潜在的競技パフォーマンスを予測するための方法
競技パフォーマンスに関連した１以上の遺伝子の一塩基多型の存在に関して、対象に由来する生物学的標本をアッセイするステップを含む、サラブレッド競走馬のような対象の潜在的競技パフォーマンスを予測するための方法およびアッセイ。競技パフォーマンス遺伝子はＭＳＴＮ、ＣＯＸ４Ｉ２、ＰＤＫ４、ＣＫＭまたはＣＯＸ４Ｉ１の中の１以上から選択され得る。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は対象の競技パフォーマンスの潜在能力を予測するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
サラブレッド馬産業は、サラブレッド馬の繁殖、訓練および競走に関係する数十億ユーロの国際的な産業である。数百万ユーロの決断が、しばしば競争能力を有すると認められた個々の動物の購入に対して行われる。サラブレッドの競走および繁殖産業へのゲノミクス情報の統合は早期の“素質確認”に対する高い潜在性を有する。サラブレッドは伝統的に、血統情報および非常に多くの表現型の特徴に基づいて競走および繁殖に対して選択される。伝統的または新規な手段による遺伝的潜在性の早期の確認が成功に優先する。産業内では、常に新規な方法および技術を検討することに関わる人々は“有効性”を見出すための探索に追われている。従って、ゲノミクス情報は、以前には入手し難かった情報を提供することによって、しばしば数百万ドルの決断を微調整するためにブリーダーやトレーナーを直接援助する潜在性を有する。
【０００３】
酸素は筋肉機能の重要なレギュレーターであり、エネルギー産生、筋肉収縮、および副生成物の除去に影響を及ぼす。運動中のエネルギーに対する要求は、酸素の利用能によって非常に限定される。哺乳類の細胞は低い細胞内酸素環境に反応するための精巧な適応機序を進化させてきた（Ｔａｙｌｏｒ ＆ Ｃｏｌｇａｎ １９９９）。ヒト運動の研究において、訓練された骨格筋におけるそのような低酸素環境への適応が炭水化物の酸化増大に対して基質選択をシフトさせ、細胞を刺激して酸素輸送および利用の状態を改善する（Ｈｏｐｐｅｌｅｒ ＆ Ｖｏｇｔ ２００１）。サラブレッド馬では、高強度での短時間の運動中に、心臓血管および呼吸系における酸素の運搬能力および送達を改善する数多くの構造的および機能的適応にもかかわらず、酸素輸送系は運動‐誘発動脈低酸素血および炭酸過剰の日常的発生においてもたらされる末梢の要求にかなり遅れを取る（Ｄｅｍｐｓｅｙ ＆ Ｗａｇｎｅｒ，１９９９；Ｓｅａｍａｎ，１９９５）。サラブレッドの反応は、訓練されたヒトアスリートを含む他の動物種に比較して、エネルギーに対する筋肉系の非常に大きい要求を反映して月並みではない。驚くべきことに、限定された酸素供給に直面してさえ、サラブレッドは厳しい運動に適切に適応する優れたアスリートであり続ける。
【０００４】
サラブレッド馬は短距離（＜１マイル）および長距離（＞１マイル）レースの両方において秀でている。これらの鍛錬（ｄｉｓｃｉｐｌｉｎｅ）に対する生理的要求は異なり、代謝経路の分配によって調節される。超最大強度（１０５〜１２５％ ＶＯ２ｍａｘ）における運動の初めの７５秒間は、酸素供給が運動中の筋肉の要求に応えることができないため、ウマは酸素欠乏を経験する（Ｄｅｍｐｓｅｙ ＆ Ｗａｇｎｅｒ，１９９９；Ｓｅａｍａｎ，１９９５）。これにもかかわらず、短距離レース（＜１０００ｍ）中、全エネルギーのおよそ７０％が好気的に供給されることになる。より長い距離およびより長い期間（＞７５秒）を競うウマは定常状態ＶＯ２に到達し、従って酸素欠乏ではない。
【０００５】
さまざまな研究が、サラブレッド競走馬における競技パフォーマンス表現型との測定可能な関連を検討するために行われてきており、それらは心臓の大きさ（Ｙｏｕｎｇら ２００５）、筋肉繊維の型（Ｒｉｖｅｒｏら ２００７）、筋骨格構造（Ｌｏｖｅら ２００６）、最大心拍数におけるスピード（Ｇｒａｍｋｏｗ ＆ Ｅｖａｎｓ ２００６）、血液学的（Ｒｅｖｉｎｇｔｏｎ １９８３）および他の生理学的変数（Ｈａｒｋｉｎｓら １９９３）の評価を含む。
【０００６】
ＷＯ２００６００３４３６は、パフォーマンスとミトコンドリアゲノムによってコード化された遺伝子変異体間の関連について記載する。しかし、ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）ハプロタイプは、母親から厳密に受け継ぎ、従って表現型に対して雌性貢献にだけ関係する。サラブレッド集団におけるｍｔＤＮＡハプロタイプの数は限定され（ｎ＝１７）、１０頭の雌だけが現在の母性血統の７４％に貢献するため（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍら ２００２）、パフォーマンスに対して目標を設定された選択が存在する集団において、これらのハプロタイプ変異体が、速やかに好ましいハプロタイプが“固定される”といったような意味のある効果を有する可能性はありそうもなく；さらに（ｍｔＤＮＡ変異体の）効果的な集団サイズは核内コード化変異体の１／３である（Ｂａｌｌａｒｄ ａｎｄ Ｄｅａｎ ２００１，Ｂｌｉｅｒら ２００１，Ｄａｓ ２００６，Ｍｅｉｋｌｅｊｏｈｎら ２００７）。その上、ｍｔＤＮＡハプロタイプは血統情報から直接推測されうる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】ＷＯ２００６００３４３６
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｔａｙｌｏｒ ＆ Ｃｏｌｇａｎ １９９９
【非特許文献２】Ｈｏｐｐｅｌｅｒ ＆ Ｖｏｇｔ ２００１
【非特許文献３】Ｄｅｍｐｓｅｙ ＆ Ｗａｇｎｅｒ，１９９９
【非特許文献４】Ｓｅａｍａｎ，１９９５
【非特許文献５】Ｙｏｕｎｇら ２００５
【非特許文献６】Ｒｉｖｅｒｏら ２００７
【非特許文献７】Ｌｏｖｅら ２００６
【非特許文献８】Ｇｒａｍｋｏｗ ＆ Ｅｖａｎｓ ２００６
【非特許文献９】Ｒｅｖｉｎｇｔｏｎ １９８３
【非特許文献１０】Ｈａｒｋｉｎｓら １９９３
【非特許文献１１】Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍら ２００２
【非特許文献１２】Ｂａｌｌａｒｄ ａｎｄ Ｄｅａｎ ２００１
【非特許文献１３】Ｂｌｉｅｒら ２００１
【非特許文献１４】Ｄａｓ ２００６
【非特許文献１５】Ｍｅｉｋｌｅｊｏｈｎら ２００７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、対象の潜在的競技パフォーマンスを予測するための、これらの問題のいくつかを克服する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
発明の陳術
本発明は核内コード化遺伝子における変異を検出するための、ＤＮＡを基にした検定を提供する。核内コード化遺伝子の変異はすべての可能性のある祖先に由来する好ましい遺伝子変異体の遺伝を反映するが、ｍｔＤＮＡ検定は雌の祖先に制限されるため、この方法はミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）検定よりも優れている。
【００１１】
本明細書に記載の方法およびアッセイはｅｘ ｖｉｖｏで実施され、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏの方法およびアッセイであると見なされうる。
【００１２】
たとえば血液、唾液、体毛、皮膚、骨髄、軟部組織、内部臓器、生検標本、精液、骨格筋組織などの遺伝物質を含むいずれか適切な生物学的標本が、本明細書に記載の方法の生物学的標本として使用されてもよい。血液および体毛標本はとりわけ生物学的標本として適している。
【００１３】
本明細書で使用する“競技パフォーマンス”には、競争レースならびに、競走、障害飛越、総合馬術、調馬、耐久競技、乗馬、狩猟などの馬術スポーツのような競走が挙げられる。馬術スポーツは競技スポーツであってもよい。
【００１４】
競争レース種には、ウマ科動物（ウマ）、ラクダ、イヌ、ゾウ、ウサギ、カンガルー、ダチョウ、ハト、ヒトおよびタカまたはハヤブサのような猛禽が挙げられる。競争レース種はサラブレッド馬または障害飛越馬であってもよい。
【００１５】
“プライマー”は、関心のある核酸配列に由来する約１５から約４０、たとえば約１８から約２５の連続したヌクレオチドを含む核酸配列を意味する。プライマーはフォワード（５′または３′）もしくはリバース（３′から５′）プライマー、または関心のある核酸配列に対する相補的核酸配列に基づいて設計されたプライマーであってもよい。本発明では、関心のある配列は競技パフォーマンスに関連した遺伝子、たとえば付録の中に挙げられた遺伝子、またはＣＯＸ４Ｉ１、ＣＯＸ４Ｉ２、ＰＤＫ４、ＣＫＭまたはＭＳＴＮ遺伝子の中の１以上のゲノム配列である。一態様では、プライマーはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３１もしくはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３２に由来する約１５から約４０、たとえば約１８から約２５の連続したヌクレオチド、またはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３１もしくはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３２に対する相補的配列に由来する約１５から約４０、たとえば約１８から約２５の連続したヌクレオチドを含んでいてもよい。“相補的配列”は、慣例のワトソン−クリック塩基対形成：すなわち、アデニンはチミンに結合し、そしてシトシンはグアニンに結合する；を使用して関心のある配列に結合する配列を意味する。
【００１６】
本発明は、優れた競技パフォーマンスに関連した一塩基多型（ＳＮＰ）を提供する。本発明は対象の競技パフォーマンスを予測する方法を提供し、該方法は付録に列挙された１以上の遺伝子における一塩基多型（ＳＮＰ）の存在に関して、対象に由来する生物学的標本をアッセイするステップを含み、ここではＳＮＰが競技パフォーマンスと有意な関連を有する。
【００１７】
本発明に従って、対象の潜在的競技パフォーマンスを予測する方法が提供され、該方法はＭＳＴＮ遺伝子、ＣＯＸ４Ｉ２遺伝子、ＰＤＫ４遺伝子、ＣＫＭ遺伝子、またはＣＯＸ４Ｉ１遺伝子の中の１以上における一塩基多型（ＳＮＰ）の存在に関して、対象に由来する生物学的標本をアッセイするステップを含む。
【００１８】
ＳＮＰはＭＳＴＮ＿６６４９３７３７（Ｔ／Ｃ）であってもよい。Ｃアレルの存在は優れた競技パフォーマンスを示す。ホモ接合ＣＣ遺伝子型の存在は優れた競技パフォーマンスを示してもよい。優れた競技パフォーマンスは優れた全力疾走パフォーマンスであってもよい。
【００１９】
ＳＮＰはＣＯＸ４Ｉ２＿２２６８４３９０（Ｃ／Ｔ）であってもよい。Ｔアレルの存在は優れた競技パフォーマンスを示してもよい。ホモ接合ＴＴ遺伝子型の存在は優れた競技パフォーマンスを示してもよい。
【００２０】
ＳＮＰはＰＤＫ４＿３８９７３２３１（Ａ／Ｇ）であってもよい。Ａアレルの存在は優れた競技パフォーマンスを示してもよい。ホモ接合ＡＡ遺伝子型の存在は優れた競技パフォーマンスを示してもよい。
【００２１】
ＳＮＰはＣＫＭ＿１５８８４５６７（Ｇ／Ａ）であってもよい。Ａアレルの存在は優れた競技パフォーマンスを示してもよい。ホモ接合ＡＡ遺伝子型の存在は優れた競技パフォーマンスを示してもよい。
【００２２】
ＳＮＰはＣＯＸ４Ｉ１＿３２７７２８７１（Ｔ／Ｃ）であってもよい。Ｔアレルの存在は優れた競技パフォーマンスを示してもよい。ホモ接合ＴＴ遺伝子型の存在が優れた競技パフォーマンスを示してもよい。
【００２３】
対象の生物学的標本は：血液、唾液、骨格筋、皮膚、精液、生検標本、骨髄、軟部組織、内部臓器および体毛を含む群から選択されてもよい。
【００２４】
対象は競争レース種に由来してもよい。対象はサラブレッド競走馬のようなウマ科動物であってもよい。
【００２５】
本発明はさらに以下のステップを含む、対象の潜在的競技パフォーマンスを測定するためのアッセイ：
−標本を得ること；
−標本からＤＮＡを抽出するか、または遊離させること；および
−前記の抽出されるか、または遊離されたＤＮＡにおける競技パフォーマンスに関連した遺伝子の標的配列の中の一塩基多型（ＳＮＰ）を確認すること；
を提供し、ここで対象の潜在的競技パフォーマンスはＳＮＰに関連する。
【００２６】
競技パフォーマンスに関連した遺伝子はＭＳＴＮ、ＣＯＸ４Ｉ２、ＰＤＫ４、ＣＫＭまたはＣＯＸ４Ｉ１の中の１以上から選択されてもよい。
【００２７】
該アッセイは、以下のステップを、一塩基多型を確認するステップの前に含んでいてもよい：
−前記の抽出されるか、または遊離されたＤＮＡにおける競技パフォーマンスに関連した遺伝子の標的配列を増幅すること。
【００２８】
ＤＮＡはゲノムＤＮＡであってもよい。
【００２９】
本発明はさらに、ＭＳＴＮ遺伝子、ＣＯＸ４Ｉ２遺伝子、ＰＤＫ４遺伝子、ＣＫＭ遺伝子、またはＣＯＸ４Ｉ１遺伝子の中の１以上における一塩基多型（ＳＮＰ）の存在を検出するための手段を含む、対象の潜在的競技パフォーマンスの測定に使用されるアッセイを提供する。
【００３０】
ＳＮＰはＭＳＴＮ＿６６４９３７３７（Ｔ／Ｃ）であってもよい。Ｃアレルの存在は優れた競技パフォーマンスを示す。ホモ接合ＣＣ遺伝子型の存在は優れた競技パフォーマンスを示してもよい。優れた競技パフォーマンスは優れた全力疾走パフォーマンスであってもよい。
【００３１】
ＳＮＰはＣＯＸ４Ｉ２＿２２６８４３９０（Ｃ／Ｔ）であってもよい。Ｔアレルの存在は優れた競技パフォーマンスを示してもよい。ホモ接合ＴＴ遺伝子型の存在は優れた競技パフォーマンスを示してもよい。
【００３２】
ＳＮＰはＰＤＫ４＿３８９７３２３１（Ａ／Ｇ）であってもよい。Ａアレルの存在は優れた競技パフォーマンスを示してもよい。ホモ接合ＡＡ遺伝子型の存在は優れた競技パフォーマンスを示してもよい。
【００３３】
ＳＮＰはＣＫＭ＿１５８８４５６７（Ｇ／Ａ）であってもよい。Ａアレルの存在は優れた競技パフォーマンスを示してもよい。ホモ接合ＡＡ遺伝子型の存在は優れた競技パフォーマンスを示してもよい。
【００３４】
ＳＮＰはＣＯＸ４Ｉ１＿３２７７２８７１（Ｔ／Ｃ）であってもよい。Ｔアレルの存在は優れた競技パフォーマンスを示してもよい。ホモ接合ＴＴ遺伝子型の存在は優れた競技パフォーマンスを示してもよい。
【００３５】
本発明はさらに以下のステップ：
−標本を得ること；
−標本からＤＮＡを抽出するか、または遊離させること；および
−前記の抽出されるか、または遊離されたＤＮＡにおけるＭＳＴＮ＿６６４９３７３７（Ｔ／Ｃ）ＳＮＰの遺伝子型を確認すること
を含む、対象の潜在的競技パフォーマンスを測定するためのアッセイを提供し、ここでＭＳＴＮ＿６６４９３７３７（Ｔ／Ｃ）ＳＮＰにおけるＣアレルの存在は優れた競技パフォーマンスを示す。
【００３６】
該アッセイは、ＭＳＴＮ＿６６４９３７３７（Ｔ／Ｃ）ＳＮＰ遺伝子型を確認するステップの前に、以下のステップを含んでいてもよい：
−前記の抽出されるか、または遊離されたＤＮＡにおけるＭＳＴＮ＿６６４９３７３７（Ｔ／Ｃ）ＳＮＰをコードする標的配列を増幅すること。
【００３７】
ホモ接合ＣＣ遺伝子型の存在は優れた競技パフォーマンスを示す。
【００３８】
優れた競技パフォーマンスは優れた全力疾走パフォーマンスであり得る。
【００３９】
ＤＮＡはゲノムＤＮＡであってもよい。
【００４０】
対象に由来する標本は：血液、唾液、骨格筋、皮膚、骨髄、生検標本、軟部組織、精液、内部臓器および体毛を含む群から選択されてもよい。
【００４１】
対象は競争レース種に由来してもよい。対象はサラブレッド競走馬のようなウマ科動物であってもよい。
【００４２】
本発明者らは、ＣＯＸ４Ｉ２遺伝子（ＥｑｕＣａｂ２．０ ２２６７６３６１−Ｃ／Ｔ）一塩基多型（ＳＮＰ）のＴアレルのホモ接合キャリア：すなわち、ＣＯＸ４Ｉ２遺伝子の両アレルにおいて多型を有するものは、ＳＮＰに対してヘテロ接合である対象：すなわちＣＯＸ４Ｉ２遺伝子のアレルの一つにおいて多型を有する対象、またはＣＯＸ４Ｉ２遺伝子のいずれのアレルもＳＮＰを持たない対象に比較して、優れた全力疾走競走馬である可能性が統計的にいっそう高い。
【００４３】
本発明者らは、ＣＯＸ４Ｉ２遺伝子における一塩基多型（ＳＮＰ）の存在または非存在に関して対象に由来する生物学的標本をアッセイするステップを含む、対象の競技パフォーマンスを予測する方法を記載する。ＳＮＰはＥｑｕＣａｂ ２．０ ＣＯＸ４Ｉ２−２２６７６３６１-Ｃ／Ｔであってもよい。ホモ接合ＴＴ遺伝子型の存在は優れた競技パフォーマンスを示してもよい。ホモ接合ＴＴ遺伝子型の存在は優れた酸素消費パフォーマンスを示してもよい。ホモ接合ＴＴ遺伝子型の存在は優れた全力疾走パフォーマンスを示してもよい。対象の生物学的標本は：血液、唾液、骨格筋、精液、生検標本、内部臓器、皮膚、骨髄（またはいずれか他の生物組織）および体毛を含む群から選択されてもよい。対象は競争レース種に由来してもよい。対象はウマ科動物であってもよい。対象はサラブレッド競走馬であってもよい。
【００４４】
本発明者らはまた、ＣＯＸ４Ｉ２遺伝子における一塩基多型（ＳＮＰ）の存在または非存在を検出するための手段を含む、対象の競技パフォーマンスを測定するための使用に関するアッセイを記載する。ＳＮＰはＥｑｕＣａｂ ２．０ ＣＯＸ４Ｉ２−２２６７６３６１-Ｃ／Ｔであってもよい。ホモ接合ＴＴ遺伝子型の存在は優れた競技パフォーマンスを示してもよい。対象の生物学的標本は：血液、唾液、骨格筋、精液、生検標本、内部臓器、皮膚、骨髄（またはいずれか他の生物組織）および体毛を含む群から選択されてもよい。対象は競争レース種に由来してもよい。対象はウマ科動物であってもよい。対象はサラブレッド競走馬であってもよい。
【００４５】
本発明は、添付の図面を参照することによって、実施例だけによって示された以下のその態様の説明からいっそう明確に理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】図１はウマにおける運動中のエネルギー分配の概要である。
【図２】図２は、サラブレッド亜集団（ＴＢＥ＿ＥＮ：＞８ｆの距離で優れたパフォーマンスをするサラブレッド；ＴＢＥ＿ＳＰ：＜８ｆの距離で優れたパフォーマンスをするサラブレッド；ＴＢＯ：レースに参加してきたが、一度も勝利せず、＜７０のハンディキャップレーティングを有するその他のサラブレッド）および非サラブレッド馬（ＡＨ：Ａｋｈａｌ−Ｔｅｋｅ；ＣＯＮ：Ｃｏｎｎｅｍａｒａ Ｐｏｎｙ；ＴＵ：Ｔｕｖａ）におけるＣＯＸ４Ｉ２ ２２６７６３６１（Ｃ／Ｔ）ＳＮＰ遺伝子型の分布を示す棒グラフである。＜８ｆの距離で首尾よく競ってきたエリートサラブレッドは、他のサラブレッド亜集団および非サラブレッドより有意に高いＴＴ遺伝子型頻度を有する。
【図３】図３は運動中にエネルギー産生に貢献する３つの主要な代謝経路間の関係を示す図であり、優れた競走パフォーマンスに関連した３種の遺伝子、ＣＫＭ、ＣＯＸ４Ｉ２およびＰＤＫ４の機能が示される。
【図４−１】図４は、ＣＫＭ ２２６８４３９０（Ｃ／Ｔ）ＳＮＰ（Ａ）、ＣＯＸ４Ｉ２ ２２６８４３９０（Ｃ／Ｔ）ＳＮＰ（Ｂ）およびＰＤＫ４ ３８９７３２３１（Ａ／Ｇ）ＳＮＰ（Ｃ）に対するエリートサラブレッド（斜線バー）と非エリートサラブレッド間、およびＭＳＴＮ ６６４９３７３７（Ｔ／Ｃ）ＳＮＰ（Ｄ）に対するエリートスプリンター（斜線バー）とエリートエンデュアランスサラブレッド間のアレル頻度分布を示すグラフである。
【図４−２】図４は、ＣＫＭ ２２６８４３９０（Ｃ／Ｔ）ＳＮＰ（Ａ）、ＣＯＸ４Ｉ２ ２２６８４３９０（Ｃ／Ｔ）ＳＮＰ（Ｂ）およびＰＤＫ４ ３８９７３２３１（Ａ／Ｇ）ＳＮＰ（Ｃ）に対するエリートサラブレッド（斜線バー）と非エリートサラブレッド間、およびＭＳＴＮ ６６４９３７３７（Ｔ／Ｃ）ＳＮＰ（Ｄ）に対するエリートスプリンター（斜線バー）とエリートエンデュアランスサラブレッド間のアレル頻度分布を示すグラフである。
【図５−１】図５は、ＣＫＭ ２２６８４３９０（Ｃ／Ｔ）ＳＮＰ（Ａ）、ＣＯＸ４Ｉ２ ２２６８４３９０（Ｃ／Ｔ）ＳＮＰ（Ｂ）およびＰＤＫ４ ３８９７３２３１（Ａ／Ｇ）ＳＮＰ（Ｃ）に対するエリートサラブレッド（斜線バー）と非エリートサラブレッド間、およびＭＳＴＮ ６６４９３７３７（Ｔ／Ｃ）ＳＮＰ（Ｄ）に対するエリートスプリンター（斜線バー）とエリートエンデュアランスサラブレッド間の遺伝子型頻度分布を示すグラフである。
【図５−２】図５は、ＣＫＭ ２２６８４３９０（Ｃ／Ｔ）ＳＮＰ（Ａ）、ＣＯＸ４Ｉ２ ２２６８４３９０（Ｃ／Ｔ）ＳＮＰ（Ｂ）およびＰＤＫ４ ３８９７３２３１（Ａ／Ｇ）ＳＮＰ（Ｃ）に対するエリートサラブレッド（斜線バー）と非エリートサラブレッド間、およびＭＳＴＮ ６６４９３７３７（Ｔ／Ｃ）ＳＮＰ（Ｄ）に対するエリートスプリンター（斜線バー）とエリートエンデュアランスサラブレッド間の遺伝子型頻度分布を示すグラフである。
【図６−１】図６の（Ａ）〜（Ｃ）は、最適レース距離に関するＭＳＴＮ ６６４９３７３７（Ｔ／Ｃ）ＳＮＰの遺伝子型頻度を示すグラフであり、（Ａ）はＣ／Ｃ遺伝子型頻度を示し；（Ｂ）はＣ／Ｔ遺伝子型頻度を示し；
【図６−２】そして（Ｃ）はＴ／Ｔ遺伝子型頻度を示す。
【図７】図７は、ＭＳＴＮ ６６４９３７３７（Ｔ／Ｃ）ＳＮＰの最適レース距離の遺伝子型頻度を示すグラフであり、ここでは２歳馬としてのグループレースで勝利したウマの最適レース距離はそれらの３歳馬レースの平均距離に置き換えられた。
【図８】図８は、持続性運動パフォーマンスに関して公知のエジプト系アラビア馬の非サラブレッド集団とサラブレッド集団における、ＭＳＴＮ ６６４９３７３７（Ｔ／Ｃ）ＳＮＰの遺伝子型頻度を示すグラフである。
【図９】図９は、６〜８ｆ、８〜１０ｆ、１０〜１２ｆのスタミナインデックスを持つ種馬（ｓｔａｌｌｉｏｎ）のＭＳＴＮ ６６４９３７３７（Ｔ／Ｃ）ＳＮＰの遺伝子型頻度を示すグラフである。
【図１０】図１０はＭＳＴＮ ６６４９３７３７（Ｔ／Ｃ）ＳＮＰのＣ／Ｃ、Ｃ／ＴおよびＴ／Ｔ遺伝子型に関するＭＳＴＮ遺伝子の相対発現を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
サラブレッド馬（Ｅｑｕｕｓ ｃａｂａｌｌｕｓ）における優れた競走パフォーマンスに関する厳しい選択の結果、運動にとって適切な多数の適応性生理的表現型が生まれたが、これらの特徴を引き起こす基礎的な分子機序は十分に理解されていない。
【００４８】
Ｅｉｖｅｒｓら（２００９）は、８頭の無調教サラブレッド馬における標準化漸増−ステップトレッドミル運動試験後のウマ骨格筋における運動−反応候補遺伝子群のｍＲＮＡ発現の適応性変化を検討した。該研究では、生検標本は運動前（Ｔ０）、運動後すぐ（Ｔ１）および運動後４時間（Ｔ２）の中臀筋から得られた。Ｔ２ではＴ０に比較して８遺伝子（ＣＫＭ、ＣＯＸ４Ｉ１、ＣＯＸ４Ｉ２、ＰＤＫ４、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、ＰＲＫＡＡ１、ＳＬＣ２Ａ１、およびＳＬＣ２Ａ４）において有意な倍率の差（Ｐ＜０．０５）が検出された。最大心拍数（ＶＨＲｍａｘ）におけるｍＲＮＡおよび速度と運動後のピーク血漿中乳酸塩濃度（［Ｌａ］Ｔ１）の関係を研究することによって、彼らはＴ２でのＣＯＸ４Ｉ１とＰＰＡＲＣＧ１Ａ、およびＴ０での［Ｌａ］Ｔ１とＣＯＸ４Ｉ１間の有意な（Ｐ＜０．０５）関連を証明した。後続の研究では、彼らは１０か月調教後の第２コホートのウマにおける遺伝子発現変化を検討した。彼らは、静止標本では、ＣＯＸ４Ｉ１遺伝子が調教後に有意な量の増加を示し、そして調教されたコホートでは運動後にＴ２において有意な倍率の差がＣＯＸ４Ｉ２、ＰＤＫ４およびＰＰＡＲＧＣ１Ａで確認されることを示した。彼らはまたＰＰＡＲＧＣ１ＡおよびＣＯＸ４Ｉ１に関してＶＨＲｍａｘと［Ｌａ］Ｔ１の有意な関係を検出した。
【００４９】
本発明は、サラブレッド競走馬において多数の運動反応遺伝子候補（付録に列挙される）における配列変異体（たとえば、ＳＮＰ）と、後向き競技パフォーマンス（競馬場成功、すなわち、グループ勝ち馬または非勝ち馬、グループ勝ち馬のハンディキャップレーティング（ＲＰＲ）および最適レース距離として示される）間の今まで未知の関係に関する。ある側面では、本発明はＣＯＸ４Ｉ１、ＣＯＸ４Ｉ２、ＰＤＫ４、ＣＫＭおよびＭＳＴＮ遺伝子におけるＳＮＰに関する。
【００５０】
ＣＯＸ４Ｉ１およびＣＯＸ４Ｉ２
シトクロムＣオキシダーゼ（ＣＯＸ）は、ミトコンドリア呼吸において還元されたシトクロムＣから酸素への電子伝達を触媒するマルチ−サブユニット酵素（複合体ＩＶ）である。ＣＯＸはダイマーであり、それぞれのモノマーは１３サブユニットから構成され、そのうちの３つ（ＣＯＸ１、２および３）はミトコンドリアゲノムによってコード化される。核内コード化ＣＯＸ４はミトコンドリア内膜上のミトコンドリアコード化サブユニットの調節および会合に関与する（Ｆｕｋｕｄａら ２００７）。ヒト骨格筋では、ＣＯＸ４ ｍＲＮＡレベルはミトコンドリア容積、伸長およびＶＯ２ｍａｘと関連することが示されている。ＣＯＸ４は、ＣＯＸ４Ｉ１およびＣＯＸ４Ｉ２遺伝子によってコードされる２つのイソ型（ＣＯＸ４−１およびＣＯＸ４−２）を含み、それらは正常酸素環境および低酸素環境において異なって調節される（Ｆｕｋｕｄａら ２００７）。正常酸素環境では、ＣＯＸ４Ｉ１は優先的に転写される。限定された酸素環境では、ＨＩＦ−１がＣＯＸ４Ｉ２およびミトコンドリアＬＯＮ遺伝子の転写を活性化する。ＬＯＮはＣＯＸ４Ｉ１の発現を阻害するため、これらの制御機序はＣＯＸ４Ｉ２の転写および蛋白質合成を増し、ＣＯＸ４−１の利用能を減少させる。この機序は限定された酸素環境において細胞呼吸の効率を最大にするための方策であると見なされている（Ｆｕｋｕｄａら ２００７）。
【００５１】
レース中の生理的要求はエネルギー需要に依存して異なり、最も効率的な様式でエネルギーを提供するための代謝経路の分配によって調節される。酸素供給は運動している筋肉の需要に応えることができないため、過最大強度（１０５〜１２５％ＶＯ２ｍａｘ）における運動の初めの７５秒間にウマは酸素欠乏を経験する（Ｄｅｍｐｓｅｙ ａｎｄ Ｗａｇｎｅｒ １９９９；Ｓｅａｍａｎら １９９５）。より長い距離およびより長い期間（＞７５秒）の間に、ウマは定常状態ＶＯ２に到達し、主として好気的代謝に頼る。レースの終了時には、ウマが“乳酸塩閾値”を通過するため、酸素消費需要は増大する。短距離レース（＜１，０００ｍ）中に、筋肉収縮に必要なＡＴＰの形態における総エネルギーのおよそ７０％は好気的代謝経路によって生み出される（Ｅａｔｏｎら １９９５）。短距離を過最大強度で運動するサラブレッド馬では、この低酸素環境が、都合よく保存された代謝スィッチをＣＯＸ４−１からＣＯＸ４−２利用に切り換えてもよい（Ｆｕｋｕｄａら ２００７）。この環境によるＣＯＸ４−２の調節が細胞の呼吸効率を増大させてもよい。ＣＯＸ４−２は従って、酸素が限定される場合、レースの初期段階において、およびレースの終了にむけてのエネルギー供給の重要なレギュレーターである。図１からわかるように、運動の初期段階において、およびレースの終了に向けて末梢の生理的システム（すなわち、骨格筋）が限定された酸素環境で稼働している間、大量のエネルギーが要求される。ＣＯＸ４−２を介したエネルギーの生成がこれらの両方の段階の期間中重要であってもよい。
【００５２】
ミトコンドリア生合成の調節がグルココルチコイドホルモンによって媒介されてもよいことは示唆されている（Ｗｅｂｅｒら ２００２）。ＣＯＸ４Ｉ２遺伝子はグルココルチコイド受容体エレメント（ＴＧＴＴ）を含み、それがＣＯＸ４−２発現を増大させ、従ってミトコンドリア容積を増すために標的とされてもよい。さらに、ＣＯＸ４Ｉ２遺伝子はｐ５３腫瘍サプレッサー結合部位（ＣＡＴＧ）を含む。最近の研究はｐ５３がミトコンドリア生合成およびＣＯＸを介した好気的代謝の調節において役割を果たしてもよいことを示唆している（Ｍａｔｏｂａら ２００６；Ｓａｌｅｅｍら ２００９）。
【００５３】
ＣＫＭ
クレアチンキナーゼ（ＣＫ）はクレアチンホスホキナーゼ（ＣＰＫ）またはホスホクレアチンキナーゼとしても知られ、種々の組織型によって発現される酵素（ＥＣ２.７.３.２
）である。該酵素はクレアチンの変換を触媒し、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）を消費してホスホクレアチンとアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）を作り出す。ＡＴＰを速やかに消費する組織、とりわけ骨格筋、さらに脳および平滑筋では、ホスホクレアチンは迅速なＡＴＰ再生のための貯蔵所として役立つ。従ってクレアチンキナーゼはそのような組織における重要な酵素である。
【００５４】
多くの細胞では、ＣＫ酵素は２つのサブユニットからなり、それはＢ（脳型）またはＭ（筋肉型）のいずれであってもよい。従って、３種の異なるアイソザイム：ＣＫ−ＭＭ、ＣＫ−ＢＢおよびＣＫ−ＭＢが存在する。これらのサブユニットの遺伝子は異なるクロモソーム上に位置する。その上、ミトコンドリアクレアチンキナーゼにはユビキタス型とサルコメア型の２つの形態が存在する。異なる型のＣＫアイソザイムを表１に列挙する。
【００５５】
表１−クレアチンキナーゼのアイソザイム
【００５６】
【表１】
【００５７】
アイソザイムパターンは組織型に依存して異なる。たとえば、ＣＫ−ＢＢは主に脳に存在し、そのレベルは骨格筋ではめったに意味を持たない。骨格筋はＣＫ−ＭＭ（９８％）および低レベルのＣＫ−ＭＢ（１％）を発現するが、対照的に心筋層（心臓の筋肉）はＣＫ−ＭＭを約７０％そしてＣＫ−ＭＢを２５〜３０％発現する。
【００５８】
クレアチンリン酸をクレアチンに変換することによってＡＤＰからＡＴＰを生産するミトコンドリアクレアチンキナーゼ（ＣＫｍ）はミトコンドリア内膜腔に存在する。ミトコンドリア形態とは別にサイトソルには３種の形態が存在する−ＣＫａ（緊急に必要な場合、クレアチンリン酸を犠牲にしてサイトソルでＡＴＰを生産する）、ＣＫｃ（リン酸化および脱リン酸化をそれぞれＡＴＰおよびＡＤＰとカップリングすることによりサイトソルにおけるクレアチンおよびクレアチンリン酸の必要な濃度を維持する）およびＣＫｇ（クレアチンの直接リン酸化を解糖経路に連結する）。
【００５９】
クレアチンキナーゼ、筋肉遺伝子（ＣＫＭ）はもっぱら横紋筋に見出されるクレアチンキナーゼの筋肉型アイソザイムをコードする。コードされた蛋白質は細胞のエネルギー論に関与する。運動中に、ＣＫＭ遺伝子ノックアウトマウスはバースト活動の欠如を示すが、正常な絶対筋力を維持する（ｖａｎ Ｄｅｕｒｓｅｎら １９９３）。本発明者らはＣＫＭ遺伝子転写物がサラブレッド馬骨格筋トランスクリプトームにおいて最も豊富な転写物であることを見出していて、ウマの運動適応においてＣＫＭ遺伝子が極めて重要な役割を果たすことを支持する。
【００６０】
ＰＤＫ４
グルコース利用の調節はグルコーストランスポーターによるグルコースの取り込み、解糖フラックスの速度およびピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体（ＰＤＣ）の触媒機能を介したミトコンドリアにおけるピルビン酸塩からアセチルＣｏＡへの変換によって厳密に制御されている。グルコースの酸化における重要な律速段階はピルビン酸デヒドロゲナーゼキナーゼ（ＰＤＫ）によって制御されるＰＤＣ会合の調節である。ＰＤＫはＰＤＣの形成を遮断し、脂肪酸をベータ−酸化して、酸化的リン酸化の基質としてのアセチル−ＣｏＡを生じる。ＰＤＫイソ型をコードする４種の遺伝子の中の３種の遺伝子（ＰＤＫ２、ＰＤＫ３およびＰＤＫ４）は、サラブレッドにおいて正の選択をされた遺伝子領域に位置する（Ｇｕら ２００９）。ＰＤＫ４遺伝子プロモーターは、肝臓および脂肪組織におけるインスリンシグナリングの重要なレギュレーターであるＦＯＸＯ１Ａ転写因子の結合部位を含む。ＦＯＸＯ１Ａにおける一塩基多型は、Ｔ２ＤＭ（２型糖尿病）発症およびヒトの関連した表現型に対して保護効果を有することが見出されている。ＦＯＸＯ１Ａはまた、サラブレッドにおいて正選択された遺伝子領域の中に見出され、そのＰＤＫ４プロモーター結合部位配列はウマにおいて保存される。転写因子ＦＯＸＯ１およびＳＭＡＤはまた、ミオスタチン（ＭＳＴＮ）遺伝子調節に関与し、それ故筋肉成長の制御において重要な役割を果たしていることが示されている。
【００６１】
正選択に関するゲノムスキャンでは、Ｇｕら（２００９）は２つの独立した統計的検定（ＦＳＴおよびＥｗｅｎｓ−Ｗａｔｔｅｒｓｏｎ検定）において中立期待から極めて有意に逸脱した領域を検出した。この領域はＰＤＫ４遺伝子を含んでいた。ＰＤＫ４遺伝子発現はＥＲＰα（エストロゲン−関連受容体α）結合を介して転写共役因子ＰＧＣ−１αによって調整される。ＰＰＡＲＧＣ１Ａ（ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体ガンマ、共役因子１アルファ）遺伝子によってコードされるＰＧＣ−１αは、ＳＬＣ２Ａ４（溶質運搬体ファミリー２（促進拡散型グルコース輸送体）、メンバー４；；以前はＧＬＵＴ４）を介してグルコース輸送をコントロールすることによってインスリン感受性を調節するエネルギー代謝の重要なレギュレーターであり、そして酸化的筋肉線維形成を行わせ、核内コード化ミトコンドリア蛋白質遺伝子とその相互作用を介してミトコンドリア生合成を調整する。
【００６２】
ＭＳＴＮ
ミオスタチンは、成長／分化因子８前駆体（ＧＤＦ−８）としても公知である。いくつかの哺乳動物種（ウシ、ヒツジおよびイヌを含む）では、筋肉肥大形質はミオスタチン（ＭＳＴＮ）遺伝子における突然変異によって引き起こされる。イヌでは、競走ウィペット（ｗｈｉｐｐｅｔ）におけるＭＳＴＮ遺伝子突然変異は“闘争的（ｂｕｌｌｙ）”表現型に関連付けられていて、ヘテロ接合の個体は、野生遺伝子型を持つ個体より有意に速い（Ｍｏｓｈｅｒら ２００７）。ＭＳＴＮ遺伝子における突然変異が競技パワーと関連してもよい。
【００６３】
本発明者らは競技パフォーマンスに関連した遺伝子における多数の一塩基多型（ＳＮＰ）を分析していて、ＳＮＰに基づいて対象の潜在的競技パフォーマンスを予測する簡単なＤＮＡを基礎にした方法を開発している。
【００６４】
本発明は以下の実施例からいっそう明確に理解されるであろう。
【実施例】
【００６５】
対象
サラブレッドとは、三大基礎種馬（ｓｔａｌｌｉｏｎ）の１種およびＴｈｅ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｓｔｕｄｂｏｏｋ，１７９１（Ｗｅａｔｈｅｒｂｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ １７９１）に記載されたおよそ３０の基礎雌馬にその血統をたどることができる登録された競走馬である。サラブレッドレースには２つの型があり：ナショナルハントレース（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｈｕｎｔ ｒａｃｅ）はハードルを跳び越えるか、またはフェンスを飛び越して４．５マイル（７，２００ｍ）までの距離を走るが、フラットレース（Ｆｌａｔ ｒａｃｅ）は障害物がなく、５ファーロング（５／８マイルまたは１，００６ｍ）から２０ファーロング（４，０２４ｍ）までの範囲の距離を走る。最も重要な標準となり、そして最も価値のあるえり抜きのフラットレースは、グループ（Ｇｒｏｕｐ）レース（ヨーロッパおよびオーストラレーシア）またはステークス（Ｓｔａｋｅｓ）レース（北米）として知られる。これらのレースの中で最も一流なものには、ブリーダーズカップレース（Ｔｈｅ Ｂｒｅｅｄｅｒｓ' Ｃｕｐ ｒａｃｅｓ（米国））、ケンタッキーダービー（Ｔｈｅ Ｋｅｎｔｕｃｋｙ Ｄｅｒｂｙ）（米国）、エプソムダービー（Ｔｈｅ Ｅｐｓｏｍ Ｄｅｒｂｙ）（英国）などが挙げられる。
【００６６】
ヨーロッパ（イギリス（Ｂｒｉｔａｉｎ）、アイルランド（北アイルランドを含む）、フランス、ドイツ、イタリア）では、８４のグループ１、９３のグループ２、および１７３のグループ３レースを含む年間３５０のグループレースが行われる。イギリス（Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）およびアイルランドでは、年間１９６のグループレース（４３のグループ１、５０のグループ２および１０３のグループ３）が競われる。イギリス（Ｂｒｉｔａｉｎ）はヨーロッパの中で１年に行われるグループレースの数（１３９）が最も多く、５７％が≦１マイル（１６０９メートル）、そして４３％が＞１マイルの距離を走る。オーストラリアは全部でほぼ２１，０００のレースから、季節毎におよそ５４０〜５５０のグループレースを行い、ニュージーランドは季節毎に７８のグループレースを主催する。グループレースの後は、準重賞レースが次の最も高いグレードのレースである。
【００６７】
≦１マイルの距離を競う馬は“スプリンター”として知られ、＞１マイルの距離を競うウマは“ステイヤー”として知られる。１マイルレースを競うウマ（‘マイラー’および‘中距離馬’）はスプリンターまたはステイヤーのいずれと見なされてもよく、騎手によってレースが行われる様式は、しばしばトレーナーが認めたウマの能力（‘スプリンター’または‘ステイヤー’）を反映する。国際競馬統括機関連盟（Ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｏｒｓｅｒａｃｉｎｇ Ａｕｔｈｏｒｉｔｉｅｓ）は５つのレース距離カテゴリー：短距離（５〜６．５ｆ、≦１，３００ｍ）、マイル（６．５１〜９．４９ｆ、１，３０１〜１，９００ｍ）、中距離（９．５〜１０．５ｆ、１，９０１〜２，１１２ｍ）、長距離（１０．５１〜１３．５ｆ、２，１１４〜２，７１６ｍ）および超長距離（＞１３．５１ｆ、＞２，７１７ｍ）；Ｓ−Ｍ−Ｉ−Ｌ−Ｅを認めている［注：１ファーロング＝１／８マイル＝２０１．２メートル］。
【００６８】
障害物レースの混乱した効果を最小限にするために、フラットレースでパフォーマンスレコードを持つウマだけが研究のコホートに含まれると見なされた。すべてのケースにおいて、２世代内の血族関係を共有する標本を排除することにより遺伝的背景を制御するために血統情報を使用した。さらに、血統内の評判のよい種親（ｓｉｒｅ）の過剰提示は可能な場合回避された。
【００６９】
１９９７〜２００６年の間に、アイルランド、イギリス（Ｂｒｉｔａｉｎ）およびニュージーランドにおいて、サラブレッド馬に由来する標本は、競走、育種および販売体制からオーナーのインフォームドコンセントを得て集められた。すべてのウマは“エリートサラブレッド”（ＴＢＥ）または“その他のサラブレッド”（ＴＢＯ）としての後ろ向き競馬場パフォーマンスレコードに基づいて分類された。エリートサラブレッドは少なくとも１つのグループ（グループ１、グループ２またはグループ３）レースに勝利しているフラットレース馬であった。その他のサラブレッドは競馬場で競走したが、フラットレースに勝利しなかったか、または８９未満のハンディキャップレーティング（レーシングポストレーティング（ＲＰＲ））を有するウマであった。
【００７０】
実施例１−ＣＯＸ４Ｉ２
短距離運動中は限定された酸素環境にもかかわらず、筋肉収縮に必要なＡＴＰの形態におけるエネルギーは好気的代謝経路（７０％好気的、３０％嫌気的）によって主に生成される。本発明者らはこの相対的低酸素環境が、都合よく保存された代謝スィッチをＣＯＸ４−１からＣＯＸ４−２に切り換え、それによって細胞呼吸の効率を増大させることを示唆する。ＣＯＸ４−２は従って全力疾走中のエネルギー供給の重要なレギュレーターであるが、酸素需要が満たされる長距離競技では必ずしも必要ではない。このスィッチは、低酸素−依存的遺伝子発現の主要なレギュレーターとして十分に性状が解析されている細胞内転写因子ＨＩＦ−１αによって媒介される（Ｓｅｍｅｎｚａ １９９８）。ＨＩＦ−１αはＰＤＫ１、ＬＤＨＡ、ＣＯＸ４−２およびＬＯＮをコードする遺伝子の転写を活性化し、ＣＯＸ４−１からＣＯＸ４−２へのスィッチを制御する。極めて激しい運動中に酸素が欠乏するサラブレッドの筋肉では、減少した酸素に対して亢進される反応および最も効率的なやり方でＡＴＰを生成する能力がその個体にとって有意義な利点を提供するであろう。
【００７１】
さらに、増大したミトコンドリア容積はより高い好気的生産能力に関連することが示されている（Ｆｌｕｃｋ ２００６）。増大した量のグルココルチコイドホルモンが、ミトコンドリアゲノムを特に目標とするか、または未知の機序によるかのいずれかでミトコンドリア生合成を刺激することが示されている（Ｗｅｂｅｒら ２００２）。グルココルチコイド受容体エレメント（グルココルチコイド反応性および関連性エレメント）は認識配列（ＴＧＴＴ）を含む。ＣＯＸ４Ｉ２遺伝子はイントロン２にこれらのエレメントの１つを含む。従って、グルココルチコイド結合が遺伝子発現増大を刺激し、ミトコンドリア容積増大およびその結果の好気的エネルギー生産能力を導いてもよい。
【００７２】
ある側面では、本発明は優れた全力疾走パフォーマンスに有意（Ｐ＜０．０１）に関連するＣＯＸ４Ｉ２における一塩基多型（ＳＮＰ）に関する。優れた短距離レース勝ち馬におけるＣＯＸ４Ｉ２ホモ接合ＴＴ遺伝子型（ＥｑｕＣａｂ２．０ ２２６７６３６１−Ｃ／Ｔ）の有意な関連が、サラブレッド馬における優れた競技パフォーマンスの、ＤＮＡを基礎にした遺伝的潜在性検定において利用されてもよい。
【００７３】
ＣＯＸ４Ｉ２遺伝子（ＥｑｕＣａｂ２．０ ２２６７６３６１−Ｃ／Ｔ）多型の正確な位置
ＣＯＸ４Ｉ２多型の正確な位置は、ｗｗｗ．ｂｒｏａｄ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｍａｍｍａｌｓ／ｈｏｒｓｅ／／で調べることができるウマゲノム配列（Ｅｑｕｕｓ ｃａｂａｌｌｕｓ．２．０版）のウマ（Ｅｑｕｕｓ ｃａｂａｌｌｕｓ）クロモソーム２２上の２２６７６３６１位である。ＣＯＸ４Ｉ２多型はＥｑｕＣａｂ２．０ ＣＯＸ４Ｉ２＿２２６７６３６１（Ｃ／Ｔ）ＳＮＰとして同定され得る。
【００７４】
ウマゲノムＥｑｕＣａｂ２アセンブリーは６．７９ｘにおける全ゲノムショットガン（Ｗｈｏｌｅ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｈｏｔｇｕｎ）（ＷＧＳ）アセンブリーであり、２００７年９月に公開された。''Ｔｗｉｌｉｇｈｔ''という名の雌サラブレッドがゲノム配列決定のための代表馬として選択された。プロジェクトの調整ならびにゲノム配列決定およびアセンブリーはＢｒｏａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅによって提供される。Ｎ５０サイズは、アセンブルしたゲノムの５０％がＮ５０サイズまたはそれより長いブロックで存在するような長さである。コンティグのＮ５０サイズは１１２．３８ｋｂであり、すべてのコンティグの全長は２．４３Ｇｂである。スカホールド（ｓｃａｆｆｏｌｄ）におけるコンティグ間のギャップが含まれる場合、アセンブリーの全長は２．６８Ｇｂである。ウマＥｑｕＣａｂ２は標準Ｅｎｓｅｍｂｌ哺乳動物パイプラインを使用してアノテーションされた。脊椎哺乳動物およびウマ蛋白質からの予測は、非脊椎哺乳動物に由来する予測に対して優先されている。予測のセットはヒトおよびマウスにおける１：１相同遺伝子に比較され、ウマアノテーションにおいて欠損したホモログはｅｘｏｎｅｒａｔｅを使用して発見されている。ウマおよびヒトｃＤＮＡは蛋白質に基づいた予測にＵＴＲを添加するために使用されている。最終遺伝子−セットは２０，７３７の蛋白質−コーディング遺伝子を含み、２，８６３は偽遺伝子として確認され、１，５８０はレトロトランスポゾン遺伝子として分類された。
【００７５】
ＥｑｕＣａｂ２．０ ＣＯＸ４Ｉ２−２２６７６３６１−Ｃ／Ｔ多型の遺伝子型判定
ＳＮＰの遺伝子型判定はエリート（ｎ＝７９）および非エリート（ｎ＝７０）パフォーマーを共に含むサラブレッド（ｎ＝１４９）の標本において実行された。エリートパフォーマー群は、優先的に短距離（≦１マイル；ｎ＝３４）レースおよび長距離（＞１マイル；ｎ＝３６）レースにおいて競走した動物のサブセット（ｎ＝７０）を含んだ。
【００７６】
ゲノムＤＮＡは新鮮な全血または体毛標本のいずれかから抽出された。血液標本は７ｍｌのバキュテナー（Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ）Ｋ３ＥＤＴＡ血液回収チューブ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）に集められた。明白な毛根を持つ体毛標本は、ラベル付きの気密ジップロック（ｚｉｐ−ｌｏｃｋ）袋に集められた。標本は、改変した標準フェノール／クロロホルム法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ ２００１）を使用してＤＮＡを抽出するまで４℃で保管された。すべての標本のＤＮＡ濃度はＮａｎｏＤｒｏｐ ＮＤ−１０００ ＵＶ−可視分光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）を使用して推測された。
【００７７】
フランキング配列およびＳＮＰ（角括弧で囲んだ太字）は以下の通りである；
（小文字で示された塩基は、配列読み取りがフランキング配列のこの領域に対して最適ではなかったことを示す）
ｃａａｇａｇｔｇｇａｇｔｇｔｇｃｔｃｃａａｇａａｃｔｇｇａｇｇｃｔａｇｃａｔｇｔａｇｃａｇａｇｇａｇｇｃａｇｔａｇｃａｇａｇｇａｇｇａｇａｇｇｔｔｇａｔｇｇｇｇｇａｇｃｔｇｃａｔｔｔｇｇａｇａｇｔｃｔｇｇｃａｇｇｃａｇｇａｃｃｔｔｇａａｔｇｃｃａｇｇｃｔａａｇｇａｇｔｔｔＡＴＴＧＧＧＡＧＧＣＡＡＧＴＧＧＧＴＧＣＴＧＡＴＡＡＡＧＧＣＴＣＡＡＧＧＡＴＴＣＣＡＴＣＡＧＧＣＴＧＴＴＣＣＣＡＣＡＡＡＧＡＣＣ［Ｃ／Ｔ］ＧＧＧＣＣＡＣＣＴＣＡＧＧＧＣＡＣＣＡＴＡＴＣＣＣＣＡＴＡＴＣＣＡＧＧＡＧＣＣＡＧＴＴＧＴＧＴＣＣＣＡＧＡＧＡＡＡＡＣＡＡＧＧＧＡＣＴＧＧＡＣＣＴＴＧＡＧＡＣＴＴＧＧＣＣＡＧＴＧＴＣＣＴＴＣＡＣＡＴＣＣＴＡＣＣＣＴＧＴＧＣＡＣＧＣＣＣＣＴＧＴＴＴＧＧＣＣＴＧＴＧＧＴＧＣＡＧＡＡＧＧＣＣＣＣＴＧＧＧＡＧＡＣＣＴＧＡＡＧＣＡＧＡＡＧＣＴＧＣＡＧＡＣＣＡＴＴＣＣＡＧＧＴＴＡＧＴＧＴＧＧＡＧＣＣＣＣＡＧＡ
（ＳＥＱ．ＩＤ Ｎｏ．１）
ＣＯＸ４Ｉ２遺伝子の遺伝子型判定は、競合的アレル特異的ＰＣＲ（ＫＡＳＰａｒ）またはＴａｑｍａｎ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）のいずれかを使用してＫＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ｗｗｗ．ｋｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ．ｃｏ．ｕｋ）によって実施された。ＫＡＳＰａｒは企業内所有の均質な蛍光遺伝子型判定系である。
【００７８】
全ＤＮＡの中の２５μＬは“ｖ−底の”９６ウェルマイクロタイタープレート中、１５ｎｇ／μＬの濃度でＫＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓに供給された。再現性をチェックするため、および標本取り扱いにおける誤差を制御するために、設定およびアッセイ検証（ｎ＝２４）ならびにブランク（９６ウェルプレート毎にｎ＝１）用のいくつかの標本も含まれた。
【００７９】
遺伝解析研究
遺伝子型判定後、先に記載の対象（ｎ＝１４９）に対して遺伝解析が実行された。
【００８０】
それぞれのＳＮＰに対して個々の二分化ロジスティック回帰モデルを適合させた。遺伝子型傾向効果は、一般的ホモ接合、ヘテロ接合、およびまれなホモ接合遺伝子型に関した効果の大きさにおける線形傾向に関連したリスクを推測することによってモデル化された。Ｐ−値は、優度比検定統計値から決定され、自由度１を持つ漸近χ２分布に従って近似された。有意に関連のあるＳＮＰのための最適な遺伝モデルは、相加、劣性および超優性モデルのコーディング変数を持つ解析を反復することによって決定された。
【００８１】
表２は対象間のＥｑｕＣａｂ２．０ ＣＯＸ４Ｉ２＿２２６７６３６１（Ｃ／Ｔ）ＳＮＰ遺伝子型頻度を示す。
【００８２】
【表２】
【００８３】
表中：Ｓｐ＝スプリンター
Ｅｎ＝エンデュアランス（または‘ステイヤー’）
ＯＲ＝オッズ比
ＬＯＷＥＲ＝下限信頼区間
ＵＰＰＥＲ＝上限信頼区間
表２では、ＥｑｕＣａｂ２．０ ＣＯＸ４Ｉ２＿２２６７６３６１（Ｃ／Ｔ）ＳＮＰホモ接合ＴＴ遺伝子型は＜８ファーロング（１マイル未満）の距離での優れた競走（全力疾走）パフォーマンスに有意に関連し（Ｐ＜０．０２）（図２）、この関連は＜７ｆの距離ではいっそう顕著である（Ｐ＜０．０１）。
【００８４】
ＣＯＸ４Ｉ２＿２２６７６３６１（Ｃ／Ｔ）ＳＮＰのホモ接合Ｔアレルを持つサラブレッド馬は、ヘテロ接合Ｔアレル（ＴＣ）を持つサラブレッド馬、またはＴアレル（ＣＣ）を持たないサラブレッド馬に比較して優れた全力疾走パフォーマンスを有する。従って、サラブレッド馬の全力疾走パフォーマンスはＣＯＸ４Ｉ２＿２２６７６３６１（Ｃ／Ｔ）ＳＮＰのホモ接合Ｔアレルの存在または不在に関して生物学的標本を試験することによって予測することができる。
【００８５】
実施例２−サラブレッド競走パフォーマンスに関連する遺伝子
本発明者らは以下の遺伝子：ＡＣＮ９、ＡＣＳＳ１、ＡＣＴＡ１、ＡＣＴＮ２、ＡＤＨＦＥ１、ＧＧＰＳ１、ＧＳＮ、ＭＣ３Ｒ、ＭＴＦＲ１、ＮＤＵＦＡ８、ＰＤＫ４、ＰＯＮ１、ＰＴＧＳ１、ＰＴＰＮ１、ＴＮＣ、ＴＯＭＭ２０、ＵＧＣＧ ＣＫＭ、ＣＯＸ４Ｉ２、ＣＯＸ４Ｉ１、ＨＩＦ１Ａ、ＭＹＥＦ２、およびＰＲＫＡＡ１における８０のＳＮＰ間の関連を検討した（ＳＮＰの詳細はサラブレッド競走パフォーマンスに関する付録に示す）。
【００８６】
本発明はＡＣＮ９、ＡＣＳＳ１、ＡＣＴＮ２、ＡＤＨＦＥ１、ＣＫＭ、ＣＯＸ４Ｉ２、ＧＳＮ、ＭＳＴＮ、ＰＯＮ１、ＰＴＧＳ１およびＰＴＰＮ１を含むこれらの遺伝子セットにおけるＳＮＰと競技パフォーマンス表現型間の有意な関連を確認する（付録を参照されたい）。ウマ骨格筋における運動に対する公知の遺伝子発現反応（Ｅｉｖｅｒｓら ２００９）およびイヌにおけるパフォーマンスとの関連の証拠（Ｍｏｓｈｅｒら ２００８）および訓練に対する反応から、サラブレッド競走パフォーマンスと有意な関連を有する４種の遺伝子（ＣＫＭ、ＣＯＸ４Ｉ２、ＰＤＫ４およびＭＳＴＮ）が詳細に検討された。これらの遺伝子の中の３種（ＣＫＭ、ＣＯＸ４Ｉ２およびＰＤＫ４）におけるＳＮＰは優れた競技パフォーマンス（グループレース勝利）に関連し、ＭＳＴＮ遺伝子におけるＳＮＰは優れた短距離レースパフォーマンスに関連する。
【００８７】
この実施例では、以下の標本セットが使用された：
表３−それぞれの亜集団にふくまれる標本の詳細。
【００８８】
【表３】
【００８９】
表中、ＴＢはサラブレッドであり、ＴＢＥはエリートグループレース勝利サラブレッドであり；そしてＴＢＯは非エリート（すなわち、その他の非勝利）サラブレッドである。ＴＢＥコホートはさらにＴＢＥ＿スプリンター（ｎ＝３９）およびＴＢＥ＿エンデュアランスまたは‘ステイヤー’（ｎ＝３２）に細分化された。
【００９０】
遺伝解析研究
ＳＮＰと競技パフォーマンスとの関連に関する検定は、ＰＬＩＮＫプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｐｎｇｕ．ｍｇｈ．ｈａｒｖａｒｄ．ｅｄｕ／ｐｕｒｃｅｌｌ／ｐｌｉｎｋ／ Ｐｕｒｃｅｌｌら，２００７)を使用して実施された。
【００９１】
標準ケース／コントロール関連解析
標準ケース／コントロール関連解析を実施するために、オプション：ｐｌｉｎｋ−−ｆｉｌｅ ｍｙｄａｔａ -ａｓｓｏｃが使用され、それが以下のフィールドを含むファイルｐｌｉｎｋ．ａｓｓｏｃを生成する：
ＣＨＲ クロモソーム
ＳＮＰ ＳＮＰ ＩＤ
ＢＰ 染色体上の位置（塩基対）
Ａ１ マイナーアレル名（全標本に基づく）
Ｆ＿Ａ ケースにおけるこのアレルの頻度
Ｆ＿Ｕ コントロールにおけるこのアレルの頻度
Ａ２ メジャーアレル名
ＣＨＩＳＱ 基本アレル検定χ−２乗（１ｄｆ）
Ｐ この検定に関する漸近ｐ−値
ＯＲ 推定オッズ比（Ａ１に関する）
関連解析
モデルオプション（ｍｏｄｅｌ ｏｐｔｉｏｎ）を使用することによって、基本アレル検定（ケース対コントロールにおけるアレルの頻度を比較する）以外の疾患と変異体間の関連の検定を実施することが可能である。本明細書で提案された検定は（基本アレル検定の他に）以下の通りである：
・コクラン−アーミテージ傾向検定（Ｃｏｃｈｒａｎ−Ａｒｍｉｔａｇｅ ｔｒｅｎｄ ｔｅｓｔ）
・遺伝子型（２ｄｆ）検定
・優性遺伝子アクション（１ｄｆ）検定
・劣性遺伝子アクション（１ｄｆ）検定
コクラン−アーミテージ検定の利点の一つは、アレルではなく個体が解析の単位であるため、ハーディ・ワインベルグ（Ｈａｒｄｙ−Ｗｅｉｎｂｅｒｇ）平衡を仮定しないことである（しかし、基本アレル検定に由来する順列に基づいた経験的ｐ−値もこの特性を有する）。ハーディ・ワインベルグ平衡からの大きな逸脱を示すＳＮＰはしばしば劣ったＳＮＰである可能性があるか、または標本における層化を反映するが、それゆえ多くのケースにおいておそらく最適に排除される。
【００９２】
遺伝子型検定は疾患ｘ遺伝子型の２ｘ３表における一般的な関連検定を提供する。優性および劣性モデルはマイナーアレルに対する検定である（どれがマイナーアレルであるかは−−ａｓｓｏｃまたは−−ｆｒｅｑコマンドのいずれかの出力の中に見出すことができる。すなわち、Ｄがマイナーアレルであり（そしてｄがメジャーアレルである）場合、以下の通りである：
アレル（Ａｌｌｅｌｉｃ）： Ｄ対ｄ
優性（Ｄｏｎｍｉｎａｎｔ）： （ＤＤ，Ｄｄ）対ｄｄ
劣性（Ｒｅｃｅｓｓｉｖｅ）： ＤＤ対（Ｄｄ、ｄｄ）
遺伝子型（Ｇｅｎｏｔｙｐｉｃ）： ＤＤ対Ｄｄ対ｄｄ
先に述べたように、これらの検定は、以下のフィールドを含むファイルｐｌｉｎｋ．モデルを生成するオプションｐｌｉｎｋ--ｆｉｌｅ ｍｙｄａｔａ--ｍｏｄｅｌによって生成される：
ＣＨＲ クロモソーム番号
ＳＮＰ ＳＮＰ識別子
ＴＥＳＴ 検定の型
ＡＦＦ ケースにおける遺伝子型／アレル
ＵＮＡＦＦ コントロールにおける遺伝子型／アレル
ＣＨＩＳＱ カイ−二乗統計量
ＤＦ 検定に関する自由度
Ｐ 漸近Ｐ−値
それぞれのＳＮＰは適用される５種の検定に対応する出力の５つの列上で見られる。行のＴＥＳＴは、先に述べた異なる型の検定を表すＡＬＬＥＬＩＣ、ＴＲＥＮＤ、ＧＥＮＯ、ＤＯＭまたはＲＥＣのいずれかを表す。遺伝子型またはアレルカウントはケースおよびコントロールに対して別個に示される。劣性および優性検定の場合、カウントは遺伝子型を表し、２つのクラスはプールされる。
【００９３】
これらの検定は二倍体遺伝子型だけを考慮する：すなわち、Ｘクロモソームの場合、雄はＡＬＬＥＬＩＣ検定からさえ除外されることになる。このように、本明細書に提示された５種の検定に対して同じデータが使用される。対照的に、基本関連コマンド（−−ａｓｓｏｃ および−−ｌｉｎｅａｒなど）は単一の雄Ｘクロモソームを含み、それゆえ結果が異なってもよいことに注意されたい。
【００９４】
遺伝子型および優性／劣性検定は２ｘ３の表において細胞毎の最少観察数である場合だけ実施され：デフォルトによって、少なくとも細胞の１つが５未満の頻度を有する場合、代わりの検定は省かれることになる（ＮＡは結果ファイルの中に記載される）。コクラン−アーミテージおよびアレル検定はすべてのケースにおいて実施される。この閾値は−−ｃｅｌｌ ｏｐｔｉｏｎ：ｐｌｉｎｋ−−ｆｉｌｅ ｍｙｄａｔａ−−ｍｏｄｅｌ−−ｃｅｌｌ ２０によって変更されうる。
【００９５】
関連検定の結果は付録にすべて提供される。４つの遺伝子ＰＤＫ４、ＣＯＸ４Ｉ２、ＣＫＭおよびＭＳＴＮにおけるＳＮＰの数が検討された。それぞれの遺伝子に対して、本発明者らはその後の検討のための形質に関して最も有意な関連（Ｐ値）（表４）を持つＳＮＰを選択した。競技パフォーマンスに最も高い関連がある４つのＳＮＰはＰＤＫ４＿３８９７３２３１-Ａ／Ｇ、ＣＯＸ４Ｉ２＿２２６８４３９０-Ｃ／Ｔ、ＣＫＭ＿１５８８４５６７-Ｇ／Ａ、およびＭＳＴＮ＿６６４９３７３７-Ｔ／Ｃであった。ＰＤＫ４、ＣＫＭおよびＣＯＸ４Ｉ２におけるＳＮＰはサラブレッド競走馬の優れた全力疾走パフォーマンスと関連した。最良適合遺伝子型モデルは以下の表５の結果に基づいて割り当てられた。
【００９６】
表４−サラブレッド競走馬の優れた（グループ勝利）パフォーマンス（ＰＤＫ４、ＣＫＭおよびＣＯＸ４Ｉ２）および優れた全力疾走パフォーマンス（ＭＳＴＮ）に関するＳＮＰ関連検定の結果。それぞれの遺伝子において最も有意な関連を持つＳＮＰがここに示される。
【００９７】
【表４】
【００９８】
表中Ａ１：アレル１；Ａ２：アレル２；Ｆ＿Ａ（Ａ１）：エリートＴＢ（ＰＤＫ４、ＣＫＭおよびＣＯＸ４Ｉ２）およびエリートスプリンター（ＭＳＴＮ）におけるアレル１の頻度；Ｆ＿Ａ（Ａ２）：エリートＴＢ（ＰＤＫ４、ＣＫＭおよびＣＯＸ４Ｉ２）およびエリートスプリンター（ＭＳＴＮ）におけるアレル２の頻度；Ｆ＿Ｕ（Ａ１）：非エリートＴＢ（ＰＤＫ４、ＣＫＭおよびＣＯＸ４Ｉ２）およびエリートエンデュアランス（ＭＳＴＮ）におけるアレル１の頻度；Ｆ＿Ｕ（Ａ２）：非エリートＴＢ（ＰＤＫ４、ＣＫＭおよびＣＯＸ４Ｉ２）およびエリートエンデュアランス（ＭＳＴＮ）におけるアレル２の頻度。
【００９９】
付加的な検討のために選択されたＳＮＰは以下のとおりであった：
ＰＤＫ４＿３８９７３２３１（Ａ／Ｇ）
ＣＯＸ４Ｉ２＿２２６８４３９０（Ｃ／Ｔ）
ＣＫＭ＿１５８８４５６７（Ｇ／Ａ）
ＭＳＴＮ＿６６４９３７３７（Ｔ／Ｃ）
表５−最良適合モデルのための関連検定の結果
【０１００】
【表５Ａ】
【０１０１】
【表５Ｂ】
【０１０２】
最良適合遺伝子型モデルは表５の結果に基づいて割り当てられた。ＳＮＰと競技パフォーマンスの関連に関する最良モデルは以下の通りに結論された：
ＰＤＫ４−Ａｌｌｅｌｉｃ→Ａアレル、すなわちＡＡまたはＡＧが好ましい。
ＣＫＭ−Ａｌｌｅｌｉｃ→Ａアレル、すなわちＡＡまたはＡＧが好ましい。
ＣＯＸ４Ｉ２−Ｒｅｃｅｓｓｉｖｅ→Ｔアレル、すなわちＴＴが好ましい。
ＭＳＴＮ−Ｇｅｎｏｔｙｐｉｃ→遺伝子型は距離カテゴリーを予測する（この実施例で使用されるコホートでは、ＣＣである‘ステイヤー’は無いが、５０％のスプリンターはＣＣであった）
ＣＫＭ、ＣＯＸ４Ｉ２およびＰＤＫ４に関するエリートおよび非エリートサラブレッドの中でのアレル頻度分布、ならびにＭＳＴＮに関するエリートスプリンターおよびエリートエンデュアランスの中でのアレル頻度分布は図４に示される。以下の表６はサラブレッド（ＴＢＥおよびＴＢＯ）における４種のＳＮＰのアレル頻度を示す。
【０１０３】
表６−サラブレッドにおける４種のＳＮＰのアレル頻度（ＴＢＥおよびＴＢＯ）
【０１０４】
【表６】
【０１０５】
表中、ＭＡＦはマイナーアレル頻度であり、ＮＣＨＲＯＢＳは解析されたクロモソーム数である。
【０１０６】
ＣＫＭ、ＣＯＸ４Ｉ２およびＰＤＫ４におけるＳＮＰに関するエリートおよび非エリートサラブレッドの遺伝子型頻度分布、ならびにＭＳＴＮにおけるＳＮＰに関するエリートスプリンターおよびエリートエンデュアランスの遺伝子型頻度分布。
【０１０７】
この研究の結果は図５および以下の表７に示される。
【０１０８】
表７−ＰＤＫ４（ＰＤＫ４＿３８９７３２３１）；ＣＯＸ４Ｉ２（ＣＯＸ４Ｉ２＿２２６８４３９０）；ＣＫＭ（ＣＫＭ＿１５８８４５６７）のＳＮＰに関するエリートおよび非エリートサラブレッド亜集団における遺伝子型頻度およびＭＳＴＮ（ＭＳＴＮ＿６６４９３７３７）のＳＮＰに関するエリートスプリンターおよびエリートエンデュアランスサラブレッドにおける遺伝子型頻度
【０１０９】
【表７】
【０１１０】
予想される中立遺伝的浮動からの逸脱を測定するために、標本コホートにおける４種のＳＮＰに関するハーディ‐ワインベルク平衡（ＨＷＥ）からの逸脱が検討された。ＨＷＥからの逸脱は選択の指標であってもよく、アレル頻度を示された集団における遺伝子型の予想される分布を変化させてもよい。この情報は、遺伝子型頻度を正しく割り当て、パフォーマンスの検定を可能にするために必要である。
【０１１１】
表８−ＡＬＬ（ＴＢすべて）；ＡＦＦ（非エリートおよびエリートスプリンター）；ＵＮＡＦＦ（非エリートおよびエリートエンデュアランス）におけるハーディ‐ワインベルク平衡からの逸脱に関する検定
【０１１２】
【表８】
【０１１３】
エリートサラブレッド亜集団のＣＯＸ４Ｉ２＿２２６８４３９０−Ｃ／Ｔにおいて、ＨＷＥからの逸脱が確認された。従って、エリートレース馬のＴＴ遺伝子型の過剰提示を説明するための検定において遺伝子型頻度が調整されてもよい。また、ＨＷＥからの逸脱は、エリートエンデュアランスサラブレッドコホートのＭＳＴＮ＿ ６６４９３７３７−Ｔ／Ｃにおいても確認された。従って、エリートエンデュアランスレース馬のＣＣ遺伝子型の過小提示を説明するための検定において遺伝子型頻度が調整されてもよい。
【０１１４】
実施例３−サラブレッド馬におけるエリート（グループレース勝利）パフォーマンスに関する多遺伝子予測検定
本発明は１以上の運動反応遺伝子におけるＳＮＰの存在または不在に基づいてサラブレッド競走馬の競技パフォーマンスを予測するための簡単なＤＮＡを基礎にした方法（遺伝子型検定）を提供する。運動反応遺伝子は付録に列挙された遺伝子の中の１以上であってもよい。たとえば、遺伝子型検定はＰＤＫ４、ＣＫＭ、ＣＯＸ４Ｉ２、ＣＯＸ４Ｉ１、ＭＳＴＮ、ＡＣＳＳ１、ＡＣＴＮ２またはＰＴＧＳ１遺伝子の中の１以上におけるＳＮＰに基づいていてもよい。サラブレッド馬の競技パフォーマンスを予測するために使用されてもよいいくつかのＳＮＰの詳細は付録に示される。遺伝子型検定がいずれか１以上のこれらのＳＮＰの組み合わせに基づいていてもよいことは理解されるであろう。
【０１１５】
図３では、運動中のエネルギー生産に貢献する３つの主要代謝経路、ならびに優れた競走パフォーマンスに関連した３つの遺伝子（ＣＫＭ、ＣＯＸ４Ｉ２およびＰＤＫ４）の経路における位置および機能が示される。この限定的でない実施例において、既知の機能の知識、運動に反応して骨格筋で遺伝子が発現されるという知識および先の実施例２の結果を使用して、本発明者らはＰＤＫ４、ＣＯＸ４Ｉ２およびＣＫＭ遺伝子におけるサラブレッド馬における優れたパフォーマンスをＳＮＰに基づいて予測するための、簡単な、ＤＮＡを基礎にした遺伝子型検定を開発した。
【０１１６】
ＣＯＸ４Ｉ２ ＳＮＰ（ＣＯＸ４Ｉ２＿２２６８４３９０（Ｃ／Ｔ）ＳＮＰ）
このＳＮＰは、ｗｗｗ．ｂｒｏａｄ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｍａｍｍａｌｓ／ｈｏｒｓｅ／／で調べることができるウマゲノム配列（Ｅｑｕｕｓ ｃａｂａｌｌｕｓ ２．０版）のウマ（Ｅｑｕｕｓ ｃａｂａｌｌｕｓ）のクロモソーム２２上２２，６８４，３９０ｂｐ位フォワード鎖に位置する。
【０１１７】
ウマゲノムＥｑｕＣａｂ２アセンブリーは６．７９ｘにおける全ゲノムショットガン（ＷＧＳ）アセンブリーであり、２００７年９月に公開された。''Ｔｗｉｌｉｇｈｔ''という名の雌サラブレッドがゲノム配列決定のための代表的なウマとして選択された。プロジェクト調整およびゲノム配列決定およびアセンブリーはＢｒｏａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅによって提供される。Ｎ５０サイズは、アセンブルしたゲノムの５０％がＮ５０サイズまたはそれより長いブロックで存在するような長さである。コンティグのＮ５０サイズは１１２．３８ｋｂであり、すべてのコンティグの全長は２．４３Ｇｂである。スカホールドのコンティグ間のギャップが含まれる場合、アセンブリーの全長は２．６８Ｇｂである。ウマＥｑｕＣａｂ２は、標準Ｅｎｓｅｍｂｌ哺乳動物パイプラインを使用してアノテーションされた。脊椎哺乳動物およびウマ蛋白質に由来する予測は無脊椎哺乳動物に由来する予測に対して優先させている。予測のセットはヒトおよびマウスの１：１相同遺伝子に比較されて、ウマアノテーションにおいて欠損した相同遺伝子はｅｘｏｎｅｒａｔｅを使用して発見されている。ウマおよびヒトｃＤＮＡは蛋白質に基づいた予測にＵＴＲを添加するために使用されている。最終遺伝子セットは２０，７３７蛋白質−コーディング遺伝子を含み、２，８６３は偽遺伝子として確認され、１，５８０はレトロ−トランスポゾン遺伝子として分類された。
【０１１８】
ＳＮＰの付加的な詳細は以下の通りである：
○ＳＮＰ：ＣＯＸ４Ｉ２＿２２６８４３９０（Ｃ／Ｔ）Ｐ＝０．０３０９８ ＯＲ＝０．５７７８
○ＥｑｕＣａｂ２．０ ＳＮＰ＿ＩＤ：ＢＩＥＣ２−６１７５６８
○ＳＮＰのゲノム位置：イントロン２
○置換型：転移
○ＳＮＰはグルココルチコイド反応要素（ＧＲＥ）結合部位（Ｃ／ＴＧＴＴ）を崩壊させる。好ましいアレル（Ｔ）は部位（ＴＧＴＴ）を保持し、従ってＧＲＥ結合を可能にし、遺伝子の発現を増大させる。好ましくないアレル（Ｃ）は部位（ＣＧＴＴ）を崩壊させ、それゆえＧＲＥ結合を不可能にし、遺伝子の発現を増大させない。あるいは、ＳＮＰはｐ５３腫瘍サプレッサー結合部位（ＣＡＣ／ＴＧ）を崩壊させる。好ましいアレル（Ｔ）は部位（ＣＡＴＧ）を保持し、それゆえｐ５３結合を可能にし、ミトコンドリア生合成に貢献する。好ましくないアレル（Ｃ）は部位（ＣＡＣＧ）を崩壊させ、それゆえｐ５３結合を不可能にし、ミトコンドリア生合成に貢献しない。
【０１１９】
隣接配列およびＳＮＰ（太字および角括弧）は以下の通りである：
ＧＣＴＧＧＧＣＧＡＴＣＣＴＧＧＧＧＡＣＡＴＡＡＡＡＧＴＧＡＡＴＣＡＣＣＴＧＧＡＴＧＧＴＴＣＴＴＧＣＣＣＴＣＡＧＧＧＴＧＣＴＣＣＣＡＧＴＣＣＡＧＴＧＧＧＧＧＡＡＣＣＡＡＣＡＣＡＡＧＣＣＣＡＧＡＴＡＡＣＴＧＴＡＡＴＡＴＡＧＧＡＴＡＴＧＴＧＧＣＧＡＧＧＧＴＧＡＡＧＴＧＴＧＴＴＣＡＡＧＧＧＧＣＴＧＴＧＡＧＧＡＣＣＣＡＡＡＧＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＴＧＡＡＡＴＣＣＴＧＧＴＧＧＧＣＣＴＴＣＣＡＧＡＧＧＡＧＧＧＣＡ［Ｔ／Ｃ］ＧＴＴＣＴＡＧＴＴＧＡＣＣＴＴＧＡＡＴＧＧＴＧＡＧＧＣＴＧＡＧＧＧＴＧＣＴＧＣＣＡＧＧＴＧＧＴＧＧＧＡＡＣＡＧＣＡＴＧＧＧＴＡＡＧＧＧＴＡＴＧＧＧＡＧＣＧＧＡＡＧＡＧＣＡＴＧＧＡＧＧＧＴＣＣＴＡＧＧＣＡＴＣＡＧＴＡＡＧＴＧＣＴＧＴＡＧＧＧＧＡＡＧＧＡＡＣＡＧＡＧＡＧＡＧＧＣＧＧＴＧＡＧＧＴＧＧＣＣＡＧＧＡＡＡＧＡＡＧＧＧＧＧＣＣＴＧＡＣＣＣＴＧＧＧＧＡＧＣＡＧＧＡＧＧＧＡＴＧＴＧＴＧＡＣＴＣＣＡＡ
（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２）
ＣＫＭ ＳＮＰ（ＣＫＭ＿１５８８４５６７（Ｇ／Ａ）ＳＮＰ）
このＳＮＰは、ｗｗｗ．ｂｒｏａｄ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｍａｍｍａｌｓ／ｈｏｒｓｅ／/で調べることができるウマゲノム配列（Ｅｑｕｕｓ ｃａｂａｌｌｕｓ ２．０版）のウマ（Ｅｑｕｕｓ ｃａｂａｌｌｕｓ）のクロモソーム１０上１５，８８４，５６７ｂｐ位に位置する。
【０１２０】
ウマゲノムＥｑｕＣａｂ２アセンブリーは６．７９ｘにおける全ゲノムショットガン（ＷＧＳ）アセンブリーであり、２００７年９月に公開された。''Ｔｗｉｌｉｇｈｔ''という名の雌サラブレッドがゲノム配列決定のための代表的なウマとして選択された。プロジェクト調整およびゲノム配列決定およびアセンブリーはＢｒｏａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅによって提供される。Ｎ５０サイズは、アセンブルしたゲノムの５０％がＮ５０サイズまたはそれより長いブロックで存在するような長さである。コンティグのＮ５０サイズは１１２．３８ｋｂであり、すべてのコンティグの全長は２．４３Ｇｂである。スカホールドのコンティグ間のギャップが含まれる場合、アセンブリーの全長は２．６８Ｇｂである。ウマＥｑｕＣａｂ２は、標準Ｅｎｓｅｍｂｌ哺乳動物パイプラインを使用してアノテーションされた。脊椎哺乳動物およびウマ蛋白質に由来する予測は非脊椎哺乳動物に由来する予測に対して優先されている。予測のセットはヒトおよびマウスの１：１相同遺伝子に比較されて、ウマアノテーションにおいて欠損した相同遺伝子はｅｘｏｎｅｒａｔｅを使用して発見されている。ウマおよびヒトｃＤＮＡは蛋白質に基づいた予測にＵＴＲを添加するために使用されている。最終遺伝子セットは２０，７３７蛋白質−コーディング遺伝子を含み、２，８６３は偽遺伝子として確認され、１，５８０はレトロ−トランスポゾン遺伝子として分類された。
【０１２１】
ＳＮＰの付加的な詳細は以下の通りである：
○ＳＮＰ：ＣＫＭ＿１５８８４５６７（Ｇ／Ａ）Ｐ＝０．０２０６６ ＯＲ＝０．４０８９
○ＥｑｕＣａｂ２．０ ＳＮＰ＿ＩＤ：ＢＩＥＣ２−１０９５７５
○ＳＮＰのゲノム位置：イントロン４
○置換型：転移
○ＳＮＰはインターフェロン調節因子結合部位（ＧＣＡ／ＧＡ）を崩壊させる。Ａアレルは部位（ＧＣＡＡ）を保持する。Ｇアレルは部位（ＧＣＧＡ）を崩壊させる。
【０１２２】
隣接配列およびＳＮＰ（太字および角括弧）は以下の通りである：
ＣＴＧＴＣＣＣＴＡＡＣＡＧＡＣＣＴＧＧＡＣＣＴＴＧＧＣＣＣＣＧＴＧＧＡＧＧＴＣＣＴＡＡＡＧＧＣＲＡＣＴＡＴＡＣＧＣＧＡＴＧＴＡＡＡＣＣＣＡＡＡＴＴＣＡＴＧＡＣＡＴＣＣＣＣＴＧＡＡＧＣＡＴＧＣＴＣＴＴＣＣＣＣＴＧＴＣＴＧＣＣＣＧＧＧＴＣＣＣＣＧＧＡＡＣＡＧＣＣＡＣＣＣＣＡＡＧＴＧＣＴＣＴＣＴＣＣＣＡＡＧＴＧＧＡＣＴＣＴＣＣＣＴＴＣＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＴＣＧＣＡＴＣＣＡＧＴＧＣＡＣＣＧＧＣＡＡＧＣ［Ａ／Ｇ］ＡＣＡＣＴＡＴＣＣＣＧＧＴＧＣＣＣＡＣＴＣＣＡＧＡＡＡＧＴＣＡＡＴＧＴＣＴＣＡＧＧＡＡＴＣＴＧＧＧＧＡＧＣＣＡＴＣＡＧＴＣＡＡＡＡＴＴＡＣＴＡＴＣＡＴＡＣＡＧＴＡＴＡＴＡＴＡＧＧＡＴＴＣＧＣＡＴＡＴＡＴＴＣＣＴＡＴＧＣＡＴＡＡＴＡＡＴＴＡＴＡＣＧＴＴＴＴＧＴＧＧＡＴＡＡＴＡＡＡＴＡＴＡＴＧＴＡＴＡＴＡＴＧＣＡＴＡＡＴＡＴＴＴＡＣＡＴＡＡＴＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＴＴＡＴＡＴＡＣＡＴＴＴＴＡＴＡＣＡＴＴ
（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３）
ＰＤＫ４（ＰＤＫ４＿３８９７３２３１（Ａ／Ｇ）ＳＮＰ）
このＳＮＰは、ｗｗｗ．ｂｒｏａｄ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｍａｍｍａｌｓ／ｈｏｒｓｅ／/で調べることができるウマゲノム配列（Ｅｑｕｕｓ ｃａｂａｌｌｕｓ ２．０版）のウマ（Ｅｑｕｕｓ ｃａｂａｌｌｕｓ）のクロモソーム４上３８，９７３，２３１ｂｐ位に位置する。
【０１２３】
ウマゲノムＥｑｕＣａｂ２アセンブリーは６．７９ｘにおける全ゲノムショットガン（ＷＧＳ）アセンブリーであり、２００７年９月に公開された。''Ｔｗｉｌｉｇｈｔ''という名の雌サラブレッドがゲノム配列決定のための代表的なウマとして選択された。プロジェクト調整およびゲノム配列決定およびアセンブリーはＢｒｏａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅによって提供される。Ｎ５０サイズは、アセンブルしたゲノムの５０％がＮ５０サイズまたはそれより長いブロックで存在するような長さである。コンティグのＮ５０サイズは１１２．３８ｋｂであり、すべてのコンティグの全長は２．４３Ｇｂである。スカホールドのコンティグ間のギャップが含まれる場合、アセンブリーの全長は２．６８Ｇｂである。ウマＥｑｕＣａｂ２は、標準Ｅｎｓｅｍｂｌ哺乳動物パイプラインを使用してアノテーションされた。脊椎哺乳動物およびウマ蛋白質に由来する予測は非脊椎哺乳動物に由来する予測に対して優先されている。予測のセットはヒトおよびマウスの１：１相同遺伝子に比較されて、ウマアノテーションにおいて欠損した相同遺伝子はｅｘｏｎｅｒａｔｅを使用して発見されている。ウマおよびヒトｃＤＮＡは蛋白質に基づいた予測にＵＴＲを添加するために使用されている。最終遺伝子セットは２０，７３７蛋白質−コーディング遺伝子を含み、２，８６３は偽遺伝子として確認され、１，５８０はレトロ−トランスポゾン遺伝子として分類された。
【０１２４】
ＳＮＰの付加的な詳細は以下の通りである：
○ＳＮＰ：ＰＤＫ４＿３８９７３２３１（Ａ／Ｇ）Ｐ＝０．００１６７６ ＯＲ＝２．２
○ＥｑｕＣａｂ２．０ ＳＮＰ＿ＩＤ：ＢＩＥＣ２−９０３６０５
○ＳＮＰのゲノム位置：イントロン２
○置換型：転移
○ＳＮＰは、転写因子（２ハンド亜鉛フィンガーホメオドメイン転写因子）結合部位（ｔａ／ｇｔｇｔＧＴＴＴｃａｇａ）から４ｂｐ上流である。
【０１２５】
隣接配列およびＳＮＰ（太字および角括弧）は以下の通りである：
ＡＣＴＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＡＣＴＴＴＣＴＡＡＣＴＴＡＡＡＡＴＴＴＡＴＧＴＴＴＡＡＣＴＡＴＴＣＣＡＧＡＧＣＡＡＴＡＴＴＣＡＧＴＴＴＴＡＴＴＴＧＧＣＡＡＡＴＧＴＴＴＴＣＡＴＴＴＴＴＴＡＴＡＧＣＡＡＡＡＧＴＡＴＴＴＡＧＡＡＡＴＴＴＴＴＡＡＧＡＡＡＧＡＴＴＴＣＡＴＡＴＴＴＣＴＴＴＣＴＡＣＴＴＣＡＴＴＣＡＴＴＣＡＴＧＴＧＴＧＧＧＴＡＧＡＡＧＴＣＴＣＧＡＡＡＧＣＡＧＣＡＧＴＡＡＡＧＡＣＴＡＴＧＧＡＴＴＧＡＡＴ［Ａ／Ｇ］ＴＧＴＧＴＴＴＣＡＧＡＴＴＧＴＣＡＴＴＧＴＴＴＡＡＴＧＧＧＴＡＴＧＧＡＡＴＧＣＡＴＡＴＡＴＴＴＣＴＴＧＡＡＴＣＡＡＴＧＡＡＣＡＡＡＡＣＧＣＴＧＴＡＴＡＧＴＣＡＧＣＡＧＡＴＴＡＧＧＧＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＧＴＧＣＡＴＡＴＣＴＧＣＴＧＣＡＧＴＧＣＡＴＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＴＡＴＴＣＴＣＴＧＡＡＡＡＴＣＴＧＣＴＣＴＴＧＴＧＧＧＴＣＡＴＣＴＡＣＣＣＴＣＴＣＴＡＡＧＣＴＴＭＡＧＣＡＣＣＣＴＴＡＴＴＴＧＴＴＡＡＡ
（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４）
リスク予測
複雑な形質に関する‘リスク’の予測は、相加遺伝分散が小さい場合、単一遺伝子ＳＮＰに頼るよりむしろ、形質に貢献する複数の遺伝子を検定することによって非常に高められる（Ｙａｎｇら ２００３）。しかし、効果が大きい場合（すなわち高オッズ比）、単一ＳＮＰが使用されてもよい。（ＨＷＥにおけるＳＮＰに対する）集団アレル頻度または（ＨＷＥから逸脱したＳＮＰに対する）観察された遺伝子型頻度およびベイズの定理（Ｂａｙｅｓ Ｔｈｅｏｒｅｍ）を使用した亜集団予測に基づいて、本発明者らはＰＤＫ４、ＣＫＭおよびＣＯＸ４Ｉ２遺伝子における配列変異体に対して、ある種の遺伝子型の組み合わせを与えられた１種または他の亜集団（エリートおよび非エリート）のメンバーである確率を検討した。結果は、２つの亜集団のそれぞれのメンバーである確率の百分率として、以下の表９に提供される。
【０１２６】
表９−遺伝子ＰＤＫ４、ＣＫＭおよびＣＯＸ４Ｉ２におけるＳＮＰを使用した優れた競走能力に関する予測検定（遺伝子型組み合わせは、レース能力に関して「最も好ましい」から「最も好ましくない」までランク付けされる）
【０１２７】
【表９Ａ】
【０１２８】
【表９Ｂ】
【０１２９】
表中、ＰＤＫ４の場合、ＡＡは遺伝子型ＡＡを表し、ＡＢは遺伝子型ＡＧを表し、そしてＢＢは遺伝子型ＧＧを表す；ＣＯＸ４Ｉ２の場合：ＡＡは遺伝子型ＣＣを表し、ＡＢは遺伝子型ＣＴを表し、そしてＢＢは遺伝子型ＴＴを表す；そしてＣＫＭの場合：ＡＡは遺伝子型ＧＧを表し、ＡＢは遺伝子型ＧＡを表し、そしてＢＢは遺伝子型ＡＡを表す。
【０１３０】
表９から、これらの３種の遺伝子における遺伝子型の最も好ましい組み合わせは、ＰＤＫ４、ＣＯＸ４Ｉ２およびＣＫＭそれぞれに対して、ＡＡ、ＴＴ、ＡＡであることを理解することができ（エリートレース馬である８２％の確率、非エリートである１８％の確率）、そしてこれらの３種の遺伝子における遺伝子型の最も好ましくない組み合わせは、ＰＤＫ、ＣＯＸ４Ｉ２およびＣＫＭ４それぞれに対して、ＧＧ、ＣＣ、ＧＧである（エリート競走馬である３％の確率、非エリートである９７％の確率）。
【０１３１】
リスク予測検定は付録に列挙された１以上のＳＮＰを使用して実施されてもよい。
【０１３２】
実施例４−ＳＮＰとハンディキャップレーティング（ＲＰＲ）との定量的関連
レーシングポストレーティング（Ｒａｃｉｎｇ Ｐｏｓｔ Ｒａｔｉｎｇｓ）（ＲＰＲ）は、レースレベル、フィールドの特性、負担重量およびレースのタイムに関して、指定されたレースにおけるウマの全体的パフォーマンスによって決定されるハンディキャップレーティングである。ＲＰＲはスピードレーティングに直接匹敵せず、むしろレーティングは、ウマがハンディキャップで負担することを要求されることになる重量を表すことを意図する。たとえば、同じ年齢および性のウマに制限されるレースでは、レーシングポストレーティング１２０のウマは、ハンディキャップでは、１１７のレーティングのウマより３ポンド多く負担することになる。オープンレースでは、セックスアローワンスおよび馬齢重量アローワンスが計算に入れられる。従って、ハンディキャップでは１２０ポンドを負担するウマが一馬身差で１２８ポンドを負担するウマに勝つ場合、１２８ポンドを負担するウマは一般に、１２０ポンドを負担するウマより６または７ポンド高いレーシングポストレーティングを与えられることになる。異なる部門のレース勝ち馬に対して満足できるレーティングを決定することに役立つ指針値は以下の表１０に示される。
【０１３３】
表１０− 勝ち馬に対するＲＰＲ指針
【０１３４】
【表１０】
【０１３５】
本発明者らは、定量的関連検定解析において競技パフォーマンスと有意な関連を示しているＳＮＰのいくつかとＲＰＲとの間に有意な関係があるかどうかを調べた。
【０１３６】
表１１−ＲＰＲと有意な関連を有するＳＮＰ
【０１３７】
【表１１】
【０１３８】
以下の表１２は、上記の表１１に列挙された３つの有意に関連したＳＮＰのそれぞれの遺伝子型に対する平均ＲＰＲを示す。
【０１３９】
表１２−表１１に由来するＳＮＰのそれぞれの遺伝子型に対する平均ＲＰＲ
【０１４０】
【表１２】
【０１４１】
上記の表１２では、ＰＤＫ４＿３８９７３２３１−（Ａ／Ｇ）において、ＡＡ遺伝子型は９９．９５の平均ＲＰＲを有し、ＡＧ遺伝子型は９７．７の平均ＲＰＲを有し、そしてＧＧ遺伝子型は８０．３の平均ＲＰＲを有する。従って本発明者らは、ＡＡおよびＡＧ遺伝子型はより高いＲＰＲと相関する好ましい遺伝子型であると結論する。ＣＯＸ４Ｉ１＿３２７７２８７１−（Ｃ／Ｔ）において、ＴＴ遺伝子型は１００．６の平均ＲＰＲを有し、ＣＣ遺伝子型は９９．７１の平均ＲＰＲを有し、そしてＣＣ遺伝子型は８３．３の平均ＲＰＲを有する。従って本発明者らは、ＴＴおよびＴＣ遺伝子型はより高いＲＰＲと相関する好ましい遺伝子型であると結論する。
【０１４２】
ＣＯＸ４Ｉ１ ＳＮＰ（ＣＯＸ４Ｉ１＿３２７７２８７１（Ｃ／Ｔ）ＳＮＰ）
このＳＮＰは、ｗｗｗ．ｂｒｏａｄ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｍａｍｍａｌｓ／ｈｏｒｓｅ／/で調べることができるウマゲノム配列（Ｅｑｕｕｓ ｃａｂａｌｌｕｓ ２．０版）のウマ（Ｅｑｕｕｓ ｃａｂａｌｌｕｓ）のクロモソーム３上３２，７７２，８７１ｂｐ位に位置する。
【０１４３】
ウマゲノムＥｑｕＣａｂ２アセンブリーは６．７９ｘにおける全ゲノムショットガン（ＷＧＳ）アセンブリーであり、２００７年９月に公開された。''Ｔｗｉｌｉｇｈｔ''という名の雌サラブレッドがゲノム配列決定のための代表的なウマとして選択された。プロジェクト調整およびゲノム配列決定およびアセンブリーはＢｒｏａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅによって提供される。Ｎ５０サイズは、アセンブルしたゲノムの５０％がＮ５０サイズまたはそれより長いブロックで存在するような長さである。コンティグのＮ５０サイズは１１２．３８ｋｂであり、すべてのコンティグの全長は２．４３Ｇｂである。スカホールドのコンティグ間のギャップが含まれる場合、アセンブリーの全長は２．６８Ｇｂである。ウマＥｑｕＣａｂ２は、標準Ｅｎｓｅｍｂｌ哺乳動物パイプラインを使用してアノテーションされた。脊椎哺乳動物およびウマ蛋白質に由来する予測は非脊椎哺乳動物に由来する予測に対して優先されている。予測のセットはヒトおよびマウスの１：１相同遺伝子に比較されて、ウマアノテーションにおいて欠損した相同遺伝子はｅｘｏｎｅｒａｔｅを使用して発見されている。ウマおよびヒトｃＤＮＡは蛋白質を基礎にした予測にＵＴＲを添加するために使用されている。最終遺伝子セットは２０，７３７蛋白質−コーディング遺伝子を含み、２，８６３は偽遺伝子として確認され、１，５８０はレトロ−トランスポゾン遺伝子として分類された。
【０１４４】
ＳＮＰの付加的な詳細は以下の通りである：
○ＳＮＰ：ＣＯＸ４Ｉ１＿３２７７２８７１（Ｃ／Ｔ）ＥＭＰ１＝０．００９６８１
○ＥｑｕＣａｂ２．０ ＳＮＰ＿ＩＤ：ＢＩＥＣ２−８１６０２８
○ＳＮＰのゲノム位置：イントロン
○置換型：転移
隣接配列およびＳＮＰ（太字および角括弧）は以下の通りであり、ここでＭはＡまたはＣである：
ＴＣＡＧＧＴＣＴＣＡＧＴＣＧＣＡＣＣＡＧＡＧＣＴＧＧＡＴＧＧＡＧＣＣＡＧＣＧＣＡＧＣＴＣＣＡＴＣＴＣＴＣＡＧＴＧＧＣＴＧＧＧＡＧＴＧＧＧＣＴＧＣＡＧＧＧＴＧＧＴＣＣＴＣＡＣＡＣＡＡＧＡＴＧＧＧＣＡＣＣＴＣＣＣＴＣＣＴＧＧＧＣＴＣＣＡＴＣＣＣＡＧＧＡＣＴＧＴＴＴＣＣＣＡＧＧＴＴＴＧＧＧＡＡＡＣＴＧＧＣＴＣＧＣＡＴＴＡＧＣＣＧＡＧＴＧＧＣＧＴＧＡＧＣＣＧＧＡＡＴＭＴＧＡＴＴＴＡＣＴＣＡＣＡＧＴＧＣＧＣ［Ｔ／Ｃ］ＧＴＧＣＴＴＧＧＴＧＧＧＧＡＡＣＧＡＣＴＴＣＣＣＴＧＣＴＴＴＧＴＡＣＡＧＣＡＣＣＣＴＧＣＧＴＴＴＣＣＡＧＴＧＧＴＧＧＴＴＴＧＴＣＴＧＧＴＣＡＣＴＡＧＴＣＴＴＴＴＡＴＣＡＡＧＡＧＡＴＡＧＴＡＴＡＧＴＧＡＡＧＧＴＴＡＧＧＴＣＡＡＧＧＡＡＡＡＧＧＧＡＡＣＴＣＴＧＡＣＴＴＧＴＣＡＧＡＧＧＧＣＴＧＴＴＴＧＡＡＣＴＧＴＡＴＧＧＧＧＡＣＴＧＣＡＴＣＴＣＧＡＴＡＡＣＣＡＧＧＡＴＴＣＴＧＧＧＴＣＴＣＣＡＧＡＣＣＣＡ
（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３２）
定量的関連検定解析において、このＳＮＰはＲＰＲと有意に関連する。
【０１４５】
実施例５−サラブレッド馬における優れた短距離レースパフォーマンスの遺伝子予測検定
サラブレッド馬は短距離（＜１，５００ｍ）および長距離（＞１，８００ｍ）レースの両方において秀でている。中距離レースで競走するウマ（‘マイラー’および‘中距離馬’）は、‘スプリンター’または‘ステイヤー’のいずれかであると見なされてもよく、騎手により遂行されるレースのやり方はしばしば調教師が認めたウマの全力疾走能力および持久力を反映する。産業内では、ウマはそれらの馬格（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）に基づいてスプリンターとして記載されてもよく、通常、肥りやすく、より筋肉質の体格を有し、より早く成熟する。それらは通常２歳馬として、そしてより短い距離を３歳馬としてレースを行う。長距離動物であると認められた個体は、成熟にいっそうの時間を必要とし、３歳馬として長距離を走る‘バックヤード（ｂａｃｋｙａｒｄ）’と呼ばれてもよい。ある地域（たとえばオーストラリア）では、ブリーダーはより速い‘短距離’型のウマだけを繁殖させることを企てる。
【０１４６】
ある側面では、本発明は１以上の運動反応遺伝子におけるＳＮＰの存在または不在に基づいて、サラブレッド競走馬の優れた短距離レースパフォーマンスを予測するための、簡単なＤＮＡを基礎にした方法（遺伝子型検定）を提供する。運動反応遺伝子は付録に列挙された１以上の遺伝子であってもよい。たとえば、遺伝子型検定はＭＳＴＮ、ＡＣＮ９、ＰＴＰＮ１、ＰＯＮ１、ＡＤＨＦＥ１、またはＧＳＮ遺伝子の中の１以上におけるＳＮＰに基づいていてもよい。サラブレッド競走馬の優れたレースパフォーマンスを予測するために使用されてもよいいくつかのＳＮＰの詳細は付録に示される。遺伝子型検定がこれらのＳＮＰのいずれか１以上の組み合わせに基づいていてもよいことは理解されるであろう。
【０１４７】
この限定的でない実施例では、本発明者らはＭＳＴＮ遺伝子を研究した。
【０１４８】
方法
関連標本
国際競馬統括機関連盟（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｏｒｓｅｒａｃｉｎｇ Ａｕｔｈｏｒｉｔｉｅｓ）は５つの距離カテゴリーを認めている：短距離（５〜６．５ｆ、≦１，３００ｍ）、マイル（６．５１〜９．４９ｆ、１，３０１〜１，９００ｍ）、中距離（９．５〜１０．５ｆ、９０１〜２，１１２ｍ）、長距離（１０．５１〜１３．５ｆ、２，１１４〜２，７１６ｍ）および超長距離（＞１３．５１ｆ、＞２，７１７ｍ）レース（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｏｒｓｅｒａｃｉｎｇ Ａｕｔｈｏｒｉｔｉｅｓ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ，ｗｗｗ．ｈｏｒｓｅｒａｃｉｎｇｉｎｔｆｅｄ．ｃｏｍ）［注：１ファーロング＝１／８マイル＝２０１．２メートル］。ケース−コントロール調査の場合、本発明者らは２つのコホートを比較した：標本は短距離（≦８ｆおよび≦７ｆ）および長距離（＞８ｆ）レースコホートに細分化された。動物の過度な血縁関係（２世代以内）および血統内の評判のよい種馬（ｓｉｒｅ）の過剰提示を回避するために、１９９８〜２００８年の間に、アイルランドおよびニュージーランドにおいてサラブレッド訓練、繁殖および販売機関から、オーナーのインフォームドコンセントを得て収集された大規模なＤＮＡ標本リポジトリ（ｎ＞１，０００）から、サラブレッドＤＮＡ標本セット（ｎ＝１４８）が選択された。
【０１４９】
レプリケーション標本
パフォーマンスに対する非遺伝的影響を最少化するために、２００４〜２００８年の間に、アイルランドにおいて同じトレーナーによって訓練されたウマに由来するＤＮＡ標本（ｎ＝１４２）のリポジトリから選択されたエリート（グループレースおよび準重賞レースに勝利）競走馬標本（ｎ＝３９）の遺伝子型を判定することにより、結果が実証された。このリポジトリのサブセット（ｎ＝１４２）は、２歳の競走馬における競馬場成功のパラメータにより、遺伝子型傾向を評価された。レースレコードは３つの供給源：ヨーロッパレースレコード、レーシングポストオンラインデータベース（Ｒａｃｉｎｇ Ｐｏｓｔ ｏｎ−ｌｉｎｅ ｄａｔａｂａｓｅ）（ｗｗｗ．ｒａｃｉｎｇｐｏｓｔ．ｃｏ．ｕｋ）；オーストラレーシアおよび東南アジアレースレコード、Ａｒｉｏｎ Ｐｅｄｉｇｒｅｅｓ（ｗｗｗ．ａｒｉｏｎ．ｃｏ．ｎｚ）；ならびに北米レースレコード、Ｐｅｄｉｇｒｅｅ Ｏｎｌｉｎｅ Ｔｈｏｒｏｕｇｈｂｒｅｄデータベース（ｗｗｗ．ｐｅｄｉｇｒｅｅｑｕｅｒｙ．ｃｏｍ）に由来した。レプリケーション標本には、解析で明らかにされた血縁関係の一部共有があった。
【０１５０】
ＤＮＡ抽出、リシークエンシングおよび遺伝子型判定
ゲノムＤＮＡは、標準フェノール／クロロホルム法の改変版（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ＆ Ｒｕｓｓｅｌｌ ２００１）を使用して、新鮮な全血または体毛標本のいずれかから抽出された。ｗｅｂを基礎にしたプライマー設計ツールＰｒｉｍｅｒ３に対するＰＣＲ ｓｕｉｔｅエクステンション（Ｒｏｚｅｎ ＆ Ｓｋａｌｅｔｓｋｙ ２０００；ｖａｎ Ｂａｒｅｎ ＆ Ｈｅｕｔｉｎｋ ２００４）を使用して、１３対の重複するＰＣＲプライマーを設計し、全ＭＳＴＮゲノム配列をカバーした（表１３）。サラブレッド−特異的配列変異体を確認するために、リシークエンシングパネルには２４の関連のないサラブレッドＤＮＡ標本が含まれた。そのようなものとして本研究はサラブレッド集団においてＭＡＦ＞０．０５のＳＮＰの９５％を検出するように強化された（Ｋｒｕｇｌｙａｋ ＆ Ｎｉｃｋｅｒｓｏｎ ２００１）。ＰＣＲ産物の２方向ＤＮＡ配列決定はＭａｃｒｏｇｅｎ Ｉｎｃ．（Ｓｅｏｕｌ，Ｋｏｒｅａ）に海外委託し、ＡＢ ３７３０ｘｌシークエンサーを使用して実行された（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）。配列変異体はＣｏｎｓｅｄ １９．０版（０９０２０６）［Ｇｏｒｄｏｎ ら １９９８］を使用したアラインメント後に配列の目視検査によって検出された。遺伝子型判定は、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＵＳＡ（関連標本）およびＨａｍｂｕｒｇ，ドイツ（レプリケーション標本）において、Ｓｅｑｕｅｎｏｍ社のＳｅｑｕｅｎｏｍ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＵＳＡ）ｉＰｌｅｘ技術を使用して実行された。
【０１５１】
統計解析
関連の検定を含むすべての統計解析は、ＰＬＩＮＫ １．０５版（Ｐｕｒｃｅｌｌ ら ２００７）を使用して実施された。品質管理分析は標本アレル頻度、欠損遺伝子型の割合（百分率）およびＨａｒｄｙ−Ｗｅｉｎｂｅｒｇ平衡からの逸脱の計算を包含した。一連のケース−コントロール関連検定は２つの遺伝子座（ｇ．６６４９３７３７Ｃ＞Ｔおよびｇ．６６４９４２１８Ａ＞Ｃ）に対して実施された。統計的有意性は、傾向に関するコクラン−アーミテージ検定および無条件（ｕｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ）遺伝子型モデルを使用して評価された。オッズ比および９５％ ＣＩは２つの最も有意な関連に関して計算された。線形回帰モデルを使用して、表現型：最適レース距離およびｋｇ／ｃｍ比を使用した遺伝子座ｇ．６６４９３７３７Ｃ＞Ｔにおける定量的形質関連を評価した。
【０１５２】
結果
ウマ、とりわけサラブレッドは、他の哺乳動物種（３０〜４０％）に比較して、体重に対する非常に高い筋肉量比（５５％）を有する（Ｇｕｎｎ １９８７）。ミオスタチン遺伝子（ＭＳＴＮ）変異体は以前に筋肉肥大に貢献することが示されている；従って、クロモソーム１８上に３つのエキソンと全長６，１７２ｂｐを含むウマＭＳＴＮ遺伝子（リバース鎖ｎｔ ６６４８９６０８-６６４９５７８０、ＥｑｕＣａｂ２．０）の配列変異が検討された。現在まで、サラブレッド馬のゲノムＭＳＴＮ配列において配列変異体は報告がなく、ＥｑｕＣａｂ２．０ ＳＮＰデータベースにおいてＭＳＴＮ ＳＮＰは実証されていない。３つのエキソンすべておよび５′上流領域の２８８ｂｐにわたる１４の重複プライマー対（表１３）を使用して１４頭の非関連サラブレッド馬におけるウマＭＳＴＮ遺伝子をリシークエンシングすることにより、新規な配列変異体が確認された。エキソン配列変異体は検出されなかったが、ＭＳＴＮのイントロン１［ｎｔ ６６４９２９７９-６６４９４８０７］において６つのＳＮＰが検出された（表１４）。
【０１５３】
集団遺伝多様性解析は、ＭＳＴＮ遺伝子を含む領域の選択がサラブレッド集団において効果的であることを示唆する。関連のないサラブレッド（ｎ＝１０６）の３つの集団、Ａｋｈａｌ−Ｔｅｋｅ（ｎ＝１８）、Ｃｏｎｎｅｍａｒａ（ｎ＝１７）およびＴｕｖａ（ｎ＝１７）馬において、ウマクロモソーム１８にまたがる１３のマイクロサテライト遺伝子座の遺伝子型判定が行われた。サラブレッドでは、連鎖不平衡の評価はＭＳＴＮ遺伝子に最も近い２つの遺伝子座、ＴＫＹ１０１（ｎｔ．６３５２８４５９）およびＴＫＹ０１６（ｎｔ．６６８３８９２０）を包含する保存されたハプロタイプを示した。集団の中で、ＦＳＴによってランクを付けられた場合、ゲノムワイド遺伝子座のトップ１０％の中にあるＴＫＹ１０１（ＦＳＴ＝０．２３）において分化（ＦＳＴ）が高かった。興味深いことに、ミオスタチンの重要なシグナリング分子であるアクチビンＡ受容体、ＩＩＡ型をコードするＡＣＶＲ２Ａに最も近いＴＫＹ３０３（ｎｔ．３１．１Ｍｂ；ＦＳＴ＝０．３１）のＦＳＴスコアが、クロモソーム１８上で最も高いＦＳＴスコアであった。ＭＳＴＮから３５０ｂｐに位置するＴＫＹ０１６の高いＦＳＴは、サラブレッドおよび非サラブレッド集団間の多岐にわたるアレル頻度分布に起因し、そして距離コホート（ＴＢＥ＜８ｆ；ｎ＝２５およびＴＢＥ＞８ｆ；ｎ＝２２）へのサラブレッド標本の再分布は、アレル１４４頻度（ＴＢＥ＜８ｆ＝７０％；ＴＢＥ＞８ｆ＝４５％）における有意な差（ピアソンのカイ二乗検定；χ２＝５．８０９；ｄｆ＝１；Ｐ＝０．０１５９）を確認した。
【０１５４】
ＭＳＴＮ配列変異体と競走表現型間の関連を検討するために、本発明者らはｎ＝１４８のサラブレッド馬の遺伝子型を判定した。サラブレッドでは、６つのＭＳＴＮ配列多型の中の４つがＭＡＦ＜０．０５を提示し（表１５）、関連解析から排除された。後ろ向き競馬場パフォーマンスに基づいて、関係のない動物を含む別個のコホートにサラブレッドを分類することによって、集団を基礎にした一連のケース−コントロール調査が実施された（表１６）。解析に使用される２つのＳＮＰ（ｇ．６６４９３７３７Ｃ＞Ｔおよびｇ．６６４９４２１８Ａ＞Ｃ）における個々の遺伝子型は、一度もレースに勝ったことがないサラブレッド（Ｔｈｏｒｏｕｇｈｂｒｅｄ−ｏｔｈｅｒ、ＴＢＯ）より、エリートグループレース勝利サラブレッド（Ｔｈｏｒｏｕｇｈｂｒｅｄ−ｅｌｉｔｅ、ＴＢＥ）ではいっそう共通でない（表１７）。さらに、後ろ向き競走能力を反映するハンディキャップレーティングが定量的表現型として評価される場合、関連は検出されなかった。しかし、短距離および長距離競走に対する筋力パワーの相対的貢献を検討する場合、エリートグループレース勝利動物は≦８ｆ（ｎ＝５１）の距離のそれらの最適レースに勝利したものと、＞８ｆ（ｎ＝３５）の距離のそれらの最適レースに勝利しているものに細分化され、極めて有意な差が見出された。［注：１ファーロング＝１／８マイル＝２０１．２メートル］。イギリス（Ｂｒｉｔａｉｎ）では、１年につき１３９のグループレースの中で、５７％が≦１マイルの距離を走り、そして４３％が＞１マイルの距離を走る。エリートパフォーマーコホートには、短距離（≦８ｆ、ｎ＝３９）レースおよび長距離（＞８ｆ、ｎ＝３２）レースを優先的に競う動物のサブセット（ｎ＝７１）が含まれた。
【０１５５】
すべての解析に対して、関連の有意性はｇ．６６４９４２１８Ａ＞Ｃより、ｇ．６６４９３７３７Ｃ＞Ｔに対して高く、これらのＳＮＰ間の連鎖不平衡は相対的に高い（ｒ２＝０．５０）。ロジスティック回帰モデルを使用するそれぞれのＳＮＰに対するコンディショニングは、ｇ．６６４９４２１８Ａ＞Ｃに対するｇ．６６４９３７３７Ｃ＞Ｔの独立した効果（Ｐ＝０．０１０８）を確認したが、ｇ．６６４９３７３７Ｃ＞Ｔに対するｇ．６６４９４２１８Ａ＞Ｃの効果は確認できず（Ｐ＝０．７３８８）、従ってｇ．６６４９３７３７Ｃ＞Ｔの結果だけがさらに検討された。２つの距離コホートの中で、本発明者らはｇ．６６４９３７３７Ｃ＞Ｔとの極めて有意な（Ｐ＝３．７０×１０−５）関連を見出し、短距離コホートが≦７ｆのそれらの最適レースに勝利している動物（ｎ＝４３）にさらに細分化される場合、この関連はわずかに、より強くなった（Ｐ＝１．８８×１０−５）（表１７ａ）。
【０１５６】
Ｃアレルは４．５４のオッズ比（９５％Ｃ．Ｉ．２．２３〜９．２３）に対応して、長距離（＞８ｆ）コホートより短距離（≦７ｆ）コホートにおいて、２倍頻度が高かった（それぞれ０．７２および０．３６）。すべてのサラブレッドが一緒に検討される場合、遺伝子座は予測されたＨａｒｄｙ−Ｗｅｉｎｂｅｒｇ比率に従った（表１８）。しかし、長距離コホートでは、おそらくこの遺伝子座での選択に起因してＨＷＥからの有意な（Ｐ＝０．００１８）逸脱があった。逆に、Ｃ／Ｃ遺伝子型はスプリンター（≦７ｆ、＞５１％）の中では最も一般的な遺伝子型であった。遺伝子型傾向効果は、傾向モデルに関するコクラン−アーミテージ検定を使用して、一般的なホモ接合、ヘテロ接合、およびまれなホモ接合遺伝子型に関する効果の大きさにおける線形傾向に関連したリスクを推測することによってモデル化された。最も簡潔なモデルは、遺伝子型が競走距離の予測に役立つことを示す遺伝子型モデル（Ｐ＝１．１８×１０−６）であった（表１７ｂ）。
【０１５７】
表１３：ウマミオスタチン（ＭＳＴＮ）遺伝子におけるＳＮＰ発見に関するＰＣＲプライマーの詳細
【０１５８】
【表１３Ａ】
【０１５９】
【表１３Ｂ】
【０１６０】
表１４：２４の関係の無いサラブレッド馬のパネルにおけるリシークエンシング後にウマミオスタチン遺伝子において発見されたＳＮＰの詳細。これらのＳＮＰはＥｑｕＣａｂ２．０ ＳＮＰマップ中のＳＮＰの中には見られず、一般に利用可能などのような文献においても今まで報告されていない。
【０１６１】
【表１４】
【０１６２】
表１５：ＭＳＴＮ ＳＮＰに関する遺伝子型判定の結果
【０１６３】
【表１５】
【０１６４】
表１６：それぞれのコホートに対する後ろ向き競馬場成功の詳細を含む、集団の概要
【０１６５】
【表１６】
【０１６６】
表１７：ａ．ｇ．６６４９３７３７Ｃ＞Ｔに関する一連のコホート比較のケース−コントロール関連検定の結果。ＴＢＥ：エリートグループレース勝利サラブレッド；ＴＢＯ：その他の非勝利サラブレッド；ＴＢＥ＞８ｆ、ＴＢＥ≦８ｆおよびＴＢＥ≦７ｆ：＞８ｆ、≦８ｆおよび≦７ｆの距離で最適（最も価値があるか、または最高の等級の）レースに勝利した、優れたグループレース勝利サラブレッド。それぞれのケースにおいてｇ．６６４９３７３７−Ｔアレルの頻度が示される。オッズ比は２つの最も有意な結果に対して計算された。ｂ．≦７ｆの距離の優れたグループレース勝利パフォーマンスとｇ．６６４９３７３７Ｃ＞Ｔとの関連の最良適合モデルの結果。
【０１６７】
【表１７】
【０１６８】
表１８．遺伝子座ｇ．６６４９３７３７Ｃ＞Ｔに対するＨａｒｄｙ−Ｗｅｉｎｂｅｒｇ平衡検定の結果。
【０１６９】
【表１８】
【０１７０】
ＭＳＴＮ ＳＮＰ（ＭＳＴＮ＿６６４９３７３７（Ｔ／Ｃ）ＳＮＰ）
このＳＮＰは、ｗｗｗ．ｂｒｏａｄ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｍａｍｍａｌｓ／ｈｏｒｓｅ／/で調べることができるウマゲノム配列（Ｅｑｕｕｓ ｃａｂａｌｌｕｓ ２．０版）のウマ（Ｅｑｕｕｓ ｃａｂａｌｌｕｓ）のクロモソーム１８上６６，４９０，２０８−６６，４９５，１８０位リバース鎖に位置する。
【０１７１】
ウマゲノムＥｑｕＣａｂ２アセンブリーは６．７９ｘにおける全ゲノムショットガン（ＷＧＳ）アセンブリーであり、２００７年９月に公開された。''Ｔｗｉｌｉｇｈｔ''という名の雌サラブレッドがゲノム配列決定のための代表的なウマとして選択された。プロジェクト調整およびゲノム配列決定およびアセンブリーはＢｒｏａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅによって提供される。Ｎ５０サイズは、アセンブルしたゲノムの５０％がＮ５０サイズまたはそれより長いブロックで存在するような長さである。コンティグのＮ５０サイズは１１２．３８ｋｂであり、すべてのコンティグの全長は２．４３Ｇｂである。スカホールドのコンティグ間のギャップが含まれる場合、アセンブリーの全長は２．６８Ｇｂである。ウマＥｑｕＣａｂ２は、標準Ｅｎｓｅｍｂｌ哺乳動物パイプラインを使用してアノテーションされた。脊椎哺乳動物およびウマ蛋白質に由来する予測は非脊椎哺乳動物に由来する予測に対して優先されている。予測のセットはヒトおよびマウスの１：１相同遺伝子に比較され、ウマアノテーションにおいて欠損した相同遺伝子はｅｘｏｎｅｒａｔｅを使用して発見されている。ウマおよびヒトｃＤＮＡは蛋白質を基礎にした予測にＵＴＲを添加するために使用されている。最終遺伝子セットは２０，７３７蛋白質−コーディング遺伝子を含み、２，８６３は偽遺伝子として確認され、１，５８０はレトロ−トランスポゾン遺伝子として分類された。
【０１７２】
ＳＮＰの付加的な詳細は以下の通りである：
○ＳＮＰ：ＭＳＴＮ＿６６４９３７３７（Ｔ／Ｃ）Ｐ＝１．８８Ｅ−０５ ＯＲ＝４．５４
○ＥｑｕＣａｂ２．０ ＳＮＰ＿ＩＤ：ＥｑｕＣａｂ２．０データベースでは検出されなかった。オン−ラインバイオインフォマティックスリソースにおけるＳＮＰの報告はない。
【０１７３】
○インハウスＳＮＰ＿ＩＤ：ＭＳＴＮ−１０＿４３９
○ＳＮＰのゲノム位置：イントロン１
○置換型：転移
隣接配列およびＳＮＰ（太字および角括弧）は以下の通りである：
ＡＧＣＴＡＡＧＣＡＡＧＴＡＡＴＴＡＧＣＡＣＡＡＡＡＡＴＴＴＧＡＡＴＧＴＴＡＴＡＴＴＣＡＧＧＣＴＡＴＣＴＣＡＡＡＡＧＴＴＡＧＡＡＡＡＴＡＣＴＧＴＣＴＴＴＡＧＡＧＣＣＡＧＧＣＴＧＴＣＡＴＴＧＴＧＡＧＣＡＡＡＡＴＣＡＣＴＡＧＣＡＡＴＴＴＣＴＴＴＴＡＴＴＴＴＧＧＴＴＣＣＣＣＡＡＧＡＴＴＧＴＴＴＡＴＡＡＡＴＡＡＧＧＴＡＡＡＴＣＴＡＣＴＣＣＡＧＧＡＣＴＡＴＴＴＧＡＴＡＧＣＡＧＡＧＴＣＡＴＡＡＡＧＧＡＡＡＡＴＴＡ［Ｔ／Ｃ］ＴＴＧＧＴＧＣＡＴＴＡＴＡＡＣＣＴＧＡＴＴＡＣＴＴＡＡＴＡＡＧＧＡＧＡＡＣＡＡＴＡＴＴＴＴＧＡＡＡＣＴＧＴＴＧＴＧＴＣＣＴＧＴＴＴＡＡＡＧＴＡＧＡＴＡＡＡＧＣＡＣＴＧＧＧＴＡＡＡＧＣＡＧＧＡＴＣＧＣＡＧＡＣＡＣＡＴＧＧＣＡＣＡＧＡＡＴＣＴＴＣＣＧＴＧＴＣＡＴＧＣＣＴＴＣＴＣＴＧＴＧＡＡＧＧＴＧＴＣＴＧＴＣＴＣＣＣＴＴＴＣＣＴＴＧＡＧＴＧＴＡＧＴＴＡＴＧＡＡＣＴＧＡＣＴＧＣＡＡＡＡＡＧＡＡＴＡＴＡＴＧ
（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． ３１）
定量的形質としての最適レース距離（ＢＲＤ）を検討することにより、本発明者らは表現型として最も高い等級または最も価値のあるグループレース勝利の距離（ファーロング）を使用して、エリートコホートのデータ（ｎ＝７９）を分析した。ＢＲＤはｇ．６６４９３７３７Ｃ＞Ｔ ＳＮＰと極めて有意（Ｐ＝４．８５ｘ０−８）に関連した（表１９）。この結果は、同じトレーナーによって生み出された３７頭のエリート競走馬（ｎ＝２７ グループレース勝ち馬およびｎ＝１０ 準重賞レース勝ち馬）において独立して実証された（Ｐ＝０．００４７）。それぞれの遺伝子型に対して、本発明者らは平均ＢＲＤを測定した（表２０）：Ｃ／Ｃ平均値＝６．２±０．８ｆ；Ｃ／Ｔ平均値＝９．１±２．４ｆ；およびＴ／Ｔ平均値＝１０．５±２．７ｆ。２ファーロング増加の遺伝子型分布は図６Ａから６に示される。アイルランドおよびイギリス（Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）では２歳馬のグループレースは≦８ｆに限定されるため、これらの距離に対してバイアスが導入されてもよい（ヨーロッパでは＞８ｆの２歳馬のグループレースは３つしかない）。従って、本発明者らは２歳馬としてただ１つのグループレースに勝利しているウマのＢＲＤを、それらの３歳馬レースの平均距離と置き換え（ｎ＝７３）、そのことが３つの遺伝子型の平均値におけるわずかな増大（Ｃ／Ｃ平均値＝６．４±１．０ｆ；Ｃ／Ｔ平均値＝９．７±２．０ｆ；およびＴ／Ｔ平均値＝１０．９±２．４ｆ）および関連の有意性における増大（Ｐ＝５．４５×１０−９）に帰着した（図７）。
【０１７４】
８つのナショナルハント（障害レース、距離１６〜３６ｆ）競走馬はまた、ｇ．６６４９３７３７Ｃ＞Ｔ ＳＮＰに対して遺伝子型判定が行われ、結果はＴアレルとスタミナとの関連を支持する（Ｔ／Ｔ、ｎ＝７；およびＣ／Ｔ、ｎ＝１）。さらに、持続運動能力で知られる非サラブレッド集団（ｎ＝３１、エジプト系アラビア馬）間の遺伝子型頻度はサラブレッド集団とかなり異なった（図８）。これらの発見は一致して、Ｃ／Ｃ遺伝子型が短距離競走にとりわけ適することを示す。
【０１７５】
サラブレッド繁殖では、子孫の予測される最適レース距離における種馬（ｓｉｒｅ）の貢献が非常に重要であると考えられている。繁殖用種馬（ｓｔａｌｌｉｏｎ）にとって、‘スタミナインデックス’（Ｓ．Ｉ．）はすべての競走子孫の平均勝利距離として見積もられる。従って、本発明者らは、本発明者らの標本においてＳ．Ｉ．を持つｎ＝１９の関係のない繁殖用種馬（ｓｔａｌｌｉｏｎ）の遺伝子型の分布を検討した（図９）。Ｓ．Ｉ．＝６〜８ｆのすべて（１００％）の種馬（ｓｔａｌｌｉｏｎ）はＣ／Ｃ遺伝子型を有し；それぞれＳ．Ｉ．＝９〜１０ｆおよび１０〜１２ｆを持つ８３．３％および７５％の種馬（ｓｔａｌｌｉｏｎ）はＣ／Ｔであり；そしてＳ．Ｉ．＝１０〜１２ｆを持つ２５％の種馬（ｓｔａｌｌｉｏｎ）はＴ／Ｔであった。標本サイズは小さいが、ｇ．６６４９３７３７Ｃ＞Ｔ遺伝子型が繁殖用種馬（ｓｔａｌｌｉｏｎ）におけるＳ．Ｉ．の予測に役立つという明確な徴候が見られる（図９）。
【０１７６】
これらのデータは、この遺伝子座における遺伝子型情報がサラブレッド馬の競走および繁殖産業において実用的な用途を有してもよいことを示す。このことをさらに評価するために、２００７年と２００８年（ｎ＝６３、２００７；ｎ＝７９、２００８）において、同じトレーナーによる内部訓練中のｎ＝１４２のウマの２歳の競走フォームが検討された。首尾一貫して、競走成功のそれぞれのパラメータに対して、Ｃ／ＣおよびＣ／Ｔ遺伝子型はＴ／Ｔ動物よりいっそう成功している２歳競走馬であった（表２０ａ）。収益の点から、Ｃ／ＣまたはＣ／Ｔである動物に対しては訓練への投資に対する報酬が最も高く；平均でこれらのウマはＴ／Ｔのウマより５．５倍稼いだ。＞スターリング（Ｓｔｅｒｌｉｎｇ）£１００，０００（ＵＳ＄１６５，０００）を稼いだ個体が除外された場合でさえ、平均でＣ／Ｃの個体はＴ／Ｔの個体より１．６倍多く稼いだ。飼育および訓練費用の大半は賞金で戻らない（少なくとも１レースで走ったウマの場合、アイルランドで７２％、イギリス（Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）で７８％）［Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｏｒｓｅｒａｃｉｎｇ Ａｕｔｈｏｒｉｔｉｅｓ，ｗｗｗ．ｈｏｒｓｅｒａｃｉｎｇｉｎｔｆｅｄ．ｃｏｍ］；従って、２歳馬としてＣ／ＣおよびＣ／Ｔの個体だけを訓練し、競走させる方策を利用することが有益であってもよい。
【０１７７】
共有された種馬（ｓｉｒｅ）の潜在的に混乱する効果を取り除くために、同じトレーナーによって２歳馬として訓練された４１頭の異母兄弟（単一種馬（ｓｉｒｅ）の子孫）［Ｃ／Ｔ、ｎ＝２２；Ｔ／Ｔ＝１９］（表２０ｃ）の競走勝利が検討された。遺伝子型と競走パフォーマンスとの有意な関連（ピアソン（Ｐｅａｒｓｏｎ）のχ２乗検定：χ２＝７．２３５；ｄｆ＝１；Ｐ＝０．００７１）が確認され；子孫の中の５頭が２歳馬グループレース勝ち馬であり、すべてがＣ／Ｔ遺伝子型を提示した。
【０１７８】
多くの場合、ブリーダーのゴールはダービー（Ｄｅｒｂｙ）勝ち馬を繁殖させることである。ダービー距離（１２ｆ）は、個体がｇ．６６４９３７３７Ｃ＞Ｔにおいて少なくとも１コピーのＴアレルを持たなければならないことを予測する。本発明者らの標本では、ｎ＝７：Ｃ／Ｔ ｎ＝６；およびＴ／Ｔ ｎ＝１がダービー勝ち馬であった。さらに、エプソンダービー（Ｅｐｓｏｎ Ｄｅｒｂｙ）およびアイルランドダービー（Ｉｌｉｓｈ Ｄｅｒｂｙ）の両方で勝利した、成功している繁殖業者の種馬（ｓｔａｌｌｉｏｎ）に由来するｎ＝５１の子孫は、遺伝子型が判定され、Ｓ．Ｉ．＝１１．３ｆであった。子孫の中では、たった２つの遺伝子型（ｎ＝２９、Ｃ／Ｔ；およびｎ＝２２、Ｔ／Ｔ）が確認され、この個体（ここでは遺伝子型判定がされていないが）がＴ／Ｔであることを示唆した。（種馬（ｓｉｒｅ）と雌親（ｄａｍ）の両方は遺伝子型判定され：種馬（ｓｉｒｅ）：Ｔ／Ｔ；雌親（ｄａｍ）：Ｃ／Ｔであった）。本発明者らは、グループレースで勝利している種馬（ｓｔａｌｌｉｏｎ）のｎ＝９の子孫の遺伝子型の平均ＢＲＤを推測し、ｇ．６６４９３７３７Ｃ＞Ｔ遺伝子型傾向（Ｃ／Ｔ：ｎ＝６；平均ＢＲＤ＝８ｆ；Ｔ／Ｔ：ｎ＝３、平均ＢＲＤ＝１０．７ｆ）をいっそう説得力のあるものにした。
【０１７９】
それらのヒト対応物と同様に、短距離競走サラブレッドは一般に長距離レースに適したウマより引き締まり、筋骨たくましい。従って、ＭＳＴＮ遺伝子型が体質量、き甲（ｗｉｔｈｅｒｓ）の重さ（ｍａｓｓ）（ｋｇ）および高さ（ｃｍ）に影響を与えるかどうかを検討するために、２回の２歳馬競走シーズン中に同じトレーナーによる内部訓練中のｎ＝９７のウマ（ｎ＝３７ 雄、ｎ＝６０ 雌）に対して行われた測定が使用された。重さ対高さ比は、ｇ．６６４９３７３７Ｃ＞Ｔ遺伝子型との有意（Ｐ＝０．０１４７）な関係（２．９４ｋｇ／ｃｍ、Ｃ／Ｃ；２．８８ｋｇ／ｃｍ、Ｃ／Ｔ；および２．８３ｋｇ／ｃｍ、Ｔ／Ｔ）を提示した。雄（Ｐ＝０．００２５）が雌（Ｐ＝０．２２７２）から独立していると見なされる場合、この関連はより強くなった（表２１）。平均で、Ｃ／Ｃの雄はＴ／Ｔの雄よりｃｍあたりの重さが６．７％（すなわち、３．０３３ｋｇ／ｃｍ対２．８４３ｋｇ／ｃｍ）大きかった。
【０１８０】
表１９：定量的形質関連検定および最適レース距離（ＢＲＤ）平均値：ａ．関連検定標本；ｂ．（≦８ｆの最適レースに勝利した２歳馬の場合）表現型として３歳馬の平均距離を使用した関連検定標本；およびｃ．レプリケーション標本。
【０１８１】
【表１９】
【０１８２】
表２０：２００７年および２００８年に同じトレーナーによる内部訓練中のｎ＝１４２のウマに関する２歳馬競走（アイルランドおよびイギリス（Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ））成功のパラメータ。ａ．２００７年＆２００８年の内部訓練中の２歳馬；ｂ．Ｃ／ＣおよびＣ／Ｔ対Ｔ／Ｔ遺伝子型を比較した２００７年＆２００８年に内部訓練中の２歳馬；ｃ：単一の種馬（ｓｉｒｅ）を共有する、内部訓練中の異母兄弟の２歳馬。
【０１８３】
【表２０】
【０１８４】
表２１．表現型としてのｋｇ／ｃｍ比に関するｇ．６６４９３７３７Ｃ＞Ｔの定量的関連検定の結果
【０１８５】
【表２１】
【０１８６】
リスク予測
集団で観察された遺伝子型頻度およびベイズの定理を使用した亜集団予測に基づいて、ＭＳＴＮ遺伝子において、ある種の遺伝子型を与えられた１つの亜集団、または他の亜集団（エリートスプリンターまたはエリートエンデュアランスもしくは‘ステイヤー’）のメンバーである確率が検討された。結果は表２２に示され、２つの亜集団のそれぞれのメンバーである可能性の百分率として提供される。
【０１８７】
表２２−優れた短距離競走能力の予測検定
【０１８８】
【表２２】
【０１８９】
表中、ＡＡは遺伝子型ＴＴを表し、ＡＢは遺伝子型ＣＴを表し、そしてＢＢは遺伝子型ＣＣを表す。
【０１９０】
表２２から、ＭＳＴＮ＿６６４９３７３７（Ｔ／Ｃ）ＳＮＰにおいて遺伝子型ＣＣを持つ対象は、それらがエリートサラブレッドであるならば、スプリンターである最も高い可能性を有すると見なすことができる。
【０１９１】
ＭＳＴＮ遺伝子発現
２つの独立したリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲアッセイにおけるＭＳＴＮ ｍＲＮＡ発現（表２３）は、ｎ＝６０の訓練されていない明け２歳馬（ｙｅａｒｌｉｎｇ）（Ｃ／Ｃ、ｎ＝１５；Ｃ／Ｔ、ｎ＝２８；Ｔ／Ｔ、ｎ＝１７）に関して集められた生検標本に由来する静止骨格筋（ｇｌｕｔｅｕｓ ｍｅｄｉｕｓ）において検討されている。
【０１９２】
表２３：ＭＳＴＮ遺伝子発現およびＴＴＮ参照遺伝子発現に関するｑＲＴ−ＰＣＲアッセイのプライマー配列
【０１９３】
【表２３】
【０１９４】
本発明者らはＭＳＴＮ ６６４９３７３７（Ｔ／Ｃ）ＳＮＰに関して遺伝子型との有意（Ｐ＝０．００３５５９）な関連を見出した。Ｃ／Ｃ遺伝子型コホートはＣ／Ｔコホート（４０５．７±２３４．１；３６８．６±２１３．６）およびＴ／Ｔコホート（３５０．１±１８５．５；３４８．１±１６７．２）のいずれよりも高いＭＳＴＮ ｍＲＮＡレベル（６５４．３±３５４．３；６１３．７±３２７．０）を有した（図１０）。
【０１９５】
また、ＭＳＴＮ遺伝子発現は訓練期間後に有意にダウンレギュレーションされることが見出された（−４．２倍、Ｐ＝０．００４３）。サラブレッド馬骨格筋トランスクリプト−ムにおいて、ＭＳＴＮ遺伝子発現は訓練期間後の遺伝子発現が最も大きく減少する。
【０１９６】
最適レース距離との定量的関連
グループレースで勝利している個体（すなわちＴＢＥ ｎ＝８６）のサブセットを使用して、定量的関連検定解析において、調べられた遺伝子のＳＮＰと最適レース距離間に有意な関係（すなわち、最も優れた特性の距離／最も価値のあるグループレース勝利）があるかどうかが調べられた。以下の表２４は、ＳＮＰが最適レース距離と有意に関連したことを示す。
【０１９７】
表２４―最適レース距離と関連するＳＮＰ
【０１９８】
【表２４】
【０１９９】
以下の表２５は、上記の表２４に由来する４つのＳＮＰに関するそれぞれの遺伝子型の平均最適レース距離を示す。
【０２００】
表２５−それぞれの遺伝子型の平均最適レース距離
【０２０１】
【表２５】
【０２０２】
表中、ＭＳＴＮ＿６６４９３７３７−（Ｔ／Ｃ）では、ＴＴ遺伝子型は１０．５４ファーロング（ｆ）の平均最適レース距離を有し、ＴＣ遺伝子型は９．０８７ｆの最適レース距離を有し、そしてＣＣ遺伝子型は６．１６７ｆの最適レース距離を有する。全体の最適レース距離は８．５５ｆであった。
【０２０３】
ＭＳＴＮ遺伝子型に基づいた遺伝子型検定に関する多くの実用的な適用が存在する。これらには、以下のものが挙げられる：
１．若馬（ｙｏｕｎｇ ｓｔｏｃｋ）（当歳（０歳）および明け２歳（１歳））
情報に基づいた選択および販売が以下のために行われうる：
・スプリンターを確認する
・中距離馬／スピードのある潜在的ダービー勝ち馬を確認する
・スタミナの強い個体を確認する；
２．内部訓練中の馬（Ｈｏｒｓｅｓ−ｉｎ−ｔｒａｉｎｉｎｇ）
運営コストを低減することが可能であり、競走方策を以下により微調整することができる；
・最も発達の早い２歳馬を確認すること
・ウマは最適レース距離に対して訓練し、競走させることが可能である
３．繁殖牝馬（Ｂｒｏｏｄｍａｒｅ）
繁殖の結果は以下により最適化することができる：
・最適繁殖用雄馬に注意を集中すること
・適合した種馬（ｓｔａｌｌｉｏｎ）を選択すること
４．種馬（ｓｔａｌｌｉｏｎ）
種馬の潜在能力は以下により促進されうる：
・若い種馬のスタミナインデックスを予測すること（５歳アドバンテジージ（ａｄｖａｎｔａｇｅ））
・種馬（ｓｔａｌｌｉｏｎ）のプロファイルを高めるために、適合する雌馬を誘致する
たとえば、当歳馬、若馬および内部訓練中の馬のＭＳＴＮ−６６４９３７３７ ＴＩＣ ＳＮＰの場合、個体の選択は２歳馬として最も好ましいパフォーマンスをする可能性が高い個体（Ｃ／ＣおよびＣ／Ｔ）に対して行われ、そして３歳になるまでレースを待つことが有益であってもよい“バックワード（ｂａｃｋｗａｒｄ）”個体（身体的に発達の遅い若いサラブレッドに対する産業専門用語）（Ｔ／Ｔ）を除いて行われてもよい。繁殖の目標は、短距離競走に対してＣ／Ｃ個体、中距離競走に対してＣ／Ｔ個体、そしてより強いスタミナが必要な競走に対してＴ／Ｔ個体を選択することによっていっそう自信を持って達成されてもよい。種馬（ｓｔａｌｌｉｏｎ）オーナーの場合、種馬（Ｓｔｕｄ）キャリアの初めにおける種馬（ｓｔａｌｌｉｏｎ）の遺伝的スタミナインデックスの予測（後ろ向き３歳子孫競走パフォーマンスからＳ．Ｉ．を推測するためには５年が必要である）は、ただちに若い種馬（ｓｔａｌｌｉｏｎ）のプロファイルを高め、それらの遺伝的潜在性を雌馬オーナーに対して売り込むことになる。このことが今度は、雌馬オーナーが、目的をもった繁殖方策により、特定の繁殖目標を達成するために種馬（ｓｔａｌｌｉｏｎ）をいっそう都合よく選択することを可能にするであろう。交配の成り行き（種馬（ｓｉｒｅ）と母馬（ｄａｍ）が共にホモ接合体である場合を除いて）から不確実性を排除するために、当歳馬の遺伝子型判定をすることが、目的を持った繁殖の成果にふさわしい個体の選択を可能にするために必要であろう。
【０２０４】
実施例６−ＳＮＰの検出
ＳＮＰは、たとえば以下の限定的でない方法を含む、任意のＳＮＰ遺伝子型判定法により決定されてもよい。
【０２０５】
Ｓｅｑｕｅｎｏｍ Ｉｎｃ
マルチプレックスＰＣＲとそれに続く単一塩基プライマー伸長反応に基づいたｉＰＬＥＸ（登録商標）Ｇｏｌｄアッセイ。ＰＣＲの後、残存するヌクレオチドはＳＡＰ処理により脱活性化される。単一塩基プライマー伸長ステップが実施され、プライマー伸長産物はＭＡＬＤＩ ＴＯＦ ＭＳを使用して分析される。
【０２０６】
ＫＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ
ＫＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓは、遺伝子型判定に本発明者らの競合的アレル特異的ＰＣＲシステムの新規形態（ＫＡＳＰａｒ）およびＴａｑｍａｎ（商標）化学の両方を使用する。ＫＡＳＰａｒアッセイは以前使用されたＡｍｐｌｉｆｌｕｏｒシステムに取って代わるために開発された自社独自の社内システムである。
【０２０７】
Ｔａｑｍａｎアッセイ
ＴａｑＭａｎ（登録商標）遺伝子型判定アッセイは、ＴａｑＭａｎ（登録商標）試薬を基にした精密な化学でＳＮＰ遺伝子型判定を実施することを容易にする。ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイはＳＮＰ検出能力を提供する。その上、ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｓａｍｐｌｅ−ｔｏ−ＳＮＰ（登録商標）キットは単一のキットにより、任意の標本からＴａｑＭａｎ化学に基づいた遺伝子型判定解析を実施するための簡潔なプロトコルを提供する。該キットは：ＤＮＡ抽出物全溶解試薬（ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔ Ａｌｌ Ｌｙｓｉｓ Ｒｅａｇｅｎｔｓ）とＴａｑＭａｎ（登録商標）ＧＴＸｐｒｅｓｓ（登録商標）Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘの２つの部分からなる。ＤＮＡ抽出物全溶解試薬はリアルタイムＰＣＲ−用のＤＮＡ遊離のための時間のかかる手順を５分間プロトコルに短縮させる。それらは血液から頬スワブまでの範囲の多様な標本を調製できる。ＴａｑＭａｎ ＧＴＸｐｒｅｓｓ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘは５０分未満でロバストなＰＣＲ増幅を可能にする。
【０２０８】
産業上の利用可能性
本明細書に記載の予測検定は、競走成功に関する高い、または低い遺伝的潜在性を有する個体を選択するために適用されてもよい。これらの検定はライフサイクルのいずれの段階、たとえば生後１日目（出生時）、販売前（すなわち、明け２歳、２歳など）、競走キャリア中（すなわち、２歳から）、繁殖中（すなわち、およそ２５歳まで）においても個体に実施されうる。その上、母馬と種馬（ｓｔａｌｌｉｏｎ）の遺伝的素質に基づいて交配のための適切な種馬（ｓｔａｌｌｉｏｎ）−母馬の縁組みを選択するために、該検定が適用されてもよい。
【０２０９】
本発明は、添付の図面と関連した先に記載の態様に限定されず、構成および詳細が変更されてもよい。
【０２１０】
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付録Ｉ：ＴＢＥ（エリート）対ＴＢＯ（勝ち馬でない）関連検定。ＳＮＰはＰ値によって並べられた。
【０２１１】
【表２６−１】
【０２１２】
【表２６−２】
【０２１３】
【表２６−３】
【０２１４】
【表２６−４】
【０２１５】
【表２６−５】
【０２１６】
付録ＩＩ：ＴＢＥ＿ＳＰ（エリートスプリンター）対ＴＢＥ＿ＥＮ（エリートステイヤー）関連検定。ＳＮＰはＰ値によって並べられた。
【０２１７】
【表２７−１】
【０２１８】
【表２７−２】
【０２１９】
【表２７−３】
【０２２０】
【表２７−４】
【０２２１】
【表２７−５】
【０２２２】
付録ＩＩＩ：ＳＮＰと表現型の有意な関連
ＴＢＥ−エリート（グループレース勝利）サラブレッド
ＴＢＯ−その他（非勝利）のサラブレッド
ＴＢＥ＿ＳＰ８−＜８ｆの距離の最適レースに勝利したエリート（グループレース勝利）サラブレッド
ＴＢＥ＿ＳＰ７−＜７ｆの距離の最適レースに勝利したエリート（グループレース勝利）サラブレッド
ＴＢＥ＿ＥＮ−＞８ｆの距離の最適レースに勝利したエリート（グループレース勝利）サラブレッド
ＳＮＰは遺伝子記号＿クロモソーム位置（ｂｐ）によって示される。
【０２２３】
【表２８】
【０２２４】
付録ＩＶ：ケース−コントロール関連検定および有意に関連するＳＮＰの最良適合モデル
ＴＢＥ対ＴＢＯ（ケース−コントロール関連検定）Ｐ＜０．０５
【０２２５】
【表２９】
【０２２６】
ＴＢＥ対ＴＢＯ 有意に関連するＳＮＰに関する最良適合モデル
【０２２７】
【表３０−１】
【０２２８】
【表３０−２】
【０２２９】
【表３０−３】
【０２３０】
ＴＢＥ＿ＳＰ７対ＴＢＥ＿ＥＮ（ケース−コントロール関連検定）Ｐ＜０．０５
【０２３１】
【表３１】
【０２３２】
ＴＢＥ＿ＳＰ７対ＴＢ＿ＥＮ 有意に関連するＳＮＰに関する最良適合モデル
【０２３３】
【表３２−１】
【０２３４】
【表３２−２】
【０２３５】
ＴＢＥ最適レース距離定量的形質関連
【０２３６】
【表３３】
【０２３７】
ＴＢＥ 有意に関連するＳＮＰに関する最適レース距離平均値（距離はファーロングである）
【０２３８】
【表３４−１】
【０２３９】
【表３４−２】
【０２４０】
【表３４−３】
【０２４１】
レーシングポストハンディキャップレーティング（最適ＲＰＲ）定量的形質関連
【０２４２】
【表３５】
【０２４３】
有意に関連するＳＮＰに関するレーシングポストハンディキャップレーティング（最適ＲＰＲ）平均値
【０２４４】
【表３６】
【技術分野】
【０００１】
本発明は対象の競技パフォーマンスの潜在能力を予測するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
サラブレッド馬産業は、サラブレッド馬の繁殖、訓練および競走に関係する数十億ユーロの国際的な産業である。数百万ユーロの決断が、しばしば競争能力を有すると認められた個々の動物の購入に対して行われる。サラブレッドの競走および繁殖産業へのゲノミクス情報の統合は早期の“素質確認”に対する高い潜在性を有する。サラブレッドは伝統的に、血統情報および非常に多くの表現型の特徴に基づいて競走および繁殖に対して選択される。伝統的または新規な手段による遺伝的潜在性の早期の確認が成功に優先する。産業内では、常に新規な方法および技術を検討することに関わる人々は“有効性”を見出すための探索に追われている。従って、ゲノミクス情報は、以前には入手し難かった情報を提供することによって、しばしば数百万ドルの決断を微調整するためにブリーダーやトレーナーを直接援助する潜在性を有する。
【０００３】
酸素は筋肉機能の重要なレギュレーターであり、エネルギー産生、筋肉収縮、および副生成物の除去に影響を及ぼす。運動中のエネルギーに対する要求は、酸素の利用能によって非常に限定される。哺乳類の細胞は低い細胞内酸素環境に反応するための精巧な適応機序を進化させてきた（Ｔａｙｌｏｒ ＆ Ｃｏｌｇａｎ １９９９）。ヒト運動の研究において、訓練された骨格筋におけるそのような低酸素環境への適応が炭水化物の酸化増大に対して基質選択をシフトさせ、細胞を刺激して酸素輸送および利用の状態を改善する（Ｈｏｐｐｅｌｅｒ ＆ Ｖｏｇｔ ２００１）。サラブレッド馬では、高強度での短時間の運動中に、心臓血管および呼吸系における酸素の運搬能力および送達を改善する数多くの構造的および機能的適応にもかかわらず、酸素輸送系は運動‐誘発動脈低酸素血および炭酸過剰の日常的発生においてもたらされる末梢の要求にかなり遅れを取る（Ｄｅｍｐｓｅｙ ＆ Ｗａｇｎｅｒ，１９９９；Ｓｅａｍａｎ，１９９５）。サラブレッドの反応は、訓練されたヒトアスリートを含む他の動物種に比較して、エネルギーに対する筋肉系の非常に大きい要求を反映して月並みではない。驚くべきことに、限定された酸素供給に直面してさえ、サラブレッドは厳しい運動に適切に適応する優れたアスリートであり続ける。
【０００４】
サラブレッド馬は短距離（＜１マイル）および長距離（＞１マイル）レースの両方において秀でている。これらの鍛錬（ｄｉｓｃｉｐｌｉｎｅ）に対する生理的要求は異なり、代謝経路の分配によって調節される。超最大強度（１０５〜１２５％ ＶＯ２ｍａｘ）における運動の初めの７５秒間は、酸素供給が運動中の筋肉の要求に応えることができないため、ウマは酸素欠乏を経験する（Ｄｅｍｐｓｅｙ ＆ Ｗａｇｎｅｒ，１９９９；Ｓｅａｍａｎ，１９９５）。これにもかかわらず、短距離レース（＜１０００ｍ）中、全エネルギーのおよそ７０％が好気的に供給されることになる。より長い距離およびより長い期間（＞７５秒）を競うウマは定常状態ＶＯ２に到達し、従って酸素欠乏ではない。
【０００５】
さまざまな研究が、サラブレッド競走馬における競技パフォーマンス表現型との測定可能な関連を検討するために行われてきており、それらは心臓の大きさ（Ｙｏｕｎｇら ２００５）、筋肉繊維の型（Ｒｉｖｅｒｏら ２００７）、筋骨格構造（Ｌｏｖｅら ２００６）、最大心拍数におけるスピード（Ｇｒａｍｋｏｗ ＆ Ｅｖａｎｓ ２００６）、血液学的（Ｒｅｖｉｎｇｔｏｎ １９８３）および他の生理学的変数（Ｈａｒｋｉｎｓら １９９３）の評価を含む。
【０００６】
ＷＯ２００６００３４３６は、パフォーマンスとミトコンドリアゲノムによってコード化された遺伝子変異体間の関連について記載する。しかし、ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）ハプロタイプは、母親から厳密に受け継ぎ、従って表現型に対して雌性貢献にだけ関係する。サラブレッド集団におけるｍｔＤＮＡハプロタイプの数は限定され（ｎ＝１７）、１０頭の雌だけが現在の母性血統の７４％に貢献するため（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍら ２００２）、パフォーマンスに対して目標を設定された選択が存在する集団において、これらのハプロタイプ変異体が、速やかに好ましいハプロタイプが“固定される”といったような意味のある効果を有する可能性はありそうもなく；さらに（ｍｔＤＮＡ変異体の）効果的な集団サイズは核内コード化変異体の１／３である（Ｂａｌｌａｒｄ ａｎｄ Ｄｅａｎ ２００１，Ｂｌｉｅｒら ２００１，Ｄａｓ ２００６，Ｍｅｉｋｌｅｊｏｈｎら ２００７）。その上、ｍｔＤＮＡハプロタイプは血統情報から直接推測されうる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】ＷＯ２００６００３４３６
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｔａｙｌｏｒ ＆ Ｃｏｌｇａｎ １９９９
【非特許文献２】Ｈｏｐｐｅｌｅｒ ＆ Ｖｏｇｔ ２００１
【非特許文献３】Ｄｅｍｐｓｅｙ ＆ Ｗａｇｎｅｒ，１９９９
【非特許文献４】Ｓｅａｍａｎ，１９９５
【非特許文献５】Ｙｏｕｎｇら ２００５
【非特許文献６】Ｒｉｖｅｒｏら ２００７
【非特許文献７】Ｌｏｖｅら ２００６
【非特許文献８】Ｇｒａｍｋｏｗ ＆ Ｅｖａｎｓ ２００６
【非特許文献９】Ｒｅｖｉｎｇｔｏｎ １９８３
【非特許文献１０】Ｈａｒｋｉｎｓら １９９３
【非特許文献１１】Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍら ２００２
【非特許文献１２】Ｂａｌｌａｒｄ ａｎｄ Ｄｅａｎ ２００１
【非特許文献１３】Ｂｌｉｅｒら ２００１
【非特許文献１４】Ｄａｓ ２００６
【非特許文献１５】Ｍｅｉｋｌｅｊｏｈｎら ２００７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、対象の潜在的競技パフォーマンスを予測するための、これらの問題のいくつかを克服する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
発明の陳術
本発明は核内コード化遺伝子における変異を検出するための、ＤＮＡを基にした検定を提供する。核内コード化遺伝子の変異はすべての可能性のある祖先に由来する好ましい遺伝子変異体の遺伝を反映するが、ｍｔＤＮＡ検定は雌の祖先に制限されるため、この方法はミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）検定よりも優れている。
【００１１】
本明細書に記載の方法およびアッセイはｅｘ ｖｉｖｏで実施され、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏの方法およびアッセイであると見なされうる。
【００１２】
たとえば血液、唾液、体毛、皮膚、骨髄、軟部組織、内部臓器、生検標本、精液、骨格筋組織などの遺伝物質を含むいずれか適切な生物学的標本が、本明細書に記載の方法の生物学的標本として使用されてもよい。血液および体毛標本はとりわけ生物学的標本として適している。
【００１３】
本明細書で使用する“競技パフォーマンス”には、競争レースならびに、競走、障害飛越、総合馬術、調馬、耐久競技、乗馬、狩猟などの馬術スポーツのような競走が挙げられる。馬術スポーツは競技スポーツであってもよい。
【００１４】
競争レース種には、ウマ科動物（ウマ）、ラクダ、イヌ、ゾウ、ウサギ、カンガルー、ダチョウ、ハト、ヒトおよびタカまたはハヤブサのような猛禽が挙げられる。競争レース種はサラブレッド馬または障害飛越馬であってもよい。
【００１５】
“プライマー”は、関心のある核酸配列に由来する約１５から約４０、たとえば約１８から約２５の連続したヌクレオチドを含む核酸配列を意味する。プライマーはフォワード（５′または３′）もしくはリバース（３′から５′）プライマー、または関心のある核酸配列に対する相補的核酸配列に基づいて設計されたプライマーであってもよい。本発明では、関心のある配列は競技パフォーマンスに関連した遺伝子、たとえば付録の中に挙げられた遺伝子、またはＣＯＸ４Ｉ１、ＣＯＸ４Ｉ２、ＰＤＫ４、ＣＫＭまたはＭＳＴＮ遺伝子の中の１以上のゲノム配列である。一態様では、プライマーはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３１もしくはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３２に由来する約１５から約４０、たとえば約１８から約２５の連続したヌクレオチド、またはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３１もしくはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３２に対する相補的配列に由来する約１５から約４０、たとえば約１８から約２５の連続したヌクレオチドを含んでいてもよい。“相補的配列”は、慣例のワトソン−クリック塩基対形成：すなわち、アデニンはチミンに結合し、そしてシトシンはグアニンに結合する；を使用して関心のある配列に結合する配列を意味する。
【００１６】
本発明は、優れた競技パフォーマンスに関連した一塩基多型（ＳＮＰ）を提供する。本発明は対象の競技パフォーマンスを予測する方法を提供し、該方法は付録に列挙された１以上の遺伝子における一塩基多型（ＳＮＰ）の存在に関して、対象に由来する生物学的標本をアッセイするステップを含み、ここではＳＮＰが競技パフォーマンスと有意な関連を有する。
【００１７】
本発明に従って、対象の潜在的競技パフォーマンスを予測する方法が提供され、該方法はＭＳＴＮ遺伝子、ＣＯＸ４Ｉ２遺伝子、ＰＤＫ４遺伝子、ＣＫＭ遺伝子、またはＣＯＸ４Ｉ１遺伝子の中の１以上における一塩基多型（ＳＮＰ）の存在に関して、対象に由来する生物学的標本をアッセイするステップを含む。
【００１８】
ＳＮＰはＭＳＴＮ＿６６４９３７３７（Ｔ／Ｃ）であってもよい。Ｃアレルの存在は優れた競技パフォーマンスを示す。ホモ接合ＣＣ遺伝子型の存在は優れた競技パフォーマンスを示してもよい。優れた競技パフォーマンスは優れた全力疾走パフォーマンスであってもよい。
【００１９】
ＳＮＰはＣＯＸ４Ｉ２＿２２６８４３９０（Ｃ／Ｔ）であってもよい。Ｔアレルの存在は優れた競技パフォーマンスを示してもよい。ホモ接合ＴＴ遺伝子型の存在は優れた競技パフォーマンスを示してもよい。
【００２０】
ＳＮＰはＰＤＫ４＿３８９７３２３１（Ａ／Ｇ）であってもよい。Ａアレルの存在は優れた競技パフォーマンスを示してもよい。ホモ接合ＡＡ遺伝子型の存在は優れた競技パフォーマンスを示してもよい。
【００２１】
ＳＮＰはＣＫＭ＿１５８８４５６７（Ｇ／Ａ）であってもよい。Ａアレルの存在は優れた競技パフォーマンスを示してもよい。ホモ接合ＡＡ遺伝子型の存在は優れた競技パフォーマンスを示してもよい。
【００２２】
ＳＮＰはＣＯＸ４Ｉ１＿３２７７２８７１（Ｔ／Ｃ）であってもよい。Ｔアレルの存在は優れた競技パフォーマンスを示してもよい。ホモ接合ＴＴ遺伝子型の存在が優れた競技パフォーマンスを示してもよい。
【００２３】
対象の生物学的標本は：血液、唾液、骨格筋、皮膚、精液、生検標本、骨髄、軟部組織、内部臓器および体毛を含む群から選択されてもよい。
【００２４】
対象は競争レース種に由来してもよい。対象はサラブレッド競走馬のようなウマ科動物であってもよい。
【００２５】
本発明はさらに以下のステップを含む、対象の潜在的競技パフォーマンスを測定するためのアッセイ：
−標本を得ること；
−標本からＤＮＡを抽出するか、または遊離させること；および
−前記の抽出されるか、または遊離されたＤＮＡにおける競技パフォーマンスに関連した遺伝子の標的配列の中の一塩基多型（ＳＮＰ）を確認すること；
を提供し、ここで対象の潜在的競技パフォーマンスはＳＮＰに関連する。
【００２６】
競技パフォーマンスに関連した遺伝子はＭＳＴＮ、ＣＯＸ４Ｉ２、ＰＤＫ４、ＣＫＭまたはＣＯＸ４Ｉ１の中の１以上から選択されてもよい。
【００２７】
該アッセイは、以下のステップを、一塩基多型を確認するステップの前に含んでいてもよい：
−前記の抽出されるか、または遊離されたＤＮＡにおける競技パフォーマンスに関連した遺伝子の標的配列を増幅すること。
【００２８】
ＤＮＡはゲノムＤＮＡであってもよい。
【００２９】
本発明はさらに、ＭＳＴＮ遺伝子、ＣＯＸ４Ｉ２遺伝子、ＰＤＫ４遺伝子、ＣＫＭ遺伝子、またはＣＯＸ４Ｉ１遺伝子の中の１以上における一塩基多型（ＳＮＰ）の存在を検出するための手段を含む、対象の潜在的競技パフォーマンスの測定に使用されるアッセイを提供する。
【００３０】
ＳＮＰはＭＳＴＮ＿６６４９３７３７（Ｔ／Ｃ）であってもよい。Ｃアレルの存在は優れた競技パフォーマンスを示す。ホモ接合ＣＣ遺伝子型の存在は優れた競技パフォーマンスを示してもよい。優れた競技パフォーマンスは優れた全力疾走パフォーマンスであってもよい。
【００３１】
ＳＮＰはＣＯＸ４Ｉ２＿２２６８４３９０（Ｃ／Ｔ）であってもよい。Ｔアレルの存在は優れた競技パフォーマンスを示してもよい。ホモ接合ＴＴ遺伝子型の存在は優れた競技パフォーマンスを示してもよい。
【００３２】
ＳＮＰはＰＤＫ４＿３８９７３２３１（Ａ／Ｇ）であってもよい。Ａアレルの存在は優れた競技パフォーマンスを示してもよい。ホモ接合ＡＡ遺伝子型の存在は優れた競技パフォーマンスを示してもよい。
【００３３】
ＳＮＰはＣＫＭ＿１５８８４５６７（Ｇ／Ａ）であってもよい。Ａアレルの存在は優れた競技パフォーマンスを示してもよい。ホモ接合ＡＡ遺伝子型の存在は優れた競技パフォーマンスを示してもよい。
【００３４】
ＳＮＰはＣＯＸ４Ｉ１＿３２７７２８７１（Ｔ／Ｃ）であってもよい。Ｔアレルの存在は優れた競技パフォーマンスを示してもよい。ホモ接合ＴＴ遺伝子型の存在は優れた競技パフォーマンスを示してもよい。
【００３５】
本発明はさらに以下のステップ：
−標本を得ること；
−標本からＤＮＡを抽出するか、または遊離させること；および
−前記の抽出されるか、または遊離されたＤＮＡにおけるＭＳＴＮ＿６６４９３７３７（Ｔ／Ｃ）ＳＮＰの遺伝子型を確認すること
を含む、対象の潜在的競技パフォーマンスを測定するためのアッセイを提供し、ここでＭＳＴＮ＿６６４９３７３７（Ｔ／Ｃ）ＳＮＰにおけるＣアレルの存在は優れた競技パフォーマンスを示す。
【００３６】
該アッセイは、ＭＳＴＮ＿６６４９３７３７（Ｔ／Ｃ）ＳＮＰ遺伝子型を確認するステップの前に、以下のステップを含んでいてもよい：
−前記の抽出されるか、または遊離されたＤＮＡにおけるＭＳＴＮ＿６６４９３７３７（Ｔ／Ｃ）ＳＮＰをコードする標的配列を増幅すること。
【００３７】
ホモ接合ＣＣ遺伝子型の存在は優れた競技パフォーマンスを示す。
【００３８】
優れた競技パフォーマンスは優れた全力疾走パフォーマンスであり得る。
【００３９】
ＤＮＡはゲノムＤＮＡであってもよい。
【００４０】
対象に由来する標本は：血液、唾液、骨格筋、皮膚、骨髄、生検標本、軟部組織、精液、内部臓器および体毛を含む群から選択されてもよい。
【００４１】
対象は競争レース種に由来してもよい。対象はサラブレッド競走馬のようなウマ科動物であってもよい。
【００４２】
本発明者らは、ＣＯＸ４Ｉ２遺伝子（ＥｑｕＣａｂ２．０ ２２６７６３６１−Ｃ／Ｔ）一塩基多型（ＳＮＰ）のＴアレルのホモ接合キャリア：すなわち、ＣＯＸ４Ｉ２遺伝子の両アレルにおいて多型を有するものは、ＳＮＰに対してヘテロ接合である対象：すなわちＣＯＸ４Ｉ２遺伝子のアレルの一つにおいて多型を有する対象、またはＣＯＸ４Ｉ２遺伝子のいずれのアレルもＳＮＰを持たない対象に比較して、優れた全力疾走競走馬である可能性が統計的にいっそう高い。
【００４３】
本発明者らは、ＣＯＸ４Ｉ２遺伝子における一塩基多型（ＳＮＰ）の存在または非存在に関して対象に由来する生物学的標本をアッセイするステップを含む、対象の競技パフォーマンスを予測する方法を記載する。ＳＮＰはＥｑｕＣａｂ ２．０ ＣＯＸ４Ｉ２−２２６７６３６１-Ｃ／Ｔであってもよい。ホモ接合ＴＴ遺伝子型の存在は優れた競技パフォーマンスを示してもよい。ホモ接合ＴＴ遺伝子型の存在は優れた酸素消費パフォーマンスを示してもよい。ホモ接合ＴＴ遺伝子型の存在は優れた全力疾走パフォーマンスを示してもよい。対象の生物学的標本は：血液、唾液、骨格筋、精液、生検標本、内部臓器、皮膚、骨髄（またはいずれか他の生物組織）および体毛を含む群から選択されてもよい。対象は競争レース種に由来してもよい。対象はウマ科動物であってもよい。対象はサラブレッド競走馬であってもよい。
【００４４】
本発明者らはまた、ＣＯＸ４Ｉ２遺伝子における一塩基多型（ＳＮＰ）の存在または非存在を検出するための手段を含む、対象の競技パフォーマンスを測定するための使用に関するアッセイを記載する。ＳＮＰはＥｑｕＣａｂ ２．０ ＣＯＸ４Ｉ２−２２６７６３６１-Ｃ／Ｔであってもよい。ホモ接合ＴＴ遺伝子型の存在は優れた競技パフォーマンスを示してもよい。対象の生物学的標本は：血液、唾液、骨格筋、精液、生検標本、内部臓器、皮膚、骨髄（またはいずれか他の生物組織）および体毛を含む群から選択されてもよい。対象は競争レース種に由来してもよい。対象はウマ科動物であってもよい。対象はサラブレッド競走馬であってもよい。
【００４５】
本発明は、添付の図面を参照することによって、実施例だけによって示された以下のその態様の説明からいっそう明確に理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】図１はウマにおける運動中のエネルギー分配の概要である。
【図２】図２は、サラブレッド亜集団（ＴＢＥ＿ＥＮ：＞８ｆの距離で優れたパフォーマンスをするサラブレッド；ＴＢＥ＿ＳＰ：＜８ｆの距離で優れたパフォーマンスをするサラブレッド；ＴＢＯ：レースに参加してきたが、一度も勝利せず、＜７０のハンディキャップレーティングを有するその他のサラブレッド）および非サラブレッド馬（ＡＨ：Ａｋｈａｌ−Ｔｅｋｅ；ＣＯＮ：Ｃｏｎｎｅｍａｒａ Ｐｏｎｙ；ＴＵ：Ｔｕｖａ）におけるＣＯＸ４Ｉ２ ２２６７６３６１（Ｃ／Ｔ）ＳＮＰ遺伝子型の分布を示す棒グラフである。＜８ｆの距離で首尾よく競ってきたエリートサラブレッドは、他のサラブレッド亜集団および非サラブレッドより有意に高いＴＴ遺伝子型頻度を有する。
【図３】図３は運動中にエネルギー産生に貢献する３つの主要な代謝経路間の関係を示す図であり、優れた競走パフォーマンスに関連した３種の遺伝子、ＣＫＭ、ＣＯＸ４Ｉ２およびＰＤＫ４の機能が示される。
【図４−１】図４は、ＣＫＭ ２２６８４３９０（Ｃ／Ｔ）ＳＮＰ（Ａ）、ＣＯＸ４Ｉ２ ２２６８４３９０（Ｃ／Ｔ）ＳＮＰ（Ｂ）およびＰＤＫ４ ３８９７３２３１（Ａ／Ｇ）ＳＮＰ（Ｃ）に対するエリートサラブレッド（斜線バー）と非エリートサラブレッド間、およびＭＳＴＮ ６６４９３７３７（Ｔ／Ｃ）ＳＮＰ（Ｄ）に対するエリートスプリンター（斜線バー）とエリートエンデュアランスサラブレッド間のアレル頻度分布を示すグラフである。
【図４−２】図４は、ＣＫＭ ２２６８４３９０（Ｃ／Ｔ）ＳＮＰ（Ａ）、ＣＯＸ４Ｉ２ ２２６８４３９０（Ｃ／Ｔ）ＳＮＰ（Ｂ）およびＰＤＫ４ ３８９７３２３１（Ａ／Ｇ）ＳＮＰ（Ｃ）に対するエリートサラブレッド（斜線バー）と非エリートサラブレッド間、およびＭＳＴＮ ６６４９３７３７（Ｔ／Ｃ）ＳＮＰ（Ｄ）に対するエリートスプリンター（斜線バー）とエリートエンデュアランスサラブレッド間のアレル頻度分布を示すグラフである。
【図５−１】図５は、ＣＫＭ ２２６８４３９０（Ｃ／Ｔ）ＳＮＰ（Ａ）、ＣＯＸ４Ｉ２ ２２６８４３９０（Ｃ／Ｔ）ＳＮＰ（Ｂ）およびＰＤＫ４ ３８９７３２３１（Ａ／Ｇ）ＳＮＰ（Ｃ）に対するエリートサラブレッド（斜線バー）と非エリートサラブレッド間、およびＭＳＴＮ ６６４９３７３７（Ｔ／Ｃ）ＳＮＰ（Ｄ）に対するエリートスプリンター（斜線バー）とエリートエンデュアランスサラブレッド間の遺伝子型頻度分布を示すグラフである。
【図５−２】図５は、ＣＫＭ ２２６８４３９０（Ｃ／Ｔ）ＳＮＰ（Ａ）、ＣＯＸ４Ｉ２ ２２６８４３９０（Ｃ／Ｔ）ＳＮＰ（Ｂ）およびＰＤＫ４ ３８９７３２３１（Ａ／Ｇ）ＳＮＰ（Ｃ）に対するエリートサラブレッド（斜線バー）と非エリートサラブレッド間、およびＭＳＴＮ ６６４９３７３７（Ｔ／Ｃ）ＳＮＰ（Ｄ）に対するエリートスプリンター（斜線バー）とエリートエンデュアランスサラブレッド間の遺伝子型頻度分布を示すグラフである。
【図６−１】図６の（Ａ）〜（Ｃ）は、最適レース距離に関するＭＳＴＮ ６６４９３７３７（Ｔ／Ｃ）ＳＮＰの遺伝子型頻度を示すグラフであり、（Ａ）はＣ／Ｃ遺伝子型頻度を示し；（Ｂ）はＣ／Ｔ遺伝子型頻度を示し；
【図６−２】そして（Ｃ）はＴ／Ｔ遺伝子型頻度を示す。
【図７】図７は、ＭＳＴＮ ６６４９３７３７（Ｔ／Ｃ）ＳＮＰの最適レース距離の遺伝子型頻度を示すグラフであり、ここでは２歳馬としてのグループレースで勝利したウマの最適レース距離はそれらの３歳馬レースの平均距離に置き換えられた。
【図８】図８は、持続性運動パフォーマンスに関して公知のエジプト系アラビア馬の非サラブレッド集団とサラブレッド集団における、ＭＳＴＮ ６６４９３７３７（Ｔ／Ｃ）ＳＮＰの遺伝子型頻度を示すグラフである。
【図９】図９は、６〜８ｆ、８〜１０ｆ、１０〜１２ｆのスタミナインデックスを持つ種馬（ｓｔａｌｌｉｏｎ）のＭＳＴＮ ６６４９３７３７（Ｔ／Ｃ）ＳＮＰの遺伝子型頻度を示すグラフである。
【図１０】図１０はＭＳＴＮ ６６４９３７３７（Ｔ／Ｃ）ＳＮＰのＣ／Ｃ、Ｃ／ＴおよびＴ／Ｔ遺伝子型に関するＭＳＴＮ遺伝子の相対発現を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
サラブレッド馬（Ｅｑｕｕｓ ｃａｂａｌｌｕｓ）における優れた競走パフォーマンスに関する厳しい選択の結果、運動にとって適切な多数の適応性生理的表現型が生まれたが、これらの特徴を引き起こす基礎的な分子機序は十分に理解されていない。
【００４８】
Ｅｉｖｅｒｓら（２００９）は、８頭の無調教サラブレッド馬における標準化漸増−ステップトレッドミル運動試験後のウマ骨格筋における運動−反応候補遺伝子群のｍＲＮＡ発現の適応性変化を検討した。該研究では、生検標本は運動前（Ｔ０）、運動後すぐ（Ｔ１）および運動後４時間（Ｔ２）の中臀筋から得られた。Ｔ２ではＴ０に比較して８遺伝子（ＣＫＭ、ＣＯＸ４Ｉ１、ＣＯＸ４Ｉ２、ＰＤＫ４、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、ＰＲＫＡＡ１、ＳＬＣ２Ａ１、およびＳＬＣ２Ａ４）において有意な倍率の差（Ｐ＜０．０５）が検出された。最大心拍数（ＶＨＲｍａｘ）におけるｍＲＮＡおよび速度と運動後のピーク血漿中乳酸塩濃度（［Ｌａ］Ｔ１）の関係を研究することによって、彼らはＴ２でのＣＯＸ４Ｉ１とＰＰＡＲＣＧ１Ａ、およびＴ０での［Ｌａ］Ｔ１とＣＯＸ４Ｉ１間の有意な（Ｐ＜０．０５）関連を証明した。後続の研究では、彼らは１０か月調教後の第２コホートのウマにおける遺伝子発現変化を検討した。彼らは、静止標本では、ＣＯＸ４Ｉ１遺伝子が調教後に有意な量の増加を示し、そして調教されたコホートでは運動後にＴ２において有意な倍率の差がＣＯＸ４Ｉ２、ＰＤＫ４およびＰＰＡＲＧＣ１Ａで確認されることを示した。彼らはまたＰＰＡＲＧＣ１ＡおよびＣＯＸ４Ｉ１に関してＶＨＲｍａｘと［Ｌａ］Ｔ１の有意な関係を検出した。
【００４９】
本発明は、サラブレッド競走馬において多数の運動反応遺伝子候補（付録に列挙される）における配列変異体（たとえば、ＳＮＰ）と、後向き競技パフォーマンス（競馬場成功、すなわち、グループ勝ち馬または非勝ち馬、グループ勝ち馬のハンディキャップレーティング（ＲＰＲ）および最適レース距離として示される）間の今まで未知の関係に関する。ある側面では、本発明はＣＯＸ４Ｉ１、ＣＯＸ４Ｉ２、ＰＤＫ４、ＣＫＭおよびＭＳＴＮ遺伝子におけるＳＮＰに関する。
【００５０】
ＣＯＸ４Ｉ１およびＣＯＸ４Ｉ２
シトクロムＣオキシダーゼ（ＣＯＸ）は、ミトコンドリア呼吸において還元されたシトクロムＣから酸素への電子伝達を触媒するマルチ−サブユニット酵素（複合体ＩＶ）である。ＣＯＸはダイマーであり、それぞれのモノマーは１３サブユニットから構成され、そのうちの３つ（ＣＯＸ１、２および３）はミトコンドリアゲノムによってコード化される。核内コード化ＣＯＸ４はミトコンドリア内膜上のミトコンドリアコード化サブユニットの調節および会合に関与する（Ｆｕｋｕｄａら ２００７）。ヒト骨格筋では、ＣＯＸ４ ｍＲＮＡレベルはミトコンドリア容積、伸長およびＶＯ２ｍａｘと関連することが示されている。ＣＯＸ４は、ＣＯＸ４Ｉ１およびＣＯＸ４Ｉ２遺伝子によってコードされる２つのイソ型（ＣＯＸ４−１およびＣＯＸ４−２）を含み、それらは正常酸素環境および低酸素環境において異なって調節される（Ｆｕｋｕｄａら ２００７）。正常酸素環境では、ＣＯＸ４Ｉ１は優先的に転写される。限定された酸素環境では、ＨＩＦ−１がＣＯＸ４Ｉ２およびミトコンドリアＬＯＮ遺伝子の転写を活性化する。ＬＯＮはＣＯＸ４Ｉ１の発現を阻害するため、これらの制御機序はＣＯＸ４Ｉ２の転写および蛋白質合成を増し、ＣＯＸ４−１の利用能を減少させる。この機序は限定された酸素環境において細胞呼吸の効率を最大にするための方策であると見なされている（Ｆｕｋｕｄａら ２００７）。
【００５１】
レース中の生理的要求はエネルギー需要に依存して異なり、最も効率的な様式でエネルギーを提供するための代謝経路の分配によって調節される。酸素供給は運動している筋肉の需要に応えることができないため、過最大強度（１０５〜１２５％ＶＯ２ｍａｘ）における運動の初めの７５秒間にウマは酸素欠乏を経験する（Ｄｅｍｐｓｅｙ ａｎｄ Ｗａｇｎｅｒ １９９９；Ｓｅａｍａｎら １９９５）。より長い距離およびより長い期間（＞７５秒）の間に、ウマは定常状態ＶＯ２に到達し、主として好気的代謝に頼る。レースの終了時には、ウマが“乳酸塩閾値”を通過するため、酸素消費需要は増大する。短距離レース（＜１，０００ｍ）中に、筋肉収縮に必要なＡＴＰの形態における総エネルギーのおよそ７０％は好気的代謝経路によって生み出される（Ｅａｔｏｎら １９９５）。短距離を過最大強度で運動するサラブレッド馬では、この低酸素環境が、都合よく保存された代謝スィッチをＣＯＸ４−１からＣＯＸ４−２利用に切り換えてもよい（Ｆｕｋｕｄａら ２００７）。この環境によるＣＯＸ４−２の調節が細胞の呼吸効率を増大させてもよい。ＣＯＸ４−２は従って、酸素が限定される場合、レースの初期段階において、およびレースの終了にむけてのエネルギー供給の重要なレギュレーターである。図１からわかるように、運動の初期段階において、およびレースの終了に向けて末梢の生理的システム（すなわち、骨格筋）が限定された酸素環境で稼働している間、大量のエネルギーが要求される。ＣＯＸ４−２を介したエネルギーの生成がこれらの両方の段階の期間中重要であってもよい。
【００５２】
ミトコンドリア生合成の調節がグルココルチコイドホルモンによって媒介されてもよいことは示唆されている（Ｗｅｂｅｒら ２００２）。ＣＯＸ４Ｉ２遺伝子はグルココルチコイド受容体エレメント（ＴＧＴＴ）を含み、それがＣＯＸ４−２発現を増大させ、従ってミトコンドリア容積を増すために標的とされてもよい。さらに、ＣＯＸ４Ｉ２遺伝子はｐ５３腫瘍サプレッサー結合部位（ＣＡＴＧ）を含む。最近の研究はｐ５３がミトコンドリア生合成およびＣＯＸを介した好気的代謝の調節において役割を果たしてもよいことを示唆している（Ｍａｔｏｂａら ２００６；Ｓａｌｅｅｍら ２００９）。
【００５３】
ＣＫＭ
クレアチンキナーゼ（ＣＫ）はクレアチンホスホキナーゼ（ＣＰＫ）またはホスホクレアチンキナーゼとしても知られ、種々の組織型によって発現される酵素（ＥＣ２.７.３.２
）である。該酵素はクレアチンの変換を触媒し、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）を消費してホスホクレアチンとアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）を作り出す。ＡＴＰを速やかに消費する組織、とりわけ骨格筋、さらに脳および平滑筋では、ホスホクレアチンは迅速なＡＴＰ再生のための貯蔵所として役立つ。従ってクレアチンキナーゼはそのような組織における重要な酵素である。
【００５４】
多くの細胞では、ＣＫ酵素は２つのサブユニットからなり、それはＢ（脳型）またはＭ（筋肉型）のいずれであってもよい。従って、３種の異なるアイソザイム：ＣＫ−ＭＭ、ＣＫ−ＢＢおよびＣＫ−ＭＢが存在する。これらのサブユニットの遺伝子は異なるクロモソーム上に位置する。その上、ミトコンドリアクレアチンキナーゼにはユビキタス型とサルコメア型の２つの形態が存在する。異なる型のＣＫアイソザイムを表１に列挙する。
【００５５】
表１−クレアチンキナーゼのアイソザイム
【００５６】
【表１】
【００５７】
アイソザイムパターンは組織型に依存して異なる。たとえば、ＣＫ−ＢＢは主に脳に存在し、そのレベルは骨格筋ではめったに意味を持たない。骨格筋はＣＫ−ＭＭ（９８％）および低レベルのＣＫ−ＭＢ（１％）を発現するが、対照的に心筋層（心臓の筋肉）はＣＫ−ＭＭを約７０％そしてＣＫ−ＭＢを２５〜３０％発現する。
【００５８】
クレアチンリン酸をクレアチンに変換することによってＡＤＰからＡＴＰを生産するミトコンドリアクレアチンキナーゼ（ＣＫｍ）はミトコンドリア内膜腔に存在する。ミトコンドリア形態とは別にサイトソルには３種の形態が存在する−ＣＫａ（緊急に必要な場合、クレアチンリン酸を犠牲にしてサイトソルでＡＴＰを生産する）、ＣＫｃ（リン酸化および脱リン酸化をそれぞれＡＴＰおよびＡＤＰとカップリングすることによりサイトソルにおけるクレアチンおよびクレアチンリン酸の必要な濃度を維持する）およびＣＫｇ（クレアチンの直接リン酸化を解糖経路に連結する）。
【００５９】
クレアチンキナーゼ、筋肉遺伝子（ＣＫＭ）はもっぱら横紋筋に見出されるクレアチンキナーゼの筋肉型アイソザイムをコードする。コードされた蛋白質は細胞のエネルギー論に関与する。運動中に、ＣＫＭ遺伝子ノックアウトマウスはバースト活動の欠如を示すが、正常な絶対筋力を維持する（ｖａｎ Ｄｅｕｒｓｅｎら １９９３）。本発明者らはＣＫＭ遺伝子転写物がサラブレッド馬骨格筋トランスクリプトームにおいて最も豊富な転写物であることを見出していて、ウマの運動適応においてＣＫＭ遺伝子が極めて重要な役割を果たすことを支持する。
【００６０】
ＰＤＫ４
グルコース利用の調節はグルコーストランスポーターによるグルコースの取り込み、解糖フラックスの速度およびピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体（ＰＤＣ）の触媒機能を介したミトコンドリアにおけるピルビン酸塩からアセチルＣｏＡへの変換によって厳密に制御されている。グルコースの酸化における重要な律速段階はピルビン酸デヒドロゲナーゼキナーゼ（ＰＤＫ）によって制御されるＰＤＣ会合の調節である。ＰＤＫはＰＤＣの形成を遮断し、脂肪酸をベータ−酸化して、酸化的リン酸化の基質としてのアセチル−ＣｏＡを生じる。ＰＤＫイソ型をコードする４種の遺伝子の中の３種の遺伝子（ＰＤＫ２、ＰＤＫ３およびＰＤＫ４）は、サラブレッドにおいて正の選択をされた遺伝子領域に位置する（Ｇｕら ２００９）。ＰＤＫ４遺伝子プロモーターは、肝臓および脂肪組織におけるインスリンシグナリングの重要なレギュレーターであるＦＯＸＯ１Ａ転写因子の結合部位を含む。ＦＯＸＯ１Ａにおける一塩基多型は、Ｔ２ＤＭ（２型糖尿病）発症およびヒトの関連した表現型に対して保護効果を有することが見出されている。ＦＯＸＯ１Ａはまた、サラブレッドにおいて正選択された遺伝子領域の中に見出され、そのＰＤＫ４プロモーター結合部位配列はウマにおいて保存される。転写因子ＦＯＸＯ１およびＳＭＡＤはまた、ミオスタチン（ＭＳＴＮ）遺伝子調節に関与し、それ故筋肉成長の制御において重要な役割を果たしていることが示されている。
【００６１】
正選択に関するゲノムスキャンでは、Ｇｕら（２００９）は２つの独立した統計的検定（ＦＳＴおよびＥｗｅｎｓ−Ｗａｔｔｅｒｓｏｎ検定）において中立期待から極めて有意に逸脱した領域を検出した。この領域はＰＤＫ４遺伝子を含んでいた。ＰＤＫ４遺伝子発現はＥＲＰα（エストロゲン−関連受容体α）結合を介して転写共役因子ＰＧＣ−１αによって調整される。ＰＰＡＲＧＣ１Ａ（ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体ガンマ、共役因子１アルファ）遺伝子によってコードされるＰＧＣ−１αは、ＳＬＣ２Ａ４（溶質運搬体ファミリー２（促進拡散型グルコース輸送体）、メンバー４；；以前はＧＬＵＴ４）を介してグルコース輸送をコントロールすることによってインスリン感受性を調節するエネルギー代謝の重要なレギュレーターであり、そして酸化的筋肉線維形成を行わせ、核内コード化ミトコンドリア蛋白質遺伝子とその相互作用を介してミトコンドリア生合成を調整する。
【００６２】
ＭＳＴＮ
ミオスタチンは、成長／分化因子８前駆体（ＧＤＦ−８）としても公知である。いくつかの哺乳動物種（ウシ、ヒツジおよびイヌを含む）では、筋肉肥大形質はミオスタチン（ＭＳＴＮ）遺伝子における突然変異によって引き起こされる。イヌでは、競走ウィペット（ｗｈｉｐｐｅｔ）におけるＭＳＴＮ遺伝子突然変異は“闘争的（ｂｕｌｌｙ）”表現型に関連付けられていて、ヘテロ接合の個体は、野生遺伝子型を持つ個体より有意に速い（Ｍｏｓｈｅｒら ２００７）。ＭＳＴＮ遺伝子における突然変異が競技パワーと関連してもよい。
【００６３】
本発明者らは競技パフォーマンスに関連した遺伝子における多数の一塩基多型（ＳＮＰ）を分析していて、ＳＮＰに基づいて対象の潜在的競技パフォーマンスを予測する簡単なＤＮＡを基礎にした方法を開発している。
【００６４】
本発明は以下の実施例からいっそう明確に理解されるであろう。
【実施例】
【００６５】
対象
サラブレッドとは、三大基礎種馬（ｓｔａｌｌｉｏｎ）の１種およびＴｈｅ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｓｔｕｄｂｏｏｋ，１７９１（Ｗｅａｔｈｅｒｂｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ １７９１）に記載されたおよそ３０の基礎雌馬にその血統をたどることができる登録された競走馬である。サラブレッドレースには２つの型があり：ナショナルハントレース（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｈｕｎｔ ｒａｃｅ）はハードルを跳び越えるか、またはフェンスを飛び越して４．５マイル（７，２００ｍ）までの距離を走るが、フラットレース（Ｆｌａｔ ｒａｃｅ）は障害物がなく、５ファーロング（５／８マイルまたは１，００６ｍ）から２０ファーロング（４，０２４ｍ）までの範囲の距離を走る。最も重要な標準となり、そして最も価値のあるえり抜きのフラットレースは、グループ（Ｇｒｏｕｐ）レース（ヨーロッパおよびオーストラレーシア）またはステークス（Ｓｔａｋｅｓ）レース（北米）として知られる。これらのレースの中で最も一流なものには、ブリーダーズカップレース（Ｔｈｅ Ｂｒｅｅｄｅｒｓ' Ｃｕｐ ｒａｃｅｓ（米国））、ケンタッキーダービー（Ｔｈｅ Ｋｅｎｔｕｃｋｙ Ｄｅｒｂｙ）（米国）、エプソムダービー（Ｔｈｅ Ｅｐｓｏｍ Ｄｅｒｂｙ）（英国）などが挙げられる。
【００６６】
ヨーロッパ（イギリス（Ｂｒｉｔａｉｎ）、アイルランド（北アイルランドを含む）、フランス、ドイツ、イタリア）では、８４のグループ１、９３のグループ２、および１７３のグループ３レースを含む年間３５０のグループレースが行われる。イギリス（Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）およびアイルランドでは、年間１９６のグループレース（４３のグループ１、５０のグループ２および１０３のグループ３）が競われる。イギリス（Ｂｒｉｔａｉｎ）はヨーロッパの中で１年に行われるグループレースの数（１３９）が最も多く、５７％が≦１マイル（１６０９メートル）、そして４３％が＞１マイルの距離を走る。オーストラリアは全部でほぼ２１，０００のレースから、季節毎におよそ５４０〜５５０のグループレースを行い、ニュージーランドは季節毎に７８のグループレースを主催する。グループレースの後は、準重賞レースが次の最も高いグレードのレースである。
【００６７】
≦１マイルの距離を競う馬は“スプリンター”として知られ、＞１マイルの距離を競うウマは“ステイヤー”として知られる。１マイルレースを競うウマ（‘マイラー’および‘中距離馬’）はスプリンターまたはステイヤーのいずれと見なされてもよく、騎手によってレースが行われる様式は、しばしばトレーナーが認めたウマの能力（‘スプリンター’または‘ステイヤー’）を反映する。国際競馬統括機関連盟（Ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｏｒｓｅｒａｃｉｎｇ Ａｕｔｈｏｒｉｔｉｅｓ）は５つのレース距離カテゴリー：短距離（５〜６．５ｆ、≦１，３００ｍ）、マイル（６．５１〜９．４９ｆ、１，３０１〜１，９００ｍ）、中距離（９．５〜１０．５ｆ、１，９０１〜２，１１２ｍ）、長距離（１０．５１〜１３．５ｆ、２，１１４〜２，７１６ｍ）および超長距離（＞１３．５１ｆ、＞２，７１７ｍ）；Ｓ−Ｍ−Ｉ−Ｌ−Ｅを認めている［注：１ファーロング＝１／８マイル＝２０１．２メートル］。
【００６８】
障害物レースの混乱した効果を最小限にするために、フラットレースでパフォーマンスレコードを持つウマだけが研究のコホートに含まれると見なされた。すべてのケースにおいて、２世代内の血族関係を共有する標本を排除することにより遺伝的背景を制御するために血統情報を使用した。さらに、血統内の評判のよい種親（ｓｉｒｅ）の過剰提示は可能な場合回避された。
【００６９】
１９９７〜２００６年の間に、アイルランド、イギリス（Ｂｒｉｔａｉｎ）およびニュージーランドにおいて、サラブレッド馬に由来する標本は、競走、育種および販売体制からオーナーのインフォームドコンセントを得て集められた。すべてのウマは“エリートサラブレッド”（ＴＢＥ）または“その他のサラブレッド”（ＴＢＯ）としての後ろ向き競馬場パフォーマンスレコードに基づいて分類された。エリートサラブレッドは少なくとも１つのグループ（グループ１、グループ２またはグループ３）レースに勝利しているフラットレース馬であった。その他のサラブレッドは競馬場で競走したが、フラットレースに勝利しなかったか、または８９未満のハンディキャップレーティング（レーシングポストレーティング（ＲＰＲ））を有するウマであった。
【００７０】
実施例１−ＣＯＸ４Ｉ２
短距離運動中は限定された酸素環境にもかかわらず、筋肉収縮に必要なＡＴＰの形態におけるエネルギーは好気的代謝経路（７０％好気的、３０％嫌気的）によって主に生成される。本発明者らはこの相対的低酸素環境が、都合よく保存された代謝スィッチをＣＯＸ４−１からＣＯＸ４−２に切り換え、それによって細胞呼吸の効率を増大させることを示唆する。ＣＯＸ４−２は従って全力疾走中のエネルギー供給の重要なレギュレーターであるが、酸素需要が満たされる長距離競技では必ずしも必要ではない。このスィッチは、低酸素−依存的遺伝子発現の主要なレギュレーターとして十分に性状が解析されている細胞内転写因子ＨＩＦ−１αによって媒介される（Ｓｅｍｅｎｚａ １９９８）。ＨＩＦ−１αはＰＤＫ１、ＬＤＨＡ、ＣＯＸ４−２およびＬＯＮをコードする遺伝子の転写を活性化し、ＣＯＸ４−１からＣＯＸ４−２へのスィッチを制御する。極めて激しい運動中に酸素が欠乏するサラブレッドの筋肉では、減少した酸素に対して亢進される反応および最も効率的なやり方でＡＴＰを生成する能力がその個体にとって有意義な利点を提供するであろう。
【００７１】
さらに、増大したミトコンドリア容積はより高い好気的生産能力に関連することが示されている（Ｆｌｕｃｋ ２００６）。増大した量のグルココルチコイドホルモンが、ミトコンドリアゲノムを特に目標とするか、または未知の機序によるかのいずれかでミトコンドリア生合成を刺激することが示されている（Ｗｅｂｅｒら ２００２）。グルココルチコイド受容体エレメント（グルココルチコイド反応性および関連性エレメント）は認識配列（ＴＧＴＴ）を含む。ＣＯＸ４Ｉ２遺伝子はイントロン２にこれらのエレメントの１つを含む。従って、グルココルチコイド結合が遺伝子発現増大を刺激し、ミトコンドリア容積増大およびその結果の好気的エネルギー生産能力を導いてもよい。
【００７２】
ある側面では、本発明は優れた全力疾走パフォーマンスに有意（Ｐ＜０．０１）に関連するＣＯＸ４Ｉ２における一塩基多型（ＳＮＰ）に関する。優れた短距離レース勝ち馬におけるＣＯＸ４Ｉ２ホモ接合ＴＴ遺伝子型（ＥｑｕＣａｂ２．０ ２２６７６３６１−Ｃ／Ｔ）の有意な関連が、サラブレッド馬における優れた競技パフォーマンスの、ＤＮＡを基礎にした遺伝的潜在性検定において利用されてもよい。
【００７３】
ＣＯＸ４Ｉ２遺伝子（ＥｑｕＣａｂ２．０ ２２６７６３６１−Ｃ／Ｔ）多型の正確な位置
ＣＯＸ４Ｉ２多型の正確な位置は、ｗｗｗ．ｂｒｏａｄ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｍａｍｍａｌｓ／ｈｏｒｓｅ／／で調べることができるウマゲノム配列（Ｅｑｕｕｓ ｃａｂａｌｌｕｓ．２．０版）のウマ（Ｅｑｕｕｓ ｃａｂａｌｌｕｓ）クロモソーム２２上の２２６７６３６１位である。ＣＯＸ４Ｉ２多型はＥｑｕＣａｂ２．０ ＣＯＸ４Ｉ２＿２２６７６３６１（Ｃ／Ｔ）ＳＮＰとして同定され得る。
【００７４】
ウマゲノムＥｑｕＣａｂ２アセンブリーは６．７９ｘにおける全ゲノムショットガン（Ｗｈｏｌｅ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｈｏｔｇｕｎ）（ＷＧＳ）アセンブリーであり、２００７年９月に公開された。''Ｔｗｉｌｉｇｈｔ''という名の雌サラブレッドがゲノム配列決定のための代表馬として選択された。プロジェクトの調整ならびにゲノム配列決定およびアセンブリーはＢｒｏａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅによって提供される。Ｎ５０サイズは、アセンブルしたゲノムの５０％がＮ５０サイズまたはそれより長いブロックで存在するような長さである。コンティグのＮ５０サイズは１１２．３８ｋｂであり、すべてのコンティグの全長は２．４３Ｇｂである。スカホールド（ｓｃａｆｆｏｌｄ）におけるコンティグ間のギャップが含まれる場合、アセンブリーの全長は２．６８Ｇｂである。ウマＥｑｕＣａｂ２は標準Ｅｎｓｅｍｂｌ哺乳動物パイプラインを使用してアノテーションされた。脊椎哺乳動物およびウマ蛋白質からの予測は、非脊椎哺乳動物に由来する予測に対して優先されている。予測のセットはヒトおよびマウスにおける１：１相同遺伝子に比較され、ウマアノテーションにおいて欠損したホモログはｅｘｏｎｅｒａｔｅを使用して発見されている。ウマおよびヒトｃＤＮＡは蛋白質に基づいた予測にＵＴＲを添加するために使用されている。最終遺伝子−セットは２０，７３７の蛋白質−コーディング遺伝子を含み、２，８６３は偽遺伝子として確認され、１，５８０はレトロトランスポゾン遺伝子として分類された。
【００７５】
ＥｑｕＣａｂ２．０ ＣＯＸ４Ｉ２−２２６７６３６１−Ｃ／Ｔ多型の遺伝子型判定
ＳＮＰの遺伝子型判定はエリート（ｎ＝７９）および非エリート（ｎ＝７０）パフォーマーを共に含むサラブレッド（ｎ＝１４９）の標本において実行された。エリートパフォーマー群は、優先的に短距離（≦１マイル；ｎ＝３４）レースおよび長距離（＞１マイル；ｎ＝３６）レースにおいて競走した動物のサブセット（ｎ＝７０）を含んだ。
【００７６】
ゲノムＤＮＡは新鮮な全血または体毛標本のいずれかから抽出された。血液標本は７ｍｌのバキュテナー（Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ）Ｋ３ＥＤＴＡ血液回収チューブ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）に集められた。明白な毛根を持つ体毛標本は、ラベル付きの気密ジップロック（ｚｉｐ−ｌｏｃｋ）袋に集められた。標本は、改変した標準フェノール／クロロホルム法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ ２００１）を使用してＤＮＡを抽出するまで４℃で保管された。すべての標本のＤＮＡ濃度はＮａｎｏＤｒｏｐ ＮＤ−１０００ ＵＶ−可視分光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）を使用して推測された。
【００７７】
フランキング配列およびＳＮＰ（角括弧で囲んだ太字）は以下の通りである；
（小文字で示された塩基は、配列読み取りがフランキング配列のこの領域に対して最適ではなかったことを示す）
ｃａａｇａｇｔｇｇａｇｔｇｔｇｃｔｃｃａａｇａａｃｔｇｇａｇｇｃｔａｇｃａｔｇｔａｇｃａｇａｇｇａｇｇｃａｇｔａｇｃａｇａｇｇａｇｇａｇａｇｇｔｔｇａｔｇｇｇｇｇａｇｃｔｇｃａｔｔｔｇｇａｇａｇｔｃｔｇｇｃａｇｇｃａｇｇａｃｃｔｔｇａａｔｇｃｃａｇｇｃｔａａｇｇａｇｔｔｔＡＴＴＧＧＧＡＧＧＣＡＡＧＴＧＧＧＴＧＣＴＧＡＴＡＡＡＧＧＣＴＣＡＡＧＧＡＴＴＣＣＡＴＣＡＧＧＣＴＧＴＴＣＣＣＡＣＡＡＡＧＡＣＣ［Ｃ／Ｔ］ＧＧＧＣＣＡＣＣＴＣＡＧＧＧＣＡＣＣＡＴＡＴＣＣＣＣＡＴＡＴＣＣＡＧＧＡＧＣＣＡＧＴＴＧＴＧＴＣＣＣＡＧＡＧＡＡＡＡＣＡＡＧＧＧＡＣＴＧＧＡＣＣＴＴＧＡＧＡＣＴＴＧＧＣＣＡＧＴＧＴＣＣＴＴＣＡＣＡＴＣＣＴＡＣＣＣＴＧＴＧＣＡＣＧＣＣＣＣＴＧＴＴＴＧＧＣＣＴＧＴＧＧＴＧＣＡＧＡＡＧＧＣＣＣＣＴＧＧＧＡＧＡＣＣＴＧＡＡＧＣＡＧＡＡＧＣＴＧＣＡＧＡＣＣＡＴＴＣＣＡＧＧＴＴＡＧＴＧＴＧＧＡＧＣＣＣＣＡＧＡ
（ＳＥＱ．ＩＤ Ｎｏ．１）
ＣＯＸ４Ｉ２遺伝子の遺伝子型判定は、競合的アレル特異的ＰＣＲ（ＫＡＳＰａｒ）またはＴａｑｍａｎ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）のいずれかを使用してＫＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ｗｗｗ．ｋｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ．ｃｏ．ｕｋ）によって実施された。ＫＡＳＰａｒは企業内所有の均質な蛍光遺伝子型判定系である。
【００７８】
全ＤＮＡの中の２５μＬは“ｖ−底の”９６ウェルマイクロタイタープレート中、１５ｎｇ／μＬの濃度でＫＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓに供給された。再現性をチェックするため、および標本取り扱いにおける誤差を制御するために、設定およびアッセイ検証（ｎ＝２４）ならびにブランク（９６ウェルプレート毎にｎ＝１）用のいくつかの標本も含まれた。
【００７９】
遺伝解析研究
遺伝子型判定後、先に記載の対象（ｎ＝１４９）に対して遺伝解析が実行された。
【００８０】
それぞれのＳＮＰに対して個々の二分化ロジスティック回帰モデルを適合させた。遺伝子型傾向効果は、一般的ホモ接合、ヘテロ接合、およびまれなホモ接合遺伝子型に関した効果の大きさにおける線形傾向に関連したリスクを推測することによってモデル化された。Ｐ−値は、優度比検定統計値から決定され、自由度１を持つ漸近χ２分布に従って近似された。有意に関連のあるＳＮＰのための最適な遺伝モデルは、相加、劣性および超優性モデルのコーディング変数を持つ解析を反復することによって決定された。
【００８１】
表２は対象間のＥｑｕＣａｂ２．０ ＣＯＸ４Ｉ２＿２２６７６３６１（Ｃ／Ｔ）ＳＮＰ遺伝子型頻度を示す。
【００８２】
【表２】
【００８３】
表中：Ｓｐ＝スプリンター
Ｅｎ＝エンデュアランス（または‘ステイヤー’）
ＯＲ＝オッズ比
ＬＯＷＥＲ＝下限信頼区間
ＵＰＰＥＲ＝上限信頼区間
表２では、ＥｑｕＣａｂ２．０ ＣＯＸ４Ｉ２＿２２６７６３６１（Ｃ／Ｔ）ＳＮＰホモ接合ＴＴ遺伝子型は＜８ファーロング（１マイル未満）の距離での優れた競走（全力疾走）パフォーマンスに有意に関連し（Ｐ＜０．０２）（図２）、この関連は＜７ｆの距離ではいっそう顕著である（Ｐ＜０．０１）。
【００８４】
ＣＯＸ４Ｉ２＿２２６７６３６１（Ｃ／Ｔ）ＳＮＰのホモ接合Ｔアレルを持つサラブレッド馬は、ヘテロ接合Ｔアレル（ＴＣ）を持つサラブレッド馬、またはＴアレル（ＣＣ）を持たないサラブレッド馬に比較して優れた全力疾走パフォーマンスを有する。従って、サラブレッド馬の全力疾走パフォーマンスはＣＯＸ４Ｉ２＿２２６７６３６１（Ｃ／Ｔ）ＳＮＰのホモ接合Ｔアレルの存在または不在に関して生物学的標本を試験することによって予測することができる。
【００８５】
実施例２−サラブレッド競走パフォーマンスに関連する遺伝子
本発明者らは以下の遺伝子：ＡＣＮ９、ＡＣＳＳ１、ＡＣＴＡ１、ＡＣＴＮ２、ＡＤＨＦＥ１、ＧＧＰＳ１、ＧＳＮ、ＭＣ３Ｒ、ＭＴＦＲ１、ＮＤＵＦＡ８、ＰＤＫ４、ＰＯＮ１、ＰＴＧＳ１、ＰＴＰＮ１、ＴＮＣ、ＴＯＭＭ２０、ＵＧＣＧ ＣＫＭ、ＣＯＸ４Ｉ２、ＣＯＸ４Ｉ１、ＨＩＦ１Ａ、ＭＹＥＦ２、およびＰＲＫＡＡ１における８０のＳＮＰ間の関連を検討した（ＳＮＰの詳細はサラブレッド競走パフォーマンスに関する付録に示す）。
【００８６】
本発明はＡＣＮ９、ＡＣＳＳ１、ＡＣＴＮ２、ＡＤＨＦＥ１、ＣＫＭ、ＣＯＸ４Ｉ２、ＧＳＮ、ＭＳＴＮ、ＰＯＮ１、ＰＴＧＳ１およびＰＴＰＮ１を含むこれらの遺伝子セットにおけるＳＮＰと競技パフォーマンス表現型間の有意な関連を確認する（付録を参照されたい）。ウマ骨格筋における運動に対する公知の遺伝子発現反応（Ｅｉｖｅｒｓら ２００９）およびイヌにおけるパフォーマンスとの関連の証拠（Ｍｏｓｈｅｒら ２００８）および訓練に対する反応から、サラブレッド競走パフォーマンスと有意な関連を有する４種の遺伝子（ＣＫＭ、ＣＯＸ４Ｉ２、ＰＤＫ４およびＭＳＴＮ）が詳細に検討された。これらの遺伝子の中の３種（ＣＫＭ、ＣＯＸ４Ｉ２およびＰＤＫ４）におけるＳＮＰは優れた競技パフォーマンス（グループレース勝利）に関連し、ＭＳＴＮ遺伝子におけるＳＮＰは優れた短距離レースパフォーマンスに関連する。
【００８７】
この実施例では、以下の標本セットが使用された：
表３−それぞれの亜集団にふくまれる標本の詳細。
【００８８】
【表３】
【００８９】
表中、ＴＢはサラブレッドであり、ＴＢＥはエリートグループレース勝利サラブレッドであり；そしてＴＢＯは非エリート（すなわち、その他の非勝利）サラブレッドである。ＴＢＥコホートはさらにＴＢＥ＿スプリンター（ｎ＝３９）およびＴＢＥ＿エンデュアランスまたは‘ステイヤー’（ｎ＝３２）に細分化された。
【００９０】
遺伝解析研究
ＳＮＰと競技パフォーマンスとの関連に関する検定は、ＰＬＩＮＫプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｐｎｇｕ．ｍｇｈ．ｈａｒｖａｒｄ．ｅｄｕ／ｐｕｒｃｅｌｌ／ｐｌｉｎｋ／ Ｐｕｒｃｅｌｌら，２００７)を使用して実施された。
【００９１】
標準ケース／コントロール関連解析
標準ケース／コントロール関連解析を実施するために、オプション：ｐｌｉｎｋ−−ｆｉｌｅ ｍｙｄａｔａ -ａｓｓｏｃが使用され、それが以下のフィールドを含むファイルｐｌｉｎｋ．ａｓｓｏｃを生成する：
ＣＨＲ クロモソーム
ＳＮＰ ＳＮＰ ＩＤ
ＢＰ 染色体上の位置（塩基対）
Ａ１ マイナーアレル名（全標本に基づく）
Ｆ＿Ａ ケースにおけるこのアレルの頻度
Ｆ＿Ｕ コントロールにおけるこのアレルの頻度
Ａ２ メジャーアレル名
ＣＨＩＳＱ 基本アレル検定χ−２乗（１ｄｆ）
Ｐ この検定に関する漸近ｐ−値
ＯＲ 推定オッズ比（Ａ１に関する）
関連解析
モデルオプション（ｍｏｄｅｌ ｏｐｔｉｏｎ）を使用することによって、基本アレル検定（ケース対コントロールにおけるアレルの頻度を比較する）以外の疾患と変異体間の関連の検定を実施することが可能である。本明細書で提案された検定は（基本アレル検定の他に）以下の通りである：
・コクラン−アーミテージ傾向検定（Ｃｏｃｈｒａｎ−Ａｒｍｉｔａｇｅ ｔｒｅｎｄ ｔｅｓｔ）
・遺伝子型（２ｄｆ）検定
・優性遺伝子アクション（１ｄｆ）検定
・劣性遺伝子アクション（１ｄｆ）検定
コクラン−アーミテージ検定の利点の一つは、アレルではなく個体が解析の単位であるため、ハーディ・ワインベルグ（Ｈａｒｄｙ−Ｗｅｉｎｂｅｒｇ）平衡を仮定しないことである（しかし、基本アレル検定に由来する順列に基づいた経験的ｐ−値もこの特性を有する）。ハーディ・ワインベルグ平衡からの大きな逸脱を示すＳＮＰはしばしば劣ったＳＮＰである可能性があるか、または標本における層化を反映するが、それゆえ多くのケースにおいておそらく最適に排除される。
【００９２】
遺伝子型検定は疾患ｘ遺伝子型の２ｘ３表における一般的な関連検定を提供する。優性および劣性モデルはマイナーアレルに対する検定である（どれがマイナーアレルであるかは−−ａｓｓｏｃまたは−−ｆｒｅｑコマンドのいずれかの出力の中に見出すことができる。すなわち、Ｄがマイナーアレルであり（そしてｄがメジャーアレルである）場合、以下の通りである：
アレル（Ａｌｌｅｌｉｃ）： Ｄ対ｄ
優性（Ｄｏｎｍｉｎａｎｔ）： （ＤＤ，Ｄｄ）対ｄｄ
劣性（Ｒｅｃｅｓｓｉｖｅ）： ＤＤ対（Ｄｄ、ｄｄ）
遺伝子型（Ｇｅｎｏｔｙｐｉｃ）： ＤＤ対Ｄｄ対ｄｄ
先に述べたように、これらの検定は、以下のフィールドを含むファイルｐｌｉｎｋ．モデルを生成するオプションｐｌｉｎｋ--ｆｉｌｅ ｍｙｄａｔａ--ｍｏｄｅｌによって生成される：
ＣＨＲ クロモソーム番号
ＳＮＰ ＳＮＰ識別子
ＴＥＳＴ 検定の型
ＡＦＦ ケースにおける遺伝子型／アレル
ＵＮＡＦＦ コントロールにおける遺伝子型／アレル
ＣＨＩＳＱ カイ−二乗統計量
ＤＦ 検定に関する自由度
Ｐ 漸近Ｐ−値
それぞれのＳＮＰは適用される５種の検定に対応する出力の５つの列上で見られる。行のＴＥＳＴは、先に述べた異なる型の検定を表すＡＬＬＥＬＩＣ、ＴＲＥＮＤ、ＧＥＮＯ、ＤＯＭまたはＲＥＣのいずれかを表す。遺伝子型またはアレルカウントはケースおよびコントロールに対して別個に示される。劣性および優性検定の場合、カウントは遺伝子型を表し、２つのクラスはプールされる。
【００９３】
これらの検定は二倍体遺伝子型だけを考慮する：すなわち、Ｘクロモソームの場合、雄はＡＬＬＥＬＩＣ検定からさえ除外されることになる。このように、本明細書に提示された５種の検定に対して同じデータが使用される。対照的に、基本関連コマンド（−−ａｓｓｏｃ および−−ｌｉｎｅａｒなど）は単一の雄Ｘクロモソームを含み、それゆえ結果が異なってもよいことに注意されたい。
【００９４】
遺伝子型および優性／劣性検定は２ｘ３の表において細胞毎の最少観察数である場合だけ実施され：デフォルトによって、少なくとも細胞の１つが５未満の頻度を有する場合、代わりの検定は省かれることになる（ＮＡは結果ファイルの中に記載される）。コクラン−アーミテージおよびアレル検定はすべてのケースにおいて実施される。この閾値は−−ｃｅｌｌ ｏｐｔｉｏｎ：ｐｌｉｎｋ−−ｆｉｌｅ ｍｙｄａｔａ−−ｍｏｄｅｌ−−ｃｅｌｌ ２０によって変更されうる。
【００９５】
関連検定の結果は付録にすべて提供される。４つの遺伝子ＰＤＫ４、ＣＯＸ４Ｉ２、ＣＫＭおよびＭＳＴＮにおけるＳＮＰの数が検討された。それぞれの遺伝子に対して、本発明者らはその後の検討のための形質に関して最も有意な関連（Ｐ値）（表４）を持つＳＮＰを選択した。競技パフォーマンスに最も高い関連がある４つのＳＮＰはＰＤＫ４＿３８９７３２３１-Ａ／Ｇ、ＣＯＸ４Ｉ２＿２２６８４３９０-Ｃ／Ｔ、ＣＫＭ＿１５８８４５６７-Ｇ／Ａ、およびＭＳＴＮ＿６６４９３７３７-Ｔ／Ｃであった。ＰＤＫ４、ＣＫＭおよびＣＯＸ４Ｉ２におけるＳＮＰはサラブレッド競走馬の優れた全力疾走パフォーマンスと関連した。最良適合遺伝子型モデルは以下の表５の結果に基づいて割り当てられた。
【００９６】
表４−サラブレッド競走馬の優れた（グループ勝利）パフォーマンス（ＰＤＫ４、ＣＫＭおよびＣＯＸ４Ｉ２）および優れた全力疾走パフォーマンス（ＭＳＴＮ）に関するＳＮＰ関連検定の結果。それぞれの遺伝子において最も有意な関連を持つＳＮＰがここに示される。
【００９７】
【表４】
【００９８】
表中Ａ１：アレル１；Ａ２：アレル２；Ｆ＿Ａ（Ａ１）：エリートＴＢ（ＰＤＫ４、ＣＫＭおよびＣＯＸ４Ｉ２）およびエリートスプリンター（ＭＳＴＮ）におけるアレル１の頻度；Ｆ＿Ａ（Ａ２）：エリートＴＢ（ＰＤＫ４、ＣＫＭおよびＣＯＸ４Ｉ２）およびエリートスプリンター（ＭＳＴＮ）におけるアレル２の頻度；Ｆ＿Ｕ（Ａ１）：非エリートＴＢ（ＰＤＫ４、ＣＫＭおよびＣＯＸ４Ｉ２）およびエリートエンデュアランス（ＭＳＴＮ）におけるアレル１の頻度；Ｆ＿Ｕ（Ａ２）：非エリートＴＢ（ＰＤＫ４、ＣＫＭおよびＣＯＸ４Ｉ２）およびエリートエンデュアランス（ＭＳＴＮ）におけるアレル２の頻度。
【００９９】
付加的な検討のために選択されたＳＮＰは以下のとおりであった：
ＰＤＫ４＿３８９７３２３１（Ａ／Ｇ）
ＣＯＸ４Ｉ２＿２２６８４３９０（Ｃ／Ｔ）
ＣＫＭ＿１５８８４５６７（Ｇ／Ａ）
ＭＳＴＮ＿６６４９３７３７（Ｔ／Ｃ）
表５−最良適合モデルのための関連検定の結果
【０１００】
【表５Ａ】
【０１０１】
【表５Ｂ】
【０１０２】
最良適合遺伝子型モデルは表５の結果に基づいて割り当てられた。ＳＮＰと競技パフォーマンスの関連に関する最良モデルは以下の通りに結論された：
ＰＤＫ４−Ａｌｌｅｌｉｃ→Ａアレル、すなわちＡＡまたはＡＧが好ましい。
ＣＫＭ−Ａｌｌｅｌｉｃ→Ａアレル、すなわちＡＡまたはＡＧが好ましい。
ＣＯＸ４Ｉ２−Ｒｅｃｅｓｓｉｖｅ→Ｔアレル、すなわちＴＴが好ましい。
ＭＳＴＮ−Ｇｅｎｏｔｙｐｉｃ→遺伝子型は距離カテゴリーを予測する（この実施例で使用されるコホートでは、ＣＣである‘ステイヤー’は無いが、５０％のスプリンターはＣＣであった）
ＣＫＭ、ＣＯＸ４Ｉ２およびＰＤＫ４に関するエリートおよび非エリートサラブレッドの中でのアレル頻度分布、ならびにＭＳＴＮに関するエリートスプリンターおよびエリートエンデュアランスの中でのアレル頻度分布は図４に示される。以下の表６はサラブレッド（ＴＢＥおよびＴＢＯ）における４種のＳＮＰのアレル頻度を示す。
【０１０３】
表６−サラブレッドにおける４種のＳＮＰのアレル頻度（ＴＢＥおよびＴＢＯ）
【０１０４】
【表６】
【０１０５】
表中、ＭＡＦはマイナーアレル頻度であり、ＮＣＨＲＯＢＳは解析されたクロモソーム数である。
【０１０６】
ＣＫＭ、ＣＯＸ４Ｉ２およびＰＤＫ４におけるＳＮＰに関するエリートおよび非エリートサラブレッドの遺伝子型頻度分布、ならびにＭＳＴＮにおけるＳＮＰに関するエリートスプリンターおよびエリートエンデュアランスの遺伝子型頻度分布。
【０１０７】
この研究の結果は図５および以下の表７に示される。
【０１０８】
表７−ＰＤＫ４（ＰＤＫ４＿３８９７３２３１）；ＣＯＸ４Ｉ２（ＣＯＸ４Ｉ２＿２２６８４３９０）；ＣＫＭ（ＣＫＭ＿１５８８４５６７）のＳＮＰに関するエリートおよび非エリートサラブレッド亜集団における遺伝子型頻度およびＭＳＴＮ（ＭＳＴＮ＿６６４９３７３７）のＳＮＰに関するエリートスプリンターおよびエリートエンデュアランスサラブレッドにおける遺伝子型頻度
【０１０９】
【表７】
【０１１０】
予想される中立遺伝的浮動からの逸脱を測定するために、標本コホートにおける４種のＳＮＰに関するハーディ‐ワインベルク平衡（ＨＷＥ）からの逸脱が検討された。ＨＷＥからの逸脱は選択の指標であってもよく、アレル頻度を示された集団における遺伝子型の予想される分布を変化させてもよい。この情報は、遺伝子型頻度を正しく割り当て、パフォーマンスの検定を可能にするために必要である。
【０１１１】
表８−ＡＬＬ（ＴＢすべて）；ＡＦＦ（非エリートおよびエリートスプリンター）；ＵＮＡＦＦ（非エリートおよびエリートエンデュアランス）におけるハーディ‐ワインベルク平衡からの逸脱に関する検定
【０１１２】
【表８】
【０１１３】
エリートサラブレッド亜集団のＣＯＸ４Ｉ２＿２２６８４３９０−Ｃ／Ｔにおいて、ＨＷＥからの逸脱が確認された。従って、エリートレース馬のＴＴ遺伝子型の過剰提示を説明するための検定において遺伝子型頻度が調整されてもよい。また、ＨＷＥからの逸脱は、エリートエンデュアランスサラブレッドコホートのＭＳＴＮ＿ ６６４９３７３７−Ｔ／Ｃにおいても確認された。従って、エリートエンデュアランスレース馬のＣＣ遺伝子型の過小提示を説明するための検定において遺伝子型頻度が調整されてもよい。
【０１１４】
実施例３−サラブレッド馬におけるエリート（グループレース勝利）パフォーマンスに関する多遺伝子予測検定
本発明は１以上の運動反応遺伝子におけるＳＮＰの存在または不在に基づいてサラブレッド競走馬の競技パフォーマンスを予測するための簡単なＤＮＡを基礎にした方法（遺伝子型検定）を提供する。運動反応遺伝子は付録に列挙された遺伝子の中の１以上であってもよい。たとえば、遺伝子型検定はＰＤＫ４、ＣＫＭ、ＣＯＸ４Ｉ２、ＣＯＸ４Ｉ１、ＭＳＴＮ、ＡＣＳＳ１、ＡＣＴＮ２またはＰＴＧＳ１遺伝子の中の１以上におけるＳＮＰに基づいていてもよい。サラブレッド馬の競技パフォーマンスを予測するために使用されてもよいいくつかのＳＮＰの詳細は付録に示される。遺伝子型検定がいずれか１以上のこれらのＳＮＰの組み合わせに基づいていてもよいことは理解されるであろう。
【０１１５】
図３では、運動中のエネルギー生産に貢献する３つの主要代謝経路、ならびに優れた競走パフォーマンスに関連した３つの遺伝子（ＣＫＭ、ＣＯＸ４Ｉ２およびＰＤＫ４）の経路における位置および機能が示される。この限定的でない実施例において、既知の機能の知識、運動に反応して骨格筋で遺伝子が発現されるという知識および先の実施例２の結果を使用して、本発明者らはＰＤＫ４、ＣＯＸ４Ｉ２およびＣＫＭ遺伝子におけるサラブレッド馬における優れたパフォーマンスをＳＮＰに基づいて予測するための、簡単な、ＤＮＡを基礎にした遺伝子型検定を開発した。
【０１１６】
ＣＯＸ４Ｉ２ ＳＮＰ（ＣＯＸ４Ｉ２＿２２６８４３９０（Ｃ／Ｔ）ＳＮＰ）
このＳＮＰは、ｗｗｗ．ｂｒｏａｄ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｍａｍｍａｌｓ／ｈｏｒｓｅ／／で調べることができるウマゲノム配列（Ｅｑｕｕｓ ｃａｂａｌｌｕｓ ２．０版）のウマ（Ｅｑｕｕｓ ｃａｂａｌｌｕｓ）のクロモソーム２２上２２，６８４，３９０ｂｐ位フォワード鎖に位置する。
【０１１７】
ウマゲノムＥｑｕＣａｂ２アセンブリーは６．７９ｘにおける全ゲノムショットガン（ＷＧＳ）アセンブリーであり、２００７年９月に公開された。''Ｔｗｉｌｉｇｈｔ''という名の雌サラブレッドがゲノム配列決定のための代表的なウマとして選択された。プロジェクト調整およびゲノム配列決定およびアセンブリーはＢｒｏａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅによって提供される。Ｎ５０サイズは、アセンブルしたゲノムの５０％がＮ５０サイズまたはそれより長いブロックで存在するような長さである。コンティグのＮ５０サイズは１１２．３８ｋｂであり、すべてのコンティグの全長は２．４３Ｇｂである。スカホールドのコンティグ間のギャップが含まれる場合、アセンブリーの全長は２．６８Ｇｂである。ウマＥｑｕＣａｂ２は、標準Ｅｎｓｅｍｂｌ哺乳動物パイプラインを使用してアノテーションされた。脊椎哺乳動物およびウマ蛋白質に由来する予測は無脊椎哺乳動物に由来する予測に対して優先させている。予測のセットはヒトおよびマウスの１：１相同遺伝子に比較されて、ウマアノテーションにおいて欠損した相同遺伝子はｅｘｏｎｅｒａｔｅを使用して発見されている。ウマおよびヒトｃＤＮＡは蛋白質に基づいた予測にＵＴＲを添加するために使用されている。最終遺伝子セットは２０，７３７蛋白質−コーディング遺伝子を含み、２，８６３は偽遺伝子として確認され、１，５８０はレトロ−トランスポゾン遺伝子として分類された。
【０１１８】
ＳＮＰの付加的な詳細は以下の通りである：
○ＳＮＰ：ＣＯＸ４Ｉ２＿２２６８４３９０（Ｃ／Ｔ）Ｐ＝０．０３０９８ ＯＲ＝０．５７７８
○ＥｑｕＣａｂ２．０ ＳＮＰ＿ＩＤ：ＢＩＥＣ２−６１７５６８
○ＳＮＰのゲノム位置：イントロン２
○置換型：転移
○ＳＮＰはグルココルチコイド反応要素（ＧＲＥ）結合部位（Ｃ／ＴＧＴＴ）を崩壊させる。好ましいアレル（Ｔ）は部位（ＴＧＴＴ）を保持し、従ってＧＲＥ結合を可能にし、遺伝子の発現を増大させる。好ましくないアレル（Ｃ）は部位（ＣＧＴＴ）を崩壊させ、それゆえＧＲＥ結合を不可能にし、遺伝子の発現を増大させない。あるいは、ＳＮＰはｐ５３腫瘍サプレッサー結合部位（ＣＡＣ／ＴＧ）を崩壊させる。好ましいアレル（Ｔ）は部位（ＣＡＴＧ）を保持し、それゆえｐ５３結合を可能にし、ミトコンドリア生合成に貢献する。好ましくないアレル（Ｃ）は部位（ＣＡＣＧ）を崩壊させ、それゆえｐ５３結合を不可能にし、ミトコンドリア生合成に貢献しない。
【０１１９】
隣接配列およびＳＮＰ（太字および角括弧）は以下の通りである：
ＧＣＴＧＧＧＣＧＡＴＣＣＴＧＧＧＧＡＣＡＴＡＡＡＡＧＴＧＡＡＴＣＡＣＣＴＧＧＡＴＧＧＴＴＣＴＴＧＣＣＣＴＣＡＧＧＧＴＧＣＴＣＣＣＡＧＴＣＣＡＧＴＧＧＧＧＧＡＡＣＣＡＡＣＡＣＡＡＧＣＣＣＡＧＡＴＡＡＣＴＧＴＡＡＴＡＴＡＧＧＡＴＡＴＧＴＧＧＣＧＡＧＧＧＴＧＡＡＧＴＧＴＧＴＴＣＡＡＧＧＧＧＣＴＧＴＧＡＧＧＡＣＣＣＡＡＡＧＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＴＧＡＡＡＴＣＣＴＧＧＴＧＧＧＣＣＴＴＣＣＡＧＡＧＧＡＧＧＧＣＡ［Ｔ／Ｃ］ＧＴＴＣＴＡＧＴＴＧＡＣＣＴＴＧＡＡＴＧＧＴＧＡＧＧＣＴＧＡＧＧＧＴＧＣＴＧＣＣＡＧＧＴＧＧＴＧＧＧＡＡＣＡＧＣＡＴＧＧＧＴＡＡＧＧＧＴＡＴＧＧＧＡＧＣＧＧＡＡＧＡＧＣＡＴＧＧＡＧＧＧＴＣＣＴＡＧＧＣＡＴＣＡＧＴＡＡＧＴＧＣＴＧＴＡＧＧＧＧＡＡＧＧＡＡＣＡＧＡＧＡＧＡＧＧＣＧＧＴＧＡＧＧＴＧＧＣＣＡＧＧＡＡＡＧＡＡＧＧＧＧＧＣＣＴＧＡＣＣＣＴＧＧＧＧＡＧＣＡＧＧＡＧＧＧＡＴＧＴＧＴＧＡＣＴＣＣＡＡ
（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２）
ＣＫＭ ＳＮＰ（ＣＫＭ＿１５８８４５６７（Ｇ／Ａ）ＳＮＰ）
このＳＮＰは、ｗｗｗ．ｂｒｏａｄ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｍａｍｍａｌｓ／ｈｏｒｓｅ／/で調べることができるウマゲノム配列（Ｅｑｕｕｓ ｃａｂａｌｌｕｓ ２．０版）のウマ（Ｅｑｕｕｓ ｃａｂａｌｌｕｓ）のクロモソーム１０上１５，８８４，５６７ｂｐ位に位置する。
【０１２０】
ウマゲノムＥｑｕＣａｂ２アセンブリーは６．７９ｘにおける全ゲノムショットガン（ＷＧＳ）アセンブリーであり、２００７年９月に公開された。''Ｔｗｉｌｉｇｈｔ''という名の雌サラブレッドがゲノム配列決定のための代表的なウマとして選択された。プロジェクト調整およびゲノム配列決定およびアセンブリーはＢｒｏａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅによって提供される。Ｎ５０サイズは、アセンブルしたゲノムの５０％がＮ５０サイズまたはそれより長いブロックで存在するような長さである。コンティグのＮ５０サイズは１１２．３８ｋｂであり、すべてのコンティグの全長は２．４３Ｇｂである。スカホールドのコンティグ間のギャップが含まれる場合、アセンブリーの全長は２．６８Ｇｂである。ウマＥｑｕＣａｂ２は、標準Ｅｎｓｅｍｂｌ哺乳動物パイプラインを使用してアノテーションされた。脊椎哺乳動物およびウマ蛋白質に由来する予測は非脊椎哺乳動物に由来する予測に対して優先されている。予測のセットはヒトおよびマウスの１：１相同遺伝子に比較されて、ウマアノテーションにおいて欠損した相同遺伝子はｅｘｏｎｅｒａｔｅを使用して発見されている。ウマおよびヒトｃＤＮＡは蛋白質に基づいた予測にＵＴＲを添加するために使用されている。最終遺伝子セットは２０，７３７蛋白質−コーディング遺伝子を含み、２，８６３は偽遺伝子として確認され、１，５８０はレトロ−トランスポゾン遺伝子として分類された。
【０１２１】
ＳＮＰの付加的な詳細は以下の通りである：
○ＳＮＰ：ＣＫＭ＿１５８８４５６７（Ｇ／Ａ）Ｐ＝０．０２０６６ ＯＲ＝０．４０８９
○ＥｑｕＣａｂ２．０ ＳＮＰ＿ＩＤ：ＢＩＥＣ２−１０９５７５
○ＳＮＰのゲノム位置：イントロン４
○置換型：転移
○ＳＮＰはインターフェロン調節因子結合部位（ＧＣＡ／ＧＡ）を崩壊させる。Ａアレルは部位（ＧＣＡＡ）を保持する。Ｇアレルは部位（ＧＣＧＡ）を崩壊させる。
【０１２２】
隣接配列およびＳＮＰ（太字および角括弧）は以下の通りである：
ＣＴＧＴＣＣＣＴＡＡＣＡＧＡＣＣＴＧＧＡＣＣＴＴＧＧＣＣＣＣＧＴＧＧＡＧＧＴＣＣＴＡＡＡＧＧＣＲＡＣＴＡＴＡＣＧＣＧＡＴＧＴＡＡＡＣＣＣＡＡＡＴＴＣＡＴＧＡＣＡＴＣＣＣＣＴＧＡＡＧＣＡＴＧＣＴＣＴＴＣＣＣＣＴＧＴＣＴＧＣＣＣＧＧＧＴＣＣＣＣＧＧＡＡＣＡＧＣＣＡＣＣＣＣＡＡＧＴＧＣＴＣＴＣＴＣＣＣＡＡＧＴＧＧＡＣＴＣＴＣＣＣＴＴＣＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＴＣＧＣＡＴＣＣＡＧＴＧＣＡＣＣＧＧＣＡＡＧＣ［Ａ／Ｇ］ＡＣＡＣＴＡＴＣＣＣＧＧＴＧＣＣＣＡＣＴＣＣＡＧＡＡＡＧＴＣＡＡＴＧＴＣＴＣＡＧＧＡＡＴＣＴＧＧＧＧＡＧＣＣＡＴＣＡＧＴＣＡＡＡＡＴＴＡＣＴＡＴＣＡＴＡＣＡＧＴＡＴＡＴＡＴＡＧＧＡＴＴＣＧＣＡＴＡＴＡＴＴＣＣＴＡＴＧＣＡＴＡＡＴＡＡＴＴＡＴＡＣＧＴＴＴＴＧＴＧＧＡＴＡＡＴＡＡＡＴＡＴＡＴＧＴＡＴＡＴＡＴＧＣＡＴＡＡＴＡＴＴＴＡＣＡＴＡＡＴＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＴＴＡＴＡＴＡＣＡＴＴＴＴＡＴＡＣＡＴＴ
（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３）
ＰＤＫ４（ＰＤＫ４＿３８９７３２３１（Ａ／Ｇ）ＳＮＰ）
このＳＮＰは、ｗｗｗ．ｂｒｏａｄ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｍａｍｍａｌｓ／ｈｏｒｓｅ／/で調べることができるウマゲノム配列（Ｅｑｕｕｓ ｃａｂａｌｌｕｓ ２．０版）のウマ（Ｅｑｕｕｓ ｃａｂａｌｌｕｓ）のクロモソーム４上３８，９７３，２３１ｂｐ位に位置する。
【０１２３】
ウマゲノムＥｑｕＣａｂ２アセンブリーは６．７９ｘにおける全ゲノムショットガン（ＷＧＳ）アセンブリーであり、２００７年９月に公開された。''Ｔｗｉｌｉｇｈｔ''という名の雌サラブレッドがゲノム配列決定のための代表的なウマとして選択された。プロジェクト調整およびゲノム配列決定およびアセンブリーはＢｒｏａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅによって提供される。Ｎ５０サイズは、アセンブルしたゲノムの５０％がＮ５０サイズまたはそれより長いブロックで存在するような長さである。コンティグのＮ５０サイズは１１２．３８ｋｂであり、すべてのコンティグの全長は２．４３Ｇｂである。スカホールドのコンティグ間のギャップが含まれる場合、アセンブリーの全長は２．６８Ｇｂである。ウマＥｑｕＣａｂ２は、標準Ｅｎｓｅｍｂｌ哺乳動物パイプラインを使用してアノテーションされた。脊椎哺乳動物およびウマ蛋白質に由来する予測は非脊椎哺乳動物に由来する予測に対して優先されている。予測のセットはヒトおよびマウスの１：１相同遺伝子に比較されて、ウマアノテーションにおいて欠損した相同遺伝子はｅｘｏｎｅｒａｔｅを使用して発見されている。ウマおよびヒトｃＤＮＡは蛋白質に基づいた予測にＵＴＲを添加するために使用されている。最終遺伝子セットは２０，７３７蛋白質−コーディング遺伝子を含み、２，８６３は偽遺伝子として確認され、１，５８０はレトロ−トランスポゾン遺伝子として分類された。
【０１２４】
ＳＮＰの付加的な詳細は以下の通りである：
○ＳＮＰ：ＰＤＫ４＿３８９７３２３１（Ａ／Ｇ）Ｐ＝０．００１６７６ ＯＲ＝２．２
○ＥｑｕＣａｂ２．０ ＳＮＰ＿ＩＤ：ＢＩＥＣ２−９０３６０５
○ＳＮＰのゲノム位置：イントロン２
○置換型：転移
○ＳＮＰは、転写因子（２ハンド亜鉛フィンガーホメオドメイン転写因子）結合部位（ｔａ／ｇｔｇｔＧＴＴＴｃａｇａ）から４ｂｐ上流である。
【０１２５】
隣接配列およびＳＮＰ（太字および角括弧）は以下の通りである：
ＡＣＴＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＡＣＴＴＴＣＴＡＡＣＴＴＡＡＡＡＴＴＴＡＴＧＴＴＴＡＡＣＴＡＴＴＣＣＡＧＡＧＣＡＡＴＡＴＴＣＡＧＴＴＴＴＡＴＴＴＧＧＣＡＡＡＴＧＴＴＴＴＣＡＴＴＴＴＴＴＡＴＡＧＣＡＡＡＡＧＴＡＴＴＴＡＧＡＡＡＴＴＴＴＴＡＡＧＡＡＡＧＡＴＴＴＣＡＴＡＴＴＴＣＴＴＴＣＴＡＣＴＴＣＡＴＴＣＡＴＴＣＡＴＧＴＧＴＧＧＧＴＡＧＡＡＧＴＣＴＣＧＡＡＡＧＣＡＧＣＡＧＴＡＡＡＧＡＣＴＡＴＧＧＡＴＴＧＡＡＴ［Ａ／Ｇ］ＴＧＴＧＴＴＴＣＡＧＡＴＴＧＴＣＡＴＴＧＴＴＴＡＡＴＧＧＧＴＡＴＧＧＡＡＴＧＣＡＴＡＴＡＴＴＴＣＴＴＧＡＡＴＣＡＡＴＧＡＡＣＡＡＡＡＣＧＣＴＧＴＡＴＡＧＴＣＡＧＣＡＧＡＴＴＡＧＧＧＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＧＴＧＣＡＴＡＴＣＴＧＣＴＧＣＡＧＴＧＣＡＴＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＴＡＴＴＣＴＣＴＧＡＡＡＡＴＣＴＧＣＴＣＴＴＧＴＧＧＧＴＣＡＴＣＴＡＣＣＣＴＣＴＣＴＡＡＧＣＴＴＭＡＧＣＡＣＣＣＴＴＡＴＴＴＧＴＴＡＡＡ
（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４）
リスク予測
複雑な形質に関する‘リスク’の予測は、相加遺伝分散が小さい場合、単一遺伝子ＳＮＰに頼るよりむしろ、形質に貢献する複数の遺伝子を検定することによって非常に高められる（Ｙａｎｇら ２００３）。しかし、効果が大きい場合（すなわち高オッズ比）、単一ＳＮＰが使用されてもよい。（ＨＷＥにおけるＳＮＰに対する）集団アレル頻度または（ＨＷＥから逸脱したＳＮＰに対する）観察された遺伝子型頻度およびベイズの定理（Ｂａｙｅｓ Ｔｈｅｏｒｅｍ）を使用した亜集団予測に基づいて、本発明者らはＰＤＫ４、ＣＫＭおよびＣＯＸ４Ｉ２遺伝子における配列変異体に対して、ある種の遺伝子型の組み合わせを与えられた１種または他の亜集団（エリートおよび非エリート）のメンバーである確率を検討した。結果は、２つの亜集団のそれぞれのメンバーである確率の百分率として、以下の表９に提供される。
【０１２６】
表９−遺伝子ＰＤＫ４、ＣＫＭおよびＣＯＸ４Ｉ２におけるＳＮＰを使用した優れた競走能力に関する予測検定（遺伝子型組み合わせは、レース能力に関して「最も好ましい」から「最も好ましくない」までランク付けされる）
【０１２７】
【表９Ａ】
【０１２８】
【表９Ｂ】
【０１２９】
表中、ＰＤＫ４の場合、ＡＡは遺伝子型ＡＡを表し、ＡＢは遺伝子型ＡＧを表し、そしてＢＢは遺伝子型ＧＧを表す；ＣＯＸ４Ｉ２の場合：ＡＡは遺伝子型ＣＣを表し、ＡＢは遺伝子型ＣＴを表し、そしてＢＢは遺伝子型ＴＴを表す；そしてＣＫＭの場合：ＡＡは遺伝子型ＧＧを表し、ＡＢは遺伝子型ＧＡを表し、そしてＢＢは遺伝子型ＡＡを表す。
【０１３０】
表９から、これらの３種の遺伝子における遺伝子型の最も好ましい組み合わせは、ＰＤＫ４、ＣＯＸ４Ｉ２およびＣＫＭそれぞれに対して、ＡＡ、ＴＴ、ＡＡであることを理解することができ（エリートレース馬である８２％の確率、非エリートである１８％の確率）、そしてこれらの３種の遺伝子における遺伝子型の最も好ましくない組み合わせは、ＰＤＫ、ＣＯＸ４Ｉ２およびＣＫＭ４それぞれに対して、ＧＧ、ＣＣ、ＧＧである（エリート競走馬である３％の確率、非エリートである９７％の確率）。
【０１３１】
リスク予測検定は付録に列挙された１以上のＳＮＰを使用して実施されてもよい。
【０１３２】
実施例４−ＳＮＰとハンディキャップレーティング（ＲＰＲ）との定量的関連
レーシングポストレーティング（Ｒａｃｉｎｇ Ｐｏｓｔ Ｒａｔｉｎｇｓ）（ＲＰＲ）は、レースレベル、フィールドの特性、負担重量およびレースのタイムに関して、指定されたレースにおけるウマの全体的パフォーマンスによって決定されるハンディキャップレーティングである。ＲＰＲはスピードレーティングに直接匹敵せず、むしろレーティングは、ウマがハンディキャップで負担することを要求されることになる重量を表すことを意図する。たとえば、同じ年齢および性のウマに制限されるレースでは、レーシングポストレーティング１２０のウマは、ハンディキャップでは、１１７のレーティングのウマより３ポンド多く負担することになる。オープンレースでは、セックスアローワンスおよび馬齢重量アローワンスが計算に入れられる。従って、ハンディキャップでは１２０ポンドを負担するウマが一馬身差で１２８ポンドを負担するウマに勝つ場合、１２８ポンドを負担するウマは一般に、１２０ポンドを負担するウマより６または７ポンド高いレーシングポストレーティングを与えられることになる。異なる部門のレース勝ち馬に対して満足できるレーティングを決定することに役立つ指針値は以下の表１０に示される。
【０１３３】
表１０− 勝ち馬に対するＲＰＲ指針
【０１３４】
【表１０】
【０１３５】
本発明者らは、定量的関連検定解析において競技パフォーマンスと有意な関連を示しているＳＮＰのいくつかとＲＰＲとの間に有意な関係があるかどうかを調べた。
【０１３６】
表１１−ＲＰＲと有意な関連を有するＳＮＰ
【０１３７】
【表１１】
【０１３８】
以下の表１２は、上記の表１１に列挙された３つの有意に関連したＳＮＰのそれぞれの遺伝子型に対する平均ＲＰＲを示す。
【０１３９】
表１２−表１１に由来するＳＮＰのそれぞれの遺伝子型に対する平均ＲＰＲ
【０１４０】
【表１２】
【０１４１】
上記の表１２では、ＰＤＫ４＿３８９７３２３１−（Ａ／Ｇ）において、ＡＡ遺伝子型は９９．９５の平均ＲＰＲを有し、ＡＧ遺伝子型は９７．７の平均ＲＰＲを有し、そしてＧＧ遺伝子型は８０．３の平均ＲＰＲを有する。従って本発明者らは、ＡＡおよびＡＧ遺伝子型はより高いＲＰＲと相関する好ましい遺伝子型であると結論する。ＣＯＸ４Ｉ１＿３２７７２８７１−（Ｃ／Ｔ）において、ＴＴ遺伝子型は１００．６の平均ＲＰＲを有し、ＣＣ遺伝子型は９９．７１の平均ＲＰＲを有し、そしてＣＣ遺伝子型は８３．３の平均ＲＰＲを有する。従って本発明者らは、ＴＴおよびＴＣ遺伝子型はより高いＲＰＲと相関する好ましい遺伝子型であると結論する。
【０１４２】
ＣＯＸ４Ｉ１ ＳＮＰ（ＣＯＸ４Ｉ１＿３２７７２８７１（Ｃ／Ｔ）ＳＮＰ）
このＳＮＰは、ｗｗｗ．ｂｒｏａｄ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｍａｍｍａｌｓ／ｈｏｒｓｅ／/で調べることができるウマゲノム配列（Ｅｑｕｕｓ ｃａｂａｌｌｕｓ ２．０版）のウマ（Ｅｑｕｕｓ ｃａｂａｌｌｕｓ）のクロモソーム３上３２，７７２，８７１ｂｐ位に位置する。
【０１４３】
ウマゲノムＥｑｕＣａｂ２アセンブリーは６．７９ｘにおける全ゲノムショットガン（ＷＧＳ）アセンブリーであり、２００７年９月に公開された。''Ｔｗｉｌｉｇｈｔ''という名の雌サラブレッドがゲノム配列決定のための代表的なウマとして選択された。プロジェクト調整およびゲノム配列決定およびアセンブリーはＢｒｏａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅによって提供される。Ｎ５０サイズは、アセンブルしたゲノムの５０％がＮ５０サイズまたはそれより長いブロックで存在するような長さである。コンティグのＮ５０サイズは１１２．３８ｋｂであり、すべてのコンティグの全長は２．４３Ｇｂである。スカホールドのコンティグ間のギャップが含まれる場合、アセンブリーの全長は２．６８Ｇｂである。ウマＥｑｕＣａｂ２は、標準Ｅｎｓｅｍｂｌ哺乳動物パイプラインを使用してアノテーションされた。脊椎哺乳動物およびウマ蛋白質に由来する予測は非脊椎哺乳動物に由来する予測に対して優先されている。予測のセットはヒトおよびマウスの１：１相同遺伝子に比較されて、ウマアノテーションにおいて欠損した相同遺伝子はｅｘｏｎｅｒａｔｅを使用して発見されている。ウマおよびヒトｃＤＮＡは蛋白質を基礎にした予測にＵＴＲを添加するために使用されている。最終遺伝子セットは２０，７３７蛋白質−コーディング遺伝子を含み、２，８６３は偽遺伝子として確認され、１，５８０はレトロ−トランスポゾン遺伝子として分類された。
【０１４４】
ＳＮＰの付加的な詳細は以下の通りである：
○ＳＮＰ：ＣＯＸ４Ｉ１＿３２７７２８７１（Ｃ／Ｔ）ＥＭＰ１＝０．００９６８１
○ＥｑｕＣａｂ２．０ ＳＮＰ＿ＩＤ：ＢＩＥＣ２−８１６０２８
○ＳＮＰのゲノム位置：イントロン
○置換型：転移
隣接配列およびＳＮＰ（太字および角括弧）は以下の通りであり、ここでＭはＡまたはＣである：
ＴＣＡＧＧＴＣＴＣＡＧＴＣＧＣＡＣＣＡＧＡＧＣＴＧＧＡＴＧＧＡＧＣＣＡＧＣＧＣＡＧＣＴＣＣＡＴＣＴＣＴＣＡＧＴＧＧＣＴＧＧＧＡＧＴＧＧＧＣＴＧＣＡＧＧＧＴＧＧＴＣＣＴＣＡＣＡＣＡＡＧＡＴＧＧＧＣＡＣＣＴＣＣＣＴＣＣＴＧＧＧＣＴＣＣＡＴＣＣＣＡＧＧＡＣＴＧＴＴＴＣＣＣＡＧＧＴＴＴＧＧＧＡＡＡＣＴＧＧＣＴＣＧＣＡＴＴＡＧＣＣＧＡＧＴＧＧＣＧＴＧＡＧＣＣＧＧＡＡＴＭＴＧＡＴＴＴＡＣＴＣＡＣＡＧＴＧＣＧＣ［Ｔ／Ｃ］ＧＴＧＣＴＴＧＧＴＧＧＧＧＡＡＣＧＡＣＴＴＣＣＣＴＧＣＴＴＴＧＴＡＣＡＧＣＡＣＣＣＴＧＣＧＴＴＴＣＣＡＧＴＧＧＴＧＧＴＴＴＧＴＣＴＧＧＴＣＡＣＴＡＧＴＣＴＴＴＴＡＴＣＡＡＧＡＧＡＴＡＧＴＡＴＡＧＴＧＡＡＧＧＴＴＡＧＧＴＣＡＡＧＧＡＡＡＡＧＧＧＡＡＣＴＣＴＧＡＣＴＴＧＴＣＡＧＡＧＧＧＣＴＧＴＴＴＧＡＡＣＴＧＴＡＴＧＧＧＧＡＣＴＧＣＡＴＣＴＣＧＡＴＡＡＣＣＡＧＧＡＴＴＣＴＧＧＧＴＣＴＣＣＡＧＡＣＣＣＡ
（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３２）
定量的関連検定解析において、このＳＮＰはＲＰＲと有意に関連する。
【０１４５】
実施例５−サラブレッド馬における優れた短距離レースパフォーマンスの遺伝子予測検定
サラブレッド馬は短距離（＜１，５００ｍ）および長距離（＞１，８００ｍ）レースの両方において秀でている。中距離レースで競走するウマ（‘マイラー’および‘中距離馬’）は、‘スプリンター’または‘ステイヤー’のいずれかであると見なされてもよく、騎手により遂行されるレースのやり方はしばしば調教師が認めたウマの全力疾走能力および持久力を反映する。産業内では、ウマはそれらの馬格（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）に基づいてスプリンターとして記載されてもよく、通常、肥りやすく、より筋肉質の体格を有し、より早く成熟する。それらは通常２歳馬として、そしてより短い距離を３歳馬としてレースを行う。長距離動物であると認められた個体は、成熟にいっそうの時間を必要とし、３歳馬として長距離を走る‘バックヤード（ｂａｃｋｙａｒｄ）’と呼ばれてもよい。ある地域（たとえばオーストラリア）では、ブリーダーはより速い‘短距離’型のウマだけを繁殖させることを企てる。
【０１４６】
ある側面では、本発明は１以上の運動反応遺伝子におけるＳＮＰの存在または不在に基づいて、サラブレッド競走馬の優れた短距離レースパフォーマンスを予測するための、簡単なＤＮＡを基礎にした方法（遺伝子型検定）を提供する。運動反応遺伝子は付録に列挙された１以上の遺伝子であってもよい。たとえば、遺伝子型検定はＭＳＴＮ、ＡＣＮ９、ＰＴＰＮ１、ＰＯＮ１、ＡＤＨＦＥ１、またはＧＳＮ遺伝子の中の１以上におけるＳＮＰに基づいていてもよい。サラブレッド競走馬の優れたレースパフォーマンスを予測するために使用されてもよいいくつかのＳＮＰの詳細は付録に示される。遺伝子型検定がこれらのＳＮＰのいずれか１以上の組み合わせに基づいていてもよいことは理解されるであろう。
【０１４７】
この限定的でない実施例では、本発明者らはＭＳＴＮ遺伝子を研究した。
【０１４８】
方法
関連標本
国際競馬統括機関連盟（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｏｒｓｅｒａｃｉｎｇ Ａｕｔｈｏｒｉｔｉｅｓ）は５つの距離カテゴリーを認めている：短距離（５〜６．５ｆ、≦１，３００ｍ）、マイル（６．５１〜９．４９ｆ、１，３０１〜１，９００ｍ）、中距離（９．５〜１０．５ｆ、９０１〜２，１１２ｍ）、長距離（１０．５１〜１３．５ｆ、２，１１４〜２，７１６ｍ）および超長距離（＞１３．５１ｆ、＞２，７１７ｍ）レース（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｏｒｓｅｒａｃｉｎｇ Ａｕｔｈｏｒｉｔｉｅｓ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ，ｗｗｗ．ｈｏｒｓｅｒａｃｉｎｇｉｎｔｆｅｄ．ｃｏｍ）［注：１ファーロング＝１／８マイル＝２０１．２メートル］。ケース−コントロール調査の場合、本発明者らは２つのコホートを比較した：標本は短距離（≦８ｆおよび≦７ｆ）および長距離（＞８ｆ）レースコホートに細分化された。動物の過度な血縁関係（２世代以内）および血統内の評判のよい種馬（ｓｉｒｅ）の過剰提示を回避するために、１９９８〜２００８年の間に、アイルランドおよびニュージーランドにおいてサラブレッド訓練、繁殖および販売機関から、オーナーのインフォームドコンセントを得て収集された大規模なＤＮＡ標本リポジトリ（ｎ＞１，０００）から、サラブレッドＤＮＡ標本セット（ｎ＝１４８）が選択された。
【０１４９】
レプリケーション標本
パフォーマンスに対する非遺伝的影響を最少化するために、２００４〜２００８年の間に、アイルランドにおいて同じトレーナーによって訓練されたウマに由来するＤＮＡ標本（ｎ＝１４２）のリポジトリから選択されたエリート（グループレースおよび準重賞レースに勝利）競走馬標本（ｎ＝３９）の遺伝子型を判定することにより、結果が実証された。このリポジトリのサブセット（ｎ＝１４２）は、２歳の競走馬における競馬場成功のパラメータにより、遺伝子型傾向を評価された。レースレコードは３つの供給源：ヨーロッパレースレコード、レーシングポストオンラインデータベース（Ｒａｃｉｎｇ Ｐｏｓｔ ｏｎ−ｌｉｎｅ ｄａｔａｂａｓｅ）（ｗｗｗ．ｒａｃｉｎｇｐｏｓｔ．ｃｏ．ｕｋ）；オーストラレーシアおよび東南アジアレースレコード、Ａｒｉｏｎ Ｐｅｄｉｇｒｅｅｓ（ｗｗｗ．ａｒｉｏｎ．ｃｏ．ｎｚ）；ならびに北米レースレコード、Ｐｅｄｉｇｒｅｅ Ｏｎｌｉｎｅ Ｔｈｏｒｏｕｇｈｂｒｅｄデータベース（ｗｗｗ．ｐｅｄｉｇｒｅｅｑｕｅｒｙ．ｃｏｍ）に由来した。レプリケーション標本には、解析で明らかにされた血縁関係の一部共有があった。
【０１５０】
ＤＮＡ抽出、リシークエンシングおよび遺伝子型判定
ゲノムＤＮＡは、標準フェノール／クロロホルム法の改変版（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ＆ Ｒｕｓｓｅｌｌ ２００１）を使用して、新鮮な全血または体毛標本のいずれかから抽出された。ｗｅｂを基礎にしたプライマー設計ツールＰｒｉｍｅｒ３に対するＰＣＲ ｓｕｉｔｅエクステンション（Ｒｏｚｅｎ ＆ Ｓｋａｌｅｔｓｋｙ ２０００；ｖａｎ Ｂａｒｅｎ ＆ Ｈｅｕｔｉｎｋ ２００４）を使用して、１３対の重複するＰＣＲプライマーを設計し、全ＭＳＴＮゲノム配列をカバーした（表１３）。サラブレッド−特異的配列変異体を確認するために、リシークエンシングパネルには２４の関連のないサラブレッドＤＮＡ標本が含まれた。そのようなものとして本研究はサラブレッド集団においてＭＡＦ＞０．０５のＳＮＰの９５％を検出するように強化された（Ｋｒｕｇｌｙａｋ ＆ Ｎｉｃｋｅｒｓｏｎ ２００１）。ＰＣＲ産物の２方向ＤＮＡ配列決定はＭａｃｒｏｇｅｎ Ｉｎｃ．（Ｓｅｏｕｌ，Ｋｏｒｅａ）に海外委託し、ＡＢ ３７３０ｘｌシークエンサーを使用して実行された（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）。配列変異体はＣｏｎｓｅｄ １９．０版（０９０２０６）［Ｇｏｒｄｏｎ ら １９９８］を使用したアラインメント後に配列の目視検査によって検出された。遺伝子型判定は、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＵＳＡ（関連標本）およびＨａｍｂｕｒｇ，ドイツ（レプリケーション標本）において、Ｓｅｑｕｅｎｏｍ社のＳｅｑｕｅｎｏｍ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＵＳＡ）ｉＰｌｅｘ技術を使用して実行された。
【０１５１】
統計解析
関連の検定を含むすべての統計解析は、ＰＬＩＮＫ １．０５版（Ｐｕｒｃｅｌｌ ら ２００７）を使用して実施された。品質管理分析は標本アレル頻度、欠損遺伝子型の割合（百分率）およびＨａｒｄｙ−Ｗｅｉｎｂｅｒｇ平衡からの逸脱の計算を包含した。一連のケース−コントロール関連検定は２つの遺伝子座（ｇ．６６４９３７３７Ｃ＞Ｔおよびｇ．６６４９４２１８Ａ＞Ｃ）に対して実施された。統計的有意性は、傾向に関するコクラン−アーミテージ検定および無条件（ｕｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ）遺伝子型モデルを使用して評価された。オッズ比および９５％ ＣＩは２つの最も有意な関連に関して計算された。線形回帰モデルを使用して、表現型：最適レース距離およびｋｇ／ｃｍ比を使用した遺伝子座ｇ．６６４９３７３７Ｃ＞Ｔにおける定量的形質関連を評価した。
【０１５２】
結果
ウマ、とりわけサラブレッドは、他の哺乳動物種（３０〜４０％）に比較して、体重に対する非常に高い筋肉量比（５５％）を有する（Ｇｕｎｎ １９８７）。ミオスタチン遺伝子（ＭＳＴＮ）変異体は以前に筋肉肥大に貢献することが示されている；従って、クロモソーム１８上に３つのエキソンと全長６，１７２ｂｐを含むウマＭＳＴＮ遺伝子（リバース鎖ｎｔ ６６４８９６０８-６６４９５７８０、ＥｑｕＣａｂ２．０）の配列変異が検討された。現在まで、サラブレッド馬のゲノムＭＳＴＮ配列において配列変異体は報告がなく、ＥｑｕＣａｂ２．０ ＳＮＰデータベースにおいてＭＳＴＮ ＳＮＰは実証されていない。３つのエキソンすべておよび５′上流領域の２８８ｂｐにわたる１４の重複プライマー対（表１３）を使用して１４頭の非関連サラブレッド馬におけるウマＭＳＴＮ遺伝子をリシークエンシングすることにより、新規な配列変異体が確認された。エキソン配列変異体は検出されなかったが、ＭＳＴＮのイントロン１［ｎｔ ６６４９２９７９-６６４９４８０７］において６つのＳＮＰが検出された（表１４）。
【０１５３】
集団遺伝多様性解析は、ＭＳＴＮ遺伝子を含む領域の選択がサラブレッド集団において効果的であることを示唆する。関連のないサラブレッド（ｎ＝１０６）の３つの集団、Ａｋｈａｌ−Ｔｅｋｅ（ｎ＝１８）、Ｃｏｎｎｅｍａｒａ（ｎ＝１７）およびＴｕｖａ（ｎ＝１７）馬において、ウマクロモソーム１８にまたがる１３のマイクロサテライト遺伝子座の遺伝子型判定が行われた。サラブレッドでは、連鎖不平衡の評価はＭＳＴＮ遺伝子に最も近い２つの遺伝子座、ＴＫＹ１０１（ｎｔ．６３５２８４５９）およびＴＫＹ０１６（ｎｔ．６６８３８９２０）を包含する保存されたハプロタイプを示した。集団の中で、ＦＳＴによってランクを付けられた場合、ゲノムワイド遺伝子座のトップ１０％の中にあるＴＫＹ１０１（ＦＳＴ＝０．２３）において分化（ＦＳＴ）が高かった。興味深いことに、ミオスタチンの重要なシグナリング分子であるアクチビンＡ受容体、ＩＩＡ型をコードするＡＣＶＲ２Ａに最も近いＴＫＹ３０３（ｎｔ．３１．１Ｍｂ；ＦＳＴ＝０．３１）のＦＳＴスコアが、クロモソーム１８上で最も高いＦＳＴスコアであった。ＭＳＴＮから３５０ｂｐに位置するＴＫＹ０１６の高いＦＳＴは、サラブレッドおよび非サラブレッド集団間の多岐にわたるアレル頻度分布に起因し、そして距離コホート（ＴＢＥ＜８ｆ；ｎ＝２５およびＴＢＥ＞８ｆ；ｎ＝２２）へのサラブレッド標本の再分布は、アレル１４４頻度（ＴＢＥ＜８ｆ＝７０％；ＴＢＥ＞８ｆ＝４５％）における有意な差（ピアソンのカイ二乗検定；χ２＝５．８０９；ｄｆ＝１；Ｐ＝０．０１５９）を確認した。
【０１５４】
ＭＳＴＮ配列変異体と競走表現型間の関連を検討するために、本発明者らはｎ＝１４８のサラブレッド馬の遺伝子型を判定した。サラブレッドでは、６つのＭＳＴＮ配列多型の中の４つがＭＡＦ＜０．０５を提示し（表１５）、関連解析から排除された。後ろ向き競馬場パフォーマンスに基づいて、関係のない動物を含む別個のコホートにサラブレッドを分類することによって、集団を基礎にした一連のケース−コントロール調査が実施された（表１６）。解析に使用される２つのＳＮＰ（ｇ．６６４９３７３７Ｃ＞Ｔおよびｇ．６６４９４２１８Ａ＞Ｃ）における個々の遺伝子型は、一度もレースに勝ったことがないサラブレッド（Ｔｈｏｒｏｕｇｈｂｒｅｄ−ｏｔｈｅｒ、ＴＢＯ）より、エリートグループレース勝利サラブレッド（Ｔｈｏｒｏｕｇｈｂｒｅｄ−ｅｌｉｔｅ、ＴＢＥ）ではいっそう共通でない（表１７）。さらに、後ろ向き競走能力を反映するハンディキャップレーティングが定量的表現型として評価される場合、関連は検出されなかった。しかし、短距離および長距離競走に対する筋力パワーの相対的貢献を検討する場合、エリートグループレース勝利動物は≦８ｆ（ｎ＝５１）の距離のそれらの最適レースに勝利したものと、＞８ｆ（ｎ＝３５）の距離のそれらの最適レースに勝利しているものに細分化され、極めて有意な差が見出された。［注：１ファーロング＝１／８マイル＝２０１．２メートル］。イギリス（Ｂｒｉｔａｉｎ）では、１年につき１３９のグループレースの中で、５７％が≦１マイルの距離を走り、そして４３％が＞１マイルの距離を走る。エリートパフォーマーコホートには、短距離（≦８ｆ、ｎ＝３９）レースおよび長距離（＞８ｆ、ｎ＝３２）レースを優先的に競う動物のサブセット（ｎ＝７１）が含まれた。
【０１５５】
すべての解析に対して、関連の有意性はｇ．６６４９４２１８Ａ＞Ｃより、ｇ．６６４９３７３７Ｃ＞Ｔに対して高く、これらのＳＮＰ間の連鎖不平衡は相対的に高い（ｒ２＝０．５０）。ロジスティック回帰モデルを使用するそれぞれのＳＮＰに対するコンディショニングは、ｇ．６６４９４２１８Ａ＞Ｃに対するｇ．６６４９３７３７Ｃ＞Ｔの独立した効果（Ｐ＝０．０１０８）を確認したが、ｇ．６６４９３７３７Ｃ＞Ｔに対するｇ．６６４９４２１８Ａ＞Ｃの効果は確認できず（Ｐ＝０．７３８８）、従ってｇ．６６４９３７３７Ｃ＞Ｔの結果だけがさらに検討された。２つの距離コホートの中で、本発明者らはｇ．６６４９３７３７Ｃ＞Ｔとの極めて有意な（Ｐ＝３．７０×１０−５）関連を見出し、短距離コホートが≦７ｆのそれらの最適レースに勝利している動物（ｎ＝４３）にさらに細分化される場合、この関連はわずかに、より強くなった（Ｐ＝１．８８×１０−５）（表１７ａ）。
【０１５６】
Ｃアレルは４．５４のオッズ比（９５％Ｃ．Ｉ．２．２３〜９．２３）に対応して、長距離（＞８ｆ）コホートより短距離（≦７ｆ）コホートにおいて、２倍頻度が高かった（それぞれ０．７２および０．３６）。すべてのサラブレッドが一緒に検討される場合、遺伝子座は予測されたＨａｒｄｙ−Ｗｅｉｎｂｅｒｇ比率に従った（表１８）。しかし、長距離コホートでは、おそらくこの遺伝子座での選択に起因してＨＷＥからの有意な（Ｐ＝０．００１８）逸脱があった。逆に、Ｃ／Ｃ遺伝子型はスプリンター（≦７ｆ、＞５１％）の中では最も一般的な遺伝子型であった。遺伝子型傾向効果は、傾向モデルに関するコクラン−アーミテージ検定を使用して、一般的なホモ接合、ヘテロ接合、およびまれなホモ接合遺伝子型に関する効果の大きさにおける線形傾向に関連したリスクを推測することによってモデル化された。最も簡潔なモデルは、遺伝子型が競走距離の予測に役立つことを示す遺伝子型モデル（Ｐ＝１．１８×１０−６）であった（表１７ｂ）。
【０１５７】
表１３：ウマミオスタチン（ＭＳＴＮ）遺伝子におけるＳＮＰ発見に関するＰＣＲプライマーの詳細
【０１５８】
【表１３Ａ】
【０１５９】
【表１３Ｂ】
【０１６０】
表１４：２４の関係の無いサラブレッド馬のパネルにおけるリシークエンシング後にウマミオスタチン遺伝子において発見されたＳＮＰの詳細。これらのＳＮＰはＥｑｕＣａｂ２．０ ＳＮＰマップ中のＳＮＰの中には見られず、一般に利用可能などのような文献においても今まで報告されていない。
【０１６１】
【表１４】
【０１６２】
表１５：ＭＳＴＮ ＳＮＰに関する遺伝子型判定の結果
【０１６３】
【表１５】
【０１６４】
表１６：それぞれのコホートに対する後ろ向き競馬場成功の詳細を含む、集団の概要
【０１６５】
【表１６】
【０１６６】
表１７：ａ．ｇ．６６４９３７３７Ｃ＞Ｔに関する一連のコホート比較のケース−コントロール関連検定の結果。ＴＢＥ：エリートグループレース勝利サラブレッド；ＴＢＯ：その他の非勝利サラブレッド；ＴＢＥ＞８ｆ、ＴＢＥ≦８ｆおよびＴＢＥ≦７ｆ：＞８ｆ、≦８ｆおよび≦７ｆの距離で最適（最も価値があるか、または最高の等級の）レースに勝利した、優れたグループレース勝利サラブレッド。それぞれのケースにおいてｇ．６６４９３７３７−Ｔアレルの頻度が示される。オッズ比は２つの最も有意な結果に対して計算された。ｂ．≦７ｆの距離の優れたグループレース勝利パフォーマンスとｇ．６６４９３７３７Ｃ＞Ｔとの関連の最良適合モデルの結果。
【０１６７】
【表１７】
【０１６８】
表１８．遺伝子座ｇ．６６４９３７３７Ｃ＞Ｔに対するＨａｒｄｙ−Ｗｅｉｎｂｅｒｇ平衡検定の結果。
【０１６９】
【表１８】
【０１７０】
ＭＳＴＮ ＳＮＰ（ＭＳＴＮ＿６６４９３７３７（Ｔ／Ｃ）ＳＮＰ）
このＳＮＰは、ｗｗｗ．ｂｒｏａｄ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｍａｍｍａｌｓ／ｈｏｒｓｅ／/で調べることができるウマゲノム配列（Ｅｑｕｕｓ ｃａｂａｌｌｕｓ ２．０版）のウマ（Ｅｑｕｕｓ ｃａｂａｌｌｕｓ）のクロモソーム１８上６６，４９０，２０８−６６，４９５，１８０位リバース鎖に位置する。
【０１７１】
ウマゲノムＥｑｕＣａｂ２アセンブリーは６．７９ｘにおける全ゲノムショットガン（ＷＧＳ）アセンブリーであり、２００７年９月に公開された。''Ｔｗｉｌｉｇｈｔ''という名の雌サラブレッドがゲノム配列決定のための代表的なウマとして選択された。プロジェクト調整およびゲノム配列決定およびアセンブリーはＢｒｏａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅによって提供される。Ｎ５０サイズは、アセンブルしたゲノムの５０％がＮ５０サイズまたはそれより長いブロックで存在するような長さである。コンティグのＮ５０サイズは１１２．３８ｋｂであり、すべてのコンティグの全長は２．４３Ｇｂである。スカホールドのコンティグ間のギャップが含まれる場合、アセンブリーの全長は２．６８Ｇｂである。ウマＥｑｕＣａｂ２は、標準Ｅｎｓｅｍｂｌ哺乳動物パイプラインを使用してアノテーションされた。脊椎哺乳動物およびウマ蛋白質に由来する予測は非脊椎哺乳動物に由来する予測に対して優先されている。予測のセットはヒトおよびマウスの１：１相同遺伝子に比較され、ウマアノテーションにおいて欠損した相同遺伝子はｅｘｏｎｅｒａｔｅを使用して発見されている。ウマおよびヒトｃＤＮＡは蛋白質を基礎にした予測にＵＴＲを添加するために使用されている。最終遺伝子セットは２０，７３７蛋白質−コーディング遺伝子を含み、２，８６３は偽遺伝子として確認され、１，５８０はレトロ−トランスポゾン遺伝子として分類された。
【０１７２】
ＳＮＰの付加的な詳細は以下の通りである：
○ＳＮＰ：ＭＳＴＮ＿６６４９３７３７（Ｔ／Ｃ）Ｐ＝１．８８Ｅ−０５ ＯＲ＝４．５４
○ＥｑｕＣａｂ２．０ ＳＮＰ＿ＩＤ：ＥｑｕＣａｂ２．０データベースでは検出されなかった。オン−ラインバイオインフォマティックスリソースにおけるＳＮＰの報告はない。
【０１７３】
○インハウスＳＮＰ＿ＩＤ：ＭＳＴＮ−１０＿４３９
○ＳＮＰのゲノム位置：イントロン１
○置換型：転移
隣接配列およびＳＮＰ（太字および角括弧）は以下の通りである：
ＡＧＣＴＡＡＧＣＡＡＧＴＡＡＴＴＡＧＣＡＣＡＡＡＡＡＴＴＴＧＡＡＴＧＴＴＡＴＡＴＴＣＡＧＧＣＴＡＴＣＴＣＡＡＡＡＧＴＴＡＧＡＡＡＡＴＡＣＴＧＴＣＴＴＴＡＧＡＧＣＣＡＧＧＣＴＧＴＣＡＴＴＧＴＧＡＧＣＡＡＡＡＴＣＡＣＴＡＧＣＡＡＴＴＴＣＴＴＴＴＡＴＴＴＴＧＧＴＴＣＣＣＣＡＡＧＡＴＴＧＴＴＴＡＴＡＡＡＴＡＡＧＧＴＡＡＡＴＣＴＡＣＴＣＣＡＧＧＡＣＴＡＴＴＴＧＡＴＡＧＣＡＧＡＧＴＣＡＴＡＡＡＧＧＡＡＡＡＴＴＡ［Ｔ／Ｃ］ＴＴＧＧＴＧＣＡＴＴＡＴＡＡＣＣＴＧＡＴＴＡＣＴＴＡＡＴＡＡＧＧＡＧＡＡＣＡＡＴＡＴＴＴＴＧＡＡＡＣＴＧＴＴＧＴＧＴＣＣＴＧＴＴＴＡＡＡＧＴＡＧＡＴＡＡＡＧＣＡＣＴＧＧＧＴＡＡＡＧＣＡＧＧＡＴＣＧＣＡＧＡＣＡＣＡＴＧＧＣＡＣＡＧＡＡＴＣＴＴＣＣＧＴＧＴＣＡＴＧＣＣＴＴＣＴＣＴＧＴＧＡＡＧＧＴＧＴＣＴＧＴＣＴＣＣＣＴＴＴＣＣＴＴＧＡＧＴＧＴＡＧＴＴＡＴＧＡＡＣＴＧＡＣＴＧＣＡＡＡＡＡＧＡＡＴＡＴＡＴＧ
（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． ３１）
定量的形質としての最適レース距離（ＢＲＤ）を検討することにより、本発明者らは表現型として最も高い等級または最も価値のあるグループレース勝利の距離（ファーロング）を使用して、エリートコホートのデータ（ｎ＝７９）を分析した。ＢＲＤはｇ．６６４９３７３７Ｃ＞Ｔ ＳＮＰと極めて有意（Ｐ＝４．８５ｘ０−８）に関連した（表１９）。この結果は、同じトレーナーによって生み出された３７頭のエリート競走馬（ｎ＝２７ グループレース勝ち馬およびｎ＝１０ 準重賞レース勝ち馬）において独立して実証された（Ｐ＝０．００４７）。それぞれの遺伝子型に対して、本発明者らは平均ＢＲＤを測定した（表２０）：Ｃ／Ｃ平均値＝６．２±０．８ｆ；Ｃ／Ｔ平均値＝９．１±２．４ｆ；およびＴ／Ｔ平均値＝１０．５±２．７ｆ。２ファーロング増加の遺伝子型分布は図６Ａから６に示される。アイルランドおよびイギリス（Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）では２歳馬のグループレースは≦８ｆに限定されるため、これらの距離に対してバイアスが導入されてもよい（ヨーロッパでは＞８ｆの２歳馬のグループレースは３つしかない）。従って、本発明者らは２歳馬としてただ１つのグループレースに勝利しているウマのＢＲＤを、それらの３歳馬レースの平均距離と置き換え（ｎ＝７３）、そのことが３つの遺伝子型の平均値におけるわずかな増大（Ｃ／Ｃ平均値＝６．４±１．０ｆ；Ｃ／Ｔ平均値＝９．７±２．０ｆ；およびＴ／Ｔ平均値＝１０．９±２．４ｆ）および関連の有意性における増大（Ｐ＝５．４５×１０−９）に帰着した（図７）。
【０１７４】
８つのナショナルハント（障害レース、距離１６〜３６ｆ）競走馬はまた、ｇ．６６４９３７３７Ｃ＞Ｔ ＳＮＰに対して遺伝子型判定が行われ、結果はＴアレルとスタミナとの関連を支持する（Ｔ／Ｔ、ｎ＝７；およびＣ／Ｔ、ｎ＝１）。さらに、持続運動能力で知られる非サラブレッド集団（ｎ＝３１、エジプト系アラビア馬）間の遺伝子型頻度はサラブレッド集団とかなり異なった（図８）。これらの発見は一致して、Ｃ／Ｃ遺伝子型が短距離競走にとりわけ適することを示す。
【０１７５】
サラブレッド繁殖では、子孫の予測される最適レース距離における種馬（ｓｉｒｅ）の貢献が非常に重要であると考えられている。繁殖用種馬（ｓｔａｌｌｉｏｎ）にとって、‘スタミナインデックス’（Ｓ．Ｉ．）はすべての競走子孫の平均勝利距離として見積もられる。従って、本発明者らは、本発明者らの標本においてＳ．Ｉ．を持つｎ＝１９の関係のない繁殖用種馬（ｓｔａｌｌｉｏｎ）の遺伝子型の分布を検討した（図９）。Ｓ．Ｉ．＝６〜８ｆのすべて（１００％）の種馬（ｓｔａｌｌｉｏｎ）はＣ／Ｃ遺伝子型を有し；それぞれＳ．Ｉ．＝９〜１０ｆおよび１０〜１２ｆを持つ８３．３％および７５％の種馬（ｓｔａｌｌｉｏｎ）はＣ／Ｔであり；そしてＳ．Ｉ．＝１０〜１２ｆを持つ２５％の種馬（ｓｔａｌｌｉｏｎ）はＴ／Ｔであった。標本サイズは小さいが、ｇ．６６４９３７３７Ｃ＞Ｔ遺伝子型が繁殖用種馬（ｓｔａｌｌｉｏｎ）におけるＳ．Ｉ．の予測に役立つという明確な徴候が見られる（図９）。
【０１７６】
これらのデータは、この遺伝子座における遺伝子型情報がサラブレッド馬の競走および繁殖産業において実用的な用途を有してもよいことを示す。このことをさらに評価するために、２００７年と２００８年（ｎ＝６３、２００７；ｎ＝７９、２００８）において、同じトレーナーによる内部訓練中のｎ＝１４２のウマの２歳の競走フォームが検討された。首尾一貫して、競走成功のそれぞれのパラメータに対して、Ｃ／ＣおよびＣ／Ｔ遺伝子型はＴ／Ｔ動物よりいっそう成功している２歳競走馬であった（表２０ａ）。収益の点から、Ｃ／ＣまたはＣ／Ｔである動物に対しては訓練への投資に対する報酬が最も高く；平均でこれらのウマはＴ／Ｔのウマより５．５倍稼いだ。＞スターリング（Ｓｔｅｒｌｉｎｇ）£１００，０００（ＵＳ＄１６５，０００）を稼いだ個体が除外された場合でさえ、平均でＣ／Ｃの個体はＴ／Ｔの個体より１．６倍多く稼いだ。飼育および訓練費用の大半は賞金で戻らない（少なくとも１レースで走ったウマの場合、アイルランドで７２％、イギリス（Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）で７８％）［Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｏｒｓｅｒａｃｉｎｇ Ａｕｔｈｏｒｉｔｉｅｓ，ｗｗｗ．ｈｏｒｓｅｒａｃｉｎｇｉｎｔｆｅｄ．ｃｏｍ］；従って、２歳馬としてＣ／ＣおよびＣ／Ｔの個体だけを訓練し、競走させる方策を利用することが有益であってもよい。
【０１７７】
共有された種馬（ｓｉｒｅ）の潜在的に混乱する効果を取り除くために、同じトレーナーによって２歳馬として訓練された４１頭の異母兄弟（単一種馬（ｓｉｒｅ）の子孫）［Ｃ／Ｔ、ｎ＝２２；Ｔ／Ｔ＝１９］（表２０ｃ）の競走勝利が検討された。遺伝子型と競走パフォーマンスとの有意な関連（ピアソン（Ｐｅａｒｓｏｎ）のχ２乗検定：χ２＝７．２３５；ｄｆ＝１；Ｐ＝０．００７１）が確認され；子孫の中の５頭が２歳馬グループレース勝ち馬であり、すべてがＣ／Ｔ遺伝子型を提示した。
【０１７８】
多くの場合、ブリーダーのゴールはダービー（Ｄｅｒｂｙ）勝ち馬を繁殖させることである。ダービー距離（１２ｆ）は、個体がｇ．６６４９３７３７Ｃ＞Ｔにおいて少なくとも１コピーのＴアレルを持たなければならないことを予測する。本発明者らの標本では、ｎ＝７：Ｃ／Ｔ ｎ＝６；およびＴ／Ｔ ｎ＝１がダービー勝ち馬であった。さらに、エプソンダービー（Ｅｐｓｏｎ Ｄｅｒｂｙ）およびアイルランドダービー（Ｉｌｉｓｈ Ｄｅｒｂｙ）の両方で勝利した、成功している繁殖業者の種馬（ｓｔａｌｌｉｏｎ）に由来するｎ＝５１の子孫は、遺伝子型が判定され、Ｓ．Ｉ．＝１１．３ｆであった。子孫の中では、たった２つの遺伝子型（ｎ＝２９、Ｃ／Ｔ；およびｎ＝２２、Ｔ／Ｔ）が確認され、この個体（ここでは遺伝子型判定がされていないが）がＴ／Ｔであることを示唆した。（種馬（ｓｉｒｅ）と雌親（ｄａｍ）の両方は遺伝子型判定され：種馬（ｓｉｒｅ）：Ｔ／Ｔ；雌親（ｄａｍ）：Ｃ／Ｔであった）。本発明者らは、グループレースで勝利している種馬（ｓｔａｌｌｉｏｎ）のｎ＝９の子孫の遺伝子型の平均ＢＲＤを推測し、ｇ．６６４９３７３７Ｃ＞Ｔ遺伝子型傾向（Ｃ／Ｔ：ｎ＝６；平均ＢＲＤ＝８ｆ；Ｔ／Ｔ：ｎ＝３、平均ＢＲＤ＝１０．７ｆ）をいっそう説得力のあるものにした。
【０１７９】
それらのヒト対応物と同様に、短距離競走サラブレッドは一般に長距離レースに適したウマより引き締まり、筋骨たくましい。従って、ＭＳＴＮ遺伝子型が体質量、き甲（ｗｉｔｈｅｒｓ）の重さ（ｍａｓｓ）（ｋｇ）および高さ（ｃｍ）に影響を与えるかどうかを検討するために、２回の２歳馬競走シーズン中に同じトレーナーによる内部訓練中のｎ＝９７のウマ（ｎ＝３７ 雄、ｎ＝６０ 雌）に対して行われた測定が使用された。重さ対高さ比は、ｇ．６６４９３７３７Ｃ＞Ｔ遺伝子型との有意（Ｐ＝０．０１４７）な関係（２．９４ｋｇ／ｃｍ、Ｃ／Ｃ；２．８８ｋｇ／ｃｍ、Ｃ／Ｔ；および２．８３ｋｇ／ｃｍ、Ｔ／Ｔ）を提示した。雄（Ｐ＝０．００２５）が雌（Ｐ＝０．２２７２）から独立していると見なされる場合、この関連はより強くなった（表２１）。平均で、Ｃ／Ｃの雄はＴ／Ｔの雄よりｃｍあたりの重さが６．７％（すなわち、３．０３３ｋｇ／ｃｍ対２．８４３ｋｇ／ｃｍ）大きかった。
【０１８０】
表１９：定量的形質関連検定および最適レース距離（ＢＲＤ）平均値：ａ．関連検定標本；ｂ．（≦８ｆの最適レースに勝利した２歳馬の場合）表現型として３歳馬の平均距離を使用した関連検定標本；およびｃ．レプリケーション標本。
【０１８１】
【表１９】
【０１８２】
表２０：２００７年および２００８年に同じトレーナーによる内部訓練中のｎ＝１４２のウマに関する２歳馬競走（アイルランドおよびイギリス（Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ））成功のパラメータ。ａ．２００７年＆２００８年の内部訓練中の２歳馬；ｂ．Ｃ／ＣおよびＣ／Ｔ対Ｔ／Ｔ遺伝子型を比較した２００７年＆２００８年に内部訓練中の２歳馬；ｃ：単一の種馬（ｓｉｒｅ）を共有する、内部訓練中の異母兄弟の２歳馬。
【０１８３】
【表２０】
【０１８４】
表２１．表現型としてのｋｇ／ｃｍ比に関するｇ．６６４９３７３７Ｃ＞Ｔの定量的関連検定の結果
【０１８５】
【表２１】
【０１８６】
リスク予測
集団で観察された遺伝子型頻度およびベイズの定理を使用した亜集団予測に基づいて、ＭＳＴＮ遺伝子において、ある種の遺伝子型を与えられた１つの亜集団、または他の亜集団（エリートスプリンターまたはエリートエンデュアランスもしくは‘ステイヤー’）のメンバーである確率が検討された。結果は表２２に示され、２つの亜集団のそれぞれのメンバーである可能性の百分率として提供される。
【０１８７】
表２２−優れた短距離競走能力の予測検定
【０１８８】
【表２２】
【０１８９】
表中、ＡＡは遺伝子型ＴＴを表し、ＡＢは遺伝子型ＣＴを表し、そしてＢＢは遺伝子型ＣＣを表す。
【０１９０】
表２２から、ＭＳＴＮ＿６６４９３７３７（Ｔ／Ｃ）ＳＮＰにおいて遺伝子型ＣＣを持つ対象は、それらがエリートサラブレッドであるならば、スプリンターである最も高い可能性を有すると見なすことができる。
【０１９１】
ＭＳＴＮ遺伝子発現
２つの独立したリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲアッセイにおけるＭＳＴＮ ｍＲＮＡ発現（表２３）は、ｎ＝６０の訓練されていない明け２歳馬（ｙｅａｒｌｉｎｇ）（Ｃ／Ｃ、ｎ＝１５；Ｃ／Ｔ、ｎ＝２８；Ｔ／Ｔ、ｎ＝１７）に関して集められた生検標本に由来する静止骨格筋（ｇｌｕｔｅｕｓ ｍｅｄｉｕｓ）において検討されている。
【０１９２】
表２３：ＭＳＴＮ遺伝子発現およびＴＴＮ参照遺伝子発現に関するｑＲＴ−ＰＣＲアッセイのプライマー配列
【０１９３】
【表２３】
【０１９４】
本発明者らはＭＳＴＮ ６６４９３７３７（Ｔ／Ｃ）ＳＮＰに関して遺伝子型との有意（Ｐ＝０．００３５５９）な関連を見出した。Ｃ／Ｃ遺伝子型コホートはＣ／Ｔコホート（４０５．７±２３４．１；３６８．６±２１３．６）およびＴ／Ｔコホート（３５０．１±１８５．５；３４８．１±１６７．２）のいずれよりも高いＭＳＴＮ ｍＲＮＡレベル（６５４．３±３５４．３；６１３．７±３２７．０）を有した（図１０）。
【０１９５】
また、ＭＳＴＮ遺伝子発現は訓練期間後に有意にダウンレギュレーションされることが見出された（−４．２倍、Ｐ＝０．００４３）。サラブレッド馬骨格筋トランスクリプト−ムにおいて、ＭＳＴＮ遺伝子発現は訓練期間後の遺伝子発現が最も大きく減少する。
【０１９６】
最適レース距離との定量的関連
グループレースで勝利している個体（すなわちＴＢＥ ｎ＝８６）のサブセットを使用して、定量的関連検定解析において、調べられた遺伝子のＳＮＰと最適レース距離間に有意な関係（すなわち、最も優れた特性の距離／最も価値のあるグループレース勝利）があるかどうかが調べられた。以下の表２４は、ＳＮＰが最適レース距離と有意に関連したことを示す。
【０１９７】
表２４―最適レース距離と関連するＳＮＰ
【０１９８】
【表２４】
【０１９９】
以下の表２５は、上記の表２４に由来する４つのＳＮＰに関するそれぞれの遺伝子型の平均最適レース距離を示す。
【０２００】
表２５−それぞれの遺伝子型の平均最適レース距離
【０２０１】
【表２５】
【０２０２】
表中、ＭＳＴＮ＿６６４９３７３７−（Ｔ／Ｃ）では、ＴＴ遺伝子型は１０．５４ファーロング（ｆ）の平均最適レース距離を有し、ＴＣ遺伝子型は９．０８７ｆの最適レース距離を有し、そしてＣＣ遺伝子型は６．１６７ｆの最適レース距離を有する。全体の最適レース距離は８．５５ｆであった。
【０２０３】
ＭＳＴＮ遺伝子型に基づいた遺伝子型検定に関する多くの実用的な適用が存在する。これらには、以下のものが挙げられる：
１．若馬（ｙｏｕｎｇ ｓｔｏｃｋ）（当歳（０歳）および明け２歳（１歳））
情報に基づいた選択および販売が以下のために行われうる：
・スプリンターを確認する
・中距離馬／スピードのある潜在的ダービー勝ち馬を確認する
・スタミナの強い個体を確認する；
２．内部訓練中の馬（Ｈｏｒｓｅｓ−ｉｎ−ｔｒａｉｎｉｎｇ）
運営コストを低減することが可能であり、競走方策を以下により微調整することができる；
・最も発達の早い２歳馬を確認すること
・ウマは最適レース距離に対して訓練し、競走させることが可能である
３．繁殖牝馬（Ｂｒｏｏｄｍａｒｅ）
繁殖の結果は以下により最適化することができる：
・最適繁殖用雄馬に注意を集中すること
・適合した種馬（ｓｔａｌｌｉｏｎ）を選択すること
４．種馬（ｓｔａｌｌｉｏｎ）
種馬の潜在能力は以下により促進されうる：
・若い種馬のスタミナインデックスを予測すること（５歳アドバンテジージ（ａｄｖａｎｔａｇｅ））
・種馬（ｓｔａｌｌｉｏｎ）のプロファイルを高めるために、適合する雌馬を誘致する
たとえば、当歳馬、若馬および内部訓練中の馬のＭＳＴＮ−６６４９３７３７ ＴＩＣ ＳＮＰの場合、個体の選択は２歳馬として最も好ましいパフォーマンスをする可能性が高い個体（Ｃ／ＣおよびＣ／Ｔ）に対して行われ、そして３歳になるまでレースを待つことが有益であってもよい“バックワード（ｂａｃｋｗａｒｄ）”個体（身体的に発達の遅い若いサラブレッドに対する産業専門用語）（Ｔ／Ｔ）を除いて行われてもよい。繁殖の目標は、短距離競走に対してＣ／Ｃ個体、中距離競走に対してＣ／Ｔ個体、そしてより強いスタミナが必要な競走に対してＴ／Ｔ個体を選択することによっていっそう自信を持って達成されてもよい。種馬（ｓｔａｌｌｉｏｎ）オーナーの場合、種馬（Ｓｔｕｄ）キャリアの初めにおける種馬（ｓｔａｌｌｉｏｎ）の遺伝的スタミナインデックスの予測（後ろ向き３歳子孫競走パフォーマンスからＳ．Ｉ．を推測するためには５年が必要である）は、ただちに若い種馬（ｓｔａｌｌｉｏｎ）のプロファイルを高め、それらの遺伝的潜在性を雌馬オーナーに対して売り込むことになる。このことが今度は、雌馬オーナーが、目的をもった繁殖方策により、特定の繁殖目標を達成するために種馬（ｓｔａｌｌｉｏｎ）をいっそう都合よく選択することを可能にするであろう。交配の成り行き（種馬（ｓｉｒｅ）と母馬（ｄａｍ）が共にホモ接合体である場合を除いて）から不確実性を排除するために、当歳馬の遺伝子型判定をすることが、目的を持った繁殖の成果にふさわしい個体の選択を可能にするために必要であろう。
【０２０４】
実施例６−ＳＮＰの検出
ＳＮＰは、たとえば以下の限定的でない方法を含む、任意のＳＮＰ遺伝子型判定法により決定されてもよい。
【０２０５】
Ｓｅｑｕｅｎｏｍ Ｉｎｃ
マルチプレックスＰＣＲとそれに続く単一塩基プライマー伸長反応に基づいたｉＰＬＥＸ（登録商標）Ｇｏｌｄアッセイ。ＰＣＲの後、残存するヌクレオチドはＳＡＰ処理により脱活性化される。単一塩基プライマー伸長ステップが実施され、プライマー伸長産物はＭＡＬＤＩ ＴＯＦ ＭＳを使用して分析される。
【０２０６】
ＫＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ
ＫＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓは、遺伝子型判定に本発明者らの競合的アレル特異的ＰＣＲシステムの新規形態（ＫＡＳＰａｒ）およびＴａｑｍａｎ（商標）化学の両方を使用する。ＫＡＳＰａｒアッセイは以前使用されたＡｍｐｌｉｆｌｕｏｒシステムに取って代わるために開発された自社独自の社内システムである。
【０２０７】
Ｔａｑｍａｎアッセイ
ＴａｑＭａｎ（登録商標）遺伝子型判定アッセイは、ＴａｑＭａｎ（登録商標）試薬を基にした精密な化学でＳＮＰ遺伝子型判定を実施することを容易にする。ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイはＳＮＰ検出能力を提供する。その上、ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｓａｍｐｌｅ−ｔｏ−ＳＮＰ（登録商標）キットは単一のキットにより、任意の標本からＴａｑＭａｎ化学に基づいた遺伝子型判定解析を実施するための簡潔なプロトコルを提供する。該キットは：ＤＮＡ抽出物全溶解試薬（ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔ Ａｌｌ Ｌｙｓｉｓ Ｒｅａｇｅｎｔｓ）とＴａｑＭａｎ（登録商標）ＧＴＸｐｒｅｓｓ（登録商標）Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘの２つの部分からなる。ＤＮＡ抽出物全溶解試薬はリアルタイムＰＣＲ−用のＤＮＡ遊離のための時間のかかる手順を５分間プロトコルに短縮させる。それらは血液から頬スワブまでの範囲の多様な標本を調製できる。ＴａｑＭａｎ ＧＴＸｐｒｅｓｓ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘは５０分未満でロバストなＰＣＲ増幅を可能にする。
【０２０８】
産業上の利用可能性
本明細書に記載の予測検定は、競走成功に関する高い、または低い遺伝的潜在性を有する個体を選択するために適用されてもよい。これらの検定はライフサイクルのいずれの段階、たとえば生後１日目（出生時）、販売前（すなわち、明け２歳、２歳など）、競走キャリア中（すなわち、２歳から）、繁殖中（すなわち、およそ２５歳まで）においても個体に実施されうる。その上、母馬と種馬（ｓｔａｌｌｉｏｎ）の遺伝的素質に基づいて交配のための適切な種馬（ｓｔａｌｌｉｏｎ）−母馬の縁組みを選択するために、該検定が適用されてもよい。
【０２０９】
本発明は、添付の図面と関連した先に記載の態様に限定されず、構成および詳細が変更されてもよい。
【０２１０】
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付録Ｉ：ＴＢＥ（エリート）対ＴＢＯ（勝ち馬でない）関連検定。ＳＮＰはＰ値によって並べられた。
【０２１１】
【表２６−１】
【０２１２】
【表２６−２】
【０２１３】
【表２６−３】
【０２１４】
【表２６−４】
【０２１５】
【表２６−５】
【０２１６】
付録ＩＩ：ＴＢＥ＿ＳＰ（エリートスプリンター）対ＴＢＥ＿ＥＮ（エリートステイヤー）関連検定。ＳＮＰはＰ値によって並べられた。
【０２１７】
【表２７−１】
【０２１８】
【表２７−２】
【０２１９】
【表２７−３】
【０２２０】
【表２７−４】
【０２２１】
【表２７−５】
【０２２２】
付録ＩＩＩ：ＳＮＰと表現型の有意な関連
ＴＢＥ−エリート（グループレース勝利）サラブレッド
ＴＢＯ−その他（非勝利）のサラブレッド
ＴＢＥ＿ＳＰ８−＜８ｆの距離の最適レースに勝利したエリート（グループレース勝利）サラブレッド
ＴＢＥ＿ＳＰ７−＜７ｆの距離の最適レースに勝利したエリート（グループレース勝利）サラブレッド
ＴＢＥ＿ＥＮ−＞８ｆの距離の最適レースに勝利したエリート（グループレース勝利）サラブレッド
ＳＮＰは遺伝子記号＿クロモソーム位置（ｂｐ）によって示される。
【０２２３】
【表２８】
【０２２４】
付録ＩＶ：ケース−コントロール関連検定および有意に関連するＳＮＰの最良適合モデル
ＴＢＥ対ＴＢＯ（ケース−コントロール関連検定）Ｐ＜０．０５
【０２２５】
【表２９】
【０２２６】
ＴＢＥ対ＴＢＯ 有意に関連するＳＮＰに関する最良適合モデル
【０２２７】
【表３０−１】
【０２２８】
【表３０−２】
【０２２９】
【表３０−３】
【０２３０】
ＴＢＥ＿ＳＰ７対ＴＢＥ＿ＥＮ（ケース−コントロール関連検定）Ｐ＜０．０５
【０２３１】
【表３１】
【０２３２】
ＴＢＥ＿ＳＰ７対ＴＢ＿ＥＮ 有意に関連するＳＮＰに関する最良適合モデル
【０２３３】
【表３２−１】
【０２３４】
【表３２−２】
【０２３５】
ＴＢＥ最適レース距離定量的形質関連
【０２３６】
【表３３】
【０２３７】
ＴＢＥ 有意に関連するＳＮＰに関する最適レース距離平均値（距離はファーロングである）
【０２３８】
【表３４−１】
【０２３９】
【表３４−２】
【０２４０】
【表３４−３】
【０２４１】
レーシングポストハンディキャップレーティング（最適ＲＰＲ）定量的形質関連
【０２４２】
【表３５】
【０２４３】
有意に関連するＳＮＰに関するレーシングポストハンディキャップレーティング（最適ＲＰＲ）平均値
【０２４４】
【表３６】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＭＳＴＮ遺伝子、ＣＯＸ４Ｉ２遺伝子、ＰＤＫ４遺伝子、ＣＫＭ遺伝子、またはＣＯＸ４Ｉ１遺伝子の中の１以上における一塩基多型（ＳＮＰ）の存在に関して、対象に由来する生物学的標本をアッセイするステップを含む、対象の潜在的競技パフォーマンスを予測するための方法。
【請求項２】
ＳＮＰがＭＳＴＮ＿６６４９３７３７（Ｔ／Ｃ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｃアレルの存在が優れた競技パフォーマンスを示す、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ホモ接合ＣＣ遺伝子型の存在が優れた競技パフォーマンスを示す、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
優れた競技パフォーマンスが優れた全力疾走パフォーマンスである、請求項２から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
ＳＮＰがＣＯＸ４Ｉ２＿２２６８４３９０（Ｃ／Ｔ）である、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
Ｔアレルの存在が優れた競技パフォーマンスを示す、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ホモ接合ＴＴ遺伝子型の存在が優れた競技パフォーマンスを示す、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
ＳＮＰがＰＤＫ４＿３８９７３２３１（Ａ／Ｇ）である、請求項１から８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
Ａアレルの存在が優れた競技パフォーマンスを示す、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ホモ接合ＡＡ遺伝子型の存在が優れた競技パフォーマンスを示す、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
ＳＮＰがＣＫＭ＿１５８８４５６７（Ｇ／Ａ）である、請求項１から１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
Ａアレルの存在が優れた競技パフォーマンスを示す、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ホモ接合ＡＡ遺伝子型の存在が優れた競技パフォーマンスを示す、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
ＳＮＰがＣＯＸ４Ｉ１＿３２７７２８７１（Ｔ／Ｃ）である、請求項１から１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
Ｔアレルの存在が優れた競技パフォーマンスを示す、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ホモ接合ＴＴ遺伝子型の存在が優れた競技パフォーマンスを示す、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
対象の生物学的標本が、血液、唾液、骨格筋、体毛、精液、骨髄、軟部組織、内部臓器生検標本および皮膚を含む群から選択される、請求項１から１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
対象が競争レース種に由来する、請求項１から１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
対象がウマ科動物である、請求項１から１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
対象がサラブレッド競走馬である、請求項１から２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
標本を得るステップ；
標本からＤＮＡを抽出するか、または遊離させるステップ；および
抽出または遊離されたＤＮＡにおける競技パフォーマンスに関連した遺伝子に由来する一塩基多型（ＳＮＰ）標的配列を同定するステップ
を含み、対象の潜在的競技パフォーマンスが当該ＳＮＰと関連する、対象の潜在的競技パフォーマンスを測定するためのアッセイ。
【請求項２３】
競技パフォーマンスに関連した遺伝子がＭＳＴＮ、ＣＯＸ４Ｉ２、ＰＤＫ４、ＣＫＭまたはＣＯＸ４Ｉ１の中の１以上から選択される、請求項２２に記載のアッセイ。
【請求項２４】
抽出または遊離されたＤＮＡにおける競技パフォーマンスに関連した遺伝子に由来する標的配列を増幅するステップを、一塩基多型を同定するステップの前に含む、請求項２２または２３に記載のアッセイ。
【請求項２５】
ＤＮＡがゲノムＤＮＡである、請求項２２から２４のいずれかに記載のアッセイ。
【請求項２６】
ＭＳＴＮ遺伝子、ＣＯＸ４Ｉ２遺伝子、ＰＤＫ４遺伝子、ＣＫＭ遺伝子、またはＣＯＸ４Ｉ１遺伝子の内の１以上における一塩基多型（ＳＮＰ）の存在を検出するための手段を含む、対象の潜在的競技パフォーマンスを測定することにおける使用のためのアッセイ。
【請求項２７】
ＳＮＰがＭＳＴＮ＿６６４９３７３７ （Ｔ／Ｃ）である、請求項２２から２６のいずれかに記載のアッセイ。
【請求項２８】
Ｃアレルの存在が優れた競技パフォーマンスを示す、請求項２７に記載のアッセイ。
【請求項２９】
ホモ接合ＣＣ遺伝子型の存在が優れた競技パフォーマンスを示す、請求項２７または２８に記載のアッセイ。
【請求項３０】
優れた競技パフォーマンスが優れた全力疾走パフォーマンスである、請求項２７から２９のいずれかに記載のアッセイ。
【請求項３１】
ＳＮＰがＣＯＸ４Ｉ２＿２２６８４３９０（Ｃ／Ｔ）である、請求項２２から３０のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
Ｔアレルの存在が優れた競技パフォーマンスを示す、請求項３１に記載のアッセイ。
【請求項３３】
ホモ接合ＴＴ遺伝子型の存在が優れた競技パフォーマンスを示す、請求項３１または３２に記載のアッセイ。
【請求項３４】
ＳＮＰがＰＤＫ４＿３８９７３２３１（Ａ／Ｇ）である、請求項２２から３３のいずれかに記載のアッセイ。
【請求項３５】
Ａアレルの存在が優れた競技パフォーマンスを示す、請求項３４に記載のアッセイ。
【請求項３６】
ホモ接合ＡＡ遺伝子型の存在が優れた競技パフォーマンスを示す、請求項３４または３５に記載のアッセイ。
【請求項３７】
ＳＮＰがＣＫＭ＿１５８８４５６７（Ｇ／Ａ）である、請求項２２から３６のいずれかに記載のアッセイ。
【請求項３８】
Ａアレルの存在が優れた競技パフォーマンスを示す、請求項３７に記載のアッセイ。
【請求項３９】
ホモ接合ＡＡ遺伝子型の存在が優れた競技パフォーマンスを示す、請求項３７または３８に記載のアッセイ。
【請求項４０】
ＳＮＰがＣＯＸ４Ｉ１＿３２７７２８７１（Ｔ／Ｃ）である、請求項２２から３９のいずれかに記載のアッセイ。
【請求項４１】
Ｔアレルの存在が優れた競技パフォーマンスを示す、請求項４０に記載のアッセイ。
【請求項４２】
ホモ接合ＴＴ遺伝子型の存在が優れた競技パフォーマンスを示す、請求項４１または４２に記載のアッセイ。
【請求項４３】
標本を得るステップ；
標本からＤＮＡを抽出するか、または遊離させるステップ；および
抽出または遊離されたＤＮＡにおけるＭＳＴＮ＿６６４９３７３７（Ｔ／Ｃ）ＳＮＰの遺伝子型を確認するステップ
を含む、対象の競技潜在性を測定するためのアッセイであって、ＭＳＴＮ＿６６４９３７３７（Ｔ／Ｃ）ＳＮＰにおけるＣアレルの存在が優れた競技パフォーマンスを示す、前記アッセイ。
【請求項４４】
ＭＳＴＮ＿６６４９３７３７（Ｔ／Ｃ）ＳＮＰの遺伝子型を確認するステップの前に、抽出または遊離されたＤＮＡにおいてＭＳＴＮ＿６６４９３７３７（Ｔ／Ｃ）ＳＮＰをコードする標的配列を増幅するステップを含む、請求項４３に記載のアッセイ。
【請求項４５】
ホモ接合ＣＣ遺伝子型の存在が優れた競技パフォーマンスを示す、請求項４３または４４に記載のアッセイ。
【請求項４６】
優れた競技パフォーマンスが優れた全力疾走パフォーマンスである、請求項４３から４５のいずれかに記載のアッセイ。
【請求項４７】
ＤＮＡがゲノムＤＮＡである、請求項４３から４６のいずれかに記載のアッセイ。
【請求項４８】
対象が競争レース種に由来する、請求項２２から４７のいずれか１項に記載のアッセイ。
【請求項４９】
対象がウマ科動物である、請求項２２から４８のいずれか１項に記載のアッセイ。
【請求項５０】
対象がサラブレッド競走馬である、請求項２２から４９のいずれか１項に記載のアッセイ。
【請求項１】
ＭＳＴＮ遺伝子、ＣＯＸ４Ｉ２遺伝子、ＰＤＫ４遺伝子、ＣＫＭ遺伝子、またはＣＯＸ４Ｉ１遺伝子の中の１以上における一塩基多型（ＳＮＰ）の存在に関して、対象に由来する生物学的標本をアッセイするステップを含む、対象の潜在的競技パフォーマンスを予測するための方法。
【請求項２】
ＳＮＰがＭＳＴＮ＿６６４９３７３７（Ｔ／Ｃ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｃアレルの存在が優れた競技パフォーマンスを示す、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ホモ接合ＣＣ遺伝子型の存在が優れた競技パフォーマンスを示す、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
優れた競技パフォーマンスが優れた全力疾走パフォーマンスである、請求項２から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
ＳＮＰがＣＯＸ４Ｉ２＿２２６８４３９０（Ｃ／Ｔ）である、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
Ｔアレルの存在が優れた競技パフォーマンスを示す、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ホモ接合ＴＴ遺伝子型の存在が優れた競技パフォーマンスを示す、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
ＳＮＰがＰＤＫ４＿３８９７３２３１（Ａ／Ｇ）である、請求項１から８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
Ａアレルの存在が優れた競技パフォーマンスを示す、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ホモ接合ＡＡ遺伝子型の存在が優れた競技パフォーマンスを示す、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
ＳＮＰがＣＫＭ＿１５８８４５６７（Ｇ／Ａ）である、請求項１から１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
Ａアレルの存在が優れた競技パフォーマンスを示す、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ホモ接合ＡＡ遺伝子型の存在が優れた競技パフォーマンスを示す、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
ＳＮＰがＣＯＸ４Ｉ１＿３２７７２８７１（Ｔ／Ｃ）である、請求項１から１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
Ｔアレルの存在が優れた競技パフォーマンスを示す、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ホモ接合ＴＴ遺伝子型の存在が優れた競技パフォーマンスを示す、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
対象の生物学的標本が、血液、唾液、骨格筋、体毛、精液、骨髄、軟部組織、内部臓器生検標本および皮膚を含む群から選択される、請求項１から１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
対象が競争レース種に由来する、請求項１から１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
対象がウマ科動物である、請求項１から１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
対象がサラブレッド競走馬である、請求項１から２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
標本を得るステップ；
標本からＤＮＡを抽出するか、または遊離させるステップ；および
抽出または遊離されたＤＮＡにおける競技パフォーマンスに関連した遺伝子に由来する一塩基多型（ＳＮＰ）標的配列を同定するステップ
を含み、対象の潜在的競技パフォーマンスが当該ＳＮＰと関連する、対象の潜在的競技パフォーマンスを測定するためのアッセイ。
【請求項２３】
競技パフォーマンスに関連した遺伝子がＭＳＴＮ、ＣＯＸ４Ｉ２、ＰＤＫ４、ＣＫＭまたはＣＯＸ４Ｉ１の中の１以上から選択される、請求項２２に記載のアッセイ。
【請求項２４】
抽出または遊離されたＤＮＡにおける競技パフォーマンスに関連した遺伝子に由来する標的配列を増幅するステップを、一塩基多型を同定するステップの前に含む、請求項２２または２３に記載のアッセイ。
【請求項２５】
ＤＮＡがゲノムＤＮＡである、請求項２２から２４のいずれかに記載のアッセイ。
【請求項２６】
ＭＳＴＮ遺伝子、ＣＯＸ４Ｉ２遺伝子、ＰＤＫ４遺伝子、ＣＫＭ遺伝子、またはＣＯＸ４Ｉ１遺伝子の内の１以上における一塩基多型（ＳＮＰ）の存在を検出するための手段を含む、対象の潜在的競技パフォーマンスを測定することにおける使用のためのアッセイ。
【請求項２７】
ＳＮＰがＭＳＴＮ＿６６４９３７３７ （Ｔ／Ｃ）である、請求項２２から２６のいずれかに記載のアッセイ。
【請求項２８】
Ｃアレルの存在が優れた競技パフォーマンスを示す、請求項２７に記載のアッセイ。
【請求項２９】
ホモ接合ＣＣ遺伝子型の存在が優れた競技パフォーマンスを示す、請求項２７または２８に記載のアッセイ。
【請求項３０】
優れた競技パフォーマンスが優れた全力疾走パフォーマンスである、請求項２７から２９のいずれかに記載のアッセイ。
【請求項３１】
ＳＮＰがＣＯＸ４Ｉ２＿２２６８４３９０（Ｃ／Ｔ）である、請求項２２から３０のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
Ｔアレルの存在が優れた競技パフォーマンスを示す、請求項３１に記載のアッセイ。
【請求項３３】
ホモ接合ＴＴ遺伝子型の存在が優れた競技パフォーマンスを示す、請求項３１または３２に記載のアッセイ。
【請求項３４】
ＳＮＰがＰＤＫ４＿３８９７３２３１（Ａ／Ｇ）である、請求項２２から３３のいずれかに記載のアッセイ。
【請求項３５】
Ａアレルの存在が優れた競技パフォーマンスを示す、請求項３４に記載のアッセイ。
【請求項３６】
ホモ接合ＡＡ遺伝子型の存在が優れた競技パフォーマンスを示す、請求項３４または３５に記載のアッセイ。
【請求項３７】
ＳＮＰがＣＫＭ＿１５８８４５６７（Ｇ／Ａ）である、請求項２２から３６のいずれかに記載のアッセイ。
【請求項３８】
Ａアレルの存在が優れた競技パフォーマンスを示す、請求項３７に記載のアッセイ。
【請求項３９】
ホモ接合ＡＡ遺伝子型の存在が優れた競技パフォーマンスを示す、請求項３７または３８に記載のアッセイ。
【請求項４０】
ＳＮＰがＣＯＸ４Ｉ１＿３２７７２８７１（Ｔ／Ｃ）である、請求項２２から３９のいずれかに記載のアッセイ。
【請求項４１】
Ｔアレルの存在が優れた競技パフォーマンスを示す、請求項４０に記載のアッセイ。
【請求項４２】
ホモ接合ＴＴ遺伝子型の存在が優れた競技パフォーマンスを示す、請求項４１または４２に記載のアッセイ。
【請求項４３】
標本を得るステップ；
標本からＤＮＡを抽出するか、または遊離させるステップ；および
抽出または遊離されたＤＮＡにおけるＭＳＴＮ＿６６４９３７３７（Ｔ／Ｃ）ＳＮＰの遺伝子型を確認するステップ
を含む、対象の競技潜在性を測定するためのアッセイであって、ＭＳＴＮ＿６６４９３７３７（Ｔ／Ｃ）ＳＮＰにおけるＣアレルの存在が優れた競技パフォーマンスを示す、前記アッセイ。
【請求項４４】
ＭＳＴＮ＿６６４９３７３７（Ｔ／Ｃ）ＳＮＰの遺伝子型を確認するステップの前に、抽出または遊離されたＤＮＡにおいてＭＳＴＮ＿６６４９３７３７（Ｔ／Ｃ）ＳＮＰをコードする標的配列を増幅するステップを含む、請求項４３に記載のアッセイ。
【請求項４５】
ホモ接合ＣＣ遺伝子型の存在が優れた競技パフォーマンスを示す、請求項４３または４４に記載のアッセイ。
【請求項４６】
優れた競技パフォーマンスが優れた全力疾走パフォーマンスである、請求項４３から４５のいずれかに記載のアッセイ。
【請求項４７】
ＤＮＡがゲノムＤＮＡである、請求項４３から４６のいずれかに記載のアッセイ。
【請求項４８】
対象が競争レース種に由来する、請求項２２から４７のいずれか１項に記載のアッセイ。
【請求項４９】
対象がウマ科動物である、請求項２２から４８のいずれか１項に記載のアッセイ。
【請求項５０】
対象がサラブレッド競走馬である、請求項２２から４９のいずれか１項に記載のアッセイ。
【図４−１】
【図４−２】
【図５−１】
【図５−２】
【図６−１】
【図６−２】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４−２】
【図５−１】
【図５−２】
【図６−１】
【図６−２】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１】
【図２】
【図３】
【公表番号】特表２０１２−５０１６７１（Ｐ２０１２−５０１６７１Ａ）
【公表日】平成２４年１月２６日（２０１２．１．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５２６６２７（Ｐ２０１１−５２６６２７）
【出願日】平成２１年９月１１日（２００９．９．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＥ２００９／００００６２
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０２９５２７
【国際公開日】平成２２年３月１８日（２０１０．３．１８）
【出願人】（５０１３３９１７１）ユニバーシティ・カレッジ・ダブリン，ナショナル・ユニバーシティ・オブ・アイルランド，ダブリン (7)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年１月２６日（２０１２．１．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年９月１１日（２００９．９．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＥ２００９／００００６２
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０２９５２７
【国際公開日】平成２２年３月１８日（２０１０．３．１８）
【出願人】（５０１３３９１７１）ユニバーシティ・カレッジ・ダブリン，ナショナル・ユニバーシティ・オブ・アイルランド，ダブリン (7)
【Ｆターム（参考）】
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