灌流可能な微小血管システムを作製するための方法
インビトロで灌流可能な微小血管のネットワーク（２２２）を作製するための方法。マトリックス（１０５４）からマンドレル（９１６）を引き出して、マトリックスからチャネルを形成する（１０１０）。細胞（１）をチャネルに注入する（１０１４）。マトリックス（１０５４）をインキュベートして、細胞（１）をチャネル内部に付着させる（１０１６）。チャネルを灌流して（１０２０）未付着の細胞を取り除き、親血管を作り出し（１０２２）、ここで親血管（１１０２）はマトリックス（１０５４）において細胞（１）で裏打ちされた灌流可能な中空チャネルを含む。周囲にあるマトリックスゲル（１０５４）中に芽（１１０６）を作り出すように親血管（１１０２）を誘導して、その結果、微小血管ネットワーク（２２２）を形成する。微小血管ネットワーク（２２２）は、親血管（１１０２）を通る管腔灌流にさらされる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
連邦支援研究に関する陳述
本発明は、ＮＩＨ国立心臓、肺および血液研究所により与えられた認可番号１Ｒ２１ ＨＬ０８１１５２−０１の下で政府支援を得て行われた。政府は本発明においてある種の権利を有する。
【０００２】
関連出願
本出願は、「灌流可能な微小血管システムを作製するための方法」という表題の、２００６年３月２４日に出願されたＮｅｕｍａｎｎの同時係属米国出願第１１３８８９２０号の優先権を主張し、その一部継続出願である。Ｎｅｕｍａｎｎの米国出願第１１３８８９２０号は参照により本明細書に組み込まれている。
【０００３】
本発明は、生理学的および病理学的血管増殖ならびに血管新生因子または血管新生抑制因子に応答した血管増殖の研究のための方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
血管増殖の正常なプロセス（たとえば、月経周期、胎盤形成、肥満症における変化、創傷修復、炎症）の間で、新たな血管の形成は調節されており最終的に停止する。重大なことに、血管増殖の調節解除は病態の決定的要素である。たとえば、腫瘍増殖、糖尿病性網膜症、関節炎、および乾癬は、病的状態の直接の一因となる血管の過剰増殖を伴う。これとは対照的に、高齢者に特徴的な血管増殖の機能障害は、創傷治療および外傷または疾患により虚血性になった組織の血行再建を損なう。したがって、新たな血管の構築を指示する機序および血管増殖を開始および停止するプロセスを理解することは、疾患における血管新生を制御する戦略の開発に重要である。
【０００５】
新たな血管の増殖（血管新生）中、毛細管および後毛細管細静脈、すなわち血管系の最小枝の管腔の内側を覆う内皮細胞から芽が生じる。血管新生は複雑な多段階プロセスである。血管新生についての発表された研究は数が何千にも達するが、血管新生増殖および形態形成を媒介し調節する細胞機構についての理解は不十分である。
【０００６】
血管新生出芽の詳細は、大半の組織が不透明であるために、インビボにおける「リアルタイム」での観察は困難である。組織切片は３Ｄでの再構築が困難であり、血管増殖の動的性質を伝えない。さらに、血管新生芽の先端付近の領域、すなわち、血管湿潤および形態形成の制御のきわめて重要な領域は組織切片で見つかることはめったにない。従来の組織学的検査の限界を克服するために、インビトロおよびインビボにおける種々の血管新生の「モデル」が開発されてきた。
【０００７】
インビボでの血管新生モデル
生体組織の不透明性を回避するために、研究者らは両生類幼虫の天然に透明な尾部を含む生きた動物の「窓」（ＣｌａｒｋとＣｌａｒｋ、１９３９）、あるいはウサギの耳（ＣｌａｒｋとＣｌａｒｋ、１９３９）、マウスの皮膚（Ａｌｇｉｒｅ、Ｃｈａｌｋｌｅｙら、１９４５）およびハムスターの頬袋（ＧｒｅｅｎｂｌａｔｔとＳｈｕｂｉ、１９６８）に植え込まれた、またはウサギの角膜ポケット（Ｇｉｍｂｒｏｎｅ、Ｃｏｔｒａｎら、１９７４）もしくはニワトリ絨毛尿膜（Ａｕｓｐｒｕｎｋ、Ｋｎｉｇｈｔｏｎら、１９７４）から開発された特殊な観察室を通じて血管新生を観察してきた。これらの初期の大部分が記述的な研究から、腫瘍誘導血管走化性の中核的パラダイムの確証および血管増殖を促進する拡散性腫瘍由来分子の対応する発見が生まれた。インビボでの血管新生の新しいアッセイでは、げっ歯類の皮下に植え込まれたゲル状基底膜タンパク質の重合体スポンジまたはプラグへの血管内殖が測定される（Ｐａｓｓａｎｉｔｉ、Ｔａｙｌｏｒら、１９９２； Ａｎｄｒａｄｅ、Ｍａｃｈａｄｏら、１９９７； Ａｋｈｔａｒ、Ｄｉｃｋｅｒｓｏｎら、２００２； Ｋｏｉｋｅ、Ｖｅｒｎｏｎら、２００３）。そのすべての優雅さの割に、インビボでのアプローチは、（１）動物による血管新生応答の種内変動；（２）ある種から別の種への結果の移行の欠如；（３）動物の購入および維持の高コスト；（４）研究目的のための動物使用に対する国民の不支持；および（５）動物手術ならびに結果の視覚化および評価において直面する複雑さによって困難になる。
【０００８】
インビトロでの血管新生の二次元（２Ｄ）モデル
血管新生の分子力学を理解することを目指して、大血管から単離した内皮細胞が、血管の内膜をシミュレートするコンフルエントな舗道様単層を形成するまで平皿で培養された（Ｊａｆｆｅ、Ｎａｃｈｍａｎら、１９７３； Ｇｉｍｂｒｏｎｅ １９７６）。大血管中の内皮障害に対する増殖応答のモデルとしては有用であるが（Ｇｉｍｂｒｏｎｅ、Ｃｏｔｒａｎら、１９７４； Ｆｉｓｈｍａｎ、Ｒｙａｎら、１９７５； ＭａｄｒｉとＳｔｅｎｎ １９８２； ＭａｄｒｉとＰｒａｔｔ １９８６； Ｊｏｚａｋｉ，Ｍａｒｕｃｈａら、１９９０； Ｒｏｓｅｎ、Ｍｅｒｏｍｓｋｙら、１９９０）、硬い基層上の内皮細胞の単層培養物は、血管新生のシミュレーションで毛細血管様の管に典型的に組織化されることはない。しかし、１９８０年、毛細血管内皮細胞の長期培養の成功に続いて（Ｆｏｌｋｍａｎ、Ｈａｕｄｅｎｓｃｈｉｌｄら、１９７９）、ウシまたはヒト毛細血管内皮細胞の２０〜４０日培養物がコンフルエント細胞単層上に２Ｄ細胞ネットワークを発生させたことが報告され、これは「インビトロ血管新生」と呼ばれるプロセスである（ＦｏｌｋｍａｎとＨａｕｄｅｎｓｃｈｉｌｄ １９８０）。ネットワークの内皮細胞は、「管腔」が、その上に細胞が組織化される「マンドレル」の内因的に合成されるネットワークであると解釈される原線維／アモルファス物質で充填された「管」のように見えた。その後の研究により、大血管由来の内皮細胞による（Ｍａｃｉａｇ、Ｋａｄｉｓｈら、１９８２； Ｍａｄｒｉ １９８２； Ｆａｄｅｒ、Ｍａｒａｓａら、１９８３）および基底膜タンパク質の展性水和ゲル（たとえば、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）ゲル）上に播種された内皮細胞による（Ｋｕｂｏｔａ、Ｋｌｅｉｎｍａｎら、１９８８）類似の２Ｄネットワーク形成が報告された。
【０００９】
血管発生の２Ｄモデルは今日依然として使用されている（Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）をベースとするアッセイ（Ｋｕｂｏｔａ、Ｋｌｅｉｎｍａｎら、１９８８）が市販されている）が、そのようなモデルには真の血管新生をよく表している以下の５つの特徴を欠いている。すなわち、
１．浸潤：２Ｄモデルの内皮細胞は細胞外マトリックス上にネットワークを形成し、細胞外マトリックスに潜り込む傾向をほとんど示さない（Ｖｅｒｎｏｎ、Ａｎｇｅｌｌｏら、１９９２； Ｖｅｒｎｏｎ、Ｌａｒａら、１９９５）。
２．方向性：２Ｄモデルでは、内皮細胞のネットワークは、予め位置決めした細胞のフィールド全体でほぼ同時にインビトロで形成されるが、インビボでの血管新生は、複数レベルの枝分かれにより分岐するフィラメント状の芽による細胞外マトリックスのベクトル浸潤を伴う。
３．正しい極性：２Ｄモデルは、毛細管に著しく類似する単細胞管を作る（Ｍａｃｉａｇ、Ｋａｄｉｓｈら、１９８２； Ｆｅｄｅｒ、Ｍａｒａｓａら、１９８３； ＳａｇｅとＶｅｒｎｏｎ １９９４）が、その極性は「裏返し」になっている、すなわち、２Ｄモデルは基底層物質をその管腔表面に沈着させ、その血栓形成表面を周囲の培地に外側に向けており（Ｍａｃｉａｇ、Ｋａｄｉｓｈら、１９８２； Ｆｅｄｅｒ、Ｍａｒａｓａら、１９８３）、これはインビボでの状況とは正反対である。
４．管腔形成：２Ｄモデルが開存性管腔をもつ内皮細胞（ＥＣ）管を生み出している証拠は弱い。典型的に、内皮細胞管は（外因性であれ細胞により合成されようと）細胞外マトリックスで充填されている「管腔」空間を有する（Ｍａｃｉａｇ、Ｋａｄｉｓｈら、１９８２； Ｍａｄｒｉ １９８２； Ｆｅｄｅｒ、Ｍａｒａｓａら、１９８３； ＳａｇｅとＶｅｒｎｏｎ １９９４； Ｖｅｒｎｏｎ、Ｌａｒａら、１９９５）。開存性管腔は、それが存在するところでは、通常、内皮細胞細胞質の厚い壁に隣接する細隙状のまたは狭い円筒空間のように見え、インビボでの毛細管を典型的に表す膨張薄壁内皮細胞管とは全く異なっている。
５．細胞特異性：２Ｄモデルでの細胞ネットワークは、非ＥＣ細胞型により実現されることがある機械的プロセスにより生み出される（Ｖｅｒｎｏｎ、Ａｎｇｅｌｌｏら、１９９２； Ｖｅｒｎｏｎ、Ｌａｒａら、１９９５）。実際、数学モデリングによれば、張力を展性のある２Ｄ細胞外マトリックス（内因的に合成されるものでも、供給される（たとえば、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）ゲル）ものでも）に適用することができるどんな接着細胞型も最適条件下でネットワークを生み出すことができることが明らかにされている（Ｍａｎｏｕｓｓａｋｉ、Ｌｕｂｋｉｎら、１９９６）、
である。
【００１０】
インビトロでの血管新生の三次元（３Ｄ）モデル
インビボでの血管新生は３Ｄ細胞外マトリックス内で起こると認識されているために、出芽がインビトロでの細胞外マトリックスの３Ｄゲル内で誘導される種々のモデルが生まれてきた。初期の３Ｄモデルでは、コラーゲンゲル内に分散された内皮細胞（Ｍｏｎｔｅｓａｎｏ、Ｏｒｃｉら、１９８３）は索および管のネットワークを形成した（ＥｌｓｄａｌｅとＢａｒｄ １９７２）。その内皮細胞管は正しい極性を示したが、浸潤および方向性という特徴が欠けていた（内皮細胞は細胞外マトリックス中に予め埋め込まれ、均一に分散されていた）。にもかかわらず、このアプローチは、管腔形成について（ＤａｖｉｓとＣａｍａｒｉｌｌｏ １９９６）および増殖因子に対する内皮細胞の応答について（Ｍａｄｒｉ、Ｐｒａｔｔら、１９８８； Ｍｅｒｗｉｎ、Ａｎｄｅｒｓｏｎら、１９９０； ＫｕｚｕｙａとＫｉｎｓｅｌｌａ １９９４； Ｍａｒｘ、Ｐｅｒｌｍｕｔｔｅｒら、１９９４； ＤａｖｉｓとＣａｍａｒｉｌｌｏ １９９６）の研究では有用であることが判明していた。
【００１１】
別のアプローチでは、３Ｄ凝固血漿中に埋め込まれた１ｍｍ切片（環）のラット大動脈は枝分かれした吻合する管を生み出した（Ｎｉｃｏｓｉａ、Ｔｃｈａｏら、１９８２）。大動脈環からの芽は、極性に加えて、血管新生様の浸潤および方向性を示した。ラット由来の大動脈環またはマウス由来の微小血管セグメントを利用する外殖片モデルを使用して、血管新生に対する腫瘍、増殖因子、種々の細胞外マトリックス支持体、および老化条件の影響が研究されてきた（Ｎｉｃｏｓｉａ、Ｔｃｈａｏら、１９８３； Ｍｏｒｉ、Ｓａｄａｈｉｒａら、１９８８； ＮｉｃｏｓｉａとＯｔｔｉｎｅｔｔｉ １９９０； Ｎｉｃｏｓｉａ、Ｂｏｎａｎｎｏら１９９２； ＶｉｌｌａｓｃｈｉとＮｉｃｏｓｉａ １９９３； Ｎｉｃｏｓｉａ、Ｂｏｎａｎｎｏら、１９９４； Ｎｉｃｏｓｉａ、Ｎｉｃｏｓｉａら、１９９４； ＮｉｃｏｓｉａとＴｕｓｚｙｎｓｋｉ １９９４； Ｈｏｙｉｎｇ、Ｂｏｓｗｅｌｌら、１９９６； Ａｒｔｈｕｒ、Ｖｅｒｎｏｎら、１９９８）。
【００１２】
精製された内皮細胞（単層または凝集体として）を誘導して、基礎をなすまたは周囲にある３Ｄ細胞外マトリックスゲル中に観血的に出芽させる種々のモデルが存在する（ＭｏｎｔｅｓａｎｏとＯｒｃｉ １９８５； Ｐｅｐｐｅｒ、Ｍｏｎｔｅｓａｎｏら、１９９１； Ｍｏｎｔｅｓａｎｏ、Ｐｅｐｐｅｒら、１９９３； ＮｅｈｌｓとＤｒｅｎｃｋｈａｈｎ １９９５； ＮｅｈｌｓとＨｅｒｒｍａｎｎ １９９６； Ｖｅｒｎｏｎ とＳａｇｅ １９９９； ＶｅｒｎｏｎとＧｏｏｄｅｎ ２００２）。これらのモデルそれぞれに、出芽形成の視覚化の難しさ、制限された出芽、薄片化のための必要条件、またはある種の内皮細胞に関する有効性の欠如を含む特定の限界がある。
【００１３】
ＷｏｌｖｅｒｉｎｅとＧｕｌｅｃは、腫瘍組織の断片をマトリックスに埋め込む３Ｄ血管新生システムを開示している（米国特許出願公開２００２／０１５０８７９Ａ１号）。微小血管の成長を特徴づけして、組織の血管新生能をアッセイすることができる。しかし、このアプローチでは、微小血管の管腔灌流が得られない。
【００１４】
Ｎｅｕｍａｎｎ（本特許の発明者）らは、２００３年、人口組織に包含することができる灌流微小血管をインビトロで作製する可能性を開示している。Ｎｅｕｍａｎｎらは、２００３年、微小血管を作製するため、収縮管により保持されたマンドレルとして１２７マイクロメートルナイロン釣り糸を使用することを教唆している。この血管は、寒天に埋め込まれたラット大動脈平滑筋細胞から作製された。これらの微小血管は、予備的な性質のもので、ヒト血管移植片を作製するのには適していなかった。
【００１５】
インビトロでの血管増殖の二次元モデルは、前で収載した血管新生をよく表す特徴を確立していないが、既存の３Ｄモデルはその特徴の一部または大半を再現している。重要なことに、現在利用できる３Ｄモデルのどれも、加圧流動循環液を含有する親血管を再構築しない。したがって、既存のインビトロ３Ｄモデルではどれを使用しても、血管増殖および形態形成に対する管腔圧力および流動の寄与についての研究は可能にならない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】米国出願第１１３８８９２０号
【特許文献２】米国特許出願公開２００２／０１５０８７９Ａ１号
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１７】
インビトロで灌流可能な微小血管のネットワークを作製するための方法が開示される。マトリックスからマンドレルを引き出し、マトリックスからチャネルを形成する。内壁を有するチャネル中に細胞を注入する。マトリックスをインキュベートして、細胞を内壁に付着させる。チャネルを灌流して未付着の細胞を取り除き、親血管を作り出し、ここで親血管はマトリックスにおいて細胞で裏打ちされた灌流可能な中空チャネルを含む。周囲にあるマトリックスゲル中に芽を作り出すように親血管を誘導して、その結果、微小血管ネットワークを形成する。微小血管ネットワークを、親血管を通る管腔灌流にさらす。
【００１８】
本開示は、３Ｄの細胞外マトリックス（ＥＣＭ）中で浸潤性管状微小血管芽を作製するための証明された方法と管腔流動の供給源となる組織工学による親血管の製作のための新規の方法論を組み合わせることにより、既存の血管新生モデルの限界を克服する方法およびシステムを提供する。灌流液を介して血管新生調節性化合物を、特定の標的受容体が存在することが分かっている内皮細胞の管腔表面に投与することができる。栄養液の管腔流動の存在により、インビトロでの毛細管の生存時間がかなり増加される。開示された血管新生システムを使用して、低酸素／高酸素、特定の可溶性生理活性化合物の試験、遺伝子改変細胞の使用、およびウイルストランスフェクションを介した遺伝子送達を含む種々の実験パラメータを評価することができる。そのシステムであれば、創傷修復、老化、癌、および粥状動脈硬化に関連して血管新生の研究が可能になる。重要なことに、本発明の教示に従ったモデルを適用すれば、生物工学により作製された人工組織に組み込むことができる完全に機能する血管系を提供できる可能性がある。
【００１９】
本開示は、微小血管を作製する、内皮細胞から微小血管を作製するおよびさらに大きな血管（たとえば、冠状動脈の大きさを有する）を作製するための多岐管設計を含むこれまでにない新規のアプローチも提供する。たとえば、微小血管ネットワークの作製のための方法を含むこれらのおよび他の重要な新技術は、後述する明細書および特許請求の範囲から明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】Ａ、Ｂ、Ｃは親血管作製の例を図式的に示す図である。
【図２】Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄは既知の熱収縮工程の例を図式的に示す図である。
【図３Ａ】取付け培養／灌流装置の既知の設計を図式的に示す図である。
【図３Ｂ】取付け培養／灌流装置の製造方法において使用する設計を図式的に示す図である。
【図４】Ａ、Ｂは培養／灌流装置のための多岐管の作製を図式的に示す図である。
【図５】Ａ、Ｂ、Ｃは、培養／灌流装置を微細加工するための別の設計を図式的に示す図である。
【図６】細胞播種法を図式的に示す図である。
【図７】２つのバイオ人工親血管間の毛細血管網の概略図である。
【図８ａ】平滑筋細胞の播種後の複数のマンドレルの例のインビトロ画像である。
【図８ｂ】灌流筋板の例を示す図である。
【図９】ＣＰＤの別の実施形態を図式的に示す図である。
【図１０】周囲にあるマトリックスへ芽を増殖させている単一親血管を示す図である。
【図１１】芽のネットワークを通して第２の親血管に繋がれた１つの親血管を示す図である。
【図１２】細胞をコラーゲンマトリックス中のチャネルに播種することにより親細胞を作製するための別の方法を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本明細書に提示する例は本発明の理解を助長するためのものである。例は説明的なものであり、本発明を例となる実施形態に限定するものではない。本発明の方法は、生理学的および病理学的血管増殖ならびに血管新生または血管新生抑制因子に応答した血管増殖の研究に有用である。他の有用な適用は、癌組織の血管新生能および抗血管新生薬への応答を評価する方法に対するものである。さらに、種々の創傷治癒装置を構築するために、および組織工学による構築物の血管新生のために本発明の方法を使用してもよい。
【００２２】
一例では、灌流可能な三次元微小血管ネットワークの作製のための方法および装置が開示される。本明細書で使用するように、「ＥＣ」とは内皮細胞のことであり、「ＳＭＣ」とは平滑筋細胞のことであり、「ＣＡＳ」とは冠状動脈代替物のことである。
【００２３】
一般に、微小血管ネットワークの培養と灌流のための装置は、中心に１つまたは複数のマンドレルを保持するチャンバーからなる（図１にもっともよく示される）。チャンバーは、どんな生体適合性材料からでも、いくつかの技術によって、たとえば、レーザー加工フレームをサンドイッチすることにより作製することができる。マンドレルは、それが退縮可能なようにチャンバー内で構築される。これは、たとえば、熱収縮によるように、マンドレルの末端を管に合わせることにより実現することができる（図２に明示する）。マンドレルの径は目的の血管内径に依存する。配置は、２Ｄまたは３Ｄにおける単一血管、２つの血管、または全列の血管までを収容するように変更することができる。マンドレルは、高分子繊維、ガラス繊維、ワイヤーなどの種々の材料のものでよい。
【００２４】
細胞をマンドレルの上に播種し、細胞を刺激してマンドレルの周囲に増殖させ、細胞が血管壁を形成し終わるとマンドレルを引き抜くことにより微小血管は作製される。次に、血管をマトリックス内に埋め込む。培養条件、マトリックスの組成物および血管新生刺激（たとえば、増殖因子）の存在に応じて、親血管は周囲にあるマトリックスに出芽する。芽は互いに吻合し、このようにして毛細血管網を形成する。マンドレルを取り外したのち、装置を灌流システムに繋ぎ、血管を管腔液体流動にさらす。
【００２５】
ここで図１Ａ、図１Ｂおよび図１Ｃに言及すると、親血管作製の例となる概略図が示されている。図１Ａは、装置本体３中の収縮管４により保持されたマンドレル２上に播種された、増殖培養液１００中の内皮細胞１を示している。図１Ｂは、細胞１が増殖し細胞スリーブ１０２の形に環状層を形成し終わったことを示している。図１Ｃは、増殖培養液１００で灌流されている細胞外マトリックス（ＥＣＭ）ゲル１１０中のマンドレル２の抜き出し後の細胞スリーブを示している。
【００２６】
本明細書に開示される方法は、組織工学的適用および研究モデルのための灌流可能なバイオ人工血管構造の工学的設計を含む。開示された方法の一般原則は、薄肉管または他の付属品にぴったり合わせた取り外し可能なマンドレル周囲の層での細胞の培養を含む。細胞層が目的の壁厚に到達した後は、マンドレルを取り外し、これにより作製されたバイオ人工血管（ＢＡＶ）は、灌流システムを用いて培養液、血液、血液代替物、または他の液体で灌流してもよい。開示された方法により、大量生産されたまたはオーダーメイドされた血管、インビトロで灌流される血管新生モデル、創傷治癒装置、組織成分、全組織および器官のほかにも研究モデルの作製が可能になる。
【００２７】
培養／灌流装置の製造
ここで図２Ａ、図２Ｂ、図２Ｃおよび図２Ｄに言及すると、既知の熱収縮工程の例となる概略図が示されている。図２Ａに具体的に示されるように、それぞれの培養／灌流装置（ＣＰＤ）は、支持フレーム１２により保持された１つまたは複数のマンドレル２を含んでいてもよい。目的の血管内径の径のマンドレル２が、その両末端を医療グレード収縮管セグメント４にぴったり入れて収まっている。マンドレル２は、模倣される血管の大きさにより、数マイクロメートルから数ミリメートルまでの径を有する生体適合性繊維（たとえば、高分子、ガラス、ワイヤーまたは同等物）を含んでいてもよい。一例では、光ファイバーを含む微小毛細血管をマンドレルとして用いた。
【００２８】
図２Ｂのさらに詳細な図に示されるように、それぞれの収縮管セグメント４の中央部分１４は、マンドレル２の１つの周囲で熱収縮される。続いて、図２Ｃに具体的に示されるように、マンドレル２が退縮され、管が切断される。図２Ｄは、マンドレルの両末端が、新たに切断され離された収縮管セグメント４により封入されるように、マンドレルの位置を変えた後の状態を示している。フレーム１２は種々の材料および技術を使用して作製してもよい。配置は、単一バイオ人工血管またはバイオ人工血管の列のいずれでも収容するよう変更してもよい。同様に、数面のマンドレル列を層状に重ねることにより、肉厚の灌流可能な組織を血管ネットワークで作製してもよい。
【００２９】
灌流チャンバーの機械加工
ここで図３Ａに言及すると、いくつかのマンドレル／収縮管集合体１１の灌流のための既知の装置が示されている。フレーム２０は、ポリカーボネートまたは同等の材料を都合よく圧延してもよい。分配チャンバー３０が設計図に含まれてもよく、これにより多くのバイオ人工血管の同時灌流が可能になる。マンドレル２を含む一組の糸の末端はシリコン管２３に集められる。
【００３０】
マイラーフレームのレーザー切断
ここで図３Ｂに言及すると、取付け培養／灌流装置の製造法で使用される新規の設計図が図式的に示されている。単一血管設計、ＣＰＤ７０は、２枚のレーザー切断Ｍｙｌａｒ（登録商標）フレーム２２間に熱収縮管に保持されたマンドレル２を挟むことにより都合よく作製してもよい。下に詳述される通りに構築された円筒状エポキシ樹脂多岐管２１は、マンドレル／収縮管集合体１１を保持するために都合よく使用してもよい。
【００３１】
マンドレル／収縮管集合体は、各マンドレルが各末端の２本の収縮管セグメント４’によりフレームウィンドウ７６中に吊るされるように粘着側が互いに押し付けられている、Ｍｙｌａｒ（登録商標）などのポリエステルフィルムまたは同類のものの２つのフレーム間に挟まれてもよい。少なくとも１本の細い安定化ワイヤー２６をフレーム２２に含むことにより、ならびに収縮管および少なくとも１本の細い安定化ワイヤー２６の周囲に、シリコーン管のモールドを使用して流し込まれる円筒状エポキシ樹脂多岐管内に封入することにより、２本の収縮管セグメント４’は安定化され補強される。２本の収縮管セグメント４’は、最終的にはＣＰＤ７０の流入ポートおよび流出ポートになる。
【００３２】
ここで図４Ａおよび図４Ｂに言及すると、培養灌流装置の多岐管の作製のための方法が図式的に示されている。図４Ａは、特に、たとえば、シリコーン管５０のスリーブを通して引っ張られる複数の収縮管／マンドレル集合体１１を示している。エポキシ接着剤４０が注入されてシリコーン管５０を詰め、硬化される。
【００３３】
図４Ｂは、特に、エポキシ接着剤４０が硬化しシリコーン管５０が切り開かれて取り外された後の状態を示している。硬化したエポキシロッド４４が残っている。エポキシロッド４４は、マンドレルが退縮された後に切断され、切断場所の後には収縮管により作製されたチャネル４２が残る。多くの収縮管の末端４６がまとめられて多岐管２１を形成してもよい。個々のＣＰＤまたはＣＰＤフレーム集合体のスタッキングを使用して３Ｄ血管列を作製することができる。
【００３４】
別の方法
ここで図５Ａ、図５Ｂおよび図５Ｃに言及すると、微細加工された培養／灌流装置の別の設計図が図式的に示されている。図５Ａは、特に、穿孔が収縮管の代わりになるスリーブ５６を有しているフレーム中の小穿孔５４を通じて取り込まれる一組のマンドレル２を示している。図５Ｂは、特に、フレーム壁５２中にはめ込まれた一組のマンドレル２を含む細胞播種前のＣＰＤを示している。
【００３５】
図５Ｃは、特に、微細加工された多岐管６４をフレーム５２の外側でスリーブ５６に取り付けてもよい、血管６２がある培養／灌流装置の別の例を示している。血管６２は本明細書で示す通りにマンドレル上で増殖され、マンドレルが取り外された後に残る。微小成形などの微細加工法は、そのようなＣＰＤフレーム集合体の大量生産のために使用してもよい。
【００３６】
血管作製および灌流
ここで図６に言及すると、細胞播種法が図式的に示されている。細胞播種のためのＣＰＤ７０を準備するために、ＣＰＤ７０は先ず洗浄され、次に紫外線殺菌される。無菌条件下で、ＣＰＤは表面、たとえば、ペトリ皿７２の底に固定される。次に、ＣＰＤフレーム集合体７０の内部ウィンドウ７６（図３Ｂに示されている）をラミニン１などの接着タンパク質を含有する溶液で満たす。１つまたは複数のスペーサー７７を必要に応じて使用してもよい。インキュベーション時間の後、接着タンパク質含有溶液を取り除き、次に、培養液中の目的の細胞型（たとえば、平滑筋細胞または内皮細胞）の懸濁液をＣＰＤ７０のウィンドウ７６に移す。
【００３７】
細胞播種は、一定量の細胞懸濁液をウィンドウに満たし、ＣＰＤフレーム集合体７０を逆さまにひっくり返し、このようにして懸滴８０を作り出すことにより実施してもよい。約４５分のインキュベーション時間中、多数の細胞がＣＰＤフレーム集合体内のマンドレル／収縮管集合体に付着することになる。過剰な細胞は懸滴の先端に沈むことになり、おそらく集めて破棄してもよい。次に、１つまたは複数のＣＰＤフレーム集合体を含有するペトリ皿を立位に戻し、ＣＰＤフレーム集合体が溢れるまで培養液で満たし、インキュベートする。一例でのインキュベーション条件は、３７℃で５％ＣＯ２の環境であった。マンドレル／収縮管集合体に付着した細胞は広がり増殖し、同心円状の単層（たとえば、内皮細胞）または厚さが１５０μｍおよびそれよりも多い多層（たとえば、平滑筋細胞）を形成する。
【００３８】
目的の壁形状または厚みで、マンドレルは引き抜かれ、それにより中空の細胞管を作り出す。もっと薄い壁は、マンドレルの引き抜きに先立って細胞スリーブの周囲に、たとえば、アガロース、コラーゲン、基底膜タンパク質のゲルなどのゲルを成形することにより、断裂から保護してもよい。次に、ＣＰＤフレーム集合体の多岐管は灌流システムに繋がれ、増殖培養液などの最適な液体で灌流される。
【００３９】
別の実施形態では、ヒト血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）由来の内皮「親」血管の作製のための方法は、以下の工程を含む：
培養装置を先ず洗浄し、次に３０分間、両側から紫外線暴露により無菌化する。無菌条件下で、装置を無菌条片でペトリ皿の底に固定する。
次に、装置の内部ウィンドウをラミニン１の接着タンパク質溶液で満たす（フィブロネクチン、フィブリン、またはゼラチンなどの他の接着タンパク質を代わりに使用することができる）。
一晩インキュベーション後、接着タンパク質含有溶液を取り除き、次に培養液中のヒト血管内皮細胞の懸濁液を装置のウィンドウに移す。
次に、ペトリ皿を逆さまにひっくり返し、このようにして装置のウィンドウに細胞培養懸濁液の懸滴を作り出す。細胞培養インキュベーター中（５％ＣＯ２、３７℃）での４５分間のインキュベーション時間後、多数の細胞が装置内のマンドレル／収縮管集合体に付着することになる。
次に、ペトリ皿を立位に戻し、装置が沈むまでヒト血管内皮細胞用の増殖培養液で満たす。
マンドレルに結合していない細胞は浮き上がり、吸引して破棄することができる。
次に、ペトリ皿をインキュベーター中（５％ＣＯ２、３７℃）に入れる。マンドレルに付着した細胞は広がり増殖し、ヒト血管内皮細胞の同心円状の単層を形成する。
次に、培養液をペトリ皿から取り除く。コラーゲン溶液を培養装置のウィンドウに満たし、固化させ、このようにしてマンドレルを細胞層で埋め込む。
ヒト血管内皮細胞がコラーゲンゲル中に芽を形成することになる。次に、マンドレルをゆっくり引き抜き、後にヒト血管内皮細胞の灌流可能な「親」微小血管が残る。
次に、装置の多岐管は灌流システムに繋がれ、ヒト血管内皮細胞増殖培養液で灌流される。
【００４０】
灌流システム
ＣＰＤは、灌流システムに線形様式でまたは循環様式のいずれで繋いでもよい。線形配置は、重力フローシステム、または市販のもしくは注文製の注射器ポンプを付けて作製してよい。注射器は灌流培養液で満たし、注射器ポンプに取り付け、ガス気密管を介してＣＰＤの上流末端に繋がれる。ＣＰＤは無菌条件下でインキュベーターに保存してもよいし、無菌細胞培養環境をＣＰＤ内に確立してもよい。ＣＰＤの下流多岐管は、灌流液を回収する末端貯蔵容器に繋がれる。循環システムを、蠕動ポンプを使用することにより作製してもよい。線形システムにも循環システムにもガス交換用の装置を取り付けてよい。ガス濃度、灌流圧、流量、温度、ならびに栄養分および代謝副産物の濃度は、センサーで測定する。集めたデータはフィードバックループに送ることもでき、目的のパラメータの厳格な制御を可能にする。
【００４１】
特定の適用
血管新生関連研究のためのモデル
ここで図７に言及すると、図７は、２つのバイオ人工親血管２００、２０２間の毛細血管網の概略図を示している。液体灌流液２０４は、「静脈」親血管２０２への流量（ｆ）を減少し、「動脈」親血管２００での抵抗（Ｒ）を増加することにより毛細管２０６を通して経路を変更される。したがって、灌流液２０４は圧力の高い血管から圧力の低い血管へ推進され、動脈末端から毛細血管床の静脈末端への自然な血流をシミュレートする。
【００４２】
血管新生研究のモデル開発、必要に応じて、創傷修復、老化、および癌、糖尿病、関節炎および乾癬の疾患における医薬品検査および研究のためにもマンドレル法を使用してよい。内皮細胞のみを、または内皮細胞、平滑筋細胞、および周皮細胞の組合せを使用して、親バイオ人工微小血管（ＢＭＶ）をミクロン径マンドレルの周囲で培養し、細胞外マトリックスの支持性ゲルに埋め込むことができる。次に、マンドレルを抜き出し、細胞外マトリックスゲル２１０内に親内皮細胞管を後に残すことになる。引き抜きは手動で、または自動装置を使用して、および極端に遅くから極端に速くまで変化する速度で実施してもよい。他のバリエーションには、凍結状態でのバイオ人工微小血管からのマンドレルの引き抜き、温度応答性ポリマーでのマンドレルのコーティング、またはマンドレルのどちらかの末端を引っ張って、それにより断裂までマンドレルを細くすることが含まれてもよい。
【００４３】
周囲にあるゲル２１０への親血管の出芽は、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、およびホルボール１２−ミリステート−１３−アセテート（ＰＭＡ）などの化合物により誘導され、これらの化合物はゲルおよび／または灌流液（たとえば、増殖培養液）に添加される。
【００４４】
複合毛細血管網２２２は、２つの隣接する親バイオ人工微小血管間に圧力差を確立し、それにより動脈および静脈血流を模倣することにより作製してもよい。次に、液体流は、「動脈」バイオ人工微小血管から相互接続された芽を通って「静脈」バイオ人工微小血管へと再誘導される。
【００４５】
灌流液は、血清および血管新生または血管新生抑制物質がない酸素添加細胞増殖培養液を有利に含んでいてもよい。別の例では、灌流液は、血清および／または血管新生影響化合物を補充した酸素添加細胞増殖培養液であってもよい。さらに別の例となる実施形態では、灌流液は酸素添加生理食塩水であってもよい。別の例では、灌流液は、酸素添加血液、血液成分、または代用血液を含んでいてもよい。さらに別の例となる実施形態では、灌流液は酸素添加でなくてもよく、システムの酸素添加は、マトリックスを介する拡散により実現される。さらに別の例となる実施形態では、血管新生または血管新生抑制化合物を灌流液に添加してもよい。
【００４６】
一例となる実施形態では、血管新生および血管新生抑制化合物などが、マトリックスに添加される。さらに別の例となる実施形態では、細胞は、灌流液へまたはマトリックスへ産物を放出する遺伝子改変細胞を含む。さらに別の例となる実施形態では、マトリックスは、フィブリン、コラーゲン、基底膜マトリックスおよびゼラチンを有利に含んでいてもよい。有用なマトリックスの一種は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）ゲルである。別の例となる実施形態では、マトリックスは、寒天、アガロース、アルギン酸、またはシリカゲルを含んでいてもよい。
【００４７】
一例となる実施形態では、細胞は、内皮細胞、平滑筋細胞、周皮細胞、ヒト細胞、動物細胞、植物細胞、幹細胞、筋肉細胞、肝細胞、腎細胞、肺細胞、皮膚細胞、上皮細胞および遺伝子改変細胞からなるグループから選択してもよい。同様に、マトリックスには、マトリックス全体に分散されても、または局所的に集中していても、内皮細胞、平滑筋細胞、周皮細胞、ヒト細胞、動物細胞、植物細胞、幹細胞、筋肉細胞、肝細胞、腎細胞、肺細胞、皮膚細胞、上皮細胞および遺伝子改変細胞からなるグループから選択される細胞が存在していてよい。いくつかの場合、健常組織または癌組織などの疾患組織の断片がマトリックスに埋め込まれている。
【００４８】
親血管からの出芽は、切片材料においてまたは全載調製物において、インビトロで顕微鏡的に調べてもよい。バイオ人工微小血管に蛍光溶液（たとえば、蛍光デキストラン）を灌流すれば、芽径、芽管腔の開存性、および吻合の程度の分析に役立つ。芽形態の３Ｄ再構築は、共焦点顕微鏡により撮られる落射蛍光像のＺ軸スタッキングにより実施してもよい。芽２２０による細胞周囲基底膜マトリックスの合成は、抗ラミニンおよびＩＶ型コラーゲン一次抗体ならびに蛍光またはペルオキシダーゼタグ付き二次抗体で免疫標識することにより、全載においておよび組織（パラフィン）切片においてモニターしてもよい。
【００４９】
複合ＥＣ／ＳＭＣ芽では、２つの細胞型間の空間関係は、ヒトＣＤ３１（クローンＰ２Ｂ１、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）に対するＦＩＴＣモノクロナール抗体（ＭＡｂ）またはＦＩＴＣ−ＵＥＡ１アグルチニン、すなわちヒト内皮細胞に特異的マーカーで内皮細胞を標識することにより調べてもよい。平滑筋細胞に、ヒトアルファＳＭアクチンに対するＭＡｂを、続いてＲＩＴＣ抗マウス二次抗体を標識してもよい。内皮細胞と平滑筋細胞間の管腔構造および相互作用の詳細は、上述の試薬で標識したパラフィン切片から入手してもよい。
【００５０】
記載する作製法は、高再現性での血管新生装置の商業的大量生産の基礎である。適切に保存すれば（たとえば、クリオ保存）、増殖前親血管または全毛細血管網は、すぐに使える形で研究者が入手できるようになると考えられる。
【００５１】
冠状動脈代用物
冠状動脈代用物の作製のために、内径がほぼ４ｍｍから５．５ｍｍの血管管腔を有する冠状動脈代用物を生じるように外径が選択されたマンドレル。代わりに、マンドレルは、灌流され、冠状動脈代用物の増殖期間中に栄養素とガスの交換を可能にするくらいの透過性のある中空管でもよい。冠状動脈代用物は、平滑筋細胞からのみ増殖されて、このようにして血管中の中間層に類似する構造物を提供するか、または、２つもしくは３つの細胞型から複合構造物として作製されてもよい。
【００５２】
平滑筋細胞はマンドレル上に播種されて、３００〜５００μｍの環状層にまで増殖される。冠状動脈代用物の作製を迅速化するため、細胞を初期増殖期中に高度に増殖性の表現型にして、次に血管壁が目的の厚さに達した後は分化状態に転換するようにＳＭＣ表現型を操作してもよい。表現型転換のために、平滑筋細胞は劇的にその増殖速度を落とし、血管の機械的性質に影響を与える、コラーゲンおよびエラスチンなどの細胞外マトリックスタンパク質の作製を誘導することになる。表現型転換は、ある種の遺伝子の発現を制御することにより実現してもよい。たとえば、テトラサイクリン応答性プロモーターの助けを借りて、遺伝子発現（たとえば、エラスチンの）は、血管壁が目的の厚さに達してしまうまで抑制されてもよい。次に、増殖培養液からテトラサイクリンを除けば、挿入遺伝子が活性化されることになる。たとえば、エラスチンが過剰発現されたら、それ以上の細胞増殖は阻害され、血管壁内で構造的およびシグナル伝達機能が発揮されることになる。機械的条件付け、たとえば、脈動流を使用して、冠状動脈代用物を強化し、細胞の生理的整列化を誘導してもよい。他の外部のまたは内部の「表現型転換」も同様に潜在的に使用してよい。
【００５３】
内皮細胞は、マンドレルを取り除いた直後に、または平滑筋細胞の条件付けおよび再構築後に、ＳＭＣスリーブ内に播種してもよい。内皮細胞播種は、内皮細胞懸濁液をＳＭＣスリーブに注入することにより実施してもよい。次に、内皮細胞を適切に付着させる期間流動を停止させる。必要であれば、内皮細胞の均等な分配を促進するために血管を回転させる、または繰り返し上下をひっくり返してもよい。
【００５４】
代わりに、内皮細胞を最初にマンドレル上に播種してもよい。その場合、平滑筋細胞は、コンフルエント内皮細胞層上に播種される。この方法では、酸素と栄養素がより豊富にある冠状動脈代用物の周辺に向かって内皮細胞が遊走するのを防ぐことが必要になる。
【００５５】
必要に応じて、線維芽細胞をＳＭＣスリーブの外側に播種すれば、外膜層を作製することができる。
【００５６】
冠状動脈代用物を作製するための細胞は、自己、非相同、または異種材料由来でもよい。細胞は、幹細胞、前駆細胞、または分化細胞でもよい。細胞は、特定の表現型を実現するために、または宿主生物の免疫応答を弱めるために遺伝子改変されてもよい。
【００５７】
本明細書に開示するＣＰＤ法は、大量生産のすぐに使える血管代用物、またはレシピエントのために注文設計される血管代用物に対する選択肢を提供する。本明細書に開示するＣＰＤ法は、冠状動脈代用物の組織工学のためのモデル開発に、アテローム発生、動脈形成の研究に、異なる血管細胞型の互いの相互関係および細胞外マトリックス成分との相互関係の研究に、一酸化窒素の効果に関する研究に、ならびに種々の医薬品の研究にも適している。
【００５８】
異なる大きさまたは種類の血管およびリンパ管
本明細書に開示するＣＰＤ法を使用して、冠状動脈以外の径と種類の血管を作製してもよい。マンドレルの径を変えれば、血管の径も変わることになる。血管の種類（動脈、静脈、リンパ管）は、細胞の表現型、および／または細胞の増殖が阻害される時点によって変えてもよい。たとえば、静脈はわずかな平滑筋細胞層のみを含有する。
【００５９】
他の管状様組織
本明細書に開示するＣＰＤ法は、胆管、涙管、耳管、卵管、輸精管、尿管、尿道、肺気道、等などの他の管状組織の工学のために使用してもよい。本明細書に開示するＣＰＤ法は、神経増殖および修復の誘導のための、グリア細胞を含む異なる細胞型からの神経導管の作製にも有用であることが判明する可能性がある。
【００６０】
工学的に操作された組織のためのＢＡＶシステム
本明細書に開示するＣＰＤ法は、取り外し可能なマンドレルの列をスカフォールドとして使用することにより、組織および器官の工学のために使用してもよい。目的の組織／器官（筋肉、肝臓、腎臓、肺、皮膚、等）の細胞は、接着タンパク質被膜マンドレル上に播種される。これらのマンドレルは、固形線維もしくはワイヤーから、または、代わりにセルロースなどの灌流可能な透過性管から作製してもよい。マンドレルは、単一の細胞スリーブを合併させる正確な間隙をおいて互いに分離される。この方法を使用して、シート状またはブロック状の組織を形成してもよい。次に、マンドレルを引き抜いて（または、別々に取り除いて）、バイオ人工組織は、灌流システムを用いて内部で灌流される。
【００６１】
創傷治癒装置
製造前バイオ人工血管システムを使用して、糖尿病患者の慢性潰瘍のためなどの創傷治癒に役立ててもよい。バイオ人工毛細血管網を（たとえば、細胞外マトリックスゲルから、血管新生増殖因子で強化された）パッチ状の支持材料に埋め込み、創傷上に置くことができる。酸素添加栄養溶液を自律的に灌流すれば、バイオ人工血管はドーナーの脈管構造および皮膚の出芽を促進すると考えられる。代わりに、そのようなバイオ人工血管パッチを創傷と植皮間に挟み込めば、移植片の内殖を促進することができると考えられる。
【００６２】
遺伝子治療装置
バイオ人工血管は、植込み式薬剤送達装置に使用することができると考えられる。細胞は、患者から採取して、インビトロで遺伝子改変すれば、ある種のタンパク質（ホルモン、酵素、等）を産生することができると考えられる。次に、これらの細胞を、上述の方法を使用して、バイオ人工血管または血管網に増殖させてもよい。宿主に再移植すれば、細胞は標的物質を産生し、局所的にまたは全身的にその物質を放出し続ける。
【００６３】
人工組織および器官
組織工学による血管網は、上記のように、組織の作製または全臓器の作製のためにも使用してよい。１つのアプローチは、１つまたは複数のインビトロ灌流親血管を作製することである。目的の組織または器官由来の間質細胞を、たとえば、ゲル中の親血管の周囲に播種する。間質細胞は、親血管を介して栄養分と酸素を供給される。間質細胞が増殖すると、栄養分と酸素への要求が増加する。細胞は血管新生因子を放出し、血管を出芽するように刺激する。自然増殖にきわめて類似して、組織が成長するに従って血管系は、同一速度で出芽する。したがって、このシステムは発生生物学の研究のための優れたモデルにもなると考えられる。
【００６４】
別のアプローチは、間質細胞の足場として平行配列のマンドレルを利用する。間質細胞が増殖するに従って、細胞層がマンドレル周囲に形成される。最終的に、すべてのマンドレル間の空間は間質細胞で満たされ、シート状の組織ができる。マンドレルを取り除くと、マンドレルにより後に残されるチャネル内を通ってその組織は灌流されてもよい。それらのチャネルは、管腔播種を通じて内皮細胞で被覆することができる。このアプローチは２Ｄに限定されるものではない。いくつかのシートをスタッキングしてもよいし、３Ｄ足場を使用してもよい。本明細書の発明者は、筋肉組織の工学のために２Ｄアレイも３Ｄアレイも使用した。
【００６５】
さらに別のアプローチでは、組織の層および血管網の層を独立して作製し、その後間欠的にスタッキングすることができると考えられる。これらのアプローチはすべて、１つまたは２つの細胞型で単純なモデルでも、またはいくつかの細胞型で構成されたかなり複雑な構築物でも作製することができる。
【００６６】
移植すると、これらの方法で工学的に操作された組織または器官を、直接血流に繋ぐことも、または宿主脈管構造が移植片に成長してしまうまで灌流システムにより灌流させておくこともできると考えられる。
【００６７】
灌流組織工学的に操作された筋肉構築物の例
ここで図８ａに言及すると、平滑筋細胞を播種した後の複数のマンドレルの例のインビトロ画像が示されている。複数のマンドレルと収縮管ユニットＭは、Ｍｙｌａｒ（登録商標）フレームに挟み込んだ。マンドレルＭ間の距離はほぼ１００μｍに調整した。収縮管セグメントの末端は、１つの上流多岐管と１つの下流多岐管に結合させた（示されていない）。Ｍｙｌａｒフレームは無菌化し、管腔被膜し、５×１０６ラット大動脈平滑筋細胞ＳＭ（ＲＡＳＭＣ）／ｍｌの懸濁液を播種した。細胞ＳＭは、個々のマンドレルＭそれぞれに付着し、増殖し、このようにして環状層を形成した。１０日後、個々の層が合併し終わり、１つの厚いシート状のまたはプレート状の平滑筋細胞を生じた。増殖培養液中にさらに７日間置いた後、培養液にはもう７日間、５０Ｕ／ｍｌヘパリンを補充した。その後、マンドレルはすべて引き抜き、組織は、１０ｍｌ／日の速度でヘパリン培養液で灌流した。灌流チャンバーは、ヘパリン培養液で満たした１００ｍｍペトリ皿の底に固定したままにした。ＳＭＣプレートは１１日間灌流した。その時間を過ぎても、チャネルＣＨは機能的なままであり、依然としてインビトロではっきりと目に見えた（図８ｂにもっともよく示されている）。
【００６８】
ここで図８ｂに言及すると、灌流筋肉プレートＭＰの例が示されている。管末端（Ｔ）を通って、引き抜かれたマンドレルにより後に残されたチャネル（ＣＨ）中へと灌流される液体が示されている。
【００６９】
ここで図９に言及すると、ＣＰＤの別の実施形態が図式的に示されている。一例では、ＣＰＤ９００は、第１スライドガラス９０４と第２スライドガラス９２０間に並置された層９０２を含む。層９０２は、チャネル９２２に繋がれた複数の液体ポートを埋め込むのに適した厚みがある。複数の液体ポートは、細胞懸濁液ポート９１４、複数の入口ポート９１２、および複数の出口ポート９１８を含む。チャネル９２２により繋がれて液体の通過および分配を可能にするポートは、同じように機能する。ポート９１２などの複数のポートは、複数のアクセスポイントを提供するように配置されている。他の適用では、液体チャンバーおよびポートがマイクロ流体材料で作製されるマイクロ流体設計を有利に用いてもよい。同様に、この層は、顕微鏡またはマイクロ流体適用において使用するのに適したシリコーンまたは他の材料を含んでいてもよい。コラーゲンチャンバー９０６は、対になった中空柔軟毛細管９１６によるアクセスのために有利に位置している。用いる毛細管の数は、ＣＰＤの大きさおよび作製されている血管の数が収容する可能性のある１つから２つよりかなり多い数の範囲でよい。複数のポートおよびチャンバーのそれぞれには、注射器ポンプが針を有する注射器に取り付けられている管入口９４０Ａ、９４０Ｂを通って１本または複数の注射器ポンプにより層を通ってアクセスしてもよい。図面を簡略化するために２つの注射器ポンプ管入口９４０Ａ、９４０Ｂのみが示されているが、場合によっては、別々の注射器ポンプ、注射器または同等物をそれぞれのチャンバーおよび／もしくはポート中に材料を注入するまたは抽出するために使用してよいことが理解されるであろう。一実施形態では、注射器ポンプはガス気密注射器に連結される。
【００７０】
別の実施形態ＣＰＤ９００の特徴を記載したので、ＣＰＤを構築するための１つの方法をここで記載すれば、本発明の理解に役立つであろう。層９０２にシリコーン層を用いる一例では、穴およびチャネルのパターンを、粘着上層９４３および粘着下層９４５で覆われたシリコーン層に打ち込む。次に、中空針をシリコーン中に刺し込み、その後この針を使用して、ポリミド被膜融合シリカ毛細管９１６をコラーゲンチャンバー９０６に、および入口ポート９１２の１つにもガイドする。２本の毛細管は、小口径管９１０により保持されて、主チャンバーから出口ポート９０８に通じる。次に、シリコーン層９０２は、粘着層の助けを借りて２枚のスライドガラス間内に挟み込まれる。その後、ＣＰＤ９００は、使用するまで加圧減菌されて、保存される。血管作製のためにチャンバー９０６の準備をするためには、コラーゲン溶液を調製し、注射針を通してコラーゲンチャンバー９０６に直接注入し、インキュベーター内で一晩ゲル化させる。次に、注射針を２つの入口ポートに差し込むことにより、ＣＰＤ９００を注射器ポンプに繋ぐ。
【００７１】
注射針は、今度はガス気密管に繋がれ、この気密管はｐＨを十分に調整した増殖培養液で満たされ、注射器ポンプに取り付けられた２つのガス気密注射器に通じている。２つの出口ポート９０８Ａ、９０８Ｂは、類似の様式の廃棄物貯蔵場所に繋がれる。注射器ポンプは、ここでは灌流ポンプとして機能するが、次に作動させると、それにより入口ポートを満たし、順次、入口ポート、毛細管および出口ポートをプライミングする。空気をすべてシステムから押し出すと、各毛細管はピンセットにつかまれ、コラーゲンチャンバーにまで伸びる末端は、毛細管の末端のみがマトリックスチャンバーまで伸びるまで、コラーゲンゲル中を引き戻される。この手順を使用して、２つの灌流可能なチャネルがコラーゲンゲル内に作製される。コラーゲンチャネル内に細胞を播種するためには、高濃度の内皮細胞懸濁液を、細胞懸濁液用のポートに注入する。次に、注射器ポンプを止め、その後毛細管のもう１つの末端を、細胞を含有する小さな貯蔵場所９１４Ｒに引き戻すと、多数の細胞がコラーゲンチャネルに直接流入する。細胞の流速は、廃棄物貯蔵場所の高さにより厳密に制御することができる。次に、細胞をコラーゲンチャネルの壁に付着させるためにＣＰＤを４５分間インキュベーターに入れる。ＣＰＤは、細胞を最適に分配するように数回ひっくり返すか、または他の方法で操作することができる。最後に、毛細管を細胞貯蔵場所から、入口ポートの一部である貯蔵場所にまで引き出し、注射器ポンプを作動させて目的の灌流速度に設定する。過剰な細胞は洗い流す。この播種法により、増殖のための時間を与えた後、細胞の相同単層をもつ２つの親血管が生じるが、そこで必要な時間は管に注入される細胞数が高濃度であるほど短くなる。マンドレルは、使用されるマンドレルの種類によって、抜き出しおよび／または分解によりマトリックスから取り除いてもよいことに注意されたい。
【００７２】
ここで図１０に言及すると、周囲にあるマトリックス１０５４中に芽１０５２を増殖している単一親血管１０５０が示されている。ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）がコラーゲンチャネル内に播種されると、そのようにして作製された親血管はコラーゲン中に出芽し始める。これらの芽は伸長して分岐し始める。これらの分岐は最終的には、反対の親血管からの分岐と吻合し、このようにして血管網を形成する。
【００７３】
ここで図１１に言及すると、ネットワークの芽１１０６を通じて第２の親血管１１０４に繋がれた第１の親血管１１０２が示されている。芽１１０６は管腔を有し、灌流されている。
【００７４】
親血管を作製するためのプロトコル
ここで図１２に言及すると、コラーゲンマトリックス内のチャネルに播種することにより親細胞を作製するための別の方法が示されている。シリコーン層を使用した別のＣＰＤは記載済みなので、当業者による本開示の理解を促進するために、微小血管システムを作製するための適用の具体例をここで記載することにする。
【００７５】
ＣＰＤは加圧減菌器で無菌化され、使用するまで無菌環境に保存される。コラーゲン溶液を調製し、氷上で保存する。コラーゲンは小型の注射器に充填される。注射器に３０Ｇ注射針を取り付け、チャンバーがコラーゲン１００２で完全に満たされるまで、コラーゲン溶液をコラーゲンチャンバーに注射針を通して注入する。第２の注射針を、空気吹き出し口としてチャンバーの反対側から注入する。
【００７６】
次に、注射針を２つの入口ポート１００４に注入することにより、ＣＰＤを注射器ポンプに繋ぐ。注射針は、今度はガス気密管に繋がれ、この気密管はｐＨが十分に調整された増殖培養液で満たされ、注射器ポンプに取り付けられた２つのガス気密注射器に通じている。２つの出口ポートは、類似の様式の廃棄物貯蔵場所（すなわち、出口ポートに注射針が注入され、管が廃棄物貯蔵場所に通じている）１００６に繋がれる。
【００７７】
注射器ポンプを灌流ポンプとして作動させ、それによって入口ポートを満たし、順次、入口ポート、毛細管、および出口ポート１００８をプライミングすることにより、ＣＰＤを灌流させる。空気がすべてシステムから押し出されると（たとえば、取り外し可能な空気吹き出し口として働く小径注射針を通して）、次に各毛細管はピンセットにつかまれ、コラーゲンチャンバーにまで伸びる末端は、毛細管の末端のみがチャンバーまで伸びるまで、コラーゲンゲル中を引き戻される。この手順を使用して、２つの灌流可能なチャネルがコラーゲンゲル１０１０内に作製される。
【００７８】
コラーゲンチャネル内に細胞を播種するために、高濃度の内皮細胞懸濁液は細胞懸濁液用のポート１０１２に注入される。次に、注射器ポンプを止め、その後毛細管のもう一方の末端は、入口ポートから細胞を含有する小さな貯蔵場所に引き戻され、多数の細胞が毛細管を通ってコラーゲンチャネル１０１４に直接流入する。細胞の流速は、背圧（廃棄物貯蔵場所の高さ）により厳密に制御することができる。次に、毛細管は入口ポートに繋がれている貯蔵場所にさらに引き戻される。
【００７９】
次に、細胞をコラーゲンチャネル１０１６の壁に付着させるためにＣＰＤを４５分間インキュベーターに入れる。ＣＰＤは、細胞を最適に分配するように数回ひっくり返すか、または他の方法で操作することができる。
【００８０】
最後に、注射器ポンプを作動させて目的の灌流速度１０２０に設定する。過剰な細胞は洗い流す。この播種法により、細胞の相同単層をもつ２つの親血管１０２２が生じる。上記のように親血管を灌流することにより、１つまたは複数の微小血管ネットワークを作製してもよい。
【００８１】
代わりに、親血管を作製するための手順は、図１Ａ〜１Ｃおよびその他を参照して、コラーゲンマトリックス内にマンドレルを埋め込み、マンドレルを抜き出し、マンドレルにより後の残されるチャネルに細胞を注入し、ほかにも上記のマンドレル上に細胞を播種することも含んでもよい。この２つの方法を組み合わせれば、異なる細胞型の層状化が可能になる。
【００８２】
本発明は、特許法に従って、当業者に本発明の新規の原理を適用して、必要とされるような例となり特殊な成分を構築し使用するのに必要な情報を提供するために、本明細書においてかなり詳細に記載されている。しかし、本発明は、明確に異なった設備、および装置および再構成アルゴリズムにより実施してもよいこと、ならびに設備の細部と操作手順の両方に関して、本発明の真の精神と範囲から逸脱することなく種々の改変を実現してもよいことは理解されるべきである。
【００８３】
本明細書に引用されたすべての参考文献の完全な開示物は、参照により本明細書に組み込まれているものとする。しかし、他の方法では妥協できない争いが生じた場合は、本明細書が効力をもつものとする。
【技術分野】
【０００１】
連邦支援研究に関する陳述
本発明は、ＮＩＨ国立心臓、肺および血液研究所により与えられた認可番号１Ｒ２１ ＨＬ０８１１５２−０１の下で政府支援を得て行われた。政府は本発明においてある種の権利を有する。
【０００２】
関連出願
本出願は、「灌流可能な微小血管システムを作製するための方法」という表題の、２００６年３月２４日に出願されたＮｅｕｍａｎｎの同時係属米国出願第１１３８８９２０号の優先権を主張し、その一部継続出願である。Ｎｅｕｍａｎｎの米国出願第１１３８８９２０号は参照により本明細書に組み込まれている。
【０００３】
本発明は、生理学的および病理学的血管増殖ならびに血管新生因子または血管新生抑制因子に応答した血管増殖の研究のための方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
血管増殖の正常なプロセス（たとえば、月経周期、胎盤形成、肥満症における変化、創傷修復、炎症）の間で、新たな血管の形成は調節されており最終的に停止する。重大なことに、血管増殖の調節解除は病態の決定的要素である。たとえば、腫瘍増殖、糖尿病性網膜症、関節炎、および乾癬は、病的状態の直接の一因となる血管の過剰増殖を伴う。これとは対照的に、高齢者に特徴的な血管増殖の機能障害は、創傷治療および外傷または疾患により虚血性になった組織の血行再建を損なう。したがって、新たな血管の構築を指示する機序および血管増殖を開始および停止するプロセスを理解することは、疾患における血管新生を制御する戦略の開発に重要である。
【０００５】
新たな血管の増殖（血管新生）中、毛細管および後毛細管細静脈、すなわち血管系の最小枝の管腔の内側を覆う内皮細胞から芽が生じる。血管新生は複雑な多段階プロセスである。血管新生についての発表された研究は数が何千にも達するが、血管新生増殖および形態形成を媒介し調節する細胞機構についての理解は不十分である。
【０００６】
血管新生出芽の詳細は、大半の組織が不透明であるために、インビボにおける「リアルタイム」での観察は困難である。組織切片は３Ｄでの再構築が困難であり、血管増殖の動的性質を伝えない。さらに、血管新生芽の先端付近の領域、すなわち、血管湿潤および形態形成の制御のきわめて重要な領域は組織切片で見つかることはめったにない。従来の組織学的検査の限界を克服するために、インビトロおよびインビボにおける種々の血管新生の「モデル」が開発されてきた。
【０００７】
インビボでの血管新生モデル
生体組織の不透明性を回避するために、研究者らは両生類幼虫の天然に透明な尾部を含む生きた動物の「窓」（ＣｌａｒｋとＣｌａｒｋ、１９３９）、あるいはウサギの耳（ＣｌａｒｋとＣｌａｒｋ、１９３９）、マウスの皮膚（Ａｌｇｉｒｅ、Ｃｈａｌｋｌｅｙら、１９４５）およびハムスターの頬袋（ＧｒｅｅｎｂｌａｔｔとＳｈｕｂｉ、１９６８）に植え込まれた、またはウサギの角膜ポケット（Ｇｉｍｂｒｏｎｅ、Ｃｏｔｒａｎら、１９７４）もしくはニワトリ絨毛尿膜（Ａｕｓｐｒｕｎｋ、Ｋｎｉｇｈｔｏｎら、１９７４）から開発された特殊な観察室を通じて血管新生を観察してきた。これらの初期の大部分が記述的な研究から、腫瘍誘導血管走化性の中核的パラダイムの確証および血管増殖を促進する拡散性腫瘍由来分子の対応する発見が生まれた。インビボでの血管新生の新しいアッセイでは、げっ歯類の皮下に植え込まれたゲル状基底膜タンパク質の重合体スポンジまたはプラグへの血管内殖が測定される（Ｐａｓｓａｎｉｔｉ、Ｔａｙｌｏｒら、１９９２； Ａｎｄｒａｄｅ、Ｍａｃｈａｄｏら、１９９７； Ａｋｈｔａｒ、Ｄｉｃｋｅｒｓｏｎら、２００２； Ｋｏｉｋｅ、Ｖｅｒｎｏｎら、２００３）。そのすべての優雅さの割に、インビボでのアプローチは、（１）動物による血管新生応答の種内変動；（２）ある種から別の種への結果の移行の欠如；（３）動物の購入および維持の高コスト；（４）研究目的のための動物使用に対する国民の不支持；および（５）動物手術ならびに結果の視覚化および評価において直面する複雑さによって困難になる。
【０００８】
インビトロでの血管新生の二次元（２Ｄ）モデル
血管新生の分子力学を理解することを目指して、大血管から単離した内皮細胞が、血管の内膜をシミュレートするコンフルエントな舗道様単層を形成するまで平皿で培養された（Ｊａｆｆｅ、Ｎａｃｈｍａｎら、１９７３； Ｇｉｍｂｒｏｎｅ １９７６）。大血管中の内皮障害に対する増殖応答のモデルとしては有用であるが（Ｇｉｍｂｒｏｎｅ、Ｃｏｔｒａｎら、１９７４； Ｆｉｓｈｍａｎ、Ｒｙａｎら、１９７５； ＭａｄｒｉとＳｔｅｎｎ １９８２； ＭａｄｒｉとＰｒａｔｔ １９８６； Ｊｏｚａｋｉ，Ｍａｒｕｃｈａら、１９９０； Ｒｏｓｅｎ、Ｍｅｒｏｍｓｋｙら、１９９０）、硬い基層上の内皮細胞の単層培養物は、血管新生のシミュレーションで毛細血管様の管に典型的に組織化されることはない。しかし、１９８０年、毛細血管内皮細胞の長期培養の成功に続いて（Ｆｏｌｋｍａｎ、Ｈａｕｄｅｎｓｃｈｉｌｄら、１９７９）、ウシまたはヒト毛細血管内皮細胞の２０〜４０日培養物がコンフルエント細胞単層上に２Ｄ細胞ネットワークを発生させたことが報告され、これは「インビトロ血管新生」と呼ばれるプロセスである（ＦｏｌｋｍａｎとＨａｕｄｅｎｓｃｈｉｌｄ １９８０）。ネットワークの内皮細胞は、「管腔」が、その上に細胞が組織化される「マンドレル」の内因的に合成されるネットワークであると解釈される原線維／アモルファス物質で充填された「管」のように見えた。その後の研究により、大血管由来の内皮細胞による（Ｍａｃｉａｇ、Ｋａｄｉｓｈら、１９８２； Ｍａｄｒｉ １９８２； Ｆａｄｅｒ、Ｍａｒａｓａら、１９８３）および基底膜タンパク質の展性水和ゲル（たとえば、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）ゲル）上に播種された内皮細胞による（Ｋｕｂｏｔａ、Ｋｌｅｉｎｍａｎら、１９８８）類似の２Ｄネットワーク形成が報告された。
【０００９】
血管発生の２Ｄモデルは今日依然として使用されている（Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）をベースとするアッセイ（Ｋｕｂｏｔａ、Ｋｌｅｉｎｍａｎら、１９８８）が市販されている）が、そのようなモデルには真の血管新生をよく表している以下の５つの特徴を欠いている。すなわち、
１．浸潤：２Ｄモデルの内皮細胞は細胞外マトリックス上にネットワークを形成し、細胞外マトリックスに潜り込む傾向をほとんど示さない（Ｖｅｒｎｏｎ、Ａｎｇｅｌｌｏら、１９９２； Ｖｅｒｎｏｎ、Ｌａｒａら、１９９５）。
２．方向性：２Ｄモデルでは、内皮細胞のネットワークは、予め位置決めした細胞のフィールド全体でほぼ同時にインビトロで形成されるが、インビボでの血管新生は、複数レベルの枝分かれにより分岐するフィラメント状の芽による細胞外マトリックスのベクトル浸潤を伴う。
３．正しい極性：２Ｄモデルは、毛細管に著しく類似する単細胞管を作る（Ｍａｃｉａｇ、Ｋａｄｉｓｈら、１９８２； Ｆｅｄｅｒ、Ｍａｒａｓａら、１９８３； ＳａｇｅとＶｅｒｎｏｎ １９９４）が、その極性は「裏返し」になっている、すなわち、２Ｄモデルは基底層物質をその管腔表面に沈着させ、その血栓形成表面を周囲の培地に外側に向けており（Ｍａｃｉａｇ、Ｋａｄｉｓｈら、１９８２； Ｆｅｄｅｒ、Ｍａｒａｓａら、１９８３）、これはインビボでの状況とは正反対である。
４．管腔形成：２Ｄモデルが開存性管腔をもつ内皮細胞（ＥＣ）管を生み出している証拠は弱い。典型的に、内皮細胞管は（外因性であれ細胞により合成されようと）細胞外マトリックスで充填されている「管腔」空間を有する（Ｍａｃｉａｇ、Ｋａｄｉｓｈら、１９８２； Ｍａｄｒｉ １９８２； Ｆｅｄｅｒ、Ｍａｒａｓａら、１９８３； ＳａｇｅとＶｅｒｎｏｎ １９９４； Ｖｅｒｎｏｎ、Ｌａｒａら、１９９５）。開存性管腔は、それが存在するところでは、通常、内皮細胞細胞質の厚い壁に隣接する細隙状のまたは狭い円筒空間のように見え、インビボでの毛細管を典型的に表す膨張薄壁内皮細胞管とは全く異なっている。
５．細胞特異性：２Ｄモデルでの細胞ネットワークは、非ＥＣ細胞型により実現されることがある機械的プロセスにより生み出される（Ｖｅｒｎｏｎ、Ａｎｇｅｌｌｏら、１９９２； Ｖｅｒｎｏｎ、Ｌａｒａら、１９９５）。実際、数学モデリングによれば、張力を展性のある２Ｄ細胞外マトリックス（内因的に合成されるものでも、供給される（たとえば、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）ゲル）ものでも）に適用することができるどんな接着細胞型も最適条件下でネットワークを生み出すことができることが明らかにされている（Ｍａｎｏｕｓｓａｋｉ、Ｌｕｂｋｉｎら、１９９６）、
である。
【００１０】
インビトロでの血管新生の三次元（３Ｄ）モデル
インビボでの血管新生は３Ｄ細胞外マトリックス内で起こると認識されているために、出芽がインビトロでの細胞外マトリックスの３Ｄゲル内で誘導される種々のモデルが生まれてきた。初期の３Ｄモデルでは、コラーゲンゲル内に分散された内皮細胞（Ｍｏｎｔｅｓａｎｏ、Ｏｒｃｉら、１９８３）は索および管のネットワークを形成した（ＥｌｓｄａｌｅとＢａｒｄ １９７２）。その内皮細胞管は正しい極性を示したが、浸潤および方向性という特徴が欠けていた（内皮細胞は細胞外マトリックス中に予め埋め込まれ、均一に分散されていた）。にもかかわらず、このアプローチは、管腔形成について（ＤａｖｉｓとＣａｍａｒｉｌｌｏ １９９６）および増殖因子に対する内皮細胞の応答について（Ｍａｄｒｉ、Ｐｒａｔｔら、１９８８； Ｍｅｒｗｉｎ、Ａｎｄｅｒｓｏｎら、１９９０； ＫｕｚｕｙａとＫｉｎｓｅｌｌａ １９９４； Ｍａｒｘ、Ｐｅｒｌｍｕｔｔｅｒら、１９９４； ＤａｖｉｓとＣａｍａｒｉｌｌｏ １９９６）の研究では有用であることが判明していた。
【００１１】
別のアプローチでは、３Ｄ凝固血漿中に埋め込まれた１ｍｍ切片（環）のラット大動脈は枝分かれした吻合する管を生み出した（Ｎｉｃｏｓｉａ、Ｔｃｈａｏら、１９８２）。大動脈環からの芽は、極性に加えて、血管新生様の浸潤および方向性を示した。ラット由来の大動脈環またはマウス由来の微小血管セグメントを利用する外殖片モデルを使用して、血管新生に対する腫瘍、増殖因子、種々の細胞外マトリックス支持体、および老化条件の影響が研究されてきた（Ｎｉｃｏｓｉａ、Ｔｃｈａｏら、１９８３； Ｍｏｒｉ、Ｓａｄａｈｉｒａら、１９８８； ＮｉｃｏｓｉａとＯｔｔｉｎｅｔｔｉ １９９０； Ｎｉｃｏｓｉａ、Ｂｏｎａｎｎｏら１９９２； ＶｉｌｌａｓｃｈｉとＮｉｃｏｓｉａ １９９３； Ｎｉｃｏｓｉａ、Ｂｏｎａｎｎｏら、１９９４； Ｎｉｃｏｓｉａ、Ｎｉｃｏｓｉａら、１９９４； ＮｉｃｏｓｉａとＴｕｓｚｙｎｓｋｉ １９９４； Ｈｏｙｉｎｇ、Ｂｏｓｗｅｌｌら、１９９６； Ａｒｔｈｕｒ、Ｖｅｒｎｏｎら、１９９８）。
【００１２】
精製された内皮細胞（単層または凝集体として）を誘導して、基礎をなすまたは周囲にある３Ｄ細胞外マトリックスゲル中に観血的に出芽させる種々のモデルが存在する（ＭｏｎｔｅｓａｎｏとＯｒｃｉ １９８５； Ｐｅｐｐｅｒ、Ｍｏｎｔｅｓａｎｏら、１９９１； Ｍｏｎｔｅｓａｎｏ、Ｐｅｐｐｅｒら、１９９３； ＮｅｈｌｓとＤｒｅｎｃｋｈａｈｎ １９９５； ＮｅｈｌｓとＨｅｒｒｍａｎｎ １９９６； Ｖｅｒｎｏｎ とＳａｇｅ １９９９； ＶｅｒｎｏｎとＧｏｏｄｅｎ ２００２）。これらのモデルそれぞれに、出芽形成の視覚化の難しさ、制限された出芽、薄片化のための必要条件、またはある種の内皮細胞に関する有効性の欠如を含む特定の限界がある。
【００１３】
ＷｏｌｖｅｒｉｎｅとＧｕｌｅｃは、腫瘍組織の断片をマトリックスに埋め込む３Ｄ血管新生システムを開示している（米国特許出願公開２００２／０１５０８７９Ａ１号）。微小血管の成長を特徴づけして、組織の血管新生能をアッセイすることができる。しかし、このアプローチでは、微小血管の管腔灌流が得られない。
【００１４】
Ｎｅｕｍａｎｎ（本特許の発明者）らは、２００３年、人口組織に包含することができる灌流微小血管をインビトロで作製する可能性を開示している。Ｎｅｕｍａｎｎらは、２００３年、微小血管を作製するため、収縮管により保持されたマンドレルとして１２７マイクロメートルナイロン釣り糸を使用することを教唆している。この血管は、寒天に埋め込まれたラット大動脈平滑筋細胞から作製された。これらの微小血管は、予備的な性質のもので、ヒト血管移植片を作製するのには適していなかった。
【００１５】
インビトロでの血管増殖の二次元モデルは、前で収載した血管新生をよく表す特徴を確立していないが、既存の３Ｄモデルはその特徴の一部または大半を再現している。重要なことに、現在利用できる３Ｄモデルのどれも、加圧流動循環液を含有する親血管を再構築しない。したがって、既存のインビトロ３Ｄモデルではどれを使用しても、血管増殖および形態形成に対する管腔圧力および流動の寄与についての研究は可能にならない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】米国出願第１１３８８９２０号
【特許文献２】米国特許出願公開２００２／０１５０８７９Ａ１号
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１７】
インビトロで灌流可能な微小血管のネットワークを作製するための方法が開示される。マトリックスからマンドレルを引き出し、マトリックスからチャネルを形成する。内壁を有するチャネル中に細胞を注入する。マトリックスをインキュベートして、細胞を内壁に付着させる。チャネルを灌流して未付着の細胞を取り除き、親血管を作り出し、ここで親血管はマトリックスにおいて細胞で裏打ちされた灌流可能な中空チャネルを含む。周囲にあるマトリックスゲル中に芽を作り出すように親血管を誘導して、その結果、微小血管ネットワークを形成する。微小血管ネットワークを、親血管を通る管腔灌流にさらす。
【００１８】
本開示は、３Ｄの細胞外マトリックス（ＥＣＭ）中で浸潤性管状微小血管芽を作製するための証明された方法と管腔流動の供給源となる組織工学による親血管の製作のための新規の方法論を組み合わせることにより、既存の血管新生モデルの限界を克服する方法およびシステムを提供する。灌流液を介して血管新生調節性化合物を、特定の標的受容体が存在することが分かっている内皮細胞の管腔表面に投与することができる。栄養液の管腔流動の存在により、インビトロでの毛細管の生存時間がかなり増加される。開示された血管新生システムを使用して、低酸素／高酸素、特定の可溶性生理活性化合物の試験、遺伝子改変細胞の使用、およびウイルストランスフェクションを介した遺伝子送達を含む種々の実験パラメータを評価することができる。そのシステムであれば、創傷修復、老化、癌、および粥状動脈硬化に関連して血管新生の研究が可能になる。重要なことに、本発明の教示に従ったモデルを適用すれば、生物工学により作製された人工組織に組み込むことができる完全に機能する血管系を提供できる可能性がある。
【００１９】
本開示は、微小血管を作製する、内皮細胞から微小血管を作製するおよびさらに大きな血管（たとえば、冠状動脈の大きさを有する）を作製するための多岐管設計を含むこれまでにない新規のアプローチも提供する。たとえば、微小血管ネットワークの作製のための方法を含むこれらのおよび他の重要な新技術は、後述する明細書および特許請求の範囲から明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】Ａ、Ｂ、Ｃは親血管作製の例を図式的に示す図である。
【図２】Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄは既知の熱収縮工程の例を図式的に示す図である。
【図３Ａ】取付け培養／灌流装置の既知の設計を図式的に示す図である。
【図３Ｂ】取付け培養／灌流装置の製造方法において使用する設計を図式的に示す図である。
【図４】Ａ、Ｂは培養／灌流装置のための多岐管の作製を図式的に示す図である。
【図５】Ａ、Ｂ、Ｃは、培養／灌流装置を微細加工するための別の設計を図式的に示す図である。
【図６】細胞播種法を図式的に示す図である。
【図７】２つのバイオ人工親血管間の毛細血管網の概略図である。
【図８ａ】平滑筋細胞の播種後の複数のマンドレルの例のインビトロ画像である。
【図８ｂ】灌流筋板の例を示す図である。
【図９】ＣＰＤの別の実施形態を図式的に示す図である。
【図１０】周囲にあるマトリックスへ芽を増殖させている単一親血管を示す図である。
【図１１】芽のネットワークを通して第２の親血管に繋がれた１つの親血管を示す図である。
【図１２】細胞をコラーゲンマトリックス中のチャネルに播種することにより親細胞を作製するための別の方法を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本明細書に提示する例は本発明の理解を助長するためのものである。例は説明的なものであり、本発明を例となる実施形態に限定するものではない。本発明の方法は、生理学的および病理学的血管増殖ならびに血管新生または血管新生抑制因子に応答した血管増殖の研究に有用である。他の有用な適用は、癌組織の血管新生能および抗血管新生薬への応答を評価する方法に対するものである。さらに、種々の創傷治癒装置を構築するために、および組織工学による構築物の血管新生のために本発明の方法を使用してもよい。
【００２２】
一例では、灌流可能な三次元微小血管ネットワークの作製のための方法および装置が開示される。本明細書で使用するように、「ＥＣ」とは内皮細胞のことであり、「ＳＭＣ」とは平滑筋細胞のことであり、「ＣＡＳ」とは冠状動脈代替物のことである。
【００２３】
一般に、微小血管ネットワークの培養と灌流のための装置は、中心に１つまたは複数のマンドレルを保持するチャンバーからなる（図１にもっともよく示される）。チャンバーは、どんな生体適合性材料からでも、いくつかの技術によって、たとえば、レーザー加工フレームをサンドイッチすることにより作製することができる。マンドレルは、それが退縮可能なようにチャンバー内で構築される。これは、たとえば、熱収縮によるように、マンドレルの末端を管に合わせることにより実現することができる（図２に明示する）。マンドレルの径は目的の血管内径に依存する。配置は、２Ｄまたは３Ｄにおける単一血管、２つの血管、または全列の血管までを収容するように変更することができる。マンドレルは、高分子繊維、ガラス繊維、ワイヤーなどの種々の材料のものでよい。
【００２４】
細胞をマンドレルの上に播種し、細胞を刺激してマンドレルの周囲に増殖させ、細胞が血管壁を形成し終わるとマンドレルを引き抜くことにより微小血管は作製される。次に、血管をマトリックス内に埋め込む。培養条件、マトリックスの組成物および血管新生刺激（たとえば、増殖因子）の存在に応じて、親血管は周囲にあるマトリックスに出芽する。芽は互いに吻合し、このようにして毛細血管網を形成する。マンドレルを取り外したのち、装置を灌流システムに繋ぎ、血管を管腔液体流動にさらす。
【００２５】
ここで図１Ａ、図１Ｂおよび図１Ｃに言及すると、親血管作製の例となる概略図が示されている。図１Ａは、装置本体３中の収縮管４により保持されたマンドレル２上に播種された、増殖培養液１００中の内皮細胞１を示している。図１Ｂは、細胞１が増殖し細胞スリーブ１０２の形に環状層を形成し終わったことを示している。図１Ｃは、増殖培養液１００で灌流されている細胞外マトリックス（ＥＣＭ）ゲル１１０中のマンドレル２の抜き出し後の細胞スリーブを示している。
【００２６】
本明細書に開示される方法は、組織工学的適用および研究モデルのための灌流可能なバイオ人工血管構造の工学的設計を含む。開示された方法の一般原則は、薄肉管または他の付属品にぴったり合わせた取り外し可能なマンドレル周囲の層での細胞の培養を含む。細胞層が目的の壁厚に到達した後は、マンドレルを取り外し、これにより作製されたバイオ人工血管（ＢＡＶ）は、灌流システムを用いて培養液、血液、血液代替物、または他の液体で灌流してもよい。開示された方法により、大量生産されたまたはオーダーメイドされた血管、インビトロで灌流される血管新生モデル、創傷治癒装置、組織成分、全組織および器官のほかにも研究モデルの作製が可能になる。
【００２７】
培養／灌流装置の製造
ここで図２Ａ、図２Ｂ、図２Ｃおよび図２Ｄに言及すると、既知の熱収縮工程の例となる概略図が示されている。図２Ａに具体的に示されるように、それぞれの培養／灌流装置（ＣＰＤ）は、支持フレーム１２により保持された１つまたは複数のマンドレル２を含んでいてもよい。目的の血管内径の径のマンドレル２が、その両末端を医療グレード収縮管セグメント４にぴったり入れて収まっている。マンドレル２は、模倣される血管の大きさにより、数マイクロメートルから数ミリメートルまでの径を有する生体適合性繊維（たとえば、高分子、ガラス、ワイヤーまたは同等物）を含んでいてもよい。一例では、光ファイバーを含む微小毛細血管をマンドレルとして用いた。
【００２８】
図２Ｂのさらに詳細な図に示されるように、それぞれの収縮管セグメント４の中央部分１４は、マンドレル２の１つの周囲で熱収縮される。続いて、図２Ｃに具体的に示されるように、マンドレル２が退縮され、管が切断される。図２Ｄは、マンドレルの両末端が、新たに切断され離された収縮管セグメント４により封入されるように、マンドレルの位置を変えた後の状態を示している。フレーム１２は種々の材料および技術を使用して作製してもよい。配置は、単一バイオ人工血管またはバイオ人工血管の列のいずれでも収容するよう変更してもよい。同様に、数面のマンドレル列を層状に重ねることにより、肉厚の灌流可能な組織を血管ネットワークで作製してもよい。
【００２９】
灌流チャンバーの機械加工
ここで図３Ａに言及すると、いくつかのマンドレル／収縮管集合体１１の灌流のための既知の装置が示されている。フレーム２０は、ポリカーボネートまたは同等の材料を都合よく圧延してもよい。分配チャンバー３０が設計図に含まれてもよく、これにより多くのバイオ人工血管の同時灌流が可能になる。マンドレル２を含む一組の糸の末端はシリコン管２３に集められる。
【００３０】
マイラーフレームのレーザー切断
ここで図３Ｂに言及すると、取付け培養／灌流装置の製造法で使用される新規の設計図が図式的に示されている。単一血管設計、ＣＰＤ７０は、２枚のレーザー切断Ｍｙｌａｒ（登録商標）フレーム２２間に熱収縮管に保持されたマンドレル２を挟むことにより都合よく作製してもよい。下に詳述される通りに構築された円筒状エポキシ樹脂多岐管２１は、マンドレル／収縮管集合体１１を保持するために都合よく使用してもよい。
【００３１】
マンドレル／収縮管集合体は、各マンドレルが各末端の２本の収縮管セグメント４’によりフレームウィンドウ７６中に吊るされるように粘着側が互いに押し付けられている、Ｍｙｌａｒ（登録商標）などのポリエステルフィルムまたは同類のものの２つのフレーム間に挟まれてもよい。少なくとも１本の細い安定化ワイヤー２６をフレーム２２に含むことにより、ならびに収縮管および少なくとも１本の細い安定化ワイヤー２６の周囲に、シリコーン管のモールドを使用して流し込まれる円筒状エポキシ樹脂多岐管内に封入することにより、２本の収縮管セグメント４’は安定化され補強される。２本の収縮管セグメント４’は、最終的にはＣＰＤ７０の流入ポートおよび流出ポートになる。
【００３２】
ここで図４Ａおよび図４Ｂに言及すると、培養灌流装置の多岐管の作製のための方法が図式的に示されている。図４Ａは、特に、たとえば、シリコーン管５０のスリーブを通して引っ張られる複数の収縮管／マンドレル集合体１１を示している。エポキシ接着剤４０が注入されてシリコーン管５０を詰め、硬化される。
【００３３】
図４Ｂは、特に、エポキシ接着剤４０が硬化しシリコーン管５０が切り開かれて取り外された後の状態を示している。硬化したエポキシロッド４４が残っている。エポキシロッド４４は、マンドレルが退縮された後に切断され、切断場所の後には収縮管により作製されたチャネル４２が残る。多くの収縮管の末端４６がまとめられて多岐管２１を形成してもよい。個々のＣＰＤまたはＣＰＤフレーム集合体のスタッキングを使用して３Ｄ血管列を作製することができる。
【００３４】
別の方法
ここで図５Ａ、図５Ｂおよび図５Ｃに言及すると、微細加工された培養／灌流装置の別の設計図が図式的に示されている。図５Ａは、特に、穿孔が収縮管の代わりになるスリーブ５６を有しているフレーム中の小穿孔５４を通じて取り込まれる一組のマンドレル２を示している。図５Ｂは、特に、フレーム壁５２中にはめ込まれた一組のマンドレル２を含む細胞播種前のＣＰＤを示している。
【００３５】
図５Ｃは、特に、微細加工された多岐管６４をフレーム５２の外側でスリーブ５６に取り付けてもよい、血管６２がある培養／灌流装置の別の例を示している。血管６２は本明細書で示す通りにマンドレル上で増殖され、マンドレルが取り外された後に残る。微小成形などの微細加工法は、そのようなＣＰＤフレーム集合体の大量生産のために使用してもよい。
【００３６】
血管作製および灌流
ここで図６に言及すると、細胞播種法が図式的に示されている。細胞播種のためのＣＰＤ７０を準備するために、ＣＰＤ７０は先ず洗浄され、次に紫外線殺菌される。無菌条件下で、ＣＰＤは表面、たとえば、ペトリ皿７２の底に固定される。次に、ＣＰＤフレーム集合体７０の内部ウィンドウ７６（図３Ｂに示されている）をラミニン１などの接着タンパク質を含有する溶液で満たす。１つまたは複数のスペーサー７７を必要に応じて使用してもよい。インキュベーション時間の後、接着タンパク質含有溶液を取り除き、次に、培養液中の目的の細胞型（たとえば、平滑筋細胞または内皮細胞）の懸濁液をＣＰＤ７０のウィンドウ７６に移す。
【００３７】
細胞播種は、一定量の細胞懸濁液をウィンドウに満たし、ＣＰＤフレーム集合体７０を逆さまにひっくり返し、このようにして懸滴８０を作り出すことにより実施してもよい。約４５分のインキュベーション時間中、多数の細胞がＣＰＤフレーム集合体内のマンドレル／収縮管集合体に付着することになる。過剰な細胞は懸滴の先端に沈むことになり、おそらく集めて破棄してもよい。次に、１つまたは複数のＣＰＤフレーム集合体を含有するペトリ皿を立位に戻し、ＣＰＤフレーム集合体が溢れるまで培養液で満たし、インキュベートする。一例でのインキュベーション条件は、３７℃で５％ＣＯ２の環境であった。マンドレル／収縮管集合体に付着した細胞は広がり増殖し、同心円状の単層（たとえば、内皮細胞）または厚さが１５０μｍおよびそれよりも多い多層（たとえば、平滑筋細胞）を形成する。
【００３８】
目的の壁形状または厚みで、マンドレルは引き抜かれ、それにより中空の細胞管を作り出す。もっと薄い壁は、マンドレルの引き抜きに先立って細胞スリーブの周囲に、たとえば、アガロース、コラーゲン、基底膜タンパク質のゲルなどのゲルを成形することにより、断裂から保護してもよい。次に、ＣＰＤフレーム集合体の多岐管は灌流システムに繋がれ、増殖培養液などの最適な液体で灌流される。
【００３９】
別の実施形態では、ヒト血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）由来の内皮「親」血管の作製のための方法は、以下の工程を含む：
培養装置を先ず洗浄し、次に３０分間、両側から紫外線暴露により無菌化する。無菌条件下で、装置を無菌条片でペトリ皿の底に固定する。
次に、装置の内部ウィンドウをラミニン１の接着タンパク質溶液で満たす（フィブロネクチン、フィブリン、またはゼラチンなどの他の接着タンパク質を代わりに使用することができる）。
一晩インキュベーション後、接着タンパク質含有溶液を取り除き、次に培養液中のヒト血管内皮細胞の懸濁液を装置のウィンドウに移す。
次に、ペトリ皿を逆さまにひっくり返し、このようにして装置のウィンドウに細胞培養懸濁液の懸滴を作り出す。細胞培養インキュベーター中（５％ＣＯ２、３７℃）での４５分間のインキュベーション時間後、多数の細胞が装置内のマンドレル／収縮管集合体に付着することになる。
次に、ペトリ皿を立位に戻し、装置が沈むまでヒト血管内皮細胞用の増殖培養液で満たす。
マンドレルに結合していない細胞は浮き上がり、吸引して破棄することができる。
次に、ペトリ皿をインキュベーター中（５％ＣＯ２、３７℃）に入れる。マンドレルに付着した細胞は広がり増殖し、ヒト血管内皮細胞の同心円状の単層を形成する。
次に、培養液をペトリ皿から取り除く。コラーゲン溶液を培養装置のウィンドウに満たし、固化させ、このようにしてマンドレルを細胞層で埋め込む。
ヒト血管内皮細胞がコラーゲンゲル中に芽を形成することになる。次に、マンドレルをゆっくり引き抜き、後にヒト血管内皮細胞の灌流可能な「親」微小血管が残る。
次に、装置の多岐管は灌流システムに繋がれ、ヒト血管内皮細胞増殖培養液で灌流される。
【００４０】
灌流システム
ＣＰＤは、灌流システムに線形様式でまたは循環様式のいずれで繋いでもよい。線形配置は、重力フローシステム、または市販のもしくは注文製の注射器ポンプを付けて作製してよい。注射器は灌流培養液で満たし、注射器ポンプに取り付け、ガス気密管を介してＣＰＤの上流末端に繋がれる。ＣＰＤは無菌条件下でインキュベーターに保存してもよいし、無菌細胞培養環境をＣＰＤ内に確立してもよい。ＣＰＤの下流多岐管は、灌流液を回収する末端貯蔵容器に繋がれる。循環システムを、蠕動ポンプを使用することにより作製してもよい。線形システムにも循環システムにもガス交換用の装置を取り付けてよい。ガス濃度、灌流圧、流量、温度、ならびに栄養分および代謝副産物の濃度は、センサーで測定する。集めたデータはフィードバックループに送ることもでき、目的のパラメータの厳格な制御を可能にする。
【００４１】
特定の適用
血管新生関連研究のためのモデル
ここで図７に言及すると、図７は、２つのバイオ人工親血管２００、２０２間の毛細血管網の概略図を示している。液体灌流液２０４は、「静脈」親血管２０２への流量（ｆ）を減少し、「動脈」親血管２００での抵抗（Ｒ）を増加することにより毛細管２０６を通して経路を変更される。したがって、灌流液２０４は圧力の高い血管から圧力の低い血管へ推進され、動脈末端から毛細血管床の静脈末端への自然な血流をシミュレートする。
【００４２】
血管新生研究のモデル開発、必要に応じて、創傷修復、老化、および癌、糖尿病、関節炎および乾癬の疾患における医薬品検査および研究のためにもマンドレル法を使用してよい。内皮細胞のみを、または内皮細胞、平滑筋細胞、および周皮細胞の組合せを使用して、親バイオ人工微小血管（ＢＭＶ）をミクロン径マンドレルの周囲で培養し、細胞外マトリックスの支持性ゲルに埋め込むことができる。次に、マンドレルを抜き出し、細胞外マトリックスゲル２１０内に親内皮細胞管を後に残すことになる。引き抜きは手動で、または自動装置を使用して、および極端に遅くから極端に速くまで変化する速度で実施してもよい。他のバリエーションには、凍結状態でのバイオ人工微小血管からのマンドレルの引き抜き、温度応答性ポリマーでのマンドレルのコーティング、またはマンドレルのどちらかの末端を引っ張って、それにより断裂までマンドレルを細くすることが含まれてもよい。
【００４３】
周囲にあるゲル２１０への親血管の出芽は、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、およびホルボール１２−ミリステート−１３−アセテート（ＰＭＡ）などの化合物により誘導され、これらの化合物はゲルおよび／または灌流液（たとえば、増殖培養液）に添加される。
【００４４】
複合毛細血管網２２２は、２つの隣接する親バイオ人工微小血管間に圧力差を確立し、それにより動脈および静脈血流を模倣することにより作製してもよい。次に、液体流は、「動脈」バイオ人工微小血管から相互接続された芽を通って「静脈」バイオ人工微小血管へと再誘導される。
【００４５】
灌流液は、血清および血管新生または血管新生抑制物質がない酸素添加細胞増殖培養液を有利に含んでいてもよい。別の例では、灌流液は、血清および／または血管新生影響化合物を補充した酸素添加細胞増殖培養液であってもよい。さらに別の例となる実施形態では、灌流液は酸素添加生理食塩水であってもよい。別の例では、灌流液は、酸素添加血液、血液成分、または代用血液を含んでいてもよい。さらに別の例となる実施形態では、灌流液は酸素添加でなくてもよく、システムの酸素添加は、マトリックスを介する拡散により実現される。さらに別の例となる実施形態では、血管新生または血管新生抑制化合物を灌流液に添加してもよい。
【００４６】
一例となる実施形態では、血管新生および血管新生抑制化合物などが、マトリックスに添加される。さらに別の例となる実施形態では、細胞は、灌流液へまたはマトリックスへ産物を放出する遺伝子改変細胞を含む。さらに別の例となる実施形態では、マトリックスは、フィブリン、コラーゲン、基底膜マトリックスおよびゼラチンを有利に含んでいてもよい。有用なマトリックスの一種は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）ゲルである。別の例となる実施形態では、マトリックスは、寒天、アガロース、アルギン酸、またはシリカゲルを含んでいてもよい。
【００４７】
一例となる実施形態では、細胞は、内皮細胞、平滑筋細胞、周皮細胞、ヒト細胞、動物細胞、植物細胞、幹細胞、筋肉細胞、肝細胞、腎細胞、肺細胞、皮膚細胞、上皮細胞および遺伝子改変細胞からなるグループから選択してもよい。同様に、マトリックスには、マトリックス全体に分散されても、または局所的に集中していても、内皮細胞、平滑筋細胞、周皮細胞、ヒト細胞、動物細胞、植物細胞、幹細胞、筋肉細胞、肝細胞、腎細胞、肺細胞、皮膚細胞、上皮細胞および遺伝子改変細胞からなるグループから選択される細胞が存在していてよい。いくつかの場合、健常組織または癌組織などの疾患組織の断片がマトリックスに埋め込まれている。
【００４８】
親血管からの出芽は、切片材料においてまたは全載調製物において、インビトロで顕微鏡的に調べてもよい。バイオ人工微小血管に蛍光溶液（たとえば、蛍光デキストラン）を灌流すれば、芽径、芽管腔の開存性、および吻合の程度の分析に役立つ。芽形態の３Ｄ再構築は、共焦点顕微鏡により撮られる落射蛍光像のＺ軸スタッキングにより実施してもよい。芽２２０による細胞周囲基底膜マトリックスの合成は、抗ラミニンおよびＩＶ型コラーゲン一次抗体ならびに蛍光またはペルオキシダーゼタグ付き二次抗体で免疫標識することにより、全載においておよび組織（パラフィン）切片においてモニターしてもよい。
【００４９】
複合ＥＣ／ＳＭＣ芽では、２つの細胞型間の空間関係は、ヒトＣＤ３１（クローンＰ２Ｂ１、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）に対するＦＩＴＣモノクロナール抗体（ＭＡｂ）またはＦＩＴＣ−ＵＥＡ１アグルチニン、すなわちヒト内皮細胞に特異的マーカーで内皮細胞を標識することにより調べてもよい。平滑筋細胞に、ヒトアルファＳＭアクチンに対するＭＡｂを、続いてＲＩＴＣ抗マウス二次抗体を標識してもよい。内皮細胞と平滑筋細胞間の管腔構造および相互作用の詳細は、上述の試薬で標識したパラフィン切片から入手してもよい。
【００５０】
記載する作製法は、高再現性での血管新生装置の商業的大量生産の基礎である。適切に保存すれば（たとえば、クリオ保存）、増殖前親血管または全毛細血管網は、すぐに使える形で研究者が入手できるようになると考えられる。
【００５１】
冠状動脈代用物
冠状動脈代用物の作製のために、内径がほぼ４ｍｍから５．５ｍｍの血管管腔を有する冠状動脈代用物を生じるように外径が選択されたマンドレル。代わりに、マンドレルは、灌流され、冠状動脈代用物の増殖期間中に栄養素とガスの交換を可能にするくらいの透過性のある中空管でもよい。冠状動脈代用物は、平滑筋細胞からのみ増殖されて、このようにして血管中の中間層に類似する構造物を提供するか、または、２つもしくは３つの細胞型から複合構造物として作製されてもよい。
【００５２】
平滑筋細胞はマンドレル上に播種されて、３００〜５００μｍの環状層にまで増殖される。冠状動脈代用物の作製を迅速化するため、細胞を初期増殖期中に高度に増殖性の表現型にして、次に血管壁が目的の厚さに達した後は分化状態に転換するようにＳＭＣ表現型を操作してもよい。表現型転換のために、平滑筋細胞は劇的にその増殖速度を落とし、血管の機械的性質に影響を与える、コラーゲンおよびエラスチンなどの細胞外マトリックスタンパク質の作製を誘導することになる。表現型転換は、ある種の遺伝子の発現を制御することにより実現してもよい。たとえば、テトラサイクリン応答性プロモーターの助けを借りて、遺伝子発現（たとえば、エラスチンの）は、血管壁が目的の厚さに達してしまうまで抑制されてもよい。次に、増殖培養液からテトラサイクリンを除けば、挿入遺伝子が活性化されることになる。たとえば、エラスチンが過剰発現されたら、それ以上の細胞増殖は阻害され、血管壁内で構造的およびシグナル伝達機能が発揮されることになる。機械的条件付け、たとえば、脈動流を使用して、冠状動脈代用物を強化し、細胞の生理的整列化を誘導してもよい。他の外部のまたは内部の「表現型転換」も同様に潜在的に使用してよい。
【００５３】
内皮細胞は、マンドレルを取り除いた直後に、または平滑筋細胞の条件付けおよび再構築後に、ＳＭＣスリーブ内に播種してもよい。内皮細胞播種は、内皮細胞懸濁液をＳＭＣスリーブに注入することにより実施してもよい。次に、内皮細胞を適切に付着させる期間流動を停止させる。必要であれば、内皮細胞の均等な分配を促進するために血管を回転させる、または繰り返し上下をひっくり返してもよい。
【００５４】
代わりに、内皮細胞を最初にマンドレル上に播種してもよい。その場合、平滑筋細胞は、コンフルエント内皮細胞層上に播種される。この方法では、酸素と栄養素がより豊富にある冠状動脈代用物の周辺に向かって内皮細胞が遊走するのを防ぐことが必要になる。
【００５５】
必要に応じて、線維芽細胞をＳＭＣスリーブの外側に播種すれば、外膜層を作製することができる。
【００５６】
冠状動脈代用物を作製するための細胞は、自己、非相同、または異種材料由来でもよい。細胞は、幹細胞、前駆細胞、または分化細胞でもよい。細胞は、特定の表現型を実現するために、または宿主生物の免疫応答を弱めるために遺伝子改変されてもよい。
【００５７】
本明細書に開示するＣＰＤ法は、大量生産のすぐに使える血管代用物、またはレシピエントのために注文設計される血管代用物に対する選択肢を提供する。本明細書に開示するＣＰＤ法は、冠状動脈代用物の組織工学のためのモデル開発に、アテローム発生、動脈形成の研究に、異なる血管細胞型の互いの相互関係および細胞外マトリックス成分との相互関係の研究に、一酸化窒素の効果に関する研究に、ならびに種々の医薬品の研究にも適している。
【００５８】
異なる大きさまたは種類の血管およびリンパ管
本明細書に開示するＣＰＤ法を使用して、冠状動脈以外の径と種類の血管を作製してもよい。マンドレルの径を変えれば、血管の径も変わることになる。血管の種類（動脈、静脈、リンパ管）は、細胞の表現型、および／または細胞の増殖が阻害される時点によって変えてもよい。たとえば、静脈はわずかな平滑筋細胞層のみを含有する。
【００５９】
他の管状様組織
本明細書に開示するＣＰＤ法は、胆管、涙管、耳管、卵管、輸精管、尿管、尿道、肺気道、等などの他の管状組織の工学のために使用してもよい。本明細書に開示するＣＰＤ法は、神経増殖および修復の誘導のための、グリア細胞を含む異なる細胞型からの神経導管の作製にも有用であることが判明する可能性がある。
【００６０】
工学的に操作された組織のためのＢＡＶシステム
本明細書に開示するＣＰＤ法は、取り外し可能なマンドレルの列をスカフォールドとして使用することにより、組織および器官の工学のために使用してもよい。目的の組織／器官（筋肉、肝臓、腎臓、肺、皮膚、等）の細胞は、接着タンパク質被膜マンドレル上に播種される。これらのマンドレルは、固形線維もしくはワイヤーから、または、代わりにセルロースなどの灌流可能な透過性管から作製してもよい。マンドレルは、単一の細胞スリーブを合併させる正確な間隙をおいて互いに分離される。この方法を使用して、シート状またはブロック状の組織を形成してもよい。次に、マンドレルを引き抜いて（または、別々に取り除いて）、バイオ人工組織は、灌流システムを用いて内部で灌流される。
【００６１】
創傷治癒装置
製造前バイオ人工血管システムを使用して、糖尿病患者の慢性潰瘍のためなどの創傷治癒に役立ててもよい。バイオ人工毛細血管網を（たとえば、細胞外マトリックスゲルから、血管新生増殖因子で強化された）パッチ状の支持材料に埋め込み、創傷上に置くことができる。酸素添加栄養溶液を自律的に灌流すれば、バイオ人工血管はドーナーの脈管構造および皮膚の出芽を促進すると考えられる。代わりに、そのようなバイオ人工血管パッチを創傷と植皮間に挟み込めば、移植片の内殖を促進することができると考えられる。
【００６２】
遺伝子治療装置
バイオ人工血管は、植込み式薬剤送達装置に使用することができると考えられる。細胞は、患者から採取して、インビトロで遺伝子改変すれば、ある種のタンパク質（ホルモン、酵素、等）を産生することができると考えられる。次に、これらの細胞を、上述の方法を使用して、バイオ人工血管または血管網に増殖させてもよい。宿主に再移植すれば、細胞は標的物質を産生し、局所的にまたは全身的にその物質を放出し続ける。
【００６３】
人工組織および器官
組織工学による血管網は、上記のように、組織の作製または全臓器の作製のためにも使用してよい。１つのアプローチは、１つまたは複数のインビトロ灌流親血管を作製することである。目的の組織または器官由来の間質細胞を、たとえば、ゲル中の親血管の周囲に播種する。間質細胞は、親血管を介して栄養分と酸素を供給される。間質細胞が増殖すると、栄養分と酸素への要求が増加する。細胞は血管新生因子を放出し、血管を出芽するように刺激する。自然増殖にきわめて類似して、組織が成長するに従って血管系は、同一速度で出芽する。したがって、このシステムは発生生物学の研究のための優れたモデルにもなると考えられる。
【００６４】
別のアプローチは、間質細胞の足場として平行配列のマンドレルを利用する。間質細胞が増殖するに従って、細胞層がマンドレル周囲に形成される。最終的に、すべてのマンドレル間の空間は間質細胞で満たされ、シート状の組織ができる。マンドレルを取り除くと、マンドレルにより後に残されるチャネル内を通ってその組織は灌流されてもよい。それらのチャネルは、管腔播種を通じて内皮細胞で被覆することができる。このアプローチは２Ｄに限定されるものではない。いくつかのシートをスタッキングしてもよいし、３Ｄ足場を使用してもよい。本明細書の発明者は、筋肉組織の工学のために２Ｄアレイも３Ｄアレイも使用した。
【００６５】
さらに別のアプローチでは、組織の層および血管網の層を独立して作製し、その後間欠的にスタッキングすることができると考えられる。これらのアプローチはすべて、１つまたは２つの細胞型で単純なモデルでも、またはいくつかの細胞型で構成されたかなり複雑な構築物でも作製することができる。
【００６６】
移植すると、これらの方法で工学的に操作された組織または器官を、直接血流に繋ぐことも、または宿主脈管構造が移植片に成長してしまうまで灌流システムにより灌流させておくこともできると考えられる。
【００６７】
灌流組織工学的に操作された筋肉構築物の例
ここで図８ａに言及すると、平滑筋細胞を播種した後の複数のマンドレルの例のインビトロ画像が示されている。複数のマンドレルと収縮管ユニットＭは、Ｍｙｌａｒ（登録商標）フレームに挟み込んだ。マンドレルＭ間の距離はほぼ１００μｍに調整した。収縮管セグメントの末端は、１つの上流多岐管と１つの下流多岐管に結合させた（示されていない）。Ｍｙｌａｒフレームは無菌化し、管腔被膜し、５×１０６ラット大動脈平滑筋細胞ＳＭ（ＲＡＳＭＣ）／ｍｌの懸濁液を播種した。細胞ＳＭは、個々のマンドレルＭそれぞれに付着し、増殖し、このようにして環状層を形成した。１０日後、個々の層が合併し終わり、１つの厚いシート状のまたはプレート状の平滑筋細胞を生じた。増殖培養液中にさらに７日間置いた後、培養液にはもう７日間、５０Ｕ／ｍｌヘパリンを補充した。その後、マンドレルはすべて引き抜き、組織は、１０ｍｌ／日の速度でヘパリン培養液で灌流した。灌流チャンバーは、ヘパリン培養液で満たした１００ｍｍペトリ皿の底に固定したままにした。ＳＭＣプレートは１１日間灌流した。その時間を過ぎても、チャネルＣＨは機能的なままであり、依然としてインビトロではっきりと目に見えた（図８ｂにもっともよく示されている）。
【００６８】
ここで図８ｂに言及すると、灌流筋肉プレートＭＰの例が示されている。管末端（Ｔ）を通って、引き抜かれたマンドレルにより後に残されたチャネル（ＣＨ）中へと灌流される液体が示されている。
【００６９】
ここで図９に言及すると、ＣＰＤの別の実施形態が図式的に示されている。一例では、ＣＰＤ９００は、第１スライドガラス９０４と第２スライドガラス９２０間に並置された層９０２を含む。層９０２は、チャネル９２２に繋がれた複数の液体ポートを埋め込むのに適した厚みがある。複数の液体ポートは、細胞懸濁液ポート９１４、複数の入口ポート９１２、および複数の出口ポート９１８を含む。チャネル９２２により繋がれて液体の通過および分配を可能にするポートは、同じように機能する。ポート９１２などの複数のポートは、複数のアクセスポイントを提供するように配置されている。他の適用では、液体チャンバーおよびポートがマイクロ流体材料で作製されるマイクロ流体設計を有利に用いてもよい。同様に、この層は、顕微鏡またはマイクロ流体適用において使用するのに適したシリコーンまたは他の材料を含んでいてもよい。コラーゲンチャンバー９０６は、対になった中空柔軟毛細管９１６によるアクセスのために有利に位置している。用いる毛細管の数は、ＣＰＤの大きさおよび作製されている血管の数が収容する可能性のある１つから２つよりかなり多い数の範囲でよい。複数のポートおよびチャンバーのそれぞれには、注射器ポンプが針を有する注射器に取り付けられている管入口９４０Ａ、９４０Ｂを通って１本または複数の注射器ポンプにより層を通ってアクセスしてもよい。図面を簡略化するために２つの注射器ポンプ管入口９４０Ａ、９４０Ｂのみが示されているが、場合によっては、別々の注射器ポンプ、注射器または同等物をそれぞれのチャンバーおよび／もしくはポート中に材料を注入するまたは抽出するために使用してよいことが理解されるであろう。一実施形態では、注射器ポンプはガス気密注射器に連結される。
【００７０】
別の実施形態ＣＰＤ９００の特徴を記載したので、ＣＰＤを構築するための１つの方法をここで記載すれば、本発明の理解に役立つであろう。層９０２にシリコーン層を用いる一例では、穴およびチャネルのパターンを、粘着上層９４３および粘着下層９４５で覆われたシリコーン層に打ち込む。次に、中空針をシリコーン中に刺し込み、その後この針を使用して、ポリミド被膜融合シリカ毛細管９１６をコラーゲンチャンバー９０６に、および入口ポート９１２の１つにもガイドする。２本の毛細管は、小口径管９１０により保持されて、主チャンバーから出口ポート９０８に通じる。次に、シリコーン層９０２は、粘着層の助けを借りて２枚のスライドガラス間内に挟み込まれる。その後、ＣＰＤ９００は、使用するまで加圧減菌されて、保存される。血管作製のためにチャンバー９０６の準備をするためには、コラーゲン溶液を調製し、注射針を通してコラーゲンチャンバー９０６に直接注入し、インキュベーター内で一晩ゲル化させる。次に、注射針を２つの入口ポートに差し込むことにより、ＣＰＤ９００を注射器ポンプに繋ぐ。
【００７１】
注射針は、今度はガス気密管に繋がれ、この気密管はｐＨを十分に調整した増殖培養液で満たされ、注射器ポンプに取り付けられた２つのガス気密注射器に通じている。２つの出口ポート９０８Ａ、９０８Ｂは、類似の様式の廃棄物貯蔵場所に繋がれる。注射器ポンプは、ここでは灌流ポンプとして機能するが、次に作動させると、それにより入口ポートを満たし、順次、入口ポート、毛細管および出口ポートをプライミングする。空気をすべてシステムから押し出すと、各毛細管はピンセットにつかまれ、コラーゲンチャンバーにまで伸びる末端は、毛細管の末端のみがマトリックスチャンバーまで伸びるまで、コラーゲンゲル中を引き戻される。この手順を使用して、２つの灌流可能なチャネルがコラーゲンゲル内に作製される。コラーゲンチャネル内に細胞を播種するためには、高濃度の内皮細胞懸濁液を、細胞懸濁液用のポートに注入する。次に、注射器ポンプを止め、その後毛細管のもう１つの末端を、細胞を含有する小さな貯蔵場所９１４Ｒに引き戻すと、多数の細胞がコラーゲンチャネルに直接流入する。細胞の流速は、廃棄物貯蔵場所の高さにより厳密に制御することができる。次に、細胞をコラーゲンチャネルの壁に付着させるためにＣＰＤを４５分間インキュベーターに入れる。ＣＰＤは、細胞を最適に分配するように数回ひっくり返すか、または他の方法で操作することができる。最後に、毛細管を細胞貯蔵場所から、入口ポートの一部である貯蔵場所にまで引き出し、注射器ポンプを作動させて目的の灌流速度に設定する。過剰な細胞は洗い流す。この播種法により、増殖のための時間を与えた後、細胞の相同単層をもつ２つの親血管が生じるが、そこで必要な時間は管に注入される細胞数が高濃度であるほど短くなる。マンドレルは、使用されるマンドレルの種類によって、抜き出しおよび／または分解によりマトリックスから取り除いてもよいことに注意されたい。
【００７２】
ここで図１０に言及すると、周囲にあるマトリックス１０５４中に芽１０５２を増殖している単一親血管１０５０が示されている。ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）がコラーゲンチャネル内に播種されると、そのようにして作製された親血管はコラーゲン中に出芽し始める。これらの芽は伸長して分岐し始める。これらの分岐は最終的には、反対の親血管からの分岐と吻合し、このようにして血管網を形成する。
【００７３】
ここで図１１に言及すると、ネットワークの芽１１０６を通じて第２の親血管１１０４に繋がれた第１の親血管１１０２が示されている。芽１１０６は管腔を有し、灌流されている。
【００７４】
親血管を作製するためのプロトコル
ここで図１２に言及すると、コラーゲンマトリックス内のチャネルに播種することにより親細胞を作製するための別の方法が示されている。シリコーン層を使用した別のＣＰＤは記載済みなので、当業者による本開示の理解を促進するために、微小血管システムを作製するための適用の具体例をここで記載することにする。
【００７５】
ＣＰＤは加圧減菌器で無菌化され、使用するまで無菌環境に保存される。コラーゲン溶液を調製し、氷上で保存する。コラーゲンは小型の注射器に充填される。注射器に３０Ｇ注射針を取り付け、チャンバーがコラーゲン１００２で完全に満たされるまで、コラーゲン溶液をコラーゲンチャンバーに注射針を通して注入する。第２の注射針を、空気吹き出し口としてチャンバーの反対側から注入する。
【００７６】
次に、注射針を２つの入口ポート１００４に注入することにより、ＣＰＤを注射器ポンプに繋ぐ。注射針は、今度はガス気密管に繋がれ、この気密管はｐＨが十分に調整された増殖培養液で満たされ、注射器ポンプに取り付けられた２つのガス気密注射器に通じている。２つの出口ポートは、類似の様式の廃棄物貯蔵場所（すなわち、出口ポートに注射針が注入され、管が廃棄物貯蔵場所に通じている）１００６に繋がれる。
【００７７】
注射器ポンプを灌流ポンプとして作動させ、それによって入口ポートを満たし、順次、入口ポート、毛細管、および出口ポート１００８をプライミングすることにより、ＣＰＤを灌流させる。空気がすべてシステムから押し出されると（たとえば、取り外し可能な空気吹き出し口として働く小径注射針を通して）、次に各毛細管はピンセットにつかまれ、コラーゲンチャンバーにまで伸びる末端は、毛細管の末端のみがチャンバーまで伸びるまで、コラーゲンゲル中を引き戻される。この手順を使用して、２つの灌流可能なチャネルがコラーゲンゲル１０１０内に作製される。
【００７８】
コラーゲンチャネル内に細胞を播種するために、高濃度の内皮細胞懸濁液は細胞懸濁液用のポート１０１２に注入される。次に、注射器ポンプを止め、その後毛細管のもう一方の末端は、入口ポートから細胞を含有する小さな貯蔵場所に引き戻され、多数の細胞が毛細管を通ってコラーゲンチャネル１０１４に直接流入する。細胞の流速は、背圧（廃棄物貯蔵場所の高さ）により厳密に制御することができる。次に、毛細管は入口ポートに繋がれている貯蔵場所にさらに引き戻される。
【００７９】
次に、細胞をコラーゲンチャネル１０１６の壁に付着させるためにＣＰＤを４５分間インキュベーターに入れる。ＣＰＤは、細胞を最適に分配するように数回ひっくり返すか、または他の方法で操作することができる。
【００８０】
最後に、注射器ポンプを作動させて目的の灌流速度１０２０に設定する。過剰な細胞は洗い流す。この播種法により、細胞の相同単層をもつ２つの親血管１０２２が生じる。上記のように親血管を灌流することにより、１つまたは複数の微小血管ネットワークを作製してもよい。
【００８１】
代わりに、親血管を作製するための手順は、図１Ａ〜１Ｃおよびその他を参照して、コラーゲンマトリックス内にマンドレルを埋め込み、マンドレルを抜き出し、マンドレルにより後の残されるチャネルに細胞を注入し、ほかにも上記のマンドレル上に細胞を播種することも含んでもよい。この２つの方法を組み合わせれば、異なる細胞型の層状化が可能になる。
【００８２】
本発明は、特許法に従って、当業者に本発明の新規の原理を適用して、必要とされるような例となり特殊な成分を構築し使用するのに必要な情報を提供するために、本明細書においてかなり詳細に記載されている。しかし、本発明は、明確に異なった設備、および装置および再構成アルゴリズムにより実施してもよいこと、ならびに設備の細部と操作手順の両方に関して、本発明の真の精神と範囲から逸脱することなく種々の改変を実現してもよいことは理解されるべきである。
【００８３】
本明細書に引用されたすべての参考文献の完全な開示物は、参照により本明細書に組み込まれているものとする。しかし、他の方法では妥協できない争いが生じた場合は、本明細書が効力をもつものとする。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
インビトロで灌流可能な微小血管のネットワークを作製するための方法であって、
マトリックス（１０５４）からマンドレル（２）を引き出して、マトリックスからチャネルを形成すること（１０１０）と、
細胞（１）をチャネルに注入すること（１０１４）と、
マトリックスをインキュベートして、細胞（１）をチャネル内部に付着させること（１０１６）と、
チャネルを灌流して（１０２０）未付着の細胞（１）を取り除き、チャネル内に、マトリックス（１０５４）において細胞（１）で裏打ちされた灌流可能な中空チャネルを含む親血管（１１０２）を作り出すこと（１０２２）と、
周囲にあるマトリックス（１０５４）中に芽（１１０６）を作り出すように親血管（１１０２）を誘導し、その結果、微小血管ネットワーク（２２２）を形成することと、
微小血管ネットワーク（２２２）を、親血管（１１０２）を通る管腔灌流にさらすことと
を含む方法。
【請求項２】
２つ以上のチャネルが複数のマンドレル（２）により形成され、マンドレル（２）が毛細管（９１６）を含み、少なくとも２つの親血管（１１０２）が、吻合して微小血管ネットワーク（２２２）を形成する芽（１１０６）を作り出すように誘導される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
少なくとも２つの親血管（１１０２）が灌流可能な血管の多次元の列（２２２）を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
チャネルの灌流（１０２０）が、血清および血管新生または血管新生抑制物質がない酸素添加細胞増殖培養液、血清を補充した酸素添加細胞増殖培養液、少なくとも１つの血管新生影響化合物、酸素添加生理食塩水、酸素添加血液、血液成分、代用血液、システムの酸素添加がマトリックスを介する拡散により実現される非酸素添加灌流液、灌流液に添加される少なくとも１つの血管新生および血管新生抑制化合物、ならびにマトリックス（１０５４）中の少なくとも１つの血管新生および血管新生抑制化合物を含む少なくとも１つの灌流液（２０４）を用いる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
細胞（１）が、灌流液（２０４）またはマトリックス（１０５４）中に産物を放出する遺伝子改変細胞（１）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
マトリックス（１０５４）が、フィブリン、コラーゲン、ゼラチン、ゲル状基底膜、寒天、アガロース、アルギン酸、基底膜タンパク質、シリカゲル、細胞およびその組合せからなるグループから選択される材料を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
細胞（１）が、マンドレル（２）の取り出し（１０１０）後のマトリックスチャネル中への注入（１０１２）、およびマンドレル（２）への事前付着とやはりマトリックス中への注入との組合せによる、マンドレル（２）への事前付着の少なくとも選択される１つの方法により、マトリックスチャネルに沈着される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
マンドレル（２）が、引き出し（１０１０）および分解のうちの少なくとも選択される１つの方法により、マトリックス（１０５４）から取り除かれる、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
細胞（１）が、内皮細胞、平滑筋細胞、周皮細胞、ヒト細胞、動物細胞、植物細胞、幹細胞、筋肉細胞、肝細胞、腎細胞、肺細胞、皮膚細胞、上皮細胞および遺伝子改変細胞からなるグループから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
マトリックス（１０５４）に、内皮細胞、平滑筋細胞、周皮細胞、ヒト細胞、動物細胞、植物細胞、幹細胞、筋肉細胞、肝細胞、腎細胞、肺細胞、皮膚細胞、上皮細胞および遺伝子改変細胞からなるグループから選択される細胞（１）を定植させる、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
健常または患部組織の断片がマトリックス（１０５４）に埋め込まれる、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
癌組織の断片がマトリックス（１０５４）に埋め込まれる、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
流体灌流液（２０４）が、灌流液（２０４）が圧力が高いほうの血管から圧力が低いほうの血管へ推進されるように、１つの親血管（２０２）への流動を減少させ、１つまたは複数の芽（２２０）により第１の血管に繋がれている第２の親血管（２００）での抵抗を増加することにより、毛細管（２０６）を通して経路が変更される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
微小血管（２２２）が、バイオ人工微小血管（２００）、開存性内皮細胞管（１１０２）、および平滑筋細胞管のうちの選択される１つを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
微小血管ネットワーク（２２２）が、灌流液（２０４）中に因子を放出する正常なまたは遺伝子改変細胞からなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
チャネルの灌流（１０２０）が、灌流液（２０４）中に因子を放出する正常または遺伝子改変細胞を使用することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
コラーゲンチャンバー（９０６）、複数の入口ポート（９１２）、少なくとも１つの毛細管（９１６）、および少なくとも１つの出口ポート（９１８）を含む培養灌流装置（ＣＰＤ）においてインビトロでヒト血管内皮細胞（１）から内皮親血管（１１０２）を作製するための方法であって、
チャンバー（９０６）がコラーゲンで満たされるまで、注射針を介してコラーゲン溶液をコラーゲンチャンバー（９０６）に注入すること（１００２）と、
入口ポートを満たし、複数の入口ポートおよび出口ポートを順次プライミングすることにより、ＣＰＤを灌流すること（１００８）と、
コラーゲンチャンバー中に少なくとも１つの灌流可能なチャネルを作製すること（１０１０）と、
内皮細胞（１）の濃縮された懸濁液を入口ポート中に注入すること（１０１２）と、
内皮細胞（１）を少なくとも１つの灌流可能なチャネルに注入すること（１０１４）と、
ＣＰＤをインキュベートして、内皮細胞（１）を少なくとも１つの灌流可能なチャネルの壁に付着させること（１０１６）と、
細胞（１）をＣＰＤ内に分配することと、
少なくとも１つの灌流可能なチャネルを灌流（１０２０）して、細胞の均一な単層を有する少なくとも１つの親血管（１１０２）を形成させることと
を含む方法。
【請求項１８】
インビトロで灌流可能な微小血管のネットワークを作製するための培養灌流装置であって、
マトリックス（１０５４）からマンドレル（９１６）を引き出して、マトリックスからチャネルを形成するための手段（１０１０）と、
内壁を有するチャネル中に細胞（１）を注入するための手段（１０１４）と、
マトリックス（１０５４）をインキュベートして、細胞（１）を内壁に付着させるための手段（１０１６）と、
チャネルを灌流して（１０２０）未付着の細胞を取り除き、親血管を作り出すための手段であって、親血管（１１０２）がマトリックス（１０５４）において細胞（１）で裏打ちされた灌流可能な中空チャネルを含む手段（１０２２）と、
周囲にあるマトリックス（１０５４）中に芽（１１０６）を作り出すように親血管（１１０２）を誘導し、その結果、微小血管ネットワーク（２２２）を形成するための手段と、
微小血管ネットワーク（２２２）を、親血管（１１０２）を通る管腔灌流（１０２０）にさらすための手段と
を含む装置。
【請求項１】
インビトロで灌流可能な微小血管のネットワークを作製するための方法であって、
マトリックス（１０５４）からマンドレル（２）を引き出して、マトリックスからチャネルを形成すること（１０１０）と、
細胞（１）をチャネルに注入すること（１０１４）と、
マトリックスをインキュベートして、細胞（１）をチャネル内部に付着させること（１０１６）と、
チャネルを灌流して（１０２０）未付着の細胞（１）を取り除き、チャネル内に、マトリックス（１０５４）において細胞（１）で裏打ちされた灌流可能な中空チャネルを含む親血管（１１０２）を作り出すこと（１０２２）と、
周囲にあるマトリックス（１０５４）中に芽（１１０６）を作り出すように親血管（１１０２）を誘導し、その結果、微小血管ネットワーク（２２２）を形成することと、
微小血管ネットワーク（２２２）を、親血管（１１０２）を通る管腔灌流にさらすことと
を含む方法。
【請求項２】
２つ以上のチャネルが複数のマンドレル（２）により形成され、マンドレル（２）が毛細管（９１６）を含み、少なくとも２つの親血管（１１０２）が、吻合して微小血管ネットワーク（２２２）を形成する芽（１１０６）を作り出すように誘導される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
少なくとも２つの親血管（１１０２）が灌流可能な血管の多次元の列（２２２）を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
チャネルの灌流（１０２０）が、血清および血管新生または血管新生抑制物質がない酸素添加細胞増殖培養液、血清を補充した酸素添加細胞増殖培養液、少なくとも１つの血管新生影響化合物、酸素添加生理食塩水、酸素添加血液、血液成分、代用血液、システムの酸素添加がマトリックスを介する拡散により実現される非酸素添加灌流液、灌流液に添加される少なくとも１つの血管新生および血管新生抑制化合物、ならびにマトリックス（１０５４）中の少なくとも１つの血管新生および血管新生抑制化合物を含む少なくとも１つの灌流液（２０４）を用いる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
細胞（１）が、灌流液（２０４）またはマトリックス（１０５４）中に産物を放出する遺伝子改変細胞（１）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
マトリックス（１０５４）が、フィブリン、コラーゲン、ゼラチン、ゲル状基底膜、寒天、アガロース、アルギン酸、基底膜タンパク質、シリカゲル、細胞およびその組合せからなるグループから選択される材料を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
細胞（１）が、マンドレル（２）の取り出し（１０１０）後のマトリックスチャネル中への注入（１０１２）、およびマンドレル（２）への事前付着とやはりマトリックス中への注入との組合せによる、マンドレル（２）への事前付着の少なくとも選択される１つの方法により、マトリックスチャネルに沈着される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
マンドレル（２）が、引き出し（１０１０）および分解のうちの少なくとも選択される１つの方法により、マトリックス（１０５４）から取り除かれる、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
細胞（１）が、内皮細胞、平滑筋細胞、周皮細胞、ヒト細胞、動物細胞、植物細胞、幹細胞、筋肉細胞、肝細胞、腎細胞、肺細胞、皮膚細胞、上皮細胞および遺伝子改変細胞からなるグループから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
マトリックス（１０５４）に、内皮細胞、平滑筋細胞、周皮細胞、ヒト細胞、動物細胞、植物細胞、幹細胞、筋肉細胞、肝細胞、腎細胞、肺細胞、皮膚細胞、上皮細胞および遺伝子改変細胞からなるグループから選択される細胞（１）を定植させる、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
健常または患部組織の断片がマトリックス（１０５４）に埋め込まれる、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
癌組織の断片がマトリックス（１０５４）に埋め込まれる、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
流体灌流液（２０４）が、灌流液（２０４）が圧力が高いほうの血管から圧力が低いほうの血管へ推進されるように、１つの親血管（２０２）への流動を減少させ、１つまたは複数の芽（２２０）により第１の血管に繋がれている第２の親血管（２００）での抵抗を増加することにより、毛細管（２０６）を通して経路が変更される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
微小血管（２２２）が、バイオ人工微小血管（２００）、開存性内皮細胞管（１１０２）、および平滑筋細胞管のうちの選択される１つを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
微小血管ネットワーク（２２２）が、灌流液（２０４）中に因子を放出する正常なまたは遺伝子改変細胞からなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
チャネルの灌流（１０２０）が、灌流液（２０４）中に因子を放出する正常または遺伝子改変細胞を使用することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
コラーゲンチャンバー（９０６）、複数の入口ポート（９１２）、少なくとも１つの毛細管（９１６）、および少なくとも１つの出口ポート（９１８）を含む培養灌流装置（ＣＰＤ）においてインビトロでヒト血管内皮細胞（１）から内皮親血管（１１０２）を作製するための方法であって、
チャンバー（９０６）がコラーゲンで満たされるまで、注射針を介してコラーゲン溶液をコラーゲンチャンバー（９０６）に注入すること（１００２）と、
入口ポートを満たし、複数の入口ポートおよび出口ポートを順次プライミングすることにより、ＣＰＤを灌流すること（１００８）と、
コラーゲンチャンバー中に少なくとも１つの灌流可能なチャネルを作製すること（１０１０）と、
内皮細胞（１）の濃縮された懸濁液を入口ポート中に注入すること（１０１２）と、
内皮細胞（１）を少なくとも１つの灌流可能なチャネルに注入すること（１０１４）と、
ＣＰＤをインキュベートして、内皮細胞（１）を少なくとも１つの灌流可能なチャネルの壁に付着させること（１０１６）と、
細胞（１）をＣＰＤ内に分配することと、
少なくとも１つの灌流可能なチャネルを灌流（１０２０）して、細胞の均一な単層を有する少なくとも１つの親血管（１１０２）を形成させることと
を含む方法。
【請求項１８】
インビトロで灌流可能な微小血管のネットワークを作製するための培養灌流装置であって、
マトリックス（１０５４）からマンドレル（９１６）を引き出して、マトリックスからチャネルを形成するための手段（１０１０）と、
内壁を有するチャネル中に細胞（１）を注入するための手段（１０１４）と、
マトリックス（１０５４）をインキュベートして、細胞（１）を内壁に付着させるための手段（１０１６）と、
チャネルを灌流して（１０２０）未付着の細胞を取り除き、親血管を作り出すための手段であって、親血管（１１０２）がマトリックス（１０５４）において細胞（１）で裏打ちされた灌流可能な中空チャネルを含む手段（１０２２）と、
周囲にあるマトリックス（１０５４）中に芽（１１０６）を作り出すように親血管（１１０２）を誘導し、その結果、微小血管ネットワーク（２２２）を形成するための手段と、
微小血管ネットワーク（２２２）を、親血管（１１０２）を通る管腔灌流（１０２０）にさらすための手段と
を含む装置。
【図１】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８ａ】
【図８ｂ】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８ａ】
【図８ｂ】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【公表番号】特表２０１０−５３９９３５（Ｐ２０１０−５３９９３５Ａ）
【公表日】平成２２年１２月２４日（２０１０．１２．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５２７０１４（Ｐ２０１０−５２７０１４）
【出願日】平成２０年９月１１日（２００８．９．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０７６０４２
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０４２４１８
【国際公開日】平成２１年４月２日（２００９．４．２）
【出願人】（５０９１２１８７９）ノーティス，インク． (3)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年１２月２４日（２０１０．１２．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年９月１１日（２００８．９．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０７６０４２
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０４２４１８
【国際公開日】平成２１年４月２日（２００９．４．２）
【出願人】（５０９１２１８７９）ノーティス，インク． (3)
【Ｆターム（参考）】
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