検出装置及び検出方法
【課題】 圃場などの野外現場で誰でも容易・確実に果樹病原体を検出できる検出装置を提供する。
【解決手段】 果樹病原体に対し特異結合性を有する第１、第２の抗体を用意し、試料液体が滴下される滴下部１１と、第１の抗体を有色粒子により標識したものを試料液体により湿潤された状態において流動可能に保持する標識区域１２と、第２の抗体が固相される検出区域１４とを、試料液体の流動方向において上流側から下流側に向けて順次連設し、検出区域とは異なる位置に対照区域を設ける。第１、第２の抗体は、果樹病原体を免疫した動物由来で抗体生産ハイブリドーマ細胞を得て、それを培養・精製して得た抗果樹病原体モノクローナル抗体である。
【解決手段】 果樹病原体に対し特異結合性を有する第１、第２の抗体を用意し、試料液体が滴下される滴下部１１と、第１の抗体を有色粒子により標識したものを試料液体により湿潤された状態において流動可能に保持する標識区域１２と、第２の抗体が固相される検出区域１４とを、試料液体の流動方向において上流側から下流側に向けて順次連設し、検出区域とは異なる位置に対照区域を設ける。第１、第２の抗体は、果樹病原体を免疫した動物由来で抗体生産ハイブリドーマ細胞を得て、それを培養・精製して得た抗果樹病原体モノクローナル抗体である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、果樹病原体に適用する検出装置及び検出方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
果樹病原体は、菌類、細菌、ウイルスに大別される。これらの果樹病原体が果樹体内あるいはその表面に存在（感染）している（陽性）か否か（陰性）を診断するために、抗原抗体反応を利用する技術がある。
【０００３】
より具体的には、例えば、凝集や沈降を利用するもの、抗体にラテックスや酵素を標識するラテックス凝集法、ＥＬＩＳＡ（酵素抗体）法が知られている。
【０００４】
果樹病原体には、樹体内の濃度が低く高感度検出できる方法でなければ、適用がないことが多い。例えば、温州萎縮ウイルス（ＳＤＶ）に関して、ラテックス凝集法では検出が不可能であり、適用がない。そのため、現実には、ＥＬＩＳＡ法がデファクトスタンダードの検査法として定着している。
【０００５】
しかしながら、ＥＬＩＳＡ法は、研究室などの施設にマイクロプレートリーダ等の高価で大規模な設備を設けないと事実上実施できない。しかも、検査結果が出るまでの一連のプロセスに、約２０時間程度の長時間を要する。これでは、圃場など屋外の現場で生産者自ら短時間で検査結果を得るというようなことは絶望的である。
【０００６】
すなわち、圃場などの野外の環境下においても、また誰でも容易にかつ確実に検出できる検出装置の開発が強く求められている。
【非特許文献１】「抗血清による動物ウイルス検定技術研修会テキスト」、社団法人日本植物防疫協会研究所、昭和６１年１１月
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明者らは、イムノクロマトグラフィー法、就中、モノクローナル抗体の調製等に精通しており、この技術を応用することにより、かかる要請に応えようと鋭意研究を重ねた結果、本発明を完成するに至ったものである。
【０００８】
即ち本発明は、果樹病原体を、圃場などの野外の現場においても、また誰でも容易にかつ確実に検出できる検出装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
第１の発明に係る検出装置は、果樹病原体に対して、いずれも特異結合性を有する第１、第２の抗体を用意し、果樹病原体を含むと疑われる試料液体が滴下される滴下部と、第１の抗体を有色粒子により標識したものを試料液体により湿潤された状態において流動可能に保持する標識区域と、第２の抗体が固相される検出区域とを、試料液体の流動方向において上流側から下流側に向けて順次連設し、検出区域とは異なる位置に対照区域を設けてなる。
【００１０】
この構成により、動物ではない果樹において、その病原体への感染を圃場など野外の現場で迅速・容易・しかも高感度に検出でき、病気の蔓延を防止することができる。例えば、農家等の生産者自身において、検査を行える。
【００１１】
第１、第２の抗体は、いずれも果樹病原体を免疫した動物の器官から取り出した細胞と、この細胞とは異なる細胞とを融合して得た抗体生産ハイブリドーマ細胞を培養・精製して得た抗果樹病原体モノクローナル抗体であることが望ましい。
【００１２】
この構成により、後述する実施例により明らかなように、検出感度を、従来のＥＬＩＳＡ法よりも数倍以上高めることができる。
【００１３】
果樹病原体は、例えば、温州萎縮ウイルス（ＳＤＶ）、あるいは、アグロバクテリウム・ツメファシェンス菌（Ａｔ菌）である。
【００１４】
この構成により、難防除病害とされている果樹病原体に対しても適用でき、病気の蔓延を予防し、果樹収量の向上に資することができる。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、イムノクロマトグラフィーの調製においてモノクローナル抗体を適用することにより、試料液体中に含まれる果樹病原体を、迅速、かつ簡便に、しかも高感度に、検出できる。その結果、病気の蔓延を予防し、果樹収量の安定化に資することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下図面を参照しながら、本発明の実施の形態を説明する。図１（ａ）は、本発明の一実施の形態における検査装置の平面図、図１（ｂ）は、同側面図である。
【００１７】
図１に示すように、本形態の検出装置は、短冊形状の多孔質坦体１３（例えば、ニトロセルロース膜からなる。）を主として構成される。試料液体のクロマト的な流動方向に沿って、上流側から順に、滴下部１１と標識区域１２と検出区域１４と対照区域１５と吸液部１６とが、連設される。
【００１８】
多孔質坦体１３あるいはその他の要素は、更に、プラスチック等よりなる基体に固定されて強度が付与されていてもよく、また、保護のために表面に透明なテープ等が貼られていてもよい。
【００１９】
標識区域１２は、保水性担体を含み、保水性担体は、第１の抗体であるモノクローナル抗体（Ｂ）を有色粒子により標識したものを液体試料により湿潤された状態において流動可能に保持する。
【００２０】
保水性担体としては、例えば、ポリエステル、レーヨン、ポリプロピレン等からなる不織布、あるいはセルロース、パルプ、ガラス繊維等からなる濾紙を挙げることができる。
【００２１】
有色粒子としては、例えば、金、セレンからなる金属コロイド、あるいは、スチレン、塩化ビニル、アクリロニトリル、酢酸ビニル、アクリル酸エステル、メタクリル酸エステル等のビニル系モノマーの単一重合体や共重合体、スチレン−ブタジエン共重合体、メチルメタクリレート−ブタジエン共重合体等のブタジエン系共重合体等に着色してなるラテックス微粒子を挙げることができる。これらのうち、抗体又は抗原の吸着性が優れ、かつ、生物学的活性を長期間安定に保持できる等の理由から、金コロイド、またはポリスチレン系のラテックス粒子が有色粒子として好適に用いられる。
【００２２】
抗体を有色粒子に結合するには、例えば、物理的又は化学的な吸着法等によることができる。
【００２３】
標識区域１２には、更に、有色粒子に抗体等を固定した第２有色粒子標織物が含浸されていてもよい。このような第２有色粒子標織物は、マーカーとして用いることができる。
【００２４】
検出区域１４は、果樹病原体と抗原抗体反応を行う、第２の抗体としてのモノクローナル抗体（Ａ）が多孔質坦体１３上に固相化されてなる。
【００２５】
固相化されたモノクローナル抗体（Ａ）は、検体中の果樹病原体（Ｘ）を認識する。果樹病原体（Ｘ）が試料液体中に存在すれば、モノクロナール抗体（Ａ）と果樹病原体（Ｘ）とモノクローナル抗体（Ｂ）と有色粒子とからなる複合体が生成され、モノクローナル抗体（Ａ）が検出区域１４に固相されているため、この複合体は、検出区域１４に捕捉される。例えば、本形態のように、モノクローナル抗体（Ａ）が検出区域１４に線状に固相化されていれば、検出区域１４が有色粒子により色づけされ、線状のサインがあらわれることになる。
【００２６】
検出区域１４は、モノクローナル抗体（Ａ）を分散させた緩衝液を、ニトロセルロース膜に塗布し、乾燥することにより得ることができる。
【００２７】
緩衝液としては、得られた検出装置の検出感度の点から、酢酸ナトリウム緩衝液、酢酸アンモニウム緩衝液、リン酸ナトリウム緩衝液等が好ましい。
【００２８】
本形態では、対照区域１５に、モノクローナル抗体（Ｂ）に対する抗体、有色粒子に対して特異的に結合する物質が固相化される。対照区域１５の呈色の有無により、イムノクロマトグラフィー試験が正常に行われたかどうかを判定できる。
【００２９】
以下に、温州萎縮ウイルス（ＳＤＶ）およびアグロバクテリウム・ツメファシェンス菌（Agrobacteriumtumefaciens：本明細書において「Ａｔ菌」という。）の検出について実施例をあげて、本発明をより詳細に説明するが、本発明は、この実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００３０】
実施例１において取り上げる果樹病原体は、温州萎縮ウイルス（ＳＤＶ）である。以下、本発明に関し抗ＳＤＶモノクローナル抗体による実施例１はもとより、これに対する抗ＳＤＶポリクローナル抗体による比較例１〜３と、ＥＬＩＳＡ法による比較例４とについて説明する。
＜実施例１＞
実施例１では、抗ＳＤＶモノクローナル抗体を使用する。
【００３１】
（抗ＳＤＶモノクローナル抗体の調製）
抗ＳＤＶモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ−Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５−４９７，１９７５）の方法に準じて調製した。ＳＤＶを免疫したマウスの脾臓から抗体を産生する細胞を取り出し、別に用意したマウスの骨髄腫細胞（ミエローマ）と融合させ、抗ＳＤＶモノクローナル抗体４Ｅ６産生ハイブリドーマ細胞ならびに抗ＳＤＶモノクローナル抗体２Ｇ２産生ハイブリドーマ細胞を得た。それぞれのハイブリドーマ細胞を培養し、マウス腹腔内に注射し、腹水を得た。得られた腹水から、硫酸アンモニウム分画し、プロテインＧカラム精製により、抗ＳＤＶモノクローナル抗体４Ｅ６ならびに抗ＳＤＶモノクローナル抗体２Ｇ２を得た。
【００３２】
（標識成分の調製）
金コロイドは、Ｇ．Ｆｒｅｎｓ（Ｎａｔｕｒｅ，２４１，２０−２２，１９７３）の方法に従い作製した。金コロイドの１０ｍｌに対し、抗ＳＤＶモノクローナル抗体４Ｅ６を４０μｇ、室温にて混合し、抗ＳＤＶモノクローナル抗体結合金コロイド（標識成分）を調製した。
【００３３】
（標識区域１２の調製）
抗ＳＤＶモノクローナル抗体結合金コロイドをＯＤ５２０＝０．８３３に調製した。調製液をガラス繊維パッドにテスト当たり３６μｌ塗布し、乾燥させ、抗ＳＤＶモノクローナル抗体結合金コロイド塗布パッド（標識区域１２）を調製した。
【００３４】
（検出区域１４の調製）
抗ＳＤＶモノクローナル抗体２Ｇ２を、多孔質坦体１３であるニトロセルロースメンブレン（ミリポア社：ＳＣＨＦ（商標））の所定位置に、テスト当たり０．４８μｌでライン状に塗布し検出区域１４を形成した。また、検出区域１４の下流側に、抗マウス抗体を同様にテスト当たり０．４８μｌで塗布し、反応確認のための対照区域１５を形成した。カゼイン溶液によるブロッキング処理を経て、抗ＳＤＶモノクローナル抗体固相化メンブレン（検出区域１４の配置された多孔質担体１３）を調製した。
【００３５】
（検出装置の作製）
滴下部１１としての濾紙、抗ＳＤＶモノクローナル抗体結合金コロイド塗布パッド、抗ＳＤＶモノクローナル抗体固相化メンブレン、吸液部１６としての濾紙とを、それぞれの端部が３ｍｍずつ重なるように、粘着剤付の樹脂上に貼付してＳＤＶの検出装置を作製した。
【００３６】
（反応性試験）
ＳＤＶ感染樹および正常樹それぞれの新梢１グラムを１０ｍｌの０．１Ｍクエン酸緩衝液で磨砕し、遠心分離で上清を採取した。ＳＤＶ感染樹サンプルについては、０．１Ｍクエン酸緩衝液で希釈系列を調製した。その１００μｌをＳＤＶ滴下部１１へ滴下し、１５分経過後、金コロイド粒子由来のライン（本例では赤紫色）出現を目視観察した。
＜比較例１〜３＞
比較例１〜３では、抗ＳＤＶポリクローナル抗体を用いる。
【００３７】
（抗ＳＤＶポリクローナル抗体の調製）
常法により、ＳＤＶを家兎に免疫し、抗血清を得た。得られた抗血情から、硫酸アンモニウム分画、プロテインＡカラム精製により、抗ＳＤＶポリクローナル抗体を得た。
【００３８】
（標識成分の調製）
金コロイドは、Ｇ．Ｆｒｅｎｓ（Ｎａｔｕｒｅ，２４１，２０−２２，１９７３）法に従い作製した。金コロイドの１０ｍｌに対し、抗ＳＤＶポリクローナル抗体を４０μｇ、室温にて混合し、抗ＳＤＶポリクローナル抗体結合金コロイド（標識成分）を調製した。
【００３９】
（標識区域１２の調製）
抗ＳＤＶポリクローナル抗体結合金コロイドをＯＤ５２０＝０．２０８（比較例１）、０．４１６（比較例２）および０．８３３（比較例３）のもの３種類を調製した。それぞれの調製液をガラス繊維パッドにテスト当たり３６μｌ塗布し、乾燥させ、抗ＳＤＶポリクローナル抗体結合金コロイド塗布パッド（標識区域１２）を調製した。
【００４０】
（検出区域１４の調製）
抗ＳＤＶポリクローナル抗体をニトロセルロースメンブレン（ミリポア杜：ＳＣＨＦ（商標））にテスト当たり０．４８μｌでライン状に塗布し検出区域１４を形成した。また、抗ウサギ抗体を同様にテスト当たり０．４８μｌで塗布し、反応確認のための対照区域１５を形成した。カゼイン溶液によるブロッキング処理を経て、抗ＳＤＶポリクローナル抗体固相化メンブレン（検出区域１４の配置された多孔質担体１３）を調製した。
【００４１】
（検出装置の作製）
滴下部１１としての濾紙、抗ＳＤＶポリクローナル抗体結合金コロイド塗布バッド、抗ＳＤＶポリクローナル抗体固相化メンブレン、吸液部１６としての濾紙とを、それぞれの端部が３ｍｍずつ重なるように、粘着剤付の樹脂上に貼付してＳＤＶの検出装置を作製した。
【００４２】
（反応性試験）
比較例１にて作製したＳＤＶの検出装置に対して実施例１と同様に反応性試験を行った。
＜比較例４＞
比較例４は、抗ＳＤＶポリクローナル抗体を用いるＥＬＩＳＡ法に関する。なお、比較例４では、（社）日本植物防疫協会製、ＳＤＶ検定用試薬を用いた。
【００４３】
（抗ＳＤＶポリクローナル抗体固相化プレートの調製）
ＳＤＶ検定用試薬に添付のコーティング液（抗ＳＤＶポリクローナル抗体含む）を５０ｍＭ Ｃａｒｂｏｎａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ＝９．６）で５００倍に希釈した。この溶液を、ＥＬＩＳＡ用９６ウエルプレート（ナルジェヌンクインターナショナル株式会社製、品番４４２４０４）に１ウエルあたり１００μｌずつ分注した。直ちにプレート上部をシールし、４℃で一晩放置し、抗体をプレートに吸着させた。ウエル中の液を捨て、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３回洗浄を行なった。ブロックエース（商標：雪印乳業薬）を１ウエルあたり３００μｌずつ分注した。直ちにプレート上部をシールし、４℃で一晩放置し、ブロッキング処理を行なった。ウエル中の液を捨て、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３回洗浄を行なった。
【００４４】
（反応性試験用サンプルの調製）
ＳＤＶ感染樹および正常樹それぞれの新梢１グラムを１０ｍｌの０．０５％（ｖ／ｖ）メルカプト酢酸−０．１Ｍクエン酸緩衝液で磨砕し、遠心分離で上清を採取した。ＳＤＶ感染樹サンプルについては、０．０５％（ｖ／ｖ）メルカプト酢酸−０．１Ｍクエン酸緩衝液で希釈系列を調製し、反応性試験用サンプルとした。反応性試験用サンプルを１ウエルあたり１００μｌずつ分注した。
【００４５】
（アルカリフォスファターゼ標識抗ＳＤＶポリクローナル抗体液の調製）
ＳＤＶ検定用試薬に添付のコンジュゲート液（アルカリフォスファターゼ標識抗ＳＤＶポリクローナル抗体含む）をＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで５００倍に希釈した。この溶液を、反応性試験用サンプルの入ったウエルに、１ウエルあたり１００μｌずつ追加分注した。直ちにプレート上部をシールし、４℃で一晩インキュベートした。ウエル中の液を捨て、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３回洗浄を行なった。
【００４６】
（呈色反応）
使用直前に酵素基質（パラニトロフェニルリン酸二ナトリウム）を１ｍｇ／１ｍｌの割合で調製液（Ｄｉｅｔｈａｎｏｌ ａｍｉｎｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒ）に溶解した。この調製液を１ウエルあたり１００μｌずつ分注し、室温で２時開放置し、呈色反応させた。ＥＬＩＳＡプレートリーダーで４０５ｎｍの吸光度を測定し、定性判定を行なった。
【００４７】
（結果の検討）
実施例１及び比較例１〜４による結果をまとめると次表のとおりである。
【００４８】
【表１】
【００４９】
背景技術の項でも述べたが、ＳＤＶの診断における既存の検査法として広く使用されるＥＬＩＳＡ法では、測定に２日要し操作ステップも多い。測定時間の短縮と測定ステップの簡便化の為の解決法としてイムノクロマトグラフィー法を検討した。ＥＬＩＳＡ法の反応系には抗ＳＤＶポリクローナルが使われており、比較例１〜３では、抗ＳＤＶポリクロナール抗体をイムノクロマトグラフィーに適用した。
【００５０】
抗ＳＤＶポリクロナール抗体を反応系に適用する比較例４（ＥＬＩＳＡ法）では、正常葉サンプルは陰性、ＳＤＶ感染樹サンプルの×１６希釈まで検出可能であった。また、同じ抗ＳＤＶポリクロナール抗体をイムノクロマトグラフィーに適用した比較例１（金コロイドＯＤ＝０．２０８）においては、正常葉サンプルは陰性、ＳＤＶ感染樹サンプルは×４希釈まで検出可能であった。
【００５１】
検出感度を上げる一般的な方法として、比較例１よりも金コロイド塗布パッドの金コロイド濃度を上げたもの（金コロイドＯＤ＝０．４１６（比較例２）および０．８３３（比較例３））を調製したところ、ＳＤＶ感染樹サンプルの反応性は上昇したものの、正常樹において偽陽性反応を呈した。すなわち、抗ＳＤＶポリクローナル抗体によってはＳＤＶ感染樹サンプルの×４希釈までの感度までしか得ることができず、既存の検査法のＥＬＩＳＡ法と比較して同等以上の検出感度を得ることはできなかった。
【００５２】
一方、抗ＳＤＶモノクローナル抗体をイムノクロマトグラフィーに適用した実施例１においては、正常葉サンプルは陰性、ＳＤＶ感染樹サンプルの×６４希釈まで検出可能であり、抗ＳＤＶポリクロナール抗体を利用したイムノクロマトグラフィーおよびＥＬＩＳＡ法よりも高い検出感度が得られた。
【００５３】
表１を参照すれば、本発明は、ＳＤＶのような果樹病原体の検出にも有用であり、しかもＥＬＩＳＡ法に勝るとも劣らない感度の検出結果を、ＥＬＩＳＡ法よりも遙かに迅速・簡便に得ることができることが理解されよう。
【００５４】
より具体的には、実施例１によると、液体試料を滴下部へ滴下するまでの処理をすれば、後は検出区域と対照区域とを検査するだけでよい。即ち、実施例１によると、ＥＬＩＳＡ法によると必須であった、標識抗体の分注、約１６時間程度のインキュベート（４℃）、ウエルの洗浄、室温２時間のインキュベート等が不要であり、迅速に（通常１５分程度である。）検出結果を得ることができる。さらに、ＥＬＩＳＡ法によると、設備が整った施設（例えば、研究所等）へ試料を搬送しないと検査が行えなかったが、実施例１では、例えば、圃場（現場）において直ちに検査を行えため、搬送に要していた時間や検査待ちの時間も節約できる。即ち、現場で即座に感染の有無を検査し、迅速な対応（例えば、感染樹の早期撤去による感染蔓延の防止等）をとりうるので、実用効果大である。実施例１によると、ＥＬＩＳＡ法によると必須であった、吸光度計、その他の高価で設置場所を要する設備は不要である。しかも、実施例１によれば、ＥＬＩＳＡ法に勝る感度（５〜１０倍程度）の検出結果が得られている。
【実施例２】
【００５５】
実施例２において取り上げる果樹病原体は、根頭がんしゅ病の原因となるＡｔ菌である。
【００５６】
根頭がんしゅ病は、土中に潜むＡｔ菌が株の傷口から侵入することによって起こり、被害部に大きなこぶをつくるのがその特徴である。根頭がんしゅ病は、ナシ、カキなどの果樹などの花木に古くから発生している。感染すると、根から水や栄養分を十分に吸い上げられなくなり樹勢が著しく衰退する。
＜実施例２＞
実施例２は、抗Ａｔ菌モノクローナル抗体を使用する。
【００５７】
（抗Ａｔ菌モノクローナル抗体の調製）
抗Ａｔ菌モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ−Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５−４９７，１９７５）の方法に準じて調製した。Ａｔ菌を免疫したマウスの脾臓から抗体を産生する細胞を取り出し、別に用意したマウスの骨髄腫細胞（ミエローマ）と融合させ、抗Ａｔ菌モノクローナル抗体Ａｇ７産生ハイブリドーマ細胞を得た。該ハイブリドーマ細胞を無血清培地中で培養、遠心分離後の上清の硫酸アンモニウム分画により、抗Ａｔ菌モノクローナル抗体Ａｇ７を得た。
【００５８】
（標識成分の調製）
金コロイドは、Ｇ．Ｆｒｅｎｓ（Ｎａｔｕｒｅ，２４１，２０−２２，１９７３）の方法に従い作製した。金コロイドの１０ｍｌに対し、抗Ａｔ菌モノクローナル抗体Ａｇ７を４０μｇ、室温にて混合し、抗Ａｔ菌モノクローナル抗体結合金コロイド（標識成分）を調製した。
【００５９】
（標識区域１２の調製）
抗Ａｔ菌モノクローナル抗体結合金コロイドをＯＤ５２０＝０．３０５に調製した。調製液をガラス繊維パッドにテスト当たり３６μｌ塗布し、乾燥させ、抗Ａｔ菌モノクローナル抗体結合金コロイド塗布バッド（標識区域１２）を調製した。
【００６０】
（検出区域１４の調製）
抗Ａｔ菌モノクローナル抗体Ａｇ７をニトロセルロースメンブレン（ミリポア社：ＳＣＨＦ（商標））にテスト当たり０．４８μｌでライン状に塗布し、検出区域１４を形成した。また、抗マウス抗体を同様にテスト当たり０．４８μｌで塗布し、反応確認のための対照区域１５を形成した。カゼイン溶液によるブロッキング処理を経て、抗Ａｔ菌モノクローナル抗体固相化メンブレン（検出区域１４の配置された多孔質担体）を調製した。
【００６１】
（検出装置の作製）
滴下部１１としての濾紙、抗Ａｔ菌モノクローナル抗体結合金コロイド塗布パッド、抗Ａｔ菌モノクローナル抗体固相化メンブレン、吸液部１６としての濾紙とを、それぞれの端部が３ｍｍずつ重なるように、粘着剤付の樹脂上に貼付してＡｔ菌の検出装置を作製した。
【００６２】
（反応性試験）
Ａｔ菌を寒天培地上で培養し、生じたコロニーを採取して、菌体数濃度が１０^8個／ｍｌとなるように緩衝液中に懸濁させた。菌体懸濁液を超音波破砕処理してＡｔ菌抗原液を得た。Ａｔ菌非感染プドウ茎部１グラムを１０ｍｌの０．１Ｍクエン酸緩衝液で磨砕後、遠心分離で上清を採取し、磨砕液を得た。Ａｔ菌抗原液の磨砕液による希釈系列を調製し、検体とした。該検体１００μｌをＡｔ菌検出装置サンプル液滴下部へ滴下し、１５分経過後、イムノクロマト判定窓における金コロイド粒子由来の赤紫色ライン出現を目視観察した。結果を（表２）に示す。
【００６３】
【表２】
【００６４】
表２を参照すれば、本発明は、Ａｔ菌のような果樹病原体の検出にも有用であることが理解されよう。
【００６５】
なお、本発明の検出装置は、ＳＤＶ、Ａｔ菌のほか、カンキツモザイクウイルス（ＣｉＭＶ）及びタターリーフウイルス（ＡＳＧＶ）等、各種の果樹病原体への適用があるものと推測される。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】（ａ）本発明の一実施の形態における検査装置の平面図 （ｂ）同側面図
【符号の説明】
【００６７】
１１ 滴下部
１２ 標識区域
１３ 多孔質坦体
１４ 検出区域
１５ 対照区域
１６ 吸液部
【技術分野】
【０００１】
本発明は、果樹病原体に適用する検出装置及び検出方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
果樹病原体は、菌類、細菌、ウイルスに大別される。これらの果樹病原体が果樹体内あるいはその表面に存在（感染）している（陽性）か否か（陰性）を診断するために、抗原抗体反応を利用する技術がある。
【０００３】
より具体的には、例えば、凝集や沈降を利用するもの、抗体にラテックスや酵素を標識するラテックス凝集法、ＥＬＩＳＡ（酵素抗体）法が知られている。
【０００４】
果樹病原体には、樹体内の濃度が低く高感度検出できる方法でなければ、適用がないことが多い。例えば、温州萎縮ウイルス（ＳＤＶ）に関して、ラテックス凝集法では検出が不可能であり、適用がない。そのため、現実には、ＥＬＩＳＡ法がデファクトスタンダードの検査法として定着している。
【０００５】
しかしながら、ＥＬＩＳＡ法は、研究室などの施設にマイクロプレートリーダ等の高価で大規模な設備を設けないと事実上実施できない。しかも、検査結果が出るまでの一連のプロセスに、約２０時間程度の長時間を要する。これでは、圃場など屋外の現場で生産者自ら短時間で検査結果を得るというようなことは絶望的である。
【０００６】
すなわち、圃場などの野外の環境下においても、また誰でも容易にかつ確実に検出できる検出装置の開発が強く求められている。
【非特許文献１】「抗血清による動物ウイルス検定技術研修会テキスト」、社団法人日本植物防疫協会研究所、昭和６１年１１月
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明者らは、イムノクロマトグラフィー法、就中、モノクローナル抗体の調製等に精通しており、この技術を応用することにより、かかる要請に応えようと鋭意研究を重ねた結果、本発明を完成するに至ったものである。
【０００８】
即ち本発明は、果樹病原体を、圃場などの野外の現場においても、また誰でも容易にかつ確実に検出できる検出装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
第１の発明に係る検出装置は、果樹病原体に対して、いずれも特異結合性を有する第１、第２の抗体を用意し、果樹病原体を含むと疑われる試料液体が滴下される滴下部と、第１の抗体を有色粒子により標識したものを試料液体により湿潤された状態において流動可能に保持する標識区域と、第２の抗体が固相される検出区域とを、試料液体の流動方向において上流側から下流側に向けて順次連設し、検出区域とは異なる位置に対照区域を設けてなる。
【００１０】
この構成により、動物ではない果樹において、その病原体への感染を圃場など野外の現場で迅速・容易・しかも高感度に検出でき、病気の蔓延を防止することができる。例えば、農家等の生産者自身において、検査を行える。
【００１１】
第１、第２の抗体は、いずれも果樹病原体を免疫した動物の器官から取り出した細胞と、この細胞とは異なる細胞とを融合して得た抗体生産ハイブリドーマ細胞を培養・精製して得た抗果樹病原体モノクローナル抗体であることが望ましい。
【００１２】
この構成により、後述する実施例により明らかなように、検出感度を、従来のＥＬＩＳＡ法よりも数倍以上高めることができる。
【００１３】
果樹病原体は、例えば、温州萎縮ウイルス（ＳＤＶ）、あるいは、アグロバクテリウム・ツメファシェンス菌（Ａｔ菌）である。
【００１４】
この構成により、難防除病害とされている果樹病原体に対しても適用でき、病気の蔓延を予防し、果樹収量の向上に資することができる。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、イムノクロマトグラフィーの調製においてモノクローナル抗体を適用することにより、試料液体中に含まれる果樹病原体を、迅速、かつ簡便に、しかも高感度に、検出できる。その結果、病気の蔓延を予防し、果樹収量の安定化に資することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下図面を参照しながら、本発明の実施の形態を説明する。図１（ａ）は、本発明の一実施の形態における検査装置の平面図、図１（ｂ）は、同側面図である。
【００１７】
図１に示すように、本形態の検出装置は、短冊形状の多孔質坦体１３（例えば、ニトロセルロース膜からなる。）を主として構成される。試料液体のクロマト的な流動方向に沿って、上流側から順に、滴下部１１と標識区域１２と検出区域１４と対照区域１５と吸液部１６とが、連設される。
【００１８】
多孔質坦体１３あるいはその他の要素は、更に、プラスチック等よりなる基体に固定されて強度が付与されていてもよく、また、保護のために表面に透明なテープ等が貼られていてもよい。
【００１９】
標識区域１２は、保水性担体を含み、保水性担体は、第１の抗体であるモノクローナル抗体（Ｂ）を有色粒子により標識したものを液体試料により湿潤された状態において流動可能に保持する。
【００２０】
保水性担体としては、例えば、ポリエステル、レーヨン、ポリプロピレン等からなる不織布、あるいはセルロース、パルプ、ガラス繊維等からなる濾紙を挙げることができる。
【００２１】
有色粒子としては、例えば、金、セレンからなる金属コロイド、あるいは、スチレン、塩化ビニル、アクリロニトリル、酢酸ビニル、アクリル酸エステル、メタクリル酸エステル等のビニル系モノマーの単一重合体や共重合体、スチレン−ブタジエン共重合体、メチルメタクリレート−ブタジエン共重合体等のブタジエン系共重合体等に着色してなるラテックス微粒子を挙げることができる。これらのうち、抗体又は抗原の吸着性が優れ、かつ、生物学的活性を長期間安定に保持できる等の理由から、金コロイド、またはポリスチレン系のラテックス粒子が有色粒子として好適に用いられる。
【００２２】
抗体を有色粒子に結合するには、例えば、物理的又は化学的な吸着法等によることができる。
【００２３】
標識区域１２には、更に、有色粒子に抗体等を固定した第２有色粒子標織物が含浸されていてもよい。このような第２有色粒子標織物は、マーカーとして用いることができる。
【００２４】
検出区域１４は、果樹病原体と抗原抗体反応を行う、第２の抗体としてのモノクローナル抗体（Ａ）が多孔質坦体１３上に固相化されてなる。
【００２５】
固相化されたモノクローナル抗体（Ａ）は、検体中の果樹病原体（Ｘ）を認識する。果樹病原体（Ｘ）が試料液体中に存在すれば、モノクロナール抗体（Ａ）と果樹病原体（Ｘ）とモノクローナル抗体（Ｂ）と有色粒子とからなる複合体が生成され、モノクローナル抗体（Ａ）が検出区域１４に固相されているため、この複合体は、検出区域１４に捕捉される。例えば、本形態のように、モノクローナル抗体（Ａ）が検出区域１４に線状に固相化されていれば、検出区域１４が有色粒子により色づけされ、線状のサインがあらわれることになる。
【００２６】
検出区域１４は、モノクローナル抗体（Ａ）を分散させた緩衝液を、ニトロセルロース膜に塗布し、乾燥することにより得ることができる。
【００２７】
緩衝液としては、得られた検出装置の検出感度の点から、酢酸ナトリウム緩衝液、酢酸アンモニウム緩衝液、リン酸ナトリウム緩衝液等が好ましい。
【００２８】
本形態では、対照区域１５に、モノクローナル抗体（Ｂ）に対する抗体、有色粒子に対して特異的に結合する物質が固相化される。対照区域１５の呈色の有無により、イムノクロマトグラフィー試験が正常に行われたかどうかを判定できる。
【００２９】
以下に、温州萎縮ウイルス（ＳＤＶ）およびアグロバクテリウム・ツメファシェンス菌（Agrobacteriumtumefaciens：本明細書において「Ａｔ菌」という。）の検出について実施例をあげて、本発明をより詳細に説明するが、本発明は、この実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００３０】
実施例１において取り上げる果樹病原体は、温州萎縮ウイルス（ＳＤＶ）である。以下、本発明に関し抗ＳＤＶモノクローナル抗体による実施例１はもとより、これに対する抗ＳＤＶポリクローナル抗体による比較例１〜３と、ＥＬＩＳＡ法による比較例４とについて説明する。
＜実施例１＞
実施例１では、抗ＳＤＶモノクローナル抗体を使用する。
【００３１】
（抗ＳＤＶモノクローナル抗体の調製）
抗ＳＤＶモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ−Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５−４９７，１９７５）の方法に準じて調製した。ＳＤＶを免疫したマウスの脾臓から抗体を産生する細胞を取り出し、別に用意したマウスの骨髄腫細胞（ミエローマ）と融合させ、抗ＳＤＶモノクローナル抗体４Ｅ６産生ハイブリドーマ細胞ならびに抗ＳＤＶモノクローナル抗体２Ｇ２産生ハイブリドーマ細胞を得た。それぞれのハイブリドーマ細胞を培養し、マウス腹腔内に注射し、腹水を得た。得られた腹水から、硫酸アンモニウム分画し、プロテインＧカラム精製により、抗ＳＤＶモノクローナル抗体４Ｅ６ならびに抗ＳＤＶモノクローナル抗体２Ｇ２を得た。
【００３２】
（標識成分の調製）
金コロイドは、Ｇ．Ｆｒｅｎｓ（Ｎａｔｕｒｅ，２４１，２０−２２，１９７３）の方法に従い作製した。金コロイドの１０ｍｌに対し、抗ＳＤＶモノクローナル抗体４Ｅ６を４０μｇ、室温にて混合し、抗ＳＤＶモノクローナル抗体結合金コロイド（標識成分）を調製した。
【００３３】
（標識区域１２の調製）
抗ＳＤＶモノクローナル抗体結合金コロイドをＯＤ５２０＝０．８３３に調製した。調製液をガラス繊維パッドにテスト当たり３６μｌ塗布し、乾燥させ、抗ＳＤＶモノクローナル抗体結合金コロイド塗布パッド（標識区域１２）を調製した。
【００３４】
（検出区域１４の調製）
抗ＳＤＶモノクローナル抗体２Ｇ２を、多孔質坦体１３であるニトロセルロースメンブレン（ミリポア社：ＳＣＨＦ（商標））の所定位置に、テスト当たり０．４８μｌでライン状に塗布し検出区域１４を形成した。また、検出区域１４の下流側に、抗マウス抗体を同様にテスト当たり０．４８μｌで塗布し、反応確認のための対照区域１５を形成した。カゼイン溶液によるブロッキング処理を経て、抗ＳＤＶモノクローナル抗体固相化メンブレン（検出区域１４の配置された多孔質担体１３）を調製した。
【００３５】
（検出装置の作製）
滴下部１１としての濾紙、抗ＳＤＶモノクローナル抗体結合金コロイド塗布パッド、抗ＳＤＶモノクローナル抗体固相化メンブレン、吸液部１６としての濾紙とを、それぞれの端部が３ｍｍずつ重なるように、粘着剤付の樹脂上に貼付してＳＤＶの検出装置を作製した。
【００３６】
（反応性試験）
ＳＤＶ感染樹および正常樹それぞれの新梢１グラムを１０ｍｌの０．１Ｍクエン酸緩衝液で磨砕し、遠心分離で上清を採取した。ＳＤＶ感染樹サンプルについては、０．１Ｍクエン酸緩衝液で希釈系列を調製した。その１００μｌをＳＤＶ滴下部１１へ滴下し、１５分経過後、金コロイド粒子由来のライン（本例では赤紫色）出現を目視観察した。
＜比較例１〜３＞
比較例１〜３では、抗ＳＤＶポリクローナル抗体を用いる。
【００３７】
（抗ＳＤＶポリクローナル抗体の調製）
常法により、ＳＤＶを家兎に免疫し、抗血清を得た。得られた抗血情から、硫酸アンモニウム分画、プロテインＡカラム精製により、抗ＳＤＶポリクローナル抗体を得た。
【００３８】
（標識成分の調製）
金コロイドは、Ｇ．Ｆｒｅｎｓ（Ｎａｔｕｒｅ，２４１，２０−２２，１９７３）法に従い作製した。金コロイドの１０ｍｌに対し、抗ＳＤＶポリクローナル抗体を４０μｇ、室温にて混合し、抗ＳＤＶポリクローナル抗体結合金コロイド（標識成分）を調製した。
【００３９】
（標識区域１２の調製）
抗ＳＤＶポリクローナル抗体結合金コロイドをＯＤ５２０＝０．２０８（比較例１）、０．４１６（比較例２）および０．８３３（比較例３）のもの３種類を調製した。それぞれの調製液をガラス繊維パッドにテスト当たり３６μｌ塗布し、乾燥させ、抗ＳＤＶポリクローナル抗体結合金コロイド塗布パッド（標識区域１２）を調製した。
【００４０】
（検出区域１４の調製）
抗ＳＤＶポリクローナル抗体をニトロセルロースメンブレン（ミリポア杜：ＳＣＨＦ（商標））にテスト当たり０．４８μｌでライン状に塗布し検出区域１４を形成した。また、抗ウサギ抗体を同様にテスト当たり０．４８μｌで塗布し、反応確認のための対照区域１５を形成した。カゼイン溶液によるブロッキング処理を経て、抗ＳＤＶポリクローナル抗体固相化メンブレン（検出区域１４の配置された多孔質担体１３）を調製した。
【００４１】
（検出装置の作製）
滴下部１１としての濾紙、抗ＳＤＶポリクローナル抗体結合金コロイド塗布バッド、抗ＳＤＶポリクローナル抗体固相化メンブレン、吸液部１６としての濾紙とを、それぞれの端部が３ｍｍずつ重なるように、粘着剤付の樹脂上に貼付してＳＤＶの検出装置を作製した。
【００４２】
（反応性試験）
比較例１にて作製したＳＤＶの検出装置に対して実施例１と同様に反応性試験を行った。
＜比較例４＞
比較例４は、抗ＳＤＶポリクローナル抗体を用いるＥＬＩＳＡ法に関する。なお、比較例４では、（社）日本植物防疫協会製、ＳＤＶ検定用試薬を用いた。
【００４３】
（抗ＳＤＶポリクローナル抗体固相化プレートの調製）
ＳＤＶ検定用試薬に添付のコーティング液（抗ＳＤＶポリクローナル抗体含む）を５０ｍＭ Ｃａｒｂｏｎａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ＝９．６）で５００倍に希釈した。この溶液を、ＥＬＩＳＡ用９６ウエルプレート（ナルジェヌンクインターナショナル株式会社製、品番４４２４０４）に１ウエルあたり１００μｌずつ分注した。直ちにプレート上部をシールし、４℃で一晩放置し、抗体をプレートに吸着させた。ウエル中の液を捨て、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３回洗浄を行なった。ブロックエース（商標：雪印乳業薬）を１ウエルあたり３００μｌずつ分注した。直ちにプレート上部をシールし、４℃で一晩放置し、ブロッキング処理を行なった。ウエル中の液を捨て、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３回洗浄を行なった。
【００４４】
（反応性試験用サンプルの調製）
ＳＤＶ感染樹および正常樹それぞれの新梢１グラムを１０ｍｌの０．０５％（ｖ／ｖ）メルカプト酢酸−０．１Ｍクエン酸緩衝液で磨砕し、遠心分離で上清を採取した。ＳＤＶ感染樹サンプルについては、０．０５％（ｖ／ｖ）メルカプト酢酸−０．１Ｍクエン酸緩衝液で希釈系列を調製し、反応性試験用サンプルとした。反応性試験用サンプルを１ウエルあたり１００μｌずつ分注した。
【００４５】
（アルカリフォスファターゼ標識抗ＳＤＶポリクローナル抗体液の調製）
ＳＤＶ検定用試薬に添付のコンジュゲート液（アルカリフォスファターゼ標識抗ＳＤＶポリクローナル抗体含む）をＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで５００倍に希釈した。この溶液を、反応性試験用サンプルの入ったウエルに、１ウエルあたり１００μｌずつ追加分注した。直ちにプレート上部をシールし、４℃で一晩インキュベートした。ウエル中の液を捨て、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３回洗浄を行なった。
【００４６】
（呈色反応）
使用直前に酵素基質（パラニトロフェニルリン酸二ナトリウム）を１ｍｇ／１ｍｌの割合で調製液（Ｄｉｅｔｈａｎｏｌ ａｍｉｎｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒ）に溶解した。この調製液を１ウエルあたり１００μｌずつ分注し、室温で２時開放置し、呈色反応させた。ＥＬＩＳＡプレートリーダーで４０５ｎｍの吸光度を測定し、定性判定を行なった。
【００４７】
（結果の検討）
実施例１及び比較例１〜４による結果をまとめると次表のとおりである。
【００４８】
【表１】
【００４９】
背景技術の項でも述べたが、ＳＤＶの診断における既存の検査法として広く使用されるＥＬＩＳＡ法では、測定に２日要し操作ステップも多い。測定時間の短縮と測定ステップの簡便化の為の解決法としてイムノクロマトグラフィー法を検討した。ＥＬＩＳＡ法の反応系には抗ＳＤＶポリクローナルが使われており、比較例１〜３では、抗ＳＤＶポリクロナール抗体をイムノクロマトグラフィーに適用した。
【００５０】
抗ＳＤＶポリクロナール抗体を反応系に適用する比較例４（ＥＬＩＳＡ法）では、正常葉サンプルは陰性、ＳＤＶ感染樹サンプルの×１６希釈まで検出可能であった。また、同じ抗ＳＤＶポリクロナール抗体をイムノクロマトグラフィーに適用した比較例１（金コロイドＯＤ＝０．２０８）においては、正常葉サンプルは陰性、ＳＤＶ感染樹サンプルは×４希釈まで検出可能であった。
【００５１】
検出感度を上げる一般的な方法として、比較例１よりも金コロイド塗布パッドの金コロイド濃度を上げたもの（金コロイドＯＤ＝０．４１６（比較例２）および０．８３３（比較例３））を調製したところ、ＳＤＶ感染樹サンプルの反応性は上昇したものの、正常樹において偽陽性反応を呈した。すなわち、抗ＳＤＶポリクローナル抗体によってはＳＤＶ感染樹サンプルの×４希釈までの感度までしか得ることができず、既存の検査法のＥＬＩＳＡ法と比較して同等以上の検出感度を得ることはできなかった。
【００５２】
一方、抗ＳＤＶモノクローナル抗体をイムノクロマトグラフィーに適用した実施例１においては、正常葉サンプルは陰性、ＳＤＶ感染樹サンプルの×６４希釈まで検出可能であり、抗ＳＤＶポリクロナール抗体を利用したイムノクロマトグラフィーおよびＥＬＩＳＡ法よりも高い検出感度が得られた。
【００５３】
表１を参照すれば、本発明は、ＳＤＶのような果樹病原体の検出にも有用であり、しかもＥＬＩＳＡ法に勝るとも劣らない感度の検出結果を、ＥＬＩＳＡ法よりも遙かに迅速・簡便に得ることができることが理解されよう。
【００５４】
より具体的には、実施例１によると、液体試料を滴下部へ滴下するまでの処理をすれば、後は検出区域と対照区域とを検査するだけでよい。即ち、実施例１によると、ＥＬＩＳＡ法によると必須であった、標識抗体の分注、約１６時間程度のインキュベート（４℃）、ウエルの洗浄、室温２時間のインキュベート等が不要であり、迅速に（通常１５分程度である。）検出結果を得ることができる。さらに、ＥＬＩＳＡ法によると、設備が整った施設（例えば、研究所等）へ試料を搬送しないと検査が行えなかったが、実施例１では、例えば、圃場（現場）において直ちに検査を行えため、搬送に要していた時間や検査待ちの時間も節約できる。即ち、現場で即座に感染の有無を検査し、迅速な対応（例えば、感染樹の早期撤去による感染蔓延の防止等）をとりうるので、実用効果大である。実施例１によると、ＥＬＩＳＡ法によると必須であった、吸光度計、その他の高価で設置場所を要する設備は不要である。しかも、実施例１によれば、ＥＬＩＳＡ法に勝る感度（５〜１０倍程度）の検出結果が得られている。
【実施例２】
【００５５】
実施例２において取り上げる果樹病原体は、根頭がんしゅ病の原因となるＡｔ菌である。
【００５６】
根頭がんしゅ病は、土中に潜むＡｔ菌が株の傷口から侵入することによって起こり、被害部に大きなこぶをつくるのがその特徴である。根頭がんしゅ病は、ナシ、カキなどの果樹などの花木に古くから発生している。感染すると、根から水や栄養分を十分に吸い上げられなくなり樹勢が著しく衰退する。
＜実施例２＞
実施例２は、抗Ａｔ菌モノクローナル抗体を使用する。
【００５７】
（抗Ａｔ菌モノクローナル抗体の調製）
抗Ａｔ菌モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ−Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５−４９７，１９７５）の方法に準じて調製した。Ａｔ菌を免疫したマウスの脾臓から抗体を産生する細胞を取り出し、別に用意したマウスの骨髄腫細胞（ミエローマ）と融合させ、抗Ａｔ菌モノクローナル抗体Ａｇ７産生ハイブリドーマ細胞を得た。該ハイブリドーマ細胞を無血清培地中で培養、遠心分離後の上清の硫酸アンモニウム分画により、抗Ａｔ菌モノクローナル抗体Ａｇ７を得た。
【００５８】
（標識成分の調製）
金コロイドは、Ｇ．Ｆｒｅｎｓ（Ｎａｔｕｒｅ，２４１，２０−２２，１９７３）の方法に従い作製した。金コロイドの１０ｍｌに対し、抗Ａｔ菌モノクローナル抗体Ａｇ７を４０μｇ、室温にて混合し、抗Ａｔ菌モノクローナル抗体結合金コロイド（標識成分）を調製した。
【００５９】
（標識区域１２の調製）
抗Ａｔ菌モノクローナル抗体結合金コロイドをＯＤ５２０＝０．３０５に調製した。調製液をガラス繊維パッドにテスト当たり３６μｌ塗布し、乾燥させ、抗Ａｔ菌モノクローナル抗体結合金コロイド塗布バッド（標識区域１２）を調製した。
【００６０】
（検出区域１４の調製）
抗Ａｔ菌モノクローナル抗体Ａｇ７をニトロセルロースメンブレン（ミリポア社：ＳＣＨＦ（商標））にテスト当たり０．４８μｌでライン状に塗布し、検出区域１４を形成した。また、抗マウス抗体を同様にテスト当たり０．４８μｌで塗布し、反応確認のための対照区域１５を形成した。カゼイン溶液によるブロッキング処理を経て、抗Ａｔ菌モノクローナル抗体固相化メンブレン（検出区域１４の配置された多孔質担体）を調製した。
【００６１】
（検出装置の作製）
滴下部１１としての濾紙、抗Ａｔ菌モノクローナル抗体結合金コロイド塗布パッド、抗Ａｔ菌モノクローナル抗体固相化メンブレン、吸液部１６としての濾紙とを、それぞれの端部が３ｍｍずつ重なるように、粘着剤付の樹脂上に貼付してＡｔ菌の検出装置を作製した。
【００６２】
（反応性試験）
Ａｔ菌を寒天培地上で培養し、生じたコロニーを採取して、菌体数濃度が１０^8個／ｍｌとなるように緩衝液中に懸濁させた。菌体懸濁液を超音波破砕処理してＡｔ菌抗原液を得た。Ａｔ菌非感染プドウ茎部１グラムを１０ｍｌの０．１Ｍクエン酸緩衝液で磨砕後、遠心分離で上清を採取し、磨砕液を得た。Ａｔ菌抗原液の磨砕液による希釈系列を調製し、検体とした。該検体１００μｌをＡｔ菌検出装置サンプル液滴下部へ滴下し、１５分経過後、イムノクロマト判定窓における金コロイド粒子由来の赤紫色ライン出現を目視観察した。結果を（表２）に示す。
【００６３】
【表２】
【００６４】
表２を参照すれば、本発明は、Ａｔ菌のような果樹病原体の検出にも有用であることが理解されよう。
【００６５】
なお、本発明の検出装置は、ＳＤＶ、Ａｔ菌のほか、カンキツモザイクウイルス（ＣｉＭＶ）及びタターリーフウイルス（ＡＳＧＶ）等、各種の果樹病原体への適用があるものと推測される。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】（ａ）本発明の一実施の形態における検査装置の平面図 （ｂ）同側面図
【符号の説明】
【００６７】
１１ 滴下部
１２ 標識区域
１３ 多孔質坦体
１４ 検出区域
１５ 対照区域
１６ 吸液部
【特許請求の範囲】
【請求項１】
果樹病原体に対して、いずれも特異結合性を有する第１、第２の抗体を用意し、
前記果樹病原体を含むと疑われる試料液体が滴下される滴下部と、前記第１の抗体を有色粒子により標識したものを前記試料液体により湿潤された状態において流動可能に保持する標識区域と、前記第２の抗体が固相される検出区域とを、前記試料液体の流動方向において上流側から下流側に向けて順次連設し、
前記検出区域とは異なる位置に対照区域を設けてなることを特徴とする検出装置。
【請求項２】
前記第１、第２の抗体は、いずれも前記果樹病原体を免疫した動物の器官から取り出した細胞と、この細胞とは異なる細胞とを融合して得た抗体生産ハイブリドーマ細胞を培養・精製して得た抗果樹病原体モノクローナル抗体である請求項１記載の検出装置。
【請求項３】
前記果樹病原体は、温州萎縮ウイルス（ＳＤＶ）である請求項１から２記載の検出装置。
【請求項４】
前記果樹病原体は、アグロバクテリウム・ツメファシェンス菌（Ａｔ菌）である請求項１から２記載の検出装置。
【請求項５】
果樹病原体への感染が疑われる果樹の器官試料を摩砕・溶解して試料液体を調製するステップと、
前記試料液体を請求項１から４のいずれか記載の検出装置の滴下部へ滴下するステップと、
前記検出装置の前記検出区域及び前記対照区域とを検査して陽性／陰性を判定するステップとを含むことを特徴とする検出方法。
【請求項１】
果樹病原体に対して、いずれも特異結合性を有する第１、第２の抗体を用意し、
前記果樹病原体を含むと疑われる試料液体が滴下される滴下部と、前記第１の抗体を有色粒子により標識したものを前記試料液体により湿潤された状態において流動可能に保持する標識区域と、前記第２の抗体が固相される検出区域とを、前記試料液体の流動方向において上流側から下流側に向けて順次連設し、
前記検出区域とは異なる位置に対照区域を設けてなることを特徴とする検出装置。
【請求項２】
前記第１、第２の抗体は、いずれも前記果樹病原体を免疫した動物の器官から取り出した細胞と、この細胞とは異なる細胞とを融合して得た抗体生産ハイブリドーマ細胞を培養・精製して得た抗果樹病原体モノクローナル抗体である請求項１記載の検出装置。
【請求項３】
前記果樹病原体は、温州萎縮ウイルス（ＳＤＶ）である請求項１から２記載の検出装置。
【請求項４】
前記果樹病原体は、アグロバクテリウム・ツメファシェンス菌（Ａｔ菌）である請求項１から２記載の検出装置。
【請求項５】
果樹病原体への感染が疑われる果樹の器官試料を摩砕・溶解して試料液体を調製するステップと、
前記試料液体を請求項１から４のいずれか記載の検出装置の滴下部へ滴下するステップと、
前記検出装置の前記検出区域及び前記対照区域とを検査して陽性／陰性を判定するステップとを含むことを特徴とする検出方法。
【図１】
【公開番号】特開２００７−８６００１（Ｐ２００７−８６００１Ａ）
【公開日】平成１９年４月５日（２００７．４．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−２７７８７９（Ｐ２００５−２７７８７９）
【出願日】平成１７年９月２６日（２００５．９．２６）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成１７年３月２９日から３月３１日 日本植物病理学会主催の「平成１７年度 日本植物病理学会大会」において文書をもって発表
【出願人】（５９１０６５５４９）福岡県 (121)
【出願人】（５９８０３４７２０）株式会社ミズホメディー (17)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年４月５日（２００７．４．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年９月２６日（２００５．９．２６）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成１７年３月２９日から３月３１日 日本植物病理学会主催の「平成１７年度 日本植物病理学会大会」において文書をもって発表
【出願人】（５９１０６５５４９）福岡県 (121)
【出願人】（５９８０３４７２０）株式会社ミズホメディー (17)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]