫ合成は１回のＰＣＲによって行われた。該ＰＣＲは、外側のプライマーである配列番号２と７（合成部位の両末端に対応する）の濃度が、内側のプライマーである配列番号３、４、５及び６の濃度よりも１００倍濃いＰＣＲ反応液を用いた。
【００７５】
より厳密なＤＮＡ合成を行うため、５０％減少させた濃度のｄＮＴＰと共に、プルーフリーディングＤＮＡポリメラーゼを用いた。
【００７６】
ＰＣＲ反応液は次の通りである：
１０×Ｐｆｕバッファー（１５ｍＭ Ｍｇ2+含有）：１０μＬ
配列番号２ プライマー［１０μＭ］：２μＬ
配列番号３ プライマー［０．１μＭ］：２μＬ
配列番号４ プライマー［０．１μＭ］：２μＬ
配列番号５ プライマー［０．１μＭ］：２μＬ
配列番号６ プライマー［０．１μＭ］：２μＬ
配列番号７ プライマー［１０μＭ］：２μＬ
Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ［３Ｕ／μＬ］：０．８μＬ
ｄＮＴＰ［各２．５ｍＭ］：４μＬ
最終量１００μＬになるよう水を加える。
【００７７】
特に、ＤＮＡの合成と増幅のために、ＴａｑポリメラーゼＰｆｕ（プロメガ（Promega））を用いて次のサイクルに付した（１×（９５℃、５分間）；４０×（９５℃、１５秒間；４８℃、３０秒間；７２℃、２０秒間）；１×（７２℃、７分間））。
【００７８】
ＰＣＲ産物をエタノール沈澱により精製し、ＴＡＥバッファー中で１％アガロースゲル電気泳動し、市販のキットを利用してゲルから回収し、ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ（商標）でＡテールを付加し、両方のＤＮＡ鎖のシーケンス解析のため、ｐＧＥＭ(登録商標)−Ｔ（プロメガ）にライゲーションした。
【００７９】
ライゲーション反応液を用いて大腸菌（Escherichia coli）ＪＭ１０１株のコンピテントセルを形質転換した。二本鎖のシーケンス解析によって、クローニングした配列と設計した配列との間に不一致が全くないことを証明した。
【００８０】
Ｂ）ＬＬ−ＴＣＫ配列を含む植物の発現ベクターの構築
ＬＬ−ＴＣＫ配列又は同様に構成された５’−ＵＴＲに、可能なフランキング領域又は分子フックを付加することにより、異なる種類の発現ベクターにおける広範囲のクローニングの解決法を提供する。本実施例においては、ｐＢＩ１２１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ４８５７８３）中の［ＥｃｏＲＶ−ＸｂａＩ］断片の代わりに、実施例１の［ＥｃｏＲＶ−ＸｂａＩ］断片をクローニングするのに用いる方法を説明する。ｐＢＩ１２１はＣａＭＶ３５Ｓプロモーター内部の外に複数のＥｃｏＲＶ部位を有するため、ＨｉｎｄＩＩＩとＸｂａＩの制限酵素の使用によって後者のプロモーターをｐＢＩ１２１（クロンテック）から切り出した（非特許文献１５）。
【００８１】
ＴＡＥバッファー中の１％アガロースゲルから断片を回収し、前もって同じ酵素を用いて消化したｐＵＣ１８（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｌ０８７５２）にサブクローニングした。
【００８２】
前述の通り、ｐＢＩ１２１が複数のＥｃｏＲＶ部位を有するため、この過程が必要とされる。得られたｐＵＣ１８／３５Ｓベクターを、３５Ｓプロモーター−ＬＬ−ＴＣＫリーダーの新規の組合せを作成するために使用した。
【００８３】
ＥｃｏＲＶとＸｂａＩ（ＮＥＢ）の消化によって、ｐＧＥＭ−ＴベクターからＬＬ−ＴＣＫ配列を切り出し、アガロースゲル電気泳動を用いてベクター配列から分離し、次に市販のキットを利用してゲルから回収した。次にｐＵＣ１８／３５Ｓベクターを同じ酵素で消化し、アルカリホスファターゼ（ファルマシア）で処理し、電気泳動し、上記の通りにゲルから回収した。続いてＴ４ＤＮＡライゲース（プロメガ）の存在下４℃で１６時間ライゲーション反応を行った。特に、適切な反応バッファーを含む１０μＬ容量中、Ｔ４ＤＮＡライゲース（１Ｕ）の存在下、［ＥｃｏＲＶ−ＸｂａＩ］断片（３．５ｎｇ）をベクター（２５ｎｇ）に組み込んだ。
【００８４】
ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターを除去するため、ｐＢＩ１２１ベクター（クロンテック）をＸｂａＩとＨｉｎｄＩＩＩ（ＮＥＢ）で消化した。次に同じ酵素を用いて、３５Ｓ−ＬＬ−ＴＣＫ複合体をクローニングベクターｐＵＣ１８から切り出した。上述の様にｐＢＩ１２１ベクターフレームと３５Ｓ−ＬＬ−ＴＣＫインサートを電気泳動し、ゲルから回収した。最後に、ｐＢＩ１２１フレームワークに３５Ｓ−ＬＬ−ＴＣＫをライゲーションし、得られたｐＢＩ１２１／３５Ｓ−ＬＬ−ＴＣＫ：：ｕｉｄＡ：：ＮＯＳベクターをｐＳＴＡＲＴ（図１）と命名した。
【００８５】
Ｃ）ＬＬ−ＴＣＫ配列を含む発現ベクターによる植物の形質転換
ＬＬ−ＴＣＫ又は同様に構成された５’−ＵＴＲを含むトランスジェニック植物は、Agrobacterium spp.人工株による重感染、フィトウイルス人工株による感染又はトランスフェクション、エレクトロポレーション、粒子を用いた導入、ＤＮＡマイクロインジェクションを含む一連の方法によって作出できる。
【００８６】
ｐＳＴＡＲＴ発現ベクターをアグロバクテリウム（Agrobacterium tumefaciens）ＥＨＡ１０５株にエレクトロポレーションし、形質転換したアグロバクテリウム細胞をタバコ（Nicotiana tabacum L., cv. Xanthi）の形質転換に用いた。即ち、カナマイシン（５０ｍｇ／Ｌ）含有ＬＢ培地（２ｍＬ）に、形質転換したアグロバクテリウム細胞を植菌した。細菌培養液を２９℃で１６時間インキュベートした。無菌培養した３０日目の実生又は後期ロゼットの植物体の成熟葉から、コルクボーラーを用いてリーフディスク（直径７ｍｍ）を得た。後者の場合、タバコの葉を蒸留水でリンスし、１％次亜塩素酸ナトリウムで５分間、９５％エタノールで３０秒表面殺菌し、層流フード下無菌ろ紙上で水気を拭き取った。
【００８７】
ナフタレン酢酸（ＮＡＡ；０．１ｍｇ／Ｌ）、６−ベンジルアデニン（ＢＡ；１ｍｇ／Ｌ）、ショ糖（３０ｇ／Ｌ）を含み、寒天（８ｇ／Ｌ）で固めたムラシゲ・スクーグ培地（１５ｍＬ）の入ったペトリ皿にリーフディスクを置いた。この移動の後すぐに前記アグロバクテリウム培養液（２ｍＬ）をペトリ皿に注ぎ、リーフディスクを均一に湿らせた。余剰のＬＢ培地を取り除いた後ペトリ皿を密封し、２５℃明条件（３０．５μＥ／平方メートル／秒）で２４時間インキュベートした。
【００８８】
ナフタレン酢酸（ＮＡＡ；０．１ｍｇ／Ｌ）、６−ベンジルアデニン（ＢＡ；１ｍｇ／Ｌ）、セフォタキシム（５００ｍｇ／Ｌ）、ショ糖（３０ｇ／Ｌ）を含み、寒天（８ｇ／Ｌ）で固めたムラシゲ・スクーグ培地（１５ｍＬ）の入った新しいペトリ皿に、リーフディスクを移した。これを２８℃、１６時間／日の照明で１週間インキュベートした；これを、カナマイシン（２００ｍｇ／Ｌ）が加わる以外は前述の基質と同じ培地に最終的に移した。外植片を３週間毎に継代培養し、再生したシュートをカルス組織から分離し、インドール−３−酪酸（２ｍｇ／Ｌ）、セフォタキシム（５００ｍｇ／Ｌ）、カナマイシン（２００ｍｇ／Ｌ）、ショ糖（３０ｇ／Ｌ）を含む半固体のムラシゲ・スクーグ培地に植え付けた。
【００８９】
推定トランスジェニック植物体をピートの鉢に植え、Ｐｏｗｅｒｓｔａｒ ＨＱＩ−Ｔランプ（Ｏｓｒａｍ）（天蓋レベルにおいて２００ｍＭフォトン／平方メートル／秒）照明を１６時間／日、２５℃／１９℃（明／暗）の温室で育成した。
【００９０】
本実施例において、ＰＣＲとβ−グルクロニダーゼアッセイにより形質転換の確認を行った。ＰＣＲアッセイにおいては、Doyle and Doyle (1990)(非特許文献１９)に従って全ＤＮＡを抽出し、次のプライマーを使用した。
フォワード ５’−ＡＣＡＡＴＴＡＣＧＴＡＴＴＴＣＴＣＴＣＴＣＴＡＧＡ−３’
リバース ５’−ＣＧＡＴＣＧＧＧＧＡＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣ−３’
【００９１】
フォワードプライマーとリバースプライマーは、それぞれＬＬ−ＴＣＫ配列の末端と、ＮＯＳターミネーターの一部にアニーリングし、形質転換していないＸａｎｔｈｉ植物体では増幅産物を生じない（トランスジェニック植物体では複製配列の長さは予想通り１９３６ｂｐである）。
【００９２】
標準的な反応液を作成し、次の温度サイクルを用いた場合、再生した植物体の約９３％がトランスジェニックであることが判明した。
サイクル：１×（９４℃、５分間）；４０×（９４℃、１分間１５秒間；６０℃、４５秒間；７２℃、２分間）；１×（７２℃、５分間）。
【００９３】
植物の形質転換は、ＧＵＳ組織化学的アッセイ（非特許文献１５）とＧＵＳ活性の蛍光定量的測定により更に示された。コントロールは、感染していないディスクからin vitroで育成したＸａｎｔｈｉ植物体からなる。蛍光定量的アッセイの方法と得られた結果とをポイントＤで更に詳しく報告する。
【００９４】
同様の手順に従って、元来のリーダー配列を含むトランスジェニック植物体を作成し、特徴付けた。他の条件が同じであれば、ＬＬ−ＴＣＫ配列は再生と形質転換の比率に影響がないことを記す。
【００９５】
Ｄ）導入遺伝子発現レベルにおけるＬＬ−ＴＣＫ配列の影響
前記の通り、ｐＢＩ１２１プラスミドとｐＳＴＡＲＴプラスミドのそれぞれを、アグロバクテリウムを介したタバコリーフディスクの形質転換に用いた。いずれの場合にも、制御される遺伝子はｕｉｄＡ（ｇｕｓＡとしても知られる）であるため、ＬＬ−ＴＣＫと広く普及したｐＢＩ１２１リーダーとで得られる導入遺伝子の発現レベルは、ｕｉｄＡがコードするβ−グルクロニダーゼ（ＥＣ３．２．１．３１）酵素活性の測定により直接的に比較することができる。各個体群から約２０個体の第一の形質転換体（第一世代Ｔ1に属するトランスジェニック植物体）についてＰＣＲにより導入遺伝子の有無をアッセイし、続いてβ−グルクロニダーゼ活性を解析した（図２）。ロゼット後期に達したら（硬化３０日）各植物体から最も若い葉３枚を採取し、押しつぶすことにより粗サップを得た（エリッヒ・ポレーネ）；粗サップ（１００μＬ）を、高分子ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）（１２ｍｇ）を含む２容量の抽出液（Jefferson 1989(非特許文献２０)）と混合した。１１，５００×ｇで１５分間遠心分離した後、上清を集め、４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルクロニド（ＭＵＧ；シグマアルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ））を基質に用いて２回蛍光定量的に解析した（Ｄｙｎａ Ｑｕａｎｔ２００フルオロメーター；ＧＥヘルスケア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））。サンプルの内因性蛍光、消光及び組み換え酵素以外の要因による基質の分解によるバックグラウンドノイズを測定するための試行を行った。導入遺伝子発現レベルを、粗サップ１ｍＬ当たりのβ−グルクロニダーゼユニットとして測定した。１ユニットは前記（非特許文献２０）と同じアッセイ条件を用いた際、１分間当たり１ｎＭの４−メチルウンベリフェロン（４−ＭＵ）を放出する酵素量によって定義された。分散と平均との間の相互関連を避けるため、データをログ変換して提供した。コロモゴロフ−スミルノフテストによってログデータ分散の正規性を、バートレット検定式によって分散の均一性をチェックした後、分散分析を行った。ダンカンの多重範囲検定法により確率水準Ｐ＝０．０５で平均を比較した。
【００９６】
蛍光データについて行わった分散分析は、同一植物体の若い葉の間では有意な分散はないが、植物体間には大きな差があることを示した。特に、合成リーダーはｕｉｄＡ発現において非常に大きな増加（１５倍まで）を測定した（表１）。
【００９７】
【表１】
【００９８】
エピジェネティックな変化によってこれらの結果が偏向していないことを示すため、分析をＴ2後代で繰返した。特に、各個体群から最良のＴ1を４個体自家受粉し、得られた種子を、選抜のためカナマイシンリッチ培地に蒔いた。各後代から抵抗性のある５〜７個体のＴ2植物体をランダムに選択し、ＰＣＲによる遺伝子導入の確認と蛍光定量的アッセイによるβ−グルクロニダーゼ活性の測定のために、ロゼット後期まで育成した。酵素レベルは先の粗サップ１ｍＬ当たりのユニットに加えて、植物間の代謝の変化を評価するために全タンパク質１ｍｇ当たりのユニット（ブラッドフォードアッセイによって測定）でも示した。
【００９９】
Ｔ1世代における観察と同様に、新規のリーダーを含むＴ2トランスジェニック植物体は有意により高いｕｉｄＡ発現レベルを示した（図３）；ｐＢＩ１２１リーダーと比較した場合、８．６倍と１２．５倍の活性増加が、それぞれ全植物個体群又は前記平均的な発現個体の評価によって見積もられた（表２）。
【０１００】
【表２】
【０１０１】
Ｅ）遺伝子の転写及び翻訳におけるＬＬ−ＴＣＫ配列の効果
ＬＬ−ＴＣＫ又は同様に構成された５’−ＵＴＲにおける、異なるエレメントの組合せは、得られた導入遺伝子の翻訳効率だけでなく、転写における測定可能な改善として反映される。本実施例においてこの様な改善は、前述の通りｐＢＩ１２１とｐＳＴＡＲＴで得られたＴ2タバコトランスジェニック植物体において観察される。その証拠を集めるため、ｐＢＩ１２１群又はｐＳＴＡＲＴ群に属する植物体（それぞれ１０個体と１３個体のＴ2）を中間ｕｉｄＡ発現レベルによって特徴付け、次のことを決定するため解析した。
ｉ．ｕｉｄＡの平均転写レベル；
ｉｉ．１８Ｓ ＲＮＡの平均転写レベル；及び
ｉｉｉ．実際に生産されたβ−グルクロニダーゼの量。
【０１０２】
実験上のエラーを最小にするため、各植物体から１枚の若い葉を採取し、２分割し、半分をＲＮＡ分離に用い、もう半分をβ−グルクロニダーゼアッセイに用いた。
【０１０３】
ＲＮＡｇｅｎｔｓ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ）を用いて全ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡ（１μｇ）からＡＭＶ逆転写酵素（プロメガ）を用いてランダムプライマーの存在下ファーストストランドｃＤＮＡを合成した。ｃＤＮＡ合成反応液を１：５に希釈し、１μＬをリアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）に用いた。
【０１０４】
ＳＹＢＲ−Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（アプライドバイオシステムズ）と特異的プライマー（各０．３μＭ最終濃度）を用いてｑＲＴ−ＰＣＲを行った。全ての反応は、ｉＣｙｃｌｅｒ ｉＱマルチカラーリアルタイムＰＣＲデテクションシステム（バイオラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ））を用いて、次のプログラムに従って行った。
プログラム：１×（９５℃、１０分間）；５０×（９５℃、１５秒間；６２℃、３０秒間；７２℃、３０秒）。
ｕｉｄＡ転写産物を増幅するため、次のプライマーを用いた：
フォワード ５’−ＴＴＡＣＧＣＴＧＡＡＧＡＧＡＴＧＣＴＣＧＡＣ−３’
リバース ５’−ＣＣＴＡＡＡＧＡＧＡＧＧＴＴＡＡＡＧＣＣＧＡＣＡＧ−３’
【０１０５】
１８Ｓ ＲＮＡ標的配列のため、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＪ２３６０１６を元にプライマーを設計した：
フォワード ５’−ＡＣＡＴＣＣＡＡＧＧＡＡＧＧＣＡＧＣＡＧ−３’
リバース ５’−ＧＡＣＴＣＡＴＡＧＡＧＣＣＣＧＧＴＡＴＴＧＴＴＡＴＴ−３’
【０１０６】
いずれの場合にも、複製配列の長さは９０ｂｐであった。各ＰＣＲにおいて、コントロールプラスミドの連続希釈を既知量のインプットコピー数に応じて加え、標準検量線を引いた。特に、１０倍連続希釈（１０5〜１０2コピー）のｕｉｄＡ含有ｐＢＩ１２１プラスミドをテンプレートに用いた。同様の目的のため、１８Ｓ ＲＮＡ遺伝子（ＡＪ２３６０１６）の５５０ｂｐ断片をｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ（プロメガ）にクローニングし、１０8〜１０5コピーの範囲内で使用した。
【０１０７】
ＩＣｙｃｌｅｒ ＩＱリアルタイムデテクションシステムソフトウエアver.3.0を用いてｕｉｄＡ転写産物とコントロールＲＮＡの開始時の量を測定した。各サンプルに対して、少なくとも３回の独立した測定を行った。全てのケースにおいて、変動係数（ＶＣ＝ＳＤ／平均）の最大値は、２０％に固定された。ｕｉｄＡと１８Ｓ ＲＮＡの間の平均転写レベルの％比を各サンプルに対して計算した。データを標準化するため、最大ｕｉｄＡ転写レベルは、１．００相当と考えられ、各トランスジェニック植物体で記録される値は、それに従って発現した。
【０１０８】
ｑＲＴ−ＰＣＲで得られた結果は、ｐＢＩ１２１リーダーをＬＬ−ＴＣＫに置換すると、平均ｕｉｄＡ転写レベルの明らかな増加が測定されることを示した。特に、転写効率はＬＬ−ＴＣＫリーダーを含む植物で、１．７倍高いことが判明した（表３）。
【０１０９】
【表３】
【０１１０】
加えて、ｕｉｄＡ転写レベルがほぼ同等の７組の植物体を同定した後（図４ａ）、β−グルクロニダーゼ濃度と相対標準化ｕｉｄＡ転写レベルとの間の比をなす翻訳効率指数（ＴＥＩ）を各植物体で算出した（図４ｂ）。ＴＥＩ値を比較することにより、２種のリーダーは、ｕｉｄＡ転写産物の翻訳効率において明らかに異なることが判明し、その翻訳効率は本発明によるリーダーを用いた場合の方が高かった（表４）。
【０１１１】
【表４】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＡＡトリヌクレオチドエレメントの繰返しとＣＴジヌクレオチドエレメントの繰返しとの組合せ等の、遺伝子発現に好ましいエレメントを含むことを特徴とする、ヌクレオチドリーダー配列５’−ＵＴＲ。
【請求項２】
必須ではないが好ましくは互いに隣接する、２コピー以上のＣＡＡエレメントからなるオリゴヌクレオチドを意味するｐｏｌｙ（ＣＡＡ）領域を含む、請求項１に記載の配列。
【請求項３】
必須ではないが好ましくは互いに隣接する、２コピー以上のＣＴエレメントからなるオリゴヌクレオチドを意味するｐｏｌｙ（ＣＴ）領域を含む、請求項１に記載の配列。
【請求項４】
１コピー以上のＡＣＡＡＴＴＡＣオクタマーを含む、請求項１に記載の配列。
【請求項５】
請求項２及び３に記載の配列の組合せを含む、請求項１に記載の配列。
【請求項６】
請求項２及び４に記載の配列の組合せを含む、請求項１に記載の配列。
【請求項７】
請求項３及び４に記載の配列の組合せを含む、請求項１に記載の配列。
【請求項８】
請求項２、３及び４に記載の配列の組合せを含む、請求項１に記載の配列。
【請求項９】
請求項２〜８のいずれかに記載の配列と、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターの転写開始部位であるＣａＭＶ３５ＳのＩｎｒ部位との組合せを含む、請求項１に記載の配列。
【請求項１０】
配列番号１に示される配列を含む、請求項１に記載の配列。
【請求項１１】
５’−ＵＴＲの植物発現ベクター中の構築物において、次のエレメントＣａＭＶ３５ＳのＩｎｒ部位、ｐｏｌｙ（ＣＡＡ）ｎ、ＡＣＡＡＴＴＡＣオクタマー及びｐｏｌｙ（ＣＴ）（ｎは２以上の任意の数）が同時に存在する構築物。
【請求項１２】
５’−３’相対位置に関係なく、先の請求項のいずれかに記載される５’−ＵＴＲリーダー配列を構成するエレメントの可能な組合せの全てを含む、請求項１に記載の配列。
【請求項１３】
先の請求項のいずれか１項で報告される配列に相補的な配列を含む、請求項１に記載の配列。
【請求項１４】
２０〜２００ヌクレオチド、好ましくは４０〜１５０ヌクレオチドを含む長さを有する、請求項１に記載の配列。
【請求項１５】
６０％未満、好ましくは５０％未満のＧ＋Ｃ含量を有する、請求項１に記載の配列。
【請求項１６】
ａ）人工合成、又はｂ）自然又は人工の配列中における自然の又は誘導される組換えプロセスによって得ることができる配列である、請求項１に記載の配列。
【請求項１７】
配列番号２〜７に示されるヌクレオチド配列又はそれらの相補配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む増幅プライマー。
【請求項１８】
発見される可能性のある天然リーダー配列５’−ＵＴＲであって、機能的に類似である限りにおいて先の請求項のいずれかに記載された配列の重要でないと変種と思われる、天然リーダー５’−ＵＴＲ配列。
【請求項１９】
先の請求項のいずれかに記載される配列の突然変異に由来する配列であって、機能的に類似である限りにおいて先の請求項のいずれかに記載された配列の重要でない変種を生成すると思われる配列において、前記突然変異は先の請求項のいずれかに記載される配列又はその相補配列における１以上のヌクレオチドの欠失、挿入、トランジション、トランスバージョンのいずれかに関するものである配列。
【請求項２０】
請求項１７に記載される１種類以上のプライマーの使用を提供することを特徴とする、請求項１〜１９のいずれかに記載の配列を人工合成するための方法。
【請求項２１】
特に、Escherichia coli、Agrobacterium tumefaciens及びAgrobacterium rhizogenesの種に関連する、先の請求項のいずれかに記載の配列を含むプラスミドを運ぶ細菌株。
【請求項２２】
宿主生物に関係なく、請求項１〜１９のいずれかに記載の配列を含む人工ウイルス株。
【請求項２３】
構成プロモーターの制御下にある、請求項１〜１９のいずれかに記載の配列を含む発現ベクターで形質転換した植物細胞。
【請求項２４】
組織特異的プロモーター、特に種子特異的プロモーターの制御下にある、請求項１〜１９のいずれかに記載の配列を含む発現ベクターで形質転換した植物細胞。
【請求項２５】
誘導可能なプロモーターの制御下にある、請求項１〜１９のいずれかに記載の配列を含む発現ベクターで形質転換した植物細胞。
【請求項２６】
フェーズ依存的転写活性を有するプロモーターの制御下にある、請求項１〜１９のいずれかに記載の配列を含む発現ベクターで形質転換した植物細胞。
【請求項２７】
葉緑体において活性を有するプロモーターの制御下にある、請求項１〜１９のいずれかに記載の配列を含む発現ベクターで形質転換した植物細胞。
【請求項２８】
ミトコンドリアにおいて活性を有するプロモーターの制御下にある、請求項１〜１９のいずれかに記載の配列を含む発現ベクターで形質転換した植物細胞。
【請求項２９】
メッセンジャーＲＮＡが請求項１〜１９のいずれかに記載の配列を含むいずれのタンパク質をも一過的に発現することを特徴とする植物であって、一過的な発現がウイルスベクター、アグロ浸潤法、粒子を用いた導入法、エレクトロポレーションによる該タンパク質の生産を意味すると解される植物。
【請求項３０】
請求項１〜１９のいずれかに記載される配列を含む発現ベクターで安定的に形質転換した双子葉植物。
【請求項３１】
ナス科（Solanaceae）、マメ科（Papilonaceae）及びアブラナ科（Cruciferae）に属する１種以上を含む、請求項３０に記載の植物。
【請求項３２】
請求項３０又は３１に記載される双子葉植物の後代。
【請求項３３】
請求項１〜１９のいずれかに記載される配列を含む発現ベクターで形質転換した単子葉植物。
【請求項３４】
イネ科（Graminaceae（Poaceae））に属する１種以上を含む、請求項３３に記載の植物。
【請求項３５】
請求項３３又は３４に記載される単子葉植物の後代。
【請求項３６】
バイオテクノロジー上の分子生産のための、請求項１〜１９のいずれかに記載される配列の使用。
【請求項３７】
組み換えタンパク質合成のための、請求項１〜１９のいずれかに記載される配列の使用。
【請求項３８】
ウイルス性、細菌性又は真菌性の病原体に対する抵抗性を誘導することを目的とする組み換えタンパク質合成のための、請求項１〜１９のいずれかに記載される配列の使用。
【請求項３９】
除草剤に対する抵抗性を誘導することを目的とする組み換えタンパク質合成のための、請求項１〜１９のいずれかに記載される配列の使用。
【請求項４０】
原料とそれに由来する製品において脂肪酸の組成を変えることを目的とする組み換えタンパク質の合成のための、請求項１〜１９のいずれかに記載される配列の使用。
【請求項４１】
原料とそれに由来する製品において栄養価を変えることを目的とする組み換えタンパク質の合成のための、請求項１〜１９のいずれかに記載される配列の使用。
【請求項４２】
燃料、ゴム及びバイオプラスチックの生産を目的とする組み換えタンパク質合成のための、請求項１〜１９のいずれかに記載される配列の使用。
【請求項４３】
工業用酵素とタンパク質商品の合成のための、請求項１〜１９のいずれかに記載される配列の使用。
【請求項４４】
医薬用タンパク質の合成のための、請求項１〜１９のいずれかに記載される配列の使用。
【請求項４５】
ヒト又は動物を対象とする経口投与ワクチンの合成のための、請求項１〜１９のいずれかに記載される配列の使用。
【請求項４６】
ヒト又は動物を対象とする注射可能なワクチンの合成のための、請求項１〜１９のいずれかに記載される配列の使用。
【請求項４７】
好ましくはイディオタイプ特異的でリンパ系腫瘍の治療に用いられる、患者特異的で注射可能なワクチンの合成のための、請求項１〜１９のいずれかに記載される配列の使用。
【請求項４８】
二次代謝産物の生成に関わるタンパク質の合成のための、請求項１〜１９のいずれかに記載される配列の使用。
【請求項４９】
形質転換細胞を同定及び／又は選択する因子として直接的又は間接的に使用可能なタンパク質の合成のための、請求項１〜１９のいずれかに記載される配列の使用。
【請求項１】
ＣＡＡトリヌクレオチドエレメントの繰返しとＣＴジヌクレオチドエレメントの繰返しとの組合せ等の、遺伝子発現に好ましいエレメントを含むことを特徴とする、ヌクレオチドリーダー配列５’−ＵＴＲ。
【請求項２】
必須ではないが好ましくは互いに隣接する、２コピー以上のＣＡＡエレメントからなるオリゴヌクレオチドを意味するｐｏｌｙ（ＣＡＡ）領域を含む、請求項１に記載の配列。
【請求項３】
必須ではないが好ましくは互いに隣接する、２コピー以上のＣＴエレメントからなるオリゴヌクレオチドを意味するｐｏｌｙ（ＣＴ）領域を含む、請求項１に記載の配列。
【請求項４】
１コピー以上のＡＣＡＡＴＴＡＣオクタマーを含む、請求項１に記載の配列。
【請求項５】
請求項２及び３に記載の配列の組合せを含む、請求項１に記載の配列。
【請求項６】
請求項２及び４に記載の配列の組合せを含む、請求項１に記載の配列。
【請求項７】
請求項３及び４に記載の配列の組合せを含む、請求項１に記載の配列。
【請求項８】
請求項２、３及び４に記載の配列の組合せを含む、請求項１に記載の配列。
【請求項９】
請求項２〜８のいずれかに記載の配列と、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターの転写開始部位であるＣａＭＶ３５ＳのＩｎｒ部位との組合せを含む、請求項１に記載の配列。
【請求項１０】
配列番号１に示される配列を含む、請求項１に記載の配列。
【請求項１１】
５’−ＵＴＲの植物発現ベクター中の構築物において、次のエレメントＣａＭＶ３５ＳのＩｎｒ部位、ｐｏｌｙ（ＣＡＡ）ｎ、ＡＣＡＡＴＴＡＣオクタマー及びｐｏｌｙ（ＣＴ）（ｎは２以上の任意の数）が同時に存在する構築物。
【請求項１２】
５’−３’相対位置に関係なく、先の請求項のいずれかに記載される５’−ＵＴＲリーダー配列を構成するエレメントの可能な組合せの全てを含む、請求項１に記載の配列。
【請求項１３】
先の請求項のいずれか１項で報告される配列に相補的な配列を含む、請求項１に記載の配列。
【請求項１４】
２０〜２００ヌクレオチド、好ましくは４０〜１５０ヌクレオチドを含む長さを有する、請求項１に記載の配列。
【請求項１５】
６０％未満、好ましくは５０％未満のＧ＋Ｃ含量を有する、請求項１に記載の配列。
【請求項１６】
ａ）人工合成、又はｂ）自然又は人工の配列中における自然の又は誘導される組換えプロセスによって得ることができる配列である、請求項１に記載の配列。
【請求項１７】
配列番号２〜７に示されるヌクレオチド配列又はそれらの相補配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む増幅プライマー。
【請求項１８】
発見される可能性のある天然リーダー配列５’−ＵＴＲであって、機能的に類似である限りにおいて先の請求項のいずれかに記載された配列の重要でないと変種と思われる、天然リーダー５’−ＵＴＲ配列。
【請求項１９】
先の請求項のいずれかに記載される配列の突然変異に由来する配列であって、機能的に類似である限りにおいて先の請求項のいずれかに記載された配列の重要でない変種を生成すると思われる配列において、前記突然変異は先の請求項のいずれかに記載される配列又はその相補配列における１以上のヌクレオチドの欠失、挿入、トランジション、トランスバージョンのいずれかに関するものである配列。
【請求項２０】
請求項１７に記載される１種類以上のプライマーの使用を提供することを特徴とする、請求項１〜１９のいずれかに記載の配列を人工合成するための方法。
【請求項２１】
特に、Escherichia coli、Agrobacterium tumefaciens及びAgrobacterium rhizogenesの種に関連する、先の請求項のいずれかに記載の配列を含むプラスミドを運ぶ細菌株。
【請求項２２】
宿主生物に関係なく、請求項１〜１９のいずれかに記載の配列を含む人工ウイルス株。
【請求項２３】
構成プロモーターの制御下にある、請求項１〜１９のいずれかに記載の配列を含む発現ベクターで形質転換した植物細胞。
【請求項２４】
組織特異的プロモーター、特に種子特異的プロモーターの制御下にある、請求項１〜１９のいずれかに記載の配列を含む発現ベクターで形質転換した植物細胞。
【請求項２５】
誘導可能なプロモーターの制御下にある、請求項１〜１９のいずれかに記載の配列を含む発現ベクターで形質転換した植物細胞。
【請求項２６】
フェーズ依存的転写活性を有するプロモーターの制御下にある、請求項１〜１９のいずれかに記載の配列を含む発現ベクターで形質転換した植物細胞。
【請求項２７】
葉緑体において活性を有するプロモーターの制御下にある、請求項１〜１９のいずれかに記載の配列を含む発現ベクターで形質転換した植物細胞。
【請求項２８】
ミトコンドリアにおいて活性を有するプロモーターの制御下にある、請求項１〜１９のいずれかに記載の配列を含む発現ベクターで形質転換した植物細胞。
【請求項２９】
メッセンジャーＲＮＡが請求項１〜１９のいずれかに記載の配列を含むいずれのタンパク質をも一過的に発現することを特徴とする植物であって、一過的な発現がウイルスベクター、アグロ浸潤法、粒子を用いた導入法、エレクトロポレーションによる該タンパク質の生産を意味すると解される植物。
【請求項３０】
請求項１〜１９のいずれかに記載される配列を含む発現ベクターで安定的に形質転換した双子葉植物。
【請求項３１】
ナス科（Solanaceae）、マメ科（Papilonaceae）及びアブラナ科（Cruciferae）に属する１種以上を含む、請求項３０に記載の植物。
【請求項３２】
請求項３０又は３１に記載される双子葉植物の後代。
【請求項３３】
請求項１〜１９のいずれかに記載される配列を含む発現ベクターで形質転換した単子葉植物。
【請求項３４】
イネ科（Graminaceae（Poaceae））に属する１種以上を含む、請求項３３に記載の植物。
【請求項３５】
請求項３３又は３４に記載される単子葉植物の後代。
【請求項３６】
バイオテクノロジー上の分子生産のための、請求項１〜１９のいずれかに記載される配列の使用。
【請求項３７】
組み換えタンパク質合成のための、請求項１〜１９のいずれかに記載される配列の使用。
【請求項３８】
ウイルス性、細菌性又は真菌性の病原体に対する抵抗性を誘導することを目的とする組み換えタンパク質合成のための、請求項１〜１９のいずれかに記載される配列の使用。
【請求項３９】
除草剤に対する抵抗性を誘導することを目的とする組み換えタンパク質合成のための、請求項１〜１９のいずれかに記載される配列の使用。
【請求項４０】
原料とそれに由来する製品において脂肪酸の組成を変えることを目的とする組み換えタンパク質の合成のための、請求項１〜１９のいずれかに記載される配列の使用。
【請求項４１】
原料とそれに由来する製品において栄養価を変えることを目的とする組み換えタンパク質の合成のための、請求項１〜１９のいずれかに記載される配列の使用。
【請求項４２】
燃料、ゴム及びバイオプラスチックの生産を目的とする組み換えタンパク質合成のための、請求項１〜１９のいずれかに記載される配列の使用。
【請求項４３】
工業用酵素とタンパク質商品の合成のための、請求項１〜１９のいずれかに記載される配列の使用。
【請求項４４】
医薬用タンパク質の合成のための、請求項１〜１９のいずれかに記載される配列の使用。
【請求項４５】
ヒト又は動物を対象とする経口投与ワクチンの合成のための、請求項１〜１９のいずれかに記載される配列の使用。
【請求項４６】
ヒト又は動物を対象とする注射可能なワクチンの合成のための、請求項１〜１９のいずれかに記載される配列の使用。
【請求項４７】
好ましくはイディオタイプ特異的でリンパ系腫瘍の治療に用いられる、患者特異的で注射可能なワクチンの合成のための、請求項１〜１９のいずれかに記載される配列の使用。
【請求項４８】
二次代謝産物の生成に関わるタンパク質の合成のための、請求項１〜１９のいずれかに記載される配列の使用。
【請求項４９】
形質転換細胞を同定及び／又は選択する因子として直接的又は間接的に使用可能なタンパク質の合成のための、請求項１〜１９のいずれかに記載される配列の使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公表番号】特表２０１０−５１４４３２（Ｐ２０１０−５１４４３２Ａ）
【公表日】平成２２年５月６日（２０１０．５．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５４３４７３（Ｐ２００９−５４３４７３）
【出願日】平成１９年１２月２７日（２００７．１２．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００７／０６４５９０
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０８０９５４
【国際公開日】平成２０年７月１０日（２００８．７．１０）
【出願人】（５０９１７７４０７）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年５月６日（２０１０．５．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１２月２７日（２００７．１２．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００７／０６４５９０
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０８０９５４
【国際公開日】平成２０年７月１０日（２００８．７．１０）
【出願人】（５０９１７７４０７）
【Ｆターム（参考）】
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