機能性分子が導入された有機磁性ナノ複合体
【課題】 生体内に投与した後、目的部位に特異的且つ効率的に集積し、各種癌および疾病を含む部位を特異的且つ安全に検出・診断することができるＭＲＩ造影剤として又は磁場療法に利用することができる安定な有機磁性ナノ複合体を提供すること。
【解決手段】 水溶性のカルボキシアルキルエーテル化多糖によって被覆された、１０〜１００ｎｍの範囲内の全体直径を有する磁性金属酸化物ナノ粒子と、該多糖にリンカーを介して共有結合された部位特異的機能性分子とからなる有機磁性ナノ複合体。
【解決手段】 水溶性のカルボキシアルキルエーテル化多糖によって被覆された、１０〜１００ｎｍの範囲内の全体直径を有する磁性金属酸化物ナノ粒子と、該多糖にリンカーを介して共有結合された部位特異的機能性分子とからなる有機磁性ナノ複合体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核磁気共鳴イメージング（以下、ＭＲＩと略記する）により、各種の疾病、癌などの病巣部位を特異的に検出することができる造影剤として、或いは高周波磁場を照射することにより病巣部位の温度を上昇させおよび／または細胞攪乱して病巣部位のみを選択的且つ特異的に死滅させる処置において有用な機能性分子が導入された有機磁性ナノ複合体に関する。
【背景技術】
【０００２】
適切な形態に処方された磁性粒子、例えばデキストランマグネタイトは、それを生体に投与し、それが集中する特定部位の生体内組織や体液をＭＲＩにより検出する画像診断や、生体に投与した後外部から電磁波を照射して特定部位に集中したデキストランマグネタイトの温度を局所的に上昇させる温熱療法において利用しうることが知られており、磁性粒子の一部は既に製品化されており、例えばＭＲＩ造影剤として臨床での診断に使用されている。しかし、デキストランマグネタイトは、生体内に投与された後、その大部分が血管循環を経て、肝臓などの細網内皮系（ＲＥＳ）に取り込まれるため、肝臓癌の検診などにその用途が限られており、また、最近、血管造影剤やリンパ節造影剤としての使用も試みられているが、依然として対象疾病がごく狭い範囲に限られているという問題がある。
【０００３】
一方、デキストランマグネタイトに代表される磁性ナノ粒子の表面に、生体内組織や病変部位を特異的に認識する物質である部位特異的機能性分子を導入することにより、ＭＲＩなどによる画像診断や温熱治療をより広範な疾病に適用できるようにする試みがいくつかなされている。例えば、非特許文献１には、デキストラン被覆した超常磁性の単結晶性酸化鉄ナノ粒子（ＭＩＯＮ）に過ヨウ素酸ナトリウムを作用させた後、脳腫瘍特異的モノクローナル抗体と結合させてなる複合体のＭＲＩによる脳腫瘍特異的診断への応用可能性について開示されている。また、非特許文献２には、デキストラン被覆した単結晶性酸化鉄ナノ粒子（ＭＩＯＮ）をコレサイトカイニン（ＣＣＫ）と共に超音波処理することにより得られるＣＣＫで標識したＭＩＯＮの膵臓特異的ＭＲＩ造影剤としての応用について開示されている。さらに、非特許文献３には、デキストラン被覆した超常磁性酸化鉄ナノ粒子（ＭＩＯＮ）にエピクロルヒドリンおよびアンモニアを作用させてアミノ基を導入した後、３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸Ｎ−スクシニミジルと反応させ、次いでＨＩＶ−ｔａｔタンパク質由来のペプチドを結合させてなる複合体の標的細胞の細胞内磁性標識への応用について開示されている。
【０００４】
特許文献１には、オリゴヌクレオチド、ポリペプチド又は多糖と磁性ナノ粒子との複合体が標的分子に結合すると凝集し、ＮＭＲ緩和能力が変化することを利用して標的分子を検出することが開示されている。
【０００５】
一方、特許文献２には、場合によりリン脂質によってリポソーム状に包囲した磁性鉄系酸化物微粒子を主成分とする感熱発熱体を用いた生体内部加熱装置が開示されている。
【０００６】
しかしながら、上記の複合体は、生体内における安定性、生体に対する安全性、標的部位への到達効率などに問題があり、製品化はもとより、臨床応用できる水準にも達していない。
【特許文献１】米国特許出願公開第２００３／００９２０２９号明細書
【特許文献２】特開平１１−５７０３１号公報
【非特許文献１】L.G.Remsenet.al.,American J. Neuroradiology, 17, 411 (1996)
【非特許文献２】P.Reimeret.al.,Radiology, 193, 527 (1994)
【非特許文献３】L.Josephson et.al.,Bioconjugate Chem., 10, 186 (1999)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の主たる目的は、生体に投与可能で且つ病巣などの標的部位に的確且つ効率的に到達させることができる、部位特異的なＭＲＩ診断および／または高周波磁場照射による磁場治療を可能とする、機能性分子が導入された有機磁性ナノ複合体を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記の目的を達成すべく鋭意検討を重ねた結果、今回、磁性ナノ粒子として水溶性のカルボキシアルキルエーテル化多糖によって被覆された磁性金属酸化物ナノ粒子を使用し且つそれに該多糖にリンカーを介して機能性分子を導入することにより、安定性や安全性のみならず、標的部位への特異的到達効率が格段に向上した有機磁性ナノ複合体が得られることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
かくして、本発明によれば、水溶性のカルボキシアルキルエーテル化多糖によって被覆された、１０〜１００ｎｍの範囲内の全体直径を有する磁性金属酸化物ナノ粒子と、該多糖にリンカーを介して共有結合された部位特異的機能性分子とからなる有機磁性ナノ複合体が提供される。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の有機磁性ナノ複合体は、各種疾病ないし癌の病巣部位のＭＲＩ診断用造影剤、局所磁場治療剤などとして有用である。
【００１１】
以下、本発明の部位特異的機能性分子が導入された有機磁性ナノ粒子複合体（以下、導入磁性ナノ複合体と略記することがある）についてさらに詳細に説明する。
【００１２】
本発明の導入磁性ナノ複合体は、原料である水溶性のカルボキシアルキルエーテル化多糖によって被覆された磁性ナノ粒子（以下、原料磁性ナノ粒子と略記することがある）にリンカーを介して部位特異的機能性分子を共有結合させることにより製造することができる。
【００１３】
原料磁性ナノ粒子
原料磁性ナノ粒子は、安定性、生体安全性及び細網内皮系に取込まれにくい性質を有することに加えて、粒子表面上に部位特異的な機能性分子をリンカーを介して結合させるための官能基が存在することが必要であり、かかる要件を満たす原料磁性ナノ粒子として、本発明では、水溶性のカルボキシルアルキルエーテル化多糖で被覆された磁性金属酸化物超微粒子、例えば、特許第２７２６５２０号公報に記載された多糖類のカルボキシルアルキルエーテルと磁性金属酸化物との複合体を使用するものである。
【００１４】
本発明で使用する原料磁性ナノ粒子については、特許第２７２６５２０号公報の引用を以てその詳細な記述に代え、ここではその概要をのべるにとどめる。
【００１５】
原料磁性ナノ粒子を構成する一方の成分である磁性金属酸化物コア粒子としては、下記式（１）
（ＭIIＯ)ｌ・Ｍ2IIIＯ3 ・・・（１）
式中、ＭIIは２価の金属原子を表し、ＭIIIは３価の金属原子を表し、ｌは０〜１の範
囲内の数である、
で示されるものを挙げることができる。上記式（１）において、２価の金属原子ＭIIとしては、例えば、マグネシウム、カルシウム、マンガン、鉄、ニッケル、コバルト、銅、亜鉛、ストロンチウム、バリウム等が挙げられ、これらはそれぞれ単独で使用することができ又は２種もしくはそれ以上を組み合わせて使用することもできる。また、３価の金属原子ＭIIIとしては、例えば、アルミニウム、鉄、イットリウム、ネオジウム、サマリウム、ユーロピウム、ガドリウム等が挙げられ、これらはそれぞれ単独で使用することができ又は２種もしくはそれ以上組み合わせて用いることもできる。
【００１６】
磁性金属酸化物コア粒子としては、中でも、上記式（１）においてＭIIIが３価の鉄である磁性金属酸化物、すなわち下記式（２）
（ＭIIＯ)ｍ・Ｆｅ2Ｏ3 ・・・（２）
式中、ＭIIは上記と同義であり、ｍは０〜１の範囲内の数である、
で示されるフェライトが好適である。ここで、ＭIIとしては前記式（１）で例示したのと同じ金属原子を挙げることができる。特に、ＭIIが２価の鉄である場合の上記式（２）の磁性金属酸化物、すなわち下記式（３）
（ＦｅＯ)ｎ・Ｆｅ2Ｏ3 ・・・（３）
式中、ｎは０〜１の範囲内の数である、
で示される磁性酸化鉄は、本発明において更に好適な磁性金属酸化物として挙げることができる。なお、上記式（３）において、ｎ＝０の場合はγ−酸化鉄（γ−Ｆｅ2Ｏ3）であり、また、ｎ＝１の場合はマグネタイト（Ｆｅ3Ｏ4）である。なお、本発明において、磁性金属酸化物には、結晶水を有する磁性金属酸化物も包含される。
【００１７】
原料磁性ナノ粒子を構成する他の成分、すなわち、上記磁性金属酸化物コア粒子を被覆するための水溶性のカルボキシアルキルエーテル化多糖（還元多糖を含む、以下同様）としては、例えば、グルコースポリマーであるデキストラン、デンプン、グリコーゲン、セルロース、プルラン、カードラン、シゾフィラン、レンチナン、ペスタロチアン等；フルクトースポリマーであるイヌリン、レバン等；マンノースポリマーであるマンナン等；ガラクト−スポリマーであるアガロース、ガラクタン等；キシロースポリマーであるキシラン；Ｌ−アラビノースポリマーであるアラビナン等の多糖類のカルボキシアルキルエーテル化物が挙げられ、中でも、グルコースポリマーのカルボキシアルキルエーテル化物、特にデキストラン、デンプン又はプルランのカルボキシアルキルエーテル化物が好ましく、さらに特に、カルボキシアルキルエーテル化デキストランが好適である。
【００１８】
カルボキシアルキルエーテル化多糖のアルキル部分は低級アルキルであることができ、例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル等が挙げられるが、好ましくはメチルである。また、そのカルボキシル基は塩の形態をとることができ、塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、アンモニウム塩やアミン塩などが挙げられるが、好ましくはナトリウム塩である。更に、カルボキシアルキルエーテル化多糖の置換度は、一般に、単糖単位当り０．０５〜０．５、好ましくは０．１〜０．３の範囲内である。
【００１９】
カルボキシアルキルエーテル化多糖は、分子量が低すぎると複合体の安定性が低下したり、生体内での異物反応が強くなり、逆に分子量が高すぎると、複合体の多糖含量が大きくなりすぎるので、一般に、１，０００〜１００，０００、好ましくは３，０００〜５０，０００、更に好ましくは５，０００〜２０，０００の範囲内の数平均分子量を有するものが適している。
【００２０】
原料磁性ナノ粒子は、特許第２７２６５２０号公報に記載の方法に従い、例えば、磁性金属酸化物コア粒子を予め調製し、次いでそれにカルボキシアルキルエーテル化多糖を反応させる２ステップ法、又はカルボキシアルキルエーテル化多糖の存在下に磁性ナノ粒子を合成する１ステップ法により製造することができるが、本発明においては、幅広い性質
を有する原料磁性ナノ粒子を製造することができる１ステップ法がより好ましい。具体的には、まず、カルボキシアルキルエーテル化多糖の水溶液中に、予め２価の金属鉱酸塩および３価の金属鉱酸塩の混合溶液を加えた後、室温ないし加温下でＮａＯＨ、ＫＯＨ、ＮＨ4ＯＨ等の塩基を中性ないし弱アルカリ性になるまで加え、１時間程度の加熱還流を行うことにより金属酸化物コアとそれを被覆するカルボキシアルキルエーテル化多糖との複合体を形成せしめることができる。金属酸化物コアに結合されなかった遊離のポリマーは、部位特異的機能性分子の導入効率を低下させる可能性があるので、冷却後、例えば、有機溶媒による分別沈殿、限外濾過、ゲル濾過などの方法により、副生する塩類とともに可能な限り除去することが好ましい。
【００２１】
かくして得られる原料磁性ナノ粒子において、磁性金属酸化物コア粒子は、通常、１〜２０ｎｍ、好ましくは２〜１０ｎｍ、更に好ましくは３〜８ｎｍの範囲内の平均直径を有することができる。本明細書において、原料磁性ナノ粒子のコアの粒子直径は透過型電子顕微鏡で測定され、平均直径は２００個の粒子直径の平均値である。
【００２２】
原料磁性ナノ粒子を構成するカルボキシアルキルエーテル化多糖と磁性金属酸化物コアの割合は、カルボキシアルキルエーテル化多糖／磁性金属酸化物コア中の金属の重量比で、通常１／１０〜４／１、好ましくは２／１０〜２／１、更に好ましくは３／１０〜１／１の範囲内が適している。
【００２３】
原料磁性ナノ粒子の全体粒子径は、生体内における細網内皮系の発達した臓器である肝臓等による取り込みを避けるなど観点から、小粒子径のものが好ましく、具体的には、通常１０〜１００ｎｍ、特に１５〜５０ｎｍ、更に特に１５〜４０ｎｍの範囲内が好適である。本明細書において、原料磁性ナノ粒子の全体粒子径は、動的光散乱法に従いレーザー光散乱測定装置によって測定した時の値である。
【００２４】
また、原料磁性ナノ粒子のＴ1及びＴ2緩和能力は、ＭＲＩによる検出感度向上などの観点から、高いことが好ましく、Ｔ1緩和能力は一般に５〜５０(mM・sec)-1、特に１０〜５０(mM・sec)-1の範囲内にあり、Ｔ2緩和能力は一般に１０〜３００(mM・sec)-1、特に５０〜２００(mM・sec)-1の範囲内にあることが好ましい。本明細書において、Ｔ1およびＴ2緩和能力は２０ＭＨｚ（０．４７テスラ）のパルスＮＭＲでＴ1またはＴ2緩和時間を測定し、得られる緩和時間の逆数、即ち１／Ｔ1または１／Ｔ2（sec-1）と測定試料中の金属濃度（ｍＭ）との関係をグラフにプロットし、最小自乗法で求めた直線の傾きから算出される値である。なお、本明細書において測定法の記載がない物性値は、特許第２７２６５２０号公報に記載の方法に従って測定されたものである。
【００２５】
部位特異的機能性分子
本発明に従い上記原料磁性ナノ粒子に導入することができる部位特異的機能性分子（以下、機能性分子と略記することがある）は、生体内の標的部位の種類などに応じて任意に選ぶことができ、標的部位を特異的に認識し、そこに結合ないし集積するような機能ないし性質を有する分子であれば、高分子のものでも低分子のものでの使用することができる。
【００２６】
そのような機能性分子として、具体的には、例えば、各種癌もしくは疾病の原因病巣などの標的部位を特異的に認識し結合ないし集積することができる抗体、ペプチド、ホルモン、糖類、病変特異的に代謝・分解される基質等が挙げられる。これら中、導入磁性ナノ複合体の安定性や安全性、製造の容易さなどの観点から、比較的低分子の機能性分子、特に分子量が１０，０００以下のペプチド、ホルモン、糖類などの部位特異的機能性をもつ有機分子が好ましい。化学合成が容易で、その組成を自由に変換することが可能であり、エンドトキシンの可能性が低く且つ原料磁性ナノ粒子との結合量を正確かつ容易に調節することができる等の実用上多くの利点を有することから、ペプチドが殊に適している。
【００２７】
本発明において使用することができるペプチドとしては、例えば、特開２００３−０１８９９４号公報に開示されているＲＥＴ発現細胞に特異的に結合するペプチド（以下、ＲＢＰ−１という）、米国特許出願公開第２００５／１５４１８７号明細書に開示されているＶＥＧＦのＫＤＲ受容体に結合するペプチド（以下、ＫＤＲ−ＢＰという）、NATURE MEDICINE, 9(9), 1173-1179 (2003) に記載されている膵臓β細胞上に発現する受容体に結合するペプチド（以下、ＧＬＰ−１という）、Biochem. Biophys. Res. Comm., 320, 18-26 (2004) に記載されている細胞核内移行機能を有するペプチド（以下、Ｃ４５Ｄ１８という）などが挙げられる。
【００２８】
導入磁性ナノ複合体の製造
本発明の導入磁性ナノ複合体は、以上に述べた原料磁性ナノ粒子と部位特異的機能性分子とをリンカーを介し共有結合させることにより製造することができる。
【００２９】
リンカーとしては、例えば、一端に、原料磁性ナノ粒子表面のカルボキシアルキルエーテル多糖中の官能基、特にカルボキシル基や水酸基と共有結合することができる官能基（ａ）を有し、且つ他端に、機能性分子中の官能基、例えば、アミノ基、ＳＨ基、カルボキシル基、水酸基などと共有結合することができる官能基（ｂ）を有する直鎖状もしくは分岐鎖状の有機化合物、例えば、脂肪族炭化水素や、アビジン、ストレプトアビジンなどが挙げられる。上記官能基（ａ）としては、例えば、カルボキシル基と共有結合可能な求核性基、特に、強固なアミド結合を形成しうるアミノ基、水酸基と共有結合可能な活性エステル基などが挙げられ、また、上記官能基（ｂ）としては、例えば、ピリジニルジスルフィド基、マレイミド基、オレフィン基、活性エステル基、アミノ基などが挙げられ、これら官能基（ｂ）のうち、ピリジニルジスルフィド基、マレイミド基、オレフィン基はＳＨ基と結合し、活性エステル基はアミノ基や水酸基などの求核性基と結合し、そしてアミノ基は活性エステル基のような求電子性基と結合することができる。
【００３０】
官能基（ｂ）としては、機能性分子の大多数が抗体、ホルモン、ペプチドなどのアミノ酸単位から構成される物質であることから、これらの物質がもつ機能に実質的に影響を与えないことを考慮し、特に、アミノ酸中の存在量が少ない官能基、例えばＳＨ基に対して結合する基を選ぶことが好ましく、例えば、ＳＨ基と強固なＣ−Ｓ結合を特異的かつ容易に形成しうる基であるマレイミド基が好適である〔Walker,TetrahedronLetters, 35(5), 665-668 (1994)参照〕。
【００３１】
原料磁性ナノ粒子への部位特異的機能性分子の導入に際してＳＨ基を利用することができる場合に使用可能なリンカーとして、具体的には、例えば、下記式（４）
Ｈ2Ｎ−(ＣＨ2)ｎ−Ｘ ・・・（４）
式中、Ｘはマレイミド基、ピリジニルジスルフィド基、オレフィン基及び活性エステル
基から選ばれる基であり、ｎは１〜１５、好ましくは２〜１０、特に２である、
で示される化合物が好適である。
【００３２】
上記式（４）の中でも、Ｘがマレイミド基である下記式（５）で示されるリンカーは、アミノ基がカルボキシアルキルデキストランのカルボキシル基とアミド結合を形成して強固に結合するとともに、マレイミド基が機能性分子中のＳＨ基と特異的かつ強固なＣ−Ｓ結合を形成するので、導入磁性ナノ複合体の化学的安定性や機能性分子の機能発現などの観点から特に好適に使用することができる。
【００３３】
【化１】
したがって、上記式（５）のリンカーを用いて機能性分子と原料磁性ナノ粒子とを結合する場合において、原料の機能性分子中にＳＨ基が存在しないとき、例えばＫＤＲ−ＢＰ、ＲＢＰ−１、ＧＬＰ−１のようなペプチドについては、機能性分子の化学構造中に、例えば、ペプチドのＣ末端側にグリシル−グリシル−システインを結合せしめることにより、予めＳＨ基を導入することができる。これにより、上記のマレイミド系リンカーを利用して原料磁性ナノ粒子に機能性分子を容易に導入することができる。
【００３４】
かかるリンカーを介しての機能性分子と原料磁性ナノ粒子との結合は、それ自体既知の方法に従って行うことができ、例えば、まず、原料磁性ナノ粒子にリンカーを結合させ、次いでそのリンカーに機能性分子を結合させてもよく、または逆に、機能性分子にリンカーを結合させ、次いでそのリンカーに原料磁性ナノ粒子を結合させるようにしてもよい。
【００３５】
また、アビジン及びストレプトアビジンはビオチン４分子と特異的且つ強固に結合する。したがって、部位特異的機能性分子の導入にＳＨ基を利用することができないような場合には、リンカーとしてアビジンまたはストレプトアビジンを使用し、それを原料磁性ナノ粒子上のカルボキシル基に例えばアミド結合により結合せしめ、一方、機能性分子の末端にはビオチンを導入しておき、アビジン−ビオチン結合により強固に結合せしめることにより、原料磁性ナノ粒子に機能性分子を導入することができる。
【００３６】
原料磁性ナノ粒子に導入することができる機能性分子は、１種のみに限られるものではなく、導入磁性ナノ粒子の用途などに応じて２種もしくはそれ以上の機能性分子を導入することもでき、それによって検出診断することができる疾病の範囲を広くすることができる。
【００３７】
原料磁性ナノ粒子へのリンカーの結合量は、粒子１個あたり１〜３０個、好ましくは５〜２５個、更に好ましくは５〜２０個の範囲内であることができる。導入されるリンカーの結合量の測定方法は、その構造や導入方法によって異なるが、上記式（５）のマレイミド系リンカーの結合量は、例えば、次のようにして測定することができる。
【００３８】
マレイミド系リンカーの結合量の測定法：
まず、リンカーを結合せしめた原料磁性ナノ粒子のバッファー溶液を適当に希釈して試料液とする。この試料液に対し過剰の既知量のグルタチオンを添加し、リンカーと結合させる。次に、その溶液を限外濾過して未結合のグルタチオンを回収する。この未結合グルタチオンの量を、Ｅｌｌｍａｎ試薬〔Ellman, G. L., Arch. Biochem. Biophysic. 74, 443 (1958)参照〕として知られるＳＨ基検出試薬を用いて定量し、結合グルタチオンの量、即ち、リンカー量を算出する。
【００３９】
また、原料磁性ナノ粒子に対する機能性分子の導入量は、導入磁性ナノ粒子の用途などに応じて変えることができるが、一般には、粒子１個あたり１〜３０個、好ましくは５〜２５個、更に好ましくは５〜２０個の範囲内であることができる。機能性分子の導入量の測定方法は、その構造や導入方法によって異なるが、本発明において最も好ましく用いられるＳＨ基を有するペプチドの場合には、例えば、次のようにしてその導入量を測定することができる。
【００４０】
ＳＨ基を有するペプチドの導入量の測定法：
原料磁性ナノ粒子にリンカーを介して結合したペプチドの量は、ＳＨ基の一般的な定量法を応用することによって測定することができる。即ち、リンカーを結合させた原料磁性ナノ粒子に既知量のペプチドを反応させた後、限外濾過により回収・精製した未反応ペプチドを、前述のＥｌｌｍａｎ試薬を用いて定量し、結合ペプチド量を逆算することによりペプチドの導入量を求めることができる。
【００４１】
原料磁性ナノ複合体への機能性分子の導入は、さらに、例えば、米国特許第４４５２７７３号明細書、欧州特許第０４５２３４２号明細書、米国特許第５４９２８１４号明細書、Weissleder et.al.,Bioconjugate Chem, ,10, 186-191 (1999)などの文献に記載の方法によって行うこともできる。
【００４２】
導入磁性ナノ複合体
かくして得られる導入磁性ナノ複合体は、原料磁性ナノ粒子がもつ物理的及び／又は化学的性質を実質的に維持しており、好ましい態様において、磁性金属酸化物コアの粒子径、カルボキシアルキルエーテル化多糖／磁性金属酸化コア中の金属の重量比、全体粒子径及びＴ1及びＴ2緩和能力はほとんど変動せず、それぞれ３０％以内の変動幅内で維持されていることが望ましい。ここで、全体粒子径は、例えばＣＭＤＭ等の原料磁性ナノ粒子単体では溶液のＰＨ変動によってその数値が大きく変化することはないが、導入磁性ナノ複合体については、溶液のＰＨ変動によりその数値が大きく変化することがある。これは、タンパクなどのコロイド粒子において一般的に多く見られる現象であるが、最適ＰＨを選択することにより、前述のごとく原料磁性粒子単体の時の数値に対しほぼ同値となり、３０％以内の変動に留めることができる。本明細書において、本発明の導入磁性ナノ複合体の全体粒子径はこれを意味する。
【００４３】
有用性
本発明により提供される導入磁性ナノ複合体は、生理学的に許容される水性磁性ゾルの状態で静脈内に投与された時に、実質的に凝集したりすることがなく、標的部位に特異的に集積するという顕著な特性を有しており、各種疾病ないし癌などの病巣部位のＭＲＩ診断用造影剤や高周波磁場照射による局所磁場治療剤などとして極めて有用である。
【００４４】
本発明の導入磁性ナノ複合体をＭＲＩ造影剤又は磁場治療剤として用いる場合、導入磁性ナノ複合体は水性ゾルの形で使用することが好ましい。水性ゾル中の導入磁性ナノ複合体の濃度は、その用途などに応じて広範囲にわたって変えることができるが、通常、金属換算で約０．１〜約２ｍｏｌ／Ｌ、特に０．３〜２ｍｏｌ／Ｌの範囲内が適している。また、該水性ゾルには、必要に応じて、例えば、塩化ナトリウム等の無機塩；ブドウ糖等の単糖類；マンニトール、ソルビトール等の糖アルコール類；乳酸、クエン酸塩、酒石酸塩等の有機酸塩；リン酸緩衝剤、トリス緩衝剤等の生理学的に許容される種々の助剤を添加することもできる。
【００４５】
本発明の導入磁性ナノ複合体をＭＲＩ造影剤として使用する場合、その投与量は、診断部位などによって異なるが、通常、金属換算で約１μｍｏｌ／ｋｇ（体重）〜約１０ｍｍｏｌ／ｋｇ（体重）、好ましくは約２μｍｏｌ／ｋｇ（体重）〜約１ｍｍｏｌ／ｋｇ（体重）、更に好ましくは約５μｍｏｌ／ｋｇ（体重）〜約１００μｍｏｌ／ｋｇ（体重）の範囲内である。投与は、例えば、静脈内、動脈内などへの注射、注入などにより行うことできるが、場合によっては、経口投与、腸内直接投与、膀胱内投与なども可能である。
【００４６】
本発明の好ましい形態の導入磁性ナノ複合体は、保存安定性に優れており、例えば、静脈投与すると、導入機能性分子の性質に従って、特異的且つ効率的に数分ないし２４時間
後には目的部位に集積し、ＭＲＩ撮像により病変部位の診断が好適に行われる。
【００４７】
一方、本発明の導入磁性ナノ複合体を磁場治療剤として使用する場合、その投与量は、処置すべき患者の症状の軽重、年齢、治療部位などによって異なるが、通常、金属換算で約１０μｍｏｌ／ｋｇ（体重）〜約１０ｍｍｏｌ／ｋｇ（体重）、好ましくは約２０μｍｏｌ／ｋｇ（体重）〜約１ｍｍｏｌ／ｋｇ（体重）の範囲内である。投与は、前述のＭＲＩ造影剤の場合と同様、例えば、静脈内、動脈内などへの注射、注入などにより行うことができるが、場合によっては、治療部位への直接投与も可能である。
【００４８】
本発明の好ましい形態の導入磁性ナノ複合体は、保存安定性に優れており、例えば、静脈投与すると、導入機能性分子の性質に従い、特異的且つ効率的に数分ないし２４時間後には目的部位に集積し、高周波磁場照射を実施することにより病変部位の治療が好適に行われる。照射する高周波磁場の周波数としては、一般に２０ＫＨｚ〜１０ＭＨｚ、好ましくは５０ＫＨｚ〜１ＭＨｚ、更に好ましくは１００〜５００ＫＨｚの範囲内が適当である。また、磁場強度としては、一般に１ｍＴ以上、好ましくは５ｍＴ以上、更に好ましくは１０ｍＴ以上が適切である。
【００４９】
本発明の導入磁性ナノ複合体の臨床的意義
近年、ＭＲＩ診断下での高周波焦点照射が可能になり、病変に対するピンポイント温熱療法が施行されている。本発明の導入磁性ナノ複合体を用いるＭＲＩによる微少病変の画像化は、このピンポイント療法を行う際のナビゲーターとなり、より精度の高い治療法の実現が可能になるものと期待される。
【００５０】
原料磁性ナノ粒子に標的機能性分子を結合させ、ＭＲＩによる画像化を試みることは、幾つかの分子種について試みられてきた。例えば、モノクローナル抗体を用いることにより特異性の高い標的化が可能になる。しかし、抗体を臨床に応用する際、ヒト型抗体に変換させることが必須であることや、使用できるモノクローナル抗体の数が限られていること、また、１分子当たりの分子量が大きいために原料磁性ナノ粒子に対して再現性よく結合させるためのシステムが煩雑なこと、さらには、抗体を調製する際にエンドトキシンの混在を完全に防ぐことが困難なこと等、解決しなければならない問題が多く残されている。
【００５１】
本発明は、標的機能性分子としてペプチドを使用することを可能とし、それによって上記の如き問題を一挙に解決し、ＭＲＩによる標的画像化を一般化することに成功したものである。ペプチドは化学合成によりエンドトキシンが混在しない状態で大量に取得することができ、また、アミノ酸配列を自由に変化させることにより結合性や特性性の異なるペプチドを探索することも可能であり、本発明の導入磁性ナノ複合体は潜在的に大きな可能性を有している。
【００５２】
以下、本発明に従い原料磁性ナノ粒子に導入される４種のペプチド、即ち、ＫＤＲ−ＢＰ、ＲＢＰ−１、ＧＬＰ−１及びＣ４５Ｄ１８について、それぞれのペプチドに関する概略及び期待される臨床応用性について説明する。
【００５３】
ＫＤＲ−ＢＰ
癌細胞の増殖には栄養血管を必要とし、例えば、転移巣が直径１〜２ｍｍを越えて増殖するためには新生血管の増殖を伴うことが知られている（Folkman Nat. Med., 1, 27-31, 1995）。新生血管は血管内皮細胞が増殖することで形成されるが、血管内皮細胞の増殖には血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ−２）とそのレセプターであるＶＥＧＦ−２レセプター（ＫＤＲ）が必須因子として関与している。したがて、ＫＤＲを標的機能性分子とすることにより、癌転移巣を標的化することが考えられる。実際、ＫＤＲを標的としたＤＮＡワクチンの有効性も報告された（Niethammer et al., Nat. Med. 12, 1369-1375, 2002）。
【００５４】
本発明は、ＫＤＲに結合性を示すペプチド（ＫＤＲ−ＢＰ）（Hetian et al., J. Biol. Chem. 277, 43137-43142, 2002）を原料磁性ナノ粒子に結合させ、転移巣をＭＲＩで画像化することを１つの目的としており、、ＫＤＲ−ＢＰが導入された磁性ナノ複合体を用いれば、臨床的に転移巣を検出することが可能となり、癌転移患者のＱＯＬを最大限温存させながら治療を行うことが可能になる。
【００５５】
ＲＢＰ−１
小児癌の中で最も予後の悪い癌として神経芽腫が上げられる。神経芽腫ではレセプター型チロシンキナーゼＲＥＴが高頻度に発現している。２９例の腫瘍組織中全例でＲＥＴ遺伝子の発現が認められる（Nagao et at., Jpn. J. Cancer Res. 81, 309-312, 1990）一方、１１例の同細胞株中１０例で発現が認められた（Ikeda I, Oncogene, 9, 1291-1296,
1990）。また、ＲＥＴに結合するモノクローナル抗体を用いることにより、神経芽腫細胞選択的な遺伝子導入も可能になっている（Yano et al., Human Gene Therapy 11, 995-1004, 2000.）。このように特異性の高い分子標的を可能にするためにＲＥＴ細胞外ドメインに結合するペプチド（ＲＢＰ−１）が同定されている（特開２００３−０１８９９４号公報）。ＲＢＰ−１は８個のアミノ酸（ＫＡＧＲＧＲＤＲ、アミノ酸を一文字で表記）からなるペプチドであり、中心のアルギニンをアラニンに置換したペプチド（ＫＡＧＡＧＡＤＲ）はＲＥＴに対する結合性を示さない。即ち、中心部に位置する正荷電にチャージしたアミノ酸がＲＥＴに対する結合に必須であることが分かっている。
【００５６】
かくして、本発明に従いＲＢＰ−１が導入された磁性ナノ複合体を用いれば、ＭＲＩの画像化により、例えば小骨盤腔に局在し、外科的な治療が行うことができないような神経芽腫を正確に診断した後、加療することが可能になるものと期待される。
【００５７】
ＧＬＰ−１
膵臓癌は症状が認められる時点ではすでに後腹壁に浸潤し、外科的手術が困難である例が多く、究めて予後の悪い悪性腫瘍として位置づけられている。ＧＬＰ−１（Glucagon like peptide-1）は、消化管ペプチドホルモンであり、膵臓細胞にその受容体が発現している（Thorens, Proc. Natl. acad. Sci. USA 89, 8641-8645, 1992）。
【００５８】
本発明に従いＧＬＰ−１が導入された磁性ナノ複合体を用いることによりＭＲＩ診断が可能になれば、膵臓癌の早期診断が可能になることが期待される。また、糖尿病症例において膵臓組織の変化を検出することが可能になることも期待される。
【００５９】
Ｃ４５Ｄ１８
本ペプチドはＨＩＶ−１の遺伝子産物の一つであるＶｐｒ（Viral protein R）に由来する２７個のアミノ酸からなる。Ｖｐｒは９６個のアミノ酸からなり、細胞の培養液に添加されると、数時間以内に細胞の中に取り込まれ、核内にまで運搬されることが知られている。この現象を司る領域としてＣ末側４５個のアミノ酸のうち、Ｃ末端１８個のアミノ酸を欠失させた部分（Ｃ４５Ｄ１８）が同定されている（Taguchi et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 320, 18-26, 2004）。さらにこの機能を用いて、静止マクロファージに対する遺伝子導入が可能になったことが報告されている（Mizoguchi et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 338, 1499-1506, 2005）。このように細胞に容易に取り込まれる性質を用いることにより、体内で血液が貯留する部分の画像化が可能になると期待される。具体的な応用例として癌病変の画像化が上げられる。癌部の血管は、透過性が亢進しており、血管内から低分子化合物やナノ粒子が血管外に漏出することが知られている。このような現象はＥＰＲ（Enhanced permeation and retension）と呼ばれ、癌部の血管
が正常組織の血管とは異なる性質を有していることが示唆されている。このＥＰＲ効果を利用して、近年ナノ粒子によるＤＤＳが試みられ、有効な治療成績が報告されている。
【００６０】
したがて、本発明に従ってＣ４５Ｄ１８が導入された磁性ナノ複合体を用いれば、それが血管外に漏出し、その後速やかに細胞内に取り込まれ、腫瘍病変をＭＲＩにより描出することが可能になると期待される。また、該Ｃ４５Ｄ１８が導入された磁性ナノ複合体を用いれば、癌部だけではなく、解離性動脈瘤等の血管病変で、血液が停留している病変をＭＲＩによって画像化でき、早期の診断が可能になって症状の進行を未然に防止することが可能になり、患者予後が改善されるものと期待される。
【実施例】
【００６１】
以下、本発明を参考例、実施例、試験例等によりさらに具体的に説明する。
【００６２】
参考例１： 原料磁性ナノ粒子の合成
カルボキメチル置換度０．２０及び平均分子量約１０，０００のカルボキメチルデキストラン（以下ＣＭＤ）５１７ｇを水１４００ｍｌに溶解し、これに１Ｍ−塩化第二鉄水溶液１０１０ｍｌに塩化第一鉄・四水和物９７．６ｇを窒素気流下で溶解した水溶液を加え、さらに約８０℃に加温しながら、攪拌下に３規定水酸化ナトリウム水溶液１９４４ｍｌを添加する。次いで、６規定塩酸を加えｐＨを７．０に調整した後、１時間３０分加熱還流する。冷却後、１８８０Ｇで３０分間遠心分離し、上清を限外濾過（分画分子量５０，０００ダルトン）を行って、目的とするカルボキシメチルデキストランマグネタイト（以下ＣＭＤＭ）水性ゾル １８００ｍｌを得た。
鉄濃度：４４．２ｍｇ／ｍｌ（鉄収率８３％）、磁性酸化鉄の粒子径：５．１ｎｍ、全
体の粒子径：４０ｎｍ、ＣＭＤ／鉄重量比：０．７、Ｔ1緩和能力：３２(mM・sec)-1、
Ｔ2緩和能力：１２１(mM・sec)-1。
【００６３】
参考例２： デキストラン被覆磁性ナノ粒子の合成
極限粘度０．０５３ｄｌ／ｇおよび数平均分子量約２，７００のカルボキシデキストラン（以下ＣＤｘ）５１７ｇを水１４００ｍｌに溶解し、これに１Ｍ−塩化第二鉄水溶液５７０ｍｌに塩化第一鉄・四水和物５５．７ｇを窒素気流下で溶解した水溶液を加え、さらに約８０℃に加温しながら、攪拌下に３規定水酸化ナトリウム水溶液９８５ｍｌを添加する。次いで、６規定塩酸を加えｐＨを７．１に調整した後、１時間３０分加熱還流する。冷却後、１８８０Ｇで３０分間遠心分離し、上清を限外濾過（分画分子量５０，０００ダルトン）を行って、目的とするカルボキシデキストランマグネタイト（以下ＡＴＤＭ）水性ゾル７３６ｍｌを得た。
鉄濃度：５９ｍｇ／ｍｌ（鉄収率９０％）、磁性酸化鉄の粒子径：５．０ｎｍ、全体の
粒子径：６８ｎｍ、ＣＤｘ／鉄重量比：０．２７、Ｔ1緩和能力：２７(mM・sec)-1、Ｔ
2緩和能力：２０３(mM・sec)-1。
【００６４】
実施例１： ＫＤＲ−ＢＰの導入
（１） 参考例１で得られたＣＭＤＭ ８ｍｌ（鉄濃度２０ｍｇ／ｍｌ）に、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（以下ＥＤＣ） ６２３ｍｇ、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（以下ＮＨＳ） １８７ｍｇ及びＮ−エチルアミノマレイミド・トリフルオロ酢酸塩２２ｍｇの０．２Ｍ−ホウ酸ナトリウムバッファー溶液８ｍｌを順次添加し、室温にて反応を行う。２０時間後、限外濾過（分画分子量５０，０００ダルトン）を行い、不要な試薬類を除去し、リンカー結合ＣＭＤＭを得た。
（２） （１）で得られたリンカー結合ＣＭＤＭの水溶液に、ＫＤＲ−ＢＰ ９．１ｍｇを添加し、室温にて反応させる。２０時間後、限外濾過（分画分子量５０，０００ダルト
ン）を行い、未結合のペプチドを回収し、定量する。上清を水で希釈した後、システイン１．０ｍｇを添加し、室温にて反応させる。２０時間後、限外濾過（分画分子量５０，０００ダルトン）を行い、上清を０．１Ｍ−リン酸ナトリウムバッファーで８ｍｌに希釈し、ＫＤＲ−ＢＰ−ＣＭＤＭ水性ゾルを得た（複合体番号１）。
鉄濃度：７．３ｍｇ／ｍｌ、ＣＭＤ／鉄重量比：０．５９、全体粒子径：３６ｎｍ（ｐ
Ｈ４）、９７ｎｍ（ｐＨ７）、７３ｎｍ（ｐＨ９）、Ｔ1緩和能力：２８(mM・sec)-1、
Ｔ2緩和能力：１１１(mM・sec)-1、磁性ナノ粒子１個あたりのペプチド導入数：１１
個。
【００６５】
実施例２： ＲＢＰ−１の導入
実施例１において、添加するペプチドをＲＢＰ−１ ９．１ｍｇ、リンカー結合ＣＭＤＭを０．１Ｍ−リン酸ナトリウムバッファー溶液とする以外は実施例１と同様に処理し、ＲＢＰ−１−ＣＭＤＭ水性ゾルを得た（複合体番号２）。
鉄濃度：６．５ｍｇ／ｍｌ、ＣＭＤ／鉄重量比：０．５４、全体粒子径：４５ｎｍ（ｐ
Ｈ７）、Ｔ1緩和能力：２７(mM・sec)-1、Ｔ2緩和能力：１０４(mM・sec)-1、磁性ナノ
粒子１個あたりのペプチド導入数：１３個。
【００６６】
実施例３： ＧＬＰ−１の導入
実施例１において、添加するペプチドをＧＬＰ−１ ５．８ｍｇとする以外は実施例１と同様に処理し、ＧＬＰ−１−ＣＭＤＭ水性ゾルを得た（複合体番号３）。
鉄濃度：７．７ｍｇ／ｍｌ、ＣＭＤ／鉄重量比：０．５３、全体粒子径：３９ｎｍ（ｐ
Ｈ４）、４３ｎｍ（ｐＨ７）、４３ｎｍ（ｐＨ９）、Ｔ1緩和能力：３１(mM・sec)-1、
Ｔ2緩和能力：１１０(mM・sec)-1、磁性ナノ粒子１個あたりのペプチド導入数：５．２
個。
【００６７】
実施例４： Ｃ４５Ｄ１８の導入
実施例１において、添加するペプチドをＣ４５Ｄ１８ ７．６ｍｇとする以外は実施例１と同様に処理し、Ｃ４５Ｄ１８−ＣＭＤＭ水性ゾルを得た（複合体番号４）。
鉄濃度：７．８ｍｇ／ｍｌ、ＣＭＤ／鉄重量比：０．５５、全体粒子径：１０９ｎｍ
（ｐＨ４）、１００ｎｍ（ｐＨ７）、４６ｎｍ（ｐＨ９）、Ｔ1緩和能力：３０(mM・
sec)-1、Ｔ2緩和能力：１１７(mM・sec)-1、磁性ナノ粒子１個あたりのペプチド導入
数：５．９個。
【００６８】
実施例５： マウス投与前処理
実施例１により得られたＫＤＲ−ＢＰ−ＣＭＤＭ（複合体番号１）０．５５ｍｌを、リン酸緩衝生理食塩水で希釈し１０ｍｌとする。これをメンブランフィルター（ポアーサイズ：０．２μｍ）にてろ過滅菌しながらバイアル瓶に充填した（鉄濃度：０．４ｍｇ／ｍＬ）。
【００６９】
実施例６： 製剤例
実施例１により得られたＫＤＲ−ＢＰ−ＣＭＤＭ（複合体番号１） ６．０ｍｌを、遠心限外ろ過（分画分子量５０，０００ダルトン）により１．５ｍｌに濃縮し、これにＤ−マンニトール６４ｍｇ及び１Ｍ−Ｌ−乳酸１６μｌを添加し、更に１Ｍ−塩酸にてｐＨを６．５に調整した。これをメンブランフィルター（ポアーサイズ：０．２μｍ）にてろ過滅菌しながらバイアル瓶に充填し、更に窒素充填した（鉄濃度：２８．７ｍｇ／ｍＬ）。
【００７０】
比較例１： ＫＤＲ−ＢＰの導入
（１） 参考例２で得られたＡＴＤＭ ８ｍｌ（鉄濃度２０ｍｇ／ｍｌ）に、ＥＤＣ ９１ｍｇ、ＮＨＳ ２７ｍｇ及びＮ−エチルアミノマレイミド・トリフルオロ酢酸塩 ６．３ｍｇの０．２Ｍ−ホウ酸ナトリウムバッファー溶液８ｍｌを順次添加し、室温にて反応
を行う。２０時間後、限外濾過（分画分子量５０，０００ダルトン）を行い、不要な試薬類を除去し、リンカー基結合ＡＴＤＭを得た。
（２） （１）で得られたリンカー結合ＡＴＤＭの水溶液に、ＫＤＲ−ＢＰ ４．２ｍｇを添加し、室温にて反応させる。２０時間後、限外濾過（分画分子量５０，０００ダルトン）を行い、未結合のペプチドを回収し、定量する。上清を水で希釈した後、システイン１．０ｍｇを添加し、室温にて反応させる。２０時間後、限外濾過（分画分子量５０，０００ダルトン）を行い、上清を０．１Ｍ−リン酸ナトリウムバッファーで８ｍｌに希釈し、ＫＤＲ−ＢＰ−ＡＴＤＭ水性ゾルを得た（複合体番号５）。
鉄濃度：７．３ｍｇ／ｍｌ、ＣＤｘ／鉄重量比：０．２５、全体粒子径：６７ｎｍ（ｐ
Ｈ７）、Ｔ1緩和能力：２７(mM・sec)-1、Ｔ2緩和能力：１８９(mM・sec)-1、磁性ナノ
粒子１個あたりのペプチド導入数：５．１個。
【００７１】
比較例２： ＲＢＰ−１の導入
比較例１において、添加するペプチドをＲＢＰ−１ ５．２ｍｇ、リンカー結合ＡＴＤＭを０．１Ｍ−リン酸ナトリウムバッファー溶液とする以外は比較例１と同様に処理し、ＲＢＰ−１−ＡＴＤＭ水性ゾルを得た（複合体番号６）。
鉄濃度：７．７ｍｇ／ｍｌ、ＣＤｘ／鉄重量比：０．２２、全体粒子径：６７ｎｍ（ｐ
Ｈ７）、Ｔ1緩和能力：２５(mM・sec)-1、Ｔ2緩和能力：２０５(mM・sec)-1、磁性ナノ
粒子１個あたりのペプチド導入数：８．５個。
【００７２】
上記実施例１〜４及び比較例１、２で得られた複合体番号１〜６の特性をまとめて示せば、下記表１のとおりである。
【００７３】
【表１】
試験例１： 安定性試験
実施例１及び比較例１において、添加するペプチドをグルタチオンとする以外は実施例１及び比較例１と同様に処理することにより、グルタチオン−磁性ナノ複合体を得た（複合体番号７、８）。これら複合体５ｍｌ（鉄濃度０．５ｍｇ／ｍｌ）に、５０ｍＭ塩化カルシウム水溶液を５ｍｌ添加した後、オートクレーブで加熱処理し、溶液の凝集の程度を目視により判定した。なお、溶液が透明な場合を○、凝集している場合を△、沈殿している場合を×とした。その結果を表２に示す。
【００７４】
【表２】
試験例２： ＫＤＲ−ＢＰ ｉｎ ｖｉｔｒｏ
実施例１により得られたＫＤＲ−ＢＰ−ＣＭＤＭ（複合体番号１）および参考例１の原料ＣＭＤＭを、ＫＤＲ陽性培養細胞と陰性培養細胞に、それぞれＦｅとして ８００μｇ／ｍｌ添加した。１２時間後、培養液でリンスし、次いで細胞をプレートから剥がし、アクリルアミドゲルに包埋し、１．５テスラのＭＲＩ装置（ＳＩＥＭＥＮＳ社製）にて、Ｔ2強調画像を撮影した。その結果を図１に示す。図中、Ａ：水のみ、Ｂ：ＣＭＤＭのみ、Ｃ：陰性細胞＋ＣＭＤＭ、Ｄ：陽性細胞＋ＣＭＤＭ、Ｅ：陰性細胞＋ＫＤＲ−ＢＰ−ＣＭＤＭ、Ｆ：陽性細胞＋ＫＤＲ−ＢＰ−ＣＭＤＭである。
【００７５】
この結果、ＫＤＲ陽性細胞にＫＤＲ−ＢＰ−ＣＭＤＭを作用させた検体（図１のＦ）に、磁性体の集積が確認された。
【００７６】
試験例３： ＲＢＰ−１ ｉｎ ｖｉｔｒｏ
実施例２により得られたＲＢＰ−１−ＣＭＤＭ（複合体番号２）と、参考例１の原料ＣＭＤＭを、ＲＥＴ陽性培養細胞と陰性培養細胞に、Ｆｅとして８００μｇ／ｍｌを添加した。１２時間後、培養液でリンスし、次いで細胞をプレートから剥がし、アクリルアミドゲルに包埋し、１．５テスラのＭＲＩ装置（ＳＩＥＭＥＮＳ社製）にて、Ｔ2強調画像を撮影した。その結果を図２に示す。図中、Ａ：水のみ、Ｂ：ＣＭＤＭのみ、Ｃ：陰性細胞＋ＣＭＤＭ、Ｄ：陽性細胞＋ＣＭＤＭ、Ｅ：陰性細胞＋ＫＤＲ−ＢＰ−ＣＭＤＭ、Ｆ：陽性細胞＋ＫＤＲ−ＢＰ−ＣＭＤＭである。
【００７７】
この結果、ＲＥＴ陽性細胞にＲＢＰ−１−ＣＭＤＭを作用させた検体（図２のＦ）に、磁性体の集積が確認された。
【００７８】
試験例４： ＫＤＲ−ＢＰ ｉｎ ｖｉｖｏ
実施例１により得られたＫＤＲ−ＢＰ−ＣＭＤＭ（複合体番号１）を、ＫＤＲ陽性腫瘍と陰性腫瘍を移植したマウスに、Ｆｅとして体重１ｇあたり５μｇ静注し、４時間２０分後に１．５テスラのＭＲＩ装置（ＳＩＥＭＥＮＳ社製）でＭＲＩを撮影した。その結果を図３に示す。図３はマウスホールボディのＴ2強調画像である。
【００７９】
この結果、ＫＤＲ陽性腫瘍（矢印）が陰性腫瘍に対して黒く写り、磁性体が集積していることが確認された。
【００８０】
試験例５： Ｃ４５Ｄ１８ ｉｎ ｖｉｔｒｏ
実施例４で得られたＣ４５Ｄ１８−ＣＭＤＭ（複合体番号４）と、参考例１の原料ＣＭＤＭを、ＨｅＬａ細胞に、Ｆｅとして８００μｇ／ｍｌ添加し、１２時間後のＭＲＩを１．５テスラＭＲＩ装置（ＳＩＥＭＥＮＳ社製）で撮影した。その結果を図４Ａ〜Ｆに示す。図中、Ａ：水のみ、Ｂ：ＣＭＤＭのみ、Ｃ：ＨｅＬａ細胞＋ＣＭＤＭ、Ｄ：ＨｅＬａ細胞＋Ｃ４５Ｄ１８（２個）−ＣＭＤＭ、Ｅ：ＨｅＬａ細胞＋Ｃ４５Ｄ１８（６個）−ＣＭＤＭ、Ｆ：ＨｅＬａ細胞＋Ｃ４５Ｄ１８（１０個）−ＣＭＤＭである。
【００８１】
この結果、Ｃ４５Ｄ１８−ＣＭＤＭが、ＣＭＤＭ単体と比較して細胞内に取り込まれることが示され、また、その結合数に応じて細胞内へ取り込まれる量が多くなることが示された。
【００８２】
試験例６： Ｃ４５Ｄ１８ ｉｎ ｖｉｖｏ
実施例４により得られたＣ４５Ｄ１８−ＣＭＤＭ（複合体番号４）を、ＫＤＲ発現腫瘍を移植したマウスに、Ｆｅとして体重１ｇあたり１５μｇ静注し、１時間４０分後に１．５テスラのＭＲＩ装置（ＳＩＥＭＥＮＳ社製）でＭＲＩを撮影した。その結果を図５に示す。図５はマウスホールボディのＴ2強調画像であり、左が投与前のマウス、右が投与後のマウスである。
【００８３】
この結果、投与前のマウス腫瘍（左矢印）に対して投与後のマウス腫瘍（右矢印２箇所）が黒く写り、磁性体が集積していることが確認された。
【００８４】
試験例７
実施例４で得られたＣ４５Ｄ１８−ＣＭＤＭ（複合体番号４）と参考例１の原料ＣＭＤＭ、及びＣ４５Ｄ１８ペプチド単体を、ＨｅＬａ細胞に、Ｆｅとして８００μｇ／ｍｌ添加し、１２時間インキュベートした後の細胞に、周波数および磁場強度を特定する高周波磁場を１時間照射した。これらの細胞増殖度を調べたところ、図６のとおりであった。このことから、複合体４が磁場照射により細胞に損傷を与える効果を持つことがわかる。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】図１Ａ〜Ｆは、実施例１で得られたＫＤＲ−ＢＰ−ＣＭＤＭ（複合体番号１）及び参考例１のＣＭＤＭを、ＫＤＲ陽性細胞と陰性細胞に添加した後、１２時間後のＭＲＩ（Ｔ2強調画像）写真である。Ａ：水のみ、Ｂ：ＣＭＤＭのみ、Ｃ：陰性細胞＋ＣＭＤＭ、Ｄ：陽性細胞＋ＣＭＤＭ、Ｅ：陰性細胞＋ＫＤＲ−ＢＰ−ＣＭＤＭ、Ｆ：陽性細胞＋ＫＤＲ−ＢＰ−ＣＭＤＭである。
【図２】図２Ａ〜Ｆは、実施例２で得られたＲＢＰ−１−ＣＭＤＭ（複合体番号２）及び参考例１のＣＭＤＭを、ＲＥＴ陽性細胞と陰性細胞に添加した後、１２時間後のＭＲＩ（Ｔ2強調画像）写真である。Ａ：水のみ、Ｂ：ＣＭＤＭのみ、Ｃ：陰性細胞＋ＣＭＤＭ、Ｄ：陽性細胞＋ＣＭＤＭ、Ｅ：陰性細胞＋ＲＢＰ−１−ＣＭＤＭ、Ｆ：陽性細胞＋ＲＢＰ−１−ＣＭＤＭである。
【図３】図３は、実施例１で得られたＫＤＲ−ＢＰ−ＣＭＤＭ（複合体番号１）を、ＫＤＲ陽性腫瘍と陰性腫瘍を移植したマウスに尾静脈注射し、４時間２０分後のＭＲＩ画像写真である。
【図４】図４Ａ〜Ｆは、実施例４で得られたＣ４５Ｄ１８−ＣＭＤＭ（複合体番号４）及び参考例１のＣＭＤＭを、培養細胞に添加した後、１２時間後のＭＲＩ画像写真である。Ａ：水のみ、Ｂ：ＣＭＤＭのみ、Ｃ：細胞＋ＣＭＤＭ、Ｄ：細胞＋Ｃ４５Ｄ１８（２個）−ＣＭＤＭ、Ｅ：細胞＋Ｃ４５Ｄ１８（６個）−ＣＭＤＭ、Ｆ：細胞＋Ｃ４５Ｄ１８（１０個）−ＣＭＤＭである。
【図５】図５は、実施例４で得られたＣ４５Ｄ１８−ＣＭＤＭ（複合体番号４）を、ＫＤＲ発現腫瘍を移植したマウスに尾静脈注射し、１時間４０分後のＭＲＩ画像写真である。左が投与前のマウス、右が投与後のマウスである。
【図６】図６は、実施例４で得られたＣ４５Ｄ１８−ＣＭＤＭ（複合体番号４）、参考例１の原料ＣＭＤＭ及びＣ４５Ｄ１８ペプチド単体を、ＨｅＬａ細胞に、Ｆｅとして８００μｇ／ｍｌ添加し、１２時間インキュベートした後の細胞に、高周波磁場を１時間照射した後の細胞増殖度を示すグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核磁気共鳴イメージング（以下、ＭＲＩと略記する）により、各種の疾病、癌などの病巣部位を特異的に検出することができる造影剤として、或いは高周波磁場を照射することにより病巣部位の温度を上昇させおよび／または細胞攪乱して病巣部位のみを選択的且つ特異的に死滅させる処置において有用な機能性分子が導入された有機磁性ナノ複合体に関する。
【背景技術】
【０００２】
適切な形態に処方された磁性粒子、例えばデキストランマグネタイトは、それを生体に投与し、それが集中する特定部位の生体内組織や体液をＭＲＩにより検出する画像診断や、生体に投与した後外部から電磁波を照射して特定部位に集中したデキストランマグネタイトの温度を局所的に上昇させる温熱療法において利用しうることが知られており、磁性粒子の一部は既に製品化されており、例えばＭＲＩ造影剤として臨床での診断に使用されている。しかし、デキストランマグネタイトは、生体内に投与された後、その大部分が血管循環を経て、肝臓などの細網内皮系（ＲＥＳ）に取り込まれるため、肝臓癌の検診などにその用途が限られており、また、最近、血管造影剤やリンパ節造影剤としての使用も試みられているが、依然として対象疾病がごく狭い範囲に限られているという問題がある。
【０００３】
一方、デキストランマグネタイトに代表される磁性ナノ粒子の表面に、生体内組織や病変部位を特異的に認識する物質である部位特異的機能性分子を導入することにより、ＭＲＩなどによる画像診断や温熱治療をより広範な疾病に適用できるようにする試みがいくつかなされている。例えば、非特許文献１には、デキストラン被覆した超常磁性の単結晶性酸化鉄ナノ粒子（ＭＩＯＮ）に過ヨウ素酸ナトリウムを作用させた後、脳腫瘍特異的モノクローナル抗体と結合させてなる複合体のＭＲＩによる脳腫瘍特異的診断への応用可能性について開示されている。また、非特許文献２には、デキストラン被覆した単結晶性酸化鉄ナノ粒子（ＭＩＯＮ）をコレサイトカイニン（ＣＣＫ）と共に超音波処理することにより得られるＣＣＫで標識したＭＩＯＮの膵臓特異的ＭＲＩ造影剤としての応用について開示されている。さらに、非特許文献３には、デキストラン被覆した超常磁性酸化鉄ナノ粒子（ＭＩＯＮ）にエピクロルヒドリンおよびアンモニアを作用させてアミノ基を導入した後、３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸Ｎ−スクシニミジルと反応させ、次いでＨＩＶ−ｔａｔタンパク質由来のペプチドを結合させてなる複合体の標的細胞の細胞内磁性標識への応用について開示されている。
【０００４】
特許文献１には、オリゴヌクレオチド、ポリペプチド又は多糖と磁性ナノ粒子との複合体が標的分子に結合すると凝集し、ＮＭＲ緩和能力が変化することを利用して標的分子を検出することが開示されている。
【０００５】
一方、特許文献２には、場合によりリン脂質によってリポソーム状に包囲した磁性鉄系酸化物微粒子を主成分とする感熱発熱体を用いた生体内部加熱装置が開示されている。
【０００６】
しかしながら、上記の複合体は、生体内における安定性、生体に対する安全性、標的部位への到達効率などに問題があり、製品化はもとより、臨床応用できる水準にも達していない。
【特許文献１】米国特許出願公開第２００３／００９２０２９号明細書
【特許文献２】特開平１１−５７０３１号公報
【非特許文献１】L.G.Remsenet.al.,American J. Neuroradiology, 17, 411 (1996)
【非特許文献２】P.Reimeret.al.,Radiology, 193, 527 (1994)
【非特許文献３】L.Josephson et.al.,Bioconjugate Chem., 10, 186 (1999)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の主たる目的は、生体に投与可能で且つ病巣などの標的部位に的確且つ効率的に到達させることができる、部位特異的なＭＲＩ診断および／または高周波磁場照射による磁場治療を可能とする、機能性分子が導入された有機磁性ナノ複合体を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記の目的を達成すべく鋭意検討を重ねた結果、今回、磁性ナノ粒子として水溶性のカルボキシアルキルエーテル化多糖によって被覆された磁性金属酸化物ナノ粒子を使用し且つそれに該多糖にリンカーを介して機能性分子を導入することにより、安定性や安全性のみならず、標的部位への特異的到達効率が格段に向上した有機磁性ナノ複合体が得られることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
かくして、本発明によれば、水溶性のカルボキシアルキルエーテル化多糖によって被覆された、１０〜１００ｎｍの範囲内の全体直径を有する磁性金属酸化物ナノ粒子と、該多糖にリンカーを介して共有結合された部位特異的機能性分子とからなる有機磁性ナノ複合体が提供される。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の有機磁性ナノ複合体は、各種疾病ないし癌の病巣部位のＭＲＩ診断用造影剤、局所磁場治療剤などとして有用である。
【００１１】
以下、本発明の部位特異的機能性分子が導入された有機磁性ナノ粒子複合体（以下、導入磁性ナノ複合体と略記することがある）についてさらに詳細に説明する。
【００１２】
本発明の導入磁性ナノ複合体は、原料である水溶性のカルボキシアルキルエーテル化多糖によって被覆された磁性ナノ粒子（以下、原料磁性ナノ粒子と略記することがある）にリンカーを介して部位特異的機能性分子を共有結合させることにより製造することができる。
【００１３】
原料磁性ナノ粒子
原料磁性ナノ粒子は、安定性、生体安全性及び細網内皮系に取込まれにくい性質を有することに加えて、粒子表面上に部位特異的な機能性分子をリンカーを介して結合させるための官能基が存在することが必要であり、かかる要件を満たす原料磁性ナノ粒子として、本発明では、水溶性のカルボキシルアルキルエーテル化多糖で被覆された磁性金属酸化物超微粒子、例えば、特許第２７２６５２０号公報に記載された多糖類のカルボキシルアルキルエーテルと磁性金属酸化物との複合体を使用するものである。
【００１４】
本発明で使用する原料磁性ナノ粒子については、特許第２７２６５２０号公報の引用を以てその詳細な記述に代え、ここではその概要をのべるにとどめる。
【００１５】
原料磁性ナノ粒子を構成する一方の成分である磁性金属酸化物コア粒子としては、下記式（１）
（ＭIIＯ)ｌ・Ｍ2IIIＯ3 ・・・（１）
式中、ＭIIは２価の金属原子を表し、ＭIIIは３価の金属原子を表し、ｌは０〜１の範
囲内の数である、
で示されるものを挙げることができる。上記式（１）において、２価の金属原子ＭIIとしては、例えば、マグネシウム、カルシウム、マンガン、鉄、ニッケル、コバルト、銅、亜鉛、ストロンチウム、バリウム等が挙げられ、これらはそれぞれ単独で使用することができ又は２種もしくはそれ以上を組み合わせて使用することもできる。また、３価の金属原子ＭIIIとしては、例えば、アルミニウム、鉄、イットリウム、ネオジウム、サマリウム、ユーロピウム、ガドリウム等が挙げられ、これらはそれぞれ単独で使用することができ又は２種もしくはそれ以上組み合わせて用いることもできる。
【００１６】
磁性金属酸化物コア粒子としては、中でも、上記式（１）においてＭIIIが３価の鉄である磁性金属酸化物、すなわち下記式（２）
（ＭIIＯ)ｍ・Ｆｅ2Ｏ3 ・・・（２）
式中、ＭIIは上記と同義であり、ｍは０〜１の範囲内の数である、
で示されるフェライトが好適である。ここで、ＭIIとしては前記式（１）で例示したのと同じ金属原子を挙げることができる。特に、ＭIIが２価の鉄である場合の上記式（２）の磁性金属酸化物、すなわち下記式（３）
（ＦｅＯ)ｎ・Ｆｅ2Ｏ3 ・・・（３）
式中、ｎは０〜１の範囲内の数である、
で示される磁性酸化鉄は、本発明において更に好適な磁性金属酸化物として挙げることができる。なお、上記式（３）において、ｎ＝０の場合はγ−酸化鉄（γ−Ｆｅ2Ｏ3）であり、また、ｎ＝１の場合はマグネタイト（Ｆｅ3Ｏ4）である。なお、本発明において、磁性金属酸化物には、結晶水を有する磁性金属酸化物も包含される。
【００１７】
原料磁性ナノ粒子を構成する他の成分、すなわち、上記磁性金属酸化物コア粒子を被覆するための水溶性のカルボキシアルキルエーテル化多糖（還元多糖を含む、以下同様）としては、例えば、グルコースポリマーであるデキストラン、デンプン、グリコーゲン、セルロース、プルラン、カードラン、シゾフィラン、レンチナン、ペスタロチアン等；フルクトースポリマーであるイヌリン、レバン等；マンノースポリマーであるマンナン等；ガラクト−スポリマーであるアガロース、ガラクタン等；キシロースポリマーであるキシラン；Ｌ−アラビノースポリマーであるアラビナン等の多糖類のカルボキシアルキルエーテル化物が挙げられ、中でも、グルコースポリマーのカルボキシアルキルエーテル化物、特にデキストラン、デンプン又はプルランのカルボキシアルキルエーテル化物が好ましく、さらに特に、カルボキシアルキルエーテル化デキストランが好適である。
【００１８】
カルボキシアルキルエーテル化多糖のアルキル部分は低級アルキルであることができ、例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル等が挙げられるが、好ましくはメチルである。また、そのカルボキシル基は塩の形態をとることができ、塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、アンモニウム塩やアミン塩などが挙げられるが、好ましくはナトリウム塩である。更に、カルボキシアルキルエーテル化多糖の置換度は、一般に、単糖単位当り０．０５〜０．５、好ましくは０．１〜０．３の範囲内である。
【００１９】
カルボキシアルキルエーテル化多糖は、分子量が低すぎると複合体の安定性が低下したり、生体内での異物反応が強くなり、逆に分子量が高すぎると、複合体の多糖含量が大きくなりすぎるので、一般に、１，０００〜１００，０００、好ましくは３，０００〜５０，０００、更に好ましくは５，０００〜２０，０００の範囲内の数平均分子量を有するものが適している。
【００２０】
原料磁性ナノ粒子は、特許第２７２６５２０号公報に記載の方法に従い、例えば、磁性金属酸化物コア粒子を予め調製し、次いでそれにカルボキシアルキルエーテル化多糖を反応させる２ステップ法、又はカルボキシアルキルエーテル化多糖の存在下に磁性ナノ粒子を合成する１ステップ法により製造することができるが、本発明においては、幅広い性質
を有する原料磁性ナノ粒子を製造することができる１ステップ法がより好ましい。具体的には、まず、カルボキシアルキルエーテル化多糖の水溶液中に、予め２価の金属鉱酸塩および３価の金属鉱酸塩の混合溶液を加えた後、室温ないし加温下でＮａＯＨ、ＫＯＨ、ＮＨ4ＯＨ等の塩基を中性ないし弱アルカリ性になるまで加え、１時間程度の加熱還流を行うことにより金属酸化物コアとそれを被覆するカルボキシアルキルエーテル化多糖との複合体を形成せしめることができる。金属酸化物コアに結合されなかった遊離のポリマーは、部位特異的機能性分子の導入効率を低下させる可能性があるので、冷却後、例えば、有機溶媒による分別沈殿、限外濾過、ゲル濾過などの方法により、副生する塩類とともに可能な限り除去することが好ましい。
【００２１】
かくして得られる原料磁性ナノ粒子において、磁性金属酸化物コア粒子は、通常、１〜２０ｎｍ、好ましくは２〜１０ｎｍ、更に好ましくは３〜８ｎｍの範囲内の平均直径を有することができる。本明細書において、原料磁性ナノ粒子のコアの粒子直径は透過型電子顕微鏡で測定され、平均直径は２００個の粒子直径の平均値である。
【００２２】
原料磁性ナノ粒子を構成するカルボキシアルキルエーテル化多糖と磁性金属酸化物コアの割合は、カルボキシアルキルエーテル化多糖／磁性金属酸化物コア中の金属の重量比で、通常１／１０〜４／１、好ましくは２／１０〜２／１、更に好ましくは３／１０〜１／１の範囲内が適している。
【００２３】
原料磁性ナノ粒子の全体粒子径は、生体内における細網内皮系の発達した臓器である肝臓等による取り込みを避けるなど観点から、小粒子径のものが好ましく、具体的には、通常１０〜１００ｎｍ、特に１５〜５０ｎｍ、更に特に１５〜４０ｎｍの範囲内が好適である。本明細書において、原料磁性ナノ粒子の全体粒子径は、動的光散乱法に従いレーザー光散乱測定装置によって測定した時の値である。
【００２４】
また、原料磁性ナノ粒子のＴ1及びＴ2緩和能力は、ＭＲＩによる検出感度向上などの観点から、高いことが好ましく、Ｔ1緩和能力は一般に５〜５０(mM・sec)-1、特に１０〜５０(mM・sec)-1の範囲内にあり、Ｔ2緩和能力は一般に１０〜３００(mM・sec)-1、特に５０〜２００(mM・sec)-1の範囲内にあることが好ましい。本明細書において、Ｔ1およびＴ2緩和能力は２０ＭＨｚ（０．４７テスラ）のパルスＮＭＲでＴ1またはＴ2緩和時間を測定し、得られる緩和時間の逆数、即ち１／Ｔ1または１／Ｔ2（sec-1）と測定試料中の金属濃度（ｍＭ）との関係をグラフにプロットし、最小自乗法で求めた直線の傾きから算出される値である。なお、本明細書において測定法の記載がない物性値は、特許第２７２６５２０号公報に記載の方法に従って測定されたものである。
【００２５】
部位特異的機能性分子
本発明に従い上記原料磁性ナノ粒子に導入することができる部位特異的機能性分子（以下、機能性分子と略記することがある）は、生体内の標的部位の種類などに応じて任意に選ぶことができ、標的部位を特異的に認識し、そこに結合ないし集積するような機能ないし性質を有する分子であれば、高分子のものでも低分子のものでの使用することができる。
【００２６】
そのような機能性分子として、具体的には、例えば、各種癌もしくは疾病の原因病巣などの標的部位を特異的に認識し結合ないし集積することができる抗体、ペプチド、ホルモン、糖類、病変特異的に代謝・分解される基質等が挙げられる。これら中、導入磁性ナノ複合体の安定性や安全性、製造の容易さなどの観点から、比較的低分子の機能性分子、特に分子量が１０，０００以下のペプチド、ホルモン、糖類などの部位特異的機能性をもつ有機分子が好ましい。化学合成が容易で、その組成を自由に変換することが可能であり、エンドトキシンの可能性が低く且つ原料磁性ナノ粒子との結合量を正確かつ容易に調節することができる等の実用上多くの利点を有することから、ペプチドが殊に適している。
【００２７】
本発明において使用することができるペプチドとしては、例えば、特開２００３−０１８９９４号公報に開示されているＲＥＴ発現細胞に特異的に結合するペプチド（以下、ＲＢＰ−１という）、米国特許出願公開第２００５／１５４１８７号明細書に開示されているＶＥＧＦのＫＤＲ受容体に結合するペプチド（以下、ＫＤＲ−ＢＰという）、NATURE MEDICINE, 9(9), 1173-1179 (2003) に記載されている膵臓β細胞上に発現する受容体に結合するペプチド（以下、ＧＬＰ−１という）、Biochem. Biophys. Res. Comm., 320, 18-26 (2004) に記載されている細胞核内移行機能を有するペプチド（以下、Ｃ４５Ｄ１８という）などが挙げられる。
【００２８】
導入磁性ナノ複合体の製造
本発明の導入磁性ナノ複合体は、以上に述べた原料磁性ナノ粒子と部位特異的機能性分子とをリンカーを介し共有結合させることにより製造することができる。
【００２９】
リンカーとしては、例えば、一端に、原料磁性ナノ粒子表面のカルボキシアルキルエーテル多糖中の官能基、特にカルボキシル基や水酸基と共有結合することができる官能基（ａ）を有し、且つ他端に、機能性分子中の官能基、例えば、アミノ基、ＳＨ基、カルボキシル基、水酸基などと共有結合することができる官能基（ｂ）を有する直鎖状もしくは分岐鎖状の有機化合物、例えば、脂肪族炭化水素や、アビジン、ストレプトアビジンなどが挙げられる。上記官能基（ａ）としては、例えば、カルボキシル基と共有結合可能な求核性基、特に、強固なアミド結合を形成しうるアミノ基、水酸基と共有結合可能な活性エステル基などが挙げられ、また、上記官能基（ｂ）としては、例えば、ピリジニルジスルフィド基、マレイミド基、オレフィン基、活性エステル基、アミノ基などが挙げられ、これら官能基（ｂ）のうち、ピリジニルジスルフィド基、マレイミド基、オレフィン基はＳＨ基と結合し、活性エステル基はアミノ基や水酸基などの求核性基と結合し、そしてアミノ基は活性エステル基のような求電子性基と結合することができる。
【００３０】
官能基（ｂ）としては、機能性分子の大多数が抗体、ホルモン、ペプチドなどのアミノ酸単位から構成される物質であることから、これらの物質がもつ機能に実質的に影響を与えないことを考慮し、特に、アミノ酸中の存在量が少ない官能基、例えばＳＨ基に対して結合する基を選ぶことが好ましく、例えば、ＳＨ基と強固なＣ−Ｓ結合を特異的かつ容易に形成しうる基であるマレイミド基が好適である〔Walker,TetrahedronLetters, 35(5), 665-668 (1994)参照〕。
【００３１】
原料磁性ナノ粒子への部位特異的機能性分子の導入に際してＳＨ基を利用することができる場合に使用可能なリンカーとして、具体的には、例えば、下記式（４）
Ｈ2Ｎ−(ＣＨ2)ｎ−Ｘ ・・・（４）
式中、Ｘはマレイミド基、ピリジニルジスルフィド基、オレフィン基及び活性エステル
基から選ばれる基であり、ｎは１〜１５、好ましくは２〜１０、特に２である、
で示される化合物が好適である。
【００３２】
上記式（４）の中でも、Ｘがマレイミド基である下記式（５）で示されるリンカーは、アミノ基がカルボキシアルキルデキストランのカルボキシル基とアミド結合を形成して強固に結合するとともに、マレイミド基が機能性分子中のＳＨ基と特異的かつ強固なＣ−Ｓ結合を形成するので、導入磁性ナノ複合体の化学的安定性や機能性分子の機能発現などの観点から特に好適に使用することができる。
【００３３】
【化１】
したがって、上記式（５）のリンカーを用いて機能性分子と原料磁性ナノ粒子とを結合する場合において、原料の機能性分子中にＳＨ基が存在しないとき、例えばＫＤＲ−ＢＰ、ＲＢＰ−１、ＧＬＰ−１のようなペプチドについては、機能性分子の化学構造中に、例えば、ペプチドのＣ末端側にグリシル−グリシル−システインを結合せしめることにより、予めＳＨ基を導入することができる。これにより、上記のマレイミド系リンカーを利用して原料磁性ナノ粒子に機能性分子を容易に導入することができる。
【００３４】
かかるリンカーを介しての機能性分子と原料磁性ナノ粒子との結合は、それ自体既知の方法に従って行うことができ、例えば、まず、原料磁性ナノ粒子にリンカーを結合させ、次いでそのリンカーに機能性分子を結合させてもよく、または逆に、機能性分子にリンカーを結合させ、次いでそのリンカーに原料磁性ナノ粒子を結合させるようにしてもよい。
【００３５】
また、アビジン及びストレプトアビジンはビオチン４分子と特異的且つ強固に結合する。したがって、部位特異的機能性分子の導入にＳＨ基を利用することができないような場合には、リンカーとしてアビジンまたはストレプトアビジンを使用し、それを原料磁性ナノ粒子上のカルボキシル基に例えばアミド結合により結合せしめ、一方、機能性分子の末端にはビオチンを導入しておき、アビジン−ビオチン結合により強固に結合せしめることにより、原料磁性ナノ粒子に機能性分子を導入することができる。
【００３６】
原料磁性ナノ粒子に導入することができる機能性分子は、１種のみに限られるものではなく、導入磁性ナノ粒子の用途などに応じて２種もしくはそれ以上の機能性分子を導入することもでき、それによって検出診断することができる疾病の範囲を広くすることができる。
【００３７】
原料磁性ナノ粒子へのリンカーの結合量は、粒子１個あたり１〜３０個、好ましくは５〜２５個、更に好ましくは５〜２０個の範囲内であることができる。導入されるリンカーの結合量の測定方法は、その構造や導入方法によって異なるが、上記式（５）のマレイミド系リンカーの結合量は、例えば、次のようにして測定することができる。
【００３８】
マレイミド系リンカーの結合量の測定法：
まず、リンカーを結合せしめた原料磁性ナノ粒子のバッファー溶液を適当に希釈して試料液とする。この試料液に対し過剰の既知量のグルタチオンを添加し、リンカーと結合させる。次に、その溶液を限外濾過して未結合のグルタチオンを回収する。この未結合グルタチオンの量を、Ｅｌｌｍａｎ試薬〔Ellman, G. L., Arch. Biochem. Biophysic. 74, 443 (1958)参照〕として知られるＳＨ基検出試薬を用いて定量し、結合グルタチオンの量、即ち、リンカー量を算出する。
【００３９】
また、原料磁性ナノ粒子に対する機能性分子の導入量は、導入磁性ナノ粒子の用途などに応じて変えることができるが、一般には、粒子１個あたり１〜３０個、好ましくは５〜２５個、更に好ましくは５〜２０個の範囲内であることができる。機能性分子の導入量の測定方法は、その構造や導入方法によって異なるが、本発明において最も好ましく用いられるＳＨ基を有するペプチドの場合には、例えば、次のようにしてその導入量を測定することができる。
【００４０】
ＳＨ基を有するペプチドの導入量の測定法：
原料磁性ナノ粒子にリンカーを介して結合したペプチドの量は、ＳＨ基の一般的な定量法を応用することによって測定することができる。即ち、リンカーを結合させた原料磁性ナノ粒子に既知量のペプチドを反応させた後、限外濾過により回収・精製した未反応ペプチドを、前述のＥｌｌｍａｎ試薬を用いて定量し、結合ペプチド量を逆算することによりペプチドの導入量を求めることができる。
【００４１】
原料磁性ナノ複合体への機能性分子の導入は、さらに、例えば、米国特許第４４５２７７３号明細書、欧州特許第０４５２３４２号明細書、米国特許第５４９２８１４号明細書、Weissleder et.al.,Bioconjugate Chem, ,10, 186-191 (1999)などの文献に記載の方法によって行うこともできる。
【００４２】
導入磁性ナノ複合体
かくして得られる導入磁性ナノ複合体は、原料磁性ナノ粒子がもつ物理的及び／又は化学的性質を実質的に維持しており、好ましい態様において、磁性金属酸化物コアの粒子径、カルボキシアルキルエーテル化多糖／磁性金属酸化コア中の金属の重量比、全体粒子径及びＴ1及びＴ2緩和能力はほとんど変動せず、それぞれ３０％以内の変動幅内で維持されていることが望ましい。ここで、全体粒子径は、例えばＣＭＤＭ等の原料磁性ナノ粒子単体では溶液のＰＨ変動によってその数値が大きく変化することはないが、導入磁性ナノ複合体については、溶液のＰＨ変動によりその数値が大きく変化することがある。これは、タンパクなどのコロイド粒子において一般的に多く見られる現象であるが、最適ＰＨを選択することにより、前述のごとく原料磁性粒子単体の時の数値に対しほぼ同値となり、３０％以内の変動に留めることができる。本明細書において、本発明の導入磁性ナノ複合体の全体粒子径はこれを意味する。
【００４３】
有用性
本発明により提供される導入磁性ナノ複合体は、生理学的に許容される水性磁性ゾルの状態で静脈内に投与された時に、実質的に凝集したりすることがなく、標的部位に特異的に集積するという顕著な特性を有しており、各種疾病ないし癌などの病巣部位のＭＲＩ診断用造影剤や高周波磁場照射による局所磁場治療剤などとして極めて有用である。
【００４４】
本発明の導入磁性ナノ複合体をＭＲＩ造影剤又は磁場治療剤として用いる場合、導入磁性ナノ複合体は水性ゾルの形で使用することが好ましい。水性ゾル中の導入磁性ナノ複合体の濃度は、その用途などに応じて広範囲にわたって変えることができるが、通常、金属換算で約０．１〜約２ｍｏｌ／Ｌ、特に０．３〜２ｍｏｌ／Ｌの範囲内が適している。また、該水性ゾルには、必要に応じて、例えば、塩化ナトリウム等の無機塩；ブドウ糖等の単糖類；マンニトール、ソルビトール等の糖アルコール類；乳酸、クエン酸塩、酒石酸塩等の有機酸塩；リン酸緩衝剤、トリス緩衝剤等の生理学的に許容される種々の助剤を添加することもできる。
【００４５】
本発明の導入磁性ナノ複合体をＭＲＩ造影剤として使用する場合、その投与量は、診断部位などによって異なるが、通常、金属換算で約１μｍｏｌ／ｋｇ（体重）〜約１０ｍｍｏｌ／ｋｇ（体重）、好ましくは約２μｍｏｌ／ｋｇ（体重）〜約１ｍｍｏｌ／ｋｇ（体重）、更に好ましくは約５μｍｏｌ／ｋｇ（体重）〜約１００μｍｏｌ／ｋｇ（体重）の範囲内である。投与は、例えば、静脈内、動脈内などへの注射、注入などにより行うことできるが、場合によっては、経口投与、腸内直接投与、膀胱内投与なども可能である。
【００４６】
本発明の好ましい形態の導入磁性ナノ複合体は、保存安定性に優れており、例えば、静脈投与すると、導入機能性分子の性質に従って、特異的且つ効率的に数分ないし２４時間
後には目的部位に集積し、ＭＲＩ撮像により病変部位の診断が好適に行われる。
【００４７】
一方、本発明の導入磁性ナノ複合体を磁場治療剤として使用する場合、その投与量は、処置すべき患者の症状の軽重、年齢、治療部位などによって異なるが、通常、金属換算で約１０μｍｏｌ／ｋｇ（体重）〜約１０ｍｍｏｌ／ｋｇ（体重）、好ましくは約２０μｍｏｌ／ｋｇ（体重）〜約１ｍｍｏｌ／ｋｇ（体重）の範囲内である。投与は、前述のＭＲＩ造影剤の場合と同様、例えば、静脈内、動脈内などへの注射、注入などにより行うことができるが、場合によっては、治療部位への直接投与も可能である。
【００４８】
本発明の好ましい形態の導入磁性ナノ複合体は、保存安定性に優れており、例えば、静脈投与すると、導入機能性分子の性質に従い、特異的且つ効率的に数分ないし２４時間後には目的部位に集積し、高周波磁場照射を実施することにより病変部位の治療が好適に行われる。照射する高周波磁場の周波数としては、一般に２０ＫＨｚ〜１０ＭＨｚ、好ましくは５０ＫＨｚ〜１ＭＨｚ、更に好ましくは１００〜５００ＫＨｚの範囲内が適当である。また、磁場強度としては、一般に１ｍＴ以上、好ましくは５ｍＴ以上、更に好ましくは１０ｍＴ以上が適切である。
【００４９】
本発明の導入磁性ナノ複合体の臨床的意義
近年、ＭＲＩ診断下での高周波焦点照射が可能になり、病変に対するピンポイント温熱療法が施行されている。本発明の導入磁性ナノ複合体を用いるＭＲＩによる微少病変の画像化は、このピンポイント療法を行う際のナビゲーターとなり、より精度の高い治療法の実現が可能になるものと期待される。
【００５０】
原料磁性ナノ粒子に標的機能性分子を結合させ、ＭＲＩによる画像化を試みることは、幾つかの分子種について試みられてきた。例えば、モノクローナル抗体を用いることにより特異性の高い標的化が可能になる。しかし、抗体を臨床に応用する際、ヒト型抗体に変換させることが必須であることや、使用できるモノクローナル抗体の数が限られていること、また、１分子当たりの分子量が大きいために原料磁性ナノ粒子に対して再現性よく結合させるためのシステムが煩雑なこと、さらには、抗体を調製する際にエンドトキシンの混在を完全に防ぐことが困難なこと等、解決しなければならない問題が多く残されている。
【００５１】
本発明は、標的機能性分子としてペプチドを使用することを可能とし、それによって上記の如き問題を一挙に解決し、ＭＲＩによる標的画像化を一般化することに成功したものである。ペプチドは化学合成によりエンドトキシンが混在しない状態で大量に取得することができ、また、アミノ酸配列を自由に変化させることにより結合性や特性性の異なるペプチドを探索することも可能であり、本発明の導入磁性ナノ複合体は潜在的に大きな可能性を有している。
【００５２】
以下、本発明に従い原料磁性ナノ粒子に導入される４種のペプチド、即ち、ＫＤＲ−ＢＰ、ＲＢＰ−１、ＧＬＰ−１及びＣ４５Ｄ１８について、それぞれのペプチドに関する概略及び期待される臨床応用性について説明する。
【００５３】
ＫＤＲ−ＢＰ
癌細胞の増殖には栄養血管を必要とし、例えば、転移巣が直径１〜２ｍｍを越えて増殖するためには新生血管の増殖を伴うことが知られている（Folkman Nat. Med., 1, 27-31, 1995）。新生血管は血管内皮細胞が増殖することで形成されるが、血管内皮細胞の増殖には血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ−２）とそのレセプターであるＶＥＧＦ−２レセプター（ＫＤＲ）が必須因子として関与している。したがて、ＫＤＲを標的機能性分子とすることにより、癌転移巣を標的化することが考えられる。実際、ＫＤＲを標的としたＤＮＡワクチンの有効性も報告された（Niethammer et al., Nat. Med. 12, 1369-1375, 2002）。
【００５４】
本発明は、ＫＤＲに結合性を示すペプチド（ＫＤＲ−ＢＰ）（Hetian et al., J. Biol. Chem. 277, 43137-43142, 2002）を原料磁性ナノ粒子に結合させ、転移巣をＭＲＩで画像化することを１つの目的としており、、ＫＤＲ−ＢＰが導入された磁性ナノ複合体を用いれば、臨床的に転移巣を検出することが可能となり、癌転移患者のＱＯＬを最大限温存させながら治療を行うことが可能になる。
【００５５】
ＲＢＰ−１
小児癌の中で最も予後の悪い癌として神経芽腫が上げられる。神経芽腫ではレセプター型チロシンキナーゼＲＥＴが高頻度に発現している。２９例の腫瘍組織中全例でＲＥＴ遺伝子の発現が認められる（Nagao et at., Jpn. J. Cancer Res. 81, 309-312, 1990）一方、１１例の同細胞株中１０例で発現が認められた（Ikeda I, Oncogene, 9, 1291-1296,
1990）。また、ＲＥＴに結合するモノクローナル抗体を用いることにより、神経芽腫細胞選択的な遺伝子導入も可能になっている（Yano et al., Human Gene Therapy 11, 995-1004, 2000.）。このように特異性の高い分子標的を可能にするためにＲＥＴ細胞外ドメインに結合するペプチド（ＲＢＰ−１）が同定されている（特開２００３−０１８９９４号公報）。ＲＢＰ−１は８個のアミノ酸（ＫＡＧＲＧＲＤＲ、アミノ酸を一文字で表記）からなるペプチドであり、中心のアルギニンをアラニンに置換したペプチド（ＫＡＧＡＧＡＤＲ）はＲＥＴに対する結合性を示さない。即ち、中心部に位置する正荷電にチャージしたアミノ酸がＲＥＴに対する結合に必須であることが分かっている。
【００５６】
かくして、本発明に従いＲＢＰ−１が導入された磁性ナノ複合体を用いれば、ＭＲＩの画像化により、例えば小骨盤腔に局在し、外科的な治療が行うことができないような神経芽腫を正確に診断した後、加療することが可能になるものと期待される。
【００５７】
ＧＬＰ−１
膵臓癌は症状が認められる時点ではすでに後腹壁に浸潤し、外科的手術が困難である例が多く、究めて予後の悪い悪性腫瘍として位置づけられている。ＧＬＰ−１（Glucagon like peptide-1）は、消化管ペプチドホルモンであり、膵臓細胞にその受容体が発現している（Thorens, Proc. Natl. acad. Sci. USA 89, 8641-8645, 1992）。
【００５８】
本発明に従いＧＬＰ−１が導入された磁性ナノ複合体を用いることによりＭＲＩ診断が可能になれば、膵臓癌の早期診断が可能になることが期待される。また、糖尿病症例において膵臓組織の変化を検出することが可能になることも期待される。
【００５９】
Ｃ４５Ｄ１８
本ペプチドはＨＩＶ−１の遺伝子産物の一つであるＶｐｒ（Viral protein R）に由来する２７個のアミノ酸からなる。Ｖｐｒは９６個のアミノ酸からなり、細胞の培養液に添加されると、数時間以内に細胞の中に取り込まれ、核内にまで運搬されることが知られている。この現象を司る領域としてＣ末側４５個のアミノ酸のうち、Ｃ末端１８個のアミノ酸を欠失させた部分（Ｃ４５Ｄ１８）が同定されている（Taguchi et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 320, 18-26, 2004）。さらにこの機能を用いて、静止マクロファージに対する遺伝子導入が可能になったことが報告されている（Mizoguchi et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 338, 1499-1506, 2005）。このように細胞に容易に取り込まれる性質を用いることにより、体内で血液が貯留する部分の画像化が可能になると期待される。具体的な応用例として癌病変の画像化が上げられる。癌部の血管は、透過性が亢進しており、血管内から低分子化合物やナノ粒子が血管外に漏出することが知られている。このような現象はＥＰＲ（Enhanced permeation and retension）と呼ばれ、癌部の血管
が正常組織の血管とは異なる性質を有していることが示唆されている。このＥＰＲ効果を利用して、近年ナノ粒子によるＤＤＳが試みられ、有効な治療成績が報告されている。
【００６０】
したがて、本発明に従ってＣ４５Ｄ１８が導入された磁性ナノ複合体を用いれば、それが血管外に漏出し、その後速やかに細胞内に取り込まれ、腫瘍病変をＭＲＩにより描出することが可能になると期待される。また、該Ｃ４５Ｄ１８が導入された磁性ナノ複合体を用いれば、癌部だけではなく、解離性動脈瘤等の血管病変で、血液が停留している病変をＭＲＩによって画像化でき、早期の診断が可能になって症状の進行を未然に防止することが可能になり、患者予後が改善されるものと期待される。
【実施例】
【００６１】
以下、本発明を参考例、実施例、試験例等によりさらに具体的に説明する。
【００６２】
参考例１： 原料磁性ナノ粒子の合成
カルボキメチル置換度０．２０及び平均分子量約１０，０００のカルボキメチルデキストラン（以下ＣＭＤ）５１７ｇを水１４００ｍｌに溶解し、これに１Ｍ−塩化第二鉄水溶液１０１０ｍｌに塩化第一鉄・四水和物９７．６ｇを窒素気流下で溶解した水溶液を加え、さらに約８０℃に加温しながら、攪拌下に３規定水酸化ナトリウム水溶液１９４４ｍｌを添加する。次いで、６規定塩酸を加えｐＨを７．０に調整した後、１時間３０分加熱還流する。冷却後、１８８０Ｇで３０分間遠心分離し、上清を限外濾過（分画分子量５０，０００ダルトン）を行って、目的とするカルボキシメチルデキストランマグネタイト（以下ＣＭＤＭ）水性ゾル １８００ｍｌを得た。
鉄濃度：４４．２ｍｇ／ｍｌ（鉄収率８３％）、磁性酸化鉄の粒子径：５．１ｎｍ、全
体の粒子径：４０ｎｍ、ＣＭＤ／鉄重量比：０．７、Ｔ1緩和能力：３２(mM・sec)-1、
Ｔ2緩和能力：１２１(mM・sec)-1。
【００６３】
参考例２： デキストラン被覆磁性ナノ粒子の合成
極限粘度０．０５３ｄｌ／ｇおよび数平均分子量約２，７００のカルボキシデキストラン（以下ＣＤｘ）５１７ｇを水１４００ｍｌに溶解し、これに１Ｍ−塩化第二鉄水溶液５７０ｍｌに塩化第一鉄・四水和物５５．７ｇを窒素気流下で溶解した水溶液を加え、さらに約８０℃に加温しながら、攪拌下に３規定水酸化ナトリウム水溶液９８５ｍｌを添加する。次いで、６規定塩酸を加えｐＨを７．１に調整した後、１時間３０分加熱還流する。冷却後、１８８０Ｇで３０分間遠心分離し、上清を限外濾過（分画分子量５０，０００ダルトン）を行って、目的とするカルボキシデキストランマグネタイト（以下ＡＴＤＭ）水性ゾル７３６ｍｌを得た。
鉄濃度：５９ｍｇ／ｍｌ（鉄収率９０％）、磁性酸化鉄の粒子径：５．０ｎｍ、全体の
粒子径：６８ｎｍ、ＣＤｘ／鉄重量比：０．２７、Ｔ1緩和能力：２７(mM・sec)-1、Ｔ
2緩和能力：２０３(mM・sec)-1。
【００６４】
実施例１： ＫＤＲ−ＢＰの導入
（１） 参考例１で得られたＣＭＤＭ ８ｍｌ（鉄濃度２０ｍｇ／ｍｌ）に、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（以下ＥＤＣ） ６２３ｍｇ、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（以下ＮＨＳ） １８７ｍｇ及びＮ−エチルアミノマレイミド・トリフルオロ酢酸塩２２ｍｇの０．２Ｍ−ホウ酸ナトリウムバッファー溶液８ｍｌを順次添加し、室温にて反応を行う。２０時間後、限外濾過（分画分子量５０，０００ダルトン）を行い、不要な試薬類を除去し、リンカー結合ＣＭＤＭを得た。
（２） （１）で得られたリンカー結合ＣＭＤＭの水溶液に、ＫＤＲ−ＢＰ ９．１ｍｇを添加し、室温にて反応させる。２０時間後、限外濾過（分画分子量５０，０００ダルト
ン）を行い、未結合のペプチドを回収し、定量する。上清を水で希釈した後、システイン１．０ｍｇを添加し、室温にて反応させる。２０時間後、限外濾過（分画分子量５０，０００ダルトン）を行い、上清を０．１Ｍ−リン酸ナトリウムバッファーで８ｍｌに希釈し、ＫＤＲ−ＢＰ−ＣＭＤＭ水性ゾルを得た（複合体番号１）。
鉄濃度：７．３ｍｇ／ｍｌ、ＣＭＤ／鉄重量比：０．５９、全体粒子径：３６ｎｍ（ｐ
Ｈ４）、９７ｎｍ（ｐＨ７）、７３ｎｍ（ｐＨ９）、Ｔ1緩和能力：２８(mM・sec)-1、
Ｔ2緩和能力：１１１(mM・sec)-1、磁性ナノ粒子１個あたりのペプチド導入数：１１
個。
【００６５】
実施例２： ＲＢＰ−１の導入
実施例１において、添加するペプチドをＲＢＰ−１ ９．１ｍｇ、リンカー結合ＣＭＤＭを０．１Ｍ−リン酸ナトリウムバッファー溶液とする以外は実施例１と同様に処理し、ＲＢＰ−１−ＣＭＤＭ水性ゾルを得た（複合体番号２）。
鉄濃度：６．５ｍｇ／ｍｌ、ＣＭＤ／鉄重量比：０．５４、全体粒子径：４５ｎｍ（ｐ
Ｈ７）、Ｔ1緩和能力：２７(mM・sec)-1、Ｔ2緩和能力：１０４(mM・sec)-1、磁性ナノ
粒子１個あたりのペプチド導入数：１３個。
【００６６】
実施例３： ＧＬＰ−１の導入
実施例１において、添加するペプチドをＧＬＰ−１ ５．８ｍｇとする以外は実施例１と同様に処理し、ＧＬＰ−１−ＣＭＤＭ水性ゾルを得た（複合体番号３）。
鉄濃度：７．７ｍｇ／ｍｌ、ＣＭＤ／鉄重量比：０．５３、全体粒子径：３９ｎｍ（ｐ
Ｈ４）、４３ｎｍ（ｐＨ７）、４３ｎｍ（ｐＨ９）、Ｔ1緩和能力：３１(mM・sec)-1、
Ｔ2緩和能力：１１０(mM・sec)-1、磁性ナノ粒子１個あたりのペプチド導入数：５．２
個。
【００６７】
実施例４： Ｃ４５Ｄ１８の導入
実施例１において、添加するペプチドをＣ４５Ｄ１８ ７．６ｍｇとする以外は実施例１と同様に処理し、Ｃ４５Ｄ１８−ＣＭＤＭ水性ゾルを得た（複合体番号４）。
鉄濃度：７．８ｍｇ／ｍｌ、ＣＭＤ／鉄重量比：０．５５、全体粒子径：１０９ｎｍ
（ｐＨ４）、１００ｎｍ（ｐＨ７）、４６ｎｍ（ｐＨ９）、Ｔ1緩和能力：３０(mM・
sec)-1、Ｔ2緩和能力：１１７(mM・sec)-1、磁性ナノ粒子１個あたりのペプチド導入
数：５．９個。
【００６８】
実施例５： マウス投与前処理
実施例１により得られたＫＤＲ−ＢＰ−ＣＭＤＭ（複合体番号１）０．５５ｍｌを、リン酸緩衝生理食塩水で希釈し１０ｍｌとする。これをメンブランフィルター（ポアーサイズ：０．２μｍ）にてろ過滅菌しながらバイアル瓶に充填した（鉄濃度：０．４ｍｇ／ｍＬ）。
【００６９】
実施例６： 製剤例
実施例１により得られたＫＤＲ−ＢＰ−ＣＭＤＭ（複合体番号１） ６．０ｍｌを、遠心限外ろ過（分画分子量５０，０００ダルトン）により１．５ｍｌに濃縮し、これにＤ−マンニトール６４ｍｇ及び１Ｍ−Ｌ−乳酸１６μｌを添加し、更に１Ｍ−塩酸にてｐＨを６．５に調整した。これをメンブランフィルター（ポアーサイズ：０．２μｍ）にてろ過滅菌しながらバイアル瓶に充填し、更に窒素充填した（鉄濃度：２８．７ｍｇ／ｍＬ）。
【００７０】
比較例１： ＫＤＲ−ＢＰの導入
（１） 参考例２で得られたＡＴＤＭ ８ｍｌ（鉄濃度２０ｍｇ／ｍｌ）に、ＥＤＣ ９１ｍｇ、ＮＨＳ ２７ｍｇ及びＮ−エチルアミノマレイミド・トリフルオロ酢酸塩 ６．３ｍｇの０．２Ｍ−ホウ酸ナトリウムバッファー溶液８ｍｌを順次添加し、室温にて反応
を行う。２０時間後、限外濾過（分画分子量５０，０００ダルトン）を行い、不要な試薬類を除去し、リンカー基結合ＡＴＤＭを得た。
（２） （１）で得られたリンカー結合ＡＴＤＭの水溶液に、ＫＤＲ−ＢＰ ４．２ｍｇを添加し、室温にて反応させる。２０時間後、限外濾過（分画分子量５０，０００ダルトン）を行い、未結合のペプチドを回収し、定量する。上清を水で希釈した後、システイン１．０ｍｇを添加し、室温にて反応させる。２０時間後、限外濾過（分画分子量５０，０００ダルトン）を行い、上清を０．１Ｍ−リン酸ナトリウムバッファーで８ｍｌに希釈し、ＫＤＲ−ＢＰ−ＡＴＤＭ水性ゾルを得た（複合体番号５）。
鉄濃度：７．３ｍｇ／ｍｌ、ＣＤｘ／鉄重量比：０．２５、全体粒子径：６７ｎｍ（ｐ
Ｈ７）、Ｔ1緩和能力：２７(mM・sec)-1、Ｔ2緩和能力：１８９(mM・sec)-1、磁性ナノ
粒子１個あたりのペプチド導入数：５．１個。
【００７１】
比較例２： ＲＢＰ−１の導入
比較例１において、添加するペプチドをＲＢＰ−１ ５．２ｍｇ、リンカー結合ＡＴＤＭを０．１Ｍ−リン酸ナトリウムバッファー溶液とする以外は比較例１と同様に処理し、ＲＢＰ−１−ＡＴＤＭ水性ゾルを得た（複合体番号６）。
鉄濃度：７．７ｍｇ／ｍｌ、ＣＤｘ／鉄重量比：０．２２、全体粒子径：６７ｎｍ（ｐ
Ｈ７）、Ｔ1緩和能力：２５(mM・sec)-1、Ｔ2緩和能力：２０５(mM・sec)-1、磁性ナノ
粒子１個あたりのペプチド導入数：８．５個。
【００７２】
上記実施例１〜４及び比較例１、２で得られた複合体番号１〜６の特性をまとめて示せば、下記表１のとおりである。
【００７３】
【表１】
試験例１： 安定性試験
実施例１及び比較例１において、添加するペプチドをグルタチオンとする以外は実施例１及び比較例１と同様に処理することにより、グルタチオン−磁性ナノ複合体を得た（複合体番号７、８）。これら複合体５ｍｌ（鉄濃度０．５ｍｇ／ｍｌ）に、５０ｍＭ塩化カルシウム水溶液を５ｍｌ添加した後、オートクレーブで加熱処理し、溶液の凝集の程度を目視により判定した。なお、溶液が透明な場合を○、凝集している場合を△、沈殿している場合を×とした。その結果を表２に示す。
【００７４】
【表２】
試験例２： ＫＤＲ−ＢＰ ｉｎ ｖｉｔｒｏ
実施例１により得られたＫＤＲ−ＢＰ−ＣＭＤＭ（複合体番号１）および参考例１の原料ＣＭＤＭを、ＫＤＲ陽性培養細胞と陰性培養細胞に、それぞれＦｅとして ８００μｇ／ｍｌ添加した。１２時間後、培養液でリンスし、次いで細胞をプレートから剥がし、アクリルアミドゲルに包埋し、１．５テスラのＭＲＩ装置（ＳＩＥＭＥＮＳ社製）にて、Ｔ2強調画像を撮影した。その結果を図１に示す。図中、Ａ：水のみ、Ｂ：ＣＭＤＭのみ、Ｃ：陰性細胞＋ＣＭＤＭ、Ｄ：陽性細胞＋ＣＭＤＭ、Ｅ：陰性細胞＋ＫＤＲ−ＢＰ−ＣＭＤＭ、Ｆ：陽性細胞＋ＫＤＲ−ＢＰ−ＣＭＤＭである。
【００７５】
この結果、ＫＤＲ陽性細胞にＫＤＲ−ＢＰ−ＣＭＤＭを作用させた検体（図１のＦ）に、磁性体の集積が確認された。
【００７６】
試験例３： ＲＢＰ−１ ｉｎ ｖｉｔｒｏ
実施例２により得られたＲＢＰ−１−ＣＭＤＭ（複合体番号２）と、参考例１の原料ＣＭＤＭを、ＲＥＴ陽性培養細胞と陰性培養細胞に、Ｆｅとして８００μｇ／ｍｌを添加した。１２時間後、培養液でリンスし、次いで細胞をプレートから剥がし、アクリルアミドゲルに包埋し、１．５テスラのＭＲＩ装置（ＳＩＥＭＥＮＳ社製）にて、Ｔ2強調画像を撮影した。その結果を図２に示す。図中、Ａ：水のみ、Ｂ：ＣＭＤＭのみ、Ｃ：陰性細胞＋ＣＭＤＭ、Ｄ：陽性細胞＋ＣＭＤＭ、Ｅ：陰性細胞＋ＫＤＲ−ＢＰ−ＣＭＤＭ、Ｆ：陽性細胞＋ＫＤＲ−ＢＰ−ＣＭＤＭである。
【００７７】
この結果、ＲＥＴ陽性細胞にＲＢＰ−１−ＣＭＤＭを作用させた検体（図２のＦ）に、磁性体の集積が確認された。
【００７８】
試験例４： ＫＤＲ−ＢＰ ｉｎ ｖｉｖｏ
実施例１により得られたＫＤＲ−ＢＰ−ＣＭＤＭ（複合体番号１）を、ＫＤＲ陽性腫瘍と陰性腫瘍を移植したマウスに、Ｆｅとして体重１ｇあたり５μｇ静注し、４時間２０分後に１．５テスラのＭＲＩ装置（ＳＩＥＭＥＮＳ社製）でＭＲＩを撮影した。その結果を図３に示す。図３はマウスホールボディのＴ2強調画像である。
【００７９】
この結果、ＫＤＲ陽性腫瘍（矢印）が陰性腫瘍に対して黒く写り、磁性体が集積していることが確認された。
【００８０】
試験例５： Ｃ４５Ｄ１８ ｉｎ ｖｉｔｒｏ
実施例４で得られたＣ４５Ｄ１８−ＣＭＤＭ（複合体番号４）と、参考例１の原料ＣＭＤＭを、ＨｅＬａ細胞に、Ｆｅとして８００μｇ／ｍｌ添加し、１２時間後のＭＲＩを１．５テスラＭＲＩ装置（ＳＩＥＭＥＮＳ社製）で撮影した。その結果を図４Ａ〜Ｆに示す。図中、Ａ：水のみ、Ｂ：ＣＭＤＭのみ、Ｃ：ＨｅＬａ細胞＋ＣＭＤＭ、Ｄ：ＨｅＬａ細胞＋Ｃ４５Ｄ１８（２個）−ＣＭＤＭ、Ｅ：ＨｅＬａ細胞＋Ｃ４５Ｄ１８（６個）−ＣＭＤＭ、Ｆ：ＨｅＬａ細胞＋Ｃ４５Ｄ１８（１０個）−ＣＭＤＭである。
【００８１】
この結果、Ｃ４５Ｄ１８−ＣＭＤＭが、ＣＭＤＭ単体と比較して細胞内に取り込まれることが示され、また、その結合数に応じて細胞内へ取り込まれる量が多くなることが示された。
【００８２】
試験例６： Ｃ４５Ｄ１８ ｉｎ ｖｉｖｏ
実施例４により得られたＣ４５Ｄ１８−ＣＭＤＭ（複合体番号４）を、ＫＤＲ発現腫瘍を移植したマウスに、Ｆｅとして体重１ｇあたり１５μｇ静注し、１時間４０分後に１．５テスラのＭＲＩ装置（ＳＩＥＭＥＮＳ社製）でＭＲＩを撮影した。その結果を図５に示す。図５はマウスホールボディのＴ2強調画像であり、左が投与前のマウス、右が投与後のマウスである。
【００８３】
この結果、投与前のマウス腫瘍（左矢印）に対して投与後のマウス腫瘍（右矢印２箇所）が黒く写り、磁性体が集積していることが確認された。
【００８４】
試験例７
実施例４で得られたＣ４５Ｄ１８−ＣＭＤＭ（複合体番号４）と参考例１の原料ＣＭＤＭ、及びＣ４５Ｄ１８ペプチド単体を、ＨｅＬａ細胞に、Ｆｅとして８００μｇ／ｍｌ添加し、１２時間インキュベートした後の細胞に、周波数および磁場強度を特定する高周波磁場を１時間照射した。これらの細胞増殖度を調べたところ、図６のとおりであった。このことから、複合体４が磁場照射により細胞に損傷を与える効果を持つことがわかる。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】図１Ａ〜Ｆは、実施例１で得られたＫＤＲ−ＢＰ−ＣＭＤＭ（複合体番号１）及び参考例１のＣＭＤＭを、ＫＤＲ陽性細胞と陰性細胞に添加した後、１２時間後のＭＲＩ（Ｔ2強調画像）写真である。Ａ：水のみ、Ｂ：ＣＭＤＭのみ、Ｃ：陰性細胞＋ＣＭＤＭ、Ｄ：陽性細胞＋ＣＭＤＭ、Ｅ：陰性細胞＋ＫＤＲ−ＢＰ−ＣＭＤＭ、Ｆ：陽性細胞＋ＫＤＲ−ＢＰ−ＣＭＤＭである。
【図２】図２Ａ〜Ｆは、実施例２で得られたＲＢＰ−１−ＣＭＤＭ（複合体番号２）及び参考例１のＣＭＤＭを、ＲＥＴ陽性細胞と陰性細胞に添加した後、１２時間後のＭＲＩ（Ｔ2強調画像）写真である。Ａ：水のみ、Ｂ：ＣＭＤＭのみ、Ｃ：陰性細胞＋ＣＭＤＭ、Ｄ：陽性細胞＋ＣＭＤＭ、Ｅ：陰性細胞＋ＲＢＰ−１−ＣＭＤＭ、Ｆ：陽性細胞＋ＲＢＰ−１−ＣＭＤＭである。
【図３】図３は、実施例１で得られたＫＤＲ−ＢＰ−ＣＭＤＭ（複合体番号１）を、ＫＤＲ陽性腫瘍と陰性腫瘍を移植したマウスに尾静脈注射し、４時間２０分後のＭＲＩ画像写真である。
【図４】図４Ａ〜Ｆは、実施例４で得られたＣ４５Ｄ１８−ＣＭＤＭ（複合体番号４）及び参考例１のＣＭＤＭを、培養細胞に添加した後、１２時間後のＭＲＩ画像写真である。Ａ：水のみ、Ｂ：ＣＭＤＭのみ、Ｃ：細胞＋ＣＭＤＭ、Ｄ：細胞＋Ｃ４５Ｄ１８（２個）−ＣＭＤＭ、Ｅ：細胞＋Ｃ４５Ｄ１８（６個）−ＣＭＤＭ、Ｆ：細胞＋Ｃ４５Ｄ１８（１０個）−ＣＭＤＭである。
【図５】図５は、実施例４で得られたＣ４５Ｄ１８−ＣＭＤＭ（複合体番号４）を、ＫＤＲ発現腫瘍を移植したマウスに尾静脈注射し、１時間４０分後のＭＲＩ画像写真である。左が投与前のマウス、右が投与後のマウスである。
【図６】図６は、実施例４で得られたＣ４５Ｄ１８−ＣＭＤＭ（複合体番号４）、参考例１の原料ＣＭＤＭ及びＣ４５Ｄ１８ペプチド単体を、ＨｅＬａ細胞に、Ｆｅとして８００μｇ／ｍｌ添加し、１２時間インキュベートした後の細胞に、高周波磁場を１時間照射した後の細胞増殖度を示すグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
水溶性のカルボキシアルキルエーテル化多糖によって被覆された、１０〜１００ｎｍの範囲内の全体直径を有する磁性金属酸化物ナノ粒子と、該多糖とリンカーを介して共有結合された部位特異的機能性分子とからなる有機磁性ナノ複合体。
【請求項２】
カルボキシアルキルエーテル化多糖がグルコースポリマーである請求項１に記載の複合体。
【請求項３】
グルコースポリマーがデキストランである請求項２に記載の複合体。
【請求項４】
磁性金属酸化物ナノ粒子が５〜５０(mM・sec)-1の範囲内のＴ1緩和能力及び１０〜３００(mM・sec)-1の範囲内のＴ2緩和能力を有するものである請求項１〜３のいずれかに記載の複合体。
【請求項５】
磁性金属酸化物ナノ粒子のコアが磁性酸化鉄であり、その直径が１〜２０ｎｍの範囲内にある請求項１〜４のいずれかに記載の複合体。
【請求項６】
カルボキシアルキルエーテル化多糖によって被覆された磁性金属酸化物ナノ粒子が１５〜４０ｎｍの範囲内の全体直径を有する請求項１〜５のいずれかに記載の複合体。
【請求項７】
部位特異的機能性分子がペプチドである請求項１〜６のいずれかに記載の複合体。
【請求項８】
ペプチドがＫＤＲ−ＢＰ、ＲＢＰ−１、Ｃ４５Ｄ１８及びＧＬＰ−１から選ばれる請求項７に記載の複合体。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれかに記載の複合体を有効成分として含んでなるＭＲＩ造影剤。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれかに記載の複合体を有効成分として含んでなる磁場療法剤。
【請求項１】
水溶性のカルボキシアルキルエーテル化多糖によって被覆された、１０〜１００ｎｍの範囲内の全体直径を有する磁性金属酸化物ナノ粒子と、該多糖とリンカーを介して共有結合された部位特異的機能性分子とからなる有機磁性ナノ複合体。
【請求項２】
カルボキシアルキルエーテル化多糖がグルコースポリマーである請求項１に記載の複合体。
【請求項３】
グルコースポリマーがデキストランである請求項２に記載の複合体。
【請求項４】
磁性金属酸化物ナノ粒子が５〜５０(mM・sec)-1の範囲内のＴ1緩和能力及び１０〜３００(mM・sec)-1の範囲内のＴ2緩和能力を有するものである請求項１〜３のいずれかに記載の複合体。
【請求項５】
磁性金属酸化物ナノ粒子のコアが磁性酸化鉄であり、その直径が１〜２０ｎｍの範囲内にある請求項１〜４のいずれかに記載の複合体。
【請求項６】
カルボキシアルキルエーテル化多糖によって被覆された磁性金属酸化物ナノ粒子が１５〜４０ｎｍの範囲内の全体直径を有する請求項１〜５のいずれかに記載の複合体。
【請求項７】
部位特異的機能性分子がペプチドである請求項１〜６のいずれかに記載の複合体。
【請求項８】
ペプチドがＫＤＲ−ＢＰ、ＲＢＰ−１、Ｃ４５Ｄ１８及びＧＬＰ−１から選ばれる請求項７に記載の複合体。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれかに記載の複合体を有効成分として含んでなるＭＲＩ造影剤。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれかに記載の複合体を有効成分として含んでなる磁場療法剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２００９−１１４０６６（Ｐ２００９−１１４０６６Ａ）
【公開日】平成２１年５月２８日（２００９．５．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−４８５７６（Ｐ２００６−４８５７６）
【出願日】平成１８年２月２４日（２００６．２．２４）
【出願人】（５０１３７２５１４）国立国際医療センター総長 (11)
【出願人】（０００２４３９６２）名糖産業株式会社 (4)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年５月２８日（２００９．５．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年２月２４日（２００６．２．２４）
【出願人】（５０１３７２５１４）国立国際医療センター総長 (11)
【出願人】（０００２４３９６２）名糖産業株式会社 (4)
【Ｆターム（参考）】
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