標的細胞または標的組織内への選定分子導入方法、それに用いる導入装置、標的細胞の細胞融合方法およびそれに用いる細胞融合装置
【課題】さまざまな種類の標的細胞または標的組織内へのさまざまな選定分子の高効率な遺伝子の導入が可能である、標的細胞または標的組織内への選定分子の導入方法、および、それに用いる導入装置を提供すること。
【解決手段】本発明は、標的細胞または標的組織内へ選定分子を導入する方法であって、前記選定分子を含む液体と前記標的細胞または標的組織とを接触させるステップと、前記液体から離間して設けられた複数の電極から前記液体に放電することにより前記液体中に電流を流すステップとを順に備える、標的細胞または標的組織内への選定分子導入方法である。
【解決手段】本発明は、標的細胞または標的組織内へ選定分子を導入する方法であって、前記選定分子を含む液体と前記標的細胞または標的組織とを接触させるステップと、前記液体から離間して設けられた複数の電極から前記液体に放電することにより前記液体中に電流を流すステップとを順に備える、標的細胞または標的組織内への選定分子導入方法である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的細胞または標的組織内への選定分子の導入方法およびそれに用いる導入装置に関する。より詳しくは、遺伝子等のポリヌクレオチドや蛋白質、生理活性分子等の選定分子を細胞内に導入する方法および細胞の融合方法またはこれらのための装置に関する。
【０００２】
また、本発明は、標的細胞または標的組織の細胞融合方法およびそれに用いる細胞融合装置に関する。
【背景技術】
【０００３】
近年、ヒトゲノムおよびマウスゲノムの解読がほぼ完了し、医学、薬学などの分野において、遺伝子工学関連の研究開発や医薬品開発を行なう際に、ＤＮＡ、ＲＮＡなどのポリヌクレオチドまたはその誘導体、シグナル伝達蛋白質や転写調節因子などの蛋白質やその誘導体などの高分子化合物、低分子生理活性物質、薬剤候補品などの選定分子を標的細胞または標的組織内に導入し、標的細胞または標的組織内での遺伝子の機能や生理活性分子の生理的な活性を試験する必要が増している。
【０００４】
現在のところ、標的細胞への選定分子の導入方法としては、エレクトロポレーション法、ジーンガン法、リポソーム法、細胞融合法、ウイルスベクター法などの方法が用いられているが、必ずしも十分に選定分子を細胞内に導入できるものではないという問題がある。
【０００５】
たとえば、エレクトロポレーション法やジーンガン法においては、多くの種類の標細細胞に応用できるが、操作が煩雑であり、かつ大多数の細胞が死滅するという問題がある。更に、これらの方法では本来標的細胞が保持する遺伝子に障害を与えることが知られており、本来標的細胞が保持する機能が失われることがしばしば起こることが知られている。また、リポソーム法や細胞融合法においては、応用できる標的細胞の種類が限定されるといった問題がある。さらに、ウイルスベクター法においては、応用できる標的細胞の種類が限定されるとともに、ベクターの構築に非常に多くの時間と労力とコストを要するという問題がある。
【０００６】
また、いずれの方法においても、すべての標的細胞への選定分子の導入効率が必ずしも十分に満足できる水準ではないばかりでなく、本来細胞が持つ機能が失われたり、癌化するなどの問題もある。
【０００７】
しかし、ヒトゲノムおよびマウスゲノムの解読がほぼ完了し、機能未知な遺伝子の機能解析が急務となっているばかりでなく、遺伝子治療や再生医療では欠損した遺伝子や過剰発現している遺伝子を抑制することで、病気の根本治療を行うことができることから、細胞や組織に障害を与えることなく高効率で選定分子を導入する方法が必要不可欠な技術として、医薬品業界をはじめとする産業界からその開発を強く求められる状況となっている。
【０００８】
ここで、標的細胞に障害を与えず選定分子を導入方法するためには、これまでの選定分子を含む液体中に直接電流を流し細胞に穴を開けることで遺伝子を導入させたり、リポソームに包まれた選定分子を膜に融合させて導入する方法では細胞膜に傷をつけるばかりでなく細胞内の遺伝子までも傷をつけることになってしまい、治療のための装置としては不適当であることから、もっぱら遺伝子治療では無毒化したウイルスベクターを用いて研究や臨床試験が行われていた。しかしながら無毒化したウイルスとても野性型のウイルスとの組み換えや染色体遺伝子の特定の場所に組み込まれることで、毒性や発ガン性を引き起こすことがわかってきた。そのためには細胞に障害を与えることなくかつ余分な試薬を用いず高効率に選定分子を導入させる機械的な方法の開発が待たれていた。
【０００９】
一方で、近年、遺伝子工学関連の研究開発や医薬品開発を行なう際に、同種のまたは異種の標的細胞を融合させることにより、さまざまな標的細胞の機能を試験する必要も同様に増しつつある。また、特定の細胞種に囚われる事ない細胞融合方法の開発が強く望まれている。
【００１０】
現在のところ、標的細胞の細胞融合方法としては、不活性化したセンダイウイルス、麻疹ウイルス、ニューカッスル病ウイルスなどを用いる方法、リゾレシチン、グリセロールオレイン酸エステル、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などを用いる方法、エレクトロポレーション法などの方法が用いられているが、必ずしも十分に細胞融合させることができるものではないという問題がある。
【００１１】
たとえば、エレクトロポレーション法においては、効率よく遺伝子を導入させる条件での細胞障害性が高く、また細胞の表現型が変わってしまうという問題ばかりでなく、分化した細胞（増殖能の低い細胞）への導入効率が低いと言う問題点がある。また、不活性化したウイルスを用いる方法においては、応用できる標的細胞の種類が限定されるといった問題や発ガン性などの問題がある。
【００１２】
上記のような問題を改善するための技術として、国際公開２００２／０６４７６７号パンフレット（特許文献１）、国際公開２００４／０１５１０１号パンフレット（特許文献２）には、細胞や選定分子を低温ガスプラズマで処理することにより細胞の近傍に存在する選定分子を細胞内に導入する方法、および、細胞を低温ガスプラズマで処理することにより細胞を融合する方法が開示されている。しかし、かかる方法は低温ガスプラズマの発生装置が必要であり、ガスを吹きつけるために細胞が乾燥し死滅してしまったり、均一な処理が難しいなどの点で、必ずしも十分なものとはいえなかった。また、選定分子の導入率についてもさらなる向上が求められていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】国際公開２００２／０６４７６７号パンフレット
【特許文献２】国際公開２００４／０１５１０１号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明の目的は、標的細胞または標的組織に障害を与えることなくまた本来持つ標的細胞または標的組織の機能を失わせることなくさまざまな種類の標的細胞または標的組織内へのさまざまな選定分子の高効率な遺伝子の導入が可能で、遺伝子治療および再生医療になどの医療機器として利用可能である、標的細胞または標的組織内への選定分子の導入方法、および、それに用いる導入装置を提供することである。
【００１５】
また、本発明の他の目的は、さまざまな種類の標的細胞または標的組織の高効率な細胞融合が可能である、標的細胞または標的組織の細胞融合方法、および、それに用いる細胞融合装置を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は、標的細胞または標的組織内へ選定分子を導入する方法であって、前記選定分子を含む液体と前記標的細胞または標的組織とを接触させるステップと、前記液体から離間して設けられた複数の電極から前記液体に放電することにより前記液体中に電流を流すステップとを順に備える、標的細胞または標的組織内への選定分子導入方法である。
【００１７】
前記複数の電極間にプラズマ放電を発生させないことが好ましい。
前記複数の電極間に数ｋＶ〜３０ｋＶの電圧を印加することが好ましい。
【００１８】
前記選定分子が分子量が５０００Ｄａ以上の生体高分子であることが好ましい。
前記生体高分子が、ポリヌクレオチド、タンパク質またはペプチドであることが好ましい。
【００１９】
また、本発明は、標的細胞または標的組織内への選定分子の導入装置であって、前記選定分子含む液体および前記標的細胞または標的組織を収容するための容器と、複数の電極と、前記電極から前記選定分子を含む液体に電流を流すための電圧を前記電極に供給する電圧供給手段とを備えた、標的細胞または標的組織内への選定分子導入装置にも関する。
【００２０】
前記電極が、前記電極と前記液体との間の最短距離が１０ｍｍ以下であり、前記電極が前記液体に接触しないように設けられることが好ましい。
【００２１】
前記電圧供給手段は前記電極と接続した直流または交流の電源であり、該電源と前記電極を接続する接続回路に整流器、抵抗、コイルまたはコンデンサを有することが好ましい。
【００２２】
さらに、本発明は、標的細胞の細胞融合方法であって、複数の前記標的細胞を液体に接触させるステップと、前記液体から離間して設けられた複数の電極から前記液体に放電することにより前記液体中に電流を流すステップとを備える、標的細胞の細胞融合方法にも関する。
【００２３】
さらに、本発明は、標的細胞の細胞融合装置であって、液体および複数の前記標的細胞を収容するための容器と、複数の電極と、前記電極から前記液体に電流を流すための電圧を前記電極に供給する電圧供給手段とを備えた、標的細胞の細胞融合装置にも関する。
【発明の効果】
【００２４】
本発明の選定分子の導入方法および導入装置によれば、さまざまな種類の標的細胞または標的組織内へのさまざまな選定分子の高効率な遺伝子の導入が可能である。
【００２５】
また、本発明の細胞融合方法および細胞融合装置によれば、さまざまな種類の標的細胞の高効率な細胞融合が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】本発明の選定分子の導入方法を説明するフローチャートである。
【図２】本発明の導入装置の一例を説明する概略図である。
【図３】本発明の導入装置の一例を説明する概略斜視図である。
【図４】本発明の導入装置の一例を説明する概略上面図である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
以下、実施の形態を示して本発明をより詳細に説明する。
＜標的細胞または標的組織内への選定分子の導入方法＞
図１は、本発明の標的細胞または標的組織内への選定分子の導入方法を説明するフローチャートである。
【００２８】
本発明の標的細胞または標的組織内への選定分子の導入方法は、前記選定分子を含む液体と前記標的細胞または標的組織とを接触させるステップ（例えば、図１のステップＳ１０１〜Ｓ１０２）と、前記液体から離間して設けられた複数の電極から前記液体に放電することにより前記液体中に電流を流すステップ（例えば、図１のステップＳ１０３〜１０５）と、を順に備える標的細胞または標的組織内への選定分子の導入方法である。
【００２９】
図１を用いて、本発明の標的細胞または標的組織内への選定分子の導入方法の一例を説明する。まず、標的細胞または標的組織を前培養後（ステップＳ１０１）、培養液を完全に除去し、標的細胞または標的組織上に選定分子を含む微量の水溶液を添加する（ステップＳ１０２）ことが好ましい。あるいは切除してきた組織切片あるいは直接組織上に選定分子を含む微量の水溶液を添加することが望ましい。
【００３０】
次に、この選定分子を含む微量の水溶液に放電により電流を流すことのできる領域に複数の電極を設置する（ステップＳ１０３）。そして、複数の電極の間に電圧を供給（印加）することにより（ステップＳ１０４）、複数の電極の間において標的細胞または標的組織上の選定分子を含む水溶液中を電流が流れることとなる（ステップＳ１０５）。
【００３１】
また、本発明において、選定分子が細胞に導入される場合には、選定分子を導入した標的細胞を後培養する（ステップＳ１０６）ことが好ましい。さらに、他の付加的なステップが備わっていてもよく、たとえば、標的細胞を後培養する（ステップＳ１０６）ことの後に、さらに選定分子の導入された標的細胞をスクリーニングしてもよい。
【００３２】
＜標的細胞＞
本発明の選定分子の導入方法において用いる標的細胞とは、選定分子を導入する標的となる細胞のことを示し、特に特定の種類の細胞に限定されるものではない。このような標的細胞の具体例としては、ヒト以外の動物細胞、ヒト以外の動物個体、ヒトの個体から採取された細胞、ヒトの個体内の細胞、ヒトの個体、植物細胞、微生物細胞などが挙げられる。これらの標的細胞は、単一の種類を用いてもよいし、二種以上を混合して用いてもよい。
【００３３】
なお、上記のヒトの個体から採取された細胞には、医薬品の研究開発などに用いられるヒトの個体に戻すことを前提としない細胞と、再生医療などに用いられるヒトの個体に戻すことを前提とする細胞とが含まれる。また、上記のヒトの個体から採取された細胞には、ヒトの個体から採取された細胞から培養された細胞も含まれる。
【００３４】
さらに、上記のヒト以外の動物細胞および植物細胞には、個体内に存在する細胞と、組織内に存在する細胞と、個体や組織から採取された細胞と、個体や組織から採取された細胞から培養された細胞とが含まれる。
【００３５】
ここで、上記とは別の側面から捉えれば、本発明に用いる標的細胞には、大腸菌、放線菌、枯草菌などの原核細胞や、酵母、ヒト以外の動物細胞、ヒトの個体から採取された細胞、ヒトの個体に含まれる細胞、植物細胞などの真核細胞が含まれる。
【００３６】
さらに、本発明に用いる標的細胞には、赤血球ゴーストやリポソームなどの脂質二重膜構造をもつものも含まれる。
【００３７】
また、本発明に用いる標的細胞は、特に処理を施されていないものであってもよいが、選定分子の導入効率を向上するためには、遺伝子導入の際に一般的に用いられる、コンピータント細胞としての処理を施されたものであってもよい。具体例としては、塩化カルシウムで処理され、細胞膜の構造が変化してＤＮＡ分子を透析しやすくなった大腸菌のコンピータント細胞などが挙げられる。
【００３８】
＜標的組織＞
一方、本発明に用いられる標的組織とは、選定分子を導入する標的となる組織のことを示し、特に特定の種類の組織に限定されるものではない。このような標的組織の具体例としては、移植に用いられるドナーからの臓器、再生医療の方法を用いて再構成された皮膚や歯根などの組織、カルス培養で構築された植物に分化前の組織、などが挙げられる。これらの標的組織は、単一の種類を用いてもよいし、二種以上を混合して用いてもよい。
【００３９】
＜導入される選定分子＞
本発明の標的細胞または標的組織内への選定分子の導入方法において用いる選定分子とは、標的細胞または標的組織に導入するために選定した分子のことを示し、特に特定の種類の分子に限定されるものではない。このような選定分子の具体例としては、ＤＮＡ、ＲＮＡなどのポリヌクレオチドまたはその誘導体、シグナル伝達蛋白質や転写調節因子などの蛋白質やペプチドとその誘導体などの高分子化合物があげられ、これらの中でも、分子量が５０００Ｄａ以上の生体高分子であることが好ましい。
【００４０】
また、上記のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの誘導体には、ベクター、アンチセンスポリヌクレオチド、デコイポリヌクレオチド、リボザイム、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡなどが含まれる。ポリヌクレオチドの分子量は特に限定されないが、細胞障害性を低く抑えかつ効率よく導入させるという理由から、１００万Ｄａ以下であることが好ましい。
【００４１】
さらに、上記の蛋白質分子、蛋白質分子誘導体には、シグナル伝達因子や、転写調節因子、各種酵素、各種受容体、抗体あるいは抗体のＦａｂ部分などが含まれる。
【００４２】
他の選定分子としては、低分子生理活性物質、薬剤候補品などが挙げられ、これらの中でも医薬品などの生理活性な低分子化合物であって、他の導入方法では組織内あるいは細胞内に導入されづらい低分子化合物が好ましい。他の導入方法では組織内あるいは細胞内に導入されづらい低分子化合物とは、分子量が１０００Ｄａ以上の低分子、膜透過性の低い分子、などである。
【００４３】
なお、上述の各種選定分子は、単一の種類を用いてもよいし、二種以上を混合して用いてもよい。
【００４４】
＜選定分子を含む液体と前記標的細胞または標的組織とを接触させるステップ＞
本発明の選定分子の導入方法において、選定分子を含む液体と前記標的細胞または標的組織とを接触させるステップについて、標的として細胞を用いる場合をより詳細に説明する。
【００４５】
本発明の選定分子の導入方法において、選定分子を含む液体と前記標的細胞とを接触させるステップは、標的細胞を前培養するステップ（図１のステップＳ１０１）および選定分子を含む液体を添加するステップ（図１のステップＳ１０２）を含むことが好ましい。
【００４６】
標的細胞の前培養（ステップＳ１０１）の方法は、特に限定されないが、プレートなどの細胞培養容器上で培養した培養接着細胞や、培養液中に懸濁した状態で標的細胞を培養する方法が挙げられる。前培養に用いる培地は、標的細胞を培養することのできる組成の培地であれば特に限定されるものではないが、たとえば寒天培地をはじめとする固体培地や試験管やフラスコ内の液体培地などが挙げられる。
【００４７】
次に、前培養された標的細胞、たとえば、プレートなどの細胞培養容器上で培養した培養接着細胞や、培養液中に懸濁している標的細胞を遠心分離または濾過などの操作により分離して、培養液を除去する。
【００４８】
次に、選定分子を含む液体を添加する際（ステップＳ１０２）には、たとえば選定分子を含む液体を標的細胞を薄く覆うように添加することが好ましい。選定分子を含む液体は、特に限定されるものではないが、たとえば選定分子を含む水溶液または懸濁液であることが好ましい。また、該水溶液または懸濁液の溶媒または分散媒としては、たとえば生理食塩水やｐＨ緩衝溶液などが挙げられる。
【００４９】
なお、標的細胞に選定分子を含む液体を接触させる際には、たとえば標的細胞または標的細胞に選定分子を含む液体を滴下する方法、標的細胞または標的組織と、選定分子を含む液体とを混合する方法などを用いることができる。また、選定分子を含む液体と標的細胞または標的組織とを接触させる別の方法としては、標的細胞または標的組織を含む分散液または懸濁液等に選定分子を含む液体を添加する方法も用いることができる。
【００５０】
＜選定分子を含む液体中に電流を流すステップ＞
本発明の選定分子の導入方法における、選定分子を含む液体から離間して設けられた複数の電極から選定分子を含む液体に放電することにより選定分子を含む液体中に電流を流すステップについて、より詳細に説明する。
【００５１】
本発明において、選定分子を含む液体から離間して設けられた複数の電極から液体に放電することにより選定分子を含む液体中に電流を流すステップは、特に限定されるものではないが、選定分子を含む液体への放電により該液体中に電流を流すことのできる領域に複数の電極を設置するステップ（図１のステップＳ１０３）、複数の電極の間に電圧を印加するステップ（図１のステップＳ１０４）、および、複数の電極と選定分子を含む液体との間で放電を発生させることにより標的細胞または標的組織と接した選定分子を含む液体中を電流が流れるステップ（図１のステップＳ１０５）を含むことが好ましい。このステップにより標的細胞または標的組織に選定分子が導入される。
【００５２】
電極を設置するステップ（ステップＳ１０３）においては、シャーレ等の容器中に標的細胞または標的組織と選定分子を含む液体とが保持された状態で、選定分子を含む液体に放電により電流を流すことのできる領域に複数の電極が設置されることが好ましい。
【００５３】
ここで、上記容器は、標的細胞または標的組織と選定分子を含む液体を保持することのできる構造であれば特に限定されるものではないが、たとえばプレート、シャーレ、チューブ、試験管、フラスコなどが挙げられる。
【００５４】
複数の電極の間に電圧を印加（供給）するステップ（ステップＳ１０４）においては、複数の電極の間に数ｋＶ〜数十ｋＶ程度の電圧を印加することが好ましく、さらに好ましくは２ｋＶ〜３０ｋＶであり、最も好ましくは５〜２０ｋＶである。数十ｋＶよりも高い電圧で電流を流すと、標的細胞または標的組織の死滅率が高くなってしまい、逆に、数ｋＶよりも低い電圧で電流を流すと選定分子の導入率を向上させる効果を得ることができない。
【００５５】
複数の電極からの放電により選定分子を含む液体中に電流を流すステップ（ステップＳ１０５）は、上記複数の電極の間に電圧を供給するステップにより、ほぼ同時に達成されるステップである。かかる電圧の印加により、選定分子を含む液体に離間して設けられた電極と選定分子を含む液体との間で放電を行わせることで、上記選定分子を含む液体に電流を流してもよく、選定分子を含む液体に接触して設けられた電極と選定分子を含む液体との間で直接的に電流を流してもよい。
【００５６】
選定分子を含む液体に電流を流す時間は、１〜１００ｍｓであることが好ましく、さらに好ましくは３〜２０ｍｓである。１００ｍｓよりも長い時間電流を流すと、標的細胞または標的組織の死滅率が高くなってしまい、逆に、１ｍｓよりも短い時間の通電では選定分子の導入率を向上させる効果を得ることができない。
【００５７】
このようにして、選定分子を含む液体に高電圧の電流を短時間流すことにより、選定分子の導入率を著しく向上させ、標的細胞または標的組織の死滅率を格段に低減することが可能となる。
【００５８】
＜導入装置＞
図２は、図１に示す本発明の選定分子の導入方法に用いられる本発明の導入装置を説明する概略図である。なお、本発明の導入装置の構造は、図２に示す構造に限定されるものではない。
【００５９】
ここで、図２（ａ）に記載される本発明の導入装置は、上述した本発明の選定分子導入方法および後述する本発明の細胞融合方法に好適に用いられる構造および機能を有している。図２（ａ）に示す本発明の導入装置は、２本の針状の電極１と電源（電圧供給手段）２と、容器３とを備えている。該電源２により、２本の電極間に電圧を印加することができる。
【００６０】
特に、図２（ａ）に記載される本発明の導入装置に備えられた複数の電極１は、上記選定分子を含む液体に離間して設けられており、複数の電極間に電圧を印加することにより該電極と上記選定分子を含む液体との間で放電を行わせることで、上記選定分子を含む液体に電流を流すことを特徴とするものである。
【００６１】
なお、本発明の導入装置は、本発明の選定分子の導入方法において、標的細胞または標的組織４と接触した選定分子を含む液体５に電極１からの放電により電流を流すことのできる領域に電極１が設置されていることを特徴としている。図２（ａ）においては、電極１は選定分子を含む液体５と離間して設けられており、電極１は選定分子を含む液体５との間に放電６を生じさせることにより、選定分子を含む液体に電極からの電流を流すことができる位置に電極１が設置されている。電極１と選定分子を含む液体５とは、両者の間の最短距離が１０ｍｍ以下であり、かつ両者が接触しないように設置されている。電極１と選定分子を含む液体５との間の最短距離は、０．１〜１０ｍｍであることが好ましく、さらに好ましくは０．１ｍｍ〜３ｍｍである。このように、電極１と選定分子を含む液体５とを互いに接触しないように設置することにより、電極を使用毎に清掃する必要がなく、電極の腐食を防止することができる。
【００６２】
また、本発明においては、直接的に電極間でプラズマ放電が発生しないように複数の電極間の距離や電極間に印加される電圧が調整されることが好ましい。電極間でプラズマ放電が発生すると、大気圧でのプラズマが不安定であるために選定分子を含む液体中を流れる電流も不安定となり、選定分子の導入効率等も不安定となるためである。なお、このような複数の電極間の距離や電極間に印加される電圧の好適な範囲は、選定分子を含む液体の電気抵抗などに影響されるものであり一概に決定することはできないが、通常の選定分子を含む水溶液を用いる場合、複数の電極のうち任意の２対の電極間の距離が０．３〜６０ｍｍであることが好ましく、任意の２対の電極間に印加される電圧は２〜３０ｋＶであることが好ましい。
【００６３】
また、本発明において、上記電極から上記選定分子を含む液体に電流を流すための電圧を上記電極に供給する電圧供給手段は、特に限定されるものではないが、たとえば高圧電源ＦＰ１０００（パール工業株式会社製）などの電源供給装置が挙げられる。電源が交流電源である場合の交流波の波形は、正弦波、半波整流、全波整流、パルスのいずれも用いることができる。
【００６４】
本発明の導入装置に用いられる電極の形状は、特に限定されるものではないが、電極から選定分子を含む液体に放電するために必要以上の電圧を印加する必要がないようにするために、選定分子を含む液体５側を先端とする針形状等の形状であることが好ましい。また、電極の材質は、特に限定されるものではないが、タングステン、モリブデンなどが挙げられ、腐食しにくい材質や、金、銀、プラチナ等の殺菌効果のある材質であることが好ましい。
【００６５】
本発明の導入装置に用いられる電極の数は２つ以上であるが、電極の数は６以上であることが好ましい。電極の数を６以上とすることにより、試料回転等の操作を必要とせずに導入を均一化することが可能となり、より選定分子の導入率が向上し、標的細胞または標的組織の死亡率も低減される。
【００６６】
また、本発明の導入装置に用いられる電極の数は、図３（ａ）に示すように正電極と負電極の数が同じとなるようにしてもよく、図３（ｂ）に示すように正電極と負電極の数が異なるようにしてもよい。なお、図３のように複数の電極を配置する場合においては、特定の電極に電流が集中してしまい均一な選定分子の導入が妨げられないよう、電源２と電極１の間に抵抗２２を設けて、電流が均一に流れるように調整することが好ましい。なお、抵抗２２の代わりにコイルやコンデンサ等を使用してよい。
【００６７】
このように、本発明の導入装置に用いられる電極の数が３以上である場合の電極の配置としては、例えば、図４（ａ）〜（ｄ）の上面図にしめすような配置が挙げられる。電極の配置は、図４（ａ）は正電極１１と負電極１２が３本ずつ左右均等に配置された構成であってもよく、図４（ｂ）のように１本の正電極１１と３本の負電極１２が不均等に配置された構成であってもよい。また、図４（ｃ）に示すように中心に正電極１１を配置し、その周囲に複数の負電極１２を配置するような構成であってもよく、正電極１１と負電極１２が逆の構成であってもよい。さらに、電源を複数使用した構成としてもよく、図４（ｄ）に示すように第１の電源に接続された正電極１１と負電極１２、および、第２の電極に接続された第２の正電極１３と第２の負電極１４からなるような電極構成をとることもできる。
【００６８】
なお、本発明の導入装置の構造は、本実施の形態で説明した構造に限定されるものではなく、たとえば電極の数や設置形態は、本実施の形態と同様の効果が得られるのであれば、互いに異なる他の形状であってもよい。また、図２（ｂ）に示されるように整流器２１を電源２と一方の電極１との間に設けてもよい。
【００６９】
本発明によれば、ガスの噴きつけ等を必要としないため標的細胞または標的組織がほとんど乾燥せず、余計な緩衝液等の添加が不要となる。また、短時間（１０ｍｓ程度）での処理が可能となり、電極構成も特別な構成を必要とせず簡素化することができる。
【００７０】
＜標的細胞の細胞融合方法＞
本発明の標的細胞の細胞融合方法は、複数の標的細胞を液体に接触させるステップと、前記液体から離間して設けられた複数の電極から前記液体に放電することにより前記液体中に電流を流すステップと、を備える、標的細胞の細胞融合方法である。
【００７１】
本発明の標的細胞の細胞融合方法は、上記の本発明の選定分子の導入方法において説明した方法と基本的に同様の各ステップを有する方法であり、同様に他の付加的ステップを備えていることが好ましい。各ステップの内容については、上記の本発明の選定分子の導入方法において説明しているため、説明は繰り返さない。
【００７２】
また、本発明の標的細胞の細胞融合方法は、上記の本発明の選定分子の導入方法と同様の種類の標的細胞を用いることが好ましい。標的細胞の種類については、上記の本発明の選定分子の導入方法において説明しているため、説明は繰り返さない。
【００７３】
さらに、本発明の標的細胞の細胞融合方法は、上記の本発明の選定分子の導入方法と同様の導入装置を用いることが好ましい。すなわち、液体および複数の前記標的細胞を収容するための容器と、複数の電極と、前記電極から前記液体に電流を流すための電圧を前記電極に供給する電圧供給手段とを備えた、標的細胞の細胞融合装置を用いることが好ましい。導入装置の構造および機能については、上記の本発明の選定分子の導入方法において説明しているため、説明は繰り返さない。
【実施例】
【００７４】
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。以下の実施例においては、全て標的細胞としてアフリカミドリザル腎臓由来の細胞（Ｃｏｓ７）を使用した。また、整流器は全て半波のものを使用した。
【００７５】
本実施例では動物樹立細胞株への標的分子の導入を試みた。本実施例を行うにあたり、まず、図３（ａ）に示すような本発明の導入装置を作製した。電極１としては、縫い針を使用し、抵抗２２として金属皮膜抵抗器を使用し、電源２としてＦＰ１０００（パール工業株式会社製）を使用した。本導入装置においては、電極間電圧を数ｋＶ〜十数ｋＶの範囲に設定でき、周波数を２０〜４０ｋＨｚの範囲に設定でき、パルス周期を１０〜２００Ｈｚの範囲に設定でき、Ｄｕｔｙを１〜１００％の範囲に設定できる。
【００７６】
本実施例では、上記の導入装置を用いて、標的細胞への選択分子の導入を実施した。まず、アフリカミドリザル腎臓由来の細胞（Ｃｏｓ７）を標的細胞として、直径６０ｍｍの培養プレート（ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｐｌａｔｅ）にまき、３７℃、二酸化炭素５％条件下で一晩培養した。培養細胞数は１ｗｅｌｌあたり１×１０6個で培養を開始した。標的細胞がプレート上によくはりついていることを確認後、培養プレートから培地を除去して、細胞表面に３０μＬの緑色蛍光蛋白質（Greeen Fluorescent Protein、本明細書においてＧＦＰとも記載する）発現プラスミド液を加え、表１に示すさまざまな条件で選定分子を含む液体に電流を流しプラスミドの導入を行った。なお、プラスミド液中のＤＮＡ濃度はリン酸緩衝生理食塩水（Phosphate Buffered Saline、以下ＰＢＳと略す。）３０μＬ中１μｇとなるように調製した。
【００７７】
なお、実施例１においては、図４（ａ）の上面図に示すように正電極１１、負電極１２を３本ずつ配置し、計６本の電極を配置した導入装置を使用した。選定分子を含む液体を保持するシャーレの直径は３５ｍｍであり、電極間の距離は約３５ｍｍの範囲である。
【００７８】
また、実施例２においては、正電極１１、負電極１２を片側に２本ずつ配置し、計４本の電極を配置した導入装置を使用した。選定分子を含む液体を保持するシャーレの直径は３５ｍｍであり、電極間の距離は約３５ｍｍであった。
【００７９】
また、実施例３〜６においては、図２（ａ）に示すように正電極１１、負電極１２を片側に１本ずつ配置し、計２本の電極を配置した導入装置を使用した。選定分子を含む液体を保持するシャーレの直径は３５ｍｍであり、電極間の距離は約３５ｍｍであった。
【００８０】
表１に記載の各条件で電流を流した後、標的細胞に直ちに培地を加えて一晩培養し、蛍光顕微鏡を用いてＧＦＰの発現を観察し、視野あたりの発現細胞数を定量化した。その目視による定量化の結果に基づき導入率を判定した。同様に後培養での死滅率を目視による定量化の結果に基づき判定した。結果を表１に示す。表１において「高さ」とは選定分子を含む液体の液面から電極までの高さ（電極と選定分子を含む液体の最短距離）を示している。
【００８１】
【表１】
【００８２】
表１に示すように、いずれの条件においても細胞内にＧＦＰの発現が観察された。導入効率としては、実施例１で最大の約６０％であり、全て４０％以上の導入率が得られている。また、標的細胞の死亡率は全て１５％以下に抑えられており、実施例１、２においては５％である。このように本発明は、従来のエレクトロポレーション法を用いた導入率は一般に高い効率であるが、標的細胞の死滅率が５０％以上であることと比較して、極めて細胞に障害を与えることなく高い導入率で選定分子を導入することが出来るものであることが分かる。
【００８３】
今回開示された実施の形態および実施例はすべての点で例示であって制限的なものではないと考えられるべきである。本発明の範囲は上記した説明ではなくて特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲と均等の意味および範囲内でのすべての変更が含まれることが意図される。
【符号の説明】
【００８４】
１ 電極、１１ 正電極、１２ 負電極、１３ 第２の正電極、１４ 第２の負電極、２ 電源、２１ 整流器、２２ 抵抗、３ シャーレ、４ 標的細胞または標的組織、５ 選定分子を含む液体、６ 放電。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的細胞または標的組織内への選定分子の導入方法およびそれに用いる導入装置に関する。より詳しくは、遺伝子等のポリヌクレオチドや蛋白質、生理活性分子等の選定分子を細胞内に導入する方法および細胞の融合方法またはこれらのための装置に関する。
【０００２】
また、本発明は、標的細胞または標的組織の細胞融合方法およびそれに用いる細胞融合装置に関する。
【背景技術】
【０００３】
近年、ヒトゲノムおよびマウスゲノムの解読がほぼ完了し、医学、薬学などの分野において、遺伝子工学関連の研究開発や医薬品開発を行なう際に、ＤＮＡ、ＲＮＡなどのポリヌクレオチドまたはその誘導体、シグナル伝達蛋白質や転写調節因子などの蛋白質やその誘導体などの高分子化合物、低分子生理活性物質、薬剤候補品などの選定分子を標的細胞または標的組織内に導入し、標的細胞または標的組織内での遺伝子の機能や生理活性分子の生理的な活性を試験する必要が増している。
【０００４】
現在のところ、標的細胞への選定分子の導入方法としては、エレクトロポレーション法、ジーンガン法、リポソーム法、細胞融合法、ウイルスベクター法などの方法が用いられているが、必ずしも十分に選定分子を細胞内に導入できるものではないという問題がある。
【０００５】
たとえば、エレクトロポレーション法やジーンガン法においては、多くの種類の標細細胞に応用できるが、操作が煩雑であり、かつ大多数の細胞が死滅するという問題がある。更に、これらの方法では本来標的細胞が保持する遺伝子に障害を与えることが知られており、本来標的細胞が保持する機能が失われることがしばしば起こることが知られている。また、リポソーム法や細胞融合法においては、応用できる標的細胞の種類が限定されるといった問題がある。さらに、ウイルスベクター法においては、応用できる標的細胞の種類が限定されるとともに、ベクターの構築に非常に多くの時間と労力とコストを要するという問題がある。
【０００６】
また、いずれの方法においても、すべての標的細胞への選定分子の導入効率が必ずしも十分に満足できる水準ではないばかりでなく、本来細胞が持つ機能が失われたり、癌化するなどの問題もある。
【０００７】
しかし、ヒトゲノムおよびマウスゲノムの解読がほぼ完了し、機能未知な遺伝子の機能解析が急務となっているばかりでなく、遺伝子治療や再生医療では欠損した遺伝子や過剰発現している遺伝子を抑制することで、病気の根本治療を行うことができることから、細胞や組織に障害を与えることなく高効率で選定分子を導入する方法が必要不可欠な技術として、医薬品業界をはじめとする産業界からその開発を強く求められる状況となっている。
【０００８】
ここで、標的細胞に障害を与えず選定分子を導入方法するためには、これまでの選定分子を含む液体中に直接電流を流し細胞に穴を開けることで遺伝子を導入させたり、リポソームに包まれた選定分子を膜に融合させて導入する方法では細胞膜に傷をつけるばかりでなく細胞内の遺伝子までも傷をつけることになってしまい、治療のための装置としては不適当であることから、もっぱら遺伝子治療では無毒化したウイルスベクターを用いて研究や臨床試験が行われていた。しかしながら無毒化したウイルスとても野性型のウイルスとの組み換えや染色体遺伝子の特定の場所に組み込まれることで、毒性や発ガン性を引き起こすことがわかってきた。そのためには細胞に障害を与えることなくかつ余分な試薬を用いず高効率に選定分子を導入させる機械的な方法の開発が待たれていた。
【０００９】
一方で、近年、遺伝子工学関連の研究開発や医薬品開発を行なう際に、同種のまたは異種の標的細胞を融合させることにより、さまざまな標的細胞の機能を試験する必要も同様に増しつつある。また、特定の細胞種に囚われる事ない細胞融合方法の開発が強く望まれている。
【００１０】
現在のところ、標的細胞の細胞融合方法としては、不活性化したセンダイウイルス、麻疹ウイルス、ニューカッスル病ウイルスなどを用いる方法、リゾレシチン、グリセロールオレイン酸エステル、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などを用いる方法、エレクトロポレーション法などの方法が用いられているが、必ずしも十分に細胞融合させることができるものではないという問題がある。
【００１１】
たとえば、エレクトロポレーション法においては、効率よく遺伝子を導入させる条件での細胞障害性が高く、また細胞の表現型が変わってしまうという問題ばかりでなく、分化した細胞（増殖能の低い細胞）への導入効率が低いと言う問題点がある。また、不活性化したウイルスを用いる方法においては、応用できる標的細胞の種類が限定されるといった問題や発ガン性などの問題がある。
【００１２】
上記のような問題を改善するための技術として、国際公開２００２／０６４７６７号パンフレット（特許文献１）、国際公開２００４／０１５１０１号パンフレット（特許文献２）には、細胞や選定分子を低温ガスプラズマで処理することにより細胞の近傍に存在する選定分子を細胞内に導入する方法、および、細胞を低温ガスプラズマで処理することにより細胞を融合する方法が開示されている。しかし、かかる方法は低温ガスプラズマの発生装置が必要であり、ガスを吹きつけるために細胞が乾燥し死滅してしまったり、均一な処理が難しいなどの点で、必ずしも十分なものとはいえなかった。また、選定分子の導入率についてもさらなる向上が求められていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】国際公開２００２／０６４７６７号パンフレット
【特許文献２】国際公開２００４／０１５１０１号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明の目的は、標的細胞または標的組織に障害を与えることなくまた本来持つ標的細胞または標的組織の機能を失わせることなくさまざまな種類の標的細胞または標的組織内へのさまざまな選定分子の高効率な遺伝子の導入が可能で、遺伝子治療および再生医療になどの医療機器として利用可能である、標的細胞または標的組織内への選定分子の導入方法、および、それに用いる導入装置を提供することである。
【００１５】
また、本発明の他の目的は、さまざまな種類の標的細胞または標的組織の高効率な細胞融合が可能である、標的細胞または標的組織の細胞融合方法、および、それに用いる細胞融合装置を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は、標的細胞または標的組織内へ選定分子を導入する方法であって、前記選定分子を含む液体と前記標的細胞または標的組織とを接触させるステップと、前記液体から離間して設けられた複数の電極から前記液体に放電することにより前記液体中に電流を流すステップとを順に備える、標的細胞または標的組織内への選定分子導入方法である。
【００１７】
前記複数の電極間にプラズマ放電を発生させないことが好ましい。
前記複数の電極間に数ｋＶ〜３０ｋＶの電圧を印加することが好ましい。
【００１８】
前記選定分子が分子量が５０００Ｄａ以上の生体高分子であることが好ましい。
前記生体高分子が、ポリヌクレオチド、タンパク質またはペプチドであることが好ましい。
【００１９】
また、本発明は、標的細胞または標的組織内への選定分子の導入装置であって、前記選定分子含む液体および前記標的細胞または標的組織を収容するための容器と、複数の電極と、前記電極から前記選定分子を含む液体に電流を流すための電圧を前記電極に供給する電圧供給手段とを備えた、標的細胞または標的組織内への選定分子導入装置にも関する。
【００２０】
前記電極が、前記電極と前記液体との間の最短距離が１０ｍｍ以下であり、前記電極が前記液体に接触しないように設けられることが好ましい。
【００２１】
前記電圧供給手段は前記電極と接続した直流または交流の電源であり、該電源と前記電極を接続する接続回路に整流器、抵抗、コイルまたはコンデンサを有することが好ましい。
【００２２】
さらに、本発明は、標的細胞の細胞融合方法であって、複数の前記標的細胞を液体に接触させるステップと、前記液体から離間して設けられた複数の電極から前記液体に放電することにより前記液体中に電流を流すステップとを備える、標的細胞の細胞融合方法にも関する。
【００２３】
さらに、本発明は、標的細胞の細胞融合装置であって、液体および複数の前記標的細胞を収容するための容器と、複数の電極と、前記電極から前記液体に電流を流すための電圧を前記電極に供給する電圧供給手段とを備えた、標的細胞の細胞融合装置にも関する。
【発明の効果】
【００２４】
本発明の選定分子の導入方法および導入装置によれば、さまざまな種類の標的細胞または標的組織内へのさまざまな選定分子の高効率な遺伝子の導入が可能である。
【００２５】
また、本発明の細胞融合方法および細胞融合装置によれば、さまざまな種類の標的細胞の高効率な細胞融合が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】本発明の選定分子の導入方法を説明するフローチャートである。
【図２】本発明の導入装置の一例を説明する概略図である。
【図３】本発明の導入装置の一例を説明する概略斜視図である。
【図４】本発明の導入装置の一例を説明する概略上面図である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
以下、実施の形態を示して本発明をより詳細に説明する。
＜標的細胞または標的組織内への選定分子の導入方法＞
図１は、本発明の標的細胞または標的組織内への選定分子の導入方法を説明するフローチャートである。
【００２８】
本発明の標的細胞または標的組織内への選定分子の導入方法は、前記選定分子を含む液体と前記標的細胞または標的組織とを接触させるステップ（例えば、図１のステップＳ１０１〜Ｓ１０２）と、前記液体から離間して設けられた複数の電極から前記液体に放電することにより前記液体中に電流を流すステップ（例えば、図１のステップＳ１０３〜１０５）と、を順に備える標的細胞または標的組織内への選定分子の導入方法である。
【００２９】
図１を用いて、本発明の標的細胞または標的組織内への選定分子の導入方法の一例を説明する。まず、標的細胞または標的組織を前培養後（ステップＳ１０１）、培養液を完全に除去し、標的細胞または標的組織上に選定分子を含む微量の水溶液を添加する（ステップＳ１０２）ことが好ましい。あるいは切除してきた組織切片あるいは直接組織上に選定分子を含む微量の水溶液を添加することが望ましい。
【００３０】
次に、この選定分子を含む微量の水溶液に放電により電流を流すことのできる領域に複数の電極を設置する（ステップＳ１０３）。そして、複数の電極の間に電圧を供給（印加）することにより（ステップＳ１０４）、複数の電極の間において標的細胞または標的組織上の選定分子を含む水溶液中を電流が流れることとなる（ステップＳ１０５）。
【００３１】
また、本発明において、選定分子が細胞に導入される場合には、選定分子を導入した標的細胞を後培養する（ステップＳ１０６）ことが好ましい。さらに、他の付加的なステップが備わっていてもよく、たとえば、標的細胞を後培養する（ステップＳ１０６）ことの後に、さらに選定分子の導入された標的細胞をスクリーニングしてもよい。
【００３２】
＜標的細胞＞
本発明の選定分子の導入方法において用いる標的細胞とは、選定分子を導入する標的となる細胞のことを示し、特に特定の種類の細胞に限定されるものではない。このような標的細胞の具体例としては、ヒト以外の動物細胞、ヒト以外の動物個体、ヒトの個体から採取された細胞、ヒトの個体内の細胞、ヒトの個体、植物細胞、微生物細胞などが挙げられる。これらの標的細胞は、単一の種類を用いてもよいし、二種以上を混合して用いてもよい。
【００３３】
なお、上記のヒトの個体から採取された細胞には、医薬品の研究開発などに用いられるヒトの個体に戻すことを前提としない細胞と、再生医療などに用いられるヒトの個体に戻すことを前提とする細胞とが含まれる。また、上記のヒトの個体から採取された細胞には、ヒトの個体から採取された細胞から培養された細胞も含まれる。
【００３４】
さらに、上記のヒト以外の動物細胞および植物細胞には、個体内に存在する細胞と、組織内に存在する細胞と、個体や組織から採取された細胞と、個体や組織から採取された細胞から培養された細胞とが含まれる。
【００３５】
ここで、上記とは別の側面から捉えれば、本発明に用いる標的細胞には、大腸菌、放線菌、枯草菌などの原核細胞や、酵母、ヒト以外の動物細胞、ヒトの個体から採取された細胞、ヒトの個体に含まれる細胞、植物細胞などの真核細胞が含まれる。
【００３６】
さらに、本発明に用いる標的細胞には、赤血球ゴーストやリポソームなどの脂質二重膜構造をもつものも含まれる。
【００３７】
また、本発明に用いる標的細胞は、特に処理を施されていないものであってもよいが、選定分子の導入効率を向上するためには、遺伝子導入の際に一般的に用いられる、コンピータント細胞としての処理を施されたものであってもよい。具体例としては、塩化カルシウムで処理され、細胞膜の構造が変化してＤＮＡ分子を透析しやすくなった大腸菌のコンピータント細胞などが挙げられる。
【００３８】
＜標的組織＞
一方、本発明に用いられる標的組織とは、選定分子を導入する標的となる組織のことを示し、特に特定の種類の組織に限定されるものではない。このような標的組織の具体例としては、移植に用いられるドナーからの臓器、再生医療の方法を用いて再構成された皮膚や歯根などの組織、カルス培養で構築された植物に分化前の組織、などが挙げられる。これらの標的組織は、単一の種類を用いてもよいし、二種以上を混合して用いてもよい。
【００３９】
＜導入される選定分子＞
本発明の標的細胞または標的組織内への選定分子の導入方法において用いる選定分子とは、標的細胞または標的組織に導入するために選定した分子のことを示し、特に特定の種類の分子に限定されるものではない。このような選定分子の具体例としては、ＤＮＡ、ＲＮＡなどのポリヌクレオチドまたはその誘導体、シグナル伝達蛋白質や転写調節因子などの蛋白質やペプチドとその誘導体などの高分子化合物があげられ、これらの中でも、分子量が５０００Ｄａ以上の生体高分子であることが好ましい。
【００４０】
また、上記のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの誘導体には、ベクター、アンチセンスポリヌクレオチド、デコイポリヌクレオチド、リボザイム、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡなどが含まれる。ポリヌクレオチドの分子量は特に限定されないが、細胞障害性を低く抑えかつ効率よく導入させるという理由から、１００万Ｄａ以下であることが好ましい。
【００４１】
さらに、上記の蛋白質分子、蛋白質分子誘導体には、シグナル伝達因子や、転写調節因子、各種酵素、各種受容体、抗体あるいは抗体のＦａｂ部分などが含まれる。
【００４２】
他の選定分子としては、低分子生理活性物質、薬剤候補品などが挙げられ、これらの中でも医薬品などの生理活性な低分子化合物であって、他の導入方法では組織内あるいは細胞内に導入されづらい低分子化合物が好ましい。他の導入方法では組織内あるいは細胞内に導入されづらい低分子化合物とは、分子量が１０００Ｄａ以上の低分子、膜透過性の低い分子、などである。
【００４３】
なお、上述の各種選定分子は、単一の種類を用いてもよいし、二種以上を混合して用いてもよい。
【００４４】
＜選定分子を含む液体と前記標的細胞または標的組織とを接触させるステップ＞
本発明の選定分子の導入方法において、選定分子を含む液体と前記標的細胞または標的組織とを接触させるステップについて、標的として細胞を用いる場合をより詳細に説明する。
【００４５】
本発明の選定分子の導入方法において、選定分子を含む液体と前記標的細胞とを接触させるステップは、標的細胞を前培養するステップ（図１のステップＳ１０１）および選定分子を含む液体を添加するステップ（図１のステップＳ１０２）を含むことが好ましい。
【００４６】
標的細胞の前培養（ステップＳ１０１）の方法は、特に限定されないが、プレートなどの細胞培養容器上で培養した培養接着細胞や、培養液中に懸濁した状態で標的細胞を培養する方法が挙げられる。前培養に用いる培地は、標的細胞を培養することのできる組成の培地であれば特に限定されるものではないが、たとえば寒天培地をはじめとする固体培地や試験管やフラスコ内の液体培地などが挙げられる。
【００４７】
次に、前培養された標的細胞、たとえば、プレートなどの細胞培養容器上で培養した培養接着細胞や、培養液中に懸濁している標的細胞を遠心分離または濾過などの操作により分離して、培養液を除去する。
【００４８】
次に、選定分子を含む液体を添加する際（ステップＳ１０２）には、たとえば選定分子を含む液体を標的細胞を薄く覆うように添加することが好ましい。選定分子を含む液体は、特に限定されるものではないが、たとえば選定分子を含む水溶液または懸濁液であることが好ましい。また、該水溶液または懸濁液の溶媒または分散媒としては、たとえば生理食塩水やｐＨ緩衝溶液などが挙げられる。
【００４９】
なお、標的細胞に選定分子を含む液体を接触させる際には、たとえば標的細胞または標的細胞に選定分子を含む液体を滴下する方法、標的細胞または標的組織と、選定分子を含む液体とを混合する方法などを用いることができる。また、選定分子を含む液体と標的細胞または標的組織とを接触させる別の方法としては、標的細胞または標的組織を含む分散液または懸濁液等に選定分子を含む液体を添加する方法も用いることができる。
【００５０】
＜選定分子を含む液体中に電流を流すステップ＞
本発明の選定分子の導入方法における、選定分子を含む液体から離間して設けられた複数の電極から選定分子を含む液体に放電することにより選定分子を含む液体中に電流を流すステップについて、より詳細に説明する。
【００５１】
本発明において、選定分子を含む液体から離間して設けられた複数の電極から液体に放電することにより選定分子を含む液体中に電流を流すステップは、特に限定されるものではないが、選定分子を含む液体への放電により該液体中に電流を流すことのできる領域に複数の電極を設置するステップ（図１のステップＳ１０３）、複数の電極の間に電圧を印加するステップ（図１のステップＳ１０４）、および、複数の電極と選定分子を含む液体との間で放電を発生させることにより標的細胞または標的組織と接した選定分子を含む液体中を電流が流れるステップ（図１のステップＳ１０５）を含むことが好ましい。このステップにより標的細胞または標的組織に選定分子が導入される。
【００５２】
電極を設置するステップ（ステップＳ１０３）においては、シャーレ等の容器中に標的細胞または標的組織と選定分子を含む液体とが保持された状態で、選定分子を含む液体に放電により電流を流すことのできる領域に複数の電極が設置されることが好ましい。
【００５３】
ここで、上記容器は、標的細胞または標的組織と選定分子を含む液体を保持することのできる構造であれば特に限定されるものではないが、たとえばプレート、シャーレ、チューブ、試験管、フラスコなどが挙げられる。
【００５４】
複数の電極の間に電圧を印加（供給）するステップ（ステップＳ１０４）においては、複数の電極の間に数ｋＶ〜数十ｋＶ程度の電圧を印加することが好ましく、さらに好ましくは２ｋＶ〜３０ｋＶであり、最も好ましくは５〜２０ｋＶである。数十ｋＶよりも高い電圧で電流を流すと、標的細胞または標的組織の死滅率が高くなってしまい、逆に、数ｋＶよりも低い電圧で電流を流すと選定分子の導入率を向上させる効果を得ることができない。
【００５５】
複数の電極からの放電により選定分子を含む液体中に電流を流すステップ（ステップＳ１０５）は、上記複数の電極の間に電圧を供給するステップにより、ほぼ同時に達成されるステップである。かかる電圧の印加により、選定分子を含む液体に離間して設けられた電極と選定分子を含む液体との間で放電を行わせることで、上記選定分子を含む液体に電流を流してもよく、選定分子を含む液体に接触して設けられた電極と選定分子を含む液体との間で直接的に電流を流してもよい。
【００５６】
選定分子を含む液体に電流を流す時間は、１〜１００ｍｓであることが好ましく、さらに好ましくは３〜２０ｍｓである。１００ｍｓよりも長い時間電流を流すと、標的細胞または標的組織の死滅率が高くなってしまい、逆に、１ｍｓよりも短い時間の通電では選定分子の導入率を向上させる効果を得ることができない。
【００５７】
このようにして、選定分子を含む液体に高電圧の電流を短時間流すことにより、選定分子の導入率を著しく向上させ、標的細胞または標的組織の死滅率を格段に低減することが可能となる。
【００５８】
＜導入装置＞
図２は、図１に示す本発明の選定分子の導入方法に用いられる本発明の導入装置を説明する概略図である。なお、本発明の導入装置の構造は、図２に示す構造に限定されるものではない。
【００５９】
ここで、図２（ａ）に記載される本発明の導入装置は、上述した本発明の選定分子導入方法および後述する本発明の細胞融合方法に好適に用いられる構造および機能を有している。図２（ａ）に示す本発明の導入装置は、２本の針状の電極１と電源（電圧供給手段）２と、容器３とを備えている。該電源２により、２本の電極間に電圧を印加することができる。
【００６０】
特に、図２（ａ）に記載される本発明の導入装置に備えられた複数の電極１は、上記選定分子を含む液体に離間して設けられており、複数の電極間に電圧を印加することにより該電極と上記選定分子を含む液体との間で放電を行わせることで、上記選定分子を含む液体に電流を流すことを特徴とするものである。
【００６１】
なお、本発明の導入装置は、本発明の選定分子の導入方法において、標的細胞または標的組織４と接触した選定分子を含む液体５に電極１からの放電により電流を流すことのできる領域に電極１が設置されていることを特徴としている。図２（ａ）においては、電極１は選定分子を含む液体５と離間して設けられており、電極１は選定分子を含む液体５との間に放電６を生じさせることにより、選定分子を含む液体に電極からの電流を流すことができる位置に電極１が設置されている。電極１と選定分子を含む液体５とは、両者の間の最短距離が１０ｍｍ以下であり、かつ両者が接触しないように設置されている。電極１と選定分子を含む液体５との間の最短距離は、０．１〜１０ｍｍであることが好ましく、さらに好ましくは０．１ｍｍ〜３ｍｍである。このように、電極１と選定分子を含む液体５とを互いに接触しないように設置することにより、電極を使用毎に清掃する必要がなく、電極の腐食を防止することができる。
【００６２】
また、本発明においては、直接的に電極間でプラズマ放電が発生しないように複数の電極間の距離や電極間に印加される電圧が調整されることが好ましい。電極間でプラズマ放電が発生すると、大気圧でのプラズマが不安定であるために選定分子を含む液体中を流れる電流も不安定となり、選定分子の導入効率等も不安定となるためである。なお、このような複数の電極間の距離や電極間に印加される電圧の好適な範囲は、選定分子を含む液体の電気抵抗などに影響されるものであり一概に決定することはできないが、通常の選定分子を含む水溶液を用いる場合、複数の電極のうち任意の２対の電極間の距離が０．３〜６０ｍｍであることが好ましく、任意の２対の電極間に印加される電圧は２〜３０ｋＶであることが好ましい。
【００６３】
また、本発明において、上記電極から上記選定分子を含む液体に電流を流すための電圧を上記電極に供給する電圧供給手段は、特に限定されるものではないが、たとえば高圧電源ＦＰ１０００（パール工業株式会社製）などの電源供給装置が挙げられる。電源が交流電源である場合の交流波の波形は、正弦波、半波整流、全波整流、パルスのいずれも用いることができる。
【００６４】
本発明の導入装置に用いられる電極の形状は、特に限定されるものではないが、電極から選定分子を含む液体に放電するために必要以上の電圧を印加する必要がないようにするために、選定分子を含む液体５側を先端とする針形状等の形状であることが好ましい。また、電極の材質は、特に限定されるものではないが、タングステン、モリブデンなどが挙げられ、腐食しにくい材質や、金、銀、プラチナ等の殺菌効果のある材質であることが好ましい。
【００６５】
本発明の導入装置に用いられる電極の数は２つ以上であるが、電極の数は６以上であることが好ましい。電極の数を６以上とすることにより、試料回転等の操作を必要とせずに導入を均一化することが可能となり、より選定分子の導入率が向上し、標的細胞または標的組織の死亡率も低減される。
【００６６】
また、本発明の導入装置に用いられる電極の数は、図３（ａ）に示すように正電極と負電極の数が同じとなるようにしてもよく、図３（ｂ）に示すように正電極と負電極の数が異なるようにしてもよい。なお、図３のように複数の電極を配置する場合においては、特定の電極に電流が集中してしまい均一な選定分子の導入が妨げられないよう、電源２と電極１の間に抵抗２２を設けて、電流が均一に流れるように調整することが好ましい。なお、抵抗２２の代わりにコイルやコンデンサ等を使用してよい。
【００６７】
このように、本発明の導入装置に用いられる電極の数が３以上である場合の電極の配置としては、例えば、図４（ａ）〜（ｄ）の上面図にしめすような配置が挙げられる。電極の配置は、図４（ａ）は正電極１１と負電極１２が３本ずつ左右均等に配置された構成であってもよく、図４（ｂ）のように１本の正電極１１と３本の負電極１２が不均等に配置された構成であってもよい。また、図４（ｃ）に示すように中心に正電極１１を配置し、その周囲に複数の負電極１２を配置するような構成であってもよく、正電極１１と負電極１２が逆の構成であってもよい。さらに、電源を複数使用した構成としてもよく、図４（ｄ）に示すように第１の電源に接続された正電極１１と負電極１２、および、第２の電極に接続された第２の正電極１３と第２の負電極１４からなるような電極構成をとることもできる。
【００６８】
なお、本発明の導入装置の構造は、本実施の形態で説明した構造に限定されるものではなく、たとえば電極の数や設置形態は、本実施の形態と同様の効果が得られるのであれば、互いに異なる他の形状であってもよい。また、図２（ｂ）に示されるように整流器２１を電源２と一方の電極１との間に設けてもよい。
【００６９】
本発明によれば、ガスの噴きつけ等を必要としないため標的細胞または標的組織がほとんど乾燥せず、余計な緩衝液等の添加が不要となる。また、短時間（１０ｍｓ程度）での処理が可能となり、電極構成も特別な構成を必要とせず簡素化することができる。
【００７０】
＜標的細胞の細胞融合方法＞
本発明の標的細胞の細胞融合方法は、複数の標的細胞を液体に接触させるステップと、前記液体から離間して設けられた複数の電極から前記液体に放電することにより前記液体中に電流を流すステップと、を備える、標的細胞の細胞融合方法である。
【００７１】
本発明の標的細胞の細胞融合方法は、上記の本発明の選定分子の導入方法において説明した方法と基本的に同様の各ステップを有する方法であり、同様に他の付加的ステップを備えていることが好ましい。各ステップの内容については、上記の本発明の選定分子の導入方法において説明しているため、説明は繰り返さない。
【００７２】
また、本発明の標的細胞の細胞融合方法は、上記の本発明の選定分子の導入方法と同様の種類の標的細胞を用いることが好ましい。標的細胞の種類については、上記の本発明の選定分子の導入方法において説明しているため、説明は繰り返さない。
【００７３】
さらに、本発明の標的細胞の細胞融合方法は、上記の本発明の選定分子の導入方法と同様の導入装置を用いることが好ましい。すなわち、液体および複数の前記標的細胞を収容するための容器と、複数の電極と、前記電極から前記液体に電流を流すための電圧を前記電極に供給する電圧供給手段とを備えた、標的細胞の細胞融合装置を用いることが好ましい。導入装置の構造および機能については、上記の本発明の選定分子の導入方法において説明しているため、説明は繰り返さない。
【実施例】
【００７４】
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。以下の実施例においては、全て標的細胞としてアフリカミドリザル腎臓由来の細胞（Ｃｏｓ７）を使用した。また、整流器は全て半波のものを使用した。
【００７５】
本実施例では動物樹立細胞株への標的分子の導入を試みた。本実施例を行うにあたり、まず、図３（ａ）に示すような本発明の導入装置を作製した。電極１としては、縫い針を使用し、抵抗２２として金属皮膜抵抗器を使用し、電源２としてＦＰ１０００（パール工業株式会社製）を使用した。本導入装置においては、電極間電圧を数ｋＶ〜十数ｋＶの範囲に設定でき、周波数を２０〜４０ｋＨｚの範囲に設定でき、パルス周期を１０〜２００Ｈｚの範囲に設定でき、Ｄｕｔｙを１〜１００％の範囲に設定できる。
【００７６】
本実施例では、上記の導入装置を用いて、標的細胞への選択分子の導入を実施した。まず、アフリカミドリザル腎臓由来の細胞（Ｃｏｓ７）を標的細胞として、直径６０ｍｍの培養プレート（ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｐｌａｔｅ）にまき、３７℃、二酸化炭素５％条件下で一晩培養した。培養細胞数は１ｗｅｌｌあたり１×１０6個で培養を開始した。標的細胞がプレート上によくはりついていることを確認後、培養プレートから培地を除去して、細胞表面に３０μＬの緑色蛍光蛋白質（Greeen Fluorescent Protein、本明細書においてＧＦＰとも記載する）発現プラスミド液を加え、表１に示すさまざまな条件で選定分子を含む液体に電流を流しプラスミドの導入を行った。なお、プラスミド液中のＤＮＡ濃度はリン酸緩衝生理食塩水（Phosphate Buffered Saline、以下ＰＢＳと略す。）３０μＬ中１μｇとなるように調製した。
【００７７】
なお、実施例１においては、図４（ａ）の上面図に示すように正電極１１、負電極１２を３本ずつ配置し、計６本の電極を配置した導入装置を使用した。選定分子を含む液体を保持するシャーレの直径は３５ｍｍであり、電極間の距離は約３５ｍｍの範囲である。
【００７８】
また、実施例２においては、正電極１１、負電極１２を片側に２本ずつ配置し、計４本の電極を配置した導入装置を使用した。選定分子を含む液体を保持するシャーレの直径は３５ｍｍであり、電極間の距離は約３５ｍｍであった。
【００７９】
また、実施例３〜６においては、図２（ａ）に示すように正電極１１、負電極１２を片側に１本ずつ配置し、計２本の電極を配置した導入装置を使用した。選定分子を含む液体を保持するシャーレの直径は３５ｍｍであり、電極間の距離は約３５ｍｍであった。
【００８０】
表１に記載の各条件で電流を流した後、標的細胞に直ちに培地を加えて一晩培養し、蛍光顕微鏡を用いてＧＦＰの発現を観察し、視野あたりの発現細胞数を定量化した。その目視による定量化の結果に基づき導入率を判定した。同様に後培養での死滅率を目視による定量化の結果に基づき判定した。結果を表１に示す。表１において「高さ」とは選定分子を含む液体の液面から電極までの高さ（電極と選定分子を含む液体の最短距離）を示している。
【００８１】
【表１】
【００８２】
表１に示すように、いずれの条件においても細胞内にＧＦＰの発現が観察された。導入効率としては、実施例１で最大の約６０％であり、全て４０％以上の導入率が得られている。また、標的細胞の死亡率は全て１５％以下に抑えられており、実施例１、２においては５％である。このように本発明は、従来のエレクトロポレーション法を用いた導入率は一般に高い効率であるが、標的細胞の死滅率が５０％以上であることと比較して、極めて細胞に障害を与えることなく高い導入率で選定分子を導入することが出来るものであることが分かる。
【００８３】
今回開示された実施の形態および実施例はすべての点で例示であって制限的なものではないと考えられるべきである。本発明の範囲は上記した説明ではなくて特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲と均等の意味および範囲内でのすべての変更が含まれることが意図される。
【符号の説明】
【００８４】
１ 電極、１１ 正電極、１２ 負電極、１３ 第２の正電極、１４ 第２の負電極、２ 電源、２１ 整流器、２２ 抵抗、３ シャーレ、４ 標的細胞または標的組織、５ 選定分子を含む液体、６ 放電。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的細胞または標的組織内へ選定分子を導入する方法であって、
前記選定分子を含む液体と前記標的細胞または標的組織とを接触させるステップと、
前記液体から離間して設けられた複数の電極から前記液体に放電することにより前記液体中に電流を流すステップと
を順に備える、標的細胞または標的組織内への選定分子導入方法。
【請求項２】
前記複数の電極間にプラズマ放電を発生させない、請求項１に記載の選定分子導入方法。
【請求項３】
前記複数の電極間に数ｋＶ〜３０ｋＶの電圧を印加する、請求項１に記載の選定分子導入方法。
【請求項４】
前記選定分子が分子量が５０００Ｄａ以上の生体高分子である、請求項１に記載の選定分子導入方法。
【請求項５】
前記生体高分子が、ポリヌクレオチド、タンパク質またはペプチドである、請求項４に記載の選定分子導入方法。
【請求項６】
標的細胞または標的組織内への選定分子の導入装置であって、
前記選定分子含む液体および前記標的細胞または標的組織を収容するための容器と、
複数の電極と、
前記電極から前記選定分子を含む液体に電流を流すための電圧を前記電極に供給する電圧供給手段と
を備えた、標的細胞または標的組織内への選定分子導入装置。
【請求項７】
前記電極が、前記電極と前記液体との間の最短距離が１０ｍｍ以下であり、前記電極が前記液体に接触しないように設けられた、請求項６に記載の選定分子導入装置。
【請求項８】
前記電圧供給手段は前記電極と接続した直流または交流の電源であり、該電源と前記電極を接続する接続回路に整流器、抵抗、コイルまたはコンデンサを有する、請求項６に記載の選定分子導入装置。
【請求項９】
標的細胞の細胞融合方法であって、
複数の前記標的細胞を液体に接触させるステップと、
前記液体から離間して設けられた複数の電極から前記液体に放電することにより前記液体中に電流を流すステップと
を備える、標的細胞の細胞融合方法。
【請求項１０】
標的細胞の細胞融合装置であって、
液体および複数の前記標的細胞を収容するための容器と、
複数の電極と、
前記電極から前記液体に電流を流すための電圧を前記電極に供給する電圧供給手段と
を備えた、標的細胞の細胞融合装置。
【請求項１】
標的細胞または標的組織内へ選定分子を導入する方法であって、
前記選定分子を含む液体と前記標的細胞または標的組織とを接触させるステップと、
前記液体から離間して設けられた複数の電極から前記液体に放電することにより前記液体中に電流を流すステップと
を順に備える、標的細胞または標的組織内への選定分子導入方法。
【請求項２】
前記複数の電極間にプラズマ放電を発生させない、請求項１に記載の選定分子導入方法。
【請求項３】
前記複数の電極間に数ｋＶ〜３０ｋＶの電圧を印加する、請求項１に記載の選定分子導入方法。
【請求項４】
前記選定分子が分子量が５０００Ｄａ以上の生体高分子である、請求項１に記載の選定分子導入方法。
【請求項５】
前記生体高分子が、ポリヌクレオチド、タンパク質またはペプチドである、請求項４に記載の選定分子導入方法。
【請求項６】
標的細胞または標的組織内への選定分子の導入装置であって、
前記選定分子含む液体および前記標的細胞または標的組織を収容するための容器と、
複数の電極と、
前記電極から前記選定分子を含む液体に電流を流すための電圧を前記電極に供給する電圧供給手段と
を備えた、標的細胞または標的組織内への選定分子導入装置。
【請求項７】
前記電極が、前記電極と前記液体との間の最短距離が１０ｍｍ以下であり、前記電極が前記液体に接触しないように設けられた、請求項６に記載の選定分子導入装置。
【請求項８】
前記電圧供給手段は前記電極と接続した直流または交流の電源であり、該電源と前記電極を接続する接続回路に整流器、抵抗、コイルまたはコンデンサを有する、請求項６に記載の選定分子導入装置。
【請求項９】
標的細胞の細胞融合方法であって、
複数の前記標的細胞を液体に接触させるステップと、
前記液体から離間して設けられた複数の電極から前記液体に放電することにより前記液体中に電流を流すステップと
を備える、標的細胞の細胞融合方法。
【請求項１０】
標的細胞の細胞融合装置であって、
液体および複数の前記標的細胞を収容するための容器と、
複数の電極と、
前記電極から前記液体に電流を流すための電圧を前記電極に供給する電圧供給手段と
を備えた、標的細胞の細胞融合装置。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２０１０−２２０５１７（Ｐ２０１０−２２０５１７Ａ）
【公開日】平成２２年１０月７日（２０１０．１０．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−７０１０１（Ｐ２００９−７０１０１）
【出願日】平成２１年３月２３日（２００９．３．２３）
【出願人】（５９１２８８０５６）パール工業株式会社 (6)
【出願人】（５０５４６７７８６）ＢＢＫバイオ株式会社 (1)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１０月７日（２０１０．１０．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年３月２３日（２００９．３．２３）
【出願人】（５９１２８８０５６）パール工業株式会社 (6)
【出願人】（５０５４６７７８６）ＢＢＫバイオ株式会社 (1)
【Ｆターム（参考）】
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