特定のポリヌクレオチドの検出方法及び当該方法に用いる検出用キット
【構成】 検出対象のその塩基配列が既知であるポリヌクレオチドに、当該ポリヌクレオチドの一部と相補的な配列を有しかつヌクレアーゼ耐性を有するオリゴヌクレオチドプライマーをハイブリダイズさせ、次いでこれに少なくとも１種のデオキシヌクレオシドトリリン酸、ＤＮＡポリメラーゼ及びヌクレアーゼを加えて、前記プライマーの３’末端に隣接しかつ前記ポリヌクレオチドと相補的である塩基種を相補鎖合成し引き続いて分解し、かつ当該相補鎖合成及び分解を少なくとも１回以上繰り返して、生成するピロリン酸又はデオキシヌクレオシドモノリン酸を検出することを特徴とする、前記ポリヌクレオチドの検出方法、並びに当該ポリヌクレオチドの検出方法に用いる検出用キット。
【効果】 遺伝的疾患や感染症の診断に有効な試料中に存在する特定の塩基配列を含むポリヌクレオチドの検出方法及び当該検出方法に使用するポリヌクレオチド検出用キットが提供される。
【効果】 遺伝的疾患や感染症の診断に有効な試料中に存在する特定の塩基配列を含むポリヌクレオチドの検出方法及び当該検出方法に使用するポリヌクレオチド検出用キットが提供される。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、遺伝的疾患や感染症の診断に有効な試料中に存在する特定の塩基配列を含むポリヌクレオチド（以下、標的ポリヌクレオチドという）の検出方法、及び当該検出方法に使用するポリヌクレオチド検出用キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】核酸塩基配列の相補性に基づく分析方法は、遺伝的な特徴を直接的に分析することが可能である。そのため、遺伝的疾患、癌化、微生物の識別等には非常に有力な手段である。また遺伝子そのものを検出対象とするために、例えば培養のような時間と手間のかかる操作を省略できる場合もある。
【０００３】しかし、検体中に目的の遺伝子量が少ない場合の検出は一般に容易ではなく、標的遺伝子そのものを、あるいは検出シグナル等を増幅することが必要となる。標的遺伝子を増幅する方法の一つとしてＰＣＲ(Polymerase Chain Reaction) 法が知られている。ＰＣＲ法は、in vitroにおける核酸の増幅技術として最も一般的な方法である。しかしながら、当該ＰＣＲ法においては、実施のために特別な温度調節装置が必要なこと；増幅反応が対数的に進むことから定量性に問題があること；試料や反応液が外部からの汚染を受け、誤って混入した核酸が鋳型として機能してしまうコンタミネーションの影響を受け易いこと等の問題点が知られている。
【０００４】即ち、ＰＣＲのようにＤＮＡを数百万倍にまで増幅させる反応では混入した微量ＤＮＡも同様に増幅されるため、誤った結果が提供される傾向がある。これは特に多数の検体を同時に扱う場合には重大な問題である。かかるコンタミネーション対策として、実験室を区別したり、あるいはＰＣＲ反応でウラシル基を取り込ませておき、新たにＰＣＲ反応を行う前にその検体をウラシルグリコシラーゼ処理し、検体中に誤って混入した他の反応系の増幅産物のみを分解するというような工夫がなされているが、前記対策としては必ずしも十分ではない。
【０００５】また、検出シグナルを増幅する方法としてはＱβレプリカーゼでシグナルＲＮＡを増幅する方法（Bio/Technology, 6, 1197-1202(1988), P.M.Lizardi et al.）が報告されている。しかし、この方法は増幅させる配列をレプリカーゼが認識する配列内に挿入する必要があり、その立体構造上の制約から挿入の位置や配列が制限される等の問題がある。またＱβレプリカーゼでシグナルＲＮＡを増幅する方法でもＰＣＲ法と同様のコンタミネーションの問題があり、根本的な解決とは言い難い。
【０００６】前記の方法は検出対象となる塩基配列を増幅する方法であるが、更に以下に述べるような分解産物を検出するシグナル増幅法も考案されている。例えば、標的核酸にオリゴヌクレオチドプローブＤＮＡをハイブリダイズさせた後、制限酵素処理し、切断されたプローブ断片を検出するシグナル増幅法が知られている(EP-0455517/A1) 。この方法は、ＰＣＲ法に比べて検出感度は低いものの、定量性に優れ、実施に際して特別な装置を必要としない等の利点がある。しかし、この方法ではプローブＤＮＡ以外に反応が繰り返し起こるようにするための特異的な配列を持つ第二のオリゴヌクレオチドを系に共存させる必要がある。また検出する部位に制限酵素切断部位が必要であるために検出可能な部位が制限される等の欠点も持つ。
【０００７】そのほかに２本鎖ＤＮＡを特異的に切断するλエクソヌクレアーゼを用いたサイクリングアッセイ法も開発されている（BioTechniques, Vol.13, No.6, 882-892(1992), C.G. Copley et al.）。この方法は、オリゴヌクレオチドプローブが相補的な配列とハイブリダイズして形成された２本鎖ＤＮＡにλエクソヌクレアーゼを作用させ、プローブＤＮＡが２本鎖を維持できない程度まで分解されると新たなプローブＤＮＡと置き替わり、続いてこの新たなプローブも分解されることによりサイクリング反応が起こるというものである。この方法は、当該プローブの分解産物を検出することにより特定のＤＮＡ配列の有無を判定することが可能である。また反応原理が単純であり、しかも検出部位の配列が制限されないという点では制限酵素を用いる方法(EP-0455517/A1) よりも有利である。
【０００８】しかし、λエクソヌクレアーゼは基質として５’末端がリン酸化されたプローブＤＮＡを要求する。ＤＮＡ合成機を用いてプローブＤＮＡを化学合成した場合５’末端はリン酸化されておらず、そのため合成後改めて末端をリン酸化する必要がある。そして、５’末端が完全にリン酸化されているのかどうかを確認することが難しいためプローブ調製の再現性の点で問題が残る。更に、λエクソヌクレアーゼを用いたサイクリングアッセイ法はプローブＤＮＡが鋳型ＤＮＡに繰り返しハイブリダイズすることが必要であるが、ハイブリダイゼーションの反応は一定温度では起こりにくいため、これが反応系全体における律速となり、サイクリング反応のターンオーバー数が少ないという問題点もある（文献では約５００回／時間）。
【０００９】エクソヌクレアーゼを用いたサイクリングアッセイ法としては、特開平５−130870号公報記載の方法も知られている。この公報記載の方法はプライマーを起点とする相補鎖の合成反応とともに５’→３’エクソヌクレアーゼを作用させてプライマーを逆方向から分解する方法である。即ち、５’→３’エクソヌクレアーゼによって分解されたプライマーに代って新たなプライマーがハイブリダイズし、ＤＮＡポリメラーゼによって相補鎖の合成と先に合成された鎖を外す反応が進行しサイクリング反応が成立する。当該方法においては、ＰＣＲ反応のような複雑な温度制御は要求されないが、プライマーのハイブリダイズ工程を繰り返す必要があるのでやはりターンオーバー数（プローブＤＮＡのハイブリダイゼーションの繰り返し数）を上げにくいという問題が残る。
【００１０】本発明者等は、これらの問題点の解消を目的として、特定の反応促進剤をエクソヌクレアーゼIII とともに用いる塩基配列検出方法を開発した（特開平6-327499号公報）。この方法はプローブの合成が容易な上、反応時には特殊な温度制御が不要となり、しかもコンタミネーションの影響を殆ど受けずに塩基配列を検出することが可能となる優れた方法である。しかし、この技術では反応促進剤は、ターンオーバー数（λエクソヌクレアーゼを用いたサイクリングアッセイ法での説明と同様のプローブＤＮＡのハイブリダイゼーションの繰り返し数）を増加させる効果は認められるものの、プローブＤＮＡが繰り返しハイブリダイズしなければならないことには変わりはなく、必ずしも高感度を得られないという問題点を残していた。
【００１１】加えて今まで述べた遺伝子の増幅法においては、プライマーとして加えたオリゴヌクレオチドは増幅産物となってプライマーとしては機能しなくなるので、予め予想される検出対象量に対して大過剰量のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用意しなければならない。特にＰＣＲ法のように対数的に増幅産物が生成する系では、非常に多量のオリゴヌクレオチドを用意する必要があった。オリゴヌクレオチドプライマーは化学的に合成するにしろ、生物材料に原料を求めるにしろ試薬成分のコストの点から使用量は少ない方が好ましい。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、特殊な装置が要求される複雑な温度制御によらず、単純な反応系でコンタミネーションの影響を受け難い塩基配列の検出技術の提供を課題とする。また本発明は、これらの目的を達成するために検出対象となる塩基配列の制限のない、汎用性に優れる検出技術の提供をも課題とするものである。更に、検出系の選択によっては高い感度と定量性を得ることが可能な塩基配列の検出技術の提供をも課題とするものである。
【００１３】
【課題を解決するための手段】本発明者等は、前記課題の解決を目的として鋭意検討を行った。その結果、一本鎖ＤＮＡには作用せず二本鎖となったＤＮＡのみを切断し、かつ塩基配列には限定されないヌクレアーゼをＤＮＡポリメラーゼとともに利用したシグナル増幅法を開発し、本発明を完成した。
【００１４】即ち、本発明は以下の事項をその要旨とするものである。
(1)検出対象のその塩基配列が既知であるポリヌクレオチドに、当該ポリヌクレオチドの一部と相補的な配列を有しかつヌクレアーゼ耐性を有するオリゴヌクレオチドプライマーをハイブリダイズさせ、次いでこれに少なくとも１種のデオキシヌクレオシドトリリン酸、ＤＮＡポリメラーゼ及びヌクレアーゼを加えて、前記プライマーの３’末端に隣接しかつ前記ポリヌクレオチドと相補的である塩基種を相補鎖合成し引き続いて分解し、かつ当該相補鎖合成及び分解を少なくとも１回以上繰り返して、生成するピロリン酸又はデオキシヌクレオシドモノリン酸を検出することを特徴とする、前記ポリヌクレオチドの検出方法。
【００１５】(2)オリゴヌクレオチドプライマーが、当該オリゴヌクレオチドプライマーの３’末端でホスホロチオエート化されたものであることを特徴とする前記(1) 記載のポリヌクレオチドの検出方法。
【００１６】(3)ＤＮＡポリメラーゼが、ＤＮＡポリメラーゼＩ、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメント、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ及びＰｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼからなる群から選ばれるＤＮＡポリメラーゼであることを特徴とする前記(1) 又は(2) 記載のポリヌクレオチドの検出方法。
【００１７】(4)ヌクレアーゼがエクソヌクレアーゼIII であることを特徴とする前記(1) 〜(3) のいずれかに記載のポリヌクレオチドの検出方法。
【００１８】(5)デオキシヌクレオシドトリリン酸のβ位及びγ位のリン酸分子以外の分子又は原子が、放射性同位元素で置換標識されており、かつヌクレアーゼによる反応により生成するデオキシヌクレオシドモノリン酸を検出することを特徴とする前記(1) 〜(4) のいずれかに記載のポリヌクレオチドの検出方法。
【００１９】(6)ヌクレアーゼによる反応により生成するデオキシヌクレオシドモノリン酸をクロマトグラフィーによって分離し当該デオキシヌクレオシドモノリン酸を光学的に測定することを特徴とする前記(1) 〜(4) のいずれかに記載のポリヌクレオチドの検出方法。
【００２０】(7)前記(1) 〜(4) のいずれかに記載のポリヌクレオチドの検出方法において、ＤＮＡポリメラーゼによる相補鎖合成により生成するピロリン酸を、アデノシン−５’−ホスホサルフェート及びアデノシントリリン酸スルフリラーゼと反応させてアデノシントリリン酸を生成させ、当該アデノシントリリン酸を検出することを特徴とするポリヌクレオチドの検出方法。
【００２１】(8)アデノシントリリン酸をルシフェリン−ルシフェラーゼ反応によって測定することを特徴とする前記(7) 記載のポリヌクレオチドの検出方法。
【００２２】(9)以下の１〜４の成分：１．検出対象のその塩基配列が既知であるポリヌクレオチドの一部と相補的な配列を有しかつヌクレアーゼ耐性を有するオリゴヌクレオチドプライマー、２．ＤＮＡポリメラーゼ、３．少なくとも１種のデオキシヌクレオシドトリリン酸、及び４．３’→５’方向に２本鎖ＤＮＡを分解する活性を有するヌクレアーゼ。を含む前記(1) 〜(8) のいずれかに記載のポリヌクレオチドの検出方法に使用するポリヌクレオチド検出用キット。
【００２３】(10) 前記(9) 記載のポリヌクレオチド検出用キットにおいて、当該検出用キットに、デオキシヌクレオシドモノリン酸検出用試薬を含有させたことを特徴とするポリヌクレオチド検出用キット。
【００２４】(11) 前記(9) 記載のポリヌクレオチド検出用キットにおいて、当該検出用キットに、ピロリン酸検出用試薬を含有させたことを特徴とするポリヌクレオチド検出用キット。
【００２５】以下、本発明について詳細に説明する。
Ａ．本発明の検出対象は、その塩基配列が既知のポリヌクレオチドである。本発明の検出対象は、動物、植物、細菌、酵母、糸状菌、マイコプラズマ、リケッチア、ウイルス他あらゆるものに由来するポリヌクレオチドにおよぶ。またポリヌクレオチドとしては、ゲノミック核酸はもちろん、ＲＮＡウイルスやｍＲＮＡから誘導されたｃＤＮＡを検出対象とすることも可能である。なお実際に検体を分析するときには、検体に含まれる検出対象以外のＤＮＡの配列や、ＤＮＡ合成のプライマーとなりうる配列の存在が問題となることがある。また、ＤＮＡポリメラーゼやヌクレアーゼの活性阻害物質、デオキシヌクレオシドトリリン酸も混入している可能性もある。更にピロリン酸を検出対象とする場合には、検体中に共存するピロリン酸も分析を妨害する要因となる。
【００２６】従って、本発明においては増幅反応を行うためには可能な限り前記混入物を除去することが好ましい。例えば、固相に結合した捕捉プローブ等を用いて標的ＤＮＡを捕捉し、続いて洗浄により前記不純物を除去し、その後に本発明を適用するとバックグランドのない高感度の検出系が可能となる。このとき捕捉プローブを５’末端で固相と結合しておけば（Eur.J.Immunol., 23, 1895-1901(1993), H.Kohsaka et al.; Nucleic Acids Research,21, 3469-3472 (1993), H.Kohsakaet al. )、捕捉プローブそのものをプライマーとして本実験の方法を適用することも可能となる。なお、前記ピロリン酸の除去についてはピロホスファターゼによる酵素的な除去も可能である。
【００２７】また、特に１塩基の伸長〜分解を１サイクルとして繰り返す、本発明の好ましい方法においては、後述するように点突然変異の検出に応用することができる。なお、点突然変異の検出方法として、特開昭59-208465 号公報記載の方法が既に知られている。この方法は、プライマーに続く相補配列の合成反応において基質としてヌクレオチドの誘導体を用いることによって点突然変異が存在する場合（又は存在しない場合）に限りこのヌクレオチド誘導体が取り込まれるという反応原理に基づく方法である。即ち、基質としてヌクレオチド誘導体を取り込んだ場合には反応産物がエクソヌクレアーゼに対する耐性を獲得するので、当該ヌクレアーゼによるヌクレオチドの分解の有無を特定することによって点突然変異を検出することができる。
【００２８】確かに、前記方法で用いられている要素の一部は本発明と共通するものである。しかしながら、そもそも前記方法がヌクレアーゼ耐性獲得の有無を点突然変異が存在する指標とすることを特徴とする方法であるのに対し、本発明は反応が繰り返し起きるかどうかを点突然変異の存在の指標として用いるものであるという点において本質的に異なる。そして、本発明方法による点突然変異の検出は、前記方法による当該変異の検出に比べても感度の点で良好であり有利である。
【００２９】Ｂ．本発明は、前記の既知のポリヌクレオチドに、当該ポリヌクレオチドの一部と相補的な配列を有しかつヌクレアーゼ耐性を有するオリゴヌクレオチドプライマーをハイブリダイズさせることを特徴とする。本発明において、「相補的」とは、塩基配列が塩基対のワトソン・クリック則に従って、もう一方の核酸と水素結合による二重鎖を形成し得る状態のことをいう。具体的には、アデニン（Ａ）に対してはチミン（Ｔ）；グアニン（Ｇ）に対してはシトシン（Ｃ）が対応する相補性を有する状態である。なお、本発明に用いるプライマーは、標的となるポリヌクレオチドの塩基配列に対して完全に相補的である必要はなく、少なくとも当該オリゴヌクレオチドが全体として前記標的ポリヌクレオチドに対してハイブリダイズすることが可能であれば足りる。具体的には、オリゴヌクレオチドの３’末端の塩基が標的ポリヌクレオチドの塩基と対応することを必須として、オリゴヌクレオチドの塩基全体の少なくとも70％が前記の相補性を標的ポリヌクレオチドとの関係において有することが必要である。かかる相補性が70％未満になると前記ハイブリダイズ自体が困難になるため好ましくない。一方、３’末端の塩基が標的ポリヌクレオチドの塩基と対応するという条件は、本発明が３’末端において塩基の付加反応を行うための必須の条件である。３’末端で塩基が対応せずプライマーが１本鎖となっていると、ポリメラーゼやヌクレアーゼが認識できなくなってしまう。
【００３０】また、本発明に用いるオリゴヌクレオチドプライマーは、既知の標的ポリヌクレオチドの「一部」と相補的であることを特徴とする。これは、本発明方法が、オリゴヌクレオチドプライマーの３’末端側にＤＮＡポリメラーゼによって付加される予め反応系に存在させた特定のデオキシヌクレオチドを検出することを特徴とすることに起因する。即ち、プライマーの３’末端側に付加されるデオキシヌクレオチドに対して鋳型となるヌクレオチドが既知でなければ、予め特定のデオキシヌクレオチドを系内に存在させることが困難である故に、本発明に用いるオリゴヌクレオチドプライマーは、既知の標的ポリヌクレオチドの「一部」と相補的であることが必要となる。
【００３１】また、本発明に用いるオリゴヌクレオチドプライマーは、ヌクレアーゼに対して耐性を有することが必要である。これは、本発明においては、系内にヌクレアーゼを存在させることが必要であるため、かかるヌクレアーゼによりオリゴヌクレオチドプライマーが分解されてしまえば本発明方法を実施することが困難になるからである。オリゴヌクレオチドプライマーにヌクレアーゼ耐性を付与する方法は特に限定されるものではなく、この分野において通常用いられる方法をいずれも利用することができる。
【００３２】具体的には、例えばＤＮＡ合成装置でプライマーとなるオリゴヌクレオチドを合成するときに公知の方法によって必要な部位にホスホロチオエート(Phosphorothioate)結合を導入すればオリゴヌクレオチドプライマーにヌクレアーゼ耐性を与えることができる。このような方法としては、例えば固相ホスホルアミダイト(Phosphoramidite) 法でＤＮＡを合成する場合であれば、ヨウ素水等による酸化工程に代えて適当なＳ化試薬（ホスホロチオエート化試薬）によって酸化処理を行うことで通常のリン酸ジエステル結合ではなくホスホロチオエート結合をオリゴヌクレオチドに導入することができる。Ｓ化試薬としては、３Ｈ-1,2-benzodithiole-3-one 1,1-dioxide(Beaucage's Reagent)、TETD/Acetonitrile(TETD:tetraethylthiuram disulfide) 等が知られている。この方法によれば、ホスホロチオエート結合をオリゴヌクレオチドの任意の部位に導入することができる。
【００３３】あるいは、ＤＮＡポリメラーゼによってＤＮＡを合成する際に、デオキシリボヌクレオシドトリリン酸のα位のリン原子に結合した酸素を硫黄に置換したものを基質として用いることによってオリゴヌクレオチドにホスホロチオエート結合を導入することができる。このような置換化合物としては、α−Ｓ−デオキシチミジントリリン酸、α−Ｓ−デオキシシトシントリリン酸、α−Ｓ−デオキシアデニントリリン酸及びα−Ｓ−デオキシグアニントリリン酸等（これらの置換化合物を総称してＳｄＸＴＰと省略する）を例示することができる。ＤＮＡポリメラーゼによる合成反応を行うときに、デオキシヌクレオシドトリリン酸（以下、ｄＸＴＰと省略する）に代えてＳｄＸＴＰを基質とすることにより、合成されたオリゴヌクレオチドはホスホロチオエート化され、ヌクレアーゼ耐性を獲得する。ＤＮＡポリメラーゼによってホスホロチオエート結合を導入する場合は、実際に検出対象であるポリヌクレオチドにハイブリダイズした状態でこの反応を進行させることができる。つまり、本発明におけるヌクレアーゼ耐性オリゴヌクレオチドプライマーは、必ずしも予め準備されている必要はなく反応時にヌクレアーゼ耐性を獲得する方法を採ることも可能である。
【００３４】一旦ヌクレアーゼ耐性とすれば以降の反応を後述する反応原理に従って進行させることができる。なお、この場合はまずＳｄＸＴＰが付加し、次いでｄＸＴＰが付加し、少なくとも２塩基分の伸長反応が必要になるが、２つめのｄＸＴＰに対してはヌクレアーゼが作用するので本発明方法を実施することができる。いずれにしても、プライマーの３’末端付近のホスホジエステル結合をホスホロチオエート結合とすることによって、３’側から攻撃するヌクレアーゼに耐性を示すオリゴヌクレオチドプライマーとなる。ただし、オリゴヌクレオチド全体をホスホロチオエート結合とすればヌクレアーゼ耐性度は更に上昇するが、同時にハイブリダイズする効率が低下することになる。従ってホスホロチオエート結合の数は、末端から１〜数個とすることが好ましい。ホスホロチオエート結合は末端の１個のみでもよいが、数個分、好ましくは３個分を連続してホスホロチオエート結合とすれば、より完全なヌクレアーゼ耐性を期待できる。
【００３５】ただし、前記のようにＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡへの取り込みの効率はＳｄＸＴＰがｄＸＴＰよりかなり低いので、始めにＳｄＸＴＰを取り込ませた後に分解用のｄＸＴＰを加えるか、あるいはＳｄＸＴＰ濃度を高めに設定しておくといった工夫が必要な場合もある。
【００３６】ヌクレアーゼ耐性の付与手段としては、前記ホスホロチオエート化の他に、メチルホスホネート(Methylphosphonate) 結合、ホスホロアミデート(Phosphoroamidate)結合、ポリアミド核酸(Polyamide nucleic acid(PNA) )結合等の導入を示すことができる。これらの結合によってヌクレオチドのリン酸結合部位、リボース部位、そして核酸の塩基部位が修飾、あるいは構造をモディファイされてヌクレアーゼ耐性を獲得する。
【００３７】この他に、オリゴヌクレオチドプライマーとしてＲＮＡプライマーを用いることも可能である。ＲＮＡはＤＮＡに作用するヌクレアーゼに対してほぼ耐性を有するものである。従って、ＲＮＡプライマーを用いれば、特別な修飾を施さなくてもＤＮＡに作用するヌクレアーゼ耐性を有するオリゴヌクレオチドプライマーを用意することが可能である。ただし、ＤＮＡに作用するヌクレアーゼやＤＮＡポリメラーゼの中にはＲＮａｓｅＨ活性を併せ持つものも存在し、このような場合にはＲＮＡプライマー自身が分解されるため酵素の組み合わせによっては高感度を得にくい場合もある。
【００３８】本発明におけるオリゴヌクレオチドプライマーは、塩基数で少なくとも６以上、好ましくは10〜50、特に好ましくは15〜30程度とする。６未満では通常の条件ではハイブリダイズしにくいばかりでなく、確率的にも非特異的な反応につながる可能性が増す。他方例えばホスホロチオエート化することによってヌクレアーゼ耐性としたオリゴヌクレオチドプライマーは、鋳型に対する親和性（Ｔｍ）が低下するので、この低下分を補うためにもある程度の長さを与えることが必要になる。これに対して30を越えると化学的に合成する時に収率が低下し易くなるので経済的に不利であるので好ましくない。更に、必要以上に長いプライマーを用いる場合はプライマー間、あるいはプライマー内の水素結合による２本鎖が形成されやすくなり非特異的な反応が起こりやすくなる。このように不必要に長いプライマーは、非特異増幅等の原因となる場合が有るので好ましくない。
【００３９】なお、本発明に使用し得るＤＮＡポリメラーゼは後述するが、その中にはＤＮＡポリメラーゼＩのように弱いながら２本鎖ＤＮＡに対する５’→３’エクソヌクレアーゼ活性を有するものも存在する。この種の酵素をＤＮＡポリメラーゼとして用いる時にはハイブリダイズしたプローブが５’側からの分解を受けるので５’側もヌクレアーゼ耐性としておくとよい。なお、同じＤＮＡポリメラーゼでもクレノウフラグメントやＰｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼはこの活性を有しないので５’側は特に修飾する必要がなく、この点においては好ましい。
【００４０】オリゴヌクレオチドプライマーの使用量は、検出対象となる塩基配列に対して十分量となるように添加する。従来の塩基配列の増幅法では、プライマーとして加えたオリゴヌクレオチドが増幅産物となってプライマーとしては機能しなくなるので鋳型となる塩基配列の量に対して大過剰量で用いる必要があったが、本発明では１度ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドプライマーが繰り返しプライマーとして機能するため少なくとも鋳型となる塩基配列と等モル存在すれば定量的な反応が可能となる。実際には、平衡状態をハイブリダイズする方に傾けるために十分量のオリゴヌクレオチドプライマーを利用するのが好ましい。検出対象となる標的配列の量をあらかじめ予想することは困難であるが、少なくとも希望する検出範囲の量に対して等モルを越える量を、好ましくは５倍以上の過剰量でオリゴヌクレオチドプライマーを用いることが高い感度を確保するうえで好ましい条件となる。
【００４１】ハイブリダイズの条件は特に限定されないが、ハイブリダイズ後はＤＮＡポリメラーゼとヌクレアーゼの存在下で全ての反応を進行させる必要があることに着目する必要がある。特にヌクレアーゼはＰＣＲ法で用いられるＴａｑポリメラーゼのような高度の耐熱性を持たないので、当該ヌクレアーゼの酵素活性を維持できる条件を採用する必要がある。また温度以外の要素である緩衝液の選択やｐＨの設定等も、ハイブリダイズのみならずヌクレアーゼの活性が十分に発現できる条件を選択すべきである。具体的な条件を例示すれば、緩衝液としてトリス−塩酸緩衝液等を用いたとき、ｐＨは約７〜９とし、20〜55℃で反応を行わせる。特に好ましい条件としては、ｐＨ7.5 〜8.5 、温度は30〜45℃を示すことができる。
【００４２】例えば、実施例に示したように、0.1pmol のプライマー、50mMのＴｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液（pH7.5)、10mM ＭｇＣｌ2 のみからなる溶液中で加熱処理（100 ℃で５分間）後、65℃で10分間アニーリングする。この場合は、すぐに37℃でＤＮＡポリメラーゼ反応及びヌクレアーゼ反応を進行させることが可能である。なお、最終的に反応系に蓄積されるピロリン酸を酵素的に測定する場合には、この酵素反応についても好適な反応条件が提供されなければならない。即ちｐＨ、塩濃度、温度等を酵素反応に適するように設定する。
【００４３】また、反応液中にＤＮＡポリメラーゼやヌクレアーゼの安定化剤を添加することができる。かかる安定化剤としては、例えば牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、β−メルカプトエタノール等を挙げることができる。かかる安定化剤の添加量は、ＢＳＡは10〜500 μg/ml、ＤＴＴは１mM程度、β−メルカプトエタノールは10mM程度である。検出対象となるポリヌクレオチドが二本鎖状態である場合には、予め一本鎖に変性する必要がある。かかる変性方法としては、通常公知の変性方法、例えば加熱変性、酸変性、アルカリ変性等を挙げることができるが、方法の簡便性と確実性に鑑みれば、加熱変性（90℃〜100 ℃で５分以上加熱）を採用するのが好ましい。
【００４４】また、目的としたプライマー以外のＤＮＡのハイブリダイズを抑制するか、又は非特異的にハイブリダイズしたＤＮＡを除去して非特異的な反応を抑制するために、ＤＮＡポリメラーゼ添加前にあらかじめエクソヌクレアーゼ処理を行うこともできる。
【００４５】Ｃ．本発明は、次いで、前記ハイブリダイズの後、系に少なくとも１種のデオキシヌクレオシドトリリン酸、ＤＮＡポリメラーゼ及びヌクレアーゼを加えて、前記プライマーの３’末端に隣接しかつ前記ポリヌクレオチドと相補的である塩基種を相補鎖合成し引き続いて分解し、かつ当該相補鎖合成及び分解を少なくとも１回以上繰り返すことを特徴とする。以下に本発明の反応原理を示す。本発明の反応原理を図１及び下記式１に示す。
【００４６】
【化１】
【００４７】まず、検出対象となる１本鎖の核酸にハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドプライマーをもとにＤＮＡポリメラーゼの作用によって相補鎖の合成がスタートする。このときに１分子のｄＸＴＰの付加にともない１分子のピロリン酸（以下ＰＰｉと省略することもある）が生成する。一方、この状態で２本鎖のＤＮＡの３’末端から分解していくヌクレアーゼを作用させると、伸長した部分を分解する反応が進行する。しかしオリゴヌクレオチドプライマーはヌクレアーゼ耐性であるためプライマー部分は分解されないでそのまま残り、再度ＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応の起点となる。このように繰り返し反応が起ることによって反応系にはピロリン酸、あるいはヌクレアーゼの分解によって生成するデオキシヌクレオシドモノリン酸が蓄積していく。
【００４８】なお前述したように、前記反応時にＤＮＡポリメラーゼの作用により、オリゴヌクレオチドプライマーをヌクレアーゼ耐性として前記工程に付することも可能である。このピロリン酸か、又はヌクレアーゼによる分解によって生成するデオキシヌクレオシドモノリン酸を検出することによって検出対象となる塩基配列の有無を検出又は定量することが可能となる。
【００４９】更に、本発明の検出方法によって点突然変異を検出する系を構成することが可能である。即ち、予め点突然変異の起る部位がわかっている場合に、当該部位の５’側に隣接する領域に相補な配列をオリゴヌクレオチドプライマーとして利用する。伸長する鎖の基質となるｄＸＴＰとして、正常な配列のときのみ伸長が起るように１種の基質のみ加えておけば、点突然変異がおきている場合には伸長できないので反応が停止する。このようにして点突然変異の有無を容易に確認することが可能となる（下記式２）。
【００５０】
【化２】
【００５１】またオリゴヌクレオチドプライマーがハイブリダイズすべき領域に変異が起れば、当然のことながらハイブリダイズの効率が低下するので反応全体が進行しにくくなり、これにより点突然変異の有無を知ることができる。前記において使用するＤＮＡポリメラーゼは、鋳型となる１本鎖の核酸に相補鎖がハイブリダイズして構成された２本鎖部分を起点として５’→３’方向に相補鎖を伸長する反応を触媒するＤＮＡポリメラーゼを用いる。実際には現在知られているＤＮＡポリメラーゼは、全て５’→３’方向へのＤＮＡ合成酵素活性を持つ。また、ＤＮＡ合成が起こるには必ずプライマーが必要であり、プライマーが存在しない場合やハイブリダイズできない場合にはＤＮＡの合成は起こり得ない。これが、本発明がプライマーと鋳型鎖に依存して特異性が高くなる理由の一つである。具体的に本発明において用いるＤＮＡポリメラーゼとしては、ＤＮＡポリメラーゼＩ、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメント、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ等又はこれらのＤＮＡポリメラーゼの変異体を挙げることができる。
【００５２】なお、ＤＮＡポリメラーゼとしてＴ４ＤＮＡポリメラーゼやＴ７ＤＮＡポリメラーゼのように強力な３’→５’エクソヌクレアーゼ活性を併せ持つものを用いれば、別途添加するヌクレアーゼ量を節約することが可能であり、又は核酸に作用する酵素として１種の強力な３’→５’エクソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼのみを加えることで本発明の反応系を構成することも可能である。ただし、これらのＤＮＡポリメラーゼはヌクレアーゼ耐性であるホスホロチオエート結合もある程度分解するので、高感度を期待できない場合もあり得る。故に、この場合はプライマーの末端付近のホスホジエステル結合を、複数の結合に亙って修飾するか、あるいはホスホロチオエート化以外の修飾によってヌクレアーゼ耐性とすることが望ましい。
【００５３】前記において使用するヌクレアーゼは、２本鎖のＤＮＡを３’→５’方向に分解する活性を持つヌクレアーゼである。このようなヌクレアーゼとしては、エクソヌクレアーゼIII が知られている。エクソヌクレアーゼIII としては現在のところ大腸菌由来のものが市販されているが、これに限定されるものではなく他の微生物やあるいは遺伝子組み換えによって得られたものであっても利用することができる。エクソヌクレアーゼIII を用いた場合には、ＤＮＡポリメラーゼとして例示したＤＮＡポリメラーゼＩ、そのクレノウフラグメント、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ等とほぼ同じ反応条件で酵素活性を示すため、ＤＮＡポリメラーゼによる反応と平行して同一の反応液中で同時に反応を進行させることができる。エクソヌクレアーゼIII は、２本鎖ＤＮＡを３’→５’方向に特異的に分解すること、１本鎖ＤＮＡには作用しないので検出対象である配列やプライマーは攻撃されない、ＳｄＸＴＰによりプライマーを簡単にヌクレアーゼ耐性にすることができる、等の特徴から本発明の反応サイクルの循環に非常に好適な酵素である。
【００５４】ＤＮＡポリメラーゼによるオリゴヌクレオチドプライマーを起点とするＤＮＡの伸長反応の基質には、デオキシヌクレオシドトリリン酸（ｄＸＴＰ）を用いる。そして、本発明においては予め配列の明らかな部分について少なくとも１塩基分が伸長すれば分析が可能となるので、少なくともこの１塩基分に対応する１種のヌクレオチドのみを用いることで所望の反応を進行させることができる。当該基質濃度は、検出対象となる塩基配列のモル数に対して十分量となるように添加する。一般的には検出対象の量を正確に予測することは困難なので、少なくとも0.1 μM 、好ましくは１μM 以上のヌクレオチドを添加しておけば、ほとんどの場合は基質が不足する事態を避けることができる。
【００５５】Ｄ．本発明は、生成するピロリン酸又はデオキシヌクレオシドモノリン酸を検出することを特徴とする。
■生成するデオキシヌクレオシドモノリン酸の検出本発明方法では、ヌクレアーゼによるヌクレオチド鎖の分解反応により生成するデオキシヌクレオシドモノリン酸（以下、ｄＸＭＰと記載する）を検出することで、即ちＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応によって付加したｄＸＴＰに対応するｄＸＭＰを検知することによって、所望のポリヌクレオチドを検出することができる。
【００５６】基質として用いるｄＸＴＰのα位のリン原子を放射性同位元素（32Ｐ又は33Ｐ）で置換標識することにより；α位のリン酸の、デオキシリボースの、若しくは塩基の水素原子を3Ｈで置換標識することにより；又はデオキシリボースの炭素原子を14Ｃで標識することにより、ｄＸＴＰとｄＸＭＰとをイオン交換樹脂などでクロマト的に分離して放射活性を追跡することによって分解産物であるｄＸＭＰの放射活性を測定することが可能である。なお、現在α位のリン原子が32Ｐ標識したｄＸＴＰとしては、ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰが市販されている。また、現在α位のリン原子が33Ｐ標識したｄＸＴＰとしては、ｄＡＴＰ及びｄＣＴＰが市販されている。また、塩基部分を3Ｈ標識したものとしては、ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰが市販されている。
【００５７】ラジオアイソトープ標識を持つｄＸＭＰは、イオン交換樹脂を用いた薄層クロマトグラフィーで分離すれば放射活性をオートラジオグラフィーによって簡便に、かつ定性的に検出することができる。また、実施例に示すようにこの放射活性を有するスポットを削り取ってシンチレーションカウンターで計数すれば、定量的な分析も可能である。更に必ずしもアイソトープで標識した基質を用いなくとも次のような操作によればｄＸＭＰの分離、測定が可能である。即ち、反応液を市販の蛍光色素を塗布した薄層クロマトグラフィーによって分離し、これに紫外線を照射すればヌクレオチドが紫外線を吸収するため、非蛍光スポットとしてｄＸＭＰを視認することができる。また、液体クロマトグラフィーによって分離し紫外線吸収を計測すればｄＸＭＰを定量的に検出することができる。
【００５８】■ＤＮＡポリメラーゼによる鎖伸長反応により生ずるピロリン酸の定量本発明方法では、ＤＮＡポリメラーゼによるｄＸＭＰの付加にともなうＰＰｉの生成を測定することにより、所望のポリヌクレオチドを検出することができる。このＤＮＡポリメラーゼによるｄＸＭＰの付加にともない生成するＰＰｉを追跡する方法によれば、酵素的に測定することが可能なうえ、反応液をクロマトグラフィー等で分離する作業も省略できるため非常に簡便な方法となる。具体的には、下記式３の反応等が知られている。当該式３の反応（J. Immunological Methods, 156, 55-60 (1992), T.Tabary et al.）では、高感度な測定が可能となるうえ、均一系で分析できるため操作も簡単である。
【００５９】
【化３】
【００６０】この他のピロリン酸の測定法としては、「Anal. Biochem., 94, 117-120 (1979)」に引用された方法等が知られている。
【００６１】Ｅ．具体例以下に具体的なオリゴヌクレオチドプライマーの配列とその配列を用いた場合の本発明による反応系を例示する（下記式４）。
【００６２】
【化４】
【００６３】■ヒトサイトメガロウイルス（以下ＣＭＶと省略する）の検出を例にとると、ＣＭＶゲノムＤＮＡ中の制限酵素EcoRI 切断断片のＤフラグメントに由来し、ＣＭＶゲノムに特異的な配列をプライマーとする。具体的な配列は式４に示したとおりである。式４に示す配列のどの部分を用いても良いが、以下の説明では式４中の→←で挟まれた部分にハイブリダイズする相補鎖をプライマーとする（配列番号１）。３’側のA-T の間のホスホジエステル結合をホスホロチオエート結合とする。ＰＰｉ又は分解産物であるｄＡＭＰを測定することにより、ＣＭＶ配列が検体中に存在するか否かを知ることができる。
【００６４】■特に１塩基の伸長〜分解を１サイクルとして繰り返す、本発明の好ましい方法では、先に述べたように点突然変異の検出に応用することができる。以下に点突然変異の検出例としてヒト癌遺伝子Ｋｉ−ｒａｓ／１２の検出系を示す。Ｋｉ−ｒａｓ／１２には、下記式５に示されるような変異体が知られている（下記式５中でドットで示したのは異常の生じていない正常な配列部分である）。
【００６５】
【化５】
【００６６】プライマーとしては式５中に示した部分の配列（配列番号２）を用いる。なお３’側のT-G 間をホスホロチオエート結合としヌクレアーゼ耐性としておき、ＤＮＡポリメラーゼによる合成用の基質としてはｄＧＴＰのみを加えておく。この例では、検出対象が正常であればｄＧＴＰを取りこむ反応が進行し、ＰＰｉとｄＧＭＰが蓄積される。しかし、検出対象が変異体である場合には、相補鎖の合成に必要なｄＴＴＰがないため反応が進行しない。逆にｄＴＴＰのみを基質に加えた時に反応が進行すれば、検出対象となった配列には点突然変異が含まれていることがわかる。本発明ではこのようにして点突然変異を検出することが可能である（下記式６参照）。
【００６７】
【化６】
【００６８】なお、式５及び式６ではプライマーが上段に、鋳型配列が下段に表示されており、前記式１、２及び４（鋳型配列が上段で、プライマーが下段）とは表示が異なっている。
【００６９】Ｆ．本発明ポリヌクレオチド検出用キット以上のような本発明に必要な各種成分は、予め組み合せた試薬の形で供給することができる。あらためて本発明による塩基配列検出用試薬の構成を次に示す。以下に示す試薬には、更に標識の検出に必要な資材や反応液を構成する緩衝剤、あるいは陰性や陽性の対照等の任意の成分を組み合せてキットの形とすることもできる。
【００７０】本発明ポリヌクレオチド検出用キットの構成は以下のごとくである。
１．検出対象のその塩基配列が既知であるポリヌクレオチドの一部と相補的な配列を有しかつヌクレアーゼ耐性を有するオリゴヌクレオチドプライマー、２．ＤＮＡポリメラーゼ、３．少なくとも１種のデオキシヌクレオシドトリリン酸、４．３’→５’方向に２本鎖ＤＮＡを分解する活性を有するヌクレアーゼ。
【００７１】以上１〜４を含むキットに、前記のポリヌクレオチドの検出の指標に応じて、検出用試薬を含ませることができる。即ち、ｄＸＭＰの検出を企図する場合には、デオキシヌクレオシドモノリン酸検出用試薬を含有させることができる。かかる検出用キットの具体例としては、例えば以下に挙げる検出用キットを挙げることができる。
【００７２】即ち、反応用試薬として、ホスホロチオエート化オリゴヌクレオチド、ＤＮＡポリメラーゼＩ クレノウフラグメント、デオキシヌクレオシドトリリン酸（32Ｐ標識）、エクソヌクレアーゼIII 、Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液、ＭｇＣｌ2 、ＢＳＡ及びＤＴＴを含み；反応停止液としてＥＤＴＡを含み；ｄＸＭＰ検出用試薬として、薄層クロマトグラフィー用イオン交換セルロース（ＰＥＩ＝ポリエチレンイミンセルロース）及びＬｉＣｌ（展開溶媒）、又はピロリン酸検出用試薬として、ＡＴＰスルフィラーゼ、アデノシン−５’−ホスホサルフェート、ルシフェリン及びルシフェラーゼを含む検出用キットを挙げることができる。
【００７３】以下に、本発明の作用機序と実際上の効果を集約して記載する。本発明におけるオリゴヌクレオチドプライマーは、検出対象となる塩基配列に特異的にハイブリダイズしＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応の起点となる。また予めヌクレアーゼ耐性としておくか、あるいはＤＮＡポリメラーゼの作用でデオキシヌクレオチド誘導体（ＳｄＸＴＰ等）を付加してヌクレアーゼ耐性とすることによって、以下に続くＤＮＡポリメラーゼの作用によるデオキシヌクレオシドトリリン酸（ｄＸＴＰ）の付加〜ヌクレアーゼの作用による分解という２つの反応を繰り返し起こすことを可能とする。この反応が繰り返し直線的に起きるので、本発明においてはヌクレアーゼ分解産物が反応系に蓄積し、定量的でしかも高感度な検出系が実現できる。
【００７４】そして、プライマーがミスマッチにより非特異的な配列にハイブリダイズしたとしても、それに隣接する領域の相補鎖を合成していく工程において予め基質として用意したｄＸＴＰが適合していなければ以降の反応が進まず誤った結果は生じないという利点を有する。また、本発明では高温処理によるＤＮＡの変性操作を繰り返す必要がないのでＤＮＡポリメラーゼをはじめとする試薬成分には熱安定性が要求されず、しかも複雑な温度制御を必要としない。そのため、操作を自動化することが容易であるという利点をも有する。
【００７５】本発明におけるＤＮＡポリメラーゼは、前記プライマーがハイブリダイズした領域に隣接する配列に対して相補な鎖を合成するものである。合成時には、１モルのｄＸＴＰの付加反応について１モルのＰＰｉを生成する。ＰＰｉは酵素反応により特異的に測定することができるので、本発明においては合成反応によって同時に信号を生成するシステムとなっている。また、別の実施態様においては、この反応で伸長した部分がヌクレアーゼによって分解された産物を検出対象とすることができる。ＤＮＡポリメラーゼは、オリゴヌクレオチドプライマーとしてヌクレアーゼ耐性でないものを利用するときにデオキシヌクレオチド誘導体を基質とすることによってこれをヌクレアーゼ耐性に変換する作用を持つ。
【００７６】本発明におけるヌクレアーゼは、検出対象となる配列とハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドプライマーを起点として伸長した部分を前記ヌクレアーゼ耐性部位まで特異的に加水分解する作用を持つ。標的配列が存在しない時にはこの分解は起こらず、またたとえ標的配列が存在していてもオリゴヌクレオチドプライマーのハイブリダイズとＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応が起きない限り加水分解されることはない。ヌクレアーゼのこのような特性により本発明において反応液中に蓄積する分解産物は、検出対象に対して特異的に、そして直線的に増加し、定量性の高い分析が可能となる。
【００７７】また、本発明の利点の一つとして、コンタミネーションの影響を受け難いことが挙げられる。即ち、たとえ反応後のサンプルがこれから反応させようとする溶液中に誤って混入しても、蓄積した分解産物そのものは新たな鋳型としては機能しないのでこれをもとに反応が進行することがなく実用上大変有利である。
【００７８】更に、本発明の固有の効果として、均一系で簡便な操作を提供できる点が挙げられる。ＤＮＡポリメラーゼによるｄＸＴＰの付加にともない生成するＰＰｉを追跡する方法を採用すれば、付加的なプローブとのハイブリダイズや電気泳動による分離等の操作を全く必要としない反応系を提供できる。ＰＰｉは純粋に酵素的な反応によって特異的に測定することができるので、合成と分解反応を行った反応液中でそのまま連続して反応を継続することが可能となり非常に実用的である。本発明のこのような利点は、ＰＣＲ法による増幅産物を検出するためにはプローブとのハイブリダイズや電気泳動による分離が要求されることと比べるとより明瞭である。
【００７９】その他、反応の第一段階で検出対象配列にハイブリダイズしたプライマーをそのまま継続して反応に利用するメリットとして、プライマーを比較的少量しか用意しなくてもよいことが挙げられる。ＰＣＲのように増幅産物によってプライマーが消費される系では大過剰のプライマーを用意しなければならないが、本発明では検出対象配列のモル数に対してわずかに過剰のプライマーを用意すれば十分である。そして、同様のことは基質となるデオキシヌクレオシドトリリン酸についてもいえる。即ち、例えばＰＣＲでは伸長する領域に必要な基質を全て用意しなければならない。本発明では、ハイブリダイズした領域に隣接する配列に相補な塩基を少なくとも１種類だけ用意すればよいので試薬構成を単純化できるという利点を有する。
【００８０】本発明の付随的な効果として点突然変異の検出に応用可能なことを挙げることができる。即ち、予め点突然変異を起こす部位が判明している時には、この部分に隣接する領域をプライマーとして選び点突然変異の起った時には反応が進行しないように反応系を設定することにより点突然変異の有無を確認することが可能である。以上のように本発明によるポリヌクレオチドの検出方法は種々の利点を有するものであり、遺伝子の分析において有効な方法となることが期待できる。
【００８１】
【実施例】以下、実施例に基づいて本発明を更に詳細に説明する。しかしながら、本実施例により本発明の技術的範囲が限定されて解釈されるものではない。
〔実施例〕 ＨＢＶ・ＤＮＡのＨＢＶ−ｅ抗原遺伝子の検出ＨＢＶ・ＤＮＡのＨＢＶ−ｅ抗原遺伝子の検出を試みた。ヌクレアーゼには大腸菌由来のエクソヌクレアーゼIII （寶酒造製）を、またプライマーＤＮＡには配列番号３に示す塩基配列を持つオリゴヌクレオチドを化学合成して用いた。
【００８２】(1)-1 プライマーＤＮＡの調製前記配列（配列番号３）のオリゴヌクレオチドは、β−シアノエチルアミダイト法（J.Am.Chem.Soc., 112, 1253-1254 (1990))に従って合成した。Ｓ化試薬として、3H-1,2-benzodithiole-3-one 1,1-dioxide(Beaucage's Reagent)を用い、３’末端側のT-C 間をホスホロチオエート結合としてヌクレアーゼ耐性プライマーＤＮＡを得た。ＤＮＡ合成機としてＣｙｃｌｏｎｅ（登録商標）Ｐｌｕｓ ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザー（日本ミリポアリミテッド）を用いた。合成したホスホロチオエート化オリゴヌクレオチドは、常法に従いＨＰＬＣで精製して使用した。
【００８３】(1)-2 塩基配列の検出プライマーＤＮＡを、標的配列となるＨＢＶ・ＤＮＡを一部にもつM13 ファージＤＮＡと混合し、実際に本発明による反応を行わせた。具体的な反応液の組成は下に示す通りであった。なお、下に示した数値はいずれも最終濃度である。反応が実際に進行しているのかどうかを確認するために、各成分を除いた反応系を設けて結果を比較した。またヌクレアーゼ耐性プライマーの必要性を確認するため同じ配列を持つがヌクレアーゼ耐性を持たないプライマーについても実験を行った。本実施例で用いたプライマーをハイブリダイズさせた場合、３’側に隣接する配列はＧであり、従ってその相補鎖の合成にはｄＣＴＰが必要である。そしてこのｄＣＴＰのヌクレアーゼ分解産物は、ｄＣＭＰとなる。
【００８４】＜反応液の組成＞第１反応（５μl ）
10fmol 標的配列（Ｍ13ファージＤＮＡ上にＨＢＶ−ｅ抗原遺伝子領域を持つ１本鎖ＤＮＡ）
１pmol プライマーＤＮＡ50mM Tris/HCl（ｐＨ7.5 ）
10mM MgCl2第２反応（10μl ）
１unit ＤＮＡポリメラーゼＩクレノウフラグメント５units エクソヌクレアーゼIII10μM ｄＣＴＰ（32P 標識、５×104cpm）
50μg/ml 牛血清アルブミン（以下ＢＳＡと略す）
10mM ジチオスレイトール
【００８５】第１反応では反応液（５μl ）を100 ℃で５分間加熱してＤＮＡを１本鎖とした後、65℃で10分間置いてプライマーＤＮＡをハイブリダイズさせた。次いで第２反応に必要な成分を含む試薬液を加えて更に37℃で反応させた。１時間反応させた後、20mMのEDTAを１μl 加えて反応を停止した。反応を停止した反応液の全量を薄層クロマトグラフィー（薄層：ＰＥＩ−Cellulose Ｆ（メルク（Merck)社製），展開溶媒：0.4M LiCl により室温で40分間展開）により分離し、ヌクレアーゼ分解産物であるｄＣＭＰをオートラジオグラフィーによって確認した。
【００８６】図２から明らかなように、検出対象となる配列、クレノウフラグメント、エクソヌクレアーゼIII のいずれを欠いてもヌクレアーゼ分解産物であるｄＣＭＰは検出されず（レーン２−４）、本発明の反応が特異的に進行していることが確認された（レーン１）。なお、レーン１は検出対象配列＋全ての試薬成分についての系であり、レーン２は試薬成分のみの系であり、レーン３は試薬成分中クレノウフラグメントを除く系であり、レーン４は試薬成分中、エクソヌクレアーゼIII を除く系である。
【００８７】またプライマーとしてヌクレアーゼ耐性を持たないものを用いた場合には、他の成分を満足する反応系であってもヌクレアーゼ分解産物としてｄＣＭＰが蓄積しないことを確認した（図３：レーン１はヌクレアーゼ耐性プライマーを利用、レーン２は修飾を施していないプライマー、即ちヌクレアーゼ感受性のプライマーを利用）。これは、ヌクレアーゼによりプライマーの３’側領域（即ち、ｄＣＴＰの付加部位）が分解されるためにｄＣＴＰが付加できなくなることが原因と考えられる。
【００８８】(2)鋳型特異性プライマーが検出対象配列と相補性を持つ場合にのみ、ヌクレアーゼによる基質の分解が起きることを確認するため次のような実験を行った。即ち、検出対象配列としてプライマーと全く相補性を持たない配列を用いる場合、及び検出対象配列の存在しない場合という２つの条件について、前記(1) と同じ操作により実際に反応を行った。
【００８９】その結果、図４（レーン１：検出対象配列がプライマー配列と相補、レーン２：検出対象配列がプライマー配列と同じセンス配列、即ち相補でない、レーン３：検出対象配列を含まない）に示すように検出対象配列とプライマーＤＮＡが相補的であれば分解産物であるｄＣＭＰが蓄積する（レーン１）が、センス配列、即ちプライマーと同じ配列であり相補的でない場合（レーン２）、及び検出対象配列が存在しない場合（レーン３）には分解産物は蓄積しないことが確認された。この実験により、本発明の反応は検出対象配列がプライマーと相補的な配列を持つ時に進行することが立証された。
【００９０】(3)基質（デオキシヌクレオシドトリリン酸）特異性基質であるデオキシヌクレオシドトリリン酸がプライマーに取り込まれるｄＣＴＰの時にのみヌクレアーゼによる分解が起ることを確認するために、前記(1)における基質をｄＧＴＰに置き換えて反応させた。その結果、図５R>５（レーン１：基質としてｄＣＴＰを利用、レーン２：基質としてｄＧＴＰを利用、レーン３：マーカーとしてｄＣＭＰとｄＣＴＰを展開、レーン４：マーカーとしてｄＧＭＰとｄＧＴＰを展開）に示すとおり基質がｄＣＴＰの時にのみ反応が進行し分解産物であるｄＣＭＰが確認され（レーン１）、ｄＧＴＰを加えた時には反応が進行しない（分解産物は生成しない、レーン２）ことを確認した。そして、この結果から本発明による検出方法が点突然変異の検出に利用できることが明らかになった。
【００９１】(4)本発明の検出感度前記(1) と同じ操作で検出対象となるＤＮＡ量を０〜１pmolに変化させて本発明による検出方法の感度を確認した（表１参照）。図６（レーン１：検出対象配列を含むＤＮＡを１pmol添加し反応させた、レーン２：検出対象配列を含むＤＮＡを0.1pmol 添加し反応させた、レーン３：検出対象配列を含むＤＮＡを0.01pmol添加し反応させた、レーン４：検出対象配列を含むＤＮＡを１fmol添加し反応させた、レーン５：検出対象配列を含むＤＮＡを0.1fmol 添加し反応させた、レーン６：検出対象配列を含むＤＮＡを0.01fmol添加し反応させた、レーン７：検出対象配列を含むＤＮＡを１amol添加して反応させた、レーン８：検出対象配列を含むＤＮＡを添加せず、反応させた）に示すように、１fmol（レーン４）のＤＮＡを検出可能なことが確認された。この結果により、本発明による検出方法の感度は極めて高いことが判明した。また本発明による塩基配列検出方法の定量性を確認するため、各バンドを切り出して液体シンチレーションカウンターにより放射活性を測定した。結果を表１に示す。表１において、（Ａ）及び（Ｂ）の値は、各スポットの放射活性（ＣＰＭ）を示す。0.1fmol 〜0.01pmolの範囲で定量性を確保できることが確認された。
【００９２】なお本実施例では、32Ｐ標識したｄＣＴＰの使用量をオートラジオグラフィーのスポットの大きさに差が生じやすい範囲に非標識のｄＣＴＰで予め希釈調整している。従って、ｄＣＴＰに占める標識物の割合を高くすれば、更に高感度を実現することが可能である。
【００９３】
【表１】
表１ 本発明検出方法の検出感度の検討──────────────────────────────────── 検出対象 (A) (B) A-B/Total dCMP 蓄積率 ＤＮＡ量 dCTP dCMP (%) (pmol) (dCMP/Target DNA)──────────────────────────────────── 1pmol 6566 17883 70.9 70.9 70.9 0.1 8805 25204 72.5 72.5 725 0.01 18381 15212 43.7 43.7 4370 1fmol 32552 1808 3.67 3.67 3670 0.1 31550 681 0.42 0.42 4200 none 35997 547 - - ────────────────────────────────────
【００９４】(5) Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼによる本発明の検出方法前記(1) におけるクレノウフラグメントに代えてＴ４ＤＮＡポリメラーゼを用い、本発明による塩基配列の検出方法を試みた。Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼは、先に述べたとおり３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を合わせ持つ酵素であるため、ヌクレアーゼ活性を持つ酵素として別の酵素を加えなくても反応系を構成することが可能である。
【００９５】Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを４units 用い、反応系を下に示す組成とした。他は前記(1) と同じ条件に基づいて反応を行った。結果は図７（レーン１：クレノウフラグメント＋エクソヌクレアーゼのみで検出対象配列を含まない、レーン２：クレノウフラグメント＋エクソヌクレアーゼ＋検出対象配列、レーン３：Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼのみ、レーン４：Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ＋検出対象配列）に示すとおりである。対照として示した前記(1) の結果に比べるとスポットは小さいが、ヌクレアーゼ分解産物であるｄＣＭＰの生成が確認された。このようにＴ４ＤＮＡポリメラーゼを用いればヌクレアーゼ活性を持つ酵素として別の物質を加えなくても本発明による反応が進行することが判明した。
【００９６】＜反応液の組成＞第一反応（５μl ）
10fmol 標的配列１pmol プライマーＤＮＡ67mM Tris/ HCl (pH8.8)6.7mM MgCl216.7mM (NH4)2SO46.7mM EDTA第二反応（１０μl ）
10mM β- メルカプトエタノール10μM ｄＣＴＰ (32P 標識、5 x 104cpm)50μg/ml ＢＳＡ４ units Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ（寶酒造製）
【００９７】
【発明の効果】本発明によれば、遺伝的疾患や感染症の診断に有効な試料中に存在する特定の塩基配列を含むポリヌクレオチドの検出方法及び当該検出方法に使用するポリヌクレオチド検出用キットが提供される。
【００９８】
【配列表】
配列番号：１配列の長さ：25配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ起源生物名：サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）
配列CCCCGAAATG GGACCCAGTA CGGAT
【００９９】配列番号：２配列の長さ：24配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ起源生物名：ヒト癌遺伝子Ｋｉ−ｒａｓ／１２ 配列 ATAAACTTGT GGTAGTTGGA GCTG 24
【０１００】配列番号：３配列の長さ：25配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ起源生物名：ＨＢＶ・ＤＮＡのＨＢＶ−ｅ抗原遺伝子 配列 AATGCCCCTA TCTTATCAAC ACTTC 25
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の反応原理を示す模式図である。
【図２】本発明によるＨＢＶ−ｅ抗原遺伝子の検出方法によって得られたオートラジオグラフィ−の結果を示す図である。
【図３】本発明による反応系におけるヌクレアーゼ耐性プライマーの必要性について調査したオートラジオグラフィーの結果を示す図である。
【図４】プライマーの配列と検出対象のポリヌクレオチドの塩基配列の相補性とヌクレアーゼ分解産物の関係を調査したオートラジオグラフィーの結果を示す図である。
【図５】基質とヌクレアーゼ分解産物の関係を調査したオートラジオグラフィーの結果を示す図である。
【図６】標的ポリヌクレオチドの濃度を変化させて感度を調査したオートラジオグラフィーの結果を示す図である。
【図７】Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを用いた場合について調査したオートラジオグラフィーの結果を示す図である。
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、遺伝的疾患や感染症の診断に有効な試料中に存在する特定の塩基配列を含むポリヌクレオチド（以下、標的ポリヌクレオチドという）の検出方法、及び当該検出方法に使用するポリヌクレオチド検出用キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】核酸塩基配列の相補性に基づく分析方法は、遺伝的な特徴を直接的に分析することが可能である。そのため、遺伝的疾患、癌化、微生物の識別等には非常に有力な手段である。また遺伝子そのものを検出対象とするために、例えば培養のような時間と手間のかかる操作を省略できる場合もある。
【０００３】しかし、検体中に目的の遺伝子量が少ない場合の検出は一般に容易ではなく、標的遺伝子そのものを、あるいは検出シグナル等を増幅することが必要となる。標的遺伝子を増幅する方法の一つとしてＰＣＲ(Polymerase Chain Reaction) 法が知られている。ＰＣＲ法は、in vitroにおける核酸の増幅技術として最も一般的な方法である。しかしながら、当該ＰＣＲ法においては、実施のために特別な温度調節装置が必要なこと；増幅反応が対数的に進むことから定量性に問題があること；試料や反応液が外部からの汚染を受け、誤って混入した核酸が鋳型として機能してしまうコンタミネーションの影響を受け易いこと等の問題点が知られている。
【０００４】即ち、ＰＣＲのようにＤＮＡを数百万倍にまで増幅させる反応では混入した微量ＤＮＡも同様に増幅されるため、誤った結果が提供される傾向がある。これは特に多数の検体を同時に扱う場合には重大な問題である。かかるコンタミネーション対策として、実験室を区別したり、あるいはＰＣＲ反応でウラシル基を取り込ませておき、新たにＰＣＲ反応を行う前にその検体をウラシルグリコシラーゼ処理し、検体中に誤って混入した他の反応系の増幅産物のみを分解するというような工夫がなされているが、前記対策としては必ずしも十分ではない。
【０００５】また、検出シグナルを増幅する方法としてはＱβレプリカーゼでシグナルＲＮＡを増幅する方法（Bio/Technology, 6, 1197-1202(1988), P.M.Lizardi et al.）が報告されている。しかし、この方法は増幅させる配列をレプリカーゼが認識する配列内に挿入する必要があり、その立体構造上の制約から挿入の位置や配列が制限される等の問題がある。またＱβレプリカーゼでシグナルＲＮＡを増幅する方法でもＰＣＲ法と同様のコンタミネーションの問題があり、根本的な解決とは言い難い。
【０００６】前記の方法は検出対象となる塩基配列を増幅する方法であるが、更に以下に述べるような分解産物を検出するシグナル増幅法も考案されている。例えば、標的核酸にオリゴヌクレオチドプローブＤＮＡをハイブリダイズさせた後、制限酵素処理し、切断されたプローブ断片を検出するシグナル増幅法が知られている(EP-0455517/A1) 。この方法は、ＰＣＲ法に比べて検出感度は低いものの、定量性に優れ、実施に際して特別な装置を必要としない等の利点がある。しかし、この方法ではプローブＤＮＡ以外に反応が繰り返し起こるようにするための特異的な配列を持つ第二のオリゴヌクレオチドを系に共存させる必要がある。また検出する部位に制限酵素切断部位が必要であるために検出可能な部位が制限される等の欠点も持つ。
【０００７】そのほかに２本鎖ＤＮＡを特異的に切断するλエクソヌクレアーゼを用いたサイクリングアッセイ法も開発されている（BioTechniques, Vol.13, No.6, 882-892(1992), C.G. Copley et al.）。この方法は、オリゴヌクレオチドプローブが相補的な配列とハイブリダイズして形成された２本鎖ＤＮＡにλエクソヌクレアーゼを作用させ、プローブＤＮＡが２本鎖を維持できない程度まで分解されると新たなプローブＤＮＡと置き替わり、続いてこの新たなプローブも分解されることによりサイクリング反応が起こるというものである。この方法は、当該プローブの分解産物を検出することにより特定のＤＮＡ配列の有無を判定することが可能である。また反応原理が単純であり、しかも検出部位の配列が制限されないという点では制限酵素を用いる方法(EP-0455517/A1) よりも有利である。
【０００８】しかし、λエクソヌクレアーゼは基質として５’末端がリン酸化されたプローブＤＮＡを要求する。ＤＮＡ合成機を用いてプローブＤＮＡを化学合成した場合５’末端はリン酸化されておらず、そのため合成後改めて末端をリン酸化する必要がある。そして、５’末端が完全にリン酸化されているのかどうかを確認することが難しいためプローブ調製の再現性の点で問題が残る。更に、λエクソヌクレアーゼを用いたサイクリングアッセイ法はプローブＤＮＡが鋳型ＤＮＡに繰り返しハイブリダイズすることが必要であるが、ハイブリダイゼーションの反応は一定温度では起こりにくいため、これが反応系全体における律速となり、サイクリング反応のターンオーバー数が少ないという問題点もある（文献では約５００回／時間）。
【０００９】エクソヌクレアーゼを用いたサイクリングアッセイ法としては、特開平５−130870号公報記載の方法も知られている。この公報記載の方法はプライマーを起点とする相補鎖の合成反応とともに５’→３’エクソヌクレアーゼを作用させてプライマーを逆方向から分解する方法である。即ち、５’→３’エクソヌクレアーゼによって分解されたプライマーに代って新たなプライマーがハイブリダイズし、ＤＮＡポリメラーゼによって相補鎖の合成と先に合成された鎖を外す反応が進行しサイクリング反応が成立する。当該方法においては、ＰＣＲ反応のような複雑な温度制御は要求されないが、プライマーのハイブリダイズ工程を繰り返す必要があるのでやはりターンオーバー数（プローブＤＮＡのハイブリダイゼーションの繰り返し数）を上げにくいという問題が残る。
【００１０】本発明者等は、これらの問題点の解消を目的として、特定の反応促進剤をエクソヌクレアーゼIII とともに用いる塩基配列検出方法を開発した（特開平6-327499号公報）。この方法はプローブの合成が容易な上、反応時には特殊な温度制御が不要となり、しかもコンタミネーションの影響を殆ど受けずに塩基配列を検出することが可能となる優れた方法である。しかし、この技術では反応促進剤は、ターンオーバー数（λエクソヌクレアーゼを用いたサイクリングアッセイ法での説明と同様のプローブＤＮＡのハイブリダイゼーションの繰り返し数）を増加させる効果は認められるものの、プローブＤＮＡが繰り返しハイブリダイズしなければならないことには変わりはなく、必ずしも高感度を得られないという問題点を残していた。
【００１１】加えて今まで述べた遺伝子の増幅法においては、プライマーとして加えたオリゴヌクレオチドは増幅産物となってプライマーとしては機能しなくなるので、予め予想される検出対象量に対して大過剰量のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用意しなければならない。特にＰＣＲ法のように対数的に増幅産物が生成する系では、非常に多量のオリゴヌクレオチドを用意する必要があった。オリゴヌクレオチドプライマーは化学的に合成するにしろ、生物材料に原料を求めるにしろ試薬成分のコストの点から使用量は少ない方が好ましい。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、特殊な装置が要求される複雑な温度制御によらず、単純な反応系でコンタミネーションの影響を受け難い塩基配列の検出技術の提供を課題とする。また本発明は、これらの目的を達成するために検出対象となる塩基配列の制限のない、汎用性に優れる検出技術の提供をも課題とするものである。更に、検出系の選択によっては高い感度と定量性を得ることが可能な塩基配列の検出技術の提供をも課題とするものである。
【００１３】
【課題を解決するための手段】本発明者等は、前記課題の解決を目的として鋭意検討を行った。その結果、一本鎖ＤＮＡには作用せず二本鎖となったＤＮＡのみを切断し、かつ塩基配列には限定されないヌクレアーゼをＤＮＡポリメラーゼとともに利用したシグナル増幅法を開発し、本発明を完成した。
【００１４】即ち、本発明は以下の事項をその要旨とするものである。
(1)検出対象のその塩基配列が既知であるポリヌクレオチドに、当該ポリヌクレオチドの一部と相補的な配列を有しかつヌクレアーゼ耐性を有するオリゴヌクレオチドプライマーをハイブリダイズさせ、次いでこれに少なくとも１種のデオキシヌクレオシドトリリン酸、ＤＮＡポリメラーゼ及びヌクレアーゼを加えて、前記プライマーの３’末端に隣接しかつ前記ポリヌクレオチドと相補的である塩基種を相補鎖合成し引き続いて分解し、かつ当該相補鎖合成及び分解を少なくとも１回以上繰り返して、生成するピロリン酸又はデオキシヌクレオシドモノリン酸を検出することを特徴とする、前記ポリヌクレオチドの検出方法。
【００１５】(2)オリゴヌクレオチドプライマーが、当該オリゴヌクレオチドプライマーの３’末端でホスホロチオエート化されたものであることを特徴とする前記(1) 記載のポリヌクレオチドの検出方法。
【００１６】(3)ＤＮＡポリメラーゼが、ＤＮＡポリメラーゼＩ、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメント、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ及びＰｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼからなる群から選ばれるＤＮＡポリメラーゼであることを特徴とする前記(1) 又は(2) 記載のポリヌクレオチドの検出方法。
【００１７】(4)ヌクレアーゼがエクソヌクレアーゼIII であることを特徴とする前記(1) 〜(3) のいずれかに記載のポリヌクレオチドの検出方法。
【００１８】(5)デオキシヌクレオシドトリリン酸のβ位及びγ位のリン酸分子以外の分子又は原子が、放射性同位元素で置換標識されており、かつヌクレアーゼによる反応により生成するデオキシヌクレオシドモノリン酸を検出することを特徴とする前記(1) 〜(4) のいずれかに記載のポリヌクレオチドの検出方法。
【００１９】(6)ヌクレアーゼによる反応により生成するデオキシヌクレオシドモノリン酸をクロマトグラフィーによって分離し当該デオキシヌクレオシドモノリン酸を光学的に測定することを特徴とする前記(1) 〜(4) のいずれかに記載のポリヌクレオチドの検出方法。
【００２０】(7)前記(1) 〜(4) のいずれかに記載のポリヌクレオチドの検出方法において、ＤＮＡポリメラーゼによる相補鎖合成により生成するピロリン酸を、アデノシン−５’−ホスホサルフェート及びアデノシントリリン酸スルフリラーゼと反応させてアデノシントリリン酸を生成させ、当該アデノシントリリン酸を検出することを特徴とするポリヌクレオチドの検出方法。
【００２１】(8)アデノシントリリン酸をルシフェリン−ルシフェラーゼ反応によって測定することを特徴とする前記(7) 記載のポリヌクレオチドの検出方法。
【００２２】(9)以下の１〜４の成分：１．検出対象のその塩基配列が既知であるポリヌクレオチドの一部と相補的な配列を有しかつヌクレアーゼ耐性を有するオリゴヌクレオチドプライマー、２．ＤＮＡポリメラーゼ、３．少なくとも１種のデオキシヌクレオシドトリリン酸、及び４．３’→５’方向に２本鎖ＤＮＡを分解する活性を有するヌクレアーゼ。を含む前記(1) 〜(8) のいずれかに記載のポリヌクレオチドの検出方法に使用するポリヌクレオチド検出用キット。
【００２３】(10) 前記(9) 記載のポリヌクレオチド検出用キットにおいて、当該検出用キットに、デオキシヌクレオシドモノリン酸検出用試薬を含有させたことを特徴とするポリヌクレオチド検出用キット。
【００２４】(11) 前記(9) 記載のポリヌクレオチド検出用キットにおいて、当該検出用キットに、ピロリン酸検出用試薬を含有させたことを特徴とするポリヌクレオチド検出用キット。
【００２５】以下、本発明について詳細に説明する。
Ａ．本発明の検出対象は、その塩基配列が既知のポリヌクレオチドである。本発明の検出対象は、動物、植物、細菌、酵母、糸状菌、マイコプラズマ、リケッチア、ウイルス他あらゆるものに由来するポリヌクレオチドにおよぶ。またポリヌクレオチドとしては、ゲノミック核酸はもちろん、ＲＮＡウイルスやｍＲＮＡから誘導されたｃＤＮＡを検出対象とすることも可能である。なお実際に検体を分析するときには、検体に含まれる検出対象以外のＤＮＡの配列や、ＤＮＡ合成のプライマーとなりうる配列の存在が問題となることがある。また、ＤＮＡポリメラーゼやヌクレアーゼの活性阻害物質、デオキシヌクレオシドトリリン酸も混入している可能性もある。更にピロリン酸を検出対象とする場合には、検体中に共存するピロリン酸も分析を妨害する要因となる。
【００２６】従って、本発明においては増幅反応を行うためには可能な限り前記混入物を除去することが好ましい。例えば、固相に結合した捕捉プローブ等を用いて標的ＤＮＡを捕捉し、続いて洗浄により前記不純物を除去し、その後に本発明を適用するとバックグランドのない高感度の検出系が可能となる。このとき捕捉プローブを５’末端で固相と結合しておけば（Eur.J.Immunol., 23, 1895-1901(1993), H.Kohsaka et al.; Nucleic Acids Research,21, 3469-3472 (1993), H.Kohsakaet al. )、捕捉プローブそのものをプライマーとして本実験の方法を適用することも可能となる。なお、前記ピロリン酸の除去についてはピロホスファターゼによる酵素的な除去も可能である。
【００２７】また、特に１塩基の伸長〜分解を１サイクルとして繰り返す、本発明の好ましい方法においては、後述するように点突然変異の検出に応用することができる。なお、点突然変異の検出方法として、特開昭59-208465 号公報記載の方法が既に知られている。この方法は、プライマーに続く相補配列の合成反応において基質としてヌクレオチドの誘導体を用いることによって点突然変異が存在する場合（又は存在しない場合）に限りこのヌクレオチド誘導体が取り込まれるという反応原理に基づく方法である。即ち、基質としてヌクレオチド誘導体を取り込んだ場合には反応産物がエクソヌクレアーゼに対する耐性を獲得するので、当該ヌクレアーゼによるヌクレオチドの分解の有無を特定することによって点突然変異を検出することができる。
【００２８】確かに、前記方法で用いられている要素の一部は本発明と共通するものである。しかしながら、そもそも前記方法がヌクレアーゼ耐性獲得の有無を点突然変異が存在する指標とすることを特徴とする方法であるのに対し、本発明は反応が繰り返し起きるかどうかを点突然変異の存在の指標として用いるものであるという点において本質的に異なる。そして、本発明方法による点突然変異の検出は、前記方法による当該変異の検出に比べても感度の点で良好であり有利である。
【００２９】Ｂ．本発明は、前記の既知のポリヌクレオチドに、当該ポリヌクレオチドの一部と相補的な配列を有しかつヌクレアーゼ耐性を有するオリゴヌクレオチドプライマーをハイブリダイズさせることを特徴とする。本発明において、「相補的」とは、塩基配列が塩基対のワトソン・クリック則に従って、もう一方の核酸と水素結合による二重鎖を形成し得る状態のことをいう。具体的には、アデニン（Ａ）に対してはチミン（Ｔ）；グアニン（Ｇ）に対してはシトシン（Ｃ）が対応する相補性を有する状態である。なお、本発明に用いるプライマーは、標的となるポリヌクレオチドの塩基配列に対して完全に相補的である必要はなく、少なくとも当該オリゴヌクレオチドが全体として前記標的ポリヌクレオチドに対してハイブリダイズすることが可能であれば足りる。具体的には、オリゴヌクレオチドの３’末端の塩基が標的ポリヌクレオチドの塩基と対応することを必須として、オリゴヌクレオチドの塩基全体の少なくとも70％が前記の相補性を標的ポリヌクレオチドとの関係において有することが必要である。かかる相補性が70％未満になると前記ハイブリダイズ自体が困難になるため好ましくない。一方、３’末端の塩基が標的ポリヌクレオチドの塩基と対応するという条件は、本発明が３’末端において塩基の付加反応を行うための必須の条件である。３’末端で塩基が対応せずプライマーが１本鎖となっていると、ポリメラーゼやヌクレアーゼが認識できなくなってしまう。
【００３０】また、本発明に用いるオリゴヌクレオチドプライマーは、既知の標的ポリヌクレオチドの「一部」と相補的であることを特徴とする。これは、本発明方法が、オリゴヌクレオチドプライマーの３’末端側にＤＮＡポリメラーゼによって付加される予め反応系に存在させた特定のデオキシヌクレオチドを検出することを特徴とすることに起因する。即ち、プライマーの３’末端側に付加されるデオキシヌクレオチドに対して鋳型となるヌクレオチドが既知でなければ、予め特定のデオキシヌクレオチドを系内に存在させることが困難である故に、本発明に用いるオリゴヌクレオチドプライマーは、既知の標的ポリヌクレオチドの「一部」と相補的であることが必要となる。
【００３１】また、本発明に用いるオリゴヌクレオチドプライマーは、ヌクレアーゼに対して耐性を有することが必要である。これは、本発明においては、系内にヌクレアーゼを存在させることが必要であるため、かかるヌクレアーゼによりオリゴヌクレオチドプライマーが分解されてしまえば本発明方法を実施することが困難になるからである。オリゴヌクレオチドプライマーにヌクレアーゼ耐性を付与する方法は特に限定されるものではなく、この分野において通常用いられる方法をいずれも利用することができる。
【００３２】具体的には、例えばＤＮＡ合成装置でプライマーとなるオリゴヌクレオチドを合成するときに公知の方法によって必要な部位にホスホロチオエート(Phosphorothioate)結合を導入すればオリゴヌクレオチドプライマーにヌクレアーゼ耐性を与えることができる。このような方法としては、例えば固相ホスホルアミダイト(Phosphoramidite) 法でＤＮＡを合成する場合であれば、ヨウ素水等による酸化工程に代えて適当なＳ化試薬（ホスホロチオエート化試薬）によって酸化処理を行うことで通常のリン酸ジエステル結合ではなくホスホロチオエート結合をオリゴヌクレオチドに導入することができる。Ｓ化試薬としては、３Ｈ-1,2-benzodithiole-3-one 1,1-dioxide(Beaucage's Reagent)、TETD/Acetonitrile(TETD:tetraethylthiuram disulfide) 等が知られている。この方法によれば、ホスホロチオエート結合をオリゴヌクレオチドの任意の部位に導入することができる。
【００３３】あるいは、ＤＮＡポリメラーゼによってＤＮＡを合成する際に、デオキシリボヌクレオシドトリリン酸のα位のリン原子に結合した酸素を硫黄に置換したものを基質として用いることによってオリゴヌクレオチドにホスホロチオエート結合を導入することができる。このような置換化合物としては、α−Ｓ−デオキシチミジントリリン酸、α−Ｓ−デオキシシトシントリリン酸、α−Ｓ−デオキシアデニントリリン酸及びα−Ｓ−デオキシグアニントリリン酸等（これらの置換化合物を総称してＳｄＸＴＰと省略する）を例示することができる。ＤＮＡポリメラーゼによる合成反応を行うときに、デオキシヌクレオシドトリリン酸（以下、ｄＸＴＰと省略する）に代えてＳｄＸＴＰを基質とすることにより、合成されたオリゴヌクレオチドはホスホロチオエート化され、ヌクレアーゼ耐性を獲得する。ＤＮＡポリメラーゼによってホスホロチオエート結合を導入する場合は、実際に検出対象であるポリヌクレオチドにハイブリダイズした状態でこの反応を進行させることができる。つまり、本発明におけるヌクレアーゼ耐性オリゴヌクレオチドプライマーは、必ずしも予め準備されている必要はなく反応時にヌクレアーゼ耐性を獲得する方法を採ることも可能である。
【００３４】一旦ヌクレアーゼ耐性とすれば以降の反応を後述する反応原理に従って進行させることができる。なお、この場合はまずＳｄＸＴＰが付加し、次いでｄＸＴＰが付加し、少なくとも２塩基分の伸長反応が必要になるが、２つめのｄＸＴＰに対してはヌクレアーゼが作用するので本発明方法を実施することができる。いずれにしても、プライマーの３’末端付近のホスホジエステル結合をホスホロチオエート結合とすることによって、３’側から攻撃するヌクレアーゼに耐性を示すオリゴヌクレオチドプライマーとなる。ただし、オリゴヌクレオチド全体をホスホロチオエート結合とすればヌクレアーゼ耐性度は更に上昇するが、同時にハイブリダイズする効率が低下することになる。従ってホスホロチオエート結合の数は、末端から１〜数個とすることが好ましい。ホスホロチオエート結合は末端の１個のみでもよいが、数個分、好ましくは３個分を連続してホスホロチオエート結合とすれば、より完全なヌクレアーゼ耐性を期待できる。
【００３５】ただし、前記のようにＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡへの取り込みの効率はＳｄＸＴＰがｄＸＴＰよりかなり低いので、始めにＳｄＸＴＰを取り込ませた後に分解用のｄＸＴＰを加えるか、あるいはＳｄＸＴＰ濃度を高めに設定しておくといった工夫が必要な場合もある。
【００３６】ヌクレアーゼ耐性の付与手段としては、前記ホスホロチオエート化の他に、メチルホスホネート(Methylphosphonate) 結合、ホスホロアミデート(Phosphoroamidate)結合、ポリアミド核酸(Polyamide nucleic acid(PNA) )結合等の導入を示すことができる。これらの結合によってヌクレオチドのリン酸結合部位、リボース部位、そして核酸の塩基部位が修飾、あるいは構造をモディファイされてヌクレアーゼ耐性を獲得する。
【００３７】この他に、オリゴヌクレオチドプライマーとしてＲＮＡプライマーを用いることも可能である。ＲＮＡはＤＮＡに作用するヌクレアーゼに対してほぼ耐性を有するものである。従って、ＲＮＡプライマーを用いれば、特別な修飾を施さなくてもＤＮＡに作用するヌクレアーゼ耐性を有するオリゴヌクレオチドプライマーを用意することが可能である。ただし、ＤＮＡに作用するヌクレアーゼやＤＮＡポリメラーゼの中にはＲＮａｓｅＨ活性を併せ持つものも存在し、このような場合にはＲＮＡプライマー自身が分解されるため酵素の組み合わせによっては高感度を得にくい場合もある。
【００３８】本発明におけるオリゴヌクレオチドプライマーは、塩基数で少なくとも６以上、好ましくは10〜50、特に好ましくは15〜30程度とする。６未満では通常の条件ではハイブリダイズしにくいばかりでなく、確率的にも非特異的な反応につながる可能性が増す。他方例えばホスホロチオエート化することによってヌクレアーゼ耐性としたオリゴヌクレオチドプライマーは、鋳型に対する親和性（Ｔｍ）が低下するので、この低下分を補うためにもある程度の長さを与えることが必要になる。これに対して30を越えると化学的に合成する時に収率が低下し易くなるので経済的に不利であるので好ましくない。更に、必要以上に長いプライマーを用いる場合はプライマー間、あるいはプライマー内の水素結合による２本鎖が形成されやすくなり非特異的な反応が起こりやすくなる。このように不必要に長いプライマーは、非特異増幅等の原因となる場合が有るので好ましくない。
【００３９】なお、本発明に使用し得るＤＮＡポリメラーゼは後述するが、その中にはＤＮＡポリメラーゼＩのように弱いながら２本鎖ＤＮＡに対する５’→３’エクソヌクレアーゼ活性を有するものも存在する。この種の酵素をＤＮＡポリメラーゼとして用いる時にはハイブリダイズしたプローブが５’側からの分解を受けるので５’側もヌクレアーゼ耐性としておくとよい。なお、同じＤＮＡポリメラーゼでもクレノウフラグメントやＰｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼはこの活性を有しないので５’側は特に修飾する必要がなく、この点においては好ましい。
【００４０】オリゴヌクレオチドプライマーの使用量は、検出対象となる塩基配列に対して十分量となるように添加する。従来の塩基配列の増幅法では、プライマーとして加えたオリゴヌクレオチドが増幅産物となってプライマーとしては機能しなくなるので鋳型となる塩基配列の量に対して大過剰量で用いる必要があったが、本発明では１度ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドプライマーが繰り返しプライマーとして機能するため少なくとも鋳型となる塩基配列と等モル存在すれば定量的な反応が可能となる。実際には、平衡状態をハイブリダイズする方に傾けるために十分量のオリゴヌクレオチドプライマーを利用するのが好ましい。検出対象となる標的配列の量をあらかじめ予想することは困難であるが、少なくとも希望する検出範囲の量に対して等モルを越える量を、好ましくは５倍以上の過剰量でオリゴヌクレオチドプライマーを用いることが高い感度を確保するうえで好ましい条件となる。
【００４１】ハイブリダイズの条件は特に限定されないが、ハイブリダイズ後はＤＮＡポリメラーゼとヌクレアーゼの存在下で全ての反応を進行させる必要があることに着目する必要がある。特にヌクレアーゼはＰＣＲ法で用いられるＴａｑポリメラーゼのような高度の耐熱性を持たないので、当該ヌクレアーゼの酵素活性を維持できる条件を採用する必要がある。また温度以外の要素である緩衝液の選択やｐＨの設定等も、ハイブリダイズのみならずヌクレアーゼの活性が十分に発現できる条件を選択すべきである。具体的な条件を例示すれば、緩衝液としてトリス−塩酸緩衝液等を用いたとき、ｐＨは約７〜９とし、20〜55℃で反応を行わせる。特に好ましい条件としては、ｐＨ7.5 〜8.5 、温度は30〜45℃を示すことができる。
【００４２】例えば、実施例に示したように、0.1pmol のプライマー、50mMのＴｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液（pH7.5)、10mM ＭｇＣｌ2 のみからなる溶液中で加熱処理（100 ℃で５分間）後、65℃で10分間アニーリングする。この場合は、すぐに37℃でＤＮＡポリメラーゼ反応及びヌクレアーゼ反応を進行させることが可能である。なお、最終的に反応系に蓄積されるピロリン酸を酵素的に測定する場合には、この酵素反応についても好適な反応条件が提供されなければならない。即ちｐＨ、塩濃度、温度等を酵素反応に適するように設定する。
【００４３】また、反応液中にＤＮＡポリメラーゼやヌクレアーゼの安定化剤を添加することができる。かかる安定化剤としては、例えば牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、β−メルカプトエタノール等を挙げることができる。かかる安定化剤の添加量は、ＢＳＡは10〜500 μg/ml、ＤＴＴは１mM程度、β−メルカプトエタノールは10mM程度である。検出対象となるポリヌクレオチドが二本鎖状態である場合には、予め一本鎖に変性する必要がある。かかる変性方法としては、通常公知の変性方法、例えば加熱変性、酸変性、アルカリ変性等を挙げることができるが、方法の簡便性と確実性に鑑みれば、加熱変性（90℃〜100 ℃で５分以上加熱）を採用するのが好ましい。
【００４４】また、目的としたプライマー以外のＤＮＡのハイブリダイズを抑制するか、又は非特異的にハイブリダイズしたＤＮＡを除去して非特異的な反応を抑制するために、ＤＮＡポリメラーゼ添加前にあらかじめエクソヌクレアーゼ処理を行うこともできる。
【００４５】Ｃ．本発明は、次いで、前記ハイブリダイズの後、系に少なくとも１種のデオキシヌクレオシドトリリン酸、ＤＮＡポリメラーゼ及びヌクレアーゼを加えて、前記プライマーの３’末端に隣接しかつ前記ポリヌクレオチドと相補的である塩基種を相補鎖合成し引き続いて分解し、かつ当該相補鎖合成及び分解を少なくとも１回以上繰り返すことを特徴とする。以下に本発明の反応原理を示す。本発明の反応原理を図１及び下記式１に示す。
【００４６】
【化１】
【００４７】まず、検出対象となる１本鎖の核酸にハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドプライマーをもとにＤＮＡポリメラーゼの作用によって相補鎖の合成がスタートする。このときに１分子のｄＸＴＰの付加にともない１分子のピロリン酸（以下ＰＰｉと省略することもある）が生成する。一方、この状態で２本鎖のＤＮＡの３’末端から分解していくヌクレアーゼを作用させると、伸長した部分を分解する反応が進行する。しかしオリゴヌクレオチドプライマーはヌクレアーゼ耐性であるためプライマー部分は分解されないでそのまま残り、再度ＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応の起点となる。このように繰り返し反応が起ることによって反応系にはピロリン酸、あるいはヌクレアーゼの分解によって生成するデオキシヌクレオシドモノリン酸が蓄積していく。
【００４８】なお前述したように、前記反応時にＤＮＡポリメラーゼの作用により、オリゴヌクレオチドプライマーをヌクレアーゼ耐性として前記工程に付することも可能である。このピロリン酸か、又はヌクレアーゼによる分解によって生成するデオキシヌクレオシドモノリン酸を検出することによって検出対象となる塩基配列の有無を検出又は定量することが可能となる。
【００４９】更に、本発明の検出方法によって点突然変異を検出する系を構成することが可能である。即ち、予め点突然変異の起る部位がわかっている場合に、当該部位の５’側に隣接する領域に相補な配列をオリゴヌクレオチドプライマーとして利用する。伸長する鎖の基質となるｄＸＴＰとして、正常な配列のときのみ伸長が起るように１種の基質のみ加えておけば、点突然変異がおきている場合には伸長できないので反応が停止する。このようにして点突然変異の有無を容易に確認することが可能となる（下記式２）。
【００５０】
【化２】
【００５１】またオリゴヌクレオチドプライマーがハイブリダイズすべき領域に変異が起れば、当然のことながらハイブリダイズの効率が低下するので反応全体が進行しにくくなり、これにより点突然変異の有無を知ることができる。前記において使用するＤＮＡポリメラーゼは、鋳型となる１本鎖の核酸に相補鎖がハイブリダイズして構成された２本鎖部分を起点として５’→３’方向に相補鎖を伸長する反応を触媒するＤＮＡポリメラーゼを用いる。実際には現在知られているＤＮＡポリメラーゼは、全て５’→３’方向へのＤＮＡ合成酵素活性を持つ。また、ＤＮＡ合成が起こるには必ずプライマーが必要であり、プライマーが存在しない場合やハイブリダイズできない場合にはＤＮＡの合成は起こり得ない。これが、本発明がプライマーと鋳型鎖に依存して特異性が高くなる理由の一つである。具体的に本発明において用いるＤＮＡポリメラーゼとしては、ＤＮＡポリメラーゼＩ、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメント、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ等又はこれらのＤＮＡポリメラーゼの変異体を挙げることができる。
【００５２】なお、ＤＮＡポリメラーゼとしてＴ４ＤＮＡポリメラーゼやＴ７ＤＮＡポリメラーゼのように強力な３’→５’エクソヌクレアーゼ活性を併せ持つものを用いれば、別途添加するヌクレアーゼ量を節約することが可能であり、又は核酸に作用する酵素として１種の強力な３’→５’エクソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼのみを加えることで本発明の反応系を構成することも可能である。ただし、これらのＤＮＡポリメラーゼはヌクレアーゼ耐性であるホスホロチオエート結合もある程度分解するので、高感度を期待できない場合もあり得る。故に、この場合はプライマーの末端付近のホスホジエステル結合を、複数の結合に亙って修飾するか、あるいはホスホロチオエート化以外の修飾によってヌクレアーゼ耐性とすることが望ましい。
【００５３】前記において使用するヌクレアーゼは、２本鎖のＤＮＡを３’→５’方向に分解する活性を持つヌクレアーゼである。このようなヌクレアーゼとしては、エクソヌクレアーゼIII が知られている。エクソヌクレアーゼIII としては現在のところ大腸菌由来のものが市販されているが、これに限定されるものではなく他の微生物やあるいは遺伝子組み換えによって得られたものであっても利用することができる。エクソヌクレアーゼIII を用いた場合には、ＤＮＡポリメラーゼとして例示したＤＮＡポリメラーゼＩ、そのクレノウフラグメント、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ等とほぼ同じ反応条件で酵素活性を示すため、ＤＮＡポリメラーゼによる反応と平行して同一の反応液中で同時に反応を進行させることができる。エクソヌクレアーゼIII は、２本鎖ＤＮＡを３’→５’方向に特異的に分解すること、１本鎖ＤＮＡには作用しないので検出対象である配列やプライマーは攻撃されない、ＳｄＸＴＰによりプライマーを簡単にヌクレアーゼ耐性にすることができる、等の特徴から本発明の反応サイクルの循環に非常に好適な酵素である。
【００５４】ＤＮＡポリメラーゼによるオリゴヌクレオチドプライマーを起点とするＤＮＡの伸長反応の基質には、デオキシヌクレオシドトリリン酸（ｄＸＴＰ）を用いる。そして、本発明においては予め配列の明らかな部分について少なくとも１塩基分が伸長すれば分析が可能となるので、少なくともこの１塩基分に対応する１種のヌクレオチドのみを用いることで所望の反応を進行させることができる。当該基質濃度は、検出対象となる塩基配列のモル数に対して十分量となるように添加する。一般的には検出対象の量を正確に予測することは困難なので、少なくとも0.1 μM 、好ましくは１μM 以上のヌクレオチドを添加しておけば、ほとんどの場合は基質が不足する事態を避けることができる。
【００５５】Ｄ．本発明は、生成するピロリン酸又はデオキシヌクレオシドモノリン酸を検出することを特徴とする。
【００５６】基質として用いるｄＸＴＰのα位のリン原子を放射性同位元素（32Ｐ又は33Ｐ）で置換標識することにより；α位のリン酸の、デオキシリボースの、若しくは塩基の水素原子を3Ｈで置換標識することにより；又はデオキシリボースの炭素原子を14Ｃで標識することにより、ｄＸＴＰとｄＸＭＰとをイオン交換樹脂などでクロマト的に分離して放射活性を追跡することによって分解産物であるｄＸＭＰの放射活性を測定することが可能である。なお、現在α位のリン原子が32Ｐ標識したｄＸＴＰとしては、ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰが市販されている。また、現在α位のリン原子が33Ｐ標識したｄＸＴＰとしては、ｄＡＴＰ及びｄＣＴＰが市販されている。また、塩基部分を3Ｈ標識したものとしては、ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰが市販されている。
【００５７】ラジオアイソトープ標識を持つｄＸＭＰは、イオン交換樹脂を用いた薄層クロマトグラフィーで分離すれば放射活性をオートラジオグラフィーによって簡便に、かつ定性的に検出することができる。また、実施例に示すようにこの放射活性を有するスポットを削り取ってシンチレーションカウンターで計数すれば、定量的な分析も可能である。更に必ずしもアイソトープで標識した基質を用いなくとも次のような操作によればｄＸＭＰの分離、測定が可能である。即ち、反応液を市販の蛍光色素を塗布した薄層クロマトグラフィーによって分離し、これに紫外線を照射すればヌクレオチドが紫外線を吸収するため、非蛍光スポットとしてｄＸＭＰを視認することができる。また、液体クロマトグラフィーによって分離し紫外線吸収を計測すればｄＸＭＰを定量的に検出することができる。
【００５８】
【００５９】
【化３】
【００６０】この他のピロリン酸の測定法としては、「Anal. Biochem., 94, 117-120 (1979)」に引用された方法等が知られている。
【００６１】Ｅ．具体例以下に具体的なオリゴヌクレオチドプライマーの配列とその配列を用いた場合の本発明による反応系を例示する（下記式４）。
【００６２】
【化４】
【００６３】
【００６４】
【００６５】
【化５】
【００６６】プライマーとしては式５中に示した部分の配列（配列番号２）を用いる。なお３’側のT-G 間をホスホロチオエート結合としヌクレアーゼ耐性としておき、ＤＮＡポリメラーゼによる合成用の基質としてはｄＧＴＰのみを加えておく。この例では、検出対象が正常であればｄＧＴＰを取りこむ反応が進行し、ＰＰｉとｄＧＭＰが蓄積される。しかし、検出対象が変異体である場合には、相補鎖の合成に必要なｄＴＴＰがないため反応が進行しない。逆にｄＴＴＰのみを基質に加えた時に反応が進行すれば、検出対象となった配列には点突然変異が含まれていることがわかる。本発明ではこのようにして点突然変異を検出することが可能である（下記式６参照）。
【００６７】
【化６】
【００６８】なお、式５及び式６ではプライマーが上段に、鋳型配列が下段に表示されており、前記式１、２及び４（鋳型配列が上段で、プライマーが下段）とは表示が異なっている。
【００６９】Ｆ．本発明ポリヌクレオチド検出用キット以上のような本発明に必要な各種成分は、予め組み合せた試薬の形で供給することができる。あらためて本発明による塩基配列検出用試薬の構成を次に示す。以下に示す試薬には、更に標識の検出に必要な資材や反応液を構成する緩衝剤、あるいは陰性や陽性の対照等の任意の成分を組み合せてキットの形とすることもできる。
【００７０】本発明ポリヌクレオチド検出用キットの構成は以下のごとくである。
１．検出対象のその塩基配列が既知であるポリヌクレオチドの一部と相補的な配列を有しかつヌクレアーゼ耐性を有するオリゴヌクレオチドプライマー、２．ＤＮＡポリメラーゼ、３．少なくとも１種のデオキシヌクレオシドトリリン酸、４．３’→５’方向に２本鎖ＤＮＡを分解する活性を有するヌクレアーゼ。
【００７１】以上１〜４を含むキットに、前記のポリヌクレオチドの検出の指標に応じて、検出用試薬を含ませることができる。即ち、ｄＸＭＰの検出を企図する場合には、デオキシヌクレオシドモノリン酸検出用試薬を含有させることができる。かかる検出用キットの具体例としては、例えば以下に挙げる検出用キットを挙げることができる。
【００７２】即ち、反応用試薬として、ホスホロチオエート化オリゴヌクレオチド、ＤＮＡポリメラーゼＩ クレノウフラグメント、デオキシヌクレオシドトリリン酸（32Ｐ標識）、エクソヌクレアーゼIII 、Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液、ＭｇＣｌ2 、ＢＳＡ及びＤＴＴを含み；反応停止液としてＥＤＴＡを含み；ｄＸＭＰ検出用試薬として、薄層クロマトグラフィー用イオン交換セルロース（ＰＥＩ＝ポリエチレンイミンセルロース）及びＬｉＣｌ（展開溶媒）、又はピロリン酸検出用試薬として、ＡＴＰスルフィラーゼ、アデノシン−５’−ホスホサルフェート、ルシフェリン及びルシフェラーゼを含む検出用キットを挙げることができる。
【００７３】以下に、本発明の作用機序と実際上の効果を集約して記載する。本発明におけるオリゴヌクレオチドプライマーは、検出対象となる塩基配列に特異的にハイブリダイズしＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応の起点となる。また予めヌクレアーゼ耐性としておくか、あるいはＤＮＡポリメラーゼの作用でデオキシヌクレオチド誘導体（ＳｄＸＴＰ等）を付加してヌクレアーゼ耐性とすることによって、以下に続くＤＮＡポリメラーゼの作用によるデオキシヌクレオシドトリリン酸（ｄＸＴＰ）の付加〜ヌクレアーゼの作用による分解という２つの反応を繰り返し起こすことを可能とする。この反応が繰り返し直線的に起きるので、本発明においてはヌクレアーゼ分解産物が反応系に蓄積し、定量的でしかも高感度な検出系が実現できる。
【００７４】そして、プライマーがミスマッチにより非特異的な配列にハイブリダイズしたとしても、それに隣接する領域の相補鎖を合成していく工程において予め基質として用意したｄＸＴＰが適合していなければ以降の反応が進まず誤った結果は生じないという利点を有する。また、本発明では高温処理によるＤＮＡの変性操作を繰り返す必要がないのでＤＮＡポリメラーゼをはじめとする試薬成分には熱安定性が要求されず、しかも複雑な温度制御を必要としない。そのため、操作を自動化することが容易であるという利点をも有する。
【００７５】本発明におけるＤＮＡポリメラーゼは、前記プライマーがハイブリダイズした領域に隣接する配列に対して相補な鎖を合成するものである。合成時には、１モルのｄＸＴＰの付加反応について１モルのＰＰｉを生成する。ＰＰｉは酵素反応により特異的に測定することができるので、本発明においては合成反応によって同時に信号を生成するシステムとなっている。また、別の実施態様においては、この反応で伸長した部分がヌクレアーゼによって分解された産物を検出対象とすることができる。ＤＮＡポリメラーゼは、オリゴヌクレオチドプライマーとしてヌクレアーゼ耐性でないものを利用するときにデオキシヌクレオチド誘導体を基質とすることによってこれをヌクレアーゼ耐性に変換する作用を持つ。
【００７６】本発明におけるヌクレアーゼは、検出対象となる配列とハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドプライマーを起点として伸長した部分を前記ヌクレアーゼ耐性部位まで特異的に加水分解する作用を持つ。標的配列が存在しない時にはこの分解は起こらず、またたとえ標的配列が存在していてもオリゴヌクレオチドプライマーのハイブリダイズとＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応が起きない限り加水分解されることはない。ヌクレアーゼのこのような特性により本発明において反応液中に蓄積する分解産物は、検出対象に対して特異的に、そして直線的に増加し、定量性の高い分析が可能となる。
【００７７】また、本発明の利点の一つとして、コンタミネーションの影響を受け難いことが挙げられる。即ち、たとえ反応後のサンプルがこれから反応させようとする溶液中に誤って混入しても、蓄積した分解産物そのものは新たな鋳型としては機能しないのでこれをもとに反応が進行することがなく実用上大変有利である。
【００７８】更に、本発明の固有の効果として、均一系で簡便な操作を提供できる点が挙げられる。ＤＮＡポリメラーゼによるｄＸＴＰの付加にともない生成するＰＰｉを追跡する方法を採用すれば、付加的なプローブとのハイブリダイズや電気泳動による分離等の操作を全く必要としない反応系を提供できる。ＰＰｉは純粋に酵素的な反応によって特異的に測定することができるので、合成と分解反応を行った反応液中でそのまま連続して反応を継続することが可能となり非常に実用的である。本発明のこのような利点は、ＰＣＲ法による増幅産物を検出するためにはプローブとのハイブリダイズや電気泳動による分離が要求されることと比べるとより明瞭である。
【００７９】その他、反応の第一段階で検出対象配列にハイブリダイズしたプライマーをそのまま継続して反応に利用するメリットとして、プライマーを比較的少量しか用意しなくてもよいことが挙げられる。ＰＣＲのように増幅産物によってプライマーが消費される系では大過剰のプライマーを用意しなければならないが、本発明では検出対象配列のモル数に対してわずかに過剰のプライマーを用意すれば十分である。そして、同様のことは基質となるデオキシヌクレオシドトリリン酸についてもいえる。即ち、例えばＰＣＲでは伸長する領域に必要な基質を全て用意しなければならない。本発明では、ハイブリダイズした領域に隣接する配列に相補な塩基を少なくとも１種類だけ用意すればよいので試薬構成を単純化できるという利点を有する。
【００８０】本発明の付随的な効果として点突然変異の検出に応用可能なことを挙げることができる。即ち、予め点突然変異を起こす部位が判明している時には、この部分に隣接する領域をプライマーとして選び点突然変異の起った時には反応が進行しないように反応系を設定することにより点突然変異の有無を確認することが可能である。以上のように本発明によるポリヌクレオチドの検出方法は種々の利点を有するものであり、遺伝子の分析において有効な方法となることが期待できる。
【００８１】
【実施例】以下、実施例に基づいて本発明を更に詳細に説明する。しかしながら、本実施例により本発明の技術的範囲が限定されて解釈されるものではない。
〔実施例〕 ＨＢＶ・ＤＮＡのＨＢＶ−ｅ抗原遺伝子の検出ＨＢＶ・ＤＮＡのＨＢＶ−ｅ抗原遺伝子の検出を試みた。ヌクレアーゼには大腸菌由来のエクソヌクレアーゼIII （寶酒造製）を、またプライマーＤＮＡには配列番号３に示す塩基配列を持つオリゴヌクレオチドを化学合成して用いた。
【００８２】(1)-1 プライマーＤＮＡの調製前記配列（配列番号３）のオリゴヌクレオチドは、β−シアノエチルアミダイト法（J.Am.Chem.Soc., 112, 1253-1254 (1990))に従って合成した。Ｓ化試薬として、3H-1,2-benzodithiole-3-one 1,1-dioxide(Beaucage's Reagent)を用い、３’末端側のT-C 間をホスホロチオエート結合としてヌクレアーゼ耐性プライマーＤＮＡを得た。ＤＮＡ合成機としてＣｙｃｌｏｎｅ（登録商標）Ｐｌｕｓ ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザー（日本ミリポアリミテッド）を用いた。合成したホスホロチオエート化オリゴヌクレオチドは、常法に従いＨＰＬＣで精製して使用した。
【００８３】(1)-2 塩基配列の検出プライマーＤＮＡを、標的配列となるＨＢＶ・ＤＮＡを一部にもつM13 ファージＤＮＡと混合し、実際に本発明による反応を行わせた。具体的な反応液の組成は下に示す通りであった。なお、下に示した数値はいずれも最終濃度である。反応が実際に進行しているのかどうかを確認するために、各成分を除いた反応系を設けて結果を比較した。またヌクレアーゼ耐性プライマーの必要性を確認するため同じ配列を持つがヌクレアーゼ耐性を持たないプライマーについても実験を行った。本実施例で用いたプライマーをハイブリダイズさせた場合、３’側に隣接する配列はＧであり、従ってその相補鎖の合成にはｄＣＴＰが必要である。そしてこのｄＣＴＰのヌクレアーゼ分解産物は、ｄＣＭＰとなる。
【００８４】＜反応液の組成＞第１反応（５μl ）
10fmol 標的配列（Ｍ13ファージＤＮＡ上にＨＢＶ−ｅ抗原遺伝子領域を持つ１本鎖ＤＮＡ）
１pmol プライマーＤＮＡ50mM Tris/HCl（ｐＨ7.5 ）
10mM MgCl2第２反応（10μl ）
１unit ＤＮＡポリメラーゼＩクレノウフラグメント５units エクソヌクレアーゼIII10μM ｄＣＴＰ（32P 標識、５×104cpm）
50μg/ml 牛血清アルブミン（以下ＢＳＡと略す）
10mM ジチオスレイトール
【００８５】第１反応では反応液（５μl ）を100 ℃で５分間加熱してＤＮＡを１本鎖とした後、65℃で10分間置いてプライマーＤＮＡをハイブリダイズさせた。次いで第２反応に必要な成分を含む試薬液を加えて更に37℃で反応させた。１時間反応させた後、20mMのEDTAを１μl 加えて反応を停止した。反応を停止した反応液の全量を薄層クロマトグラフィー（薄層：ＰＥＩ−Cellulose Ｆ（メルク（Merck)社製），展開溶媒：0.4M LiCl により室温で40分間展開）により分離し、ヌクレアーゼ分解産物であるｄＣＭＰをオートラジオグラフィーによって確認した。
【００８６】図２から明らかなように、検出対象となる配列、クレノウフラグメント、エクソヌクレアーゼIII のいずれを欠いてもヌクレアーゼ分解産物であるｄＣＭＰは検出されず（レーン２−４）、本発明の反応が特異的に進行していることが確認された（レーン１）。なお、レーン１は検出対象配列＋全ての試薬成分についての系であり、レーン２は試薬成分のみの系であり、レーン３は試薬成分中クレノウフラグメントを除く系であり、レーン４は試薬成分中、エクソヌクレアーゼIII を除く系である。
【００８７】またプライマーとしてヌクレアーゼ耐性を持たないものを用いた場合には、他の成分を満足する反応系であってもヌクレアーゼ分解産物としてｄＣＭＰが蓄積しないことを確認した（図３：レーン１はヌクレアーゼ耐性プライマーを利用、レーン２は修飾を施していないプライマー、即ちヌクレアーゼ感受性のプライマーを利用）。これは、ヌクレアーゼによりプライマーの３’側領域（即ち、ｄＣＴＰの付加部位）が分解されるためにｄＣＴＰが付加できなくなることが原因と考えられる。
【００８８】(2)鋳型特異性プライマーが検出対象配列と相補性を持つ場合にのみ、ヌクレアーゼによる基質の分解が起きることを確認するため次のような実験を行った。即ち、検出対象配列としてプライマーと全く相補性を持たない配列を用いる場合、及び検出対象配列の存在しない場合という２つの条件について、前記(1) と同じ操作により実際に反応を行った。
【００８９】その結果、図４（レーン１：検出対象配列がプライマー配列と相補、レーン２：検出対象配列がプライマー配列と同じセンス配列、即ち相補でない、レーン３：検出対象配列を含まない）に示すように検出対象配列とプライマーＤＮＡが相補的であれば分解産物であるｄＣＭＰが蓄積する（レーン１）が、センス配列、即ちプライマーと同じ配列であり相補的でない場合（レーン２）、及び検出対象配列が存在しない場合（レーン３）には分解産物は蓄積しないことが確認された。この実験により、本発明の反応は検出対象配列がプライマーと相補的な配列を持つ時に進行することが立証された。
【００９０】(3)基質（デオキシヌクレオシドトリリン酸）特異性基質であるデオキシヌクレオシドトリリン酸がプライマーに取り込まれるｄＣＴＰの時にのみヌクレアーゼによる分解が起ることを確認するために、前記(1)における基質をｄＧＴＰに置き換えて反応させた。その結果、図５R>５（レーン１：基質としてｄＣＴＰを利用、レーン２：基質としてｄＧＴＰを利用、レーン３：マーカーとしてｄＣＭＰとｄＣＴＰを展開、レーン４：マーカーとしてｄＧＭＰとｄＧＴＰを展開）に示すとおり基質がｄＣＴＰの時にのみ反応が進行し分解産物であるｄＣＭＰが確認され（レーン１）、ｄＧＴＰを加えた時には反応が進行しない（分解産物は生成しない、レーン２）ことを確認した。そして、この結果から本発明による検出方法が点突然変異の検出に利用できることが明らかになった。
【００９１】(4)本発明の検出感度前記(1) と同じ操作で検出対象となるＤＮＡ量を０〜１pmolに変化させて本発明による検出方法の感度を確認した（表１参照）。図６（レーン１：検出対象配列を含むＤＮＡを１pmol添加し反応させた、レーン２：検出対象配列を含むＤＮＡを0.1pmol 添加し反応させた、レーン３：検出対象配列を含むＤＮＡを0.01pmol添加し反応させた、レーン４：検出対象配列を含むＤＮＡを１fmol添加し反応させた、レーン５：検出対象配列を含むＤＮＡを0.1fmol 添加し反応させた、レーン６：検出対象配列を含むＤＮＡを0.01fmol添加し反応させた、レーン７：検出対象配列を含むＤＮＡを１amol添加して反応させた、レーン８：検出対象配列を含むＤＮＡを添加せず、反応させた）に示すように、１fmol（レーン４）のＤＮＡを検出可能なことが確認された。この結果により、本発明による検出方法の感度は極めて高いことが判明した。また本発明による塩基配列検出方法の定量性を確認するため、各バンドを切り出して液体シンチレーションカウンターにより放射活性を測定した。結果を表１に示す。表１において、（Ａ）及び（Ｂ）の値は、各スポットの放射活性（ＣＰＭ）を示す。0.1fmol 〜0.01pmolの範囲で定量性を確保できることが確認された。
【００９２】なお本実施例では、32Ｐ標識したｄＣＴＰの使用量をオートラジオグラフィーのスポットの大きさに差が生じやすい範囲に非標識のｄＣＴＰで予め希釈調整している。従って、ｄＣＴＰに占める標識物の割合を高くすれば、更に高感度を実現することが可能である。
【００９３】
【表１】
表１ 本発明検出方法の検出感度の検討──────────────────────────────────── 検出対象 (A) (B) A-B/Total dCMP 蓄積率 ＤＮＡ量 dCTP dCMP (%) (pmol) (dCMP/Target DNA)──────────────────────────────────── 1pmol 6566 17883 70.9 70.9 70.9 0.1 8805 25204 72.5 72.5 725 0.01 18381 15212 43.7 43.7 4370 1fmol 32552 1808 3.67 3.67 3670 0.1 31550 681 0.42 0.42 4200 none 35997 547 - - ────────────────────────────────────
【００９４】(5) Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼによる本発明の検出方法前記(1) におけるクレノウフラグメントに代えてＴ４ＤＮＡポリメラーゼを用い、本発明による塩基配列の検出方法を試みた。Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼは、先に述べたとおり３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を合わせ持つ酵素であるため、ヌクレアーゼ活性を持つ酵素として別の酵素を加えなくても反応系を構成することが可能である。
【００９５】Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを４units 用い、反応系を下に示す組成とした。他は前記(1) と同じ条件に基づいて反応を行った。結果は図７（レーン１：クレノウフラグメント＋エクソヌクレアーゼのみで検出対象配列を含まない、レーン２：クレノウフラグメント＋エクソヌクレアーゼ＋検出対象配列、レーン３：Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼのみ、レーン４：Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ＋検出対象配列）に示すとおりである。対照として示した前記(1) の結果に比べるとスポットは小さいが、ヌクレアーゼ分解産物であるｄＣＭＰの生成が確認された。このようにＴ４ＤＮＡポリメラーゼを用いればヌクレアーゼ活性を持つ酵素として別の物質を加えなくても本発明による反応が進行することが判明した。
【００９６】＜反応液の組成＞第一反応（５μl ）
10fmol 標的配列１pmol プライマーＤＮＡ67mM Tris/ HCl (pH8.8)6.7mM MgCl216.7mM (NH4)2SO46.7mM EDTA第二反応（１０μl ）
10mM β- メルカプトエタノール10μM ｄＣＴＰ (32P 標識、5 x 104cpm)50μg/ml ＢＳＡ４ units Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ（寶酒造製）
【００９７】
【発明の効果】本発明によれば、遺伝的疾患や感染症の診断に有効な試料中に存在する特定の塩基配列を含むポリヌクレオチドの検出方法及び当該検出方法に使用するポリヌクレオチド検出用キットが提供される。
【００９８】
【配列表】
配列番号：１配列の長さ：25配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ起源生物名：サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）
配列CCCCGAAATG GGACCCAGTA CGGAT
【００９９】配列番号：２配列の長さ：24配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ起源生物名：ヒト癌遺伝子Ｋｉ−ｒａｓ／１２ 配列 ATAAACTTGT GGTAGTTGGA GCTG 24
【０１００】配列番号：３配列の長さ：25配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ起源生物名：ＨＢＶ・ＤＮＡのＨＢＶ−ｅ抗原遺伝子 配列 AATGCCCCTA TCTTATCAAC ACTTC 25
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の反応原理を示す模式図である。
【図２】本発明によるＨＢＶ−ｅ抗原遺伝子の検出方法によって得られたオートラジオグラフィ−の結果を示す図である。
【図３】本発明による反応系におけるヌクレアーゼ耐性プライマーの必要性について調査したオートラジオグラフィーの結果を示す図である。
【図４】プライマーの配列と検出対象のポリヌクレオチドの塩基配列の相補性とヌクレアーゼ分解産物の関係を調査したオートラジオグラフィーの結果を示す図である。
【図５】基質とヌクレアーゼ分解産物の関係を調査したオートラジオグラフィーの結果を示す図である。
【図６】標的ポリヌクレオチドの濃度を変化させて感度を調査したオートラジオグラフィーの結果を示す図である。
【図７】Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを用いた場合について調査したオートラジオグラフィーの結果を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】 検出対象のその塩基配列が既知であるポリヌクレオチドに、当該ポリヌクレオチドの一部と相補的な配列を有しかつヌクレアーゼ耐性を有するオリゴヌクレオチドプライマーをハイブリダイズさせ、次いでこれに少なくとも１種のデオキシヌクレオシドトリリン酸、ＤＮＡポリメラーゼ及びヌクレアーゼを加えて、前記プライマーの３’末端に隣接しかつ前記ポリヌクレオチドと相補的である塩基種を相補鎖合成し引き続いて分解し、かつ当該相補鎖合成及び分解を少なくとも１回以上繰り返して、生成するピロリン酸又はデオキシヌクレオシドモノリン酸を検出することを特徴とする、前記ポリヌクレオチドの検出方法。
【請求項２】 オリゴヌクレオチドプライマーが、当該オリゴヌクレオチドプライマーの３’末端でホスホロチオエート化されたものであることを特徴とする請求項１記載のポリヌクレオチドの検出方法。
【請求項３】 ＤＮＡポリメラーゼが、ＤＮＡポリメラーゼＩ、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメント、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ及びＰｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼからなる群から選ばれるＤＮＡポリメラーゼであることを特徴とする請求項１又は２記載のポリヌクレオチドの検出方法。
【請求項４】 ヌクレアーゼがエクソヌクレアーゼIII であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドの検出方法。
【請求項５】 デオキシヌクレオシドトリリン酸のβ位及びγ位のリン酸分子以外の分子又は原子が、放射性同位元素で置換標識されており、かつヌクレアーゼによる反応により生成するデオキシヌクレオシドモノリン酸を検出することを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドの検出方法。
【請求項６】 ヌクレアーゼによる反応により生成するデオキシヌクレオシドモノリン酸をクロマトグラフィーによって分離し当該デオキシヌクレオシドモノリン酸を光学的に測定することを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドの検出方法。
【請求項７】 請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドの検出方法において、ＤＮＡポリメラーゼによる相補鎖合成により生成するピロリン酸を、アデノシン−５’−ホスホサルフェート及びアデノシントリリン酸スルフリラーゼと反応させてアデノシントリリン酸を生成させ、当該アデノシントリリン酸を検出することを特徴とするポリヌクレオチドの検出方法。
【請求項８】 アデノシントリリン酸をルシフェリン−ルシフェラーゼ反応によって測定することを特徴とする請求項７記載のポリヌクレオチドの検出方法。
【請求項９】 以下の１〜４の成分：１．検出対象のその塩基配列が既知であるポリヌクレオチドの一部と相補的な配列を有しかつヌクレアーゼ耐性を有するオリゴヌクレオチドプライマー、２．ＤＮＡポリメラーゼ、３．少なくとも１種のデオキシヌクレオシドトリリン酸、及び４．３’→５’方向に２本鎖ＤＮＡを分解する活性を有するヌクレアーゼ。
を含む請求項１〜８のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドの検出方法に使用するポリヌクレオチド検出用キット。
【請求項１０】 請求項９記載のポリヌクレオチド検出用キットにおいて、当該検出用キットに、デオキシヌクレオシドモノリン酸検出用試薬を含有させたことを特徴とするポリヌクレオチド検出用キット。
【請求項１１】 請求項９記載のポリヌクレオチド検出用キットにおいて、当該検出用キットに、ピロリン酸検出用試薬を含有させたことを特徴とするポリヌクレオチド検出用キット。
【請求項１】 検出対象のその塩基配列が既知であるポリヌクレオチドに、当該ポリヌクレオチドの一部と相補的な配列を有しかつヌクレアーゼ耐性を有するオリゴヌクレオチドプライマーをハイブリダイズさせ、次いでこれに少なくとも１種のデオキシヌクレオシドトリリン酸、ＤＮＡポリメラーゼ及びヌクレアーゼを加えて、前記プライマーの３’末端に隣接しかつ前記ポリヌクレオチドと相補的である塩基種を相補鎖合成し引き続いて分解し、かつ当該相補鎖合成及び分解を少なくとも１回以上繰り返して、生成するピロリン酸又はデオキシヌクレオシドモノリン酸を検出することを特徴とする、前記ポリヌクレオチドの検出方法。
【請求項２】 オリゴヌクレオチドプライマーが、当該オリゴヌクレオチドプライマーの３’末端でホスホロチオエート化されたものであることを特徴とする請求項１記載のポリヌクレオチドの検出方法。
【請求項３】 ＤＮＡポリメラーゼが、ＤＮＡポリメラーゼＩ、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメント、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ及びＰｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼからなる群から選ばれるＤＮＡポリメラーゼであることを特徴とする請求項１又は２記載のポリヌクレオチドの検出方法。
【請求項４】 ヌクレアーゼがエクソヌクレアーゼIII であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドの検出方法。
【請求項５】 デオキシヌクレオシドトリリン酸のβ位及びγ位のリン酸分子以外の分子又は原子が、放射性同位元素で置換標識されており、かつヌクレアーゼによる反応により生成するデオキシヌクレオシドモノリン酸を検出することを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドの検出方法。
【請求項６】 ヌクレアーゼによる反応により生成するデオキシヌクレオシドモノリン酸をクロマトグラフィーによって分離し当該デオキシヌクレオシドモノリン酸を光学的に測定することを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドの検出方法。
【請求項７】 請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドの検出方法において、ＤＮＡポリメラーゼによる相補鎖合成により生成するピロリン酸を、アデノシン−５’−ホスホサルフェート及びアデノシントリリン酸スルフリラーゼと反応させてアデノシントリリン酸を生成させ、当該アデノシントリリン酸を検出することを特徴とするポリヌクレオチドの検出方法。
【請求項８】 アデノシントリリン酸をルシフェリン−ルシフェラーゼ反応によって測定することを特徴とする請求項７記載のポリヌクレオチドの検出方法。
【請求項９】 以下の１〜４の成分：１．検出対象のその塩基配列が既知であるポリヌクレオチドの一部と相補的な配列を有しかつヌクレアーゼ耐性を有するオリゴヌクレオチドプライマー、２．ＤＮＡポリメラーゼ、３．少なくとも１種のデオキシヌクレオシドトリリン酸、及び４．３’→５’方向に２本鎖ＤＮＡを分解する活性を有するヌクレアーゼ。
を含む請求項１〜８のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドの検出方法に使用するポリヌクレオチド検出用キット。
【請求項１０】 請求項９記載のポリヌクレオチド検出用キットにおいて、当該検出用キットに、デオキシヌクレオシドモノリン酸検出用試薬を含有させたことを特徴とするポリヌクレオチド検出用キット。
【請求項１１】 請求項９記載のポリヌクレオチド検出用キットにおいて、当該検出用キットに、ピロリン酸検出用試薬を含有させたことを特徴とするポリヌクレオチド検出用キット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図７】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図７】
【図６】
【公開番号】特開平７−２３１７９９
【公開日】平成７年（１９９５）９月５日
【国際特許分類】
【出願番号】特願平６−３１８７１１
【出願日】平成６年（１９９４）１２月２１日
【出願人】（０００１２０４５６）栄研化学株式会社 (67)
【出願人】（０００００２９５６）田辺製薬株式会社 (225)
【公開日】平成７年（１９９５）９月５日
【国際特許分類】
【出願日】平成６年（１９９４）１２月２１日
【出願人】（０００１２０４５６）栄研化学株式会社 (67)
【出願人】（０００００２９５６）田辺製薬株式会社 (225)
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