牛乳由来セリンプロテア−ゼインヒビタ−及びその製造法

【目的】特にトリプシンに対して強い阻害活性を有する物質とその製造法に関する。
【構成】牛乳及びホエ−に含有される分子量が60,000〜70,000の範囲である酸性タンパク質でセリンプロテア−ゼ活性を特異的に阻害することを特徴とする物質並びにこの物質を得るべく、ウシ初乳、常乳及び末期乳から得たホエ−を5.5又はそれ以上のpH環境下において陰イオン交換樹脂に吸着させることを特徴とする方法。

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】この発明は特にトリプシンに対して強い阻害活性を有する物質とその製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】セリンプロテア−ゼインヒビタ−については、1930〜1940年代にKunitzがウシ膵臓塩基性トリプシンインヒビタ−(M.Kunitz,J.H.Northrop,J.Gen.Physiol,19.991(1936))及び大豆トリプシンインヒビタ−(M.Kunitz,J.Gen.Physiol,29.149(1946))を結晶化して以来、多くの研究がなされてきた。ウシ初乳中のトリプシンインヒビタ−についても、1951年にラスコフスキ−らによつて報告されている(Laskowski,M.,Jr.,and Laskowski,M.,Federation Proc.,9,194(1950))。分子量10,500の低分子量のものと高分子量のものの２種類が存在するとされているが、その後このトリプシンインヒビタ−については、ほとんど検討されていない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】発明者らは、ウシ初乳から高分子量のセリンプロテア−ゼインヒビタ−(SPI)を精製することにより、特にトリプシンに対して強い阻害物質とその製造法を得ようとするものである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】すなわちこの発明は、牛乳及びホエ−に含有される分子量が60,000〜70,000の範囲である酸性タンパク質でセリンプロテア−ゼ活性を特異的に阻害することを特徴とする物質と、ウシ初乳、常乳及び末期乳から得たホエ−を5.5又はそれ以上のpH環境下において陰イオン交換樹脂に吸着させることを特徴とする物質の製造法を提案するものである。
【０００５】
【作用】ウシ初乳、常乳及び末期乳から得られるホエ−から5.5又はそれ以上のpH環境下で陰イオン交換樹脂に吸着させて分子量60,000〜70,000の範囲の酸性タンパク質でセリンプロテア−ゼ活性を特異的に阻害する物質を得る。
【０００６】
【実施例】SPIの精製に当つては、ウシ初乳から常乳によつてホエ−を得、DEAE（ジエチルアミノエチル基）-セルロ−スに吸着させ、1MのNaClで溶出させた画分を凍結乾燥したものをスタ−テイングマテリアルとして以下の精製に用いた。
【０００７】最初に、0.1MのTris-HClバツフア−(pH7.2)で平衡化したセフアロ−スCL-4Bカラムを用いたゲル濾過を行なつた。各フラクシヨンのSPI活性はトリプシンに基質となるカゼインを37℃で反応させ、TCA（トリクロロ酢酸）で反応を停止させたのち、遠心分離で沈殿を除いた上清のO.D 275nmを測定することによつて表した。
【０００８】
【表１】

【０００９】その結果、SPI活性はフラクシヨンNo.122〜126に強く認められたので、この部分を集め、トヨパ−ルHW-55によりリクロマトを行なつた。前記の方法でSPI活性を測定したところ、メインピ−クの前半にかかつたシヨルダ−部分に活性が認められた。さらに、この画分をHPLCで分析し、図１に示した結果を得た。この２つのピ−クのうち前の１のピ−クのみ強いSPI活性を有しており、２のピ−クに活性は認められなかつた。したがつて、１のピ−クのみを分取し、ウシ初乳SPIとして、種々の実験に用いた。
【００１０】また前述のスタ−テイングマテリアルからトリプシン−セフアロ−スカラムを用いたアフイニテイ−クロマトグラフイ−によつて同様なSPIが得られた。CNBr-activated Sepharose4Bにトリプシンをカツプリングさせ、初乳SPIを吸着させる。2MのNaClを含むTris-HClバツフア−(pH7.2)でゲルを洗い、pH12のバツフア−により溶出してくる画分にSPI活性が確認された。
【００１１】SPIの性状に関しては、精製したSPIは、Native PAGEとSDS-PAGEで共にシングルバンドとなり、SDS-PAGEの結果から、分子量は60,000〜70,000の範囲であつた。また２次元電気泳動の結果、等電点は酸性側となつた。
【００１２】次に、SPIのpH安定性と熱安定性について検討した。活性測定には、メチルクマリルアミドペプタイドを基質として用い、遊離してくるアミノメチルクマリンを、蛍光光度計で測定し、コントロ−ルに対する阻害率(%)で示した。
【００１３】
【表２】

【００１４】SPIはそれぞれのpHのバツフア−に溶かし、37℃で１時間、各pH状態に保つたのち測定した。その結果、SPIはpH５の弱酸性から中性域で安定であつた(図２)。熱安定性は65℃と80℃で０〜60分間の加熱を行ない、５分ごとにサンプリングして、阻害活性を測定した。80℃では、５分間の加熱でほぼ100%失活したのに対し、65℃の加熱では、活性はゆるやかに失なわれたが、60分間加熱後も７割程度は残していた（図３）。
【００１５】次にトリプシン以外のセリンプロテア−ゼとして、エラスタ−ゼ、プラスミン、MIP（戻り誘導酵素）について検討した。ここで、MIPとは、木下らによつて報告されているように、魚体の筋肉中に存在するセリンプロテア−ゼである。このプロテア−ゼは、加熱により活性化してミオシンを分解するため、カマボコ等の魚肉練り製品の「戻り」の原因とされている。今回用いたMIPはメルル−サ科パシフイツクヘイクのすり身より木下らの方法に準じて調製した。
【００１６】活性測定は前記のように各プロテア−ゼに対し特異性の高いメチルクマリルアミドペプタイドを基質に用い、トリプシン、エラスタ−ゼ、プラスミンは37℃で、MIPについては、至適温度である60℃で反応させ、SPI活性を測定した。
【００１７】＊使用した合成基質（ペプチド研）
トリプシン：Boc-Phe-Ser-Arg-MCAMIP ：Boc-Phe-Ser-Arg-MCAエラスタ−ゼ：Suc-Ala-Ala-Ala-MCAプラスミン：Boc-Val-Leu-Lys-MCA0.1Mリン酸バツフア−pH7.5(MIPのみpH7.0)に溶解して用いた。
【００１８】その結果、トリプシンに対し最も強い阻害活性を有し、次いでMIP、エラスタ−ゼ、プラスミンの順に活性は低下した（図４）。トリプシン活性は0.175μMのSPIで、MIP活性は1.4μMのSPIで完全に阻害された。また1.4μMのSPIでエラスタ−ゼは約40%、プラスミンは約20%阻害された（プラスミンにはほとんど作用しないと考えられた）。
【００１９】
【発明の効果】上述のようにしてこの発明によれば、セリンプロテア−ゼ活性を特異的に阻害する物質が得られた。
【図面の簡単な説明】
【図１】SPI活性のHPLCパタ−ンを示すグラフである。
【図２】SPIのpH安定性を示すグラフである。
【図３】SPIの温度安定性を示すグラフである。
【図４】各セリンプロテア−ゼに対するSPIの阻害効果を示すグラフである。

【特許請求の範囲】
【請求項１】牛乳及びホエ−に含有される分子量が60,000〜70,000の範囲である酸性タンパク質でセリンプロテア−ゼ活性を特異的に阻害することを特徴とする物質。
【請求項２】トリプシン活性を顕著に阻害し、その他のセリンプロテア−ゼ活性も阻害することを特徴とする請求項１記載の物質。
【請求項３】 pH５−７の範囲で安定であり、80℃、10分間の加熱で完全に失活することを特徴とする請求項１又は２記載の物質。
【請求項４】ウシ初乳、常乳及び末期乳から得たホエ−を5.5又はそれ以上のpH環境下において陰イオン交換樹脂に吸着させることを特徴とする請求項１，２，３のいずれかに記載の物質の製造法。
【請求項５】請求項４に記載したホエ−を分画分子量50,000のモジユ−ルを用いて限外濾過処理をしたリテンテイト又はそのリテンテイトをトリプシン又はその他のセリンプロテア−ゼを固定化した樹脂に特異的に吸着させることを特徴とした請求項１，２，３のいずれかに記載の物質の製造法。

【図１】