生体分子の金属担体への固定法
核酸の溶液を、周期律表第２周期〜第７周期のＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ族および遷移元素から選ばれる金属、又は同金属を含む合金等からなる金属担体上にスポットし、同溶液を乾燥させ、担体に波長２８０ｎｍの成分を含む紫外線を好ましくは１００ｍＪ／ｃｍ２以上照射することにより、前記担体に核酸を固定する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
本発明は、核酸等の生体分子を担体に固定化する方法に関する。本発明の方法は、ハイブリダイゼーションによる核酸の分析等の操作に有用である。
【背景技術】
従来、ハイブリダイゼーションによる核酸の分析や、イムノアッセイ等においては、核酸やタンパク質を膜や平板などの担体に固定化する技術が利用されている。このような生体分子の固定化法として、核酸では、以下のものが知られている。
（１）５’末端にチオール基を有する核酸とチオール基を含むビーズ状基材間のジスルフィド結合による固定（Ｐ．Ｊ．Ｒ．Ｄａｙ，Ｐ．Ｓ．Ｆｌｏｒａ，Ｊ．Ｅ．Ｆｏｘ，Ｍ．Ｒ．Ｗａｌｋｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２７８，７３５−７４０（１９９１））等のような、修飾基を導入した核酸を化学結合させる方法。
（２）核酸を、紫外線（ＵＶ）照射又は加熱処理により、ニトロセルロース、ナイロンメンブレン、又はポリ−Ｌ−リジン等のカチオンポリマーで被覆されたガラス等の担体等に、吸着固定させる方法（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐａｇｅｓ ２．１０９−２．１１３ ａｎｄ ｐａｇｅｓ ９．３４−９．４６、特表平１０−５０３８４１号公報）。
（３）ポリリジン溶液で処理されたマイクロプレートのウェル中に核酸を注入し、３７℃に加熱することにより、物理吸着させることにより固定する方法（Ｇ．Ｃ．Ｎ．Ｐａｒｒｙ ａｎｄ Ａ．Ｄ．Ｂ．Ｍａｌｃｏｍ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．，１７，２３０−２３１（１９８９））。
（４）基材上に結合させたヌクレオチドを用い、基材上でＤＮＡを合成する方法（国際公開第９７／１０３６５号パンフレット（ＷＯ９７／１０３６５））。
（５）カルボジイミド基を有する高分子化合物を担持させたガラス等の基材に核酸を固定する方法（特開平８−２３９７５号公報）。
しかし、上記の（１）の方法は、極めて特殊な機械と試薬を必要とする。また、（２）及び（３）の方法においては、ハイブリダイゼーションを行った場合、特に操作過程で担体から核酸が剥がれ落ち、結果として検出感度が下がったり、再現性が得られない等の欠点がある。また、この方法では、長い核酸は固定できるが、オリゴマー等約５０ｍｅｒ以下の短い核酸になると、効率よく固定化できないという欠点がある。尚、これらの方法では、ＵＶ照射量は数十ｍＪ／ｃｍ２程度である。さらに、（４）の方法は、基材上でＤＮＡを合成するために、極めて特殊な機械と試薬を必要とし、さらに、合成できる核酸も２５ｍｅｒ程度までに限られるという欠点がある。また、（５）の方法は、基材の材料が限られ、表面のコーティング工程が必要である。
【発明の開示】
本発明は、上記従来技術の状況に鑑み、生体分子、例えば核酸、特に短鎖長の核酸を担体に、簡便、かつ、効率よく固定する方法を提供することを課題とする。
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、核酸溶液を金属製の担体上にスポットした後に、紫外線を担体に照射することによって、核酸を担体に効率よく固定化することができることを見い出し、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、以下のとおりである。
（１）生体分子を担体に固定化する方法であって、生体分子の溶液を担体上にスポットする工程と、前記生体分子溶液をスポットした担体に波長２８０ｎｍの成分を含む紫外線を照射する工程を含み、前記担体は金属製であることを特徴とする方法。
（２）前記紫外線が、波長２２０〜３００ｎｍの成分を含むことを特徴とする（１）に記載の方法。
（３）前記金属は、周期律表第２周期〜第７周期のＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ族および遷移元素から選ばれる金属、又は同金属を含む合金である（１）又は（２）に記載の方法。
（４）前記紫外線の照射量は１００ｍＪ／ｃｍ２以上である（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５）前記生体分子は核酸、タンパク質、糖、抗原、抗体、ペプチド、酵素から選ばれる（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（６）生体分子が担体上に固定化された生体分子固定化担体の製造法であって、生体分子の溶液を担体上にスポットする工程と、前記生体分子溶液をスポットした担体に波長２８０ｎｍの成分を含む紫外線を照射し、前記生体分子を担体に固定化する工程を含む方法。
（７）前記紫外線が、波長２２０〜３００ｎｍの成分を含むことを特徴とする（６）に記載の方法。
（８）前記生体分子は核酸であって、核酸固定化担体はハイブリダイゼーションによる核酸の分析に用いられるものである（６）又は（７）に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
図１は、実施例で作製したオリゴヌクレオチド固定化平板を用いたハイブリダイゼーションの結果を示す図（写真）。
点線は、実施例１及び比較例１でオリゴヌクレオチドを固定化した領域、及びコントロールである１×ＴＥ緩衝液をスポットした領域を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に用いる担体は、生体分子を固定化するためのものであり、金属製であることを特徴とする。金属としては、紫外線照射により生体分子を固定化することができるものであれば特に制限されず、好ましくは、周期律表第２周期〜第７周期のＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ族および遷移元素から選ばれる金属、又は同金属を含む合金が挙げられる。
上記周期律表第２周期〜第７周期のＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ族および遷移元素から選ばれる金属として特に好ましいものとしては、アルミニウム、チタン、白金、タングステン、モリブデン、金、銅、ニッケル等が挙げられる。
また、上記合金として具体的には、洋白（成分：Ｃｕ，Ｎｉ，Ｚｎ）、真鍮（成分：Ｃｕ，Ｚｎ）、ブロンズ（成分：Ｃｕ，Ｂｅ）、モネル（成分：Ｃｕ，Ｎｉ，Ｆｅ，Ｍｎ）、ニッケルコバルト合金（成分：Ｎｉ，Ｃｏ）、ニッケルクロム合金（成分：Ｎｉ，Ｃｒ）、コバルト合金（成分：Ｃｏ，Ｎｉ，Ｃｒ）、ステンレス（成分：Ｎｉ，Ｃｒ，Ｆｅ）、銀タングステン（成分：Ａｇ，Ｗ）、βチタン（成分：Ｔｉ，Ｖ，Ａｌ）、αβチタン（成分：Ｔｉ，Ｖ，Ａｌ）、ＮＴ合金（成分：Ｔｉ，Ｎｉ）、アルミニウム合金（成分：Ａｌ，Ｃｕ，Ｍｇ，Ｓｉ，Ｍｎ，Ｚｎ）、ジュラルミン（成分：Ａｌ，Ｃｕ，Ｓｉ，Ｆｅ，Ｍｎ，Ｍｇ，Ｚｎ）、マグネシウム合金（成分：Ｍｇ，Ａｌ，Ｚｎ）、Ｋ２４（成分：Ａｕ）、Ｋ１８（成分：Ａｕ，Ａｇ，Ｃｕ）、ベリリウム銅（成分：Ｃｕ，Ｂｅ）、鋳鉄（成分：Ｆｅ，Ｍｎ，Ｓ，Ｃ）、炭素鋼（成分：Ｆｅ，Ｃ，Ｓｉ，Ｍｎ，Ｐ，Ｓ）、青銅鋳物（成分：Ｃｕ，Ｓｎ，Ｚｎ，Ｐｂ）、りん青銅鋳物（成分：Ｃｕ，Ｚｎ，Ｐ）、黄銅鋳物（成分：Ｃｕ，Ｚｎ，Ｐｂ）、マンガン黄銅（成分：Ｃｕ，Ｚｎ，Ｍｎ，Ｆｅ，Ａｌ）、シルジン青銅鋳物（成分：Ｃｕ，Ｓｉ，Ｚｎ）、アルミニウム青銅鋳物（成分：Ｃｕ，Ａｌ，Ｆｅ，Ｎｉ，Ｍｎ）、エリンバー（成分：Ｎｉ，Ｃｒ，Ｍｎ）、エリンバーエクストラ（成分：Ｎｉ，Ｃｒ，Ｃｏ，Ｍｎ）、インバー（成分：Ｎｉ，Ｆｅ）、スーパーインバー（成分：Ｆｅ，Ｎｉ，Ｃｏ）、ステンレスインバー（成分：Ｆｅ，Ｃｏ，Ｃｒ）、Ｍａｌｏｔｔｅｓ（成分：Ｓｎ，Ｂｉ，Ｐｂ）、リポウィッツ（Ｌｉｐｏｗｉｔｚ）（成分：Ｓｎ，Ｂｉ，Ｐｂ，Ｃｄ）、ウッズ（Ｗｏｏｄ’ｓ）（成分：Ｓｎ，Ｂｉ，Ｐｂ，Ｃｄ）、マンガニン（成分：Ｃｕ，Ｍｎ，Ｎｉ，Ｆｅ）、イザベリン（成分：Ｃｕ，Ｍｎ，Ａｌ）、コンスタンタン（成分：Ｃｕ，Ｎｉ）、アルクレス（成分：Ｆｅ，Ｃｒ，Ａｌ）、カンタル（成分：Ｃｒ，Ｆｅ，Ａｌ，Ｃｏ）、アルメル（成分：Ｎｉ，Ａｌ）、磁性材料（Ｆｅ，Ｎｉ，Ｃｏ等強磁性遷移元素を含む材料）、パーマロイ（成分：Ｆｅ，Ｎｉ）、アルパーム（成分：Ｆｅ，Ａｌ）、フェライト（Ｆｅ２Ｏ３を主成分とする複合酸化物）、センダスト（成分：Ｆｅ，Ｓｉ，Ａｌ）、スーパーセンダスト（成分：Ｆｅ，Ｓｉ，Ａｌ，Ｎｉ，）、アルニコ（成分：Ｆｅ，Ａｌ，Ｎｉ，Ｃｏ）、水素吸蔵金属（ランタンニッケル合金（成分：Ｌａ，Ｎｉ）等）、Ｃｏ−Ｃｒ系合金、ＳｎＯ２系酸化物、Ｎｂ−Ｔｉ合金、制振合金（振動を低減もしくは吸収、振動の伝播を遮断する合金材料、Ａｌ−Ｚｎ超塑性合金、サイレントアロイ、ニチノール等）、電極用材料、半導体材料（シリコン、ゲルマニウム、カリウムヒ素等）等が挙げられる。
また、上記金属は、他の金属で蒸着又はメッキ処理（加工）されていても良い。更に、前記金属は、形状を保持するために異なる種類の前記金属が積層してもよく、単一金属であっても良い。
本発明における担体は、本質的に上記金属からなる。担体は、金属のみから構成されていてもよいし、非金属材料上に金属が接着、蒸着又はメッキ等により積層されていてもよい。
上記担体の形状は、特に問われないが、箔（フォイル）状、平板（プレート）状、薄片（ウェーハ）状、フィルター状、ビーズ状等が挙げられる。また、マイクロタイタープレートのような形状であっても良い。さらに、得られる結果の保存を容易にするため、平板等の裏面をシール等に使用できる材料（接着剤等）を塗布、コート等をすることによって、シールとしても使用することもできる。
上記担体の所定の位置に、生体分子の溶液をスポットする。生体分子としては、核酸、タンパク質、糖、抗原、抗体、ペプチド、酵素などが挙げられる。以下、生体分子として核酸を例として説明するが、固定の際に紫外線を照射する以外は、他の物質でも通常固定化に用いられている方法や条件を採用することができる。
核酸としては、通常の固相化核酸を用いた核酸同士のハイブリダイゼーションに用いられる固相化核酸と特に変わるところはなく、ハイブリダイゼーションが可能な核酸であれば特に制限されず、例えば、天然又は合成のＤＮＡ（オリゴヌクレオチドを含む）もしくはＲＮＡ（オリゴヌクレオチドを含む）が挙げられる。また、上記核酸は１本鎖であっても、２本鎖であっても構わない。核酸の鎖長は、ハイブリダイゼーションが可能な長さであれば特に制限されないが、通常５〜５００００塩基、好ましくは２０〜１００００塩基である。また、核酸の５’末端あるいは３’末端にチミジン等、紫外線によって反応活性基を有するオリゴヌクレオチドの重合体を有しても良い。
核酸を溶解する溶媒も特に制限されず、蒸留水、又は通常核酸溶液の調製に用いられる緩衝液、例えばＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ塩酸，ｐＨ８．０／１ｍＭ ＥＤＴＡ）等のＴｒｉｓ緩衝液、食塩を含む水溶液、カルボン酸塩を含む水溶液（クエン酸ナトリウム、クエン酸アンモニウム、酢酸ナトリウム等）、スルホン酸塩を含む水溶液（ドデシル硫酸ナトリウム、ドデシル硫酸アンモニウム等）、ホスホン酸塩を含む水溶液等（リン酸ナトリウム、リン酸アンモニウム等）等を挙げることができる。また、一般に市販されている溶媒、Ｍｉｃｒｏ Ｓｐｏｔｔｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＴｅｌｅＣＨｅｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．社製）等も挙げることができる。また、核酸溶液の濃度も特に制限されないが、通常１ｍｍｏｌ／ｍｌ〜１ｆｍｏｌ／ｍｌ、好ましくは１００ｐｍｏｌ／ｍｌ〜１００ｆｍｏｌ／ｍｌの濃度である。
核酸溶液を担体上にスポットする方法としては、ピペットで核酸溶液を担体上に滴下する方法、又は市販のスポッタを用いる方法等が挙げられる。スポットの形状及びスポット量としては、核酸溶液をスポットした位置を把握することができる程度であれば、特に制限されないが、形状としては点状又は円状が好ましい。また、好ましいスポット量は１０ｎｌ〜１０ｍｌである。核酸溶液は、担体上に１箇所又は複数箇所にスポットされる。スポットされる核酸溶液は、１種類でも２種類又はそれ以上であってもよい。尚、担体に核酸が固定されたことを示す陽性コントロールとして、標識した核酸を固定化しておいてもよい。
本発明の好ましい形態においては、核酸溶液を担体上にスポットした後に、２８０ｎｍの波長を含む紫外線を照射する。前記紫外線としては、波長２２０〜３００ｎｍの成分を含む紫外線が挙げられる。また、前記核酸溶液をスポット後紫外線照射前に乾燥させることができる。前記核酸溶液の乾燥方法としては、自然に乾燥させてもよく、加熱して乾燥させてもよい。加熱する場合の温度は、通常３０〜１００℃、好ましくは３５〜４５℃である。
次に、担体、少なくとも担体の核酸を固定した部位に、波長２８０ｎｍの成分を含む紫外線を照射する。具体的には、波長２８０ｎｍの単色光でもよいし、波長２８０ｎｍを含むブロードな波形を有する紫外線であっても良い。波長２８０ｎｍを含むブロードな波形を有する紫外線としては、例えば波長２２０〜３００ｎｍの成分を含む紫外線が挙げられる。また、波長２２０〜３００ｎｍの成分を含む紫外線としては、２８０ｎｍ付近に極大値を有する紫外線が挙げられる。照射量は、累積照射量として通常１００ｍＪ／ｃｍ２以上、好ましくは２００ｍＪ／ｃｍ２以上である。
上記のようにして、核酸を担体上に固定化することにより、核酸固定化担体が製造される。本発明の方法により得られる核酸固定化担体は、例えば、ハイブリダイゼーションによる核酸の分析に用いることができる。本発明の方法により担体に固定化された核酸は、通常のハイブリダイゼーションの条件下で担体から脱離しにくいため、紫外線照射を行わない場合に比べて検出感度が良好で、再現性も良い。ハイブリダイゼーション及びその検出は、通常の固相化核酸を用いたハイブリダイゼーションと同様にして行うことができる。
本発明では、核酸を固定化するのに用いる担体として、安価な金属材料を用いることができるので、低コスト化が可能である。また、金属材料は形成が容易なため、様々な形態のＤＮＡマイクロアレイの作製が容易となる。また、長期保存が可能であり、保存安定性に優れている。さらに、本発明の方法は、担体表面のコーティング工程が不要であり、電極等に使用される金属に直接核酸を固定することができる。電極に核酸を固定することにより溶液中の相補的な核酸と固定された核酸とを効率良くハイブリダイゼーションを行うことができる。核酸は負電化をもっている為、正極に引き寄せられるため、正極の付近は核酸濃度が高くなりやすく、ハイブリダイゼーションが効率よく進むと考えられる。
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。
実施例１ 核酸の平板への固定化
常法に従い、オリゴヌクレオチド合成機（Ｐｅｒｋｉｎ−ｅｌｍｅｒ Ａｐｐｌｉｅｄ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、配列番号１、２に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（２１ｍｅｒ）を合成した。また、プローブとして、配列番号３に示す塩基配列を有するＤＮＡ（２６２ｂｐ）を調製した。尚、配列番号１に示すオリゴヌクレオチド及びプローブは、５’末端をビオチン化した。また、配列番号２に示すオリゴヌクレオチドはビオチン化プローブと相補性を持っている。これらのオリゴヌクレオチドを１ｐｍｏｌ／μｌになるように１×ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ塩酸，ｐＨ８／１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶解した。
市販品のアルミニウム箔（三菱アルミニウム株式会社製）の所定の位置に、上記オリゴヌクレオチド溶液それぞれを、３箇所づつスポットした（図１）。スポットの量は０．５μｌづつであり、スポットの大きさは直径約１ｍｍであった。このアルミニウム箔を乾燥機に入れ、３７℃で２０分乾燥した。次にＵｖｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ ２４００（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）を用い、波長２８０ｎｍを含む紫外線を１６ｃｍの距離から２５０ｍＪ／ｃｍ２照射した。照射時間は１００秒であった。その後、前記アルミニウム箔を水中で３０分間振とうして洗浄した後、乾燥させた。
一方、コントロールとして核酸を含まない溶液（１×ＴＥ緩衝液）も同様にアルミニウム箔にスポットし、固定化の操作を行った。
比較例１
予め、アルミニウム箔に、Ｕｖｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ ２４００（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）を用い、波長２８０ｎｍを含むｎｍの紫外線を１６ｃｍの距離から２５０ｍＪ／ｃｍ２照射した。実施例１に記載のオリゴヌクレオチド溶液それぞれを、アルミニウム箔の所定の位置に、３箇所づつスポットした。スポットの量は０．５μｌづつであり、スポットの大きさは直径約１ｍｍであった。照射時間は１００秒であった。このアルミニウム箔を乾燥機に入れ３７℃で２０分乾燥した。その後、前記アルミニウム箔を水中で３０分間振とうして洗浄し、乾燥させた。
一方、コントロールとして核酸を含まない溶液（１×ＴＥ緩衝液）も同様にアルミニウム箔にスポットし、固定化の操作を行った。
実施例２ ハイブリダイゼーション及びその検出
（１）ハイブリダイゼーション
実施例１及び比較例１のオリゴヌクレオチド固定化アルミニウム箔の核酸を固定化した部分に、３ｐｍｏｌビオチン化プローブ（２６２ｂｐ）を含むハイブリダイゼーション溶液（Ａｒｒａｙｉｔ ＵｎｉＨｙｂ（ＴｅｌｅＣＨｅｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．） ６０μｌをのせ、アルミニウム箔を水が浸入しないケース（ハイブリカセット）に入れてそのケースごとウォーターバスに沈め、４５℃で２時間加熱した。
（２）ポストハイブリダイゼーション
上記ハイブリダイゼーションの後、以下の条件でポストハイブリダイゼーション洗浄を行い、オリゴヌクレオチド固定化アルミニウム箔に非特異的に吸着したプローブを除去した。
〔ポストハイブリダイゼーション洗浄の条件〕
１）２×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ；室温、５分間、２回
２）０．２×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ；４０℃、５分間、２回
３）２×ＳＳＣ；室温１分間、３回
（３）アルミニウム箔に固定化されたオリゴヌクレオチド及びハイブリダイゼーションの検出
アルミニウム箔のハイブリダイゼーション溶液を載せた部分に、乳タンパクを含むブロッキング溶液（ブロックエース 雪印乳業製）１．５ｍｌをのせ、室温で３０分間ブロッキングを行った。ブロッキング溶液を除いた後、ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼコンジュゲート溶液（ＶＥＣＴＯＲ社製）を１．５ｍｌのせ、室温で３０分間反応させた。つぎに、アルミニウム箔をＴＢＳＴ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），０．１５Ｍ ＮａＣｌ，０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０）溶液に浸し、５分間振とうして反応しなかったコンジュゲートを除去した。最後に、アルミニウム箔のハイブリダイゼーション溶液を載せた部分に基質溶液（ＴＭＢ）を１．５ｍｌのせて、３０分間放置し、発色反応を行った。
その結果を、表１に示す。表１中の記号の意味は、表２以下でも同様である。配列番号１のオリゴヌクレオチドを固定化した位置のシグナルは固定化されたオリゴヌクレオチドの量を、配列番号２のオリゴヌクレオチドを固定化した位置のシグナルはハイブリダイゼーションの強度を、それぞれ示す。
表１の結果から明らかなように、実施例１のオリゴヌクレオチド固定化アルミニウム箔は、比較例１のオリゴヌクレオチド固定化アルミニウム箔に比べて、オリゴヌクレオチドが確実にアルミニウム箔上に固定化されていることがわかる。また、実施例１のオリゴヌクレオチド固定化アルミニウム箔では、ハイブリダイゼーションシグナルも明瞭に現れた。なお、コントロールの位置（核酸を含まない溶液をスポットした箇所）にはシグナルはまったく現れなかった。
実施例３ 核酸の平板への固定化
常法に従い、オリゴヌクレオチド合成機（Ｐｅｒｋｉｎ−ｅｌｍｅｒ Ａｐｐｌｉｅｄ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、配列番号４、５及び６に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（３１ｍｅｒ）を合成した。尚、配列番号４に示すオリゴヌクレオチドは、５’末端をビオチン化した。また、配列番号４及び５に示すオリゴヌクレオチドは、実施例１に記載の配列番号１及び２に示すオリゴヌクレオチドの５’末端に１０個のチミジンが連結した配列を有している。配列番号５のオリゴヌクレオチドは、前記ビオチン化プローブと相補性を持っており、配列番号６に示すオリゴヌクレオチドは、配列番号５に示すオリゴヌクレオチドと１塩基配列が異なるため相補性を持っていない。これらのオリゴヌクレオチドを１００ｐｍｏｌ／ｍｌになるように５×ＳＳＣに溶解した。
市販品のステンレス製の平板（特殊金属工業株式会社製）の所定の位置に、上記オリゴヌクレオチド溶液それぞれを、スポッター（Ｐｙｘｓｉｓ５５００ ＣＡＲＴＥＳＩＡＮ社製）を用いて３箇所づつスポットした。スポットの大きさは直径約０．３ｍｍであった。この平板を乾燥機に入れ、４２℃で２０分乾燥した。次にＵｖｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ ２４００（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）を用い、波長２８０ｎｍを含む紫外線を１６ｃｍの距離から３００ｍＪ／ｃｍ２照射した。照射時間は１２０秒であった。その後、前記平板を水中で３０分間振とうして洗浄した後、乾燥させた。
一方、コントロールとして核酸を含まない溶液（２ｘＳＳＣ緩衝液）も同様に平板にスポットし、固定化の操作を行った。
比較例２
予め、ステンレス製の平板に、Ｕｖｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ ２４００（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）を用い、波長２８０ｎｍを含む紫外線を１６ｃｍの距離から３００ｍＪ／ｃｍ２照射した。実施例３に記載のオリゴヌクレオチド溶液それぞれを、ステンレス製の平板の所定の位置に、スポッター（Ｐｙｘｓｉｓ５５００ ＣＡＲＴＥＳＩＡＮ社製）を用いて３箇所づつスポットした。照射時間は１２０秒であった。この平板を乾燥機に入れ４２℃で２０分乾燥した。その後、前記平板を水中で３０分間振とうして洗浄し、乾燥させた。
一方、コントロールとして核酸を含まない溶液（２ｘＳＳＣ緩衝液）も同様に平板にスポットし、固定化の操作を行った。
実施例４ ハイブリダイゼーション及びその検出
実施例３及び比較例２のオリゴヌクレオチド固定化平板の核酸を固定化した部分に、３ｐｍｏｌビオチン化プローブ（２６２ｂｐ）を含むハイブリダイゼーション溶液（Ａｒｒａｙｉｔ ＵｎｉＨｙｂ（ＴｅｌｅＣＨｅｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）６０ｍｌをのせ、平板を水が浸入しないケース（ハイブリカセット）に入れてそのケースごとウォーターバスに沈め、４５℃で２時間加熱した。
以下、実施例２と同様にしてポストハイブリダイゼーション、及び平板に固定化されたオリゴヌクレオチドならびにハイブリダイゼーションの検出を行った。その結果を、表２に示す。配列番号４のオリゴヌクレオチドを固定化した位置のシグナルは固定化されたオリゴヌクレオチドの量を、配列番号５のオリゴヌクレオチドを固定化した位置のシグナルはハイブリダイゼーションの強度を、それぞれ示す。
表２の結果から明らかなように、実施例３のオリゴヌクレオチド固定化平板は、比較例２のオリゴヌクレオチド固定化平板に比べて、オリゴヌクレオチドが確実に平板上に固定化されていることがわかる。また、実施例３のオリゴヌクレオチド固定化平板では、ハイブリダイゼーションシグナルも明瞭に現れた。ここで、コントロールの位置（核酸を含まない溶液をスポットした箇所）及び配列番号６にはシグナルはまったく現れなかった。
実施例５ 核酸の平板への固定化
銀タングステン製の平板（イースタン技研株式会社製）の所定の位置に、実施例３で調製したオリゴヌクレオチド溶液それぞれを、スポッターを用いて３箇所づつスポットした。スポットの大きさは直径約０．３ｍｍであった。この平板を乾燥機に入れ、４２℃で２０分乾燥した。次にＵｖｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ ２４００（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）を用い、波長２８０ｎｍを含む紫外線を１６ｃｍの距離から４００ｍＪ／ｃｍ２照射した。照射時間は１６０秒であった。その後、前記平板を水中で３０分間振とうして洗浄した後、乾燥させた。
一方、コントロールとして核酸を含まない溶液（２ｘＳＳＣ緩衝液）も同様に平板にスポットし、固定化の操作を行った。
比較例３
予め、銀タングステン製の平板に、Ｕｖｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ ２４００（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）を用い、波長２８０ｎｍを含む紫外線を１６ｃｍの距離から４００ｍＪ／ｃｍ２照射した。実施例３に記載のオリゴヌクレオチド溶液それぞれを、銀タングステン製の平板の所定の位置に、スポッター（Ｐｙｘｓｉｓ５５００ ＣＡＲＴＥＳＩＡＮ社製）を用いて３箇所づつスポットした。照射時間は１６０秒であった。この平板を乾燥機に入れ４２℃で２０分乾燥した。その後、前記平板を水中で３０分間振とうして洗浄し、乾燥させた。
一方、コントロールとして核酸を含まない溶液（２ｘＳＳＣ緩衝液）も同様に平板にスポットし、固定化の操作を行った。
実施例６ ハイブリダイゼーション及びその検出
実施例５及び比較例３のオリゴヌクレオチド固定化平板の核酸を固定化した部分に、３ｐｍｏｌビオチン化プローブ（２６２ｂｐ）を含むハイブリダイゼーション溶液（Ａｒｒａｙｉｔ ＵｎｉＨｙｂ（ＴｅｌｅＣＨｅｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）６０ｍｌをのせ、平板を水が浸入しないケース（ハイブリカセット）に入れてそのケースごとウォーターバスに沈め、４５℃で２時間加熱した。
以下、実施例２と同様にしてポストハイブリダイゼーション、及び平板に固定化されたオリゴヌクレオチドならびにハイブリダイゼーションの検出を行った。その結果を、表３に示す。
表３の結果から明らかなように、実施例５のオリゴヌクレオチド固定化平板は、比較例３のオリゴヌクレオチド固定化平板に比べて、オリゴヌクレオチドが確実に平板上に固定化されていることがわかる。また、実施例５のオリゴヌクレオチド固定化平板では、ハイブリダイゼーションシグナルも明瞭に現れた。ここで、コントロールの位置（核酸を含まない溶液をスポットした箇所）及び配列番号６にはシグナルはまったく現れなかった。
実施例７ 核酸の平板への固定化
常法に従い、配列番号７及び８に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして、λＤＮＡ断片（Ａ）を増幅した。得られた断片をアガロース電気泳動し、エチジウムブロマイド染色により検出した結果、その断片の長さは約３００ｂであった。また、前記λＤＮＡと相補的でないλＤＮＡ断片（Ｂ）（約３００ｂ）も同様に増幅した。
市販品のアルミニウム箔（三菱アルミニウム株式会社製）の所定の位置に、上記λＤＮＡ溶液それぞれを、スポッター（Ｐｙｘｓｉｓ５５００ ＣＡＲＴＥＳＩＡＮ社製）を用いて３箇所づつスポットした。スポットの大きさは直径約０．３ｍｍであった。このアルミニウム箔を乾燥機に入れ、４２℃で２０分乾燥した。次にＵｖｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ ２４００（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）を用い、波長２８０ｎｍを含む紫外線を１６ｃｍの距離から６００ｍＪ／ｃｍ２照射した。照射時間は２４０秒であった。その後、前記アルミニウム箔を水中で３０分間振とうして洗浄した後、乾燥させた。
一方、コントロールとして核酸を含まない溶液（１×ＴＥ緩衝液）も同様にアルミニウム箔にスポットし、固定化の操作を行った。
比較例４
実施例７に記載のλＤＮＡ溶液（濃度１ｐｍｏｌ／μｌ）それぞれを、アルミニウム箔の所定の位置に、スポッター（Ｐｙｘｓｉｓ５５００ ＣＡＲＴＥＳＩＡＮ社製）を用いて３箇所づつスポットした。このアルミニウム箔を乾燥機に入れ４２℃で２０分乾燥した。その後、前記アルミニウム箔を水中で３０分間振とうして洗浄し、乾燥させた。
一方、コントロールとして核酸を含まない溶液（１×ＴＥ緩衝液）も同様にアルミニウム箔にスポットし、固定化の操作を行った。
実施例８ ハイブリダイゼーション及びその検出
（１）ハイブリダイゼーション
配列番号７に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドの５’末端にビオチンを標識したオリゴヌクレオチド及び配列番号８に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして、λＤＮＡ断片（Ｃ）を増幅した。このλＤＮＡ断片（Ｃ）の配列は、実施例７で作製したλＤＮＡ断片（Ａ）の配列と同一である。
実施例７及び比較例４のλＤＮＡ固定化アルミニウム箔を９５℃に暖めた水中に５分間浸し、４℃に冷やした水中に５分間浸した。次いで、λＤＮＡ固定化アルミニウム箔の核酸を固定化した部分に、前記０．５ｐｍｏｌビオチン化λＤＮＡ（Ｃ）を含むハイブリダイゼーション溶液（Ａｒｒａｙｉｔ ＵｎｉＨｙｂ（ＴｅｌｅＣＨｅｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）６０ｍｌをのせ、アルミニウム箔を水が浸入しないケース（ハイブリカセット）に入れてそのケースごとウォーターバスに沈め、５５℃で２時間加熱した。
（２）ポストハイブリダイゼーション
上記ハイブリダイゼーションの後、以下の条件でポストハイブリダイゼーション洗浄を行い、λＤＮＡ固定化アルミニウム箔に非特異的に吸着したプローブを除去した。
〔ポストハイブリダイゼーション洗浄の条件〕
１）２×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ；室温、５分間、２回
２）０．２×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ；４０℃、５分間、２回
３）２×ＳＳＣ；室温１分間、３回
（３）ハイブリダイゼーションの検出
アルミニウム箔のハイブリダイゼーション溶液を載せた部分に、乳タンパクを含むブロッキング溶液（ブロックエース 雪印乳業製）１．５ｍｌをのせ、室温で３０分間ブロッキングを行った。ブロッキング溶液を除いた後、ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼコンジュゲート溶液（ＶＥＣＴＯＲ社製）を１．５ｍｌのせ、室温で３０分間反応させた。つぎに、アルミニウム箔をＴＢＳＴ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），０．１５Ｍ ＮａＣｌ，０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０）溶液に浸し、５分間振とうして反応しなかったコンジュゲートを除去した。最後に、アルミニウム箔（はく）のハイブリダイゼーション溶液を載せた部分に基質溶液（ＴＭＢ）を１．５ｍｌのせて、３０分間放置し、発色反応を行った。
その結果を表４に示す。
表４の結果から明らかなように、ハイブリダイゼーションシグナルが特異的かつ明瞭に現れたことから、実施例７のλＤＮＡ断片固定化アルミニウムはくはλＤＮＡ断片が確実にアルミニウムはく上に固定化されていることがわかる。一方、比較例４のλＤＮＡ断片固定化アルミニウムはくには、シグナルはまったく現れなかった。さらに、実施例７のλＤＮＡ断片固定化アルミニウムはく及び比較例４のλＤＮＡ断片固定化アルミニウムはくのコントロールの位置（核酸を含まない溶液をスポットした箇所）にもシグナルはまったく現れなかった。
実施例９ 核酸の平板への固定化
市販品のステンレス製の平板（特殊金属工業株式会社製）の所定の位置に、実施例７に記載のλＤＮＡ溶液それぞれを、スポッター（Ｐｙｘｓｉｓ５５００ ＣＡＲＴＥＳＩＡＮ社製）を用いて３箇所づつスポットした。スポットの大きさは直径約０．３ｍｍであった。この平板を乾燥機に入れ、４２℃で２０分乾燥した。次にＵｖｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ ２４００（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）を用い、波長２８０ｎｍを含む紫外線を１６ｃｍの距離から１２００ｍＪ／ｃｍ２照射した。照射時間は４８０秒であった。その後、前記平板を水中で３０分間振とうして洗浄した後、乾燥させた。
一方、コントロールとして核酸を含まない溶液（１×ＴＥ緩衝液）も同様に平板にスポットし、固定化の操作を行った。
比較例５
実施例７記載のλＤＮＡ溶液（濃度１ｐｍｏｌ／μｌ）それぞれを、ステンレス製の平板の所定の位置に、スポッター（Ｐｙｘｓｉｓ５５００ ＣＡＲＴＥＳＩＡＮ社製）を用いて３箇所づつスポットした。この平板を乾燥機に入れ４２℃で２０分乾燥した。その後、前記平板を水中で３０分間振とうして洗浄し、乾燥させた。
一方、コントロールとして核酸を含まない溶液（１×ＴＥ緩衝液）も同様に平板にスポットし、固定化の操作を行った。
実施例１０ ハイブリダイゼーション及びその検出
実施例９及び比較例５のλＤＮＡ固定化平板を９５℃に暖めた水中に１０分間浸し、４℃に冷やした水中に５分間浸した。次いで、λＤＮＡ固定化平板の核酸を固定化した部分に、実施例８に記載の１ｐｍｏｌビオチン化λＤＮＡ（Ｃ）を含むハイブリダイゼーション溶液（Ａｒｒａｙｉｔ ＵｎｉＨｙｂ（ＴｅｌｅＣＨｅｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）６０ｍｌをのせ、平板を水が浸入しないケース（ハイブリカセット）に入れてそのケースごとウォーターバスに沈め、６０℃で２時間加熱した。
以下、実施例８と同様にしてポストハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションの検出を行った。その結果を表５に示す。
表５の結果から明らかなように、ハイブリダイゼーションシグナルが特異的かつ明瞭に現れたことから、実施例９のλＤＮＡ断片固定化平板はλＤＮＡ断片が確実に平板上に固定化されていることがわかる。一方、比較例５のλＤＮＡ断片固定化平板には、シグナルはまったく現れなかった。さらに、実施例９のλＤＮＡ断片固定化平板及び比較例５のλＤＮＡ断片固定化平板のコントロールの位置（核酸を含まない溶液をスポットした箇所）にもシグナルはまったく現れなかった。
実施例１１ 核酸の平板への固定化
市販品のシリコンウェーハ（三菱住友シリコン株式会社製）の所定の位置に、実施例７に記載のλＤＮＡ溶液それぞれを、スポッター（Ｐｙｘｓｉｓ５５００ ＣＡＲＴＥＳＩＡＮ社製）を用いて３箇所づつスポットした。スポットの大きさは直径約０．３ｍｍであった。このシリコンウェーハを乾燥機に入れ、４２℃で２０分乾燥した。次にＵｖｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ ２４００（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）を用い、波長２８０ｎｍを含む紫外線を１６ｃｍの距離から１２００ｍＪ／ｃｍ２照射した。照射時間は４８０秒であった。その後、前記シリコンウェーハを水中で３０分間振とうして洗浄した後、乾燥させた。
一方、コントロールとして核酸を含まない溶液（１×ＴＥ緩衝液）も同様にシリコンウェーハにスポットし、固定化の操作を行った。
比較例６
実施例７記載のλＤＮＡ溶液（濃度１ｐｍｏｌ／μｌ）それぞれを、シリコンウェーハの所定の位置に、スポッター（Ｐｙｘｓｉｓ５５００ ＣＡＲＴＥＳＩＡＮ社製）を用いて３箇所づつスポットした。この平板を乾燥機に入れ４２℃で２０分乾燥した。その後、前記シリコンウェーハを水中で３０分間振とうして洗浄し、乾燥させた。
実施例１２ ハイブリダイゼーション及びその検出
実施例１１及び比較例６のλＤＮＡ固定化シリコンウェーハを９５℃に暖めた水中に１０分間浸し、４℃に冷やした水中に５分間浸した。次いで、λＤＮＡ固定化シリコンウェーハの核酸を固定化した部分に、実施例８に記載の１ｐｍｏｌビオチン化λＤＮＡ（Ｃ）を含むハイブリダイゼーション溶液（Ａｒｒａｙｉｔ ＵｎｉＨｙｂ（ＴｅｌｅＣＨｅｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）６０ｍｌをのせ、シリコンウェーハを水が浸入しないケース（ハイブリカセット）に入れてそのケースごとウォーターバスに沈め、６０℃で２時間加熱した。
以下、実施例８と同様にしてポストハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションの検出を行った。その結果を表６に示す。
表６の結果から明らかなように、ハイブリダイゼーションシグナルが特異的かつ明瞭に現れたことから、実施例１１のλＤＮＡ断片固定化シリコンウェーハはλＤＮＡ断片が確実にシリコンウェーハ上に固定化されていることがわかる。一方、比較例６のλＤＮＡ断片固定化シリコンウェーハには、シグナルはまったく現れなかった。さらに、実施例１１のλＤＮＡ断片固定化シリコンウェーハ及び比較例６のλＤＮＡ断片固定化シリコンウェーハのコントロールの位置（核酸を含まない溶液をスポットした箇所）にもシグナルはまったく現れなかった。
実施例１３ 核酸の平板への固定化
ガラス板に金蒸着させた基板の所定の位置に、実施例７に記載のλＤＮＡ溶液それぞれを、スポッター（Ｐｙｘｓｉｓ５５００ ＣＡＲＴＥＳＩＡＮ社製）を用いて３箇所づつスポットした。スポットの大きさは直径約０．３ｍｍであった。この金蒸着ガラス基板を乾燥機に入れ、４２℃で２０分乾燥した。次にＵｖｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ ２４００（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）を用い、波長２８０ｎｍを含む紫外線を１６ｃｍの距離から１２００ｍＪ／ｃｍ２照射した。照射時間は４８０秒であった。その後、前記金蒸着ガラス基板を水中で３０分間振とうして洗浄した後、乾燥させた。
一方、コントロールとして核酸を含まない溶液（１×ＴＥ緩衝液）も同様に金蒸着ガラス基板にスポットし、固定化の操作を行った。
比較例７
実施例７記載のλＤＮＡ溶液（濃度１ｐｍｏｌ／μｌ）それぞれを、金蒸着ガラス基板の所定の位置に、スポッター（Ｐｙｘｓｉｓ５５００ ＣＡＲＴＥＳＩＡＮ社製）を用いて３箇所づつスポットした。この平板を乾燥機に入れ４２℃で２０分乾燥した。その後、前記金蒸着ガラス基板を水中で３０分間振とうして洗浄し、乾燥させた。
実施例１４ ハイブリダイゼーション及びその検出
実施例１３及び比較例７のλＤＮＡ固定化金蒸着ガラス基板を９５℃に暖めた水中に１０分間浸し、４℃に冷やした水中に５分間浸した。次いで、λＤＮＡ固定化金蒸着ガラス基板の核酸を固定化した部分に、実施例８に記載の１ｐｍｏｌビオチン化λＤＮＡ（Ｃ）を含むハイブリダイゼーション溶液（Ａｒｒａｙｉｔ ＵｎｉＨｙｂ（ＴｅｌｅＣＨｅｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）６０ｍｌをのせ、金蒸着ガラス基板を水が浸入しないケース（ハイブリカセット）に入れてそのケースごとウォーターバスに沈め、６０℃で２時間加熱した。
以下、実施例８と同様にしてポストハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションの検出を行った。その結果を表７に示す。
表７の結果から明らかなように、ハイブリダイゼーションシグナルが特異的かつ明瞭に現れたことから、実施例１３のλＤＮＡ断片固定化金蒸着ガラス基板はλＤＮＡ断片が確実に金蒸着ガラス基板上に固定化されていることがわかる。一方、比較例７のλＤＮＡ断片固定化金蒸着ガラス基板には、シグナルはまったく現れなかった。さらに、実施例１３のλＤＮＡ断片固定化金蒸着ガラス基板及び比較例７のλＤＮＡ断片固定化金蒸着ガラス基板のコントロールの位置（核酸を含まない溶液をスポットした箇所）にもシグナルはまったく現れなかった。
実施例１５ 核酸の平板への固定化
市販の銅箔（日鉱金属加工株式会社製）の所定の位置に、実施例７に記載のλＤＮＡ溶液それぞれを、スポッター（Ｐｙｘｓｉｓ５５００ ＣＡＲＴＥＳＩＡＮ社製）を用いて３箇所づつスポットした。スポットの大きさは直径約０．３ｍｍであった。この銅箔を乾燥機に入れ、４２℃で２０分乾燥した。次にＵｖｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ ２４００（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）を用い、波長２５４ｎｍを含む紫外線を１６ｃｍの距離から１２００ｍＪ／ｃｍ２照射した。照射時間は４８０秒であった。その後、前記銅箔を水中で３０分間振とうして洗浄した後、乾燥させた。
一方、コントロールとして核酸を含まない溶液（１×ＴＥ緩衝液）も同様に銅箔にスポットし、固定化の操作を行った。
比較例８
実施例７記載のλＤＮＡ溶液（濃度１ｐｍｏｌ／μｌ）それぞれを、銅箔の所定の位置に、スポッター（Ｐｙｘｓｉｓ５５００ ＣＡＲＴＥＳＩＡＮ社製）を用いて３箇所づつスポットした。この銅箔を乾燥機に入れ４２℃で２０分乾燥した。その後、前記銅箔を水中で３０分間振とうして洗浄し、乾燥させた。
実施例１６ ハイブリダイゼーション及びその検出
実施例１５及び比較例８のλＤＮＡ固定化銅箔を９５℃に暖めた水中に１０分間浸し、４℃に冷やした水中に５分間浸した。次いで、λＤＮＡ固定化銅箔の核酸を固定化した部分に、実施例８に記載の１ｐｍｏｌビオチン化λＤＮＡ（Ｃ）を含むハイブリダイゼーション溶液（Ａｒｒａｙｉｔ ＵｎｉＨｙｂ（ＴｅｌｅＣＨｅｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）６０ｍｌをのせ、銅箔を水が浸入しないケース（ハイブリカセット）に入れてそのケースごとウォーターバスに沈め、６０℃で２時間加熱した。
以下、実施例８と同様にしてポストハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションの検出を行った。その結果を表８に示す。
表８の結果から明らかなように、ハイブリダイゼーションシグナルが特異的かつ明瞭に現れたことから、実施例１５のλＤＮＡ断片固定化銅箔はλＤＮＡ断片が確実に銅箔上に固定化されていることがわかる。一方、比較例８のλＤＮＡ断片固定化銅箔には、シグナルはまったく現れなかった。さらに、実施例１５のλＤＮＡ断片固定化金蒸着ガラス基板及び比較例８のλＤＮＡ断片固定化銅箔のコントロールの位置（核酸を含まない溶液をスポットした箇所）にもシグナルはまったく現れなかった。
実施例１７ 核酸の平板への固定化
市販の純ニッケル箔（日鉱金属加工株式会社製）の所定の位置に、実施例７に記載のλＤＮＡ溶液それぞれを、スポッター（Ｐｙｘｓｉｓ５５００ ＣＡＲＴＥＳＩＡＮ社製）を用いて３箇所づつスポットした。スポットの大きさは直径約０．３ｍｍであった。この純ニッケル箔を乾燥機に入れ、４２℃で２０分乾燥した。次にＵｖｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ ２４００（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）を用い、波長２８０ｎｍを含む紫外線を１６ｃｍの距離から１２００ｍＪ／ｃｍ２照射した。照射時間は４８０秒であった。その後、前記純ニッケル箔を水中で３０分間振とうして洗浄した後、乾燥させた。
一方、コントロールとして核酸を含まない溶液（１×ＴＥ緩衝液）も同様に純ニッケル箔にスポットし、固定化の操作を行った。
比較例９
実施例７記載のλＤＮＡ溶液（濃度１ｐｍｏｌ／μｌ）それぞれを、純ニッケル箔の所定の位置に、スポッター（Ｐｙｘｓｉｓ５５００ ＣＡＲＴＥＳＩＡＮ社製）を用いて３箇所づつスポットした。この純ニッケル箔を乾燥機に入れ４２℃で２０分乾燥した。その後、前記純ニッケル箔を水中で３０分間振とうして洗浄し、乾燥させた。
実施例１８ ハイブリダイゼーション及びその検出
実施例１７及び比較例９のλＤＮＡ固定化純ニッケル箔を９５℃に暖めた水中に１０分間浸し、４℃に冷やした水中に５分間浸した。次いで、λＤＮＡ固定化純ニッケル箔の核酸を固定化した部分に、実施例８に記載の１ｐｍｏｌビオチン化λＤＮＡ（Ｃ）を含むハイブリダイゼーション溶液（Ａｒｒａｙｉｔ ＵｎｉＨｙｂ（ＴｅｌｅＣＨｅｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）６０ｍｌをのせ、純ニッケル箔を水が浸入しないケース（ハイブリカセット）に入れてそのケースごとウォーターバスに沈め、６０℃で２時間加熱した。
以下、実施例８と同様にしてポストハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションの検出を行った。その結果を表９に示す。
表９の結果から明らかなように、ハイブリダイゼーションシグナルが特異的かつ明瞭に現れたことから、実施例１７のλＤＮＡ断片固定化銅箔はλＤＮＡ断片が確実に純ニッケル箔上に固定化されていることがわかる。一方、比較例９のλＤＮＡ断片固定化純ニッケル箔には、シグナルはまったく現れなかった。さらに、実施例１７のλＤＮＡ断片固定化純ニッケル箔及び比較例９のλＤＮＡ断片固定化純ニッケル箔のコントロールの位置（核酸を含まない溶液をスポットした箇所）にもシグナルはまったく現れなかった。
【実施例１９】
常法に従い、オリゴヌクレオチド合成機（Ｐｅｒｋｉｎ−ｅｌｍｅｒ Ａｐｐｌｉｅｄ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、配列番号９、１０及び１１に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（２６ｍｅｒ）を合成した。尚、配列番号９に示すオリゴヌクレオチドは、５’末端をビオチン化した。また、配列番号９及び１０に示すオリゴヌクレオチドは、実施例１に記載の配列番号１及び２に示すオリゴヌクレオチドの５’末端に５個のチミジンが連結した配列を有している。配列番号１１に示すオリゴヌクレオチドは、配列番号５に示すオリゴヌクレオチドと１塩基配列が異なるため相補性を持っていない。すなわち、これらのオリゴヌクレオチドは、実施例３の配列番号４、５及び６のオリゴヌクレオチドの５’末端のチミジンを５個に減らしたものである。
上記オリゴヌクレオチドを、実施例３と同様にして市販品のステンレス製の平板（特殊金属工業株式会社製）に固定化した。以下、実施例２と同様にしてポストハイブリダイゼーション、及び平板に固定化されたオリゴヌクレオチドならびにハイブリダイゼーションの検出を行った。
比較例１０
実施例１９に記載のオリゴヌクレオチド溶液を用いた他は、比較例２と同様にして、ステンレス製の平板に各々のオリゴヌクレオチドを固定化した。
【実施例２０】
実施例１９及び比較例１０のオリゴヌクレオチド固定化平板の核酸を固定化した部分に、３ｐｍｏｌビオチン化プローブ（２６２ｂｐ）を含むハイブリダイゼーション溶液（Ａｒｒａｙｉｔ ＵｎｉＨｙｂ（ＴｅｌｅＣＨｅｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）６０ｍｌをのせ、平板を水が浸入しないケース（ハイブリカセット）に入れてそのケースごとウォーターバスに沈め、４５℃で２時間加熱した。
以下、実施例２と同様にしてポストハイブリダイゼーション、及び平板に固定化されたオリゴヌクレオチドならびにハイブリダイゼーションの検出を行った。その結果を、表１０に示す。配列番号９のオリゴヌクレオチドを固定化した位置のシグナルは固定化されたオリゴヌクレオチドの量を、配列番号１０のオリゴヌクレオチドを固定化した位置のシグナルはハイブリダイゼーションの強度を、それぞれ示す。
【産業上の利用の可能性】
本発明の方法により、生体分子、例えば核酸、特に鎖長の短い核酸を、金属製担体に簡便、かつ、効率よく固定することができる。また、担体表面のコーティングが不要であるため、金属製の電極等に直接生体分子を固定化することができる。
【配列表】
【図１】
【技術分野】
本発明は、核酸等の生体分子を担体に固定化する方法に関する。本発明の方法は、ハイブリダイゼーションによる核酸の分析等の操作に有用である。
【背景技術】
従来、ハイブリダイゼーションによる核酸の分析や、イムノアッセイ等においては、核酸やタンパク質を膜や平板などの担体に固定化する技術が利用されている。このような生体分子の固定化法として、核酸では、以下のものが知られている。
（１）５’末端にチオール基を有する核酸とチオール基を含むビーズ状基材間のジスルフィド結合による固定（Ｐ．Ｊ．Ｒ．Ｄａｙ，Ｐ．Ｓ．Ｆｌｏｒａ，Ｊ．Ｅ．Ｆｏｘ，Ｍ．Ｒ．Ｗａｌｋｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２７８，７３５−７４０（１９９１））等のような、修飾基を導入した核酸を化学結合させる方法。
（２）核酸を、紫外線（ＵＶ）照射又は加熱処理により、ニトロセルロース、ナイロンメンブレン、又はポリ−Ｌ−リジン等のカチオンポリマーで被覆されたガラス等の担体等に、吸着固定させる方法（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐａｇｅｓ ２．１０９−２．１１３ ａｎｄ ｐａｇｅｓ ９．３４−９．４６、特表平１０−５０３８４１号公報）。
（３）ポリリジン溶液で処理されたマイクロプレートのウェル中に核酸を注入し、３７℃に加熱することにより、物理吸着させることにより固定する方法（Ｇ．Ｃ．Ｎ．Ｐａｒｒｙ ａｎｄ Ａ．Ｄ．Ｂ．Ｍａｌｃｏｍ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．，１７，２３０−２３１（１９８９））。
（４）基材上に結合させたヌクレオチドを用い、基材上でＤＮＡを合成する方法（国際公開第９７／１０３６５号パンフレット（ＷＯ９７／１０３６５））。
（５）カルボジイミド基を有する高分子化合物を担持させたガラス等の基材に核酸を固定する方法（特開平８−２３９７５号公報）。
しかし、上記の（１）の方法は、極めて特殊な機械と試薬を必要とする。また、（２）及び（３）の方法においては、ハイブリダイゼーションを行った場合、特に操作過程で担体から核酸が剥がれ落ち、結果として検出感度が下がったり、再現性が得られない等の欠点がある。また、この方法では、長い核酸は固定できるが、オリゴマー等約５０ｍｅｒ以下の短い核酸になると、効率よく固定化できないという欠点がある。尚、これらの方法では、ＵＶ照射量は数十ｍＪ／ｃｍ２程度である。さらに、（４）の方法は、基材上でＤＮＡを合成するために、極めて特殊な機械と試薬を必要とし、さらに、合成できる核酸も２５ｍｅｒ程度までに限られるという欠点がある。また、（５）の方法は、基材の材料が限られ、表面のコーティング工程が必要である。
【発明の開示】
本発明は、上記従来技術の状況に鑑み、生体分子、例えば核酸、特に短鎖長の核酸を担体に、簡便、かつ、効率よく固定する方法を提供することを課題とする。
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、核酸溶液を金属製の担体上にスポットした後に、紫外線を担体に照射することによって、核酸を担体に効率よく固定化することができることを見い出し、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、以下のとおりである。
（１）生体分子を担体に固定化する方法であって、生体分子の溶液を担体上にスポットする工程と、前記生体分子溶液をスポットした担体に波長２８０ｎｍの成分を含む紫外線を照射する工程を含み、前記担体は金属製であることを特徴とする方法。
（２）前記紫外線が、波長２２０〜３００ｎｍの成分を含むことを特徴とする（１）に記載の方法。
（３）前記金属は、周期律表第２周期〜第７周期のＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ族および遷移元素から選ばれる金属、又は同金属を含む合金である（１）又は（２）に記載の方法。
（４）前記紫外線の照射量は１００ｍＪ／ｃｍ２以上である（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５）前記生体分子は核酸、タンパク質、糖、抗原、抗体、ペプチド、酵素から選ばれる（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（６）生体分子が担体上に固定化された生体分子固定化担体の製造法であって、生体分子の溶液を担体上にスポットする工程と、前記生体分子溶液をスポットした担体に波長２８０ｎｍの成分を含む紫外線を照射し、前記生体分子を担体に固定化する工程を含む方法。
（７）前記紫外線が、波長２２０〜３００ｎｍの成分を含むことを特徴とする（６）に記載の方法。
（８）前記生体分子は核酸であって、核酸固定化担体はハイブリダイゼーションによる核酸の分析に用いられるものである（６）又は（７）に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
図１は、実施例で作製したオリゴヌクレオチド固定化平板を用いたハイブリダイゼーションの結果を示す図（写真）。
点線は、実施例１及び比較例１でオリゴヌクレオチドを固定化した領域、及びコントロールである１×ＴＥ緩衝液をスポットした領域を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に用いる担体は、生体分子を固定化するためのものであり、金属製であることを特徴とする。金属としては、紫外線照射により生体分子を固定化することができるものであれば特に制限されず、好ましくは、周期律表第２周期〜第７周期のＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ族および遷移元素から選ばれる金属、又は同金属を含む合金が挙げられる。
上記周期律表第２周期〜第７周期のＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ族および遷移元素から選ばれる金属として特に好ましいものとしては、アルミニウム、チタン、白金、タングステン、モリブデン、金、銅、ニッケル等が挙げられる。
また、上記合金として具体的には、洋白（成分：Ｃｕ，Ｎｉ，Ｚｎ）、真鍮（成分：Ｃｕ，Ｚｎ）、ブロンズ（成分：Ｃｕ，Ｂｅ）、モネル（成分：Ｃｕ，Ｎｉ，Ｆｅ，Ｍｎ）、ニッケルコバルト合金（成分：Ｎｉ，Ｃｏ）、ニッケルクロム合金（成分：Ｎｉ，Ｃｒ）、コバルト合金（成分：Ｃｏ，Ｎｉ，Ｃｒ）、ステンレス（成分：Ｎｉ，Ｃｒ，Ｆｅ）、銀タングステン（成分：Ａｇ，Ｗ）、βチタン（成分：Ｔｉ，Ｖ，Ａｌ）、αβチタン（成分：Ｔｉ，Ｖ，Ａｌ）、ＮＴ合金（成分：Ｔｉ，Ｎｉ）、アルミニウム合金（成分：Ａｌ，Ｃｕ，Ｍｇ，Ｓｉ，Ｍｎ，Ｚｎ）、ジュラルミン（成分：Ａｌ，Ｃｕ，Ｓｉ，Ｆｅ，Ｍｎ，Ｍｇ，Ｚｎ）、マグネシウム合金（成分：Ｍｇ，Ａｌ，Ｚｎ）、Ｋ２４（成分：Ａｕ）、Ｋ１８（成分：Ａｕ，Ａｇ，Ｃｕ）、ベリリウム銅（成分：Ｃｕ，Ｂｅ）、鋳鉄（成分：Ｆｅ，Ｍｎ，Ｓ，Ｃ）、炭素鋼（成分：Ｆｅ，Ｃ，Ｓｉ，Ｍｎ，Ｐ，Ｓ）、青銅鋳物（成分：Ｃｕ，Ｓｎ，Ｚｎ，Ｐｂ）、りん青銅鋳物（成分：Ｃｕ，Ｚｎ，Ｐ）、黄銅鋳物（成分：Ｃｕ，Ｚｎ，Ｐｂ）、マンガン黄銅（成分：Ｃｕ，Ｚｎ，Ｍｎ，Ｆｅ，Ａｌ）、シルジン青銅鋳物（成分：Ｃｕ，Ｓｉ，Ｚｎ）、アルミニウム青銅鋳物（成分：Ｃｕ，Ａｌ，Ｆｅ，Ｎｉ，Ｍｎ）、エリンバー（成分：Ｎｉ，Ｃｒ，Ｍｎ）、エリンバーエクストラ（成分：Ｎｉ，Ｃｒ，Ｃｏ，Ｍｎ）、インバー（成分：Ｎｉ，Ｆｅ）、スーパーインバー（成分：Ｆｅ，Ｎｉ，Ｃｏ）、ステンレスインバー（成分：Ｆｅ，Ｃｏ，Ｃｒ）、Ｍａｌｏｔｔｅｓ（成分：Ｓｎ，Ｂｉ，Ｐｂ）、リポウィッツ（Ｌｉｐｏｗｉｔｚ）（成分：Ｓｎ，Ｂｉ，Ｐｂ，Ｃｄ）、ウッズ（Ｗｏｏｄ’ｓ）（成分：Ｓｎ，Ｂｉ，Ｐｂ，Ｃｄ）、マンガニン（成分：Ｃｕ，Ｍｎ，Ｎｉ，Ｆｅ）、イザベリン（成分：Ｃｕ，Ｍｎ，Ａｌ）、コンスタンタン（成分：Ｃｕ，Ｎｉ）、アルクレス（成分：Ｆｅ，Ｃｒ，Ａｌ）、カンタル（成分：Ｃｒ，Ｆｅ，Ａｌ，Ｃｏ）、アルメル（成分：Ｎｉ，Ａｌ）、磁性材料（Ｆｅ，Ｎｉ，Ｃｏ等強磁性遷移元素を含む材料）、パーマロイ（成分：Ｆｅ，Ｎｉ）、アルパーム（成分：Ｆｅ，Ａｌ）、フェライト（Ｆｅ２Ｏ３を主成分とする複合酸化物）、センダスト（成分：Ｆｅ，Ｓｉ，Ａｌ）、スーパーセンダスト（成分：Ｆｅ，Ｓｉ，Ａｌ，Ｎｉ，）、アルニコ（成分：Ｆｅ，Ａｌ，Ｎｉ，Ｃｏ）、水素吸蔵金属（ランタンニッケル合金（成分：Ｌａ，Ｎｉ）等）、Ｃｏ−Ｃｒ系合金、ＳｎＯ２系酸化物、Ｎｂ−Ｔｉ合金、制振合金（振動を低減もしくは吸収、振動の伝播を遮断する合金材料、Ａｌ−Ｚｎ超塑性合金、サイレントアロイ、ニチノール等）、電極用材料、半導体材料（シリコン、ゲルマニウム、カリウムヒ素等）等が挙げられる。
また、上記金属は、他の金属で蒸着又はメッキ処理（加工）されていても良い。更に、前記金属は、形状を保持するために異なる種類の前記金属が積層してもよく、単一金属であっても良い。
本発明における担体は、本質的に上記金属からなる。担体は、金属のみから構成されていてもよいし、非金属材料上に金属が接着、蒸着又はメッキ等により積層されていてもよい。
上記担体の形状は、特に問われないが、箔（フォイル）状、平板（プレート）状、薄片（ウェーハ）状、フィルター状、ビーズ状等が挙げられる。また、マイクロタイタープレートのような形状であっても良い。さらに、得られる結果の保存を容易にするため、平板等の裏面をシール等に使用できる材料（接着剤等）を塗布、コート等をすることによって、シールとしても使用することもできる。
上記担体の所定の位置に、生体分子の溶液をスポットする。生体分子としては、核酸、タンパク質、糖、抗原、抗体、ペプチド、酵素などが挙げられる。以下、生体分子として核酸を例として説明するが、固定の際に紫外線を照射する以外は、他の物質でも通常固定化に用いられている方法や条件を採用することができる。
核酸としては、通常の固相化核酸を用いた核酸同士のハイブリダイゼーションに用いられる固相化核酸と特に変わるところはなく、ハイブリダイゼーションが可能な核酸であれば特に制限されず、例えば、天然又は合成のＤＮＡ（オリゴヌクレオチドを含む）もしくはＲＮＡ（オリゴヌクレオチドを含む）が挙げられる。また、上記核酸は１本鎖であっても、２本鎖であっても構わない。核酸の鎖長は、ハイブリダイゼーションが可能な長さであれば特に制限されないが、通常５〜５００００塩基、好ましくは２０〜１００００塩基である。また、核酸の５’末端あるいは３’末端にチミジン等、紫外線によって反応活性基を有するオリゴヌクレオチドの重合体を有しても良い。
核酸を溶解する溶媒も特に制限されず、蒸留水、又は通常核酸溶液の調製に用いられる緩衝液、例えばＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ塩酸，ｐＨ８．０／１ｍＭ ＥＤＴＡ）等のＴｒｉｓ緩衝液、食塩を含む水溶液、カルボン酸塩を含む水溶液（クエン酸ナトリウム、クエン酸アンモニウム、酢酸ナトリウム等）、スルホン酸塩を含む水溶液（ドデシル硫酸ナトリウム、ドデシル硫酸アンモニウム等）、ホスホン酸塩を含む水溶液等（リン酸ナトリウム、リン酸アンモニウム等）等を挙げることができる。また、一般に市販されている溶媒、Ｍｉｃｒｏ Ｓｐｏｔｔｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＴｅｌｅＣＨｅｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．社製）等も挙げることができる。また、核酸溶液の濃度も特に制限されないが、通常１ｍｍｏｌ／ｍｌ〜１ｆｍｏｌ／ｍｌ、好ましくは１００ｐｍｏｌ／ｍｌ〜１００ｆｍｏｌ／ｍｌの濃度である。
核酸溶液を担体上にスポットする方法としては、ピペットで核酸溶液を担体上に滴下する方法、又は市販のスポッタを用いる方法等が挙げられる。スポットの形状及びスポット量としては、核酸溶液をスポットした位置を把握することができる程度であれば、特に制限されないが、形状としては点状又は円状が好ましい。また、好ましいスポット量は１０ｎｌ〜１０ｍｌである。核酸溶液は、担体上に１箇所又は複数箇所にスポットされる。スポットされる核酸溶液は、１種類でも２種類又はそれ以上であってもよい。尚、担体に核酸が固定されたことを示す陽性コントロールとして、標識した核酸を固定化しておいてもよい。
本発明の好ましい形態においては、核酸溶液を担体上にスポットした後に、２８０ｎｍの波長を含む紫外線を照射する。前記紫外線としては、波長２２０〜３００ｎｍの成分を含む紫外線が挙げられる。また、前記核酸溶液をスポット後紫外線照射前に乾燥させることができる。前記核酸溶液の乾燥方法としては、自然に乾燥させてもよく、加熱して乾燥させてもよい。加熱する場合の温度は、通常３０〜１００℃、好ましくは３５〜４５℃である。
次に、担体、少なくとも担体の核酸を固定した部位に、波長２８０ｎｍの成分を含む紫外線を照射する。具体的には、波長２８０ｎｍの単色光でもよいし、波長２８０ｎｍを含むブロードな波形を有する紫外線であっても良い。波長２８０ｎｍを含むブロードな波形を有する紫外線としては、例えば波長２２０〜３００ｎｍの成分を含む紫外線が挙げられる。また、波長２２０〜３００ｎｍの成分を含む紫外線としては、２８０ｎｍ付近に極大値を有する紫外線が挙げられる。照射量は、累積照射量として通常１００ｍＪ／ｃｍ２以上、好ましくは２００ｍＪ／ｃｍ２以上である。
上記のようにして、核酸を担体上に固定化することにより、核酸固定化担体が製造される。本発明の方法により得られる核酸固定化担体は、例えば、ハイブリダイゼーションによる核酸の分析に用いることができる。本発明の方法により担体に固定化された核酸は、通常のハイブリダイゼーションの条件下で担体から脱離しにくいため、紫外線照射を行わない場合に比べて検出感度が良好で、再現性も良い。ハイブリダイゼーション及びその検出は、通常の固相化核酸を用いたハイブリダイゼーションと同様にして行うことができる。
本発明では、核酸を固定化するのに用いる担体として、安価な金属材料を用いることができるので、低コスト化が可能である。また、金属材料は形成が容易なため、様々な形態のＤＮＡマイクロアレイの作製が容易となる。また、長期保存が可能であり、保存安定性に優れている。さらに、本発明の方法は、担体表面のコーティング工程が不要であり、電極等に使用される金属に直接核酸を固定することができる。電極に核酸を固定することにより溶液中の相補的な核酸と固定された核酸とを効率良くハイブリダイゼーションを行うことができる。核酸は負電化をもっている為、正極に引き寄せられるため、正極の付近は核酸濃度が高くなりやすく、ハイブリダイゼーションが効率よく進むと考えられる。
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。
実施例１ 核酸の平板への固定化
常法に従い、オリゴヌクレオチド合成機（Ｐｅｒｋｉｎ−ｅｌｍｅｒ Ａｐｐｌｉｅｄ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、配列番号１、２に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（２１ｍｅｒ）を合成した。また、プローブとして、配列番号３に示す塩基配列を有するＤＮＡ（２６２ｂｐ）を調製した。尚、配列番号１に示すオリゴヌクレオチド及びプローブは、５’末端をビオチン化した。また、配列番号２に示すオリゴヌクレオチドはビオチン化プローブと相補性を持っている。これらのオリゴヌクレオチドを１ｐｍｏｌ／μｌになるように１×ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ塩酸，ｐＨ８／１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶解した。
市販品のアルミニウム箔（三菱アルミニウム株式会社製）の所定の位置に、上記オリゴヌクレオチド溶液それぞれを、３箇所づつスポットした（図１）。スポットの量は０．５μｌづつであり、スポットの大きさは直径約１ｍｍであった。このアルミニウム箔を乾燥機に入れ、３７℃で２０分乾燥した。次にＵｖｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ ２４００（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）を用い、波長２８０ｎｍを含む紫外線を１６ｃｍの距離から２５０ｍＪ／ｃｍ２照射した。照射時間は１００秒であった。その後、前記アルミニウム箔を水中で３０分間振とうして洗浄した後、乾燥させた。
一方、コントロールとして核酸を含まない溶液（１×ＴＥ緩衝液）も同様にアルミニウム箔にスポットし、固定化の操作を行った。
比較例１
予め、アルミニウム箔に、Ｕｖｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ ２４００（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）を用い、波長２８０ｎｍを含むｎｍの紫外線を１６ｃｍの距離から２５０ｍＪ／ｃｍ２照射した。実施例１に記載のオリゴヌクレオチド溶液それぞれを、アルミニウム箔の所定の位置に、３箇所づつスポットした。スポットの量は０．５μｌづつであり、スポットの大きさは直径約１ｍｍであった。照射時間は１００秒であった。このアルミニウム箔を乾燥機に入れ３７℃で２０分乾燥した。その後、前記アルミニウム箔を水中で３０分間振とうして洗浄し、乾燥させた。
一方、コントロールとして核酸を含まない溶液（１×ＴＥ緩衝液）も同様にアルミニウム箔にスポットし、固定化の操作を行った。
実施例２ ハイブリダイゼーション及びその検出
（１）ハイブリダイゼーション
実施例１及び比較例１のオリゴヌクレオチド固定化アルミニウム箔の核酸を固定化した部分に、３ｐｍｏｌビオチン化プローブ（２６２ｂｐ）を含むハイブリダイゼーション溶液（Ａｒｒａｙｉｔ ＵｎｉＨｙｂ（ＴｅｌｅＣＨｅｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．） ６０μｌをのせ、アルミニウム箔を水が浸入しないケース（ハイブリカセット）に入れてそのケースごとウォーターバスに沈め、４５℃で２時間加熱した。
（２）ポストハイブリダイゼーション
上記ハイブリダイゼーションの後、以下の条件でポストハイブリダイゼーション洗浄を行い、オリゴヌクレオチド固定化アルミニウム箔に非特異的に吸着したプローブを除去した。
〔ポストハイブリダイゼーション洗浄の条件〕
１）２×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ；室温、５分間、２回
２）０．２×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ；４０℃、５分間、２回
３）２×ＳＳＣ；室温１分間、３回
（３）アルミニウム箔に固定化されたオリゴヌクレオチド及びハイブリダイゼーションの検出
アルミニウム箔のハイブリダイゼーション溶液を載せた部分に、乳タンパクを含むブロッキング溶液（ブロックエース 雪印乳業製）１．５ｍｌをのせ、室温で３０分間ブロッキングを行った。ブロッキング溶液を除いた後、ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼコンジュゲート溶液（ＶＥＣＴＯＲ社製）を１．５ｍｌのせ、室温で３０分間反応させた。つぎに、アルミニウム箔をＴＢＳＴ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），０．１５Ｍ ＮａＣｌ，０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０）溶液に浸し、５分間振とうして反応しなかったコンジュゲートを除去した。最後に、アルミニウム箔のハイブリダイゼーション溶液を載せた部分に基質溶液（ＴＭＢ）を１．５ｍｌのせて、３０分間放置し、発色反応を行った。
その結果を、表１に示す。表１中の記号の意味は、表２以下でも同様である。配列番号１のオリゴヌクレオチドを固定化した位置のシグナルは固定化されたオリゴヌクレオチドの量を、配列番号２のオリゴヌクレオチドを固定化した位置のシグナルはハイブリダイゼーションの強度を、それぞれ示す。
表１の結果から明らかなように、実施例１のオリゴヌクレオチド固定化アルミニウム箔は、比較例１のオリゴヌクレオチド固定化アルミニウム箔に比べて、オリゴヌクレオチドが確実にアルミニウム箔上に固定化されていることがわかる。また、実施例１のオリゴヌクレオチド固定化アルミニウム箔では、ハイブリダイゼーションシグナルも明瞭に現れた。なお、コントロールの位置（核酸を含まない溶液をスポットした箇所）にはシグナルはまったく現れなかった。
実施例３ 核酸の平板への固定化
常法に従い、オリゴヌクレオチド合成機（Ｐｅｒｋｉｎ−ｅｌｍｅｒ Ａｐｐｌｉｅｄ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、配列番号４、５及び６に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（３１ｍｅｒ）を合成した。尚、配列番号４に示すオリゴヌクレオチドは、５’末端をビオチン化した。また、配列番号４及び５に示すオリゴヌクレオチドは、実施例１に記載の配列番号１及び２に示すオリゴヌクレオチドの５’末端に１０個のチミジンが連結した配列を有している。配列番号５のオリゴヌクレオチドは、前記ビオチン化プローブと相補性を持っており、配列番号６に示すオリゴヌクレオチドは、配列番号５に示すオリゴヌクレオチドと１塩基配列が異なるため相補性を持っていない。これらのオリゴヌクレオチドを１００ｐｍｏｌ／ｍｌになるように５×ＳＳＣに溶解した。
市販品のステンレス製の平板（特殊金属工業株式会社製）の所定の位置に、上記オリゴヌクレオチド溶液それぞれを、スポッター（Ｐｙｘｓｉｓ５５００ ＣＡＲＴＥＳＩＡＮ社製）を用いて３箇所づつスポットした。スポットの大きさは直径約０．３ｍｍであった。この平板を乾燥機に入れ、４２℃で２０分乾燥した。次にＵｖｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ ２４００（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）を用い、波長２８０ｎｍを含む紫外線を１６ｃｍの距離から３００ｍＪ／ｃｍ２照射した。照射時間は１２０秒であった。その後、前記平板を水中で３０分間振とうして洗浄した後、乾燥させた。
一方、コントロールとして核酸を含まない溶液（２ｘＳＳＣ緩衝液）も同様に平板にスポットし、固定化の操作を行った。
比較例２
予め、ステンレス製の平板に、Ｕｖｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ ２４００（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）を用い、波長２８０ｎｍを含む紫外線を１６ｃｍの距離から３００ｍＪ／ｃｍ２照射した。実施例３に記載のオリゴヌクレオチド溶液それぞれを、ステンレス製の平板の所定の位置に、スポッター（Ｐｙｘｓｉｓ５５００ ＣＡＲＴＥＳＩＡＮ社製）を用いて３箇所づつスポットした。照射時間は１２０秒であった。この平板を乾燥機に入れ４２℃で２０分乾燥した。その後、前記平板を水中で３０分間振とうして洗浄し、乾燥させた。
一方、コントロールとして核酸を含まない溶液（２ｘＳＳＣ緩衝液）も同様に平板にスポットし、固定化の操作を行った。
実施例４ ハイブリダイゼーション及びその検出
実施例３及び比較例２のオリゴヌクレオチド固定化平板の核酸を固定化した部分に、３ｐｍｏｌビオチン化プローブ（２６２ｂｐ）を含むハイブリダイゼーション溶液（Ａｒｒａｙｉｔ ＵｎｉＨｙｂ（ＴｅｌｅＣＨｅｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）６０ｍｌをのせ、平板を水が浸入しないケース（ハイブリカセット）に入れてそのケースごとウォーターバスに沈め、４５℃で２時間加熱した。
以下、実施例２と同様にしてポストハイブリダイゼーション、及び平板に固定化されたオリゴヌクレオチドならびにハイブリダイゼーションの検出を行った。その結果を、表２に示す。配列番号４のオリゴヌクレオチドを固定化した位置のシグナルは固定化されたオリゴヌクレオチドの量を、配列番号５のオリゴヌクレオチドを固定化した位置のシグナルはハイブリダイゼーションの強度を、それぞれ示す。
表２の結果から明らかなように、実施例３のオリゴヌクレオチド固定化平板は、比較例２のオリゴヌクレオチド固定化平板に比べて、オリゴヌクレオチドが確実に平板上に固定化されていることがわかる。また、実施例３のオリゴヌクレオチド固定化平板では、ハイブリダイゼーションシグナルも明瞭に現れた。ここで、コントロールの位置（核酸を含まない溶液をスポットした箇所）及び配列番号６にはシグナルはまったく現れなかった。
実施例５ 核酸の平板への固定化
銀タングステン製の平板（イースタン技研株式会社製）の所定の位置に、実施例３で調製したオリゴヌクレオチド溶液それぞれを、スポッターを用いて３箇所づつスポットした。スポットの大きさは直径約０．３ｍｍであった。この平板を乾燥機に入れ、４２℃で２０分乾燥した。次にＵｖｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ ２４００（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）を用い、波長２８０ｎｍを含む紫外線を１６ｃｍの距離から４００ｍＪ／ｃｍ２照射した。照射時間は１６０秒であった。その後、前記平板を水中で３０分間振とうして洗浄した後、乾燥させた。
一方、コントロールとして核酸を含まない溶液（２ｘＳＳＣ緩衝液）も同様に平板にスポットし、固定化の操作を行った。
比較例３
予め、銀タングステン製の平板に、Ｕｖｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ ２４００（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）を用い、波長２８０ｎｍを含む紫外線を１６ｃｍの距離から４００ｍＪ／ｃｍ２照射した。実施例３に記載のオリゴヌクレオチド溶液それぞれを、銀タングステン製の平板の所定の位置に、スポッター（Ｐｙｘｓｉｓ５５００ ＣＡＲＴＥＳＩＡＮ社製）を用いて３箇所づつスポットした。照射時間は１６０秒であった。この平板を乾燥機に入れ４２℃で２０分乾燥した。その後、前記平板を水中で３０分間振とうして洗浄し、乾燥させた。
一方、コントロールとして核酸を含まない溶液（２ｘＳＳＣ緩衝液）も同様に平板にスポットし、固定化の操作を行った。
実施例６ ハイブリダイゼーション及びその検出
実施例５及び比較例３のオリゴヌクレオチド固定化平板の核酸を固定化した部分に、３ｐｍｏｌビオチン化プローブ（２６２ｂｐ）を含むハイブリダイゼーション溶液（Ａｒｒａｙｉｔ ＵｎｉＨｙｂ（ＴｅｌｅＣＨｅｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）６０ｍｌをのせ、平板を水が浸入しないケース（ハイブリカセット）に入れてそのケースごとウォーターバスに沈め、４５℃で２時間加熱した。
以下、実施例２と同様にしてポストハイブリダイゼーション、及び平板に固定化されたオリゴヌクレオチドならびにハイブリダイゼーションの検出を行った。その結果を、表３に示す。
表３の結果から明らかなように、実施例５のオリゴヌクレオチド固定化平板は、比較例３のオリゴヌクレオチド固定化平板に比べて、オリゴヌクレオチドが確実に平板上に固定化されていることがわかる。また、実施例５のオリゴヌクレオチド固定化平板では、ハイブリダイゼーションシグナルも明瞭に現れた。ここで、コントロールの位置（核酸を含まない溶液をスポットした箇所）及び配列番号６にはシグナルはまったく現れなかった。
実施例７ 核酸の平板への固定化
常法に従い、配列番号７及び８に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして、λＤＮＡ断片（Ａ）を増幅した。得られた断片をアガロース電気泳動し、エチジウムブロマイド染色により検出した結果、その断片の長さは約３００ｂであった。また、前記λＤＮＡと相補的でないλＤＮＡ断片（Ｂ）（約３００ｂ）も同様に増幅した。
市販品のアルミニウム箔（三菱アルミニウム株式会社製）の所定の位置に、上記λＤＮＡ溶液それぞれを、スポッター（Ｐｙｘｓｉｓ５５００ ＣＡＲＴＥＳＩＡＮ社製）を用いて３箇所づつスポットした。スポットの大きさは直径約０．３ｍｍであった。このアルミニウム箔を乾燥機に入れ、４２℃で２０分乾燥した。次にＵｖｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ ２４００（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）を用い、波長２８０ｎｍを含む紫外線を１６ｃｍの距離から６００ｍＪ／ｃｍ２照射した。照射時間は２４０秒であった。その後、前記アルミニウム箔を水中で３０分間振とうして洗浄した後、乾燥させた。
一方、コントロールとして核酸を含まない溶液（１×ＴＥ緩衝液）も同様にアルミニウム箔にスポットし、固定化の操作を行った。
比較例４
実施例７に記載のλＤＮＡ溶液（濃度１ｐｍｏｌ／μｌ）それぞれを、アルミニウム箔の所定の位置に、スポッター（Ｐｙｘｓｉｓ５５００ ＣＡＲＴＥＳＩＡＮ社製）を用いて３箇所づつスポットした。このアルミニウム箔を乾燥機に入れ４２℃で２０分乾燥した。その後、前記アルミニウム箔を水中で３０分間振とうして洗浄し、乾燥させた。
一方、コントロールとして核酸を含まない溶液（１×ＴＥ緩衝液）も同様にアルミニウム箔にスポットし、固定化の操作を行った。
実施例８ ハイブリダイゼーション及びその検出
（１）ハイブリダイゼーション
配列番号７に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドの５’末端にビオチンを標識したオリゴヌクレオチド及び配列番号８に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして、λＤＮＡ断片（Ｃ）を増幅した。このλＤＮＡ断片（Ｃ）の配列は、実施例７で作製したλＤＮＡ断片（Ａ）の配列と同一である。
実施例７及び比較例４のλＤＮＡ固定化アルミニウム箔を９５℃に暖めた水中に５分間浸し、４℃に冷やした水中に５分間浸した。次いで、λＤＮＡ固定化アルミニウム箔の核酸を固定化した部分に、前記０．５ｐｍｏｌビオチン化λＤＮＡ（Ｃ）を含むハイブリダイゼーション溶液（Ａｒｒａｙｉｔ ＵｎｉＨｙｂ（ＴｅｌｅＣＨｅｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）６０ｍｌをのせ、アルミニウム箔を水が浸入しないケース（ハイブリカセット）に入れてそのケースごとウォーターバスに沈め、５５℃で２時間加熱した。
（２）ポストハイブリダイゼーション
上記ハイブリダイゼーションの後、以下の条件でポストハイブリダイゼーション洗浄を行い、λＤＮＡ固定化アルミニウム箔に非特異的に吸着したプローブを除去した。
〔ポストハイブリダイゼーション洗浄の条件〕
１）２×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ；室温、５分間、２回
２）０．２×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ；４０℃、５分間、２回
３）２×ＳＳＣ；室温１分間、３回
（３）ハイブリダイゼーションの検出
アルミニウム箔のハイブリダイゼーション溶液を載せた部分に、乳タンパクを含むブロッキング溶液（ブロックエース 雪印乳業製）１．５ｍｌをのせ、室温で３０分間ブロッキングを行った。ブロッキング溶液を除いた後、ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼコンジュゲート溶液（ＶＥＣＴＯＲ社製）を１．５ｍｌのせ、室温で３０分間反応させた。つぎに、アルミニウム箔をＴＢＳＴ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），０．１５Ｍ ＮａＣｌ，０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０）溶液に浸し、５分間振とうして反応しなかったコンジュゲートを除去した。最後に、アルミニウム箔（はく）のハイブリダイゼーション溶液を載せた部分に基質溶液（ＴＭＢ）を１．５ｍｌのせて、３０分間放置し、発色反応を行った。
その結果を表４に示す。
表４の結果から明らかなように、ハイブリダイゼーションシグナルが特異的かつ明瞭に現れたことから、実施例７のλＤＮＡ断片固定化アルミニウムはくはλＤＮＡ断片が確実にアルミニウムはく上に固定化されていることがわかる。一方、比較例４のλＤＮＡ断片固定化アルミニウムはくには、シグナルはまったく現れなかった。さらに、実施例７のλＤＮＡ断片固定化アルミニウムはく及び比較例４のλＤＮＡ断片固定化アルミニウムはくのコントロールの位置（核酸を含まない溶液をスポットした箇所）にもシグナルはまったく現れなかった。
実施例９ 核酸の平板への固定化
市販品のステンレス製の平板（特殊金属工業株式会社製）の所定の位置に、実施例７に記載のλＤＮＡ溶液それぞれを、スポッター（Ｐｙｘｓｉｓ５５００ ＣＡＲＴＥＳＩＡＮ社製）を用いて３箇所づつスポットした。スポットの大きさは直径約０．３ｍｍであった。この平板を乾燥機に入れ、４２℃で２０分乾燥した。次にＵｖｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ ２４００（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）を用い、波長２８０ｎｍを含む紫外線を１６ｃｍの距離から１２００ｍＪ／ｃｍ２照射した。照射時間は４８０秒であった。その後、前記平板を水中で３０分間振とうして洗浄した後、乾燥させた。
一方、コントロールとして核酸を含まない溶液（１×ＴＥ緩衝液）も同様に平板にスポットし、固定化の操作を行った。
比較例５
実施例７記載のλＤＮＡ溶液（濃度１ｐｍｏｌ／μｌ）それぞれを、ステンレス製の平板の所定の位置に、スポッター（Ｐｙｘｓｉｓ５５００ ＣＡＲＴＥＳＩＡＮ社製）を用いて３箇所づつスポットした。この平板を乾燥機に入れ４２℃で２０分乾燥した。その後、前記平板を水中で３０分間振とうして洗浄し、乾燥させた。
一方、コントロールとして核酸を含まない溶液（１×ＴＥ緩衝液）も同様に平板にスポットし、固定化の操作を行った。
実施例１０ ハイブリダイゼーション及びその検出
実施例９及び比較例５のλＤＮＡ固定化平板を９５℃に暖めた水中に１０分間浸し、４℃に冷やした水中に５分間浸した。次いで、λＤＮＡ固定化平板の核酸を固定化した部分に、実施例８に記載の１ｐｍｏｌビオチン化λＤＮＡ（Ｃ）を含むハイブリダイゼーション溶液（Ａｒｒａｙｉｔ ＵｎｉＨｙｂ（ＴｅｌｅＣＨｅｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）６０ｍｌをのせ、平板を水が浸入しないケース（ハイブリカセット）に入れてそのケースごとウォーターバスに沈め、６０℃で２時間加熱した。
以下、実施例８と同様にしてポストハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションの検出を行った。その結果を表５に示す。
表５の結果から明らかなように、ハイブリダイゼーションシグナルが特異的かつ明瞭に現れたことから、実施例９のλＤＮＡ断片固定化平板はλＤＮＡ断片が確実に平板上に固定化されていることがわかる。一方、比較例５のλＤＮＡ断片固定化平板には、シグナルはまったく現れなかった。さらに、実施例９のλＤＮＡ断片固定化平板及び比較例５のλＤＮＡ断片固定化平板のコントロールの位置（核酸を含まない溶液をスポットした箇所）にもシグナルはまったく現れなかった。
実施例１１ 核酸の平板への固定化
市販品のシリコンウェーハ（三菱住友シリコン株式会社製）の所定の位置に、実施例７に記載のλＤＮＡ溶液それぞれを、スポッター（Ｐｙｘｓｉｓ５５００ ＣＡＲＴＥＳＩＡＮ社製）を用いて３箇所づつスポットした。スポットの大きさは直径約０．３ｍｍであった。このシリコンウェーハを乾燥機に入れ、４２℃で２０分乾燥した。次にＵｖｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ ２４００（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）を用い、波長２８０ｎｍを含む紫外線を１６ｃｍの距離から１２００ｍＪ／ｃｍ２照射した。照射時間は４８０秒であった。その後、前記シリコンウェーハを水中で３０分間振とうして洗浄した後、乾燥させた。
一方、コントロールとして核酸を含まない溶液（１×ＴＥ緩衝液）も同様にシリコンウェーハにスポットし、固定化の操作を行った。
比較例６
実施例７記載のλＤＮＡ溶液（濃度１ｐｍｏｌ／μｌ）それぞれを、シリコンウェーハの所定の位置に、スポッター（Ｐｙｘｓｉｓ５５００ ＣＡＲＴＥＳＩＡＮ社製）を用いて３箇所づつスポットした。この平板を乾燥機に入れ４２℃で２０分乾燥した。その後、前記シリコンウェーハを水中で３０分間振とうして洗浄し、乾燥させた。
実施例１２ ハイブリダイゼーション及びその検出
実施例１１及び比較例６のλＤＮＡ固定化シリコンウェーハを９５℃に暖めた水中に１０分間浸し、４℃に冷やした水中に５分間浸した。次いで、λＤＮＡ固定化シリコンウェーハの核酸を固定化した部分に、実施例８に記載の１ｐｍｏｌビオチン化λＤＮＡ（Ｃ）を含むハイブリダイゼーション溶液（Ａｒｒａｙｉｔ ＵｎｉＨｙｂ（ＴｅｌｅＣＨｅｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）６０ｍｌをのせ、シリコンウェーハを水が浸入しないケース（ハイブリカセット）に入れてそのケースごとウォーターバスに沈め、６０℃で２時間加熱した。
以下、実施例８と同様にしてポストハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションの検出を行った。その結果を表６に示す。
表６の結果から明らかなように、ハイブリダイゼーションシグナルが特異的かつ明瞭に現れたことから、実施例１１のλＤＮＡ断片固定化シリコンウェーハはλＤＮＡ断片が確実にシリコンウェーハ上に固定化されていることがわかる。一方、比較例６のλＤＮＡ断片固定化シリコンウェーハには、シグナルはまったく現れなかった。さらに、実施例１１のλＤＮＡ断片固定化シリコンウェーハ及び比較例６のλＤＮＡ断片固定化シリコンウェーハのコントロールの位置（核酸を含まない溶液をスポットした箇所）にもシグナルはまったく現れなかった。
実施例１３ 核酸の平板への固定化
ガラス板に金蒸着させた基板の所定の位置に、実施例７に記載のλＤＮＡ溶液それぞれを、スポッター（Ｐｙｘｓｉｓ５５００ ＣＡＲＴＥＳＩＡＮ社製）を用いて３箇所づつスポットした。スポットの大きさは直径約０．３ｍｍであった。この金蒸着ガラス基板を乾燥機に入れ、４２℃で２０分乾燥した。次にＵｖｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ ２４００（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）を用い、波長２８０ｎｍを含む紫外線を１６ｃｍの距離から１２００ｍＪ／ｃｍ２照射した。照射時間は４８０秒であった。その後、前記金蒸着ガラス基板を水中で３０分間振とうして洗浄した後、乾燥させた。
一方、コントロールとして核酸を含まない溶液（１×ＴＥ緩衝液）も同様に金蒸着ガラス基板にスポットし、固定化の操作を行った。
比較例７
実施例７記載のλＤＮＡ溶液（濃度１ｐｍｏｌ／μｌ）それぞれを、金蒸着ガラス基板の所定の位置に、スポッター（Ｐｙｘｓｉｓ５５００ ＣＡＲＴＥＳＩＡＮ社製）を用いて３箇所づつスポットした。この平板を乾燥機に入れ４２℃で２０分乾燥した。その後、前記金蒸着ガラス基板を水中で３０分間振とうして洗浄し、乾燥させた。
実施例１４ ハイブリダイゼーション及びその検出
実施例１３及び比較例７のλＤＮＡ固定化金蒸着ガラス基板を９５℃に暖めた水中に１０分間浸し、４℃に冷やした水中に５分間浸した。次いで、λＤＮＡ固定化金蒸着ガラス基板の核酸を固定化した部分に、実施例８に記載の１ｐｍｏｌビオチン化λＤＮＡ（Ｃ）を含むハイブリダイゼーション溶液（Ａｒｒａｙｉｔ ＵｎｉＨｙｂ（ＴｅｌｅＣＨｅｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）６０ｍｌをのせ、金蒸着ガラス基板を水が浸入しないケース（ハイブリカセット）に入れてそのケースごとウォーターバスに沈め、６０℃で２時間加熱した。
以下、実施例８と同様にしてポストハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションの検出を行った。その結果を表７に示す。
表７の結果から明らかなように、ハイブリダイゼーションシグナルが特異的かつ明瞭に現れたことから、実施例１３のλＤＮＡ断片固定化金蒸着ガラス基板はλＤＮＡ断片が確実に金蒸着ガラス基板上に固定化されていることがわかる。一方、比較例７のλＤＮＡ断片固定化金蒸着ガラス基板には、シグナルはまったく現れなかった。さらに、実施例１３のλＤＮＡ断片固定化金蒸着ガラス基板及び比較例７のλＤＮＡ断片固定化金蒸着ガラス基板のコントロールの位置（核酸を含まない溶液をスポットした箇所）にもシグナルはまったく現れなかった。
実施例１５ 核酸の平板への固定化
市販の銅箔（日鉱金属加工株式会社製）の所定の位置に、実施例７に記載のλＤＮＡ溶液それぞれを、スポッター（Ｐｙｘｓｉｓ５５００ ＣＡＲＴＥＳＩＡＮ社製）を用いて３箇所づつスポットした。スポットの大きさは直径約０．３ｍｍであった。この銅箔を乾燥機に入れ、４２℃で２０分乾燥した。次にＵｖｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ ２４００（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）を用い、波長２５４ｎｍを含む紫外線を１６ｃｍの距離から１２００ｍＪ／ｃｍ２照射した。照射時間は４８０秒であった。その後、前記銅箔を水中で３０分間振とうして洗浄した後、乾燥させた。
一方、コントロールとして核酸を含まない溶液（１×ＴＥ緩衝液）も同様に銅箔にスポットし、固定化の操作を行った。
比較例８
実施例７記載のλＤＮＡ溶液（濃度１ｐｍｏｌ／μｌ）それぞれを、銅箔の所定の位置に、スポッター（Ｐｙｘｓｉｓ５５００ ＣＡＲＴＥＳＩＡＮ社製）を用いて３箇所づつスポットした。この銅箔を乾燥機に入れ４２℃で２０分乾燥した。その後、前記銅箔を水中で３０分間振とうして洗浄し、乾燥させた。
実施例１６ ハイブリダイゼーション及びその検出
実施例１５及び比較例８のλＤＮＡ固定化銅箔を９５℃に暖めた水中に１０分間浸し、４℃に冷やした水中に５分間浸した。次いで、λＤＮＡ固定化銅箔の核酸を固定化した部分に、実施例８に記載の１ｐｍｏｌビオチン化λＤＮＡ（Ｃ）を含むハイブリダイゼーション溶液（Ａｒｒａｙｉｔ ＵｎｉＨｙｂ（ＴｅｌｅＣＨｅｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）６０ｍｌをのせ、銅箔を水が浸入しないケース（ハイブリカセット）に入れてそのケースごとウォーターバスに沈め、６０℃で２時間加熱した。
以下、実施例８と同様にしてポストハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションの検出を行った。その結果を表８に示す。
表８の結果から明らかなように、ハイブリダイゼーションシグナルが特異的かつ明瞭に現れたことから、実施例１５のλＤＮＡ断片固定化銅箔はλＤＮＡ断片が確実に銅箔上に固定化されていることがわかる。一方、比較例８のλＤＮＡ断片固定化銅箔には、シグナルはまったく現れなかった。さらに、実施例１５のλＤＮＡ断片固定化金蒸着ガラス基板及び比較例８のλＤＮＡ断片固定化銅箔のコントロールの位置（核酸を含まない溶液をスポットした箇所）にもシグナルはまったく現れなかった。
実施例１７ 核酸の平板への固定化
市販の純ニッケル箔（日鉱金属加工株式会社製）の所定の位置に、実施例７に記載のλＤＮＡ溶液それぞれを、スポッター（Ｐｙｘｓｉｓ５５００ ＣＡＲＴＥＳＩＡＮ社製）を用いて３箇所づつスポットした。スポットの大きさは直径約０．３ｍｍであった。この純ニッケル箔を乾燥機に入れ、４２℃で２０分乾燥した。次にＵｖｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ ２４００（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）を用い、波長２８０ｎｍを含む紫外線を１６ｃｍの距離から１２００ｍＪ／ｃｍ２照射した。照射時間は４８０秒であった。その後、前記純ニッケル箔を水中で３０分間振とうして洗浄した後、乾燥させた。
一方、コントロールとして核酸を含まない溶液（１×ＴＥ緩衝液）も同様に純ニッケル箔にスポットし、固定化の操作を行った。
比較例９
実施例７記載のλＤＮＡ溶液（濃度１ｐｍｏｌ／μｌ）それぞれを、純ニッケル箔の所定の位置に、スポッター（Ｐｙｘｓｉｓ５５００ ＣＡＲＴＥＳＩＡＮ社製）を用いて３箇所づつスポットした。この純ニッケル箔を乾燥機に入れ４２℃で２０分乾燥した。その後、前記純ニッケル箔を水中で３０分間振とうして洗浄し、乾燥させた。
実施例１８ ハイブリダイゼーション及びその検出
実施例１７及び比較例９のλＤＮＡ固定化純ニッケル箔を９５℃に暖めた水中に１０分間浸し、４℃に冷やした水中に５分間浸した。次いで、λＤＮＡ固定化純ニッケル箔の核酸を固定化した部分に、実施例８に記載の１ｐｍｏｌビオチン化λＤＮＡ（Ｃ）を含むハイブリダイゼーション溶液（Ａｒｒａｙｉｔ ＵｎｉＨｙｂ（ＴｅｌｅＣＨｅｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）６０ｍｌをのせ、純ニッケル箔を水が浸入しないケース（ハイブリカセット）に入れてそのケースごとウォーターバスに沈め、６０℃で２時間加熱した。
以下、実施例８と同様にしてポストハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションの検出を行った。その結果を表９に示す。
表９の結果から明らかなように、ハイブリダイゼーションシグナルが特異的かつ明瞭に現れたことから、実施例１７のλＤＮＡ断片固定化銅箔はλＤＮＡ断片が確実に純ニッケル箔上に固定化されていることがわかる。一方、比較例９のλＤＮＡ断片固定化純ニッケル箔には、シグナルはまったく現れなかった。さらに、実施例１７のλＤＮＡ断片固定化純ニッケル箔及び比較例９のλＤＮＡ断片固定化純ニッケル箔のコントロールの位置（核酸を含まない溶液をスポットした箇所）にもシグナルはまったく現れなかった。
【実施例１９】
常法に従い、オリゴヌクレオチド合成機（Ｐｅｒｋｉｎ−ｅｌｍｅｒ Ａｐｐｌｉｅｄ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、配列番号９、１０及び１１に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（２６ｍｅｒ）を合成した。尚、配列番号９に示すオリゴヌクレオチドは、５’末端をビオチン化した。また、配列番号９及び１０に示すオリゴヌクレオチドは、実施例１に記載の配列番号１及び２に示すオリゴヌクレオチドの５’末端に５個のチミジンが連結した配列を有している。配列番号１１に示すオリゴヌクレオチドは、配列番号５に示すオリゴヌクレオチドと１塩基配列が異なるため相補性を持っていない。すなわち、これらのオリゴヌクレオチドは、実施例３の配列番号４、５及び６のオリゴヌクレオチドの５’末端のチミジンを５個に減らしたものである。
上記オリゴヌクレオチドを、実施例３と同様にして市販品のステンレス製の平板（特殊金属工業株式会社製）に固定化した。以下、実施例２と同様にしてポストハイブリダイゼーション、及び平板に固定化されたオリゴヌクレオチドならびにハイブリダイゼーションの検出を行った。
比較例１０
実施例１９に記載のオリゴヌクレオチド溶液を用いた他は、比較例２と同様にして、ステンレス製の平板に各々のオリゴヌクレオチドを固定化した。
【実施例２０】
実施例１９及び比較例１０のオリゴヌクレオチド固定化平板の核酸を固定化した部分に、３ｐｍｏｌビオチン化プローブ（２６２ｂｐ）を含むハイブリダイゼーション溶液（Ａｒｒａｙｉｔ ＵｎｉＨｙｂ（ＴｅｌｅＣＨｅｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）６０ｍｌをのせ、平板を水が浸入しないケース（ハイブリカセット）に入れてそのケースごとウォーターバスに沈め、４５℃で２時間加熱した。
以下、実施例２と同様にしてポストハイブリダイゼーション、及び平板に固定化されたオリゴヌクレオチドならびにハイブリダイゼーションの検出を行った。その結果を、表１０に示す。配列番号９のオリゴヌクレオチドを固定化した位置のシグナルは固定化されたオリゴヌクレオチドの量を、配列番号１０のオリゴヌクレオチドを固定化した位置のシグナルはハイブリダイゼーションの強度を、それぞれ示す。
【産業上の利用の可能性】
本発明の方法により、生体分子、例えば核酸、特に鎖長の短い核酸を、金属製担体に簡便、かつ、効率よく固定することができる。また、担体表面のコーティングが不要であるため、金属製の電極等に直接生体分子を固定化することができる。
【配列表】
【図１】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体分子を担体に固定化する方法であって、生体分子の溶液を担体上にスポットする工程と、前記生体分子溶液をスポットした担体に波長２８０ｎｍの成分を含む紫外線を照射する工程を含み、前記担体は金属であることを特徴とする方法。
【請求項２】
前記紫外線が、波長２２０〜３００ｎｍの成分を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記金属は、周期律表第２周期〜第７周期のＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ族および遷移元素から選ばれる金属、又は同金属を含む合金である請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記紫外線の照射量は１００ｍＪ／ｃｍ２以上である請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記生体分子は核酸、タンパク質、糖、抗原、抗体、ペプチド、酵素から選ばれる請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
生体分子が担体上に固定化された生体分子固定化担体の製造法であって、生体分子の溶液を担体上にスポットする工程と、前記生体分子溶液をスポットした担体に波長２８０ｎｍの成分を含む紫外線を照射し、前記生体分子を担体に固定化する工程を含む方法。
【請求項７】
前記紫外線が、波長２２０〜３００ｎｍの成分を含むことを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記生体分子は核酸であって、核酸固定化担体はハイブリダイゼーションによる核酸の分析に用いられるものである請求項６に記載の方法。
【請求項１】
生体分子を担体に固定化する方法であって、生体分子の溶液を担体上にスポットする工程と、前記生体分子溶液をスポットした担体に波長２８０ｎｍの成分を含む紫外線を照射する工程を含み、前記担体は金属であることを特徴とする方法。
【請求項２】
前記紫外線が、波長２２０〜３００ｎｍの成分を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記金属は、周期律表第２周期〜第７周期のＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ族および遷移元素から選ばれる金属、又は同金属を含む合金である請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記紫外線の照射量は１００ｍＪ／ｃｍ２以上である請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記生体分子は核酸、タンパク質、糖、抗原、抗体、ペプチド、酵素から選ばれる請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
生体分子が担体上に固定化された生体分子固定化担体の製造法であって、生体分子の溶液を担体上にスポットする工程と、前記生体分子溶液をスポットした担体に波長２８０ｎｍの成分を含む紫外線を照射し、前記生体分子を担体に固定化する工程を含む方法。
【請求項７】
前記紫外線が、波長２２０〜３００ｎｍの成分を含むことを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記生体分子は核酸であって、核酸固定化担体はハイブリダイゼーションによる核酸の分析に用いられるものである請求項６に記載の方法。
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０４８９７３
【国際公開日】平成１６年６月１０日（２００４．６．１０）
【発行日】平成１８年３月２３日（２００６．３．２３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５５５０３３（Ｐ２００４−５５５０３３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００３／０１５０１０
【国際出願日】平成１５年１１月２５日（２００３．１１．２５）
【出願人】（０００００４３７４）日清紡績株式会社 (370)
【国際公開日】平成１６年６月１０日（２００４．６．１０）
【発行日】平成１８年３月２３日（２００６．３．２３）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００３／０１５０１０
【国際出願日】平成１５年１１月２５日（２００３．１１．２５）
【出願人】（０００００４３７４）日清紡績株式会社 (370)
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