植物の二次細胞壁形成を促進する方法
【課題】植物において二次細胞壁の厚さを増大するための方法を提供する。
【解決手段】管状要素分化（ＴＥＤ）関連タンパク質またはそのＣ末端断片を用いて植物の二次細胞壁の厚さを増大させるための方法であって、ＴＥＤ６とＴＥＤ７の組み合わせ、ＴＥＤ６のＣ末端断片、ＴＥＤ７のＣ末端断片、およびＴＥＤ６のＣ末端断片とＴＥＤ７のＣ末端断片の組み合わせからなる群から選択されるタンパク質をコードするＤＮＡを発現可能に含むトランスジェニック（Ｔｇ）植物を作出し、該ＤＮＡを該植物内で発現させることを含む方法、ならびに、Ｔｇ植物およびその後代、細胞、組織または種子。
【解決手段】管状要素分化（ＴＥＤ）関連タンパク質またはそのＣ末端断片を用いて植物の二次細胞壁の厚さを増大させるための方法であって、ＴＥＤ６とＴＥＤ７の組み合わせ、ＴＥＤ６のＣ末端断片、ＴＥＤ７のＣ末端断片、およびＴＥＤ６のＣ末端断片とＴＥＤ７のＣ末端断片の組み合わせからなる群から選択されるタンパク質をコードするＤＮＡを発現可能に含むトランスジェニック（Ｔｇ）植物を作出し、該ＤＮＡを該植物内で発現させることを含む方法、ならびに、Ｔｇ植物およびその後代、細胞、組織または種子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物の木繊維二次細胞壁形成を促進する機能を有するタンパク質、それをコードするＤＮＡ、ならびに、その利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
人類は、長い間、樹幹、根、葉、枝等の木質バイオマスを、製紙、建築、飼料、燃料等の多岐にわたる産業分野で利用してきた。木質バイオマスを利用した産業は、将来的にも、持続的利用可能な資源を活用できるとして地球環境問題改善の観点から再認識されており、現行の化石資源に替わるカーボンソースの利用による循環型産業として期待されている。そこで、木質バイオマスの持続的かつ安定的確保達成のため、ユーカリ属、アカシア属等の早生樹を中心とした植林産業が世界的に進められている。
【０００３】
木質バイオマスは、植物茎の二次木部に存在する導管細胞と木繊維細胞で構成されている。これらの細胞は、共に細胞内にセルロース、ヘミセルロース、リグニンで構成される二次細胞壁を形成することが特徴的である。木質バイオマスとして産業分野で利用されているのは、主に二次木部の大部分を占めている木繊維細胞の方である（非特許文献１）。この木繊維細胞の二次細胞壁の量（肥厚の度合い）は、バイオマス量や木繊維の物理的性質に影響を及ぼすため、大変重要である。
【０００４】
近年、木質バイオマスを用いたバイオエネルギー生産やバイオファイナリーが盛んになってきていることは周知のとおりである。二次細胞壁が厚くなりバイオマス量が増加することは、これらの生産性向上やコスト低減の面で大変有意義である。また、従来の製紙原材料として見た場合も、二次細胞壁が厚くルンケル比（二次細胞壁とルーメンの比率）が大きい木繊維が求められる嵩高紙等において、生産性向上やコスト低減の面で大変有意義である。
【０００５】
将来の植林事業の進展にあわせ、主要な木質バイオマスである木繊維細胞の二次細胞壁形成を促進することで、そのバイオマス量（セルロース、ヘミセルロース、リグニン）を改変することで、さらにルンケル比率等の木繊維形態を改変することで将来のエネルギー利用や工業原料としての用途拡張も見込まれる。従って、地球規模での木質バイオマスのより効果的かつ効率的生産を実現するためにも、木繊維細胞の二次細胞壁形成促進方法の開発は非常に重要である。
【０００６】
現在までに、いくつかの二次細胞壁形成促進方法が公知となっている（特許文献１〜５、非特許文献２〜５）。しかしながら、多くが木繊維以外の植物細胞の二次細胞壁形成促進であり、促進される細胞や二次細胞壁の量が非常に少ないため、実用上は利用できない。また、木繊維細胞の二次細胞壁形成促進の公知技術にも存在するが、矮化するなどの悪影響が現れるため、実用上利用できない。このように、現在公知となっている技術では、木繊維細胞の二次細胞壁形成促進は困難である。
【０００７】
ところで、本発明者らは、導管細胞形成時に特異的に発現が誘導される遺伝子を多数見出している（非特許文献６）。本発明者らが見出した遺伝子群の中には、機能未知の遺伝子が多数含まれており、導管形成に何らかの役割を担っていると考えられる。導管細胞と木繊維細胞は、共に内部に二次細胞壁を形成する面では大変似ており、また起源も同じ仮導管と言われている。従って、これらの遺伝子機能を解析することで、導管細胞だけでなく木繊維細胞の二次細胞壁形成も制御できる可能性が考えられる。しかしながら、そのような技術や知見はない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特許第4068152号公報
【特許文献２】特表第2003-509009号公報
【特許文献３】特開第2006-246852号公報
【特許文献４】特表第2006-526990号公報
【特許文献５】特開第2008-178422号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Evert, RF. Esau’s Plant Anatomy, Meristems, Cells, and Tissues of the Plant Body: their Structure, Function, and Development. 3rd edn. New Jersey: John Wiley & Sons, Inc.
【非特許文献２】Kuboら, 2005 Genes & Dev. 19:1855-1860
【非特許文献３】Goicoecheaら, 2005 The Plant Journal 43:553-567
【非特許文献４】Mitsudaら, 2005 The Plant Cell 17:2993-3006
【非特許文献５】Zhongら、2006 The Plant Cell 18:3158-3170
【非特許文献６】Demura, T.とFukuda, H. 2007 Trends in Plant Sci. 12:64-70
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、本発明の目的は、機能未知遺伝子であるＴＥＤ６およびＴＥＤ７の利用方法、ならびに、二次細胞壁形成が促進された植物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、植物の管状要素分化（ＴＥＤ）関連タンパク質であるＴＥＤ６またはＴＥＤ７が、植物の二次細胞壁のセルロース合成と二次細胞壁のパターン形成に関与するであろうと予測してきたが、このようなタンパク質は単独ではそのような機能をもたないことが判明したため、さらに鋭意研究を重ねた結果、以下のような特徴を有する発明を完成させた。
【００１２】
したがって、本発明は、要約すると以下のような特徴を包含する。
本発明は、第１の態様において、ＴＥＤ関連タンパク質またはそのＣ末端断片を用いて植物の二次細胞壁の厚さを増大させるための方法であって、ＴＥＤ６とＴＥＤ７の組み合わせ、ＴＥＤ６のＣ末端断片、ＴＥＤ７のＣ末端断片、およびＴＥＤ６のＣ末端断片とＴＥＤ７のＣ末端断片の組み合わせからなる群から選択されるタンパク質をコードするＤＮＡを発現可能に含むトランスジェニック植物を作出し、該ＤＮＡを該植物内で発現させることを含む方法を提供する。
【００１３】
その実施形態において、上記ＴＥＤ６またはＴＥＤ７のＣ末端断片は、ＴＥＤ６またはＴＥＤ７の成熟アミノ酸配列のうちＮ末端から膜貫通ドメインまでの配列を含まないアミノ酸配列、あるいはそのアミノ酸配列においてＮ末端側および/またはＣ末端側に１もしくは数個のアミノ酸の欠失、置換または付加を含むアミノ酸配列、からなる。
ここで、「数個」とは、１０以下の整数、すなわち２〜１０の整数を指す。
【００１４】
本発明はまた、第２の態様において、上記のＴＥＤ６とＴＥＤ７の組み合わせ、ＴＥＤ６のＣ末端断片、ＴＥＤ７のＣ末端断片、およびＴＥＤ６のＣ末端断片とＴＥＤ７のＣ末端断片の組み合わせからなる群から選択されるタンパク質をコードするＤＮＡを発現可能に含む、かつ、野生型植物と比べて二次細胞壁の厚さが増大していることを特徴とするトランスジェニック植物またはその後代を提供する。
【００１５】
本発明はさらに、第３の態様において、上記のトランスジェニック植物またはその後代由来の細胞または組織を提供する。
本発明はさらに、第４の態様において、上記のトランスジェニック植物またはその後代の種子を提供する。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の方法は、植物の木繊維細胞で二次細胞壁形成を促進し二次細胞壁の厚さを増大させることを可能にする。二次細胞壁の肥厚化は、バイオマス量の増加に導くことができるという利点を有する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】この図は、ヒャクニチソウ（Ｚｉｎｎｉａ ｅｌｅｇａｎｓ）細胞の二次細胞壁形成に及ぼすＺｅ ＴＥＤ６、Ｚｅ ＴＥＤ７、およびそれのＣ末端断片の過剰発現の効果を示す。縦軸は、視覚化可能な二次細胞壁を有する細胞の割合（％）を示す。図１Ａは、ＺｅＴＥＤ６の全長およびＣ末端断片（配列番号１の２７Ｌｅｕ〜９５Ａｌａ）の過剰発現を示し、図１Ｂは、Ｚｅ ＴＥＤ７−１の全長およびＣ末端断片（配列番号２の２０９Ｔｒｐ〜３００Ｇｌｙ）の過剰発現を示し、ならびに、図１Ｃは、Ｚｅ ＴＥＤ６とＺｅ ＴＥＤ７の過剰共発現を示す。また、図中、ＧＵＳ（β−グルクロニダーゼ）は、Ｚｅ ＴＥＤ６、Ｚｅ ＴＥＤ７またはそれらのＣ末端断片の代わりにＧＵＳが過剰発現された植物コントロールを示す。
【図２】この図は、ヒャクニチソウのＴＥＤ６およびＴＥＤ７（すなわち、Ｚｅ ＴＥＤ６、Ｚｅ ＴＥＤ７）のアミノ酸配列、ならびに、シロイヌナズナ、ポプラおよびイネの同族体のアミノ酸配列のアラインメント（図２Ａ）、ｎｅｉｇｈｂｏｒ−ｊｏｉｎｉｎｇ法によるＭＥＧＡ４（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖｅｒｓｉｏｎ ４．０;Ｔａｍｕｒａ， Ｋ．ら（２００７） Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． Ｅｎｖｏｌ． ２４：１５９６−１５９９）を利用した保存領域の比較を示す樹形図（図２Ｂ）、ならびに、図２Ｂの作成に使用した、それらアミノ酸配列の比較的保存されたＣ末端領域（図２Ｃ）を示す。図２Ａで、太字が膜貫通ドメインを示し、下線が、実施例で使用されたＺ１９４３およびＺ１６６５３クローンのアミノ酸配列を表す。Ｏｓ０８ｇ０１０８３００は、Ｃ末端ドメインの２つの反復を含んでおり（図２Ａ）、図２ＢではＯｓ０８ｇ０１０８３００のＣ末端ドメインの保存された２つの反復領域を分割して示した。
【図３】この図は、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）の根でのＡｔ ＴＥＤ６およびＡｔ ＴＥＤ７遺伝子に及ぼす一過性のＲＮＡｉ解析の結果を示す。図３Ａは、一過性に誘導されたＲＮＡｉ条件下でＡｔ ＴＥＤ６およびＡｔ ＴＥＤ７遺伝子の発現を示す。Ａｔ ＴＥＤ６、Ａｔ ＴＥＤ７およびそれら両方に対応する逆反復配列が、グルココルチコイド仲介誘導系の制御下でトランスジェニックシロイヌナズナ植物で一過性に発現された。総ＲＮＡは、１０μＭデキサメタゾン補充増殖培地上で５時間インキュベートされた１週令のシロイヌナズナ幼植物から抽出された。すべてのＲＴ−ＰＣＲサンプルを、ＰＣＲサイクルがＡｔ ＴＥＤ６で２５サイクル、Ａｔ ＴＥＤ７とユビキチンで３０サイクルであること以外同一条件下で調製した。図３Ｂ〜３Ｅは、Ａｔ ＴＥＤ６およびＡｔ ＴＥＤ７遺伝子のＲＮＡｉ系統の表現型を示す。３週令のトランスジェニックシロイヌナズナ植物を、１０μＭデキサメタゾン補充増殖培地上で５日間インキュベートして、グルココルチコイド仲介誘導系で逆反復配列を発現した。誘導の間に、より遅く発生した根の導管形成に対するＲＮＡｉの影響を調べた。図３Ｂ中のバーは、５０μｍを表す。図３Ｂは、野生型Ｃｏｌ−０である。図３Ｃは、Ａｔ ＴＥＤ７ ＲＮＡｉ系統であり、階紋状後生木部導管が直線状に伸びた状態を示す。図３Ｄは、Ａｔ ＴＥＤ６−ＴＥＤ７キメラＲＮＡｉ系統であり、直線状に伸びた後生木部導管での欠落を示す。図３Ｅは、ＹＦＰ ＲＮＡｉ系統であり、大きく窪んだ後生木部導管要素を示す。ここで、ＹＦＰは、黄色蛍光タンパク質を表す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
（ＴＥＤ６およびＴＥＤ７タンパク質をコードするＤＮＡ）
ＴＥＤ６およびＴＥＤ７はいずれも、植物における導管などの管状要素の分化に関連したＩ型膜タンパク質である。これらのタンパク質は、植物細胞中で同時に過剰発現されるとき、導管細胞や木繊維細胞の二次細胞壁形成の促進に導く。
【００１９】
ＴＥＤ６およびＴＥＤ７は、多くの植物種で、Ｎ末端側からプロリン（Ｐｒｏ）に富むドメイン、単一の膜貫通（ＴＭ）ドメイン、およびＣ末端ドメインからなる特徴的な構造を有する。プロリンに富むドメインは、細胞外ドメインであり、一方、Ｃ末端ドメインは細胞質ドメインである。一般に、植物の細胞外タンパク質のうち、プロリンに富む配列は、ヒドロキシプロリンに富む糖タンパク質（ＨＲＧＰ）の特徴であることが周知されており、特にＴＥＤ７はＨＲＧＰであろうと推定されるが、特にＺｅ ＴＥＤ７にはＨＲＧＰファミリーに典型的に認められる反復配列が存在していない。
【００２０】
図２に、例えば、ヒャクニチソウ、シロイヌナズナ、ポプラおよびイネからなる植物のＴＥＤ６およびＴＥＤ７のアミノ酸配列のアラインメント（図２Ａ）と、それらアミノ酸配列の比較的保存されたＣ末端領域のアミノ酸配列（図２Ｃ）を示す。異種の植物間では、これらＴＥＤタンパク質の配列同一性は高くないが、上記のような特徴的なドメイン構造を有するという点で、上記例示のタンパク質は管状要素分化関連タンパク質ファミリーに属することが理解される。
【００２１】
これらの植物由来のＴＥＤ６およびＴＥＤ７のアミノ酸配列は、以下の配列番号で後述の配列表に記載されている。
ヒャクニチソウのＴＥＤ６、ＴＥＤ７−１およびＴＥＤ７−２：配列番号１（ＡＢ３７７５１４）、配列番号２（ＡＢ３７７５１５）、および配列番号３（ＡＢ３７７５１６）
シロイヌナズナのＴＥＤ６およびＴＥＤ７：配列番号４（Ａｔｌｇ４３７９０）および配列番号５（Ａｔ５ｇ４８９２０）
ポプラのＴＥＤ６およびＴＥＤ７：配列番号６（ｅｕｇｅｎｅ３．０００２０６７１）および配列番号７（ｅｕｇｅｎｅ３．０００７０３８２）、配列番号８（ｆｇｅｎｅｓｈ１＿ｐｇ．Ｃ＿ＬＧ＿Ｖ０００００８）（ここで、配列番号７と８の配列は、ＴＥＤ７に属する。）
イネのＴＥＤ：配列番号９（Ｏｓ０８ｇ０１０８３００）（（注）配列番号１０（Ｏｓ０８ｇ０１０８３００＿１ｓｔ：TERKAEVHNL SGHVHVHKAT ESGPSGAKAT VLSIDEDLKF QEVAG）、配列番号１１（Ｏｓ０８ｇ０１０８３００＿２ｎｄ：AENKAELINV TEHIHVDEKI VSGPQGQKIE ILSEDEDIRF EEEGR）（ここで、配列番号１０と１１の配列は配列番号９の配列の重複ドメインを分割した部分配列である。））
【００２２】
また、これらのアミノ酸配列のうち膜貫通領域およびＣ末端ドメイン（図２Ａ）、ならびに比較的保存されたＣ末端領域（図２Ｃ）の各アミノ酸配列のアミノ酸残基位置は、配列番号１〜１１のアミノ酸配列と図２に記載の配列とから決定することができる。
【００２３】
本発明で使用可能なＴＥＤ６、ＴＥＤ７およびそれらのＣ末端断片は、ＴＥＤ６とＴＥＤ７の組み合わせ、ＴＥＤ６のＣ末端断片またはＴＥＤ７のＣ末端断片の形態として、導管細胞や木繊維細胞の二次細胞壁形成を促進する能力を喪失させない限り、野生型のアミノ酸配列に変異が導入されていてもよい。このような変異型ＴＥＤ６およびＴＥＤ７は、野生型のアミノ酸配列と７０％以上または８０％以上、好ましくは９０％以上または９５％以上、さらに好ましくは９８％以上または９９％以上の同一性を有している。アミノ酸の変異は、例えば、１もしくは複数（好ましくは、数個）のアミノ酸の欠失、置換または付加である。このうち、置換は、保存的アミノ酸置換が望ましい。保存的アミノ酸置換とは、例えば構造的、電気的、極性もしくは疎水性などの性質が類似したアミノ酸間の置換を意味する。このような性質は、例えばアミノ酸側鎖の類似性で分類することも可能である。塩基性側鎖を有するアミノ酸は、リシン、アルギニン、ヒスチジンからなり、酸性側鎖を有するアミノ酸は、アスパラギン酸、グルタミン酸からなり、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸は、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システインなどを含み、疎水性側鎖を有するアミノ酸は、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニンなどを含み、分岐側鎖を有するアミノ酸はトレオニン、バリン、イソロイシンからなり、ならびに、芳香族側鎖を有するアミノ酸は、チロシン、トリプトファン、フェニルアラニン、ヒスチジンからなる。
【００２４】
また、上記のＴＥＤ６、ＴＥＤ７およびそれらのＣ末端断片をコードするＤＮＡも、変異を含むことができる。そのような変異には、例えば遺伝暗号の縮重に基づく変異（すなわち、サイレント変異）、スプライス変異、多型による変異などが含まれる。あるいは、ストリンジェント条件下で野生型ＤＮＡとハイブリダイゼーション可能な塩基配列からなる変異体も、上記変異型ＤＮＡに含まれる。ただし、これらのＤＮＡによってコードされる変異型タンパク質は、ＴＥＤ６とＴＥＤ７の組み合わせ、ＴＥＤ６のＣ末端断片またはＴＥＤ７のＣ末端断片の形態として、導管細胞や木繊維細胞の二次細胞壁形成を促進する能力を有しているべきである。そのような能力は、野生型と同等またはそれ以上であってもよいし、あるいは、野生型より劣っていてもよい。変異型ＴＥＤ６およびＴＥＤ７をコードするＤＮＡは、野生型の成熟塩基配列と７０％以上または８０％以上、好ましくは９０％以上または９５％以上、さらに好ましくは９８％以上または９９％以上の同一性を有している。
【００２５】
ここで、ストリンジェント条件とは、例えば、約４２〜５５℃、２〜６×ＳＳＣでのハイブリダイゼーションののち、５０〜６５℃、０．１〜１×ＳＳＣ、０．１〜０．２％ＳＤＳでの１回もしくは複数回の洗浄からなる条件を含むが、このような条件は、鋳型核酸のＧＣ含量、イオン強度、温度などによって変化するため、上記の特定の条件に制限されないものとする。ここで、１×ＳＳＣは、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ クエン酸Ｎａ、ｐＨ７．０からなる。一般に、ストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度、ｐＨでの特定の配列の融解温度（Ｔｍ）よりも約５℃低くなるように設定される。ここで、Ｔｍは、鋳型配列に相補的なプローブの５０％が、平衡状態で鋳型配列にハイブリダイズする温度をいう。
【００２６】
人為的に変異を導入する手法として、例えば部位特異的突然変異誘発法、ＰＣＲを利用する変異導入法などが好ましく使用できる（Ｓａｍｂｒｏｏｋら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， １９８９， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ａｕｓｕｂｅｌら， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， １９９４， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓなど）。
【００２７】
本明細書中で使用する「同一性」は、例えば２つのアミノ酸配列又は塩基配列を、ギャップを導入するか又はギャップを導入しないで整列させたとき、アミノ酸又は塩基の総数に対する同一アミノ酸又は塩基の数の割合（％）を意味する。
【００２８】
また、ホモログ配列の検索或いは相同性検索は、ＢＬＡＳＴ（ＢＬＡＳＴＮ， ＢＬＡＳＴＰ， ＢＬＡＳＴＸなど）、ＦＡＳＴＡなどの公知のアルゴリズムを利用することによって実施できる。
【００２９】
上で例示した以外の植物の他のＴＥＤ６およびＴＥＤ７タンパク質のアミノ酸配列、ならびにそのようなタンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列は、植物ゲノムを公開する、例えば、ＮＣＢＩ（米国）、ＥＢＩ（欧州）、ＫＡＯＳ（かずさＤＮＡ研究所）、ＩＲＧＳＰ（国際イネゲノム塩基配列解析プロジェクト）、ＧｒａｉｎＧｅｎｅｓ（米国）、ＰＧＤＩＣ（米国）、ＦｏｒｅｓｔＧＥＮ（森林総合研究所）などのｗｅｂサイトにアクセスすることによって入手することができる。
【００３０】
本発明では、特に、ＴＥＤ６とＴＥＤ７の組み合わせ、ＴＥＤ６のＣ末端断片、ＴＥＤ７のＣ末端断片、およびＴＥＤ６のＣ末端断片とＴＥＤ７のＣ末端断片の組み合わせが、導管細胞や木繊維細胞の二次細胞壁形成を促進するうえで重要な機能を果たしている。
【００３１】
ここで、「ＴＥＤ６とＴＥＤ７の組み合わせ」は、植物または植物細胞内で、ＴＥＤ６およびＴＥＤ７をコードするＤＮＡが実質的に同時に発現し、これらのタンパク質に翻訳されることによって実現可能である。この場合、これらＤＮＡの発現は、該２つのＤＮＡが別々のベクターに発現可能に組み込まれていてもよいし、あるいは該２つのＤＮＡが同一のベクターに互いに発現可能にタンデムに組み込まれていてもよい。
【００３２】
また、「ＴＥＤ６のＣ末端断片」または「ＴＥＤ７のＣ末端断片」における「Ｃ末端断片」は、ＴＥＤ６またはＴＥＤ７タンパク質の細胞質側のＣ末端ドメイン（すなわち、成熟アミノ酸配列のうちＮ末端から膜貫通ドメインまでの配列を含まないアミノ酸配列を有するドメイン）からなっていてもよいし、あるいは、該Ｃ末端ドメインのアミノ酸配列においてＮ末端側および／またはＣ末端側に１もしくは数個のアミノ酸の欠失、置換または付加を含むアミノ酸配列を有していてもよい。後者の場合には、例えば、Ｃ末端断片のＮ末端側に、Ｃ末端ドメインと隣接する膜貫通領域の１〜３個程度のアミノ酸残基が付加されていてもよいし、また、例えば、Ｃ末端ドメインのアミノ酸配列からＣ末端側配列の一部（例えば１０個以下のアミノ酸残基）が欠失されていてもよい。通常、本発明における上記Ｃ末端断片は、図２Ｃに示されるような、植物間で比較的保存されたアミノ酸配列を含んでいること、および導管細胞や木繊維細胞の二次細胞壁形成を促進する能力を有していること、が望ましい。このようなＣ末端断片をコードするＤＮＡは、ＴＥＤ６またはＴＥＤ７タンパク質をコードするＤＮＡを鋳型にし、Ｃ末端ドメイン（場合により、膜貫通領域のＣ末端側１〜３アミノ酸残基を含んでもよい）をコードする塩基配列のうち増幅しようとする配列に基づいて作製された５’プライマーおよび３’プラーマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うことによって得ることができる。その後、作製されたＤＮＡは、適するベクターに組み込まれる。
【００３３】
ＰＣＲ法および条件については、ＰＣＲバッファー中、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（例えばＴａｑポリメラーゼ）、センスプライマー、アンチセンスプラーマーおよびｄＮＴＰｓ（Ｎ＝Ａ，Ｔ，Ｇ，Ｃ）、ならびに鋳型ＤＮＡ、の存在下、変性（例えば９４℃２０秒〜５分）、アニーリング（例えば５５℃３０秒〜１分）および伸長（例えば７２℃３０秒〜１０分）を１サイクルとして約２０〜約４０サイクルを含む増殖サイクルからなる通常の手法が使用される。具体的な手法は、例えばＡｕｓｕｂｅｌら， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， １９９４， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓなどに記載されている。増幅産物は、アガロースゲルまたはポリアクリルアミドゲル電気泳動によって単離精製することができる。
【００３４】
ちなみに、後述の実施例で使用したヒャクニチソウのＴＥＤ６およびＴＥＤ７−１のＣ末端断片のアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号１の２７Ｌｅｕから９５Ａｌａまでの配列、配列番号２の２０９Ｔｒｐから３００Ｇｌｙまでの配列である。
【００３５】
さらに、「ＴＥＤ６のＣ末端断片とＴＥＤ７のＣ末端断片の組み合わせ」は、「ＴＥＤ６とＴＥＤ７の組み合わせ」の場合と同様に、植物または植物細胞内で、ＴＥＤ６タンパク質のＣ末端断片をコードするＤＮＡおよびＴＥＤ７タンパク質のＣ末端断片をコードするＤＮＡが実質的に同時に発現し、これらのタンパク質に翻訳されることによって実現可能である。この場合、これらＤＮＡの発現は、該２つのＤＮＡが別々のベクターに発現可能に組み込まれていてもよいし、あるいは該２つのＤＮＡが同一のベクターに互いに発現可能にタンデムに組み込まれていてもよい。
【００３６】
上記ＤＮＡおよびそれを含むベクターは、例えば遺伝子組換え技術によって製造することができる。遺伝子組換え技術は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， １９８９， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ａｕｓｕｂｅｌら， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， １９９４， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓなどに記載される手法を利用することができる。
【００３７】
簡単に説明すると、例えば、植物組織由来のｃＤＮＡライブラリーから、公知の配列を基にして作製したプライマーを使用するＰＣＲによってＴＥＤ６またはＴＥＤ７をコードするＤＮＡを増幅することができる。該ＤＮＡを、例えばアガロースゲルまたはポリアクリルアミドゲル電気泳動で精製したのち、適当な発現ベクターに発現可能な状態で挿入する。
【００３８】
ベクターの例は、バイナリーベクターまたはその他のベクターである。バイナリーベクターは、アグロバクテリウムＴ−ＤＮＡのライトボーダー（ＲＢ）とレフトボーダー（ＬＢ）の２つの約２５ｂｐボーダー配列を含み、両ボーダー配列の間に、外来ＤＮＡが挿入される。バイナリーベクターは、例えばｐＢＩ系（例えば、ｐＢＩ１０１， ｐＢＩ１０１．２， ｐＢＩ１０１．３， ｐＢＩ１２１， ｐＢＩ２２１ （以上Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社））、ｐＧＡ４８２、ｐＧＡＨ、ｐＢＩＧなどである。その他のベクターには、例えば中間系プラスミドｐＬＧＶ２３Ｎｅｏ、ｐＮＣＡＴ、ｐＭＯＮ２００など、またはＧＡＴＥＷＡＹカセットを含むｐＨ３５ＧＳ（Ｋｕｂｏら， ２００５， Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖ． １９： １８５５-１８６０）などが含まれる。外来ＤＮＡの５’末端には、プロモーターが連結される。プロモーターの例は、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーター、ノパリン合成酵素遺伝子プロモーター、トウモロコシユビキチンプロモーター、オクトピン合成酵素遺伝子プロモーター、イネアクチンプロモーターなどである。また、外来ＤＮＡの３’末端にはターミネーター（例えばノパリン合成酵素遺伝子ターミネーターなど）が挿入される。ベクターにはさらに、形質転換細胞を選抜するために必要な選択マーカーが挿入される。選択マーカーの例は、薬剤耐性遺伝子であるカナマイシン耐性遺伝子（ＮＰＴＩＩ）、ハイグロマイシン耐性遺伝子（ｈｔｐ）、ビアラホス耐性遺伝子（ｂａｒ）などである。
【００３９】
（トランスジェニック植物の作出）
上記のようにして構築したベクターを植物に導入する形質転換法としては、アグロバクテリウムを用いた方法を例示することができるが、それ以外にも、遺伝子銃、エレクトロポレーション、ウイルスベクター、フローラルディップ法、リーフディスク法などによっても、導入することができる。植物の形質転換技術や組織培養技術に関しては、例えば島本功、岡田清孝監修、植物細胞工学シリーズ15、モデル植物の実験プロトコール、遺伝学的手法からゲノム解析まで、秀潤社（2001年）に記載されている。
【００４０】
バイナリーベクター−アグロバクテリウム系を利用する方法では、植物細胞、カルスまたは植物組織片を準備し、これにアグロバクテリウムを感染させて、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを植物細胞内に導入する。形質転換においては、培地にフェノール化合物（アセトシリンゴン）を添加してもよく、特に単子葉植物においては、該細胞は効率よく形質転換されうる。また、アグロバクテリウムとしては、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ菌株（Ｃ５８， ＬＢＡ４４０４， ＥＨＡ１０１， ＥＨＡ１０５， Ｃ５８Ｃ１ＲｉｆＲなど）が使用されうる。
【００４１】
形質転換用培地は、固体培地であり、例えばＭＳ培地、Ｂ５培地、ＤＫＮ培地、Ｌｉｎｓｍａｉｅｒ ＆ Ｓｋｏｏｇ培地などの植物培養用培地を基本培地として、これに１〜５％のマルトース、蔗糖、グルコース、ソルビトールなどの糖類、及び０．２〜１％の寒天、アガロース、ゲルライト、ゲランガムなどの多糖類固化剤を添加することができる。培地には、カザミノ酸、アブシジン酸、カイネチン、２，４−Ｄ、インドール酢酸、インドール酪酸などのオーキシン類やサイトカイニン類、カナマイシン、ハイグロマイシン、カルベニシリンなどの抗生物質、アセトシリンゴンなどを添加することができる。培地の好適ｐＨは、５〜６、例えばｐＨ５．５〜５．８である。また、形質転換後に、例えば転写活性化を誘導する物質、例えば、グルココルチコイド、デキサメタゾン、エストロゲン、それらの誘導体などのステロイドホルモンを培地に添加することもできる。
【００４２】
具体的には、アグロバクテリウムの菌液を暗所、約２５℃、約４日間での培養により調製し、この菌液に植物カルス又は組織（例えば葉片、根、茎片、成長点など）を数分間浸漬し、水分を除いたのち、固体培地に置床して共存培養する。カルスは、植物細胞塊であり、植物組織片又は完熟種子などからカルス誘導培地を用いて誘導することができる。形質転換されたカルス又は組織片を選択マーカーに基づいて選択し、その後、カルスについては、再分化培地にて幼植物体に再分化させることができる。一方、植物片については、植物片からカルスを誘導して幼植物体に再分化させるか、或いは植物片からプロトプラストを調製し、カルス培養を経て幼植物体に再分化させることができる。このようにして得られた幼植物体を発根後に土壌に移し植物体に再生する。
【００４３】
また、フローラルディップ法を使用する場合には、例えばＣｌｏｕｇｈとＢｅｎｔ（Ｐｌａｎｔ Ｊ．１６， ７３５−７４３（１９９８））らによって記載されるように、例えばアグロバクテリウムの菌液を暗所、約２５℃、約４日間での培養により調製し、この菌液に未熟な花芽が発達するまで生育させた形質転換対象の植物宿主の花芽を１０秒間浸漬し、覆いをして一晩湿度を保つ；翌日覆いを取り、植物をそのまま生育させて種子を収穫する；形質転換された個体は、適切な選択マーカー例えば抗生物質を加えた固体培地上に収穫した種子を播種することで選択することができる；このようにして選択した個体を土壌に移し生育させることにより、トランスジェニック植物の次世代の種子を得ることができる。
トランスジェニック植物を野生型と交配させることによって、トランスジェニック植物と同様の新規形質をもつ後代を作出することができる。
【００４４】
上記の方法で作出されたトランスジェニック植物またはその後代は、ＴＥＤ６とＴＥＤ７の組み合わせ、ＴＥＤ６のＣ末端断片、ＴＥＤ７のＣ末端断片、およびＴＥＤ６のＣ末端断片とＴＥＤ７のＣ末端断片の組み合わせからなる群から選択されるタンパク質をコードするＤＮＡを発現可能に含み、かつ、野生型植物と比べて二次細胞壁の厚さが増大していることを特徴とする。
したがって、本発明はさらに、そのようなトランスジェニック植物またはその後代だけでなく、それらの細胞または組織あるいは種子をも提供する。
【００４５】
本発明の対象植物は、双子葉植物、単子葉植物、裸子植物、樹木などの植物を非限定的に含む。特に有用性の高い植物には、バイオマス資源として重要な木本植物および草本植物、例えばユーカリ、ポプラ、サトウキビ、イネ、ムギ類などが含まれる。
【００４６】
（ＴＥＤ６およびＴＥＤ７の二次細胞壁形成促進機能）
ＴＥＤ６およびＴＥＤ７がいずれも導管の二次細胞壁の合成に関与するであろうということが、シロイヌナズナを用いた研究の過程で本発明者によって推定された（Ｔ． Ｄｅｍｕｒａ， “Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ Ｕｎｄｅｒｌｙｉｎｇ Ｘｙｌｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ， ａｓ ａ Ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ Ｗｏｏｄ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ”， Ａｂｓｔｒａｃｔｓ ｉｎ ＦＵＮＣＦＩＢＥＲ ２００８ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ ｔｈｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｗｏｏｄ， ｐａｇｅ １２ （２００８））。しかしながら、実際、ＴＥＤ６またはＴＥＤ７単独では、二次細胞壁の形成を促進する機能を有していないことが判明した。
【００４７】
今回はじめて本発明者らによって、ＲＮＡ干渉法（ＲＮＡi）を利用して、本発明に示されるように、ＴＥＤ６とＴＥＤ７の組み合わせ、ＴＥＤ６のＣ末端断片、ＴＥＤ７のＣ末端断片、およびＴＥＤ６のＣ末端断片とＴＥＤ７のＣ末端断片の組み合わせからなる群から選択されるタンパク質が、導管細胞及び木繊維細胞の二次細胞壁形成を促進する機能をもつことが見出された。本発明に関わるこれらのタンパク質およびそれらのＣ末端断片ならびにそれらの例示は、上で記載したとおりである。
【００４８】
ＴＥＤ６およびＴＥＤ７タンパク質は、細胞内局在の解析の結果、主に植物細胞の形質膜に存在し、細胞壁にも幾分か存在していることがわかった。このうち、ＴＥＤ７は、ＴＥＤ６と比べて細胞壁により多く保持されやすく、これはおそらくＴＥＤ７のプロリンに富むＮ末端ドメインの相互作用によるものであろうと考えられる。構造的に、ＴＥＤ７に比べて、ＴＥＤ６は、プロリンに富むＮ末端ドメインが非常に短いために、ＴＥＤ６は細胞壁に保持されにくいと推定されるが、ＴＥＤ６については、シロイヌナズナでの実験の結果、ＴＥＤ６はセルロース合成酵素ＣｅｓＡのＩＲＸ３サブユニットに結合することが判明し、これは、ＴＥＤ６と二次細胞壁−ＣｅｓＡ複合体とが相互作用していることを示す証拠である。
【００４９】
（実施例）
本発明を以下の実施例によってさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は、これらの実施例によって限定されないものとする。
【実施例１】
【００５０】
ヒャクニチソウ属（Ｚｉｎｎｉａ）植物の管状要素におけるＺｅ ＴＥＤ６およびＺｅ ＴＥＤ７遺伝子の機能解析
Ｚｅ ＴＥＤ６およびＺｅ ＴＥＤ７タンパク質のバイオインフォマチクス分析（ＳＯＳＵＩ、ＴＭＨＭＭおよびＳｉｇｎａｌＰを含む）により、それらのタンパク質はともに「Ｉ型膜タンパク質」（細胞外または内腔のＮ末端と細胞質Ｃ末端を有する１回膜貫通タンパク質）であることが予測された。上記タンパク質はいずれも、一般的な１回膜貫通ドメイン様疎水性領域（それぞれＺｅ ＴＥＤ６およびＺｅ ＴＥＤ７タンパク質の９５アミノ酸のうち２３アミノ酸および３００アミノ酸のうちの２３アミノ酸を表す）を含み、それらのＣ末端は細胞質側であると予測された。しかしながら、これらタンパク質の潜在的な活性に関しては、これまでＰｒｏＤｏｍ、ＰＲＯＳＩＴＥまたはＰｆａｍによって機能的ドメインがまったく予測されていなかった。Ｐｒｏに富む領域のみが、Ｚｅ ＴＥＤ７タンパク質のＮ末端領域で同定されていた。植物の細胞外タンパク質のなかで、Ｐｒｏに富む配列は、ヒドロキシプロリンに富む糖タンパク質（ＨＲＧＰ）であることはよく知られている。Ｚｅ ＴＥＤ７はＨＲＧＰであろうけれども、それはＨＲＧＰファミリーで一般に認められる何らの反復モチーフを有していない。
【００５１】
ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター駆動の、Ｃ末端にＹＦＰ（黄色蛍光タンパク質）を融合したタンパク質をコードするプラスミドを、エレクトロポレーションによってヒャクニチソウの葉肉に導入することによって、Ｚｅ ＴＥＤ６およびＺｅ ＴＥＤ７の細胞内局在を実験的に調べた（Ｅｎｄｏら（２００８） Ｐｌａｎｔ Ｊ． ５３：８６４−８７５）。各融合タンパク質の蛍光シグナルは、細胞の末梢領域でのみ検出されたが、このことは、形質膜および／または細胞壁での局在を示している。原形質分離している細胞により、それらが主に形質膜に局在し、細胞壁にもある程度局在していることが明示された。Ｚｅ ＴＥＤ７−ＹＦＰ融合タンパク質の方が、Ｚｅ ＴＥＤ６−ＹＦＰ融合タンパク質と比べて、より多く細胞壁に保持されていた。このことは、Ｚｅ ＴＥＤ７タンパク質のＰｒｏに富むＮ末端ドメインと細胞壁との可能な相互作用によって説明することができる。
【００５２】
全長のＺｅ ＴＥＤ６またはＺｅ ＴＥＤ７タンパク質の過剰発現がＴＥ ＳＣＷ（二次細胞壁（ｓｅｃｏｄａｒｙ ｃｅｌｌ ｗａｌｌ））形成に及ぼす作用を、ｄｓＲＮＡ仲介ＲＮＡｉ法によって、視覚化可能なＴＥ ＳＣＷを示す細胞数に対して調べた。さらに、これらのタンパク質のＣ末端ドメインについても同様に調べ、ＳＣＷ形成における上記細胞質ドメインの機能を評価した。その結果、全長タンパク質ではなくＣ末端ドメインのみを用いて、僅かではあるが有意な増加（過剰発現するＧＵＳコントロールの数％増加）を見出した。したがって、ＳＣＷ形成に対するこの正の効果を観察するために、低密度細胞培養（０．５×１０５細胞ｍＬ−１）を使用した。このような培養は、通常、コントロールにおける低率のＳＣＷ形成（３０％未満）を示す。これによって、Ｃ末端ドメインを用いてＳＣＷ形成の割合が統計的に有意に増加することが確認された（図１Ａおよび１Ｂ）。同様に、Ｚｅ ＴＥＤ６および Ｚｅ ＴＥＤ７両方の全長タンパク質の同時過剰発現により、ＳＣＷ形成割合が増加した（図１Ｃ）が、このことは、ＴＥのＳＣＷ形成中でのＺｅ ＴＥＤ６およびＺｅ ＴＥＤ７タンパク質の機能的相互作用を示している。
【実施例２】
【００５３】
アブラナ科植物（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）でのＡｔ ＴＥＤ６およびＡｔ ＴＥＤ７の機能解析
ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓにおけるＺｅ ＴＥＤ６およびＺｅ ＴＥＤ７遺伝子のホモログがそれぞれ、Ａｔ１ｇ４３７９０ （Ａｔ ＴＥＤ６）およびＡｔ５ｇ４８９２０ （Ａｔ ＴＥＤ７）であることを見出した。Ａｔ ＴＥＤ６およびＡｔ ＴＥＤ７のプロモーター活性を、Ａｔ ＴＥＤ６およびＡｔ ＴＥＤ７の１ｋｂ−および０．５ｋｂ−上流配列を用いて調べた。これらの上流配列には、ＧＵＳレポーター遺伝子を連結した。幼植物でのレポータートランスジーン発現は、両遺伝子内の分化する導管要素に制限されたが、このことによりさらに、Ｚｅ ＴＥＤ６およびＺｅ ＴＥＤ７との機能的相同性が確認された。Ａｔ ＴＥＤ６およびＡｔ ＴＥＤ７のコード配列のＮ末端にそれぞれ、ＹＦＰレポーター遺伝子を連結し、それら自身のプロモーターの制御下で発現した。Ａｔ ＴＥＤ６シグナルおよびＴＥＤ７−ＹＦＰシグナルは、原生木部と後生木部の分化する導管要素中の発生するＳＣＷの下側でのみ特異的に観察された。幾つかの場合、これらのシグナルの不統一な局在が、後生木部の導管要素で認められたが、その生物学的意義については依然として不明である。
【００５４】
Ａｔ ＴＥＤ６およびＡｔ ＴＥＤ７の機能を調べるために、ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターを連結したＡｔ ＴＥＤ６およびＡｔ ＴＥＤ７の全長、Ｃ末端または逆反復（ＲＮＡｉ）を有するトランスジェニックＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓを作製したが、Ａｔ ＴＥＤ７の逆反復をもつものを除いて劇的な形態学的な変化は観察されなかった。
【００５５】
トランスジェニック植物は、発芽培地で増殖できなかったが、カルス誘導培養上で生き続けた。このことは、Ａｔ ＴＥＤ７遺伝子の機能の構成的喪失の結果、ＲＮＡｉ分析において幼植物の致死が生じることを示している。
【００５６】
Ａｔ ＴＥＤ６およびＡｔ ＴＥＤ７の機能喪失をさらに調べるために、挿入変異体に関するＳＡＬＫ Ｔ−ＤＮＡデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｓｉｇｎａｌ．ｓａｌｋ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｔｄｎａｅｘｐｒｅｓｓ）を検索した。Ａｔ ＴＥＤ６についていかなる系統の入手もできなかったが、Ａｔ ＴＥＤ７について、Ｔ−ＤＮＡ／トランスポゾン挿入系統（ＳＡＬＫ＿０８４１１５、ＳＡＬＫ＿０８９５４９およびＳＭ＿２＿３０４４４）を入手することができた。しかしながら、Ａｔ ＴＥＤ７のコード領域には挿入はなかったがＡｔ ＴＥＤ７の５’または３’フランキング領域に挿入が認められた。このことから、挿入がＡｔ ＴＥＤ７のノックアウト変異体でないことが示された。
【００５７】
Ａｔ ＴＥＤ７の構成的ＲＮＡｉの代わりに、デキサメタゾン（ＤＥＸ）誘導プロモーター（ＡｏｙａｍａとＣｈｕａ （１９９７）Ｐｌａｎｔ Ｊ． １１：６０５−６１２）を使用した。誘導性プロモーターと連結した、Ａｔ ＴＥＤ６、Ａｔ ＴＥＤ７、Ａｔ ＴＥＤ６とＡｔ ＴＥＤ７のキメラ、ならびにＹＦＰ（コントロール）、の各逆反復配列を、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物に導入した。形質転換体の選択を、非誘導条件下で、誘導性ＲＮＡｉ構築物を保有する十分に成長した植物を選択することによって行った。Ａｔ ＴＥＤ７ ＲＮＡｉおよびＡｔ ＴＥＤ６-ＴＥＤ７キメラＲＮＡｉの両方の形質転換体を少数得ることができたが、これはおそらく、幼植物の致死性を生じさせるＡｔ ＴＥＤ７逆反復の残存「漏出」発現によるためであると考えられる。誘導性ＲＮＡｉの効率を、１０μＭデキサメタゾンに５時間晒したあとに選択された幼若植物系統において、標的転写体の各々についてＲＴ−ＰＣＲで調べた（図３Ａ）。誘導性ＲＮＡｉを、１０μＭデキサメタゾン補充増殖培地上で植物を５日間インキュベートすることによって３週令のＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物に対して行った（図３Ｂ〜３Ｅ）。予期しないことであったが、ＤＥＸ誘導性ＲＮＡｉ自身が、ＳＣＷ上に異常に大きな壁孔をもつ根の後生木部導管の形成、および場合により根の原生木部導管形成の阻害、を含む固有の作用を有することが判明した（図３Ｅ）。しかしながら、その固有の作用の他に、根の導管要素のＳＣＷ形成の明らかな欠陥が、Ａｔ ＴＥＤ７およびＡｔ ＴＥＤ６-ＴＥＤ７キメラの誘導性ＲＮＡｉ系統で起こった（図３Ｂおよび３Ｃ）。これらの両方の系統では、一般的でない階紋状ＳＣＷを持つ異常な導管要素（図３Ｃ）が、通常、網状化または壁孔化したＳＣＷを示す後生木部導管の代わりに形成された（図３Ｂ）。さらに、Ａｔ ＴＥＤ６-ＴＥＤ７キメラＲＮＡｉ系統は、後生木部の不連続なまたは欠落した導管を示した（図３Ｄ）。Ａｔ ＴＥＤ６-ＴＥＤ７キメラＲＮＡｉ系統の根に対し実施した透過型電子顕微鏡により、ＹＦＰ ＲＮＡｉコントロールに反して、薄く不完全なＳＣＷ（これは階紋状ＳＣＷを表すと推定される。）をもつ導管が、後生木部の位置に存在した。これらの結果は、導管要素のＳＣＷ形成におけるＡｔ ＴＥＤ６およびＡｔ ＴＥＤ７の関与を強く示している。
【実施例３】
【００５８】
（ｄｓＲＮＡおよびプラスミドＤＮＡ）
Ｚｉｎｎｉａ ＥＳＴクローン（Ｄｅｍｕｒａら２００２， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９９：１５７９４−１５７９９）をＰＣＲに掛けて、両末端にＴ７およびＳＰ６プロモーターを含む断片を作製した。ＰＣＲ産物を精製し、Ｅｎｄｏら（Ｐｌａｎｔ Ｊ． ５３：８６４−８７５， ２００８）によって記載されるように、ｄｓＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ合成のための鋳型として直接使用した。Ｚｅ ＴＥＤ６およびＺｅ ＴＥＤ７遺伝子の完全長ｃＤＮＡ（それぞれ、Ｚ１９４３、Ｚ１６６５３クローン）を、 ＳＭＡＲＴ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ （Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｌｏｎｔｅｃｈ．ｃｏｍ／）を用いて得た。そのコード配列をｐＨ３５ＧＹ （Ｋｕｂｏら２００５， Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． １９：１８５５−１８６０）およびｐＹ３５ＧＳ（Ｅｎｄｏら ２００８, Ｐｌａｎｔ Ｊ． ５３：８６４−８７５）に挿入し、それぞれ、タンパク質の局在とＺｉｎｎｉａ細胞内での過剰発現を調べた。ｐＹ３５ＧＳにＧＵＳを挿入することによって構築されたｐＹ３５ＧＵＳを、コントロールとして使用した。Ｚｅ ＴＥＤ６（配列番号１）の２７Ｌｅｕから９５Ａｌａまでをコードする配列およびＺｅ ＴＥＤ７（配列番号２）の２０９Ｔｒｐから３００Ｇｌｙまでをコードする配列を、ｐＹ３５ＧＳに挿入した。Ａｔ ＴＥＤ６およびＡｔ ＴＥＤ７遺伝子の開始コドンの５’上流（それぞれ、１ｋｂおよび０．５ｋｂ）を、プロモーター領域として使用した。断片を、ｐＢＧＧＵＳ （Ｋｕｂｏら，２００５（上記））に挿入し、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物でのそれらのプロモーター活性を調べた。 プロモーター領域およびＯＲＦを含むゲノム断片を、ｐＨＧＹ（これは、そのＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター配列を欠失することによってｐＨ３５ＧＹから誘導された。）に挿入した。ＦＡＤ２ （Ａｔ３ｇ１２１２０）遺伝子の第１イントロンを、完全長Ａｔ ＴＥＤ６ ＯＲＦ、Ａｔ ＴＥＤ７ ＯＲＦ、およびＡｔ ＴＥＤ６-ＴＥＤ７キメラ配列の逆反復配列のリンカーとして使用した。Ａｔ ＴＥＤ７ ＯＲＦをＡｔ ＴＥＤ６ ＯＲＦのＰｓｈＡＩ部位に挿入することによって、キメラを構築した。逆反復をｐＨ３５ＧＳ （Ｋｕｂｏら， ２００５（上記））および／またはｐＴＡ７００２（ＡｏｙａｍａとＣｈｕａ １９９７ Ｐｌａｎｔ Ｊ． １１：６０５−６１２）の中に入れて、構成的で一過性のＲＮＡｉ系統をそれぞれ作製するためのベクターとした。ＶＮＤ７ ｃＤＮＡ （Ｙａｍａｇｕｃｈｉら２００８， Ｐｌａｎｔ Ｊ． ５５：６５２−６６４）をｐＥＲ８ （Ｚｕｏら２０００， Ｐｌａｎｔ Ｊ． ２４：２６５−２７３）に挿入して異所性ＴＥ誘導性系統を作製するためのベクターとした。
【００５９】
（ＲＴ−ＰＣＲ）
ＲＮＡを、Ｅｎｄｏら（２００８（上記））によって記載されたように、２つの独立の系統から調製し、ｃＤＮＡ合成のために使用した。ＰＣＲは、Ａｔ ＴＥＤ６およびＡｔ ＴＥＤ７の５’−および３’−ＵＴＲ にそれぞれ位置するプライマーを用いて実施された。使用したプライマーは、Ａｔ ＴＥＤ６について、５’−ＡＧＡ ＧＣＣ ＴＣＡ ＣＡＣ ＡＴＣ ＡＡＡ ＣＡＣ ＡＡＧ−３’（配列番号１２）および５’−ＧＧＴ ＡＡＣ ＡＴＴ ＡＴＧ ＡＡＴ ＧＡＡ ＧＡＡ ＡＧＣ ＴＣ−３’（配列番号１３）； Ａｔ ＴＥＤ７について、５’−ＡＡＣ ＣＡＴ ＴＴＡ ＡＧＴ ＡＣＡ ＴＡＣ ＡＴＡ ＣＴＣ ＣＣ−３’（配列番号１４）および５’−ＡＴＧ ＡＴＴ ＧＴＴ ＴＡＣ ＡＴＴ ＴＴＧ ＡＧＣ ＣＴＴ ＴＴＧ−３’（配列番号１５）；アクチン２ （Ａｔ３ｇ１８７８０）について、５’−ＣＣＧ ＴＴＴ ＴＧＡ ＡＴＣ ＴＴＣ ＣＴＣ ＡＡＴ Ｃ−３’（配列番号１６）および５’−ＡＴＡ ＣＣＧ ＧＴＡ ＣＣＡ ＴＴＧ ＴＣＡ ＣＡＣ Ａ−３’（配列番号１７）；ならびに、ユビキチン（Ａｔ５ｇ５７８６０）について、５’−ＴＣＣ ＡＡＴ ＧＴＧ ＡＴＣ ＣＡＡ ＣＡＧ ＡＧＡ Ｃ−３’（配列番号１８）および５’−ＴＴＣ ＡＡＡ ＧＴＣ ＡＡＡ ＧＣＣ ＡＣＡ ＡＣＴ Ｇ−３’（配列番号１９）である。
【００６０】
さらにまた、Ｚｅ ＴＥＤ７−１およびＺｅ ＴＥＤ７−２のＰＣＲ増幅用プライマーはともに下記のものが使用された。
５’−ＴＴＣ ＣＣＴ ＣＡＴ ＴＴＴ ＣＣＡ ＣＣＧ ＣＣＡ ＴＣ−３’（配列番号２０）、および５’−ＴＧＴ ＴＧＴ ＧＧＡ ＡＴＧ ＧＴＴ ＧＣＴ ＴＧＧ ＡＧＡ−３’（配列番号２１）
【産業上の利用可能性】
【００６１】
本発明は、植物において導管細胞および木繊維細胞の二次細胞壁形成を促進し、したがって二次細胞壁の厚さを増大するため、バイオマス資源である木本植物や草本植物のセルロース含量を増大させることを可能にするため、産業上有用性が高い。
【配列表フリーテキスト】
【００６２】
配列番号１２〜２１：プライマー
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物の木繊維二次細胞壁形成を促進する機能を有するタンパク質、それをコードするＤＮＡ、ならびに、その利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
人類は、長い間、樹幹、根、葉、枝等の木質バイオマスを、製紙、建築、飼料、燃料等の多岐にわたる産業分野で利用してきた。木質バイオマスを利用した産業は、将来的にも、持続的利用可能な資源を活用できるとして地球環境問題改善の観点から再認識されており、現行の化石資源に替わるカーボンソースの利用による循環型産業として期待されている。そこで、木質バイオマスの持続的かつ安定的確保達成のため、ユーカリ属、アカシア属等の早生樹を中心とした植林産業が世界的に進められている。
【０００３】
木質バイオマスは、植物茎の二次木部に存在する導管細胞と木繊維細胞で構成されている。これらの細胞は、共に細胞内にセルロース、ヘミセルロース、リグニンで構成される二次細胞壁を形成することが特徴的である。木質バイオマスとして産業分野で利用されているのは、主に二次木部の大部分を占めている木繊維細胞の方である（非特許文献１）。この木繊維細胞の二次細胞壁の量（肥厚の度合い）は、バイオマス量や木繊維の物理的性質に影響を及ぼすため、大変重要である。
【０００４】
近年、木質バイオマスを用いたバイオエネルギー生産やバイオファイナリーが盛んになってきていることは周知のとおりである。二次細胞壁が厚くなりバイオマス量が増加することは、これらの生産性向上やコスト低減の面で大変有意義である。また、従来の製紙原材料として見た場合も、二次細胞壁が厚くルンケル比（二次細胞壁とルーメンの比率）が大きい木繊維が求められる嵩高紙等において、生産性向上やコスト低減の面で大変有意義である。
【０００５】
将来の植林事業の進展にあわせ、主要な木質バイオマスである木繊維細胞の二次細胞壁形成を促進することで、そのバイオマス量（セルロース、ヘミセルロース、リグニン）を改変することで、さらにルンケル比率等の木繊維形態を改変することで将来のエネルギー利用や工業原料としての用途拡張も見込まれる。従って、地球規模での木質バイオマスのより効果的かつ効率的生産を実現するためにも、木繊維細胞の二次細胞壁形成促進方法の開発は非常に重要である。
【０００６】
現在までに、いくつかの二次細胞壁形成促進方法が公知となっている（特許文献１〜５、非特許文献２〜５）。しかしながら、多くが木繊維以外の植物細胞の二次細胞壁形成促進であり、促進される細胞や二次細胞壁の量が非常に少ないため、実用上は利用できない。また、木繊維細胞の二次細胞壁形成促進の公知技術にも存在するが、矮化するなどの悪影響が現れるため、実用上利用できない。このように、現在公知となっている技術では、木繊維細胞の二次細胞壁形成促進は困難である。
【０００７】
ところで、本発明者らは、導管細胞形成時に特異的に発現が誘導される遺伝子を多数見出している（非特許文献６）。本発明者らが見出した遺伝子群の中には、機能未知の遺伝子が多数含まれており、導管形成に何らかの役割を担っていると考えられる。導管細胞と木繊維細胞は、共に内部に二次細胞壁を形成する面では大変似ており、また起源も同じ仮導管と言われている。従って、これらの遺伝子機能を解析することで、導管細胞だけでなく木繊維細胞の二次細胞壁形成も制御できる可能性が考えられる。しかしながら、そのような技術や知見はない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特許第4068152号公報
【特許文献２】特表第2003-509009号公報
【特許文献３】特開第2006-246852号公報
【特許文献４】特表第2006-526990号公報
【特許文献５】特開第2008-178422号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Evert, RF. Esau’s Plant Anatomy, Meristems, Cells, and Tissues of the Plant Body: their Structure, Function, and Development. 3rd edn. New Jersey: John Wiley & Sons, Inc.
【非特許文献２】Kuboら, 2005 Genes & Dev. 19:1855-1860
【非特許文献３】Goicoecheaら, 2005 The Plant Journal 43:553-567
【非特許文献４】Mitsudaら, 2005 The Plant Cell 17:2993-3006
【非特許文献５】Zhongら、2006 The Plant Cell 18:3158-3170
【非特許文献６】Demura, T.とFukuda, H. 2007 Trends in Plant Sci. 12:64-70
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、本発明の目的は、機能未知遺伝子であるＴＥＤ６およびＴＥＤ７の利用方法、ならびに、二次細胞壁形成が促進された植物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、植物の管状要素分化（ＴＥＤ）関連タンパク質であるＴＥＤ６またはＴＥＤ７が、植物の二次細胞壁のセルロース合成と二次細胞壁のパターン形成に関与するであろうと予測してきたが、このようなタンパク質は単独ではそのような機能をもたないことが判明したため、さらに鋭意研究を重ねた結果、以下のような特徴を有する発明を完成させた。
【００１２】
したがって、本発明は、要約すると以下のような特徴を包含する。
本発明は、第１の態様において、ＴＥＤ関連タンパク質またはそのＣ末端断片を用いて植物の二次細胞壁の厚さを増大させるための方法であって、ＴＥＤ６とＴＥＤ７の組み合わせ、ＴＥＤ６のＣ末端断片、ＴＥＤ７のＣ末端断片、およびＴＥＤ６のＣ末端断片とＴＥＤ７のＣ末端断片の組み合わせからなる群から選択されるタンパク質をコードするＤＮＡを発現可能に含むトランスジェニック植物を作出し、該ＤＮＡを該植物内で発現させることを含む方法を提供する。
【００１３】
その実施形態において、上記ＴＥＤ６またはＴＥＤ７のＣ末端断片は、ＴＥＤ６またはＴＥＤ７の成熟アミノ酸配列のうちＮ末端から膜貫通ドメインまでの配列を含まないアミノ酸配列、あるいはそのアミノ酸配列においてＮ末端側および/またはＣ末端側に１もしくは数個のアミノ酸の欠失、置換または付加を含むアミノ酸配列、からなる。
ここで、「数個」とは、１０以下の整数、すなわち２〜１０の整数を指す。
【００１４】
本発明はまた、第２の態様において、上記のＴＥＤ６とＴＥＤ７の組み合わせ、ＴＥＤ６のＣ末端断片、ＴＥＤ７のＣ末端断片、およびＴＥＤ６のＣ末端断片とＴＥＤ７のＣ末端断片の組み合わせからなる群から選択されるタンパク質をコードするＤＮＡを発現可能に含む、かつ、野生型植物と比べて二次細胞壁の厚さが増大していることを特徴とするトランスジェニック植物またはその後代を提供する。
【００１５】
本発明はさらに、第３の態様において、上記のトランスジェニック植物またはその後代由来の細胞または組織を提供する。
本発明はさらに、第４の態様において、上記のトランスジェニック植物またはその後代の種子を提供する。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の方法は、植物の木繊維細胞で二次細胞壁形成を促進し二次細胞壁の厚さを増大させることを可能にする。二次細胞壁の肥厚化は、バイオマス量の増加に導くことができるという利点を有する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】この図は、ヒャクニチソウ（Ｚｉｎｎｉａ ｅｌｅｇａｎｓ）細胞の二次細胞壁形成に及ぼすＺｅ ＴＥＤ６、Ｚｅ ＴＥＤ７、およびそれのＣ末端断片の過剰発現の効果を示す。縦軸は、視覚化可能な二次細胞壁を有する細胞の割合（％）を示す。図１Ａは、ＺｅＴＥＤ６の全長およびＣ末端断片（配列番号１の２７Ｌｅｕ〜９５Ａｌａ）の過剰発現を示し、図１Ｂは、Ｚｅ ＴＥＤ７−１の全長およびＣ末端断片（配列番号２の２０９Ｔｒｐ〜３００Ｇｌｙ）の過剰発現を示し、ならびに、図１Ｃは、Ｚｅ ＴＥＤ６とＺｅ ＴＥＤ７の過剰共発現を示す。また、図中、ＧＵＳ（β−グルクロニダーゼ）は、Ｚｅ ＴＥＤ６、Ｚｅ ＴＥＤ７またはそれらのＣ末端断片の代わりにＧＵＳが過剰発現された植物コントロールを示す。
【図２】この図は、ヒャクニチソウのＴＥＤ６およびＴＥＤ７（すなわち、Ｚｅ ＴＥＤ６、Ｚｅ ＴＥＤ７）のアミノ酸配列、ならびに、シロイヌナズナ、ポプラおよびイネの同族体のアミノ酸配列のアラインメント（図２Ａ）、ｎｅｉｇｈｂｏｒ−ｊｏｉｎｉｎｇ法によるＭＥＧＡ４（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖｅｒｓｉｏｎ ４．０;Ｔａｍｕｒａ， Ｋ．ら（２００７） Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． Ｅｎｖｏｌ． ２４：１５９６−１５９９）を利用した保存領域の比較を示す樹形図（図２Ｂ）、ならびに、図２Ｂの作成に使用した、それらアミノ酸配列の比較的保存されたＣ末端領域（図２Ｃ）を示す。図２Ａで、太字が膜貫通ドメインを示し、下線が、実施例で使用されたＺ１９４３およびＺ１６６５３クローンのアミノ酸配列を表す。Ｏｓ０８ｇ０１０８３００は、Ｃ末端ドメインの２つの反復を含んでおり（図２Ａ）、図２ＢではＯｓ０８ｇ０１０８３００のＣ末端ドメインの保存された２つの反復領域を分割して示した。
【図３】この図は、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）の根でのＡｔ ＴＥＤ６およびＡｔ ＴＥＤ７遺伝子に及ぼす一過性のＲＮＡｉ解析の結果を示す。図３Ａは、一過性に誘導されたＲＮＡｉ条件下でＡｔ ＴＥＤ６およびＡｔ ＴＥＤ７遺伝子の発現を示す。Ａｔ ＴＥＤ６、Ａｔ ＴＥＤ７およびそれら両方に対応する逆反復配列が、グルココルチコイド仲介誘導系の制御下でトランスジェニックシロイヌナズナ植物で一過性に発現された。総ＲＮＡは、１０μＭデキサメタゾン補充増殖培地上で５時間インキュベートされた１週令のシロイヌナズナ幼植物から抽出された。すべてのＲＴ−ＰＣＲサンプルを、ＰＣＲサイクルがＡｔ ＴＥＤ６で２５サイクル、Ａｔ ＴＥＤ７とユビキチンで３０サイクルであること以外同一条件下で調製した。図３Ｂ〜３Ｅは、Ａｔ ＴＥＤ６およびＡｔ ＴＥＤ７遺伝子のＲＮＡｉ系統の表現型を示す。３週令のトランスジェニックシロイヌナズナ植物を、１０μＭデキサメタゾン補充増殖培地上で５日間インキュベートして、グルココルチコイド仲介誘導系で逆反復配列を発現した。誘導の間に、より遅く発生した根の導管形成に対するＲＮＡｉの影響を調べた。図３Ｂ中のバーは、５０μｍを表す。図３Ｂは、野生型Ｃｏｌ−０である。図３Ｃは、Ａｔ ＴＥＤ７ ＲＮＡｉ系統であり、階紋状後生木部導管が直線状に伸びた状態を示す。図３Ｄは、Ａｔ ＴＥＤ６−ＴＥＤ７キメラＲＮＡｉ系統であり、直線状に伸びた後生木部導管での欠落を示す。図３Ｅは、ＹＦＰ ＲＮＡｉ系統であり、大きく窪んだ後生木部導管要素を示す。ここで、ＹＦＰは、黄色蛍光タンパク質を表す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
（ＴＥＤ６およびＴＥＤ７タンパク質をコードするＤＮＡ）
ＴＥＤ６およびＴＥＤ７はいずれも、植物における導管などの管状要素の分化に関連したＩ型膜タンパク質である。これらのタンパク質は、植物細胞中で同時に過剰発現されるとき、導管細胞や木繊維細胞の二次細胞壁形成の促進に導く。
【００１９】
ＴＥＤ６およびＴＥＤ７は、多くの植物種で、Ｎ末端側からプロリン（Ｐｒｏ）に富むドメイン、単一の膜貫通（ＴＭ）ドメイン、およびＣ末端ドメインからなる特徴的な構造を有する。プロリンに富むドメインは、細胞外ドメインであり、一方、Ｃ末端ドメインは細胞質ドメインである。一般に、植物の細胞外タンパク質のうち、プロリンに富む配列は、ヒドロキシプロリンに富む糖タンパク質（ＨＲＧＰ）の特徴であることが周知されており、特にＴＥＤ７はＨＲＧＰであろうと推定されるが、特にＺｅ ＴＥＤ７にはＨＲＧＰファミリーに典型的に認められる反復配列が存在していない。
【００２０】
図２に、例えば、ヒャクニチソウ、シロイヌナズナ、ポプラおよびイネからなる植物のＴＥＤ６およびＴＥＤ７のアミノ酸配列のアラインメント（図２Ａ）と、それらアミノ酸配列の比較的保存されたＣ末端領域のアミノ酸配列（図２Ｃ）を示す。異種の植物間では、これらＴＥＤタンパク質の配列同一性は高くないが、上記のような特徴的なドメイン構造を有するという点で、上記例示のタンパク質は管状要素分化関連タンパク質ファミリーに属することが理解される。
【００２１】
これらの植物由来のＴＥＤ６およびＴＥＤ７のアミノ酸配列は、以下の配列番号で後述の配列表に記載されている。
ヒャクニチソウのＴＥＤ６、ＴＥＤ７−１およびＴＥＤ７−２：配列番号１（ＡＢ３７７５１４）、配列番号２（ＡＢ３７７５１５）、および配列番号３（ＡＢ３７７５１６）
シロイヌナズナのＴＥＤ６およびＴＥＤ７：配列番号４（Ａｔｌｇ４３７９０）および配列番号５（Ａｔ５ｇ４８９２０）
ポプラのＴＥＤ６およびＴＥＤ７：配列番号６（ｅｕｇｅｎｅ３．０００２０６７１）および配列番号７（ｅｕｇｅｎｅ３．０００７０３８２）、配列番号８（ｆｇｅｎｅｓｈ１＿ｐｇ．Ｃ＿ＬＧ＿Ｖ０００００８）（ここで、配列番号７と８の配列は、ＴＥＤ７に属する。）
イネのＴＥＤ：配列番号９（Ｏｓ０８ｇ０１０８３００）（（注）配列番号１０（Ｏｓ０８ｇ０１０８３００＿１ｓｔ：TERKAEVHNL SGHVHVHKAT ESGPSGAKAT VLSIDEDLKF QEVAG）、配列番号１１（Ｏｓ０８ｇ０１０８３００＿２ｎｄ：AENKAELINV TEHIHVDEKI VSGPQGQKIE ILSEDEDIRF EEEGR）（ここで、配列番号１０と１１の配列は配列番号９の配列の重複ドメインを分割した部分配列である。））
【００２２】
また、これらのアミノ酸配列のうち膜貫通領域およびＣ末端ドメイン（図２Ａ）、ならびに比較的保存されたＣ末端領域（図２Ｃ）の各アミノ酸配列のアミノ酸残基位置は、配列番号１〜１１のアミノ酸配列と図２に記載の配列とから決定することができる。
【００２３】
本発明で使用可能なＴＥＤ６、ＴＥＤ７およびそれらのＣ末端断片は、ＴＥＤ６とＴＥＤ７の組み合わせ、ＴＥＤ６のＣ末端断片またはＴＥＤ７のＣ末端断片の形態として、導管細胞や木繊維細胞の二次細胞壁形成を促進する能力を喪失させない限り、野生型のアミノ酸配列に変異が導入されていてもよい。このような変異型ＴＥＤ６およびＴＥＤ７は、野生型のアミノ酸配列と７０％以上または８０％以上、好ましくは９０％以上または９５％以上、さらに好ましくは９８％以上または９９％以上の同一性を有している。アミノ酸の変異は、例えば、１もしくは複数（好ましくは、数個）のアミノ酸の欠失、置換または付加である。このうち、置換は、保存的アミノ酸置換が望ましい。保存的アミノ酸置換とは、例えば構造的、電気的、極性もしくは疎水性などの性質が類似したアミノ酸間の置換を意味する。このような性質は、例えばアミノ酸側鎖の類似性で分類することも可能である。塩基性側鎖を有するアミノ酸は、リシン、アルギニン、ヒスチジンからなり、酸性側鎖を有するアミノ酸は、アスパラギン酸、グルタミン酸からなり、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸は、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システインなどを含み、疎水性側鎖を有するアミノ酸は、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニンなどを含み、分岐側鎖を有するアミノ酸はトレオニン、バリン、イソロイシンからなり、ならびに、芳香族側鎖を有するアミノ酸は、チロシン、トリプトファン、フェニルアラニン、ヒスチジンからなる。
【００２４】
また、上記のＴＥＤ６、ＴＥＤ７およびそれらのＣ末端断片をコードするＤＮＡも、変異を含むことができる。そのような変異には、例えば遺伝暗号の縮重に基づく変異（すなわち、サイレント変異）、スプライス変異、多型による変異などが含まれる。あるいは、ストリンジェント条件下で野生型ＤＮＡとハイブリダイゼーション可能な塩基配列からなる変異体も、上記変異型ＤＮＡに含まれる。ただし、これらのＤＮＡによってコードされる変異型タンパク質は、ＴＥＤ６とＴＥＤ７の組み合わせ、ＴＥＤ６のＣ末端断片またはＴＥＤ７のＣ末端断片の形態として、導管細胞や木繊維細胞の二次細胞壁形成を促進する能力を有しているべきである。そのような能力は、野生型と同等またはそれ以上であってもよいし、あるいは、野生型より劣っていてもよい。変異型ＴＥＤ６およびＴＥＤ７をコードするＤＮＡは、野生型の成熟塩基配列と７０％以上または８０％以上、好ましくは９０％以上または９５％以上、さらに好ましくは９８％以上または９９％以上の同一性を有している。
【００２５】
ここで、ストリンジェント条件とは、例えば、約４２〜５５℃、２〜６×ＳＳＣでのハイブリダイゼーションののち、５０〜６５℃、０．１〜１×ＳＳＣ、０．１〜０．２％ＳＤＳでの１回もしくは複数回の洗浄からなる条件を含むが、このような条件は、鋳型核酸のＧＣ含量、イオン強度、温度などによって変化するため、上記の特定の条件に制限されないものとする。ここで、１×ＳＳＣは、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ クエン酸Ｎａ、ｐＨ７．０からなる。一般に、ストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度、ｐＨでの特定の配列の融解温度（Ｔｍ）よりも約５℃低くなるように設定される。ここで、Ｔｍは、鋳型配列に相補的なプローブの５０％が、平衡状態で鋳型配列にハイブリダイズする温度をいう。
【００２６】
人為的に変異を導入する手法として、例えば部位特異的突然変異誘発法、ＰＣＲを利用する変異導入法などが好ましく使用できる（Ｓａｍｂｒｏｏｋら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， １９８９， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ａｕｓｕｂｅｌら， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， １９９４， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓなど）。
【００２７】
本明細書中で使用する「同一性」は、例えば２つのアミノ酸配列又は塩基配列を、ギャップを導入するか又はギャップを導入しないで整列させたとき、アミノ酸又は塩基の総数に対する同一アミノ酸又は塩基の数の割合（％）を意味する。
【００２８】
また、ホモログ配列の検索或いは相同性検索は、ＢＬＡＳＴ（ＢＬＡＳＴＮ， ＢＬＡＳＴＰ， ＢＬＡＳＴＸなど）、ＦＡＳＴＡなどの公知のアルゴリズムを利用することによって実施できる。
【００２９】
上で例示した以外の植物の他のＴＥＤ６およびＴＥＤ７タンパク質のアミノ酸配列、ならびにそのようなタンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列は、植物ゲノムを公開する、例えば、ＮＣＢＩ（米国）、ＥＢＩ（欧州）、ＫＡＯＳ（かずさＤＮＡ研究所）、ＩＲＧＳＰ（国際イネゲノム塩基配列解析プロジェクト）、ＧｒａｉｎＧｅｎｅｓ（米国）、ＰＧＤＩＣ（米国）、ＦｏｒｅｓｔＧＥＮ（森林総合研究所）などのｗｅｂサイトにアクセスすることによって入手することができる。
【００３０】
本発明では、特に、ＴＥＤ６とＴＥＤ７の組み合わせ、ＴＥＤ６のＣ末端断片、ＴＥＤ７のＣ末端断片、およびＴＥＤ６のＣ末端断片とＴＥＤ７のＣ末端断片の組み合わせが、導管細胞や木繊維細胞の二次細胞壁形成を促進するうえで重要な機能を果たしている。
【００３１】
ここで、「ＴＥＤ６とＴＥＤ７の組み合わせ」は、植物または植物細胞内で、ＴＥＤ６およびＴＥＤ７をコードするＤＮＡが実質的に同時に発現し、これらのタンパク質に翻訳されることによって実現可能である。この場合、これらＤＮＡの発現は、該２つのＤＮＡが別々のベクターに発現可能に組み込まれていてもよいし、あるいは該２つのＤＮＡが同一のベクターに互いに発現可能にタンデムに組み込まれていてもよい。
【００３２】
また、「ＴＥＤ６のＣ末端断片」または「ＴＥＤ７のＣ末端断片」における「Ｃ末端断片」は、ＴＥＤ６またはＴＥＤ７タンパク質の細胞質側のＣ末端ドメイン（すなわち、成熟アミノ酸配列のうちＮ末端から膜貫通ドメインまでの配列を含まないアミノ酸配列を有するドメイン）からなっていてもよいし、あるいは、該Ｃ末端ドメインのアミノ酸配列においてＮ末端側および／またはＣ末端側に１もしくは数個のアミノ酸の欠失、置換または付加を含むアミノ酸配列を有していてもよい。後者の場合には、例えば、Ｃ末端断片のＮ末端側に、Ｃ末端ドメインと隣接する膜貫通領域の１〜３個程度のアミノ酸残基が付加されていてもよいし、また、例えば、Ｃ末端ドメインのアミノ酸配列からＣ末端側配列の一部（例えば１０個以下のアミノ酸残基）が欠失されていてもよい。通常、本発明における上記Ｃ末端断片は、図２Ｃに示されるような、植物間で比較的保存されたアミノ酸配列を含んでいること、および導管細胞や木繊維細胞の二次細胞壁形成を促進する能力を有していること、が望ましい。このようなＣ末端断片をコードするＤＮＡは、ＴＥＤ６またはＴＥＤ７タンパク質をコードするＤＮＡを鋳型にし、Ｃ末端ドメイン（場合により、膜貫通領域のＣ末端側１〜３アミノ酸残基を含んでもよい）をコードする塩基配列のうち増幅しようとする配列に基づいて作製された５’プライマーおよび３’プラーマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うことによって得ることができる。その後、作製されたＤＮＡは、適するベクターに組み込まれる。
【００３３】
ＰＣＲ法および条件については、ＰＣＲバッファー中、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（例えばＴａｑポリメラーゼ）、センスプライマー、アンチセンスプラーマーおよびｄＮＴＰｓ（Ｎ＝Ａ，Ｔ，Ｇ，Ｃ）、ならびに鋳型ＤＮＡ、の存在下、変性（例えば９４℃２０秒〜５分）、アニーリング（例えば５５℃３０秒〜１分）および伸長（例えば７２℃３０秒〜１０分）を１サイクルとして約２０〜約４０サイクルを含む増殖サイクルからなる通常の手法が使用される。具体的な手法は、例えばＡｕｓｕｂｅｌら， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， １９９４， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓなどに記載されている。増幅産物は、アガロースゲルまたはポリアクリルアミドゲル電気泳動によって単離精製することができる。
【００３４】
ちなみに、後述の実施例で使用したヒャクニチソウのＴＥＤ６およびＴＥＤ７−１のＣ末端断片のアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号１の２７Ｌｅｕから９５Ａｌａまでの配列、配列番号２の２０９Ｔｒｐから３００Ｇｌｙまでの配列である。
【００３５】
さらに、「ＴＥＤ６のＣ末端断片とＴＥＤ７のＣ末端断片の組み合わせ」は、「ＴＥＤ６とＴＥＤ７の組み合わせ」の場合と同様に、植物または植物細胞内で、ＴＥＤ６タンパク質のＣ末端断片をコードするＤＮＡおよびＴＥＤ７タンパク質のＣ末端断片をコードするＤＮＡが実質的に同時に発現し、これらのタンパク質に翻訳されることによって実現可能である。この場合、これらＤＮＡの発現は、該２つのＤＮＡが別々のベクターに発現可能に組み込まれていてもよいし、あるいは該２つのＤＮＡが同一のベクターに互いに発現可能にタンデムに組み込まれていてもよい。
【００３６】
上記ＤＮＡおよびそれを含むベクターは、例えば遺伝子組換え技術によって製造することができる。遺伝子組換え技術は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， １９８９， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ａｕｓｕｂｅｌら， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， １９９４， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓなどに記載される手法を利用することができる。
【００３７】
簡単に説明すると、例えば、植物組織由来のｃＤＮＡライブラリーから、公知の配列を基にして作製したプライマーを使用するＰＣＲによってＴＥＤ６またはＴＥＤ７をコードするＤＮＡを増幅することができる。該ＤＮＡを、例えばアガロースゲルまたはポリアクリルアミドゲル電気泳動で精製したのち、適当な発現ベクターに発現可能な状態で挿入する。
【００３８】
ベクターの例は、バイナリーベクターまたはその他のベクターである。バイナリーベクターは、アグロバクテリウムＴ−ＤＮＡのライトボーダー（ＲＢ）とレフトボーダー（ＬＢ）の２つの約２５ｂｐボーダー配列を含み、両ボーダー配列の間に、外来ＤＮＡが挿入される。バイナリーベクターは、例えばｐＢＩ系（例えば、ｐＢＩ１０１， ｐＢＩ１０１．２， ｐＢＩ１０１．３， ｐＢＩ１２１， ｐＢＩ２２１ （以上Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社））、ｐＧＡ４８２、ｐＧＡＨ、ｐＢＩＧなどである。その他のベクターには、例えば中間系プラスミドｐＬＧＶ２３Ｎｅｏ、ｐＮＣＡＴ、ｐＭＯＮ２００など、またはＧＡＴＥＷＡＹカセットを含むｐＨ３５ＧＳ（Ｋｕｂｏら， ２００５， Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖ． １９： １８５５-１８６０）などが含まれる。外来ＤＮＡの５’末端には、プロモーターが連結される。プロモーターの例は、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーター、ノパリン合成酵素遺伝子プロモーター、トウモロコシユビキチンプロモーター、オクトピン合成酵素遺伝子プロモーター、イネアクチンプロモーターなどである。また、外来ＤＮＡの３’末端にはターミネーター（例えばノパリン合成酵素遺伝子ターミネーターなど）が挿入される。ベクターにはさらに、形質転換細胞を選抜するために必要な選択マーカーが挿入される。選択マーカーの例は、薬剤耐性遺伝子であるカナマイシン耐性遺伝子（ＮＰＴＩＩ）、ハイグロマイシン耐性遺伝子（ｈｔｐ）、ビアラホス耐性遺伝子（ｂａｒ）などである。
【００３９】
（トランスジェニック植物の作出）
上記のようにして構築したベクターを植物に導入する形質転換法としては、アグロバクテリウムを用いた方法を例示することができるが、それ以外にも、遺伝子銃、エレクトロポレーション、ウイルスベクター、フローラルディップ法、リーフディスク法などによっても、導入することができる。植物の形質転換技術や組織培養技術に関しては、例えば島本功、岡田清孝監修、植物細胞工学シリーズ15、モデル植物の実験プロトコール、遺伝学的手法からゲノム解析まで、秀潤社（2001年）に記載されている。
【００４０】
バイナリーベクター−アグロバクテリウム系を利用する方法では、植物細胞、カルスまたは植物組織片を準備し、これにアグロバクテリウムを感染させて、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを植物細胞内に導入する。形質転換においては、培地にフェノール化合物（アセトシリンゴン）を添加してもよく、特に単子葉植物においては、該細胞は効率よく形質転換されうる。また、アグロバクテリウムとしては、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ菌株（Ｃ５８， ＬＢＡ４４０４， ＥＨＡ１０１， ＥＨＡ１０５， Ｃ５８Ｃ１ＲｉｆＲなど）が使用されうる。
【００４１】
形質転換用培地は、固体培地であり、例えばＭＳ培地、Ｂ５培地、ＤＫＮ培地、Ｌｉｎｓｍａｉｅｒ ＆ Ｓｋｏｏｇ培地などの植物培養用培地を基本培地として、これに１〜５％のマルトース、蔗糖、グルコース、ソルビトールなどの糖類、及び０．２〜１％の寒天、アガロース、ゲルライト、ゲランガムなどの多糖類固化剤を添加することができる。培地には、カザミノ酸、アブシジン酸、カイネチン、２，４−Ｄ、インドール酢酸、インドール酪酸などのオーキシン類やサイトカイニン類、カナマイシン、ハイグロマイシン、カルベニシリンなどの抗生物質、アセトシリンゴンなどを添加することができる。培地の好適ｐＨは、５〜６、例えばｐＨ５．５〜５．８である。また、形質転換後に、例えば転写活性化を誘導する物質、例えば、グルココルチコイド、デキサメタゾン、エストロゲン、それらの誘導体などのステロイドホルモンを培地に添加することもできる。
【００４２】
具体的には、アグロバクテリウムの菌液を暗所、約２５℃、約４日間での培養により調製し、この菌液に植物カルス又は組織（例えば葉片、根、茎片、成長点など）を数分間浸漬し、水分を除いたのち、固体培地に置床して共存培養する。カルスは、植物細胞塊であり、植物組織片又は完熟種子などからカルス誘導培地を用いて誘導することができる。形質転換されたカルス又は組織片を選択マーカーに基づいて選択し、その後、カルスについては、再分化培地にて幼植物体に再分化させることができる。一方、植物片については、植物片からカルスを誘導して幼植物体に再分化させるか、或いは植物片からプロトプラストを調製し、カルス培養を経て幼植物体に再分化させることができる。このようにして得られた幼植物体を発根後に土壌に移し植物体に再生する。
【００４３】
また、フローラルディップ法を使用する場合には、例えばＣｌｏｕｇｈとＢｅｎｔ（Ｐｌａｎｔ Ｊ．１６， ７３５−７４３（１９９８））らによって記載されるように、例えばアグロバクテリウムの菌液を暗所、約２５℃、約４日間での培養により調製し、この菌液に未熟な花芽が発達するまで生育させた形質転換対象の植物宿主の花芽を１０秒間浸漬し、覆いをして一晩湿度を保つ；翌日覆いを取り、植物をそのまま生育させて種子を収穫する；形質転換された個体は、適切な選択マーカー例えば抗生物質を加えた固体培地上に収穫した種子を播種することで選択することができる；このようにして選択した個体を土壌に移し生育させることにより、トランスジェニック植物の次世代の種子を得ることができる。
トランスジェニック植物を野生型と交配させることによって、トランスジェニック植物と同様の新規形質をもつ後代を作出することができる。
【００４４】
上記の方法で作出されたトランスジェニック植物またはその後代は、ＴＥＤ６とＴＥＤ７の組み合わせ、ＴＥＤ６のＣ末端断片、ＴＥＤ７のＣ末端断片、およびＴＥＤ６のＣ末端断片とＴＥＤ７のＣ末端断片の組み合わせからなる群から選択されるタンパク質をコードするＤＮＡを発現可能に含み、かつ、野生型植物と比べて二次細胞壁の厚さが増大していることを特徴とする。
したがって、本発明はさらに、そのようなトランスジェニック植物またはその後代だけでなく、それらの細胞または組織あるいは種子をも提供する。
【００４５】
本発明の対象植物は、双子葉植物、単子葉植物、裸子植物、樹木などの植物を非限定的に含む。特に有用性の高い植物には、バイオマス資源として重要な木本植物および草本植物、例えばユーカリ、ポプラ、サトウキビ、イネ、ムギ類などが含まれる。
【００４６】
（ＴＥＤ６およびＴＥＤ７の二次細胞壁形成促進機能）
ＴＥＤ６およびＴＥＤ７がいずれも導管の二次細胞壁の合成に関与するであろうということが、シロイヌナズナを用いた研究の過程で本発明者によって推定された（Ｔ． Ｄｅｍｕｒａ， “Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ Ｕｎｄｅｒｌｙｉｎｇ Ｘｙｌｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ， ａｓ ａ Ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ Ｗｏｏｄ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ”， Ａｂｓｔｒａｃｔｓ ｉｎ ＦＵＮＣＦＩＢＥＲ ２００８ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ ｔｈｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｗｏｏｄ， ｐａｇｅ １２ （２００８））。しかしながら、実際、ＴＥＤ６またはＴＥＤ７単独では、二次細胞壁の形成を促進する機能を有していないことが判明した。
【００４７】
今回はじめて本発明者らによって、ＲＮＡ干渉法（ＲＮＡi）を利用して、本発明に示されるように、ＴＥＤ６とＴＥＤ７の組み合わせ、ＴＥＤ６のＣ末端断片、ＴＥＤ７のＣ末端断片、およびＴＥＤ６のＣ末端断片とＴＥＤ７のＣ末端断片の組み合わせからなる群から選択されるタンパク質が、導管細胞及び木繊維細胞の二次細胞壁形成を促進する機能をもつことが見出された。本発明に関わるこれらのタンパク質およびそれらのＣ末端断片ならびにそれらの例示は、上で記載したとおりである。
【００４８】
ＴＥＤ６およびＴＥＤ７タンパク質は、細胞内局在の解析の結果、主に植物細胞の形質膜に存在し、細胞壁にも幾分か存在していることがわかった。このうち、ＴＥＤ７は、ＴＥＤ６と比べて細胞壁により多く保持されやすく、これはおそらくＴＥＤ７のプロリンに富むＮ末端ドメインの相互作用によるものであろうと考えられる。構造的に、ＴＥＤ７に比べて、ＴＥＤ６は、プロリンに富むＮ末端ドメインが非常に短いために、ＴＥＤ６は細胞壁に保持されにくいと推定されるが、ＴＥＤ６については、シロイヌナズナでの実験の結果、ＴＥＤ６はセルロース合成酵素ＣｅｓＡのＩＲＸ３サブユニットに結合することが判明し、これは、ＴＥＤ６と二次細胞壁−ＣｅｓＡ複合体とが相互作用していることを示す証拠である。
【００４９】
（実施例）
本発明を以下の実施例によってさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は、これらの実施例によって限定されないものとする。
【実施例１】
【００５０】
ヒャクニチソウ属（Ｚｉｎｎｉａ）植物の管状要素におけるＺｅ ＴＥＤ６およびＺｅ ＴＥＤ７遺伝子の機能解析
Ｚｅ ＴＥＤ６およびＺｅ ＴＥＤ７タンパク質のバイオインフォマチクス分析（ＳＯＳＵＩ、ＴＭＨＭＭおよびＳｉｇｎａｌＰを含む）により、それらのタンパク質はともに「Ｉ型膜タンパク質」（細胞外または内腔のＮ末端と細胞質Ｃ末端を有する１回膜貫通タンパク質）であることが予測された。上記タンパク質はいずれも、一般的な１回膜貫通ドメイン様疎水性領域（それぞれＺｅ ＴＥＤ６およびＺｅ ＴＥＤ７タンパク質の９５アミノ酸のうち２３アミノ酸および３００アミノ酸のうちの２３アミノ酸を表す）を含み、それらのＣ末端は細胞質側であると予測された。しかしながら、これらタンパク質の潜在的な活性に関しては、これまでＰｒｏＤｏｍ、ＰＲＯＳＩＴＥまたはＰｆａｍによって機能的ドメインがまったく予測されていなかった。Ｐｒｏに富む領域のみが、Ｚｅ ＴＥＤ７タンパク質のＮ末端領域で同定されていた。植物の細胞外タンパク質のなかで、Ｐｒｏに富む配列は、ヒドロキシプロリンに富む糖タンパク質（ＨＲＧＰ）であることはよく知られている。Ｚｅ ＴＥＤ７はＨＲＧＰであろうけれども、それはＨＲＧＰファミリーで一般に認められる何らの反復モチーフを有していない。
【００５１】
ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター駆動の、Ｃ末端にＹＦＰ（黄色蛍光タンパク質）を融合したタンパク質をコードするプラスミドを、エレクトロポレーションによってヒャクニチソウの葉肉に導入することによって、Ｚｅ ＴＥＤ６およびＺｅ ＴＥＤ７の細胞内局在を実験的に調べた（Ｅｎｄｏら（２００８） Ｐｌａｎｔ Ｊ． ５３：８６４−８７５）。各融合タンパク質の蛍光シグナルは、細胞の末梢領域でのみ検出されたが、このことは、形質膜および／または細胞壁での局在を示している。原形質分離している細胞により、それらが主に形質膜に局在し、細胞壁にもある程度局在していることが明示された。Ｚｅ ＴＥＤ７−ＹＦＰ融合タンパク質の方が、Ｚｅ ＴＥＤ６−ＹＦＰ融合タンパク質と比べて、より多く細胞壁に保持されていた。このことは、Ｚｅ ＴＥＤ７タンパク質のＰｒｏに富むＮ末端ドメインと細胞壁との可能な相互作用によって説明することができる。
【００５２】
全長のＺｅ ＴＥＤ６またはＺｅ ＴＥＤ７タンパク質の過剰発現がＴＥ ＳＣＷ（二次細胞壁（ｓｅｃｏｄａｒｙ ｃｅｌｌ ｗａｌｌ））形成に及ぼす作用を、ｄｓＲＮＡ仲介ＲＮＡｉ法によって、視覚化可能なＴＥ ＳＣＷを示す細胞数に対して調べた。さらに、これらのタンパク質のＣ末端ドメインについても同様に調べ、ＳＣＷ形成における上記細胞質ドメインの機能を評価した。その結果、全長タンパク質ではなくＣ末端ドメインのみを用いて、僅かではあるが有意な増加（過剰発現するＧＵＳコントロールの数％増加）を見出した。したがって、ＳＣＷ形成に対するこの正の効果を観察するために、低密度細胞培養（０．５×１０５細胞ｍＬ−１）を使用した。このような培養は、通常、コントロールにおける低率のＳＣＷ形成（３０％未満）を示す。これによって、Ｃ末端ドメインを用いてＳＣＷ形成の割合が統計的に有意に増加することが確認された（図１Ａおよび１Ｂ）。同様に、Ｚｅ ＴＥＤ６および Ｚｅ ＴＥＤ７両方の全長タンパク質の同時過剰発現により、ＳＣＷ形成割合が増加した（図１Ｃ）が、このことは、ＴＥのＳＣＷ形成中でのＺｅ ＴＥＤ６およびＺｅ ＴＥＤ７タンパク質の機能的相互作用を示している。
【実施例２】
【００５３】
アブラナ科植物（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）でのＡｔ ＴＥＤ６およびＡｔ ＴＥＤ７の機能解析
ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓにおけるＺｅ ＴＥＤ６およびＺｅ ＴＥＤ７遺伝子のホモログがそれぞれ、Ａｔ１ｇ４３７９０ （Ａｔ ＴＥＤ６）およびＡｔ５ｇ４８９２０ （Ａｔ ＴＥＤ７）であることを見出した。Ａｔ ＴＥＤ６およびＡｔ ＴＥＤ７のプロモーター活性を、Ａｔ ＴＥＤ６およびＡｔ ＴＥＤ７の１ｋｂ−および０．５ｋｂ−上流配列を用いて調べた。これらの上流配列には、ＧＵＳレポーター遺伝子を連結した。幼植物でのレポータートランスジーン発現は、両遺伝子内の分化する導管要素に制限されたが、このことによりさらに、Ｚｅ ＴＥＤ６およびＺｅ ＴＥＤ７との機能的相同性が確認された。Ａｔ ＴＥＤ６およびＡｔ ＴＥＤ７のコード配列のＮ末端にそれぞれ、ＹＦＰレポーター遺伝子を連結し、それら自身のプロモーターの制御下で発現した。Ａｔ ＴＥＤ６シグナルおよびＴＥＤ７−ＹＦＰシグナルは、原生木部と後生木部の分化する導管要素中の発生するＳＣＷの下側でのみ特異的に観察された。幾つかの場合、これらのシグナルの不統一な局在が、後生木部の導管要素で認められたが、その生物学的意義については依然として不明である。
【００５４】
Ａｔ ＴＥＤ６およびＡｔ ＴＥＤ７の機能を調べるために、ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターを連結したＡｔ ＴＥＤ６およびＡｔ ＴＥＤ７の全長、Ｃ末端または逆反復（ＲＮＡｉ）を有するトランスジェニックＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓを作製したが、Ａｔ ＴＥＤ７の逆反復をもつものを除いて劇的な形態学的な変化は観察されなかった。
【００５５】
トランスジェニック植物は、発芽培地で増殖できなかったが、カルス誘導培養上で生き続けた。このことは、Ａｔ ＴＥＤ７遺伝子の機能の構成的喪失の結果、ＲＮＡｉ分析において幼植物の致死が生じることを示している。
【００５６】
Ａｔ ＴＥＤ６およびＡｔ ＴＥＤ７の機能喪失をさらに調べるために、挿入変異体に関するＳＡＬＫ Ｔ−ＤＮＡデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｓｉｇｎａｌ．ｓａｌｋ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｔｄｎａｅｘｐｒｅｓｓ）を検索した。Ａｔ ＴＥＤ６についていかなる系統の入手もできなかったが、Ａｔ ＴＥＤ７について、Ｔ−ＤＮＡ／トランスポゾン挿入系統（ＳＡＬＫ＿０８４１１５、ＳＡＬＫ＿０８９５４９およびＳＭ＿２＿３０４４４）を入手することができた。しかしながら、Ａｔ ＴＥＤ７のコード領域には挿入はなかったがＡｔ ＴＥＤ７の５’または３’フランキング領域に挿入が認められた。このことから、挿入がＡｔ ＴＥＤ７のノックアウト変異体でないことが示された。
【００５７】
Ａｔ ＴＥＤ７の構成的ＲＮＡｉの代わりに、デキサメタゾン（ＤＥＸ）誘導プロモーター（ＡｏｙａｍａとＣｈｕａ （１９９７）Ｐｌａｎｔ Ｊ． １１：６０５−６１２）を使用した。誘導性プロモーターと連結した、Ａｔ ＴＥＤ６、Ａｔ ＴＥＤ７、Ａｔ ＴＥＤ６とＡｔ ＴＥＤ７のキメラ、ならびにＹＦＰ（コントロール）、の各逆反復配列を、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物に導入した。形質転換体の選択を、非誘導条件下で、誘導性ＲＮＡｉ構築物を保有する十分に成長した植物を選択することによって行った。Ａｔ ＴＥＤ７ ＲＮＡｉおよびＡｔ ＴＥＤ６-ＴＥＤ７キメラＲＮＡｉの両方の形質転換体を少数得ることができたが、これはおそらく、幼植物の致死性を生じさせるＡｔ ＴＥＤ７逆反復の残存「漏出」発現によるためであると考えられる。誘導性ＲＮＡｉの効率を、１０μＭデキサメタゾンに５時間晒したあとに選択された幼若植物系統において、標的転写体の各々についてＲＴ−ＰＣＲで調べた（図３Ａ）。誘導性ＲＮＡｉを、１０μＭデキサメタゾン補充増殖培地上で植物を５日間インキュベートすることによって３週令のＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物に対して行った（図３Ｂ〜３Ｅ）。予期しないことであったが、ＤＥＸ誘導性ＲＮＡｉ自身が、ＳＣＷ上に異常に大きな壁孔をもつ根の後生木部導管の形成、および場合により根の原生木部導管形成の阻害、を含む固有の作用を有することが判明した（図３Ｅ）。しかしながら、その固有の作用の他に、根の導管要素のＳＣＷ形成の明らかな欠陥が、Ａｔ ＴＥＤ７およびＡｔ ＴＥＤ６-ＴＥＤ７キメラの誘導性ＲＮＡｉ系統で起こった（図３Ｂおよび３Ｃ）。これらの両方の系統では、一般的でない階紋状ＳＣＷを持つ異常な導管要素（図３Ｃ）が、通常、網状化または壁孔化したＳＣＷを示す後生木部導管の代わりに形成された（図３Ｂ）。さらに、Ａｔ ＴＥＤ６-ＴＥＤ７キメラＲＮＡｉ系統は、後生木部の不連続なまたは欠落した導管を示した（図３Ｄ）。Ａｔ ＴＥＤ６-ＴＥＤ７キメラＲＮＡｉ系統の根に対し実施した透過型電子顕微鏡により、ＹＦＰ ＲＮＡｉコントロールに反して、薄く不完全なＳＣＷ（これは階紋状ＳＣＷを表すと推定される。）をもつ導管が、後生木部の位置に存在した。これらの結果は、導管要素のＳＣＷ形成におけるＡｔ ＴＥＤ６およびＡｔ ＴＥＤ７の関与を強く示している。
【実施例３】
【００５８】
（ｄｓＲＮＡおよびプラスミドＤＮＡ）
Ｚｉｎｎｉａ ＥＳＴクローン（Ｄｅｍｕｒａら２００２， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９９：１５７９４−１５７９９）をＰＣＲに掛けて、両末端にＴ７およびＳＰ６プロモーターを含む断片を作製した。ＰＣＲ産物を精製し、Ｅｎｄｏら（Ｐｌａｎｔ Ｊ． ５３：８６４−８７５， ２００８）によって記載されるように、ｄｓＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ合成のための鋳型として直接使用した。Ｚｅ ＴＥＤ６およびＺｅ ＴＥＤ７遺伝子の完全長ｃＤＮＡ（それぞれ、Ｚ１９４３、Ｚ１６６５３クローン）を、 ＳＭＡＲＴ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ （Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｌｏｎｔｅｃｈ．ｃｏｍ／）を用いて得た。そのコード配列をｐＨ３５ＧＹ （Ｋｕｂｏら２００５， Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． １９：１８５５−１８６０）およびｐＹ３５ＧＳ（Ｅｎｄｏら ２００８, Ｐｌａｎｔ Ｊ． ５３：８６４−８７５）に挿入し、それぞれ、タンパク質の局在とＺｉｎｎｉａ細胞内での過剰発現を調べた。ｐＹ３５ＧＳにＧＵＳを挿入することによって構築されたｐＹ３５ＧＵＳを、コントロールとして使用した。Ｚｅ ＴＥＤ６（配列番号１）の２７Ｌｅｕから９５Ａｌａまでをコードする配列およびＺｅ ＴＥＤ７（配列番号２）の２０９Ｔｒｐから３００Ｇｌｙまでをコードする配列を、ｐＹ３５ＧＳに挿入した。Ａｔ ＴＥＤ６およびＡｔ ＴＥＤ７遺伝子の開始コドンの５’上流（それぞれ、１ｋｂおよび０．５ｋｂ）を、プロモーター領域として使用した。断片を、ｐＢＧＧＵＳ （Ｋｕｂｏら，２００５（上記））に挿入し、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物でのそれらのプロモーター活性を調べた。 プロモーター領域およびＯＲＦを含むゲノム断片を、ｐＨＧＹ（これは、そのＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター配列を欠失することによってｐＨ３５ＧＹから誘導された。）に挿入した。ＦＡＤ２ （Ａｔ３ｇ１２１２０）遺伝子の第１イントロンを、完全長Ａｔ ＴＥＤ６ ＯＲＦ、Ａｔ ＴＥＤ７ ＯＲＦ、およびＡｔ ＴＥＤ６-ＴＥＤ７キメラ配列の逆反復配列のリンカーとして使用した。Ａｔ ＴＥＤ７ ＯＲＦをＡｔ ＴＥＤ６ ＯＲＦのＰｓｈＡＩ部位に挿入することによって、キメラを構築した。逆反復をｐＨ３５ＧＳ （Ｋｕｂｏら， ２００５（上記））および／またはｐＴＡ７００２（ＡｏｙａｍａとＣｈｕａ １９９７ Ｐｌａｎｔ Ｊ． １１：６０５−６１２）の中に入れて、構成的で一過性のＲＮＡｉ系統をそれぞれ作製するためのベクターとした。ＶＮＤ７ ｃＤＮＡ （Ｙａｍａｇｕｃｈｉら２００８， Ｐｌａｎｔ Ｊ． ５５：６５２−６６４）をｐＥＲ８ （Ｚｕｏら２０００， Ｐｌａｎｔ Ｊ． ２４：２６５−２７３）に挿入して異所性ＴＥ誘導性系統を作製するためのベクターとした。
【００５９】
（ＲＴ−ＰＣＲ）
ＲＮＡを、Ｅｎｄｏら（２００８（上記））によって記載されたように、２つの独立の系統から調製し、ｃＤＮＡ合成のために使用した。ＰＣＲは、Ａｔ ＴＥＤ６およびＡｔ ＴＥＤ７の５’−および３’−ＵＴＲ にそれぞれ位置するプライマーを用いて実施された。使用したプライマーは、Ａｔ ＴＥＤ６について、５’−ＡＧＡ ＧＣＣ ＴＣＡ ＣＡＣ ＡＴＣ ＡＡＡ ＣＡＣ ＡＡＧ−３’（配列番号１２）および５’−ＧＧＴ ＡＡＣ ＡＴＴ ＡＴＧ ＡＡＴ ＧＡＡ ＧＡＡ ＡＧＣ ＴＣ−３’（配列番号１３）； Ａｔ ＴＥＤ７について、５’−ＡＡＣ ＣＡＴ ＴＴＡ ＡＧＴ ＡＣＡ ＴＡＣ ＡＴＡ ＣＴＣ ＣＣ−３’（配列番号１４）および５’−ＡＴＧ ＡＴＴ ＧＴＴ ＴＡＣ ＡＴＴ ＴＴＧ ＡＧＣ ＣＴＴ ＴＴＧ−３’（配列番号１５）；アクチン２ （Ａｔ３ｇ１８７８０）について、５’−ＣＣＧ ＴＴＴ ＴＧＡ ＡＴＣ ＴＴＣ ＣＴＣ ＡＡＴ Ｃ−３’（配列番号１６）および５’−ＡＴＡ ＣＣＧ ＧＴＡ ＣＣＡ ＴＴＧ ＴＣＡ ＣＡＣ Ａ−３’（配列番号１７）；ならびに、ユビキチン（Ａｔ５ｇ５７８６０）について、５’−ＴＣＣ ＡＡＴ ＧＴＧ ＡＴＣ ＣＡＡ ＣＡＧ ＡＧＡ Ｃ−３’（配列番号１８）および５’−ＴＴＣ ＡＡＡ ＧＴＣ ＡＡＡ ＧＣＣ ＡＣＡ ＡＣＴ Ｇ−３’（配列番号１９）である。
【００６０】
さらにまた、Ｚｅ ＴＥＤ７−１およびＺｅ ＴＥＤ７−２のＰＣＲ増幅用プライマーはともに下記のものが使用された。
５’−ＴＴＣ ＣＣＴ ＣＡＴ ＴＴＴ ＣＣＡ ＣＣＧ ＣＣＡ ＴＣ−３’（配列番号２０）、および５’−ＴＧＴ ＴＧＴ ＧＧＡ ＡＴＧ ＧＴＴ ＧＣＴ ＴＧＧ ＡＧＡ−３’（配列番号２１）
【産業上の利用可能性】
【００６１】
本発明は、植物において導管細胞および木繊維細胞の二次細胞壁形成を促進し、したがって二次細胞壁の厚さを増大するため、バイオマス資源である木本植物や草本植物のセルロース含量を増大させることを可能にするため、産業上有用性が高い。
【配列表フリーテキスト】
【００６２】
配列番号１２〜２１：プライマー
【特許請求の範囲】
【請求項１】
管状要素分化（ＴＥＤ）関連タンパク質またはそのＣ末端断片を用いて植物の二次細胞壁の厚さを増大させるための方法であって、ＴＥＤ６とＴＥＤ７の組み合わせ、ＴＥＤ６のＣ末端断片、ＴＥＤ７のＣ末端断片、およびＴＥＤ６のＣ末端断片とＴＥＤ７のＣ末端断片の組み合わせからなる群から選択されるタンパク質をコードするＤＮＡを発現可能に含むトランスジェニック植物を作出し、該ＤＮＡを該植物内で発現させることを含む、前記方法。
【請求項２】
前記ＴＥＤ６またはＴＥＤ７のＣ末端断片が、ＴＥＤ６またはＴＥＤ７の成熟アミノ酸配列のうちＮ末端から膜貫通ドメインまでの配列を含まないアミノ酸配列、あるいはそのアミノ酸配列においてＮ末端側および/またはＣ末端側に１もしくは数個のアミノ酸の欠失、置換または付加を含むアミノ酸配列、からなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＴＥＤ６とＴＥＤ７の組み合わせ、ＴＥＤ６のＣ末端断片、ＴＥＤ７のＣ末端断片、およびＴＥＤ６のＣ末端断片とＴＥＤ７のＣ末端断片の組み合わせからなる群から選択されるタンパク質をコードするＤＮＡを発現可能に含む、かつ、野生型植物と比べて二次細胞壁の厚さが増大していることを特徴とするトランスジェニック植物またはその後代。
【請求項４】
請求項３記載のトランスジェニック植物またはその後代由来の細胞または組織。
【請求項５】
請求項３記載のトランスジェニック植物またはその後代由来の種子。
【請求項１】
管状要素分化（ＴＥＤ）関連タンパク質またはそのＣ末端断片を用いて植物の二次細胞壁の厚さを増大させるための方法であって、ＴＥＤ６とＴＥＤ７の組み合わせ、ＴＥＤ６のＣ末端断片、ＴＥＤ７のＣ末端断片、およびＴＥＤ６のＣ末端断片とＴＥＤ７のＣ末端断片の組み合わせからなる群から選択されるタンパク質をコードするＤＮＡを発現可能に含むトランスジェニック植物を作出し、該ＤＮＡを該植物内で発現させることを含む、前記方法。
【請求項２】
前記ＴＥＤ６またはＴＥＤ７のＣ末端断片が、ＴＥＤ６またはＴＥＤ７の成熟アミノ酸配列のうちＮ末端から膜貫通ドメインまでの配列を含まないアミノ酸配列、あるいはそのアミノ酸配列においてＮ末端側および/またはＣ末端側に１もしくは数個のアミノ酸の欠失、置換または付加を含むアミノ酸配列、からなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＴＥＤ６とＴＥＤ７の組み合わせ、ＴＥＤ６のＣ末端断片、ＴＥＤ７のＣ末端断片、およびＴＥＤ６のＣ末端断片とＴＥＤ７のＣ末端断片の組み合わせからなる群から選択されるタンパク質をコードするＤＮＡを発現可能に含む、かつ、野生型植物と比べて二次細胞壁の厚さが増大していることを特徴とするトランスジェニック植物またはその後代。
【請求項４】
請求項３記載のトランスジェニック植物またはその後代由来の細胞または組織。
【請求項５】
請求項３記載のトランスジェニック植物またはその後代由来の種子。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２０１０−２３３５３６（Ｐ２０１０−２３３５３６Ａ）
【公開日】平成２２年１０月２１日（２０１０．１０．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−８６９２２（Ｐ２００９−８６９２２）
【出願日】平成２１年３月３１日（２００９．３．３１）
【出願人】（５０３３５９８２１）独立行政法人理化学研究所 (1,056)
【出願人】（０００１２２２９８）王子製紙株式会社 (2,055)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１０月２１日（２０１０．１０．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年３月３１日（２００９．３．３１）
【出願人】（５０３３５９８２１）独立行政法人理化学研究所 (1,056)
【出願人】（０００１２２２９８）王子製紙株式会社 (2,055)
【Ｆターム（参考）】
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