生体分子固定化基板、生体分子輸送基板及びバイオチップ
【課題】基板上に固定化する生体分子の位置や密度、パターン化、配列化を高度に制御でき、固定化した生体分子の流動性及び安定性が高く、該生体分子の生理機能が失活するおそれが低く、生産性が高い生体分子固定化基板及び生体分子輸送基板、並びにバイオチップの提供を目的とする。
【解決手段】基板本体１１上に脂質二分子膜１２が形成され、脂質二分子膜１２に生体分子１３が固定化されている生体分子固定化基板１。また、基板本体上に親水部と疎水部からなる所定のパターンが形成されており、前記親水部表面に、生体分子が固定化された脂質二分子膜を自発展開させる生体分子輸送基板。また、生体分子固定化基板１又は生体分子輸送基板を用いたバイオチップ。
【解決手段】基板本体１１上に脂質二分子膜１２が形成され、脂質二分子膜１２に生体分子１３が固定化されている生体分子固定化基板１。また、基板本体上に親水部と疎水部からなる所定のパターンが形成されており、前記親水部表面に、生体分子が固定化された脂質二分子膜を自発展開させる生体分子輸送基板。また、生体分子固定化基板１又は生体分子輸送基板を用いたバイオチップ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体分子固定化基板、生体分子輸送基板及びバイオチップに関する。
【背景技術】
【０００２】
固体基板上に、生体分子を二次元的に配列して固定化したバイオチップは、医療診断、環境センシング、ナノバイオオプティクス・エレクトロニクスなどの幅広い分野における基盤素子として期待されている。特に、バイオ・環境センシング素子や医薬品開発においては、基板上に特定多数の生体分子を所望のパターンで固定化し、生体分子の種類や濃度、あるいは生体分子間の相互作用（活性検出、分子認識など。）をハイスループットで調査、診断できるバイオチップは、多大な市場価値をもたらすと期待されている。
【０００３】
また、これらの産業分野だけでなく、酵素、抗体をはじめとするタンパク質やＤＮＡなどの機能性生体分子を、非破壊で安定して基板上に固定化する方法は、生体組織内で起こる生体分子間の反応機構を解明する基礎研究分野においても重要である。
生体組織は、細胞内で、タンパク質同士の相互作用や、イオン、電子、化学物質などの信号の伝達により、情報交換を行うことで生体機能を発現する。生体組織における生理学的な機構を解明する場合、細胞内のような多数の生体分子が存在する複雑系を用いると、分子レベルでの生体分子間の相互作用や信号伝達の解析は非常に難解となる。そのため、特定の生体分子を基板上に固定化し、簡略化した生体モデルを構築することで、各生体分子の相互作用や情報伝達機構、あるいは構造変化などの時間的変動を簡便に追跡できるバイオチップの開発が求められている。
【０００４】
特にタンパク質などの生体分子を基板上に固定化する方法としては、ビオチン−ストレプトアビジン間の特異的な結合を利用する方法が広く用いられている（非特許文献１）。該方法では、一般的に、末端を修飾したビオチン分子を基板上に固定化し、該ビオチン分子に、ビオチンを特異的に認識するストレプトアビジンを結合させ、該ストレプトアビジンに、ビオチン化されたタンパク質を結合させる方法が用いられる。
また、自己組織化膜を形成した基板やレジストを塗布した基板に、紫外線を照射してパターンを描画し、該パターン上にビオチン−ストレプトアビジン結合を介してタンパク質を固定化する、タンパク質のパターンニング方法が知られている（非特許文献２、３）。
ビオチン−ストレプトアビジン結合を利用する方法では、タンパク質を、活性を保ったまま基板上に固定化できる。具体的には、アルカンチオールを脂質部分に有するビオチン脂質を金表面に結合させ、ストレプトアビジン、ビオチン標識したａｎｔｉ−ＨＣＧ（human chorionic gonadotropin）−Ｆａｂフラグメント、及びＨＣＧを順に結合させた場合に、固定化したタンパク質の分子認識能が保持されていることが表面プラズモン共鳴測定により確認されている（非特許文献４）。
しかし、該方法は、基板に結合するためのビオチン分子の末端修飾や、タンパク質の末端をビオチン化する修飾が必要であるため、その反応収率、時間的効率を考慮すると、バイオチップの大量生産には不向きである。
【０００５】
また、基板上にタンパク質を固定化する方法としては、ビオチン−ストレプトアビジン結合を利用する方法以外に、有機分子の自己組織化膜を用いる方法がある。例えば、下記に示す方法が挙げられる。
金基板上に、３−メルカプトプロピオン酸や１１−メルカプトウンデカン酸などの自己組織化膜を形成する。次いで、該自己組織化膜の上側に位置する末端のカルボキシ基に、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノ）プロピルカルボジイミドを触媒として、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドをカップリングする。次いで、該自己組織化膜の最表面にあるスクシンイミド基と、タンパク質のアミノ酸末端（Ｎ末端）とを選択的に結合させ、タンパク質を基板上に固定化する（非特許文献５）。
しかし、該方法は、一般に末端がチオール化された化合物を用いる必要があるため、金基板のような特定の基板上にしかタンパク質を固定化することができない。また、最終的にタンパク質を結合するには、基板の前処理として、数種のスペーサー分子を結合させる必要があり、反応プロセスが多段階にわたるため工程が煩雑になる。また、反応が多段階になるほど、基板上にタンパク質を固定化する効率が低くなる。
【０００６】
その他、基板上にタンパク質を化学的に固定化したり、パターンニングしたりする方法が知られている。具体的には、タンパク質を、スペーサー分子を介した共有結合により、基板上に強固に固定化する方法が挙げられる（非特許文献６）。
しかし、生体分子は本来流動性のある媒質中で活動しているのに対し、該方法はスペーサー分子により生体分子を基板上に強固に固定するため、生体分子の流動性が失われる。また、スペーサー分子と共有結合することで、生体分子自体の構造が変化する可能性があるため、固定化により生体分子本来の機能や活動が制限され、生理機能が損なわれるおそれがある。
【０００７】
固定化する生体分子の生理機能が損なわれることを抑制する方法としては、タンパク質を金基板上に固定化し、該タンパク質の周囲をチオール化脂質分子の自己組織化膜で被覆することで、基板上に擬似的な細胞膜構造を形成する方法が示されている（非特許文献７）。該方法では、タンパク質が脂質分子で包囲されているため、比較的生理条件に近い状態で生体分子を基板上に固定化できる。
しかし、該方法でバイオチップを作製すると、脂質分子が金−チオール結合により基板に強く結合され、形成される脂質膜に柔軟性がなくなるため、該脂質膜の機能が時間とともに低下するおそれがある。また、タンパク質も直接基板に担持されるため、基板との相互作用が強く、タンパク質本来の構造や機能を保持したまま長時間安定して固定化できない可能性がある。そのため、このような方法は、長期保存やバイオチップの用途としては信頼性が低い。
【０００８】
以上のように、バイオセンサやバイオチップ等への適用が検討されている従来の生体分子固定化基板は、生体分子の固定化手法が煩雑なために生産性が低く、固定化する基板が限定されるうえ、固定化した生体分子の流動性及び安定性が低くなり、該生体分子の生理機能が失活するおそれがある。また、従来の生体分子固定化基板では、生体分子の流動性が低いため、基板上で生体分子を移動させ、所望の位置に輸送することはできない。さらに、基板上に固定化する生体分子の位置や密度、パターン化や配列化の制御はまだまだ不充分であり、それらの制御のさらなる向上が望まれている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】V. H. Perez-Lunら、「ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティ（Journal of American Chemical Society）」、第１２１巻、１９９９年、第６４６９−６４７８頁
【非特許文献２】J. Dohら、「ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティ（Journal of American Chemical Society）」、第１２６巻、２００４年、第９１７０−９１７１頁
【非特許文献３】K. L. Christmanら、「ラングミュア（Langmuir）」、第２２巻、２００６年、第７４４１−７４５０頁
【非特許文献４】W. Mullerら、「サイエンス（Science）」、第２６２巻、１９９３年、第１７０６−１７０８頁
【非特許文献５】M. Veisehら、「ラングミュア（Langmuir）」、第１８巻、２００２年、第６６７１−６６７８頁
【非特許文献６】A. S. Blawasら、「バイオマテリアルズ（Biomaterials）」、第１９巻、１９９８年、第５９５−６０９頁
【非特許文献７】D. A. Cisnerosら、「アンゲヴァンテ・ ケミィ・インターナショナル・エディション（Angewandte Chemie International Edition）」、第４５巻、２００６年、第３２５２−３２５６頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、基板上に固定化する生体分子の位置や密度、パターン化、配列化を高度に制御でき、固定化した生体分子の流動性及び安定性が高く、該生体分子の生理機能が失活するおそれが低く、生産性が高い生体分子固定化基板、及び基板上の所望の位置に生体分子を輸送できる生体分子輸送基板、並びにそれらを用いたバイオチップの提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、前記課題を解決するために以下の構成を採用した。
［１］基板本体上に脂質二分子膜が形成され、該脂質二分子膜に生体分子が固定化されていることを特徴とする生体分子固定化基板。
［２］前記脂質二分子膜が、ヒスチジン残基と結合するニッケル錯体部位を有するニッケル錯体脂質分子を含み、前記生体分子がヒスチジン残基を有しており、前記ニッケル錯体脂質分子のニッケル錯体部位と、前記生体分子のヒスチジン残基の結合により該生体分子が固定化されている、前記［１］に記載の生体分子固定化基板。
［３］前記生体分子が、抗原、抗体、酵素、膜タンパク質、受容体型タンパク質、蛍光タンパク質、細胞骨格、モータータンパク質からなる群から選ばれる少なくとも１種の機能性タンパク質であり、かつ該機能性タンパク質の末端がヒスチジンタグ化されている、前記［２］に記載の生体分子固定化基板。
［４］前記脂質二分子膜が、前記ニッケル錯体脂質分子により形成されたドメイン領域、及びニッケル錯体部位を有さない脂質分子により形成されたドメイン領域からなる脂質二分子膜である、前記［２］又は［３］に記載の生体分子固定化基板。
［５］前記脂質二分子膜中に前記ニッケル錯体脂質分子が均一に分散している、前記［２］〜［４］のいずれかに記載の生体分子固定化基板。
［６］基板本体上に脂質二分子膜が形成され、該脂質二分子膜に生体分子が固定化された基板であって、前記基板本体上に親水部と疎水部からなる所定のパターンが形成されており、前記脂質二分子膜が、前記親水部表面に、生体分子が固定化された脂質二分子膜を自発展開させて形成されることを特徴とする生体分子輸送基板。
［７］前記［１］〜［５］に記載の生体分子固定化基板又は前記［６］に記載の生体分子輸送基板を用いたバイオチップ。
［８］多検体の生体分子をハイスループットスクリーニング検出するバイオチップであって、種類及び／又は濃度の異なる複数の生体分子が、脂質二分子膜に固定化され、前記基板本体上の所定の位置に配置された、前記［７］に記載のバイオチップ。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の生体分子固定化基板は、基板上に固定化する生体分子の位置や密度、パターン化、配列化を高度に制御できる。また、固定化した生体分子の流動性及び安定性が高く、該生体分子の生理機能が失活するおそれが低く、生産性も高い。
本発明の生体分子輸送基板は、さらに基板上の所望の位置に生体分子を輸送できる。
また、本発明は、前記生体分子固定化基板又は生体分子輸送基板を用いたバイオチップを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明の生体分子固定化基板の実施形態の一例を示した概念図である。
【図２】図１の生体分子固定化基板におけるニッケル錯体脂質分子（ａ）及び飽和脂質分子（ｂ）を示した図である。
【図３】本発明の生体分子固定化基板における脂質二分子膜のパターン化の例を示した概念図である。
【図４】基板本体上にパターン化した脂質二分子膜を形成する方法の一工程を示した部分断面図である。
【図５】基板本体上に生体分子を所定のパターンで固定化する方法の一工程を示した部分断面図である。
【図６】本発明の生体分子固定化基板の他の実施形態例を示した概念図（ａ）、及び該基板に用いる不飽和脂質分子を示した図である。
【図７】本発明の生体分子輸送基板における脂質二分子膜の自発展開の様子を示した斜視図（ａ）、及びその領域Ｘの拡大図（ｂ）である。
【図８】本発明のバイオチップの実施形態の一例を示した斜視図である。
【図９】実施例１〜３における脂質二分子膜のＡＦＭ像及び該ＡＦＭ像中の直線部分の脂質二分子膜の高さ情報である。
【図１０】実施例１〜３における基板のレーザー蛍光顕微鏡による蛍光像である。
【図１１】実施例４及び比較例１における基板のレーザー蛍光顕微鏡による蛍光像である。
【図１２】実施例５の生体分子輸送基板における脂質二分子膜の自発展開を観察した蛍光像である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
＜生体分子固定化基板＞
本発明の生体分子固定化基板は、基板本体上に脂質二分子膜が形成され、該脂質二分子膜に生体分子が固定化されていることを特徴とする。
【００１５】
基板本体としては、安定に脂質二分子膜を形成できる親水性の基板が好ましく、例えば、ガラス、石英、シリコン、サファイア、マイカ（雲母）などからなる基板を用いることができる。また、疎水性の基板の表面に、化学洗浄、分子修飾などの処理を施し、表面を親水化したものを用いてもよい。
基板本体は、膜厚４〜５ｎｍ程度の脂質二分子膜を形成することが容易な点から、ナノメートルスケールの平坦性を有するものが好ましい。
基板本体の厚さは、０．１〜２０ｍｍが好ましい。
【００１６】
本発明における脂質二分子膜とは、基板に支持された（人工）脂質二分子膜である。脂質二分子膜は、両親媒性分子であるリン脂質などの脂質分子が二層構造を形成した膜であり、生体膜の最も基本的な構造である。
脂質分子おいては、各脂質の疎水部のアシル鎖長、アシル鎖内の二重結合の有無、さらにその二重結合の部位と数は特に限定されない。本明細書中では、アシル鎖中に二重結合部位を含まない脂質分子を飽和脂質分子、アシル鎖中に二重結合部位を含む脂質分子を不飽和脂質分子という。
脂質分子の種類としては、例えば、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジルイノシトールホスフェイト（ＰＩＰ）、ホスファチジン酸（ＰＡ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、スフィンゴ脂質などが挙げられる。これら脂質分子は、１種類のみを使用してもよく、２種類以上を併用してもよい。
【００１７】
本発明の生体分子固定化基板における脂質二分子膜は、ニッケル錯体脂質分子を含むことが好ましい。すなわち、脂質二分子膜への生体分子の固定化は、ニッケル錯体脂質分子を用いて行うことが好ましい。ニッケル錯体脂質分子とは、ヒスチジン残基と結合するニッケル錯体部位を有する脂質分子である。ニッケル錯体部位は、ヒスチジン残基を有する分子と特異的に相互作用（配位結合）するため、末端にヒスチジン残基を有する生体分子を脂質二分子膜表面に選択的に固定化できる。ニッケル錯体部位としては、ニトリロ三酢酸とニッケルの錯体が挙げられる。
基板本体上に、ニッケル錯体脂質分子を含む脂質二分子膜を形成させ、該脂質二分子膜に、末端にヒスチジン残基を有する生体分子を作用させることで、該ニッケル錯体部位と生体分子のヒスチジン残基の結合により生体分子が固定化される。
【００１８】
脂質二分子膜に固定化する生体分子は、当該生体分子との間に何らかの相互作用（化学結合の形成、吸着など。）を生じ得る特異結合物質が存在する生体由来の分子であり、末端にヒスチジン残基を有する。すなわち、検体となる試料中の目的物質や候補目的物質（生体に由来するタンパク質、ペプチド、低分子化合物など。）と特異的に結合または吸着でき、かつ末端にヒスチジン残基を有する分子である。
【００１９】
生体分子としては、生体分子間の特異的な相互作用を活かしたバイオチップを開発できる点から、末端がヒスチジンタグ化された機能性タンパク質が好ましい。
機能性タンパク質としては、抗原、抗体、酵素、膜タンパク質、受容体型タンパク質、蛍光タンパク質、細胞骨格及びモータータンパク質からなる群から選択される少なくとも１種が好ましい。
ただし、生体分子は、特異的に相互作用する特異結合物質が存在し、末端にヒスチジン残基を有するものであれば、ヒスチジンタグ化された機能性タンパク質には限定されない。例えば、ヒスチジンタグ化された糖鎖化合物、ＤＮＡ、ＲＮＡなどを用いることもできる。
【００２０】
ヒスチジンタグは、３〜１０個のヒスチジン残基が連なるヒスチジン連鎖が好ましい。ヒスチジン残基が３個以上であれば、ニッケル錯体部位との結合の安定性が向上する。また、ヒスチジン残基が１０個以下であれば、分子内での立体障害が生じにくい。
また、ニッケル錯体部位とヒスチジン残基の配位結合は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などのキレート剤を添加することで解離できる。そのため、脂質二分子膜上に固定化した生体分子は自由に脱離させることができるので、脂質二分子膜を形成した基板は再利用が可能である。
【００２１】
このように、ニッケル錯体脂質分子と末端にヒスチジン残基を有する生体分子を用いることにより、脂質二分子膜に生体分子を固定化できる。脂質二分子膜は、ニッケル錯体脂質分子のみからなる膜であってもよく、ニッケル錯体脂質分子と他の脂質分子からなる膜であってもよい。ここで、他の脂質分子とは、ニッケル錯体部位を有さない飽和脂質分子又は不飽和脂質分子である。本発明の生体分子固定化基板では、ニッケル錯体脂質分子と、他の脂質分子を混合して脂質二分子膜中のニッケル錯体脂質分子の分布を制御することで、基板に固定化する生体分子の分布を制御できる。
具体的には、脂質二分子膜中に、ニッケル錯体脂質分子からなるドメイン領域と、他の脂質分子からなるドメイン領域とを形成させ、ニッケル錯体脂質分子を基板上で相分離させることで、基板上で生体分子を局在化させることができる。また、脂質二分子膜中でニッケル錯体分子と他の脂質分子を共に均一に分散させることで、基板上に生体分子を均一に固定化できる。
【００２２】
以下、本発明の生体分子固定化基板の実施形態の一例を示して詳細に説明する。
（第１実施形態）
本実施形態の生体分子固定化基板１は、図１に示すように、基板本体１１と、基板本体１１上に形成された脂質二分子膜１２と、脂質二分子膜１２に固定化された生体分子１３とを有している。
【００２３】
基板本体１１は、平板状の基板であり、ナノメートルスケールの平坦な表面を有する。
脂質二分子膜１２は、不飽和型のニッケル錯体脂質分子１４と、飽和脂質分子１５からなる。
本実施形態のニッケル錯体脂質分子１４は、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−［（Ｎ−（５−アミノ−１−カルボキシペンチル）イミノジアセティックアシッド）スクシニル］（ニッケル塩）（1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiaceticacid)succinyl] (Nickel salt)）である。ニッケル錯体脂質分子１４は、図２（ａ）に示すように、二重結合を含むアシル鎖からなる疎水部１４ａと、疎水部１４ａと結合している親水部１４ｂと、親水部１４ｂに結合しているニッケル錯体部１４ｃとからなる。ニッケル錯体脂質分子１４のゲル−液晶相転移温度は−２０℃である。
飽和脂質分子１５は、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−フォスフォコリン（1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine、ＤＳＰＣ）である。飽和脂質分子１５は、図２（ｂ）に示すように、直鎖状のアシル鎖からなる疎水部１５ａと、疎水部１５ａと結合している親水部１５ｂとからなる。飽和脂質分子１５のゲル−液晶相転移温度は５５℃である。
生体分子１３は、末端にヒスチジンタグ１３ａを有している。
【００２４】
生体基板固定化基板１では、不飽和型のニッケル錯体脂質分子１４と飽和脂質分子１５の混合脂質を用いることで、ニッケル錯体脂質分子１４と飽和脂質分子１５が相分離した脂質二分子膜１２が形成される。このように脂質分子が相分離してドメイン領域が形成されるのは、ニッケル錯体脂質分子１４と飽和脂質分子１５の流動性が異なるためである（L. J. Johnston、「ラングミュア（Langmuir）」、第２３巻、２００７年、第５８８６−５８９５頁）。
このドメイン領域を有する脂質二分子膜の構造は、多くの場合、アシル鎖同士の疎水性相互作用が強い飽和脂質分子（飽和脂質分子１５）が密に集合したドメイン領域を形成し、その周囲を流動性の高い不飽和脂質分子（ニッケル錯体脂質分子１４）が取り囲む相分離構造となる。ドメイン領域の大きさは、脂質二分子膜を形成する際、用いる各脂質分子のゲル−液晶相転移温度を考慮した最適な温度で熱処理を行うことで適宜変化させることができる。熱処理温度、熱処理時間、室温までの降温速度等がドメイン領域の大きさを決定する重要なパラメータとなる。また、ドメイン領域の大きさは、用いる各脂質分子のモル比を調節することによっても調節できる。
【００２５】
生体分子１３は、ヒスチジンタグ１３ａとニッケル錯体脂質分子１４のニッケル錯体部位１４ｃが結合することで、脂質二分子膜１２中のニッケル錯体脂質分子１４上に選択的に固定化される。
生体分子固定化基板１では、脂質二分子膜１２中のニッケル錯体脂質分子１４のドメイン領域の大きさを調節することで、生体分子１３を自由に高密度化したり局在化させたりできる。また、生体分子１３は末端にヒスチジン残基を有するので、生体分子１３を脂質二分子膜１２上に配向を揃えて固定化できる。
【００２６】
生体分子固定化基板１は、以下に示す方法で製造できる。
基板本体１１上に脂質二分子膜１２を形成する方法としては、緩衝液内に作製した脂質ベシクルを基板本体１１上に展開し、該脂質ベシクルが基板本体１１表面に衝突することで脂質二分子膜を形成させるベシクルフュージョン法が好ましい。ベシクルフュージョン法によれば、基板本体１１上に膜厚４〜５ｎｍ程度の脂質二分子膜１２の単分子膜を容易に形成できる。ただし、基板本体１１上に脂質二分子膜１２を形成する方法は、ベシクルフュージョン法には限定されず、基板本体１１上に安定して脂質二分子膜１２を形成できる方法であれば、公知のいずれの方法を適用してもよい。
生体分子１３を固定化する方法としては、生体分子を含む緩衝液を脂質二分子膜１２上に添加し、３０分〜数時間、室温で静置した後、緩衝液を滴下して上澄み液を取り除く処理を繰り返して洗浄し、未固定の生体分子１３を除去する方法が好ましい。
また、生体分子固定化基板１に固定化した生体分子１３は、ＥＤＴＡなどのキレート剤を添加することで脱離させることができ、脂質二分子膜１２を有する基板は再利用できる。
【００２７】
生体分子固定化基板１は、脂質二分子膜１２中のニッケル錯体脂質分子１４からなるドメイン領域１４Ａと飽和脂質分子１５からなるドメイン領域１５Ａを所定のパターンで形成し、生体分子１４を所定のパターンでより精密に制御して固定化できる。例えば、図３し示す（ａ）〜（ｆ）のパターンが挙げられる。
（ａ）円形状のドメイン領域１５Ｂと、基板１上のドメイン領域１５Ｂの周りを占めるドメイン領域１５Ａとが形成されるパターン。
（ｂ）長方形状のドメイン領域１５Ａとドメイン領域１５Ｂが、基板１を半分に分割するように形成されるパターン。
（ｃ）２つのドメイン領域１５Ａと２つのドメイン領域１５Ｂとを交互に、基板１を四分割するように配置されるパターン。
（ｄ）基板１の中心に円形状のドメイン領域１５Ｂが形成され、その周りに輪形状のドメイン領域１５Ａとドメイン領域１５Ｂが交互に２つずつ形成され、さらにその周囲の残りの領域にドメイン領域Ａが形成されているパターン。
（ｅ）複数のドメイン領域１５Ａとドメイン領域１５Ｂを交互に縞状に形成されるパターン。
（ｆ）ドメイン領域１５Ａとドメイン領域１５Ｂを交互に碁盤目状に形成されるパターン。
【００２８】
図３（ａ）〜（ｆ）に例示したようなパターンの脂質二分子膜１２を形成する方法としては、例えば、下記工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）を有する方法が挙げられる。
（ｉ）基板本体１１表面にリソグラフィー技術で微細加工を施し、図４（ａ）に示すように、所望の形状の凹凸パターンを描画した基板本体１１Ａを得る。このとき、凸部上にレジスト薄膜１６を残存させる。
（ｉｉ）飽和脂質分子１５を基板本体１１Ａ上に展開し、図４（ｂ）に示すように、基板本体１１Ａの凹部に飽和脂質分子１５からなる脂質二分子膜を形成する。
（ｉｉｉ）図４（ｃ）に示すように、凸部上のレジスト薄膜１６を除去し、ニッケル錯体脂質分子１４を基板本体１１Ａ上に展開して、図４（ｄ）に示すように、基板本体１１Ａの凸部にニッケル錯体脂質分子１４からなる脂質二分子膜を形成する。
【００２９】
工程（ｉ）：
基板本体１１表面への凹凸パターンの形成は、公知のリソグラフィー技術が適用できる。該凹凸パターンの大きさは、通常のリソグラフィー技術によれば、幅、深さ共に数１０ｎｍ〜数ｍｍの範囲で幅広く制御できる。凹部及び凸部の幅は、バイオチップの高密度化を考慮すると、１０ｎｍ〜１μｍが好ましい。また、凹部の深さ（凸部の高さ）は、同様の理由から、１０ｎｍ〜１００ｎｍが好ましい。
【００３０】
工程（ｉｉ）：
飽和脂質分子１５は、ベシクルフュージョン法により基板本体１１Ａ上に展開する。脂質分子はレジスト薄膜１６上には吸着しない。基板本体１１Ａ上に飽和脂質分子１５を展開した後、６０〜８０℃の温度で熱処理を施すことにより、凹部のみで飽和脂質分子１５からなる安定な脂質二分子膜が形成される。
【００３１】
工程（ｉｉｉ）：
凸部上に残存するレジスト薄膜１６を紫外線照射により除去し、緩衝液で基板上を繰り返し洗浄する。ニッケル錯体脂質分子１４をベシクルフュージョン法で基板本体１１Ａ上に展開する。ニッケル錯体脂質分子１４は、飽和脂質分子１５が膜形成していない凸部上に堆積し、脂質二分子膜を形成する。
凹部では飽和脂質分子１５が最密充填構造の密な脂質二分子膜を形成しており、該脂質二分子膜にニッケル錯体脂質分子１４が混入することはほとんどないと考えられる。飽和脂質分子１５の脂質二分子膜上に、ニッケル錯体脂質分子１４の脂質二分子膜が積層することも考えられるが、その場合は緩衝液で繰り返し洗浄することで積層膜を容易に除去できる。
【００３２】
前記工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）によるパターン形成方法では、基板本体１１としてガラス基板や金属基板などを用いる場合、ニッケル錯体脂質分子１４と飽和脂質分子１５で基板表面全体を被覆することが好ましい。ガラス基板や金属基板の表面には生体分子１４が吸着しやすい。そのため、それらの基板の表面が露出していると、ニッケル錯体脂質分子１４以外の場所でも生体分子１３が固定化され、所望のパターンで選択的に生体分子１３を固定化することが困難になる。
また、生体分子固定化基板１においては、工程（ｉｉ）において、飽和脂質分子１５の代わりにニッケル錯体脂質分子１４を用いて凹部に脂質二分子膜を形成させ、工程（ｉｉｉ）において、ニッケル錯体脂質分子１４の代わりに飽和脂質分子１５を用いて脂質二分子膜を形成させてもよい。
【００３３】
前記工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）の後、基板本体１１Ａ上の所定のパターンの脂質二分子膜１２に、生体分子１３を作用させることで、図５に示すように、生体分子１３を基板本体１１Ａ上に所定のパターンで固定化できる。
このように、ニッケル錯体脂質分子１４と飽和脂質分子１５のドメイン領域を所定のパターンで形成した生体分子固定化基板１は、高効率、高密度で生体分子１３を固定化できるため、バイオチップとして好適である。さらに、ナノスケールでパターン化された生体分子固定化基板１を用いれば、図３（ａ）〜（ｆ）に例示したようなパターンで生体分子１３を配列させて固定化したり、分子レベルで孤立させて固定化したりすることもできる。このような基板は、分子レベルでの生体分子間の反応メカニズムを解析する基板材料として有用である。
なお、該方法を用いれば、ニッケル錯体脂質分子１４と飽和脂質分子１５のような、飽和脂質分子と不飽和脂質分子の組み合わせを用いなくても、図３（ａ）〜（ｆ）に例示したようなパターン化が可能である。例えば、不飽和型のニッケル錯体脂質分子と不飽和脂質分子の組み合わせであっても、前記工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）を行うことにより所定のパターンで脂質二分子膜を形成し、そのパターンで生体分子を固定化できる。
【００３４】
（第２実施形態）
本実施形態の生体分子固定化基板２は、図６（ａ）に示すように、基板本体２１と、基板本体２１上に形成された脂質二分子膜２２と、脂質二分子膜２２に固定化された生体分子２３とを有している。
基板本体２１は、平板状の基板であり、ナノメートルスケールの平坦な表面を有する。
脂質二分子膜２２は、不飽和型のニッケル錯体脂質分子２４と、不飽和脂質分子２５からなる。
ニッケル錯体脂質分子２４は、第１実施形態のニッケル錯体脂質分子１４と同じである。
不飽和脂質分子２５は、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−フォスフォコリン（1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine、ＤＯＰＣ）である。不飽和脂質分子２５は、図６（ｂ）に示すように、二重結合を含むアシル鎖からなる疎水部２５ａと、疎水部２５ａと結合している親水部２５ｂとからなる。不飽和脂質分子２５のゲル−液晶相転移温度は−２２℃である。
生体分子２３は、第１実施形態の生体分子１３と同様に、末端にヒスチジンタグ２３ａを有している。生体分子２３は、生体分子１３と同じものが挙げられ、好ましい態様も同じである。
【００３５】
生体分子固定化基板２では、共に流動性の高い不飽和脂質分子同士を用いるため、ニッケル錯体脂質分子２４と不飽和脂質分子２５がそれぞれ均一に分散した脂質二分子膜２２が形成される。この脂質二分子膜２２のニッケル錯体脂質分子２４に生体分子２３を固定化することで、脂質二分子膜２２上に、生体分子２３を均一に分散させて固定化できる。
生体分子固定化基板２の製造方法は、ニッケル錯体脂質分子２４と不飽和脂質分子の混合脂質を用いる以外は、第１実施形態の生体分子固定化基板１と同じ製造方法が用いられる。また、生体分子固定化基板２に固定化した生体分子２３は、ＥＤＴＡなどのキレート剤を添加することで脱離させることができ、脂質二分子膜２２を有する基板は再利用できる。
【００３６】
以上説明した本発明の生体分子固定化基板は、生体分子の固定化に脂質二分子膜を利用している。脂質二分子膜は細胞膜の基本構造であり、基板上に形成した脂質二分子膜に生体分子を固定化することで、生理条件に近い環境で生体分子が存在し得る。そのため、生体分子を非破壊で、かつ生理機能を保持したまま、長期間安定して基板上に担持でき、生体分子の生理機能の失活を抑制できる。また、不飽和型のニッケル錯体脂質分子を利用すれば、固定化した生体分子の流動性が特に優れた生体分子固定化基板が得られる。また、用いる脂質分子の種類及び混合比の調節、前記工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）のようなパターン形成方法により、基板上に固定化する生体分子の位置や密度、パターン化、配列化を高度に制御できる。また、生体分子固定化基板は、固定化の際の基板に対する処理が比較的少なく生産性が高い。
【００３７】
なお、本発明の生体分子固定化基板は、前述の生体分子固定化基板１、２には限定されない。例えば、飽和型のニッケル錯体脂質分子と飽和脂質分子の組み合わせ、又は飽和型のニッケル錯体脂質分子と不飽和脂質分子の組み合わせを用いて脂質二分子膜を形成した生体分子固定化基板であってもよく、ニッケル錯体脂質分子のみを用いて脂質二分子膜を形成した生体分子固定化基板であってもよい。
また、脂質二分子膜への生体分子の固定化は、ニッケル錯体脂質分子と、末端にヒスチジン残基を有する生体分子を用いる方法には限定されず、例えば、ビオチン化された脂質分子にストレプトアビジンを介して、ビオチン化タンパク質を固定化する方法であってもよい。
【００３８】
＜生体分子輸送基板＞
本発明の生体分子輸送基板は、前述した生体分子固定化基板と同様に、基板本体上に脂質二分子膜が形成され、該脂質二分子膜に生体分子が固定化される基板であり、前記基板本体上に親水部と疎水部からなる所定のパターンが形成されており、前記脂質二分子膜が、前記親水部表面に、生体分子が固定化された脂質二分子膜を自発展開させて形成される基板である。
室温で流動性の高い不飽和脂質分子（不飽和脂質分子２５、卵黄由来のホスファチジルコリンなど。）及び不飽和型のニッケル錯体脂質分子（ニッケル錯体脂質分子１４など。）を混合した脂質二分子膜は、自発展開現象を発現する。また、特開２００７−２４８２９０号公報には、基板表面に親水部及び疎水部からなるパターンを形成することで、脂質二分子膜の自発展開を制御できることが示されている。自発展開とは、基板表面上を、脂質二分子膜が自己組織化によって成長しつつ広がっていくことをいう。自発展開は、通常、緩衝液中で生じる。
本発明の生体分子輸送基板は、生体分子を固定化した脂質二分子膜の自発展開を制御することで、生体分子の基板上での輸送を可能にしたものである。
【００３９】
以下、本発明の生体分子輸送基板の実施形態の一例を示して詳細に説明する。
本実施形態の生体分子輸送基板３は、図７に示すように、表面に親水部３２及び疎水部３３からなるパターンが形成された基板本体３１を有しており、生体分子３５が固定化された脂質二分子膜３４が親水部３２に自発展開される。すなわち、基板本体３１表面における親水部３２が脂質二分子膜３４を自発展開させる流路となり、該流路である親水部３２を経由して生体分子３５が輸送される。
【００４０】
基板本体３１の材質としては、ガラス、石英、シリコン、サファイア、マイカ（雲母）などが挙げられる。更に、基板の表面を親水性にするような表面修飾を施したものを用いてもよい。
【００４１】
疎水部３３の材質としては、例えば、フォトレジストなどの樹脂、金、チタンなどの金属類が用いられる。
親水部３２は、試料収容部３２ａ及び３２ｂと、試料収容部３２ａと試料収容部３２ｂを連絡する複数の流路案内部３２ｃからなる。親水部３２は、すべて基板本体３１の親水性の表面から構成される。すなわち、親水部３２は、親水性の表面を有する基板本体３１の表面に、フォトレジストなどで疎水膜を形成し、該疎水膜を所定のパターンで剥離することにより形成される。
表面に親水部３２及び疎水部３３からなるパターンが形成された基板本体３１は、特開２００７−２４８２９０号公報に記載の方法で製造できる。
【００４２】
試料収容部３２ａに生体分子が固定化された脂質二分子膜３４を配置し（図７、点Ｓ）、親水部３２が覆われるように基板本体３１表面に緩衝液を滴下する。これにより、脂質二分子膜３４が流路案内部３２ｃを経由して他方の試料収容部３２ｂまで自発展開し、脂質二分子膜３４に固定化された生体分子３５が試料収容部３２ｂまで輸送される。
【００４３】
以上説明した本発明の生体分子輸送基板は、生体分子を脂質二分子膜に固定化するため、固定化した生体分子の流動性が高く、基板上で生体分子を輸送できる。また、脂質二分子膜上に固定化することで生体分子の安定性が高くなるため、その生理機能の失活を抑制できる。また、生体分子輸送基板は、生産性が高い。
なお、本発明の生体分子輸送基板は、前述した生体分子固定化基板３には限定されない。例えば、親水部３２及び疎水部３３からなるパターンは特に限定されず、所望の流路が形成されるように適宜選定できる。
【００４４】
＜バイオチップ＞
本発明のバイオチップは、前述した本発明の生体分子固定化基板又は生体分子輸送基板を用いたものである。
生体分子の診断、検出では、多くの場合、試料中には多検体の分子が含まれる。そのため、バイオチップには、多検体の分子を同時に、短時間で、分子選択的に判定、定量できるように素子構造化されることが求められる。すなわち、バイオチップには、検体となる生体分子のハイスループットスクリーニング機能が付与されることが求められる。
【００４５】
本発明のバイオチップは、検出部として、種類及び／又は濃度が異なる特定の生体分子がそれぞれ固定化された脂質二分子膜が形成される生体分子配置部を複数設けることで、ハイスループットスクリーニング機能が付与できる。かかるバイオチップの素子構造としては、基板本体上の親水部及び疎水部のパターンを利用した流路型が好ましい。
以下、本発明のバイオチップの実施形態の一例として、親水部及び疎水部からなるパターンを有する生体分子輸送基板を利用した、流路型の素子構造を有するバイオチップを示して詳細に説明する。
【００４６】
本実施形態のバイオチップ４は、図８に示すように、基板本体４１上に、３つの試料配置部４２ａ〜４２ｃと、１つの試薬配置部４３と、１つの検出部（ドレイン）４４とが設けられている。検出部４４には、３つの生体分子配置部４４ａ〜４４ｃが設けられている。各々の生体分子配置部４４ａ〜４４ｃには、それぞれ異なる種類の生体分子ａ〜ｃが固定化された脂質二分子膜が形成されている。また、試料配置部４２ａ〜４２ｃと、試薬配置部４３と、生体分子配置部４４ａ〜４４ｃとは、流路案内部４５により連絡されている。
試料配置部４２ａ〜４２ｃ、試薬配置部４３、生体分子配置部４４ａ〜４４ｃ及び流路案内部４５は、親水部である。基板本体４１上のそれ以外の部分は、金属やレジストなどからなる疎水部である。
流路案内部４５の幅は、１〜１００μｍが好ましい。
【００４７】
バイオチップ４による診断・検出は、例えば、以下の手順で実施できる。
３つの試料配置部４２ａ〜４２ｃに脂質二分子膜を形成し、それぞれの脂質二分子膜上に、検体として末端にヒスチジン残基を有する異なる種類の生体分子を含む検体試料を配する。各試料は、脂質二分子膜の自発展開により輸送され、流路案内部４５に流入して混合される。流路案内部４５では、試薬配置部４３から任意に試薬を流入させて、混合試料に試薬を混合し、試料中の生体分子と反応させることもできる。混合試料は、生体分子配置部４４ａ〜４４ｃに流入する。
【００４８】
検出部４４では、例えば、試料中に生体分子ａと結合する標的分子がある場合、該標的分子が生体分子配置部４４ａにおいて生体分子ａと結合する。オプティカルプローブ５０により各生体分子配置部４４ａ〜４４ｃの分光測定を行うことで、検体試料中の標的分子が特異的に結合した生体分子配置部４４ａ〜４４ｃにおいてのみ、分光信号が観測される。
この流路型のバイオチップ４を用いることにより、試料中に含まれる標的分子を、分子選択的に、同定、定量、診断することが可能となる。
【００４９】
以上説明したバイオチップでは、検出部における生体分子配置部に短時間、かつ高収率で生体分子を固定化できる。また、生体分子は脂質二分子膜に固定化するため、固定化された生体分子の流動性及び安定性が高く、生理機能が長期間にわたり保持される。さらに、固定化する生体分子の位置及び密度の制御、パターンニング、生体分子の輸送などが容易に達成できる。そのため、バイオチップ上の反応点（検出部）を高密度に集積させることが可能であり、バイオチップのスループットの向上、高感度化、小型化、生体分子の輸送に伴う逐次的な生体分子反応計測などの付加価値が得られる。
【実施例】
【００５０】
以下、実施例及び比較例を示して本発明を詳細に説明する。ただし、本発明は以下の記載によっては限定されない。
本実施例では、生体分子として、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を用い、生体分子固定化基板及び生体分子輸送基板を作製した。
【００５１】
＜生体分子固定化基板＞
以下、生体分子固定化基板を作製した例について説明する。
［実施例１］
（脂質二分子膜の形成）
１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−フォスフォコリン（ＤＳＰＣ、１０ｍＭ）のクロロホルム溶液と、ニッケル錯体脂質分子（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−［（Ｎ−（５−アミノ−１−カルボキシペンチル）イミノジアセティックアシッド）スクシニル］（ニッケル塩）、１ｍＭ）のクロロホルム溶液をそれぞれ調製した。その後、脂質全体の質量が２．０ｍｇ、かつ、混合比がＤＳＰＣ：ニッケル錯体脂質分子＝５０：５０（ｍｏｌ％）となるように、それぞれのクロロホルム溶液をガラス瓶内で混合した。その後、混合液にアルゴンガスを吹き付けてクロロホルム溶液を蒸発させ、混合脂質分子からなる膜をガラス瓶の内壁に形成した。さらに、真空下で終夜乾燥し、クロロホルムを完全に除去した。次に、該ガラス瓶に、１．０ｍＬのリン酸緩衝液（ＰＢＳ緩衝液、０．１Ｍリン酸ナトリウム、０．１５Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ７．２）を加え、１分間超音波処理を施し、該緩衝液内で脂質ベシクルを形成した。さらに、該緩衝液をＰＢＳ緩衝液で１０倍希釈（脂質濃度０．２ｍｇ／ｍＬ）し、試料溶液とした。
次に、へき開したマイカ基板上に、前記試料溶液を２０μＬ滴下し、さらにＰＢＳ緩衝液を２００μＬ程度加えた後、該マイカ基板を３０分間、６０℃でアニール処理した。該アニール処理により、脂質ベシクルが素早くマイカ基板上に吸着し、脂質二分子膜が形成された。３０分間静置して試料を室温に戻した後、マイカ基板上の試料の上澄み溶液を吸い取り、脂質分子を含まない以外は試料溶液と同じ組成の緩衝液を滴下する洗浄処理を５回繰り返し、マイカ基板に吸着していない脂質分子を除去して清浄化した。
得られた基板は、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）で観察した。該基板のＡＦＭ像を図９（ａ）に示す。
【００５２】
（生体分子の固定化）
末端がヒスチジンタグ化された緑色蛍光タンパク質（rTurbo GFP、Evogen社製）にＰＢＳ緩衝液を加え、１０μｇ／ｍＬのＧＦＰ溶液を調製した。マイカ基板上に形成した脂質二分子膜上に、該ＧＦＰ溶液を２０μＬ滴下し、吸着時間として３０分静置した。添加したＧＦＰの分子数は７．４×１０−１２ｍｏｌであり、脂質二分子膜内のニッケル錯体脂質分子の分子数（５０ｍｏｌ％混合比）は２．２×１０−９ｍｏｌであった。
その後、ＧＦＰ溶液の上澄み溶液を吸い取り、試料の上澄み溶液を吸い取り、ＰＢＳ緩衝液を滴下し、その上澄み液を吸い取る洗浄処理を５回繰り返し、ニッケル錯体脂質分子に吸着していないＧＦＰを除去して清浄化し、生体分子固定化基板を得た。
ＧＦＰ添加前の基板と、ＧＦＰを添加して得られた生体分子固定化基板は、レーザー蛍光顕微鏡（励起：４８８ｎｍアルゴンレーザー、観測：５０５〜５２５ｎｍ領域観測用の蛍光フィルター、４０倍対物レンズ）にて観察した。ＧＦＰ添加前の基板の蛍光像を図１０（ａ）、ＧＦＰ添加後の基板の蛍光像を図１０（ｂ）に示す。
【００５３】
［実施例２］
ＤＳＰＣとニッケル錯体脂質分子の混合比を、ＤＳＰＣ：ニッケル錯体脂質分子＝７０：３０（ｍｏｌ％）とした以外は、実施例１と同様にして脂質二分子膜を形成し、ＧＦＰを固定化して生体分子固定化基板を得た。脂質二分子膜を形成した基板のＡＦＭ像を図９（ｂ）、ＧＦＰ添加後の基板の蛍光像を図１０（ｃ）に示す。
【００５４】
［実施例３］
ＤＳＰＣとニッケル錯体脂質分子の混合比を、ＤＳＰＣ：ニッケル錯体脂質分子＝９０：１０（ｍｏｌ％）とした以外は、実施例１と同様にして脂質二分子膜を形成し、ＧＦＰを固定化して生体分子固定化基板を得た。脂質二分子膜を形成した基板のＡＦＭ像を図９（ｃ）、ＧＦＰ添加後の基板の蛍光像を図１０（ｄ）に示す。
【００５５】
図７（ａ）に示すように、実施例１では、マイカ基板上に脂質二分子膜を形成した際、直径約１〜２μｍのドメイン領域（以下、「ドメイン領域Ａ」という。）と、ドメイン領域Ａとの高さの差が１ｎｍのドメイン領域（以下、「ドメイン領域Ｂ」という。）が観測された。また、図７（ｂ）、（ｃ）に示すように、実施例２及び３でＤＳＰＣの割合を増加させた場合、ドメイン領域Ａの面積が増大した。このことから、ドメイン領域ＡがＤＳＰＣからなるドメイン領域であり、ドメイン領域Ｂがニッケル錯体脂質分子からなるドメイン領域であることがわかった。ドメイン領域Ａはマイカ基板からの高さが約５ｎｍであった。また、ドメイン領域Ａ、Ｂは、ともに脂質二分子膜の単分子膜構造を形成していた。
観測したＡＦＭ像から、ドメイン領域Ａの面積を計測したところ、脂質二分子膜全体に対する面積比は、実施例１が４７％、実施例２が８１％、実施例３が９４％であり、各例における試料溶液中の混合比とほぼ一致していた。このように、アシル鎖同士の分子間の相互作用が強い飽和型のＤＳＰＣと、不飽和型のニッケル錯体脂質分子を用いることにより、飽和型のＤＳＰＣの周りを不飽和型のニッケル錯体脂質分子が流動的に取り囲んだドメイン領域を有する脂質二分子膜を形成できることが確認された。
【００５６】
また、実施例１におけるＧＦＰの固定化については、図１０（ａ）に示すように、ＧＦＰ添加前は脂質二分子膜の蛍光像は得られないが、ＧＦＰを添加した後は、図１０（ｂ）に示すように、緑色の蛍光像が得られた。また、図１０（ｂ）の蛍光像と図９（ａ）のＡＦＭ像との対応から、ニッケル錯体脂質分子からなるドメイン領域Ｂのみから蛍光が観測されていることが分かった。すなわち、末端がヒスチジンタグ化されたＧＦＰは、ニッケル錯体脂質分子と特異的に結合した。同様に、実施例２及び３についても、図１０（ｃ）及び図１０（ｄ）に示すように、緑色の蛍光像が観測され、図９（ｂ）及び図９（ｃ）との対応から、ニッケル錯体脂質分子からなるドメイン領域Ｂのみから蛍光が観測されていることが確認された。
このように、ニッケル錯体脂質分子と、末端がヒスチジンタグ化された生体分子を用いることにより、生体分子を特定の領域のみに選択的に固定化できることが確認された。
【００５７】
［実施例４］
ＤＳＰＣを１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−フォスフォコリン（ＤＯＰＣ）に変更し、６０℃でのアニール処理を施さずに室温で静置して脂質二分子膜を形成した以外は、実施例１と同様にして脂質二分子膜を形成した。その結果、各脂質分子はドメイン領域を形成せず、それぞれが均一に分散した脂質二分子膜が形成された（図示せず）。これは、不飽和型のＤＯＰＣとニッケル錯体脂質は、室温で両者とも液晶相であり、双方が流動的に混ざり合うためである。
次に、実施例１と同様にして、脂質二分子膜上にＧＦＰを固定化して生体分子固定化基板を得た。ＧＦＰ添加後の基板の蛍光像を図１１（ａ）に示す。
【００５８】
［比較例１］
ニッケル錯体脂質分子を用いない以外は、実施例１と同様にして脂質二分子膜を形成し、ＧＦＰの固定化を行った。ＧＦＰ添加後の基板の蛍光像を図１１（ｂ）に示す。
【００５９】
ＤＯＰＣ：ニッケル錯体脂質分子の混合比を５０：５０（ｍｏｌ％）で形成した脂質二分子膜上にＧＦＰ溶液を添加した実施例４では、図１１（ａ）に示すように、脂質間二分子膜全体に均一に緑色の蛍光像が観測された。
一方、ＤＯＰＣのみからなる脂質二分子膜にＧＦＰ溶液を添加した比較例１では、脂質二分子膜上にヒスチジン残基の吸着サイトが存在しないため、図１１（ｂ）に示すように、ＧＦＰは膜上には固定化されず、蛍光像は観測されなかった。
以上のように、本発明の生体分子固定化基板では、ニッケル錯体脂質分子と組み合わせる脂質分子の種類（飽和・不飽和）や、その混合比などを変化させることにより、タンパク質などの生体分子の固定化密度、固定化領域（局所的あるいは分散）を容易に制御できることが確認された。
【００６０】
＜生体分子輸送基板＞
以下、生体分子輸送基板を作製した例について説明する。
［実施例５］
実施例４と同じＤＯＰＣとニッケル錯体脂質分子からなる脂質二分子膜を用い、室温でのＧＦＰの輸送を試みた。
（タンパク質輸送用試料）
実施例１と同様にして、ＤＯＰＣ：ニッケル錯体脂質分子＝５０：５０（ｍｏｌ％）（合計脂質量：２ｍｇ）になるように、それぞれのクロロホルム溶液を混合した。その混合溶液中に、ＰＢＳ緩衝液で１０μｇ／ｍＬの濃度に調製したＧＦＰ（rTurbo GFP、Evogen社製）を２００μＬ添加した（ＧＦＰ量：２μｇ）。次に、双溶性溶媒であるエタノール１００μＬ程度を、双方の溶液が均一に混合するように添加した。その後、アルゴンガスを吹き付けて、全ての溶液を蒸発させ、ＧＦＰが固定化された混合脂質分子を含む脂質二分子膜をガラス瓶の内壁に形成した。これを真空下で終夜乾燥させ、残存する溶液を完全に除去した。さらに、再度、試料を微量のクロロホルムに浸し、クロロホルムを乾燥させてタンパク質輸送用試料とした。該試料中のＧＦＰの分子数は７．４×１０−１１ｍｏｌであり、混合脂質中のニッケル錯体脂質分子の分子数（５０ｍｏｌ％混合比）は２．２×１０−７ｍｏｌであった。
【００６１】
（パターン化流路基板）
ガラス基板（ガラスウエハ）上に、プライマーとしてヘキサメチルジシロキサンを滴下し、毎分５００回転で３０秒間、引き続き毎分２０００回転で３０秒間のスピンコートを行った。次いで、フォトレジスト（ＴＳＭＲ−Ｖ３、東京応化工業社製）を滴下し、毎分５００回転で３０秒間、引き続き毎分２０００回転で３０秒間のスピンコートを行った。このガラス基板を１２０℃のオーブンで９０秒間ベーキングした。これをフォトマスクによって露光し、引き続き現像した。次に、スパッタ蒸着法によって、ガラス基板上にチタンを５ｎｍ蒸着し、さらに金を４５ｎｍ蒸着した。スパッタ蒸着後のガラス基板を、メチルエチルケトンに浸漬して超音波処理し、リフトオフプロセスによりレジストを溶解・剥離した。次いで、純水流水下で洗浄し、図７に例示した、親水部及び疎水部からなるパターンを有するパターン化流路基板を得た。その後、該パターン化流路基板を、ピラニア溶液（過酸化水素水：硫酸＝１：４）、及びフッ化アンモニウム溶液を用いて洗浄し、ガラス表面のＳｉＯ２面をエッチングして親水化処理を施した。
【００６２】
（タンパク質の輸送）
前記タンパク質輸送用試料をガラス製キャピラリーの先端に付着させ、前記パターン化流路基板の一方の試料収容部（図７、試料収容部３２ａ）に配置した。その後のパターン化流路基板をレーザー蛍光顕微鏡で観察したところ、青色入射光の励起により、前記試料収容部でＧＦＰ由来の緑色発光が確認された（図示せず）。この状態で、レーザー蛍光顕微鏡の対物レンズ（４０倍レンズ使用）と試料との間に、ＰＢＳ緩衝液を静かに注入した。該ＰＢＳ緩衝液の注入から３０、３００、６００、９００、１２００、１５００秒後の蛍光像を図１２（ａ）〜（ｆ）に示す。
【００６３】
図１２（ａ）〜（ｆ）に示すように、流動性の高い脂質分子が親水性の流路内で自発展開し、その自発展開に伴って脂質二分子膜上に固定化されたＧＦＰが輸送された。このＧＦＰの輸送は、疎水的な金属からなる流路外の部分には展開しなかった。また、この生体分子輸送基板は、表面を洗浄して親水性処理を施していたため、有機物質の不純物の存在などによって自発展開速度が遅延するなどの不都合は確認されなかった。
【符号の説明】
【００６４】
１、２ 生体分子固定化基板 １１ 基板本体 １２ 脂質二分子膜 １３ 生体分子 １４ ニッケル錯体脂質分子 １５ 飽和脂質分子 ３ 生体分子輸送基板 ３１ 基板本体 ３２ 親水部 ３３ 疎水部 ３４ 脂質二分子膜 ４ バイオチップ
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体分子固定化基板、生体分子輸送基板及びバイオチップに関する。
【背景技術】
【０００２】
固体基板上に、生体分子を二次元的に配列して固定化したバイオチップは、医療診断、環境センシング、ナノバイオオプティクス・エレクトロニクスなどの幅広い分野における基盤素子として期待されている。特に、バイオ・環境センシング素子や医薬品開発においては、基板上に特定多数の生体分子を所望のパターンで固定化し、生体分子の種類や濃度、あるいは生体分子間の相互作用（活性検出、分子認識など。）をハイスループットで調査、診断できるバイオチップは、多大な市場価値をもたらすと期待されている。
【０００３】
また、これらの産業分野だけでなく、酵素、抗体をはじめとするタンパク質やＤＮＡなどの機能性生体分子を、非破壊で安定して基板上に固定化する方法は、生体組織内で起こる生体分子間の反応機構を解明する基礎研究分野においても重要である。
生体組織は、細胞内で、タンパク質同士の相互作用や、イオン、電子、化学物質などの信号の伝達により、情報交換を行うことで生体機能を発現する。生体組織における生理学的な機構を解明する場合、細胞内のような多数の生体分子が存在する複雑系を用いると、分子レベルでの生体分子間の相互作用や信号伝達の解析は非常に難解となる。そのため、特定の生体分子を基板上に固定化し、簡略化した生体モデルを構築することで、各生体分子の相互作用や情報伝達機構、あるいは構造変化などの時間的変動を簡便に追跡できるバイオチップの開発が求められている。
【０００４】
特にタンパク質などの生体分子を基板上に固定化する方法としては、ビオチン−ストレプトアビジン間の特異的な結合を利用する方法が広く用いられている（非特許文献１）。該方法では、一般的に、末端を修飾したビオチン分子を基板上に固定化し、該ビオチン分子に、ビオチンを特異的に認識するストレプトアビジンを結合させ、該ストレプトアビジンに、ビオチン化されたタンパク質を結合させる方法が用いられる。
また、自己組織化膜を形成した基板やレジストを塗布した基板に、紫外線を照射してパターンを描画し、該パターン上にビオチン−ストレプトアビジン結合を介してタンパク質を固定化する、タンパク質のパターンニング方法が知られている（非特許文献２、３）。
ビオチン−ストレプトアビジン結合を利用する方法では、タンパク質を、活性を保ったまま基板上に固定化できる。具体的には、アルカンチオールを脂質部分に有するビオチン脂質を金表面に結合させ、ストレプトアビジン、ビオチン標識したａｎｔｉ−ＨＣＧ（human chorionic gonadotropin）−Ｆａｂフラグメント、及びＨＣＧを順に結合させた場合に、固定化したタンパク質の分子認識能が保持されていることが表面プラズモン共鳴測定により確認されている（非特許文献４）。
しかし、該方法は、基板に結合するためのビオチン分子の末端修飾や、タンパク質の末端をビオチン化する修飾が必要であるため、その反応収率、時間的効率を考慮すると、バイオチップの大量生産には不向きである。
【０００５】
また、基板上にタンパク質を固定化する方法としては、ビオチン−ストレプトアビジン結合を利用する方法以外に、有機分子の自己組織化膜を用いる方法がある。例えば、下記に示す方法が挙げられる。
金基板上に、３−メルカプトプロピオン酸や１１−メルカプトウンデカン酸などの自己組織化膜を形成する。次いで、該自己組織化膜の上側に位置する末端のカルボキシ基に、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノ）プロピルカルボジイミドを触媒として、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドをカップリングする。次いで、該自己組織化膜の最表面にあるスクシンイミド基と、タンパク質のアミノ酸末端（Ｎ末端）とを選択的に結合させ、タンパク質を基板上に固定化する（非特許文献５）。
しかし、該方法は、一般に末端がチオール化された化合物を用いる必要があるため、金基板のような特定の基板上にしかタンパク質を固定化することができない。また、最終的にタンパク質を結合するには、基板の前処理として、数種のスペーサー分子を結合させる必要があり、反応プロセスが多段階にわたるため工程が煩雑になる。また、反応が多段階になるほど、基板上にタンパク質を固定化する効率が低くなる。
【０００６】
その他、基板上にタンパク質を化学的に固定化したり、パターンニングしたりする方法が知られている。具体的には、タンパク質を、スペーサー分子を介した共有結合により、基板上に強固に固定化する方法が挙げられる（非特許文献６）。
しかし、生体分子は本来流動性のある媒質中で活動しているのに対し、該方法はスペーサー分子により生体分子を基板上に強固に固定するため、生体分子の流動性が失われる。また、スペーサー分子と共有結合することで、生体分子自体の構造が変化する可能性があるため、固定化により生体分子本来の機能や活動が制限され、生理機能が損なわれるおそれがある。
【０００７】
固定化する生体分子の生理機能が損なわれることを抑制する方法としては、タンパク質を金基板上に固定化し、該タンパク質の周囲をチオール化脂質分子の自己組織化膜で被覆することで、基板上に擬似的な細胞膜構造を形成する方法が示されている（非特許文献７）。該方法では、タンパク質が脂質分子で包囲されているため、比較的生理条件に近い状態で生体分子を基板上に固定化できる。
しかし、該方法でバイオチップを作製すると、脂質分子が金−チオール結合により基板に強く結合され、形成される脂質膜に柔軟性がなくなるため、該脂質膜の機能が時間とともに低下するおそれがある。また、タンパク質も直接基板に担持されるため、基板との相互作用が強く、タンパク質本来の構造や機能を保持したまま長時間安定して固定化できない可能性がある。そのため、このような方法は、長期保存やバイオチップの用途としては信頼性が低い。
【０００８】
以上のように、バイオセンサやバイオチップ等への適用が検討されている従来の生体分子固定化基板は、生体分子の固定化手法が煩雑なために生産性が低く、固定化する基板が限定されるうえ、固定化した生体分子の流動性及び安定性が低くなり、該生体分子の生理機能が失活するおそれがある。また、従来の生体分子固定化基板では、生体分子の流動性が低いため、基板上で生体分子を移動させ、所望の位置に輸送することはできない。さらに、基板上に固定化する生体分子の位置や密度、パターン化や配列化の制御はまだまだ不充分であり、それらの制御のさらなる向上が望まれている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】V. H. Perez-Lunら、「ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティ（Journal of American Chemical Society）」、第１２１巻、１９９９年、第６４６９−６４７８頁
【非特許文献２】J. Dohら、「ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティ（Journal of American Chemical Society）」、第１２６巻、２００４年、第９１７０−９１７１頁
【非特許文献３】K. L. Christmanら、「ラングミュア（Langmuir）」、第２２巻、２００６年、第７４４１−７４５０頁
【非特許文献４】W. Mullerら、「サイエンス（Science）」、第２６２巻、１９９３年、第１７０６−１７０８頁
【非特許文献５】M. Veisehら、「ラングミュア（Langmuir）」、第１８巻、２００２年、第６６７１−６６７８頁
【非特許文献６】A. S. Blawasら、「バイオマテリアルズ（Biomaterials）」、第１９巻、１９９８年、第５９５−６０９頁
【非特許文献７】D. A. Cisnerosら、「アンゲヴァンテ・ ケミィ・インターナショナル・エディション（Angewandte Chemie International Edition）」、第４５巻、２００６年、第３２５２−３２５６頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、基板上に固定化する生体分子の位置や密度、パターン化、配列化を高度に制御でき、固定化した生体分子の流動性及び安定性が高く、該生体分子の生理機能が失活するおそれが低く、生産性が高い生体分子固定化基板、及び基板上の所望の位置に生体分子を輸送できる生体分子輸送基板、並びにそれらを用いたバイオチップの提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、前記課題を解決するために以下の構成を採用した。
［１］基板本体上に脂質二分子膜が形成され、該脂質二分子膜に生体分子が固定化されていることを特徴とする生体分子固定化基板。
［２］前記脂質二分子膜が、ヒスチジン残基と結合するニッケル錯体部位を有するニッケル錯体脂質分子を含み、前記生体分子がヒスチジン残基を有しており、前記ニッケル錯体脂質分子のニッケル錯体部位と、前記生体分子のヒスチジン残基の結合により該生体分子が固定化されている、前記［１］に記載の生体分子固定化基板。
［３］前記生体分子が、抗原、抗体、酵素、膜タンパク質、受容体型タンパク質、蛍光タンパク質、細胞骨格、モータータンパク質からなる群から選ばれる少なくとも１種の機能性タンパク質であり、かつ該機能性タンパク質の末端がヒスチジンタグ化されている、前記［２］に記載の生体分子固定化基板。
［４］前記脂質二分子膜が、前記ニッケル錯体脂質分子により形成されたドメイン領域、及びニッケル錯体部位を有さない脂質分子により形成されたドメイン領域からなる脂質二分子膜である、前記［２］又は［３］に記載の生体分子固定化基板。
［５］前記脂質二分子膜中に前記ニッケル錯体脂質分子が均一に分散している、前記［２］〜［４］のいずれかに記載の生体分子固定化基板。
［６］基板本体上に脂質二分子膜が形成され、該脂質二分子膜に生体分子が固定化された基板であって、前記基板本体上に親水部と疎水部からなる所定のパターンが形成されており、前記脂質二分子膜が、前記親水部表面に、生体分子が固定化された脂質二分子膜を自発展開させて形成されることを特徴とする生体分子輸送基板。
［７］前記［１］〜［５］に記載の生体分子固定化基板又は前記［６］に記載の生体分子輸送基板を用いたバイオチップ。
［８］多検体の生体分子をハイスループットスクリーニング検出するバイオチップであって、種類及び／又は濃度の異なる複数の生体分子が、脂質二分子膜に固定化され、前記基板本体上の所定の位置に配置された、前記［７］に記載のバイオチップ。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の生体分子固定化基板は、基板上に固定化する生体分子の位置や密度、パターン化、配列化を高度に制御できる。また、固定化した生体分子の流動性及び安定性が高く、該生体分子の生理機能が失活するおそれが低く、生産性も高い。
本発明の生体分子輸送基板は、さらに基板上の所望の位置に生体分子を輸送できる。
また、本発明は、前記生体分子固定化基板又は生体分子輸送基板を用いたバイオチップを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明の生体分子固定化基板の実施形態の一例を示した概念図である。
【図２】図１の生体分子固定化基板におけるニッケル錯体脂質分子（ａ）及び飽和脂質分子（ｂ）を示した図である。
【図３】本発明の生体分子固定化基板における脂質二分子膜のパターン化の例を示した概念図である。
【図４】基板本体上にパターン化した脂質二分子膜を形成する方法の一工程を示した部分断面図である。
【図５】基板本体上に生体分子を所定のパターンで固定化する方法の一工程を示した部分断面図である。
【図６】本発明の生体分子固定化基板の他の実施形態例を示した概念図（ａ）、及び該基板に用いる不飽和脂質分子を示した図である。
【図７】本発明の生体分子輸送基板における脂質二分子膜の自発展開の様子を示した斜視図（ａ）、及びその領域Ｘの拡大図（ｂ）である。
【図８】本発明のバイオチップの実施形態の一例を示した斜視図である。
【図９】実施例１〜３における脂質二分子膜のＡＦＭ像及び該ＡＦＭ像中の直線部分の脂質二分子膜の高さ情報である。
【図１０】実施例１〜３における基板のレーザー蛍光顕微鏡による蛍光像である。
【図１１】実施例４及び比較例１における基板のレーザー蛍光顕微鏡による蛍光像である。
【図１２】実施例５の生体分子輸送基板における脂質二分子膜の自発展開を観察した蛍光像である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
＜生体分子固定化基板＞
本発明の生体分子固定化基板は、基板本体上に脂質二分子膜が形成され、該脂質二分子膜に生体分子が固定化されていることを特徴とする。
【００１５】
基板本体としては、安定に脂質二分子膜を形成できる親水性の基板が好ましく、例えば、ガラス、石英、シリコン、サファイア、マイカ（雲母）などからなる基板を用いることができる。また、疎水性の基板の表面に、化学洗浄、分子修飾などの処理を施し、表面を親水化したものを用いてもよい。
基板本体は、膜厚４〜５ｎｍ程度の脂質二分子膜を形成することが容易な点から、ナノメートルスケールの平坦性を有するものが好ましい。
基板本体の厚さは、０．１〜２０ｍｍが好ましい。
【００１６】
本発明における脂質二分子膜とは、基板に支持された（人工）脂質二分子膜である。脂質二分子膜は、両親媒性分子であるリン脂質などの脂質分子が二層構造を形成した膜であり、生体膜の最も基本的な構造である。
脂質分子おいては、各脂質の疎水部のアシル鎖長、アシル鎖内の二重結合の有無、さらにその二重結合の部位と数は特に限定されない。本明細書中では、アシル鎖中に二重結合部位を含まない脂質分子を飽和脂質分子、アシル鎖中に二重結合部位を含む脂質分子を不飽和脂質分子という。
脂質分子の種類としては、例えば、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジルイノシトールホスフェイト（ＰＩＰ）、ホスファチジン酸（ＰＡ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、スフィンゴ脂質などが挙げられる。これら脂質分子は、１種類のみを使用してもよく、２種類以上を併用してもよい。
【００１７】
本発明の生体分子固定化基板における脂質二分子膜は、ニッケル錯体脂質分子を含むことが好ましい。すなわち、脂質二分子膜への生体分子の固定化は、ニッケル錯体脂質分子を用いて行うことが好ましい。ニッケル錯体脂質分子とは、ヒスチジン残基と結合するニッケル錯体部位を有する脂質分子である。ニッケル錯体部位は、ヒスチジン残基を有する分子と特異的に相互作用（配位結合）するため、末端にヒスチジン残基を有する生体分子を脂質二分子膜表面に選択的に固定化できる。ニッケル錯体部位としては、ニトリロ三酢酸とニッケルの錯体が挙げられる。
基板本体上に、ニッケル錯体脂質分子を含む脂質二分子膜を形成させ、該脂質二分子膜に、末端にヒスチジン残基を有する生体分子を作用させることで、該ニッケル錯体部位と生体分子のヒスチジン残基の結合により生体分子が固定化される。
【００１８】
脂質二分子膜に固定化する生体分子は、当該生体分子との間に何らかの相互作用（化学結合の形成、吸着など。）を生じ得る特異結合物質が存在する生体由来の分子であり、末端にヒスチジン残基を有する。すなわち、検体となる試料中の目的物質や候補目的物質（生体に由来するタンパク質、ペプチド、低分子化合物など。）と特異的に結合または吸着でき、かつ末端にヒスチジン残基を有する分子である。
【００１９】
生体分子としては、生体分子間の特異的な相互作用を活かしたバイオチップを開発できる点から、末端がヒスチジンタグ化された機能性タンパク質が好ましい。
機能性タンパク質としては、抗原、抗体、酵素、膜タンパク質、受容体型タンパク質、蛍光タンパク質、細胞骨格及びモータータンパク質からなる群から選択される少なくとも１種が好ましい。
ただし、生体分子は、特異的に相互作用する特異結合物質が存在し、末端にヒスチジン残基を有するものであれば、ヒスチジンタグ化された機能性タンパク質には限定されない。例えば、ヒスチジンタグ化された糖鎖化合物、ＤＮＡ、ＲＮＡなどを用いることもできる。
【００２０】
ヒスチジンタグは、３〜１０個のヒスチジン残基が連なるヒスチジン連鎖が好ましい。ヒスチジン残基が３個以上であれば、ニッケル錯体部位との結合の安定性が向上する。また、ヒスチジン残基が１０個以下であれば、分子内での立体障害が生じにくい。
また、ニッケル錯体部位とヒスチジン残基の配位結合は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などのキレート剤を添加することで解離できる。そのため、脂質二分子膜上に固定化した生体分子は自由に脱離させることができるので、脂質二分子膜を形成した基板は再利用が可能である。
【００２１】
このように、ニッケル錯体脂質分子と末端にヒスチジン残基を有する生体分子を用いることにより、脂質二分子膜に生体分子を固定化できる。脂質二分子膜は、ニッケル錯体脂質分子のみからなる膜であってもよく、ニッケル錯体脂質分子と他の脂質分子からなる膜であってもよい。ここで、他の脂質分子とは、ニッケル錯体部位を有さない飽和脂質分子又は不飽和脂質分子である。本発明の生体分子固定化基板では、ニッケル錯体脂質分子と、他の脂質分子を混合して脂質二分子膜中のニッケル錯体脂質分子の分布を制御することで、基板に固定化する生体分子の分布を制御できる。
具体的には、脂質二分子膜中に、ニッケル錯体脂質分子からなるドメイン領域と、他の脂質分子からなるドメイン領域とを形成させ、ニッケル錯体脂質分子を基板上で相分離させることで、基板上で生体分子を局在化させることができる。また、脂質二分子膜中でニッケル錯体分子と他の脂質分子を共に均一に分散させることで、基板上に生体分子を均一に固定化できる。
【００２２】
以下、本発明の生体分子固定化基板の実施形態の一例を示して詳細に説明する。
（第１実施形態）
本実施形態の生体分子固定化基板１は、図１に示すように、基板本体１１と、基板本体１１上に形成された脂質二分子膜１２と、脂質二分子膜１２に固定化された生体分子１３とを有している。
【００２３】
基板本体１１は、平板状の基板であり、ナノメートルスケールの平坦な表面を有する。
脂質二分子膜１２は、不飽和型のニッケル錯体脂質分子１４と、飽和脂質分子１５からなる。
本実施形態のニッケル錯体脂質分子１４は、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−［（Ｎ−（５−アミノ−１−カルボキシペンチル）イミノジアセティックアシッド）スクシニル］（ニッケル塩）（1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiaceticacid)succinyl] (Nickel salt)）である。ニッケル錯体脂質分子１４は、図２（ａ）に示すように、二重結合を含むアシル鎖からなる疎水部１４ａと、疎水部１４ａと結合している親水部１４ｂと、親水部１４ｂに結合しているニッケル錯体部１４ｃとからなる。ニッケル錯体脂質分子１４のゲル−液晶相転移温度は−２０℃である。
飽和脂質分子１５は、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−フォスフォコリン（1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine、ＤＳＰＣ）である。飽和脂質分子１５は、図２（ｂ）に示すように、直鎖状のアシル鎖からなる疎水部１５ａと、疎水部１５ａと結合している親水部１５ｂとからなる。飽和脂質分子１５のゲル−液晶相転移温度は５５℃である。
生体分子１３は、末端にヒスチジンタグ１３ａを有している。
【００２４】
生体基板固定化基板１では、不飽和型のニッケル錯体脂質分子１４と飽和脂質分子１５の混合脂質を用いることで、ニッケル錯体脂質分子１４と飽和脂質分子１５が相分離した脂質二分子膜１２が形成される。このように脂質分子が相分離してドメイン領域が形成されるのは、ニッケル錯体脂質分子１４と飽和脂質分子１５の流動性が異なるためである（L. J. Johnston、「ラングミュア（Langmuir）」、第２３巻、２００７年、第５８８６−５８９５頁）。
このドメイン領域を有する脂質二分子膜の構造は、多くの場合、アシル鎖同士の疎水性相互作用が強い飽和脂質分子（飽和脂質分子１５）が密に集合したドメイン領域を形成し、その周囲を流動性の高い不飽和脂質分子（ニッケル錯体脂質分子１４）が取り囲む相分離構造となる。ドメイン領域の大きさは、脂質二分子膜を形成する際、用いる各脂質分子のゲル−液晶相転移温度を考慮した最適な温度で熱処理を行うことで適宜変化させることができる。熱処理温度、熱処理時間、室温までの降温速度等がドメイン領域の大きさを決定する重要なパラメータとなる。また、ドメイン領域の大きさは、用いる各脂質分子のモル比を調節することによっても調節できる。
【００２５】
生体分子１３は、ヒスチジンタグ１３ａとニッケル錯体脂質分子１４のニッケル錯体部位１４ｃが結合することで、脂質二分子膜１２中のニッケル錯体脂質分子１４上に選択的に固定化される。
生体分子固定化基板１では、脂質二分子膜１２中のニッケル錯体脂質分子１４のドメイン領域の大きさを調節することで、生体分子１３を自由に高密度化したり局在化させたりできる。また、生体分子１３は末端にヒスチジン残基を有するので、生体分子１３を脂質二分子膜１２上に配向を揃えて固定化できる。
【００２６】
生体分子固定化基板１は、以下に示す方法で製造できる。
基板本体１１上に脂質二分子膜１２を形成する方法としては、緩衝液内に作製した脂質ベシクルを基板本体１１上に展開し、該脂質ベシクルが基板本体１１表面に衝突することで脂質二分子膜を形成させるベシクルフュージョン法が好ましい。ベシクルフュージョン法によれば、基板本体１１上に膜厚４〜５ｎｍ程度の脂質二分子膜１２の単分子膜を容易に形成できる。ただし、基板本体１１上に脂質二分子膜１２を形成する方法は、ベシクルフュージョン法には限定されず、基板本体１１上に安定して脂質二分子膜１２を形成できる方法であれば、公知のいずれの方法を適用してもよい。
生体分子１３を固定化する方法としては、生体分子を含む緩衝液を脂質二分子膜１２上に添加し、３０分〜数時間、室温で静置した後、緩衝液を滴下して上澄み液を取り除く処理を繰り返して洗浄し、未固定の生体分子１３を除去する方法が好ましい。
また、生体分子固定化基板１に固定化した生体分子１３は、ＥＤＴＡなどのキレート剤を添加することで脱離させることができ、脂質二分子膜１２を有する基板は再利用できる。
【００２７】
生体分子固定化基板１は、脂質二分子膜１２中のニッケル錯体脂質分子１４からなるドメイン領域１４Ａと飽和脂質分子１５からなるドメイン領域１５Ａを所定のパターンで形成し、生体分子１４を所定のパターンでより精密に制御して固定化できる。例えば、図３し示す（ａ）〜（ｆ）のパターンが挙げられる。
（ａ）円形状のドメイン領域１５Ｂと、基板１上のドメイン領域１５Ｂの周りを占めるドメイン領域１５Ａとが形成されるパターン。
（ｂ）長方形状のドメイン領域１５Ａとドメイン領域１５Ｂが、基板１を半分に分割するように形成されるパターン。
（ｃ）２つのドメイン領域１５Ａと２つのドメイン領域１５Ｂとを交互に、基板１を四分割するように配置されるパターン。
（ｄ）基板１の中心に円形状のドメイン領域１５Ｂが形成され、その周りに輪形状のドメイン領域１５Ａとドメイン領域１５Ｂが交互に２つずつ形成され、さらにその周囲の残りの領域にドメイン領域Ａが形成されているパターン。
（ｅ）複数のドメイン領域１５Ａとドメイン領域１５Ｂを交互に縞状に形成されるパターン。
（ｆ）ドメイン領域１５Ａとドメイン領域１５Ｂを交互に碁盤目状に形成されるパターン。
【００２８】
図３（ａ）〜（ｆ）に例示したようなパターンの脂質二分子膜１２を形成する方法としては、例えば、下記工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）を有する方法が挙げられる。
（ｉ）基板本体１１表面にリソグラフィー技術で微細加工を施し、図４（ａ）に示すように、所望の形状の凹凸パターンを描画した基板本体１１Ａを得る。このとき、凸部上にレジスト薄膜１６を残存させる。
（ｉｉ）飽和脂質分子１５を基板本体１１Ａ上に展開し、図４（ｂ）に示すように、基板本体１１Ａの凹部に飽和脂質分子１５からなる脂質二分子膜を形成する。
（ｉｉｉ）図４（ｃ）に示すように、凸部上のレジスト薄膜１６を除去し、ニッケル錯体脂質分子１４を基板本体１１Ａ上に展開して、図４（ｄ）に示すように、基板本体１１Ａの凸部にニッケル錯体脂質分子１４からなる脂質二分子膜を形成する。
【００２９】
工程（ｉ）：
基板本体１１表面への凹凸パターンの形成は、公知のリソグラフィー技術が適用できる。該凹凸パターンの大きさは、通常のリソグラフィー技術によれば、幅、深さ共に数１０ｎｍ〜数ｍｍの範囲で幅広く制御できる。凹部及び凸部の幅は、バイオチップの高密度化を考慮すると、１０ｎｍ〜１μｍが好ましい。また、凹部の深さ（凸部の高さ）は、同様の理由から、１０ｎｍ〜１００ｎｍが好ましい。
【００３０】
工程（ｉｉ）：
飽和脂質分子１５は、ベシクルフュージョン法により基板本体１１Ａ上に展開する。脂質分子はレジスト薄膜１６上には吸着しない。基板本体１１Ａ上に飽和脂質分子１５を展開した後、６０〜８０℃の温度で熱処理を施すことにより、凹部のみで飽和脂質分子１５からなる安定な脂質二分子膜が形成される。
【００３１】
工程（ｉｉｉ）：
凸部上に残存するレジスト薄膜１６を紫外線照射により除去し、緩衝液で基板上を繰り返し洗浄する。ニッケル錯体脂質分子１４をベシクルフュージョン法で基板本体１１Ａ上に展開する。ニッケル錯体脂質分子１４は、飽和脂質分子１５が膜形成していない凸部上に堆積し、脂質二分子膜を形成する。
凹部では飽和脂質分子１５が最密充填構造の密な脂質二分子膜を形成しており、該脂質二分子膜にニッケル錯体脂質分子１４が混入することはほとんどないと考えられる。飽和脂質分子１５の脂質二分子膜上に、ニッケル錯体脂質分子１４の脂質二分子膜が積層することも考えられるが、その場合は緩衝液で繰り返し洗浄することで積層膜を容易に除去できる。
【００３２】
前記工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）によるパターン形成方法では、基板本体１１としてガラス基板や金属基板などを用いる場合、ニッケル錯体脂質分子１４と飽和脂質分子１５で基板表面全体を被覆することが好ましい。ガラス基板や金属基板の表面には生体分子１４が吸着しやすい。そのため、それらの基板の表面が露出していると、ニッケル錯体脂質分子１４以外の場所でも生体分子１３が固定化され、所望のパターンで選択的に生体分子１３を固定化することが困難になる。
また、生体分子固定化基板１においては、工程（ｉｉ）において、飽和脂質分子１５の代わりにニッケル錯体脂質分子１４を用いて凹部に脂質二分子膜を形成させ、工程（ｉｉｉ）において、ニッケル錯体脂質分子１４の代わりに飽和脂質分子１５を用いて脂質二分子膜を形成させてもよい。
【００３３】
前記工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）の後、基板本体１１Ａ上の所定のパターンの脂質二分子膜１２に、生体分子１３を作用させることで、図５に示すように、生体分子１３を基板本体１１Ａ上に所定のパターンで固定化できる。
このように、ニッケル錯体脂質分子１４と飽和脂質分子１５のドメイン領域を所定のパターンで形成した生体分子固定化基板１は、高効率、高密度で生体分子１３を固定化できるため、バイオチップとして好適である。さらに、ナノスケールでパターン化された生体分子固定化基板１を用いれば、図３（ａ）〜（ｆ）に例示したようなパターンで生体分子１３を配列させて固定化したり、分子レベルで孤立させて固定化したりすることもできる。このような基板は、分子レベルでの生体分子間の反応メカニズムを解析する基板材料として有用である。
なお、該方法を用いれば、ニッケル錯体脂質分子１４と飽和脂質分子１５のような、飽和脂質分子と不飽和脂質分子の組み合わせを用いなくても、図３（ａ）〜（ｆ）に例示したようなパターン化が可能である。例えば、不飽和型のニッケル錯体脂質分子と不飽和脂質分子の組み合わせであっても、前記工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）を行うことにより所定のパターンで脂質二分子膜を形成し、そのパターンで生体分子を固定化できる。
【００３４】
（第２実施形態）
本実施形態の生体分子固定化基板２は、図６（ａ）に示すように、基板本体２１と、基板本体２１上に形成された脂質二分子膜２２と、脂質二分子膜２２に固定化された生体分子２３とを有している。
基板本体２１は、平板状の基板であり、ナノメートルスケールの平坦な表面を有する。
脂質二分子膜２２は、不飽和型のニッケル錯体脂質分子２４と、不飽和脂質分子２５からなる。
ニッケル錯体脂質分子２４は、第１実施形態のニッケル錯体脂質分子１４と同じである。
不飽和脂質分子２５は、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−フォスフォコリン（1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine、ＤＯＰＣ）である。不飽和脂質分子２５は、図６（ｂ）に示すように、二重結合を含むアシル鎖からなる疎水部２５ａと、疎水部２５ａと結合している親水部２５ｂとからなる。不飽和脂質分子２５のゲル−液晶相転移温度は−２２℃である。
生体分子２３は、第１実施形態の生体分子１３と同様に、末端にヒスチジンタグ２３ａを有している。生体分子２３は、生体分子１３と同じものが挙げられ、好ましい態様も同じである。
【００３５】
生体分子固定化基板２では、共に流動性の高い不飽和脂質分子同士を用いるため、ニッケル錯体脂質分子２４と不飽和脂質分子２５がそれぞれ均一に分散した脂質二分子膜２２が形成される。この脂質二分子膜２２のニッケル錯体脂質分子２４に生体分子２３を固定化することで、脂質二分子膜２２上に、生体分子２３を均一に分散させて固定化できる。
生体分子固定化基板２の製造方法は、ニッケル錯体脂質分子２４と不飽和脂質分子の混合脂質を用いる以外は、第１実施形態の生体分子固定化基板１と同じ製造方法が用いられる。また、生体分子固定化基板２に固定化した生体分子２３は、ＥＤＴＡなどのキレート剤を添加することで脱離させることができ、脂質二分子膜２２を有する基板は再利用できる。
【００３６】
以上説明した本発明の生体分子固定化基板は、生体分子の固定化に脂質二分子膜を利用している。脂質二分子膜は細胞膜の基本構造であり、基板上に形成した脂質二分子膜に生体分子を固定化することで、生理条件に近い環境で生体分子が存在し得る。そのため、生体分子を非破壊で、かつ生理機能を保持したまま、長期間安定して基板上に担持でき、生体分子の生理機能の失活を抑制できる。また、不飽和型のニッケル錯体脂質分子を利用すれば、固定化した生体分子の流動性が特に優れた生体分子固定化基板が得られる。また、用いる脂質分子の種類及び混合比の調節、前記工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）のようなパターン形成方法により、基板上に固定化する生体分子の位置や密度、パターン化、配列化を高度に制御できる。また、生体分子固定化基板は、固定化の際の基板に対する処理が比較的少なく生産性が高い。
【００３７】
なお、本発明の生体分子固定化基板は、前述の生体分子固定化基板１、２には限定されない。例えば、飽和型のニッケル錯体脂質分子と飽和脂質分子の組み合わせ、又は飽和型のニッケル錯体脂質分子と不飽和脂質分子の組み合わせを用いて脂質二分子膜を形成した生体分子固定化基板であってもよく、ニッケル錯体脂質分子のみを用いて脂質二分子膜を形成した生体分子固定化基板であってもよい。
また、脂質二分子膜への生体分子の固定化は、ニッケル錯体脂質分子と、末端にヒスチジン残基を有する生体分子を用いる方法には限定されず、例えば、ビオチン化された脂質分子にストレプトアビジンを介して、ビオチン化タンパク質を固定化する方法であってもよい。
【００３８】
＜生体分子輸送基板＞
本発明の生体分子輸送基板は、前述した生体分子固定化基板と同様に、基板本体上に脂質二分子膜が形成され、該脂質二分子膜に生体分子が固定化される基板であり、前記基板本体上に親水部と疎水部からなる所定のパターンが形成されており、前記脂質二分子膜が、前記親水部表面に、生体分子が固定化された脂質二分子膜を自発展開させて形成される基板である。
室温で流動性の高い不飽和脂質分子（不飽和脂質分子２５、卵黄由来のホスファチジルコリンなど。）及び不飽和型のニッケル錯体脂質分子（ニッケル錯体脂質分子１４など。）を混合した脂質二分子膜は、自発展開現象を発現する。また、特開２００７−２４８２９０号公報には、基板表面に親水部及び疎水部からなるパターンを形成することで、脂質二分子膜の自発展開を制御できることが示されている。自発展開とは、基板表面上を、脂質二分子膜が自己組織化によって成長しつつ広がっていくことをいう。自発展開は、通常、緩衝液中で生じる。
本発明の生体分子輸送基板は、生体分子を固定化した脂質二分子膜の自発展開を制御することで、生体分子の基板上での輸送を可能にしたものである。
【００３９】
以下、本発明の生体分子輸送基板の実施形態の一例を示して詳細に説明する。
本実施形態の生体分子輸送基板３は、図７に示すように、表面に親水部３２及び疎水部３３からなるパターンが形成された基板本体３１を有しており、生体分子３５が固定化された脂質二分子膜３４が親水部３２に自発展開される。すなわち、基板本体３１表面における親水部３２が脂質二分子膜３４を自発展開させる流路となり、該流路である親水部３２を経由して生体分子３５が輸送される。
【００４０】
基板本体３１の材質としては、ガラス、石英、シリコン、サファイア、マイカ（雲母）などが挙げられる。更に、基板の表面を親水性にするような表面修飾を施したものを用いてもよい。
【００４１】
疎水部３３の材質としては、例えば、フォトレジストなどの樹脂、金、チタンなどの金属類が用いられる。
親水部３２は、試料収容部３２ａ及び３２ｂと、試料収容部３２ａと試料収容部３２ｂを連絡する複数の流路案内部３２ｃからなる。親水部３２は、すべて基板本体３１の親水性の表面から構成される。すなわち、親水部３２は、親水性の表面を有する基板本体３１の表面に、フォトレジストなどで疎水膜を形成し、該疎水膜を所定のパターンで剥離することにより形成される。
表面に親水部３２及び疎水部３３からなるパターンが形成された基板本体３１は、特開２００７−２４８２９０号公報に記載の方法で製造できる。
【００４２】
試料収容部３２ａに生体分子が固定化された脂質二分子膜３４を配置し（図７、点Ｓ）、親水部３２が覆われるように基板本体３１表面に緩衝液を滴下する。これにより、脂質二分子膜３４が流路案内部３２ｃを経由して他方の試料収容部３２ｂまで自発展開し、脂質二分子膜３４に固定化された生体分子３５が試料収容部３２ｂまで輸送される。
【００４３】
以上説明した本発明の生体分子輸送基板は、生体分子を脂質二分子膜に固定化するため、固定化した生体分子の流動性が高く、基板上で生体分子を輸送できる。また、脂質二分子膜上に固定化することで生体分子の安定性が高くなるため、その生理機能の失活を抑制できる。また、生体分子輸送基板は、生産性が高い。
なお、本発明の生体分子輸送基板は、前述した生体分子固定化基板３には限定されない。例えば、親水部３２及び疎水部３３からなるパターンは特に限定されず、所望の流路が形成されるように適宜選定できる。
【００４４】
＜バイオチップ＞
本発明のバイオチップは、前述した本発明の生体分子固定化基板又は生体分子輸送基板を用いたものである。
生体分子の診断、検出では、多くの場合、試料中には多検体の分子が含まれる。そのため、バイオチップには、多検体の分子を同時に、短時間で、分子選択的に判定、定量できるように素子構造化されることが求められる。すなわち、バイオチップには、検体となる生体分子のハイスループットスクリーニング機能が付与されることが求められる。
【００４５】
本発明のバイオチップは、検出部として、種類及び／又は濃度が異なる特定の生体分子がそれぞれ固定化された脂質二分子膜が形成される生体分子配置部を複数設けることで、ハイスループットスクリーニング機能が付与できる。かかるバイオチップの素子構造としては、基板本体上の親水部及び疎水部のパターンを利用した流路型が好ましい。
以下、本発明のバイオチップの実施形態の一例として、親水部及び疎水部からなるパターンを有する生体分子輸送基板を利用した、流路型の素子構造を有するバイオチップを示して詳細に説明する。
【００４６】
本実施形態のバイオチップ４は、図８に示すように、基板本体４１上に、３つの試料配置部４２ａ〜４２ｃと、１つの試薬配置部４３と、１つの検出部（ドレイン）４４とが設けられている。検出部４４には、３つの生体分子配置部４４ａ〜４４ｃが設けられている。各々の生体分子配置部４４ａ〜４４ｃには、それぞれ異なる種類の生体分子ａ〜ｃが固定化された脂質二分子膜が形成されている。また、試料配置部４２ａ〜４２ｃと、試薬配置部４３と、生体分子配置部４４ａ〜４４ｃとは、流路案内部４５により連絡されている。
試料配置部４２ａ〜４２ｃ、試薬配置部４３、生体分子配置部４４ａ〜４４ｃ及び流路案内部４５は、親水部である。基板本体４１上のそれ以外の部分は、金属やレジストなどからなる疎水部である。
流路案内部４５の幅は、１〜１００μｍが好ましい。
【００４７】
バイオチップ４による診断・検出は、例えば、以下の手順で実施できる。
３つの試料配置部４２ａ〜４２ｃに脂質二分子膜を形成し、それぞれの脂質二分子膜上に、検体として末端にヒスチジン残基を有する異なる種類の生体分子を含む検体試料を配する。各試料は、脂質二分子膜の自発展開により輸送され、流路案内部４５に流入して混合される。流路案内部４５では、試薬配置部４３から任意に試薬を流入させて、混合試料に試薬を混合し、試料中の生体分子と反応させることもできる。混合試料は、生体分子配置部４４ａ〜４４ｃに流入する。
【００４８】
検出部４４では、例えば、試料中に生体分子ａと結合する標的分子がある場合、該標的分子が生体分子配置部４４ａにおいて生体分子ａと結合する。オプティカルプローブ５０により各生体分子配置部４４ａ〜４４ｃの分光測定を行うことで、検体試料中の標的分子が特異的に結合した生体分子配置部４４ａ〜４４ｃにおいてのみ、分光信号が観測される。
この流路型のバイオチップ４を用いることにより、試料中に含まれる標的分子を、分子選択的に、同定、定量、診断することが可能となる。
【００４９】
以上説明したバイオチップでは、検出部における生体分子配置部に短時間、かつ高収率で生体分子を固定化できる。また、生体分子は脂質二分子膜に固定化するため、固定化された生体分子の流動性及び安定性が高く、生理機能が長期間にわたり保持される。さらに、固定化する生体分子の位置及び密度の制御、パターンニング、生体分子の輸送などが容易に達成できる。そのため、バイオチップ上の反応点（検出部）を高密度に集積させることが可能であり、バイオチップのスループットの向上、高感度化、小型化、生体分子の輸送に伴う逐次的な生体分子反応計測などの付加価値が得られる。
【実施例】
【００５０】
以下、実施例及び比較例を示して本発明を詳細に説明する。ただし、本発明は以下の記載によっては限定されない。
本実施例では、生体分子として、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を用い、生体分子固定化基板及び生体分子輸送基板を作製した。
【００５１】
＜生体分子固定化基板＞
以下、生体分子固定化基板を作製した例について説明する。
［実施例１］
（脂質二分子膜の形成）
１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−フォスフォコリン（ＤＳＰＣ、１０ｍＭ）のクロロホルム溶液と、ニッケル錯体脂質分子（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−［（Ｎ−（５−アミノ−１−カルボキシペンチル）イミノジアセティックアシッド）スクシニル］（ニッケル塩）、１ｍＭ）のクロロホルム溶液をそれぞれ調製した。その後、脂質全体の質量が２．０ｍｇ、かつ、混合比がＤＳＰＣ：ニッケル錯体脂質分子＝５０：５０（ｍｏｌ％）となるように、それぞれのクロロホルム溶液をガラス瓶内で混合した。その後、混合液にアルゴンガスを吹き付けてクロロホルム溶液を蒸発させ、混合脂質分子からなる膜をガラス瓶の内壁に形成した。さらに、真空下で終夜乾燥し、クロロホルムを完全に除去した。次に、該ガラス瓶に、１．０ｍＬのリン酸緩衝液（ＰＢＳ緩衝液、０．１Ｍリン酸ナトリウム、０．１５Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ７．２）を加え、１分間超音波処理を施し、該緩衝液内で脂質ベシクルを形成した。さらに、該緩衝液をＰＢＳ緩衝液で１０倍希釈（脂質濃度０．２ｍｇ／ｍＬ）し、試料溶液とした。
次に、へき開したマイカ基板上に、前記試料溶液を２０μＬ滴下し、さらにＰＢＳ緩衝液を２００μＬ程度加えた後、該マイカ基板を３０分間、６０℃でアニール処理した。該アニール処理により、脂質ベシクルが素早くマイカ基板上に吸着し、脂質二分子膜が形成された。３０分間静置して試料を室温に戻した後、マイカ基板上の試料の上澄み溶液を吸い取り、脂質分子を含まない以外は試料溶液と同じ組成の緩衝液を滴下する洗浄処理を５回繰り返し、マイカ基板に吸着していない脂質分子を除去して清浄化した。
得られた基板は、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）で観察した。該基板のＡＦＭ像を図９（ａ）に示す。
【００５２】
（生体分子の固定化）
末端がヒスチジンタグ化された緑色蛍光タンパク質（rTurbo GFP、Evogen社製）にＰＢＳ緩衝液を加え、１０μｇ／ｍＬのＧＦＰ溶液を調製した。マイカ基板上に形成した脂質二分子膜上に、該ＧＦＰ溶液を２０μＬ滴下し、吸着時間として３０分静置した。添加したＧＦＰの分子数は７．４×１０−１２ｍｏｌであり、脂質二分子膜内のニッケル錯体脂質分子の分子数（５０ｍｏｌ％混合比）は２．２×１０−９ｍｏｌであった。
その後、ＧＦＰ溶液の上澄み溶液を吸い取り、試料の上澄み溶液を吸い取り、ＰＢＳ緩衝液を滴下し、その上澄み液を吸い取る洗浄処理を５回繰り返し、ニッケル錯体脂質分子に吸着していないＧＦＰを除去して清浄化し、生体分子固定化基板を得た。
ＧＦＰ添加前の基板と、ＧＦＰを添加して得られた生体分子固定化基板は、レーザー蛍光顕微鏡（励起：４８８ｎｍアルゴンレーザー、観測：５０５〜５２５ｎｍ領域観測用の蛍光フィルター、４０倍対物レンズ）にて観察した。ＧＦＰ添加前の基板の蛍光像を図１０（ａ）、ＧＦＰ添加後の基板の蛍光像を図１０（ｂ）に示す。
【００５３】
［実施例２］
ＤＳＰＣとニッケル錯体脂質分子の混合比を、ＤＳＰＣ：ニッケル錯体脂質分子＝７０：３０（ｍｏｌ％）とした以外は、実施例１と同様にして脂質二分子膜を形成し、ＧＦＰを固定化して生体分子固定化基板を得た。脂質二分子膜を形成した基板のＡＦＭ像を図９（ｂ）、ＧＦＰ添加後の基板の蛍光像を図１０（ｃ）に示す。
【００５４】
［実施例３］
ＤＳＰＣとニッケル錯体脂質分子の混合比を、ＤＳＰＣ：ニッケル錯体脂質分子＝９０：１０（ｍｏｌ％）とした以外は、実施例１と同様にして脂質二分子膜を形成し、ＧＦＰを固定化して生体分子固定化基板を得た。脂質二分子膜を形成した基板のＡＦＭ像を図９（ｃ）、ＧＦＰ添加後の基板の蛍光像を図１０（ｄ）に示す。
【００５５】
図７（ａ）に示すように、実施例１では、マイカ基板上に脂質二分子膜を形成した際、直径約１〜２μｍのドメイン領域（以下、「ドメイン領域Ａ」という。）と、ドメイン領域Ａとの高さの差が１ｎｍのドメイン領域（以下、「ドメイン領域Ｂ」という。）が観測された。また、図７（ｂ）、（ｃ）に示すように、実施例２及び３でＤＳＰＣの割合を増加させた場合、ドメイン領域Ａの面積が増大した。このことから、ドメイン領域ＡがＤＳＰＣからなるドメイン領域であり、ドメイン領域Ｂがニッケル錯体脂質分子からなるドメイン領域であることがわかった。ドメイン領域Ａはマイカ基板からの高さが約５ｎｍであった。また、ドメイン領域Ａ、Ｂは、ともに脂質二分子膜の単分子膜構造を形成していた。
観測したＡＦＭ像から、ドメイン領域Ａの面積を計測したところ、脂質二分子膜全体に対する面積比は、実施例１が４７％、実施例２が８１％、実施例３が９４％であり、各例における試料溶液中の混合比とほぼ一致していた。このように、アシル鎖同士の分子間の相互作用が強い飽和型のＤＳＰＣと、不飽和型のニッケル錯体脂質分子を用いることにより、飽和型のＤＳＰＣの周りを不飽和型のニッケル錯体脂質分子が流動的に取り囲んだドメイン領域を有する脂質二分子膜を形成できることが確認された。
【００５６】
また、実施例１におけるＧＦＰの固定化については、図１０（ａ）に示すように、ＧＦＰ添加前は脂質二分子膜の蛍光像は得られないが、ＧＦＰを添加した後は、図１０（ｂ）に示すように、緑色の蛍光像が得られた。また、図１０（ｂ）の蛍光像と図９（ａ）のＡＦＭ像との対応から、ニッケル錯体脂質分子からなるドメイン領域Ｂのみから蛍光が観測されていることが分かった。すなわち、末端がヒスチジンタグ化されたＧＦＰは、ニッケル錯体脂質分子と特異的に結合した。同様に、実施例２及び３についても、図１０（ｃ）及び図１０（ｄ）に示すように、緑色の蛍光像が観測され、図９（ｂ）及び図９（ｃ）との対応から、ニッケル錯体脂質分子からなるドメイン領域Ｂのみから蛍光が観測されていることが確認された。
このように、ニッケル錯体脂質分子と、末端がヒスチジンタグ化された生体分子を用いることにより、生体分子を特定の領域のみに選択的に固定化できることが確認された。
【００５７】
［実施例４］
ＤＳＰＣを１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−フォスフォコリン（ＤＯＰＣ）に変更し、６０℃でのアニール処理を施さずに室温で静置して脂質二分子膜を形成した以外は、実施例１と同様にして脂質二分子膜を形成した。その結果、各脂質分子はドメイン領域を形成せず、それぞれが均一に分散した脂質二分子膜が形成された（図示せず）。これは、不飽和型のＤＯＰＣとニッケル錯体脂質は、室温で両者とも液晶相であり、双方が流動的に混ざり合うためである。
次に、実施例１と同様にして、脂質二分子膜上にＧＦＰを固定化して生体分子固定化基板を得た。ＧＦＰ添加後の基板の蛍光像を図１１（ａ）に示す。
【００５８】
［比較例１］
ニッケル錯体脂質分子を用いない以外は、実施例１と同様にして脂質二分子膜を形成し、ＧＦＰの固定化を行った。ＧＦＰ添加後の基板の蛍光像を図１１（ｂ）に示す。
【００５９】
ＤＯＰＣ：ニッケル錯体脂質分子の混合比を５０：５０（ｍｏｌ％）で形成した脂質二分子膜上にＧＦＰ溶液を添加した実施例４では、図１１（ａ）に示すように、脂質間二分子膜全体に均一に緑色の蛍光像が観測された。
一方、ＤＯＰＣのみからなる脂質二分子膜にＧＦＰ溶液を添加した比較例１では、脂質二分子膜上にヒスチジン残基の吸着サイトが存在しないため、図１１（ｂ）に示すように、ＧＦＰは膜上には固定化されず、蛍光像は観測されなかった。
以上のように、本発明の生体分子固定化基板では、ニッケル錯体脂質分子と組み合わせる脂質分子の種類（飽和・不飽和）や、その混合比などを変化させることにより、タンパク質などの生体分子の固定化密度、固定化領域（局所的あるいは分散）を容易に制御できることが確認された。
【００６０】
＜生体分子輸送基板＞
以下、生体分子輸送基板を作製した例について説明する。
［実施例５］
実施例４と同じＤＯＰＣとニッケル錯体脂質分子からなる脂質二分子膜を用い、室温でのＧＦＰの輸送を試みた。
（タンパク質輸送用試料）
実施例１と同様にして、ＤＯＰＣ：ニッケル錯体脂質分子＝５０：５０（ｍｏｌ％）（合計脂質量：２ｍｇ）になるように、それぞれのクロロホルム溶液を混合した。その混合溶液中に、ＰＢＳ緩衝液で１０μｇ／ｍＬの濃度に調製したＧＦＰ（rTurbo GFP、Evogen社製）を２００μＬ添加した（ＧＦＰ量：２μｇ）。次に、双溶性溶媒であるエタノール１００μＬ程度を、双方の溶液が均一に混合するように添加した。その後、アルゴンガスを吹き付けて、全ての溶液を蒸発させ、ＧＦＰが固定化された混合脂質分子を含む脂質二分子膜をガラス瓶の内壁に形成した。これを真空下で終夜乾燥させ、残存する溶液を完全に除去した。さらに、再度、試料を微量のクロロホルムに浸し、クロロホルムを乾燥させてタンパク質輸送用試料とした。該試料中のＧＦＰの分子数は７．４×１０−１１ｍｏｌであり、混合脂質中のニッケル錯体脂質分子の分子数（５０ｍｏｌ％混合比）は２．２×１０−７ｍｏｌであった。
【００６１】
（パターン化流路基板）
ガラス基板（ガラスウエハ）上に、プライマーとしてヘキサメチルジシロキサンを滴下し、毎分５００回転で３０秒間、引き続き毎分２０００回転で３０秒間のスピンコートを行った。次いで、フォトレジスト（ＴＳＭＲ−Ｖ３、東京応化工業社製）を滴下し、毎分５００回転で３０秒間、引き続き毎分２０００回転で３０秒間のスピンコートを行った。このガラス基板を１２０℃のオーブンで９０秒間ベーキングした。これをフォトマスクによって露光し、引き続き現像した。次に、スパッタ蒸着法によって、ガラス基板上にチタンを５ｎｍ蒸着し、さらに金を４５ｎｍ蒸着した。スパッタ蒸着後のガラス基板を、メチルエチルケトンに浸漬して超音波処理し、リフトオフプロセスによりレジストを溶解・剥離した。次いで、純水流水下で洗浄し、図７に例示した、親水部及び疎水部からなるパターンを有するパターン化流路基板を得た。その後、該パターン化流路基板を、ピラニア溶液（過酸化水素水：硫酸＝１：４）、及びフッ化アンモニウム溶液を用いて洗浄し、ガラス表面のＳｉＯ２面をエッチングして親水化処理を施した。
【００６２】
（タンパク質の輸送）
前記タンパク質輸送用試料をガラス製キャピラリーの先端に付着させ、前記パターン化流路基板の一方の試料収容部（図７、試料収容部３２ａ）に配置した。その後のパターン化流路基板をレーザー蛍光顕微鏡で観察したところ、青色入射光の励起により、前記試料収容部でＧＦＰ由来の緑色発光が確認された（図示せず）。この状態で、レーザー蛍光顕微鏡の対物レンズ（４０倍レンズ使用）と試料との間に、ＰＢＳ緩衝液を静かに注入した。該ＰＢＳ緩衝液の注入から３０、３００、６００、９００、１２００、１５００秒後の蛍光像を図１２（ａ）〜（ｆ）に示す。
【００６３】
図１２（ａ）〜（ｆ）に示すように、流動性の高い脂質分子が親水性の流路内で自発展開し、その自発展開に伴って脂質二分子膜上に固定化されたＧＦＰが輸送された。このＧＦＰの輸送は、疎水的な金属からなる流路外の部分には展開しなかった。また、この生体分子輸送基板は、表面を洗浄して親水性処理を施していたため、有機物質の不純物の存在などによって自発展開速度が遅延するなどの不都合は確認されなかった。
【符号の説明】
【００６４】
１、２ 生体分子固定化基板 １１ 基板本体 １２ 脂質二分子膜 １３ 生体分子 １４ ニッケル錯体脂質分子 １５ 飽和脂質分子 ３ 生体分子輸送基板 ３１ 基板本体 ３２ 親水部 ３３ 疎水部 ３４ 脂質二分子膜 ４ バイオチップ
【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板本体上に脂質二分子膜が形成され、該脂質二分子膜に生体分子が固定化されていることを特徴とする生体分子固定化基板。
【請求項２】
前記脂質二分子膜が、ヒスチジン残基と結合するニッケル錯体部位を有するニッケル錯体脂質分子を含み、前記生体分子がヒスチジン残基を有しており、
前記ニッケル錯体脂質分子のニッケル錯体部位と、前記生体分子のヒスチジン残基の結合により該生体分子が固定化されている、請求項１に記載の生体分子固定化基板。
【請求項３】
前記生体分子が、抗原、抗体、酵素、膜タンパク質、受容体型タンパク質、蛍光タンパク質、細胞骨格、モータータンパク質からなる群から選ばれる少なくとも１種の機能性タンパク質であり、かつ該機能性タンパク質の末端がヒスチジンタグ化されている、請求項２に記載の生体分子固定化基板。
【請求項４】
前記脂質二分子膜が、前記ニッケル錯体脂質分子により形成されたドメイン領域、及びニッケル錯体部位を有さない脂質分子により形成されたドメイン領域からなる脂質二分子膜である、請求項２又は３に記載の生体分子固定化基板。
【請求項５】
前記脂質二分子膜中に前記ニッケル錯体脂質分子が均一に分散している、請求項２〜４のいずれかに記載の生体分子固定化基板。
【請求項６】
基板本体上に脂質二分子膜が形成され、該脂質二分子膜に生体分子が固定化された基板であって、
前記基板本体上に親水部と疎水部からなる所定のパターンが形成されており、
前記脂質二分子膜が、前記親水部表面に、生体分子が固定化された脂質二分子膜を自発展開させて形成されることを特徴とする生体分子輸送基板。
【請求項７】
請求項１〜５に記載の生体分子固定化基板又は請求項６に記載の生体分子輸送基板を用いたバイオチップ。
【請求項８】
多検体の生体分子をハイスループットスクリーニング検出するバイオチップであって、
種類及び／又は濃度の異なる複数の生体分子が、脂質二分子膜に固定化され、前記基板本体上の所定の位置に配置された、請求項７に記載のバイオチップ。
【請求項１】
基板本体上に脂質二分子膜が形成され、該脂質二分子膜に生体分子が固定化されていることを特徴とする生体分子固定化基板。
【請求項２】
前記脂質二分子膜が、ヒスチジン残基と結合するニッケル錯体部位を有するニッケル錯体脂質分子を含み、前記生体分子がヒスチジン残基を有しており、
前記ニッケル錯体脂質分子のニッケル錯体部位と、前記生体分子のヒスチジン残基の結合により該生体分子が固定化されている、請求項１に記載の生体分子固定化基板。
【請求項３】
前記生体分子が、抗原、抗体、酵素、膜タンパク質、受容体型タンパク質、蛍光タンパク質、細胞骨格、モータータンパク質からなる群から選ばれる少なくとも１種の機能性タンパク質であり、かつ該機能性タンパク質の末端がヒスチジンタグ化されている、請求項２に記載の生体分子固定化基板。
【請求項４】
前記脂質二分子膜が、前記ニッケル錯体脂質分子により形成されたドメイン領域、及びニッケル錯体部位を有さない脂質分子により形成されたドメイン領域からなる脂質二分子膜である、請求項２又は３に記載の生体分子固定化基板。
【請求項５】
前記脂質二分子膜中に前記ニッケル錯体脂質分子が均一に分散している、請求項２〜４のいずれかに記載の生体分子固定化基板。
【請求項６】
基板本体上に脂質二分子膜が形成され、該脂質二分子膜に生体分子が固定化された基板であって、
前記基板本体上に親水部と疎水部からなる所定のパターンが形成されており、
前記脂質二分子膜が、前記親水部表面に、生体分子が固定化された脂質二分子膜を自発展開させて形成されることを特徴とする生体分子輸送基板。
【請求項７】
請求項１〜５に記載の生体分子固定化基板又は請求項６に記載の生体分子輸送基板を用いたバイオチップ。
【請求項８】
多検体の生体分子をハイスループットスクリーニング検出するバイオチップであって、
種類及び／又は濃度の異なる複数の生体分子が、脂質二分子膜に固定化され、前記基板本体上の所定の位置に配置された、請求項７に記載のバイオチップ。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【公開番号】特開２０１１−２７６３２（Ｐ２０１１−２７６３２Ａ）
【公開日】平成２３年２月１０日（２０１１．２．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１７５５７２（Ｐ２００９−１７５５７２）
【出願日】平成２１年７月２８日（２００９．７．２８）
【出願人】（０００００４２２６）日本電信電話株式会社 (13,992)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年２月１０日（２０１１．２．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年７月２８日（２００９．７．２８）
【出願人】（０００００４２２６）日本電信電話株式会社 (13,992)
【Ｆターム（参考）】
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