植物由来のＶＬＰを調製する方法
植物由来のウイルス様粒子（ＶＬＰ）を調製する方法を提供する。該方法は、植物またはアポプラスト局在ＶＬＰを含む植物材料を得て、植物または植物材料からプロトプラスト／スフェロプラスト画分およびアポプラスト画分を生産し、アポプラスト画分を回収することを含み得る。アポプラスト画分は、植物由来のＶＬＰを含む。あるいは、ＶＬＰは、消化された画分を生産するための細胞壁分解酵素組成物を使用して植物材料を消化することにより、植物由来のＶＬＰを含む植物または植物材料から得ることができる。消化された画分を濾過し、濾過された画分を生産し、植物由来のＶＬＰを濾過された画分から回収する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、植物由来のウイルス様粒子（ＶＬＰ）を調製する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
宿主細胞、例えば、大腸菌、昆虫細胞培養および哺乳動物細胞培養における現行の組換え発現戦略は、培養培地中で非常に高レベルでタンパク質を発現させ、分泌させる。これらの系を使用して、高レベルの発現、適当なタンパク質フォールディングおよびタンパク質の翻訳後修飾をなし遂げる。さらに、細胞内タンパク質が他の成分（ＤＮＡ、小胞、膜、色素など）から容易に分離され得るため、発現されたタンパク質の精製は簡単にされる。植物または酵母発現系において、細胞壁は、培養培地への発現されたタンパク質の分泌を防止する。
【０００３】
ウイルス感染に対抗する主な方法の１つは、ワクチン接種による方法である。突発的発生または流行病に対するワクチン、または季節的需要（例えば、秋に起こる毎年の「インフルエンザのシーズン」、または世界中で発見された最近の「豚インフルエンザ」発生）に合うワクチンの生産は、与えられた短い通知期間中に十分な量のワクチンの生産が必要である。インフルエンザワクチンの現在の世界的生産量は、世界中でのインフルエンザの大流行に直面して不十分であり得る。さらに、毎年、優勢なインフルエンザ株は変化し、したがって、その年に必要度の低い貯蔵は実用的ではない。有効なインフルエンザワクチンの経済的な大規模生産は非常に価値がある。
【０００４】
ウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、インフルエンザワクチンを製造するために使用され得る。超構造物、例えば、ＶＬＰは、ウイルスカプシドの構造を模倣するが、ゲノムを欠いており、したがって複製できないか、または二次感染のための手段を提供できない。ＶＬＰは、強い免疫応答を刺激するための単離された（可溶性）組換え抗原の改良された代替品を提供する。ＶＬＰは、特定のウイルスタンパク質の発現時にアセンブリーし、同種のウイルスに類似している外面を呈示するが本当のウイルス粒子とは違って遺伝物質を組み込まない。天然のウイルスと同様の粒子および多価構造における抗原の提示は、バランスのとれた体液性および細胞性成分を伴う免疫応答の刺激増強をなし遂げる。単離された抗原による刺激を越えるこのような改良は、エンベロープＶＬＰが天然の膜結合状態において表面抗原呈示するので、エンベロープウイルスに特に当てはまると考えられる（Grgacic and Anderson, 2006, Methods 40, 60-65）。さらに、ナノ粒子組織を有するインフルエンザＶＬＰは、組換え血球凝集素（ＨＡ）（すなわち、モノマーＨＡまたはロゼットに組織化されたＨＡ；ＨＡの３−８のトリマーのアセンブリー）と比較して、より良いワクチン候補物であることが示されており、それらは体液性および細胞性免疫応答の両方を活性化することができる（Bright, R.Aら 2007, Vaccine 25, 3871-3878）。
【０００５】
現在市販の大多数のインフルエンザワクチンは、卵培養ビリオンから得られたウイルス粒子またはウイルス抗原からなる。卵由来のワクチンの生産は、孵化鶏卵中での生ウイルスの培養に頼る。スプリットインフルエンザワクチンは、デタージェントでの精製されたビリオンの化学的不活性化および破壊後に得られる。組換えインフルエンザ抗原は、パンデミックワクチン製品としてウイルス由来の抗原の有効な代替品である。組換え抗原は、新規株の遺伝子構造上の情報がいったん利用可能となれば、該情報から組換え抗原を製造することができ、生産過程の迅速な開始を可能にする。しかしながら、精製された組換えＨＡサブユニットは、不活性化スプリットインフルエンザワクチンよりも有効性が低いようであり、より高い抗原含量が、強力な免疫応答を産生するために必要である（Treanorら 2007, J. Am. Med. Assoc. 297, 1577-1582）。
【０００６】
インフルエンザＶＬＰは、培養された哺乳動物細胞において、全１０個のインフルエンザタンパク質の共発現から得られている（Menaら 1996, J. Virol. 70, 5016-5024）。いくつかのウイルスタンパク質は、ＶＬＰの生産のために不必要であり、ワクチン開発プログラムにおけるインフルエンザＶＬＰは、２つの主要な抗原性エンベロープタンパク質（ＨＡおよびＮＡ）とＭ１との共発現から、またはＨＡとＭ１のみとの共発現から生産されている（Kangら 2009, Virus Res. 143, 140-146）。Ｃｈｅｎら（2007, J. Virol. 81, 7111-7123）は、ＨＡ単独がＶＬＰ形成および出芽を駆動することができ、Ｍ１共発現をそれらの系において省くことができることを示している。しかしながら、ＨＡがＶＬＰを生産する哺乳動物細胞の表面上でシアル化糖タンパク質に結合することが見出されたため、ウイルスシアリダーゼは共発現され、出芽後、生産細胞からＶＬＰの放出を可能にした。
【０００７】
単純ＶＬＰ生産系、例えば、非構造ウイルスタンパク質の発現を必要としない１つまたは少しのウイルスタンパク質のみの発現に頼るものがワクチンの開発を加速するために望ましい。植物系におけるＶＬＰを含むウイルス抗原の生産は、植物が温室または野外において生長することが可能であり、無菌組織培養方法および処理の必要がない点において有利である。
【０００８】
ＰＣＴ公開ＷＯ２００６／１１９５１６（ＷｉｌｌｉａｍｓｏｎおよびＲｙｂｉｃｋｉによる）は、植物におけるインフルエンザＡ／ベトナム／１１９４／２００４の全長および切断ヒトコドン最適Ｈ５ ＨＡの発現を記載している。切断構築物は、膜固定ドメインを欠いている。ＨＡタンパク質の最大蓄積は、ＥＲに標的化する構築物で得られた。膜標的ドメインを欠いている構築物は検出可能なＨＡを生じなかった。ＶＬＰの生産は報告されなかった。
【０００９】
脂質エンベロープを含むインフルエンザＨＡ ＶＬＰの生産は、ＷＯ２００９／００９８７６およびＷＯ２００９／０７６７７８において本発明者らにより以前に記載されている（D'Aoustらによる；これら両方を出典明示により本明細書に包含させる）。エンベロープウイルスにおいて、脂質層または膜がウイルスにより保持されることが有利であり得る。脂質の組成は、系によって変化し得（例えば、植物生産エンベロープウイルスは、エンベロープ中に植物脂質または植物ステロールを含むであろう）、改善された免疫応答に寄与し得る。
【００１０】
ＨＢＶ表面抗原（ＨＢｓＡｇ）を発現するトランスジェニックタバコにおけるエンベロープＶＬＰのアセンブリーは、Masonら(1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 11745-11749)により記載された。植物生産ＨＢＶ ＶＬＰは、非経口的に投与されたとき、マウスにおいて強力なＢおよびＴ細胞免疫応答を誘導することが示されたが（Huangら 2005, Vaccine 23, 1851-1858）、摂取を介する経口免疫化試験のみが適度の免疫応答を誘導した（Smithら 2003, Vaccine 21, 4011-4021）。Ｇｒｅｃｏ（2007, Vaccine 25, 8228-8240）は、ＨＢｓＡｇとの融合におけるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）エピトープが、トランスジェニックタバコおよびシロイヌナズナにおいて発現されるとき、ＶＬＰとして蓄積し、二価ＶＬＰワクチンを作ることを示した。
【００１１】
トランスジェニックタバコおよびジャガイモ植物におけるウイルスカプシドタンパク質（ＮＶＣＰ）の発現は、非エンベロープＶＬＰのアセンブリーをもたらした（Masonら 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 5335-5340）。ＮＶＣＰ ＶＬＰは、アグロインフィルトレーションされたベンサミアナタバコ(N. benthamiana)の葉において生産され（Huangら 2009, Biotechnol. Bioeng. 103, 706-714）、経口投与時のそれらの免疫原性はマウスにおいて証明された（Santiら 2008, Vaccine 26, 1846-1854）。ＶＬＰの形態における２１５−７５１μｇのＮＶＣＰを含む生のジャガイモの健常成人ボランティアへの２または３回の投与は、免疫化されたボランティアの９５％において免疫応答の発生をもたらした（Tacketら 2000, J. Infect. Dis. 182, 302-305）。非エンベロープＶＬＰは、また、ＨＢＶコア抗原（ＨＢｃＡｇ；Huangら 2009, Biotechnol. Bioeng. 103, 706-714）およびヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）主要カプシドタンパク質Ｌ１（Varsaniら 2003, Arch. Virol. 148, 1771-1786）の発現から得られている。
【００１２】
ＶＬＰをワクチン製剤において使用する前に、植物または植物材料に存在するいくつか、または全てのタンパク質、炭水化物などからＶＬＰを分離することが望ましいかもしれない。興味あるタンパク質を含む間質液抽出物を提供するために減圧および遠心分離処理を含む、植物の細胞間隙からタンパク質を抽出するための方法は、ＰＣＴ公開ＷＯ００／０９７２５（Ｔｕｒｐｅｎらによる）に記載されている。このアプローチは、減圧および遠心分離下で孔を通過する小型タンパク質（５０ｋＤａまたはそれより小さい）に対して適当であるが、大型超構造(superstructure)タンパク質またはタンパク質複合体、例えば、ＶＬＰに対して適当ではない。
【００１３】
McCormickら 1999 (Proc Natl Acad Sci USA 96:703-708)は、発現されたタンパク質を細胞外区画へ標的化するための一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）エピトープに融合されたイネアミラーゼシグナルペプチドの使用、次にｓｃＦｖポリペプチドの回収のための葉および茎組織の減圧浸潤を記載している。Moehnkeら 2008 (Biotechnol Lett 30:1259-1264)は、アポプラスト抽出を使用してタバコから組換え植物アレルゲンを得るためのＭｃＣｏｒｍｉｃｋの減圧浸潤方法の使用を記載している。ＰＣＴ公開ＷＯ２００３／０２５１２４（Ｚｈａｎｇらによる）は、植物において、マウスシグナル配列を使用してアポプラスト間隙に標的化するｓｃＦｖ免疫グロブリンの発現を記載している。
【００１４】
ＶＬＰの複雑さ、およびそれらを生産し得る植物組織を考慮すると、植物タンパク質を含まないか、または植物タンパク質から容易に分離され、エンベロープウイルスの構造および免疫原性特性を保持したままであるＶＬＰを調製する方法が望ましい。
【発明の概要】
【００１５】
発明の概要
本発明は、植物由来のウイルス様粒子（ＶＬＰ）を調製する方法に関する。さらに具体的に、本発明は、インフルエンザ抗原を含むＶＬＰを調製する方法に関する。
【００１６】
本発明の目的は、植物由来のウイルス様粒子を調製する改良された方法を提供することにある。
【００１７】
本発明は、アポプラスト内に局在している植物由来のＶＬＰを含む植物または植物材料を得て；プロトプラストおよびアポプラスト画分を生産し、該アポプラスト画分は、植物由来のＶＬＰを含み；アポプラスト画分を回収することを含む、植物由来のＶＬＰを調製する方法（Ａ）を提供する。該方法は、アポプラスト画分から植物由来のＶＬＰを精製する工程をさらに含み得る。植物由来のＶＬＰは、キメラ植物由来のＶＬＰであり得る。植物由来のＶＬＰは、ウイルスエンベロープタンパク質、ウイルス構造タンパク質、ウイルスカプシドタンパク質、およびウイルスコートタンパク質の群から選択され得る。植物由来のＶＬＰは、インフルエンザの血球凝集素を含み得る。
【００１８】
アポプラストおよびプロトプラスト画分は、酵素組成物による植物または植物材料の処理により生産され得る。酵素組成物は、１つもしくはそれ以上のペクチナーゼ、１つもしくはそれ以上のセルラーゼ、または、１つもしくはそれ以上のペクチナーゼおよび１つもしくはそれ以上のセルラーゼを含み得る。さらに、所望により、酵素組成物は、リパーゼまたはプロテアーゼを含まないか、または該組成物は、添加されたリパーゼまたはプロテアーゼを含まない。
【００１９】
植物または植物材料は、植物を成長、回収または成長および回収することにより得ることができる。植物材料は、植物の一部または全体、１つもしくはそれ以上の植物細胞、葉、茎、根または培養された植物細胞を含み得る。
【００２０】
本発明は、上記されている植物由来のＶＬＰを調製する方法（方法Ａ）であって、ウイルスエンベロープタンパク質、ウイルス構造タンパク質、ウイルスカプシドタンパク質、およびウイルスコートタンパク質の群から選択される該ＶＬＰをコードする核酸が植物に一過性で導入される方法を提供する。あるいは、該核酸は植物のゲノム内に安定に組み込まれる。
【００２１】
本発明は、上記されている植物由来のＶＬＰを調製する方法（方法Ａ）であって、アポプラスト画分から植物由来のＶＬＰを精製する工程をさらに含む方法を提供する。精製する工程は、浄化された抽出物を生産するための深層濾過を用いるアポプラスト画分の濾過、次に、陽イオン交換樹脂を使用する浄化された抽出物のクロマトグラフィーを含み得る。
【００２２】
理論に縛られることは望まないが、翻訳後修飾されたタンパク質の中間型または種々の細胞内区画において起こる他の型のプロセッシングを含むタンパク質が、共抽出されないので、アポプラストから得られるタンパク質は、より均質である。組換えタンパク質の均質性のより高い程度は、一般的にタンパク質を含む調製物のより高い質をもたらし、より高い効力、より長い半減期またはより良い免疫原性能力を含む有益な特性を有する産物をもたらし得る。例えば、高マンノースグリコシル化を含む血液タンパク質は、複合グリコシル化を含むタンパク質よりもより迅速に血液循環中に除去される。アポプラスト画分において生産されるグリコシル化タンパク質は、さらに複合型のグリコシル化を示す。したがって、細胞壁消化を含む本明細書に記載されている方法を使用して調製されたアポプラスト由来タンパク質は、例えば、循環中のより良い半減期を示す。
【００２３】
本発明は、また、植物由来の脂質エンベロープを含む植物由来のＶＬＰを調製する方法（Ｂ）であって、アポプラスト内に局在しているＶＬＰを含む植物または植物材料を得て；植物または植物材料を酵素組成物で処理し、プロトプラスト画分および１つもしくはそれ以上のアポプラストタンパク質組成物を生産し；プロトプラスト画分から１つもしくはそれ以上のアポプラストタンパク質複合体を分離することを含み、該１つもしくはそれ以上のアポプラストタンパク質複合体は該ＶＬＰを含む方法を提供する。酵素組成物は、１つもしくはそれ以上のペクチナーゼ、１つもしくはそれ以上のセルロース、または、１つもしくはそれ以上のペクチナーゼおよび１つもしくはそれ以上のセルラーゼを含み得る。さらに、所望により、酵素組成物はリパーゼまたはプロテアーゼを含まないか、または該組成物は添加されたリパーゼまたはプロテアーゼを含まない。植物由来のＶＬＰは、キメラ植物由来のＶＬＰであり得る。植物由来のＶＬＰは、ウイルスエンベロープタンパク質、ウイルス構造タンパク質、ウイルスカプシドタンパク質、およびウイルスコートタンパク質の群から選択され得る。植物由来のＶＬＰは、インフルエンザの血球凝集素を含み得る。
【００２４】
本発明は、上記されている植物由来のＶＬＰを調製する方法（方法Ｂ）であって、ウイルスエンベロープタンパク質、ウイルス構造タンパク質、ウイルスカプシドタンパク質、およびウイルスコートタンパク質の群から選択されるＶＬＰをコードする核酸が植物に一過性で導入される方法を提供する。あるいは、該核酸は植物のゲノム内に安定に組み込まれる。
【００２５】
本発明は、上記されている植物由来のＶＬＰを調製する方法（方法Ｂ）であって、アポプラスト画分から植物由来のＶＬＰを精製する工程をさらに含む方法を提供する。精製する工程は、浄化された画分を生産するための深層濾過を用いるアポプラスト画分の濾過、次に、陽イオン交換樹脂を使用する浄化された抽出物のクロマトグラフィーを含み得る。
【００２６】
植物由来のＶＬＰは、１つ以上のインフルエンザＨＡポリペプチドを含むＶＬＰを含み得る。インフルエンザＨＡポリペプチドは、また、キメラＨＡポリペプチドであり得る。植物由来のＶＬＰは、赤血球凝集能をさらに含み得る。植物または植物材料は、植物を成長、回収または成長および回収することにより得ることができる。植物材料は、植物の一部または全体、または、１つもしくはそれ以上の植物細胞、葉、茎、根または培養細胞を含み得る。
【００２７】
本発明は、また、植物由来のＶＬＰを含む植物または植物材料を得、消化された画分を生産するために細胞壁分解酵素組成物を使用して植物材料を消化し、濾過された画分を生産するために消化された画分を濾過し、濾過された画分から植物由来のＶＬＰを回収することを含む植物由来のＶＬＰを調製する方法（Ｃ）を提供する。
【００２８】
酵素組成物は、１つもしくはそれ以上のペクチナーゼ、１つもしくはそれ以上のセルロース、または、１つもしくはそれ以上のペクチナーゼおよび１つもしくはそれ以上のセルラーゼを含み得る。さらに、所望により、酵素組成物はリパーゼまたはプロテアーゼを含まないか、または該組成物は添加されたリパーゼまたはプロテアーゼを含まない。植物由来のＶＬＰは、キメラ植物由来のＶＬＰであり得る。植物由来のＶＬＰは、ウイルスエンベロープタンパク質、ウイルス構造タンパク質、ウイルスカプシドタンパク質、およびウイルスコートタンパク質の群から選択され得る。植物由来のＶＬＰは、インフルエンザの血球凝集素を含み得る。
【００２９】
本発明は、上記されている植物由来のＶＬＰを調製する方法（方法Ｃ）であって、ウイルスエンベロープタンパク質、ウイルス構造タンパク質、ウイルスカプシドタンパク質、およびウイルスコートタンパク質の群から選択されるＶＬＰをコードする核酸が植物に一過性で導入される方法を提供する。あるいは、該核酸は植物のゲノム内に安定に組み込まれる。
【００３０】
本発明は、上記されている植物由来のＶＬＰを調製する方法（方法Ｃ）であって、細胞残屑および不溶性材料から濾過された画分中のＶＬＰを分離する工程をさらに含む方法を提供する。分離する工程は、浄化された画分を生産するための遠心分離、深層濾過、または遠心分離および深層濾過の両方により行われ得る。植物由来のＶＬＰは、クロマトグラフィーによりさらに精製され得る、例えば、浄化された抽出物は陽イオン交換樹脂を使用して精製され得る。
【００３１】
植物由来のＶＬＰは、１つ以上のインフルエンザＨＡポリペプチドを含むＶＬＰを含み得る。インフルエンザＨＡポリペプチドは、また、キメラＨＡポリペプチドであり得る。植物由来のＶＬＰは、赤血球凝集能をさらに含み得る。植物または植物材料は、植物を成長、回収または成長および回収することにより得ることができる。植物材料は、植物の一部または全体、または、１つもしくはそれ以上の植物細胞、葉、茎、根または培養細胞を含み得る。
【００３２】
理論に縛られることは望まないが、植物由来の脂質を含む植物製ＶＬＰは、他の製造系において製造されたＶＬＰよりも強い免疫反応を誘導し得、生または弱毒化全ウイルスワクチンにより誘導される免疫反応と比較したとき、これらの植物製ＶＬＰにより誘導される免疫反応はより強い。
【００３３】
宿主細胞から得られるタンパク質抽出物の組成物は、複雑であり、一般的に、単離される興味あるタンパク質または超構造と共に細胞間および細胞内成分を含む。興味あるタンパク質または超構造を豊富にすることができ、調製過程内での効率を増加することができるので、アポプラスト画分の調製、次いで、細胞内タンパク質および成分を分離する工程は、有利である。より少ない効率的な工程を含む単純な過程を有することは、有意な収率の増加およびコスト削減をもたらし得る。たとえ、プロトプラストが抽出処理中に無傷のままでないとしても、細胞壁分解酵素を使用して細胞壁を消化する工程がＶＬＰタンパク質の収率を増加させることも見出された。理論に縛られることは望まないが、細胞壁消化の工程は、細胞壁のポリマー成分をほどき、細胞壁内に結合されたＶＬＰの放出を助け得る。このプロトコールは、また、細胞内成分内のＶＬＰの汚染を最小限にし得る。
【００３４】
植物細胞壁を消化する方法は知られており、細胞壁を消化する酵素カクテル混合物は変化し得る。本発明は、使用された細胞壁消化方法により限定されない。
【００３５】
本明細書に記載されている方法は、均質化、混合または粉砕を含む植物由来のＶＬＰを調製するための方法と比較したとき、植物由来のＶＬＰ抽出物のより少ない破壊および汚染をもたらす。本明細書に記載されている方法は、植物組織のアポプラスト画分を提供し、プロトプラストおよびそれらの成分の完全性を維持し得る。本明細書に記載されている方法は、たとえ、プロトプラストまたはプロトプラストの一部が、それらの完全性をなくし、もはや無傷でなくても、ＶＬＰを精製することにおいて有効である。
【００３６】
これらの方法は、標準的な組織破壊技術、例えば、均質化、混合または粉砕を含むＶＬＰ抽出方法と比較したとき、ＶＬＰのより高い収率を提供する。より良い収率は、一部分において、ＶＬＰおよび／または脂質エンベロープの構造的完全性を破壊するせん断力の減少に起因し得る。アポプラスト画分からのＶＬＰの調製は、アポプラスト画分が細胞質タンパク質を有意に減少しているか、または該タンパク質を有さないため、有利であり得る。したがって、アポプラスト画分中の他のタンパク質および物質からのＨＡのモノマー、ＨＡのトリマーまたはフラグメントを含むＶＬＰの分離は、容易に行われる。しかしながら、ＶＬＰの収率の増加はまた、たとえ、プロトプラスト調製物またはプロトプラスト調製物の一部が無傷でなくても、本明細書に記載されている方法を使用して得ることができる。
【００３７】
本発明のＶＬＰは、また、標準的な組織破壊技術を使用して得られるものよりも、より良い赤血球凝集能を示すと特徴付けられる。この改良された赤血球凝集能は、無傷なＶＬＰ（溶液中に遊離するわずかなＨＡモノマーまたはトリマー）のより良い収率、無傷な脂質エンベロープを有する無傷なＶＬＰのより良い収率、またはそれらの組合せに起因し得る。
【００３８】
ＶＬＰを使用して製造されたワクチンは、全ウイルスを使用して製造されたワクチンと比較して、非感染性であるという利点を提供する。したがって、生物学的封じ込めは、問題ではなく、製造のために必要でない。植物製ＶＬＰは、発現系を温室または野外において生育可能とすることによるさらなる利点を提供し、したがって、有意により経済的であり、スケールアップのために適当である。
【００３９】
さらに、植物は、シアル酸残基の合成および該残基のタンパク質への付加に関与する酵素を含まない。ＶＬＰは、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）の非存在下で生産することができ、植物中でのＶＬＰ生産を確実にするために、ＮＡを共発現する、または生産細胞をシアリダーゼ（ノイラミニダーゼ）で処理もしくは抽出する必要がない。
【００４０】
この発明の概要は、必ずしも、本発明の全ての特徴を記載していない。
【００４１】
本発明のこれらのおよび他の特徴は、図面について言及する以下の記載からさらに明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】図１は、Ｈ５ Ａ／インドネシア／５／０５ 血球凝集素の発現のためのＣＰＭＶＨＴベースの発現カセット（構築物６８５）の略図を示す。
【００４３】
【図２】図２は、Ａ）ＰａｃＩ（３５Ｓプロモーターの上流）からＡｓｃＩ（ＮＯＳターミネーターのすぐ下流）のＨ５／インド（構築物番号６８５）を発現する構築物の一部の核酸配列（配列番号１）を示す。Ａ／インドネシア／５／２００５由来のＨ５のコード配列は下線を引いている。図２Ｂは、構築物番号６８５によってコードされるＨ５ Ａ／インドネシア／５／０５ 血球凝集素のアミノ酸配列（配列番号２）を示す。
【００４４】
【図３Ａ】図３は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）による血球凝集素（ＨＡ）含有構造物の特性化を示す。消化された植物抽出物の遠心分離後に、ペレットを再懸濁し、ＳＥＣにより分別する。図３Ａは、画分あたりの全可溶性タンパク質含有量を示す（塗りつぶされた三角形；最大％、左側 Ｙ軸；Ｂｒａｄｆｏｒｄ法を使用して決定された）。回収された画分の赤血球凝集能（塗りつぶされた棒；右側 Ｙ軸）も示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、ＳＥＣで溶出された画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。画分をアセトンにより沈殿させ、分析前に１／４０容量の還元サンプルローディングバッファー中に再懸濁した。ゲルを０．１％のＣｏｏｍａｓｓｉｅＲ−２５０溶液で染色した。精製されたＶＬＰを対照として用いた。ＨＡ０モノマーに対応するバンドは、矢印により示されている。ＭＷ−分子量標準（ｋＤａ）；Ｃ−精製されたＶＬＰ（対照）；レーン７から１０および１４から１６は、図３Ａに示されているＳＥＣ分析から溶出された画分番号に対応する。
【００４５】
【図４】図４は、酵素消化後に、およびＣｏｍｉｔｒｏｌＴＭホモジェナイザーを使用する機械的均質化により得られるタンパク質プロフィールの比較を示す。サンプルを変性サンプルローディングバッファー中で処理し、タンパク質を溶出画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により分離した。ゲルを０．１％のＣｏｏｍａｓｓｉｅ Ｒ−２５０溶液で染色した。ＭＷ−分子量標準（ｋＤａ）；レーン１−２５μｌの酵素混合物；レーン２−２５μｌの植物組織の酵素消化物およびレーン３−５μｌのＣｏｍｉｔｒｏｌホモジェナイザーで得られた抽出物。
【００４６】
【図５】図５は、アルファルファプラストシアニンプロモーターおよび５’ＵＴＲ、Ａ／インドネシア／５／２００５由来のＨ５の血球凝集素コード配列（構築物＃６６０）、アルファルファプラストシアニン３’ＵＴＲおよびターミネーター配列を含むＨＡ発現カセットの核酸配列（配列番号：９）を示す。
【００４７】
【図６】図６は、アポプラスト画分中のＨＡ−ＶＬＰの分離に関する陽イオン交換樹脂上のＨＡ−ＶＬＰの直接的捕捉を示す。サンプルを非還元変性サンプルローディングバッファー中で処理し、タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。ゲルを０．１％のＣｏｏｍａｓｓｉｅＲ−２５０溶液で染色した。レーン１：遠心分離後のアポプラスト画分、レーン２−３：連続精密濾過後のアポプラスト画分；レーン４：陽イオン交換の負荷；レーン５：陽イオン交換の画分を介する流入物。レーン６；１０×濃縮された陽イオン交換からの溶出物；レーン７：分子量標準（ｋＤａ）。
【００４８】
【図７】図７は、消化バッファーへのＮａＣｌの添加なしで浄化後のＨ５／Ｉｎｄｏ ＶＬＰ（Ａ）およびＨ１／Ｃａｌ ＶＬＰ（Ｂ）ならびに上記添加後のＨ１／Ｃａｌ ＶＬＰ（Ｃ）のナノ粒子トラッキング分析（ＮＴＡ）プロフィールを示す。ＮＴＡ実験を、ＮａｎｏＳｉｇｈｔ ＬＭ２０（NanoSight, Amesbury, UK）で行った。装置は、青色レーザー（４０５ｎｍ）、サンプルチャンバーおよびＶｉｔｏｎ フルオロエラストマー ｏ−リングを備えている。室温でビデオを記録し、ＮＴＡ ２．０ ソフトウェアを使用して分析した。サンプルを６０秒間記録した。最適な粒子分解能が得られるように、シャッター(shutter)および利得(gain)を手動で選択した。
【００４９】
【図８】図８は、異なるバッファーを使用して酵素消化により産生されたＨ３／ブリズベン ＶＬＰの抽出物のウェスタンブロットを示す。レーン１）純粋な組換えＨＡ標準（５μｇ、Immune Technology Corp.製 IT-003-0042p）、レーン２から５は以下のバッファー中で行われた７μｌの遠心された酵素抽出物を含む。レーン２）６００ｍＭのマンニトール＋１２５ｍＭのクエン酸塩＋７５ｍＭのＮａＰＯ４＋２５ｍＭのＥＤＴＡ＋０．０４％の亜硫酸水素塩ｐＨ６．２、レーン３）６００ｍＭのマンニトール＋１２５ｍＭのクエン酸塩＋７５ｍＭのＮａＰＯ４＋５０ｍＭのＥＤＴＡ＋０．０４％の亜硫酸水素塩ｐＨ６．２、レーン４）２００ｍＭのマンニトール＋１２５ｍＭのクエン酸塩＋７５ｍＭのＮａＰＯ４＋２５ｍＭのＥＤＴＡ＋０．０３％の亜硫酸水素塩ｐＨ６．２、レーン５）２００ｍＭのマンニトール＋１２５ｍＭのクエン酸塩＋７５ｍＭのＮａＰＯ４＋５０ｍＭのＥＤＴＡ＋０．０３％の亜硫酸水素塩ｐＨ６．２。矢印は、ＨＡ０の免疫検出シグナルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
詳細な説明
本発明は、植物由来のウイルス様粒子（ＶＬＰ）を調製する方法に関する。さらに具体的には、本発明は、インフルエンザの血球凝集素（ＨＡ）を含むＶＬＰを調製する方法に関する。
【００５１】
以下の記載は、好ましい態様である。
【００５２】
本発明は、興味あるタンパク質またはタンパク質超構造物を得るための方法を提供する。興味あるタンパク質は、プロトプラスト／スフェロプラスト区画を除外する植物細胞部分に対応するアポプラストまたは細胞外区画に存在し得る。該方法は、植物細胞を囲むセルロース植物細胞壁を除去、消化または消化および除去の両方をすることを含む。細胞壁を消化することにより、細胞壁のポリマー成分はほどかれ、興味あるタンパク質またはタンパク質超構造物は、より容易に放出され得る。この方法を使用することにより、主に宿主細胞タンパク質および成分を含むプロトプラスト／スフェロプラスト区画がアポプラストから分離されるため、興味あるタンパク質またはタンパク質超構造物は豊富になる。以下に記載されているとおり、本明細書において提供される方法は、処理中、プロトプラスト／スフェロプラスト区画の完全性を喪失するとき、プロトプラスト／スフェロプラスト区画が無傷でないとき、および、プロトプラスト／スフェロプラスト区画由来の宿主細胞タンパク質および成分の一部がアポプラスト画分に存在するとき、興味あるタンパク質またはタンパク質超構造物を得ることにおいてなお有効である。
【００５３】
タンパク質超構造物の例は２つ以上のポリペプチドからなる構造物であり；該ポリペプチドは同じであるか、または異なっていてよく；異なるとき、それらは、約１：１から約１０：１またはそれ以上の比率で存在し得る。タンパク質超構造物は、１つ以上の脂質、リン脂質、核酸、膜などをさらに含み得る。２つ以上のポリペプチドは、共有結合、ジスルフィド架橋、電荷相互作用、疎水性引力、ファン・デル・ワールス力、水素結合などにより結合され得る。タンパク質超構造物の例は、エンベロープまたは非エンベロープのウイルス様粒子（ＶＬＰ）、例えば、ウイルスエンベロープタンパク質、ウイルス構造タンパク質、ウイルスカプシドタンパク質、またはウイルスコートタンパク質である。
【００５４】
本発明は、また、植物由来のウイルス様粒子（ＶＬＰ）を調製する方法を提供する。該方法は、アポプラスト内に局在される植物由来のＶＬＰを含む植物または植物材料を得て、植物材料からプロトプラスト／スフェロプラスト画分およびアポプラスト画分を生産し、ここで、該アポプラスト画分は植物由来のＶＬＰを含み、アポプラスト画分を回収することを含む。所望により、植物由来のＶＬＰは、アポプラスト画分から精製され得る。
【００５５】
本発明は、また、植物由来の脂質エンベロープを含むＶＬＰを調製する方法を提供する。該方法は、ＶＬＰを含む植物または植物材料を得て、植物または植物材料を酵素組成物で処理して、１つもしくはそれ以上のアポプラストタンパク質複合体およびプロトプラスト／スフェロプラスト画分を生産し、プロトプラスト画分から１つもしくはそれ以上のアポプラストタンパク質複合体を分離することを含む。１つもしくはそれ以上のアポプラストタンパク質複合体は、植物由来の脂質エンベロープを含むＶＬＰを含む。
【００５６】
本発明は、また、植物由来のＶＬＰを含む植物または植物材料を得て、細胞壁分解酵素組成物を使用して植物材料を消化して消化された画分を生産し、消化された画分を濾過して濾過された画分を生産し、濾過された画分から植物由来のＶＬＰを回収することを含む、植物由来のＶＬＰを調製する方法を提供する。この方法において、プロトプラストの完全性は必要ではないかもしれない。
【００５７】
プロトプラストは、細胞壁が完全に、または部分的に除去された植物細胞である。スフェロプラストは、細胞壁の部分的除去を有し得る。プロトプラスト、スフェロプラストまたはプロトプラストおよびスフェロプラストの両方（プロトプラスト／スフェロプラスト）は、本明細書に記載されているとおりに使用され得、本明細書において使用される該用語は互換可能である。細胞壁は機械的に破壊および除去され得るか（例えば、均質化、混合を介して）、細胞壁は完全に、または部分的に酵素的に消化され得るか、または細胞壁は機械的および酵素的方法の組合せ、例えば、均質化、次に細胞壁の消化のための酵素での処理を使用して除去され得る。プロトプラストは、また、培養された植物細胞、例えば、液体培養された植物細胞または固体培養された植物細胞から得ることができる。
【００５８】
植物組織培養、培養された植物細胞およびプロトプラスト、スフェロプラストなどの生産の一般原理を記載している標準参考文献は、植物組織培養に関する入門書、MK Razdan 2nd Ed.(Science Publishers, 2003；これを出典明示により本明細書に包含させる）、または例えば、以下のＵＲＬ：molecular-plant-biotechnology.info/plant-tissue-culture/protoplast-isolation.htmを含む。プロトプラスト（またはスフェロプラスト）生産および操作に関する方法および技術は、例えば、Davey MRら 2005 (Biotechnology Advances 23:131-171；これを出典明示により本明細書に包含させる）に記載されている。タンパク質生化学、分子生物学などの一般的な方法および原理を記載している標準参考文献は、例えば、Ausubelら Current Protocols In Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York (1998 and Supplements to 2001；これを出典明示により本明細書に包含させる）；Sambrookら Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York, 1989（これを出典明示により本明細書に包含させる）；Kaufmanら Eds., Handbook Of Molecular And Cellular Methods In Biology And Medicine, CRC Press, Boca Raton ,1995（これを出典明示により本明細書に包含させる）；McPherson, Ed., Directed Mutagenesis: A Practical Approach, IRL Press, Oxford, 1991（これを出典明示により本明細書に包含させる）を含む。
【００５９】
プロトプラストまたはスフェロプラストの遊離のために植物細胞壁を消化または破壊するための酵素は、当業者に知られており、セルラーゼ（ＥＣ ３．２．１．４）、ペクチナーゼ（ＥＣ ３．２．１．１５）、キシラナーゼ（ＥＣ ３．２．１．８）、キチナーゼ（ＥＣ ３．２．１．１４）、ヘミセルラーゼまたはそれらの組合せを含み得る。適当な酵素の非限定的な例は、セルラーゼ、ヘミセルラーゼおよびペクチナーゼを含む多成分酵素混合物、例えば、ＭＡＣＥＲＯＺＹＭＥＴＭ（おおよそ：セルラーゼ：０．１Ｕ／ｍｇ、ヘミセルラーゼ：０．２５Ｕ／ｍｇ、およびペクチナーゼ：０．５Ｕ／ｍｇを含む）を含む。市販の酵素、酵素混合物および供給者の他の例は、表１に記載されている（植物組織培養に関する入門書参照、MK Razdan 2nd Ed.., Science Publishers, 2003による）。
【００６０】
セルラーゼの別名および型は、エンド−１，４−β−Ｄ−グルカナーゼ；β−１，４−グルカナーゼ；β−１，４−エンドグリカンヒドロラーゼ；セルラーゼＡ；セルロシンＡＰ；エンドグルカナーゼＤ；アルカリセルラーゼ；セルラーゼＡ３；セルデキストリナーゼ；９．５セルラーゼ；アビセラーゼ；パンセラーゼＳＳおよび１，４−（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカン４−グルカノヒドロラーゼを含む。ペクチナーゼ（ポリガラクツロナーゼ）の別名および型は、ペクチン分解酵素；ペクチナーゼ；エンドポリガラクツロナーゼ；ペクトラーゼ；ペクチンヒドロラーゼ；ペクチンポリガラクツロナーゼ；エンド−ポリガラクツロナーゼ；ポリ−α−１，４−ガラクツロニドグリカノヒドロラーゼ；エンドガラクツロナナーゼ；エンド−Ｄ−ガラクツロナナーゼおよびポリ（１，４−α−Ｄ−ガラクツロニド）グリカノヒドロラーゼを含む。キシラナーゼの別名および型は、ヘミセルラーゼ、エンド−（１→４）−β−キシラン４−キシラノヒドロラーゼ；エンド−１，４−キシラナーゼ；キシラナーゼ；β−１，４−キシラナーゼ；エンド−１，４−キシラナーゼ；エンド−β−１，４−キシラナーゼ；エンド−１，４−β−Ｄ−キシラナーゼ；１，４−β−キシランキシラノヒドロラーゼ；β−キシラナーゼ；β−１，４−キシランキシラノヒドロラーゼ；エンド−１，４−β−キシラナーゼ；β−Ｄ−キシラナーゼを含む。キチナーゼの別名および型は、キトデキストリナーゼ；１，４−β−ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ；ポリ−β−グルコサミニダーゼ；β−１，４−ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ；ポリ［１，４−（Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド）］グリカノヒドロラーゼを含む。
【００６１】
表１：プロトプラスト単離のための市販の酵素の非限定的な例
【表１】
【００６２】
特定の酵素または酵素の組合せおよび濃度および反応条件の選択は、ＶＬＰを含むプロトプラストおよびアポプラスト画分が得られる使用される植物組織の型に依存し得る。セルラーゼ、ヘミセルラーゼおよびペクチナーゼ、例えば、ペクチナーゼ ＭＡＣＥＲＯＺＹＭＥＴＭまたはマルチフェクトの混合物は、０．０１％から２．５％（ｖ／ｖ）の範囲の濃度、例えば、０．０１、０．０２、０．０４、０．０６、０．０８、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４または２．５％（ｖ／ｖ）またはそれらの間の任意の量で使用され得る。ＭＡＣＥＲＯＺＹＭＥＴＭまたはマルチフェクトは、単独で、または他の酵素、例えば、セルラーゼ、ペクチナーゼ、ヘミセルラーゼ、またはそれらの組合せと組み合わせて使用され得る。セルラーゼは、０．１％から５％の範囲の濃度、例えば、０．１、０．２５、０．５、０．７５、１．０、１．２５、１．５、１．７５、２．０、２．２５、２．５、２．７５．３．０．３．２５、３．５、３．７５、４．０、４．２５、４．５、４．７５、５．０％（ｗ／ｖ）またはそれらの間の任意の量で使用され得る。
【００６３】
酵素溶液（細胞壁を破壊する組成物、消化する溶液とも称される）は、一般的に、バッファーまたはバッファー系、浸透圧調節物質、および１つもしくはそれ以上の塩、二価の陽イオンまたは他の添加剤を含む。バッファーまたはバッファー系は、酵素活性およびタンパク質またはＶＬＰの安定性に適当な範囲におけるｐＨ、例えば、約ｐＨ５．０から約８．０の範囲内またはそれらの間の任意の値のｐＨを維持するように選択される。使用される選択されたｐＨは、回収されるＶＬＰに依存して変化し得、例えば、ｐＨは、５．０、５．２、５．４、５．６、５．８、６．０、６．２、６．４、６．６、６．８、７．０、７．２、７．４、７．６、７．８、８．０またはそれらの間の任意のｐＨであり得る。バッファーまたはバッファー系の例は、限定はしないが、ＭＥＳ、リン酸塩、クエン酸塩などを含む。１つ以上のバッファーまたはバッファー系は、酵素溶液（消化する溶液）中で混合され得；１つ以上のバッファーは、０ｍＭから約２００ｍＭの濃度またはそれらの間の任意の量、例えば、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０または１９０ｍＭまたはそれらの間の任意の量で存在し得る。適合性に依存して、浸透圧調節物質成分を所望により加えることができる。浸透圧調節物質およびその濃度は、酵素溶液の浸透力を上げるために選択される。浸透圧調節物質の例は、マンニトール、ソルビトールまたは他の糖アルコール、種々のポリマー長のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などを含む。浸透圧調節物質の濃度範囲は、植物種、使用される浸透圧調節物質の型および選択される植物組織の型（元の種または器官、例えば、葉または茎）に依存して変化し得る。一般的に、該範囲は、０Ｍから約０．８Ｍ、例えば、０．０５、０．１、０．１５、０．２、０．２５、０．３、０．３５、０．４、０．５、０．６、０．７または０．７５Ｍまたはそれらの間の任意の量、例えば、０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００ｎＭのマンニトールまたはそれらの間の任意の量である。浸透圧調節物質の濃度は、また、パーセンテージ（ｗ／ｖ）として示され得る。いくつかの植物または組織型において、それは、わずかに高張性の調製物を使用するために有益であり得、細胞壁から植物細胞の細胞膜の分離を容易にし得る。浸透圧調節物質は、また、消化中に除くことができる。
【００６４】
植物消化のために設定するための別のパラメーターは温度である。温度は、消化処理中、所望により、コントロールされ得る。有用な温度範囲は、４℃から４０℃もしくはそれらの間の任意の温度、例えば、約４℃から約１５℃もしくはそれらの間の任意の温度、または、約４℃から約２２℃もしくはそれらの間の任意の温度である。選択される温度に依存して、他の消化の実験パラメーターは、最適な抽出条件を維持するために調節され得る。
【００６５】
陽イオン、塩またはそれらの両方を、例えば、二価の陽イオン、例えば、Ｃａ２＋またはＭｇ２＋を０．５−５０ｍＭまたはそれらの間の任意の量で、塩、例えば、ＣａＣｌ２、ＮａＣｌ、ＣｕＳＯ４、ＫＮＯ３などを約０から約７５０ｍＭまたはそれらの間の任意の量、例えば、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００または７５０ｍＭで、細胞膜安定性を改善するために加えられ得る。他の添加剤、例えば、キレート剤、例えば、限定はしないが、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡを約０から約２００ｍＭまたはそれらの間の任意の量、例えば、５、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００ｍＭまたはそれらの間の任意の量で、酸化を防止するための還元剤、例えば、限定はしないが、亜硫酸水素ナトリウムまたはアスコルビン酸を０．００５−０．４％またはそれらの間の任意の量、例えば、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．１５、０．２、０，２５、０．３、０．３５、０．４％またはそれらの間の任意の量、特異的酵素阻害剤（以下参照）で、所望により、葉の老化の阻害剤、例えば、シクロヘキシミド、カイネチンまたは１つ以上のポリアミンもまた、加え得る。
【００６６】
消化溶液は、また、約０から約６００ｍＭのマンニトール、約０から約５００ｍＭのＮａＣｌ、約０から約５０ｍＭのＥＤＴＡ、約１％から約２％ｖ／ｖのセルロース、約０から約１％ｖ／ｖのペクチナーゼ、約０．０３から約０．０４％のメタ重亜硫酸ナトリウム、約０から約１２５ｍＭのクエン酸塩または約０から７５ｍＭのＮａＰＯ４の１つ以上を含み得る。
【００６７】
植物材料は、植物細胞壁への酵素または酵素組成物の接触を増強するために処理され得る。例えば、葉の表皮は、酵素組成物での処理前に除去されるか、またははぎ取られ得る。植物材料は、小さな一片（手動または破砕または切断装置、例えば、Ｕｒｓｃｈｅｌ ｓｌｉｃｅｒで）に切られ得る；切断された植物材料には、部分的減圧下で酵素組成物がさらに浸潤し得る（Nishimura and Beevers 1978, Plant Physiol 62:40-43; Newellら 1998, J. Exp Botany 49:817-827）。また、酵素組成物での処置前または中に、植物材料の機械的摂動が植物組織に適用され得る（Giridharら 1989. Protoplasma 151:151-157）。さらに、培養された植物細胞、液体または固体のいずれかでの培養物は、プロトプラストまたはスフェロプラストを調製するために使用され得る。
【００６８】
リパーゼまたはプロテアーゼを欠いているか、または不活性化したリパーゼまたはプロテアーゼを有する酵素組成物を使用することが望ましいかもしれない。いくつかの態様において、１つ以上のプロテアーゼまたはリパーゼ阻害剤は、酵素組成物中に含まれ得る。リパーゼ阻害剤の例はＲＨＣ８０２６７（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）を含み；プロテアーゼ阻害剤の例はＥ−６４、Ｎａ２ＥＤＴＡ、ペプスタチン、アプロチニン、ＰＭＳＦ、ペファブロック、ロイペプチン、ベスタチンなどを含む。
【００６９】
酵素組成物中で植物材料を混合または撹拌するあらゆる適当な方法が使用され得る。例えば、植物材料を、トレイもしくはパンにおいて、または回転震盪器を介して穏やかに回転または振動させ、回転または振動ドラム中でころがし得る。プロトプラスト（および／またはスフェロプラスト）損傷を最小限にするために、それらが消化スープから除去されるまで用心すべきである。したがって、消化容器(digestion vessel)が選択されるべきである。
【００７０】
非限定的な例として、５００ｍＭのマンニトール、１０ｍのＣａＣｌ２および５ｍＭのＭＥＳ（ｐＨ５．６）中に１．５％のセルラーゼ（Ｏｎｏｚｕｋａ Ｒ−１０）および０．３７５％のＭＡＣＥＲＯＺＹＭＥＴＭを含む酵素組成物は、いくつかのタバコ組織からのプロトプラスト（またはスフェロプラスト）の生産ために使用され得る。本明細書に記載されているとおり、マンニトールの濃度は、また、約０から約５００ｍＭまたはそれらの間の任意の量で変化され得る。本明細書に記載されている情報を提供された当業者は、ＶＬＰの生産のために使用されるタバコ種または別の種の年齢および系統に対して適当な酵素組成物を決定することができる。
【００７１】
細胞壁の破壊または細胞壁の部分的消化において、プロトプラスト画分（プロトプラストおよび／またはスフェロプラストを含む）および「アポプラスト画分」が得られる。あるいは、「消化された画分」を得ることができる。以下に記載されているとおり、プロトプラスト画分の完全性は、本明細書に記載されているように高収率でタンパク質を生産するために必要でないであろう、したがって、アポプラスト画分または消化された画分は、タンパク質、例えば、限定はしないが、ＶＬＰ、ウイルスエンベロープタンパク質、ウイルス構造タンパク質、ウイルスカプシドタンパク質、ウイルスコートタンパク質の抽出のために使用され得る。
【００７２】
「アポプラスト画分」とは、プロトプラストの完全性の維持を助けるために使用され得る浸透圧調節物質および／または他の成分の存在下で、植物材料の細胞壁分解酵素を使用する酵素消化または部分的酵素消化の後に得られる画分を意味する。アポプラスト画分は、崩壊したプロトプラスト（またはスフェロプラスト）から生じるいくつかの成分を含み得る。例えば、アポプラスト画分は、約０から約５０％（ｖ／ｖ）またはそれらの間の任意の量のプロトプラスト画分由来の成分、または、０、０．１、０．５、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５もしくは５０％（ｖ／ｖ）またはそれらの間の任意の量のプロトプラスト画分由来の成分を含み得る。
【００７３】
「消化された画分」とは、植物材料の細胞壁分解酵素を使用する酵素消化または部分的酵素消化の後に残存する画分を意味し、しかしながら、プロトプラストの完全性は必要ではなく、消化された画分は無傷な、崩壊された、または、無傷かつ崩壊されたプロトプラストを含み得る。消化された画分を生産するために使用される細胞壁分解酵素を含む組成物は、浸透圧調節物質を含み得るか、または浸透圧調節物質は、プロトプラストを得るために使用される標準手順に存在する量と比較したとき少ない量で存在し得るか、または浸透圧調節物質は、組成物に非存在であり得る。消化された画分はアポプラスト画分およびプロトプラスト／スフェロプラスト画分を含むが、しかしながら、プロトプラスト／スフェロプラスト画分は無傷であるか、または無傷でないかもしれない。消化された画分は、細胞内成分および細胞外成分を含む。浸透圧調節物質がプロトプラスト／スフェロプラストを無傷で維持するために使用されるとき、細胞内成分は、プロトプラスト／スフェロプラストの形態において見いだされ得る。浸透圧調節物質が消化溶液中に使用されないとき、プロトプラスト／スフェロプラストは崩壊し得、細胞内および細胞外成分は、消化された画分中に混合され得る。本明細書に記載されているとおり、ＶＬＰは、任意の適当な技術を使用して消化された画分の成分から分離され得る。理論に縛られることは望まないが、細胞壁消化の工程は、細胞壁消化の工程は、細胞壁のポリマー成分をほどき、そうでなければ細胞壁内に捕捉されているＶＬＰの放出を助け得る。このプロトコールは、また、細胞内成分でのＶＬＰの汚染を最小限にする。ＶＬＰは、興味ある該タンパク質または超構造タンパク質を含む分離された画分を得るために、低速遠心分離、次に、濾過、深層濾過、沈降、沈殿、例えば、限定はしないが、硫酸アンモニウム沈殿、またはそれらの組合せを使用して、酵素消化後の細胞残屑から分離され得る。
【００７４】
浸透圧調節物質が使用されるとき、プロトプラスト／スフェロプラスト画分またはプロトプラストを含む画分は、ＶＬＰおよび／またはＶＬＰを含むプロトプラスト／スフェロプラストを含む分離された画分を得るために、任意の適当な技術、例えば、限定はしないが、遠心分離、濾過、深層濾過、沈降、沈殿、またはそれらの組合せを使用して、アポプラスト画分から分離され得る。
【００７５】
プロトプラスト（およびスフェロプラスト）画分、またはプロトプラストを含む画分は、分離された画分を得るために、任意の適当な技術、例えば、限定はしないが、遠心分離、濾過、深層濾過、沈降、沈殿、またはそれらの組合せを使用して、アポプラスト画分から分離され得る。
【００７６】
分離された画分は、例えば、上清（遠心、沈降、または沈殿されるとき）または濾液（濾過されるとき）であり得、ＶＬＰに関して豊富である。分離された画分は、例えば、さらなる遠心分離工程、沈殿、クロマトグラフィー工程（例えば、サイズ排除、イオン交換クロマトグラフィー）、タンジェンシャルフロー濾過またはそれらの組合せにより、ＶＬＰを単離、精製、濃縮またはそれらの組合せでさらに処理され得る。精製されたＶＬＰの存在は、例えば、ネイティブ(native)またはＳＤＳ−ＰＡＧＥ、適当な検出抗体を使用するウエスタン分析、毛細管電気泳動法または当業者に明らかである任意の他の方法により確認され得る。
【００７７】
アポプラストは、細胞膜の外側の植物細胞の部分であり、植物の細胞壁および細胞間隙を含む。プロトプラスト（および／またはスフェロプラスト）の完全性が消化およびさらなる処理中に維持されていることが好ましいが、ＶＬＰを豊富にするために、プロトプラストが無傷のままである必要はない。
【００７８】
合成中、ＶＬＰは、細胞膜の外側に分泌される。ＶＬＰは、約２０ｎｍから１μｍまたはそれらの間の任意の量、例えば、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、または２００ｎｍ、または、それらの間の任意の量、例えば、１００ｎｍの平均サイズであり、脂質膜を含み得る。いったん合成されると、ＶＬＰは、そのサイズのため、細胞膜および細胞壁間に捕捉されたままの可能性があり、植物タンパク質を得るために使用される標準的な機械的方法を使用する単離またはさらなる精製ではアクセスできない可能性がある。収率を最大限にし、細胞タンパク質でのＶＬＰ画分の汚染を最小限にし、ＶＬＰ、いくつかの態様において、関連脂質エンベロープまたは膜の完全性を維持するために、プロトプラスト（および／またはスフェロプラスト）に対する機械的損傷を最小限にするＶＬＰを放出するために細胞壁を破壊する方法、例えば、本明細書に記載されている酵素方法は有用であり得る。しかしながら、全てのプロトプラストの完全性が処理中に維持されている必要はない。
【００７９】
本発明のいくつかの局面における植物において生産されるＶＬＰは、植物由来の脂質と複合体化し得る。ＶＬＰは、ＨＡ０前駆体形態、またはジスルフィド架橋形態により共に保持されているＨＡ１もしくはＨＡ２ドメインを含み得る。植物由来の脂質は、脂質二重層の形態であり得、ＶＬＰを囲むエンベロープをさらに含み得る。植物由来の脂質は、限定はしないが、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、スフィンゴ糖脂質、植物ステロールまたはそれらの組合せを含む、ＶＬＰが生産される植物の細胞膜の脂質成分を含み得る。植物由来の脂質は、「植物脂質」と称され得る。植物ステロールの例は当分野で知られており、例えば、スチグマステロール、シトステロール、２４−メチルコレステロールおよびコレステロールを含む（Mongrandら 2004, J. Biol Chem 279:36277-86）。
【００８０】
ウイルス構造タンパク質、例えば、ＨＡの正確な折り畳み、および、ＨＡのトリマー形成は、ＶＬＰのアセンブリーに望ましい。ＶＬＰおよび特に植物由来の脂質エンベロープを含むＶＬＰは、対象に投与されるとき、構造タンパク質のモノマーの投与と比較して、優れた免疫応答を提供し得る。
【００８１】
いくつかの態様において、ポリペプチド発現は、植物の任意の細胞内または細胞外間隙、オルガネラまたは組織に標的化され得る。発現されるポリペプチドを特定の位置に局在させるために、ポリペプチドをコードする核酸は、シグナルペプチドをコードする核酸配列に連結され得る。あるいは、シグナルペプチドは、輸送ペプチドまたはシグナル配列とも称され得る。発現されるポリペプチドのアポプラストへの局在化を指向するためのシグナルペプチドまたはペプチド配列は、限定はしないが、イネアミラーゼシグナルペプチド（McCormick 1999, Proc Natl Acad Sci USA 96:703-708）、アミノ酸配列：
ＭＡＫＮＶＡＩＦＧＬＬＦＳＬＬＬＬＶＰＳＱＩＦＡＥＥ；配列番号１０
を有するタンパク質ジスルフィドイソメラーゼシグナルペプチド（ＰＤＩ）、植物病因関連タンパク質（PRP; Szyperskiら PNAS 95:2262-2262）、例えば、タバコ植物病因関連タンパク質２（ＰＲＰ）、ヒトモノクローナル抗体シグナルペプチド（ＳＰ）、またはあらゆる天然血球凝集素シグナルペプチドを含む。
【００８２】
いくつかの例において、発現されたポリペプチドは、例えば、該ポリペプチドがシグナルペプチドまたは輸送ペプチドの非存在下で発現し、分泌されるとき、特異的な細胞間または細胞外間隙（例えば、アポプラスト）、オルガネラまたは組織に蓄積し得る。
【００８３】
「ウイルス様粒子（ＶＬＰ）」または「ウイルス様粒子」または「ＶＬＰ」なる用語は、自己アセンブリーし、ウイルス表面タンパク質、例えば、インフルエンザＨＡタンパク質またはキメラインフルエンザＨＡタンパク質を含む構造物を示す。ＶＬＰおよびキメラＶＬＰは、一般的に、感染において生産されるビリオンと形態学的および抗原的に類似するが、複製に十分な遺伝情報を欠いており、したがって非感染性である。ＶＬＰおよびキメラＶＬＰは、植物宿主細胞を含む適当な宿主細胞において生産され、所望によりさらに精製され得る。
【００８４】
インフルエンザＶＬＰおよびキメラインフルエンザＶＬＰが本明細書に例示されているが、本明細書に記載されている方法は、アポプラストに局在するか、またはアポプラストに分泌されるあらゆる植物由来のＶＬＰに対して使用され得る。
【００８５】
「キメラタンパク質」または「キメラポリペプチド」とは、単一のポリペプチドとして融合された、２つまたはそれ以上の供給源、例えば、限定はしないが、２つまたはそれ以上のインフルエンザ型またはサブタイプ由来のアミノ酸配列を含むタンパク質またはポリペプチドを意味する。キメラタンパク質またはポリペプチドは、ポリペプチドまたはタンパク質の残部と同種（すなわち天然）または異種であるシグナルペプチドを含み得る。キメラタンパク質またはキメラポリペプチドは、キメラヌクレオチド配列からの転写産物として生産され得、無傷なままであるか、または必要により、キメラタンパク質またはキメラポリペプチドは合成後に開裂され得る。無傷なキメラタンパク質またはキメラタンパク質の開裂した部分は結合して、マルチマータンパク質を形成し得る。キメラタンパク質またはキメラポリペプチドは、また、ジスルフィド架橋を介して結合されているサブユニットを含むタンパク質またはポリペプチド（すなわち、マルチマータンパク質）を含み得る。例えば、２つまたはそれ以上の供給源由来のアミノ酸配列を含むキメラポリペプチドは、サブユニットおよびジスルフィド架橋を介して結合されているサブユニットにプロセッシングされ、キメラタンパク質またはキメラポリペプチドを生産し得る。
【００８６】
ポリペプチドは、インフルエンザの血球凝集素（ＨＡ）であってよく、ポリペプチドを作るそれぞれの２つまたはそれ以上のアミノ酸配列は、異なるＨＡから得て、キメラＨＡまたはキメラインフルエンザＨＡを生産することができる。キメラＨＡは、また、合成後に開裂される異種シグナルペプチド（キメラＨＡプレタンパク質）を含むアミノ酸配列を含み得る。本明細書に記載されている本発明において使用され得るＨＡタンパク質の例は、ＷＯ２００９／００９８７６；ＷＯ２００９／０７６７７８；ＷＯ２０１０／００３２２５（これらを出典明示により本明細書に包含させる）において見いだされ得る。キメラポリペプチドをコードする核酸は、「キメラ核酸」または「キメラヌクレオチド配列」として記載されていてもよい。キメラＨＡからなるウイルス様粒子は、「キメラＶＬＰ」として記載されていてもよい。キメラＶＬＰは、２０１０年６月２５日に出願されたＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＣＡ２０１０／０００９８３、および米国仮出願第６１／２２０，１６１号（２００９年６月２４日に出願された）（これらを出典明示により本明細書に包含させる）にさらに記載されている。ＶＬＰは、天然またはキメラＨＡの発現から得ることができる。
【００８７】
本発明により提供される方法によって調製されるＶＬＰのＨＡは、既知の配列および開発または同定されている変異体ＨＡ配列を含む。さらに、本明細書に記載されているように生産されるＶＬＰは、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）または他の成分、例えば、Ｍ１（Ｍタンパク質）、Ｍ２、ＮＳなどを含まない。しかしながら、ＨＡおよびＮＡを含むＶＬＰが望まれる場合は、ＮＡおよびＭ１をＨＡと共発現させ得る。
【００８８】
一般的に、「脂質」なる用語は、脂溶性（親油性）の天然分子を示す。本発明のいくつかの局面によって植物において生産されるキメラＶＬＰは、植物由来の脂質と複合体化し得る。植物由来の脂質は、脂質二重層の形態であり得、ＶＬＰをとり囲むエンベロープをさらに含み得る。ＶＬＰが生産されるとき、植物由来の脂質は、リン脂質、トリ−、ジ−、およびモノグリセリド、ならびに脂溶性ステロールまたはステロールを含む代謝産物を含む植物の細胞膜の脂質成分を含み得る。例えば、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、スフィンゴ糖脂質、植物ステロールまたはそれらの組合せを含む。あるいは、植物由来の脂質は、「植物脂質」とも称され得る。植物ステロールの例は、カンペステロール、スチグマステロール、エルゴステロール、ブラシカステロール、デルタ−７−スチグマステロール、デルタ−７−アベナステロール、ダウノステロール(daunosterol)、シトステロール、２４−メチルコレステロール、コレステロールまたはベータ−シトステロール（Mongrandら 2004, J. Biol Chem 279:36277-86）を含む。当業者は容易に理解できるとおり、細胞の細胞膜の脂質組成は、細胞または細胞を得る生物体もしくは種の培養または成長条件にしたがって変化し得る。
【００８９】
細胞膜は、一般的に、脂質二重層ならびに種々の機能に関するタンパク質を含む。特定の脂質の局在濃度は、脂質二重層において見いだすことができ、「脂質ラフト」と称される。これらの脂質ラフトマイクロドメインは、スフィンゴ脂質およびステロールにおいて豊富であり得る。理論に縛られることは望まないが、脂質ラフトは、エンドおよびエキソサイトーシス、ウイルスまたは他の感染因子の進入または放出、細胞間シグナル変換、細胞または生物体の他の構造成分、例えば、細胞内および細胞外マトリックスとの相互作用における有意な役割を有し得る。
【００９０】
脂質エンベロープを含むＶＬＰは、以前に、ＷＯ２００９／００９８７６；ＷＯ２００９／０７６７７８およびＷＯ２０１０／００３２２５（これらは出典明示により本明細書に包含させる）に記載されている。インフルエンザウイルスに関して、本明細書において使用される「血球凝集素」または「ＨＡ」なる用語は、インフルエンザウイルス粒子の構造的糖タンパク質を示す。本発明のＨＡは、あらゆるサブタイプから得ることができる。例えば、ＨＡは、サブタイプＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５もしくはＨ１６、またはインフルエンザＢ型もしくはＣ型のものであってよい。本発明の組換えＨＡは、また、任意の血球凝集素の配列に基づくアミノ酸配列を含み得る。インフルエンザの血球凝集素の構造は、よく試験されており、二次、三次および四次構造における高程度の保存を証明されている。アミノ酸配列は変化し得るが、この構造的保存は保存されている（例えば、Skehel and Wiley, 2000 Ann Rev Biochem 69:531-69; Vaccaroら 2005参照；これらは出典明示により本明細書に包含させる）。ＨＡをコードするヌクレオチド配列は知られており、例えば、BioDefense and Public Health Database（現在のインフルエンザ研究データベース；Squiresら 2008 Nucleic Acids Research 36:D497-D503）、例えば、ＵＲＬ：biohealthbase.org/GSearch/home.do?decorator=Influenza）または全米バイオテクノロジー情報センターにより支えられているデータベース（ＮＣＢＩ；例えば、ＵＲＬ：ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=nuccore&cmd=search&term=Influenza）（これら両方を出典明示により本明細書に包含させる）から利用できる。
【００９１】
本発明は、また、ヒトまたは宿主動物、例えば、霊長類、ウマ、ブタ、トリ、ヒツジ、水鳥、渡り鳥、ウズラ、カモ、ガチョウ、家禽、ニワトリ、ラクダ、イヌ(canine)、イヌ(dog)、ネコ(feline)、ネコ(cat)、トラ、ヒョウ、ジャコウネコ、ミンク、テン、フェレット、ペット、家畜、マウス、ラット、アシカ、クジラなどに感染するウイルスのインフルエンザＶＬＰを含むＶＬＰを調製、単離または調製および単離の両方をする方法に関する。いくつかのインフルエンザウイルスは、１つ以上の宿主動物に感染し得る。
【００９２】
アミノ酸変異は、インフルエンザウイルスの血球凝集素において許容される。この変異は、継続的に同定されている新規の株を提供する。新規の株間の感染性は、変化していてもよい。しかしながら、次にＶＬＰを形成する血球凝集素トリマーの形成は維持されている。本発明は、また、ＨＡサブタイプまたは配列、またはＶＬＰを含むキメラＨＡ、または起源の種にかかわらず、何らかの植物由来のＶＬＰを調製する方法を含む。
【００９３】
血球凝集素の正確な折り畳みは、インフルエンザの血球凝集素の他の特性中で、タンパク質の安定性、マルチマーの形成、ＶＬＰの形成およびＨＡの機能（血球凝集する能力）のために重要であり得る。タンパク質の折り畳みは、限定はしないが、タンパク質の配列、タンパク質の相対的量、細胞内の密集度、折り畳まれた、部分的に折り畳まれた、もしくは折り畳まれていないタンパク質に結合もしくは一過性に結合し得る補因子の利用可能性、１つ以上のシャペロンタンパク質の存在などを含む１つ以上の因子により影響され得る。
【００９４】
熱ショックタンパク質（Ｈｓｐ）またはストレスタンパク質は、シャペロンタンパク質の例であり、タンパク質合成、細胞内輸送、誤った折り畳みの防止、タンパク質凝集の防止、タンパク質複合体のアセンブリーおよび脱アセンブリー、タンパク質フォールディングならびにタンパク質脱凝集を含む種々の細胞過程に参加し得る。このようなシャペロンタンパク質の例は、限定はしないが、Ｈｓｐ６０、Ｈｓｐ６５、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ９０、Ｈｓｐ１００、Ｈｓｐ２０−３０、Ｈｓｐ１０、Ｈｓｐ１００−２００、Ｈｓｐ１００、Ｈｓｐ９０、Ｌｏｎ、ＴＦ５５、ＦＫＢＰ、シクロフィリン、ＣｌｐＰ、ＧｒｐＥ、ユビキチン、カルネキシンおよびタンパク質ジスルフィドイソメラーゼを含む（例えば、Macario, A.J.L., Cold Spring Harbor Laboratory Res. 25:59-70. 1995; Parsell, D.A. & Lindquist, S. Ann. Rev. Genet. 27:437-496 (1993)；米国特許第５，２３２，８３３号参照）。シャペロンタンパク質、例えば、限定はしないがＨｓｐ４０およびＨｓｐ７０は、キメラＨＡ（２０１０年６月２５日に出願されたＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＣＡ２０１０／０００９８３、および２００９年６月２４日に出願された米国仮出願第６１／２２０，１６１号；ＷＯ２００９／００９８７６およびＷＯ２００９／０７６７７８（これらの全てを出典明示により本明細書に包含させる）の折り畳みを保証するために使用され得る。タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ；受入番号Ｚ１１４９９）も使用され得る。
【００９５】
いったん回収されれば、ＶＬＰは、例えば、血球凝集アッセイ、電子顕微鏡、光散乱、サイズ排除クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、ウェスタンブロット分析または電気泳動法により、構造、サイズ効力または活性について評価され得る。ＶＬＰのサイズ、濃度、活性および組成を評価するためのこれらの、および他の方法は、当該分野で知られている。
【００９６】
分取サイズ排除クロマトグラフィーにおいて、ＶＬＰを含む調製物を、本明細書に記載されている方法により得て、不溶性材料を遠心分離により除去し得る。ＰＥＧでの沈殿も利益を与え得る。回収されたタンパク質を慣用の方法（例えば、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイ、ＢＣＡ））を使用して定量し、抽出物を例えば、ＳＥＰＨＡＣＲＹＬＴＭ、ＳＥＰＨＡＤＥＸＴＭもしくは同様の媒体を使用するサイズ排除カラムに通過させ、画分を回収してもよい。Ｂｌｕｅ Ｄｅｘｔｒａｎ ２０００または適当なタンパク質は、較正標準として使用され得る。抽出物を、また、陽イオン交換カラムに通過させ、活性な画分を回収してもよい。クロマトグラフィー後、画分を、タンパク質電気泳動法、免疫ブロット法、または両方によりさらに分析し、ＶＬＰおよび画分のタンパク質成分の存在を確認してもよい。
【００９７】
血球凝集アッセイは、当分野でよく知られている方法を使用して、ＶＬＰ含有画分の赤血球凝集能を評価するために使用され得る。理論に縛られることは望まないが、異なる動物由来のＲＢＣへのＨＡの結合能力は、シアル酸α２，３またはα２，３に対するＨＡのアフィニティーおよびＲＢＣの表面上のこれらのシアル酸の存在により駆動される。インフルエンザウイルス由来のウマおよびトリＨＡは、シチメンチョウ、ニワトリ、アヒル、モルモット、ヒト、ヒツジ、ウマおよびウシを含む全てのいくつかの種由来の赤血球を凝集させる。一方で、ヒトＨＡは、シチメンチョウ、ニワトリ、アヒル、モルモット、ヒトおよびヒツジの赤血球に結合する（Ito Tら 1997, Virology, 227:493-499; Medeiros Rら 2001. Virology 289:74-85）。
【００９８】
血球凝集阻害（ＨＩまたはＨＡＩ）アッセイは、また、組換えＨＡによる赤血球（ＲＢＣ）の凝集を阻害することができる、キメラＨＡまたはキメラＶＬＰを含むワクチンまたはワクチン組成物により誘導される抗体の有効性を証明するために使用され得る。血清サンプルの血球凝集阻害抗体力価は、マイクロタイターＨＡＩにより評価され得る（Aymardら 1973）。任意の種、例えば、ウマ、シチメンチョウ、ニワトリなど由来の赤血球が使用され得る。このアッセイは、ＶＬＰの表面上のＨＡトリマーのアセンブリーに関する間接的情報を与え、ＨＡ上の抗原部位の適当な提示を確認する。
【００９９】
交差反応性ＨＡＩ力価は、また、ワクチンサブタイプに関連する他のウイルスの株に対する免疫応答の有効性を証明するために使用され得る。例えば、第１のインフルエンザ型またはサブタイプのＨＤＣを含むキメラ血球凝集素を含むワクチン組成物で免疫化された対象由来の血清を、第２の株の全ウイルスまたはウイルス粒子を用いるＨＡＩアッセイにおいて使用し、ＨＡＩ力価を決定され得る。
【０１００】
ＶＬＰを含むトランスジェニック植物、植物細胞、植物材料または種子の形質転換および再生のための方法は、当該分野で確立されており、当業者に知られている。形質転換された、および再生された植物を得る方法は、本発明に重要ではない。
【０１０１】
「形質転換」とは、遺伝子型で、表現型で、またはそれら両方で発現される遺伝情報（ヌクレオチド配列）の種間移動を意味する。キメラ構築物から宿主への遺伝情報の種間移動は、遺伝性であり（すなわち、宿主のゲノム内に組み込まれる）、遺伝情報の移動は安定であると考えられるか、または該移動は一過性であり、遺伝情報の移動は遺伝性でなくてもよい。
【０１０２】
「植物材料」なる用語は、植物に由来するあらゆる物質を意味する。植物材料は、植物全体、組織、細胞またはそれらの任意の画分を含み得る。さらに、植物材料は、細胞内植物成分、細胞外植物成分、植物の液体または固体抽出物、またはそれらの組合せを含み得る。さらに、植物材料は、植物の葉、茎、果実、根またはそれらの組合せ由来の植物、植物細胞、組織、液体抽出物またはそれらの組合せを含み得る。植物材料は、何らかの処理工程に付されていない植物またはそれらの一部を含み得る。植物の一部は、植物材料を含み得る。植物または植物材料は、任意の方法により回収されるか、または得ることができる、例えば、植物全体が使用され得るか、または、葉もしくは他の組織が記載されている方法における使用のために特異的に除去され得る。ＶＬＰを発現し、分泌するトランスジェニック植物は、また、本明細書に記載されている処理に対する出発物質として使用され得る。
【０１０３】
本発明の構築物は、Ｔｉプラスミド、Ｒｉプラスミド、植物ウイルスベクター、直接的ＤＮＡ形質転換、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、浸潤などを使用して植物細胞に導入することができる。このような技術に関して、例えば、Weissbach and Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology, Academy Press, New York VIII, pp. 421-463 (1988); Geierson and Corey, Plant Molecular Biology, 2d Ed. (1988); and Miki and Iyer, Fundamentals of Gene Transfer in Plants. In Plant Metabolism, 2d Ed. DT. Dennis, DH Turpin, DD Lefebrve, DB Layzell (eds), Addison-Wesley, Langmans Ltd. London, pp. 561-579 (1997)。他の方法は、例えば、プロトプラスト、マイクロインジェクション、微粒子銃またはウィスカー、および減圧浸潤を使用する直接的ＤＮＡ取込、リポソームの使用、エレクトロポレーションを含む。例えば、Bilangら(Gene 100: 247-250 (1991), Scheidら(Mol. Gen. Genet. 228: 104-112, 1991), Guercheら(Plant Science 52: 111-116, 1987), Neuhauseら(Theor. Appl Genet. 75: 30-36, 1987), Kleinら Nature 327: 70-73 (1987); Howellら(Science 208: 1265, 1980), Horschら(Science 227: 1229-1231, 1985), DeBlockら(Plant Physiology 91: 694-701, 1989), Methods for Plant Molecular Biology (Weissbach and Weissbach, eds., Academic Press Inc., 1988), Methods in Plant Molecular Biology (Schuler and Zielinski, eds., Academic Press Inc., 1989), Liu and Lomonossoff (J. Virol Meth, 105:343-348, 2002)、米国特許第４，９４５，０５０；５，０３６，００６；５，１００，７９２；６，４０３，８６５；５，６２５，１３６（これらの全てを出典明示により本明細書に包含させる）参照。
【０１０４】
一過性の発現方法は、本発明の構築物を発現するために使用され得る（Liu and Lomonossoff, 2002, Journal of Virological Methods, 105:343-348参照；これを出典明示により本明細書に包含させる）。あるいは、ＰＣＴ公開ＷＯ００／０６３４００、ＷＯ００／０３７６６３（出典明示により本明細書に包含させる）に記載されている減圧ベース一過性発現方法が使用され得る。これらの方法は、例えば、限定はしないが、アグロ接種(Agro-inoculation)またはアグロ浸潤(Agro-infiltration)の方法を含み得るが、しかしながら、他の一過性方法も、また、上記されているとおりに使用され得る。アグロ接種またはアグロ浸潤のいずれかで、所望の核酸を含むアグロバクテリウムの混合物は、組織、例えば、葉、植物の地上部分（茎、葉および花を含む）、植物の他の部分（茎、根、花）、または植物全体の細胞間隙に入る。表皮横断後、アグロバクテリウムは細胞に感染し、ｔ−ＤＮＡコピーを移動させる。ｔ−ＤＮＡがエピソームで転写され、ｍＲＮＡが翻訳され、感染細胞中で興味あるタンパク質の生産を引き起こすが、しかしながら、核内でのｔ−ＤＮＡの継代は一過性である。
【０１０５】
本発明の方法により調製されるインフルエンザＶＬＰは、既存のインフルエンザワクチンと共に使用して、ワクチンを補うか、それをより効果的にさせるか、または必要な投与用量を減少させ得る。当業者に知られているとおり、ワクチンは１つもしくはそれ以上のインフルエンザウイルスに対するものであり得る。適当なワクチンの例は、限定はしないが、Ｓａｎｏｆｉ−Ｐａｓｔｅｕｒ、ＩＤ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ、Ｍｅｒｉａｌ、Ｓｉｎｏｖａｃ、Ｃｈｉｒｏｎ、Ｒｏｃｈｅ、ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ、Ｎｏｖａｒｔｉｓ、Ｓａｎｏｆｉ−Ａｖｅｎｔｉｓ、Ｓｅｒｏｎｏ、Ｓｈｉｒｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓなどから市販により利用できるものを含む。
【０１０６】
所望により、本発明のＶＬＰは、当業者に知られている適当なアジュバントと混合され得る。さらに、ＶＬＰは、上記定義のとおりに、標的生物体の処置のための有効用量のＶＬＰを含むワクチン組成物において使用され得る。さらに、本発明によって生産されるＶＬＰは、他のタンパク質成分と共発現されるか、または他のＶＬＰまたはインフルエンザタンパク質成分、例えば、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、Ｍ１およびＭ２と再構成され得る。それは、また、ワクチンタンパク質、例えば、マラリア抗原、ＨＩＶ抗原、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）抗原などから製造される他のＶＬＰと共発現または再構成することができる。
【０１０７】
本明細書に記載されている配列は、以下に要約されている。
【表２】
【０１０８】
本発明は、以下の実施例においてさらに説明される。しかしながら、これらの実施例は説明の目的のためのみであり、いかなる方法においても、本発明の範囲を限定するために使用するべきでないことを理解すべきである。
【０１０９】
発現カセットのアセンブリー
ＶＬＰの生産のために使用され得る構築物は、米国仮出願第６１／２２０，１６１号（２００９年６月２４日に出願された）、ＷＯ２００９／００９８７６、ＷＯ２００９／０７６７７８およびＷＯ２０１０／００３２２５（これら全てを出典明示により本明細書に包含させる）に記載されている。構築物は、また、表２に記載されているものを含み得る。これらの構築物のアセンブリーは、ＷＯ２００９／００９８７６、ＷＯ２００９／０７６７７８、ＷＯ２０１０／００３２２５およびＵＳ６１／２２０，１６１に記載されている。しかしながら、既知のＨＡを含む他の構築物、例えば、限定はしないが、表２に記載されているものおよび同様の、または異なる調節要素およびプロモーターと組み合わせられたものは、また、本明細書に記載されているＶＬＰの生産のために使用され得る。
【０１１０】
表２：血球凝集素生産のために使用することができる構築物の非限定的な例
【表３】
【表４】
【０１１１】
ＣＰＭＶ−ＨＴ発現カセットは、５’に、位置１１５および１６１で変異したＡＴＧを有するササゲモザイクウイルス（ＣＰＭＶ）ＲＮＡ２のヌクレオチド１−５１２、ならびに、３’に、ＣＰＭＶ ＲＮＡ２（３’ＵＴＲに対応する）のヌクレオチド３３３０−３４８１、次にＮＯＳターミネーターが並ぶ、興味あるコード配列を含むｍＲＮＡの発現をコントロールするための３５Ｓプロモーターを含んだ。プラスミドｐＢＤ−Ｃ５−１ＬＣ（Sainsburyら 2008; Plant Biotechnology Journal 6: 82-92およびＰＣＴ公開ＷＯ２００７／１３５４８０）を、ＣＰＭＶ−ＨＴ−ベースの血球凝集素発現カセットのアセンブリーのために使用した。ＣＰＭＶ ＲＮＡ２の位置１１５および１６１でＡＴＧの変異を、Darveauら(Methods in Neuroscience 26: 77-85 (1995))に示されているＰＣＲベースのライゲーション方法を使用して行った。２つの別々のＰＣＲを、ｐＢＤ−Ｃ５−１ＬＣを鋳型として行った。第１の増幅のためのプライマーは、ｐＢｉｎＰｌｕｓ．２６１３ｃ（配列番号：３）およびＭｕｔ−ＡＴＧ１１５．ｒ（配列番号：４）であった。第２の増幅のためのプライマーは、Ｍｕｔ−ＡＴＧ１６１．ｃ（配列番号：５）およびＬＣ−Ｃ５−１．１１０ｒ（配列番号：６）であった。２つのフラグメントを混合し、ｐＢｉｎＰｌｕｓ．２６１３ｃ（配列番号：３）およびＬＣ−Ｃ５−１．１１０ｒ（配列番号：６）をプライマーとして使用する第３の増幅のための鋳型として使用した。得られたフラグメントをＰａｃＩおよびＡｐａＩで消化し、同じ酵素で消化されたｐＢＤ−Ｃ５−１ＬＣにクローニングした。生産された発現カセットを８２８と名付けた。
【０１１２】
ＣＰＭＶ−ＨＴ発現カセット（構築物番号６８５）中のＨ５ Ａ／インドネシア／５／２００５のアセンブリー
このカセットのアセンブリーは、ＷＯ２００９／００９８７６、ＷＯ２００９／０７６７７８およびＷＯ２０１０／００３３２５（これらを出典明示により本明細書に包含させる）に記載されている。
【０１１３】
簡潔には、Ａ／インドネシア／５／２００５由来のＨ５のコード配列を、以下のとおりに、ＣＰＭＶ−ＨＴにクローニングした：制限酵素認識部位ＡｐａＩ（開始ＡＴＧのすぐ上流）およびＳｔｕＩ（終始コドンのすぐ下流）を、鋳型として構築物番号６６０（D'Aoustら Plant Biotechnology Journal 6:930-940 (2008)）を使用する、プライマーＡｐａＩ−Ｈ５（Ａ−Ｉｎｄｏ）．１ｃ（配列番号：７）およびＨ５（Ａ−Ｉｎｄｏ）−ＳｔｕＩ．１７０７ｒ（配列番号：８）でのＰＣＲ増幅を行うことにより、血球凝集素コード配列に付加した。構築物６６０は、アルファルファプラストシアニンプロモーターおよび５’ＵＴＲ、Ａ／インドネシア／５／２００５（構築物＃６６０）由来のＨ５の血球凝集素コード配列、アルファルファプラストシアニン３’ＵＴＲおよびターミネーター配列を含む（配列番号：９；図５）。得られたフラグメントを、ＡｐａＩおよびＳｔｕＩ制限酵素で消化し、予め同じ酵素で消化された構築物番号８２８にクローニングした。得られたカセットを構築物番号６８５と名付けた（図１、２）。
【０１１４】
サイレンシングのサプレッサー
転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）は、植物中の導入遺伝子の発現の制限に関与する場合があり、導入遺伝子ｍＲＮＡの特異的分解を中和するために、ジャガイモウイルスＹ（ＨｃＰｒｏ）由来のサイレンシングのサプレッサーの共発現が使用され得る（Brignetiら 1998）。サイレンシングの代替サプレッサー、例えば、限定はしないが、ＴＥＶ−ｐ１／ＨＣ−Ｐｒｏ（タバコエッチ病ウイルス−ｐ１／ＨＣ−Ｐｒｏ）、ＢＹＶ−ｐ２１、トマトブッシースタントウイルスのｐ１９（ＴＢＳＶ ｐ１９）、トマトクリンクルウイルスのカプシドタンパク質（ＴＣＶ−ＣＰ）、キュウリモザイクウイルスの２ｂ（ＣＭＶ−２ｂ）、ジャガイモウイルスＸのｐ２５（ＰＶＸ−ｐ２５）、ジャガイモウイルスＭのｐ１１（ＰＶＭ−ｐ１１）、ジャガイモウイルスＳのｐ１１（ＰＶＳ−ｐ１１）、ブルーベリースコーチウイルスのｐ１６（ＢＳｃＶ−ｐ１６）、カンキツトリステザウイルスのｐ２３（ＣＴＶ−ｐ２３）、ブドウ葉巻随伴ウイルス−２のｐ２４（ＧＬＲａＶ−２ ｐ２４）、ブドウウイルスＡのｐ１０（ＧＶＡ−ｐ１０）、ブドウウイルスＢのｐ１４（ＧＶＢ−ｐ１４）、ヘラクレウム潜在ウイルスのｐ１０（ＨＬＶ−ｐ１０）、またはニンニク共通潜在ウイルスのｐ１６（ＧＣＬＶ−ｐ１６）は、当分野でよく知られており、本明細書に記載されているとおりに使用され得る（Chibaら2006, Virology 346:7-14；これを出典明示により本明細書に包含させる）。したがって、サイレンシングのサプレッサー、例えば、限定はしないが、ＨｃＰｒｏ、ＴＥＶ −ｐ１／ＨＣ−Ｐｒｏ、ＢＹＶ−ｐ２１、ＴＢＳＶ ｐ１９、ＴＣＶ−ＣＰ、ＣＭＶ−２ｂ、ＰＶＸ−ｐ２５、ＰＶＭ−ｐ１１、ＰＶＳ−ｐ１１、ＢＳｃＶ−ｐ１６、ＣＴＶ−ｐ２３、ＧＬＲａＶ−２ ｐ２４、ＧＢＶ−ｐ１４、ＨＬＶ−ｐ１０、ＧＣＬＶ−ｐ１６またはＧＶＡ−ｐ１０は、興味あるタンパク質をコードする核酸配列と共に共発現され、植物内で高レベルのタンパク質生産をさらに保証し得る。
【０１１５】
ｐ１９の構築物は、ＷＯ２０１０／０００３２２５（これを出典明示により本明細書に包含させる）に記載されている。簡潔には、トマトブッシースタントウイルス（ＴＢＳＶ）のｐ１９タンパク質のコード配列を、Darveauら(Methods in Neuroscience 26: 77-85(1995))に示されているＰＣＲベースのライゲーション方法により、アルファルファプラストシアニン発現カセットに連結した。第１のＰＣＲにおいて、プラストシアニンプロモーターのセグメントを、プライマーＰｌａｓｔｏ−４４３ｃ：
ＧＴＡＴＴＡＧＴＡＡＴＴＡＧＡＡＴＴＴＧＧＴＧＴＣ（配列番号：１１）
およびｓｕｐＰ１９−ｐｌａｓｔｏ．ｒ
ＣＣＴＴＧＴＡＴＡＧＣＴＣＧＴＴＣＣＡＴＴＴＴＣＴＣＴＣＡＡＧＡＴＧ（配列番号：１２）
を使用して、構築物６６０（ＷＯ２０１０／０００３２２５に記載されている、これを出典明示により本明細書に包含させる）を鋳型として増幅した。並行して、ｐ１９のコード配列を含む別のフラグメントを、プライマーｓｕｐＰ１９−１ｃ
ＡＴＧＧＡＡＣＧＡＧＣＴＡＴＡＣＡＡＧＧ（配列番号：１３）
およびＳｕｐＰ１９−ＳａｃＩ．ｒ
ＡＧＴＣＧＡＧＣＴＣＴＴＡＣＴＣＧＣＴＴＴＣＴＴＴＴＴＣＧＡＡＧ（配列番号：１４）
でVoinnetら(The Plant Journal 33: 949-956 (2003))に記載されている構築物３５Ｓ：ｐ１９を鋳型として使用して増幅した。次に、増幅産物を混合し、第２の増幅（アセンブリー反応）のための鋳型として、プライマーＰｌａｓｔｏ−４４３ｃおよびＳｕｐＰ１９−ＳａｃＩ．ｒと使用した。得られたフラグメントをＢａｍＨＩ（プラストシアニンプロモーター中）およびＳａｃＩ（ｐ１９コード配列の最後）で消化し、同じ制限酵素で以前に消化された構築物番号６６０にクローニングし、構築物番号Ｒ４７２を得た。該プラスミドを用いて、エレクトロポレーション（Mattanovichら 1989）により、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（AGL1; ATCC, Manassas, VA 20108, USA）を形質転換した。全てのアグロバクテリウム・ツメファシエンス株の完全性を、制限マッピングにより確認した。Ｒ４７２を含むアグロバクテリウム・ツメファシエンス株を「ＡＧＬ１／Ｒ４７２」と称した。
【０１１６】
ＨｃＰｒｏ構築物（３５ＨｃＰｒｏ）を、Hamiltonら(2002)に記載されているとおりに調製した。全てのクローンを、構築物の完全性を確認するためにシーケンシングした。該プラスミドを用いて、エレクトロポレーション（Mattanovichら 1989）により、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（AGL1; ATCC, Manassas, VA 20108, USA）を形質転換した。全てのアグロバクテリウム・ツメファシエンス株の完全性を、制限マッピングにより確認した。
【０１１７】
植物バイオマスの調製、接種材料、アグロ浸潤(agroinfiltration)および回収
ベンサミアナタバコ(Nicotiana benthamiana)植物を、市販のピートモス培養器で満たされた平箱中で種子から生長させた。該植物は、１６／８光周期および日中２５℃／夜間２０℃の温度レジメンの下で温室で生長させた。播種の３週間後、個々の小植物を選択し、ポットに移し、同じ環境条件下でさらに３週間温室で生長させておいた。６週間後、植物は８０ｇの平均重量および３０ｃｍの高さを有した。
【０１１８】
アグロバクテリウム株ＡＧＬ１を、D'Aoustら 2008 (Plant Biotechnology Journal 6:930-940)により記載されている方法を使用して、以下に特定されている構築物でトランスフェクトした（エレクトロポレーション）。トランスフェクトされたアグロバクテリウムを、１０ｍＭの２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、２０μＭのアセトシリンゴン、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンおよび２５μｇ／ｍｌのカルベニシリンｐＨ５．６を補ったＹＥＢ培地中で０．６から１．６のＯＤ６００まで増殖させた。アグロバクテリウム懸濁液を使用前に遠心し、浸潤培地（１０ｍＭのＭｇＣｌ２および１０ｍＭのＭＥＳ ｐＨ５．６）に再懸濁した。
【０１１９】
植物を、D'Aoustら（上記）に記載されているように、アグロ浸潤させた。簡潔には、減圧浸潤のために、アグロバクテリウム・ツメファシエンス懸濁液を遠心し、浸潤培地に再懸濁し、４℃で一晩保管した。浸潤の日に、培養バッチを、２．５培養容量に希釈し、使用前に暖めておいた。ベンサミアナタバコの植物全体を、２分間２０−４０Ｔｏｒｒの減圧下で気密ステンレス鋼タンク中で細菌懸濁液中に逆さまに置いた。特記されない限り、すべての浸潤を、１：１比率でＲ４７２（株ＡＧＬ１／Ｒ４７２）で形質転換された細菌と共浸潤として行った。減圧浸潤後、植物を回収までの４−６日のインキュベーション期間、温室に戻した。
【０１２０】
葉のサンプリングおよび全タンパク質抽出（機械的均質化）
４、５、６、７および８日間のインキュベーション後、植物の地上部を回収し、即座に使用した。３容量の１％のＴｒｉｔｉｏｎ Ｘ−１００および０．００４％のメタ重亜硫酸ナトリウムを含む冷５０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ８．０、０．１５ＭのＮａＣｌ中で植物組織を均質化することにより、全可溶性タンパク質を抽出した。植物組織を、１容量の冷５０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ８、０．１５ＭのＮａＣｌ中で、ＰＯＬＹＴＲＯＮＴＭを使用して機械的に均質化し、乳鉢および乳棒またはＣＯＭＩＴＲＯＬＴＭで粉砕した。ＣＯＭＩＴＲＯＬＴＭで使用されるバッファーは、また、０．０４％のメタ重亜硫酸ナトリウムを含んだ。均質化後、粉砕された植物原料のスラリーを５，０００ｇで４℃で５分遠心し、粗抽出物（上清）を分析のために保持した。浄化された粗抽出物の全タンパク質含有量を、参照標準としてウシ血清アルブミンを使用して、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイ（Bio-Rad, Hercules, CA）により決定した。
【０１２１】
細胞壁消化によるＶＬＰ抽出
葉組織をベンサミアナタバコ植物から回収し、〜１ｃｍ２切片に切った。葉切片を、室温（ＲＴ）で３０分間、５００ｍＭのマンニトールに浸した。次に、マンニトール溶液を除去し、プロトプラスト化溶液（５００ｍＭのマンニトール、１０ｍＭのＣａＣｌ２および５ｍＭのＭＥＳ／ＫＯＨ（ｐＨ５．６））中の酵素混合物（トリコデルマ・ビリデ(Trichoderma viride)由来のセルラーゼの混合物（Ｏｎｏｚｕｋａ Ｒ−１０；３％ｖ／ｖ）およびクモノスカビ属由来のペクチナーゼの混合物（ＭＡＣＥＲＯＺＹＭＥＴＭ；０．７５％ｖ／ｖ；両方ともYakult Pharmaceuticalsから）と交換した。使用される比率は、１００ｍＬの溶液あたり２０ｇの葉切片であった。この調製物を浅い容器（〜１１×１８ｃｍ）に平坦に広げ、４０ｒｐｍで２６℃で回転震盪器上で１６時間インキュベートした。
【０１２２】
あるいは、ＶＬＰ抽出を以下のとおりに行ってもよい：植物を、実施例１に記載されているＡＧＬ１／＃６８５でアグロ浸潤させた。葉組織を浸潤後６日目にベンサミアナタバコ植物から回収し、〜１ｃｍ２切片に切った。マルチフェクトペクチナーゼＦＥ、マルチフェクトＣＸ ＣＧおよびマルチフェクトＣＸ Ｂ（Genencor）を、それぞれ１．０％（ｖ／ｖ）で、６００ｍＭのマンニトール、７５ｍＭのクエン酸塩、０．０４％の亜硫酸水素ナトリウムｐＨ６．０バッファー（新鮮バイオマス；消化バッファーを１：２．５（ｗ／ｖ）の比率で使用する）に加えた。バイオマスを、オービタルシェーカーで室温で１５時間消化した。
【０１２３】
インキュベーション後、葉の破片を濾過（２５０または４００μｍのメッシュのナイロン濾過）により除去した。懸濁液中のプロトプラストを、２００×ｇ（１５分）で遠心分離、次に、上清をさらに浄化するために５０００×ｇ（１５分）で上清の遠心分離により回収した。あるいは、５０００×ｇで１５分間の単一の遠心分離工程を用いてもよい。次に、数ｍＬの上清を７０，０００×ｇで３０分遠心分離した。得られたペレットを１．７ｍＬのＰＢＳに再懸濁し、即座に分析するか、または冷凍した。
【０１２４】
タンパク質分析
Ｈ５に関する血球凝集アッセイは、Nayak and Reichl (2004)により記載されている方法に基づいた。簡潔には、試験サンプル（１００μＬ）の連続二重希釈を１００μＬのＰＢＳを含むＶ字底９６ウェルマイクロタイタープレート中で作り、ウェル当たり１００μＬの希釈されたサンプルを置いた。１００マイクロリットルの０．２５％のシチメンチョウ赤血球懸濁液（Bio Link Inc., Syracuse, NY）をそれぞれのウェルに加え、プレートを室温で２時間インキュベートした。完全血球凝集を示す最も高い希釈度の逆数を血球凝集活性として記録した。並行して、組換えＨＡ５標準（Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４ Ｈ５Ｎ１）（Protein Science Corporation, Meriden, CT）をＰＢＳで希釈し、それぞれのプレート上に対照として使用した。
【０１２５】
ＥＬＩＳＡ
ＨＡ５標準を、１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００での処理、次にＴｉｓｓｕｅ ＬｙｓｅｒＴＭ（Ｑｉａｇｅｎ）中で１分機械的撹拌により破壊された精製されたウイルス様粒子を用いて調製した。Ｕ字底９６ウェルマイクロタイタープレートを、５０ｍＭの炭酸−重炭酸コートバッファー（ｐＨ９．６）中の１０μｇ／ｍＬの捕捉抗体（Immune Technology Corporation、#IT-003-005I）で４℃で１６−１８時間コートした。全ての洗浄を、０．１％のＴｗｅｅｎ−２０を含む０．０１ＭのＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）ｐＨ７．４で行った。インキュベーション後、プレートを３回洗浄し、ＰＢＳ中の１％のカゼインで３７℃で１時間でブロックした。ブロッキング工程後、プレートを３回洗浄した。ＨＡ５標準を模造抽出物（ＡＧＬ１／Ｒ４７２単独で浸潤させた葉組織から調製された）に希釈し、５００から５０ｎｇ／ｍＬの標準曲線を作成した。定量するためのサンプルを、マイクロプレートに負荷する前に、１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で処理した。プレートを３７℃で１時間さらにインキュベートした。洗浄後、１：１０００に希釈されたＨＡ５（ＣＢＥＲ／ＦＤＡ）に対するヒツジポリクローナル抗体を加え、プレートを３７℃で１時間インキュベートした。洗浄後、１：１０００に希釈されたセイヨウワサビペルオキシダーゼ結合ウサギ抗ヒツジ抗体を加え、プレートを３７℃で１時間インキュベートした。最終洗浄後、プレートを室温で２０分ＳｕｒｅＢｌｕｅ ＴＭＢペルオキシダーゼ基質（ＫＰＬ）とインキュベートした。反応を１ＮのＨＣｌの添加により停止させ、Ａ４５０値をＭｕｌｔｉｓｋａｎ Ａｓｃｅｎｔ プレートリーダー（Thermo Scientific）を使用して測定した。
【実施例】
【０１２６】
実施例１：植物組織の酵素抽出は、上昇した相対活性を有する高い量のＨＡを放出する
本発明の酵素抽出方法から得られたＨＡの量および相対活性を、一般的な機械的抽出方法で得られたＨＡのものと比較した。ベンサミアナタバコ植物をＡＧＬ１／６８５で浸潤させ、５から６日のインキュベーション期間後に葉を回収した。葉ホモジネートを次の通りに調製した：２グラムの葉をホモジェナイザーでホモジェナイズし；４ｇの葉を乳鉢および乳棒で粉砕し；２５ｋｇの葉を抽出バッファー（５０ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ ｐＨ８．０、１：１ｗ／ｖ比率）中で、ＣＯＭＩＴＲＯＬＴＭ処理装置（Urschel Laboratories）でホモジェナイズした。酵素抽出を次の通りに行った：２０グラムの回収した葉を、上記されているＭａｃｅｒｏｚｙｍｅペクチナーゼおよびＯｎｏｚｕｋａ Ｒ−１０セルラーゼで消化に付した。消化後、葉の破片を濾過（ナイロン濾過、２５０μｍメッシュ）により除去した。懸濁液中のプロトプラストを２００×ｇ（１５分）で遠心分離により除去し、上清を５０００×ｇ（１５分）で遠心分離によりさらに浄化した。
【０１２７】
これらの植物抽出物のそれぞれにおけるＨＡの量および相対活性を表３に示す。酵素抽出方法から得られたＨＡの量は、機械的方法から得られた量よりも有意に良い。
表３：植物の葉の機械的および酵素抽出から得られたＨＡの量および相対活性の比較。全てのデータは、それぞれの抽出方法のために加えられた液体の容量の差を考慮して調整した。ＣｏｍｉｔｒｏｌＴＭ抽出方法を本比較分析の目的のための標準値として選択した。
【表５】
＊量はＥＬＩＳＡ分析により評価した。
【０１２８】
実施例２：植物組織の酵素消化はＶＬＰ中に組織化されたＨＡを放出する
分画遠心分離およびサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）の組合せを、本明細書に記載されている酵素抽出方法により得られたＨＡがＶＬＰとして組織化されていることを証明するために使用した。ベンサミアナタバコ植物を実施例１に記載されているＡＧＬ１／６８５でアグロ浸潤された。実施例１に記載のように、葉を浸潤から６日後に植物から回収し、〜１ｃｍ２切片に切り、次に消化し、粗濾過し、遠心した。
【０１２９】
次に、浄化されたサンプルを７０，０００×ｇで遠心し、ＶＬＰの分離を行った。ＶＬＰを含む遠心分離ペレットを、１／５０容量のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；０．１Ｍのリン酸ナトリウム、０．１５ＭのＮａＣｌ ｐＨ７．２）に穏やかに再懸濁し、ＳＥＣカラムに負荷した。
【０１３０】
３２ｍｌのＳＥＰＨＡＣＲＹＬＴＭ Ｓ−５００高分解能ビーズ（S-500 HR: GE Healthcare, Uppsala, Sweden, Cat. No. 17-0613-10）のＳＥＣカラムを、平衡／溶出バッファー（５０ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８）で調製した。ＳＥＣクロマトグラフィーを、平衡カラム上への１．５ｍｌのＶＬＰサンプルの負荷、および４５ｍｌの平衡／溶出バッファーでのその溶出で行った。溶出物を１．７ｍＬの画分中で回収し、それぞれの画分のタンパク質含有量を、１０μＬの溶出画分と２００μＬの希釈Ｂｉｏ−Ｒａｄタンパク質色素試薬（Bio-Rad, Hercules, CA）を混合することにより評価した。それぞれの分離の前に、Ｂｌｕｅ Ｄｅｘｔｒａｎ ２０００（GE Healthcare Bio-Science Corp., Piscataway, NJ, USA）での較正を行った。Ｂｌｕｅ Ｄｅｘｔｒａｎ ２０００および宿主タンパク質の両方での溶出プロフィールの比較を、分離の均一性を保証するために、それぞれの分離について行った。
【０１３１】
ＳＥＣ溶出画分のタンパク質分析
浄化された粗抽出物の全タンパク質含有量を、参照標準としてウシ血清アルブミンを使用するＢｒａｄｆｏｒｄ アッセイ（Bio-Rad, Hercules, CA）により決定した。ＳＥＣ溶出画分に存在するタンパク質をアセトンで沈殿させ（Bollagら 1996）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析または免疫ブロット法分析のぞれぞれのために、０．２５容量または０．０５容量のいずれかの変性サンプルローディングバッファー（０．１ＭのＴｒｉｓ ｐＨ６．８、０．０５％のブロモフェノールブルー、１２．５％のグリセロール、４％のＳＤＳおよび５％のベータ−メルカプトエタノール）に再懸濁した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離を還元条件下で行い、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｒｉｌｌａｎｔ Ｂｌｕｅ Ｒ−２５０をタンパク質染色のために使用した。
【０１３２】
Ｈ５に対する血球凝集アッセイを、Nayak and Reichl (2004)により記載されている方法に基づいて行った。簡潔には、試験サンプル（１００μＬ）の連続二重希釈物を１００μＬのＰＢＳを含むＶ字底９６ウェルマイクロタイタープレートにおいて作り、ウェル当たり１００μＬの希釈サンプルを置いた。１００マイクロリットルの０．２５％のシチメンチョウ赤血球懸濁液（Bio Link Inc., Syracuse, NY）をそれぞれのウェルに加え、プレートを室温で２時間インキュベートした。完全血球凝集を示す最も高い希釈度の逆数を血球凝集活性として記録した。並行して、組換えＨＡ５標準（Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４ Ｈ５Ｎ１）（Protein Science Corporation, Meriden, CT）をＰＢＳで希釈し、それぞれのプレート上に対照として使用した。
【０１３３】
図３Ａは、血球凝集活性がカラムの空隙容量に対応する画分に濃縮されることを示し、血球凝集活性が高分子量の構造的組織化から生じることを確認する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（図３Ｂ）は、同じ空隙容量画分（画分７−１０）が、また、約７５ｋＤａで検出可能であるＨＡ０モノマーに対応するバンドで、最も高いＨＡ含有量を提供することを示した。
【０１３４】
実施例３：植物組織の酵素消化はわずかな汚染物質と共にＨＡ−ＶＬＰを放出する
ベンサミアナタバコ植物を、実施例１に記載されているＡＧＬ１／６８５でアグロ浸潤した。実施例１に記載されているように、葉を浸潤から６日後に回収し、〜１ｃｍ２切片に切り、消化し、粗濾過し、遠心した。
【０１３５】
葉の制御した酵素消化により、少なくとも部分的に細胞壁を除去し、かくして、細胞壁と細胞膜との間の空間に存在するタンパク質および成分を抽出培地中へ放出させた。多数の細胞内タンパク質および成分がまだ損傷を受けず、ほとんど無傷なプロトプラスト内に含まれているため、最初の遠心分離工程はそれらの除去を可能にし、したがって、図４に示されているとおり、細胞外植物タンパク質および成分（アポプラスト画分）に加えて、結果として生じる細胞壁分解酵素を含む溶液を提供した。
【０１３６】
図４は、以前に記載されている葉組織の制御された酵素消化後に得られた溶液のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示し、レーン１は使用された酵素混合物を示し、レーン２は酵素消化後に得られた溶液を示す。ＣｏｍｉｔｒｏｌＴＭからの粗抽出物のタンパク質含有量を比較のためにレーン３に提供する。レーン２に示された抽出物に関するバイオマス：バッファー比率は１：５（ｗ／ｖ）であったが、レーン３に関して１：１（ｗ／ｖ）であった。したがって、レーン２および３のそれぞれは、等量の出発物質由来のタンパク質を含む。ほぼ同じバッファー：植物比率のため、機械的植物抽出物は約３．５−４ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度を含有したが、本方法にしたがって得られた酵素植物抽出物は約１ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度を提供した。
【０１３７】
レーン３に存在する主要な汚染物質は、２つの型のタンパク質サブユニット：大型の鎖（Ｌ、約５５ｋＤａ）および小型の鎖（Ｓ、約１３ｋＤａ）で作られているＲｕｂｉｓＣｏ（リブロース−１，５−二リン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ）であることが見出された。全８つの大型の鎖ダイマーおよび８つの小型の鎖は、通常、互いにＲｕｂｉｓＣｏ ５４０ｋＤａの大型複合体にアセンブリーする。この植物タンパク質汚染物質は機械的抽出方法由来の植物抽出物において多量に見出されるが（図４における矢印参照）、それは、本明細書に記載されている酵素消化方法により得られる植物抽出物に実質的には存在しない。したがって、本方法は、処理の早い段階に、とりわけこの主要な植物タンパク質汚染物質の除去を可能にする。
【０１３８】
実施例４：植物組織の酵素消化は、陽イオン交換樹脂上に直接捕捉されることができる条件下でＨＡ−ＶＬＰを放出する
ベンサミアナタバコ植物を、実施例１に記載されているＡＧＬ１／６８５でアグロインフィルトレーションした。葉を浸潤から６日後に回収し、〜１ｃｍ２切片に切り、オービタルシェーカー中で室温で１５時間消化した。消化バッファーは、６００ｍＭのマンニトール、７５ｍＭのクエン酸塩、０．０４％の亜硫酸水素ナトリウム ｐＨ６．０バッファー溶液中にそれぞれ、１．０％（ｖ／ｖ）のマルチフェクトペクチナーゼＦＥ、１．０％（ｖ／ｖ）のマルチフェクト ＣＸ ＣＧおよび／または１．０％（ｖ／ｖ）のマルチフェクト ＣＸ Ｂ（全てＧｅｎｅｎｃｏｒから）を含み、バイオマス：消化バッファー比率は１：２．５（ｗ／ｖ）を使用した。
【０１３９】
消化後、アポプラスト画分を４００μｍのナイロンフィルターを介して濾過し、消化されていない粗植物組織（最初のバイオマスの＜５％）を除去した。次に、濾過された抽出物を５０００×ｇで室温で１５分遠心し、プロトプラストおよび細胞内汚染物質（タンパク質、ＤＮＡ、膜、小胞、色素など）を除去した。次に、上清を、０．６５μｍのガラス繊維フィルター（Sartopore2/Sartorius Stedim）および０．４５／０．２μｍフィルターを使用して深層濾過（浄化のために）し、クロマトグラフィーに付した。
【０１４０】
浄化されたアポプラスト画分を、平衡／溶出バッファー（５０ｍＭのＮａＰＯ４、１００ｍＭのＮａＣｌ、０．００５％のＴｗｅｅｎ ８０ ｐＨ６．０）で平衡化された陽イオン交換カラム（Poros HS Applied Biosystems）に付した。ＵＶが０に戻ったとき、溶出物を、高い濃度のＮａＣｌ（５００ｍＭ）を含む平衡／溶出バッファーで段階的に溶出をした。必要により、クロマトグラフィー画分を、１０ｋＤａのＭＷＣＯを備えたＡｍｉｃｏｎＴＭ装置を使用して１０倍に濃縮した。タンパク質分析を、以前の実施例に記載されているとおりに行った。
【０１４１】
上記条件下で、多数の酵素および植物タンパク質は陽イオン交換樹脂に結合しなかったが、ＨＡ−ＶＬＰは結合し、したがって、溶出画分中に相当豊富なＨＡ−ＶＬＰを提供した（図６）。加えて、図６レーン４および５に示されるとおり、セルラーゼおよびペクチナーゼは、ｐＨ７で陽イオン交換カラムに結合しなかった。結果として、ＨＡ血球凝集活性に基づくＨＡ−ＶＬＰの回収率は、陽イオン交換カラムへの負荷の前の９２％であり、溶出画分中で６６％であった。１９４の精製倍数を、陽イオン交換樹脂からの溶出画分で測定した。
【０１４２】
実施例５：消化バッファーへのＮａＣｌの添加
ベンサミアナタバコ植物を、実施例１に記載されている興味ある血球凝集素（Ｈ１／Ｃａｌ ＷＴ、Ｂ／Ｆｌｏ、Ｈ５／ＩｎｄｏまたはＨ１／Ｃａｌ Ｘ１７９Ａ）を発現する構築物を有するアグロバクテリウムＡＧＬ１株でアグロ浸潤した。葉を浸潤から６日後に回収し、〜１ｃｍ２切片に切り、以下に記載されていることを除いて実施例４にしたがって消化した。濾過、遠心分離および浄化は、実施例４に記載されているとおりに行った。
【０１４３】
ＮａＣｌを消化バッファーに加え、ＨＡ−ＶＬＰ回収率における潜在的な効果を評価した。推測される利点は、浄化中に除去される懸濁液中の植物細胞または粒子とＨＡとの非特異的結合の潜在的な防止ならびにＨＡ−ＶＬＰのコロイド安定性の達成および／または維持および／または改良における潜在的な効果であった。
【０１４４】
消化バッファーへの５００ｍＭのＮａＣｌの添加は、遠心分離によるプロトプラストおよび細胞残屑の除去後に、バイオマス１グラムあたりのＨＡ−ＶＬＰ回収率の増加をもたらした。しかしながら、この増加は、Ｈ１／Ｃａｌ ＷＴおよびＢ／Ｆｌｏ株に対してのみ示されたが、Ｈ５に対する回収率はこのアプローチにより有意に増加しなかった（表４）。
表４：ＨＡ−ＶＬＰ回収率に対する消化工程へのＮａＣｌの添加の効果（血球凝集活性単位、ｄｉｌ：希釈度の逆数により測定される）
【表６】
１ ＮａＣｌ有りの収率（ｄｉｌ／ｇ）を、ＮａＣｌ無しの収率（ｄｉｌ／ｇ）で割った。
【０１４５】
消化中の５００ｍＭのＮａＣｌの添加は、消化中のＨＡ−ＶＬＰの放出の増加をさらにもたらし、次いで、Ｈ１／Ｃａｌ ＷＴおよびＨ１／Ｃａｌ Ｘ−１７９Ａ株の両方に対して浄化後に増加した回収率をもたらしたが、Ｈ５／Ｉｎｄｏ株に対してはもたらさなかった（表５）。
表５：浄化工程後のＨＡ−ＶＬＰ回収率に対する消化工程へのＮａＣｌの添加の効果（血球凝集活性単位により測定される）
【表７】
１回収率は、遠心された消化された抽出物において見出された活性と比較しての深層濾過後に得られた血球凝集活性のパーセントで示される。
【０１４６】
酵素消化中のＮａＣｌの添加有り、または無しのＨＡ−ＶＬＰの会合状態を、Ｈ５／ＩｎｄｏおよびＨ１／Ｃａｌ ＷＴ（それぞれ図７Ａおよび７Ｂ）に対してナノ粒子トラッキング分析（ＮＴＡ）を使用して試験した。消化がＮａＣｌの非存在下で行われたとき、粒子の単分散調製物はＨ５に対して観察されたが、Ｈ１／Ｃａｌ調製物は粒子種のずっと大きいアレイを示した。消化バッファーへのＮａＣｌの添加は、図７Ｃにおいて見出されるみごとに単分散の粒子分布により示されているとおり、Ｈ１／Ｃａｌに関するＨＡ−ＶＬＰ自己会合を減少させた。Ｈ１／Ｃａｌ ＷＴ−ＶＬＰに関する１５０ｎｍの粒子数は、消化バッファーへの５００ｍＭのＮａＣｌの添加により増強された（約５倍）。
【０１４７】
実施例６：色素の制御放出
ベンサミアナタバコ植物を、実施例１に記載されている興味ある血球凝集素（Ｈ５／Ｉｎｄｏ）を発現する構築物を有するアグロバクテリウムＡＧＬ１株でアグロ浸潤した。葉を浸潤から６日後に回収し、〜１ｃｍ２切片に切り、５００ｍＭのＮａＣｌまたは５００ｍＭのＮａＣｌおよび２５ｍＭのＥＤＴＡの消化バッファーへの添加で実施例４に記載されているとおりに消化した。濾過、遠心分離および浄化は、実施例４に記載されているとおりに行った。
【０１４８】
酵素消化工程中の緑色を有する成分の放出は、緑色がかった着色を有するＶＬＰの精製された調製物をもたらした。したがって、細胞壁消化溶液の組成を調べ、減少した緑色着色、したがって増加した純度を有するＶＬＰ精製調製物を得るように調整した。理論に縛られることは望まないが、Ｃａ２＋が細胞壁の中葉の構成の保持において重要な役割を果たすため、通常、植物細胞壁中に高い濃度のＣａ２＋があるという事実を考慮すると、Ｃａ２＋−キレート剤であるＥＤＴＡの添加は細胞壁の酵素的脱重合を容易にし、それにより、無傷な細胞内オルガネラ、例えば、葉緑体を保護し、緑色−色素成分の放出を防止し得る。
【０１４９】
表６に示されるとおり、消化バッファーへの２５ｍＭのＥＤＴＡの添加は、調製物の吸収の差（ＯＤ６７２ｎｍ−ＯＤ６５０ｎｍ）を測定することにより評価されるとおり、精製されたＨ５−ＶＬＰ調製物の緑色着色を減少させる。緑色の成分が高い量で放出されるか、または安定に除去されないとき、ＶＬＰ調製物は△ＯＤ＞０．０４０を示した。
表６：Ｈ５−ＶＬＰ調製物の緑色着色に対する消化バッファーへの２５ｍＭのＥＤＴＡの添加の効果
【表８】
【０１５０】
実施例７：別の消化バッファー組成
ベンサミアナタバコ植物を、実施例１に記載されている興味ある血球凝集素（Ｈ５／Ｉｎｄｏ）を発現する構築物を有するアグロバクテリウムＡＧＬ１株でアグロ浸潤した。葉を浸潤から６日後に回収し、〜１ｃｍ２切片に切り、表７−９に記載されているとおり０％、０．２５％、０．５％、０．７５％または１％ｖ／ｖのマルチフェクトペクチナーゼＦＥ、マルチフェクトＣＸ−ＣＧセルラーゼおよびマルチフェクトＣＸ Ｂセルロースを含む消化バッファーの修飾で実施例４にしたがって消化した。濾過、遠心分離および浄化は、実施例４に記載されているとおりに行った。
【０１５１】
以下の表７および８に示されているとおり、ペクチナーゼは、消化バッファー中に必須でないことが証明された。同様のレベルのＨ５／ＩｎｄｏまたはＨ１／Ｃａｌ ＷＴ ＶＬＰを、ペクチナーゼの存在または非存在下のいずれかで本方法で抽出することができる。さらに、以前の実施例と比較してセルラーゼの濃度の減少が抽出量において有意な影響を有さないことを見出した（表９）。
表７：ベンサミアナタバコの葉の消化によるＨ５／Ｉｎｄｏ ＶＬＰの放出。全ての条件を反復で試験した（ＨＡ−ＶＬＰの濃度は、血球凝集活性、ｄｉｌ：希釈度の逆数により測定した）。
【表９】
＊マルチフェクト ＣＸ ＧＣ
【０１５２】
表８：ベンサミアナタバコの葉の消化によるＨ１／Ｃａｌ ＷＴ ＶＬＰの放出。全ての条件を反復で試験した（ＨＡ−ＶＬＰの濃度は、血球凝集活性、ｄｉｌ：希釈度の逆数により測定した）。
【表１０】
＊それぞれ１％のマルチフェクト ＣＸ ＧＣおよびマルチフェクト ＣＸ Ｂ
【０１５３】
表９：ベンサミアナタバコの葉の消化によるＨ１／Ｃａｌ ＷＴ ＶＬＰの放出。全ての条件を反復で試験した（ＨＡ−ＶＬＰの濃度は、血球凝集活性、ｄｉｌ：希釈度の逆数により測定した）。
【表１１】
＊マルチフェクト ＣＸ ＧＣ
【０１５４】
実施例８：中性ｐＨに近い条件下での酵素消化
消化中のｐＨの制御は、いくつかのＶＬＰの抽出に重要であり得る。消化工程中に起こる細胞壁の脱重合が、適当なバッファーの存在下で溶液を酸性化することができる（すなわちｐＨ６から５）酸糖を放出することができること、およびいくつかのＶＬＰ（例えば、Ｈ３／ＢｒｉｓおよびＢ／Ｆｌｏ ＨＡを含むもの）が穏やかな酸性条件に対する強い感受性をすでに証明していることを考慮して、生産されるＶＬＰの収率に対するかかる起こりうる酸性化の影響を調査した。
【０１５５】
ベンサミアナタバコ植物を、実施例１に記載されている興味ある血球凝集素（Ｂ／Ｆｌｏ、Ｈ５／Ｉｎｄｏ、Ｈ３／Ｂｒｉｓ）を発現する構築物を有するアグロバクテリウムＡＧＬ１株でアグロ浸潤した。葉を浸潤から６日後に回収し、〜１ｃｍ２切片に切り、５００ｍＭのＮａＣｌ；２５もしくは５０ｍＭのＥＤＴＡ；０．０３もしくは０．０４％の亜硫酸水素ナトリウム；０、１００、２００もしくは６００ｍＭのマンニトール、７５、１２５もしくは１５０ｍＭのクエン酸塩；および／または７５ｍＭのＮａＰＯ４を含む消化条件の修飾で、表１０−１４に記載されているとおり調節された消化バッファーのｐＨで実施例４にしたがって消化した。濾過、遠心分離および浄化は、実施例４に記載されているとおりに行った。
【０１５６】
クエン酸塩の濃度の増加（バッファー効果 ｐＨ３．０から５．４）およびリン酸ナトリウムの添加（バッファー効果 ｐＨ最大６．０）を含め、様々な消化バッファー組成を、酵素消化の最後までに約５．５のｐＨをなし遂げるように試験した。表１０は、Ｂ株由来のＶＬＰが、消化後のｐＨが約ｐＨ６．０であったとき、非常に効率的に抽出されたことを示す。
表１０：Ｂ／Ｆｌｏ ＶＬＰの抽出収率に対する消化バッファー組成の効果
【表１２】
１全てのバッファーは、６００ｍＭのマンニトール、０．０４％のメタ重亜硫酸ナトリウムを含んだ
【０１５７】
次に、ｐＨ６．０に近い最終ｐＨ値に達するように、より高いｐＨで消化を開始する効果を試験した。表１１に示されているとおり、ほぼ天然条件で植物細胞壁の消化が可能であり、Ｈ５／Ｉｎｄｏ ＶＬＰに対する抽出収率を悪化させなかった。
表１１：Ｈ５／Ｉｎｄｏ ＶＬＰの抽出収率に対する消化バッファーの最初のｐＨの効果
【表１３】
１全ての消化バッファーは、６００ｍＭのマンニトール、０．０４％のメタ重亜硫酸ナトリウム、１２５ｍＭのクエン酸塩＋７５ｍＭのＮａＰＯ４＋５００ｍＭのＮａＣｌ＋２５ｍＭのＥＤＴＡを含んだ
【０１５８】
消化溶液の他の成分も、また、ＶＬＰの抽出収率に負の影響を及ぼすことなく修飾が可能であることが示された。表１２は、５．４−５．７の消化後ｐＨを得られるとき、Ｂ／Ｆｌｏ ＶＬＰの抽出収率を増強するために、消化溶液に提供することができる修飾を説明する。このような修飾は、クエン酸塩の濃度の増加およびＰＯ４バッファーの添加を含む。ＥＤＴＡの濃度の増加が、一般的に、さらなる酸性化抽出物をもたらし、ＶＬＰ抽出収率を低下させることが見出された。
表１２：Ｂ／Ｆｌｏ ＶＬＰの抽出収率に対する種々の消化バッファー成分の効果
【表１４】
１全てのバッファーは、５００ｍＭのＮａＣｌおよび０．０４％のメタ重亜硫酸ナトリウムを含んだ
【０１５９】
Ｈ３／ブリズベンＶＬＰの抽出収率を改良するために、バッファー組成をさらに修飾した（表１３）。
表１３：Ｈ３／Ｂｒｉｓ ＶＬＰの抽出収率に対する消化溶液中のマンニトールおよび亜硫酸水素ナトリウムの濃度の効果
【表１５】
１全てのバッファーは、１２５ｍＭのクエン酸塩、７５ｍＭのＮａＰＯ４、５００ｍＭのＮａＣｌを含んだ
【０１６０】
表１２および１３に示されているとおり、ＶＬＰの抽出収率に有意に影響を及ぼすことなく、マンニトール濃度を２００ｍＭに減少させることができた。１００ｍＭへのマンニトール濃度のさらなる減少、および消化溶液からのマンニトールの完全な削除は、得られるＨＡ−ＶＬＰのレベルに有意に影響しなかった（表１４）。
表１４：異なる濃度のマンニトールを有するバッファー中で実施されたバイオマスの消化からのＨ５／Ｉｎｄｏ ＶＬＰの放出
【表１６】
１全てのバッファーは、７５ｍＭのクエン酸塩 ｐＨ６．０＋０．０４％のメタ重亜硫酸ナトリウムを含んだ
２２つの試験を、マンニトールなし（試験１）および１００ｍＭのマンニトール有り（試験２）対６００ｍＭのマンニトールで、ＶＬＰの抽出収率を比較するために実施した
【０１６１】
実施例９：広範な種類のＨＡ−ＶＬＰに対する酵素消化の適合性
本明細書に記載されている植物バイオマスに関する酵素消化方法は、広範な種類のＨＡ−ＶＬＰの抽出に適用される可能性がある。上記実施例に示されているＨ５／Ｉｎｄｏ、Ｈ１／Ｃａｌ ＷＴ ＶＬＰ、Ｈ３／ＢｒｉｓおよびＢ／Ｆｌｏを含むＨＡ−ＶＬＰの抽出に加えて、本明細書に記載されている方法は、また、表１５に示されている季節的Ｈ１／ＢｒｉｓおよびＨ１／ＮＣ由来のＨＡ−ＶＬＰの抽出のために適当であることが示された。
表１５：アグロ浸潤されたベンサミアナタバコの葉の消化からの季節的Ｈ１／ＢｒｉｓおよびＨ１／ＮＣ ＶＬＰの放出（血球凝集活性により測定されるＨＡの濃度、ｄｉｌ：希釈度の逆数）。
【表１７】
【０１６２】
全ての引用文献は、まるで、それぞれの個々の文献が具体的および個々に出典明示により本明細書に包含させることを意図するように、ならびに、まるで、完全に本明細書に示されているように、出典明示により本明細書に包含させる。本明細書中における参考文献の引用は、このような文献が本発明に対する先行技術であるとの承認と解釈すべきでなくみなされるべきでない。
【０１６３】
本発明の１つ以上の現在の好ましい態様は、一例として記載されている。本発明は、実質的に上記されているものならびに実施例および図面を基準にしたものの全ての態様、修飾および変化を含む。特許請求の範囲に定義されている本発明の範囲から逸脱することなく、多くの変化および修飾を行うことができることは、当業者に明らかである。このような修飾の例は、実質的に同じ方法で同じ結果をなし遂げるために、本発明の何らかの局面に関して既知の等価物の置換を含む。
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、植物由来のウイルス様粒子（ＶＬＰ）を調製する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
宿主細胞、例えば、大腸菌、昆虫細胞培養および哺乳動物細胞培養における現行の組換え発現戦略は、培養培地中で非常に高レベルでタンパク質を発現させ、分泌させる。これらの系を使用して、高レベルの発現、適当なタンパク質フォールディングおよびタンパク質の翻訳後修飾をなし遂げる。さらに、細胞内タンパク質が他の成分（ＤＮＡ、小胞、膜、色素など）から容易に分離され得るため、発現されたタンパク質の精製は簡単にされる。植物または酵母発現系において、細胞壁は、培養培地への発現されたタンパク質の分泌を防止する。
【０００３】
ウイルス感染に対抗する主な方法の１つは、ワクチン接種による方法である。突発的発生または流行病に対するワクチン、または季節的需要（例えば、秋に起こる毎年の「インフルエンザのシーズン」、または世界中で発見された最近の「豚インフルエンザ」発生）に合うワクチンの生産は、与えられた短い通知期間中に十分な量のワクチンの生産が必要である。インフルエンザワクチンの現在の世界的生産量は、世界中でのインフルエンザの大流行に直面して不十分であり得る。さらに、毎年、優勢なインフルエンザ株は変化し、したがって、その年に必要度の低い貯蔵は実用的ではない。有効なインフルエンザワクチンの経済的な大規模生産は非常に価値がある。
【０００４】
ウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、インフルエンザワクチンを製造するために使用され得る。超構造物、例えば、ＶＬＰは、ウイルスカプシドの構造を模倣するが、ゲノムを欠いており、したがって複製できないか、または二次感染のための手段を提供できない。ＶＬＰは、強い免疫応答を刺激するための単離された（可溶性）組換え抗原の改良された代替品を提供する。ＶＬＰは、特定のウイルスタンパク質の発現時にアセンブリーし、同種のウイルスに類似している外面を呈示するが本当のウイルス粒子とは違って遺伝物質を組み込まない。天然のウイルスと同様の粒子および多価構造における抗原の提示は、バランスのとれた体液性および細胞性成分を伴う免疫応答の刺激増強をなし遂げる。単離された抗原による刺激を越えるこのような改良は、エンベロープＶＬＰが天然の膜結合状態において表面抗原呈示するので、エンベロープウイルスに特に当てはまると考えられる（Grgacic and Anderson, 2006, Methods 40, 60-65）。さらに、ナノ粒子組織を有するインフルエンザＶＬＰは、組換え血球凝集素（ＨＡ）（すなわち、モノマーＨＡまたはロゼットに組織化されたＨＡ；ＨＡの３−８のトリマーのアセンブリー）と比較して、より良いワクチン候補物であることが示されており、それらは体液性および細胞性免疫応答の両方を活性化することができる（Bright, R.Aら 2007, Vaccine 25, 3871-3878）。
【０００５】
現在市販の大多数のインフルエンザワクチンは、卵培養ビリオンから得られたウイルス粒子またはウイルス抗原からなる。卵由来のワクチンの生産は、孵化鶏卵中での生ウイルスの培養に頼る。スプリットインフルエンザワクチンは、デタージェントでの精製されたビリオンの化学的不活性化および破壊後に得られる。組換えインフルエンザ抗原は、パンデミックワクチン製品としてウイルス由来の抗原の有効な代替品である。組換え抗原は、新規株の遺伝子構造上の情報がいったん利用可能となれば、該情報から組換え抗原を製造することができ、生産過程の迅速な開始を可能にする。しかしながら、精製された組換えＨＡサブユニットは、不活性化スプリットインフルエンザワクチンよりも有効性が低いようであり、より高い抗原含量が、強力な免疫応答を産生するために必要である（Treanorら 2007, J. Am. Med. Assoc. 297, 1577-1582）。
【０００６】
インフルエンザＶＬＰは、培養された哺乳動物細胞において、全１０個のインフルエンザタンパク質の共発現から得られている（Menaら 1996, J. Virol. 70, 5016-5024）。いくつかのウイルスタンパク質は、ＶＬＰの生産のために不必要であり、ワクチン開発プログラムにおけるインフルエンザＶＬＰは、２つの主要な抗原性エンベロープタンパク質（ＨＡおよびＮＡ）とＭ１との共発現から、またはＨＡとＭ１のみとの共発現から生産されている（Kangら 2009, Virus Res. 143, 140-146）。Ｃｈｅｎら（2007, J. Virol. 81, 7111-7123）は、ＨＡ単独がＶＬＰ形成および出芽を駆動することができ、Ｍ１共発現をそれらの系において省くことができることを示している。しかしながら、ＨＡがＶＬＰを生産する哺乳動物細胞の表面上でシアル化糖タンパク質に結合することが見出されたため、ウイルスシアリダーゼは共発現され、出芽後、生産細胞からＶＬＰの放出を可能にした。
【０００７】
単純ＶＬＰ生産系、例えば、非構造ウイルスタンパク質の発現を必要としない１つまたは少しのウイルスタンパク質のみの発現に頼るものがワクチンの開発を加速するために望ましい。植物系におけるＶＬＰを含むウイルス抗原の生産は、植物が温室または野外において生長することが可能であり、無菌組織培養方法および処理の必要がない点において有利である。
【０００８】
ＰＣＴ公開ＷＯ２００６／１１９５１６（ＷｉｌｌｉａｍｓｏｎおよびＲｙｂｉｃｋｉによる）は、植物におけるインフルエンザＡ／ベトナム／１１９４／２００４の全長および切断ヒトコドン最適Ｈ５ ＨＡの発現を記載している。切断構築物は、膜固定ドメインを欠いている。ＨＡタンパク質の最大蓄積は、ＥＲに標的化する構築物で得られた。膜標的ドメインを欠いている構築物は検出可能なＨＡを生じなかった。ＶＬＰの生産は報告されなかった。
【０００９】
脂質エンベロープを含むインフルエンザＨＡ ＶＬＰの生産は、ＷＯ２００９／００９８７６およびＷＯ２００９／０７６７７８において本発明者らにより以前に記載されている（D'Aoustらによる；これら両方を出典明示により本明細書に包含させる）。エンベロープウイルスにおいて、脂質層または膜がウイルスにより保持されることが有利であり得る。脂質の組成は、系によって変化し得（例えば、植物生産エンベロープウイルスは、エンベロープ中に植物脂質または植物ステロールを含むであろう）、改善された免疫応答に寄与し得る。
【００１０】
ＨＢＶ表面抗原（ＨＢｓＡｇ）を発現するトランスジェニックタバコにおけるエンベロープＶＬＰのアセンブリーは、Masonら(1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 11745-11749)により記載された。植物生産ＨＢＶ ＶＬＰは、非経口的に投与されたとき、マウスにおいて強力なＢおよびＴ細胞免疫応答を誘導することが示されたが（Huangら 2005, Vaccine 23, 1851-1858）、摂取を介する経口免疫化試験のみが適度の免疫応答を誘導した（Smithら 2003, Vaccine 21, 4011-4021）。Ｇｒｅｃｏ（2007, Vaccine 25, 8228-8240）は、ＨＢｓＡｇとの融合におけるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）エピトープが、トランスジェニックタバコおよびシロイヌナズナにおいて発現されるとき、ＶＬＰとして蓄積し、二価ＶＬＰワクチンを作ることを示した。
【００１１】
トランスジェニックタバコおよびジャガイモ植物におけるウイルスカプシドタンパク質（ＮＶＣＰ）の発現は、非エンベロープＶＬＰのアセンブリーをもたらした（Masonら 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 5335-5340）。ＮＶＣＰ ＶＬＰは、アグロインフィルトレーションされたベンサミアナタバコ(N. benthamiana)の葉において生産され（Huangら 2009, Biotechnol. Bioeng. 103, 706-714）、経口投与時のそれらの免疫原性はマウスにおいて証明された（Santiら 2008, Vaccine 26, 1846-1854）。ＶＬＰの形態における２１５−７５１μｇのＮＶＣＰを含む生のジャガイモの健常成人ボランティアへの２または３回の投与は、免疫化されたボランティアの９５％において免疫応答の発生をもたらした（Tacketら 2000, J. Infect. Dis. 182, 302-305）。非エンベロープＶＬＰは、また、ＨＢＶコア抗原（ＨＢｃＡｇ；Huangら 2009, Biotechnol. Bioeng. 103, 706-714）およびヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）主要カプシドタンパク質Ｌ１（Varsaniら 2003, Arch. Virol. 148, 1771-1786）の発現から得られている。
【００１２】
ＶＬＰをワクチン製剤において使用する前に、植物または植物材料に存在するいくつか、または全てのタンパク質、炭水化物などからＶＬＰを分離することが望ましいかもしれない。興味あるタンパク質を含む間質液抽出物を提供するために減圧および遠心分離処理を含む、植物の細胞間隙からタンパク質を抽出するための方法は、ＰＣＴ公開ＷＯ００／０９７２５（Ｔｕｒｐｅｎらによる）に記載されている。このアプローチは、減圧および遠心分離下で孔を通過する小型タンパク質（５０ｋＤａまたはそれより小さい）に対して適当であるが、大型超構造(superstructure)タンパク質またはタンパク質複合体、例えば、ＶＬＰに対して適当ではない。
【００１３】
McCormickら 1999 (Proc Natl Acad Sci USA 96:703-708)は、発現されたタンパク質を細胞外区画へ標的化するための一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）エピトープに融合されたイネアミラーゼシグナルペプチドの使用、次にｓｃＦｖポリペプチドの回収のための葉および茎組織の減圧浸潤を記載している。Moehnkeら 2008 (Biotechnol Lett 30:1259-1264)は、アポプラスト抽出を使用してタバコから組換え植物アレルゲンを得るためのＭｃＣｏｒｍｉｃｋの減圧浸潤方法の使用を記載している。ＰＣＴ公開ＷＯ２００３／０２５１２４（Ｚｈａｎｇらによる）は、植物において、マウスシグナル配列を使用してアポプラスト間隙に標的化するｓｃＦｖ免疫グロブリンの発現を記載している。
【００１４】
ＶＬＰの複雑さ、およびそれらを生産し得る植物組織を考慮すると、植物タンパク質を含まないか、または植物タンパク質から容易に分離され、エンベロープウイルスの構造および免疫原性特性を保持したままであるＶＬＰを調製する方法が望ましい。
【発明の概要】
【００１５】
発明の概要
本発明は、植物由来のウイルス様粒子（ＶＬＰ）を調製する方法に関する。さらに具体的に、本発明は、インフルエンザ抗原を含むＶＬＰを調製する方法に関する。
【００１６】
本発明の目的は、植物由来のウイルス様粒子を調製する改良された方法を提供することにある。
【００１７】
本発明は、アポプラスト内に局在している植物由来のＶＬＰを含む植物または植物材料を得て；プロトプラストおよびアポプラスト画分を生産し、該アポプラスト画分は、植物由来のＶＬＰを含み；アポプラスト画分を回収することを含む、植物由来のＶＬＰを調製する方法（Ａ）を提供する。該方法は、アポプラスト画分から植物由来のＶＬＰを精製する工程をさらに含み得る。植物由来のＶＬＰは、キメラ植物由来のＶＬＰであり得る。植物由来のＶＬＰは、ウイルスエンベロープタンパク質、ウイルス構造タンパク質、ウイルスカプシドタンパク質、およびウイルスコートタンパク質の群から選択され得る。植物由来のＶＬＰは、インフルエンザの血球凝集素を含み得る。
【００１８】
アポプラストおよびプロトプラスト画分は、酵素組成物による植物または植物材料の処理により生産され得る。酵素組成物は、１つもしくはそれ以上のペクチナーゼ、１つもしくはそれ以上のセルラーゼ、または、１つもしくはそれ以上のペクチナーゼおよび１つもしくはそれ以上のセルラーゼを含み得る。さらに、所望により、酵素組成物は、リパーゼまたはプロテアーゼを含まないか、または該組成物は、添加されたリパーゼまたはプロテアーゼを含まない。
【００１９】
植物または植物材料は、植物を成長、回収または成長および回収することにより得ることができる。植物材料は、植物の一部または全体、１つもしくはそれ以上の植物細胞、葉、茎、根または培養された植物細胞を含み得る。
【００２０】
本発明は、上記されている植物由来のＶＬＰを調製する方法（方法Ａ）であって、ウイルスエンベロープタンパク質、ウイルス構造タンパク質、ウイルスカプシドタンパク質、およびウイルスコートタンパク質の群から選択される該ＶＬＰをコードする核酸が植物に一過性で導入される方法を提供する。あるいは、該核酸は植物のゲノム内に安定に組み込まれる。
【００２１】
本発明は、上記されている植物由来のＶＬＰを調製する方法（方法Ａ）であって、アポプラスト画分から植物由来のＶＬＰを精製する工程をさらに含む方法を提供する。精製する工程は、浄化された抽出物を生産するための深層濾過を用いるアポプラスト画分の濾過、次に、陽イオン交換樹脂を使用する浄化された抽出物のクロマトグラフィーを含み得る。
【００２２】
理論に縛られることは望まないが、翻訳後修飾されたタンパク質の中間型または種々の細胞内区画において起こる他の型のプロセッシングを含むタンパク質が、共抽出されないので、アポプラストから得られるタンパク質は、より均質である。組換えタンパク質の均質性のより高い程度は、一般的にタンパク質を含む調製物のより高い質をもたらし、より高い効力、より長い半減期またはより良い免疫原性能力を含む有益な特性を有する産物をもたらし得る。例えば、高マンノースグリコシル化を含む血液タンパク質は、複合グリコシル化を含むタンパク質よりもより迅速に血液循環中に除去される。アポプラスト画分において生産されるグリコシル化タンパク質は、さらに複合型のグリコシル化を示す。したがって、細胞壁消化を含む本明細書に記載されている方法を使用して調製されたアポプラスト由来タンパク質は、例えば、循環中のより良い半減期を示す。
【００２３】
本発明は、また、植物由来の脂質エンベロープを含む植物由来のＶＬＰを調製する方法（Ｂ）であって、アポプラスト内に局在しているＶＬＰを含む植物または植物材料を得て；植物または植物材料を酵素組成物で処理し、プロトプラスト画分および１つもしくはそれ以上のアポプラストタンパク質組成物を生産し；プロトプラスト画分から１つもしくはそれ以上のアポプラストタンパク質複合体を分離することを含み、該１つもしくはそれ以上のアポプラストタンパク質複合体は該ＶＬＰを含む方法を提供する。酵素組成物は、１つもしくはそれ以上のペクチナーゼ、１つもしくはそれ以上のセルロース、または、１つもしくはそれ以上のペクチナーゼおよび１つもしくはそれ以上のセルラーゼを含み得る。さらに、所望により、酵素組成物はリパーゼまたはプロテアーゼを含まないか、または該組成物は添加されたリパーゼまたはプロテアーゼを含まない。植物由来のＶＬＰは、キメラ植物由来のＶＬＰであり得る。植物由来のＶＬＰは、ウイルスエンベロープタンパク質、ウイルス構造タンパク質、ウイルスカプシドタンパク質、およびウイルスコートタンパク質の群から選択され得る。植物由来のＶＬＰは、インフルエンザの血球凝集素を含み得る。
【００２４】
本発明は、上記されている植物由来のＶＬＰを調製する方法（方法Ｂ）であって、ウイルスエンベロープタンパク質、ウイルス構造タンパク質、ウイルスカプシドタンパク質、およびウイルスコートタンパク質の群から選択されるＶＬＰをコードする核酸が植物に一過性で導入される方法を提供する。あるいは、該核酸は植物のゲノム内に安定に組み込まれる。
【００２５】
本発明は、上記されている植物由来のＶＬＰを調製する方法（方法Ｂ）であって、アポプラスト画分から植物由来のＶＬＰを精製する工程をさらに含む方法を提供する。精製する工程は、浄化された画分を生産するための深層濾過を用いるアポプラスト画分の濾過、次に、陽イオン交換樹脂を使用する浄化された抽出物のクロマトグラフィーを含み得る。
【００２６】
植物由来のＶＬＰは、１つ以上のインフルエンザＨＡポリペプチドを含むＶＬＰを含み得る。インフルエンザＨＡポリペプチドは、また、キメラＨＡポリペプチドであり得る。植物由来のＶＬＰは、赤血球凝集能をさらに含み得る。植物または植物材料は、植物を成長、回収または成長および回収することにより得ることができる。植物材料は、植物の一部または全体、または、１つもしくはそれ以上の植物細胞、葉、茎、根または培養細胞を含み得る。
【００２７】
本発明は、また、植物由来のＶＬＰを含む植物または植物材料を得、消化された画分を生産するために細胞壁分解酵素組成物を使用して植物材料を消化し、濾過された画分を生産するために消化された画分を濾過し、濾過された画分から植物由来のＶＬＰを回収することを含む植物由来のＶＬＰを調製する方法（Ｃ）を提供する。
【００２８】
酵素組成物は、１つもしくはそれ以上のペクチナーゼ、１つもしくはそれ以上のセルロース、または、１つもしくはそれ以上のペクチナーゼおよび１つもしくはそれ以上のセルラーゼを含み得る。さらに、所望により、酵素組成物はリパーゼまたはプロテアーゼを含まないか、または該組成物は添加されたリパーゼまたはプロテアーゼを含まない。植物由来のＶＬＰは、キメラ植物由来のＶＬＰであり得る。植物由来のＶＬＰは、ウイルスエンベロープタンパク質、ウイルス構造タンパク質、ウイルスカプシドタンパク質、およびウイルスコートタンパク質の群から選択され得る。植物由来のＶＬＰは、インフルエンザの血球凝集素を含み得る。
【００２９】
本発明は、上記されている植物由来のＶＬＰを調製する方法（方法Ｃ）であって、ウイルスエンベロープタンパク質、ウイルス構造タンパク質、ウイルスカプシドタンパク質、およびウイルスコートタンパク質の群から選択されるＶＬＰをコードする核酸が植物に一過性で導入される方法を提供する。あるいは、該核酸は植物のゲノム内に安定に組み込まれる。
【００３０】
本発明は、上記されている植物由来のＶＬＰを調製する方法（方法Ｃ）であって、細胞残屑および不溶性材料から濾過された画分中のＶＬＰを分離する工程をさらに含む方法を提供する。分離する工程は、浄化された画分を生産するための遠心分離、深層濾過、または遠心分離および深層濾過の両方により行われ得る。植物由来のＶＬＰは、クロマトグラフィーによりさらに精製され得る、例えば、浄化された抽出物は陽イオン交換樹脂を使用して精製され得る。
【００３１】
植物由来のＶＬＰは、１つ以上のインフルエンザＨＡポリペプチドを含むＶＬＰを含み得る。インフルエンザＨＡポリペプチドは、また、キメラＨＡポリペプチドであり得る。植物由来のＶＬＰは、赤血球凝集能をさらに含み得る。植物または植物材料は、植物を成長、回収または成長および回収することにより得ることができる。植物材料は、植物の一部または全体、または、１つもしくはそれ以上の植物細胞、葉、茎、根または培養細胞を含み得る。
【００３２】
理論に縛られることは望まないが、植物由来の脂質を含む植物製ＶＬＰは、他の製造系において製造されたＶＬＰよりも強い免疫反応を誘導し得、生または弱毒化全ウイルスワクチンにより誘導される免疫反応と比較したとき、これらの植物製ＶＬＰにより誘導される免疫反応はより強い。
【００３３】
宿主細胞から得られるタンパク質抽出物の組成物は、複雑であり、一般的に、単離される興味あるタンパク質または超構造と共に細胞間および細胞内成分を含む。興味あるタンパク質または超構造を豊富にすることができ、調製過程内での効率を増加することができるので、アポプラスト画分の調製、次いで、細胞内タンパク質および成分を分離する工程は、有利である。より少ない効率的な工程を含む単純な過程を有することは、有意な収率の増加およびコスト削減をもたらし得る。たとえ、プロトプラストが抽出処理中に無傷のままでないとしても、細胞壁分解酵素を使用して細胞壁を消化する工程がＶＬＰタンパク質の収率を増加させることも見出された。理論に縛られることは望まないが、細胞壁消化の工程は、細胞壁のポリマー成分をほどき、細胞壁内に結合されたＶＬＰの放出を助け得る。このプロトコールは、また、細胞内成分内のＶＬＰの汚染を最小限にし得る。
【００３４】
植物細胞壁を消化する方法は知られており、細胞壁を消化する酵素カクテル混合物は変化し得る。本発明は、使用された細胞壁消化方法により限定されない。
【００３５】
本明細書に記載されている方法は、均質化、混合または粉砕を含む植物由来のＶＬＰを調製するための方法と比較したとき、植物由来のＶＬＰ抽出物のより少ない破壊および汚染をもたらす。本明細書に記載されている方法は、植物組織のアポプラスト画分を提供し、プロトプラストおよびそれらの成分の完全性を維持し得る。本明細書に記載されている方法は、たとえ、プロトプラストまたはプロトプラストの一部が、それらの完全性をなくし、もはや無傷でなくても、ＶＬＰを精製することにおいて有効である。
【００３６】
これらの方法は、標準的な組織破壊技術、例えば、均質化、混合または粉砕を含むＶＬＰ抽出方法と比較したとき、ＶＬＰのより高い収率を提供する。より良い収率は、一部分において、ＶＬＰおよび／または脂質エンベロープの構造的完全性を破壊するせん断力の減少に起因し得る。アポプラスト画分からのＶＬＰの調製は、アポプラスト画分が細胞質タンパク質を有意に減少しているか、または該タンパク質を有さないため、有利であり得る。したがって、アポプラスト画分中の他のタンパク質および物質からのＨＡのモノマー、ＨＡのトリマーまたはフラグメントを含むＶＬＰの分離は、容易に行われる。しかしながら、ＶＬＰの収率の増加はまた、たとえ、プロトプラスト調製物またはプロトプラスト調製物の一部が無傷でなくても、本明細書に記載されている方法を使用して得ることができる。
【００３７】
本発明のＶＬＰは、また、標準的な組織破壊技術を使用して得られるものよりも、より良い赤血球凝集能を示すと特徴付けられる。この改良された赤血球凝集能は、無傷なＶＬＰ（溶液中に遊離するわずかなＨＡモノマーまたはトリマー）のより良い収率、無傷な脂質エンベロープを有する無傷なＶＬＰのより良い収率、またはそれらの組合せに起因し得る。
【００３８】
ＶＬＰを使用して製造されたワクチンは、全ウイルスを使用して製造されたワクチンと比較して、非感染性であるという利点を提供する。したがって、生物学的封じ込めは、問題ではなく、製造のために必要でない。植物製ＶＬＰは、発現系を温室または野外において生育可能とすることによるさらなる利点を提供し、したがって、有意により経済的であり、スケールアップのために適当である。
【００３９】
さらに、植物は、シアル酸残基の合成および該残基のタンパク質への付加に関与する酵素を含まない。ＶＬＰは、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）の非存在下で生産することができ、植物中でのＶＬＰ生産を確実にするために、ＮＡを共発現する、または生産細胞をシアリダーゼ（ノイラミニダーゼ）で処理もしくは抽出する必要がない。
【００４０】
この発明の概要は、必ずしも、本発明の全ての特徴を記載していない。
【００４１】
本発明のこれらのおよび他の特徴は、図面について言及する以下の記載からさらに明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】図１は、Ｈ５ Ａ／インドネシア／５／０５ 血球凝集素の発現のためのＣＰＭＶＨＴベースの発現カセット（構築物６８５）の略図を示す。
【００４３】
【図２】図２は、Ａ）ＰａｃＩ（３５Ｓプロモーターの上流）からＡｓｃＩ（ＮＯＳターミネーターのすぐ下流）のＨ５／インド（構築物番号６８５）を発現する構築物の一部の核酸配列（配列番号１）を示す。Ａ／インドネシア／５／２００５由来のＨ５のコード配列は下線を引いている。図２Ｂは、構築物番号６８５によってコードされるＨ５ Ａ／インドネシア／５／０５ 血球凝集素のアミノ酸配列（配列番号２）を示す。
【００４４】
【図３Ａ】図３は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）による血球凝集素（ＨＡ）含有構造物の特性化を示す。消化された植物抽出物の遠心分離後に、ペレットを再懸濁し、ＳＥＣにより分別する。図３Ａは、画分あたりの全可溶性タンパク質含有量を示す（塗りつぶされた三角形；最大％、左側 Ｙ軸；Ｂｒａｄｆｏｒｄ法を使用して決定された）。回収された画分の赤血球凝集能（塗りつぶされた棒；右側 Ｙ軸）も示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、ＳＥＣで溶出された画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。画分をアセトンにより沈殿させ、分析前に１／４０容量の還元サンプルローディングバッファー中に再懸濁した。ゲルを０．１％のＣｏｏｍａｓｓｉｅＲ−２５０溶液で染色した。精製されたＶＬＰを対照として用いた。ＨＡ０モノマーに対応するバンドは、矢印により示されている。ＭＷ−分子量標準（ｋＤａ）；Ｃ−精製されたＶＬＰ（対照）；レーン７から１０および１４から１６は、図３Ａに示されているＳＥＣ分析から溶出された画分番号に対応する。
【００４５】
【図４】図４は、酵素消化後に、およびＣｏｍｉｔｒｏｌＴＭホモジェナイザーを使用する機械的均質化により得られるタンパク質プロフィールの比較を示す。サンプルを変性サンプルローディングバッファー中で処理し、タンパク質を溶出画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により分離した。ゲルを０．１％のＣｏｏｍａｓｓｉｅ Ｒ−２５０溶液で染色した。ＭＷ−分子量標準（ｋＤａ）；レーン１−２５μｌの酵素混合物；レーン２−２５μｌの植物組織の酵素消化物およびレーン３−５μｌのＣｏｍｉｔｒｏｌホモジェナイザーで得られた抽出物。
【００４６】
【図５】図５は、アルファルファプラストシアニンプロモーターおよび５’ＵＴＲ、Ａ／インドネシア／５／２００５由来のＨ５の血球凝集素コード配列（構築物＃６６０）、アルファルファプラストシアニン３’ＵＴＲおよびターミネーター配列を含むＨＡ発現カセットの核酸配列（配列番号：９）を示す。
【００４７】
【図６】図６は、アポプラスト画分中のＨＡ−ＶＬＰの分離に関する陽イオン交換樹脂上のＨＡ−ＶＬＰの直接的捕捉を示す。サンプルを非還元変性サンプルローディングバッファー中で処理し、タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。ゲルを０．１％のＣｏｏｍａｓｓｉｅＲ−２５０溶液で染色した。レーン１：遠心分離後のアポプラスト画分、レーン２−３：連続精密濾過後のアポプラスト画分；レーン４：陽イオン交換の負荷；レーン５：陽イオン交換の画分を介する流入物。レーン６；１０×濃縮された陽イオン交換からの溶出物；レーン７：分子量標準（ｋＤａ）。
【００４８】
【図７】図７は、消化バッファーへのＮａＣｌの添加なしで浄化後のＨ５／Ｉｎｄｏ ＶＬＰ（Ａ）およびＨ１／Ｃａｌ ＶＬＰ（Ｂ）ならびに上記添加後のＨ１／Ｃａｌ ＶＬＰ（Ｃ）のナノ粒子トラッキング分析（ＮＴＡ）プロフィールを示す。ＮＴＡ実験を、ＮａｎｏＳｉｇｈｔ ＬＭ２０（NanoSight, Amesbury, UK）で行った。装置は、青色レーザー（４０５ｎｍ）、サンプルチャンバーおよびＶｉｔｏｎ フルオロエラストマー ｏ−リングを備えている。室温でビデオを記録し、ＮＴＡ ２．０ ソフトウェアを使用して分析した。サンプルを６０秒間記録した。最適な粒子分解能が得られるように、シャッター(shutter)および利得(gain)を手動で選択した。
【００４９】
【図８】図８は、異なるバッファーを使用して酵素消化により産生されたＨ３／ブリズベン ＶＬＰの抽出物のウェスタンブロットを示す。レーン１）純粋な組換えＨＡ標準（５μｇ、Immune Technology Corp.製 IT-003-0042p）、レーン２から５は以下のバッファー中で行われた７μｌの遠心された酵素抽出物を含む。レーン２）６００ｍＭのマンニトール＋１２５ｍＭのクエン酸塩＋７５ｍＭのＮａＰＯ４＋２５ｍＭのＥＤＴＡ＋０．０４％の亜硫酸水素塩ｐＨ６．２、レーン３）６００ｍＭのマンニトール＋１２５ｍＭのクエン酸塩＋７５ｍＭのＮａＰＯ４＋５０ｍＭのＥＤＴＡ＋０．０４％の亜硫酸水素塩ｐＨ６．２、レーン４）２００ｍＭのマンニトール＋１２５ｍＭのクエン酸塩＋７５ｍＭのＮａＰＯ４＋２５ｍＭのＥＤＴＡ＋０．０３％の亜硫酸水素塩ｐＨ６．２、レーン５）２００ｍＭのマンニトール＋１２５ｍＭのクエン酸塩＋７５ｍＭのＮａＰＯ４＋５０ｍＭのＥＤＴＡ＋０．０３％の亜硫酸水素塩ｐＨ６．２。矢印は、ＨＡ０の免疫検出シグナルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
詳細な説明
本発明は、植物由来のウイルス様粒子（ＶＬＰ）を調製する方法に関する。さらに具体的には、本発明は、インフルエンザの血球凝集素（ＨＡ）を含むＶＬＰを調製する方法に関する。
【００５１】
以下の記載は、好ましい態様である。
【００５２】
本発明は、興味あるタンパク質またはタンパク質超構造物を得るための方法を提供する。興味あるタンパク質は、プロトプラスト／スフェロプラスト区画を除外する植物細胞部分に対応するアポプラストまたは細胞外区画に存在し得る。該方法は、植物細胞を囲むセルロース植物細胞壁を除去、消化または消化および除去の両方をすることを含む。細胞壁を消化することにより、細胞壁のポリマー成分はほどかれ、興味あるタンパク質またはタンパク質超構造物は、より容易に放出され得る。この方法を使用することにより、主に宿主細胞タンパク質および成分を含むプロトプラスト／スフェロプラスト区画がアポプラストから分離されるため、興味あるタンパク質またはタンパク質超構造物は豊富になる。以下に記載されているとおり、本明細書において提供される方法は、処理中、プロトプラスト／スフェロプラスト区画の完全性を喪失するとき、プロトプラスト／スフェロプラスト区画が無傷でないとき、および、プロトプラスト／スフェロプラスト区画由来の宿主細胞タンパク質および成分の一部がアポプラスト画分に存在するとき、興味あるタンパク質またはタンパク質超構造物を得ることにおいてなお有効である。
【００５３】
タンパク質超構造物の例は２つ以上のポリペプチドからなる構造物であり；該ポリペプチドは同じであるか、または異なっていてよく；異なるとき、それらは、約１：１から約１０：１またはそれ以上の比率で存在し得る。タンパク質超構造物は、１つ以上の脂質、リン脂質、核酸、膜などをさらに含み得る。２つ以上のポリペプチドは、共有結合、ジスルフィド架橋、電荷相互作用、疎水性引力、ファン・デル・ワールス力、水素結合などにより結合され得る。タンパク質超構造物の例は、エンベロープまたは非エンベロープのウイルス様粒子（ＶＬＰ）、例えば、ウイルスエンベロープタンパク質、ウイルス構造タンパク質、ウイルスカプシドタンパク質、またはウイルスコートタンパク質である。
【００５４】
本発明は、また、植物由来のウイルス様粒子（ＶＬＰ）を調製する方法を提供する。該方法は、アポプラスト内に局在される植物由来のＶＬＰを含む植物または植物材料を得て、植物材料からプロトプラスト／スフェロプラスト画分およびアポプラスト画分を生産し、ここで、該アポプラスト画分は植物由来のＶＬＰを含み、アポプラスト画分を回収することを含む。所望により、植物由来のＶＬＰは、アポプラスト画分から精製され得る。
【００５５】
本発明は、また、植物由来の脂質エンベロープを含むＶＬＰを調製する方法を提供する。該方法は、ＶＬＰを含む植物または植物材料を得て、植物または植物材料を酵素組成物で処理して、１つもしくはそれ以上のアポプラストタンパク質複合体およびプロトプラスト／スフェロプラスト画分を生産し、プロトプラスト画分から１つもしくはそれ以上のアポプラストタンパク質複合体を分離することを含む。１つもしくはそれ以上のアポプラストタンパク質複合体は、植物由来の脂質エンベロープを含むＶＬＰを含む。
【００５６】
本発明は、また、植物由来のＶＬＰを含む植物または植物材料を得て、細胞壁分解酵素組成物を使用して植物材料を消化して消化された画分を生産し、消化された画分を濾過して濾過された画分を生産し、濾過された画分から植物由来のＶＬＰを回収することを含む、植物由来のＶＬＰを調製する方法を提供する。この方法において、プロトプラストの完全性は必要ではないかもしれない。
【００５７】
プロトプラストは、細胞壁が完全に、または部分的に除去された植物細胞である。スフェロプラストは、細胞壁の部分的除去を有し得る。プロトプラスト、スフェロプラストまたはプロトプラストおよびスフェロプラストの両方（プロトプラスト／スフェロプラスト）は、本明細書に記載されているとおりに使用され得、本明細書において使用される該用語は互換可能である。細胞壁は機械的に破壊および除去され得るか（例えば、均質化、混合を介して）、細胞壁は完全に、または部分的に酵素的に消化され得るか、または細胞壁は機械的および酵素的方法の組合せ、例えば、均質化、次に細胞壁の消化のための酵素での処理を使用して除去され得る。プロトプラストは、また、培養された植物細胞、例えば、液体培養された植物細胞または固体培養された植物細胞から得ることができる。
【００５８】
植物組織培養、培養された植物細胞およびプロトプラスト、スフェロプラストなどの生産の一般原理を記載している標準参考文献は、植物組織培養に関する入門書、MK Razdan 2nd Ed.(Science Publishers, 2003；これを出典明示により本明細書に包含させる）、または例えば、以下のＵＲＬ：molecular-plant-biotechnology.info/plant-tissue-culture/protoplast-isolation.htmを含む。プロトプラスト（またはスフェロプラスト）生産および操作に関する方法および技術は、例えば、Davey MRら 2005 (Biotechnology Advances 23:131-171；これを出典明示により本明細書に包含させる）に記載されている。タンパク質生化学、分子生物学などの一般的な方法および原理を記載している標準参考文献は、例えば、Ausubelら Current Protocols In Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York (1998 and Supplements to 2001；これを出典明示により本明細書に包含させる）；Sambrookら Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York, 1989（これを出典明示により本明細書に包含させる）；Kaufmanら Eds., Handbook Of Molecular And Cellular Methods In Biology And Medicine, CRC Press, Boca Raton ,1995（これを出典明示により本明細書に包含させる）；McPherson, Ed., Directed Mutagenesis: A Practical Approach, IRL Press, Oxford, 1991（これを出典明示により本明細書に包含させる）を含む。
【００５９】
プロトプラストまたはスフェロプラストの遊離のために植物細胞壁を消化または破壊するための酵素は、当業者に知られており、セルラーゼ（ＥＣ ３．２．１．４）、ペクチナーゼ（ＥＣ ３．２．１．１５）、キシラナーゼ（ＥＣ ３．２．１．８）、キチナーゼ（ＥＣ ３．２．１．１４）、ヘミセルラーゼまたはそれらの組合せを含み得る。適当な酵素の非限定的な例は、セルラーゼ、ヘミセルラーゼおよびペクチナーゼを含む多成分酵素混合物、例えば、ＭＡＣＥＲＯＺＹＭＥＴＭ（おおよそ：セルラーゼ：０．１Ｕ／ｍｇ、ヘミセルラーゼ：０．２５Ｕ／ｍｇ、およびペクチナーゼ：０．５Ｕ／ｍｇを含む）を含む。市販の酵素、酵素混合物および供給者の他の例は、表１に記載されている（植物組織培養に関する入門書参照、MK Razdan 2nd Ed.., Science Publishers, 2003による）。
【００６０】
セルラーゼの別名および型は、エンド−１，４−β−Ｄ−グルカナーゼ；β−１，４−グルカナーゼ；β−１，４−エンドグリカンヒドロラーゼ；セルラーゼＡ；セルロシンＡＰ；エンドグルカナーゼＤ；アルカリセルラーゼ；セルラーゼＡ３；セルデキストリナーゼ；９．５セルラーゼ；アビセラーゼ；パンセラーゼＳＳおよび１，４−（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカン４−グルカノヒドロラーゼを含む。ペクチナーゼ（ポリガラクツロナーゼ）の別名および型は、ペクチン分解酵素；ペクチナーゼ；エンドポリガラクツロナーゼ；ペクトラーゼ；ペクチンヒドロラーゼ；ペクチンポリガラクツロナーゼ；エンド−ポリガラクツロナーゼ；ポリ−α−１，４−ガラクツロニドグリカノヒドロラーゼ；エンドガラクツロナナーゼ；エンド−Ｄ−ガラクツロナナーゼおよびポリ（１，４−α−Ｄ−ガラクツロニド）グリカノヒドロラーゼを含む。キシラナーゼの別名および型は、ヘミセルラーゼ、エンド−（１→４）−β−キシラン４−キシラノヒドロラーゼ；エンド−１，４−キシラナーゼ；キシラナーゼ；β−１，４−キシラナーゼ；エンド−１，４−キシラナーゼ；エンド−β−１，４−キシラナーゼ；エンド−１，４−β−Ｄ−キシラナーゼ；１，４−β−キシランキシラノヒドロラーゼ；β−キシラナーゼ；β−１，４−キシランキシラノヒドロラーゼ；エンド−１，４−β−キシラナーゼ；β−Ｄ−キシラナーゼを含む。キチナーゼの別名および型は、キトデキストリナーゼ；１，４−β−ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ；ポリ−β−グルコサミニダーゼ；β−１，４−ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ；ポリ［１，４−（Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド）］グリカノヒドロラーゼを含む。
【００６１】
表１：プロトプラスト単離のための市販の酵素の非限定的な例
【表１】
【００６２】
特定の酵素または酵素の組合せおよび濃度および反応条件の選択は、ＶＬＰを含むプロトプラストおよびアポプラスト画分が得られる使用される植物組織の型に依存し得る。セルラーゼ、ヘミセルラーゼおよびペクチナーゼ、例えば、ペクチナーゼ ＭＡＣＥＲＯＺＹＭＥＴＭまたはマルチフェクトの混合物は、０．０１％から２．５％（ｖ／ｖ）の範囲の濃度、例えば、０．０１、０．０２、０．０４、０．０６、０．０８、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４または２．５％（ｖ／ｖ）またはそれらの間の任意の量で使用され得る。ＭＡＣＥＲＯＺＹＭＥＴＭまたはマルチフェクトは、単独で、または他の酵素、例えば、セルラーゼ、ペクチナーゼ、ヘミセルラーゼ、またはそれらの組合せと組み合わせて使用され得る。セルラーゼは、０．１％から５％の範囲の濃度、例えば、０．１、０．２５、０．５、０．７５、１．０、１．２５、１．５、１．７５、２．０、２．２５、２．５、２．７５．３．０．３．２５、３．５、３．７５、４．０、４．２５、４．５、４．７５、５．０％（ｗ／ｖ）またはそれらの間の任意の量で使用され得る。
【００６３】
酵素溶液（細胞壁を破壊する組成物、消化する溶液とも称される）は、一般的に、バッファーまたはバッファー系、浸透圧調節物質、および１つもしくはそれ以上の塩、二価の陽イオンまたは他の添加剤を含む。バッファーまたはバッファー系は、酵素活性およびタンパク質またはＶＬＰの安定性に適当な範囲におけるｐＨ、例えば、約ｐＨ５．０から約８．０の範囲内またはそれらの間の任意の値のｐＨを維持するように選択される。使用される選択されたｐＨは、回収されるＶＬＰに依存して変化し得、例えば、ｐＨは、５．０、５．２、５．４、５．６、５．８、６．０、６．２、６．４、６．６、６．８、７．０、７．２、７．４、７．６、７．８、８．０またはそれらの間の任意のｐＨであり得る。バッファーまたはバッファー系の例は、限定はしないが、ＭＥＳ、リン酸塩、クエン酸塩などを含む。１つ以上のバッファーまたはバッファー系は、酵素溶液（消化する溶液）中で混合され得；１つ以上のバッファーは、０ｍＭから約２００ｍＭの濃度またはそれらの間の任意の量、例えば、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０または１９０ｍＭまたはそれらの間の任意の量で存在し得る。適合性に依存して、浸透圧調節物質成分を所望により加えることができる。浸透圧調節物質およびその濃度は、酵素溶液の浸透力を上げるために選択される。浸透圧調節物質の例は、マンニトール、ソルビトールまたは他の糖アルコール、種々のポリマー長のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などを含む。浸透圧調節物質の濃度範囲は、植物種、使用される浸透圧調節物質の型および選択される植物組織の型（元の種または器官、例えば、葉または茎）に依存して変化し得る。一般的に、該範囲は、０Ｍから約０．８Ｍ、例えば、０．０５、０．１、０．１５、０．２、０．２５、０．３、０．３５、０．４、０．５、０．６、０．７または０．７５Ｍまたはそれらの間の任意の量、例えば、０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００ｎＭのマンニトールまたはそれらの間の任意の量である。浸透圧調節物質の濃度は、また、パーセンテージ（ｗ／ｖ）として示され得る。いくつかの植物または組織型において、それは、わずかに高張性の調製物を使用するために有益であり得、細胞壁から植物細胞の細胞膜の分離を容易にし得る。浸透圧調節物質は、また、消化中に除くことができる。
【００６４】
植物消化のために設定するための別のパラメーターは温度である。温度は、消化処理中、所望により、コントロールされ得る。有用な温度範囲は、４℃から４０℃もしくはそれらの間の任意の温度、例えば、約４℃から約１５℃もしくはそれらの間の任意の温度、または、約４℃から約２２℃もしくはそれらの間の任意の温度である。選択される温度に依存して、他の消化の実験パラメーターは、最適な抽出条件を維持するために調節され得る。
【００６５】
陽イオン、塩またはそれらの両方を、例えば、二価の陽イオン、例えば、Ｃａ２＋またはＭｇ２＋を０．５−５０ｍＭまたはそれらの間の任意の量で、塩、例えば、ＣａＣｌ２、ＮａＣｌ、ＣｕＳＯ４、ＫＮＯ３などを約０から約７５０ｍＭまたはそれらの間の任意の量、例えば、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００または７５０ｍＭで、細胞膜安定性を改善するために加えられ得る。他の添加剤、例えば、キレート剤、例えば、限定はしないが、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡを約０から約２００ｍＭまたはそれらの間の任意の量、例えば、５、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００ｍＭまたはそれらの間の任意の量で、酸化を防止するための還元剤、例えば、限定はしないが、亜硫酸水素ナトリウムまたはアスコルビン酸を０．００５−０．４％またはそれらの間の任意の量、例えば、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．１５、０．２、０，２５、０．３、０．３５、０．４％またはそれらの間の任意の量、特異的酵素阻害剤（以下参照）で、所望により、葉の老化の阻害剤、例えば、シクロヘキシミド、カイネチンまたは１つ以上のポリアミンもまた、加え得る。
【００６６】
消化溶液は、また、約０から約６００ｍＭのマンニトール、約０から約５００ｍＭのＮａＣｌ、約０から約５０ｍＭのＥＤＴＡ、約１％から約２％ｖ／ｖのセルロース、約０から約１％ｖ／ｖのペクチナーゼ、約０．０３から約０．０４％のメタ重亜硫酸ナトリウム、約０から約１２５ｍＭのクエン酸塩または約０から７５ｍＭのＮａＰＯ４の１つ以上を含み得る。
【００６７】
植物材料は、植物細胞壁への酵素または酵素組成物の接触を増強するために処理され得る。例えば、葉の表皮は、酵素組成物での処理前に除去されるか、またははぎ取られ得る。植物材料は、小さな一片（手動または破砕または切断装置、例えば、Ｕｒｓｃｈｅｌ ｓｌｉｃｅｒで）に切られ得る；切断された植物材料には、部分的減圧下で酵素組成物がさらに浸潤し得る（Nishimura and Beevers 1978, Plant Physiol 62:40-43; Newellら 1998, J. Exp Botany 49:817-827）。また、酵素組成物での処置前または中に、植物材料の機械的摂動が植物組織に適用され得る（Giridharら 1989. Protoplasma 151:151-157）。さらに、培養された植物細胞、液体または固体のいずれかでの培養物は、プロトプラストまたはスフェロプラストを調製するために使用され得る。
【００６８】
リパーゼまたはプロテアーゼを欠いているか、または不活性化したリパーゼまたはプロテアーゼを有する酵素組成物を使用することが望ましいかもしれない。いくつかの態様において、１つ以上のプロテアーゼまたはリパーゼ阻害剤は、酵素組成物中に含まれ得る。リパーゼ阻害剤の例はＲＨＣ８０２６７（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）を含み；プロテアーゼ阻害剤の例はＥ−６４、Ｎａ２ＥＤＴＡ、ペプスタチン、アプロチニン、ＰＭＳＦ、ペファブロック、ロイペプチン、ベスタチンなどを含む。
【００６９】
酵素組成物中で植物材料を混合または撹拌するあらゆる適当な方法が使用され得る。例えば、植物材料を、トレイもしくはパンにおいて、または回転震盪器を介して穏やかに回転または振動させ、回転または振動ドラム中でころがし得る。プロトプラスト（および／またはスフェロプラスト）損傷を最小限にするために、それらが消化スープから除去されるまで用心すべきである。したがって、消化容器(digestion vessel)が選択されるべきである。
【００７０】
非限定的な例として、５００ｍＭのマンニトール、１０ｍのＣａＣｌ２および５ｍＭのＭＥＳ（ｐＨ５．６）中に１．５％のセルラーゼ（Ｏｎｏｚｕｋａ Ｒ−１０）および０．３７５％のＭＡＣＥＲＯＺＹＭＥＴＭを含む酵素組成物は、いくつかのタバコ組織からのプロトプラスト（またはスフェロプラスト）の生産ために使用され得る。本明細書に記載されているとおり、マンニトールの濃度は、また、約０から約５００ｍＭまたはそれらの間の任意の量で変化され得る。本明細書に記載されている情報を提供された当業者は、ＶＬＰの生産のために使用されるタバコ種または別の種の年齢および系統に対して適当な酵素組成物を決定することができる。
【００７１】
細胞壁の破壊または細胞壁の部分的消化において、プロトプラスト画分（プロトプラストおよび／またはスフェロプラストを含む）および「アポプラスト画分」が得られる。あるいは、「消化された画分」を得ることができる。以下に記載されているとおり、プロトプラスト画分の完全性は、本明細書に記載されているように高収率でタンパク質を生産するために必要でないであろう、したがって、アポプラスト画分または消化された画分は、タンパク質、例えば、限定はしないが、ＶＬＰ、ウイルスエンベロープタンパク質、ウイルス構造タンパク質、ウイルスカプシドタンパク質、ウイルスコートタンパク質の抽出のために使用され得る。
【００７２】
「アポプラスト画分」とは、プロトプラストの完全性の維持を助けるために使用され得る浸透圧調節物質および／または他の成分の存在下で、植物材料の細胞壁分解酵素を使用する酵素消化または部分的酵素消化の後に得られる画分を意味する。アポプラスト画分は、崩壊したプロトプラスト（またはスフェロプラスト）から生じるいくつかの成分を含み得る。例えば、アポプラスト画分は、約０から約５０％（ｖ／ｖ）またはそれらの間の任意の量のプロトプラスト画分由来の成分、または、０、０．１、０．５、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５もしくは５０％（ｖ／ｖ）またはそれらの間の任意の量のプロトプラスト画分由来の成分を含み得る。
【００７３】
「消化された画分」とは、植物材料の細胞壁分解酵素を使用する酵素消化または部分的酵素消化の後に残存する画分を意味し、しかしながら、プロトプラストの完全性は必要ではなく、消化された画分は無傷な、崩壊された、または、無傷かつ崩壊されたプロトプラストを含み得る。消化された画分を生産するために使用される細胞壁分解酵素を含む組成物は、浸透圧調節物質を含み得るか、または浸透圧調節物質は、プロトプラストを得るために使用される標準手順に存在する量と比較したとき少ない量で存在し得るか、または浸透圧調節物質は、組成物に非存在であり得る。消化された画分はアポプラスト画分およびプロトプラスト／スフェロプラスト画分を含むが、しかしながら、プロトプラスト／スフェロプラスト画分は無傷であるか、または無傷でないかもしれない。消化された画分は、細胞内成分および細胞外成分を含む。浸透圧調節物質がプロトプラスト／スフェロプラストを無傷で維持するために使用されるとき、細胞内成分は、プロトプラスト／スフェロプラストの形態において見いだされ得る。浸透圧調節物質が消化溶液中に使用されないとき、プロトプラスト／スフェロプラストは崩壊し得、細胞内および細胞外成分は、消化された画分中に混合され得る。本明細書に記載されているとおり、ＶＬＰは、任意の適当な技術を使用して消化された画分の成分から分離され得る。理論に縛られることは望まないが、細胞壁消化の工程は、細胞壁消化の工程は、細胞壁のポリマー成分をほどき、そうでなければ細胞壁内に捕捉されているＶＬＰの放出を助け得る。このプロトコールは、また、細胞内成分でのＶＬＰの汚染を最小限にする。ＶＬＰは、興味ある該タンパク質または超構造タンパク質を含む分離された画分を得るために、低速遠心分離、次に、濾過、深層濾過、沈降、沈殿、例えば、限定はしないが、硫酸アンモニウム沈殿、またはそれらの組合せを使用して、酵素消化後の細胞残屑から分離され得る。
【００７４】
浸透圧調節物質が使用されるとき、プロトプラスト／スフェロプラスト画分またはプロトプラストを含む画分は、ＶＬＰおよび／またはＶＬＰを含むプロトプラスト／スフェロプラストを含む分離された画分を得るために、任意の適当な技術、例えば、限定はしないが、遠心分離、濾過、深層濾過、沈降、沈殿、またはそれらの組合せを使用して、アポプラスト画分から分離され得る。
【００７５】
プロトプラスト（およびスフェロプラスト）画分、またはプロトプラストを含む画分は、分離された画分を得るために、任意の適当な技術、例えば、限定はしないが、遠心分離、濾過、深層濾過、沈降、沈殿、またはそれらの組合せを使用して、アポプラスト画分から分離され得る。
【００７６】
分離された画分は、例えば、上清（遠心、沈降、または沈殿されるとき）または濾液（濾過されるとき）であり得、ＶＬＰに関して豊富である。分離された画分は、例えば、さらなる遠心分離工程、沈殿、クロマトグラフィー工程（例えば、サイズ排除、イオン交換クロマトグラフィー）、タンジェンシャルフロー濾過またはそれらの組合せにより、ＶＬＰを単離、精製、濃縮またはそれらの組合せでさらに処理され得る。精製されたＶＬＰの存在は、例えば、ネイティブ(native)またはＳＤＳ−ＰＡＧＥ、適当な検出抗体を使用するウエスタン分析、毛細管電気泳動法または当業者に明らかである任意の他の方法により確認され得る。
【００７７】
アポプラストは、細胞膜の外側の植物細胞の部分であり、植物の細胞壁および細胞間隙を含む。プロトプラスト（および／またはスフェロプラスト）の完全性が消化およびさらなる処理中に維持されていることが好ましいが、ＶＬＰを豊富にするために、プロトプラストが無傷のままである必要はない。
【００７８】
合成中、ＶＬＰは、細胞膜の外側に分泌される。ＶＬＰは、約２０ｎｍから１μｍまたはそれらの間の任意の量、例えば、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、または２００ｎｍ、または、それらの間の任意の量、例えば、１００ｎｍの平均サイズであり、脂質膜を含み得る。いったん合成されると、ＶＬＰは、そのサイズのため、細胞膜および細胞壁間に捕捉されたままの可能性があり、植物タンパク質を得るために使用される標準的な機械的方法を使用する単離またはさらなる精製ではアクセスできない可能性がある。収率を最大限にし、細胞タンパク質でのＶＬＰ画分の汚染を最小限にし、ＶＬＰ、いくつかの態様において、関連脂質エンベロープまたは膜の完全性を維持するために、プロトプラスト（および／またはスフェロプラスト）に対する機械的損傷を最小限にするＶＬＰを放出するために細胞壁を破壊する方法、例えば、本明細書に記載されている酵素方法は有用であり得る。しかしながら、全てのプロトプラストの完全性が処理中に維持されている必要はない。
【００７９】
本発明のいくつかの局面における植物において生産されるＶＬＰは、植物由来の脂質と複合体化し得る。ＶＬＰは、ＨＡ０前駆体形態、またはジスルフィド架橋形態により共に保持されているＨＡ１もしくはＨＡ２ドメインを含み得る。植物由来の脂質は、脂質二重層の形態であり得、ＶＬＰを囲むエンベロープをさらに含み得る。植物由来の脂質は、限定はしないが、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、スフィンゴ糖脂質、植物ステロールまたはそれらの組合せを含む、ＶＬＰが生産される植物の細胞膜の脂質成分を含み得る。植物由来の脂質は、「植物脂質」と称され得る。植物ステロールの例は当分野で知られており、例えば、スチグマステロール、シトステロール、２４−メチルコレステロールおよびコレステロールを含む（Mongrandら 2004, J. Biol Chem 279:36277-86）。
【００８０】
ウイルス構造タンパク質、例えば、ＨＡの正確な折り畳み、および、ＨＡのトリマー形成は、ＶＬＰのアセンブリーに望ましい。ＶＬＰおよび特に植物由来の脂質エンベロープを含むＶＬＰは、対象に投与されるとき、構造タンパク質のモノマーの投与と比較して、優れた免疫応答を提供し得る。
【００８１】
いくつかの態様において、ポリペプチド発現は、植物の任意の細胞内または細胞外間隙、オルガネラまたは組織に標的化され得る。発現されるポリペプチドを特定の位置に局在させるために、ポリペプチドをコードする核酸は、シグナルペプチドをコードする核酸配列に連結され得る。あるいは、シグナルペプチドは、輸送ペプチドまたはシグナル配列とも称され得る。発現されるポリペプチドのアポプラストへの局在化を指向するためのシグナルペプチドまたはペプチド配列は、限定はしないが、イネアミラーゼシグナルペプチド（McCormick 1999, Proc Natl Acad Sci USA 96:703-708）、アミノ酸配列：
ＭＡＫＮＶＡＩＦＧＬＬＦＳＬＬＬＬＶＰＳＱＩＦＡＥＥ；配列番号１０
を有するタンパク質ジスルフィドイソメラーゼシグナルペプチド（ＰＤＩ）、植物病因関連タンパク質（PRP; Szyperskiら PNAS 95:2262-2262）、例えば、タバコ植物病因関連タンパク質２（ＰＲＰ）、ヒトモノクローナル抗体シグナルペプチド（ＳＰ）、またはあらゆる天然血球凝集素シグナルペプチドを含む。
【００８２】
いくつかの例において、発現されたポリペプチドは、例えば、該ポリペプチドがシグナルペプチドまたは輸送ペプチドの非存在下で発現し、分泌されるとき、特異的な細胞間または細胞外間隙（例えば、アポプラスト）、オルガネラまたは組織に蓄積し得る。
【００８３】
「ウイルス様粒子（ＶＬＰ）」または「ウイルス様粒子」または「ＶＬＰ」なる用語は、自己アセンブリーし、ウイルス表面タンパク質、例えば、インフルエンザＨＡタンパク質またはキメラインフルエンザＨＡタンパク質を含む構造物を示す。ＶＬＰおよびキメラＶＬＰは、一般的に、感染において生産されるビリオンと形態学的および抗原的に類似するが、複製に十分な遺伝情報を欠いており、したがって非感染性である。ＶＬＰおよびキメラＶＬＰは、植物宿主細胞を含む適当な宿主細胞において生産され、所望によりさらに精製され得る。
【００８４】
インフルエンザＶＬＰおよびキメラインフルエンザＶＬＰが本明細書に例示されているが、本明細書に記載されている方法は、アポプラストに局在するか、またはアポプラストに分泌されるあらゆる植物由来のＶＬＰに対して使用され得る。
【００８５】
「キメラタンパク質」または「キメラポリペプチド」とは、単一のポリペプチドとして融合された、２つまたはそれ以上の供給源、例えば、限定はしないが、２つまたはそれ以上のインフルエンザ型またはサブタイプ由来のアミノ酸配列を含むタンパク質またはポリペプチドを意味する。キメラタンパク質またはポリペプチドは、ポリペプチドまたはタンパク質の残部と同種（すなわち天然）または異種であるシグナルペプチドを含み得る。キメラタンパク質またはキメラポリペプチドは、キメラヌクレオチド配列からの転写産物として生産され得、無傷なままであるか、または必要により、キメラタンパク質またはキメラポリペプチドは合成後に開裂され得る。無傷なキメラタンパク質またはキメラタンパク質の開裂した部分は結合して、マルチマータンパク質を形成し得る。キメラタンパク質またはキメラポリペプチドは、また、ジスルフィド架橋を介して結合されているサブユニットを含むタンパク質またはポリペプチド（すなわち、マルチマータンパク質）を含み得る。例えば、２つまたはそれ以上の供給源由来のアミノ酸配列を含むキメラポリペプチドは、サブユニットおよびジスルフィド架橋を介して結合されているサブユニットにプロセッシングされ、キメラタンパク質またはキメラポリペプチドを生産し得る。
【００８６】
ポリペプチドは、インフルエンザの血球凝集素（ＨＡ）であってよく、ポリペプチドを作るそれぞれの２つまたはそれ以上のアミノ酸配列は、異なるＨＡから得て、キメラＨＡまたはキメラインフルエンザＨＡを生産することができる。キメラＨＡは、また、合成後に開裂される異種シグナルペプチド（キメラＨＡプレタンパク質）を含むアミノ酸配列を含み得る。本明細書に記載されている本発明において使用され得るＨＡタンパク質の例は、ＷＯ２００９／００９８７６；ＷＯ２００９／０７６７７８；ＷＯ２０１０／００３２２５（これらを出典明示により本明細書に包含させる）において見いだされ得る。キメラポリペプチドをコードする核酸は、「キメラ核酸」または「キメラヌクレオチド配列」として記載されていてもよい。キメラＨＡからなるウイルス様粒子は、「キメラＶＬＰ」として記載されていてもよい。キメラＶＬＰは、２０１０年６月２５日に出願されたＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＣＡ２０１０／０００９８３、および米国仮出願第６１／２２０，１６１号（２００９年６月２４日に出願された）（これらを出典明示により本明細書に包含させる）にさらに記載されている。ＶＬＰは、天然またはキメラＨＡの発現から得ることができる。
【００８７】
本発明により提供される方法によって調製されるＶＬＰのＨＡは、既知の配列および開発または同定されている変異体ＨＡ配列を含む。さらに、本明細書に記載されているように生産されるＶＬＰは、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）または他の成分、例えば、Ｍ１（Ｍタンパク質）、Ｍ２、ＮＳなどを含まない。しかしながら、ＨＡおよびＮＡを含むＶＬＰが望まれる場合は、ＮＡおよびＭ１をＨＡと共発現させ得る。
【００８８】
一般的に、「脂質」なる用語は、脂溶性（親油性）の天然分子を示す。本発明のいくつかの局面によって植物において生産されるキメラＶＬＰは、植物由来の脂質と複合体化し得る。植物由来の脂質は、脂質二重層の形態であり得、ＶＬＰをとり囲むエンベロープをさらに含み得る。ＶＬＰが生産されるとき、植物由来の脂質は、リン脂質、トリ−、ジ−、およびモノグリセリド、ならびに脂溶性ステロールまたはステロールを含む代謝産物を含む植物の細胞膜の脂質成分を含み得る。例えば、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、スフィンゴ糖脂質、植物ステロールまたはそれらの組合せを含む。あるいは、植物由来の脂質は、「植物脂質」とも称され得る。植物ステロールの例は、カンペステロール、スチグマステロール、エルゴステロール、ブラシカステロール、デルタ−７−スチグマステロール、デルタ−７−アベナステロール、ダウノステロール(daunosterol)、シトステロール、２４−メチルコレステロール、コレステロールまたはベータ−シトステロール（Mongrandら 2004, J. Biol Chem 279:36277-86）を含む。当業者は容易に理解できるとおり、細胞の細胞膜の脂質組成は、細胞または細胞を得る生物体もしくは種の培養または成長条件にしたがって変化し得る。
【００８９】
細胞膜は、一般的に、脂質二重層ならびに種々の機能に関するタンパク質を含む。特定の脂質の局在濃度は、脂質二重層において見いだすことができ、「脂質ラフト」と称される。これらの脂質ラフトマイクロドメインは、スフィンゴ脂質およびステロールにおいて豊富であり得る。理論に縛られることは望まないが、脂質ラフトは、エンドおよびエキソサイトーシス、ウイルスまたは他の感染因子の進入または放出、細胞間シグナル変換、細胞または生物体の他の構造成分、例えば、細胞内および細胞外マトリックスとの相互作用における有意な役割を有し得る。
【００９０】
脂質エンベロープを含むＶＬＰは、以前に、ＷＯ２００９／００９８７６；ＷＯ２００９／０７６７７８およびＷＯ２０１０／００３２２５（これらは出典明示により本明細書に包含させる）に記載されている。インフルエンザウイルスに関して、本明細書において使用される「血球凝集素」または「ＨＡ」なる用語は、インフルエンザウイルス粒子の構造的糖タンパク質を示す。本発明のＨＡは、あらゆるサブタイプから得ることができる。例えば、ＨＡは、サブタイプＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５もしくはＨ１６、またはインフルエンザＢ型もしくはＣ型のものであってよい。本発明の組換えＨＡは、また、任意の血球凝集素の配列に基づくアミノ酸配列を含み得る。インフルエンザの血球凝集素の構造は、よく試験されており、二次、三次および四次構造における高程度の保存を証明されている。アミノ酸配列は変化し得るが、この構造的保存は保存されている（例えば、Skehel and Wiley, 2000 Ann Rev Biochem 69:531-69; Vaccaroら 2005参照；これらは出典明示により本明細書に包含させる）。ＨＡをコードするヌクレオチド配列は知られており、例えば、BioDefense and Public Health Database（現在のインフルエンザ研究データベース；Squiresら 2008 Nucleic Acids Research 36:D497-D503）、例えば、ＵＲＬ：biohealthbase.org/GSearch/home.do?decorator=Influenza）または全米バイオテクノロジー情報センターにより支えられているデータベース（ＮＣＢＩ；例えば、ＵＲＬ：ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=nuccore&cmd=search&term=Influenza）（これら両方を出典明示により本明細書に包含させる）から利用できる。
【００９１】
本発明は、また、ヒトまたは宿主動物、例えば、霊長類、ウマ、ブタ、トリ、ヒツジ、水鳥、渡り鳥、ウズラ、カモ、ガチョウ、家禽、ニワトリ、ラクダ、イヌ(canine)、イヌ(dog)、ネコ(feline)、ネコ(cat)、トラ、ヒョウ、ジャコウネコ、ミンク、テン、フェレット、ペット、家畜、マウス、ラット、アシカ、クジラなどに感染するウイルスのインフルエンザＶＬＰを含むＶＬＰを調製、単離または調製および単離の両方をする方法に関する。いくつかのインフルエンザウイルスは、１つ以上の宿主動物に感染し得る。
【００９２】
アミノ酸変異は、インフルエンザウイルスの血球凝集素において許容される。この変異は、継続的に同定されている新規の株を提供する。新規の株間の感染性は、変化していてもよい。しかしながら、次にＶＬＰを形成する血球凝集素トリマーの形成は維持されている。本発明は、また、ＨＡサブタイプまたは配列、またはＶＬＰを含むキメラＨＡ、または起源の種にかかわらず、何らかの植物由来のＶＬＰを調製する方法を含む。
【００９３】
血球凝集素の正確な折り畳みは、インフルエンザの血球凝集素の他の特性中で、タンパク質の安定性、マルチマーの形成、ＶＬＰの形成およびＨＡの機能（血球凝集する能力）のために重要であり得る。タンパク質の折り畳みは、限定はしないが、タンパク質の配列、タンパク質の相対的量、細胞内の密集度、折り畳まれた、部分的に折り畳まれた、もしくは折り畳まれていないタンパク質に結合もしくは一過性に結合し得る補因子の利用可能性、１つ以上のシャペロンタンパク質の存在などを含む１つ以上の因子により影響され得る。
【００９４】
熱ショックタンパク質（Ｈｓｐ）またはストレスタンパク質は、シャペロンタンパク質の例であり、タンパク質合成、細胞内輸送、誤った折り畳みの防止、タンパク質凝集の防止、タンパク質複合体のアセンブリーおよび脱アセンブリー、タンパク質フォールディングならびにタンパク質脱凝集を含む種々の細胞過程に参加し得る。このようなシャペロンタンパク質の例は、限定はしないが、Ｈｓｐ６０、Ｈｓｐ６５、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ９０、Ｈｓｐ１００、Ｈｓｐ２０−３０、Ｈｓｐ１０、Ｈｓｐ１００−２００、Ｈｓｐ１００、Ｈｓｐ９０、Ｌｏｎ、ＴＦ５５、ＦＫＢＰ、シクロフィリン、ＣｌｐＰ、ＧｒｐＥ、ユビキチン、カルネキシンおよびタンパク質ジスルフィドイソメラーゼを含む（例えば、Macario, A.J.L., Cold Spring Harbor Laboratory Res. 25:59-70. 1995; Parsell, D.A. & Lindquist, S. Ann. Rev. Genet. 27:437-496 (1993)；米国特許第５，２３２，８３３号参照）。シャペロンタンパク質、例えば、限定はしないがＨｓｐ４０およびＨｓｐ７０は、キメラＨＡ（２０１０年６月２５日に出願されたＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＣＡ２０１０／０００９８３、および２００９年６月２４日に出願された米国仮出願第６１／２２０，１６１号；ＷＯ２００９／００９８７６およびＷＯ２００９／０７６７７８（これらの全てを出典明示により本明細書に包含させる）の折り畳みを保証するために使用され得る。タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ；受入番号Ｚ１１４９９）も使用され得る。
【００９５】
いったん回収されれば、ＶＬＰは、例えば、血球凝集アッセイ、電子顕微鏡、光散乱、サイズ排除クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、ウェスタンブロット分析または電気泳動法により、構造、サイズ効力または活性について評価され得る。ＶＬＰのサイズ、濃度、活性および組成を評価するためのこれらの、および他の方法は、当該分野で知られている。
【００９６】
分取サイズ排除クロマトグラフィーにおいて、ＶＬＰを含む調製物を、本明細書に記載されている方法により得て、不溶性材料を遠心分離により除去し得る。ＰＥＧでの沈殿も利益を与え得る。回収されたタンパク質を慣用の方法（例えば、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイ、ＢＣＡ））を使用して定量し、抽出物を例えば、ＳＥＰＨＡＣＲＹＬＴＭ、ＳＥＰＨＡＤＥＸＴＭもしくは同様の媒体を使用するサイズ排除カラムに通過させ、画分を回収してもよい。Ｂｌｕｅ Ｄｅｘｔｒａｎ ２０００または適当なタンパク質は、較正標準として使用され得る。抽出物を、また、陽イオン交換カラムに通過させ、活性な画分を回収してもよい。クロマトグラフィー後、画分を、タンパク質電気泳動法、免疫ブロット法、または両方によりさらに分析し、ＶＬＰおよび画分のタンパク質成分の存在を確認してもよい。
【００９７】
血球凝集アッセイは、当分野でよく知られている方法を使用して、ＶＬＰ含有画分の赤血球凝集能を評価するために使用され得る。理論に縛られることは望まないが、異なる動物由来のＲＢＣへのＨＡの結合能力は、シアル酸α２，３またはα２，３に対するＨＡのアフィニティーおよびＲＢＣの表面上のこれらのシアル酸の存在により駆動される。インフルエンザウイルス由来のウマおよびトリＨＡは、シチメンチョウ、ニワトリ、アヒル、モルモット、ヒト、ヒツジ、ウマおよびウシを含む全てのいくつかの種由来の赤血球を凝集させる。一方で、ヒトＨＡは、シチメンチョウ、ニワトリ、アヒル、モルモット、ヒトおよびヒツジの赤血球に結合する（Ito Tら 1997, Virology, 227:493-499; Medeiros Rら 2001. Virology 289:74-85）。
【００９８】
血球凝集阻害（ＨＩまたはＨＡＩ）アッセイは、また、組換えＨＡによる赤血球（ＲＢＣ）の凝集を阻害することができる、キメラＨＡまたはキメラＶＬＰを含むワクチンまたはワクチン組成物により誘導される抗体の有効性を証明するために使用され得る。血清サンプルの血球凝集阻害抗体力価は、マイクロタイターＨＡＩにより評価され得る（Aymardら 1973）。任意の種、例えば、ウマ、シチメンチョウ、ニワトリなど由来の赤血球が使用され得る。このアッセイは、ＶＬＰの表面上のＨＡトリマーのアセンブリーに関する間接的情報を与え、ＨＡ上の抗原部位の適当な提示を確認する。
【００９９】
交差反応性ＨＡＩ力価は、また、ワクチンサブタイプに関連する他のウイルスの株に対する免疫応答の有効性を証明するために使用され得る。例えば、第１のインフルエンザ型またはサブタイプのＨＤＣを含むキメラ血球凝集素を含むワクチン組成物で免疫化された対象由来の血清を、第２の株の全ウイルスまたはウイルス粒子を用いるＨＡＩアッセイにおいて使用し、ＨＡＩ力価を決定され得る。
【０１００】
ＶＬＰを含むトランスジェニック植物、植物細胞、植物材料または種子の形質転換および再生のための方法は、当該分野で確立されており、当業者に知られている。形質転換された、および再生された植物を得る方法は、本発明に重要ではない。
【０１０１】
「形質転換」とは、遺伝子型で、表現型で、またはそれら両方で発現される遺伝情報（ヌクレオチド配列）の種間移動を意味する。キメラ構築物から宿主への遺伝情報の種間移動は、遺伝性であり（すなわち、宿主のゲノム内に組み込まれる）、遺伝情報の移動は安定であると考えられるか、または該移動は一過性であり、遺伝情報の移動は遺伝性でなくてもよい。
【０１０２】
「植物材料」なる用語は、植物に由来するあらゆる物質を意味する。植物材料は、植物全体、組織、細胞またはそれらの任意の画分を含み得る。さらに、植物材料は、細胞内植物成分、細胞外植物成分、植物の液体または固体抽出物、またはそれらの組合せを含み得る。さらに、植物材料は、植物の葉、茎、果実、根またはそれらの組合せ由来の植物、植物細胞、組織、液体抽出物またはそれらの組合せを含み得る。植物材料は、何らかの処理工程に付されていない植物またはそれらの一部を含み得る。植物の一部は、植物材料を含み得る。植物または植物材料は、任意の方法により回収されるか、または得ることができる、例えば、植物全体が使用され得るか、または、葉もしくは他の組織が記載されている方法における使用のために特異的に除去され得る。ＶＬＰを発現し、分泌するトランスジェニック植物は、また、本明細書に記載されている処理に対する出発物質として使用され得る。
【０１０３】
本発明の構築物は、Ｔｉプラスミド、Ｒｉプラスミド、植物ウイルスベクター、直接的ＤＮＡ形質転換、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、浸潤などを使用して植物細胞に導入することができる。このような技術に関して、例えば、Weissbach and Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology, Academy Press, New York VIII, pp. 421-463 (1988); Geierson and Corey, Plant Molecular Biology, 2d Ed. (1988); and Miki and Iyer, Fundamentals of Gene Transfer in Plants. In Plant Metabolism, 2d Ed. DT. Dennis, DH Turpin, DD Lefebrve, DB Layzell (eds), Addison-Wesley, Langmans Ltd. London, pp. 561-579 (1997)。他の方法は、例えば、プロトプラスト、マイクロインジェクション、微粒子銃またはウィスカー、および減圧浸潤を使用する直接的ＤＮＡ取込、リポソームの使用、エレクトロポレーションを含む。例えば、Bilangら(Gene 100: 247-250 (1991), Scheidら(Mol. Gen. Genet. 228: 104-112, 1991), Guercheら(Plant Science 52: 111-116, 1987), Neuhauseら(Theor. Appl Genet. 75: 30-36, 1987), Kleinら Nature 327: 70-73 (1987); Howellら(Science 208: 1265, 1980), Horschら(Science 227: 1229-1231, 1985), DeBlockら(Plant Physiology 91: 694-701, 1989), Methods for Plant Molecular Biology (Weissbach and Weissbach, eds., Academic Press Inc., 1988), Methods in Plant Molecular Biology (Schuler and Zielinski, eds., Academic Press Inc., 1989), Liu and Lomonossoff (J. Virol Meth, 105:343-348, 2002)、米国特許第４，９４５，０５０；５，０３６，００６；５，１００，７９２；６，４０３，８６５；５，６２５，１３６（これらの全てを出典明示により本明細書に包含させる）参照。
【０１０４】
一過性の発現方法は、本発明の構築物を発現するために使用され得る（Liu and Lomonossoff, 2002, Journal of Virological Methods, 105:343-348参照；これを出典明示により本明細書に包含させる）。あるいは、ＰＣＴ公開ＷＯ００／０６３４００、ＷＯ００／０３７６６３（出典明示により本明細書に包含させる）に記載されている減圧ベース一過性発現方法が使用され得る。これらの方法は、例えば、限定はしないが、アグロ接種(Agro-inoculation)またはアグロ浸潤(Agro-infiltration)の方法を含み得るが、しかしながら、他の一過性方法も、また、上記されているとおりに使用され得る。アグロ接種またはアグロ浸潤のいずれかで、所望の核酸を含むアグロバクテリウムの混合物は、組織、例えば、葉、植物の地上部分（茎、葉および花を含む）、植物の他の部分（茎、根、花）、または植物全体の細胞間隙に入る。表皮横断後、アグロバクテリウムは細胞に感染し、ｔ−ＤＮＡコピーを移動させる。ｔ−ＤＮＡがエピソームで転写され、ｍＲＮＡが翻訳され、感染細胞中で興味あるタンパク質の生産を引き起こすが、しかしながら、核内でのｔ−ＤＮＡの継代は一過性である。
【０１０５】
本発明の方法により調製されるインフルエンザＶＬＰは、既存のインフルエンザワクチンと共に使用して、ワクチンを補うか、それをより効果的にさせるか、または必要な投与用量を減少させ得る。当業者に知られているとおり、ワクチンは１つもしくはそれ以上のインフルエンザウイルスに対するものであり得る。適当なワクチンの例は、限定はしないが、Ｓａｎｏｆｉ−Ｐａｓｔｅｕｒ、ＩＤ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ、Ｍｅｒｉａｌ、Ｓｉｎｏｖａｃ、Ｃｈｉｒｏｎ、Ｒｏｃｈｅ、ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ、Ｎｏｖａｒｔｉｓ、Ｓａｎｏｆｉ−Ａｖｅｎｔｉｓ、Ｓｅｒｏｎｏ、Ｓｈｉｒｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓなどから市販により利用できるものを含む。
【０１０６】
所望により、本発明のＶＬＰは、当業者に知られている適当なアジュバントと混合され得る。さらに、ＶＬＰは、上記定義のとおりに、標的生物体の処置のための有効用量のＶＬＰを含むワクチン組成物において使用され得る。さらに、本発明によって生産されるＶＬＰは、他のタンパク質成分と共発現されるか、または他のＶＬＰまたはインフルエンザタンパク質成分、例えば、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、Ｍ１およびＭ２と再構成され得る。それは、また、ワクチンタンパク質、例えば、マラリア抗原、ＨＩＶ抗原、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）抗原などから製造される他のＶＬＰと共発現または再構成することができる。
【０１０７】
本明細書に記載されている配列は、以下に要約されている。
【表２】
【０１０８】
本発明は、以下の実施例においてさらに説明される。しかしながら、これらの実施例は説明の目的のためのみであり、いかなる方法においても、本発明の範囲を限定するために使用するべきでないことを理解すべきである。
【０１０９】
発現カセットのアセンブリー
ＶＬＰの生産のために使用され得る構築物は、米国仮出願第６１／２２０，１６１号（２００９年６月２４日に出願された）、ＷＯ２００９／００９８７６、ＷＯ２００９／０７６７７８およびＷＯ２０１０／００３２２５（これら全てを出典明示により本明細書に包含させる）に記載されている。構築物は、また、表２に記載されているものを含み得る。これらの構築物のアセンブリーは、ＷＯ２００９／００９８７６、ＷＯ２００９／０７６７７８、ＷＯ２０１０／００３２２５およびＵＳ６１／２２０，１６１に記載されている。しかしながら、既知のＨＡを含む他の構築物、例えば、限定はしないが、表２に記載されているものおよび同様の、または異なる調節要素およびプロモーターと組み合わせられたものは、また、本明細書に記載されているＶＬＰの生産のために使用され得る。
【０１１０】
表２：血球凝集素生産のために使用することができる構築物の非限定的な例
【表３】
【表４】
【０１１１】
ＣＰＭＶ−ＨＴ発現カセットは、５’に、位置１１５および１６１で変異したＡＴＧを有するササゲモザイクウイルス（ＣＰＭＶ）ＲＮＡ２のヌクレオチド１−５１２、ならびに、３’に、ＣＰＭＶ ＲＮＡ２（３’ＵＴＲに対応する）のヌクレオチド３３３０−３４８１、次にＮＯＳターミネーターが並ぶ、興味あるコード配列を含むｍＲＮＡの発現をコントロールするための３５Ｓプロモーターを含んだ。プラスミドｐＢＤ−Ｃ５−１ＬＣ（Sainsburyら 2008; Plant Biotechnology Journal 6: 82-92およびＰＣＴ公開ＷＯ２００７／１３５４８０）を、ＣＰＭＶ−ＨＴ−ベースの血球凝集素発現カセットのアセンブリーのために使用した。ＣＰＭＶ ＲＮＡ２の位置１１５および１６１でＡＴＧの変異を、Darveauら(Methods in Neuroscience 26: 77-85 (1995))に示されているＰＣＲベースのライゲーション方法を使用して行った。２つの別々のＰＣＲを、ｐＢＤ−Ｃ５−１ＬＣを鋳型として行った。第１の増幅のためのプライマーは、ｐＢｉｎＰｌｕｓ．２６１３ｃ（配列番号：３）およびＭｕｔ−ＡＴＧ１１５．ｒ（配列番号：４）であった。第２の増幅のためのプライマーは、Ｍｕｔ−ＡＴＧ１６１．ｃ（配列番号：５）およびＬＣ−Ｃ５−１．１１０ｒ（配列番号：６）であった。２つのフラグメントを混合し、ｐＢｉｎＰｌｕｓ．２６１３ｃ（配列番号：３）およびＬＣ−Ｃ５−１．１１０ｒ（配列番号：６）をプライマーとして使用する第３の増幅のための鋳型として使用した。得られたフラグメントをＰａｃＩおよびＡｐａＩで消化し、同じ酵素で消化されたｐＢＤ−Ｃ５−１ＬＣにクローニングした。生産された発現カセットを８２８と名付けた。
【０１１２】
ＣＰＭＶ−ＨＴ発現カセット（構築物番号６８５）中のＨ５ Ａ／インドネシア／５／２００５のアセンブリー
このカセットのアセンブリーは、ＷＯ２００９／００９８７６、ＷＯ２００９／０７６７７８およびＷＯ２０１０／００３３２５（これらを出典明示により本明細書に包含させる）に記載されている。
【０１１３】
簡潔には、Ａ／インドネシア／５／２００５由来のＨ５のコード配列を、以下のとおりに、ＣＰＭＶ−ＨＴにクローニングした：制限酵素認識部位ＡｐａＩ（開始ＡＴＧのすぐ上流）およびＳｔｕＩ（終始コドンのすぐ下流）を、鋳型として構築物番号６６０（D'Aoustら Plant Biotechnology Journal 6:930-940 (2008)）を使用する、プライマーＡｐａＩ−Ｈ５（Ａ−Ｉｎｄｏ）．１ｃ（配列番号：７）およびＨ５（Ａ−Ｉｎｄｏ）−ＳｔｕＩ．１７０７ｒ（配列番号：８）でのＰＣＲ増幅を行うことにより、血球凝集素コード配列に付加した。構築物６６０は、アルファルファプラストシアニンプロモーターおよび５’ＵＴＲ、Ａ／インドネシア／５／２００５（構築物＃６６０）由来のＨ５の血球凝集素コード配列、アルファルファプラストシアニン３’ＵＴＲおよびターミネーター配列を含む（配列番号：９；図５）。得られたフラグメントを、ＡｐａＩおよびＳｔｕＩ制限酵素で消化し、予め同じ酵素で消化された構築物番号８２８にクローニングした。得られたカセットを構築物番号６８５と名付けた（図１、２）。
【０１１４】
サイレンシングのサプレッサー
転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）は、植物中の導入遺伝子の発現の制限に関与する場合があり、導入遺伝子ｍＲＮＡの特異的分解を中和するために、ジャガイモウイルスＹ（ＨｃＰｒｏ）由来のサイレンシングのサプレッサーの共発現が使用され得る（Brignetiら 1998）。サイレンシングの代替サプレッサー、例えば、限定はしないが、ＴＥＶ−ｐ１／ＨＣ−Ｐｒｏ（タバコエッチ病ウイルス−ｐ１／ＨＣ−Ｐｒｏ）、ＢＹＶ−ｐ２１、トマトブッシースタントウイルスのｐ１９（ＴＢＳＶ ｐ１９）、トマトクリンクルウイルスのカプシドタンパク質（ＴＣＶ−ＣＰ）、キュウリモザイクウイルスの２ｂ（ＣＭＶ−２ｂ）、ジャガイモウイルスＸのｐ２５（ＰＶＸ−ｐ２５）、ジャガイモウイルスＭのｐ１１（ＰＶＭ−ｐ１１）、ジャガイモウイルスＳのｐ１１（ＰＶＳ−ｐ１１）、ブルーベリースコーチウイルスのｐ１６（ＢＳｃＶ−ｐ１６）、カンキツトリステザウイルスのｐ２３（ＣＴＶ−ｐ２３）、ブドウ葉巻随伴ウイルス−２のｐ２４（ＧＬＲａＶ−２ ｐ２４）、ブドウウイルスＡのｐ１０（ＧＶＡ−ｐ１０）、ブドウウイルスＢのｐ１４（ＧＶＢ−ｐ１４）、ヘラクレウム潜在ウイルスのｐ１０（ＨＬＶ−ｐ１０）、またはニンニク共通潜在ウイルスのｐ１６（ＧＣＬＶ−ｐ１６）は、当分野でよく知られており、本明細書に記載されているとおりに使用され得る（Chibaら2006, Virology 346:7-14；これを出典明示により本明細書に包含させる）。したがって、サイレンシングのサプレッサー、例えば、限定はしないが、ＨｃＰｒｏ、ＴＥＶ −ｐ１／ＨＣ−Ｐｒｏ、ＢＹＶ−ｐ２１、ＴＢＳＶ ｐ１９、ＴＣＶ−ＣＰ、ＣＭＶ−２ｂ、ＰＶＸ−ｐ２５、ＰＶＭ−ｐ１１、ＰＶＳ−ｐ１１、ＢＳｃＶ−ｐ１６、ＣＴＶ−ｐ２３、ＧＬＲａＶ−２ ｐ２４、ＧＢＶ−ｐ１４、ＨＬＶ−ｐ１０、ＧＣＬＶ−ｐ１６またはＧＶＡ−ｐ１０は、興味あるタンパク質をコードする核酸配列と共に共発現され、植物内で高レベルのタンパク質生産をさらに保証し得る。
【０１１５】
ｐ１９の構築物は、ＷＯ２０１０／０００３２２５（これを出典明示により本明細書に包含させる）に記載されている。簡潔には、トマトブッシースタントウイルス（ＴＢＳＶ）のｐ１９タンパク質のコード配列を、Darveauら(Methods in Neuroscience 26: 77-85(1995))に示されているＰＣＲベースのライゲーション方法により、アルファルファプラストシアニン発現カセットに連結した。第１のＰＣＲにおいて、プラストシアニンプロモーターのセグメントを、プライマーＰｌａｓｔｏ−４４３ｃ：
ＧＴＡＴＴＡＧＴＡＡＴＴＡＧＡＡＴＴＴＧＧＴＧＴＣ（配列番号：１１）
およびｓｕｐＰ１９−ｐｌａｓｔｏ．ｒ
ＣＣＴＴＧＴＡＴＡＧＣＴＣＧＴＴＣＣＡＴＴＴＴＣＴＣＴＣＡＡＧＡＴＧ（配列番号：１２）
を使用して、構築物６６０（ＷＯ２０１０／０００３２２５に記載されている、これを出典明示により本明細書に包含させる）を鋳型として増幅した。並行して、ｐ１９のコード配列を含む別のフラグメントを、プライマーｓｕｐＰ１９−１ｃ
ＡＴＧＧＡＡＣＧＡＧＣＴＡＴＡＣＡＡＧＧ（配列番号：１３）
およびＳｕｐＰ１９−ＳａｃＩ．ｒ
ＡＧＴＣＧＡＧＣＴＣＴＴＡＣＴＣＧＣＴＴＴＣＴＴＴＴＴＣＧＡＡＧ（配列番号：１４）
でVoinnetら(The Plant Journal 33: 949-956 (2003))に記載されている構築物３５Ｓ：ｐ１９を鋳型として使用して増幅した。次に、増幅産物を混合し、第２の増幅（アセンブリー反応）のための鋳型として、プライマーＰｌａｓｔｏ−４４３ｃおよびＳｕｐＰ１９−ＳａｃＩ．ｒと使用した。得られたフラグメントをＢａｍＨＩ（プラストシアニンプロモーター中）およびＳａｃＩ（ｐ１９コード配列の最後）で消化し、同じ制限酵素で以前に消化された構築物番号６６０にクローニングし、構築物番号Ｒ４７２を得た。該プラスミドを用いて、エレクトロポレーション（Mattanovichら 1989）により、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（AGL1; ATCC, Manassas, VA 20108, USA）を形質転換した。全てのアグロバクテリウム・ツメファシエンス株の完全性を、制限マッピングにより確認した。Ｒ４７２を含むアグロバクテリウム・ツメファシエンス株を「ＡＧＬ１／Ｒ４７２」と称した。
【０１１６】
ＨｃＰｒｏ構築物（３５ＨｃＰｒｏ）を、Hamiltonら(2002)に記載されているとおりに調製した。全てのクローンを、構築物の完全性を確認するためにシーケンシングした。該プラスミドを用いて、エレクトロポレーション（Mattanovichら 1989）により、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（AGL1; ATCC, Manassas, VA 20108, USA）を形質転換した。全てのアグロバクテリウム・ツメファシエンス株の完全性を、制限マッピングにより確認した。
【０１１７】
植物バイオマスの調製、接種材料、アグロ浸潤(agroinfiltration)および回収
ベンサミアナタバコ(Nicotiana benthamiana)植物を、市販のピートモス培養器で満たされた平箱中で種子から生長させた。該植物は、１６／８光周期および日中２５℃／夜間２０℃の温度レジメンの下で温室で生長させた。播種の３週間後、個々の小植物を選択し、ポットに移し、同じ環境条件下でさらに３週間温室で生長させておいた。６週間後、植物は８０ｇの平均重量および３０ｃｍの高さを有した。
【０１１８】
アグロバクテリウム株ＡＧＬ１を、D'Aoustら 2008 (Plant Biotechnology Journal 6:930-940)により記載されている方法を使用して、以下に特定されている構築物でトランスフェクトした（エレクトロポレーション）。トランスフェクトされたアグロバクテリウムを、１０ｍＭの２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、２０μＭのアセトシリンゴン、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンおよび２５μｇ／ｍｌのカルベニシリンｐＨ５．６を補ったＹＥＢ培地中で０．６から１．６のＯＤ６００まで増殖させた。アグロバクテリウム懸濁液を使用前に遠心し、浸潤培地（１０ｍＭのＭｇＣｌ２および１０ｍＭのＭＥＳ ｐＨ５．６）に再懸濁した。
【０１１９】
植物を、D'Aoustら（上記）に記載されているように、アグロ浸潤させた。簡潔には、減圧浸潤のために、アグロバクテリウム・ツメファシエンス懸濁液を遠心し、浸潤培地に再懸濁し、４℃で一晩保管した。浸潤の日に、培養バッチを、２．５培養容量に希釈し、使用前に暖めておいた。ベンサミアナタバコの植物全体を、２分間２０−４０Ｔｏｒｒの減圧下で気密ステンレス鋼タンク中で細菌懸濁液中に逆さまに置いた。特記されない限り、すべての浸潤を、１：１比率でＲ４７２（株ＡＧＬ１／Ｒ４７２）で形質転換された細菌と共浸潤として行った。減圧浸潤後、植物を回収までの４−６日のインキュベーション期間、温室に戻した。
【０１２０】
葉のサンプリングおよび全タンパク質抽出（機械的均質化）
４、５、６、７および８日間のインキュベーション後、植物の地上部を回収し、即座に使用した。３容量の１％のＴｒｉｔｉｏｎ Ｘ−１００および０．００４％のメタ重亜硫酸ナトリウムを含む冷５０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ８．０、０．１５ＭのＮａＣｌ中で植物組織を均質化することにより、全可溶性タンパク質を抽出した。植物組織を、１容量の冷５０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ８、０．１５ＭのＮａＣｌ中で、ＰＯＬＹＴＲＯＮＴＭを使用して機械的に均質化し、乳鉢および乳棒またはＣＯＭＩＴＲＯＬＴＭで粉砕した。ＣＯＭＩＴＲＯＬＴＭで使用されるバッファーは、また、０．０４％のメタ重亜硫酸ナトリウムを含んだ。均質化後、粉砕された植物原料のスラリーを５，０００ｇで４℃で５分遠心し、粗抽出物（上清）を分析のために保持した。浄化された粗抽出物の全タンパク質含有量を、参照標準としてウシ血清アルブミンを使用して、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイ（Bio-Rad, Hercules, CA）により決定した。
【０１２１】
細胞壁消化によるＶＬＰ抽出
葉組織をベンサミアナタバコ植物から回収し、〜１ｃｍ２切片に切った。葉切片を、室温（ＲＴ）で３０分間、５００ｍＭのマンニトールに浸した。次に、マンニトール溶液を除去し、プロトプラスト化溶液（５００ｍＭのマンニトール、１０ｍＭのＣａＣｌ２および５ｍＭのＭＥＳ／ＫＯＨ（ｐＨ５．６））中の酵素混合物（トリコデルマ・ビリデ(Trichoderma viride)由来のセルラーゼの混合物（Ｏｎｏｚｕｋａ Ｒ−１０；３％ｖ／ｖ）およびクモノスカビ属由来のペクチナーゼの混合物（ＭＡＣＥＲＯＺＹＭＥＴＭ；０．７５％ｖ／ｖ；両方ともYakult Pharmaceuticalsから）と交換した。使用される比率は、１００ｍＬの溶液あたり２０ｇの葉切片であった。この調製物を浅い容器（〜１１×１８ｃｍ）に平坦に広げ、４０ｒｐｍで２６℃で回転震盪器上で１６時間インキュベートした。
【０１２２】
あるいは、ＶＬＰ抽出を以下のとおりに行ってもよい：植物を、実施例１に記載されているＡＧＬ１／＃６８５でアグロ浸潤させた。葉組織を浸潤後６日目にベンサミアナタバコ植物から回収し、〜１ｃｍ２切片に切った。マルチフェクトペクチナーゼＦＥ、マルチフェクトＣＸ ＣＧおよびマルチフェクトＣＸ Ｂ（Genencor）を、それぞれ１．０％（ｖ／ｖ）で、６００ｍＭのマンニトール、７５ｍＭのクエン酸塩、０．０４％の亜硫酸水素ナトリウムｐＨ６．０バッファー（新鮮バイオマス；消化バッファーを１：２．５（ｗ／ｖ）の比率で使用する）に加えた。バイオマスを、オービタルシェーカーで室温で１５時間消化した。
【０１２３】
インキュベーション後、葉の破片を濾過（２５０または４００μｍのメッシュのナイロン濾過）により除去した。懸濁液中のプロトプラストを、２００×ｇ（１５分）で遠心分離、次に、上清をさらに浄化するために５０００×ｇ（１５分）で上清の遠心分離により回収した。あるいは、５０００×ｇで１５分間の単一の遠心分離工程を用いてもよい。次に、数ｍＬの上清を７０，０００×ｇで３０分遠心分離した。得られたペレットを１．７ｍＬのＰＢＳに再懸濁し、即座に分析するか、または冷凍した。
【０１２４】
タンパク質分析
Ｈ５に関する血球凝集アッセイは、Nayak and Reichl (2004)により記載されている方法に基づいた。簡潔には、試験サンプル（１００μＬ）の連続二重希釈を１００μＬのＰＢＳを含むＶ字底９６ウェルマイクロタイタープレート中で作り、ウェル当たり１００μＬの希釈されたサンプルを置いた。１００マイクロリットルの０．２５％のシチメンチョウ赤血球懸濁液（Bio Link Inc., Syracuse, NY）をそれぞれのウェルに加え、プレートを室温で２時間インキュベートした。完全血球凝集を示す最も高い希釈度の逆数を血球凝集活性として記録した。並行して、組換えＨＡ５標準（Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４ Ｈ５Ｎ１）（Protein Science Corporation, Meriden, CT）をＰＢＳで希釈し、それぞれのプレート上に対照として使用した。
【０１２５】
ＥＬＩＳＡ
ＨＡ５標準を、１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００での処理、次にＴｉｓｓｕｅ ＬｙｓｅｒＴＭ（Ｑｉａｇｅｎ）中で１分機械的撹拌により破壊された精製されたウイルス様粒子を用いて調製した。Ｕ字底９６ウェルマイクロタイタープレートを、５０ｍＭの炭酸−重炭酸コートバッファー（ｐＨ９．６）中の１０μｇ／ｍＬの捕捉抗体（Immune Technology Corporation、#IT-003-005I）で４℃で１６−１８時間コートした。全ての洗浄を、０．１％のＴｗｅｅｎ−２０を含む０．０１ＭのＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）ｐＨ７．４で行った。インキュベーション後、プレートを３回洗浄し、ＰＢＳ中の１％のカゼインで３７℃で１時間でブロックした。ブロッキング工程後、プレートを３回洗浄した。ＨＡ５標準を模造抽出物（ＡＧＬ１／Ｒ４７２単独で浸潤させた葉組織から調製された）に希釈し、５００から５０ｎｇ／ｍＬの標準曲線を作成した。定量するためのサンプルを、マイクロプレートに負荷する前に、１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で処理した。プレートを３７℃で１時間さらにインキュベートした。洗浄後、１：１０００に希釈されたＨＡ５（ＣＢＥＲ／ＦＤＡ）に対するヒツジポリクローナル抗体を加え、プレートを３７℃で１時間インキュベートした。洗浄後、１：１０００に希釈されたセイヨウワサビペルオキシダーゼ結合ウサギ抗ヒツジ抗体を加え、プレートを３７℃で１時間インキュベートした。最終洗浄後、プレートを室温で２０分ＳｕｒｅＢｌｕｅ ＴＭＢペルオキシダーゼ基質（ＫＰＬ）とインキュベートした。反応を１ＮのＨＣｌの添加により停止させ、Ａ４５０値をＭｕｌｔｉｓｋａｎ Ａｓｃｅｎｔ プレートリーダー（Thermo Scientific）を使用して測定した。
【実施例】
【０１２６】
実施例１：植物組織の酵素抽出は、上昇した相対活性を有する高い量のＨＡを放出する
本発明の酵素抽出方法から得られたＨＡの量および相対活性を、一般的な機械的抽出方法で得られたＨＡのものと比較した。ベンサミアナタバコ植物をＡＧＬ１／６８５で浸潤させ、５から６日のインキュベーション期間後に葉を回収した。葉ホモジネートを次の通りに調製した：２グラムの葉をホモジェナイザーでホモジェナイズし；４ｇの葉を乳鉢および乳棒で粉砕し；２５ｋｇの葉を抽出バッファー（５０ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ ｐＨ８．０、１：１ｗ／ｖ比率）中で、ＣＯＭＩＴＲＯＬＴＭ処理装置（Urschel Laboratories）でホモジェナイズした。酵素抽出を次の通りに行った：２０グラムの回収した葉を、上記されているＭａｃｅｒｏｚｙｍｅペクチナーゼおよびＯｎｏｚｕｋａ Ｒ−１０セルラーゼで消化に付した。消化後、葉の破片を濾過（ナイロン濾過、２５０μｍメッシュ）により除去した。懸濁液中のプロトプラストを２００×ｇ（１５分）で遠心分離により除去し、上清を５０００×ｇ（１５分）で遠心分離によりさらに浄化した。
【０１２７】
これらの植物抽出物のそれぞれにおけるＨＡの量および相対活性を表３に示す。酵素抽出方法から得られたＨＡの量は、機械的方法から得られた量よりも有意に良い。
表３：植物の葉の機械的および酵素抽出から得られたＨＡの量および相対活性の比較。全てのデータは、それぞれの抽出方法のために加えられた液体の容量の差を考慮して調整した。ＣｏｍｉｔｒｏｌＴＭ抽出方法を本比較分析の目的のための標準値として選択した。
【表５】
＊量はＥＬＩＳＡ分析により評価した。
【０１２８】
実施例２：植物組織の酵素消化はＶＬＰ中に組織化されたＨＡを放出する
分画遠心分離およびサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）の組合せを、本明細書に記載されている酵素抽出方法により得られたＨＡがＶＬＰとして組織化されていることを証明するために使用した。ベンサミアナタバコ植物を実施例１に記載されているＡＧＬ１／６８５でアグロ浸潤された。実施例１に記載のように、葉を浸潤から６日後に植物から回収し、〜１ｃｍ２切片に切り、次に消化し、粗濾過し、遠心した。
【０１２９】
次に、浄化されたサンプルを７０，０００×ｇで遠心し、ＶＬＰの分離を行った。ＶＬＰを含む遠心分離ペレットを、１／５０容量のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；０．１Ｍのリン酸ナトリウム、０．１５ＭのＮａＣｌ ｐＨ７．２）に穏やかに再懸濁し、ＳＥＣカラムに負荷した。
【０１３０】
３２ｍｌのＳＥＰＨＡＣＲＹＬＴＭ Ｓ−５００高分解能ビーズ（S-500 HR: GE Healthcare, Uppsala, Sweden, Cat. No. 17-0613-10）のＳＥＣカラムを、平衡／溶出バッファー（５０ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８）で調製した。ＳＥＣクロマトグラフィーを、平衡カラム上への１．５ｍｌのＶＬＰサンプルの負荷、および４５ｍｌの平衡／溶出バッファーでのその溶出で行った。溶出物を１．７ｍＬの画分中で回収し、それぞれの画分のタンパク質含有量を、１０μＬの溶出画分と２００μＬの希釈Ｂｉｏ−Ｒａｄタンパク質色素試薬（Bio-Rad, Hercules, CA）を混合することにより評価した。それぞれの分離の前に、Ｂｌｕｅ Ｄｅｘｔｒａｎ ２０００（GE Healthcare Bio-Science Corp., Piscataway, NJ, USA）での較正を行った。Ｂｌｕｅ Ｄｅｘｔｒａｎ ２０００および宿主タンパク質の両方での溶出プロフィールの比較を、分離の均一性を保証するために、それぞれの分離について行った。
【０１３１】
ＳＥＣ溶出画分のタンパク質分析
浄化された粗抽出物の全タンパク質含有量を、参照標準としてウシ血清アルブミンを使用するＢｒａｄｆｏｒｄ アッセイ（Bio-Rad, Hercules, CA）により決定した。ＳＥＣ溶出画分に存在するタンパク質をアセトンで沈殿させ（Bollagら 1996）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析または免疫ブロット法分析のぞれぞれのために、０．２５容量または０．０５容量のいずれかの変性サンプルローディングバッファー（０．１ＭのＴｒｉｓ ｐＨ６．８、０．０５％のブロモフェノールブルー、１２．５％のグリセロール、４％のＳＤＳおよび５％のベータ−メルカプトエタノール）に再懸濁した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離を還元条件下で行い、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｒｉｌｌａｎｔ Ｂｌｕｅ Ｒ−２５０をタンパク質染色のために使用した。
【０１３２】
Ｈ５に対する血球凝集アッセイを、Nayak and Reichl (2004)により記載されている方法に基づいて行った。簡潔には、試験サンプル（１００μＬ）の連続二重希釈物を１００μＬのＰＢＳを含むＶ字底９６ウェルマイクロタイタープレートにおいて作り、ウェル当たり１００μＬの希釈サンプルを置いた。１００マイクロリットルの０．２５％のシチメンチョウ赤血球懸濁液（Bio Link Inc., Syracuse, NY）をそれぞれのウェルに加え、プレートを室温で２時間インキュベートした。完全血球凝集を示す最も高い希釈度の逆数を血球凝集活性として記録した。並行して、組換えＨＡ５標準（Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４ Ｈ５Ｎ１）（Protein Science Corporation, Meriden, CT）をＰＢＳで希釈し、それぞれのプレート上に対照として使用した。
【０１３３】
図３Ａは、血球凝集活性がカラムの空隙容量に対応する画分に濃縮されることを示し、血球凝集活性が高分子量の構造的組織化から生じることを確認する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（図３Ｂ）は、同じ空隙容量画分（画分７−１０）が、また、約７５ｋＤａで検出可能であるＨＡ０モノマーに対応するバンドで、最も高いＨＡ含有量を提供することを示した。
【０１３４】
実施例３：植物組織の酵素消化はわずかな汚染物質と共にＨＡ−ＶＬＰを放出する
ベンサミアナタバコ植物を、実施例１に記載されているＡＧＬ１／６８５でアグロ浸潤した。実施例１に記載されているように、葉を浸潤から６日後に回収し、〜１ｃｍ２切片に切り、消化し、粗濾過し、遠心した。
【０１３５】
葉の制御した酵素消化により、少なくとも部分的に細胞壁を除去し、かくして、細胞壁と細胞膜との間の空間に存在するタンパク質および成分を抽出培地中へ放出させた。多数の細胞内タンパク質および成分がまだ損傷を受けず、ほとんど無傷なプロトプラスト内に含まれているため、最初の遠心分離工程はそれらの除去を可能にし、したがって、図４に示されているとおり、細胞外植物タンパク質および成分（アポプラスト画分）に加えて、結果として生じる細胞壁分解酵素を含む溶液を提供した。
【０１３６】
図４は、以前に記載されている葉組織の制御された酵素消化後に得られた溶液のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示し、レーン１は使用された酵素混合物を示し、レーン２は酵素消化後に得られた溶液を示す。ＣｏｍｉｔｒｏｌＴＭからの粗抽出物のタンパク質含有量を比較のためにレーン３に提供する。レーン２に示された抽出物に関するバイオマス：バッファー比率は１：５（ｗ／ｖ）であったが、レーン３に関して１：１（ｗ／ｖ）であった。したがって、レーン２および３のそれぞれは、等量の出発物質由来のタンパク質を含む。ほぼ同じバッファー：植物比率のため、機械的植物抽出物は約３．５−４ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度を含有したが、本方法にしたがって得られた酵素植物抽出物は約１ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度を提供した。
【０１３７】
レーン３に存在する主要な汚染物質は、２つの型のタンパク質サブユニット：大型の鎖（Ｌ、約５５ｋＤａ）および小型の鎖（Ｓ、約１３ｋＤａ）で作られているＲｕｂｉｓＣｏ（リブロース−１，５−二リン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ）であることが見出された。全８つの大型の鎖ダイマーおよび８つの小型の鎖は、通常、互いにＲｕｂｉｓＣｏ ５４０ｋＤａの大型複合体にアセンブリーする。この植物タンパク質汚染物質は機械的抽出方法由来の植物抽出物において多量に見出されるが（図４における矢印参照）、それは、本明細書に記載されている酵素消化方法により得られる植物抽出物に実質的には存在しない。したがって、本方法は、処理の早い段階に、とりわけこの主要な植物タンパク質汚染物質の除去を可能にする。
【０１３８】
実施例４：植物組織の酵素消化は、陽イオン交換樹脂上に直接捕捉されることができる条件下でＨＡ−ＶＬＰを放出する
ベンサミアナタバコ植物を、実施例１に記載されているＡＧＬ１／６８５でアグロインフィルトレーションした。葉を浸潤から６日後に回収し、〜１ｃｍ２切片に切り、オービタルシェーカー中で室温で１５時間消化した。消化バッファーは、６００ｍＭのマンニトール、７５ｍＭのクエン酸塩、０．０４％の亜硫酸水素ナトリウム ｐＨ６．０バッファー溶液中にそれぞれ、１．０％（ｖ／ｖ）のマルチフェクトペクチナーゼＦＥ、１．０％（ｖ／ｖ）のマルチフェクト ＣＸ ＣＧおよび／または１．０％（ｖ／ｖ）のマルチフェクト ＣＸ Ｂ（全てＧｅｎｅｎｃｏｒから）を含み、バイオマス：消化バッファー比率は１：２．５（ｗ／ｖ）を使用した。
【０１３９】
消化後、アポプラスト画分を４００μｍのナイロンフィルターを介して濾過し、消化されていない粗植物組織（最初のバイオマスの＜５％）を除去した。次に、濾過された抽出物を５０００×ｇで室温で１５分遠心し、プロトプラストおよび細胞内汚染物質（タンパク質、ＤＮＡ、膜、小胞、色素など）を除去した。次に、上清を、０．６５μｍのガラス繊維フィルター（Sartopore2/Sartorius Stedim）および０．４５／０．２μｍフィルターを使用して深層濾過（浄化のために）し、クロマトグラフィーに付した。
【０１４０】
浄化されたアポプラスト画分を、平衡／溶出バッファー（５０ｍＭのＮａＰＯ４、１００ｍＭのＮａＣｌ、０．００５％のＴｗｅｅｎ ８０ ｐＨ６．０）で平衡化された陽イオン交換カラム（Poros HS Applied Biosystems）に付した。ＵＶが０に戻ったとき、溶出物を、高い濃度のＮａＣｌ（５００ｍＭ）を含む平衡／溶出バッファーで段階的に溶出をした。必要により、クロマトグラフィー画分を、１０ｋＤａのＭＷＣＯを備えたＡｍｉｃｏｎＴＭ装置を使用して１０倍に濃縮した。タンパク質分析を、以前の実施例に記載されているとおりに行った。
【０１４１】
上記条件下で、多数の酵素および植物タンパク質は陽イオン交換樹脂に結合しなかったが、ＨＡ−ＶＬＰは結合し、したがって、溶出画分中に相当豊富なＨＡ−ＶＬＰを提供した（図６）。加えて、図６レーン４および５に示されるとおり、セルラーゼおよびペクチナーゼは、ｐＨ７で陽イオン交換カラムに結合しなかった。結果として、ＨＡ血球凝集活性に基づくＨＡ−ＶＬＰの回収率は、陽イオン交換カラムへの負荷の前の９２％であり、溶出画分中で６６％であった。１９４の精製倍数を、陽イオン交換樹脂からの溶出画分で測定した。
【０１４２】
実施例５：消化バッファーへのＮａＣｌの添加
ベンサミアナタバコ植物を、実施例１に記載されている興味ある血球凝集素（Ｈ１／Ｃａｌ ＷＴ、Ｂ／Ｆｌｏ、Ｈ５／ＩｎｄｏまたはＨ１／Ｃａｌ Ｘ１７９Ａ）を発現する構築物を有するアグロバクテリウムＡＧＬ１株でアグロ浸潤した。葉を浸潤から６日後に回収し、〜１ｃｍ２切片に切り、以下に記載されていることを除いて実施例４にしたがって消化した。濾過、遠心分離および浄化は、実施例４に記載されているとおりに行った。
【０１４３】
ＮａＣｌを消化バッファーに加え、ＨＡ−ＶＬＰ回収率における潜在的な効果を評価した。推測される利点は、浄化中に除去される懸濁液中の植物細胞または粒子とＨＡとの非特異的結合の潜在的な防止ならびにＨＡ−ＶＬＰのコロイド安定性の達成および／または維持および／または改良における潜在的な効果であった。
【０１４４】
消化バッファーへの５００ｍＭのＮａＣｌの添加は、遠心分離によるプロトプラストおよび細胞残屑の除去後に、バイオマス１グラムあたりのＨＡ−ＶＬＰ回収率の増加をもたらした。しかしながら、この増加は、Ｈ１／Ｃａｌ ＷＴおよびＢ／Ｆｌｏ株に対してのみ示されたが、Ｈ５に対する回収率はこのアプローチにより有意に増加しなかった（表４）。
表４：ＨＡ−ＶＬＰ回収率に対する消化工程へのＮａＣｌの添加の効果（血球凝集活性単位、ｄｉｌ：希釈度の逆数により測定される）
【表６】
１ ＮａＣｌ有りの収率（ｄｉｌ／ｇ）を、ＮａＣｌ無しの収率（ｄｉｌ／ｇ）で割った。
【０１４５】
消化中の５００ｍＭのＮａＣｌの添加は、消化中のＨＡ−ＶＬＰの放出の増加をさらにもたらし、次いで、Ｈ１／Ｃａｌ ＷＴおよびＨ１／Ｃａｌ Ｘ−１７９Ａ株の両方に対して浄化後に増加した回収率をもたらしたが、Ｈ５／Ｉｎｄｏ株に対してはもたらさなかった（表５）。
表５：浄化工程後のＨＡ−ＶＬＰ回収率に対する消化工程へのＮａＣｌの添加の効果（血球凝集活性単位により測定される）
【表７】
１回収率は、遠心された消化された抽出物において見出された活性と比較しての深層濾過後に得られた血球凝集活性のパーセントで示される。
【０１４６】
酵素消化中のＮａＣｌの添加有り、または無しのＨＡ−ＶＬＰの会合状態を、Ｈ５／ＩｎｄｏおよびＨ１／Ｃａｌ ＷＴ（それぞれ図７Ａおよび７Ｂ）に対してナノ粒子トラッキング分析（ＮＴＡ）を使用して試験した。消化がＮａＣｌの非存在下で行われたとき、粒子の単分散調製物はＨ５に対して観察されたが、Ｈ１／Ｃａｌ調製物は粒子種のずっと大きいアレイを示した。消化バッファーへのＮａＣｌの添加は、図７Ｃにおいて見出されるみごとに単分散の粒子分布により示されているとおり、Ｈ１／Ｃａｌに関するＨＡ−ＶＬＰ自己会合を減少させた。Ｈ１／Ｃａｌ ＷＴ−ＶＬＰに関する１５０ｎｍの粒子数は、消化バッファーへの５００ｍＭのＮａＣｌの添加により増強された（約５倍）。
【０１４７】
実施例６：色素の制御放出
ベンサミアナタバコ植物を、実施例１に記載されている興味ある血球凝集素（Ｈ５／Ｉｎｄｏ）を発現する構築物を有するアグロバクテリウムＡＧＬ１株でアグロ浸潤した。葉を浸潤から６日後に回収し、〜１ｃｍ２切片に切り、５００ｍＭのＮａＣｌまたは５００ｍＭのＮａＣｌおよび２５ｍＭのＥＤＴＡの消化バッファーへの添加で実施例４に記載されているとおりに消化した。濾過、遠心分離および浄化は、実施例４に記載されているとおりに行った。
【０１４８】
酵素消化工程中の緑色を有する成分の放出は、緑色がかった着色を有するＶＬＰの精製された調製物をもたらした。したがって、細胞壁消化溶液の組成を調べ、減少した緑色着色、したがって増加した純度を有するＶＬＰ精製調製物を得るように調整した。理論に縛られることは望まないが、Ｃａ２＋が細胞壁の中葉の構成の保持において重要な役割を果たすため、通常、植物細胞壁中に高い濃度のＣａ２＋があるという事実を考慮すると、Ｃａ２＋−キレート剤であるＥＤＴＡの添加は細胞壁の酵素的脱重合を容易にし、それにより、無傷な細胞内オルガネラ、例えば、葉緑体を保護し、緑色−色素成分の放出を防止し得る。
【０１４９】
表６に示されるとおり、消化バッファーへの２５ｍＭのＥＤＴＡの添加は、調製物の吸収の差（ＯＤ６７２ｎｍ−ＯＤ６５０ｎｍ）を測定することにより評価されるとおり、精製されたＨ５−ＶＬＰ調製物の緑色着色を減少させる。緑色の成分が高い量で放出されるか、または安定に除去されないとき、ＶＬＰ調製物は△ＯＤ＞０．０４０を示した。
表６：Ｈ５−ＶＬＰ調製物の緑色着色に対する消化バッファーへの２５ｍＭのＥＤＴＡの添加の効果
【表８】
【０１５０】
実施例７：別の消化バッファー組成
ベンサミアナタバコ植物を、実施例１に記載されている興味ある血球凝集素（Ｈ５／Ｉｎｄｏ）を発現する構築物を有するアグロバクテリウムＡＧＬ１株でアグロ浸潤した。葉を浸潤から６日後に回収し、〜１ｃｍ２切片に切り、表７−９に記載されているとおり０％、０．２５％、０．５％、０．７５％または１％ｖ／ｖのマルチフェクトペクチナーゼＦＥ、マルチフェクトＣＸ−ＣＧセルラーゼおよびマルチフェクトＣＸ Ｂセルロースを含む消化バッファーの修飾で実施例４にしたがって消化した。濾過、遠心分離および浄化は、実施例４に記載されているとおりに行った。
【０１５１】
以下の表７および８に示されているとおり、ペクチナーゼは、消化バッファー中に必須でないことが証明された。同様のレベルのＨ５／ＩｎｄｏまたはＨ１／Ｃａｌ ＷＴ ＶＬＰを、ペクチナーゼの存在または非存在下のいずれかで本方法で抽出することができる。さらに、以前の実施例と比較してセルラーゼの濃度の減少が抽出量において有意な影響を有さないことを見出した（表９）。
表７：ベンサミアナタバコの葉の消化によるＨ５／Ｉｎｄｏ ＶＬＰの放出。全ての条件を反復で試験した（ＨＡ−ＶＬＰの濃度は、血球凝集活性、ｄｉｌ：希釈度の逆数により測定した）。
【表９】
＊マルチフェクト ＣＸ ＧＣ
【０１５２】
表８：ベンサミアナタバコの葉の消化によるＨ１／Ｃａｌ ＷＴ ＶＬＰの放出。全ての条件を反復で試験した（ＨＡ−ＶＬＰの濃度は、血球凝集活性、ｄｉｌ：希釈度の逆数により測定した）。
【表１０】
＊それぞれ１％のマルチフェクト ＣＸ ＧＣおよびマルチフェクト ＣＸ Ｂ
【０１５３】
表９：ベンサミアナタバコの葉の消化によるＨ１／Ｃａｌ ＷＴ ＶＬＰの放出。全ての条件を反復で試験した（ＨＡ−ＶＬＰの濃度は、血球凝集活性、ｄｉｌ：希釈度の逆数により測定した）。
【表１１】
＊マルチフェクト ＣＸ ＧＣ
【０１５４】
実施例８：中性ｐＨに近い条件下での酵素消化
消化中のｐＨの制御は、いくつかのＶＬＰの抽出に重要であり得る。消化工程中に起こる細胞壁の脱重合が、適当なバッファーの存在下で溶液を酸性化することができる（すなわちｐＨ６から５）酸糖を放出することができること、およびいくつかのＶＬＰ（例えば、Ｈ３／ＢｒｉｓおよびＢ／Ｆｌｏ ＨＡを含むもの）が穏やかな酸性条件に対する強い感受性をすでに証明していることを考慮して、生産されるＶＬＰの収率に対するかかる起こりうる酸性化の影響を調査した。
【０１５５】
ベンサミアナタバコ植物を、実施例１に記載されている興味ある血球凝集素（Ｂ／Ｆｌｏ、Ｈ５／Ｉｎｄｏ、Ｈ３／Ｂｒｉｓ）を発現する構築物を有するアグロバクテリウムＡＧＬ１株でアグロ浸潤した。葉を浸潤から６日後に回収し、〜１ｃｍ２切片に切り、５００ｍＭのＮａＣｌ；２５もしくは５０ｍＭのＥＤＴＡ；０．０３もしくは０．０４％の亜硫酸水素ナトリウム；０、１００、２００もしくは６００ｍＭのマンニトール、７５、１２５もしくは１５０ｍＭのクエン酸塩；および／または７５ｍＭのＮａＰＯ４を含む消化条件の修飾で、表１０−１４に記載されているとおり調節された消化バッファーのｐＨで実施例４にしたがって消化した。濾過、遠心分離および浄化は、実施例４に記載されているとおりに行った。
【０１５６】
クエン酸塩の濃度の増加（バッファー効果 ｐＨ３．０から５．４）およびリン酸ナトリウムの添加（バッファー効果 ｐＨ最大６．０）を含め、様々な消化バッファー組成を、酵素消化の最後までに約５．５のｐＨをなし遂げるように試験した。表１０は、Ｂ株由来のＶＬＰが、消化後のｐＨが約ｐＨ６．０であったとき、非常に効率的に抽出されたことを示す。
表１０：Ｂ／Ｆｌｏ ＶＬＰの抽出収率に対する消化バッファー組成の効果
【表１２】
１全てのバッファーは、６００ｍＭのマンニトール、０．０４％のメタ重亜硫酸ナトリウムを含んだ
【０１５７】
次に、ｐＨ６．０に近い最終ｐＨ値に達するように、より高いｐＨで消化を開始する効果を試験した。表１１に示されているとおり、ほぼ天然条件で植物細胞壁の消化が可能であり、Ｈ５／Ｉｎｄｏ ＶＬＰに対する抽出収率を悪化させなかった。
表１１：Ｈ５／Ｉｎｄｏ ＶＬＰの抽出収率に対する消化バッファーの最初のｐＨの効果
【表１３】
１全ての消化バッファーは、６００ｍＭのマンニトール、０．０４％のメタ重亜硫酸ナトリウム、１２５ｍＭのクエン酸塩＋７５ｍＭのＮａＰＯ４＋５００ｍＭのＮａＣｌ＋２５ｍＭのＥＤＴＡを含んだ
【０１５８】
消化溶液の他の成分も、また、ＶＬＰの抽出収率に負の影響を及ぼすことなく修飾が可能であることが示された。表１２は、５．４−５．７の消化後ｐＨを得られるとき、Ｂ／Ｆｌｏ ＶＬＰの抽出収率を増強するために、消化溶液に提供することができる修飾を説明する。このような修飾は、クエン酸塩の濃度の増加およびＰＯ４バッファーの添加を含む。ＥＤＴＡの濃度の増加が、一般的に、さらなる酸性化抽出物をもたらし、ＶＬＰ抽出収率を低下させることが見出された。
表１２：Ｂ／Ｆｌｏ ＶＬＰの抽出収率に対する種々の消化バッファー成分の効果
【表１４】
１全てのバッファーは、５００ｍＭのＮａＣｌおよび０．０４％のメタ重亜硫酸ナトリウムを含んだ
【０１５９】
Ｈ３／ブリズベンＶＬＰの抽出収率を改良するために、バッファー組成をさらに修飾した（表１３）。
表１３：Ｈ３／Ｂｒｉｓ ＶＬＰの抽出収率に対する消化溶液中のマンニトールおよび亜硫酸水素ナトリウムの濃度の効果
【表１５】
１全てのバッファーは、１２５ｍＭのクエン酸塩、７５ｍＭのＮａＰＯ４、５００ｍＭのＮａＣｌを含んだ
【０１６０】
表１２および１３に示されているとおり、ＶＬＰの抽出収率に有意に影響を及ぼすことなく、マンニトール濃度を２００ｍＭに減少させることができた。１００ｍＭへのマンニトール濃度のさらなる減少、および消化溶液からのマンニトールの完全な削除は、得られるＨＡ−ＶＬＰのレベルに有意に影響しなかった（表１４）。
表１４：異なる濃度のマンニトールを有するバッファー中で実施されたバイオマスの消化からのＨ５／Ｉｎｄｏ ＶＬＰの放出
【表１６】
１全てのバッファーは、７５ｍＭのクエン酸塩 ｐＨ６．０＋０．０４％のメタ重亜硫酸ナトリウムを含んだ
２２つの試験を、マンニトールなし（試験１）および１００ｍＭのマンニトール有り（試験２）対６００ｍＭのマンニトールで、ＶＬＰの抽出収率を比較するために実施した
【０１６１】
実施例９：広範な種類のＨＡ−ＶＬＰに対する酵素消化の適合性
本明細書に記載されている植物バイオマスに関する酵素消化方法は、広範な種類のＨＡ−ＶＬＰの抽出に適用される可能性がある。上記実施例に示されているＨ５／Ｉｎｄｏ、Ｈ１／Ｃａｌ ＷＴ ＶＬＰ、Ｈ３／ＢｒｉｓおよびＢ／Ｆｌｏを含むＨＡ−ＶＬＰの抽出に加えて、本明細書に記載されている方法は、また、表１５に示されている季節的Ｈ１／ＢｒｉｓおよびＨ１／ＮＣ由来のＨＡ−ＶＬＰの抽出のために適当であることが示された。
表１５：アグロ浸潤されたベンサミアナタバコの葉の消化からの季節的Ｈ１／ＢｒｉｓおよびＨ１／ＮＣ ＶＬＰの放出（血球凝集活性により測定されるＨＡの濃度、ｄｉｌ：希釈度の逆数）。
【表１７】
【０１６２】
全ての引用文献は、まるで、それぞれの個々の文献が具体的および個々に出典明示により本明細書に包含させることを意図するように、ならびに、まるで、完全に本明細書に示されているように、出典明示により本明細書に包含させる。本明細書中における参考文献の引用は、このような文献が本発明に対する先行技術であるとの承認と解釈すべきでなくみなされるべきでない。
【０１６３】
本発明の１つ以上の現在の好ましい態様は、一例として記載されている。本発明は、実質的に上記されているものならびに実施例および図面を基準にしたものの全ての態様、修飾および変化を含む。特許請求の範囲に定義されている本発明の範囲から逸脱することなく、多くの変化および修飾を行うことができることは、当業者に明らかである。このような修飾の例は、実質的に同じ方法で同じ結果をなし遂げるために、本発明の何らかの局面に関して既知の等価物の置換を含む。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物由来のＶＬＰを調製する方法であって、
ａ．アポプラスト局在ＶＬＰを含む植物または植物材料を得ること、
ｂ．プロトプラスト／スフェロプラスト画分およびアポプラスト画分を生産すること；および、
ｃ．アポプラスト画分を回収すること、ここに、該アポプラスト画分は、植物由来のＶＬＰを含む
を含む方法。
【請求項２】
生産する工程（工程ｂ）において、アポプラストおよびプロトプラスト画分が、細胞壁分解酵素組成物による植物または植物材料の処理により生産される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
細胞壁分解酵素組成物が、１つもしくはそれ以上のペクチナーゼ、１つもしくはそれ以上のセルラーゼ、または、１つもしくはそれ以上のペクチナーゼおよび１つもしくはそれ以上のセルラーゼを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
細胞壁分解酵素組成物が、１つまたはそれ以上のリパーゼ、プロテアーゼまたはペクチナーゼを含まない、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
得る工程（工程ａ）において、植物が、ウイルスエンベロープタンパク質、ウイルス構造タンパク質、ウイルスカプシドタンパク質、およびウイルスコートタンパク質の群から選択されるタンパク質をコードする核酸配列で形質転換され、該植物または植物材料が回収される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
核酸が植物に一過性で導入される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
核酸が植物のゲノム内に安定に組み込まれる、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
得る工程（工程ａ）において、植物を成長させ、植物または植物材料を回収する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
核酸がインフルエンザの血球凝集素をコードする、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
植物由来のＶＬＰがノイラミニダーゼまたはＭタンパク質を含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
植物材料が葉および培養された植物細胞の群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
ｄ）アポプラスト画分から植物由来のＶＬＰを精製する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
精製する工程が、浄化された抽出物を生産するための深層濾過を使用してアポプラスト画分を濾過すること、次に、陽イオン交換樹脂を使用する浄化された抽出物のクロマトグラフィーを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
植物由来の脂質エンベロープを含む植物由来のＶＬＰを調製する方法であって、
ａ．アポプラスト局在ＶＬＰを含む植物または植物材料を得ること、
ｂ．植物または植物材料を酵素組成物で処理して、プロトプラスト／スフェロプラスト画分およびＶＬＰを含む１つもしくはそれ以上のアポプラストタンパク質複合体を生産すること；
ｃ．プロトプラスト画分から１つもしくはそれ以上のアポプラストタンパク質複合体を分離すること
を含む方法。
【請求項１５】
酵素組成物が、１つもしくはそれ以上のペクチナーゼ、１つもしくはそれ以上のセルラーゼ、または、１つもしくはそれ以上のペクチナーゼおよび１つもしくはそれ以上のセルラーゼを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
酵素組成物が、１つまたはそれ以上のリパーゼ、プロテアーゼまたはペクチナーゼを含まない、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
ｄ）アポプラスト画分から植物由来のＶＬＰを精製する工程をさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
精製する工程が、浄化された抽出物を生産するための深層濾過を使用してアポプラスト画分を濾過すること、次に、陽イオン交換樹脂を使用する浄化された抽出物のクロマトグラフィーを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
得る工程（工程ａ）において、植物が、ウイルスエンベロープタンパク質、ウイルス構造タンパク質、ウイルスカプシドタンパク質、およびウイルスコートタンパク質の群から選択されるタンパク質をコードする核酸配列で形質転換され、該植物または植物材料が回収される、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
核酸が植物に一過性で導入される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
核酸が植物のゲノム内に安定に組み込まれる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
得る工程（工程ａ）において、植物を成長させ、植物または植物材料を回収する、請求項１４に記載の方法。
【請求項２３】
ＶＬＰがインフルエンザの血球凝集素を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
植物材料が葉および培養された植物細胞の群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項２５】
ＶＬＰがノイラミニダーゼまたはＭタンパク質を含まない、請求項１４に記載の方法。
【請求項２６】
ａ．植物由来のＶＬＰを含む植物または植物材料を得ること、
ｂ．消化された画分を生産するために細胞壁分解酵素組成物を使用して植物材料を消化すること、
ｃ．濾過された画分を生産するために消化された画分を濾過し、濾過された画分から植物由来のＶＬＰを回収すること
を含む、植物由来のＶＬＰを調製する方法。
【請求項２７】
細胞壁分解酵素組成物が、１つもしくはそれ以上のペクチナーゼ、１つもしくはそれ以上のセルラーゼ、または、１つもしくはそれ以上のペクチナーゼおよび１つもしくはそれ以上のセルラーゼを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
細胞壁分解酵素組成物が、１つもしくはそれ以上のペクチナーゼ、１つもしくはそれ以上のセルラーゼ、または、１つもしくはそれ以上のペクチナーゼおよび１つもしくはそれ以上のセルラーゼを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
得る工程（工程ａ）において、植物が、ウイルスエンベロープタンパク質、ウイルス構造タンパク質、ウイルスカプシドタンパク質、およびウイルスコートタンパク質の群から選択されるタンパク質をコードする核酸配列で形質転換され、植物または植物材料が回収される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
核酸が植物に一過性で導入される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
核酸が植物のゲノム内に安定に組み込まれる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
植物由来のＶＬＰがインフルエンザの血球凝集素を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
植物材料が葉および培養された植物細胞の群から選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３４】
ｄ）細胞残屑および不溶性材料から濾過された画分中の該ＶＬＰを分離する工程をさらに含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３５】
分離する工程が遠心分離により行われる、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
分離する工程が深層濾過により行われる、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
ｄ）濾過された画分から植物由来のＶＬＰを精製する工程をさらに含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３８】
精製する工程が、浄化された抽出物を生産するための濾過された画分の深層濾過、次に、陽イオン交換樹脂を使用する浄化された抽出物のクロマトグラフィーを含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項１】
植物由来のＶＬＰを調製する方法であって、
ａ．アポプラスト局在ＶＬＰを含む植物または植物材料を得ること、
ｂ．プロトプラスト／スフェロプラスト画分およびアポプラスト画分を生産すること；および、
ｃ．アポプラスト画分を回収すること、ここに、該アポプラスト画分は、植物由来のＶＬＰを含む
を含む方法。
【請求項２】
生産する工程（工程ｂ）において、アポプラストおよびプロトプラスト画分が、細胞壁分解酵素組成物による植物または植物材料の処理により生産される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
細胞壁分解酵素組成物が、１つもしくはそれ以上のペクチナーゼ、１つもしくはそれ以上のセルラーゼ、または、１つもしくはそれ以上のペクチナーゼおよび１つもしくはそれ以上のセルラーゼを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
細胞壁分解酵素組成物が、１つまたはそれ以上のリパーゼ、プロテアーゼまたはペクチナーゼを含まない、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
得る工程（工程ａ）において、植物が、ウイルスエンベロープタンパク質、ウイルス構造タンパク質、ウイルスカプシドタンパク質、およびウイルスコートタンパク質の群から選択されるタンパク質をコードする核酸配列で形質転換され、該植物または植物材料が回収される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
核酸が植物に一過性で導入される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
核酸が植物のゲノム内に安定に組み込まれる、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
得る工程（工程ａ）において、植物を成長させ、植物または植物材料を回収する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
核酸がインフルエンザの血球凝集素をコードする、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
植物由来のＶＬＰがノイラミニダーゼまたはＭタンパク質を含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
植物材料が葉および培養された植物細胞の群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
ｄ）アポプラスト画分から植物由来のＶＬＰを精製する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
精製する工程が、浄化された抽出物を生産するための深層濾過を使用してアポプラスト画分を濾過すること、次に、陽イオン交換樹脂を使用する浄化された抽出物のクロマトグラフィーを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
植物由来の脂質エンベロープを含む植物由来のＶＬＰを調製する方法であって、
ａ．アポプラスト局在ＶＬＰを含む植物または植物材料を得ること、
ｂ．植物または植物材料を酵素組成物で処理して、プロトプラスト／スフェロプラスト画分およびＶＬＰを含む１つもしくはそれ以上のアポプラストタンパク質複合体を生産すること；
ｃ．プロトプラスト画分から１つもしくはそれ以上のアポプラストタンパク質複合体を分離すること
を含む方法。
【請求項１５】
酵素組成物が、１つもしくはそれ以上のペクチナーゼ、１つもしくはそれ以上のセルラーゼ、または、１つもしくはそれ以上のペクチナーゼおよび１つもしくはそれ以上のセルラーゼを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
酵素組成物が、１つまたはそれ以上のリパーゼ、プロテアーゼまたはペクチナーゼを含まない、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
ｄ）アポプラスト画分から植物由来のＶＬＰを精製する工程をさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
精製する工程が、浄化された抽出物を生産するための深層濾過を使用してアポプラスト画分を濾過すること、次に、陽イオン交換樹脂を使用する浄化された抽出物のクロマトグラフィーを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
得る工程（工程ａ）において、植物が、ウイルスエンベロープタンパク質、ウイルス構造タンパク質、ウイルスカプシドタンパク質、およびウイルスコートタンパク質の群から選択されるタンパク質をコードする核酸配列で形質転換され、該植物または植物材料が回収される、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
核酸が植物に一過性で導入される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
核酸が植物のゲノム内に安定に組み込まれる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
得る工程（工程ａ）において、植物を成長させ、植物または植物材料を回収する、請求項１４に記載の方法。
【請求項２３】
ＶＬＰがインフルエンザの血球凝集素を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
植物材料が葉および培養された植物細胞の群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項２５】
ＶＬＰがノイラミニダーゼまたはＭタンパク質を含まない、請求項１４に記載の方法。
【請求項２６】
ａ．植物由来のＶＬＰを含む植物または植物材料を得ること、
ｂ．消化された画分を生産するために細胞壁分解酵素組成物を使用して植物材料を消化すること、
ｃ．濾過された画分を生産するために消化された画分を濾過し、濾過された画分から植物由来のＶＬＰを回収すること
を含む、植物由来のＶＬＰを調製する方法。
【請求項２７】
細胞壁分解酵素組成物が、１つもしくはそれ以上のペクチナーゼ、１つもしくはそれ以上のセルラーゼ、または、１つもしくはそれ以上のペクチナーゼおよび１つもしくはそれ以上のセルラーゼを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
細胞壁分解酵素組成物が、１つもしくはそれ以上のペクチナーゼ、１つもしくはそれ以上のセルラーゼ、または、１つもしくはそれ以上のペクチナーゼおよび１つもしくはそれ以上のセルラーゼを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
得る工程（工程ａ）において、植物が、ウイルスエンベロープタンパク質、ウイルス構造タンパク質、ウイルスカプシドタンパク質、およびウイルスコートタンパク質の群から選択されるタンパク質をコードする核酸配列で形質転換され、植物または植物材料が回収される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
核酸が植物に一過性で導入される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
核酸が植物のゲノム内に安定に組み込まれる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
植物由来のＶＬＰがインフルエンザの血球凝集素を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
植物材料が葉および培養された植物細胞の群から選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３４】
ｄ）細胞残屑および不溶性材料から濾過された画分中の該ＶＬＰを分離する工程をさらに含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３５】
分離する工程が遠心分離により行われる、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
分離する工程が深層濾過により行われる、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
ｄ）濾過された画分から植物由来のＶＬＰを精製する工程をさらに含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３８】
精製する工程が、浄化された抽出物を生産するための濾過された画分の深層濾過、次に、陽イオン交換樹脂を使用する浄化された抽出物のクロマトグラフィーを含む、請求項３４に記載の方法。
【図１】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図７Ｃ】
【図８】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図７Ｃ】
【図８】
【公表番号】特表２０１３−５０５０２５（Ｐ２０１３−５０５０２５Ａ）
【公表日】平成２５年２月１４日（２０１３．２．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５３００５９（Ｐ２０１２−５３００５９）
【出願日】平成２２年９月２１日（２０１０．９．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＡ２０１０／００１４８８
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０３５４２２
【国際公開日】平成２３年３月３１日（２０１１．３．３１）
【出願人】（５０２１２１３９５）メディカゴ インコーポレイテッド (13)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年２月１４日（２０１３．２．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年９月２１日（２０１０．９．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＡ２０１０／００１４８８
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０３５４２２
【国際公開日】平成２３年３月３１日（２０１１．３．３１）
【出願人】（５０２１２１３９５）メディカゴ インコーポレイテッド (13)
【Ｆターム（参考）】
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