生体触媒を用いたα−ヒドロキシ酸或いはα−ヒドロキシ酸アンモニウムの製造方法
【課題】生体触媒を用いてα−ヒドロキシニトリル化合物からα−ヒドロキシ酸又はα−ヒドロキシ酸アンモニウムを製造する方法の提供。
【解決手段】ニトリラーゼ活性を有する微生物菌体に由来する生体触媒を用いてα−ヒドロキシニトリルをα−ヒドロキシ酸アンモニウムに変換する工程を含むα−ヒドロキシ酸又はα−ヒドロキシ酸アンモニウムの製造方法において、該生体触媒として、α−ヒドロキシニトリルをα−ヒドロキシ酸アンモニウムに変換する反応の初期比活性が３２[mmol/g-乾燥生体触媒/Hr]以上であるニトリラーゼ活性を有する生体触媒を用いることを特徴とするα−ヒドロキシ酸又はα−ヒドロキシ酸アンモニウムの製造方法。
【解決手段】ニトリラーゼ活性を有する微生物菌体に由来する生体触媒を用いてα−ヒドロキシニトリルをα−ヒドロキシ酸アンモニウムに変換する工程を含むα−ヒドロキシ酸又はα−ヒドロキシ酸アンモニウムの製造方法において、該生体触媒として、α−ヒドロキシニトリルをα−ヒドロキシ酸アンモニウムに変換する反応の初期比活性が３２[mmol/g-乾燥生体触媒/Hr]以上であるニトリラーゼ活性を有する生体触媒を用いることを特徴とするα−ヒドロキシ酸又はα−ヒドロキシ酸アンモニウムの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は，ニトリラーゼ活性を有する生体触媒を用いてα−ヒドロキシ酸或いはα−ヒドロキシ酸アンモニウム、とりわけグリコール酸或いはグリコール酸アンモニウムを製造する方法に関する
【背景技術】
【０００２】
酵素活性を有する生体触媒を利用して目的の化合物を合成する方法は、反応条件が穏和であるため反応プロセスが簡略化できること、あるいは副生成物が少なく高純度の反応生成物を取得できる等の利点があるため、近年、様々な化合物の製造に用いられている。中でもニトリル化合物をカルボン酸或いはカルボン酸アンモニウムに変換する活性を持つニトリラーゼやニトリル化合物をカルボン酸アミドに変換する活性を持つニトリルヒドラターゼ等の加水分解酵素は、その特異的な反応挙動から、様々なカルボン酸或いはカルボン酸アンモニウム及びカルボン酸アミドの製造に用いる検討がなされている。
【０００３】
それらの中で、ニトリラーゼ活性を有する生体触媒を用いて、α−ヒドロキシニトリルをα−ヒドロキシ酸アンモニウムに変換するα−ヒドロキシ酸或いはα−ヒドロキシ酸アンモニウムの製造方法も数多く検討されている。例えばCorynebacterium属を用いてグリコール酸、乳酸、２−ヒドロキシイソ酪酸を製造する方法(特許文献1)、或いはRhodococcus属またはGordona属を用いてグリコール酸を製造する方法(特許文献２)、或いはAcidovorax属を用いてグリコール酸、２−ヒドロキシイソ酪酸を製造する方法(特許文献３)、或いはBrevibacterium属を用いて乳酸を製造する方法(特許文献４)、或いはPseudomonas属またはArthrobacter属またはAspergillus属またはPenicillium属またはCochliobolus属またはFusarium属を用いて乳酸、２−ヒドロキシイソ酪酸、２−ヒドロキシ−２−フェニルプロピオン酸、マンデル酸、を製造する方法(特許文献５)、或いはEnterobacter属またはArthrobacter属またはCaseobacter属またはBrevibacterium属またはAureobacterium属またはEscherichia属またはMicrococcus属またはStreptomyces属またはFlavobacterium属またはAeromonas属またはNocardia属またはMycoplana属またはCellulomonas属またはErwinia属またはCandida属またはPseudomonas属またはRhodococcus属またはBacillus属またはAlcaligenes属またはCorynebacterium属またはMyclobacterium属またはObsumbacterium属を用いてD-乳酸を製造する方法(特許文献６)、或いはGordona属を用いてＬ−３−フェニル乳酸、Ｌ−４−フェニル−２−ヒドロキシ酪酸、Ｄ−マンデル酸及びその誘導体を製造する方法(特許文献７)、Rhodococcus属またはAlcaligenes属またはBrevibacterium属またはPseudomonas属を用いてＬ−３−フェニル乳酸、Ｌ−４−フェニル−２−ヒドロキシ酪酸を製造する方法(特許文献８)、或いはRhodococcus属またはAlcaligenes属またはBrevibacterium属またはPseudomonas属を用いてＬ−３−フェニル乳酸、Ｌ−４−フェニル−２−ヒドロキシ酪酸を製造する方法(特許文献９)、或いはGordona属を用いてＬ−３−フェニル乳酸、Ｄ−マンデル酸及びその誘導体を製造する方法(特許文献１０)、或いはPantoea属またはMicrococcus属またはBacteridium属またはBacillus属またはActinomadura属またはKitasatospora属またはPilimelia属またはAchromobacter属またはBeijerinckia属またはCelluslomonas属またはKlebsiella属またはActinopolispora属またはActinosynnema属またはActinopulanes属またはAmycolata属またはSaccharopolyspora属またはStreptomyces属またはNocardioides属またはProvindencia属またはMirobacterium属またはRhodobacter属またはRhodospirillum属またはCaceobcter属またはPseudomonas属またはAlcaligenes属またはCorynebaterium属またはBrevibacterium属またはNocardia属またはRhodococcus属またはArthrobacter属またはTorulopsis属またはRhodopseudomonas属またはAcinetobacter属またはMycobacterium属またはCandida属またはAgrobacterium属またはAspergillus属またはPenicillium属またはCochliobolus属またはFusarium属またはEnterobacter属またはXanthobacter属またはErwinia属またはCitrobacter属またはAeromonas属またはGordona属を用いて２−ヒドロキシ−４−メチルチオ酪酸を製造する方法(特許文献１１)、或いはAlcaligenes属を用いて２−ヒドロキシ−４−メチルチオ酪酸を製造する方法(特許文献１２)、或いはVarioovorax属またはArthrobacter属を用いて乳酸、２−ヒドロキシ−４−メチルチオ酪酸を製造する方法(特許文献１３)、或いは或いはEscherichia属またはPseudomonas属またはAlcaligenes属を用いてR-マンデル酸、の製造方法(特許文献１４)、或いはArthrobacter属を用いて２−ヒドロキシ−４−メチルチオ酪酸を製造する方法(特許文献１５〜１７)、或いはRhodococcus属を用いて２−ヒドロキシ−４−メチルチオ酪酸を製造する方法(特許文献１８)、或いはCorynebacterium属を用いてマンデル酸を製造する方法(特許文献１９)、或いはEnterobacter属またはArthrobacter属またはCaseobacter属またはBrevibacterium属またはAureobacterium属またはEschrichia属またはMicrococcus属またはStreptomyces属またはFlavobacterium属またはAeromonas属またはNocardia属またはMycoplana属またはCellulomonas属またはErwinia属またはCandida属またはPseudomonas属またはRhodococcus属またはBacillus属を用いてＬ−乳酸を製造する方法(特許文献２０)、或いはAureobacterium属またはPseudomonas属またはCaseobacter属またはAlcaligenes属またはAcinetobacter属またはBrevibacterium属またはNocardia属を用いてR−マンデル酸及びその誘導体を製造する方法(特許文献２１〜２３)、Rhodococcus属を用いてR−マンデル酸を製造する方法(特許文献２５、２７)、或いはAlcaligenes属を用いてＲ−マンデル酸を製造する方法(特許文献２６)、Alcaligenes属の由来のニトリラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子DNAをベクターに組み込んだ組み替え体DNAで形質転換された形質転換体を用いてＲ−マンデル酸を製造する方法(特許文献２８)、或いはAlcaligenes属またはCorynebacterium属を用いてＲ−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸を製造する方法(特許文献２９)、或いはAcinetobacter属またはAlcaligenes属またはPseudomonas属またはRhodopseudomonas属またはCorynebacterium属またはBacillus属またはMycobacterium属またはRhodococcus属またはNocardia属またはArthrobacter属またはKlebsiella属またはCandida属を用いて3-(S)-tert.-フ゛トキシカルホ゛ニルアミノ-4-シクロヘキシル-2-(R)-ヒドロキシ酪酸を製造する方法(特許文献３０)、或いはRhodococcus属またはPseudomonas属またはArthrobacter属またはBrevibacterium属を用いて２−ヒドロキシイソ酪酸を製造する方法(特許文献３１)、或いはRhodococcus属を用いて２−ヒドロキシイソ酪酸を製造する方法(特許文献３２)、或いはAchromobacter属を用いて２−ヒドロキシイソ酪酸を製造する方法(特許文献３３)等が開示されている。
【０００４】
これら先行文献に開示されたα−ヒドロキシ酸の製造方法においては、α−ヒドロキシニトリルを微生物触媒(ニトリラーゼ)で加水分解し、まずα−ヒドロキシ酸アンモニウムを得て、これを当業者によく知られている通常の方法、例えば酸による中和、イオン交換樹脂カラム、電気透析、熱分解等の方法により、遊離のα−ヒドロキシ酸を製造している。
【０００５】
しかしながら、前述の従来の技術では、用いている各種生体触媒の持つ加水分解酵素、つまりニトリラーゼがα−ヒドロキシニトリルに対して必ずしも工業的に満足できる初期比活性及びまたは初期生産速度を有しておらず、リアクターサイズが非常に大きくなる等の問題を抱えており、更なるニトリラーゼ初期比活性及びまたは初期生産速度の向上が求められていた。
【０００６】
更に、工業的にα−ヒドロキシ酸或いはα−ヒドロキシ酸アンモニウムを製造する場合、経済的理由から高い生成物蓄積濃度が必要となるが、特に20重量%以上のような高濃度α-ヒドロキシ酸アンモニウムを製造する場合、反応初期のニトリラーゼ比活性及びまたは初期生産速度が高いにも拘らず、反応が進行し反応生成物の蓄積濃度が上がるにつれて、生成物阻害及びまたは失活、或いは高生成物蓄積濃度で初めて顕著となる基質阻害及びまたは失活のため、結果的に反応初期から反応終了時に至る時間平均のニトリラーゼ生産速度が低くなり、実用的な反応時間での高蓄積濃度の達成及びまたは実用的なリアクターサイズでの大量のα−ヒドロキシ酸或いはα−ヒドロキシ酸アンモニウムの製造ができるレベルではなかった。また、この解決法として大量の生体触媒を用いて短時間に生成物の高蓄積濃度を達成する方法が考えられるが、その場合、乾燥生体触媒重量当たりの生産量(=生体触媒の生産能力)が低いので触媒コストが非常に高く、とても実用的なものとは言えなかった。また、そのように大量の生体触媒を用いると、後の精製工程に多大な負荷をかけ、品質の低下或いは精製コストの上昇を招き、益々工業的には不利なもとなる。
【０００７】
例えば、前記特許文献１では、Corynebacterium属を用いて、乳酸アンモニウム平均生産速度が１５．４ｍｍｏｌ／ｇ−乾燥菌体／Ｈｒ、乳酸アンモニウム蓄積濃度が９．８重量％（３０℃×４Ｈｒ）、乳酸アンモニウム生産量が０．１６４ｍｏｌ／ｇ−乾燥菌体であることが記載されている。また、前記特許文献３では、Acidovorax属を用いて、グリコール酸アンモニウム平均生産速度が１．７ｍｍｏｌ／ｇ−乾燥菌体／Ｈｒ、グリコール酸アンモニウム蓄積濃度が９．３重量％、グリコール酸アンモニウム生産量が０．０６９ｍｏｌ／ｇ−乾燥菌体であることが記載されている。
また、前記特許文献３３では、Achromobacter属を用いて、２−ヒドロキシイソ酪酸アンモニウム平均生産速度が１．８ｍｍｏｌ／ｇ−乾燥菌体／Ｈｒ、２−ヒドロキシイソ酪酸アンモニウム蓄積濃度が３．７重量％（３０℃×１０Ｈｒ）、２−ヒドロキシイソ酪酸アンモニウム生産量が０．０１８ｍｏｌ／ｇ−乾燥菌体であることが記載されている。これらの例はいずれも工業的に満足できるレベルの平均生産速度を有しているとは言えない。
【０００８】
一方、例えば、前記特許文献１７では、Arthrobacter属を用いて、２−ヒドロキシ−４−メチルチオ酪酸アンモニウム蓄積濃度が４９重量％（３０℃×１９Ｈｒ）と非常に高いものもあるが、２−ヒドロキシ−４−メチルチオ酪酸平均生産速度が２３．３ｍｍｏｌ／ｇ−乾燥菌体／Ｈｒ（３５℃×１８Ｈｒ）、２−ヒドロキシ−４−メチルチオ酪酸生産量が０．０７ｍｏｌ／ｇ−乾燥菌体と低い値であることが記載されている。また、前記特許文献２では、Rhodococcus属またはGordona属を用いて、グリコール酸アンモニウム蓄積濃度が４８．２重量％（２０℃×２４Ｈｒ）と非常に高く、しかもグリコール酸アンモニウム生産量も０．７７ｍｏｌ／ ｇ−乾燥菌体と非常に高いが、グリコール酸アンモニウム平均生産速度が１８．５ｍｍｏｌ／ｇ−乾燥菌体／Ｈｒ（２０℃×２４Ｈｒ）と低い値であることが記載されている。これらの例も、いずれも工業的に満足できるレベルの平均生産速度を有しているとは言えない。
【０００９】
このように生成物蓄積濃度或いはまた初期生産速度及びまたは平均生産速度及びまたは乾燥生体触媒重量当たりの生産量が低い理由として、一般的にα―ドロキシニトリルが水溶液中で対応するアルデヒドもしくはケトンと青酸に部分的に分解・解離(非特許文献１)し、青酸によって酵素活性が阻害されることが挙げられる。(非特許文献２)また、解離したアルデヒドの作用で酵素が短時間で失活する可能性も指摘されており、これを解決するための方法として、反応系内に、亜硫酸イオン、酸性亜硫酸イオンまたは亜ジチオン酸イオンを添加する方法(特許文献３４、３５)、亜燐酸イオンまたは次亜燐酸イオンを添加する方法(特許文献３６)が提案されている。しかしながら、これらの添加物を使用してもα−ヒドロキシ酸或いはα−ヒドロキシ酸アンモニウムの生成蓄積濃度は決して高くはなく、Alcaligenes属によるマンデル酸の蓄積濃度１６．６重量％(特許文献３４，３５)、Gordona属によるマンデル酸の蓄積濃度１２重量%(特許文献３６)がそれぞれ実施例に示されている。
【００１０】
また、反応系中のシアンヒドリン濃度をコントロールすることにより、シアンヒドリンや部分的分解・解離生成物であるアルデヒド及びまたは青酸による酵素活性阻害及びまたは失活の影響を少なくする方法(特許文献３７)が開示されている。この方法によれば、マンデル酸蓄積濃度２０重量％を達成できることが実施例に示されているが、使用菌体量が、ＯＤ630＝４．２とかなり多く、恐らく初期生産速度及びまたは平均生産速度及びまたは乾燥生体触媒重量当たりの生産量がかなり低いものと推定される。
【００１１】
つまり、工業的に充分な生産性を有するために必要な、実用的な反応時間で高蓄積濃度を達成できる及びまたは実用的なリアクターサイズで大量のα−ヒドロキシ酸或いはα−ヒドロキシ酸アンモニウムを製造できる、実質的に高いニトリラーゼ比活性を有する生体触媒を用いた工業的なα−ヒドロキシ酸或いはα−ヒドロキシ酸アンモニウムの製造方法がないのが実状である。
【００１２】
【特許文献１】特公平３−３８８３６号公報
【特許文献２】特開平９−０２８３９０号公報
【特許文献３】特表２００５−５０４５０６号公報
【特許文献４】米国特許第３９４０３１６号明細書
【特許文献５】特公平４−６３６７５号公報
【特許文献６】米国特許第５２３４８２６号明細書
【特許文献７】特開平６−２３７７８９号公報
【特許文献８】特開平６−２８４８９９号公報
【特許文献９】欧州特許出願公開第６１００４９号明細書
【特許文献１０】欧州特許出願公開第６１００４８号明細書
【特許文献１１】特開平１０−１７９１８３号公報
【特許文献１２】特表２００１−５０２９０８号公報
【特許文献１３】米国特許第６０３７１５５号明細書
【特許文献１４】特表２００２−５２７１０６号公報
【特許文献１５】特開２００２−３４５８４号公報
【特許文献１６】国際公開第２００２／０５２０２７号パンフレット
【特許文献１７】国際公開第２００３／０６２４３７号パンフレット
【特許文献１８】特開２００４−８１１６９号公報
【特許文献１９】特開昭６２−２９６８８３号公報
【特許文献２０】特開平４−９９４９７号公報
【特許文献２１】特開平４−９９４９６号公報
【特許文献２２】特開平４−９９４９５号公報
【特許文献２３】特開平４−２１８３８５号公報
【特許文献２４】特開平５−９５７９５号公報
【特許文献２５】特開平５−１９２１８９号公報
【特許文献２６】特開平４−３４１１８５号公報
【特許文献２７】米国特許第５２９６３７３号明細書
【特許文献２８】特開平６−１５３９６８号公報
【特許文献２９】特開平５−１９２１９０号公報
【特許文献３０】特開平６−３１９５９１号公報
【特許文献３１】特開平４−４０８９７号公報
【特許文献３２】特開平５−２１９９６９号公報
【特許文献３３】特開平６−２３７７７６号公報
【特許文献３４】特開平５−１９２１８９号公報
【特許文献３５】米国特許第５３２６７０２号明細書
【特許文献３６】特開平７−２１３２９６号公報
【特許文献３７】特開平８−１３１１８８号公報
【非特許文献１】Chemical Reviews,42,189- ,(1948)
【非特許文献２】Agricultural Biological Chemistry,46,1165- ,(1982)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の課題は、ニトリラーゼ活性を有する微生物菌体由来の生体触媒を用いてα−ヒドロキシニトリル化合物からα−ヒドロキシ酸或いはα−ヒドロキシ酸アンモニウムを製造するに当たり、実用的な反応時間での高蓄積濃度の達成及びまたは実用的なリアクターサイズでの大量のα−ヒドロキシ酸或いはα−ヒドロキシ酸アンモニウムの製造を実用的なレベルの触媒コストと製品品質で達成できる工業的α−ヒドロキシ酸或いはα−ヒドロキシ酸アンモニウムの製造法を提供することに有る。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らはニトリラーゼ活性を有する微生物菌体由来の生体触媒を用いてα−ヒドロキシニトリル化合物からα−ヒドロキシ酸或いはα−ヒドロキシ酸アンモニウムを製造するに当たり、実用的な反応時間で高蓄積濃度を達成でき、また、実用的なリアクターサイズで大量のα−ヒドロキシ酸或いはα−ヒドロキシ酸アンモニウムの製造を実用的なレベルの触媒コストと製品品質で達成できる、工業的α−ヒドロキシ酸或いはα−ヒドロキシ酸アンモニウムの製造法について鋭意検討を行ったところアシネトバクター・エスピー(Acinetobacter sp.)AK226(FERM BP-08590)が今まで知られている微生物の中で最も高いα−ヒドロキシニトリル加水分解能力を有すること、つまり、目的と
する初期比活性、初期生産速度、平均生産速度、蓄積濃度、g乾燥生体触媒重量当たりの生産量を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１５】
即ち本発明は、以下に記載する通りの構成を有する。
［１］ニトリラーゼ活性を有する微生物菌体に由来する生体触媒を用いてα−ヒドロキシニトリルをα−ヒドロキシ酸アンモニウムに変換する工程を含むα−ヒドロキシ酸又はα−ヒドロキシ酸アンモニウムの製造方法において、該生体触媒として、α−ヒドロキシニトリルをα−ヒドロキシ酸アンモニウムに変換する反応の初期比活性が３２[mmol/g-乾燥生体触媒/Hr]以上であるニトリラーゼ活性を有する生体触媒を用いることを特徴とするα−ヒドロキシ酸又はα−ヒドロキシ酸アンモニウムの製造方法。
［２］生体触媒が蓄積できるα−ヒドロキシ酸アンモニウム濃度が２０〜７０重量％であるニトリラーゼ活性を有する生体触媒を用いることを特徴とする請求項1記載のα−ヒドロキシ酸或いはα−ヒドロキシ酸アンモニウムの製造方法。
［３］生体触媒が、g乾燥生体触媒重量当たりのα−ヒドロキシ酸アンモニウムの生産量が０．７８[mol/g-乾燥生体触媒]以上であるニトリラーゼ活性を有する生体触媒であることを特徴とする［１］、［２］記載のα−ヒドロキシ酸或いはα−ヒドロキシ酸アンモニウムの製造方法。
［４］生体触媒が、α−ヒドロキシ酸アンモニウムの初期生産速度が３２[mmol/g-乾燥生体触媒/Hr]以上であり、且つ平均生産速度が１６[mmol/g-乾燥生体触媒/Hr]以上であるニトリラーゼ活性を有する生体触媒であることを特徴とする［１］〜［３］記載のα−ヒドロキシ酸或いはα−ヒドロキシ酸アンモニウムの製造方法。
［５］α−ヒドロキシニトリルをα−ヒドロキシ酸アンモニウムに変換する反応の反応系中のｐＨを６以上８以下、且つ反応温度を３０〜６０℃にコントロールすることを特徴とする［１］〜［４］記載のα−ヒドロキシ酸或いはα−ヒドロキシ酸アンモニウムの製造方法。
［６］生体触媒が、アシネトバクター属に属する微生物菌体に由来する生体触媒であることを特徴とする［１］〜［５］記載のα−ヒドロキシ酸或いはα−ヒドロキシ酸アンモニウムの製造方法。
［７］アシネトバクター属に属する微生物菌体が、アシネトバクター・エスピー(Acinetobacter sp.)AK226或いはアシネトバクター・エスピー(Acinetobacter sp.)AK227又はそれら菌体より誘導された微生物菌体であることを特徴とする［６］記載のα−ヒドロキシ酸或いはα−ヒドロキシ酸アンモニウムの製造方法。
［８］アシネトバクター属に属する微生物菌体が、アシネトバクター・エスピー(Acinetobacter sp.)AK226又はそれら菌体より誘導された微生物菌体であることを特徴とする［７］記載のα−ヒドロキシ酸或いはα−ヒドロキシ酸アンモニウム)の製造方法。
［９］生体触媒が、微生物菌体そのもの、該微生物の菌体処理物、該微生物の抽出物、該微生物の固定化物、該微生物から単離されたニトリラーゼ酵素、該微生物から単離されたニトリラーゼ酵素の固定化物、あるいは該微生物のニトリラーゼ活性をコードする遺伝子を別の生物に組み替え、該ニトリラーゼ活性を発現させたもの、その処理物、抽出物、固定化物、該生物から単離されたニトリラーゼ酵素、該生物から単離されたニトリラーゼ酵素の固定化物よりなる群から選ばれた少なくとも一種であることを特徴とする［１］〜［８］記載のα−ヒドロキシ酸或いはα−ヒドロキシ酸アンモニウムの製造方法。
［１０］基質として用いるα−ヒドロキシニトリルがグリコロニトリルである［１］〜［９］記載のグリコール酸或いはグリコール酸アンモニウムの製造方法。
【発明の効果】
【００１６】
本発明は、ニトリラーゼ活性を有する微生物菌体由来の生体触媒を用いてα−ヒドロキシニトリル化合物からα−ヒドロキシ酸或いはα−ヒドロキシ酸アンモニウムを製造するに当たり、実用的な反応時間での高蓄積濃度の達成及びまたは実用的なリアクターサイズでの大量のα−ヒドロキシ酸或いはα−ヒドロキシ酸アンモニウムの製造を実用的なレベルの触媒コストと製品品質で達成できるα−ヒドロキシ酸或いはα−ヒドロキシ酸アンモニウムの製造法を提供できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下本願発明について具体的に説明する。
本発明で言うニトリラーゼ活性を有する微生物菌体に由来する生体触媒とは、ニトリル基をカルボン酸基或いはカルボン酸アンモニウム基へ直接変換する能力を有する微生物菌体由来のニトリラーゼ酵素を保有する触媒であれば如何なる形態のものでもよい。
【００１８】
微生物種としては多くのものが知られているが、例えばニトリラーゼ高活性を有するものとして、Rhodococcus属、Acinetobacter属、Alcaligenes属、Pseudomonas属、Corynebacterium属等が挙げられる。本発明においてはこれらの中でも、特にグラム陰性菌であるAcinetobacter属、Alcaligenes属が好ましく、更に好ましくはAcinetobacteｒ属がよい。具体的にはAcinetobacter sp.AK226(FERM BP-08590)、Acinetobacter sp.AK227(FERM- BP-08591)である。これらの菌株は、特開２００５−１７６６３９、特開２００４−３０５０６６、特開２００４−３０５０５８、特開２００４−３０５０６２、特開２００１−２９９３７８、特開平１１−１８０９７１、特開平０６−３０３９９１、特開昭６３−２０９５９２、特公昭６３−２５９６号公報等に記載されている。
【００１９】
また例えば、天然の或いは人為的に改良したニトリラーゼ遺伝子を遺伝子工学的手法によって組み込んだ微生物、或いはそこから取り出したニトリラーゼ酵素であっても構わないが、ニトリラーゼの発現量が少ない微生物或いはα−ヒドロキシニトリルからα−ヒドロキシ酸アンモニウムへの変換活性の低いニトリラーゼを発現した微生物を少量用いてα−ヒドロキシ酸(アンモニウム)を製造するには、より多くの反応時間を要するため、可能な限りニトリラーゼを高発現した微生物、及びまたは変換活性の高いニトリラーゼを発現した微生物、或いはそこから取り出したニトリラーゼ酵素を用いることが望ましい。
【００２０】
生体触媒の形態としては微生物細胞を休眠状態でそのまま使用しても構わないし、或いは破砕処理したもの、または該微生物細胞から必要なニトリラーゼ酵素を取り出したものをそのまま使用しても構わないし、一般的な包括法、架橋法、担体結合法等で固定化したものを使用してもよい。尚、固定化担体の例としては、ガラスビーズ、シリカゲル、ポリウレタン、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、カラギーナン、アルギン酸、光架橋樹脂等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２１】
微生物をそのまま用いる場合、水(蒸留水及びまたはイオン交換水)のみに懸濁させても構わないが、通常、ニトリラーゼ活性の長期保持の観点から無機塩のバッファー液に懸濁させて使用する。また、固定化したものを用いる場合にも同じく、通常、バッファー液に懸濁させて使用する。この時のバッファー液濃度は、反応液中の不純物低減の観点から低ければ低いほどよいが、生体触媒の安定性、ニトリラーゼ活性の保持の観点からは通常０．１Ｍ未満であり、好ましくは０．０１〜０．０８Ｍ、より好ましくは０．０２〜０．０６Ｍである。
【００２２】
本発明で言うα−ヒドロキシニトリルとは、一般式［Ｉ］：ＲＣＨ（ＯＨ）ＣＮ（式中Ｒは水素原子、置換基を有してもよいＣ１〜Ｃ６のアルキル基、置換基を有してもよいＣ２〜Ｃ６のアルケニル基、置換基を有してよいＣ１〜Ｃ６アルコキシル基、置換基を有してもよいアリール基、置換基を有してもよいアリールオキシ基又は置換基を有してもよい複素環基を示す。）で表されるα−ヒドロキシニトリルを言い、例えば、マンデロニトリル、アセトンシアンヒドリン、グリコロニトリル、ラクトニトリル、２−ヒドロキシ−４−メチルチオンブチロニトリル等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２３】
本発明で言う初期比活性は、本発明にとって非常に重要なファクターである。元来、該初期比活性は反応条件によって大きく変わるものであるが、本発明における該初期比活性とは、反応温度３０℃、ｐＨ＝６．５〜７．０、反応基質濃度：１ｗｔ％の反応条件で、生体触媒リン酸バッファー懸濁液にα−ヒドロキシニトリル水溶液を添加することで反応を開始し、反応開始から５分におけるα−ヒドロキシ酸アンモニウム生産モル量を使用乾燥生体触媒重量で除し、更に反応時間（５分＝１／１２時間）で除することにより得られる、乾燥生体触媒重量当たり、１時間当たりのα−ヒドロキシ酸アンモニウム生産量と定義する。但し、菌体使用量はα−ヒドロキシニトリル転化率が１５〜３０％になるように調整するものとする。本発明においては、該初期比活性が３２［mmol/g-乾燥生体触媒／Hr］以上であることが必須であり、好ましくは５０［mmol/g-乾燥生体触媒／Hr］以上、より好ましくは１００［mmol/g-乾燥生体触媒／Hr］以上、更に好ましくは２００［mmol/g-乾燥生体触媒／Hr］以上、最も好ましくは３００［mmol/g-乾燥生体触媒／Hr］以上がよい。
【００２４】
本発明における生体触媒が蓄積できるα−ヒドロキシ酸アンモニウム濃度は、本発明にとって非常に重要なファクターである。本発明における生体触媒が蓄積できるα−ヒドロキシ酸アンモニウム濃度とは、生体触媒懸濁液にα−ヒドロキシニトリル水溶液を連続的或いは間欠的に添加することで反応を開始し、反応中の反応液中のα−ヒドロキシニトリル濃度を基質阻害の現れる濃度以下にコントロールしながら反応させた時に到達し得るα−ヒドロキシ酸アンモニウムの重量濃度のことである。本発明においては２０重量％以上が必須であり、好ましくは３０重量％以上、より好ましくは４０重量％以上、更に好ましくは５０重量％以上、最も好ましくは６０重量％以上がよい。
【００２５】
本発明で言うg乾燥生体触媒重量当たりの生産量は、本発明にとって非常に重要なファクターである。本発明におけるg乾燥生体触媒重量当たりの生産量とは、生体触媒懸濁液にα−ヒドロキシニトリル水溶液を連続的或いは間欠的に添加することで反応を開始し、反応中の反応液中のα−ヒドロキシニトリル濃度を基質阻害の現れる濃度以下にコントロールしながら反応させた時に、α−ヒドロキシ酸アンモニウム蓄積濃度の増加に伴い現れる生成物阻害又は失活或いはその他要因によって引き起こされる阻害又は失活によって反応が完全に停止した時点までのα−ヒドロキシ酸アンモニウムの生産モル量を使用乾燥生体触媒重量で除することで得られる、乾燥生体触媒重量当たりのα−ヒドロキシ酸アンモニウム生産モル量のことである。本発明においては、０．７８［mol/g-乾燥生体触媒］以上であることが必須であり、好ましくは２［mol/g-乾燥生体触媒］以上、より好ましくは３［mol/g-乾燥生体触媒］以上、更に好ましくは４［mol/g−乾燥生体触媒］以上、最もこの好ましくは５［mol/g-乾燥生体触媒］以上がよい。
【００２６】
初期生産速度は、本発明にとって非常に重要なファクターである。本発明における初期生産速度は、任意の反応条件で、生体触媒懸濁液にα−ヒドロキシニトリル水溶液を連続的或いは間欠的に添加する事で反応を開始し、反応開始から1時間におけるα−ヒドロキシ酸アンモニウム生産モル量を使用乾燥生体触媒重量で除することにより得られる、乾燥生体触媒重量当たり、1時間当たりのα−ヒドロキシ酸アンモニウム生産量と定義する。本発明においては、該初期生産速度が３２[mmol/g-乾燥生体触媒/Hr]以上、好ましくは５０[mmol/g-乾燥生体触媒/Hr]以上、より好ましくは１００[mmol/g-乾燥生体触媒/Hr]以上、更に好ましくは２００[mmol/g-乾燥生体触媒/Hr]以上、最も好ましくは３００[mmol/g-乾燥生体触媒/Hr]以上がよい。
【００２７】
本発明で言う平均生産速度は、本発明にとって非常に重要なファクターである。本発明における平均生産速度は、任意の反応条件で、生体触媒懸濁液にα−ヒドロキシニトリル水溶液を連続的或いは間欠的に添加する事で反応を開始し、生成物であるα−ヒドロキシ酸アンモニウム蓄積濃度が高くなるにつれて引き起こされる活性低下の結果、生産速度が初期生産速度の１／２に低下した時点までの時間平均の生産速度のことであり、その時点までのα−ヒドロキシ酸アンモニウムの生産モル量を反応時間で除することにより得られる。本発明における平均生産速度は、１６[mmol/g-乾燥生体触媒/Hr]以上が必須であり、好ましくは３２[mmol/g-乾燥生体触媒/Hr]以上、より好ましくは５０[mmol/g-乾燥生体触媒/Hr]以上、更に好ましくは１００[mmol/g-乾燥生体触媒/Hr]以上、最も好ましくは１５０[mmol/g-乾燥生体触媒/Hr]以上がよい。
【００２８】
反応液のｐＨは、１）使用する生体触媒のニトリラーゼ比活性の至適ｐＨと２）基質α−ヒドロキシニトリルのＨＣＮとアルデヒド或いはケトンへの分解抑制の観点から決定される。１）については、α−ヒドロキシニトリル以外のニトリルの加水分解活性挙動よりｐＨ＝７〜１１のアルカリ性領域がよいと推定されるが、２）の観点からは、ｐＨ＝２程度の酸性領域がよいことが判っている。本発明においては反応液のｐＨは６〜８がよく、好ましくは６．５〜７がよい。
【００２９】
原料であるα−ヒドロキシニトリルは非常に不安定な物質であるため、通常、安定剤として硫酸やリン酸或いは酢酸といった酸成分を含む。よって、反応系中のｐＨを調整するには反応系へのアルカリの添加が必須となる。その場合使用するアルカリは反応に影響を及ぼさなければ特に限定されないが、生成物の一つであるアンモニアを使用するのが望ましい。アンモニアの形態はガスであっても、アンモニア水であっても構わないが、通常、扱いの容易さからアンモニア水が望ましい。
【００３０】
反応温度については、反応温度が低すぎると反応活性が低くなり、高濃度のα−ヒドロキシ酸アンモニウムを製造する場合、より多くの反応時間を要する。一方、反応温度が高すぎると生体触媒の熱劣化で、目的とするα−ヒドロキシ酸アンモニウムの濃度が高い場合、該濃度まで到達させることが困難となり、結果として新たな生体触媒の追添等の処置が必要となり触媒コストが高くなる。また、温度が高すぎると、基質α−ヒドロキシニトリルのＨＣＮとアルデヒド或いはケトンへの分解促進にも繋がり、それらによる反応阻害や失活等、ますますの反応活性低下を引き起こす。よって、通常、反応温度は３０〜６０℃がよく、好ましくは４０〜５０℃がよい。
【００３１】
α−ヒドロキシ酸(アンモニウム)を製造する反応方法は、固定床、移動層、流動層、撹拌槽等、いずれでもよく、また連続反応でも半回分反応でもよいが、特に固定化されていない微生物菌体を用いる場合、反応の容易性から攪拌槽を用いた半回分反応がよい。その場合、反応効率の観点から、適切な攪拌を行うのがよい。
【００３２】
また、半回分反応を行う場合、生体触媒は1バッチ使い捨てでもよいし、繰り返し反応を行ってもよい。但し、繰り返し反応を行う場合、該生体触媒をα−ヒドロキシ酸アンモニウム高濃度から低濃度へ急激に変化させるため、浸透圧の影響等で比活性が低下する場合があるので注意を要する。
【００３３】
反応基質であるα−ヒドロキシニトリル化合物の定常濃度については、４重量％以下が好ましく、より好ましくは２重量％以下、更に好ましくは１重量％以下、最も好ましくは０．３重量％以下にコントロールするのがよい。α−ヒドロキシニトリル化合物の濃度が高すぎると、生成物阻害及びまたは失活、或いは高生成物蓄積濃度で初めて顕著となる基質阻害及びまたは失活の影響が急激に大きくなり、それまで進行していた反応が停止してしまう場合がある。また、α−ヒドロキシニトリル化合物の濃度が低すぎると反応速度を低下させることとなり、効率的にα−ヒドロキシ酸或いはα−ヒドロキシ酸アンモニウムを製造できないので不利である。以上の理由から、反応中のα−ヒドロキシニトリル化合物定常濃度を管理することは非常に重要である。
【００３４】
製造されるα−ヒドロキシ酸アンモニウムに対する使用乾燥生体触媒重量は１／１００以下がよく、好ましくは１／１００〜１／２００、より好ましくは１／２００〜１／３００、更に好ましくは１／３００〜１／５００、最も好ましくは１／５００以下である。製造されるα−ヒドロキシ酸アンモニウムに対する使用乾燥生体触媒重量が多すぎると該生体触媒懸濁液由来の不純物が反応液中に多く同伴されるため精製コストが上がり、製品品質が低下するので好ましくない。逆に、製造されるα−ヒドロキシ酸アンモニウムに対する使用乾燥生体触媒重量が少なすぎるとリアクターボリューム当たりの生産性が低下し、大きなリアクターサイズが必要となり経済的に不利となる。
【００３５】
＜実施例＞
以下実施例を挙げて本発明をより詳細に説明する。尚、本発明はこれらの実施例により限定されるものではなく、その要旨を超えない限り、様々な変更、修飾が可能である。特に実施例においては、グリコロニトリルを用いた実験のみを示すが、本発明の主旨を考慮すると、原料中に存在するアルデヒド或いはシアン化合物の濃度をコントロールすることが重要なので、グリコロニトリル以外のα−ヒドロキシニトリルについても同様の現象と結果が得られることは容易に類推できるものである。
【００３６】
本発明に使用する生体触媒であるAcinetobacter sp.AK226は本発明者らが既に特許生物寄託センター(産総研)に国際寄託したものであり、ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５９０の国際寄託番号を有するものである。
【００３７】
生体触媒懸濁液中の乾燥生体触媒重量の測定法は、以下のごとく実施した。まず、適当な濃度の生体触媒懸濁液を適量取り、−８０℃まで冷却した後、凍結乾燥機を用いて完全に乾燥し、その重量値から前記生体触媒懸濁液の濃度を算出した。既知濃度となった生体触媒懸濁液を適当な複数の濃度に希釈し、ＵＶ計（島津臨床用分光光度計、波長：６００ｎｍ、石英製フローセル、容量：１６μＬ、光路長：５ｍｍ）を用いて室温において透過度を測定し、該ＵＶ計での該生体触媒の検量線を作成した。以後、該ＵＶ計の指示値から任意の該生体触媒懸濁液の乾燥生体触媒濃度を算出した。
【００３８】
反応液の分析は、以下のごとく実施した。
基質であるα−ヒドロキシニトリルを高速液体クロマトグラフィーで測定した。また、生成物であるα−ヒドロキシ酸或いはα−ヒドロキシ酸アンモニウムは、高速液体クロマトグラフィーでα−ヒドロキシ酸として測定した（高速液体クロマトグラフィーの溶離液はリン酸水溶液であり、酸性を呈するため、αヒドロキシ酸アンモニウムは分析器中でα−ヒドロキシ酸に変換される。）。カラムはイオン排除カラム（島津Ｓｈｉｍ−ｐａｃｋ ＳＣＲ−１０１Ｈ）、カラム温度は４０℃、移動相はリン酸水溶液（ｐＨ＝２．３）、検出器はＵＶ（島津ＳＰＤ−１０ＡＶ ｖｐ、２１０ｎｍ）及びＲＩ（島津ＲＩＤ−６Ａ）で実施した。
【実施例１】
【００３９】
［生体触媒の調製］
塩化ナトリウム０．１重量％、リン酸二水素カリウム０．１重量％、硫酸マグネシウム七水和物０．０５重量％、硫酸第一鉄七水和物０．００５重量％、硫酸アンモニウム０．１重量％、硝酸カリウム０．１重量％硫酸マンガン五水和物０．００５重量％を含む培養液２５０ｍｌを三角フラスコに仕込み、ｐＨが７になるように水酸化ナトリウムで調整し、１２１℃で２０分間滅菌した後、アセトニトリル０．５重量％を添加した。これにAcinetobacter sp.AK226を接種して３０℃で振とう培養した（前培養）。ミーストパウダー０．３重量％、グルタミン酸ナトリウム０．５重量％、硫酸アンモニウム０．５重量％、リン酸水素二カリウム０．２重量％、リン酸ニ水素カリウム０．１５重量％、塩化ナトリウム０．１重量％、硫酸マグネシウム七水和物０．１８重量％、塩化マンガン４水和物０．０２重量％、塩化カルシウム二水和物０．０１重量％、硫酸鉄７水和物０．００３重量％、硫酸亜鉛７水和物０．００２重量％、硫酸銅５水和物０．００２重量％、大豆油２重量％を含む培養液３Ｌを５Ｌジャーファーメンターに仕込み、１２１℃で２０分間滅菌した後、前記の前培養液を接種して３０℃で通気攪拌を行った。培養開始１０時間後から大豆油のフィードを開始した。ＰＨは７になるようにリン酸及びアンモニア水でコントロールし、最終的に約５重量％のAcinetobacter sp.AK226懸濁液を得た。更に０．０６Ｍリン酸バッファーを用いて２回洗浄を行い、最終的にリン酸バッファーに懸濁されたAcinetobacter sp.AK226懸濁液（乾燥菌体濃度５〜１０重量％）を得た。
【００４０】
［初期比活性の測定］
生体触媒として実施例１の操作で得られたAcinetobacter sp.AK226を用いて、グリコロニトリルの加水分解反応を行った。まず、０．０６Ｍリン酸バッファーに懸濁した状態で冷蔵保存された既知菌体濃度のAcinetobacter sp.AK226懸濁液を濃度が３２０重量ｐｐｍとなるように５０ｍＬナスフラスコに予め仕込まれた０．０６Ｍリン酸水溶液（グリコロニトリル水溶液添加時にｐＨ＝６．８になるように予めｐＨ調整したもの）２０ｍｌに懸濁させた。該フラスコを３０℃恒温水槽に入れてスターラー攪拌を実施し、内温が３０℃になるまでしばらく保持した。次に原料の５５％グリコロニトリル水溶液（アルドリッチ製）を、マイクロピペッターを用いて０．３６ｍｌ添加し反応を開始した。反応中の反応液のｐＨは６．８であった。５分後にサンプリングを実施し、２Ｍ塩酸水溶液で希釈することで反応を停止し、フィルター処理で菌体を除いた後、高速液体クロマトグラフィー分析を実施した。得られた初期比活性は３５０［ｍｍｏｌ／ｇ−乾燥菌体／Ｈｒ］であった。
【００４１】
［グリコール酸アンモニウムの製造］
上記で得たAcinetobacter sp.AK226懸濁液を用いて、グリコロニトリルの加水分解によるグリコール酸アンモニウムの蓄積実験を行った。
既知菌体濃度のAcinetobacter sp.AK226懸濁液を濃度が４３００重量ｐｐｍとなるように５０ｍＬナスフラスコに予め仕込まれた蒸留水１５．８ｍｌに懸濁させた。該フラスコにｐＨ計と温度計を設置し反応液のｐＨと温度をモニタリングできるようにして、３０℃恒温水槽に入れてスターラー攪拌を実施し、内温が３０℃になるまでしばらく保持した。次に原料の５５重量％グリコロニトリル水溶液（アルドリッチ製）を、マイクロピペッターを用いて５００μＬずつ間欠的に添加すると同時に５ｗｔ％ＫＯＨ を添加してｐＨを６．５〜７に維持した。反応中は定期的にサンプリングを行い、高速液体クロマトグラフィーでグリコロニトリルとグリコール酸アンモニウム濃度を測定し、定常グリコロニトリル濃度が２重量％以下になるように原料の添加量を調節した。初期生産速度は１８０［ｍｍｏｌ／ｇ−乾燥菌体／Ｈｒ］、平均生産速度は１５０［ｍｍｏｌ／ｇ−乾燥菌体／Ｈｒ］、最終グリコール酸アンモニウム蓄積濃度は４５．６重量％、生産性は１．５７［ｍｏｌ／ｇ−乾燥菌体］であった。最終結果は図１に示す。
【実施例２】
【００４２】
実施例１と同様の操作で得られたAcinetobacter sp.AK226懸濁液を用いて、グリコロニトリルの加水分解によるグリコール酸アンモニウムの蓄積実験を行った。
既知菌体濃度のAcinetobacter sp.AK226懸濁液を濃度が１．０２重量％となるように５０ｍＬナスフラスコに予め仕込まれた蒸留水１５．８ｍｌに懸濁させた。該フラスコにｐＨ計と温度計を設置し反応液のｐＨと温度をモニタリングできるようにして、５０℃恒温水槽に入れてスターラー攪拌を実施し、内温が５０℃になるまでしばらく保持した。次に原料の５５重量％グリコロニトリル水溶液（東京化成製）を、マイクロピペッターを用いて５００μＬずつ間欠的に添加すると同時に５ｗｔ％ＫＯＨ を添加してｐＨを６．５〜７に維持した。反応中は定期的にサンプリングを行い、高速液体クロマトグラフィーでグリコロニトリルとグリコール酸アンモニウム濃度を測定し、定常グリコロニトリル濃度が２重量％以下になるように原料の添加量を調節した。最終的なグリコール酸アンモニウム蓄積濃度は６８重量％であった。
【産業上の利用可能性】
【００４３】
本発明法によれば、初期比活性が高いだけではなく、高α−ヒドロキシ酸アンモニウム蓄積濃度と該蓄積濃度になるまでの時間平均の比活性が高い生体触媒を用いることにより、任意のα−ヒドロキシニトリル化合物から工業的に有用なα−ヒドロキシ酸或いはα−ヒドロキシ酸アンモニウムを実用的なリアクターサイズ、反応時間、触媒コストで生産することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】実施例１における生体触媒によるグリコール酸アンモニウムの生産量−反応時間及び蓄積濃度−反応時間の関係を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は，ニトリラーゼ活性を有する生体触媒を用いてα−ヒドロキシ酸或いはα−ヒドロキシ酸アンモニウム、とりわけグリコール酸或いはグリコール酸アンモニウムを製造する方法に関する
【背景技術】
【０００２】
酵素活性を有する生体触媒を利用して目的の化合物を合成する方法は、反応条件が穏和であるため反応プロセスが簡略化できること、あるいは副生成物が少なく高純度の反応生成物を取得できる等の利点があるため、近年、様々な化合物の製造に用いられている。中でもニトリル化合物をカルボン酸或いはカルボン酸アンモニウムに変換する活性を持つニトリラーゼやニトリル化合物をカルボン酸アミドに変換する活性を持つニトリルヒドラターゼ等の加水分解酵素は、その特異的な反応挙動から、様々なカルボン酸或いはカルボン酸アンモニウム及びカルボン酸アミドの製造に用いる検討がなされている。
【０００３】
それらの中で、ニトリラーゼ活性を有する生体触媒を用いて、α−ヒドロキシニトリルをα−ヒドロキシ酸アンモニウムに変換するα−ヒドロキシ酸或いはα−ヒドロキシ酸アンモニウムの製造方法も数多く検討されている。例えばCorynebacterium属を用いてグリコール酸、乳酸、２−ヒドロキシイソ酪酸を製造する方法(特許文献1)、或いはRhodococcus属またはGordona属を用いてグリコール酸を製造する方法(特許文献２)、或いはAcidovorax属を用いてグリコール酸、２−ヒドロキシイソ酪酸を製造する方法(特許文献３)、或いはBrevibacterium属を用いて乳酸を製造する方法(特許文献４)、或いはPseudomonas属またはArthrobacter属またはAspergillus属またはPenicillium属またはCochliobolus属またはFusarium属を用いて乳酸、２−ヒドロキシイソ酪酸、２−ヒドロキシ−２−フェニルプロピオン酸、マンデル酸、を製造する方法(特許文献５)、或いはEnterobacter属またはArthrobacter属またはCaseobacter属またはBrevibacterium属またはAureobacterium属またはEscherichia属またはMicrococcus属またはStreptomyces属またはFlavobacterium属またはAeromonas属またはNocardia属またはMycoplana属またはCellulomonas属またはErwinia属またはCandida属またはPseudomonas属またはRhodococcus属またはBacillus属またはAlcaligenes属またはCorynebacterium属またはMyclobacterium属またはObsumbacterium属を用いてD-乳酸を製造する方法(特許文献６)、或いはGordona属を用いてＬ−３−フェニル乳酸、Ｌ−４−フェニル−２−ヒドロキシ酪酸、Ｄ−マンデル酸及びその誘導体を製造する方法(特許文献７)、Rhodococcus属またはAlcaligenes属またはBrevibacterium属またはPseudomonas属を用いてＬ−３−フェニル乳酸、Ｌ−４−フェニル−２−ヒドロキシ酪酸を製造する方法(特許文献８)、或いはRhodococcus属またはAlcaligenes属またはBrevibacterium属またはPseudomonas属を用いてＬ−３−フェニル乳酸、Ｌ−４−フェニル−２−ヒドロキシ酪酸を製造する方法(特許文献９)、或いはGordona属を用いてＬ−３−フェニル乳酸、Ｄ−マンデル酸及びその誘導体を製造する方法(特許文献１０)、或いはPantoea属またはMicrococcus属またはBacteridium属またはBacillus属またはActinomadura属またはKitasatospora属またはPilimelia属またはAchromobacter属またはBeijerinckia属またはCelluslomonas属またはKlebsiella属またはActinopolispora属またはActinosynnema属またはActinopulanes属またはAmycolata属またはSaccharopolyspora属またはStreptomyces属またはNocardioides属またはProvindencia属またはMirobacterium属またはRhodobacter属またはRhodospirillum属またはCaceobcter属またはPseudomonas属またはAlcaligenes属またはCorynebaterium属またはBrevibacterium属またはNocardia属またはRhodococcus属またはArthrobacter属またはTorulopsis属またはRhodopseudomonas属またはAcinetobacter属またはMycobacterium属またはCandida属またはAgrobacterium属またはAspergillus属またはPenicillium属またはCochliobolus属またはFusarium属またはEnterobacter属またはXanthobacter属またはErwinia属またはCitrobacter属またはAeromonas属またはGordona属を用いて２−ヒドロキシ−４−メチルチオ酪酸を製造する方法(特許文献１１)、或いはAlcaligenes属を用いて２−ヒドロキシ−４−メチルチオ酪酸を製造する方法(特許文献１２)、或いはVarioovorax属またはArthrobacter属を用いて乳酸、２−ヒドロキシ−４−メチルチオ酪酸を製造する方法(特許文献１３)、或いは或いはEscherichia属またはPseudomonas属またはAlcaligenes属を用いてR-マンデル酸、の製造方法(特許文献１４)、或いはArthrobacter属を用いて２−ヒドロキシ−４−メチルチオ酪酸を製造する方法(特許文献１５〜１７)、或いはRhodococcus属を用いて２−ヒドロキシ−４−メチルチオ酪酸を製造する方法(特許文献１８)、或いはCorynebacterium属を用いてマンデル酸を製造する方法(特許文献１９)、或いはEnterobacter属またはArthrobacter属またはCaseobacter属またはBrevibacterium属またはAureobacterium属またはEschrichia属またはMicrococcus属またはStreptomyces属またはFlavobacterium属またはAeromonas属またはNocardia属またはMycoplana属またはCellulomonas属またはErwinia属またはCandida属またはPseudomonas属またはRhodococcus属またはBacillus属を用いてＬ−乳酸を製造する方法(特許文献２０)、或いはAureobacterium属またはPseudomonas属またはCaseobacter属またはAlcaligenes属またはAcinetobacter属またはBrevibacterium属またはNocardia属を用いてR−マンデル酸及びその誘導体を製造する方法(特許文献２１〜２３)、Rhodococcus属を用いてR−マンデル酸を製造する方法(特許文献２５、２７)、或いはAlcaligenes属を用いてＲ−マンデル酸を製造する方法(特許文献２６)、Alcaligenes属の由来のニトリラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子DNAをベクターに組み込んだ組み替え体DNAで形質転換された形質転換体を用いてＲ−マンデル酸を製造する方法(特許文献２８)、或いはAlcaligenes属またはCorynebacterium属を用いてＲ−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸を製造する方法(特許文献２９)、或いはAcinetobacter属またはAlcaligenes属またはPseudomonas属またはRhodopseudomonas属またはCorynebacterium属またはBacillus属またはMycobacterium属またはRhodococcus属またはNocardia属またはArthrobacter属またはKlebsiella属またはCandida属を用いて3-(S)-tert.-フ゛トキシカルホ゛ニルアミノ-4-シクロヘキシル-2-(R)-ヒドロキシ酪酸を製造する方法(特許文献３０)、或いはRhodococcus属またはPseudomonas属またはArthrobacter属またはBrevibacterium属を用いて２−ヒドロキシイソ酪酸を製造する方法(特許文献３１)、或いはRhodococcus属を用いて２−ヒドロキシイソ酪酸を製造する方法(特許文献３２)、或いはAchromobacter属を用いて２−ヒドロキシイソ酪酸を製造する方法(特許文献３３)等が開示されている。
【０００４】
これら先行文献に開示されたα−ヒドロキシ酸の製造方法においては、α−ヒドロキシニトリルを微生物触媒(ニトリラーゼ)で加水分解し、まずα−ヒドロキシ酸アンモニウムを得て、これを当業者によく知られている通常の方法、例えば酸による中和、イオン交換樹脂カラム、電気透析、熱分解等の方法により、遊離のα−ヒドロキシ酸を製造している。
【０００５】
しかしながら、前述の従来の技術では、用いている各種生体触媒の持つ加水分解酵素、つまりニトリラーゼがα−ヒドロキシニトリルに対して必ずしも工業的に満足できる初期比活性及びまたは初期生産速度を有しておらず、リアクターサイズが非常に大きくなる等の問題を抱えており、更なるニトリラーゼ初期比活性及びまたは初期生産速度の向上が求められていた。
【０００６】
更に、工業的にα−ヒドロキシ酸或いはα−ヒドロキシ酸アンモニウムを製造する場合、経済的理由から高い生成物蓄積濃度が必要となるが、特に20重量%以上のような高濃度α-ヒドロキシ酸アンモニウムを製造する場合、反応初期のニトリラーゼ比活性及びまたは初期生産速度が高いにも拘らず、反応が進行し反応生成物の蓄積濃度が上がるにつれて、生成物阻害及びまたは失活、或いは高生成物蓄積濃度で初めて顕著となる基質阻害及びまたは失活のため、結果的に反応初期から反応終了時に至る時間平均のニトリラーゼ生産速度が低くなり、実用的な反応時間での高蓄積濃度の達成及びまたは実用的なリアクターサイズでの大量のα−ヒドロキシ酸或いはα−ヒドロキシ酸アンモニウムの製造ができるレベルではなかった。また、この解決法として大量の生体触媒を用いて短時間に生成物の高蓄積濃度を達成する方法が考えられるが、その場合、乾燥生体触媒重量当たりの生産量(=生体触媒の生産能力)が低いので触媒コストが非常に高く、とても実用的なものとは言えなかった。また、そのように大量の生体触媒を用いると、後の精製工程に多大な負荷をかけ、品質の低下或いは精製コストの上昇を招き、益々工業的には不利なもとなる。
【０００７】
例えば、前記特許文献１では、Corynebacterium属を用いて、乳酸アンモニウム平均生産速度が１５．４ｍｍｏｌ／ｇ−乾燥菌体／Ｈｒ、乳酸アンモニウム蓄積濃度が９．８重量％（３０℃×４Ｈｒ）、乳酸アンモニウム生産量が０．１６４ｍｏｌ／ｇ−乾燥菌体であることが記載されている。また、前記特許文献３では、Acidovorax属を用いて、グリコール酸アンモニウム平均生産速度が１．７ｍｍｏｌ／ｇ−乾燥菌体／Ｈｒ、グリコール酸アンモニウム蓄積濃度が９．３重量％、グリコール酸アンモニウム生産量が０．０６９ｍｏｌ／ｇ−乾燥菌体であることが記載されている。
また、前記特許文献３３では、Achromobacter属を用いて、２−ヒドロキシイソ酪酸アンモニウム平均生産速度が１．８ｍｍｏｌ／ｇ−乾燥菌体／Ｈｒ、２−ヒドロキシイソ酪酸アンモニウム蓄積濃度が３．７重量％（３０℃×１０Ｈｒ）、２−ヒドロキシイソ酪酸アンモニウム生産量が０．０１８ｍｏｌ／ｇ−乾燥菌体であることが記載されている。これらの例はいずれも工業的に満足できるレベルの平均生産速度を有しているとは言えない。
【０００８】
一方、例えば、前記特許文献１７では、Arthrobacter属を用いて、２−ヒドロキシ−４−メチルチオ酪酸アンモニウム蓄積濃度が４９重量％（３０℃×１９Ｈｒ）と非常に高いものもあるが、２−ヒドロキシ−４−メチルチオ酪酸平均生産速度が２３．３ｍｍｏｌ／ｇ−乾燥菌体／Ｈｒ（３５℃×１８Ｈｒ）、２−ヒドロキシ−４−メチルチオ酪酸生産量が０．０７ｍｏｌ／ｇ−乾燥菌体と低い値であることが記載されている。また、前記特許文献２では、Rhodococcus属またはGordona属を用いて、グリコール酸アンモニウム蓄積濃度が４８．２重量％（２０℃×２４Ｈｒ）と非常に高く、しかもグリコール酸アンモニウム生産量も０．７７ｍｏｌ／ ｇ−乾燥菌体と非常に高いが、グリコール酸アンモニウム平均生産速度が１８．５ｍｍｏｌ／ｇ−乾燥菌体／Ｈｒ（２０℃×２４Ｈｒ）と低い値であることが記載されている。これらの例も、いずれも工業的に満足できるレベルの平均生産速度を有しているとは言えない。
【０００９】
このように生成物蓄積濃度或いはまた初期生産速度及びまたは平均生産速度及びまたは乾燥生体触媒重量当たりの生産量が低い理由として、一般的にα―ドロキシニトリルが水溶液中で対応するアルデヒドもしくはケトンと青酸に部分的に分解・解離(非特許文献１)し、青酸によって酵素活性が阻害されることが挙げられる。(非特許文献２)また、解離したアルデヒドの作用で酵素が短時間で失活する可能性も指摘されており、これを解決するための方法として、反応系内に、亜硫酸イオン、酸性亜硫酸イオンまたは亜ジチオン酸イオンを添加する方法(特許文献３４、３５)、亜燐酸イオンまたは次亜燐酸イオンを添加する方法(特許文献３６)が提案されている。しかしながら、これらの添加物を使用してもα−ヒドロキシ酸或いはα−ヒドロキシ酸アンモニウムの生成蓄積濃度は決して高くはなく、Alcaligenes属によるマンデル酸の蓄積濃度１６．６重量％(特許文献３４，３５)、Gordona属によるマンデル酸の蓄積濃度１２重量%(特許文献３６)がそれぞれ実施例に示されている。
【００１０】
また、反応系中のシアンヒドリン濃度をコントロールすることにより、シアンヒドリンや部分的分解・解離生成物であるアルデヒド及びまたは青酸による酵素活性阻害及びまたは失活の影響を少なくする方法(特許文献３７)が開示されている。この方法によれば、マンデル酸蓄積濃度２０重量％を達成できることが実施例に示されているが、使用菌体量が、ＯＤ630＝４．２とかなり多く、恐らく初期生産速度及びまたは平均生産速度及びまたは乾燥生体触媒重量当たりの生産量がかなり低いものと推定される。
【００１１】
つまり、工業的に充分な生産性を有するために必要な、実用的な反応時間で高蓄積濃度を達成できる及びまたは実用的なリアクターサイズで大量のα−ヒドロキシ酸或いはα−ヒドロキシ酸アンモニウムを製造できる、実質的に高いニトリラーゼ比活性を有する生体触媒を用いた工業的なα−ヒドロキシ酸或いはα−ヒドロキシ酸アンモニウムの製造方法がないのが実状である。
【００１２】
【特許文献１】特公平３−３８８３６号公報
【特許文献２】特開平９−０２８３９０号公報
【特許文献３】特表２００５−５０４５０６号公報
【特許文献４】米国特許第３９４０３１６号明細書
【特許文献５】特公平４−６３６７５号公報
【特許文献６】米国特許第５２３４８２６号明細書
【特許文献７】特開平６−２３７７８９号公報
【特許文献８】特開平６−２８４８９９号公報
【特許文献９】欧州特許出願公開第６１００４９号明細書
【特許文献１０】欧州特許出願公開第６１００４８号明細書
【特許文献１１】特開平１０−１７９１８３号公報
【特許文献１２】特表２００１−５０２９０８号公報
【特許文献１３】米国特許第６０３７１５５号明細書
【特許文献１４】特表２００２−５２７１０６号公報
【特許文献１５】特開２００２−３４５８４号公報
【特許文献１６】国際公開第２００２／０５２０２７号パンフレット
【特許文献１７】国際公開第２００３／０６２４３７号パンフレット
【特許文献１８】特開２００４−８１１６９号公報
【特許文献１９】特開昭６２−２９６８８３号公報
【特許文献２０】特開平４−９９４９７号公報
【特許文献２１】特開平４−９９４９６号公報
【特許文献２２】特開平４−９９４９５号公報
【特許文献２３】特開平４−２１８３８５号公報
【特許文献２４】特開平５−９５７９５号公報
【特許文献２５】特開平５−１９２１８９号公報
【特許文献２６】特開平４−３４１１８５号公報
【特許文献２７】米国特許第５２９６３７３号明細書
【特許文献２８】特開平６−１５３９６８号公報
【特許文献２９】特開平５−１９２１９０号公報
【特許文献３０】特開平６−３１９５９１号公報
【特許文献３１】特開平４−４０８９７号公報
【特許文献３２】特開平５−２１９９６９号公報
【特許文献３３】特開平６−２３７７７６号公報
【特許文献３４】特開平５−１９２１８９号公報
【特許文献３５】米国特許第５３２６７０２号明細書
【特許文献３６】特開平７−２１３２９６号公報
【特許文献３７】特開平８−１３１１８８号公報
【非特許文献１】Chemical Reviews,42,189- ,(1948)
【非特許文献２】Agricultural Biological Chemistry,46,1165- ,(1982)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の課題は、ニトリラーゼ活性を有する微生物菌体由来の生体触媒を用いてα−ヒドロキシニトリル化合物からα−ヒドロキシ酸或いはα−ヒドロキシ酸アンモニウムを製造するに当たり、実用的な反応時間での高蓄積濃度の達成及びまたは実用的なリアクターサイズでの大量のα−ヒドロキシ酸或いはα−ヒドロキシ酸アンモニウムの製造を実用的なレベルの触媒コストと製品品質で達成できる工業的α−ヒドロキシ酸或いはα−ヒドロキシ酸アンモニウムの製造法を提供することに有る。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らはニトリラーゼ活性を有する微生物菌体由来の生体触媒を用いてα−ヒドロキシニトリル化合物からα−ヒドロキシ酸或いはα−ヒドロキシ酸アンモニウムを製造するに当たり、実用的な反応時間で高蓄積濃度を達成でき、また、実用的なリアクターサイズで大量のα−ヒドロキシ酸或いはα−ヒドロキシ酸アンモニウムの製造を実用的なレベルの触媒コストと製品品質で達成できる、工業的α−ヒドロキシ酸或いはα−ヒドロキシ酸アンモニウムの製造法について鋭意検討を行ったところアシネトバクター・エスピー(Acinetobacter sp.)AK226(FERM BP-08590)が今まで知られている微生物の中で最も高いα−ヒドロキシニトリル加水分解能力を有すること、つまり、目的と
する初期比活性、初期生産速度、平均生産速度、蓄積濃度、g乾燥生体触媒重量当たりの生産量を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１５】
即ち本発明は、以下に記載する通りの構成を有する。
［１］ニトリラーゼ活性を有する微生物菌体に由来する生体触媒を用いてα−ヒドロキシニトリルをα−ヒドロキシ酸アンモニウムに変換する工程を含むα−ヒドロキシ酸又はα−ヒドロキシ酸アンモニウムの製造方法において、該生体触媒として、α−ヒドロキシニトリルをα−ヒドロキシ酸アンモニウムに変換する反応の初期比活性が３２[mmol/g-乾燥生体触媒/Hr]以上であるニトリラーゼ活性を有する生体触媒を用いることを特徴とするα−ヒドロキシ酸又はα−ヒドロキシ酸アンモニウムの製造方法。
［２］生体触媒が蓄積できるα−ヒドロキシ酸アンモニウム濃度が２０〜７０重量％であるニトリラーゼ活性を有する生体触媒を用いることを特徴とする請求項1記載のα−ヒドロキシ酸或いはα−ヒドロキシ酸アンモニウムの製造方法。
［３］生体触媒が、g乾燥生体触媒重量当たりのα−ヒドロキシ酸アンモニウムの生産量が０．７８[mol/g-乾燥生体触媒]以上であるニトリラーゼ活性を有する生体触媒であることを特徴とする［１］、［２］記載のα−ヒドロキシ酸或いはα−ヒドロキシ酸アンモニウムの製造方法。
［４］生体触媒が、α−ヒドロキシ酸アンモニウムの初期生産速度が３２[mmol/g-乾燥生体触媒/Hr]以上であり、且つ平均生産速度が１６[mmol/g-乾燥生体触媒/Hr]以上であるニトリラーゼ活性を有する生体触媒であることを特徴とする［１］〜［３］記載のα−ヒドロキシ酸或いはα−ヒドロキシ酸アンモニウムの製造方法。
［５］α−ヒドロキシニトリルをα−ヒドロキシ酸アンモニウムに変換する反応の反応系中のｐＨを６以上８以下、且つ反応温度を３０〜６０℃にコントロールすることを特徴とする［１］〜［４］記載のα−ヒドロキシ酸或いはα−ヒドロキシ酸アンモニウムの製造方法。
［６］生体触媒が、アシネトバクター属に属する微生物菌体に由来する生体触媒であることを特徴とする［１］〜［５］記載のα−ヒドロキシ酸或いはα−ヒドロキシ酸アンモニウムの製造方法。
［７］アシネトバクター属に属する微生物菌体が、アシネトバクター・エスピー(Acinetobacter sp.)AK226或いはアシネトバクター・エスピー(Acinetobacter sp.)AK227又はそれら菌体より誘導された微生物菌体であることを特徴とする［６］記載のα−ヒドロキシ酸或いはα−ヒドロキシ酸アンモニウムの製造方法。
［８］アシネトバクター属に属する微生物菌体が、アシネトバクター・エスピー(Acinetobacter sp.)AK226又はそれら菌体より誘導された微生物菌体であることを特徴とする［７］記載のα−ヒドロキシ酸或いはα−ヒドロキシ酸アンモニウム)の製造方法。
［９］生体触媒が、微生物菌体そのもの、該微生物の菌体処理物、該微生物の抽出物、該微生物の固定化物、該微生物から単離されたニトリラーゼ酵素、該微生物から単離されたニトリラーゼ酵素の固定化物、あるいは該微生物のニトリラーゼ活性をコードする遺伝子を別の生物に組み替え、該ニトリラーゼ活性を発現させたもの、その処理物、抽出物、固定化物、該生物から単離されたニトリラーゼ酵素、該生物から単離されたニトリラーゼ酵素の固定化物よりなる群から選ばれた少なくとも一種であることを特徴とする［１］〜［８］記載のα−ヒドロキシ酸或いはα−ヒドロキシ酸アンモニウムの製造方法。
［１０］基質として用いるα−ヒドロキシニトリルがグリコロニトリルである［１］〜［９］記載のグリコール酸或いはグリコール酸アンモニウムの製造方法。
【発明の効果】
【００１６】
本発明は、ニトリラーゼ活性を有する微生物菌体由来の生体触媒を用いてα−ヒドロキシニトリル化合物からα−ヒドロキシ酸或いはα−ヒドロキシ酸アンモニウムを製造するに当たり、実用的な反応時間での高蓄積濃度の達成及びまたは実用的なリアクターサイズでの大量のα−ヒドロキシ酸或いはα−ヒドロキシ酸アンモニウムの製造を実用的なレベルの触媒コストと製品品質で達成できるα−ヒドロキシ酸或いはα−ヒドロキシ酸アンモニウムの製造法を提供できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下本願発明について具体的に説明する。
本発明で言うニトリラーゼ活性を有する微生物菌体に由来する生体触媒とは、ニトリル基をカルボン酸基或いはカルボン酸アンモニウム基へ直接変換する能力を有する微生物菌体由来のニトリラーゼ酵素を保有する触媒であれば如何なる形態のものでもよい。
【００１８】
微生物種としては多くのものが知られているが、例えばニトリラーゼ高活性を有するものとして、Rhodococcus属、Acinetobacter属、Alcaligenes属、Pseudomonas属、Corynebacterium属等が挙げられる。本発明においてはこれらの中でも、特にグラム陰性菌であるAcinetobacter属、Alcaligenes属が好ましく、更に好ましくはAcinetobacteｒ属がよい。具体的にはAcinetobacter sp.AK226(FERM BP-08590)、Acinetobacter sp.AK227(FERM- BP-08591)である。これらの菌株は、特開２００５−１７６６３９、特開２００４−３０５０６６、特開２００４−３０５０５８、特開２００４−３０５０６２、特開２００１−２９９３７８、特開平１１−１８０９７１、特開平０６−３０３９９１、特開昭６３−２０９５９２、特公昭６３−２５９６号公報等に記載されている。
【００１９】
また例えば、天然の或いは人為的に改良したニトリラーゼ遺伝子を遺伝子工学的手法によって組み込んだ微生物、或いはそこから取り出したニトリラーゼ酵素であっても構わないが、ニトリラーゼの発現量が少ない微生物或いはα−ヒドロキシニトリルからα−ヒドロキシ酸アンモニウムへの変換活性の低いニトリラーゼを発現した微生物を少量用いてα−ヒドロキシ酸(アンモニウム)を製造するには、より多くの反応時間を要するため、可能な限りニトリラーゼを高発現した微生物、及びまたは変換活性の高いニトリラーゼを発現した微生物、或いはそこから取り出したニトリラーゼ酵素を用いることが望ましい。
【００２０】
生体触媒の形態としては微生物細胞を休眠状態でそのまま使用しても構わないし、或いは破砕処理したもの、または該微生物細胞から必要なニトリラーゼ酵素を取り出したものをそのまま使用しても構わないし、一般的な包括法、架橋法、担体結合法等で固定化したものを使用してもよい。尚、固定化担体の例としては、ガラスビーズ、シリカゲル、ポリウレタン、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、カラギーナン、アルギン酸、光架橋樹脂等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２１】
微生物をそのまま用いる場合、水(蒸留水及びまたはイオン交換水)のみに懸濁させても構わないが、通常、ニトリラーゼ活性の長期保持の観点から無機塩のバッファー液に懸濁させて使用する。また、固定化したものを用いる場合にも同じく、通常、バッファー液に懸濁させて使用する。この時のバッファー液濃度は、反応液中の不純物低減の観点から低ければ低いほどよいが、生体触媒の安定性、ニトリラーゼ活性の保持の観点からは通常０．１Ｍ未満であり、好ましくは０．０１〜０．０８Ｍ、より好ましくは０．０２〜０．０６Ｍである。
【００２２】
本発明で言うα−ヒドロキシニトリルとは、一般式［Ｉ］：ＲＣＨ（ＯＨ）ＣＮ（式中Ｒは水素原子、置換基を有してもよいＣ１〜Ｃ６のアルキル基、置換基を有してもよいＣ２〜Ｃ６のアルケニル基、置換基を有してよいＣ１〜Ｃ６アルコキシル基、置換基を有してもよいアリール基、置換基を有してもよいアリールオキシ基又は置換基を有してもよい複素環基を示す。）で表されるα−ヒドロキシニトリルを言い、例えば、マンデロニトリル、アセトンシアンヒドリン、グリコロニトリル、ラクトニトリル、２−ヒドロキシ−４−メチルチオンブチロニトリル等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２３】
本発明で言う初期比活性は、本発明にとって非常に重要なファクターである。元来、該初期比活性は反応条件によって大きく変わるものであるが、本発明における該初期比活性とは、反応温度３０℃、ｐＨ＝６．５〜７．０、反応基質濃度：１ｗｔ％の反応条件で、生体触媒リン酸バッファー懸濁液にα−ヒドロキシニトリル水溶液を添加することで反応を開始し、反応開始から５分におけるα−ヒドロキシ酸アンモニウム生産モル量を使用乾燥生体触媒重量で除し、更に反応時間（５分＝１／１２時間）で除することにより得られる、乾燥生体触媒重量当たり、１時間当たりのα−ヒドロキシ酸アンモニウム生産量と定義する。但し、菌体使用量はα−ヒドロキシニトリル転化率が１５〜３０％になるように調整するものとする。本発明においては、該初期比活性が３２［mmol/g-乾燥生体触媒／Hr］以上であることが必須であり、好ましくは５０［mmol/g-乾燥生体触媒／Hr］以上、より好ましくは１００［mmol/g-乾燥生体触媒／Hr］以上、更に好ましくは２００［mmol/g-乾燥生体触媒／Hr］以上、最も好ましくは３００［mmol/g-乾燥生体触媒／Hr］以上がよい。
【００２４】
本発明における生体触媒が蓄積できるα−ヒドロキシ酸アンモニウム濃度は、本発明にとって非常に重要なファクターである。本発明における生体触媒が蓄積できるα−ヒドロキシ酸アンモニウム濃度とは、生体触媒懸濁液にα−ヒドロキシニトリル水溶液を連続的或いは間欠的に添加することで反応を開始し、反応中の反応液中のα−ヒドロキシニトリル濃度を基質阻害の現れる濃度以下にコントロールしながら反応させた時に到達し得るα−ヒドロキシ酸アンモニウムの重量濃度のことである。本発明においては２０重量％以上が必須であり、好ましくは３０重量％以上、より好ましくは４０重量％以上、更に好ましくは５０重量％以上、最も好ましくは６０重量％以上がよい。
【００２５】
本発明で言うg乾燥生体触媒重量当たりの生産量は、本発明にとって非常に重要なファクターである。本発明におけるg乾燥生体触媒重量当たりの生産量とは、生体触媒懸濁液にα−ヒドロキシニトリル水溶液を連続的或いは間欠的に添加することで反応を開始し、反応中の反応液中のα−ヒドロキシニトリル濃度を基質阻害の現れる濃度以下にコントロールしながら反応させた時に、α−ヒドロキシ酸アンモニウム蓄積濃度の増加に伴い現れる生成物阻害又は失活或いはその他要因によって引き起こされる阻害又は失活によって反応が完全に停止した時点までのα−ヒドロキシ酸アンモニウムの生産モル量を使用乾燥生体触媒重量で除することで得られる、乾燥生体触媒重量当たりのα−ヒドロキシ酸アンモニウム生産モル量のことである。本発明においては、０．７８［mol/g-乾燥生体触媒］以上であることが必須であり、好ましくは２［mol/g-乾燥生体触媒］以上、より好ましくは３［mol/g-乾燥生体触媒］以上、更に好ましくは４［mol/g−乾燥生体触媒］以上、最もこの好ましくは５［mol/g-乾燥生体触媒］以上がよい。
【００２６】
初期生産速度は、本発明にとって非常に重要なファクターである。本発明における初期生産速度は、任意の反応条件で、生体触媒懸濁液にα−ヒドロキシニトリル水溶液を連続的或いは間欠的に添加する事で反応を開始し、反応開始から1時間におけるα−ヒドロキシ酸アンモニウム生産モル量を使用乾燥生体触媒重量で除することにより得られる、乾燥生体触媒重量当たり、1時間当たりのα−ヒドロキシ酸アンモニウム生産量と定義する。本発明においては、該初期生産速度が３２[mmol/g-乾燥生体触媒/Hr]以上、好ましくは５０[mmol/g-乾燥生体触媒/Hr]以上、より好ましくは１００[mmol/g-乾燥生体触媒/Hr]以上、更に好ましくは２００[mmol/g-乾燥生体触媒/Hr]以上、最も好ましくは３００[mmol/g-乾燥生体触媒/Hr]以上がよい。
【００２７】
本発明で言う平均生産速度は、本発明にとって非常に重要なファクターである。本発明における平均生産速度は、任意の反応条件で、生体触媒懸濁液にα−ヒドロキシニトリル水溶液を連続的或いは間欠的に添加する事で反応を開始し、生成物であるα−ヒドロキシ酸アンモニウム蓄積濃度が高くなるにつれて引き起こされる活性低下の結果、生産速度が初期生産速度の１／２に低下した時点までの時間平均の生産速度のことであり、その時点までのα−ヒドロキシ酸アンモニウムの生産モル量を反応時間で除することにより得られる。本発明における平均生産速度は、１６[mmol/g-乾燥生体触媒/Hr]以上が必須であり、好ましくは３２[mmol/g-乾燥生体触媒/Hr]以上、より好ましくは５０[mmol/g-乾燥生体触媒/Hr]以上、更に好ましくは１００[mmol/g-乾燥生体触媒/Hr]以上、最も好ましくは１５０[mmol/g-乾燥生体触媒/Hr]以上がよい。
【００２８】
反応液のｐＨは、１）使用する生体触媒のニトリラーゼ比活性の至適ｐＨと２）基質α−ヒドロキシニトリルのＨＣＮとアルデヒド或いはケトンへの分解抑制の観点から決定される。１）については、α−ヒドロキシニトリル以外のニトリルの加水分解活性挙動よりｐＨ＝７〜１１のアルカリ性領域がよいと推定されるが、２）の観点からは、ｐＨ＝２程度の酸性領域がよいことが判っている。本発明においては反応液のｐＨは６〜８がよく、好ましくは６．５〜７がよい。
【００２９】
原料であるα−ヒドロキシニトリルは非常に不安定な物質であるため、通常、安定剤として硫酸やリン酸或いは酢酸といった酸成分を含む。よって、反応系中のｐＨを調整するには反応系へのアルカリの添加が必須となる。その場合使用するアルカリは反応に影響を及ぼさなければ特に限定されないが、生成物の一つであるアンモニアを使用するのが望ましい。アンモニアの形態はガスであっても、アンモニア水であっても構わないが、通常、扱いの容易さからアンモニア水が望ましい。
【００３０】
反応温度については、反応温度が低すぎると反応活性が低くなり、高濃度のα−ヒドロキシ酸アンモニウムを製造する場合、より多くの反応時間を要する。一方、反応温度が高すぎると生体触媒の熱劣化で、目的とするα−ヒドロキシ酸アンモニウムの濃度が高い場合、該濃度まで到達させることが困難となり、結果として新たな生体触媒の追添等の処置が必要となり触媒コストが高くなる。また、温度が高すぎると、基質α−ヒドロキシニトリルのＨＣＮとアルデヒド或いはケトンへの分解促進にも繋がり、それらによる反応阻害や失活等、ますますの反応活性低下を引き起こす。よって、通常、反応温度は３０〜６０℃がよく、好ましくは４０〜５０℃がよい。
【００３１】
α−ヒドロキシ酸(アンモニウム)を製造する反応方法は、固定床、移動層、流動層、撹拌槽等、いずれでもよく、また連続反応でも半回分反応でもよいが、特に固定化されていない微生物菌体を用いる場合、反応の容易性から攪拌槽を用いた半回分反応がよい。その場合、反応効率の観点から、適切な攪拌を行うのがよい。
【００３２】
また、半回分反応を行う場合、生体触媒は1バッチ使い捨てでもよいし、繰り返し反応を行ってもよい。但し、繰り返し反応を行う場合、該生体触媒をα−ヒドロキシ酸アンモニウム高濃度から低濃度へ急激に変化させるため、浸透圧の影響等で比活性が低下する場合があるので注意を要する。
【００３３】
反応基質であるα−ヒドロキシニトリル化合物の定常濃度については、４重量％以下が好ましく、より好ましくは２重量％以下、更に好ましくは１重量％以下、最も好ましくは０．３重量％以下にコントロールするのがよい。α−ヒドロキシニトリル化合物の濃度が高すぎると、生成物阻害及びまたは失活、或いは高生成物蓄積濃度で初めて顕著となる基質阻害及びまたは失活の影響が急激に大きくなり、それまで進行していた反応が停止してしまう場合がある。また、α−ヒドロキシニトリル化合物の濃度が低すぎると反応速度を低下させることとなり、効率的にα−ヒドロキシ酸或いはα−ヒドロキシ酸アンモニウムを製造できないので不利である。以上の理由から、反応中のα−ヒドロキシニトリル化合物定常濃度を管理することは非常に重要である。
【００３４】
製造されるα−ヒドロキシ酸アンモニウムに対する使用乾燥生体触媒重量は１／１００以下がよく、好ましくは１／１００〜１／２００、より好ましくは１／２００〜１／３００、更に好ましくは１／３００〜１／５００、最も好ましくは１／５００以下である。製造されるα−ヒドロキシ酸アンモニウムに対する使用乾燥生体触媒重量が多すぎると該生体触媒懸濁液由来の不純物が反応液中に多く同伴されるため精製コストが上がり、製品品質が低下するので好ましくない。逆に、製造されるα−ヒドロキシ酸アンモニウムに対する使用乾燥生体触媒重量が少なすぎるとリアクターボリューム当たりの生産性が低下し、大きなリアクターサイズが必要となり経済的に不利となる。
【００３５】
＜実施例＞
以下実施例を挙げて本発明をより詳細に説明する。尚、本発明はこれらの実施例により限定されるものではなく、その要旨を超えない限り、様々な変更、修飾が可能である。特に実施例においては、グリコロニトリルを用いた実験のみを示すが、本発明の主旨を考慮すると、原料中に存在するアルデヒド或いはシアン化合物の濃度をコントロールすることが重要なので、グリコロニトリル以外のα−ヒドロキシニトリルについても同様の現象と結果が得られることは容易に類推できるものである。
【００３６】
本発明に使用する生体触媒であるAcinetobacter sp.AK226は本発明者らが既に特許生物寄託センター(産総研)に国際寄託したものであり、ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５９０の国際寄託番号を有するものである。
【００３７】
生体触媒懸濁液中の乾燥生体触媒重量の測定法は、以下のごとく実施した。まず、適当な濃度の生体触媒懸濁液を適量取り、−８０℃まで冷却した後、凍結乾燥機を用いて完全に乾燥し、その重量値から前記生体触媒懸濁液の濃度を算出した。既知濃度となった生体触媒懸濁液を適当な複数の濃度に希釈し、ＵＶ計（島津臨床用分光光度計、波長：６００ｎｍ、石英製フローセル、容量：１６μＬ、光路長：５ｍｍ）を用いて室温において透過度を測定し、該ＵＶ計での該生体触媒の検量線を作成した。以後、該ＵＶ計の指示値から任意の該生体触媒懸濁液の乾燥生体触媒濃度を算出した。
【００３８】
反応液の分析は、以下のごとく実施した。
基質であるα−ヒドロキシニトリルを高速液体クロマトグラフィーで測定した。また、生成物であるα−ヒドロキシ酸或いはα−ヒドロキシ酸アンモニウムは、高速液体クロマトグラフィーでα−ヒドロキシ酸として測定した（高速液体クロマトグラフィーの溶離液はリン酸水溶液であり、酸性を呈するため、αヒドロキシ酸アンモニウムは分析器中でα−ヒドロキシ酸に変換される。）。カラムはイオン排除カラム（島津Ｓｈｉｍ−ｐａｃｋ ＳＣＲ−１０１Ｈ）、カラム温度は４０℃、移動相はリン酸水溶液（ｐＨ＝２．３）、検出器はＵＶ（島津ＳＰＤ−１０ＡＶ ｖｐ、２１０ｎｍ）及びＲＩ（島津ＲＩＤ−６Ａ）で実施した。
【実施例１】
【００３９】
［生体触媒の調製］
塩化ナトリウム０．１重量％、リン酸二水素カリウム０．１重量％、硫酸マグネシウム七水和物０．０５重量％、硫酸第一鉄七水和物０．００５重量％、硫酸アンモニウム０．１重量％、硝酸カリウム０．１重量％硫酸マンガン五水和物０．００５重量％を含む培養液２５０ｍｌを三角フラスコに仕込み、ｐＨが７になるように水酸化ナトリウムで調整し、１２１℃で２０分間滅菌した後、アセトニトリル０．５重量％を添加した。これにAcinetobacter sp.AK226を接種して３０℃で振とう培養した（前培養）。ミーストパウダー０．３重量％、グルタミン酸ナトリウム０．５重量％、硫酸アンモニウム０．５重量％、リン酸水素二カリウム０．２重量％、リン酸ニ水素カリウム０．１５重量％、塩化ナトリウム０．１重量％、硫酸マグネシウム七水和物０．１８重量％、塩化マンガン４水和物０．０２重量％、塩化カルシウム二水和物０．０１重量％、硫酸鉄７水和物０．００３重量％、硫酸亜鉛７水和物０．００２重量％、硫酸銅５水和物０．００２重量％、大豆油２重量％を含む培養液３Ｌを５Ｌジャーファーメンターに仕込み、１２１℃で２０分間滅菌した後、前記の前培養液を接種して３０℃で通気攪拌を行った。培養開始１０時間後から大豆油のフィードを開始した。ＰＨは７になるようにリン酸及びアンモニア水でコントロールし、最終的に約５重量％のAcinetobacter sp.AK226懸濁液を得た。更に０．０６Ｍリン酸バッファーを用いて２回洗浄を行い、最終的にリン酸バッファーに懸濁されたAcinetobacter sp.AK226懸濁液（乾燥菌体濃度５〜１０重量％）を得た。
【００４０】
［初期比活性の測定］
生体触媒として実施例１の操作で得られたAcinetobacter sp.AK226を用いて、グリコロニトリルの加水分解反応を行った。まず、０．０６Ｍリン酸バッファーに懸濁した状態で冷蔵保存された既知菌体濃度のAcinetobacter sp.AK226懸濁液を濃度が３２０重量ｐｐｍとなるように５０ｍＬナスフラスコに予め仕込まれた０．０６Ｍリン酸水溶液（グリコロニトリル水溶液添加時にｐＨ＝６．８になるように予めｐＨ調整したもの）２０ｍｌに懸濁させた。該フラスコを３０℃恒温水槽に入れてスターラー攪拌を実施し、内温が３０℃になるまでしばらく保持した。次に原料の５５％グリコロニトリル水溶液（アルドリッチ製）を、マイクロピペッターを用いて０．３６ｍｌ添加し反応を開始した。反応中の反応液のｐＨは６．８であった。５分後にサンプリングを実施し、２Ｍ塩酸水溶液で希釈することで反応を停止し、フィルター処理で菌体を除いた後、高速液体クロマトグラフィー分析を実施した。得られた初期比活性は３５０［ｍｍｏｌ／ｇ−乾燥菌体／Ｈｒ］であった。
【００４１】
［グリコール酸アンモニウムの製造］
上記で得たAcinetobacter sp.AK226懸濁液を用いて、グリコロニトリルの加水分解によるグリコール酸アンモニウムの蓄積実験を行った。
既知菌体濃度のAcinetobacter sp.AK226懸濁液を濃度が４３００重量ｐｐｍとなるように５０ｍＬナスフラスコに予め仕込まれた蒸留水１５．８ｍｌに懸濁させた。該フラスコにｐＨ計と温度計を設置し反応液のｐＨと温度をモニタリングできるようにして、３０℃恒温水槽に入れてスターラー攪拌を実施し、内温が３０℃になるまでしばらく保持した。次に原料の５５重量％グリコロニトリル水溶液（アルドリッチ製）を、マイクロピペッターを用いて５００μＬずつ間欠的に添加すると同時に５ｗｔ％ＫＯＨ を添加してｐＨを６．５〜７に維持した。反応中は定期的にサンプリングを行い、高速液体クロマトグラフィーでグリコロニトリルとグリコール酸アンモニウム濃度を測定し、定常グリコロニトリル濃度が２重量％以下になるように原料の添加量を調節した。初期生産速度は１８０［ｍｍｏｌ／ｇ−乾燥菌体／Ｈｒ］、平均生産速度は１５０［ｍｍｏｌ／ｇ−乾燥菌体／Ｈｒ］、最終グリコール酸アンモニウム蓄積濃度は４５．６重量％、生産性は１．５７［ｍｏｌ／ｇ−乾燥菌体］であった。最終結果は図１に示す。
【実施例２】
【００４２】
実施例１と同様の操作で得られたAcinetobacter sp.AK226懸濁液を用いて、グリコロニトリルの加水分解によるグリコール酸アンモニウムの蓄積実験を行った。
既知菌体濃度のAcinetobacter sp.AK226懸濁液を濃度が１．０２重量％となるように５０ｍＬナスフラスコに予め仕込まれた蒸留水１５．８ｍｌに懸濁させた。該フラスコにｐＨ計と温度計を設置し反応液のｐＨと温度をモニタリングできるようにして、５０℃恒温水槽に入れてスターラー攪拌を実施し、内温が５０℃になるまでしばらく保持した。次に原料の５５重量％グリコロニトリル水溶液（東京化成製）を、マイクロピペッターを用いて５００μＬずつ間欠的に添加すると同時に５ｗｔ％ＫＯＨ を添加してｐＨを６．５〜７に維持した。反応中は定期的にサンプリングを行い、高速液体クロマトグラフィーでグリコロニトリルとグリコール酸アンモニウム濃度を測定し、定常グリコロニトリル濃度が２重量％以下になるように原料の添加量を調節した。最終的なグリコール酸アンモニウム蓄積濃度は６８重量％であった。
【産業上の利用可能性】
【００４３】
本発明法によれば、初期比活性が高いだけではなく、高α−ヒドロキシ酸アンモニウム蓄積濃度と該蓄積濃度になるまでの時間平均の比活性が高い生体触媒を用いることにより、任意のα−ヒドロキシニトリル化合物から工業的に有用なα−ヒドロキシ酸或いはα−ヒドロキシ酸アンモニウムを実用的なリアクターサイズ、反応時間、触媒コストで生産することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】実施例１における生体触媒によるグリコール酸アンモニウムの生産量−反応時間及び蓄積濃度−反応時間の関係を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ニトリラーゼ活性を有する微生物菌体に由来する生体触媒を用いてα−ヒドロキシニトリルをα−ヒドロキシ酸アンモニウムに変換する工程を含むα−ヒドロキシ酸又はα−ヒドロキシ酸アンモニウムの製造方法において、該生体触媒として、α−ヒドロキシニトリルをα−ヒドロキシ酸アンモニウムに変換する反応の初期比活性が３２[mmol/g-乾燥生体触媒/Hr]以上であるニトリラーゼ活性を有する生体触媒を用いることを特徴とするα−ヒドロキシ酸又はα−ヒドロキシ酸アンモニウムの製造方法。
【請求項２】
生体触媒が蓄積できるα−ヒドロキシ酸アンモニウム濃度が２０〜７０重量％であるニトリラーゼ活性を有する生体触媒を用いることを特徴とする請求項1記載のα−ヒドロキシ酸或いはα−ヒドロキシ酸アンモニウムの製造方法。
【請求項３】
生体触媒が、g乾燥生体触媒重量当たりのα−ヒドロキシ酸アンモニウムの生産量が０．７８[mol/g-乾燥生体触媒]以上であるニトリラーゼ活性を有する生体触媒であることを特徴とする請求項１又は２記載のα−ヒドロキシ酸或いはα−ヒドロキシ酸アンモニウムの製造方法。
【請求項４】
生体触媒が、α−ヒドロキシ酸アンモニウムの初期生産速度が３２[mmol/g-乾燥生体触媒/Hr]以上であり、且つ平均生産速度が１６[mmol/g-乾燥生体触媒/Hr]以上であるニトリラーゼ活性を有する生体触媒であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のα−ヒドロキシ酸或いはα−ヒドロキシ酸アンモニウムの製造方法。
【請求項５】
α−ヒドロキシニトリルをα−ヒドロキシ酸アンモニウムに変換する反応の反応系中のｐＨを６以上８以下、且つ反応温度を３０〜６０℃にコントロールすることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載のα−ヒドロキシ酸或いはα−ヒドロキシ酸アンモニウムの製造方法。
【請求項６】
生体触媒が、アシネトバクター属に属する微生物菌体に由来する生体触媒であることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載のα−ヒドロキシ酸或いはα−ヒドロキシ酸アンモニウムの製造方法。
【請求項７】
アシネトバクター属に属する微生物菌体が、アシネトバクター・エスピー(Acinetobacter sp.)AK226或いはアシネトバクター・エスピー(Acinetobacter sp.)AK227又はそれら菌体より誘導された微生物菌体であることを特徴とする請求項６記載のα−ヒドロキシ酸或いはα−ヒドロキシ酸アンモニウムの製造方法。
【請求項８】
アシネトバクター属に属する微生物菌体が、アシネトバクター・エスピー(Acinetobacter sp.)AK226又はそれら菌体より誘導された微生物菌体であることを特徴とする請求項７記載のα−ヒドロキシ酸或いはα−ヒドロキシ酸アンモニウム)の製造方法。
【請求項９】
生体触媒が、微生物菌体そのもの、該微生物の菌体処理物、該微生物の抽出物、該微生物の固定化物、該微生物から単離されたニトリラーゼ酵素、該微生物から単離されたニトリラーゼ酵素の固定化物、あるいは該微生物のニトリラーゼ活性をコードする遺伝子を別の生物に組み替え、該ニトリラーゼ活性を発現させたもの、その処理物、抽出物、固定化物、該生物から単離されたニトリラーゼ酵素、該生物から単離されたニトリラーゼ酵素の固定化物よりなる群から選ばれた少なくとも一種であることを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載のα−ヒドロキシ酸或いはα−ヒドロキシ酸アンモニウムの製造方法。
【請求項１０】
基質として用いるα−ヒドロキシニトリルがグリコロニトリルである請求項１〜９のいずれかに記載のグリコール酸或いはグリコール酸アンモニウムの製造方法。
【請求項１】
ニトリラーゼ活性を有する微生物菌体に由来する生体触媒を用いてα−ヒドロキシニトリルをα−ヒドロキシ酸アンモニウムに変換する工程を含むα−ヒドロキシ酸又はα−ヒドロキシ酸アンモニウムの製造方法において、該生体触媒として、α−ヒドロキシニトリルをα−ヒドロキシ酸アンモニウムに変換する反応の初期比活性が３２[mmol/g-乾燥生体触媒/Hr]以上であるニトリラーゼ活性を有する生体触媒を用いることを特徴とするα−ヒドロキシ酸又はα−ヒドロキシ酸アンモニウムの製造方法。
【請求項２】
生体触媒が蓄積できるα−ヒドロキシ酸アンモニウム濃度が２０〜７０重量％であるニトリラーゼ活性を有する生体触媒を用いることを特徴とする請求項1記載のα−ヒドロキシ酸或いはα−ヒドロキシ酸アンモニウムの製造方法。
【請求項３】
生体触媒が、g乾燥生体触媒重量当たりのα−ヒドロキシ酸アンモニウムの生産量が０．７８[mol/g-乾燥生体触媒]以上であるニトリラーゼ活性を有する生体触媒であることを特徴とする請求項１又は２記載のα−ヒドロキシ酸或いはα−ヒドロキシ酸アンモニウムの製造方法。
【請求項４】
生体触媒が、α−ヒドロキシ酸アンモニウムの初期生産速度が３２[mmol/g-乾燥生体触媒/Hr]以上であり、且つ平均生産速度が１６[mmol/g-乾燥生体触媒/Hr]以上であるニトリラーゼ活性を有する生体触媒であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のα−ヒドロキシ酸或いはα−ヒドロキシ酸アンモニウムの製造方法。
【請求項５】
α−ヒドロキシニトリルをα−ヒドロキシ酸アンモニウムに変換する反応の反応系中のｐＨを６以上８以下、且つ反応温度を３０〜６０℃にコントロールすることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載のα−ヒドロキシ酸或いはα−ヒドロキシ酸アンモニウムの製造方法。
【請求項６】
生体触媒が、アシネトバクター属に属する微生物菌体に由来する生体触媒であることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載のα−ヒドロキシ酸或いはα−ヒドロキシ酸アンモニウムの製造方法。
【請求項７】
アシネトバクター属に属する微生物菌体が、アシネトバクター・エスピー(Acinetobacter sp.)AK226或いはアシネトバクター・エスピー(Acinetobacter sp.)AK227又はそれら菌体より誘導された微生物菌体であることを特徴とする請求項６記載のα−ヒドロキシ酸或いはα−ヒドロキシ酸アンモニウムの製造方法。
【請求項８】
アシネトバクター属に属する微生物菌体が、アシネトバクター・エスピー(Acinetobacter sp.)AK226又はそれら菌体より誘導された微生物菌体であることを特徴とする請求項７記載のα−ヒドロキシ酸或いはα−ヒドロキシ酸アンモニウム)の製造方法。
【請求項９】
生体触媒が、微生物菌体そのもの、該微生物の菌体処理物、該微生物の抽出物、該微生物の固定化物、該微生物から単離されたニトリラーゼ酵素、該微生物から単離されたニトリラーゼ酵素の固定化物、あるいは該微生物のニトリラーゼ活性をコードする遺伝子を別の生物に組み替え、該ニトリラーゼ活性を発現させたもの、その処理物、抽出物、固定化物、該生物から単離されたニトリラーゼ酵素、該生物から単離されたニトリラーゼ酵素の固定化物よりなる群から選ばれた少なくとも一種であることを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載のα−ヒドロキシ酸或いはα−ヒドロキシ酸アンモニウムの製造方法。
【請求項１０】
基質として用いるα−ヒドロキシニトリルがグリコロニトリルである請求項１〜９のいずれかに記載のグリコール酸或いはグリコール酸アンモニウムの製造方法。
【図１】
【公開番号】特開２００７−２９５８２１（Ｐ２００７−２９５８２１Ａ）
【公開日】平成１９年１１月１５日（２００７．１１．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−１２５０７２（Ｐ２００６−１２５０７２）
【出願日】平成１８年４月２８日（２００６．４．２８）
【出願人】（３０３０４６３１４）旭化成ケミカルズ株式会社 (2,513)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年１１月１５日（２００７．１１．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年４月２８日（２００６．４．２８）
【出願人】（３０３０４６３１４）旭化成ケミカルズ株式会社 (2,513)
【Ｆターム（参考）】
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