生体内分解性縫合糸
【課題】従来技術では困難であった生体内で分解する際のpH変化の少なく、平滑性を有する生体内分解性縫合糸を提供すること。
【解決手段】ポリペプチドから作製されることを特徴とする、生体内分解性縫合糸。
【解決手段】ポリペプチドから作製されることを特徴とする、生体内分解性縫合糸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリペプチドを用いた生体内分解性縫合糸に関する。
【背景技術】
【０００２】
手術時の組織の縫合には、ナイロン等の非分解性の縫合糸やポリ乳酸やポリグリコール酸等の生体内分解性縫合糸が用いられている。前者は種々の性質の縫合糸が上市されており、満足度の高い製品となっている。一方、後者の生体内分解性縫合糸は用いられる素材も非常に限られており、必ずしも臨床で要求される性質を完全に満たしているとは言えない。これらの縫合糸に要求される性質として、（１）素材自身が生体内で毒性を有さないこと、（２）分解物が安全であること、（３）適度な平滑性を有すること、（４）結節強力であることが挙げられる。
【０００３】
現在上市されている生体内分解性縫合糸としてはポリ乳酸やポリグリコール酸といった分解部位がエステル結合である合成高分子が用いられている（特許文献１）。該ポリマーは生体内分解性のポリマーであり、非常に生体適合性が高いことが知られている。しかしながら、分解時に酸が発生するため、組織の局所部位でのpHが大きく低下し、損傷部位の修復を遅らせる恐れがある。
【０００４】
また、上記のような合成高分子は疎水性が高く、水分の割合の高い組織に適用する際には、生体と縫合糸との水分割合が大きく異なるため、生体とのなじみに問題がある。
【特許文献１】特開昭６３−２６４９１３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、従来技術では困難であった生体内で分解する際のpH変化の少なく、平滑性を有する生体内分解性縫合糸を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、ポリペプチドを素材として用いて縫合糸を作製することにより、分解時にpHが大幅に低下せず、かつ平滑性を有する生体内分解性縫合糸を作製できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
即ち、本発明によれば、ポリペプチドから作製されることを特徴とする、生体内分解性縫合糸が提供される
好ましくは、ポリペプチドは、生体由来のタンパク質、又は遺伝子組み換えタンパク質である。
好ましくは、ポリペプチドは、遺伝子組み換えゼラチンである。
【０００８】
好ましくは、本発明の生体内分解性縫合糸は、さらに多糖を構成成分として含む。
好ましくは、多糖はグリコサミノグリカン、キチン、又はキトサンである。
【０００９】
好ましくは、ポリペプチドは架橋されている。
好ましくは、該架橋は光、熱、縮合剤、又は酵素による架橋である。
好ましくは、該架橋はグルタルアルデヒドによる架橋である。
【００１０】
好ましくは、糸は、膨潤状態、又は乾燥状態である。
好ましくは、本発明の生体内分解性縫合糸は、ポリペプチドと溶媒を含む溶液を射出して糸を成形することにより作製される。
好ましくは、溶媒は、水または有機フッ素化合物である。
好ましくは、溶媒は有機フッ素化合物である。
好ましくは、溶媒は1，1，1，3，3，3‐ヘキサフルオロ-2プロパノール、2,2,2-トリフルオロエタノールである。
【００１１】
好ましくは、糸の半分が分解した際の糸内部のpHは５以上８以下である。
好ましくは、糸の全てを加水分解した際のカルボン酸基は20 mol%以下である。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、（１）素材自身が毒性を示さず、（２）分解時にpHが大幅に低下せず（分解物が毒性を示さない）、組織の修復を阻害せず、（３）平滑性が高い生体内分解性縫合糸を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本発明で用いるポリペプチドはタンパク質であることが好ましく、中でもゼラチンが最も好ましい。ゼラチンは天然型でも構わないが、縫合糸に必要な各種パラメーターの精密な設計を可能にすることから、遺伝子組み換えゼラチンであることが特に好ましい。
【００１４】
遺伝子組み換えゼラチンとしては、例えば、EP0926543B、EP1014176A,WO2002/052342、EP1063565B、WO2004/085473、US6992172、WO2006/91099、WO2005/011740に記載のものを用いることができるがこれらに限定されるものではない。また、該生体高分子は部分的に加水分解されていてもよい。該ゼラチンは生体由来のコラーゲンの配列とのアミノ酸同一性が40％であればよく、より好ましくは50％以上である。より好ましくは80％以上、最も好ましくは90％以上である。ここで言うコラーゲンとは天然に存在するものであればいずれであっても構わないが、好ましくはI型、II型、III型、IV型、およびV型である。より好ましくは、I型、II型、III型である。別の形態によると、該コラーゲンの由来は好ましくは、ヒト、ウシ、ブタ、マウス、ラットである。より好ましくはヒトである。
【００１５】
該遺伝子組み換えゼラチンの等電点は4.8〜10であり、より好ましくは5〜10である。より好ましくは5〜9.5である。
【００１６】
遺伝子組み換えゼラチンがコラーゲンに特徴的なGXY部分を有し、分子量が2 KDa以上100 KDa以下である。より好ましくは2.5 KDa以上95KDa以下である。より好ましくは5 KDa以上90 KDa以上である。最も好ましくは、10 KDa以上90KDa以下である。コラーゲンに特徴的なGXY部分とは、ゼラチン・コラーゲンのアミノ酸組成および配列における、他のタンパク質と比較して非常に特異的な部分構造である。この部分においてはグリシンが全体の約３分の１を占め、アミノ酸配列では３個に１個の繰り返しとなっている。グリシンは最も簡単なアミノ酸であり、分子鎖の配置への束縛も少なく、ゲル化に際してのヘリックス構造の再生に大きく寄与している。X,Yであらわされるアミノ酸はイミノ酸（プロリン、オキシプロリン）が多く含まれ、全体の１０％〜４５％を占める。
【００１７】
好ましくは、該遺伝子組み換えゼラチンは脱アミン化されていない。
好ましくは、該遺伝子組み換えゼラチンはプロコラーゲンおよびプロコラーゲンを有さない。
好ましくは、該遺伝子組み換えゼラチンは天然コラーゲンをコードする核酸により調製された実質的に純粋なコラーゲン様材料である。
【００１８】
遺伝子組み換えゼラチンなどのポリペプチドは、その他の合成高分子との混合物としても利用することができる。好ましくは、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、およびそれらの共重合体、ポリ（ε―カプロラクトン）、ポリ（ヒドロキシアルカノエート）（PHA）、ポリ（ビスーカルボキシフェノキシプロパン）、ビスカルボキシフェノキシプロパンーセバシン酸共重合体、グリセロール、ポリエチレングリコール、ヒアルロン酸ベンジルエステル、ヒアルロン酸エチルエステル、アセチルセルロースである。
【００１９】
本発明で用いる合成高分子の分子量は特に限定することはないが、実質的には1KDa以上10MDa以下である。好ましくは5 KDa以上500 KDa以下である。最も好ましくは10 KDa以上100 KDa以下である。さらに、該合成高分子は架橋および化学修飾が施されていても構わない。
【００２０】
本発明では、生体内分解性縫合糸を作製するための素材として、遺伝子組み換えゼラチンなどのポリペプチドと一緒に多糖を用いることができる。本発明で用いることができる多糖の種類は、本発明を実施可能である限りは特に限定はないが、好ましくはグリコサミノグリカン、κカラギナン、キチン、キトサンである。多糖の使用量は特に限定されないが、ポリペプチドの使用量に対して一般的には0.１％から５０％、好ましくは１％から２０％程度である。特に、κカラギナンを混合すると、ゲルの強度が向上することがある。
【００２１】
本発明におけるポリペプチドは架橋されていてもよい。架橋は光、熱、架橋剤（化学化架橋剤（縮合剤）、又は酵素など）によって行うことができる。本発明で用いる架橋剤は本発明を実施可能である限りは特に限定はなく、化学架橋剤でも酵素でもよい。化学架橋剤としては、例えば、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、カルボジイミド、シアナミドなどが挙げられる。好ましくは、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒドである。
【００２２】
酵素による架橋を行う場合、酵素としては、ポリペプチドの架橋作用を有するものであれば特に限定されないが、好ましくはトランスグルタミナーゼおよびラッカーゼ、最も好ましくはトランスグルタミナーゼを用いて架橋を行うことができる。トランスグルタミナーゼで酵素架橋するタンパク質の具体例としては、リジン残基およびグルタミン残基を有するタンパク質であれば特に制限されない。トランスグルタミナーゼは、哺乳類由来のものであっても、微生物由来のものであってもよく、具体的には、味の素（株）製アクティバシリーズ、試薬として発売されている哺乳類由来のトランスグルタミナーゼ、例えば、オリエンタル酵母工業（株）製、Upstate USA Inc.製、Biodesign International製などのモルモット肝臓由来トランスグルタミナーゼ、ヤギ由来トランスグルタミナーゼ、ウサギ由来トランスグルタミナーゼなど、ヒト由来の血液凝固因子（Factor XIIIa、 Haematologic Technologies， Inc.社）などが挙げられる。
【００２３】
生体高分子の架橋には生体高分子の溶液と架橋剤を混合する過程とそれらの均一溶液の反応する過程の２つの過程を有する。
【００２４】
本発明においてポリペプチドを架橋剤で処理する際の混合温度は、溶液を均一に攪拌できる限り特に限定されないが、好ましくは０℃〜４０℃であり、より好ましくは０℃〜３０℃であり、より好ましくは３℃〜２５℃であり、より好ましくは３℃〜１５℃であり、さらに好ましくは３℃〜１０℃であり、特に好ましくは３℃〜７℃である。
【００２５】
ポリペプチドと架橋剤を攪拌した後は温度を上昇させることができる。反応温度としては架橋が進行する限りは特に限定はないが、ポリペプチドの変性や分解を考慮すると実質的には０℃〜６０℃であり、より好ましくは０℃〜４０℃であり、より好ましくは３℃〜２５℃であり、より好ましくは３℃から１５℃であり、さらに好ましくは３℃〜１０℃であり、特に好ましくは３℃〜７℃である。
【００２６】
軟骨等の生体組織は稼動により磨耗されうる場所であるが、実際は非常に摩擦係数が小さいことが知られている。それは生体組織がゲル状態であることであるといわれている。ゲルは摩擦を受けた際に、表面付近で構造変化が起こり、低摩擦となっている。従って、本発明で作製される糸はゲルとして組織との低摩擦の糸を提供することも可能である。
【００２７】
得られる糸の使用の際は、乾燥、湿潤のいずれの場合でも構わないが、使用時の組織との摩擦が最低限にしたいときは、湿潤状態で用いることが望ましい。
【００２８】
本発明の生体内分解性縫合糸は、例えば、ポリペプチドと溶媒を含む溶液を射出して糸を成形することにより作製することができる。本発明の縫合糸を作製する際に使用する溶媒は、水または有機フッ素化合物であることが好ましく、有機フッ素化合物であることがさらに好ましい。溶媒は、より好ましくは炭素数１から８の有機フッ素化合物であり、さらに好ましくは炭素数１から６の有機フッ素化合物であり、さらに好ましくは炭素数１から３の有機フッ素化合物である。溶媒は、特に好ましくは、１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノール、2,2,2-トリフルオロエタノール、ヘキサフルオロアセトン、トリフルオロ酢酸、またはペンタフルオロプロピオン酸である。
【００２９】
本発明の目的を達成するために、好ましくは本発明の縫合糸の半分が分解した際の糸内部のｐＨが５以上８以下であることが好ましい。また、縫合糸すべてを加水分解した際のカルボン酸基が20 mol%以下であることが好ましい。
【００３０】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００３１】
実施例１： 遺伝子組み換えゼラチンの合成
コラーゲンに特徴的なGXY配列を有する遺伝子組み換えゼラチンを先行例に従って合成した（EP-A-0926453、EP-A-1014176、WO01/34646、WO2006/091099）。配列の一例を示すがこれらに限定されるものではない。
【００３２】
名称：HU（配列番号１）
GPPGEPGPTGLPGPPGERGGPGSRGFPGADGVAGPKGPAGERGSPGPAGPKGSPGEAGRPGEAGLPGAKGLTGSPGSPGPDGKTGPPGPAGQDGRPGPPGPPGARGQAGVMGFPGPKGAAGEPGKAGERGVPGPPGAVGPAGKDGEAGAQGPPGPAGPAGERGEQGPAGSPGFQGLPGPAGPPGEAGKPGEQGVPGDLGAPGPSGPA
【００３３】
名称：HU3（配列番号２）
GPPGEPGPTGLPGPPGERGGPGSRGFPGADGVAGPKGPAGERGSPGPAGPKGSPGEAGRPGEAGLPGAKGLTGSPGSPGPDGKTGPPGPAGQDGRPGPPGPPGARGQAGVMGFPGPKGAAGEPGKAGERGVPGPPGAVGPAGKDGEAGAQGPPGPAGPAGERGEQGPAGSPGFQGLPGPAGPPGEAGKPGEQGVPGDLGAPGPSGPAGEPGPTGLPGPPGERGGPGSRGFPGADGVAGPKGPAGERGSPGPAGPKGSPGEAGRPGEAGLPGAKGLTGSPGSPGPDGKTGPPGPAGQDGRPGPPGPPGARGQAGVMGFPGPKGAAGEPGKAGERGVPGPPGAVGPAGKDGEAGAQGPPGPAGPAGERGEQGPAGSPGFQGLPGPAGPPGEAGKPGEQGVPGDLGAPGPSGPAGEPGPTGLPGPPGERGGPGSRGFPGADGVAGPKGPAGERGSPGPAGPKGSPGEAGRPGEAGLPGAKGLTGSPGSPGPDGKTGPPGPAGQDGRPGPPGPPGARGQAGVMGFPGPKGAAGEPGKAGERGVPGPPGAVGPAGKDGEAGAQGPPGPAGPAGERGEQGPAGSPGFQGLPGPAGPPGEAGKPGEQGVPGDLGAPGPSGPAG
【００３４】
名称：HU4（配列番号３）
GPPGEPGPTGLPGPPGERGGPGSRGFPGADGVAGPKGPAGERGSPGPAGPKGSPGEAGRPGEAGLPGAKGLTGSPGSPGPDGKTGPPGPAGQDGRPGPPGPPGARGQAGVMGFPGPKGAAGEPGKAGERGVPGPPGAVGPAGKDGEAGAQGPPGPAGPAGERGEQGPAGSPGFQGLPGPAGPPGEAGKPGEQGVPGDLGAPGPSGPAGEPGPTGLPGPPGERGGPGSRGFPGADGVAGPKGPAGERGSPGPAGPKGSPGEAGRPGEAGLPGAKGLTGSPGSPGPDGKTGPPGPAGQDGRPGPPGPPGARGQAGVMGFPGPKGAAGEPGKAGERGVPGPPGAVGPAGKDGEAGAQGPPGPAGPAGERGEQGPAGSPGFQGLPGPAGPPGEAGKPGEQGVPGDLGAPGPSGPAGEPGPTGLPGPPGERGGPGSRGFPGADGVAGPKGPAGERGSPGPAGPKGSPGEAGRPGEAGLPGAKGLTGSPGSPGPDGKTGPPGPAGQDGRPGPPGPPGARGQAGVMGFPGPKGAAGEPGKAGERGVPGPPGAVGPAGKDGEAGAQGPPGPAGPAGERGEQGPAGSPGFQGLPGPAGPPGEAGKPGEQGVPGDLGAPGPSGPAGEPGPTGLPGPPGERGGPGSRGFPGADGVAGPKGPAGERGSPGPAGPKGSPGEAGRPGEAGLPGAKGLTGSPGSPGPDGKTGPPGPAGQDGRPGPPGPPGARGQAGVMGFPGPKGAAGEPGKAGERGVPGPPGAVGPAGKDGEAGAQGPPGPAGPAGERGEQGPAGSPGFQGLPGPAGPPGEAGKPGEQGVPGDLGAPGPSGPAGG
【００３５】
名称：Ｐ（配列番号４）
GPPGEPGNPGSPGNQGQPGNKGSPGNPGQPGNEGQPGQPGQNGQPGEPGSNGPQGSQGNPGKNGQPGSPGSQGSPGNQGSPGQPGNPGQPGEQGKPGNQGPAGG
【００３６】
名称：Ｐ４（配列番号５）
GPPGEPGNPGSPGNQGQPGNKGSPGNPGQPGNEGQPGQPGQNGQPGEPGSNGPQGSQGNPGKNGQPGSPGSQGSPGNQGSPGQPGNPGQPGEQGKPGNQGPAGEPGNPGSPGNQGQPGNKGSPGNPGQPGNEGQPGQPGQNGQPGEPGSNGPQGSQGNPGKNGQPGSPGSQGSPGNQGSPGQPGNPGQPGEQGKPGNQGPAGEPGNPGSPGNQGQPGNKGSPGNPGQPGNEGQPGQPGQNGQPGEPGSNGPQGSQGNPGKNGQPGSPGSQGSPGNQGSPGQPGNPGQPGEQGKPGNQGPAGEPGNPGSPGNQGQPGNKGSPGNPGQPGNEGQPGQPGQNGQPGEPGSNGPQGSQGNPGKNGQPGSPGSQGSPGNQGSPGQPGNPGQPGEQGKPGNQGPAGG
【００３７】
実施例２：ゼラチン縫合糸の作製
ブタ皮膚酸処理ゼラチン（ニッピ社製）、または実施例１にて合成した遺伝子組み換えゼラチンまたはフィブロジェン社製遺伝子組み換えゼラチン（100 KDa）、および2％グルタルアルデヒド（GA）を含む1,1,1,3,3,3−ヘキサフルオロ−２−プロパノール（HFIP）-水混合溶液（ゼラチン濃度：20％、HFIP/水＝11.5）を４℃でシリンジから射出し、糸を成形した後、40℃で15時間静置した。該糸を5Mグリシン水溶液に浸漬し、40℃で15時間静置した。該糸を水にて洗浄したのち、HFIPを除去し（温度：50℃、湿度：95％、時間：3日）、架橋ゼラチンによる糸を作製した。いずれのゼラチンを用いた場合も架橋ゼラチンによる縫合糸を作製できた。また、ＨＦＩＰの代わりに2,2,2-トリフルオロエタノール（ＴＦＥ）を用いても同様の結果を得た。
【００３８】
また、ブタ皮膚酸処理ゼラチン（ニッピ社製）、または実施例１にて合成した遺伝子組み換えゼラチンまたはフィブロジェン社製遺伝子組み換えゼラチン（100 KDa）、および2％グルタルアルデヒド（GA）を含む水溶液（ゼラチン濃度：20％）を30℃でシリンジから射出し、一晩静置することで、架橋ゼラチンによる糸を作製した。いずれのゼラチンを用いた場合も架橋ゼラチンによる縫合糸を作製できた。
【００３９】
上記作製した糸のうち、ＨＦＩＰより作製した糸は水より作製した糸に比べて強度を有した。
【００４０】
実施例３：キトサンーゼラチン縫合糸の作製
ブタ皮膚酸処理ゼラチン（20％）、キトサン（1％、和光純薬製）、およびグルタルアルデヒド（2％）を含むHFIP−水混合溶液（HFIP/水＝11.5）を４℃でシリンジから射出し、糸を成形した後、40℃で15時間静置した。該糸を5Mグリシン水溶液に浸漬し、40℃で15時間静置した。該糸を水にて洗浄したのち、HFIPを除去し（温度：50℃、湿度：95％、時間：3日）、架橋ゼラチンーキトサン混合糸を得た。
【００４１】
実施例４：分解時のpH
糸の分解時の内部のpH変化を調べるため、別に上記と同様の組成のゼラチン構造物（5 mm四方）を作製した。比較例としてポリ乳酸をテトラヒドロフランにて溶解、キャストすることで構造物を作製した（5 mm四方）。ゼラチン構造物をコラゲナーゼにて構造物の半分が分解したところで、構造物を取り出し、切開し、pH試験紙によりpHを測定した。
【００４２】
一方、ポリ乳酸を高温（80℃）、高湿（湿度：100％）で静置し、構造物の半分が分解したところで構造物を取り出し、切開し、pH試験紙によりpHを測定した。
【００４３】
いずれのゼラチンを用いた場合も、ゼラチン構造物のpHは約5-7であったのに対し、ポリ乳酸内部のpHは約2であった。ポリ乳酸やポリグリコール酸により作製した糸は体内で分解される際に組織の局所で大きなpH変化を引き起こしているのに対し、ゼラチンにより作製した糸は生体内で分解する際のpH変化を低減することができたと言える。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリペプチドを用いた生体内分解性縫合糸に関する。
【背景技術】
【０００２】
手術時の組織の縫合には、ナイロン等の非分解性の縫合糸やポリ乳酸やポリグリコール酸等の生体内分解性縫合糸が用いられている。前者は種々の性質の縫合糸が上市されており、満足度の高い製品となっている。一方、後者の生体内分解性縫合糸は用いられる素材も非常に限られており、必ずしも臨床で要求される性質を完全に満たしているとは言えない。これらの縫合糸に要求される性質として、（１）素材自身が生体内で毒性を有さないこと、（２）分解物が安全であること、（３）適度な平滑性を有すること、（４）結節強力であることが挙げられる。
【０００３】
現在上市されている生体内分解性縫合糸としてはポリ乳酸やポリグリコール酸といった分解部位がエステル結合である合成高分子が用いられている（特許文献１）。該ポリマーは生体内分解性のポリマーであり、非常に生体適合性が高いことが知られている。しかしながら、分解時に酸が発生するため、組織の局所部位でのpHが大きく低下し、損傷部位の修復を遅らせる恐れがある。
【０００４】
また、上記のような合成高分子は疎水性が高く、水分の割合の高い組織に適用する際には、生体と縫合糸との水分割合が大きく異なるため、生体とのなじみに問題がある。
【特許文献１】特開昭６３−２６４９１３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、従来技術では困難であった生体内で分解する際のpH変化の少なく、平滑性を有する生体内分解性縫合糸を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、ポリペプチドを素材として用いて縫合糸を作製することにより、分解時にpHが大幅に低下せず、かつ平滑性を有する生体内分解性縫合糸を作製できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
即ち、本発明によれば、ポリペプチドから作製されることを特徴とする、生体内分解性縫合糸が提供される
好ましくは、ポリペプチドは、生体由来のタンパク質、又は遺伝子組み換えタンパク質である。
好ましくは、ポリペプチドは、遺伝子組み換えゼラチンである。
【０００８】
好ましくは、本発明の生体内分解性縫合糸は、さらに多糖を構成成分として含む。
好ましくは、多糖はグリコサミノグリカン、キチン、又はキトサンである。
【０００９】
好ましくは、ポリペプチドは架橋されている。
好ましくは、該架橋は光、熱、縮合剤、又は酵素による架橋である。
好ましくは、該架橋はグルタルアルデヒドによる架橋である。
【００１０】
好ましくは、糸は、膨潤状態、又は乾燥状態である。
好ましくは、本発明の生体内分解性縫合糸は、ポリペプチドと溶媒を含む溶液を射出して糸を成形することにより作製される。
好ましくは、溶媒は、水または有機フッ素化合物である。
好ましくは、溶媒は有機フッ素化合物である。
好ましくは、溶媒は1，1，1，3，3，3‐ヘキサフルオロ-2プロパノール、2,2,2-トリフルオロエタノールである。
【００１１】
好ましくは、糸の半分が分解した際の糸内部のpHは５以上８以下である。
好ましくは、糸の全てを加水分解した際のカルボン酸基は20 mol%以下である。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、（１）素材自身が毒性を示さず、（２）分解時にpHが大幅に低下せず（分解物が毒性を示さない）、組織の修復を阻害せず、（３）平滑性が高い生体内分解性縫合糸を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本発明で用いるポリペプチドはタンパク質であることが好ましく、中でもゼラチンが最も好ましい。ゼラチンは天然型でも構わないが、縫合糸に必要な各種パラメーターの精密な設計を可能にすることから、遺伝子組み換えゼラチンであることが特に好ましい。
【００１４】
遺伝子組み換えゼラチンとしては、例えば、EP0926543B、EP1014176A,WO2002/052342、EP1063565B、WO2004/085473、US6992172、WO2006/91099、WO2005/011740に記載のものを用いることができるがこれらに限定されるものではない。また、該生体高分子は部分的に加水分解されていてもよい。該ゼラチンは生体由来のコラーゲンの配列とのアミノ酸同一性が40％であればよく、より好ましくは50％以上である。より好ましくは80％以上、最も好ましくは90％以上である。ここで言うコラーゲンとは天然に存在するものであればいずれであっても構わないが、好ましくはI型、II型、III型、IV型、およびV型である。より好ましくは、I型、II型、III型である。別の形態によると、該コラーゲンの由来は好ましくは、ヒト、ウシ、ブタ、マウス、ラットである。より好ましくはヒトである。
【００１５】
該遺伝子組み換えゼラチンの等電点は4.8〜10であり、より好ましくは5〜10である。より好ましくは5〜9.5である。
【００１６】
遺伝子組み換えゼラチンがコラーゲンに特徴的なGXY部分を有し、分子量が2 KDa以上100 KDa以下である。より好ましくは2.5 KDa以上95KDa以下である。より好ましくは5 KDa以上90 KDa以上である。最も好ましくは、10 KDa以上90KDa以下である。コラーゲンに特徴的なGXY部分とは、ゼラチン・コラーゲンのアミノ酸組成および配列における、他のタンパク質と比較して非常に特異的な部分構造である。この部分においてはグリシンが全体の約３分の１を占め、アミノ酸配列では３個に１個の繰り返しとなっている。グリシンは最も簡単なアミノ酸であり、分子鎖の配置への束縛も少なく、ゲル化に際してのヘリックス構造の再生に大きく寄与している。X,Yであらわされるアミノ酸はイミノ酸（プロリン、オキシプロリン）が多く含まれ、全体の１０％〜４５％を占める。
【００１７】
好ましくは、該遺伝子組み換えゼラチンは脱アミン化されていない。
好ましくは、該遺伝子組み換えゼラチンはプロコラーゲンおよびプロコラーゲンを有さない。
好ましくは、該遺伝子組み換えゼラチンは天然コラーゲンをコードする核酸により調製された実質的に純粋なコラーゲン様材料である。
【００１８】
遺伝子組み換えゼラチンなどのポリペプチドは、その他の合成高分子との混合物としても利用することができる。好ましくは、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、およびそれらの共重合体、ポリ（ε―カプロラクトン）、ポリ（ヒドロキシアルカノエート）（PHA）、ポリ（ビスーカルボキシフェノキシプロパン）、ビスカルボキシフェノキシプロパンーセバシン酸共重合体、グリセロール、ポリエチレングリコール、ヒアルロン酸ベンジルエステル、ヒアルロン酸エチルエステル、アセチルセルロースである。
【００１９】
本発明で用いる合成高分子の分子量は特に限定することはないが、実質的には1KDa以上10MDa以下である。好ましくは5 KDa以上500 KDa以下である。最も好ましくは10 KDa以上100 KDa以下である。さらに、該合成高分子は架橋および化学修飾が施されていても構わない。
【００２０】
本発明では、生体内分解性縫合糸を作製するための素材として、遺伝子組み換えゼラチンなどのポリペプチドと一緒に多糖を用いることができる。本発明で用いることができる多糖の種類は、本発明を実施可能である限りは特に限定はないが、好ましくはグリコサミノグリカン、κカラギナン、キチン、キトサンである。多糖の使用量は特に限定されないが、ポリペプチドの使用量に対して一般的には0.１％から５０％、好ましくは１％から２０％程度である。特に、κカラギナンを混合すると、ゲルの強度が向上することがある。
【００２１】
本発明におけるポリペプチドは架橋されていてもよい。架橋は光、熱、架橋剤（化学化架橋剤（縮合剤）、又は酵素など）によって行うことができる。本発明で用いる架橋剤は本発明を実施可能である限りは特に限定はなく、化学架橋剤でも酵素でもよい。化学架橋剤としては、例えば、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、カルボジイミド、シアナミドなどが挙げられる。好ましくは、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒドである。
【００２２】
酵素による架橋を行う場合、酵素としては、ポリペプチドの架橋作用を有するものであれば特に限定されないが、好ましくはトランスグルタミナーゼおよびラッカーゼ、最も好ましくはトランスグルタミナーゼを用いて架橋を行うことができる。トランスグルタミナーゼで酵素架橋するタンパク質の具体例としては、リジン残基およびグルタミン残基を有するタンパク質であれば特に制限されない。トランスグルタミナーゼは、哺乳類由来のものであっても、微生物由来のものであってもよく、具体的には、味の素（株）製アクティバシリーズ、試薬として発売されている哺乳類由来のトランスグルタミナーゼ、例えば、オリエンタル酵母工業（株）製、Upstate USA Inc.製、Biodesign International製などのモルモット肝臓由来トランスグルタミナーゼ、ヤギ由来トランスグルタミナーゼ、ウサギ由来トランスグルタミナーゼなど、ヒト由来の血液凝固因子（Factor XIIIa、 Haematologic Technologies， Inc.社）などが挙げられる。
【００２３】
生体高分子の架橋には生体高分子の溶液と架橋剤を混合する過程とそれらの均一溶液の反応する過程の２つの過程を有する。
【００２４】
本発明においてポリペプチドを架橋剤で処理する際の混合温度は、溶液を均一に攪拌できる限り特に限定されないが、好ましくは０℃〜４０℃であり、より好ましくは０℃〜３０℃であり、より好ましくは３℃〜２５℃であり、より好ましくは３℃〜１５℃であり、さらに好ましくは３℃〜１０℃であり、特に好ましくは３℃〜７℃である。
【００２５】
ポリペプチドと架橋剤を攪拌した後は温度を上昇させることができる。反応温度としては架橋が進行する限りは特に限定はないが、ポリペプチドの変性や分解を考慮すると実質的には０℃〜６０℃であり、より好ましくは０℃〜４０℃であり、より好ましくは３℃〜２５℃であり、より好ましくは３℃から１５℃であり、さらに好ましくは３℃〜１０℃であり、特に好ましくは３℃〜７℃である。
【００２６】
軟骨等の生体組織は稼動により磨耗されうる場所であるが、実際は非常に摩擦係数が小さいことが知られている。それは生体組織がゲル状態であることであるといわれている。ゲルは摩擦を受けた際に、表面付近で構造変化が起こり、低摩擦となっている。従って、本発明で作製される糸はゲルとして組織との低摩擦の糸を提供することも可能である。
【００２７】
得られる糸の使用の際は、乾燥、湿潤のいずれの場合でも構わないが、使用時の組織との摩擦が最低限にしたいときは、湿潤状態で用いることが望ましい。
【００２８】
本発明の生体内分解性縫合糸は、例えば、ポリペプチドと溶媒を含む溶液を射出して糸を成形することにより作製することができる。本発明の縫合糸を作製する際に使用する溶媒は、水または有機フッ素化合物であることが好ましく、有機フッ素化合物であることがさらに好ましい。溶媒は、より好ましくは炭素数１から８の有機フッ素化合物であり、さらに好ましくは炭素数１から６の有機フッ素化合物であり、さらに好ましくは炭素数１から３の有機フッ素化合物である。溶媒は、特に好ましくは、１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノール、2,2,2-トリフルオロエタノール、ヘキサフルオロアセトン、トリフルオロ酢酸、またはペンタフルオロプロピオン酸である。
【００２９】
本発明の目的を達成するために、好ましくは本発明の縫合糸の半分が分解した際の糸内部のｐＨが５以上８以下であることが好ましい。また、縫合糸すべてを加水分解した際のカルボン酸基が20 mol%以下であることが好ましい。
【００３０】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００３１】
実施例１： 遺伝子組み換えゼラチンの合成
コラーゲンに特徴的なGXY配列を有する遺伝子組み換えゼラチンを先行例に従って合成した（EP-A-0926453、EP-A-1014176、WO01/34646、WO2006/091099）。配列の一例を示すがこれらに限定されるものではない。
【００３２】
名称：HU（配列番号１）
GPPGEPGPTGLPGPPGERGGPGSRGFPGADGVAGPKGPAGERGSPGPAGPKGSPGEAGRPGEAGLPGAKGLTGSPGSPGPDGKTGPPGPAGQDGRPGPPGPPGARGQAGVMGFPGPKGAAGEPGKAGERGVPGPPGAVGPAGKDGEAGAQGPPGPAGPAGERGEQGPAGSPGFQGLPGPAGPPGEAGKPGEQGVPGDLGAPGPSGPA
【００３３】
名称：HU3（配列番号２）
GPPGEPGPTGLPGPPGERGGPGSRGFPGADGVAGPKGPAGERGSPGPAGPKGSPGEAGRPGEAGLPGAKGLTGSPGSPGPDGKTGPPGPAGQDGRPGPPGPPGARGQAGVMGFPGPKGAAGEPGKAGERGVPGPPGAVGPAGKDGEAGAQGPPGPAGPAGERGEQGPAGSPGFQGLPGPAGPPGEAGKPGEQGVPGDLGAPGPSGPAGEPGPTGLPGPPGERGGPGSRGFPGADGVAGPKGPAGERGSPGPAGPKGSPGEAGRPGEAGLPGAKGLTGSPGSPGPDGKTGPPGPAGQDGRPGPPGPPGARGQAGVMGFPGPKGAAGEPGKAGERGVPGPPGAVGPAGKDGEAGAQGPPGPAGPAGERGEQGPAGSPGFQGLPGPAGPPGEAGKPGEQGVPGDLGAPGPSGPAGEPGPTGLPGPPGERGGPGSRGFPGADGVAGPKGPAGERGSPGPAGPKGSPGEAGRPGEAGLPGAKGLTGSPGSPGPDGKTGPPGPAGQDGRPGPPGPPGARGQAGVMGFPGPKGAAGEPGKAGERGVPGPPGAVGPAGKDGEAGAQGPPGPAGPAGERGEQGPAGSPGFQGLPGPAGPPGEAGKPGEQGVPGDLGAPGPSGPAG
【００３４】
名称：HU4（配列番号３）
GPPGEPGPTGLPGPPGERGGPGSRGFPGADGVAGPKGPAGERGSPGPAGPKGSPGEAGRPGEAGLPGAKGLTGSPGSPGPDGKTGPPGPAGQDGRPGPPGPPGARGQAGVMGFPGPKGAAGEPGKAGERGVPGPPGAVGPAGKDGEAGAQGPPGPAGPAGERGEQGPAGSPGFQGLPGPAGPPGEAGKPGEQGVPGDLGAPGPSGPAGEPGPTGLPGPPGERGGPGSRGFPGADGVAGPKGPAGERGSPGPAGPKGSPGEAGRPGEAGLPGAKGLTGSPGSPGPDGKTGPPGPAGQDGRPGPPGPPGARGQAGVMGFPGPKGAAGEPGKAGERGVPGPPGAVGPAGKDGEAGAQGPPGPAGPAGERGEQGPAGSPGFQGLPGPAGPPGEAGKPGEQGVPGDLGAPGPSGPAGEPGPTGLPGPPGERGGPGSRGFPGADGVAGPKGPAGERGSPGPAGPKGSPGEAGRPGEAGLPGAKGLTGSPGSPGPDGKTGPPGPAGQDGRPGPPGPPGARGQAGVMGFPGPKGAAGEPGKAGERGVPGPPGAVGPAGKDGEAGAQGPPGPAGPAGERGEQGPAGSPGFQGLPGPAGPPGEAGKPGEQGVPGDLGAPGPSGPAGEPGPTGLPGPPGERGGPGSRGFPGADGVAGPKGPAGERGSPGPAGPKGSPGEAGRPGEAGLPGAKGLTGSPGSPGPDGKTGPPGPAGQDGRPGPPGPPGARGQAGVMGFPGPKGAAGEPGKAGERGVPGPPGAVGPAGKDGEAGAQGPPGPAGPAGERGEQGPAGSPGFQGLPGPAGPPGEAGKPGEQGVPGDLGAPGPSGPAGG
【００３５】
名称：Ｐ（配列番号４）
GPPGEPGNPGSPGNQGQPGNKGSPGNPGQPGNEGQPGQPGQNGQPGEPGSNGPQGSQGNPGKNGQPGSPGSQGSPGNQGSPGQPGNPGQPGEQGKPGNQGPAGG
【００３６】
名称：Ｐ４（配列番号５）
GPPGEPGNPGSPGNQGQPGNKGSPGNPGQPGNEGQPGQPGQNGQPGEPGSNGPQGSQGNPGKNGQPGSPGSQGSPGNQGSPGQPGNPGQPGEQGKPGNQGPAGEPGNPGSPGNQGQPGNKGSPGNPGQPGNEGQPGQPGQNGQPGEPGSNGPQGSQGNPGKNGQPGSPGSQGSPGNQGSPGQPGNPGQPGEQGKPGNQGPAGEPGNPGSPGNQGQPGNKGSPGNPGQPGNEGQPGQPGQNGQPGEPGSNGPQGSQGNPGKNGQPGSPGSQGSPGNQGSPGQPGNPGQPGEQGKPGNQGPAGEPGNPGSPGNQGQPGNKGSPGNPGQPGNEGQPGQPGQNGQPGEPGSNGPQGSQGNPGKNGQPGSPGSQGSPGNQGSPGQPGNPGQPGEQGKPGNQGPAGG
【００３７】
実施例２：ゼラチン縫合糸の作製
ブタ皮膚酸処理ゼラチン（ニッピ社製）、または実施例１にて合成した遺伝子組み換えゼラチンまたはフィブロジェン社製遺伝子組み換えゼラチン（100 KDa）、および2％グルタルアルデヒド（GA）を含む1,1,1,3,3,3−ヘキサフルオロ−２−プロパノール（HFIP）-水混合溶液（ゼラチン濃度：20％、HFIP/水＝11.5）を４℃でシリンジから射出し、糸を成形した後、40℃で15時間静置した。該糸を5Mグリシン水溶液に浸漬し、40℃で15時間静置した。該糸を水にて洗浄したのち、HFIPを除去し（温度：50℃、湿度：95％、時間：3日）、架橋ゼラチンによる糸を作製した。いずれのゼラチンを用いた場合も架橋ゼラチンによる縫合糸を作製できた。また、ＨＦＩＰの代わりに2,2,2-トリフルオロエタノール（ＴＦＥ）を用いても同様の結果を得た。
【００３８】
また、ブタ皮膚酸処理ゼラチン（ニッピ社製）、または実施例１にて合成した遺伝子組み換えゼラチンまたはフィブロジェン社製遺伝子組み換えゼラチン（100 KDa）、および2％グルタルアルデヒド（GA）を含む水溶液（ゼラチン濃度：20％）を30℃でシリンジから射出し、一晩静置することで、架橋ゼラチンによる糸を作製した。いずれのゼラチンを用いた場合も架橋ゼラチンによる縫合糸を作製できた。
【００３９】
上記作製した糸のうち、ＨＦＩＰより作製した糸は水より作製した糸に比べて強度を有した。
【００４０】
実施例３：キトサンーゼラチン縫合糸の作製
ブタ皮膚酸処理ゼラチン（20％）、キトサン（1％、和光純薬製）、およびグルタルアルデヒド（2％）を含むHFIP−水混合溶液（HFIP/水＝11.5）を４℃でシリンジから射出し、糸を成形した後、40℃で15時間静置した。該糸を5Mグリシン水溶液に浸漬し、40℃で15時間静置した。該糸を水にて洗浄したのち、HFIPを除去し（温度：50℃、湿度：95％、時間：3日）、架橋ゼラチンーキトサン混合糸を得た。
【００４１】
実施例４：分解時のpH
糸の分解時の内部のpH変化を調べるため、別に上記と同様の組成のゼラチン構造物（5 mm四方）を作製した。比較例としてポリ乳酸をテトラヒドロフランにて溶解、キャストすることで構造物を作製した（5 mm四方）。ゼラチン構造物をコラゲナーゼにて構造物の半分が分解したところで、構造物を取り出し、切開し、pH試験紙によりpHを測定した。
【００４２】
一方、ポリ乳酸を高温（80℃）、高湿（湿度：100％）で静置し、構造物の半分が分解したところで構造物を取り出し、切開し、pH試験紙によりpHを測定した。
【００４３】
いずれのゼラチンを用いた場合も、ゼラチン構造物のpHは約5-7であったのに対し、ポリ乳酸内部のpHは約2であった。ポリ乳酸やポリグリコール酸により作製した糸は体内で分解される際に組織の局所で大きなpH変化を引き起こしているのに対し、ゼラチンにより作製した糸は生体内で分解する際のpH変化を低減することができたと言える。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリペプチドから作製されることを特徴とする、生体内分解性縫合糸。
【請求項２】
ポリペプチドが、生体由来のタンパク質、又は遺伝子組み換えタンパク質である、請求項１に記載の生体内分解性縫合糸。
【請求項３】
ポリペプチドが、遺伝子組み換えゼラチンである、請求項１又は２に記載の生体内分解性縫合糸。
【請求項４】
さらに多糖を構成成分として含む、請求項１から３の何れかに記載の生体内分解性縫合糸。
【請求項５】
多糖がグリコサミノグリカン、κカラギナン、キチン、又はキトサンである、請求項４に記載の生体内分解性縫合糸。
【請求項６】
ポリペプチドが架橋されている、請求項１から５の何れかに記載の生体内分解性縫合糸。
【請求項７】
該架橋が光、熱、縮合剤、又は酵素による架橋である、請求項６に記載の生体内分解性縫合糸。
【請求項８】
該架橋がグルタルアルデヒドによる架橋である、請求項６又は７に記載の生体内分解性縫合糸。
【請求項９】
該糸が、膨潤状態、又は乾燥状態である、請求項１から８の何れかに記載の生体内分解性縫合糸。
【請求項１０】
ポリペプチドと溶媒を含む溶液を射出して糸を成形することにより作製される、請求項１から９の何れかに記載の生体内分解性縫合糸。
【請求項１１】
該溶媒が、水または有機フッ素化合物である、請求項１０に記載の生体内分解性縫合糸。
【請求項１２】
該溶媒が有機フッ素化合物である、請求項１０に記載の生体内分解性縫合糸。
【請求項１３】
該溶媒が1，1，1，3，3，3‐ヘキサフルオロ-2プロパノール、2,2,2-トリフルオロエタノールである、請求項１０に記載の生体内分解性縫合糸。
【請求項１４】
糸の半分が分解した際の糸内部のpHが５以上８以下である、請求項１から１３の何れかに記載の生体内分解性縫合糸。
【請求項１】
ポリペプチドから作製されることを特徴とする、生体内分解性縫合糸。
【請求項２】
ポリペプチドが、生体由来のタンパク質、又は遺伝子組み換えタンパク質である、請求項１に記載の生体内分解性縫合糸。
【請求項３】
ポリペプチドが、遺伝子組み換えゼラチンである、請求項１又は２に記載の生体内分解性縫合糸。
【請求項４】
さらに多糖を構成成分として含む、請求項１から３の何れかに記載の生体内分解性縫合糸。
【請求項５】
多糖がグリコサミノグリカン、κカラギナン、キチン、又はキトサンである、請求項４に記載の生体内分解性縫合糸。
【請求項６】
ポリペプチドが架橋されている、請求項１から５の何れかに記載の生体内分解性縫合糸。
【請求項７】
該架橋が光、熱、縮合剤、又は酵素による架橋である、請求項６に記載の生体内分解性縫合糸。
【請求項８】
該架橋がグルタルアルデヒドによる架橋である、請求項６又は７に記載の生体内分解性縫合糸。
【請求項９】
該糸が、膨潤状態、又は乾燥状態である、請求項１から８の何れかに記載の生体内分解性縫合糸。
【請求項１０】
ポリペプチドと溶媒を含む溶液を射出して糸を成形することにより作製される、請求項１から９の何れかに記載の生体内分解性縫合糸。
【請求項１１】
該溶媒が、水または有機フッ素化合物である、請求項１０に記載の生体内分解性縫合糸。
【請求項１２】
該溶媒が有機フッ素化合物である、請求項１０に記載の生体内分解性縫合糸。
【請求項１３】
該溶媒が1，1，1，3，3，3‐ヘキサフルオロ-2プロパノール、2,2,2-トリフルオロエタノールである、請求項１０に記載の生体内分解性縫合糸。
【請求項１４】
糸の半分が分解した際の糸内部のpHが５以上８以下である、請求項１から１３の何れかに記載の生体内分解性縫合糸。
【公開番号】特開２００８−２６４１４７（Ｐ２００８−２６４１４７Ａ）
【公開日】平成２０年１１月６日（２００８．１１．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−１１００４０（Ｐ２００７−１１００４０）
【出願日】平成１９年４月１９日（２００７．４．１９）
【出願人】（３０６０３７３１１）富士フイルム株式会社 (25,513)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１１月６日（２００８．１１．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年４月１９日（２００７．４．１９）
【出願人】（３０６０３７３１１）富士フイルム株式会社 (25,513)
【Ｆターム（参考）】
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