検出方法および検出システム
【課題】被検出物質を極めて高感度に検出可能な検出方法および検出システムを得る。
【解決手段】センサ14部上に、液体試料中の被検出物質Ａの量に応じた量の標識結合物質BFを結合させ、センサ部14への励起光の照射により該センサ部14の表面に生じるエバネッセント場、または光電場増強場において標識Ｆから生じる光に基づく信号を検出して、被検出物質Ａの量を検出する検出方法において、標識結合物質BFを固定層に結合させた後、センサ部14上の流体を、標識結合物質BFと固定層との結合が外れず、かつセンサ部14上に該流体が静的に存在する場合と比較して、信号の信号量が大きく検出される一定の流速で移動させつつ、信号を検出する。
【解決手段】センサ14部上に、液体試料中の被検出物質Ａの量に応じた量の標識結合物質BFを結合させ、センサ部14への励起光の照射により該センサ部14の表面に生じるエバネッセント場、または光電場増強場において標識Ｆから生じる光に基づく信号を検出して、被検出物質Ａの量を検出する検出方法において、標識結合物質BFを固定層に結合させた後、センサ部14上の流体を、標識結合物質BFと固定層との結合が外れず、かつセンサ部14上に該流体が静的に存在する場合と比較して、信号の信号量が大きく検出される一定の流速で移動させつつ、信号を検出する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中の被検出物質を検出する検出方法、および検出システムに関するものでああり、特に、エバネッセント場あるいは光電場増強場を用いた光信号検出により被検出物質を検出する検出方法、および検出システムに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、バイオ測定等において、高感度かつ容易な測定法として蛍光検出法が広く用いられている。この蛍光検出法は、特定波長の光により励起されて蛍光を発する被検出物質を含むと考えられる試料に上記特定波長の励起光を照射し、そのとき蛍光を検出することによって被検出物質の存在を確認する方法である。また、被検出物質が蛍光体ではない場合、蛍光色素で標識されて被検出物質と特異的に結合する物質を試料に接触させ、その後上記と同様にして蛍光を検出することにより、この結合すなわち被検出物質の存在を確認することも広くなされている。
【０００３】
バイオ測定においては、例えば、試料に含まれる被検出物質である抗原を検出するため、基板上に被検出物質と特異的に結合する１次抗体を固定しておき、基板上に試料を供給することにより、１次抗体に被検出物質を特異的に結合させ、次いで、被検出物質と特異的に結合する、蛍光標識が付与された２次抗体を添加し、被検出物質と結合させることにより、１次抗体―被検出物質―２次抗体の、所謂サンドイッチを形成し、２次抗体に付与されている蛍光標識からの蛍光を検出するサンドイッチ法や、被検出物質と競合して１次抗体と特異的に結合する、蛍光標識された競合２次抗体を被検出物質と競合的に１次抗体と結合させ、１次抗体と結合した競合２次抗体からの蛍光を検出する競合法などのアッセイがなされる。
【０００４】
この際、基板上に固定された１次抗体と被検出物質を介して結合した２次抗体、あるいは直接結合した競合２次抗体のみからの蛍光を検出するために、エバネッセント光により蛍光を励起するエバネッセント蛍光法が提案されている。エバネッセント蛍光法は、基板表面で全反射する励起光を基板裏面から入射し、基板表面に染み出すエバネッセント波により蛍光を励起してその蛍光を検出するものである。
【０００５】
また、エバネッセント蛍光法において、感度を向上させるため、プラズモン共鳴による電場増強の効果を利用する方法が特許文献１、非特許文献１などに提案されている。表面プラズモン増強蛍光法は、プラズモン共鳴を生じさせるため、基板上に金属層を設け、基板と金属層との界面に対して基板裏面から、全反射角以上の角度で励起光を入射し、この励起光の照射により金属層に表面プラズモンを生じさせ、その電場増強作用によって、蛍光信号を増大させてＳ／Ｎを向上させるものである。
【０００６】
同様に、エバネッセント蛍光法において、センサ部の電場を増強する効果を有するものとして、導波モードによる電場増強効果を利用する方法が非特許文献２に提案されている。この光導波モード増強蛍光分光法（OWF：Optical waveguide mode enhanced fluorescence spectroscopy)は、基板上に金属層と、誘電体などからなる光導波層とを順次形成し、基板裏面から全反射角以上の角度で励起光を入射し、この励起光の照射により光導波層に光導波モードを生じさせ、その電場増強効果によって、蛍光信号を増強させるものである。
【０００７】
また、特許文献２および非特許文献３には、表面プラズモンによる増強された電場において励起された蛍光標識からの蛍光を検出するのではなく、その蛍光が金属層に新たに表面プラズモンを誘起して生じる放射光（SPCE: Surface Plasmon-Coupled Emission)をプリズム側から取り出す方法が提案されている。
【０００８】
このように、バイオ測定等においては、被測定物質を検出するための方法として、励起光の照射により、プラズモン共鳴や光導波モードを生じさせ、これらによって増強された電場で蛍光標識を励起させ、その蛍光を直接、あるいは間接的に検出する種々の方法が提案されている。
【０００９】
上記したエバネッセント蛍光法で生じるエバネッセント場および増強される電場は、電場発生面からの距離に対して急激に減衰することが知られている。図１２は、表面プラズモンによる電場増強効果の増強場発生面（金属面）からの離間距離依存性を示すグラフであり、プリズム（ポリメタクリル酸メチル樹脂；PMMA)上に５０ｎｍ厚の金膜を設けたセンサ上に溶媒（水）が存在する系とし、励起光（レーザ波長６５６ｎｍ）を、励起入射角７２．５°の条件でプリズムと金膜の界面に対して入射させる場合についてのシミュレーション結果である。このグラフから確認されるように、電場のエネルギー増強度は１００ｎｍ程度の離間で半減する。従って、蛍光標識はできるだけ増強場発生面に近接していることが好ましい。
【００１０】
一方、バイオ測定においては、より短時間での測定を可能とすることが望まれており、センサ部上における反応を効率よく生じさせ、測定時間の短縮を図る方法が種々提案されている。例えば、特許文献３には、ＤＮＡチップにおける複数の反応工程において、流体と機能性基体を接触させるそれぞれの工程で、それぞれに適した流動速度で流体を流動させる方法が提案されている。また、特許文献４には、マイクロ流路内で流体を超高速する方法が提案されている。
【特許文献１】特開平１０−３０７１４１号公報
【特許文献２】米国特許出願公開第２００５／００５３９７４号明細書
【特許文献３】国際公開番号ＷＯ２００４／１０４５８４号
【特許文献４】特開２００７−１０１２２１号公報
【非特許文献１】W.Knoll他、Analytical Chemistry 77(2005), p.2426-2431
【非特許文献２】2007年春季 応用物理学会 予稿集 Ｎo.３,P.1378
【非特許文献３】Thorsten Liebermann Wolfgang Knoll, "Surface-plasmon field-enhanced fluorescence spectroscopy" Colloids and Surfaces A 171(2000)115-130
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
上述のように、エバネッセント蛍光法やエバネッセント光の光電場をプラズモン共鳴や光導波モードにより増強してセンサ部近傍からの光信号を検出する場合、エバネッセント波の光電場および表面プラズモン共鳴や光導波モードによる電場増強の効果は、金属層や光導波層表面から離れるに従って急激に減衰する。そのため、表面から標識までの距離が僅かに長くなるだけで、信号量が大きく減少してしまうため、標識をなるべくセンサ部表面に近づけた状態で信号検出を行う必要がある。
【００１２】
本発明は上記の事情に鑑みてなされたものであり、標識をセンサ部表面に近づけた状態で信号検出を行うことができる検出方法および検出システムを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明の検出方法は、液体試料が流下されるマイクロ流路を有する流路部材の該流路内に、励起光の照射により光を生じる標識が付与された標識結合物質と結合する固定層を備えたセンサ部が設けられてなる流路型センサチップを用意し、
前記流路内に液体試料を流下させることにより、被検出物質の量に応じた量の前記標識結合物質を前記固定層に結合させ、
前記センサ部への励起光の照射により該センサ部の表面に生じるエバネッセント場、または光電場増強場において前記標識から生じる光に基づく信号を検出して、前記被検出物質の量を検出する検出方法において、
前記標識結合物質を前記固定層に結合させた後、
前記センサ部上の流体を、前記標識結合物質と前記固定層との結合が外れず、かつ前記センサ部上に該流体が静的に存在する場合と比較して、前記信号の信号量が大きく検出される一定の流速で移動させつつ、前記信号を検出することを特徴とする。
【００１４】
すなわち、本発明は、センサ部上の流体を一定の流速で移動させ、センサ部上に層流を生じさせた状態で信号を検出することを特徴とする。
【００１５】
なお、ここで「標識結合物質」は被検出物質の量に応じた量だけセンサ部上に結合する、標識が付与された結合物質であり、例えば、サンドイッチ法によるアッセイを行う場合には、被検出物質と特異的に結合する結合物質と標識とから構成され、競合法によるアッセイを行う場合には、被検出物質と競合する結合物質と標識とから構成される。
【００１６】
標識は、励起光に対し光応答性を有するものであればよく、励起光の照射により蛍光を生じる蛍光色素分子、蛍光微粒子、量子ドット（半導体微粒子）のみならず、励起光の照射により散乱光を生じる金属微粒子などであってもよい。
【００１７】
「被検出物質の量を検出する」とは被検出物質の存在の有無を含み、定量的な量のみならず、定性的な量を含むものとする。
【００１８】
また、「光電場増強場」とは、増強された光電場を意味し、光電場を増強させる方法は、プラズモン共鳴によるものであってもよいし、光導波モードの励起によるものであってもよい。
【００１９】
また、「前記標識から生じる光に基づく信号を検出」とは、標識から生じる光を直接検出するものであってもよいし、間接的に検出するものであってもよい。
【００２０】
前記標識結合物質を前記固定層に結合させた後、前記センサ部上の流体の流速を徐々に上げながら、前記信号を検出することにより、該流速に対する前記信号量の変化率を取得し、該信号量の変化率に基づいて、前記一定の流速を定めることが望ましい。
【００２１】
ここで、前記信号量の変化率が、該変化率の測定開始時の値の半分以下となった所定の流速を前記一定の流速と定めることが好ましく、前記信号量の変化率が、０となったときの流速を前記一定の流速と定めることがより好ましい。
【００２２】
また、予め取得された、前記標識結合物質と前記固定層との組合せに適する流速を、前記一定の流速と定めるようにしてもよい。
【００２３】
本発明の検出システムは、液体試料が流下されるマイクロ流路を有する流路部材の該流路内に、励起光の照射により光を生じる標識が付与された標識結合物質と結合する固定層を備えたセンサ部が設けられてなる流路型センサチップと、
前記センサ部上における流体の流速を制御するポンプと、
前記センサ部に励起光を照射する励起光照射光学系および該センサ部からの光に基づく信号を検出する光検出器を備えた光信号検出装置と、
前記ポンプおよび前記光信号検出装置に接続された信号処理制御部であって、前記センサ部上の流体の、前記標識結合物質と前記固定層との結合が外れず、かつ前記センサ部上において該流体が静的に存在する場合と比較して、前記信号の信号量が大きく検出される一定の流速を定める流速決定手段と、前記センサ部上の流体を該一定の流速で移動させつつ、前記信号を検出するように前記ポンプおよび光信号検出装置を制御する制御手段とを含む信号処理制御部とを備えていることを特徴とするものである。
【００２４】
前記制御手段が、前記センサ部上の流体の流速を徐々に上げながら、前記信号を検出することにより、該流速に対する前記信号量の変化率を取得するように、前記ポンプおよび前記光信号検出装置を制御するものであり、前記流速決定手段が、該信号量の変化率に基づいて、前記一定の流速を定めるものであることが望ましい。
【００２５】
このとき、前記流速決定手段は、前記信号量の変化率が、該変化率の測定開始時の値の半分以下となった所定の流速を前記一定の流速と定めるものであることが好ましく、前記信号量の変化率が、０となったときの流速を前記一定の流速と定めるものであることがより好ましい。
【００２６】
また、前記流速決定手段は、予め取得され、所定の記憶手段に記憶された、前記標識結合物質と前記固定層との組合せに適する流速を、前記一定の流速と定めるものであってもよい。
このとき、標識結合物質と固定層との複数の組合せについて、組合せ毎に適する流速との対応関係を示すテーブルを備え、検出に用いられる前記組合せに応じて、該テーブルに基づいて前記一定の流速を定めてもよい。
【００２７】
前記所定の記憶手段は、前記信号処理制御部内に備えられていてもよいし、信号処理制御部外に備えられていてもよい。例えば、前記所定の記憶手段が、前記センサチップの、前記信号の検出に支障のない箇所に設けられたチップ情報部であれば、該チップ情報部から前記適する流速を読み取る情報読取手段を備えればよい。
【００２８】
前記センサチップは、前記流路の前記センサ部の上流側に設けられた、該流路に前記液体試料を注入するための注入口と、前記流路の前記センサ部の下流側に設けられた、前記注入口から注入された前記液体試料を該下流側に流すための空気口とを備えてなり、前記ポンプが、前記注入口または空気口を利用して、前記センサ部上の流体に流速を与えるものであることが望ましい。
【００２９】
前記流路型センサチップに設けられる前記固定層が、前記被検出物質と特異的に結合する第１の結合物質が固定されてなる層であり、前記蛍光標識結合物質が、前記被検出物質と特異的に結合する第２の結合物質を含み、前記被検出物質を介して前記第１の結合物質と結合するものであれば、サンドイッチ法によるアッセイを行うのに好適なものとなる。
【００３０】
また、前記固定層が、前記被検出物質と特異的に結合する第１の結合物質が固定されてなる層であり、前記蛍光標識結合物質は、前記第１の結合物質と特異的に結合する第３の結合物質を含み、前記被検出物質と競合して前記第１の結合物質と結合するものであれば、競合法によるアッセイを行うのに好適なものとなる。
【００３１】
さらに、前記流路内の前記センサ部の流路壁面に金属層が設けられ、該金属層上に前記固定層が設けられていることが好ましい。また、金属層上に光導波層を備え、さらに該光導波層上に前記固定層が設けられていてもよい。なお、前記金属層の材料としては、Ａｕ、Ａｇ、Ｃｕ、Ａｌ、Ｐｔ、Ｎｉ、Ｔｉ、およびこれらの合金からなる群より選択される少なくとも１種の金属を主成分とすることが望ましい。なおここで、「主成分」は、含量９０質量％以上の成分と定義する。また、前記光導波層の材料としては、ＳｉＯ２ 、ＴｉＯ２、ＨｆＯ２などの無機酸化膜、ポリスチレン、ＰＭＭＡなどの有機ポリマー等が挙げられる。
【発明の効果】
【００３２】
本発明の検出方法および検出システムによれば、センサ部上に標識結合物質を結合させた後、センサ部上に流体を一定の流速で移動させることにより、マイクロ流路内に層流が生じ、この層流により、標識結合物質が流れ方向に傾けられるため、センサ部表面により近づけることができる。センサ部表面に標識結合物質を近づけた状態で、標識から生じる光に基づく信号を検出するので、センサ部表面のエバネッセント場または光電場増強場の強い領域を効率よく利用することができるため、被検出物質の有無および／または量を精度よく検出することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
以下、図面を参照して本発明の実施形態について説明する。なお、各図において説明の便宜上、各部の寸法は実際のものとは異ならせている。
【００３４】
＜第１の実施形態の検出システム＞
図１は本発明の第１の実施形態の検出システム１の概略構成を模式的に示す全体図であり、図２Ａ〜図２Ｃは、それぞれセンサチップ形状を模式的に示す斜視図、側面図および平面図である。
【００３５】
本検出システム１は、流路型センサチップ１０と、流路型センサチップ１０の流路内における流体の流速を制御するポンプ２０と、光信号検出装置３０と、ポンプ２０および光信号検出装置３０に接続され、これらを制御する信号処理制御部４０とを備えている。本実施形態では、さらに、流路内における流体の流速を測定するための流速測定器２５を備えており、また、液体試料や緩衝液を流路内に注入するための分注装置（図１においては分注ノズル２８部分のみ図示）を備えている。
【００３６】
流路型センサチップ１０は、液体試料が流下されるマイクロ流路１１を有する流路部材１２の該流路１１内に、励起光の照射により光を生じる標識Ｆが付与された標識結合物質ＢＦと結合する固定層１３を備えたセンサ部１４が設けられてなるものである。
【００３７】
流路型センサチップ１０の形状は、図２Ａ〜図２Ｃに示すように、マイクロ流路１１を有する流路部材１２と、液だめ１６ａ、１６ｂと該液だめの底部に設けられた開口１５ａ、１５ｂとを備えた上板部材１７とが、超音波溶接により接続されて構成されている。流路部材１２および流路部材１７は、ポリスチレン等の透明な誘電体材料からなり、射出成型によりそれぞれ成型することができる。流路サイズは、一例として、流路の幅が２ｍｍ、流路の深さが１００μｍ程度である。流路型センサチップ１０には、少なくともセンサ部１４の上流側および下流側にそれぞれ１つずつ開口（空気口）が流路内の流体の流速を調整するために必要である。本実施形態においては、上流側の開口１５ａは液体試料を注入する注入口として用いられ、下流側の開口１５ｂにはポンプが接続される。
【００３８】
また、本実施形態においては、図１に示すようにセンサチップ１０のセンサ部１４の最も流路壁面側には金属膜１８が設けられており、金属膜１８上に自己組織化膜１９が設けられ、さらにその自己組織化膜１９上に固定層１３が設けられている。固定層１３は、具体的には、被検出物質（例えば抗原）Ａと特異的に結合する第１の結合物質（例えば、１次抗体）Ｂ１からなる。なお、本実施形態において、センサ表面とは金属膜表面をいうものとする。金属膜１８は、所定領域に開口を有するマスクを流路底面に形成し、既知の蒸着法で成膜形成することができる。金属膜１８の厚みは、金属膜１８の材料と、励起光の波長により表面プラズモンが強く励起されるように適宜定めることが望ましい。例えば、励起光として７８０ｎｍに中心波長を有するレーザ光を用い、金属膜として金（Ａｕ）膜を用いる場合、金属膜の厚みは５０ｎｍ±２０ｎｍが好適である。さらに好ましくは、４７ｎｍ±１０ｎｍである。なお、金属膜は、Ａｕ、Ａｇ、Ｃｕ、Ａｌ、Ｐｔ、Ｎｉ、Ｔｉ、およびこれらの合金からなる群より選択される少なくとも１種の金属を主成分とするものが好ましい。
【００３９】
標識Ｆは、蛍光分子ｆと該蛍光分子ｆを内包する光透過材料１６とからなる蛍光物質である。図１の一部に拡大して示すように、複数の蛍光色素分子ｆが内包されていれば蛍光量を増加させることができるため、より好ましい。なお、蛍光色素分子ｆが光透過材料１６により内包されて金属層と所定以上の距離を保つことができるように構成されていれば、蛍光色素分子ｆが金属層１２に近接した場合に生じる金属消光を防止することができる。材料１６としては、具体的には、ポリスチレンやＳｉＯ2などが挙げられるが、蛍光色素分子ｆを内包でき、かつ、該蛍光色素分子ｆからの蛍光を透過させて外部に放出できるものであれば特に制限されない。
【００４０】
蛍光色素分子が金属層に接近しすぎた場合に生じる消光は、金属へのエネルギー移動に伴うものであり、このエネルギー移動の程度は、金属が半無限の厚さを持つ平面なら距離の３乗に反比例して、金属が無限に薄い平板なら距離の４乗に反比例して、また、金属が微粒子なら距離の６乗に反比例して小さくなる。従って、金属層１８と蛍光色素分子ｆとの間の距離は少なくとも数ｎｍ以上、より好ましくは１０ｎｍ以上確保しておくことが望ましい。
【００４１】
蛍光物質Ｆは、例えば、以下のようにして作製することができる。
まず、ポリスチレン粒子（Ｅｓｔａｐｏｒ社、φ５００ｎｍ、１０％ｓｏｌｉｄ、カルボキシル基、製品番号Ｋ１―０５０）を調液して０．１％ｓｏｌｉｄ ｉｎ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ポリスチレン溶液：ｐＨ７．０）を作製する。
次に、蛍光色素（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ社、ＢＯＤＩＰＹ―ＦＬ―ＳＥ、製品番号Ｄ２１８４）０．３ｍｇの酢酸エチル溶液（１ｍＬ）を作製する。
上記ポリスチレン溶液と蛍光色素溶液を混合し、エバポレートしながら含浸を行った後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ、４℃、２０分を２回）を行い、上清を除去する。以上の工程により、ポリスチレンにより蛍光色素を内包してなる蛍光物質Ｆを得ることができる。このような手順で、ポリスチレン粒子に蛍光色素を含浸させて作製された蛍光物質Ｆの粒径はポリスチレン粒子の粒径と同一（上記例ではφ５００ｎｍ）となる。
【００４２】
本実施形態においては、標識として、蛍光分子ｆと該蛍光分子ｆを内包する光透過材料１６とからなる蛍光物質を例に挙げているが、本発明において、標識は蛍光物質に限るものではなく、量子ドット、金属微粒子など、励起光の照射により何らかの光（蛍光、散乱光など）を生じる光応答性を有するものであればよい。
【００４３】
標識結合物質ＢＦは、被検出物質Ａと特異的に結合する第２の結合物質Ｂ２であって、標識Ｆが付与されてなるものである。なお、本実施形態では、サンドイッチアッセイを行う場合を例にあげているが、標識結合物質は、標識が付与された結合物質であり、被検出物質Ａを介して、もしくは直接固定層１３と結合する結合物質であればよく、競合アッセイを行う場合には、結合物質として、被検出物質Ａと競合して固定層１３と直接結合する第３の結合物質とすればよい。被検出物質Ａが抗原である場合、第１の結合物質Ｂ１として所謂１次抗体を用い、標識結合物質として所謂標識２次抗体を用いればよい。
【００４４】
光信号検出装置３０は、センサ部１４に励起光Ｌｏを照射する励起光照射光学系３１と、センサ部１４からの光に基づく信号を検出する光検出器３４とを備えている。本実施形態においては、励起光照射光学系３１によって、流路型センサチップ１０に対し、金属膜１８と流路内壁面との界面に全反射角以上の所定角度で励起光Ｌoを入射させることにより、金属膜表面に表面プラズモンを生じさせ、金属膜表面に染み出したエバネッセント場の光電場を増強させ、この増強された光電場において、蛍光物質から生じる蛍光を流路上方から光検出器で検出するよう構成されている。励起光照射光学系３１は、励起光Ｌｏを出力する半導体レーザ（ＬＤ）等からなる光源３２と、センサチップのセンサ部下方に配置されたプリズム３３とを備えている。プリズム３３は、流路内壁面と金属膜１８との界面で励起光Ｌｏが全反射するように励起光Ｌｏを導光するものである。なお、プリズム３３と流路部材１２とは、屈折率マッチングオイルを介して接触されている。光源３２は、プリズム３３の一面からセンサチップ１０の流路ない壁面で励起光Ｌｏが全反射角以上で、かつ金属膜で表面プラズモン共鳴する特定の角度で入射するように配置されている。さらに、光源３２とプリズム３３との間に必要に応じて導光部材を配置してもよい。また、プリズム２２と誘電体プレート１１とが一体的に形成されていてもよい。なお、励起光Ｌｏは、表面プラズモンを誘起するようにｐ偏光で界面に対して入射させる。
【００４５】
なお、本実施形態においては、励起光Ｌｏとして、界面に所定の角度θで入射する平行光を入射するものとしたが、励起光としては、角度θを中心に角度幅Δθを持つファンビーム（集束光）を用いてもよい。ファンビームを用いれば、界面に対して角度θ―Δθ／２〜θ＋Δθ／２の範囲の入射角度で入射することになり、金属膜上への試料供給の前後において、金属膜上の媒質の屈折率が変化し、そのために表面プラズモンが生じる共鳴角が変化する場合にも入射角度の調整をすることなく、共鳴角の変化に対応することができる。なお、ファンビームは入射角度による強度変化が少ないフラットな分布を持つものであることがより好ましい。
【００４６】
光検出器３４としては、ＣＣＤ、ＰＤ（フォトダイオード）、フォトマルチプライア、ｃ−ＭＯＳ等を適宜用いることができる。なお、光検出器３４の受光面の前方には、適宜、波長選択フィルタを備え、所望の光信号（ここでは、蛍光信号）のみを検出できるようにすることが望ましい。
【００４７】
信号処理制御部４０は、センサ部１４上の流体の、標識結合物質ＢＦと固定層１３との結合が外れず、かつセンサ部１４上において該流体が静的に存在する場合と比較して、信号の信号量が大きく検出される一定の流速を定める流速決定手段４２と、センサ部１４上の流体を該一定の流速で移動させつつ、信号を検出するようにポンプ２０および光信号検出装置３０を制御する制御手段４４とを含む。具体的にはパーソナルコンピュータなどで構成することができる。なお、光検出器３０からの信号はアンプ３５により増幅されて信号処理制御部４０に入力される。
【００４８】
本実施形態においては、信号処理制御部４０は、センサ部１４上における信号計測に適する流速を決定するために、制御部４４により、センサ部１４上の流体の流速を徐々に上げながら、信号を検出することにより、該流速に対する前記信号量の変化率を取得するように、ポンプ２０および光信号検出装置３０を制御し、流速決定手段４２により、該信号量の変化率に基づいて、一定の流速を定める。流速決定手段４２は、信号量の変化率が、該変化率の測定開始時の値の半分以下となった所定の流速を一定の流速と定めるよう構成されていてもよいし、信号量の変化率が、０となったときの流速を一定の流速と定めるよう構成されていてもよい。
【００４９】
流速測定器２５は、流路１１内の流体の流速を測定するものであり、信号処理制御部４０に接続され、モニタしている流速を制御部４０に出力する。マイクロ流路内の流速は吸引ポンプの出力（吸引力）から得ることもできるため、流速測定器は必ずしも必要ではないが、より厳密な測定を行うために設置されていることが望ましい。具体的には、レーザ流速計や超音波流速計など既知の測定器を用いることができる。
【００５０】
＜第１の実施形態の検出方法＞
上記検出システム１を用いた本発明の第１の実施形態の検出方法は、上述の流路型センサチップ１０を用い、流路１１内に液体試料Ｓを流下させることにより、被検出物質Ａの量に応じた量の標識結合物質を固定層に結合させた後、センサ部１４への励起光の照射により該センサ部の表面に生じる光電場増強場において標識から生じる光に基づく信号を検出して、被検出物質の量を検出する際に、標識結合物質と固定層との結合が外れず、かつセンサ部上に該流体が静的に存在する場合と比較して、信号の信号量が大きく検出される一定の流速で移動させつつ、信号を検出することを特徴とする。本実施形態においては、信号検出に適する流速を一定の流速として定めた上で、信号検出を行うものである。
【００５１】
図１および図２に示した流路型センサチップや、さらに本発明の検出方法および検出システムの流路型センサチップとして利用可能な、電気泳動、化学反応、細胞培養および分離検出などのラボプロセスが集積化されたラボ-オン-ア-チップ（Lab-0n-a-chip：Laboratory on a Chip）やマイクロ-タス(μ-TAS：Micro-Total Analysis Systems)などに設けられるマイクロスケールの流路における流体の流れは生体由来の分析物（血液、尿など）を扱う場合、レイノルズ数（Re）がRe＜200と低いため、乱流は生じず層流が支配的となる。
【００５２】
層流とは、図３に示すように、マイクロ流路内の流線が壁面に対して平行で、流路中央部で最も流速が早く、流路壁面近傍では摩擦力により流速が小さい流れのことである。層流は流路内で図３に示すような速度分布を持つために、標識物質はずり応力Ｔを受けて、傾くことになる。その結果、標識物質とセンサ表面間の距離が短くなり、信号が増大する。ずり応力Ｔは、センサ表面法線方向をｚ方向、流路内流れ方向の流速をｖ（ｚ）、粘性係数μとすると、
Ｔ＝μ・ｄｖ（ｚ）／ｄｚ
と表される。一般的に流路壁面近傍では壁面からの距離に対して流速が大きく変化するので、上式から大きなずり応力が発生することがわかる。
【００５３】
図４は、流体が静的なとき（ｖ＝０）と、一定の流速で移動しているとき（ｖ＝ｖａ）の標識結合物質の状態を模式的に示したものである。ここでは、センサ表面に厚み３ｎｍ以下の自己組織化膜を設け、その上に固定層として被検出物質Ａと特異的に結合する第１の抗体（長さ１０〜５０ｎｍ）Ｂ1が設けられているものとしている。標識結合物質ＢＦは、被検出物質Ａと特異的に結合する第２の抗体Ｂ２と標識物質Ｆとを含むものであり、標識物質Ｆは、蛍光分子ｆが該蛍光分子ｆからの蛍光を透過する材料により内包されてなる蛍光物質からなるものとしている。
【００５４】
流体が静的なとき、すなわち静止流体内では、標識結合物質は固定層と結合した状態で流体中に浮かんだ状態となっており、標識結合物質とセンサ部表面との距離は標識結合物質や、固定層のサイズによるが、図４に示すような、２つの抗体によって被検出物質である抗原を挟むサンドイッチを形成する場合、３０〜１００ｎｍ程度である。一方、流体が一定の流速で移動しているとき、すなわち層流内では、標識結合物質が固定層と結合した状態でずり応力を受けて傾くことにより、標識物質と固定層との距離を１５ｎｍ程度まで近づけることができる。なお、ここで、センサ表面から標識物質までの距離は、センサ表面から標識物質表面までの最短距離としている。
【００５５】
図５は、標識物質として図４で示すような蛍光物質を用いたときの、該蛍光物質とセンサ表面との距離と蛍光信号量比の関係を示した図である。なお、図５は、多層膜近似シミュレーションによって得られた計算値であり、プリズム（ポリメタクリル酸メチル樹脂；PMMA)上に５０ｎｍ厚の金膜を設けたセンサ上に溶媒（水）が存在する系とし、直径３１０ｎｍの球状の蛍光物質を標識として用い、励起光（レーザ波長６５６ｎｍ）を、励起入射角７２．５°の条件でプリズムと金膜の界面に対して入射させる場合についてのシミュレーション結果である。ここで、蛍光物質がセンサ表面に接した距離ゼロの時の蛍光信号量を１としている。
【００５６】
既述の通り、静止流体ではサンドイッチ形成後の蛍光ビーズはセンサ表面から概ね３０ｎｍ以上離れているため、図５から蛍光信号量比は、0.75以下であり、蛍光ビーズとセンサ表面からの距離を１５ｎｍまで近づけると、蛍光信号量比を0.85程度まで向上させることができることが分かる。
【００５７】
このように、センサ部上に層流を生じさせることにより、固定層と結合している標識物質にずり応力を与え、センサ部表面に近づけることができる。これにより、Ｓ／Ｎよく安定した信号を検出することが可能となる。
【００５８】
なお、上記シミュレーションは、上述の通り、蛍光物質を用いて行ったが、標識として、蛍光分子、量子ドット、金属微粒子などを用いた場合であっても、同様に層流によりずり応力を受け、標識は、静止流体内と比較して層流内においてセンサ表面に近づけられる効果が得られる。
【００５９】
図６は、サンドイッチ形成後に、センサ部上の流速を徐々に増加させた場合の流速と蛍光量の関係を示した模式図である。
【００６０】
静止流体内において、標識（蛍光物質）が最もセンサ表面から離れているとすると、図６に示すように、流速増加に伴って蛍光物質にはずり応力が働き、蛍光物質とセンサ表面間の距離が短くなるために蛍光量が増大する。さらに、流速を増加させていくと、ずり応力も増大していくので蛍光量はさらに増大する。しかし、流速が大きくなりすぎると、サンドイッチ複合体の特異結合部分にかかるずり応力により、特異結合がはずれて蛍光物質が固定表面から剥離するという現象が現れる。このとき、蛍光量は大きく減衰する。実際には、蛍光物質の剥離が起こらず、かつ、なるべく大きな蛍光量（信号量）を得ることができる流速とすべきである。適する流速の決定方法については後記する。
【００６１】
本実施形態の検出方法における手順を説明する。ここでは、一例として、尿、血液などの生体試料Ｓに含まれる被検出物質として抗原Ａを検出する場合について説明する。
【００６２】
本実施形態において、センサチップ１０として、流路１１のセンサチップ１４上流側の一部に、抗原Ａと特異的に結合する第２の結合物質である２次抗体Ｂ２と蛍光標識Ｆとからなる蛍光標識結合物質（標識２次抗体）ＢＦが予め吸着固定されているものを用いる。
【００６３】
１）まず、マイクロ流路の注入口１５aから分注装置２８により生体試料Ｓを注入し、空気口１５ｂに接続された吸引ポンプ２０の吸引操作により生体試料Ｓをマイクロ流路１１内に導入する。
【００６４】
２）流路１１に導入された試料は流路に吸着固定されている標識２次抗体ＢＦと混ぜ合わされ、抗原Ａが標識２次抗体ＢＦの２次抗体Ｂ２と結合し、さらに２次抗体Ｂ2と結合した抗原Ａが、センサ部１４上に固定されている固定層１３である１次抗体Ｂ１と結合し、抗原Ａが１次抗体Ｂ１と２次抗体Ｂ２（標識２次抗体ＢＦ）で挟み込まれたいわゆるサンドイッチが形成される。
【００６５】
３）光信号測定に適する流速を決定する。信号処理制御部４０が、制御部４４によりポンプ２０を制御して流速を変化させつつ光検出器３４から光信号を取得し、流速測定器２５からの流速値および光検出器３４からの光信号量とから光信号量の変化率を求め、流速決定手段４２において光信号量の変化率がほぼゼロになった流速ｖａを光信号検出時の流速と定め、制御部４４によりポンプを制御して流速を固定する。
【００６６】
詳細には次の手順となる。
３ａ）流速変化による光信号量の変動のモニタリングを開始する。具体的には、励起光を照射し、センサ表面上に光電場増強場を発生させ、標識物質からの光信号量Ｉを光検出器で検出を開始すると共に、ポンプ操作により流路内の流体の流速ｖを徐々に大きくしていく。すなわち、センサ部上の流体の流速を徐々に上げながら、光信号を検出することにより、該流速に対する信号量の変化率を取得する。なお、この際、流速測定器で正確な流速を検出する。ここで、流路１１内の流体は上記結合反応後に残存する試料であってもよいし、必要に応じて分注装置２８により流路１１内に注入された緩衝液であってもよい。
３ｂ）図６に示すように、光信号量Ｉは流速の増加に伴い増加し、一旦飽和した後、信号量Ｉが減少するので、光信号量の変化率（ｄＩ／ｄｖ）が低下していき、ほぼゼロとなったときの流速において、最大の信号量Ｉが検出できる。従って、光信号量の変化率がほぼゼロになった流速ｖａでポンプ操作を中止し、該流速ｖａを被検体検出のための光信号検出時の流速と定める。
【００６７】
４）ポンプ２０の吸引操作により流路内の流体の流速ｖを一定の流速ｖａに維持固定した状態で、センサ部からの光信号量を光検出器で検出取得する。
【００６８】
なお、最終的な光信号取得のタイミングは、光信号量の変化率がほぼゼロになったときが最も好ましいが、本発明は、これに限定されるものではなく、標識結合物質と固定層との結合が外れず、かつセンサ部上に該流体が静的に存在する場合と比較して、信号の信号量が大きく検出される一定の流速下であればよい。例えば、信号量の変化率が、該変化率の測定開始時の値の半分になったとき（ｄＩ/ｄｖ＝1/2×ｄＩ(0)/ｄｖ(0)）と定めてもよいし、信号量の変化率が、該変化率の測定開始時の値の半分以下となり、０となるまでの所定の流速を一定の流速と定めてもよい。
【００６９】
このように、センサ部上の流体を一定の流速で移動させることにより、蛍光物質をセンサ部に近づけた状態で蛍光を検出することにより、光増強電場を有効に利用してＳ／Ｎよい信号を得ることができ、検査の信頼性を向上させることができる。
【００７０】
＜第２の実施形態の検出システム＞
第２の実施形態である検出システムおよび検出方法について図７を参照して説明する。図７は第２の実施形態の検出システム２の概略構成を模式的に示す全体図である。なお、以下においては、第１実施形態と同じ構成要素には同じ参照符号を付し、詳細な説明を省略する。また図７のセンサチップにおいては液だめ部は省略してある。
【００７１】
図７に示す検出システムは、信号処理制御部５０の構成が第１の実施形態のシステムと異なる。具体的には、本実施形態の信号処理制御部５０は、流速決定手段５２内の記憶手段が、予め取得された、標識結合物質と固定層との複数の組合せについて、該組合せ毎に適する一定の流速との対応関係を示すテーブルＴを備え、検出に用いられる組合せに応じて、該テーブルＴに基づいて一定の流速を定めるものである点で第１の実施形態のシステムと異なる。
【００７２】
＜第２の実施形態の検出方法＞
本実施形態の検出方法は、信号検出を行うに適する一定の流速を定める方法が第１の実施形態の検出方法と異なる。
【００７３】
上述の通り、センサ部上の固定層１３に標識結合物質ＢＦを結合させた状態で流速を大きくしていくと、層流によるずり応力が固定層と結合物質との結合力を上回ることにより、結合物質の剥離が開始する。この剥離は固定層（第１の結合物質）と標識結合物質との種類（具体的には、抗原・抗体の種類）によって決まる特異結合の強さに依存しているので、検査対象となる固定層と標識結合物質の組合せ（抗原・抗体の組合せ）に適する流速を予め実験的に求めておき、チップ情報など何らかの形態で保存（記憶）しておく。そして、実際の検査時には、その組合せに適した流速下で光信号を検出する。
【００７４】
サンドイッチアッセイの場合、標識結合物質（第２の結合物質）は、被検出物質（抗原）を介して固定層（第１の結合物質）に結合されており、第１の結合物質―抗原―第２の結合物質の組合せ毎に適する流速を求めておく。競合法の場合、標識結合物質（第３の結合物質）が固定層（第１の結合物質）に直接結合していることから、第１の結合物質―第３の結合物質および第１の結合物質−抗原の組合せ毎に適する流速を求めておく。
【００７５】
実験的に流速を求める方法は、上述の第１の実施形態の手順３）と同様に、流速を増加させつつ蛍光信号量を測定し、信号量の変化率を測定して、該変化率の変化をモニタリングして求める方法が好ましい。変化率が、該変化率の測定開始時の値の半分以下（ｄＩ/ｄｖ＝1/2×ｄＩ(0)/ｄｖ(0)）から０となるまでの所定の流速を、適切な流速とし、この流速を固定層と結合物質との組合せと対応付けて保存しておく。
【００７６】
本実施形態の検出システム２においては、流速決定手段５２内の記憶手段に固定層と結合物質との複数の組合せと各組合せに適切な流速とが対応付けられたテーブルＴを備えておき、実際の測定対象に応じてテーブルＴを参照して適宜適切な流速が決定されるよう構成されている。
【００７７】
以下、本実施形態の検出方法における手順を説明する。試料Ｓをマイクロ流路１１内に注入し、センサ部上に第１の結合物質（１次抗体）−抗原−第２の結合物質（２次抗体）のサンドイッチを形成させる手順は第１の実施形態の１）−２）と同様に行う。
【００７８】
３’）光信号測定に適する流速を決定する。信号処理制御部４０の流速決定手段４２が、標識結合物質と固定層との複数の組合せについて、該組合せ毎に適する一定の流速との対応関係を示すテーブルＴから、検出に用いられている組合せに応じて、一定の流速を定める。
【００７９】
４’）ポンプ２０の吸引操作により流路内の流体の流速ｖを一定の流速に維持固定した状態で、センサ部からの光信号量を光検出器で検出取得する。
【００８０】
本実施形態の場合も第１の実施形態の場合と同様に、センサ部上の流体を一定の流速で移動させることにより、蛍光物質をセンサ部に引き寄せた状態で蛍光を検出することにより、光増強電場を有効に利用してＳ／Ｎよい信号を得ることができ、検査の信頼性を向上させることができる。
【００８１】
上記においては、流速決定手段５２に固定層と結合物質の組合せと、該組合せに適する流速が対応付けられたテーブルを備える実施形態について説明したが、固定層と結合物質の組合せと該組合せに適する流速は他の形態の記憶手段に記憶されていてもよい。たとえば、図７に示すように、流路型センサチップ１０’の上面の、信号測定に影響を生じない箇所に該チップ１０’に予め固定層と、該固定層と結合し得る結合物質との組合せに適する流速を記憶したチップ情報部６０を備え、また、検査システムに該情報部６０から適する流速を読み取る情報読取手段を備えるものとし、該チップ１０’を用いた測定時に、該チップ情報部６０から適する流速を読み取って、流速決定手段により該適する流速を、一定の流速と定めるようにしてもよい。
【００８２】
チップ情報部６０にはバーコード６１などで情報を記録してもよいし、ＩＣチップを備えてもよい。情報読取手段としては、チップ情報部６０における情報の記録形態に応じ、バーコードリーダあるいはＩＣ読取装置などを備えればよい。
【００８３】
上記各実施形態において、流路型センサチップ１０は、基本的にセンサ部の上流側および下流側にそれぞれ少なくとも１つずつの空気口１５ａ、１５ｂを備えていることにより、流路内の流体の流速を調整が可能となっている。上記実施形態においては、空気口１５ｂに吸引ポンプ２０を接続して吸引操作により流体を移動させる構成について説明したが、注入口に押し出しポンプを接続して押し出し操作により流体を移動させるよう構成することもできる。
【００８４】
流路型センサチップ１０の設計変更例について説明する。図９および図１０は、設計変更例のセンサチップ１０Ａ、１０Ｂの平面図である。
【００８５】
図９に示すセンサチップ１０Ａは、流路の注入口１５ａとセンサ部１４との間に空気口５１を備えたものである。該空気口７１に押し出しポンプを接続し、押し出し操作により流体を下流側へ移動させることができる。
【００８６】
図１０に示すセンサチップ１０Ｂは、流路の注入口１５ａとセンサ部１４との間で流路が分岐して枝路７２を備え、該枝路７２の末端に空気口７３を備えたものである。空気孔７３に押し出しポンプを接続し、押し出し操作により流体を下流側へ移動させることができる。センサチップ１０Ｂのような枝路を備えた流路では、ポンプにより押し出し操作により注入口１５ａ側に流体が移動するのを防ぐため、液だめに十分な緩衝液を溜めておく、あるいは注入口１５ａに栓をする、あるいは、分岐点より上流側に逆流防止の弁を流路内に配置しておく必要がある。
【００８７】
なお、センサチップとしては、流路に４つ以上の空気口を備えたものを用いてもよい。また、２つ以上の空気口にそれぞれポンプを備えるようにしてもよい。なお、ポンプは、圧力をかけて流れを引き起きこす圧力ポンプに限定されず、微細流路で用いられる一般的な送液制御可能なものであればよく、例えば、電気浸透流ポンプなどであってもよい。
【００８８】
上記各実施形態においては、標識として蛍光物質を用い、光信号の検出として、表面プラズモンによりセンサ部表面に光電場増強場を生じさせ、該光電場増強場において蛍光物質が励起されることによって生じる光を検出するものについて説明したが、光電場を増強させる方法は、表面プラズモン共鳴によるもののみならず、局在プラズモン共鳴によるものであってもよいし、光導波モードの励起によるものであってもよい。また、蛍光標識から生じる蛍光を直接検出してもよいし、間接的に検出してもよい。また、標識として蛍光物質のみならず、蛍光色素分子あるいは量子ドットを用い、これらからの蛍光を直接または間接的に検出するものとしてもよい。さらに、標識として、金属微粒子を用いる場合には、金属微粒子による励起光の散乱光を検出すればよい。また、光電場増強場を生じさせた場合のみならず、増強場を用いないエバネッセント蛍光法による蛍光信号検出の際にも、エバネッセント場がセンサ表面から離れるにつれ急激に減衰する現象は同様であり、標識をセンサ表面に引き寄せた状態で信号検出を行うことにより、やはり信号量の増加の効果を得ることができ、Ｓ／Ｎを向上させることができる。
【００８９】
局在プラズモン共鳴による光電場増強場を生じさせるためには、センサ部に金属膜に代えて、励起光の照射を受けて、所謂局在プラズモンを生じる、表面に励起光Ｌｏの波長よりも小さい凹凸構造を有する金属微細構造体、あるいは、励起光の波長よりも小さいサイズの複数の金属ナノロッドを備えていてもよい。このような局在プラズモンを生じさせる場合には、励起光照射光学系は、透過光あるいは落射光として励起光Ｌｏを照射するよう構成とすることができる。励起光の照射を受けて局在プラズモンを生じる金属微細構造体としては、その他、特開２００６−３２２０６７号公報、特開２００６-２５０９２４号公報などに記載の金属体を陽極酸化して得られる微細構造体を利用した種々の形態の金属微細構造体を用いることができる。
【００９０】
光導波モードによる光電場増強場を生じさせるためには、センサ部の金属層上に光導波層を備え、該光導波層の上に自己組織化膜および固定層を設けた構成とすればよい。
【００９１】
標識からの光信号を間接的に検出する装置および方法について図１１を参照して説明する。図１１は第３の実施形態の検出システム３のセンサチップ１０（図１１において液だめ部は省略。）および光信号検出装置３０’を示す要部構成図である。本実施形態の検出システム３の光信号検出装置３０’は、第１の実施形態の検出システム１における光信号検出装置３０と、光検出器３４の配置が異なり、表面プラズモン共鳴により光電場増強場Ｄを生じさせ、増強された電場において励起された蛍光が金属膜１８に新たに表面プラズモンを誘起することにより、流路下方に放射される、新たに誘起されたプラズモンからの放射光を検出するように構成されている。
【００９２】
放射光を検出する光信号検出装置３０’による放射光検出の原理について説明する。
センサ部１４に、励起光照射光学系３１により励起光Ｌｏを照射する。このとき、励起光照射光学系３１により励起光Ｌｏが流路内壁面と金属膜１８との界面に対して全反射角以上の特定の入射角度で入射させる。これにより、金属膜１８上の試料Ｓ中にエバネッセント波が滲み出し、このエバネッセント波によって金属膜１２中に表面プラズモンが励起される。励起光の入射により金属層上に生じている光電場（エバネッセント波に起因する電場）が、この表面プラズモンにより増強され、金属層上に光電場増強領域Ｄが形成される。光電場増強領域の金属膜表面には、蛍光物質Ｆが引き寄せられており、蛍光物質Ｆが励起されて（実質的にはその蛍光物質中の蛍光色素分子ｆが励起されて）蛍光が発生する。このとき、表面プラズモンによる光電場増強の効果により蛍光は増強されたものとなる。金属膜１８上で生じたこの蛍光が、金属膜１８に表面プラズモンを新たに誘起し、この表面プラズモンによりセンサチップ１０の金属膜形成面と反対側から特定の角度で放射光Ｌｐが射出される。光検出器３４によって、この放射光Ｌｐを検出することにより、標識結合物質と結合した被検出物質の有無および／または量を検出することができる。
【００９３】
放射光Ｌｐは蛍光が金属膜の特定の波数の表面プラズモンと結合する際に生じるものであり、蛍光の波長に応じてその結合する波数は定まり、その波数に応じて放射光の出射角度が定まる。通常励起光Ｌｏの波長と蛍光の波長とは異なることから、蛍光により励起される表面プラズモンは、励起光Ｌｏにより生じた表面プラズモンとは異なる波数のものとなり、励起光Ｌｏの入射角度とは異なる角度で放射光Ｌｐは放射される。
【００９４】
このように、標識からの蛍光を間接的に検出する場合であっても、光電場増強場を利用していることから、センサ部表面に標識をより近づけることにより信号のＳ／Ｎを向上させることができるため、層流を利用して標識をセンサ部表面に近づける本発明の検査方法およびシステムが有効である。
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１】本発明の第１実施形態による検出システムを示す概略構成図
【図２Ａ】本発明の検出システムに用いられる流路型センサチップを示す斜視図
【図２Ｂ】本発明の検出システムに用いられる流路型センサチップを示す側断面図
【図２Ｃ】本発明の検出システムに用いられる流路型センサチップを示す平面図
【図３】流路内の速度分布（層流）を示す図
【図４】静止流体内および層流内における固定層と標識結合物質の結合状態を示す模式図
【図５】金属膜と蛍光物質間の距離と蛍光信号量比との関係を示す図
【図６】流速と蛍光量の関係を示す図
【図７】センサチップの他の例を示す平面図
【図８】本発明の第２実施形態による検出システムを示す概略構成図
【図９】センサチップの設計変更例を示す平面図
【図１０】センサチップの設計変更例を示す平面図
【図１１】本発明の第３実施形態による検出システムの一部を示す概略図
【図１２】入射光に対する電場エネルギー像強度の金属膜からの距離依存性を示す図
【符号の説明】
【００９６】
１、２、３ 検出システム
１０、１０’、１０Ａ、１０Ｂ 流路型センサチップ
１２ 流路部材
１３ 固定層（第１の結合物質）
１４ センサ部
１９ 金属膜
２０ ポンプ
２５ 流速測定器
３０ 光信号検出装置
３１ 励起光照射光学系
３２ 光源
３３ プリズム
３４ 光検出器
３５ アンプ
Ａ 抗原（被検出物質）
Ｂ１ １次抗体（第１の結合物質）
Ｂ２ ２次抗体（第２の結合物質）
ＢＦ 標識２次抗体（蛍光標識結合物質）
Ｆ 蛍光物質
ｆ 蛍光色素分子
Ｌｏ 励起光
Ｌｆ 蛍光
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中の被検出物質を検出する検出方法、および検出システムに関するものでああり、特に、エバネッセント場あるいは光電場増強場を用いた光信号検出により被検出物質を検出する検出方法、および検出システムに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、バイオ測定等において、高感度かつ容易な測定法として蛍光検出法が広く用いられている。この蛍光検出法は、特定波長の光により励起されて蛍光を発する被検出物質を含むと考えられる試料に上記特定波長の励起光を照射し、そのとき蛍光を検出することによって被検出物質の存在を確認する方法である。また、被検出物質が蛍光体ではない場合、蛍光色素で標識されて被検出物質と特異的に結合する物質を試料に接触させ、その後上記と同様にして蛍光を検出することにより、この結合すなわち被検出物質の存在を確認することも広くなされている。
【０００３】
バイオ測定においては、例えば、試料に含まれる被検出物質である抗原を検出するため、基板上に被検出物質と特異的に結合する１次抗体を固定しておき、基板上に試料を供給することにより、１次抗体に被検出物質を特異的に結合させ、次いで、被検出物質と特異的に結合する、蛍光標識が付与された２次抗体を添加し、被検出物質と結合させることにより、１次抗体―被検出物質―２次抗体の、所謂サンドイッチを形成し、２次抗体に付与されている蛍光標識からの蛍光を検出するサンドイッチ法や、被検出物質と競合して１次抗体と特異的に結合する、蛍光標識された競合２次抗体を被検出物質と競合的に１次抗体と結合させ、１次抗体と結合した競合２次抗体からの蛍光を検出する競合法などのアッセイがなされる。
【０００４】
この際、基板上に固定された１次抗体と被検出物質を介して結合した２次抗体、あるいは直接結合した競合２次抗体のみからの蛍光を検出するために、エバネッセント光により蛍光を励起するエバネッセント蛍光法が提案されている。エバネッセント蛍光法は、基板表面で全反射する励起光を基板裏面から入射し、基板表面に染み出すエバネッセント波により蛍光を励起してその蛍光を検出するものである。
【０００５】
また、エバネッセント蛍光法において、感度を向上させるため、プラズモン共鳴による電場増強の効果を利用する方法が特許文献１、非特許文献１などに提案されている。表面プラズモン増強蛍光法は、プラズモン共鳴を生じさせるため、基板上に金属層を設け、基板と金属層との界面に対して基板裏面から、全反射角以上の角度で励起光を入射し、この励起光の照射により金属層に表面プラズモンを生じさせ、その電場増強作用によって、蛍光信号を増大させてＳ／Ｎを向上させるものである。
【０００６】
同様に、エバネッセント蛍光法において、センサ部の電場を増強する効果を有するものとして、導波モードによる電場増強効果を利用する方法が非特許文献２に提案されている。この光導波モード増強蛍光分光法（OWF：Optical waveguide mode enhanced fluorescence spectroscopy)は、基板上に金属層と、誘電体などからなる光導波層とを順次形成し、基板裏面から全反射角以上の角度で励起光を入射し、この励起光の照射により光導波層に光導波モードを生じさせ、その電場増強効果によって、蛍光信号を増強させるものである。
【０００７】
また、特許文献２および非特許文献３には、表面プラズモンによる増強された電場において励起された蛍光標識からの蛍光を検出するのではなく、その蛍光が金属層に新たに表面プラズモンを誘起して生じる放射光（SPCE: Surface Plasmon-Coupled Emission)をプリズム側から取り出す方法が提案されている。
【０００８】
このように、バイオ測定等においては、被測定物質を検出するための方法として、励起光の照射により、プラズモン共鳴や光導波モードを生じさせ、これらによって増強された電場で蛍光標識を励起させ、その蛍光を直接、あるいは間接的に検出する種々の方法が提案されている。
【０００９】
上記したエバネッセント蛍光法で生じるエバネッセント場および増強される電場は、電場発生面からの距離に対して急激に減衰することが知られている。図１２は、表面プラズモンによる電場増強効果の増強場発生面（金属面）からの離間距離依存性を示すグラフであり、プリズム（ポリメタクリル酸メチル樹脂；PMMA)上に５０ｎｍ厚の金膜を設けたセンサ上に溶媒（水）が存在する系とし、励起光（レーザ波長６５６ｎｍ）を、励起入射角７２．５°の条件でプリズムと金膜の界面に対して入射させる場合についてのシミュレーション結果である。このグラフから確認されるように、電場のエネルギー増強度は１００ｎｍ程度の離間で半減する。従って、蛍光標識はできるだけ増強場発生面に近接していることが好ましい。
【００１０】
一方、バイオ測定においては、より短時間での測定を可能とすることが望まれており、センサ部上における反応を効率よく生じさせ、測定時間の短縮を図る方法が種々提案されている。例えば、特許文献３には、ＤＮＡチップにおける複数の反応工程において、流体と機能性基体を接触させるそれぞれの工程で、それぞれに適した流動速度で流体を流動させる方法が提案されている。また、特許文献４には、マイクロ流路内で流体を超高速する方法が提案されている。
【特許文献１】特開平１０−３０７１４１号公報
【特許文献２】米国特許出願公開第２００５／００５３９７４号明細書
【特許文献３】国際公開番号ＷＯ２００４／１０４５８４号
【特許文献４】特開２００７−１０１２２１号公報
【非特許文献１】W.Knoll他、Analytical Chemistry 77(2005), p.2426-2431
【非特許文献２】2007年春季 応用物理学会 予稿集 Ｎo.３,P.1378
【非特許文献３】Thorsten Liebermann Wolfgang Knoll, "Surface-plasmon field-enhanced fluorescence spectroscopy" Colloids and Surfaces A 171(2000)115-130
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
上述のように、エバネッセント蛍光法やエバネッセント光の光電場をプラズモン共鳴や光導波モードにより増強してセンサ部近傍からの光信号を検出する場合、エバネッセント波の光電場および表面プラズモン共鳴や光導波モードによる電場増強の効果は、金属層や光導波層表面から離れるに従って急激に減衰する。そのため、表面から標識までの距離が僅かに長くなるだけで、信号量が大きく減少してしまうため、標識をなるべくセンサ部表面に近づけた状態で信号検出を行う必要がある。
【００１２】
本発明は上記の事情に鑑みてなされたものであり、標識をセンサ部表面に近づけた状態で信号検出を行うことができる検出方法および検出システムを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明の検出方法は、液体試料が流下されるマイクロ流路を有する流路部材の該流路内に、励起光の照射により光を生じる標識が付与された標識結合物質と結合する固定層を備えたセンサ部が設けられてなる流路型センサチップを用意し、
前記流路内に液体試料を流下させることにより、被検出物質の量に応じた量の前記標識結合物質を前記固定層に結合させ、
前記センサ部への励起光の照射により該センサ部の表面に生じるエバネッセント場、または光電場増強場において前記標識から生じる光に基づく信号を検出して、前記被検出物質の量を検出する検出方法において、
前記標識結合物質を前記固定層に結合させた後、
前記センサ部上の流体を、前記標識結合物質と前記固定層との結合が外れず、かつ前記センサ部上に該流体が静的に存在する場合と比較して、前記信号の信号量が大きく検出される一定の流速で移動させつつ、前記信号を検出することを特徴とする。
【００１４】
すなわち、本発明は、センサ部上の流体を一定の流速で移動させ、センサ部上に層流を生じさせた状態で信号を検出することを特徴とする。
【００１５】
なお、ここで「標識結合物質」は被検出物質の量に応じた量だけセンサ部上に結合する、標識が付与された結合物質であり、例えば、サンドイッチ法によるアッセイを行う場合には、被検出物質と特異的に結合する結合物質と標識とから構成され、競合法によるアッセイを行う場合には、被検出物質と競合する結合物質と標識とから構成される。
【００１６】
標識は、励起光に対し光応答性を有するものであればよく、励起光の照射により蛍光を生じる蛍光色素分子、蛍光微粒子、量子ドット（半導体微粒子）のみならず、励起光の照射により散乱光を生じる金属微粒子などであってもよい。
【００１７】
「被検出物質の量を検出する」とは被検出物質の存在の有無を含み、定量的な量のみならず、定性的な量を含むものとする。
【００１８】
また、「光電場増強場」とは、増強された光電場を意味し、光電場を増強させる方法は、プラズモン共鳴によるものであってもよいし、光導波モードの励起によるものであってもよい。
【００１９】
また、「前記標識から生じる光に基づく信号を検出」とは、標識から生じる光を直接検出するものであってもよいし、間接的に検出するものであってもよい。
【００２０】
前記標識結合物質を前記固定層に結合させた後、前記センサ部上の流体の流速を徐々に上げながら、前記信号を検出することにより、該流速に対する前記信号量の変化率を取得し、該信号量の変化率に基づいて、前記一定の流速を定めることが望ましい。
【００２１】
ここで、前記信号量の変化率が、該変化率の測定開始時の値の半分以下となった所定の流速を前記一定の流速と定めることが好ましく、前記信号量の変化率が、０となったときの流速を前記一定の流速と定めることがより好ましい。
【００２２】
また、予め取得された、前記標識結合物質と前記固定層との組合せに適する流速を、前記一定の流速と定めるようにしてもよい。
【００２３】
本発明の検出システムは、液体試料が流下されるマイクロ流路を有する流路部材の該流路内に、励起光の照射により光を生じる標識が付与された標識結合物質と結合する固定層を備えたセンサ部が設けられてなる流路型センサチップと、
前記センサ部上における流体の流速を制御するポンプと、
前記センサ部に励起光を照射する励起光照射光学系および該センサ部からの光に基づく信号を検出する光検出器を備えた光信号検出装置と、
前記ポンプおよび前記光信号検出装置に接続された信号処理制御部であって、前記センサ部上の流体の、前記標識結合物質と前記固定層との結合が外れず、かつ前記センサ部上において該流体が静的に存在する場合と比較して、前記信号の信号量が大きく検出される一定の流速を定める流速決定手段と、前記センサ部上の流体を該一定の流速で移動させつつ、前記信号を検出するように前記ポンプおよび光信号検出装置を制御する制御手段とを含む信号処理制御部とを備えていることを特徴とするものである。
【００２４】
前記制御手段が、前記センサ部上の流体の流速を徐々に上げながら、前記信号を検出することにより、該流速に対する前記信号量の変化率を取得するように、前記ポンプおよび前記光信号検出装置を制御するものであり、前記流速決定手段が、該信号量の変化率に基づいて、前記一定の流速を定めるものであることが望ましい。
【００２５】
このとき、前記流速決定手段は、前記信号量の変化率が、該変化率の測定開始時の値の半分以下となった所定の流速を前記一定の流速と定めるものであることが好ましく、前記信号量の変化率が、０となったときの流速を前記一定の流速と定めるものであることがより好ましい。
【００２６】
また、前記流速決定手段は、予め取得され、所定の記憶手段に記憶された、前記標識結合物質と前記固定層との組合せに適する流速を、前記一定の流速と定めるものであってもよい。
このとき、標識結合物質と固定層との複数の組合せについて、組合せ毎に適する流速との対応関係を示すテーブルを備え、検出に用いられる前記組合せに応じて、該テーブルに基づいて前記一定の流速を定めてもよい。
【００２７】
前記所定の記憶手段は、前記信号処理制御部内に備えられていてもよいし、信号処理制御部外に備えられていてもよい。例えば、前記所定の記憶手段が、前記センサチップの、前記信号の検出に支障のない箇所に設けられたチップ情報部であれば、該チップ情報部から前記適する流速を読み取る情報読取手段を備えればよい。
【００２８】
前記センサチップは、前記流路の前記センサ部の上流側に設けられた、該流路に前記液体試料を注入するための注入口と、前記流路の前記センサ部の下流側に設けられた、前記注入口から注入された前記液体試料を該下流側に流すための空気口とを備えてなり、前記ポンプが、前記注入口または空気口を利用して、前記センサ部上の流体に流速を与えるものであることが望ましい。
【００２９】
前記流路型センサチップに設けられる前記固定層が、前記被検出物質と特異的に結合する第１の結合物質が固定されてなる層であり、前記蛍光標識結合物質が、前記被検出物質と特異的に結合する第２の結合物質を含み、前記被検出物質を介して前記第１の結合物質と結合するものであれば、サンドイッチ法によるアッセイを行うのに好適なものとなる。
【００３０】
また、前記固定層が、前記被検出物質と特異的に結合する第１の結合物質が固定されてなる層であり、前記蛍光標識結合物質は、前記第１の結合物質と特異的に結合する第３の結合物質を含み、前記被検出物質と競合して前記第１の結合物質と結合するものであれば、競合法によるアッセイを行うのに好適なものとなる。
【００３１】
さらに、前記流路内の前記センサ部の流路壁面に金属層が設けられ、該金属層上に前記固定層が設けられていることが好ましい。また、金属層上に光導波層を備え、さらに該光導波層上に前記固定層が設けられていてもよい。なお、前記金属層の材料としては、Ａｕ、Ａｇ、Ｃｕ、Ａｌ、Ｐｔ、Ｎｉ、Ｔｉ、およびこれらの合金からなる群より選択される少なくとも１種の金属を主成分とすることが望ましい。なおここで、「主成分」は、含量９０質量％以上の成分と定義する。また、前記光導波層の材料としては、ＳｉＯ２ 、ＴｉＯ２、ＨｆＯ２などの無機酸化膜、ポリスチレン、ＰＭＭＡなどの有機ポリマー等が挙げられる。
【発明の効果】
【００３２】
本発明の検出方法および検出システムによれば、センサ部上に標識結合物質を結合させた後、センサ部上に流体を一定の流速で移動させることにより、マイクロ流路内に層流が生じ、この層流により、標識結合物質が流れ方向に傾けられるため、センサ部表面により近づけることができる。センサ部表面に標識結合物質を近づけた状態で、標識から生じる光に基づく信号を検出するので、センサ部表面のエバネッセント場または光電場増強場の強い領域を効率よく利用することができるため、被検出物質の有無および／または量を精度よく検出することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
以下、図面を参照して本発明の実施形態について説明する。なお、各図において説明の便宜上、各部の寸法は実際のものとは異ならせている。
【００３４】
＜第１の実施形態の検出システム＞
図１は本発明の第１の実施形態の検出システム１の概略構成を模式的に示す全体図であり、図２Ａ〜図２Ｃは、それぞれセンサチップ形状を模式的に示す斜視図、側面図および平面図である。
【００３５】
本検出システム１は、流路型センサチップ１０と、流路型センサチップ１０の流路内における流体の流速を制御するポンプ２０と、光信号検出装置３０と、ポンプ２０および光信号検出装置３０に接続され、これらを制御する信号処理制御部４０とを備えている。本実施形態では、さらに、流路内における流体の流速を測定するための流速測定器２５を備えており、また、液体試料や緩衝液を流路内に注入するための分注装置（図１においては分注ノズル２８部分のみ図示）を備えている。
【００３６】
流路型センサチップ１０は、液体試料が流下されるマイクロ流路１１を有する流路部材１２の該流路１１内に、励起光の照射により光を生じる標識Ｆが付与された標識結合物質ＢＦと結合する固定層１３を備えたセンサ部１４が設けられてなるものである。
【００３７】
流路型センサチップ１０の形状は、図２Ａ〜図２Ｃに示すように、マイクロ流路１１を有する流路部材１２と、液だめ１６ａ、１６ｂと該液だめの底部に設けられた開口１５ａ、１５ｂとを備えた上板部材１７とが、超音波溶接により接続されて構成されている。流路部材１２および流路部材１７は、ポリスチレン等の透明な誘電体材料からなり、射出成型によりそれぞれ成型することができる。流路サイズは、一例として、流路の幅が２ｍｍ、流路の深さが１００μｍ程度である。流路型センサチップ１０には、少なくともセンサ部１４の上流側および下流側にそれぞれ１つずつ開口（空気口）が流路内の流体の流速を調整するために必要である。本実施形態においては、上流側の開口１５ａは液体試料を注入する注入口として用いられ、下流側の開口１５ｂにはポンプが接続される。
【００３８】
また、本実施形態においては、図１に示すようにセンサチップ１０のセンサ部１４の最も流路壁面側には金属膜１８が設けられており、金属膜１８上に自己組織化膜１９が設けられ、さらにその自己組織化膜１９上に固定層１３が設けられている。固定層１３は、具体的には、被検出物質（例えば抗原）Ａと特異的に結合する第１の結合物質（例えば、１次抗体）Ｂ１からなる。なお、本実施形態において、センサ表面とは金属膜表面をいうものとする。金属膜１８は、所定領域に開口を有するマスクを流路底面に形成し、既知の蒸着法で成膜形成することができる。金属膜１８の厚みは、金属膜１８の材料と、励起光の波長により表面プラズモンが強く励起されるように適宜定めることが望ましい。例えば、励起光として７８０ｎｍに中心波長を有するレーザ光を用い、金属膜として金（Ａｕ）膜を用いる場合、金属膜の厚みは５０ｎｍ±２０ｎｍが好適である。さらに好ましくは、４７ｎｍ±１０ｎｍである。なお、金属膜は、Ａｕ、Ａｇ、Ｃｕ、Ａｌ、Ｐｔ、Ｎｉ、Ｔｉ、およびこれらの合金からなる群より選択される少なくとも１種の金属を主成分とするものが好ましい。
【００３９】
標識Ｆは、蛍光分子ｆと該蛍光分子ｆを内包する光透過材料１６とからなる蛍光物質である。図１の一部に拡大して示すように、複数の蛍光色素分子ｆが内包されていれば蛍光量を増加させることができるため、より好ましい。なお、蛍光色素分子ｆが光透過材料１６により内包されて金属層と所定以上の距離を保つことができるように構成されていれば、蛍光色素分子ｆが金属層１２に近接した場合に生じる金属消光を防止することができる。材料１６としては、具体的には、ポリスチレンやＳｉＯ2などが挙げられるが、蛍光色素分子ｆを内包でき、かつ、該蛍光色素分子ｆからの蛍光を透過させて外部に放出できるものであれば特に制限されない。
【００４０】
蛍光色素分子が金属層に接近しすぎた場合に生じる消光は、金属へのエネルギー移動に伴うものであり、このエネルギー移動の程度は、金属が半無限の厚さを持つ平面なら距離の３乗に反比例して、金属が無限に薄い平板なら距離の４乗に反比例して、また、金属が微粒子なら距離の６乗に反比例して小さくなる。従って、金属層１８と蛍光色素分子ｆとの間の距離は少なくとも数ｎｍ以上、より好ましくは１０ｎｍ以上確保しておくことが望ましい。
【００４１】
蛍光物質Ｆは、例えば、以下のようにして作製することができる。
まず、ポリスチレン粒子（Ｅｓｔａｐｏｒ社、φ５００ｎｍ、１０％ｓｏｌｉｄ、カルボキシル基、製品番号Ｋ１―０５０）を調液して０．１％ｓｏｌｉｄ ｉｎ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ポリスチレン溶液：ｐＨ７．０）を作製する。
次に、蛍光色素（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ社、ＢＯＤＩＰＹ―ＦＬ―ＳＥ、製品番号Ｄ２１８４）０．３ｍｇの酢酸エチル溶液（１ｍＬ）を作製する。
上記ポリスチレン溶液と蛍光色素溶液を混合し、エバポレートしながら含浸を行った後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ、４℃、２０分を２回）を行い、上清を除去する。以上の工程により、ポリスチレンにより蛍光色素を内包してなる蛍光物質Ｆを得ることができる。このような手順で、ポリスチレン粒子に蛍光色素を含浸させて作製された蛍光物質Ｆの粒径はポリスチレン粒子の粒径と同一（上記例ではφ５００ｎｍ）となる。
【００４２】
本実施形態においては、標識として、蛍光分子ｆと該蛍光分子ｆを内包する光透過材料１６とからなる蛍光物質を例に挙げているが、本発明において、標識は蛍光物質に限るものではなく、量子ドット、金属微粒子など、励起光の照射により何らかの光（蛍光、散乱光など）を生じる光応答性を有するものであればよい。
【００４３】
標識結合物質ＢＦは、被検出物質Ａと特異的に結合する第２の結合物質Ｂ２であって、標識Ｆが付与されてなるものである。なお、本実施形態では、サンドイッチアッセイを行う場合を例にあげているが、標識結合物質は、標識が付与された結合物質であり、被検出物質Ａを介して、もしくは直接固定層１３と結合する結合物質であればよく、競合アッセイを行う場合には、結合物質として、被検出物質Ａと競合して固定層１３と直接結合する第３の結合物質とすればよい。被検出物質Ａが抗原である場合、第１の結合物質Ｂ１として所謂１次抗体を用い、標識結合物質として所謂標識２次抗体を用いればよい。
【００４４】
光信号検出装置３０は、センサ部１４に励起光Ｌｏを照射する励起光照射光学系３１と、センサ部１４からの光に基づく信号を検出する光検出器３４とを備えている。本実施形態においては、励起光照射光学系３１によって、流路型センサチップ１０に対し、金属膜１８と流路内壁面との界面に全反射角以上の所定角度で励起光Ｌoを入射させることにより、金属膜表面に表面プラズモンを生じさせ、金属膜表面に染み出したエバネッセント場の光電場を増強させ、この増強された光電場において、蛍光物質から生じる蛍光を流路上方から光検出器で検出するよう構成されている。励起光照射光学系３１は、励起光Ｌｏを出力する半導体レーザ（ＬＤ）等からなる光源３２と、センサチップのセンサ部下方に配置されたプリズム３３とを備えている。プリズム３３は、流路内壁面と金属膜１８との界面で励起光Ｌｏが全反射するように励起光Ｌｏを導光するものである。なお、プリズム３３と流路部材１２とは、屈折率マッチングオイルを介して接触されている。光源３２は、プリズム３３の一面からセンサチップ１０の流路ない壁面で励起光Ｌｏが全反射角以上で、かつ金属膜で表面プラズモン共鳴する特定の角度で入射するように配置されている。さらに、光源３２とプリズム３３との間に必要に応じて導光部材を配置してもよい。また、プリズム２２と誘電体プレート１１とが一体的に形成されていてもよい。なお、励起光Ｌｏは、表面プラズモンを誘起するようにｐ偏光で界面に対して入射させる。
【００４５】
なお、本実施形態においては、励起光Ｌｏとして、界面に所定の角度θで入射する平行光を入射するものとしたが、励起光としては、角度θを中心に角度幅Δθを持つファンビーム（集束光）を用いてもよい。ファンビームを用いれば、界面に対して角度θ―Δθ／２〜θ＋Δθ／２の範囲の入射角度で入射することになり、金属膜上への試料供給の前後において、金属膜上の媒質の屈折率が変化し、そのために表面プラズモンが生じる共鳴角が変化する場合にも入射角度の調整をすることなく、共鳴角の変化に対応することができる。なお、ファンビームは入射角度による強度変化が少ないフラットな分布を持つものであることがより好ましい。
【００４６】
光検出器３４としては、ＣＣＤ、ＰＤ（フォトダイオード）、フォトマルチプライア、ｃ−ＭＯＳ等を適宜用いることができる。なお、光検出器３４の受光面の前方には、適宜、波長選択フィルタを備え、所望の光信号（ここでは、蛍光信号）のみを検出できるようにすることが望ましい。
【００４７】
信号処理制御部４０は、センサ部１４上の流体の、標識結合物質ＢＦと固定層１３との結合が外れず、かつセンサ部１４上において該流体が静的に存在する場合と比較して、信号の信号量が大きく検出される一定の流速を定める流速決定手段４２と、センサ部１４上の流体を該一定の流速で移動させつつ、信号を検出するようにポンプ２０および光信号検出装置３０を制御する制御手段４４とを含む。具体的にはパーソナルコンピュータなどで構成することができる。なお、光検出器３０からの信号はアンプ３５により増幅されて信号処理制御部４０に入力される。
【００４８】
本実施形態においては、信号処理制御部４０は、センサ部１４上における信号計測に適する流速を決定するために、制御部４４により、センサ部１４上の流体の流速を徐々に上げながら、信号を検出することにより、該流速に対する前記信号量の変化率を取得するように、ポンプ２０および光信号検出装置３０を制御し、流速決定手段４２により、該信号量の変化率に基づいて、一定の流速を定める。流速決定手段４２は、信号量の変化率が、該変化率の測定開始時の値の半分以下となった所定の流速を一定の流速と定めるよう構成されていてもよいし、信号量の変化率が、０となったときの流速を一定の流速と定めるよう構成されていてもよい。
【００４９】
流速測定器２５は、流路１１内の流体の流速を測定するものであり、信号処理制御部４０に接続され、モニタしている流速を制御部４０に出力する。マイクロ流路内の流速は吸引ポンプの出力（吸引力）から得ることもできるため、流速測定器は必ずしも必要ではないが、より厳密な測定を行うために設置されていることが望ましい。具体的には、レーザ流速計や超音波流速計など既知の測定器を用いることができる。
【００５０】
＜第１の実施形態の検出方法＞
上記検出システム１を用いた本発明の第１の実施形態の検出方法は、上述の流路型センサチップ１０を用い、流路１１内に液体試料Ｓを流下させることにより、被検出物質Ａの量に応じた量の標識結合物質を固定層に結合させた後、センサ部１４への励起光の照射により該センサ部の表面に生じる光電場増強場において標識から生じる光に基づく信号を検出して、被検出物質の量を検出する際に、標識結合物質と固定層との結合が外れず、かつセンサ部上に該流体が静的に存在する場合と比較して、信号の信号量が大きく検出される一定の流速で移動させつつ、信号を検出することを特徴とする。本実施形態においては、信号検出に適する流速を一定の流速として定めた上で、信号検出を行うものである。
【００５１】
図１および図２に示した流路型センサチップや、さらに本発明の検出方法および検出システムの流路型センサチップとして利用可能な、電気泳動、化学反応、細胞培養および分離検出などのラボプロセスが集積化されたラボ-オン-ア-チップ（Lab-0n-a-chip：Laboratory on a Chip）やマイクロ-タス(μ-TAS：Micro-Total Analysis Systems)などに設けられるマイクロスケールの流路における流体の流れは生体由来の分析物（血液、尿など）を扱う場合、レイノルズ数（Re）がRe＜200と低いため、乱流は生じず層流が支配的となる。
【００５２】
層流とは、図３に示すように、マイクロ流路内の流線が壁面に対して平行で、流路中央部で最も流速が早く、流路壁面近傍では摩擦力により流速が小さい流れのことである。層流は流路内で図３に示すような速度分布を持つために、標識物質はずり応力Ｔを受けて、傾くことになる。その結果、標識物質とセンサ表面間の距離が短くなり、信号が増大する。ずり応力Ｔは、センサ表面法線方向をｚ方向、流路内流れ方向の流速をｖ（ｚ）、粘性係数μとすると、
Ｔ＝μ・ｄｖ（ｚ）／ｄｚ
と表される。一般的に流路壁面近傍では壁面からの距離に対して流速が大きく変化するので、上式から大きなずり応力が発生することがわかる。
【００５３】
図４は、流体が静的なとき（ｖ＝０）と、一定の流速で移動しているとき（ｖ＝ｖａ）の標識結合物質の状態を模式的に示したものである。ここでは、センサ表面に厚み３ｎｍ以下の自己組織化膜を設け、その上に固定層として被検出物質Ａと特異的に結合する第１の抗体（長さ１０〜５０ｎｍ）Ｂ1が設けられているものとしている。標識結合物質ＢＦは、被検出物質Ａと特異的に結合する第２の抗体Ｂ２と標識物質Ｆとを含むものであり、標識物質Ｆは、蛍光分子ｆが該蛍光分子ｆからの蛍光を透過する材料により内包されてなる蛍光物質からなるものとしている。
【００５４】
流体が静的なとき、すなわち静止流体内では、標識結合物質は固定層と結合した状態で流体中に浮かんだ状態となっており、標識結合物質とセンサ部表面との距離は標識結合物質や、固定層のサイズによるが、図４に示すような、２つの抗体によって被検出物質である抗原を挟むサンドイッチを形成する場合、３０〜１００ｎｍ程度である。一方、流体が一定の流速で移動しているとき、すなわち層流内では、標識結合物質が固定層と結合した状態でずり応力を受けて傾くことにより、標識物質と固定層との距離を１５ｎｍ程度まで近づけることができる。なお、ここで、センサ表面から標識物質までの距離は、センサ表面から標識物質表面までの最短距離としている。
【００５５】
図５は、標識物質として図４で示すような蛍光物質を用いたときの、該蛍光物質とセンサ表面との距離と蛍光信号量比の関係を示した図である。なお、図５は、多層膜近似シミュレーションによって得られた計算値であり、プリズム（ポリメタクリル酸メチル樹脂；PMMA)上に５０ｎｍ厚の金膜を設けたセンサ上に溶媒（水）が存在する系とし、直径３１０ｎｍの球状の蛍光物質を標識として用い、励起光（レーザ波長６５６ｎｍ）を、励起入射角７２．５°の条件でプリズムと金膜の界面に対して入射させる場合についてのシミュレーション結果である。ここで、蛍光物質がセンサ表面に接した距離ゼロの時の蛍光信号量を１としている。
【００５６】
既述の通り、静止流体ではサンドイッチ形成後の蛍光ビーズはセンサ表面から概ね３０ｎｍ以上離れているため、図５から蛍光信号量比は、0.75以下であり、蛍光ビーズとセンサ表面からの距離を１５ｎｍまで近づけると、蛍光信号量比を0.85程度まで向上させることができることが分かる。
【００５７】
このように、センサ部上に層流を生じさせることにより、固定層と結合している標識物質にずり応力を与え、センサ部表面に近づけることができる。これにより、Ｓ／Ｎよく安定した信号を検出することが可能となる。
【００５８】
なお、上記シミュレーションは、上述の通り、蛍光物質を用いて行ったが、標識として、蛍光分子、量子ドット、金属微粒子などを用いた場合であっても、同様に層流によりずり応力を受け、標識は、静止流体内と比較して層流内においてセンサ表面に近づけられる効果が得られる。
【００５９】
図６は、サンドイッチ形成後に、センサ部上の流速を徐々に増加させた場合の流速と蛍光量の関係を示した模式図である。
【００６０】
静止流体内において、標識（蛍光物質）が最もセンサ表面から離れているとすると、図６に示すように、流速増加に伴って蛍光物質にはずり応力が働き、蛍光物質とセンサ表面間の距離が短くなるために蛍光量が増大する。さらに、流速を増加させていくと、ずり応力も増大していくので蛍光量はさらに増大する。しかし、流速が大きくなりすぎると、サンドイッチ複合体の特異結合部分にかかるずり応力により、特異結合がはずれて蛍光物質が固定表面から剥離するという現象が現れる。このとき、蛍光量は大きく減衰する。実際には、蛍光物質の剥離が起こらず、かつ、なるべく大きな蛍光量（信号量）を得ることができる流速とすべきである。適する流速の決定方法については後記する。
【００６１】
本実施形態の検出方法における手順を説明する。ここでは、一例として、尿、血液などの生体試料Ｓに含まれる被検出物質として抗原Ａを検出する場合について説明する。
【００６２】
本実施形態において、センサチップ１０として、流路１１のセンサチップ１４上流側の一部に、抗原Ａと特異的に結合する第２の結合物質である２次抗体Ｂ２と蛍光標識Ｆとからなる蛍光標識結合物質（標識２次抗体）ＢＦが予め吸着固定されているものを用いる。
【００６３】
１）まず、マイクロ流路の注入口１５aから分注装置２８により生体試料Ｓを注入し、空気口１５ｂに接続された吸引ポンプ２０の吸引操作により生体試料Ｓをマイクロ流路１１内に導入する。
【００６４】
２）流路１１に導入された試料は流路に吸着固定されている標識２次抗体ＢＦと混ぜ合わされ、抗原Ａが標識２次抗体ＢＦの２次抗体Ｂ２と結合し、さらに２次抗体Ｂ2と結合した抗原Ａが、センサ部１４上に固定されている固定層１３である１次抗体Ｂ１と結合し、抗原Ａが１次抗体Ｂ１と２次抗体Ｂ２（標識２次抗体ＢＦ）で挟み込まれたいわゆるサンドイッチが形成される。
【００６５】
３）光信号測定に適する流速を決定する。信号処理制御部４０が、制御部４４によりポンプ２０を制御して流速を変化させつつ光検出器３４から光信号を取得し、流速測定器２５からの流速値および光検出器３４からの光信号量とから光信号量の変化率を求め、流速決定手段４２において光信号量の変化率がほぼゼロになった流速ｖａを光信号検出時の流速と定め、制御部４４によりポンプを制御して流速を固定する。
【００６６】
詳細には次の手順となる。
３ａ）流速変化による光信号量の変動のモニタリングを開始する。具体的には、励起光を照射し、センサ表面上に光電場増強場を発生させ、標識物質からの光信号量Ｉを光検出器で検出を開始すると共に、ポンプ操作により流路内の流体の流速ｖを徐々に大きくしていく。すなわち、センサ部上の流体の流速を徐々に上げながら、光信号を検出することにより、該流速に対する信号量の変化率を取得する。なお、この際、流速測定器で正確な流速を検出する。ここで、流路１１内の流体は上記結合反応後に残存する試料であってもよいし、必要に応じて分注装置２８により流路１１内に注入された緩衝液であってもよい。
３ｂ）図６に示すように、光信号量Ｉは流速の増加に伴い増加し、一旦飽和した後、信号量Ｉが減少するので、光信号量の変化率（ｄＩ／ｄｖ）が低下していき、ほぼゼロとなったときの流速において、最大の信号量Ｉが検出できる。従って、光信号量の変化率がほぼゼロになった流速ｖａでポンプ操作を中止し、該流速ｖａを被検体検出のための光信号検出時の流速と定める。
【００６７】
４）ポンプ２０の吸引操作により流路内の流体の流速ｖを一定の流速ｖａに維持固定した状態で、センサ部からの光信号量を光検出器で検出取得する。
【００６８】
なお、最終的な光信号取得のタイミングは、光信号量の変化率がほぼゼロになったときが最も好ましいが、本発明は、これに限定されるものではなく、標識結合物質と固定層との結合が外れず、かつセンサ部上に該流体が静的に存在する場合と比較して、信号の信号量が大きく検出される一定の流速下であればよい。例えば、信号量の変化率が、該変化率の測定開始時の値の半分になったとき（ｄＩ/ｄｖ＝1/2×ｄＩ(0)/ｄｖ(0)）と定めてもよいし、信号量の変化率が、該変化率の測定開始時の値の半分以下となり、０となるまでの所定の流速を一定の流速と定めてもよい。
【００６９】
このように、センサ部上の流体を一定の流速で移動させることにより、蛍光物質をセンサ部に近づけた状態で蛍光を検出することにより、光増強電場を有効に利用してＳ／Ｎよい信号を得ることができ、検査の信頼性を向上させることができる。
【００７０】
＜第２の実施形態の検出システム＞
第２の実施形態である検出システムおよび検出方法について図７を参照して説明する。図７は第２の実施形態の検出システム２の概略構成を模式的に示す全体図である。なお、以下においては、第１実施形態と同じ構成要素には同じ参照符号を付し、詳細な説明を省略する。また図７のセンサチップにおいては液だめ部は省略してある。
【００７１】
図７に示す検出システムは、信号処理制御部５０の構成が第１の実施形態のシステムと異なる。具体的には、本実施形態の信号処理制御部５０は、流速決定手段５２内の記憶手段が、予め取得された、標識結合物質と固定層との複数の組合せについて、該組合せ毎に適する一定の流速との対応関係を示すテーブルＴを備え、検出に用いられる組合せに応じて、該テーブルＴに基づいて一定の流速を定めるものである点で第１の実施形態のシステムと異なる。
【００７２】
＜第２の実施形態の検出方法＞
本実施形態の検出方法は、信号検出を行うに適する一定の流速を定める方法が第１の実施形態の検出方法と異なる。
【００７３】
上述の通り、センサ部上の固定層１３に標識結合物質ＢＦを結合させた状態で流速を大きくしていくと、層流によるずり応力が固定層と結合物質との結合力を上回ることにより、結合物質の剥離が開始する。この剥離は固定層（第１の結合物質）と標識結合物質との種類（具体的には、抗原・抗体の種類）によって決まる特異結合の強さに依存しているので、検査対象となる固定層と標識結合物質の組合せ（抗原・抗体の組合せ）に適する流速を予め実験的に求めておき、チップ情報など何らかの形態で保存（記憶）しておく。そして、実際の検査時には、その組合せに適した流速下で光信号を検出する。
【００７４】
サンドイッチアッセイの場合、標識結合物質（第２の結合物質）は、被検出物質（抗原）を介して固定層（第１の結合物質）に結合されており、第１の結合物質―抗原―第２の結合物質の組合せ毎に適する流速を求めておく。競合法の場合、標識結合物質（第３の結合物質）が固定層（第１の結合物質）に直接結合していることから、第１の結合物質―第３の結合物質および第１の結合物質−抗原の組合せ毎に適する流速を求めておく。
【００７５】
実験的に流速を求める方法は、上述の第１の実施形態の手順３）と同様に、流速を増加させつつ蛍光信号量を測定し、信号量の変化率を測定して、該変化率の変化をモニタリングして求める方法が好ましい。変化率が、該変化率の測定開始時の値の半分以下（ｄＩ/ｄｖ＝1/2×ｄＩ(0)/ｄｖ(0)）から０となるまでの所定の流速を、適切な流速とし、この流速を固定層と結合物質との組合せと対応付けて保存しておく。
【００７６】
本実施形態の検出システム２においては、流速決定手段５２内の記憶手段に固定層と結合物質との複数の組合せと各組合せに適切な流速とが対応付けられたテーブルＴを備えておき、実際の測定対象に応じてテーブルＴを参照して適宜適切な流速が決定されるよう構成されている。
【００７７】
以下、本実施形態の検出方法における手順を説明する。試料Ｓをマイクロ流路１１内に注入し、センサ部上に第１の結合物質（１次抗体）−抗原−第２の結合物質（２次抗体）のサンドイッチを形成させる手順は第１の実施形態の１）−２）と同様に行う。
【００７８】
３’）光信号測定に適する流速を決定する。信号処理制御部４０の流速決定手段４２が、標識結合物質と固定層との複数の組合せについて、該組合せ毎に適する一定の流速との対応関係を示すテーブルＴから、検出に用いられている組合せに応じて、一定の流速を定める。
【００７９】
４’）ポンプ２０の吸引操作により流路内の流体の流速ｖを一定の流速に維持固定した状態で、センサ部からの光信号量を光検出器で検出取得する。
【００８０】
本実施形態の場合も第１の実施形態の場合と同様に、センサ部上の流体を一定の流速で移動させることにより、蛍光物質をセンサ部に引き寄せた状態で蛍光を検出することにより、光増強電場を有効に利用してＳ／Ｎよい信号を得ることができ、検査の信頼性を向上させることができる。
【００８１】
上記においては、流速決定手段５２に固定層と結合物質の組合せと、該組合せに適する流速が対応付けられたテーブルを備える実施形態について説明したが、固定層と結合物質の組合せと該組合せに適する流速は他の形態の記憶手段に記憶されていてもよい。たとえば、図７に示すように、流路型センサチップ１０’の上面の、信号測定に影響を生じない箇所に該チップ１０’に予め固定層と、該固定層と結合し得る結合物質との組合せに適する流速を記憶したチップ情報部６０を備え、また、検査システムに該情報部６０から適する流速を読み取る情報読取手段を備えるものとし、該チップ１０’を用いた測定時に、該チップ情報部６０から適する流速を読み取って、流速決定手段により該適する流速を、一定の流速と定めるようにしてもよい。
【００８２】
チップ情報部６０にはバーコード６１などで情報を記録してもよいし、ＩＣチップを備えてもよい。情報読取手段としては、チップ情報部６０における情報の記録形態に応じ、バーコードリーダあるいはＩＣ読取装置などを備えればよい。
【００８３】
上記各実施形態において、流路型センサチップ１０は、基本的にセンサ部の上流側および下流側にそれぞれ少なくとも１つずつの空気口１５ａ、１５ｂを備えていることにより、流路内の流体の流速を調整が可能となっている。上記実施形態においては、空気口１５ｂに吸引ポンプ２０を接続して吸引操作により流体を移動させる構成について説明したが、注入口に押し出しポンプを接続して押し出し操作により流体を移動させるよう構成することもできる。
【００８４】
流路型センサチップ１０の設計変更例について説明する。図９および図１０は、設計変更例のセンサチップ１０Ａ、１０Ｂの平面図である。
【００８５】
図９に示すセンサチップ１０Ａは、流路の注入口１５ａとセンサ部１４との間に空気口５１を備えたものである。該空気口７１に押し出しポンプを接続し、押し出し操作により流体を下流側へ移動させることができる。
【００８６】
図１０に示すセンサチップ１０Ｂは、流路の注入口１５ａとセンサ部１４との間で流路が分岐して枝路７２を備え、該枝路７２の末端に空気口７３を備えたものである。空気孔７３に押し出しポンプを接続し、押し出し操作により流体を下流側へ移動させることができる。センサチップ１０Ｂのような枝路を備えた流路では、ポンプにより押し出し操作により注入口１５ａ側に流体が移動するのを防ぐため、液だめに十分な緩衝液を溜めておく、あるいは注入口１５ａに栓をする、あるいは、分岐点より上流側に逆流防止の弁を流路内に配置しておく必要がある。
【００８７】
なお、センサチップとしては、流路に４つ以上の空気口を備えたものを用いてもよい。また、２つ以上の空気口にそれぞれポンプを備えるようにしてもよい。なお、ポンプは、圧力をかけて流れを引き起きこす圧力ポンプに限定されず、微細流路で用いられる一般的な送液制御可能なものであればよく、例えば、電気浸透流ポンプなどであってもよい。
【００８８】
上記各実施形態においては、標識として蛍光物質を用い、光信号の検出として、表面プラズモンによりセンサ部表面に光電場増強場を生じさせ、該光電場増強場において蛍光物質が励起されることによって生じる光を検出するものについて説明したが、光電場を増強させる方法は、表面プラズモン共鳴によるもののみならず、局在プラズモン共鳴によるものであってもよいし、光導波モードの励起によるものであってもよい。また、蛍光標識から生じる蛍光を直接検出してもよいし、間接的に検出してもよい。また、標識として蛍光物質のみならず、蛍光色素分子あるいは量子ドットを用い、これらからの蛍光を直接または間接的に検出するものとしてもよい。さらに、標識として、金属微粒子を用いる場合には、金属微粒子による励起光の散乱光を検出すればよい。また、光電場増強場を生じさせた場合のみならず、増強場を用いないエバネッセント蛍光法による蛍光信号検出の際にも、エバネッセント場がセンサ表面から離れるにつれ急激に減衰する現象は同様であり、標識をセンサ表面に引き寄せた状態で信号検出を行うことにより、やはり信号量の増加の効果を得ることができ、Ｓ／Ｎを向上させることができる。
【００８９】
局在プラズモン共鳴による光電場増強場を生じさせるためには、センサ部に金属膜に代えて、励起光の照射を受けて、所謂局在プラズモンを生じる、表面に励起光Ｌｏの波長よりも小さい凹凸構造を有する金属微細構造体、あるいは、励起光の波長よりも小さいサイズの複数の金属ナノロッドを備えていてもよい。このような局在プラズモンを生じさせる場合には、励起光照射光学系は、透過光あるいは落射光として励起光Ｌｏを照射するよう構成とすることができる。励起光の照射を受けて局在プラズモンを生じる金属微細構造体としては、その他、特開２００６−３２２０６７号公報、特開２００６-２５０９２４号公報などに記載の金属体を陽極酸化して得られる微細構造体を利用した種々の形態の金属微細構造体を用いることができる。
【００９０】
光導波モードによる光電場増強場を生じさせるためには、センサ部の金属層上に光導波層を備え、該光導波層の上に自己組織化膜および固定層を設けた構成とすればよい。
【００９１】
標識からの光信号を間接的に検出する装置および方法について図１１を参照して説明する。図１１は第３の実施形態の検出システム３のセンサチップ１０（図１１において液だめ部は省略。）および光信号検出装置３０’を示す要部構成図である。本実施形態の検出システム３の光信号検出装置３０’は、第１の実施形態の検出システム１における光信号検出装置３０と、光検出器３４の配置が異なり、表面プラズモン共鳴により光電場増強場Ｄを生じさせ、増強された電場において励起された蛍光が金属膜１８に新たに表面プラズモンを誘起することにより、流路下方に放射される、新たに誘起されたプラズモンからの放射光を検出するように構成されている。
【００９２】
放射光を検出する光信号検出装置３０’による放射光検出の原理について説明する。
センサ部１４に、励起光照射光学系３１により励起光Ｌｏを照射する。このとき、励起光照射光学系３１により励起光Ｌｏが流路内壁面と金属膜１８との界面に対して全反射角以上の特定の入射角度で入射させる。これにより、金属膜１８上の試料Ｓ中にエバネッセント波が滲み出し、このエバネッセント波によって金属膜１２中に表面プラズモンが励起される。励起光の入射により金属層上に生じている光電場（エバネッセント波に起因する電場）が、この表面プラズモンにより増強され、金属層上に光電場増強領域Ｄが形成される。光電場増強領域の金属膜表面には、蛍光物質Ｆが引き寄せられており、蛍光物質Ｆが励起されて（実質的にはその蛍光物質中の蛍光色素分子ｆが励起されて）蛍光が発生する。このとき、表面プラズモンによる光電場増強の効果により蛍光は増強されたものとなる。金属膜１８上で生じたこの蛍光が、金属膜１８に表面プラズモンを新たに誘起し、この表面プラズモンによりセンサチップ１０の金属膜形成面と反対側から特定の角度で放射光Ｌｐが射出される。光検出器３４によって、この放射光Ｌｐを検出することにより、標識結合物質と結合した被検出物質の有無および／または量を検出することができる。
【００９３】
放射光Ｌｐは蛍光が金属膜の特定の波数の表面プラズモンと結合する際に生じるものであり、蛍光の波長に応じてその結合する波数は定まり、その波数に応じて放射光の出射角度が定まる。通常励起光Ｌｏの波長と蛍光の波長とは異なることから、蛍光により励起される表面プラズモンは、励起光Ｌｏにより生じた表面プラズモンとは異なる波数のものとなり、励起光Ｌｏの入射角度とは異なる角度で放射光Ｌｐは放射される。
【００９４】
このように、標識からの蛍光を間接的に検出する場合であっても、光電場増強場を利用していることから、センサ部表面に標識をより近づけることにより信号のＳ／Ｎを向上させることができるため、層流を利用して標識をセンサ部表面に近づける本発明の検査方法およびシステムが有効である。
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１】本発明の第１実施形態による検出システムを示す概略構成図
【図２Ａ】本発明の検出システムに用いられる流路型センサチップを示す斜視図
【図２Ｂ】本発明の検出システムに用いられる流路型センサチップを示す側断面図
【図２Ｃ】本発明の検出システムに用いられる流路型センサチップを示す平面図
【図３】流路内の速度分布（層流）を示す図
【図４】静止流体内および層流内における固定層と標識結合物質の結合状態を示す模式図
【図５】金属膜と蛍光物質間の距離と蛍光信号量比との関係を示す図
【図６】流速と蛍光量の関係を示す図
【図７】センサチップの他の例を示す平面図
【図８】本発明の第２実施形態による検出システムを示す概略構成図
【図９】センサチップの設計変更例を示す平面図
【図１０】センサチップの設計変更例を示す平面図
【図１１】本発明の第３実施形態による検出システムの一部を示す概略図
【図１２】入射光に対する電場エネルギー像強度の金属膜からの距離依存性を示す図
【符号の説明】
【００９６】
１、２、３ 検出システム
１０、１０’、１０Ａ、１０Ｂ 流路型センサチップ
１２ 流路部材
１３ 固定層（第１の結合物質）
１４ センサ部
１９ 金属膜
２０ ポンプ
２５ 流速測定器
３０ 光信号検出装置
３１ 励起光照射光学系
３２ 光源
３３ プリズム
３４ 光検出器
３５ アンプ
Ａ 抗原（被検出物質）
Ｂ１ １次抗体（第１の結合物質）
Ｂ２ ２次抗体（第２の結合物質）
ＢＦ 標識２次抗体（蛍光標識結合物質）
Ｆ 蛍光物質
ｆ 蛍光色素分子
Ｌｏ 励起光
Ｌｆ 蛍光
【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体試料が流下されるマイクロ流路を有する流路部材の該流路内に、励起光の照射により光を生じる標識が付与された標識結合物質と結合する固定層を備えたセンサ部が設けられてなる流路型センサチップを用意し、
前記流路内に液体試料を流下させることにより、被検出物質の量に応じた量の前記標識結合物質を前記固定層に結合させ、
前記センサ部への励起光の照射により該センサ部の表面に生じるエバネッセント場、または光電場増強場において前記標識から生じる光に基づく信号を検出して、前記被検出物質の量を検出する検出方法において、
前記標識結合物質を前記固定層に結合させた後、
前記センサ部上の流体を、前記標識結合物質と前記固定層との結合が外れず、かつ前記センサ部上に該流体が静的に存在する場合と比較して、前記信号の信号量が大きく検出される一定の流速で移動させつつ、前記信号を検出することを特徴とする検出方法。
【請求項２】
前記標識結合物質を前記固定層に結合させた後、
前記センサ部上の流体の流速を徐々に上げながら、前記信号を検出することにより、該流速に対する前記信号量の変化率を取得し、
該信号量の変化率に基づいて、前記一定の流速を定めることを特徴とする請求項１記載の検出方法。
【請求項３】
前記信号量の変化率が、該変化率の測定開始時の値の半分以下となった所定の流速を前記一定の流速と定めることを特徴とする請求項２記載の検出方法。
【請求項４】
前記信号量の変化率が、０となったときの流速を前記一定の流速と定めることを特徴とする請求項２記載の検出方法。
【請求項５】
予め取得された、前記標識結合物質と前記固定層との組合せに適する流速を、前記一定の流速と定めることを特徴とする請求項１記載の検出方法。
【請求項６】
液体試料が流下されるマイクロ流路を有する流路部材の該流路内に、励起光の照射により光を生じる標識が付与された標識結合物質と結合する固定層を備えたセンサ部が設けられてなる流路型センサチップと、
前記センサ部上における流体の流速を制御するポンプと、
前記センサ部に励起光を照射する励起光照射光学系および該センサ部からの光に基づく信号を検出する光検出器を備えた光信号検出装置と、
前記ポンプおよび前記光信号検出装置に接続された信号処理制御部であって、前記センサ部上の流体の、前記標識結合物質と前記固定層との結合が外れず、かつ前記センサ部上において該流体が静的に存在する場合と比較して、前記信号の信号量が大きく検出される一定の流速を定める流速決定手段と、前記センサ部上の流体を該一定の流速で移動させつつ、前記信号を検出するように前記ポンプおよび前記光信号検出装置を制御する制御手段とを含む信号処理制御部とを備えていることを特徴とする検出システム。
【請求項７】
前記制御手段が、前記センサ部上の流体の流速を徐々に上げながら、前記信号を検出することにより、該流速に対する前記信号量の変化率を取得するように、前記ポンプおよび前記光信号検出装置を制御するものであり、
前記流速決定手段が、該信号量の変化率に基づいて、前記一定の流速を定めるものであることを特徴とする請求項６記載の検出システム。
【請求項８】
前記流速決定手段が、前記信号量の変化率が、該変化率の測定開始時の値の半分以下となった所定の流速を前記一定の流速と定めるものであることを特徴とする請求項７記載の検出システム。
【請求項９】
前記流速決定手段が、前記信号量の変化率が、０となったときの流速を前記一定の流速と定めるものであることを特徴とする請求項７記載の検出システム。
【請求項１０】
前記流速決定手段が、予め取得され、所定の記憶手段に記憶された、前記標識結合物質と前記固定層との組合せに適する流速を、前記一定の流速と定めるものであることを特徴とする請求項６記載の検出システム。
【請求項１１】
前記所定の記憶手段が、前記信号処理制御部内に備えられていることを特徴とする請求項１０記載の検出システム。
【請求項１２】
前記記憶手段が、前記センサチップの、前記信号の検出に支障のない箇所に設けられた、チップ情報部であり、
該チップ情報部から前記適する流速を読み取る情報読取手段を備えていることを特徴とする請求項１０記載の検出システム。
【請求項１３】
前記センサチップが、前記流路の前記センサ部の上流側に設けられた、該流路に前記液体試料を注入するための注入口と、前記流路の前記センサ部の下流側に設けられた、前記注入口から注入された前記液体試料を該下流側に流すための空気口とを備えてなり、
前記ポンプが、前記注入口または空気口を利用して、前記センサ部上の流体に流速を与えるものであることを特徴とする請求項６から１２いずれか１項記載の検出システム。
【請求項１】
液体試料が流下されるマイクロ流路を有する流路部材の該流路内に、励起光の照射により光を生じる標識が付与された標識結合物質と結合する固定層を備えたセンサ部が設けられてなる流路型センサチップを用意し、
前記流路内に液体試料を流下させることにより、被検出物質の量に応じた量の前記標識結合物質を前記固定層に結合させ、
前記センサ部への励起光の照射により該センサ部の表面に生じるエバネッセント場、または光電場増強場において前記標識から生じる光に基づく信号を検出して、前記被検出物質の量を検出する検出方法において、
前記標識結合物質を前記固定層に結合させた後、
前記センサ部上の流体を、前記標識結合物質と前記固定層との結合が外れず、かつ前記センサ部上に該流体が静的に存在する場合と比較して、前記信号の信号量が大きく検出される一定の流速で移動させつつ、前記信号を検出することを特徴とする検出方法。
【請求項２】
前記標識結合物質を前記固定層に結合させた後、
前記センサ部上の流体の流速を徐々に上げながら、前記信号を検出することにより、該流速に対する前記信号量の変化率を取得し、
該信号量の変化率に基づいて、前記一定の流速を定めることを特徴とする請求項１記載の検出方法。
【請求項３】
前記信号量の変化率が、該変化率の測定開始時の値の半分以下となった所定の流速を前記一定の流速と定めることを特徴とする請求項２記載の検出方法。
【請求項４】
前記信号量の変化率が、０となったときの流速を前記一定の流速と定めることを特徴とする請求項２記載の検出方法。
【請求項５】
予め取得された、前記標識結合物質と前記固定層との組合せに適する流速を、前記一定の流速と定めることを特徴とする請求項１記載の検出方法。
【請求項６】
液体試料が流下されるマイクロ流路を有する流路部材の該流路内に、励起光の照射により光を生じる標識が付与された標識結合物質と結合する固定層を備えたセンサ部が設けられてなる流路型センサチップと、
前記センサ部上における流体の流速を制御するポンプと、
前記センサ部に励起光を照射する励起光照射光学系および該センサ部からの光に基づく信号を検出する光検出器を備えた光信号検出装置と、
前記ポンプおよび前記光信号検出装置に接続された信号処理制御部であって、前記センサ部上の流体の、前記標識結合物質と前記固定層との結合が外れず、かつ前記センサ部上において該流体が静的に存在する場合と比較して、前記信号の信号量が大きく検出される一定の流速を定める流速決定手段と、前記センサ部上の流体を該一定の流速で移動させつつ、前記信号を検出するように前記ポンプおよび前記光信号検出装置を制御する制御手段とを含む信号処理制御部とを備えていることを特徴とする検出システム。
【請求項７】
前記制御手段が、前記センサ部上の流体の流速を徐々に上げながら、前記信号を検出することにより、該流速に対する前記信号量の変化率を取得するように、前記ポンプおよび前記光信号検出装置を制御するものであり、
前記流速決定手段が、該信号量の変化率に基づいて、前記一定の流速を定めるものであることを特徴とする請求項６記載の検出システム。
【請求項８】
前記流速決定手段が、前記信号量の変化率が、該変化率の測定開始時の値の半分以下となった所定の流速を前記一定の流速と定めるものであることを特徴とする請求項７記載の検出システム。
【請求項９】
前記流速決定手段が、前記信号量の変化率が、０となったときの流速を前記一定の流速と定めるものであることを特徴とする請求項７記載の検出システム。
【請求項１０】
前記流速決定手段が、予め取得され、所定の記憶手段に記憶された、前記標識結合物質と前記固定層との組合せに適する流速を、前記一定の流速と定めるものであることを特徴とする請求項６記載の検出システム。
【請求項１１】
前記所定の記憶手段が、前記信号処理制御部内に備えられていることを特徴とする請求項１０記載の検出システム。
【請求項１２】
前記記憶手段が、前記センサチップの、前記信号の検出に支障のない箇所に設けられた、チップ情報部であり、
該チップ情報部から前記適する流速を読み取る情報読取手段を備えていることを特徴とする請求項１０記載の検出システム。
【請求項１３】
前記センサチップが、前記流路の前記センサ部の上流側に設けられた、該流路に前記液体試料を注入するための注入口と、前記流路の前記センサ部の下流側に設けられた、前記注入口から注入された前記液体試料を該下流側に流すための空気口とを備えてなり、
前記ポンプが、前記注入口または空気口を利用して、前記センサ部上の流体に流速を与えるものであることを特徴とする請求項６から１２いずれか１項記載の検出システム。
【図１】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【公開番号】特開２０１０−４３８９０（Ｐ２０１０−４３８９０Ａ）
【公開日】平成２２年２月２５日（２０１０．２．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２０６８１８（Ｐ２００８−２０６８１８）
【出願日】平成２０年８月１１日（２００８．８．１１）
【出願人】（３０６０３７３１１）富士フイルム株式会社 (25,513)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年２月２５日（２０１０．２．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年８月１１日（２００８．８．１１）
【出願人】（３０６０３７３１１）富士フイルム株式会社 (25,513)
【Ｆターム（参考）】
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