植物の品種改良の時間を短縮するための方法及びキット
【課題】植物の品種改良に必要な時間を短縮して品種改良の効率を向上させること。
【解決手段】ＦＴ遺伝子が導入されている形質転換体植物である台木に非形質転換体植物を穂木として接ぎ木する工程および穂木にて交配する工程を包含する、植物の品種改良の時間を短縮するための方法を提供する。さらに、ＦＴ遺伝子が導入されている形質転換体植物を備えている、植物の品種改良の時間を短縮するためのキットもまた提供する。
【解決手段】ＦＴ遺伝子が導入されている形質転換体植物である台木に非形質転換体植物を穂木として接ぎ木する工程および穂木にて交配する工程を包含する、植物の品種改良の時間を短縮するための方法を提供する。さらに、ＦＴ遺伝子が導入されている形質転換体植物を備えている、植物の品種改良の時間を短縮するためのキットもまた提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物の品種改良を効率よく行うための方法及びキットに関するものであり、より詳細には、ＦＴ遺伝子が導入された形質転換体植物を用いる植物の品種改良の時間を短縮するための方法及びキットに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従前より、植物の品種改良の代表的な方法として、交配技術が用いられている。この交配技術は、選択した植物の品種間で交配させ、雑種第一代またはその後の世代に生じた個体の中から、目的の形質を備えたものを選抜し、新品種に育種する技術である。この交配に用いられる植物は、生殖活動（すなわち、受粉、接合、受精など）が可能になるまで栽培されていることが必要であり、育種に長期間を費やす品種も存在する。
【０００３】
一般に、植物には栄養生長期と生殖生長期とがあり、特に種子植物においては、生長相が栄養生長期から生殖生長期へ転換して花芽が形成される時期がある。この花芽が形成されることにより、植物は生殖活動が可能になる。この栄養生長期から生殖生長期への転換、すなわち、花成は、植物の繁殖に直結する現象であるため、植物の生活環における重要な現象である。花成を人為的に制御することができれば、育種の効率化が可能となり、その結果、上記交配技術による品種改良に費やす時間を短縮することができる。よって、植物における花成の制御機構の解明は、学術的に重要なテーマの一つであるだけでなく、産業的にも重要なテーマの一つである。
【０００４】
このような花成の制御機構に関する研究は、アブラナ科の野草であるシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）を用いて行われている。特に、シロイヌナズナから見出されたＦＬＯＷＥＲＩＮＧ ＬＯＣＵＳ Ｔ遺伝子（ＦＴ遺伝子）が導入された形質転換体植物においては、ＦＴ遺伝子の働きにより花成が促進される。このことより、ＦＴ遺伝子は花成のスイッチ遺伝子（すなわち、花成制御遺伝子）として知られている（特許文献１を参照のこと）。また、本発明者らは、ＦＴ遺伝子およびそのファミリーが細胞間でのタンパク質の移動を司るとともに自らも細胞間を移動することを見出している（特許文献２を参照のこと）。
【０００５】
日長中立性植物である野生型タバコ（ＳＲ１）では、長日条件下または短日条件下のいずれにおいても本葉の枚数が２０枚程度に達することが開花に必要である。このような野生型タバコ（ＳＲ１）にアラビドプシス（シロイヌナズナ）由来のＦＴ遺伝子を導入した場合、ＦＴ遺伝子を導入したＦＴ形質転換体（３５Ｓ：：ＦＴ／ＳＲ１）では、長日条件下において本葉の枚数が５枚程度に達した段階で開花する。
【０００６】
上述したように、ＦＴ形質転換体（３５Ｓ：：ＦＴ／ＳＲ１）では、開花に必要な葉数が減少しているので、開花促進効果を有しているといえる。このように、人為的に花成の制御が可能な形質転換体植物が、様々な種において容易に作製され、しかも繁殖が可能となれば、品種改良技術の発達に大きく寄与するといえる。
【特許文献１】特開２００３−０９８７２公報（平成１５年１月１４日公開）
【特許文献２】特開２００４−２６１１２２公報（平成１６年９月２４日公開）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、上記形質転換体タバコ（３５Ｓ：：ＦＴ／ＳＲ１）は、開花が早いために、開花時期には植物体自体が十分に生育しない。よって、ＦＴ形質転換体自体は、農業上要求される形質（例えば、収量の増加、および／または花、果実などの大型化）に直接結びつく場合はむしろ少なく、実用的ではない。
【０００８】
また、形質転換体植物を繁殖させるための手段として母株からの種子の採取を採用する場合は、その母株が遺伝的に安定している必要がある。しかし、その母株を育種するためには長い年月および労力を必要とするので、母株からの種子の採取によって形質転換体を繁殖させることは実用的ではない。また、遺伝子導入が困難な品種も存在するので、このような品種においては、新たな形質転換体を作製することは容易ではない。
【０００９】
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、植物の品種改良に必要な時間を短縮して品種改良の効率を向上させる技術を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明に係る植物の品種改良の時間を短縮する方法は、上記課題を解決するために、ＦＴ遺伝子が導入されている形質転換体植物である台木に非形質転換体植物を穂木として接ぎ木する工程および穂木にて交配する工程を包含することを特徴としている。
【００１１】
本発明に係る植物の品種改良の時間を短縮する方法は、ＦＴ遺伝子を導入して形質転換体植物を作製する工程をさらに包含してもよい。
【００１２】
本発明に係る植物の品種改良の時間を短縮する方法において、上記形質転換体植物および上記非形質転換体植物は接ぎ木親和性を有していることが必要である。
【００１３】
本発明に係る植物の品種改良の時間を短縮する方法において、上記非形質転換体植物は野生型であってもよい。
【００１４】
本発明に係る植物の品種改良の時間を短縮するためのキットは、上記課題を解決するために、ＦＴ遺伝子が導入された形質転換体植物を備えていることを特徴としている。
【００１５】
本発明に係る植物の品種改良の時間を短縮するためのキットは、上記課題を解決するために、植物に導入可能な形態であるＦＴ遺伝子構築物および該ＦＴ遺伝子構築物を導入するための植物を備えていることを特徴としている。
【発明の効果】
【００１６】
本発明に従って、開花促進効果を有しているＦＴ形質転換体を台木として接ぎ木栽培した穂木にて交配させることにより、品種改良の時間を短縮することができ、農作物の生産に大いに貢献することができる。また、本発明に従えば、ＦＴ形質転換体の開花促進効果を穂木に首尾よく伝播させることができ、種子を短期間で取得することができる。さらに、本発明に従って、開花促進効果を有しているＦＴ形質転換体を台木として接ぎ木栽培すると、ＦＴ形質転換体から得られる種子とは異なり、導入遺伝子が含まれない種子を首尾よく取得し得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明者らは、上記形質転換体タバコ（３５Ｓ：：ＦＴ／ＳＲ１）を台木とし、野生型タバコＳＲ１または短日性タバコ（短日条件下で開花する）メリーランドマンモス種（ＭＭ）を接ぎ穂（穂木）として接ぎ木栽培し、穂木において交配させることにより、ＦＴ遺伝子が含まれない種子が通常より短期間で得られることを見出し、本発明を完成させるに至った。ＭＭは、長日条件下では開花しないが、接ぎ木栽培することにより長日条件下での花成が促進された。
【００１８】
本発明を用いれば、ＦＴ形質転換体の開花促進効果を穂木に首尾よく伝播させることができ、種子を短期間で取得することができる。形質転換体を台木に用いかつ野生型を穂木に用いた構成からなる接ぎ木を品種改良に用いるという発想が従来には存在しておらず、よって、本発明の構成を有する接ぎ木技術は、従来からは容易に予想することができない、非常に画期的なものである。また、遺伝子導入によって台木へ導入された形質が台木から穂木へ伝播するかまたは伝播しないということは、これまでに示されておらず、本発明において、形質転換体を台木に用いた場合であっても、遺伝子導入によって台木に付与された形質が穂木へ伝播することが初めて示された。また、本発明を用いれば、十分に生育した穂木にＦＴ遺伝子の形質を付与することができるので、本発明は、開花時期に植物体自体が十分に生育していないＦＴ形質転換体自体を用いることによる不具合を解消して、収量の増加、および／または花、果実などの大型化を実現し得る、という非常に有益な利点を有している。
【００１９】
接ぎ木は、増殖を目的とする植物体の一部を他の植物体に接着させ、独立した個体として養成する栄養繁殖方法の１つであり、果樹、花木、庭園樹、果菜類などで採用されている。園芸植物は長い年月にわたって品種改良が行われているために、遺伝的に固定されていないものが多い。このような植物においてもまた、親の形質を確実に伝える栄養繁殖が重要であり、そのための主要な繁殖方法として、接ぎ木が採用されている。
【００２０】
接木栽培において、繁殖目的の接ぎ穂（穂木）が接がれる台となる植物体を台木という。接木栽培による利点としては、穂木の品種の特性が維持されること、挿し木が困難な植物を容易に繁殖させ得ること、適切な台木を選択することにより特別な栽培目的（例えば、樹勢の調整、環境に対する適応性の促進、病害虫による被害の回避、果実品質、結実率の向上など）が達せられること、などが挙げられる。種子繁殖では、経済栽培する主要果樹のほとんどにおいてその品種の特性が失われるが、接木栽培では、遺伝的特性を維持したまま、台木の有する栄養面での形質を穂木に伝えることにより、穂木を首尾よく生育させることができる。
【００２１】
１つの局面において、本発明は、植物の品種改良の時間を短縮する方法を提供する。一実施形態において、本発明に係る方法は、ＦＴ遺伝子が導入されている形質転換体植物である台木に非形質転換体植物を穂木として接ぎ木する工程および穂木にて交配する工程を包含し得る。形質転換体を台木として用いる接ぎ木技術はこれまでに知られていない。
【００２２】
植物には遺伝子導入が困難な品種も存在するので、遺伝子導入によって品種改良を試みる場合は、目的の植物に対して遺伝子導入が可能であるか否かを検討する必要がある。しかし、本発明に従えば、ＦＴ遺伝子導入が容易に行い得る品種を台木に用いればよく、品種改良を行うべき植物に対してＦＴ遺伝子導入を行う必要がない。また、形質転換体を台木に用いかつ野生型を穂木に用いた構成からなる接ぎ木を品種改良に用いられることが従来行われなかったので、当業者は本発明の構成を容易に想到することはできなかった。また、形質転換によって台木に導入された形質が、接ぎ木することによって穂木に伝わるということは、これまでに知られていない。
【００２３】
本明細書中で使用される場合、「ＦＴ遺伝子」はシロイヌナズナ由来のＦＴタンパク質（配列番号２）をコードする遺伝子（配列番号１：Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＢ０２７５０４）に限定されず、いわゆるＦＴグループに属するものであればよい。ＦＴグループに属するタンパク質は、多くの植物において見出されており、全体に高度に保存されている。ＦＴグループのタンパク質としては、シロイヌナズナのＦＴタンパク質、ＴＳＦタンパク質、ＭＦＴタンパク質；温州ミカンのＣｉＦＴタンパク質；イネのＨｄ３ａタンパク質、ＲＦＴ１タンパク質、ＡＬ６６２９４６タンパク質、ＡＰ００３０７９タンパク質、Ａｐ００２８８２タンパク質；等が挙げられる。なお、ＡＬ６６２９４６タンパク質、ＡＰ００３０７９タンパク質およびＡｐ００２８８２タンパク質のナンバーはイネ由来ＥＳＴの登録ナンバーである。
【００２４】
なお、本明細書中で使用される場合、配列番号２に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子、または当該アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列をコードする遺伝子もまた、「ＦＴ遺伝子」に包含される。
【００２５】
ポリペプチドのアミノ酸配列中のいくつかのアミノ酸が、このポリペプチドの構造または機能に有意に影響することなく容易に改変され得ることは、当該分野において周知である。さらに、人為的に改変させるだけではく、天然のタンパク質において、当該タンパク質の構造または機能を有意に変化させない変異体が存在することもまた周知である。
【００２６】
当業者は、周知技術を使用してポリペプチドのアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸を容易に変異（例えば、欠失、挿入、逆転、反復、およびタイプ置換（例えば、親水性残基の別の残基への置換、しかし通常は強く親水性の残基を強く疎水性の残基には置換しない）を含む変異）させることができる。ポリペプチドにおける「中性」アミノ酸置換は、一般的にそのポリペプチドの活性にほとんど影響しないことは、当該分野において周知である。例えば、公知の点変異導入法に従えば、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの任意の塩基を変異させることができる。また、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの任意の部位に対応するプライマーを設計して欠失変異体または付加変異体を作製することができる。さらに、本明細書中に記載される方法を用いれば、作製した変異体が所望のＦＴ活性を有するか否かを容易に決定し得る。なお、本明細書中で使用される場合、「ＦＴ活性」とは、花成を促進する機能が意図される。
【００２７】
接ぎ木を行うに際し、接ぎ木の活着を首尾よく行わせるために、台木と穂木との間に親和性のあることが必要とされる。接ぎ木の活着は、穂木および台木両方の接着面において主に形成層にてカルスが分化して抱合するため、いかにして形成層を広く滑らかに接着させるが重要となるからである。もちろん、同一種間での接木はそのほとんどが首尾よく行い得る。よって、本発明において使用される穂木としては、台木と同一種の植物が好ましいが、接ぎ木が首尾よく行われるものであれば特に限定されない。つまり、本発明を行う場合、台木と穂木との間の接ぎ木親和性があればよく、改良が所望される穂木は、台木に対して接ぎ木親和性を有しているもの全てが使用され得る。
【００２８】
本発明において、好ましくは、上記形質転換体植物および上記非形質転換体植物が同一種に由来し得る。なお、上記非形質転換体植物は野生型であることが好ましいがこれに限定されない。
【００２９】
接ぎ木の方法としては、枝接ぎ（例えば、切り接ぎ、割り接ぎ、舌次、袋接ぎ、合わせ接ぎなど）、芽接ぎ（ｂｕｄｄｉｎｇ）（例えば、盾芽接ぎ、そぎ接ぎなど）、根接ぎなどが知られており、本発明においては、いかなる接ぎ木方法が採用されてもよい。
【００３０】
本発明において、穂木にて交配する工程は従来公知の技術が適用される。従来、交配に至るまでの間の育種に長期間を要していたが、本発明を用いれば、育種期間を有意に短縮することができるので、その結果、植物の品種改良を効率よく行うことができる。
【００３１】
本発明の方法に従えば、植物の品種改良の時間を短縮することができる。また、ＦＴ遺伝子の花成促進作用を台木から穂木へ伝搬させて、穂木における開花を促進させることができる。また、シロイヌナズナのＦＴ遺伝子がタバコに対してもその効果を示したということは、異種間で共通の効果を示し得るという特性を有していることであり、すなわち、１種類の台木を作製すれば、接ぎ木親和性を有していればどのような穂木であっても開花促進効果を付与することが期待し得る。
【００３２】
本発明の方法に従えば、穂木に実った種子には導入遺伝子マーカーであるカナマイシンに対する耐性がなく、上記接ぎ木栽培に用いた導入遺伝子が穂木および次世代へ伝搬しない。よって、遺伝子組み換え作物（ＧＭＯ：Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｏｒｇａｎｉｓｍｓ）を環境へ拡散させることを回避し得る。本発明によって示される「台木に導入された遺伝子が穂木へ移動しないが、導入遺伝子によって台木にもたらされた形質が穂木へ移動する」という技術はこれまでに示されていない。
【００３３】
さらなる局面において、本発明は、植物の品種改良の時間を短縮するためのキットを提供する。一実施形態において、本発明に係るキットは、ＦＴ遺伝子が導入された形質転換体植物を備えていることが好ましい。
【００３４】
本明細書中で使用される場合、「植物に導入可能な形態であるＦＴ遺伝子構築物」は、公知の遺伝子導入法によって植物へ導入し得る形態（例えば、プラスミドベクター）にＦＴ遺伝子が挿入されてなる構築物であって、ＦＴ遺伝子によってコードされるＦＴタンパク質を発現し得る構築物が意図される。植物に導入可能な形態であるＦＴ遺伝子構築物としては、例えば、ＦＴ遺伝子のｃＤＮＡが挿入された組換え発現ベクターなどが挙げられる。組換え発現ベクターの作製方法としては、プラスミド、ファージ、またはコスミドなどを用いる方法が挙げられるが特に限定されない。
【００３５】
ベクターの具体的な種類は特に限定されず、宿主細胞中で発現可能なベクターが適宜選択され得る。すなわち、宿主細胞の種類に応じて、確実にＦＴタンパク質を発現させるために適宜プロモーター配列を選択し、これとＦＴ遺伝子を各種プラスミド等に組み込んだベクターを発現ベクターとして用いればよい。
【００３６】
公知の遺伝子導入法としては、例えば、アグロバクテリウム法、バーティクルガン法、ウィルスベクター法、エレクトロポレーション法、ポリエチレングリコール法、マイクロインジェクション法、リポソーム法などが挙げられるが、これらに限定されない。当業者は、導入する植物の種類に応じて好ましい遺伝子導入法を選択し得る。
【００３７】
なお、ベクターは、少なくとも１つの選択マーカーを含むことが好ましい。このようなマーカーとしては、植物細胞の培養についてはカナマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子またはバスタ耐性遺伝子、ならびにＥ．ｃｏｌｉおよび他の細菌における培養についてはテトラサイクリン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ゲンタマイシン耐性遺伝子またはカナマイシン耐性遺伝子が挙げられる。
【００３８】
導入した遺伝子が台木および穂木に存在するか否かについては、台木および穂木からＤＮＡを抽出して、ＰＣＲ法、サザンブロッティング法などを行うことにより調べることができる。また、ＦＴ遺伝子構築物に連結したマーカー遺伝子の存在を確認することにより、導入した遺伝子が台木および穂木に存在するか否かを知ることができる。
【００３９】
本発明に係る方法及びキットを適用する植物としては、園芸植物が好ましい。本発明に用いられ得る園芸植物としては、接ぎ木技術が適用され得るものであれば何でもよく、当業者は、接ぎ木技術を適用し得る園芸植物を容易に選択し得る。
【００４０】
また、本発明に係る方法及びキットを適用する植物としては、種々の食用植物が挙げられる。好ましい食用植物としては、マメ科植物（ダイズ、エンドウ、アルファルファなど）、ナス科植物（タバコ、トマト、ジャガイモなど）、アブラナ科植物（ナタネ、キャベツなど）、ウリ科植物（キュウリ、カボチャなど）、セリ科植物（ニンジン、セロリなど）などの双子葉植物が挙げられるがこれらに限定されない。また、樹木としては、果樹、花木（スギ、ヒノキ、マツなど）が挙げられるがこれらに限定されない。
【００４１】
本明細書において、主に、ＦＴ遺伝子を導入した形質転換体植物を用いて本発明に係る方法及びキットを説明してきたが、ＦＴタンパク質を発現する形質転換体植物を作製するための工程をさらに包含する方法、およびＦＴタンパク質を発現する形質転換体植物を作製するためのツールをさらに備えているキットもまた、本発明の技術的範囲に属する。
【００４２】
すなわち、さらなる局面において、本発明は、ＦＴ遺伝子を導入して形質転換体植物を作製する工程、該形質転換体植物の台木に非形質転換体植物を穂木として接ぎ木する工程、および穂木にて交配する工程を包含する植物の品種改良の時間を短縮する方法を提供する。また、別の局面において、本発明は、植物に導入可能な形態であるＦＴ遺伝子構築物およびＦＴ遺伝子構築物を導入するための植物を備えている植物の品種改良の時間を短縮するためのキットを提供する。
【００４３】
尚、発明を実施するための最良の形態の項においてなした具体的な実施態様および以下の実施例は、あくまでも、本発明の技術内容を明らかにするものであって、そのような具体例にのみ限定して狭義に解釈されるべきものではなく、当業者は、本発明の精神および添付の特許請求の範囲内で変更して実施することができる。
【００４４】
また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
【実施例】
【００４５】
〔１：培地の調製〕
ＭＳプラント培地を以下の手順に従って調製した。ＭＳ Ｓａｌｔ（和光純薬）４．３ｇおよびスクロース３０ｇを蒸留水９５０ｍｌに溶解した後、この溶液を１Ｎ ＫＯＨでｐＨ５．７に調整し、さらに蒸留水を加えて総容量を１Ｌにした。ｂａｃｔｏ−ａｇａｒ ８ｇを添加した後、この溶液を１Ｌフラスコに移し、緩やかに攪拌した。この溶液を２０分間オートクレーブにて滅菌し、６０℃前後まで溶液の温度が下がった時点で、滅菌したペトリ皿に分注した。
【００４６】
ＭＳＫＣプラント培地を以下の手順に従って調製した。上記ＭＳプラント培地と同様の手順に従って調製した溶液に、オートクレーブ後の溶液の温度が６０℃の時点で、１００μｇ／ｍｌ Ｋａｎａｍｙｃｉｎ（明治製薬） １ｍｌ及び５００ｍｇ／ｍｌ Ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ（Ｓｉｇｍａ） ２ｍｌを添加し、次いで同様に分注した。
【００４７】
＃３プレート培地を以下の手順に従って調製した。ＭＳ Ｓａｌｔ（和光純薬）４．３ｇ、スクロース３０ｇ、０．１ｇ ｍｙｏ−ｉｎｏｓｉｔｏｌ（Ｓｉｇｍａ）、１ｍｇ／ｍｌ Ｔｈｉａｍｉｎｅ−ＨＣＬ（Ｓｉｇｍａ）０．４ｍｌを蒸留水９５０ｍｌに溶解した後、この溶液を１Ｎ ＫＯＨでｐＨ５．７に調整し、さらに蒸留水を加えて総容量を１Ｌにした。ｂａｃｔｏ−ａｇａｒ ８ｇを添加した後、この溶液を１Ｌフラスコに移し、緩やかに攪拌した。この溶液を２０分間オートクレーブにて滅菌し、６０℃前後まで溶液の温度が下がった時点で、１０-5Ｍ ６−Ｂｅｎｚｙｌａｍｉｎｏｐｕｒｉｎｅ（Ｓｉｇｍａ） ０．４５ｍｌ及び１０-6Ｍ Ｉｎｄｏｌ−３−ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ（Ｓｉｇｍａ） １１７μｌを添加し、ペトリ皿に分注した。
【００４８】
＃３ＫＣプレート培地を以下の手順に従って調製した。上記＃３プレート培地と同様の手順に従って調製した溶液に、オートクレーブ後の溶液の温度が６０℃の時点で、１００μｇ／ｍｌ Ｋａｎａｍｙｃｉｎ（明治製薬） １ｍｌ及び１００μｇ／ｍｌ Ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ（Ｓｉｇｍａ）２ｍｌを添加し、次いで同様に分注した。
【００４９】
〔２：発現ベクターの構築および形質転換〕
本実施例では、供試植物として野生型タバコＳＲ１種（ＳＲ１）を用いた。ＳＲ１に導入する遺伝子として、シロイヌナズナ由来のＦＴ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＡＢ０２７５０４）（配列番号１）を用いた。
【００５０】
野生型アラビドプシス（Ｃｏｌエコタイプ）から抽出した総ＲＮＡから逆転写したｃＤＮＡをテンプレートとし、プライマー（ＦＴ−Ｆ１：５’−ＴＴＣＴＣＴＡＧＡＡＴＧＴＣＴＡＴＡＡＡＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣ（配列番号３）；ＦＴ−ＸｂａＲｖ：３’−ＴＴＣＴＡＧＡＣＴＡＡＡＧＴＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＣＧＣ（配列番号４））を用いてＰＣＲを行い、ＦＴ ｃＤＮＡ（配列番号１）を取得した。
【００５１】
ｐＣＧＮ１５４７（Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １４：２６９−２７６（１９９０）を参照のこと）にＦＴ遺伝子（配列番号１）を挿入して、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーター下でＦＴ遺伝子を発現させるバイナリベクターを構築した。このバイナリベクターを以下の手順に従ってアグロバクテリアに導入した。無菌的に一晩培養したアグロバクテリア菌の培養溶液５ｍｌを５０倍に希釈した後、２８℃で５〜６時間培養した。ＯＤ値が０．１５〜０．２０に達した段階で、この培養液を、４℃、７０００ｒｐｍ以下で１０〜１５分間遠心分離することにより集菌した。この菌体を、０℃の１ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）を用いて洗浄した。これらの遠心分離工程、集菌工程、及び洗浄工程を３回繰り返した後、０℃の１０％グリセロール約２０ｍｌを用いて洗浄、遠心分離、集菌した菌体を、０℃の１０％グリセロール２．５ｍｌ中に懸濁した。この懸濁液を滅菌チューブに分注し、液体窒素で凍結した後、−７０℃で保存したものを、コンピテントセルとして用いた。コンピテントセルを使用時に氷上で溶解し、溶解したセル４０μｌに、導入すべきバイナリベクターを含むＤＮＡ溶液（１００〜１０００ｎｇのＤＮＡを含む）１〜５μｌを添加した。この溶液を、電極幅０．２ｃｍのキュベットを用いて、パルス２．５ｋＶ、キャパシタンス２５μＦ、パルスコントロール２００Ωでエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションの直後に０．８ｍｌの培地（ＹＥＢ）をキュベットに加え、懸濁液をチューブに移し、２８℃で１時間インキュベートした。この懸濁液の１／１０の量を、リファンピシン及び必要な抗生物質を含んだＹＥＢプレートに播種し、コロニーが形成されるまで２８℃で培養した。形成されたコロニーからさらにクローン培養した遺伝子導入菌を植物体の感染に用いた。
【００５２】
２５〜２８℃で無菌的に培養した野生型タバコＳＲ１種を、葉数が７〜８枚に達するまで生育させた。滅菌したメスを用いて葉を切り取り、中央の葉脈を取り除き、４枚に切り取った。アグロバクテリアの感染には、植物体の新芽から３〜４枚目の葉を用いるのが最も好ましい。この切り取った葉を、アグロバクテリアが十分培養されたプレート上に配置した後、注射針を挿して傷つけた葉にアグロバクテリアを感染させた。この葉を＃３培地（５ｍｇ／ｍｌ ｂｅｎｚｙｌａｍｉｎｏｐｕｒｉｎｅ及び１．５ｍｇ／ｍｌ ｉｎｄｏｌ−ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄを含むＭＳ ｓａｌｔｓ、ｓｕｃｒｏｓｅ、ｂａｃｔｏ−ａｇａｒ、ｍｙｏ−ｉｎｏｓｉｔｏｌ及びＴｈｉａｍｉｎｅ−ＨＣｌからなる培地）に移し、無菌室にて２５℃で培養した。３日後、＃３培地上の葉を、＃３ＫＣ培地（１００μｇ／ｍｌ Ｋａｎａｍｙｃｉｎ及び１００μｇ／ｍｌ Ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎを含む＃３培地）に移した。さらに３〜４週間培養することにより、葉をカルス化させた。このカルスから突出するシュートをメスで切り取り、このシュートをＭＳＫＣプラント培地（１００μｇ／ｍｌ Ｋａｎａｍｙｃｉｎ及び５００ｍｇ／ｍｌ Ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎを含むＭＳ基本培地）に移した。切り取ったシュートに残存するカルスを首尾よく除去した。切り取ったシュートを、新鮮な＃３ＫＣ培地に移しさらに培養した。形質転換したシュートからは１〜２週間程で根が誘導された。さらに１〜２週間後、プラント培地中の植物が十分育ったことを確認した後、葉を１枚〜２枚つけた茎を切り取り、ＭＳＫＣプラント培地に移した。移植した植物のうち根が再び誘導された植物の根を十分洗浄して培地を除去し、土に移植した。移植した植物の自家受粉次世代においてカナマイシン耐性の有無を指標にして形質転換の有無を確認した。
【００５３】
〔３：形質転換体を台木に用いた場合の穂木への影響〕
選抜されたＦＴ遺伝子形質転換体（導入遺伝子のホモ接合体である形質転換第３世代）（３５Ｓ：：ＦＴ／ＳＲ１）を、長日条件下（１６時間明期（２８℃）／８時間暗期（２５℃））において生育させた。この形質転換体を、本葉が２〜５枚に達するまで生育させた後に、接ぎ木栽培に用いた。穂木として、野生型タバコＳＲ１品種（ＳＲ１）またはＭａｒｙｌａｎｄ Ｍａｍｍｏｔｈ品種（ＭＭ）を用いた。ＳＲ１は、長日条件下または短日条件下（８時間明期（２８℃）／１６時間暗期（２５℃））のいずれにおいても本葉の枚数が２０枚程度に達したころに開花する日長中立性の品種である（図３）。また、ＭＭ品種は、長日条件下では開花せず、短日条件下においてのみ開花する品種である。コントロールとして、ＳＲ１を台木とし、穂木としてＳＲ１またはＭＭを用いて接ぎ木栽培を行った。なお、接ぎ木を、切接法によって行った。
【００５４】
長日条件下では、３５Ｓ：：ＦＴ／ＳＲ１を台木としかつＳＲ１を穂木とした植物体において、本葉の枚数が８枚程度に達した段階で穂木での開花が観察された（図１）。また、同一条件下で、３５Ｓ：：ＦＴ／ＳＲ１を台木としかつＭＭを穂木とした植物体において、本葉の枚数が１０枚程度に達した段階で穂木での開花が観察された（図２）。しかし、ＳＲ１を台木としかつＳＲ１を穂木として接ぎ木した植物体では、接ぎ木しない場合と同様に、本葉の枚数が１５−２０枚程度に達した段階で穂木での開花が観察された（示さず）。また、ＳＲ１を台木としかつＭＭを穂木として接ぎ木した植物体では、本葉の枚数が３０枚を超えても穂木での開花は観察されなかった（図４）。
【００５５】
図５には、ＦＴ遺伝子を導入したＦＴ形質転換体（左）では、長日条件下において本葉の枚数が５枚程度に達した段階で開花するが、野生型タバコ（右）では、同時期には開花していない様子を示す。
【００５６】
なお、３５Ｓ：：ＦＴ／ＳＲ１を台木としかつＳＲ１またはＭＭを穂木とした植物体の穂木に実った種子を、ＭＳＫプレート（１００μｇ／ｍｌ Ｋａｎａｍｙｃｉｎを含むＭＳ基本培地）に播種したが、全ての種子が死滅した。すなわち、これらの穂木からはカナマイシン耐性を有する種子が得られなかった（示さず）。これは、台木に導入された遺伝子の穂木への伝搬はみられなかったことを示す。
【産業上の利用可能性】
【００５７】
本発明の方法を用いることにより、従来よりも短期間で品種改良植物を作製することができるので、農作物の生産に大いに貢献できる。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】ＦＴ遺伝子を導入したＦＴ形質転換体を台木としかつ野生型ＳＲ１を穂木とした植物体における、長日条件下での開花の様子を示す図である。
【図２】ＦＴ遺伝子を導入したＦＴ形質転換体を台木としかつＭＭを穂木とした植物体における、長日条件下での開花の様子を示す図である。
【図３】野生型ＳＲ１の、長日条件下での開花の様子を示す図である。
【図４】野生型ＳＲ１を台木としかつＭＭを穂木とした植物体における、長日条件下では開花しない様子を示す図である。
【図５】同一条件下（長日条件下）にて同一期間生育させたＦＴ形質転換体（左）および野生型タバコ（右）における開花の状態を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物の品種改良を効率よく行うための方法及びキットに関するものであり、より詳細には、ＦＴ遺伝子が導入された形質転換体植物を用いる植物の品種改良の時間を短縮するための方法及びキットに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従前より、植物の品種改良の代表的な方法として、交配技術が用いられている。この交配技術は、選択した植物の品種間で交配させ、雑種第一代またはその後の世代に生じた個体の中から、目的の形質を備えたものを選抜し、新品種に育種する技術である。この交配に用いられる植物は、生殖活動（すなわち、受粉、接合、受精など）が可能になるまで栽培されていることが必要であり、育種に長期間を費やす品種も存在する。
【０００３】
一般に、植物には栄養生長期と生殖生長期とがあり、特に種子植物においては、生長相が栄養生長期から生殖生長期へ転換して花芽が形成される時期がある。この花芽が形成されることにより、植物は生殖活動が可能になる。この栄養生長期から生殖生長期への転換、すなわち、花成は、植物の繁殖に直結する現象であるため、植物の生活環における重要な現象である。花成を人為的に制御することができれば、育種の効率化が可能となり、その結果、上記交配技術による品種改良に費やす時間を短縮することができる。よって、植物における花成の制御機構の解明は、学術的に重要なテーマの一つであるだけでなく、産業的にも重要なテーマの一つである。
【０００４】
このような花成の制御機構に関する研究は、アブラナ科の野草であるシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）を用いて行われている。特に、シロイヌナズナから見出されたＦＬＯＷＥＲＩＮＧ ＬＯＣＵＳ Ｔ遺伝子（ＦＴ遺伝子）が導入された形質転換体植物においては、ＦＴ遺伝子の働きにより花成が促進される。このことより、ＦＴ遺伝子は花成のスイッチ遺伝子（すなわち、花成制御遺伝子）として知られている（特許文献１を参照のこと）。また、本発明者らは、ＦＴ遺伝子およびそのファミリーが細胞間でのタンパク質の移動を司るとともに自らも細胞間を移動することを見出している（特許文献２を参照のこと）。
【０００５】
日長中立性植物である野生型タバコ（ＳＲ１）では、長日条件下または短日条件下のいずれにおいても本葉の枚数が２０枚程度に達することが開花に必要である。このような野生型タバコ（ＳＲ１）にアラビドプシス（シロイヌナズナ）由来のＦＴ遺伝子を導入した場合、ＦＴ遺伝子を導入したＦＴ形質転換体（３５Ｓ：：ＦＴ／ＳＲ１）では、長日条件下において本葉の枚数が５枚程度に達した段階で開花する。
【０００６】
上述したように、ＦＴ形質転換体（３５Ｓ：：ＦＴ／ＳＲ１）では、開花に必要な葉数が減少しているので、開花促進効果を有しているといえる。このように、人為的に花成の制御が可能な形質転換体植物が、様々な種において容易に作製され、しかも繁殖が可能となれば、品種改良技術の発達に大きく寄与するといえる。
【特許文献１】特開２００３−０９８７２公報（平成１５年１月１４日公開）
【特許文献２】特開２００４−２６１１２２公報（平成１６年９月２４日公開）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、上記形質転換体タバコ（３５Ｓ：：ＦＴ／ＳＲ１）は、開花が早いために、開花時期には植物体自体が十分に生育しない。よって、ＦＴ形質転換体自体は、農業上要求される形質（例えば、収量の増加、および／または花、果実などの大型化）に直接結びつく場合はむしろ少なく、実用的ではない。
【０００８】
また、形質転換体植物を繁殖させるための手段として母株からの種子の採取を採用する場合は、その母株が遺伝的に安定している必要がある。しかし、その母株を育種するためには長い年月および労力を必要とするので、母株からの種子の採取によって形質転換体を繁殖させることは実用的ではない。また、遺伝子導入が困難な品種も存在するので、このような品種においては、新たな形質転換体を作製することは容易ではない。
【０００９】
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、植物の品種改良に必要な時間を短縮して品種改良の効率を向上させる技術を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明に係る植物の品種改良の時間を短縮する方法は、上記課題を解決するために、ＦＴ遺伝子が導入されている形質転換体植物である台木に非形質転換体植物を穂木として接ぎ木する工程および穂木にて交配する工程を包含することを特徴としている。
【００１１】
本発明に係る植物の品種改良の時間を短縮する方法は、ＦＴ遺伝子を導入して形質転換体植物を作製する工程をさらに包含してもよい。
【００１２】
本発明に係る植物の品種改良の時間を短縮する方法において、上記形質転換体植物および上記非形質転換体植物は接ぎ木親和性を有していることが必要である。
【００１３】
本発明に係る植物の品種改良の時間を短縮する方法において、上記非形質転換体植物は野生型であってもよい。
【００１４】
本発明に係る植物の品種改良の時間を短縮するためのキットは、上記課題を解決するために、ＦＴ遺伝子が導入された形質転換体植物を備えていることを特徴としている。
【００１５】
本発明に係る植物の品種改良の時間を短縮するためのキットは、上記課題を解決するために、植物に導入可能な形態であるＦＴ遺伝子構築物および該ＦＴ遺伝子構築物を導入するための植物を備えていることを特徴としている。
【発明の効果】
【００１６】
本発明に従って、開花促進効果を有しているＦＴ形質転換体を台木として接ぎ木栽培した穂木にて交配させることにより、品種改良の時間を短縮することができ、農作物の生産に大いに貢献することができる。また、本発明に従えば、ＦＴ形質転換体の開花促進効果を穂木に首尾よく伝播させることができ、種子を短期間で取得することができる。さらに、本発明に従って、開花促進効果を有しているＦＴ形質転換体を台木として接ぎ木栽培すると、ＦＴ形質転換体から得られる種子とは異なり、導入遺伝子が含まれない種子を首尾よく取得し得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明者らは、上記形質転換体タバコ（３５Ｓ：：ＦＴ／ＳＲ１）を台木とし、野生型タバコＳＲ１または短日性タバコ（短日条件下で開花する）メリーランドマンモス種（ＭＭ）を接ぎ穂（穂木）として接ぎ木栽培し、穂木において交配させることにより、ＦＴ遺伝子が含まれない種子が通常より短期間で得られることを見出し、本発明を完成させるに至った。ＭＭは、長日条件下では開花しないが、接ぎ木栽培することにより長日条件下での花成が促進された。
【００１８】
本発明を用いれば、ＦＴ形質転換体の開花促進効果を穂木に首尾よく伝播させることができ、種子を短期間で取得することができる。形質転換体を台木に用いかつ野生型を穂木に用いた構成からなる接ぎ木を品種改良に用いるという発想が従来には存在しておらず、よって、本発明の構成を有する接ぎ木技術は、従来からは容易に予想することができない、非常に画期的なものである。また、遺伝子導入によって台木へ導入された形質が台木から穂木へ伝播するかまたは伝播しないということは、これまでに示されておらず、本発明において、形質転換体を台木に用いた場合であっても、遺伝子導入によって台木に付与された形質が穂木へ伝播することが初めて示された。また、本発明を用いれば、十分に生育した穂木にＦＴ遺伝子の形質を付与することができるので、本発明は、開花時期に植物体自体が十分に生育していないＦＴ形質転換体自体を用いることによる不具合を解消して、収量の増加、および／または花、果実などの大型化を実現し得る、という非常に有益な利点を有している。
【００１９】
接ぎ木は、増殖を目的とする植物体の一部を他の植物体に接着させ、独立した個体として養成する栄養繁殖方法の１つであり、果樹、花木、庭園樹、果菜類などで採用されている。園芸植物は長い年月にわたって品種改良が行われているために、遺伝的に固定されていないものが多い。このような植物においてもまた、親の形質を確実に伝える栄養繁殖が重要であり、そのための主要な繁殖方法として、接ぎ木が採用されている。
【００２０】
接木栽培において、繁殖目的の接ぎ穂（穂木）が接がれる台となる植物体を台木という。接木栽培による利点としては、穂木の品種の特性が維持されること、挿し木が困難な植物を容易に繁殖させ得ること、適切な台木を選択することにより特別な栽培目的（例えば、樹勢の調整、環境に対する適応性の促進、病害虫による被害の回避、果実品質、結実率の向上など）が達せられること、などが挙げられる。種子繁殖では、経済栽培する主要果樹のほとんどにおいてその品種の特性が失われるが、接木栽培では、遺伝的特性を維持したまま、台木の有する栄養面での形質を穂木に伝えることにより、穂木を首尾よく生育させることができる。
【００２１】
１つの局面において、本発明は、植物の品種改良の時間を短縮する方法を提供する。一実施形態において、本発明に係る方法は、ＦＴ遺伝子が導入されている形質転換体植物である台木に非形質転換体植物を穂木として接ぎ木する工程および穂木にて交配する工程を包含し得る。形質転換体を台木として用いる接ぎ木技術はこれまでに知られていない。
【００２２】
植物には遺伝子導入が困難な品種も存在するので、遺伝子導入によって品種改良を試みる場合は、目的の植物に対して遺伝子導入が可能であるか否かを検討する必要がある。しかし、本発明に従えば、ＦＴ遺伝子導入が容易に行い得る品種を台木に用いればよく、品種改良を行うべき植物に対してＦＴ遺伝子導入を行う必要がない。また、形質転換体を台木に用いかつ野生型を穂木に用いた構成からなる接ぎ木を品種改良に用いられることが従来行われなかったので、当業者は本発明の構成を容易に想到することはできなかった。また、形質転換によって台木に導入された形質が、接ぎ木することによって穂木に伝わるということは、これまでに知られていない。
【００２３】
本明細書中で使用される場合、「ＦＴ遺伝子」はシロイヌナズナ由来のＦＴタンパク質（配列番号２）をコードする遺伝子（配列番号１：Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＢ０２７５０４）に限定されず、いわゆるＦＴグループに属するものであればよい。ＦＴグループに属するタンパク質は、多くの植物において見出されており、全体に高度に保存されている。ＦＴグループのタンパク質としては、シロイヌナズナのＦＴタンパク質、ＴＳＦタンパク質、ＭＦＴタンパク質；温州ミカンのＣｉＦＴタンパク質；イネのＨｄ３ａタンパク質、ＲＦＴ１タンパク質、ＡＬ６６２９４６タンパク質、ＡＰ００３０７９タンパク質、Ａｐ００２８８２タンパク質；等が挙げられる。なお、ＡＬ６６２９４６タンパク質、ＡＰ００３０７９タンパク質およびＡｐ００２８８２タンパク質のナンバーはイネ由来ＥＳＴの登録ナンバーである。
【００２４】
なお、本明細書中で使用される場合、配列番号２に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子、または当該アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列をコードする遺伝子もまた、「ＦＴ遺伝子」に包含される。
【００２５】
ポリペプチドのアミノ酸配列中のいくつかのアミノ酸が、このポリペプチドの構造または機能に有意に影響することなく容易に改変され得ることは、当該分野において周知である。さらに、人為的に改変させるだけではく、天然のタンパク質において、当該タンパク質の構造または機能を有意に変化させない変異体が存在することもまた周知である。
【００２６】
当業者は、周知技術を使用してポリペプチドのアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸を容易に変異（例えば、欠失、挿入、逆転、反復、およびタイプ置換（例えば、親水性残基の別の残基への置換、しかし通常は強く親水性の残基を強く疎水性の残基には置換しない）を含む変異）させることができる。ポリペプチドにおける「中性」アミノ酸置換は、一般的にそのポリペプチドの活性にほとんど影響しないことは、当該分野において周知である。例えば、公知の点変異導入法に従えば、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの任意の塩基を変異させることができる。また、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの任意の部位に対応するプライマーを設計して欠失変異体または付加変異体を作製することができる。さらに、本明細書中に記載される方法を用いれば、作製した変異体が所望のＦＴ活性を有するか否かを容易に決定し得る。なお、本明細書中で使用される場合、「ＦＴ活性」とは、花成を促進する機能が意図される。
【００２７】
接ぎ木を行うに際し、接ぎ木の活着を首尾よく行わせるために、台木と穂木との間に親和性のあることが必要とされる。接ぎ木の活着は、穂木および台木両方の接着面において主に形成層にてカルスが分化して抱合するため、いかにして形成層を広く滑らかに接着させるが重要となるからである。もちろん、同一種間での接木はそのほとんどが首尾よく行い得る。よって、本発明において使用される穂木としては、台木と同一種の植物が好ましいが、接ぎ木が首尾よく行われるものであれば特に限定されない。つまり、本発明を行う場合、台木と穂木との間の接ぎ木親和性があればよく、改良が所望される穂木は、台木に対して接ぎ木親和性を有しているもの全てが使用され得る。
【００２８】
本発明において、好ましくは、上記形質転換体植物および上記非形質転換体植物が同一種に由来し得る。なお、上記非形質転換体植物は野生型であることが好ましいがこれに限定されない。
【００２９】
接ぎ木の方法としては、枝接ぎ（例えば、切り接ぎ、割り接ぎ、舌次、袋接ぎ、合わせ接ぎなど）、芽接ぎ（ｂｕｄｄｉｎｇ）（例えば、盾芽接ぎ、そぎ接ぎなど）、根接ぎなどが知られており、本発明においては、いかなる接ぎ木方法が採用されてもよい。
【００３０】
本発明において、穂木にて交配する工程は従来公知の技術が適用される。従来、交配に至るまでの間の育種に長期間を要していたが、本発明を用いれば、育種期間を有意に短縮することができるので、その結果、植物の品種改良を効率よく行うことができる。
【００３１】
本発明の方法に従えば、植物の品種改良の時間を短縮することができる。また、ＦＴ遺伝子の花成促進作用を台木から穂木へ伝搬させて、穂木における開花を促進させることができる。また、シロイヌナズナのＦＴ遺伝子がタバコに対してもその効果を示したということは、異種間で共通の効果を示し得るという特性を有していることであり、すなわち、１種類の台木を作製すれば、接ぎ木親和性を有していればどのような穂木であっても開花促進効果を付与することが期待し得る。
【００３２】
本発明の方法に従えば、穂木に実った種子には導入遺伝子マーカーであるカナマイシンに対する耐性がなく、上記接ぎ木栽培に用いた導入遺伝子が穂木および次世代へ伝搬しない。よって、遺伝子組み換え作物（ＧＭＯ：Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｏｒｇａｎｉｓｍｓ）を環境へ拡散させることを回避し得る。本発明によって示される「台木に導入された遺伝子が穂木へ移動しないが、導入遺伝子によって台木にもたらされた形質が穂木へ移動する」という技術はこれまでに示されていない。
【００３３】
さらなる局面において、本発明は、植物の品種改良の時間を短縮するためのキットを提供する。一実施形態において、本発明に係るキットは、ＦＴ遺伝子が導入された形質転換体植物を備えていることが好ましい。
【００３４】
本明細書中で使用される場合、「植物に導入可能な形態であるＦＴ遺伝子構築物」は、公知の遺伝子導入法によって植物へ導入し得る形態（例えば、プラスミドベクター）にＦＴ遺伝子が挿入されてなる構築物であって、ＦＴ遺伝子によってコードされるＦＴタンパク質を発現し得る構築物が意図される。植物に導入可能な形態であるＦＴ遺伝子構築物としては、例えば、ＦＴ遺伝子のｃＤＮＡが挿入された組換え発現ベクターなどが挙げられる。組換え発現ベクターの作製方法としては、プラスミド、ファージ、またはコスミドなどを用いる方法が挙げられるが特に限定されない。
【００３５】
ベクターの具体的な種類は特に限定されず、宿主細胞中で発現可能なベクターが適宜選択され得る。すなわち、宿主細胞の種類に応じて、確実にＦＴタンパク質を発現させるために適宜プロモーター配列を選択し、これとＦＴ遺伝子を各種プラスミド等に組み込んだベクターを発現ベクターとして用いればよい。
【００３６】
公知の遺伝子導入法としては、例えば、アグロバクテリウム法、バーティクルガン法、ウィルスベクター法、エレクトロポレーション法、ポリエチレングリコール法、マイクロインジェクション法、リポソーム法などが挙げられるが、これらに限定されない。当業者は、導入する植物の種類に応じて好ましい遺伝子導入法を選択し得る。
【００３７】
なお、ベクターは、少なくとも１つの選択マーカーを含むことが好ましい。このようなマーカーとしては、植物細胞の培養についてはカナマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子またはバスタ耐性遺伝子、ならびにＥ．ｃｏｌｉおよび他の細菌における培養についてはテトラサイクリン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ゲンタマイシン耐性遺伝子またはカナマイシン耐性遺伝子が挙げられる。
【００３８】
導入した遺伝子が台木および穂木に存在するか否かについては、台木および穂木からＤＮＡを抽出して、ＰＣＲ法、サザンブロッティング法などを行うことにより調べることができる。また、ＦＴ遺伝子構築物に連結したマーカー遺伝子の存在を確認することにより、導入した遺伝子が台木および穂木に存在するか否かを知ることができる。
【００３９】
本発明に係る方法及びキットを適用する植物としては、園芸植物が好ましい。本発明に用いられ得る園芸植物としては、接ぎ木技術が適用され得るものであれば何でもよく、当業者は、接ぎ木技術を適用し得る園芸植物を容易に選択し得る。
【００４０】
また、本発明に係る方法及びキットを適用する植物としては、種々の食用植物が挙げられる。好ましい食用植物としては、マメ科植物（ダイズ、エンドウ、アルファルファなど）、ナス科植物（タバコ、トマト、ジャガイモなど）、アブラナ科植物（ナタネ、キャベツなど）、ウリ科植物（キュウリ、カボチャなど）、セリ科植物（ニンジン、セロリなど）などの双子葉植物が挙げられるがこれらに限定されない。また、樹木としては、果樹、花木（スギ、ヒノキ、マツなど）が挙げられるがこれらに限定されない。
【００４１】
本明細書において、主に、ＦＴ遺伝子を導入した形質転換体植物を用いて本発明に係る方法及びキットを説明してきたが、ＦＴタンパク質を発現する形質転換体植物を作製するための工程をさらに包含する方法、およびＦＴタンパク質を発現する形質転換体植物を作製するためのツールをさらに備えているキットもまた、本発明の技術的範囲に属する。
【００４２】
すなわち、さらなる局面において、本発明は、ＦＴ遺伝子を導入して形質転換体植物を作製する工程、該形質転換体植物の台木に非形質転換体植物を穂木として接ぎ木する工程、および穂木にて交配する工程を包含する植物の品種改良の時間を短縮する方法を提供する。また、別の局面において、本発明は、植物に導入可能な形態であるＦＴ遺伝子構築物およびＦＴ遺伝子構築物を導入するための植物を備えている植物の品種改良の時間を短縮するためのキットを提供する。
【００４３】
尚、発明を実施するための最良の形態の項においてなした具体的な実施態様および以下の実施例は、あくまでも、本発明の技術内容を明らかにするものであって、そのような具体例にのみ限定して狭義に解釈されるべきものではなく、当業者は、本発明の精神および添付の特許請求の範囲内で変更して実施することができる。
【００４４】
また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
【実施例】
【００４５】
〔１：培地の調製〕
ＭＳプラント培地を以下の手順に従って調製した。ＭＳ Ｓａｌｔ（和光純薬）４．３ｇおよびスクロース３０ｇを蒸留水９５０ｍｌに溶解した後、この溶液を１Ｎ ＫＯＨでｐＨ５．７に調整し、さらに蒸留水を加えて総容量を１Ｌにした。ｂａｃｔｏ−ａｇａｒ ８ｇを添加した後、この溶液を１Ｌフラスコに移し、緩やかに攪拌した。この溶液を２０分間オートクレーブにて滅菌し、６０℃前後まで溶液の温度が下がった時点で、滅菌したペトリ皿に分注した。
【００４６】
ＭＳＫＣプラント培地を以下の手順に従って調製した。上記ＭＳプラント培地と同様の手順に従って調製した溶液に、オートクレーブ後の溶液の温度が６０℃の時点で、１００μｇ／ｍｌ Ｋａｎａｍｙｃｉｎ（明治製薬） １ｍｌ及び５００ｍｇ／ｍｌ Ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ（Ｓｉｇｍａ） ２ｍｌを添加し、次いで同様に分注した。
【００４７】
＃３プレート培地を以下の手順に従って調製した。ＭＳ Ｓａｌｔ（和光純薬）４．３ｇ、スクロース３０ｇ、０．１ｇ ｍｙｏ−ｉｎｏｓｉｔｏｌ（Ｓｉｇｍａ）、１ｍｇ／ｍｌ Ｔｈｉａｍｉｎｅ−ＨＣＬ（Ｓｉｇｍａ）０．４ｍｌを蒸留水９５０ｍｌに溶解した後、この溶液を１Ｎ ＫＯＨでｐＨ５．７に調整し、さらに蒸留水を加えて総容量を１Ｌにした。ｂａｃｔｏ−ａｇａｒ ８ｇを添加した後、この溶液を１Ｌフラスコに移し、緩やかに攪拌した。この溶液を２０分間オートクレーブにて滅菌し、６０℃前後まで溶液の温度が下がった時点で、１０-5Ｍ ６−Ｂｅｎｚｙｌａｍｉｎｏｐｕｒｉｎｅ（Ｓｉｇｍａ） ０．４５ｍｌ及び１０-6Ｍ Ｉｎｄｏｌ−３−ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ（Ｓｉｇｍａ） １１７μｌを添加し、ペトリ皿に分注した。
【００４８】
＃３ＫＣプレート培地を以下の手順に従って調製した。上記＃３プレート培地と同様の手順に従って調製した溶液に、オートクレーブ後の溶液の温度が６０℃の時点で、１００μｇ／ｍｌ Ｋａｎａｍｙｃｉｎ（明治製薬） １ｍｌ及び１００μｇ／ｍｌ Ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ（Ｓｉｇｍａ）２ｍｌを添加し、次いで同様に分注した。
【００４９】
〔２：発現ベクターの構築および形質転換〕
本実施例では、供試植物として野生型タバコＳＲ１種（ＳＲ１）を用いた。ＳＲ１に導入する遺伝子として、シロイヌナズナ由来のＦＴ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＡＢ０２７５０４）（配列番号１）を用いた。
【００５０】
野生型アラビドプシス（Ｃｏｌエコタイプ）から抽出した総ＲＮＡから逆転写したｃＤＮＡをテンプレートとし、プライマー（ＦＴ−Ｆ１：５’−ＴＴＣＴＣＴＡＧＡＡＴＧＴＣＴＡＴＡＡＡＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣ（配列番号３）；ＦＴ−ＸｂａＲｖ：３’−ＴＴＣＴＡＧＡＣＴＡＡＡＧＴＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＣＧＣ（配列番号４））を用いてＰＣＲを行い、ＦＴ ｃＤＮＡ（配列番号１）を取得した。
【００５１】
ｐＣＧＮ１５４７（Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １４：２６９−２７６（１９９０）を参照のこと）にＦＴ遺伝子（配列番号１）を挿入して、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーター下でＦＴ遺伝子を発現させるバイナリベクターを構築した。このバイナリベクターを以下の手順に従ってアグロバクテリアに導入した。無菌的に一晩培養したアグロバクテリア菌の培養溶液５ｍｌを５０倍に希釈した後、２８℃で５〜６時間培養した。ＯＤ値が０．１５〜０．２０に達した段階で、この培養液を、４℃、７０００ｒｐｍ以下で１０〜１５分間遠心分離することにより集菌した。この菌体を、０℃の１ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）を用いて洗浄した。これらの遠心分離工程、集菌工程、及び洗浄工程を３回繰り返した後、０℃の１０％グリセロール約２０ｍｌを用いて洗浄、遠心分離、集菌した菌体を、０℃の１０％グリセロール２．５ｍｌ中に懸濁した。この懸濁液を滅菌チューブに分注し、液体窒素で凍結した後、−７０℃で保存したものを、コンピテントセルとして用いた。コンピテントセルを使用時に氷上で溶解し、溶解したセル４０μｌに、導入すべきバイナリベクターを含むＤＮＡ溶液（１００〜１０００ｎｇのＤＮＡを含む）１〜５μｌを添加した。この溶液を、電極幅０．２ｃｍのキュベットを用いて、パルス２．５ｋＶ、キャパシタンス２５μＦ、パルスコントロール２００Ωでエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションの直後に０．８ｍｌの培地（ＹＥＢ）をキュベットに加え、懸濁液をチューブに移し、２８℃で１時間インキュベートした。この懸濁液の１／１０の量を、リファンピシン及び必要な抗生物質を含んだＹＥＢプレートに播種し、コロニーが形成されるまで２８℃で培養した。形成されたコロニーからさらにクローン培養した遺伝子導入菌を植物体の感染に用いた。
【００５２】
２５〜２８℃で無菌的に培養した野生型タバコＳＲ１種を、葉数が７〜８枚に達するまで生育させた。滅菌したメスを用いて葉を切り取り、中央の葉脈を取り除き、４枚に切り取った。アグロバクテリアの感染には、植物体の新芽から３〜４枚目の葉を用いるのが最も好ましい。この切り取った葉を、アグロバクテリアが十分培養されたプレート上に配置した後、注射針を挿して傷つけた葉にアグロバクテリアを感染させた。この葉を＃３培地（５ｍｇ／ｍｌ ｂｅｎｚｙｌａｍｉｎｏｐｕｒｉｎｅ及び１．５ｍｇ／ｍｌ ｉｎｄｏｌ−ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄを含むＭＳ ｓａｌｔｓ、ｓｕｃｒｏｓｅ、ｂａｃｔｏ−ａｇａｒ、ｍｙｏ−ｉｎｏｓｉｔｏｌ及びＴｈｉａｍｉｎｅ−ＨＣｌからなる培地）に移し、無菌室にて２５℃で培養した。３日後、＃３培地上の葉を、＃３ＫＣ培地（１００μｇ／ｍｌ Ｋａｎａｍｙｃｉｎ及び１００μｇ／ｍｌ Ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎを含む＃３培地）に移した。さらに３〜４週間培養することにより、葉をカルス化させた。このカルスから突出するシュートをメスで切り取り、このシュートをＭＳＫＣプラント培地（１００μｇ／ｍｌ Ｋａｎａｍｙｃｉｎ及び５００ｍｇ／ｍｌ Ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎを含むＭＳ基本培地）に移した。切り取ったシュートに残存するカルスを首尾よく除去した。切り取ったシュートを、新鮮な＃３ＫＣ培地に移しさらに培養した。形質転換したシュートからは１〜２週間程で根が誘導された。さらに１〜２週間後、プラント培地中の植物が十分育ったことを確認した後、葉を１枚〜２枚つけた茎を切り取り、ＭＳＫＣプラント培地に移した。移植した植物のうち根が再び誘導された植物の根を十分洗浄して培地を除去し、土に移植した。移植した植物の自家受粉次世代においてカナマイシン耐性の有無を指標にして形質転換の有無を確認した。
【００５３】
〔３：形質転換体を台木に用いた場合の穂木への影響〕
選抜されたＦＴ遺伝子形質転換体（導入遺伝子のホモ接合体である形質転換第３世代）（３５Ｓ：：ＦＴ／ＳＲ１）を、長日条件下（１６時間明期（２８℃）／８時間暗期（２５℃））において生育させた。この形質転換体を、本葉が２〜５枚に達するまで生育させた後に、接ぎ木栽培に用いた。穂木として、野生型タバコＳＲ１品種（ＳＲ１）またはＭａｒｙｌａｎｄ Ｍａｍｍｏｔｈ品種（ＭＭ）を用いた。ＳＲ１は、長日条件下または短日条件下（８時間明期（２８℃）／１６時間暗期（２５℃））のいずれにおいても本葉の枚数が２０枚程度に達したころに開花する日長中立性の品種である（図３）。また、ＭＭ品種は、長日条件下では開花せず、短日条件下においてのみ開花する品種である。コントロールとして、ＳＲ１を台木とし、穂木としてＳＲ１またはＭＭを用いて接ぎ木栽培を行った。なお、接ぎ木を、切接法によって行った。
【００５４】
長日条件下では、３５Ｓ：：ＦＴ／ＳＲ１を台木としかつＳＲ１を穂木とした植物体において、本葉の枚数が８枚程度に達した段階で穂木での開花が観察された（図１）。また、同一条件下で、３５Ｓ：：ＦＴ／ＳＲ１を台木としかつＭＭを穂木とした植物体において、本葉の枚数が１０枚程度に達した段階で穂木での開花が観察された（図２）。しかし、ＳＲ１を台木としかつＳＲ１を穂木として接ぎ木した植物体では、接ぎ木しない場合と同様に、本葉の枚数が１５−２０枚程度に達した段階で穂木での開花が観察された（示さず）。また、ＳＲ１を台木としかつＭＭを穂木として接ぎ木した植物体では、本葉の枚数が３０枚を超えても穂木での開花は観察されなかった（図４）。
【００５５】
図５には、ＦＴ遺伝子を導入したＦＴ形質転換体（左）では、長日条件下において本葉の枚数が５枚程度に達した段階で開花するが、野生型タバコ（右）では、同時期には開花していない様子を示す。
【００５６】
なお、３５Ｓ：：ＦＴ／ＳＲ１を台木としかつＳＲ１またはＭＭを穂木とした植物体の穂木に実った種子を、ＭＳＫプレート（１００μｇ／ｍｌ Ｋａｎａｍｙｃｉｎを含むＭＳ基本培地）に播種したが、全ての種子が死滅した。すなわち、これらの穂木からはカナマイシン耐性を有する種子が得られなかった（示さず）。これは、台木に導入された遺伝子の穂木への伝搬はみられなかったことを示す。
【産業上の利用可能性】
【００５７】
本発明の方法を用いることにより、従来よりも短期間で品種改良植物を作製することができるので、農作物の生産に大いに貢献できる。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】ＦＴ遺伝子を導入したＦＴ形質転換体を台木としかつ野生型ＳＲ１を穂木とした植物体における、長日条件下での開花の様子を示す図である。
【図２】ＦＴ遺伝子を導入したＦＴ形質転換体を台木としかつＭＭを穂木とした植物体における、長日条件下での開花の様子を示す図である。
【図３】野生型ＳＲ１の、長日条件下での開花の様子を示す図である。
【図４】野生型ＳＲ１を台木としかつＭＭを穂木とした植物体における、長日条件下では開花しない様子を示す図である。
【図５】同一条件下（長日条件下）にて同一期間生育させたＦＴ形質転換体（左）および野生型タバコ（右）における開花の状態を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＦＴ遺伝子が導入されている形質転換体植物である台木に非形質転換体植物を穂木として接ぎ木する工程および穂木にて交配する工程を包含することを特徴とする植物の品種改良の時間を短縮する方法。
【請求項２】
ＦＴ遺伝子を導入して形質転換体植物を作製する工程をさらに包含することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記形質転換体植物および前記非形質転換体植物が同一種に由来することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記非形質転換体植物が野生型であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ＦＴ遺伝子が導入されている形質転換体植物を備えていることを特徴とする植物の品種改良の時間を短縮するためのキット。
【請求項６】
植物に導入可能な形態であるＦＴ遺伝子構築物および該ＦＴ遺伝子構築物を導入するための植物を備えていることを特徴とする植物の品種改良の時間を短縮するためのキット。
【請求項１】
ＦＴ遺伝子が導入されている形質転換体植物である台木に非形質転換体植物を穂木として接ぎ木する工程および穂木にて交配する工程を包含することを特徴とする植物の品種改良の時間を短縮する方法。
【請求項２】
ＦＴ遺伝子を導入して形質転換体植物を作製する工程をさらに包含することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記形質転換体植物および前記非形質転換体植物が同一種に由来することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記非形質転換体植物が野生型であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ＦＴ遺伝子が導入されている形質転換体植物を備えていることを特徴とする植物の品種改良の時間を短縮するためのキット。
【請求項６】
植物に導入可能な形態であるＦＴ遺伝子構築物および該ＦＴ遺伝子構築物を導入するための植物を備えていることを特徴とする植物の品種改良の時間を短縮するためのキット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２００７−２０２４４１（Ｐ２００７−２０２４４１Ａ）
【公開日】平成１９年８月１６日（２００７．８．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−２３５０１（Ｐ２００６−２３５０１）
【出願日】平成１８年１月３１日（２００６．１．３１）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り ２００５年１１月２５日 第２８回日本分子生物学会年会組織委員会発行の「第２８回日本分子生物学会年会講演要旨集」に発表
【出願人】（５０３３６０１１５）独立行政法人科学技術振興機構 (1,734)
【出願人】（５９１０６０９８０）岡山県 (96)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年８月１６日（２００７．８．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１月３１日（２００６．１．３１）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り ２００５年１１月２５日 第２８回日本分子生物学会年会組織委員会発行の「第２８回日本分子生物学会年会講演要旨集」に発表
【出願人】（５０３３６０１１５）独立行政法人科学技術振興機構 (1,734)
【出願人】（５９１０６０９８０）岡山県 (96)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]