疾患を検出する方法および化合物
本発明は、細胞酸化ストレス、細胞変性および／または細胞死に関連した疾患の検出法を提供する。本発明は、酸化ストレス、変性および／または死の過程を経ている細胞を検出するための、チオール（−ＳＨ）基含有化合物にも関する。本発明は、診断および治療を目的として、診療において該化合物を使用する方法も提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、細胞酸化ストレス、細胞変性および／または細胞死に関連した疾患の検出法を提供する。本発明は、酸化ストレス、変性および／または死の過程を経ている細胞を検出するための、チオール（−ＳＨ）基含有化合物にも関する。本発明は、診断および治療を目的として、診療において該化合物を使用する方法も提供する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
種々の神経学的障害、特に神経変性障害、例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンチントン病、クロイツフェルト−ヤコブ病または進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）の、特に疾患の初期段階における正確な診断は、臨床神経科医にとって重要な課題となることが多い。臨床神経科医が、その目的に入手できる手段は、患者の病歴、報告された症状、神経学的試験および補助的試験、例えば脳コンピュータ断層撮影（ＣＴスキャン）または磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）における所見を含む。概して、これらの手段は、現在、不充分であることが多く、疾患の比較的遅い段階でのみ、根源的な神経病理学的過程を示しうるにすぎないことが多い。臨床神経学的診療において遭遇することが多いもう１つの課題は、治療に対する脳腫瘍の反応のモニタリングである。従って、前記の重大かつ身体を衰弱させる神経学的疾患のいずれにおいても、正確な診断をし、治療計画を立て、疾患の経過を追跡し、または治療効果を評価するために、神経病理学的過程の検出および画像化のための新規な非侵襲的方法が明らかに必要とされている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
分子画像化は、分子プローブの使用に関係し、画像化用のマーカを含む、新規かつ急速に発展している分野であり、該画像化は、非侵襲的臨床画像化法、例えば、陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴスキャン）によって、健康および疾患に関連した細胞過程を知らせることができる。酸化ストレスは、多くの疾患の病原における特徴の１つである。酸素フリーラジカルによる細胞損傷は、神経変性において重大な役割を担っていることが示されている。アポトーシスは、酸化ストレスが死のプログラムの強力な誘発因子である故に死の過程の誘発レベルにおいて、および、ミトコンドリア機能の劇的変化としての細胞死の実施レベルにおいて、酸化ストレスに関係し、かつ、一般に細胞の抗酸化メカニズムの崩壊はアポトーシスの間に生じる。現在、診療において、酸化ストレスを分子画像化する手段が存在しない。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
発明の要旨
本発明のある実施形態において、患者または動物の組織における酸化ストレスに関連した細胞死または疾患過程を検出する方法を提供し、該方法は、（ｉ）患者または動物に、画像化用のマーカに連結させた本発明のチオール含有化合物を投与する工程、および（ｉｉ）患者または動物の被験組織に結合した化合物の量を検出する工程、を含んで成り；患者または動物の組織に結合した化合物の有意量の検出は、該組織における細胞死または疾患過程の存在を示す。
【０００５】
本発明の他の実施形態において、被験患者または動物の神経系における酸化ストレスに関連した細胞死または疾患過程を検出する方法を提供し、該方法は、（ｉ）患者または動物に、画像化用のマーカに連結させた本発明のチオール含有化合物を投与する工程、およ
び（ｉｉ）神経系の被験部分に結合した化合物の量を検出する工程、を含んで成り；コントロールと比較して、神経系の被験部分に結合した化合物の有意量の検出は、神経系の該部分における細胞死または疾患過程の存在を示す。
【０００６】
本発明のある実施形態において、酸化ストレスとは、フリーラジカルの過剰、抗酸化物質レベルの減少またはその両方が存在する場合に生じる生物組織への損傷を意味する。
【０００７】
本発明の他の実施形態において、本発明の化合物および方法によって検出される疾患過程は、下記のものに関連している：神経細胞またはグリア細胞内の酸化ストレス；アポトーシスを経ている神経細胞またはグリア細胞；他の機序の細胞死を経ている神経細胞またはグリア細胞；神経細胞体または神経突起の変性であると考えられる神経変性の過程；死の過程（例えば、アポトーシスによる）を経ている脳腫瘍の細胞；および神経系の細胞内における、または該細胞に関連したタンパク質の異常蓄積。そのようなタンパク質異常蓄積は、特に、細胞内封入体の形態（例えば、神経細線維もつれ、レヴィー小体）、または細胞外異常タンパク質沈着物の形態（例えば、アミロイドプラーク）を採る。
【０００８】
本発明の他の実施形態において、本発明の方法を、下記のような神経学的障害の診断に使用する：急性損傷、例えば、限定されないが、脳梗塞、中毒性発作または脳外傷；または慢性神経変性障害、例えば、限定されないが、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、多系統萎縮症（ＭＳＡ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、ハンチントン病、レヴィー小体疾患、プリオン障害、例えばクロイツフェルト−ヤコブ病、および脱髄性障害、例えば多発性硬化症。
【０００９】
本発明の他の実施形態において、本発明の方法を、治療に対する腫瘍の反応をモニターするのに使用する。大部分の抗腫瘍剤、例えば化学療法薬、または放射線照射は、腫瘍におけるアポトーシスの誘発によって作用する故に、本発明の方法および化合物を介した、治療によって誘発された腫瘍細胞死レベルの画像化は、抗腫瘍治療の有効性を非侵襲的に示すことができる。
【００１０】
本発明のある実施形態において、組織または器官内の疾患過程または細胞死過程を経ている細胞の検出に役立つ本発明に使用される化合物は、下記の式（Ｉ）で示される：
【００１１】
【化１】
【００１２】
［式中、
Ｌ１は、Ｃ１、Ｃ２およびＣ３直鎖または分岐鎖アルキレンから選択され；
Ｌ２は、不存在、およびＣ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６直鎖または分岐鎖アルキレンリンカーから選択され；
Ｑは、不存在、および置換されていてもよいアリール、ヘテロアリール、アリール−スルホンアミドおよびヘテロアリール−スルホンアミドから選択され；
Ｍは、画像化用のマーカである］。
【００１３】
他の局面において、本発明は、組織または器官における細胞死の検出のための、下記の式（ＩＩ）で示される構造を有する化合物およびその使用を提供する：
【００１４】
【化２】
【００１５】
［式中、ＭおよびＬ２は、それぞれ、上述のように定義される］。
本発明の他の実施形態において、Ｍは水素であり、Ｌ２は不存在であり、化合物はＮＳＴ７２９と称され、下記の式ＩＩＩで示される構造を有する：
【００１６】
【化３】
【００１７】
本発明の他の局面において、下記の式ＩＶで示される構造で表される化合物を提供する：
【００１８】
【化４】
【００１９】
［式中、
ｎは、２または３の整数を表し；
Ｆ原子は、１８Ｆまたは１９Ｆである］。
【００２０】
ｎ＝３の場合、化合物はＮＳＴ７３９と称される。
本発明の他の局面において、下記の式Ｖで示される構造で表される化合物を提供する：
【００２１】
【化５】
【００２２】
［式中、ＭおよびＬ２は、それぞれ、上述のように定義される］。本発明のある実施形態において、Ｍは水素であり、Ｌ２は不存在である。
【００２３】
本発明の他の局面において、下記の式ＶＩで示される構造で表される化合物を提供する：
【００２４】
【化６】
【００２５】
［式中、
Ｌ２およびＭは、上述と同意義であり；
Ｙは、不存在、−Ｏ−、ＮＨおよびＣ１、Ｃ２、Ｃ３またはＣ４アルキルアミンから選択される］。
【００２６】
本発明の他の実施形態において、下記の式ＶＩＩで示される構造で表される化合物を提供する：
【００２７】
【化７】
【００２８】
［式中、Ｆ原子は、１８Ｆまたは１９Ｆであってよい］。
本発明の他の局面において、下記の式ＶＩＩＩで示される構造を有する化合物を提供する：
【００２９】
【化８】
【００３０】
［式中、
Ｆは、１８Ｆまたは１９Ｆであってよく；
Ｒは、アリールまたはヘテロアリール、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６直鎖または分岐鎖の、置換されていてもよいアルキル、またはそれらの組合せである］。
【００３１】
本発明の他の局面において、下記の式ＩＸで示される構造で表される化合物を提供する：
【００３２】
【化９】
【００３３】
［式中、Ｆは、１８Ｆまたは１９Ｆであってよい］。
本発明に使用される化合物は、該化合物の医薬的に許容される塩、金属キレート、溶媒化合物および水化物、ならびに医薬的に許容される塩の溶媒化合物および水化物も包含する。医薬的に許容される付加塩の例は、無機および有機酸付加塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、燐酸塩、硫酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、マンデル酸塩、蓚酸塩および酢酸塩であるが、それらに限定されない。または、医薬的に許容される無機および有機塩基付加塩、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム等も使用しうる。
【００３４】
本発明の他の実施形態において、患者または動物の脳腫瘍における酸化ストレスまたは細胞死を検出する方法を提供し、該方法は、患者または動物に、式Ｉ〜ＩＸで示されるいずれかの構造で表されるいずれか１つの化合物を投与する工程、および脳腫瘍に結合した化合物の量を検出する工程、を含んで成り；脳腫瘍に結合した化合物の有意量の検出は、腫瘍における酸化ストレスまたは細胞死の存在を示す。
【００３５】
本発明の他の実施形態において、患者または動物の組織における細胞死または疾患過程の検出用の診断組成物を製造するための、式Ｉ〜ＩＸで示されるいずれかの構造で表される化合物の使用を提供する。
【００３６】
本発明の実施形態において、組織は、脳またはその部分であってよい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３７】
発明の詳細な実施形態
本発明は、その実施形態の１つにおいて、下記の観察に基づいている：細胞タンパク質のシステインのチオール（−ＳＨ）基のレドックス状態が、正常な健康な細胞と、酸化ストレスに関連した疾患関連過程を経ている細胞、またはアポトーシスのような死の過程を経ている細胞とを区別するための、または脳組織内のアミロイドプラークのようなタンパク質の異常沈着を検出するための、尺度としての役割を果たしうる。健康な細胞の細胞内タンパク質のシステイン残基のチオール基は、ほとんどの場合、還元状態にあり、即ち、遊離チオール（−ＳＨ）である。これは、生存可能な健康細胞における−ＳＨ−還元物質の高サイトゾル濃度による。これに対して、細胞疾患またはアポトーシスのような細胞死の場合、細胞は、酸化ストレスを受け、細胞内抗酸化メカニズムを失う。これは、特に、細胞内タンパク質のシステインのチオール基間のジスルフィド結合（Ｓ−Ｓ）の発生によって示される。
【００３８】
本発明は、被験組織または器官の細胞内のジスルフィド結合の負荷（ｌｏａｄ）の特徴づけによって、細胞疾患過程または細胞死を検出する方法に関する。本発明の方法によるジスルフィド結合の細胞負荷の特性決定は、この目的のために、チオレート−ジスルフィド反応（ＴＤＲ）を生体内で利用するという新規概念に基づいている。ＴＤＲは、ジスルフィド結合とチオレートアニオンとの化学反応であり、それによって、Ｓ−Ｓ結合の硫黄原子が、攻撃するチオレート基によって置換される。１つの局面において、本発明は、チオール基および画像化用のマーカの両方を含んで成る化合物の投与に関する。チオレート形態のチオール基は、ＴＤＲによってジスルフィドと相互作用して、Ｓ−Ｓ結合によって、その部位への画像化用マーカの結合を生じる（図６）。非結合化合物は、被験細胞から洗い流される。このようにして、画像化のために選択されたマーカに関して、画像化法（ｉｍａｇｉｎｇ ｍｏｄａｌｉｔｉｅｓ）によって、ジスルフィド結合の発生部位を記録しモニターする。上述したように、細胞内ジスルフィド結合の発生は、細胞疾患または細胞死と関連している故に、得られた画像は、被験組織内のこれらの疾患関連過程の発生に対応し、従って、それらの程度についての情報を与える。
【００３９】
本発明のある実施形態において、患者または動物の組織における疾患過程または細胞死を検出する方法を提供し、該方法は、（ｉ）画像化用のマーカに連結させた本発明のチオール含有化合物を投与する工程、および（ｉｉ）患者または動物の組織に結合した化合物の量を検出する工程、を含んで成り；患者または動物の組織に結合した化合物の有意量の検出は、該組織における細胞死または疾患過程の存在を示す。
【００４０】
本発明のある実施形態において、被験患者または動物の神経系における疾患過程を検出する方法を提供し、該方法は、（ｉ）画像化用のマーカに連結させた本発明のチオール含有化合物を投与する工程、および（ｉｉ）神経系の被験部分に結合した化合物の量を検出する工程、を含んで成り；コントロールと比較して、神経系の被験部分に結合した化合物の有意量の検出は、神経系の該部分における疾患過程の存在を示す。
【００４１】
「神経系の部分に結合した化合物の有意量」という用語は、本発明の実施形態によれば、神経系の正常な非疾患部分に結合した量より少なくとも１０％多い量で神経系の部分に結合した、診断用のマーカを含んで成るかまたはそれに結合した本発明の化合物の量を意味する。検出は、画像化法を使用することによってインビボであるか、または組織を視覚化するための方法を使用することによって、インビトロ、またはエクスビボであってよい。他の実施形態において、その量は５０％多くてもよい。本発明の他の実施形態において、その量は７５％多くてもよい。他の実施形態において、その量は１５０％多くてもよい。他の実施形態において、その量は約２倍多くてもよい。他の実施形態において、その量は５倍以上多くてもよい。他の実施形態において、その量は１０倍以上多くてもよい。
【００４２】
「疾患過程」という用語は、以下において、細胞または組織の機能または生存を損ない、かつ酸化ストレスに関連している、細胞または組織における任意の過程を意味する。本発明による疾患過程は、特に、神経系を含みうる。
【００４３】
「細胞死」という用語は、以下において、細胞の消滅に導く任意の過程、特に、アポトーシスまたはネクローシスによる細胞死を意味する。
【００４４】
本発明の他の実施形態において、本発明の化合物および方法によって検出される疾患過程は以下のものである：神経細胞またはグリア細胞内の酸化ストレス；アポトーシスを経ている神経細胞またはグリア細胞；他の機序の細胞死を経ている神経細胞またはグリア細胞；細胞体または神経突起の変性であると考えられる神経変性の過程；死の過程（例えば、アポトーシスによる）を経ている脳腫瘍の細胞；および神経系の細胞内における、または該細胞に関連したタンパク質の異常蓄積。そのようなタンパク質異常蓄積は、特に、細胞内封入体の形態（例えば、神経細線維もつれ、レヴィー小体）、または細胞外異常タンパク質沈着物の形態（例えば、アミロイドプラーク）である。
【００４５】
本発明の他の実施形態において、本明細書に記載する方法および化合物を、下記のような神経学的障害の診断に使用しうる：急性損傷、例えば、限定されないが、脳梗塞、中毒性発作または脳外傷；または慢性神経変性障害、例えば、限定されないが、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、多系統萎縮症（ＭＳＡ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、ハンチントン病、びまん性レヴィー小体疾患、プリオン障害、例えばクロイツフェルト−ヤコブ病、および脱髄性障害、例えば多発性硬化症。
【００４６】
本発明の他の実施形態において、本発明の方法を、治療に対する脳腫瘍の反応をモニターするのに使用する。大部分の抗腫瘍剤、例えば化学療法薬、または放射線照射は、腫瘍内のアポトーシスの誘発によって作用する故に、本発明の方法および化合物での、治療によって誘発された腫瘍細胞死レベルの画像化は、腫瘍治療の有効性を非侵襲的に示すことができる。
【００４７】
本発明のある実施形態において、組織または器官内の疾患過程または細胞死過程を経ている細胞を検出する作用をする本発明に使用される化合物は、下記の式（Ｉ）で示される：
【００４８】
【化１０】
【００４９】
［式中、
Ｌ１は、Ｃ１、Ｃ２およびＣ３直鎖または分岐鎖アルキレンから選択され；
Ｌ２は、不存在、およびＣ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６直鎖または分岐鎖アルキレンリンカーから選択され；
Ｑは、不存在、および置換されていてもよいアリール、ヘテロアリール、アリールスルホンアミドおよびヘテロアリール−スルホンアミドから選択され；
Ｍは、水素および画像化用のマーカから選択される］。
【００５０】
本発明のある実施形態において、画像化用マーカ（Ｍ）は、１８Ｆ、１５Ｏ、１８Ｏ、１１Ｃ、１３Ｃ、１２４Ｉ、１３Ｎおよび７５Ｂｒから選択しうる。
【００５１】
他の局面において、本発明は、組織または器官における細胞死の検出用の、下記の式（ＩＩ）で示される構造を有する化合物およびその使用を提供する：
【００５２】
【化１１】
【００５３】
［式中、ＭおよびＬ２は、それぞれ、上述のように定義される］。
本発明の他の実施形態において、Ｍは水素であり、Ｌ２は不存在であり、化合物はＮＳＴ７２９と称され、下記の式ＩＩＩで示される構造を有する：
【００５４】
【化１２】
【００５５】
本発明の他の局面において、下記の式ＩＶで示される構造で表される化合物を提供する：
【００５６】
【化１３】
【００５７】
［式中、
ｎは、２または３の整数を表し；
Ｆ原子は、１８Ｆまたは１９Ｆである］。ｎ＝３の場合、化合物はＮＳＴ７３９と称される。
【００５８】
本発明の他の局面において、下記の式Ｖで示される構造で表される化合物を提供する：
【００５９】
【化１４】
【００６０】
［式中、ＭおよびＬ２は、それぞれ、上述のように定義される］。本発明のある実施形態において、Ｍは水素であり、Ｌ２は不存在である。
【００６１】
本発明の他の局面において、下記の式ＶＩで示される構造で表される化合物を提供する：
【００６２】
【化１５】
【００６３】
［式中、
Ｌ２およびＭは、上述と同意義であり；
Ｙは、不存在、−Ｏ−、ＮＨおよびＣ１、Ｃ２、Ｃ３またはＣ４アルキルアミンから選択される］。
【００６４】
本発明の他の実施形態において、下記の式ＶＩＩで示される構造で表される化合物を提供する：
【００６５】
【化１６】
【００６６】
［式中、Ｆ原子は、１８Ｆまたは１９Ｆであってよい］。
本発明の他の局面において、下記の式ＶＩＩＩで示される構造で表される化合物を提供する：
【００６７】
【化１７】
【００６８】
［式中、
Ｆは、１８Ｆまたは１９Ｆであってよく；
Ｒは、アリールまたはヘテロアリール、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６直鎖または分岐鎖の置換されていてもよいアルキル、またはそれらの組合せである］。
【００６９】
本発明の他の局面において、下記の式ＩＸで示される構造で表される化合物を提供する：
【００７０】
【化１８】
【００７１】
［式中、Ｆは、１８Ｆまたは１９Ｆであってよい］。
本発明に使用される化合物は、該化合物の医薬的に許容される塩、金属キレート、溶媒化合物および水化物、ならびに医薬的に許容される該塩の溶媒化合物および水化物も包含する。医薬的に許容される付加塩の例は、無機および有機酸付加塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、燐酸塩、硫酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、マンデル酸塩、蓚酸塩および酢酸塩であるが、それらに限定されない。または、医薬的に許容される無機および有機塩基付加塩、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム等も使用しうる。
【００７２】
本発明の化合物は、正常な健康な細胞と、疾患関連過程を経ている細胞、特に、酸化ストレスを受けている細胞、アポトーシスのような死の過程を経ている細胞、変性を経ている神経突起、または、特に、細胞内封入体の形態（例えば、神経細線維もつれ、レヴィー小体）、または細胞外異常タンパク質沈着物の形態（例えば、アミロイドプラーク）の、神経系の細胞内における、または該細胞に関連したタンパク質の異常蓄積とを区別しうる。
【００７３】
健康な細胞の細胞内タンパク質は、強い細胞内抗酸化メカニズムにより、チオール基の還元状態（即ち、遊離チオールの形態）を特徴とするが、上述した病変は、該抗酸化メカニズムの喪失を特徴とし、従って、ジスルフィド（−Ｓ−Ｓ−）結合の形成を促進する。本発明の任意化合物のチオール基は、これらのジスルフィド結合形成反応に関与しやすく、従って、該化合物は、細胞の抗酸化メカニズムの喪失の程度に直接的に相関した程度に、細胞に結合する。従って、本発明の化合物の被験細胞への結合のレベルは、細胞の疾患または死の過程に関連した細胞レドックス状態の減損のレベルを示す。さらに、比較的低い分子量、および生理的ｐＨにおける疎水性は、本発明の化合物が、血液脳関門（ＢＢＢ
）を効率的に通過し、脳細胞に接近することを可能にする。
【００７４】
本発明の神経病理的過程の検出法は、実施例４に示すように、アルツハイマー病が疑われる患者の脳のアミロイドプラークの量を測定する手段として使用しうる。従って、脳アミロイドーシスが疑われる患者の脳におけるアミロイドプラークの量を測定する方法を提供し、該方法は、下記の工程を含んで成る：（ｉ）上述のように定義される式Ｉ〜ＩＸで示される構造を有するいずれかの化合物に、脳組織を接触させる工程、および、（ｉｉ）脳組織におけるプラークに結合した化合物の量を測定するために、ヒトまたは動物を画像化する工程。
【００７５】
上述した方法は、患者または動物（該動物は、１つの実施形態において、トランスジェニック動物であってもよい）におけるアミロイドプラークの量を減少させるために投与された薬剤の有効性を確認するのに適用してもよく、該方法は、（ｉ）動物に薬剤を投与する工程、（ｉｉ）上述のように定義される式Ｉ〜ＩＸで示される構造を有するいずれかの化合物を投与する工程、および（ｉｉｉ）画像化または組織病理学によってシグナルを検出する工程、を含んで成り；画像強度が減少した場合、または検出プラークの量が減少した場合、薬剤は、被験脳におけるアミロイドプラークの負荷を減少させるのに有効であるものとして同定される。工程（ｉ）および（ｉｉ）の順序を変えてよいことに注目すべきである。
【００７６】
本発明の他の実施形態において、下記に罹患している疑いのあるヒトの脳における病理学的変化を検出する方法を提供する：急性神経学的障害、例えば、脳梗塞、中毒性発作または脳外傷；または慢性神経変性障害、例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、多系統萎縮症（ＭＳＡ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、ハンチントン病、レヴィー小体疾患、プリオン障害、例えばクロイツフェルト−ヤコブ病、および脱髄性障害、例えば多発性硬化症。それぞれの神経病理学的変化は、下記から選択される：疾患過程を経ている細胞、アポトーシスのような死の過程を経ている細胞、変形および変性を経ている神経突起、および、アミロイドプラークのような、脳組織内の細胞内または細胞外タンパク質沈着物。該方法は、（ｉ）上述のように定義される式Ｉ〜ＩＸで示される構造を有するいずれかの化合物に、脳組織を接触させる工程、および（ｉｉ）脳組織に結合した化合物の量を測定するために対象を画像化する工程、を含んで成り；コントロールと比較して、被験脳への有意量の結合の画像化がみられた場合、脳病変を示す。
【００７７】
本発明の他の局面において、患者または動物（該動物は、１つの実施形態において、トランスジェニック動物であってもよい）における上述のいずれかの神経病理学的変化を減少させることにおける薬剤の有効性を検出する方法を提供し、該方法は、（ｉ）被験患者または動物に薬剤を投与する工程、（ｉｉ）上述のように定義される式Ｉ〜ＩＸで示される構造を有するいずれかの化合物を投与する工程、および（ｉｉｉ）画像化によってシグナルを検出する工程、を含んで成り；シグナル強度が減少した場合、該薬剤は、被験脳における疾患の負荷を減少させるのに有効であるものとして同定される。工程（ｉ）および（ｉｉ）の順序を変えてよいことに注目すべきである。
【００７８】
本発明のある実施形態において、ＰＥＴまたはＳＰＥＣＴによる放射性核種画像化によって、患者における疾患過程を経ている細胞または組織の画像を得るための、本発明化合物の使用に関して、（異常組織に結合した化合物の量）／（正常細胞に結合した化合物の量）の比率の計算は、死の過程を経ている組織から得たシグナルの振幅または強度を、死の過程を経ていない組織から得たシグナルの振幅／強度と比較することによって行いうる。
【００７９】
本発明の１つの実施形態において、死の過程を経ている細胞、例えばアポトーシスを経ている細胞を、選択的に標的にする、式Ｉ〜ＩＸで示される構造によって示される化合物を提供する。
【００８０】
本発明の他の局面において、細胞集団において死の過程を経ている細胞を検出する方法を提供し、該方法は、（ｉ）式Ｉ〜ＩＸで示されるいずれか１つの構造で表される化合物、または式Ｉ〜ＩＸで示される構造で表される化合物の医薬的に許容される塩、金属キレート、溶媒化合物および水化物、および該塩の溶媒化合物および水化物に、細胞集団を接触させる工程、および（ｉｉ）細胞に結合した化合物の量を測定する工程、を含んで成り；細胞に結合した化合物の有意量は、死の過程を経ている細胞の存在を示す。
【００８１】
「細胞に結合した化合物の有意量」という用語は、本発明によれば、正常な細胞に結合した量より１０％以上多い量で、死の過程を経ている細胞に結合した、診断用マーカを含んで成るかまたはそれに結合した本発明の化合物の量を意味する。他の実施形態において、その量は５０％多くてもよい。本発明の他の実施形態において、その量は７５％多くてもよい。他の実施形態において、その量は１５０％多くてもよい。他の実施形態において、その量は約２倍多くてもよい。他の実施形態において、その量は２倍以上多くてもよい。他の実施形態において、その量は５倍以上多くてもよい。他の実施形態において、その量は１０倍以上多くてもよい。
【００８２】
本発明の他の局面によれば、患者または動物において死の過程を経ている細胞を検出する方法を提供し、該方法は、（ｉ）１８Ｆのような画像化用マーカを含有する式Ｉ〜ＩＸで示される構造で表される化合物、または式Ｉ〜ＩＸで示される構造で表される化合物の医薬的に許容される塩、金属キレート、溶媒化合物および水化物、および該塩の溶媒化合物および水化物を、患者または動物に投与する工程、および（ｉｉ）細胞に結合した化合物の量を測定するために、被験患者または動物を画像化する工程、を含んで成り；細胞に結合した化合物の有意量の検出は、これらの細胞が死の過程を経ている細胞であることを示す。
【００８３】
本発明の化合物は、下記の本発明の２種類の手法において、死の過程を経ている細胞を含有する組織および器官への、医薬的に有用な薬剤の選択的標的化のために使用しうる：
（ｉ） 以下に「検出手法」と称される第１手法によれば、死の過程を経ている細胞に画像化用マーカを向けるために、選択的結合を使用しうる。下記に説明するように、これは、そのような細胞が発生する疾患の診断のために、インビボ、エクスビボまたはインビトロにおいて診療に使用しうる；
（ｉｉ） 以下に「治療的手法」と称される第２手法によれば、死の過程を経ている細胞が発生する体の器官および組織、例えば、細胞死、血栓形成または炎症の領域への、治療薬の選択的標的化のために、選択的結合特性を使用する。
【００８４】
本発明の化合物は、死の過程を経ている細胞の形成を特徴とする種々の医学的状態の検出および診断に使用しうる。死の過程を経ている細胞を特徴とする臨床状態の例を以下に示す。
【００８５】
過剰アポトーシスの発生を特徴とする疾患、例えば、変性疾患、神経変性疾患（例えば、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン舞踏病）、ＡＩＤＳ、ＡＬＳ、プリオン疾患、骨髄異形成症候群、虚血性または中毒性発作、移植拒絶反応中の移植細胞損失；腫瘍、特に高悪性／浸潤性腫瘍は、過剰の組織増殖に加えて、増強したアポトーシスも特徴とすることが多い。
【００８６】
炎症性疾患および／または免疫媒介病因または病原に関連した疾患、自己免疫疾患、例
えば、抗リン脂質抗体症候群、全身性エリテマトーデス、結合組織疾患、例えば、慢性関節リウマチ、強皮症；甲状腺炎；皮膚疾患、例えば、天疱瘡または結節性紅斑；自己免疫性血液疾患；自己免疫性神経系疾患、例えば重症筋無力症；多発性硬化症；炎症性腸疾患、例えば潰瘍性大腸炎；血管炎。
【００８７】
アテローム硬化性プラーク、特に、不安定な脆弱性の断裂しやすいプラークは、死の過程を経ている細胞、例えば、アポトーシスマクロファージ、アポトーシス平滑筋細胞、アポトーシス内皮細胞、および活性化血小板も特徴とする。そのような活性化血小板は、血栓において発生し、不安定なアテローム硬化性プラークに付随していることが多い。
【００８８】
実施形態の１つにおいて、本発明は、画像化用のマーカを含有するかまたはそれに連結させた、本発明に記載の化合物のいずれかを有効成分として含んで成る医薬組成物であって、インビトロ、エクスビボまたはインビボでの神経組織疾患または死の過程またはアミロイドプラークを検出するための医薬組成物に関する。次に、検出可能な標識を、当業者に既知の方法によって、かつ、使用される特定の標識、例えば、蛍光、放射線放射、発色、磁気共鳴、Ｘ線等に応じて、検出することができる。画像化は、当業者に既知であるように、使用されるトレーサおよび画像化法に応じて、適切な装置を使用して行われる。
【００８９】
１つの実施形態において、検出可能な標識は、放射性同位体であってよい。陽電子断層撮影法（ＰＥＴ）スキャンに使用される放射性同位体の例は、１８Ｆ、１５Ｏ、１８Ｏ、１１Ｃ、１３Ｃ、１２４Ｉ、１３Ｎおよび７５Ｂｒである。
【００９０】
ある実施形態において、本発明の化合物は、ＰＥＴスキャンによる臨床画像化を目的とし、該化合物は１８Ｆ原子を含んで成る。
【００９１】
上述した構造を有するいずれの化合物であってもよい化合物を、ＰＥＴ画像化のために１８Ｆで標識化する方法は、１８Ｆ原子を化合物に付加し、それによってＰＥＴ画像化のために化合物を１８Ｆ原子で放射性標識することを含んで成る。場合により、１８Ｆ原子での放射性標識の反応中に、１８Ｆ原子の付加工程前に、化合物の他の官能基（例えば、チオール基）を適切な保護基で保護してもよく、該保護基は、１８Ｆ原子の付加工程後に除去される。
【００９２】
蛍光検出のために、本発明の化合物は、当分野で既知の任意の蛍光プローブから選択される、画像化用マーカとしての蛍光基（即ち、Ｍ基）を含んで成ってよい。そのようなプローブの例は、５−（ジメチルアミノ）ナフタレン−１−スルホニルアミド（ダンシル−アミド）、およびフルオレセインである。
【００９３】
標的部位への化合物結合の評価は、ＦＡＣＳまたは共焦点顕微鏡検査によるかまたはＰＥＴのような画像化法によって、蛍光を測定することによって行いうる。
【００９４】
本発明の化合物は、種々の医学的状態の検出および診断に使用でき、該医学的状態は、ジスルフィド（−Ｓ−Ｓ−）結合の形成を伴う細胞内タンパク質のチオール基の酸化によって示される酸化ストレス、または異常な細胞外タンパク質沈着物（例えばアミロイドプラーク）の蓄積を特徴とする。
【００９５】
自然に、または治療に反応して生じた腫瘍内の酸化ストレスおよび／または細胞死の発生を評価することを目的として、脳腫瘍を患っていることがわかっている人において、検出を行うこともできる。大部分の抗腫瘍治療、例えば化学療法または放射線療法は、アポトーシスの誘発によってその作用を発揮するので、脳腫瘍細胞の治療誘発アポトーシスの本発明の化合物による検出は、抗腫瘍薬への腫瘍の感受性の程度を示しうる。これは、抗
癌剤の投与時と、その有効性の正確な評価時との時間差をかなり短縮し、脳腫瘍の治療をよりよく最適化することを可能にしうる。
【００９６】
本発明の化合物および医薬的に許容される担体を含んで成る医薬組成物は、任意の既知の経路、特に、経口、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、舌下、眼内、鼻腔内または局所投与によるか、または脳内投与によって、投与しうる。担体は、所望の投与法に応じて選択すべきであり、任意の既知の成分、例えば、溶媒；エマルゲイター（ｅｍｕｌｇａｔｏｒｓ）、賦形剤、タルク；香味剤；着色剤等を包含する。医薬組成物は、所望であれば、疾患を治療し、副作用を除去し、または活性成分の活性を増加させるために使用される他の医薬的活性化合物も含有しうる。
【００９７】
実施例
本発明を理解し、実際にどのように本発明を実施しうるかを把握するために、以下の実施例を記載する：本発明の化合物の合成に関する実施例；および、死の過程を経ている細胞、老人性アミロイドプラーク、および変性を経ている神経突起への、選択的結合における、本発明の化合物の生物学的性能を示す実施例。実施例において、化合物は、蛍光標識、即ちダンシルアミド基を含有し、それによって、蛍光顕微鏡検査を可能にする。病理的過程を経ている細胞への、本発明の化合物の選択的結合を、いくつかのモデルにおいてインビボで示した：
（ｉ） 中大脳動脈（ＭＣＡ）の閉塞によって細胞死を誘発させた脳梗塞マウスモデル；
（ｉｉ） Ｂ−１６マウス黒色腫における化学療法によって誘発させた細胞死；
（ｉｉｉ） 突然変異スーパーオキシドジスムターゼ遺伝子を有し、それによって運動ニューロン様疾患（ｍｏｔｏｒ ｎｅｕｒｏｎ−ｌｉｋｅ ｄｉｓｅａｓｅ）を発症したトランスジェニックマウス；
（ｉｖ） βＡＰＰのＴＧ２５７６変異を有し、それによって脳内にアミロイドプラークを発症した老齢トランスジェニックマウス。
【００９８】
遊離チオール基を含有するいくつかの化合物の性能を示す：ＮＳＴ７２８、ＮＳＴ７２９、ＮＳＴ７３９およびダンシル−システイン（ＤＣ）。本発明の化合物と同じ蛍光プローブおよび同様の分子量および疎水性を有し、かつ−ＳＨ基を有さない故に選択したｎ−ブチルダンシルアミド（ＢＤＡ）を、コントロール化合物として使用した。従って、生物学的試験におけるその性能と、チオール含有化合物の性能との比較は、病理的変化を経ている構造物への選択的結合における、化合物の生物学的活性をもたらす該基の役割を示している。同様に、腫瘍へのダンシル−システイン（ＤＣ）結合の性能評価において、チオール基を含有しないダンシル−グリシンおよびダンシル−セリンをコントロール化合物として使用した。
【００９９】
アポトーシス細胞の素性を、シーケンシャルスライド（ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ ｓｌｉｄｅ）において行われるＴＵＮＥＬ染色によって確認し；アミロイドプラークの素性を、コンゴー赤でのシーケンシャルスライドの染色によって確認した。両確認法は、それぞれ、アポトーシスの評価法、またはアミロイドプラークの検出法として、広く認められている。
【実施例１】
【０１００】
ＮＳＴ７２８、ＮＳＴ７２９、ＮＳＴ７３９、ＤＣおよびＢＤＡの合成
１．ダンシル−システイン（ＤＣ）の合成
【０１０１】
【化１９】
【０１０２】
シスチン（１、１当量）を、４当量の炭酸カリウムと共に、水／アセトン溶液に溶解させた。塩化ダンシル（２．５当量）を添加し、溶液を室温で１．５時間撹拌した。アセトンを除去し、２Ｍクエン酸の添加によって溶液をｐＨ３に酸性化した。水性混合物を酢酸エチルで抽出した。抽出物を合わし、硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を蒸発させた。得られた粗生成物を塩基性水溶液に溶解させた。溶液をエーテルで洗浄し、次に、ｐＨ３に再び酸性化して、黄色沈殿物を得た。ＥＳＩ−ＭＳおよび１Ｈ−ＮＭＲは構造２と一致していた[1H-NMR (D2O, δ=ppm): 8.50 (2H, dd); 8.25 (2H, dd); 8.15 (2H, d); 7.50 (4H, m); 7.20 (2H, dd); 4.05 (2H, m); 2.85 (12H, s); 2.60 (4H, m)。ESI-MS: Calc. m/z=706.1. Found m/z+H+=707.5]。
【０１０３】
中間体２を１：１のメタノール：ＮａＰＰｉバッファ（０．１Ｍ、ｐＨ７．４）に溶解させた。窒素を溶液に１０分間泡立たせ、次に、２当量のジチオトレイトール（ＤＴＴ）を添加した。反応をＴＬＣによってモニターした。必要な場合に、追加のＤＴＴを添加した。出発物質が使い尽くされた際に、メタノールを蒸発させ、水溶液の容量を元の半分に減少させた。溶液を２Ｍクエン酸によってｐＨ３にゆっくり酸性化し、次に、０℃で３０分間冷却した。沈殿物を吸引濾過によって収集し、吸水器（ｐｕｍｐ）で乾燥し、窒素下に充填した（ｐａｃｋａｇｅｄ ｕｎｄｅｒ ｎｉｔｒｏｇｅｎ）。ＥＳＩ−ＭＳおよび１Ｈ−ＮＭＲは、構造３、即ちダンシル−システイン（ＤＣ）と一致していた[1H-NMR (CDCl3,δ=ppm): 8.50 (1H, d); 8.30; (1H, d); 8.20 (1H, d) ; 7.60 (1H, t); 7.50 (1H, t); 7.20 (1H, d); 5.90 (1H, d); 4.15 (1H, m), 2.90 (6H, s); 2.70 (2H, m)。ESI-MS: Calc. m/z=354.4. Found m/z+H+=355.7]。
【０１０４】
２．ＮＳＴ７２９の合成
【０１０５】
【化２０】
【０１０６】
シスタミン（４、１当量）を、４当量の炭酸カリウムと共に、水／アセトン溶液に溶解させた。塩化ダンシル（２．５当量）を添加し、溶液を室温で１．５時間撹拌した。アセトンを除去し、２Ｍクエン酸の添加によって溶液をｐＨ３に酸性化した。水性混合物を酢酸エチルで抽出した。抽出物を合わし、５％炭酸水素ナトリウムで洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を蒸発させた。得られた粗生成物を、シリカゲル上でのＬＣによって精製した。カラムをヘキサン中の０〜３０％酢酸エチルの勾配で溶離した。主要黄色蛍光画分を収集した。ＥＳＩ−ＭＳおよび１Ｈ−ＮＭＲは、ジダンシルシスタミンである構造５と一致していた：1H-NMR (CDCl3, =ppm): 8.55 (2H, d), 8.23 (4H, dd); 7.50 (4H, q); 7.20 (2H, d); 5.20 (2H, t); 3.10 (4H, q); 2.90 (12H, s); 2.50 (4H, t)。ESI-MS: Calc. m/z=618.9. Found m/z+H+=620.1。中間体５を１：１のメタノール：ＮａＰＰｉバッファ（０．１Ｍ、ｐＨ７．４）に溶解させた。窒素を溶液に１０分間泡立たせ、次に、２当量のジチオトレイトール（ＤＴＴ）を添加した。反応をＴＬＣによってモニターし
た。必要な場合に、追加のＤＴＴを添加した。出発物質が使い尽くされた際に、メタノールを蒸発させ、水溶液の容量を元の半分に減少させた。溶液を２Ｍクエン酸によってｐＨ３にゆっくり酸性化し、次に、０℃で３０分間冷却した。沈殿物を吸引濾過によって収集し、吸水器で乾燥し、窒素下に充填した。ＥＳＩ−ＭＳおよび１Ｈ−ＮＭＲは、ＮＳＴ７２９［ｎ−（２−メルカプトエチル）−ダンシルアミド（６）］である構造６と一致していた：1H-NMR (CDCl3, =ppm): 8.55 (1H, d); 8.30 (2H, t); 7.55 (2H, m); 7.20 (1H, d); 5.20 (1H, d); 3.05 (2H, q); 2.90 (6H, s); 2.50 (2H, q)。ESI-MS: Calc. m/z=310.4. Found m/z+H+=311.5。
【０１０７】
３．ＮＳＴ ｎ−ブチルダンシルアミド（ＢＤＡ）の合成
【０１０８】
【化２１】
【０１０９】
１当量の塩化ダンシル（７）を、１：１のアセトニトリル：水中の２当量のブチルアミンおよび炭酸カリウムを含有する溶液に添加した。溶液を室温で１．５時間撹拌した。次に、アセトニトリルを除去し、水残渣を酢酸エチルで抽出した。有機溶液を５％炭酸水素ナトリウム、２Ｍクエン酸および塩水で洗浄した。溶液を硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、溶媒をフラッシュ蒸発によって除去した。粗生成物を必要最低限量の酢酸エチルに溶解させ、曇るまでヘキサンを添加した。溶液を冷蔵庫に２時間保管した。沈殿物を吸引濾過によって収集し、ヘキサンで洗浄し、吸水器で乾燥させた。ＥＳＩ−ＭＳおよび１Ｈ−ＮＭＲは、（ｎ−ブチルダンシルアミド；ＢＤＡ）である構造８と一致していた：1H-NMR (CDCl3, =ppm): 8.55 (1H, d); 8.30 (2H, dd); 7.55 (2H, m); 7.20 (1H, d); 4.80 (1H, t); 2.90 (8H, m); 1.35 (2H, m). 1.20 (2H, m); 0.70 (3H, t)。ESI-MS: Calc. m/z=306.4. Found m/z+H+=307.4。
【０１１０】
４．Ｎ−（３−フルオロプロピル）−Ｎ−（２−チオエチル）−ダンシルアミド（ＮＳＴ７３９）の合成
【０１１１】
【化２２】
【０１１２】
ｎ−（２−ＰＭＢ−チオエチル）−ダンシルアミド（２）： １．３ｍｍｏｌの２−アミノエタンチオール−ＰＭＢエーテルヒドロクロリド（１）および３ｍｍｏｌのＫ２ＣＯ３を、１：１のアセトニトリル：水の混合物に溶解させた。塩化ダンシル１ｍｍｏｌを添加し、溶液を室温で２０分間撹拌した。アセトニトリルを除去し、残留水相から黄色油状
残渣をＤＣＭに抽出した。有機抽出物を合わし、Ｍ ＮａＨＳＯ４で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、溶媒を蒸発させた。ＴＬＣ（３：２の石油エーテル：酢酸エチル）は、Ｒｆ＝０．８において１つの黄色蛍光点（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｓｐｏｔ）を示した。１Ｈ−ＮＭＲおよびＥＳＩ−ＭＳは中間体２と一致していた。生成物は、さらに精製しなくても次の段階に使用するのに充分に純粋（ｃｌｅａｎ）であった。1H-NMRは以下のとおりであった: (CDCl3, =ppm): 8.55 (1H, d); 8.30 (1H, d); 8.20 (1H, dd); 7.55 (2H, m); 7.20 (1H, d); 7.00 (2H, d); 6.75 (2H, d), 5.20 (1H, t); 3. 75 (3H, s); 3.30 (2H, s); 2.95 (2H, q); 2.85 (6H, s); 2.35 (2H, t)。ESI-MS: m/z+H+=431.47。１ｍｍｏｌの生成物２を、ＤＭＦに溶解させ、１．５ｍｍｏｌのＣｓ２ＣＯ３の存在下に、７０℃で１５分間撹拌した。次に、ブロモプロパノール１．５ｍｍｏｌを添加し、混合物を７０℃で一晩撹拌した。ＤＭＦを除去し、残渣をＤＣＭに溶解させた。溶液を１Ｍ ＮａＨＳＯ４および５％ＮａＨＣＯ３で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、溶媒を除去した。粗生成物のＴＬＣ（３：２の石油エーテル：酢酸エチル）は、それぞれＲｆ＝０．４６、０．３２および０．２０において３つの黄色蛍光点を示した。粗生成物をシリカゲル上でのフラッシュＬＣによって精製した。Ｒｆ＝０．４８における物質が溶離されるまで、カラムをＤＣＭ中の２５％石油エーテルで溶離した。次に、溶離剤をＤＣＭに交換し、他の物質を溶離させた。スペクトル（１Ｈ−ＮＭＲおよびＥＳＩ−ＭＳ）データは、Ｒｆ＝０．３２における物質が、下記データを有する所望構造３と一致していることを示した。1H-NMRデータ: (CDCl3, =ppm): 8.55 (1H, d); 8.25 (1H, d); 8.15 (1H, dd); 7.50 (2H, m); 7.15
(3H, m); 6.80 (2H, d); 3.80 (3H, s); 3.60 (4H, m); 3.35 (4H, m); 2.85 (6H, s), 2.50 (2H, m), 2.10 (1H, broad); 1.65 (2H, m)。ESI-MS: m/z+H+=489.87, m/z+Na+=511.60。１ｍｍｏｌの生成物３をＤＣＭに溶解させ、トリエチルアミン１．４ｍｍｏｌを添加した。塩化メシル１．３ｍｍｏｌをゆっくり滴下し、溶液を室温で１．５時間撹拌した。反応混合物のＴＬＣ（３：２の石油エーテル：酢酸エチル）は、全ての出発物質の全消費、および出発物質の上方を流れる新しい物質の出現を示した。溶液混合物を、追加のＤＣＭで希釈し、１Ｍ ＮａＨＳＯ４および５％ＮａＨＣＯ３で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、溶媒を除去した。ＴＬＣは、Ｒｆ＝０．４５における純粋点（ｃｌｅａｎ ｓｐｏｔ）を示した。生成物（４）をさらに精製せずに使用した。その特性は以下の通りであった：
1H-NMR (CDCl3, =ppm): 8.55 (1H, d); 8.25 (1H, d); 8.15 (1H, d); 7.55 (2H, m); 7.20 (lH, d); 7.15 (2H, d); 6.80 (2H, d); 4.10 (2H, t); 3.80 (3H, s); 3.60 (2H, m); 3.35 (4H, q); 2.95 (3H, s), 2.85 (6H, s); 2.50 (2H, t), 1.90 (2H, m)。ESI-MS: m/z+ H+=567.33, m/z+Na+ =589.27。
【０１１３】
ｎ−（３−フルオロプロピル）−Ｎ−（２−ＰＭＢ−チオエチル）−ダンシルアミド（５）： １ｍｍｏｌのＫＦ、１ｍｍｏｌのクリプトフィックス［２，２，２］および０．５ｍｍｏｌのＫ２ＣＯ３を、アセトニトリル中の１０％水に溶解させた。溶液を、乾燥するまで蒸発させ、残渣を乾燥アセトニトリルに溶解させ、溶媒を再び除去した。この方法をさらに３回繰り返し、蒸発器を開けて窒素雰囲気にした。乾燥アセトニトリルに溶解した生成物３（０．２ｍｍｏｌ）を含有する溶液を、乾燥残渣に添加し、混合物を１５分間還流させた。次に、溶媒を除去し、残渣を、必要最低限量の、ＤＣＭ中２５％石油エーテルに溶解させた。溶液を直接、シリカゲルカラムに適用し、前記の溶媒混合物で溶離した。溶離された第１黄色蛍光物質を収集した。ＥＳＩ−ＭＳおよび１Ｈ−ＮＭＲは、所望物質５と一致していた。19F-NMR (CDCl3, =ppm):-44.50, m. 1H-NMR (CDCl3, =ppm): 8.55 (1H, d); 8.25 (1H, d); 8.15 (1H, dd); 7.50 (2H, m); 7.15 (3H,m); 6.80 (2H, d); 4.40 (1H, t); 4.25 (1H, t); 3.75 (3H, s); 3.60 (2H, m); 3.35 (4H, m); 2.95 (3H, s), 2.85 (6H, s); 2.50 (2H, m), 1.80 (2H, m)。ESI-MS: m/z+H+=491.72。０．５ｍｍｏｌの生成物５を、５ｍＬのＴＦＡに溶解させた。アニソール２００μＬ、次に、酢酸水銀（ＩＩ） １ｍｍｏｌを添加した。溶液を室温で１５分間維持し、光から保護した。次に、ＴＦＡをフラッシュ蒸発によって除去し、残渣をエーテルで洗浄した。固形物を濾過に
よって取り、新しいエーテルで洗浄し、メタノールに溶解させた。Ｈ２Ｓの流れを溶液に３分間泡立たせた。溶液をさらに５分間撹拌し、黒色沈殿物をセライトのパッドで濾過して取った。酢酸ナトリウムを中性ｐＨまで添加し、溶媒を除去した。粗生成物をＬＣ（ＤＣＭで溶離）によって精製した。溶離した第１黄色蛍光物質を分析して、生成物６の構造であることを確認した。ＮＳＴ８３９［ｎ−（３−フルオロプロピル）−Ｎ−（２−チオエチル）−ダンシルアミド（６）］を単離し、以下のように特徴づけた：19F-NMR (CDCl3, =ppm):-44.70,m. 1H-NMR (CDCl3, =ppm): 8.55 (1H, d); 8.30 (1H, d); 8.20 (1H, d); 7.55 (2H, m); 7.20 (1H, m); 6.80 (2H, d); 4.40 (1H, t); 4.30 (1H, t); 3.45 (4H, m); 2.85 (6H, s); 2.65 (2H, q), 1.90 (2H, m); 1.30 (1H, t)。ESI-MS: m/z+H+=371.14。
【０１１４】
従って、この実施例は、臨床ＰＥＴスキャンのための１８Ｆ連結の「Ｈｏｔ−Ｂｏｘ」化学に使用される条件に適合した方法における、ＮＳＴ７３９へのフッ素の連結の実施可能性を示す。
【実施例２】
【０１１５】
マウスにおける中大脳動脈（ＭＣＡ）閉塞後の細胞死を経ている細胞へのＮＳＴ７２９の選択的結合
マウスにおける中大脳動脈（ＭＣＡ）焼灼術後のアポトーシスを経ている脳細胞を同定するＮＳＴ７２９の能力を示すために、マウスにおいてインビボ試験を行った。
【０１１６】
実験手順
体重２０〜２５ｇの成熟した雄のＢａｌｂ／Ｃマウスにおいて、実験を行った。中大脳動脈の片側（ｕｎｉｌａｔｅｒａｌ）焼灼術によって虚血を誘発させた。簡単に言えば、マウスに麻酔をかけ、側頭下手法によって虚血を誘発させた。ＭＣＡが外側嗅索と交差するレベルで開頭術を行った。硬膜を慎重に開き、動脈を露出させ、その起点から下大脳静脈と交差する点まで、両極性ジアテルミーによって閉塞した。全ての可視の枝も、バイパス形成による血液供給を防止するために閉塞した。切開部位をクリップで閉じ、動物に鎮痛薬を注射し、回復させた。中大脳動脈（ＭＣＡ）焼灼から２２時間後、２００μＬ中１．４ｍｇのＢＤＡ（遊離チオール残基を含有しないが、それ以外は、構造および分子量においてＮＳＴ７２９に類似し、従って、チオール残基の必要性に関して、対照として使用しうる）またはＮＳＴ７２９（１０％（ＢＤＡ）および５０％（ＤＣＡ？？？ ＤＣＡを意味するのか、またはＮＳＴ７２９であるべきか？ クレモホール／トリズマ−塩基（Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ／ｔｒｉｚｍａ−ｂａｓｅ）０．１Ｍ）を、動物を殺す２時間前に静脈内注射した。損傷の誘導から２４時間後に、マウスに麻酔をかけ、殺し、さらなる分析のために、脳を除去して液体窒素に入れた。１０μｍの凍結切片を調製した。薄片を、蛍光顕微鏡によって視覚化した。
【０１１７】
実験結果
図１から明らかなように、損傷領域の細胞は、ＮＳＴ７２９への広範囲な結合を示した。蛍光強度によって示されるＮＳＴ７２９の結合レベルは、ＢＤＡ（ＮＳＴ７２９に類似した構造を有するが、チオール基を含有しない）の結合レベルより顕著に高かった。さらに、ＮＳＴ７２９によって検出されたアポトーシス事象の数は、ＢＤＡによって検出された細胞数より顕著に多かった。
【０１１８】
これらの結果は、遊離チオール基が、脳におけるアポトーシス細胞への化合物の選択的結合を可能にするのに重要な成分であることを示す。
【実施例３】
【０１１９】
腫瘍、マウス黒色腫における、アポトーシス細胞へのＤＣのインビボ標的化
実験手順
腫瘍、特に黒色腫のような浸潤性悪性腫瘍は、異常な組織増殖に加えて、腫瘍細胞の顕著なアポトーシスも特徴とする。従って、腫瘍内におけるこれらのアポトーシス細胞の選択的標的化におけるＤＣの性能を試験した。マウス（ｃ５７／ｂｌａｃｋ；８週齢の雄のマウス）の両側の側腹部に、マウス黒色腫由来Ｂ１６−Ｆ１０細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−６４７５；容量１００μＬ中に１０５細胞／マウス）を皮下注射した。注射の前に、４ｍＭ Ｌ−グルタミン；１００単位／ｍＬ ペニシリン；１００μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン；１２．５単位／ｍＬ ナイスタチンおよび１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を補足したダルベッコ修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）における培養に、該細胞系を維持した。腫瘍を１４日間成長させ、それまでに腫瘍は直径５〜７ｍｍに達した。
【０１２０】
ダンシル−システイン（ＤＣ）、または対照化合物ダンシル−グリシンまたはダンシル−セリン（ＮａＰｐｉバッファ、ｐＨ７．４０中に、それぞれ２ｍｇ／マウス）を静脈内注射した。２時間後、マウスを殺し、腫瘍および他の器官を取り、直ぐに液体窒素中で凍結させた。次に、凍結切片を各器官から調製した。腫瘍または他の器官による被験化合物の取り込みを、蛍光顕微鏡によって評価した。
【０１２１】
実験結果
図２Ａは、腫瘍の蛍光顕微鏡検査を示す。細胞死を経ている多数の腫瘍細胞へのＤＣの広範な結合が観察される。アポトーシス細胞への顕著な取り込みによって生じた、化合物の細胞内蓄積、および高レベルの選択性も示され、生存腫瘍細胞は無染色のままである。
【０１２２】
高レベルの選択性は、図２Ｂにも示され、同じ動物の小腸組織の蛍光顕微鏡検査を示し、正常な生存組織への化合物の結合がないことを示している。同様の結果が、種々の他の非標的組織、例えば、結腸、腎臓、脾臓、筋肉または心臓から得られた。
【０１２３】
これに対して、ＤＣに類似した構造を有するが遊離チオール基を含有しないダンシル−グリシンおよびダンシル−セリンは、アポトーシス細胞または生存腫瘍細胞による有意な取り込みを示さなかった（データ示さず）。
【０１２４】
これらの結果は、アポトーシスを経ている細胞への化合物の選択的結合を可能にすることにおける、遊離チオール基の重要性を示している。
【実施例４】
【０１２５】
二重突然変異ＡＰＰを有するＡＰＰ Ｓｗｅｄｉｓｈ ＴＧ２５７６マウスにおけるアミロイドプラークの検出
ＡＰＰの突然変異を有する１才半のＡＰＰ Ｓｗｅｄｉｓｈ ＴＧ２５７６マウスにおいて、実験を行った。ＢＤＡ（遊離チオール残基を含有せず）およびＮＳＴ７２９を静脈内注射し、２時間後に、マウスに麻酔をかけ、さらなる分析のために、脳を除去して液体窒素に入れた。厚さ各１０μｍの凍結切片を調製し、蛍光顕微鏡によって視覚化した。
【０１２６】
実験結果
図３から明らかなように、アミロイドプラークが、ＮＳＴ７２９によって鮮明に視覚化され、周囲の脳細胞は無染色のままである。蛍光強度の比較分析によって評価すると、プラークへのＮＳＴ７２９の結合強度は、対照化合物ＢＤＡの結合強度より顕著に高かった。
【０１２７】
結果は、ＮＳＴ７２９が脳内のアミロイドプラークに選択的に結合することができること、かつ、該化合物の−ＳＨ基がこの特性を可能にする役割を担っていることを示している。
【実施例５】
【０１２８】
運動ニューロン疾患のマウスモデルにおける、インビボでの、変性神経細胞へのＮＳＴ７２９の選択的結合
Ｇ９３Ａの点変異を有するＳＯＤについて、トランスジェニックマウスにおいて実験を行った。ＮＳＴ７２９（２００μＬ ５０％クレモホール／トリズマ−塩基０．１Ｍ中１．４ｍｇ／動物）を、静脈内注射した。２時間後、マウスに麻酔をかけ、さらなる分析のために、脳および脊髄を除去して液体窒素に入れた。厚さ１０μｍの凍結切片を調製した。蛍光顕微鏡によって、薄片を視覚化した。
【０１２９】
実験結果
図４は、脳橋の運動核の断面を示す。重度の広範囲な変性過程の神経細胞が見られる。顕著なのは神経細胞軸索の変性過程であり、軸索突起の重度の変形、不規則性および肥厚を有している。これらの全ての神経病変は、ＮＳＴ７２９の顕著な取り込みを示したが、同じ領域の他の細胞、ならびに他の脳領域の細胞は、そのような取り込みを示さなかった。従って、この実施例は、全身投与されたＮＳＴ７２９の、運動ニューロン変性に関連した神経病理的変化を特異的に標的とし表示する可能性を、明らかに示している。
【実施例６】
【０１３０】
マウスにおける中大脳動脈閉塞後の細胞死を経ている細胞へのＮＳＴ７３９の選択的標的化
中大脳動脈（ＭＣＡ）閉塞による脳虚血によって誘発されたアポトーシスを経ている細胞への選択的結合における、ＮＳＴ７３９の性能を示すために、マウスにおいて生体内試験を行った。
【０１３１】
実験手順
体重２０〜２５ｇの成熟した雄のＢａｌｂ／Ｃマウスにおいて、実験を行った。中大脳動脈の片側焼灼術によって脳虚血を誘発させた。簡単に言えば、マウスに麻酔をかけ、側頭下手法によって虚血を誘発させた。ＭＣＡが外側嗅索と交差するレベルで開頭術を行った。硬膜を慎重に開き、動脈を露出させ、その起点から下大脳静脈と交差する点まで、両極性ジアテルミーによって閉塞した。全ての可視の枝も、バイパス形成による血液供給を防止するために閉塞した。切開部位をクリップで閉じ、動物に鎮痛薬を注射し、回復させた。中大脳動脈（ＭＣＡ）焼灼から２２時間後、ＮＳＴ７３９またはコントロール化合物ＢＤＡ（それぞれ１．４ｍｇ／動物）を静脈内注射した。損傷の誘導から２４時間後、かつＮＳＴ７３９の投与から２時間後に、マウスに麻酔をかけ、殺し、さらなる分析のために、脳を除去して液体窒素に入れた。１０μｍの凍結切片を調製した。薄片を、蛍光顕微鏡によって視覚化した。
【０１３２】
実験結果
図５に示されるように、損傷領域の細胞は、ＮＳＴ７３９への広範囲な結合を示したが、他の脳領域の細胞は、無染色のままであった。蛍光強度によって示されるＮＳＴ７３９の結合レベルは、チオール基を含有しないＢＤＡの結合レベルと比較して有意に高かった。
【０１３３】
得られた結果は、虚血性損傷後に、脳における細胞死を経ている細胞への選択的結合におけるＮＳＴ７３９の性能を示している。ＤＢＡの結合と比較して、ＮＳＴ７３９の増加した結合は、化合物のこの特性を可能にする遊離チオール基の重要性を示している。
【実施例７】
【０１３４】
疾患または死の過程を経ている細胞への本発明の化合物の選択的結合のメカニズム
本発明の化合物の作用メカニズムを示すために、図６にも示されているような、アポトーシスを経ている細胞の細胞内タンパク質へのＮＳＴ７２９の結合を説明する。
【０１３５】
健康な細胞の細胞内タンパク質におけるシステイン残基のチオール基は、ほとんどの場合、還元状態であり、即ち遊離チオール（−ＳＨ）である。これは、−ＳＨ還元物質の高サイトゾル濃度による。従って、一般に、Ｓ−Ｓ結合はサイトゾルにおけるタンパク質分子においてめったに見られない。これに対して、細胞疾患、または、例えばアポトーシスによる、細胞死を経ている細胞の場合、酸化ストレスが生じ、細胞内抗酸化メカニズムの損失が生じる。これは、特に、これらの細胞における細胞内タンパク質のシステインのチオール基間におけるジスルフィド結合（Ｓ−Ｓ）の発生によって示される。
【０１３６】
図６Ａに示されるように、本発明の化合物の典型としてのＮＳＴ７２９は、生理的条件において無荷電プロトン化状態、またはチオレート陰イオンとして脱プロトン状態であることができるチオール基を含有する。無電荷疎水性プロトン化状態は、化合物が細胞膜（および血液脳関門）を通過して細胞内空間に分散することを可能にし、一方、荷電チオレート陰イオンは、チオレートジスルフィド交換反応に関与することができる。図６Ｂに示すように、正常な健康な細胞においては、化合物の標的が存在しない。従って、化合物は、細胞から洗い流される。これに対して、酸化ストレスおよびジスルフィド結合形成を経ているアポトーシス細胞においては、チオレート陰イオンがＳ−Ｓ結合を攻撃し、チオール基の１つに取って代わることができる。この反応により、ＮＳＴ７２９に含有された画像化用マーカ（蛍光ダンシル基）が、細胞内タンパク質（そのシステイン残基がＳ−Ｓ結合に関与している）（図６Ａのタンパク質Ａ）に共有結合的に付加される。続いて、非結合分子は細胞から洗い流され、Ｓ−Ｓ結合形成の部位に結合した分子だけが残る。画像化プローブとしての特性（例えば、ＮＳＴ７２９のダンシル基の蛍光）により、本発明の化合物の画像化用マーカは、下記におけるその所在位置についての情報を与えうる：正常な細胞レドックス状態の減損を経ている細胞、即ち、酸化ストレスを受けている細胞、病気の細胞および／または死の過程を経ている細胞におけるその存在。次に、この情報を、化合物のプローブの画像化特性に関して、画像化装置によって収集し分析する（例えば、ＮＳＴ７２９におけるダンシルについての蛍光の分析）。従って、本発明の方法は、シグナルが得られないかまたは顕著に少ないシグナルしか得られない健康な生存細胞に対して、酸化ストレス、細胞疾患または細胞死を経ている細胞、シグナルを明示するあらゆる細胞の画像マップの形成を可能にする。
【実施例８】
【０１３７】
１８Ｆでの放射性標識に適した条件における、陽電子断層撮影法（ＰＥＴ）による画像化用のＮｅｕｒｏＳｅｎｓｅの合成
画像化用の種々のマーカを、本発明の化合物に使用できる。いくつかの化合物、例えば、ＮＳ７２９は、蛍光プローブ（例えば、ダンシル基）を有する。しかし、例えば陽電子断層撮影法（ＰＥＴ）によって、臨床画像化を可能にする放射標識で、化合物を標識することが望ましい。この目的のために、下記の式ＶＩＩで示される構造を有するＮｅｕｒｏＳｅｎｓｅと称される化合物を合成し、放射性同位体１８Ｆで標識する方法が開発された。
【０１３８】
【化２３】
【０１３９】
１８Ｆ放射性同位体の半減期１１５分に関して、１８Ｆ付加の放射化学に必要とされる条件およびタイムライン（ｔｉｍｅｌｉｎｅｓ）に適応させたフッ素付加方法が開発された。
【０１４０】
ＮｅｕｒｏＳｅｎｓｅの合成を、下記の合成式に従って行った：
【０１４１】
【化２４】
【０１４２】
１８Ｆ ＰＥＴ画像化のための放射合成のタイムラインへの、この合成経路の適合を、下記の表１に示す：
【０１４３】
【表１】
【０１４４】
従って、ＮｅｕｒｏＳｅｎｓｅの合成および精製の合計時間は７０分であり、ＰＥＴ画
像化に充分適した時間枠である。
【図面の簡単な説明】
【０１４５】
【図１】マウスの中大脳動脈（ＭＣＡ）閉塞後の、インビボでの、脳内のアポトーシス細胞へのＮＳＴ７２９の選択的結合を示す。
【図２】図２ＡおよびＢは、正常組織、即ち小腸への結合の不存在（図２Ｂ）に対して、インビボでの、腫瘍によって誘発されたアポトーシス細胞へのＤＣの選択的結合（図２Ａ）を示す。
【図３】インビボでの、トランスジェニックＡＰＰ ＴＧ２５７６マウスの脳内のアミロイド老年斑への、ＮＳＴ７２９の結合を示す。
【図４】インビボでの、運動ニューロン疾患のマウスモデルにおける変性神経細胞への、ＮＳＴ７２９の結合を示す。
【図５】マウスにおけるＭＣＡ閉塞後の、インビボでの、死の過程を経ている細胞への、ＮＳＴ７３９の結合を示す。
【図６】酸化ストレスに関連した疾患、または死の過程を経ている細胞への、本発明の化合物の選択的結合のメカニズムを示す。アポトーシスを経ている細胞の細胞内タンパク質への、ＮＳＴ７２９の結合が示されている。（Ａ）：アポトーシスを経ている細胞のサイトゾルにおけるタンパク質への、ＮＳＴ７２９の結合。（Ｂ）：健康な細胞のサイトゾルにおける、ＮＳＴ７２９の結合の不存在。図におけるＡおよびＢは、細胞内タンパク質の例である。
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、細胞酸化ストレス、細胞変性および／または細胞死に関連した疾患の検出法を提供する。本発明は、酸化ストレス、変性および／または死の過程を経ている細胞を検出するための、チオール（−ＳＨ）基含有化合物にも関する。本発明は、診断および治療を目的として、診療において該化合物を使用する方法も提供する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
種々の神経学的障害、特に神経変性障害、例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンチントン病、クロイツフェルト−ヤコブ病または進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）の、特に疾患の初期段階における正確な診断は、臨床神経科医にとって重要な課題となることが多い。臨床神経科医が、その目的に入手できる手段は、患者の病歴、報告された症状、神経学的試験および補助的試験、例えば脳コンピュータ断層撮影（ＣＴスキャン）または磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）における所見を含む。概して、これらの手段は、現在、不充分であることが多く、疾患の比較的遅い段階でのみ、根源的な神経病理学的過程を示しうるにすぎないことが多い。臨床神経学的診療において遭遇することが多いもう１つの課題は、治療に対する脳腫瘍の反応のモニタリングである。従って、前記の重大かつ身体を衰弱させる神経学的疾患のいずれにおいても、正確な診断をし、治療計画を立て、疾患の経過を追跡し、または治療効果を評価するために、神経病理学的過程の検出および画像化のための新規な非侵襲的方法が明らかに必要とされている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
分子画像化は、分子プローブの使用に関係し、画像化用のマーカを含む、新規かつ急速に発展している分野であり、該画像化は、非侵襲的臨床画像化法、例えば、陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴスキャン）によって、健康および疾患に関連した細胞過程を知らせることができる。酸化ストレスは、多くの疾患の病原における特徴の１つである。酸素フリーラジカルによる細胞損傷は、神経変性において重大な役割を担っていることが示されている。アポトーシスは、酸化ストレスが死のプログラムの強力な誘発因子である故に死の過程の誘発レベルにおいて、および、ミトコンドリア機能の劇的変化としての細胞死の実施レベルにおいて、酸化ストレスに関係し、かつ、一般に細胞の抗酸化メカニズムの崩壊はアポトーシスの間に生じる。現在、診療において、酸化ストレスを分子画像化する手段が存在しない。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
発明の要旨
本発明のある実施形態において、患者または動物の組織における酸化ストレスに関連した細胞死または疾患過程を検出する方法を提供し、該方法は、（ｉ）患者または動物に、画像化用のマーカに連結させた本発明のチオール含有化合物を投与する工程、および（ｉｉ）患者または動物の被験組織に結合した化合物の量を検出する工程、を含んで成り；患者または動物の組織に結合した化合物の有意量の検出は、該組織における細胞死または疾患過程の存在を示す。
【０００５】
本発明の他の実施形態において、被験患者または動物の神経系における酸化ストレスに関連した細胞死または疾患過程を検出する方法を提供し、該方法は、（ｉ）患者または動物に、画像化用のマーカに連結させた本発明のチオール含有化合物を投与する工程、およ
び（ｉｉ）神経系の被験部分に結合した化合物の量を検出する工程、を含んで成り；コントロールと比較して、神経系の被験部分に結合した化合物の有意量の検出は、神経系の該部分における細胞死または疾患過程の存在を示す。
【０００６】
本発明のある実施形態において、酸化ストレスとは、フリーラジカルの過剰、抗酸化物質レベルの減少またはその両方が存在する場合に生じる生物組織への損傷を意味する。
【０００７】
本発明の他の実施形態において、本発明の化合物および方法によって検出される疾患過程は、下記のものに関連している：神経細胞またはグリア細胞内の酸化ストレス；アポトーシスを経ている神経細胞またはグリア細胞；他の機序の細胞死を経ている神経細胞またはグリア細胞；神経細胞体または神経突起の変性であると考えられる神経変性の過程；死の過程（例えば、アポトーシスによる）を経ている脳腫瘍の細胞；および神経系の細胞内における、または該細胞に関連したタンパク質の異常蓄積。そのようなタンパク質異常蓄積は、特に、細胞内封入体の形態（例えば、神経細線維もつれ、レヴィー小体）、または細胞外異常タンパク質沈着物の形態（例えば、アミロイドプラーク）を採る。
【０００８】
本発明の他の実施形態において、本発明の方法を、下記のような神経学的障害の診断に使用する：急性損傷、例えば、限定されないが、脳梗塞、中毒性発作または脳外傷；または慢性神経変性障害、例えば、限定されないが、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、多系統萎縮症（ＭＳＡ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、ハンチントン病、レヴィー小体疾患、プリオン障害、例えばクロイツフェルト−ヤコブ病、および脱髄性障害、例えば多発性硬化症。
【０００９】
本発明の他の実施形態において、本発明の方法を、治療に対する腫瘍の反応をモニターするのに使用する。大部分の抗腫瘍剤、例えば化学療法薬、または放射線照射は、腫瘍におけるアポトーシスの誘発によって作用する故に、本発明の方法および化合物を介した、治療によって誘発された腫瘍細胞死レベルの画像化は、抗腫瘍治療の有効性を非侵襲的に示すことができる。
【００１０】
本発明のある実施形態において、組織または器官内の疾患過程または細胞死過程を経ている細胞の検出に役立つ本発明に使用される化合物は、下記の式（Ｉ）で示される：
【００１１】
【化１】
【００１２】
［式中、
Ｌ１は、Ｃ１、Ｃ２およびＣ３直鎖または分岐鎖アルキレンから選択され；
Ｌ２は、不存在、およびＣ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６直鎖または分岐鎖アルキレンリンカーから選択され；
Ｑは、不存在、および置換されていてもよいアリール、ヘテロアリール、アリール−スルホンアミドおよびヘテロアリール−スルホンアミドから選択され；
Ｍは、画像化用のマーカである］。
【００１３】
他の局面において、本発明は、組織または器官における細胞死の検出のための、下記の式（ＩＩ）で示される構造を有する化合物およびその使用を提供する：
【００１４】
【化２】
【００１５】
［式中、ＭおよびＬ２は、それぞれ、上述のように定義される］。
本発明の他の実施形態において、Ｍは水素であり、Ｌ２は不存在であり、化合物はＮＳＴ７２９と称され、下記の式ＩＩＩで示される構造を有する：
【００１６】
【化３】
【００１７】
本発明の他の局面において、下記の式ＩＶで示される構造で表される化合物を提供する：
【００１８】
【化４】
【００１９】
［式中、
ｎは、２または３の整数を表し；
Ｆ原子は、１８Ｆまたは１９Ｆである］。
【００２０】
ｎ＝３の場合、化合物はＮＳＴ７３９と称される。
本発明の他の局面において、下記の式Ｖで示される構造で表される化合物を提供する：
【００２１】
【化５】
【００２２】
［式中、ＭおよびＬ２は、それぞれ、上述のように定義される］。本発明のある実施形態において、Ｍは水素であり、Ｌ２は不存在である。
【００２３】
本発明の他の局面において、下記の式ＶＩで示される構造で表される化合物を提供する：
【００２４】
【化６】
【００２５】
［式中、
Ｌ２およびＭは、上述と同意義であり；
Ｙは、不存在、−Ｏ−、ＮＨおよびＣ１、Ｃ２、Ｃ３またはＣ４アルキルアミンから選択される］。
【００２６】
本発明の他の実施形態において、下記の式ＶＩＩで示される構造で表される化合物を提供する：
【００２７】
【化７】
【００２８】
［式中、Ｆ原子は、１８Ｆまたは１９Ｆであってよい］。
本発明の他の局面において、下記の式ＶＩＩＩで示される構造を有する化合物を提供する：
【００２９】
【化８】
【００３０】
［式中、
Ｆは、１８Ｆまたは１９Ｆであってよく；
Ｒは、アリールまたはヘテロアリール、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６直鎖または分岐鎖の、置換されていてもよいアルキル、またはそれらの組合せである］。
【００３１】
本発明の他の局面において、下記の式ＩＸで示される構造で表される化合物を提供する：
【００３２】
【化９】
【００３３】
［式中、Ｆは、１８Ｆまたは１９Ｆであってよい］。
本発明に使用される化合物は、該化合物の医薬的に許容される塩、金属キレート、溶媒化合物および水化物、ならびに医薬的に許容される塩の溶媒化合物および水化物も包含する。医薬的に許容される付加塩の例は、無機および有機酸付加塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、燐酸塩、硫酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、マンデル酸塩、蓚酸塩および酢酸塩であるが、それらに限定されない。または、医薬的に許容される無機および有機塩基付加塩、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム等も使用しうる。
【００３４】
本発明の他の実施形態において、患者または動物の脳腫瘍における酸化ストレスまたは細胞死を検出する方法を提供し、該方法は、患者または動物に、式Ｉ〜ＩＸで示されるいずれかの構造で表されるいずれか１つの化合物を投与する工程、および脳腫瘍に結合した化合物の量を検出する工程、を含んで成り；脳腫瘍に結合した化合物の有意量の検出は、腫瘍における酸化ストレスまたは細胞死の存在を示す。
【００３５】
本発明の他の実施形態において、患者または動物の組織における細胞死または疾患過程の検出用の診断組成物を製造するための、式Ｉ〜ＩＸで示されるいずれかの構造で表される化合物の使用を提供する。
【００３６】
本発明の実施形態において、組織は、脳またはその部分であってよい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３７】
発明の詳細な実施形態
本発明は、その実施形態の１つにおいて、下記の観察に基づいている：細胞タンパク質のシステインのチオール（−ＳＨ）基のレドックス状態が、正常な健康な細胞と、酸化ストレスに関連した疾患関連過程を経ている細胞、またはアポトーシスのような死の過程を経ている細胞とを区別するための、または脳組織内のアミロイドプラークのようなタンパク質の異常沈着を検出するための、尺度としての役割を果たしうる。健康な細胞の細胞内タンパク質のシステイン残基のチオール基は、ほとんどの場合、還元状態にあり、即ち、遊離チオール（−ＳＨ）である。これは、生存可能な健康細胞における−ＳＨ−還元物質の高サイトゾル濃度による。これに対して、細胞疾患またはアポトーシスのような細胞死の場合、細胞は、酸化ストレスを受け、細胞内抗酸化メカニズムを失う。これは、特に、細胞内タンパク質のシステインのチオール基間のジスルフィド結合（Ｓ−Ｓ）の発生によって示される。
【００３８】
本発明は、被験組織または器官の細胞内のジスルフィド結合の負荷（ｌｏａｄ）の特徴づけによって、細胞疾患過程または細胞死を検出する方法に関する。本発明の方法によるジスルフィド結合の細胞負荷の特性決定は、この目的のために、チオレート−ジスルフィド反応（ＴＤＲ）を生体内で利用するという新規概念に基づいている。ＴＤＲは、ジスルフィド結合とチオレートアニオンとの化学反応であり、それによって、Ｓ−Ｓ結合の硫黄原子が、攻撃するチオレート基によって置換される。１つの局面において、本発明は、チオール基および画像化用のマーカの両方を含んで成る化合物の投与に関する。チオレート形態のチオール基は、ＴＤＲによってジスルフィドと相互作用して、Ｓ−Ｓ結合によって、その部位への画像化用マーカの結合を生じる（図６）。非結合化合物は、被験細胞から洗い流される。このようにして、画像化のために選択されたマーカに関して、画像化法（ｉｍａｇｉｎｇ ｍｏｄａｌｉｔｉｅｓ）によって、ジスルフィド結合の発生部位を記録しモニターする。上述したように、細胞内ジスルフィド結合の発生は、細胞疾患または細胞死と関連している故に、得られた画像は、被験組織内のこれらの疾患関連過程の発生に対応し、従って、それらの程度についての情報を与える。
【００３９】
本発明のある実施形態において、患者または動物の組織における疾患過程または細胞死を検出する方法を提供し、該方法は、（ｉ）画像化用のマーカに連結させた本発明のチオール含有化合物を投与する工程、および（ｉｉ）患者または動物の組織に結合した化合物の量を検出する工程、を含んで成り；患者または動物の組織に結合した化合物の有意量の検出は、該組織における細胞死または疾患過程の存在を示す。
【００４０】
本発明のある実施形態において、被験患者または動物の神経系における疾患過程を検出する方法を提供し、該方法は、（ｉ）画像化用のマーカに連結させた本発明のチオール含有化合物を投与する工程、および（ｉｉ）神経系の被験部分に結合した化合物の量を検出する工程、を含んで成り；コントロールと比較して、神経系の被験部分に結合した化合物の有意量の検出は、神経系の該部分における疾患過程の存在を示す。
【００４１】
「神経系の部分に結合した化合物の有意量」という用語は、本発明の実施形態によれば、神経系の正常な非疾患部分に結合した量より少なくとも１０％多い量で神経系の部分に結合した、診断用のマーカを含んで成るかまたはそれに結合した本発明の化合物の量を意味する。検出は、画像化法を使用することによってインビボであるか、または組織を視覚化するための方法を使用することによって、インビトロ、またはエクスビボであってよい。他の実施形態において、その量は５０％多くてもよい。本発明の他の実施形態において、その量は７５％多くてもよい。他の実施形態において、その量は１５０％多くてもよい。他の実施形態において、その量は約２倍多くてもよい。他の実施形態において、その量は５倍以上多くてもよい。他の実施形態において、その量は１０倍以上多くてもよい。
【００４２】
「疾患過程」という用語は、以下において、細胞または組織の機能または生存を損ない、かつ酸化ストレスに関連している、細胞または組織における任意の過程を意味する。本発明による疾患過程は、特に、神経系を含みうる。
【００４３】
「細胞死」という用語は、以下において、細胞の消滅に導く任意の過程、特に、アポトーシスまたはネクローシスによる細胞死を意味する。
【００４４】
本発明の他の実施形態において、本発明の化合物および方法によって検出される疾患過程は以下のものである：神経細胞またはグリア細胞内の酸化ストレス；アポトーシスを経ている神経細胞またはグリア細胞；他の機序の細胞死を経ている神経細胞またはグリア細胞；細胞体または神経突起の変性であると考えられる神経変性の過程；死の過程（例えば、アポトーシスによる）を経ている脳腫瘍の細胞；および神経系の細胞内における、または該細胞に関連したタンパク質の異常蓄積。そのようなタンパク質異常蓄積は、特に、細胞内封入体の形態（例えば、神経細線維もつれ、レヴィー小体）、または細胞外異常タンパク質沈着物の形態（例えば、アミロイドプラーク）である。
【００４５】
本発明の他の実施形態において、本明細書に記載する方法および化合物を、下記のような神経学的障害の診断に使用しうる：急性損傷、例えば、限定されないが、脳梗塞、中毒性発作または脳外傷；または慢性神経変性障害、例えば、限定されないが、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、多系統萎縮症（ＭＳＡ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、ハンチントン病、びまん性レヴィー小体疾患、プリオン障害、例えばクロイツフェルト−ヤコブ病、および脱髄性障害、例えば多発性硬化症。
【００４６】
本発明の他の実施形態において、本発明の方法を、治療に対する脳腫瘍の反応をモニターするのに使用する。大部分の抗腫瘍剤、例えば化学療法薬、または放射線照射は、腫瘍内のアポトーシスの誘発によって作用する故に、本発明の方法および化合物での、治療によって誘発された腫瘍細胞死レベルの画像化は、腫瘍治療の有効性を非侵襲的に示すことができる。
【００４７】
本発明のある実施形態において、組織または器官内の疾患過程または細胞死過程を経ている細胞を検出する作用をする本発明に使用される化合物は、下記の式（Ｉ）で示される：
【００４８】
【化１０】
【００４９】
［式中、
Ｌ１は、Ｃ１、Ｃ２およびＣ３直鎖または分岐鎖アルキレンから選択され；
Ｌ２は、不存在、およびＣ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６直鎖または分岐鎖アルキレンリンカーから選択され；
Ｑは、不存在、および置換されていてもよいアリール、ヘテロアリール、アリールスルホンアミドおよびヘテロアリール−スルホンアミドから選択され；
Ｍは、水素および画像化用のマーカから選択される］。
【００５０】
本発明のある実施形態において、画像化用マーカ（Ｍ）は、１８Ｆ、１５Ｏ、１８Ｏ、１１Ｃ、１３Ｃ、１２４Ｉ、１３Ｎおよび７５Ｂｒから選択しうる。
【００５１】
他の局面において、本発明は、組織または器官における細胞死の検出用の、下記の式（ＩＩ）で示される構造を有する化合物およびその使用を提供する：
【００５２】
【化１１】
【００５３】
［式中、ＭおよびＬ２は、それぞれ、上述のように定義される］。
本発明の他の実施形態において、Ｍは水素であり、Ｌ２は不存在であり、化合物はＮＳＴ７２９と称され、下記の式ＩＩＩで示される構造を有する：
【００５４】
【化１２】
【００５５】
本発明の他の局面において、下記の式ＩＶで示される構造で表される化合物を提供する：
【００５６】
【化１３】
【００５７】
［式中、
ｎは、２または３の整数を表し；
Ｆ原子は、１８Ｆまたは１９Ｆである］。ｎ＝３の場合、化合物はＮＳＴ７３９と称される。
【００５８】
本発明の他の局面において、下記の式Ｖで示される構造で表される化合物を提供する：
【００５９】
【化１４】
【００６０】
［式中、ＭおよびＬ２は、それぞれ、上述のように定義される］。本発明のある実施形態において、Ｍは水素であり、Ｌ２は不存在である。
【００６１】
本発明の他の局面において、下記の式ＶＩで示される構造で表される化合物を提供する：
【００６２】
【化１５】
【００６３】
［式中、
Ｌ２およびＭは、上述と同意義であり；
Ｙは、不存在、−Ｏ−、ＮＨおよびＣ１、Ｃ２、Ｃ３またはＣ４アルキルアミンから選択される］。
【００６４】
本発明の他の実施形態において、下記の式ＶＩＩで示される構造で表される化合物を提供する：
【００６５】
【化１６】
【００６６】
［式中、Ｆ原子は、１８Ｆまたは１９Ｆであってよい］。
本発明の他の局面において、下記の式ＶＩＩＩで示される構造で表される化合物を提供する：
【００６７】
【化１７】
【００６８】
［式中、
Ｆは、１８Ｆまたは１９Ｆであってよく；
Ｒは、アリールまたはヘテロアリール、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６直鎖または分岐鎖の置換されていてもよいアルキル、またはそれらの組合せである］。
【００６９】
本発明の他の局面において、下記の式ＩＸで示される構造で表される化合物を提供する：
【００７０】
【化１８】
【００７１】
［式中、Ｆは、１８Ｆまたは１９Ｆであってよい］。
本発明に使用される化合物は、該化合物の医薬的に許容される塩、金属キレート、溶媒化合物および水化物、ならびに医薬的に許容される該塩の溶媒化合物および水化物も包含する。医薬的に許容される付加塩の例は、無機および有機酸付加塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、燐酸塩、硫酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、マンデル酸塩、蓚酸塩および酢酸塩であるが、それらに限定されない。または、医薬的に許容される無機および有機塩基付加塩、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム等も使用しうる。
【００７２】
本発明の化合物は、正常な健康な細胞と、疾患関連過程を経ている細胞、特に、酸化ストレスを受けている細胞、アポトーシスのような死の過程を経ている細胞、変性を経ている神経突起、または、特に、細胞内封入体の形態（例えば、神経細線維もつれ、レヴィー小体）、または細胞外異常タンパク質沈着物の形態（例えば、アミロイドプラーク）の、神経系の細胞内における、または該細胞に関連したタンパク質の異常蓄積とを区別しうる。
【００７３】
健康な細胞の細胞内タンパク質は、強い細胞内抗酸化メカニズムにより、チオール基の還元状態（即ち、遊離チオールの形態）を特徴とするが、上述した病変は、該抗酸化メカニズムの喪失を特徴とし、従って、ジスルフィド（−Ｓ−Ｓ−）結合の形成を促進する。本発明の任意化合物のチオール基は、これらのジスルフィド結合形成反応に関与しやすく、従って、該化合物は、細胞の抗酸化メカニズムの喪失の程度に直接的に相関した程度に、細胞に結合する。従って、本発明の化合物の被験細胞への結合のレベルは、細胞の疾患または死の過程に関連した細胞レドックス状態の減損のレベルを示す。さらに、比較的低い分子量、および生理的ｐＨにおける疎水性は、本発明の化合物が、血液脳関門（ＢＢＢ
）を効率的に通過し、脳細胞に接近することを可能にする。
【００７４】
本発明の神経病理的過程の検出法は、実施例４に示すように、アルツハイマー病が疑われる患者の脳のアミロイドプラークの量を測定する手段として使用しうる。従って、脳アミロイドーシスが疑われる患者の脳におけるアミロイドプラークの量を測定する方法を提供し、該方法は、下記の工程を含んで成る：（ｉ）上述のように定義される式Ｉ〜ＩＸで示される構造を有するいずれかの化合物に、脳組織を接触させる工程、および、（ｉｉ）脳組織におけるプラークに結合した化合物の量を測定するために、ヒトまたは動物を画像化する工程。
【００７５】
上述した方法は、患者または動物（該動物は、１つの実施形態において、トランスジェニック動物であってもよい）におけるアミロイドプラークの量を減少させるために投与された薬剤の有効性を確認するのに適用してもよく、該方法は、（ｉ）動物に薬剤を投与する工程、（ｉｉ）上述のように定義される式Ｉ〜ＩＸで示される構造を有するいずれかの化合物を投与する工程、および（ｉｉｉ）画像化または組織病理学によってシグナルを検出する工程、を含んで成り；画像強度が減少した場合、または検出プラークの量が減少した場合、薬剤は、被験脳におけるアミロイドプラークの負荷を減少させるのに有効であるものとして同定される。工程（ｉ）および（ｉｉ）の順序を変えてよいことに注目すべきである。
【００７６】
本発明の他の実施形態において、下記に罹患している疑いのあるヒトの脳における病理学的変化を検出する方法を提供する：急性神経学的障害、例えば、脳梗塞、中毒性発作または脳外傷；または慢性神経変性障害、例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、多系統萎縮症（ＭＳＡ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、ハンチントン病、レヴィー小体疾患、プリオン障害、例えばクロイツフェルト−ヤコブ病、および脱髄性障害、例えば多発性硬化症。それぞれの神経病理学的変化は、下記から選択される：疾患過程を経ている細胞、アポトーシスのような死の過程を経ている細胞、変形および変性を経ている神経突起、および、アミロイドプラークのような、脳組織内の細胞内または細胞外タンパク質沈着物。該方法は、（ｉ）上述のように定義される式Ｉ〜ＩＸで示される構造を有するいずれかの化合物に、脳組織を接触させる工程、および（ｉｉ）脳組織に結合した化合物の量を測定するために対象を画像化する工程、を含んで成り；コントロールと比較して、被験脳への有意量の結合の画像化がみられた場合、脳病変を示す。
【００７７】
本発明の他の局面において、患者または動物（該動物は、１つの実施形態において、トランスジェニック動物であってもよい）における上述のいずれかの神経病理学的変化を減少させることにおける薬剤の有効性を検出する方法を提供し、該方法は、（ｉ）被験患者または動物に薬剤を投与する工程、（ｉｉ）上述のように定義される式Ｉ〜ＩＸで示される構造を有するいずれかの化合物を投与する工程、および（ｉｉｉ）画像化によってシグナルを検出する工程、を含んで成り；シグナル強度が減少した場合、該薬剤は、被験脳における疾患の負荷を減少させるのに有効であるものとして同定される。工程（ｉ）および（ｉｉ）の順序を変えてよいことに注目すべきである。
【００７８】
本発明のある実施形態において、ＰＥＴまたはＳＰＥＣＴによる放射性核種画像化によって、患者における疾患過程を経ている細胞または組織の画像を得るための、本発明化合物の使用に関して、（異常組織に結合した化合物の量）／（正常細胞に結合した化合物の量）の比率の計算は、死の過程を経ている組織から得たシグナルの振幅または強度を、死の過程を経ていない組織から得たシグナルの振幅／強度と比較することによって行いうる。
【００７９】
本発明の１つの実施形態において、死の過程を経ている細胞、例えばアポトーシスを経ている細胞を、選択的に標的にする、式Ｉ〜ＩＸで示される構造によって示される化合物を提供する。
【００８０】
本発明の他の局面において、細胞集団において死の過程を経ている細胞を検出する方法を提供し、該方法は、（ｉ）式Ｉ〜ＩＸで示されるいずれか１つの構造で表される化合物、または式Ｉ〜ＩＸで示される構造で表される化合物の医薬的に許容される塩、金属キレート、溶媒化合物および水化物、および該塩の溶媒化合物および水化物に、細胞集団を接触させる工程、および（ｉｉ）細胞に結合した化合物の量を測定する工程、を含んで成り；細胞に結合した化合物の有意量は、死の過程を経ている細胞の存在を示す。
【００８１】
「細胞に結合した化合物の有意量」という用語は、本発明によれば、正常な細胞に結合した量より１０％以上多い量で、死の過程を経ている細胞に結合した、診断用マーカを含んで成るかまたはそれに結合した本発明の化合物の量を意味する。他の実施形態において、その量は５０％多くてもよい。本発明の他の実施形態において、その量は７５％多くてもよい。他の実施形態において、その量は１５０％多くてもよい。他の実施形態において、その量は約２倍多くてもよい。他の実施形態において、その量は２倍以上多くてもよい。他の実施形態において、その量は５倍以上多くてもよい。他の実施形態において、その量は１０倍以上多くてもよい。
【００８２】
本発明の他の局面によれば、患者または動物において死の過程を経ている細胞を検出する方法を提供し、該方法は、（ｉ）１８Ｆのような画像化用マーカを含有する式Ｉ〜ＩＸで示される構造で表される化合物、または式Ｉ〜ＩＸで示される構造で表される化合物の医薬的に許容される塩、金属キレート、溶媒化合物および水化物、および該塩の溶媒化合物および水化物を、患者または動物に投与する工程、および（ｉｉ）細胞に結合した化合物の量を測定するために、被験患者または動物を画像化する工程、を含んで成り；細胞に結合した化合物の有意量の検出は、これらの細胞が死の過程を経ている細胞であることを示す。
【００８３】
本発明の化合物は、下記の本発明の２種類の手法において、死の過程を経ている細胞を含有する組織および器官への、医薬的に有用な薬剤の選択的標的化のために使用しうる：
（ｉ） 以下に「検出手法」と称される第１手法によれば、死の過程を経ている細胞に画像化用マーカを向けるために、選択的結合を使用しうる。下記に説明するように、これは、そのような細胞が発生する疾患の診断のために、インビボ、エクスビボまたはインビトロにおいて診療に使用しうる；
（ｉｉ） 以下に「治療的手法」と称される第２手法によれば、死の過程を経ている細胞が発生する体の器官および組織、例えば、細胞死、血栓形成または炎症の領域への、治療薬の選択的標的化のために、選択的結合特性を使用する。
【００８４】
本発明の化合物は、死の過程を経ている細胞の形成を特徴とする種々の医学的状態の検出および診断に使用しうる。死の過程を経ている細胞を特徴とする臨床状態の例を以下に示す。
【００８５】
過剰アポトーシスの発生を特徴とする疾患、例えば、変性疾患、神経変性疾患（例えば、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン舞踏病）、ＡＩＤＳ、ＡＬＳ、プリオン疾患、骨髄異形成症候群、虚血性または中毒性発作、移植拒絶反応中の移植細胞損失；腫瘍、特に高悪性／浸潤性腫瘍は、過剰の組織増殖に加えて、増強したアポトーシスも特徴とすることが多い。
【００８６】
炎症性疾患および／または免疫媒介病因または病原に関連した疾患、自己免疫疾患、例
えば、抗リン脂質抗体症候群、全身性エリテマトーデス、結合組織疾患、例えば、慢性関節リウマチ、強皮症；甲状腺炎；皮膚疾患、例えば、天疱瘡または結節性紅斑；自己免疫性血液疾患；自己免疫性神経系疾患、例えば重症筋無力症；多発性硬化症；炎症性腸疾患、例えば潰瘍性大腸炎；血管炎。
【００８７】
アテローム硬化性プラーク、特に、不安定な脆弱性の断裂しやすいプラークは、死の過程を経ている細胞、例えば、アポトーシスマクロファージ、アポトーシス平滑筋細胞、アポトーシス内皮細胞、および活性化血小板も特徴とする。そのような活性化血小板は、血栓において発生し、不安定なアテローム硬化性プラークに付随していることが多い。
【００８８】
実施形態の１つにおいて、本発明は、画像化用のマーカを含有するかまたはそれに連結させた、本発明に記載の化合物のいずれかを有効成分として含んで成る医薬組成物であって、インビトロ、エクスビボまたはインビボでの神経組織疾患または死の過程またはアミロイドプラークを検出するための医薬組成物に関する。次に、検出可能な標識を、当業者に既知の方法によって、かつ、使用される特定の標識、例えば、蛍光、放射線放射、発色、磁気共鳴、Ｘ線等に応じて、検出することができる。画像化は、当業者に既知であるように、使用されるトレーサおよび画像化法に応じて、適切な装置を使用して行われる。
【００８９】
１つの実施形態において、検出可能な標識は、放射性同位体であってよい。陽電子断層撮影法（ＰＥＴ）スキャンに使用される放射性同位体の例は、１８Ｆ、１５Ｏ、１８Ｏ、１１Ｃ、１３Ｃ、１２４Ｉ、１３Ｎおよび７５Ｂｒである。
【００９０】
ある実施形態において、本発明の化合物は、ＰＥＴスキャンによる臨床画像化を目的とし、該化合物は１８Ｆ原子を含んで成る。
【００９１】
上述した構造を有するいずれの化合物であってもよい化合物を、ＰＥＴ画像化のために１８Ｆで標識化する方法は、１８Ｆ原子を化合物に付加し、それによってＰＥＴ画像化のために化合物を１８Ｆ原子で放射性標識することを含んで成る。場合により、１８Ｆ原子での放射性標識の反応中に、１８Ｆ原子の付加工程前に、化合物の他の官能基（例えば、チオール基）を適切な保護基で保護してもよく、該保護基は、１８Ｆ原子の付加工程後に除去される。
【００９２】
蛍光検出のために、本発明の化合物は、当分野で既知の任意の蛍光プローブから選択される、画像化用マーカとしての蛍光基（即ち、Ｍ基）を含んで成ってよい。そのようなプローブの例は、５−（ジメチルアミノ）ナフタレン−１−スルホニルアミド（ダンシル−アミド）、およびフルオレセインである。
【００９３】
標的部位への化合物結合の評価は、ＦＡＣＳまたは共焦点顕微鏡検査によるかまたはＰＥＴのような画像化法によって、蛍光を測定することによって行いうる。
【００９４】
本発明の化合物は、種々の医学的状態の検出および診断に使用でき、該医学的状態は、ジスルフィド（−Ｓ−Ｓ−）結合の形成を伴う細胞内タンパク質のチオール基の酸化によって示される酸化ストレス、または異常な細胞外タンパク質沈着物（例えばアミロイドプラーク）の蓄積を特徴とする。
【００９５】
自然に、または治療に反応して生じた腫瘍内の酸化ストレスおよび／または細胞死の発生を評価することを目的として、脳腫瘍を患っていることがわかっている人において、検出を行うこともできる。大部分の抗腫瘍治療、例えば化学療法または放射線療法は、アポトーシスの誘発によってその作用を発揮するので、脳腫瘍細胞の治療誘発アポトーシスの本発明の化合物による検出は、抗腫瘍薬への腫瘍の感受性の程度を示しうる。これは、抗
癌剤の投与時と、その有効性の正確な評価時との時間差をかなり短縮し、脳腫瘍の治療をよりよく最適化することを可能にしうる。
【００９６】
本発明の化合物および医薬的に許容される担体を含んで成る医薬組成物は、任意の既知の経路、特に、経口、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、舌下、眼内、鼻腔内または局所投与によるか、または脳内投与によって、投与しうる。担体は、所望の投与法に応じて選択すべきであり、任意の既知の成分、例えば、溶媒；エマルゲイター（ｅｍｕｌｇａｔｏｒｓ）、賦形剤、タルク；香味剤；着色剤等を包含する。医薬組成物は、所望であれば、疾患を治療し、副作用を除去し、または活性成分の活性を増加させるために使用される他の医薬的活性化合物も含有しうる。
【００９７】
実施例
本発明を理解し、実際にどのように本発明を実施しうるかを把握するために、以下の実施例を記載する：本発明の化合物の合成に関する実施例；および、死の過程を経ている細胞、老人性アミロイドプラーク、および変性を経ている神経突起への、選択的結合における、本発明の化合物の生物学的性能を示す実施例。実施例において、化合物は、蛍光標識、即ちダンシルアミド基を含有し、それによって、蛍光顕微鏡検査を可能にする。病理的過程を経ている細胞への、本発明の化合物の選択的結合を、いくつかのモデルにおいてインビボで示した：
（ｉ） 中大脳動脈（ＭＣＡ）の閉塞によって細胞死を誘発させた脳梗塞マウスモデル；
（ｉｉ） Ｂ−１６マウス黒色腫における化学療法によって誘発させた細胞死；
（ｉｉｉ） 突然変異スーパーオキシドジスムターゼ遺伝子を有し、それによって運動ニューロン様疾患（ｍｏｔｏｒ ｎｅｕｒｏｎ−ｌｉｋｅ ｄｉｓｅａｓｅ）を発症したトランスジェニックマウス；
（ｉｖ） βＡＰＰのＴＧ２５７６変異を有し、それによって脳内にアミロイドプラークを発症した老齢トランスジェニックマウス。
【００９８】
遊離チオール基を含有するいくつかの化合物の性能を示す：ＮＳＴ７２８、ＮＳＴ７２９、ＮＳＴ７３９およびダンシル−システイン（ＤＣ）。本発明の化合物と同じ蛍光プローブおよび同様の分子量および疎水性を有し、かつ−ＳＨ基を有さない故に選択したｎ−ブチルダンシルアミド（ＢＤＡ）を、コントロール化合物として使用した。従って、生物学的試験におけるその性能と、チオール含有化合物の性能との比較は、病理的変化を経ている構造物への選択的結合における、化合物の生物学的活性をもたらす該基の役割を示している。同様に、腫瘍へのダンシル−システイン（ＤＣ）結合の性能評価において、チオール基を含有しないダンシル−グリシンおよびダンシル−セリンをコントロール化合物として使用した。
【００９９】
アポトーシス細胞の素性を、シーケンシャルスライド（ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ ｓｌｉｄｅ）において行われるＴＵＮＥＬ染色によって確認し；アミロイドプラークの素性を、コンゴー赤でのシーケンシャルスライドの染色によって確認した。両確認法は、それぞれ、アポトーシスの評価法、またはアミロイドプラークの検出法として、広く認められている。
【実施例１】
【０１００】
ＮＳＴ７２８、ＮＳＴ７２９、ＮＳＴ７３９、ＤＣおよびＢＤＡの合成
１．ダンシル−システイン（ＤＣ）の合成
【０１０１】
【化１９】
【０１０２】
シスチン（１、１当量）を、４当量の炭酸カリウムと共に、水／アセトン溶液に溶解させた。塩化ダンシル（２．５当量）を添加し、溶液を室温で１．５時間撹拌した。アセトンを除去し、２Ｍクエン酸の添加によって溶液をｐＨ３に酸性化した。水性混合物を酢酸エチルで抽出した。抽出物を合わし、硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を蒸発させた。得られた粗生成物を塩基性水溶液に溶解させた。溶液をエーテルで洗浄し、次に、ｐＨ３に再び酸性化して、黄色沈殿物を得た。ＥＳＩ−ＭＳおよび１Ｈ−ＮＭＲは構造２と一致していた[1H-NMR (D2O, δ=ppm): 8.50 (2H, dd); 8.25 (2H, dd); 8.15 (2H, d); 7.50 (4H, m); 7.20 (2H, dd); 4.05 (2H, m); 2.85 (12H, s); 2.60 (4H, m)。ESI-MS: Calc. m/z=706.1. Found m/z+H+=707.5]。
【０１０３】
中間体２を１：１のメタノール：ＮａＰＰｉバッファ（０．１Ｍ、ｐＨ７．４）に溶解させた。窒素を溶液に１０分間泡立たせ、次に、２当量のジチオトレイトール（ＤＴＴ）を添加した。反応をＴＬＣによってモニターした。必要な場合に、追加のＤＴＴを添加した。出発物質が使い尽くされた際に、メタノールを蒸発させ、水溶液の容量を元の半分に減少させた。溶液を２Ｍクエン酸によってｐＨ３にゆっくり酸性化し、次に、０℃で３０分間冷却した。沈殿物を吸引濾過によって収集し、吸水器（ｐｕｍｐ）で乾燥し、窒素下に充填した（ｐａｃｋａｇｅｄ ｕｎｄｅｒ ｎｉｔｒｏｇｅｎ）。ＥＳＩ−ＭＳおよび１Ｈ−ＮＭＲは、構造３、即ちダンシル−システイン（ＤＣ）と一致していた[1H-NMR (CDCl3,δ=ppm): 8.50 (1H, d); 8.30; (1H, d); 8.20 (1H, d) ; 7.60 (1H, t); 7.50 (1H, t); 7.20 (1H, d); 5.90 (1H, d); 4.15 (1H, m), 2.90 (6H, s); 2.70 (2H, m)。ESI-MS: Calc. m/z=354.4. Found m/z+H+=355.7]。
【０１０４】
２．ＮＳＴ７２９の合成
【０１０５】
【化２０】
【０１０６】
シスタミン（４、１当量）を、４当量の炭酸カリウムと共に、水／アセトン溶液に溶解させた。塩化ダンシル（２．５当量）を添加し、溶液を室温で１．５時間撹拌した。アセトンを除去し、２Ｍクエン酸の添加によって溶液をｐＨ３に酸性化した。水性混合物を酢酸エチルで抽出した。抽出物を合わし、５％炭酸水素ナトリウムで洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を蒸発させた。得られた粗生成物を、シリカゲル上でのＬＣによって精製した。カラムをヘキサン中の０〜３０％酢酸エチルの勾配で溶離した。主要黄色蛍光画分を収集した。ＥＳＩ−ＭＳおよび１Ｈ−ＮＭＲは、ジダンシルシスタミンである構造５と一致していた：1H-NMR (CDCl3, =ppm): 8.55 (2H, d), 8.23 (4H, dd); 7.50 (4H, q); 7.20 (2H, d); 5.20 (2H, t); 3.10 (4H, q); 2.90 (12H, s); 2.50 (4H, t)。ESI-MS: Calc. m/z=618.9. Found m/z+H+=620.1。中間体５を１：１のメタノール：ＮａＰＰｉバッファ（０．１Ｍ、ｐＨ７．４）に溶解させた。窒素を溶液に１０分間泡立たせ、次に、２当量のジチオトレイトール（ＤＴＴ）を添加した。反応をＴＬＣによってモニターし
た。必要な場合に、追加のＤＴＴを添加した。出発物質が使い尽くされた際に、メタノールを蒸発させ、水溶液の容量を元の半分に減少させた。溶液を２Ｍクエン酸によってｐＨ３にゆっくり酸性化し、次に、０℃で３０分間冷却した。沈殿物を吸引濾過によって収集し、吸水器で乾燥し、窒素下に充填した。ＥＳＩ−ＭＳおよび１Ｈ−ＮＭＲは、ＮＳＴ７２９［ｎ−（２−メルカプトエチル）−ダンシルアミド（６）］である構造６と一致していた：1H-NMR (CDCl3, =ppm): 8.55 (1H, d); 8.30 (2H, t); 7.55 (2H, m); 7.20 (1H, d); 5.20 (1H, d); 3.05 (2H, q); 2.90 (6H, s); 2.50 (2H, q)。ESI-MS: Calc. m/z=310.4. Found m/z+H+=311.5。
【０１０７】
３．ＮＳＴ ｎ−ブチルダンシルアミド（ＢＤＡ）の合成
【０１０８】
【化２１】
【０１０９】
１当量の塩化ダンシル（７）を、１：１のアセトニトリル：水中の２当量のブチルアミンおよび炭酸カリウムを含有する溶液に添加した。溶液を室温で１．５時間撹拌した。次に、アセトニトリルを除去し、水残渣を酢酸エチルで抽出した。有機溶液を５％炭酸水素ナトリウム、２Ｍクエン酸および塩水で洗浄した。溶液を硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、溶媒をフラッシュ蒸発によって除去した。粗生成物を必要最低限量の酢酸エチルに溶解させ、曇るまでヘキサンを添加した。溶液を冷蔵庫に２時間保管した。沈殿物を吸引濾過によって収集し、ヘキサンで洗浄し、吸水器で乾燥させた。ＥＳＩ−ＭＳおよび１Ｈ−ＮＭＲは、（ｎ−ブチルダンシルアミド；ＢＤＡ）である構造８と一致していた：1H-NMR (CDCl3, =ppm): 8.55 (1H, d); 8.30 (2H, dd); 7.55 (2H, m); 7.20 (1H, d); 4.80 (1H, t); 2.90 (8H, m); 1.35 (2H, m). 1.20 (2H, m); 0.70 (3H, t)。ESI-MS: Calc. m/z=306.4. Found m/z+H+=307.4。
【０１１０】
４．Ｎ−（３−フルオロプロピル）−Ｎ−（２−チオエチル）−ダンシルアミド（ＮＳＴ７３９）の合成
【０１１１】
【化２２】
【０１１２】
ｎ−（２−ＰＭＢ−チオエチル）−ダンシルアミド（２）： １．３ｍｍｏｌの２−アミノエタンチオール−ＰＭＢエーテルヒドロクロリド（１）および３ｍｍｏｌのＫ２ＣＯ３を、１：１のアセトニトリル：水の混合物に溶解させた。塩化ダンシル１ｍｍｏｌを添加し、溶液を室温で２０分間撹拌した。アセトニトリルを除去し、残留水相から黄色油状
残渣をＤＣＭに抽出した。有機抽出物を合わし、Ｍ ＮａＨＳＯ４で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、溶媒を蒸発させた。ＴＬＣ（３：２の石油エーテル：酢酸エチル）は、Ｒｆ＝０．８において１つの黄色蛍光点（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｓｐｏｔ）を示した。１Ｈ−ＮＭＲおよびＥＳＩ−ＭＳは中間体２と一致していた。生成物は、さらに精製しなくても次の段階に使用するのに充分に純粋（ｃｌｅａｎ）であった。1H-NMRは以下のとおりであった: (CDCl3, =ppm): 8.55 (1H, d); 8.30 (1H, d); 8.20 (1H, dd); 7.55 (2H, m); 7.20 (1H, d); 7.00 (2H, d); 6.75 (2H, d), 5.20 (1H, t); 3. 75 (3H, s); 3.30 (2H, s); 2.95 (2H, q); 2.85 (6H, s); 2.35 (2H, t)。ESI-MS: m/z+H+=431.47。１ｍｍｏｌの生成物２を、ＤＭＦに溶解させ、１．５ｍｍｏｌのＣｓ２ＣＯ３の存在下に、７０℃で１５分間撹拌した。次に、ブロモプロパノール１．５ｍｍｏｌを添加し、混合物を７０℃で一晩撹拌した。ＤＭＦを除去し、残渣をＤＣＭに溶解させた。溶液を１Ｍ ＮａＨＳＯ４および５％ＮａＨＣＯ３で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、溶媒を除去した。粗生成物のＴＬＣ（３：２の石油エーテル：酢酸エチル）は、それぞれＲｆ＝０．４６、０．３２および０．２０において３つの黄色蛍光点を示した。粗生成物をシリカゲル上でのフラッシュＬＣによって精製した。Ｒｆ＝０．４８における物質が溶離されるまで、カラムをＤＣＭ中の２５％石油エーテルで溶離した。次に、溶離剤をＤＣＭに交換し、他の物質を溶離させた。スペクトル（１Ｈ−ＮＭＲおよびＥＳＩ−ＭＳ）データは、Ｒｆ＝０．３２における物質が、下記データを有する所望構造３と一致していることを示した。1H-NMRデータ: (CDCl3, =ppm): 8.55 (1H, d); 8.25 (1H, d); 8.15 (1H, dd); 7.50 (2H, m); 7.15
(3H, m); 6.80 (2H, d); 3.80 (3H, s); 3.60 (4H, m); 3.35 (4H, m); 2.85 (6H, s), 2.50 (2H, m), 2.10 (1H, broad); 1.65 (2H, m)。ESI-MS: m/z+H+=489.87, m/z+Na+=511.60。１ｍｍｏｌの生成物３をＤＣＭに溶解させ、トリエチルアミン１．４ｍｍｏｌを添加した。塩化メシル１．３ｍｍｏｌをゆっくり滴下し、溶液を室温で１．５時間撹拌した。反応混合物のＴＬＣ（３：２の石油エーテル：酢酸エチル）は、全ての出発物質の全消費、および出発物質の上方を流れる新しい物質の出現を示した。溶液混合物を、追加のＤＣＭで希釈し、１Ｍ ＮａＨＳＯ４および５％ＮａＨＣＯ３で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、溶媒を除去した。ＴＬＣは、Ｒｆ＝０．４５における純粋点（ｃｌｅａｎ ｓｐｏｔ）を示した。生成物（４）をさらに精製せずに使用した。その特性は以下の通りであった：
1H-NMR (CDCl3, =ppm): 8.55 (1H, d); 8.25 (1H, d); 8.15 (1H, d); 7.55 (2H, m); 7.20 (lH, d); 7.15 (2H, d); 6.80 (2H, d); 4.10 (2H, t); 3.80 (3H, s); 3.60 (2H, m); 3.35 (4H, q); 2.95 (3H, s), 2.85 (6H, s); 2.50 (2H, t), 1.90 (2H, m)。ESI-MS: m/z+ H+=567.33, m/z+Na+ =589.27。
【０１１３】
ｎ−（３−フルオロプロピル）−Ｎ−（２−ＰＭＢ−チオエチル）−ダンシルアミド（５）： １ｍｍｏｌのＫＦ、１ｍｍｏｌのクリプトフィックス［２，２，２］および０．５ｍｍｏｌのＫ２ＣＯ３を、アセトニトリル中の１０％水に溶解させた。溶液を、乾燥するまで蒸発させ、残渣を乾燥アセトニトリルに溶解させ、溶媒を再び除去した。この方法をさらに３回繰り返し、蒸発器を開けて窒素雰囲気にした。乾燥アセトニトリルに溶解した生成物３（０．２ｍｍｏｌ）を含有する溶液を、乾燥残渣に添加し、混合物を１５分間還流させた。次に、溶媒を除去し、残渣を、必要最低限量の、ＤＣＭ中２５％石油エーテルに溶解させた。溶液を直接、シリカゲルカラムに適用し、前記の溶媒混合物で溶離した。溶離された第１黄色蛍光物質を収集した。ＥＳＩ−ＭＳおよび１Ｈ−ＮＭＲは、所望物質５と一致していた。19F-NMR (CDCl3, =ppm):-44.50, m. 1H-NMR (CDCl3, =ppm): 8.55 (1H, d); 8.25 (1H, d); 8.15 (1H, dd); 7.50 (2H, m); 7.15 (3H,m); 6.80 (2H, d); 4.40 (1H, t); 4.25 (1H, t); 3.75 (3H, s); 3.60 (2H, m); 3.35 (4H, m); 2.95 (3H, s), 2.85 (6H, s); 2.50 (2H, m), 1.80 (2H, m)。ESI-MS: m/z+H+=491.72。０．５ｍｍｏｌの生成物５を、５ｍＬのＴＦＡに溶解させた。アニソール２００μＬ、次に、酢酸水銀（ＩＩ） １ｍｍｏｌを添加した。溶液を室温で１５分間維持し、光から保護した。次に、ＴＦＡをフラッシュ蒸発によって除去し、残渣をエーテルで洗浄した。固形物を濾過に
よって取り、新しいエーテルで洗浄し、メタノールに溶解させた。Ｈ２Ｓの流れを溶液に３分間泡立たせた。溶液をさらに５分間撹拌し、黒色沈殿物をセライトのパッドで濾過して取った。酢酸ナトリウムを中性ｐＨまで添加し、溶媒を除去した。粗生成物をＬＣ（ＤＣＭで溶離）によって精製した。溶離した第１黄色蛍光物質を分析して、生成物６の構造であることを確認した。ＮＳＴ８３９［ｎ−（３−フルオロプロピル）−Ｎ−（２−チオエチル）−ダンシルアミド（６）］を単離し、以下のように特徴づけた：19F-NMR (CDCl3, =ppm):-44.70,m. 1H-NMR (CDCl3, =ppm): 8.55 (1H, d); 8.30 (1H, d); 8.20 (1H, d); 7.55 (2H, m); 7.20 (1H, m); 6.80 (2H, d); 4.40 (1H, t); 4.30 (1H, t); 3.45 (4H, m); 2.85 (6H, s); 2.65 (2H, q), 1.90 (2H, m); 1.30 (1H, t)。ESI-MS: m/z+H+=371.14。
【０１１４】
従って、この実施例は、臨床ＰＥＴスキャンのための１８Ｆ連結の「Ｈｏｔ−Ｂｏｘ」化学に使用される条件に適合した方法における、ＮＳＴ７３９へのフッ素の連結の実施可能性を示す。
【実施例２】
【０１１５】
マウスにおける中大脳動脈（ＭＣＡ）閉塞後の細胞死を経ている細胞へのＮＳＴ７２９の選択的結合
マウスにおける中大脳動脈（ＭＣＡ）焼灼術後のアポトーシスを経ている脳細胞を同定するＮＳＴ７２９の能力を示すために、マウスにおいてインビボ試験を行った。
【０１１６】
実験手順
体重２０〜２５ｇの成熟した雄のＢａｌｂ／Ｃマウスにおいて、実験を行った。中大脳動脈の片側（ｕｎｉｌａｔｅｒａｌ）焼灼術によって虚血を誘発させた。簡単に言えば、マウスに麻酔をかけ、側頭下手法によって虚血を誘発させた。ＭＣＡが外側嗅索と交差するレベルで開頭術を行った。硬膜を慎重に開き、動脈を露出させ、その起点から下大脳静脈と交差する点まで、両極性ジアテルミーによって閉塞した。全ての可視の枝も、バイパス形成による血液供給を防止するために閉塞した。切開部位をクリップで閉じ、動物に鎮痛薬を注射し、回復させた。中大脳動脈（ＭＣＡ）焼灼から２２時間後、２００μＬ中１．４ｍｇのＢＤＡ（遊離チオール残基を含有しないが、それ以外は、構造および分子量においてＮＳＴ７２９に類似し、従って、チオール残基の必要性に関して、対照として使用しうる）またはＮＳＴ７２９（１０％（ＢＤＡ）および５０％（ＤＣＡ？？？ ＤＣＡを意味するのか、またはＮＳＴ７２９であるべきか？ クレモホール／トリズマ−塩基（Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ／ｔｒｉｚｍａ−ｂａｓｅ）０．１Ｍ）を、動物を殺す２時間前に静脈内注射した。損傷の誘導から２４時間後に、マウスに麻酔をかけ、殺し、さらなる分析のために、脳を除去して液体窒素に入れた。１０μｍの凍結切片を調製した。薄片を、蛍光顕微鏡によって視覚化した。
【０１１７】
実験結果
図１から明らかなように、損傷領域の細胞は、ＮＳＴ７２９への広範囲な結合を示した。蛍光強度によって示されるＮＳＴ７２９の結合レベルは、ＢＤＡ（ＮＳＴ７２９に類似した構造を有するが、チオール基を含有しない）の結合レベルより顕著に高かった。さらに、ＮＳＴ７２９によって検出されたアポトーシス事象の数は、ＢＤＡによって検出された細胞数より顕著に多かった。
【０１１８】
これらの結果は、遊離チオール基が、脳におけるアポトーシス細胞への化合物の選択的結合を可能にするのに重要な成分であることを示す。
【実施例３】
【０１１９】
腫瘍、マウス黒色腫における、アポトーシス細胞へのＤＣのインビボ標的化
実験手順
腫瘍、特に黒色腫のような浸潤性悪性腫瘍は、異常な組織増殖に加えて、腫瘍細胞の顕著なアポトーシスも特徴とする。従って、腫瘍内におけるこれらのアポトーシス細胞の選択的標的化におけるＤＣの性能を試験した。マウス（ｃ５７／ｂｌａｃｋ；８週齢の雄のマウス）の両側の側腹部に、マウス黒色腫由来Ｂ１６−Ｆ１０細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−６４７５；容量１００μＬ中に１０５細胞／マウス）を皮下注射した。注射の前に、４ｍＭ Ｌ−グルタミン；１００単位／ｍＬ ペニシリン；１００μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン；１２．５単位／ｍＬ ナイスタチンおよび１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を補足したダルベッコ修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）における培養に、該細胞系を維持した。腫瘍を１４日間成長させ、それまでに腫瘍は直径５〜７ｍｍに達した。
【０１２０】
ダンシル−システイン（ＤＣ）、または対照化合物ダンシル−グリシンまたはダンシル−セリン（ＮａＰｐｉバッファ、ｐＨ７．４０中に、それぞれ２ｍｇ／マウス）を静脈内注射した。２時間後、マウスを殺し、腫瘍および他の器官を取り、直ぐに液体窒素中で凍結させた。次に、凍結切片を各器官から調製した。腫瘍または他の器官による被験化合物の取り込みを、蛍光顕微鏡によって評価した。
【０１２１】
実験結果
図２Ａは、腫瘍の蛍光顕微鏡検査を示す。細胞死を経ている多数の腫瘍細胞へのＤＣの広範な結合が観察される。アポトーシス細胞への顕著な取り込みによって生じた、化合物の細胞内蓄積、および高レベルの選択性も示され、生存腫瘍細胞は無染色のままである。
【０１２２】
高レベルの選択性は、図２Ｂにも示され、同じ動物の小腸組織の蛍光顕微鏡検査を示し、正常な生存組織への化合物の結合がないことを示している。同様の結果が、種々の他の非標的組織、例えば、結腸、腎臓、脾臓、筋肉または心臓から得られた。
【０１２３】
これに対して、ＤＣに類似した構造を有するが遊離チオール基を含有しないダンシル−グリシンおよびダンシル−セリンは、アポトーシス細胞または生存腫瘍細胞による有意な取り込みを示さなかった（データ示さず）。
【０１２４】
これらの結果は、アポトーシスを経ている細胞への化合物の選択的結合を可能にすることにおける、遊離チオール基の重要性を示している。
【実施例４】
【０１２５】
二重突然変異ＡＰＰを有するＡＰＰ Ｓｗｅｄｉｓｈ ＴＧ２５７６マウスにおけるアミロイドプラークの検出
ＡＰＰの突然変異を有する１才半のＡＰＰ Ｓｗｅｄｉｓｈ ＴＧ２５７６マウスにおいて、実験を行った。ＢＤＡ（遊離チオール残基を含有せず）およびＮＳＴ７２９を静脈内注射し、２時間後に、マウスに麻酔をかけ、さらなる分析のために、脳を除去して液体窒素に入れた。厚さ各１０μｍの凍結切片を調製し、蛍光顕微鏡によって視覚化した。
【０１２６】
実験結果
図３から明らかなように、アミロイドプラークが、ＮＳＴ７２９によって鮮明に視覚化され、周囲の脳細胞は無染色のままである。蛍光強度の比較分析によって評価すると、プラークへのＮＳＴ７２９の結合強度は、対照化合物ＢＤＡの結合強度より顕著に高かった。
【０１２７】
結果は、ＮＳＴ７２９が脳内のアミロイドプラークに選択的に結合することができること、かつ、該化合物の−ＳＨ基がこの特性を可能にする役割を担っていることを示している。
【実施例５】
【０１２８】
運動ニューロン疾患のマウスモデルにおける、インビボでの、変性神経細胞へのＮＳＴ７２９の選択的結合
Ｇ９３Ａの点変異を有するＳＯＤについて、トランスジェニックマウスにおいて実験を行った。ＮＳＴ７２９（２００μＬ ５０％クレモホール／トリズマ−塩基０．１Ｍ中１．４ｍｇ／動物）を、静脈内注射した。２時間後、マウスに麻酔をかけ、さらなる分析のために、脳および脊髄を除去して液体窒素に入れた。厚さ１０μｍの凍結切片を調製した。蛍光顕微鏡によって、薄片を視覚化した。
【０１２９】
実験結果
図４は、脳橋の運動核の断面を示す。重度の広範囲な変性過程の神経細胞が見られる。顕著なのは神経細胞軸索の変性過程であり、軸索突起の重度の変形、不規則性および肥厚を有している。これらの全ての神経病変は、ＮＳＴ７２９の顕著な取り込みを示したが、同じ領域の他の細胞、ならびに他の脳領域の細胞は、そのような取り込みを示さなかった。従って、この実施例は、全身投与されたＮＳＴ７２９の、運動ニューロン変性に関連した神経病理的変化を特異的に標的とし表示する可能性を、明らかに示している。
【実施例６】
【０１３０】
マウスにおける中大脳動脈閉塞後の細胞死を経ている細胞へのＮＳＴ７３９の選択的標的化
中大脳動脈（ＭＣＡ）閉塞による脳虚血によって誘発されたアポトーシスを経ている細胞への選択的結合における、ＮＳＴ７３９の性能を示すために、マウスにおいて生体内試験を行った。
【０１３１】
実験手順
体重２０〜２５ｇの成熟した雄のＢａｌｂ／Ｃマウスにおいて、実験を行った。中大脳動脈の片側焼灼術によって脳虚血を誘発させた。簡単に言えば、マウスに麻酔をかけ、側頭下手法によって虚血を誘発させた。ＭＣＡが外側嗅索と交差するレベルで開頭術を行った。硬膜を慎重に開き、動脈を露出させ、その起点から下大脳静脈と交差する点まで、両極性ジアテルミーによって閉塞した。全ての可視の枝も、バイパス形成による血液供給を防止するために閉塞した。切開部位をクリップで閉じ、動物に鎮痛薬を注射し、回復させた。中大脳動脈（ＭＣＡ）焼灼から２２時間後、ＮＳＴ７３９またはコントロール化合物ＢＤＡ（それぞれ１．４ｍｇ／動物）を静脈内注射した。損傷の誘導から２４時間後、かつＮＳＴ７３９の投与から２時間後に、マウスに麻酔をかけ、殺し、さらなる分析のために、脳を除去して液体窒素に入れた。１０μｍの凍結切片を調製した。薄片を、蛍光顕微鏡によって視覚化した。
【０１３２】
実験結果
図５に示されるように、損傷領域の細胞は、ＮＳＴ７３９への広範囲な結合を示したが、他の脳領域の細胞は、無染色のままであった。蛍光強度によって示されるＮＳＴ７３９の結合レベルは、チオール基を含有しないＢＤＡの結合レベルと比較して有意に高かった。
【０１３３】
得られた結果は、虚血性損傷後に、脳における細胞死を経ている細胞への選択的結合におけるＮＳＴ７３９の性能を示している。ＤＢＡの結合と比較して、ＮＳＴ７３９の増加した結合は、化合物のこの特性を可能にする遊離チオール基の重要性を示している。
【実施例７】
【０１３４】
疾患または死の過程を経ている細胞への本発明の化合物の選択的結合のメカニズム
本発明の化合物の作用メカニズムを示すために、図６にも示されているような、アポトーシスを経ている細胞の細胞内タンパク質へのＮＳＴ７２９の結合を説明する。
【０１３５】
健康な細胞の細胞内タンパク質におけるシステイン残基のチオール基は、ほとんどの場合、還元状態であり、即ち遊離チオール（−ＳＨ）である。これは、−ＳＨ還元物質の高サイトゾル濃度による。従って、一般に、Ｓ−Ｓ結合はサイトゾルにおけるタンパク質分子においてめったに見られない。これに対して、細胞疾患、または、例えばアポトーシスによる、細胞死を経ている細胞の場合、酸化ストレスが生じ、細胞内抗酸化メカニズムの損失が生じる。これは、特に、これらの細胞における細胞内タンパク質のシステインのチオール基間におけるジスルフィド結合（Ｓ−Ｓ）の発生によって示される。
【０１３６】
図６Ａに示されるように、本発明の化合物の典型としてのＮＳＴ７２９は、生理的条件において無荷電プロトン化状態、またはチオレート陰イオンとして脱プロトン状態であることができるチオール基を含有する。無電荷疎水性プロトン化状態は、化合物が細胞膜（および血液脳関門）を通過して細胞内空間に分散することを可能にし、一方、荷電チオレート陰イオンは、チオレートジスルフィド交換反応に関与することができる。図６Ｂに示すように、正常な健康な細胞においては、化合物の標的が存在しない。従って、化合物は、細胞から洗い流される。これに対して、酸化ストレスおよびジスルフィド結合形成を経ているアポトーシス細胞においては、チオレート陰イオンがＳ−Ｓ結合を攻撃し、チオール基の１つに取って代わることができる。この反応により、ＮＳＴ７２９に含有された画像化用マーカ（蛍光ダンシル基）が、細胞内タンパク質（そのシステイン残基がＳ−Ｓ結合に関与している）（図６Ａのタンパク質Ａ）に共有結合的に付加される。続いて、非結合分子は細胞から洗い流され、Ｓ−Ｓ結合形成の部位に結合した分子だけが残る。画像化プローブとしての特性（例えば、ＮＳＴ７２９のダンシル基の蛍光）により、本発明の化合物の画像化用マーカは、下記におけるその所在位置についての情報を与えうる：正常な細胞レドックス状態の減損を経ている細胞、即ち、酸化ストレスを受けている細胞、病気の細胞および／または死の過程を経ている細胞におけるその存在。次に、この情報を、化合物のプローブの画像化特性に関して、画像化装置によって収集し分析する（例えば、ＮＳＴ７２９におけるダンシルについての蛍光の分析）。従って、本発明の方法は、シグナルが得られないかまたは顕著に少ないシグナルしか得られない健康な生存細胞に対して、酸化ストレス、細胞疾患または細胞死を経ている細胞、シグナルを明示するあらゆる細胞の画像マップの形成を可能にする。
【実施例８】
【０１３７】
１８Ｆでの放射性標識に適した条件における、陽電子断層撮影法（ＰＥＴ）による画像化用のＮｅｕｒｏＳｅｎｓｅの合成
画像化用の種々のマーカを、本発明の化合物に使用できる。いくつかの化合物、例えば、ＮＳ７２９は、蛍光プローブ（例えば、ダンシル基）を有する。しかし、例えば陽電子断層撮影法（ＰＥＴ）によって、臨床画像化を可能にする放射標識で、化合物を標識することが望ましい。この目的のために、下記の式ＶＩＩで示される構造を有するＮｅｕｒｏＳｅｎｓｅと称される化合物を合成し、放射性同位体１８Ｆで標識する方法が開発された。
【０１３８】
【化２３】
【０１３９】
１８Ｆ放射性同位体の半減期１１５分に関して、１８Ｆ付加の放射化学に必要とされる条件およびタイムライン（ｔｉｍｅｌｉｎｅｓ）に適応させたフッ素付加方法が開発された。
【０１４０】
ＮｅｕｒｏＳｅｎｓｅの合成を、下記の合成式に従って行った：
【０１４１】
【化２４】
【０１４２】
１８Ｆ ＰＥＴ画像化のための放射合成のタイムラインへの、この合成経路の適合を、下記の表１に示す：
【０１４３】
【表１】
【０１４４】
従って、ＮｅｕｒｏＳｅｎｓｅの合成および精製の合計時間は７０分であり、ＰＥＴ画
像化に充分適した時間枠である。
【図面の簡単な説明】
【０１４５】
【図１】マウスの中大脳動脈（ＭＣＡ）閉塞後の、インビボでの、脳内のアポトーシス細胞へのＮＳＴ７２９の選択的結合を示す。
【図２】図２ＡおよびＢは、正常組織、即ち小腸への結合の不存在（図２Ｂ）に対して、インビボでの、腫瘍によって誘発されたアポトーシス細胞へのＤＣの選択的結合（図２Ａ）を示す。
【図３】インビボでの、トランスジェニックＡＰＰ ＴＧ２５７６マウスの脳内のアミロイド老年斑への、ＮＳＴ７２９の結合を示す。
【図４】インビボでの、運動ニューロン疾患のマウスモデルにおける変性神経細胞への、ＮＳＴ７２９の結合を示す。
【図５】マウスにおけるＭＣＡ閉塞後の、インビボでの、死の過程を経ている細胞への、ＮＳＴ７３９の結合を示す。
【図６】酸化ストレスに関連した疾患、または死の過程を経ている細胞への、本発明の化合物の選択的結合のメカニズムを示す。アポトーシスを経ている細胞の細胞内タンパク質への、ＮＳＴ７２９の結合が示されている。（Ａ）：アポトーシスを経ている細胞のサイトゾルにおけるタンパク質への、ＮＳＴ７２９の結合。（Ｂ）：健康な細胞のサイトゾルにおける、ＮＳＴ７２９の結合の不存在。図におけるＡおよびＢは、細胞内タンパク質の例である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者または動物の組織における細胞死過程または疾患過程を検出する方法であって、下記の工程：
（ｉ） 式Ｉで示される構造を有するチオール含有化合物を投与する工程：
【化１】
［式中、
Ｌ１は、Ｃ１、Ｃ２およびＣ３直鎖または分岐鎖アルキレンから選択され；
Ｌ２は、不存在、およびＣ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６直鎖または分岐鎖アルキレンリンカーから選択され；
Ｑは、不存在、および置換されていてもよいアリール、ヘテロアリール、アリール−スルホンアミドおよびヘテロアリール−スルホンアミドから選択され；
Ｍは、画像化用のマーカである］；および
（ｉｉ） 患者または動物の組織に結合した化合物の量を検出する工程；
を含んで成り、
患者または動物の組織に結合した化合物の有意量の検出が、該組織における細胞死または疾患過程の存在を示す方法。
【請求項２】
細胞死過程または疾患過程が、酸化ストレスに関連している請求項１に記載の方法。
【請求項３】
細胞または組織が、中枢または末梢神経系の部分である請求項１に記載の方法。
【請求項４】
式（ＩＩ）で示される構造を有する化合物：
【化２】
［式中、ＭおよびＬ２は、それぞれ、請求項３に定義した通りである］。
【請求項５】
Ｍが水素であり、Ｌ２が不存在である請求項４に記載の化合物。
【請求項６】
式ＩＩＩで示される構造で表される請求項４に記載の化合物：
【化３】
［式中、Ｆ原子は、１８Ｆまたは１９Ｆであってよい］。
【請求項７】
式ＩＶで示される構造で表される請求項４に記載の化合物：
【化４】
［式中、
ｎは、２または３の整数を表し；
Ｆ原子は、１８Ｆまたは１９Ｆである］。
【請求項８】
式Ｖで示される構造で表される化合物：
【化５】
［式中、ＭおよびＬ２は、それぞれ、請求項３に定義した通りである］。
【請求項９】
Ｍが水素であり、Ｌ２が不存在である請求項８に記載の化合物。
【請求項１０】
式ＶＩで示される構造で表される化合物：
【化６】
［式中、
Ｌ２およびＭは、上述と同意義であり；
Ｙは、不存在、−Ｏ−、ＮＨおよびＣ１、Ｃ２、Ｃ３またはＣ４アルキルアミンから選択される］。
【請求項１１】
式ＶＩＩで示される構造で表される請求項１０に記載の化合物：
【化７】
［式中、Ｆ原子は、１８Ｆまたは１９Ｆであってよい］。
【請求項１２】
式ＶＩＩＩで示される構造で表される化合物：
【化８】
［式中、
Ｆは、１８Ｆまたは１９Ｆであってよく；
Ｒは、アリールまたはヘテロアリール、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６直鎖または分岐鎖の、置換されていてもよいアルキル、またはそれらの組合せである］。
【請求項１３】
式ＩＸで示される構造で表される化合物：
【化９】
［式中、Ｆは、１８Ｆまたは１９Ｆである］。
【請求項１４】
アルツハイマー病の疑いのあるヒトまたは動物の脳におけるアミロイドプラークの量を測定する方法であって、下記の工程：
（ｉ） 請求項４〜１５に記載の式Ｉ〜ＩＸで示されるいずれかの構造で表されるいず
れかの化合物を投与する工程；および、
（ｉｉ） アミロイドプラークに結合した化合物の量を測定するために、ヒトまたは動物を画像化する工程；
を含んで成る方法。
【請求項１５】
患者または動物におけるアミロイドプラークの量の減少における薬剤の有効性を評価する方法であって、下記の工程：
（ｉ） 被験患者または動物に薬剤を投与する工程；
（ｉｉ） 式Ｉ〜ＩＸで示されるいずれかの構造で表されるいずれかの化合物を投与する工程；および
（ｉｉｉ） 画像化、オートラジオグラフィーまたは組織病理学によってプラークの量を検出する工程；
を含んで成り、
画像強度が減少した場合、または検出されたプラークの量が減少した場合、薬剤が、患者または動物の脳におけるアミロイドプラークの負荷を減少させるのに有効であるものとして同定される方法。
【請求項１６】
患者または動物の組織における疾患過程を減少させる薬剤の有効性を評価する方法であって、下記の工程：
（ｉ） 被験患者または動物に薬剤を投与する工程；
（ｉｉ） 式Ｉ〜ＩＸで示されるいずれかの構造で表されるいずれかの化合物を投与する工程；および
（ｉｉｉ） 画像化、オートラジオグラフィーまたは組織病理学によって、被験患者または動物の組織に結合した化合物の量を検出する工程；
を含んで成り、
画像強度が減少した場合、その薬剤が疾患過程を減少させるのに有効であるものとして同定される方法。
【請求項１７】
疾患過程が、細胞または組織における酸化ストレスを有する請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
細胞または組織が、中枢または末梢神経系の部分である請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
患者または動物の脳腫瘍における酸化ストレスまたは細胞死を検出する方法であって、下記の工程：
請求項４〜１４に記載の式Ｉ〜ＩＸで示されるいずれかの構造で表されるいずれか１つの化合物を、患者または動物に投与する工程；および
脳腫瘍に結合した化合物の量を検出する工程；
を含んで成り、
脳腫瘍に結合した化合物の有意量の検出が、腫瘍における酸化ストレスまたは細胞死の存在を示す方法。
【請求項２０】
抗癌治療に対する脳腫瘍の反応をモニターするための、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
式Ｉ〜ＩＸで示されるいずれかの構造で表されるいずれか１つの化合物、および医薬的に許容される担体を含んで成る医薬組成物。
【請求項２２】
式Ｉ〜ＩＸで示されるいずれかの構造で表されるいずれか１つの化合物を含んで成る医薬組成物であって、該化合物が診断用のマーカに結合されているかまたは該マーカを含有する医薬組成物。
【請求項２３】
患者または動物における酸化ストレスに関連した細胞死または疾患過程の検出用の診断組成物を製造するための、式Ｉ〜ＩＸで示されるいずれかの構造で表される化合物の使用。
【請求項２４】
組織が、中枢または末梢神経系の部分である請求項２３に記載の使用。
【請求項１】
患者または動物の組織における細胞死過程または疾患過程を検出する方法であって、下記の工程：
（ｉ） 式Ｉで示される構造を有するチオール含有化合物を投与する工程：
【化１】
［式中、
Ｌ１は、Ｃ１、Ｃ２およびＣ３直鎖または分岐鎖アルキレンから選択され；
Ｌ２は、不存在、およびＣ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６直鎖または分岐鎖アルキレンリンカーから選択され；
Ｑは、不存在、および置換されていてもよいアリール、ヘテロアリール、アリール−スルホンアミドおよびヘテロアリール−スルホンアミドから選択され；
Ｍは、画像化用のマーカである］；および
（ｉｉ） 患者または動物の組織に結合した化合物の量を検出する工程；
を含んで成り、
患者または動物の組織に結合した化合物の有意量の検出が、該組織における細胞死または疾患過程の存在を示す方法。
【請求項２】
細胞死過程または疾患過程が、酸化ストレスに関連している請求項１に記載の方法。
【請求項３】
細胞または組織が、中枢または末梢神経系の部分である請求項１に記載の方法。
【請求項４】
式（ＩＩ）で示される構造を有する化合物：
【化２】
［式中、ＭおよびＬ２は、それぞれ、請求項３に定義した通りである］。
【請求項５】
Ｍが水素であり、Ｌ２が不存在である請求項４に記載の化合物。
【請求項６】
式ＩＩＩで示される構造で表される請求項４に記載の化合物：
【化３】
［式中、Ｆ原子は、１８Ｆまたは１９Ｆであってよい］。
【請求項７】
式ＩＶで示される構造で表される請求項４に記載の化合物：
【化４】
［式中、
ｎは、２または３の整数を表し；
Ｆ原子は、１８Ｆまたは１９Ｆである］。
【請求項８】
式Ｖで示される構造で表される化合物：
【化５】
［式中、ＭおよびＬ２は、それぞれ、請求項３に定義した通りである］。
【請求項９】
Ｍが水素であり、Ｌ２が不存在である請求項８に記載の化合物。
【請求項１０】
式ＶＩで示される構造で表される化合物：
【化６】
［式中、
Ｌ２およびＭは、上述と同意義であり；
Ｙは、不存在、−Ｏ−、ＮＨおよびＣ１、Ｃ２、Ｃ３またはＣ４アルキルアミンから選択される］。
【請求項１１】
式ＶＩＩで示される構造で表される請求項１０に記載の化合物：
【化７】
［式中、Ｆ原子は、１８Ｆまたは１９Ｆであってよい］。
【請求項１２】
式ＶＩＩＩで示される構造で表される化合物：
【化８】
［式中、
Ｆは、１８Ｆまたは１９Ｆであってよく；
Ｒは、アリールまたはヘテロアリール、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６直鎖または分岐鎖の、置換されていてもよいアルキル、またはそれらの組合せである］。
【請求項１３】
式ＩＸで示される構造で表される化合物：
【化９】
［式中、Ｆは、１８Ｆまたは１９Ｆである］。
【請求項１４】
アルツハイマー病の疑いのあるヒトまたは動物の脳におけるアミロイドプラークの量を測定する方法であって、下記の工程：
（ｉ） 請求項４〜１５に記載の式Ｉ〜ＩＸで示されるいずれかの構造で表されるいず
れかの化合物を投与する工程；および、
（ｉｉ） アミロイドプラークに結合した化合物の量を測定するために、ヒトまたは動物を画像化する工程；
を含んで成る方法。
【請求項１５】
患者または動物におけるアミロイドプラークの量の減少における薬剤の有効性を評価する方法であって、下記の工程：
（ｉ） 被験患者または動物に薬剤を投与する工程；
（ｉｉ） 式Ｉ〜ＩＸで示されるいずれかの構造で表されるいずれかの化合物を投与する工程；および
（ｉｉｉ） 画像化、オートラジオグラフィーまたは組織病理学によってプラークの量を検出する工程；
を含んで成り、
画像強度が減少した場合、または検出されたプラークの量が減少した場合、薬剤が、患者または動物の脳におけるアミロイドプラークの負荷を減少させるのに有効であるものとして同定される方法。
【請求項１６】
患者または動物の組織における疾患過程を減少させる薬剤の有効性を評価する方法であって、下記の工程：
（ｉ） 被験患者または動物に薬剤を投与する工程；
（ｉｉ） 式Ｉ〜ＩＸで示されるいずれかの構造で表されるいずれかの化合物を投与する工程；および
（ｉｉｉ） 画像化、オートラジオグラフィーまたは組織病理学によって、被験患者または動物の組織に結合した化合物の量を検出する工程；
を含んで成り、
画像強度が減少した場合、その薬剤が疾患過程を減少させるのに有効であるものとして同定される方法。
【請求項１７】
疾患過程が、細胞または組織における酸化ストレスを有する請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
細胞または組織が、中枢または末梢神経系の部分である請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
患者または動物の脳腫瘍における酸化ストレスまたは細胞死を検出する方法であって、下記の工程：
請求項４〜１４に記載の式Ｉ〜ＩＸで示されるいずれかの構造で表されるいずれか１つの化合物を、患者または動物に投与する工程；および
脳腫瘍に結合した化合物の量を検出する工程；
を含んで成り、
脳腫瘍に結合した化合物の有意量の検出が、腫瘍における酸化ストレスまたは細胞死の存在を示す方法。
【請求項２０】
抗癌治療に対する脳腫瘍の反応をモニターするための、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
式Ｉ〜ＩＸで示されるいずれかの構造で表されるいずれか１つの化合物、および医薬的に許容される担体を含んで成る医薬組成物。
【請求項２２】
式Ｉ〜ＩＸで示されるいずれかの構造で表されるいずれか１つの化合物を含んで成る医薬組成物であって、該化合物が診断用のマーカに結合されているかまたは該マーカを含有する医薬組成物。
【請求項２３】
患者または動物における酸化ストレスに関連した細胞死または疾患過程の検出用の診断組成物を製造するための、式Ｉ〜ＩＸで示されるいずれかの構造で表される化合物の使用。
【請求項２４】
組織が、中枢または末梢神経系の部分である請求項２３に記載の使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公表番号】特表２００８−５０５８８４（Ｐ２００８−５０５８８４Ａ）
【公表日】平成２０年２月２８日（２００８．２．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５１９９８１（Ｐ２００７−５１９９８１）
【出願日】平成１７年７月７日（２００５．７．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＬ２００５／０００７２５
【国際公開番号】ＷＯ２００６／００６１５６
【国際公開日】平成１８年１月１９日（２００６．１．１９）
【出願人】（５０５４６７８６７）エヌエスティー・ニューロサバイバル・テクノロジーズ・リミテッド (5)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年２月２８日（２００８．２．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年７月７日（２００５．７．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＬ２００５／０００７２５
【国際公開番号】ＷＯ２００６／００６１５６
【国際公開日】平成１８年１月１９日（２００６．１．１９）
【出願人】（５０５４６７８６７）エヌエスティー・ニューロサバイバル・テクノロジーズ・リミテッド (5)
【Ｆターム（参考）】
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