癌の治療に有用なＣｐＧ含有ゲノムを有するパルボウィルス
野生型ゲノムには存在しない少なくとも２つの追加のＣｐＧ挿入を含有するＣｐＧモチーフ含有ゲノムを特徴とするパルボウィルス、及び、該パルボウィルスの使用に関する。例えば、パルボウィルスＨ１、又はＬｕＩＩＩ、マウス微小ウィルス（ＭＭＶ）、マウスパルボウィルス（ＭＰＶ）、ラット微小ウィルス（ＲＭＶ）、ラットパルボウィルス（ＲＰＶ）若しくはラットウィルス（ＲＶ）に基づくパルボウィルス、前述のウィルス種に基づくベクタ及び／あるいは前述のウィルス種を活発に産生することができる細胞を、例えば、癌、好ましくは膵臓癌、肝臓癌又はリンパ腫の治療用医薬組成物の製造に使用する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、野生型ゲノムには存在しない少なくとも２つの追加のＣｐＧモチーフを有するＣｐＧ含有ゲノムを特徴とする、パルボウィルスに関する。本発明はまた、癌治療のための上記パルボウィルスの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
げっ歯類パルボウィルス等の腫瘍溶解性ウィルスは、新しい癌治療のツールである。癌細胞を特異的に殺す（腫瘍溶解）他、免疫システムを刺激する危険信号を出してウィルス感染腫瘍を排除する。腫瘍溶解現象の結果、自然及び獲得免疫システムが腫瘍抗原に近づくことができるようになり、クロスプライミングやワクチン接種効果をもたらす。げっ歯類パルボウィルスは、「固有の」腫瘍溶解活性を有する、すなわち、ネズミ及びヒト両起源の癌細胞内で選択的に複製して癌細胞を殺す、一本鎖ＤＮＡウィルスである。（非特許文献１）。ヒトへの臨床応用の最も有望な（Ｈ−１ＰＶを含む）候補は、更にその抗癌効果が改善される必要がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ｒｏｍｍｅｌａｅｒｅ Ｊ，Ｇｉｅｓｅ Ｎ，Ｃｚｉｅｐｌｕｃｈ Ｃ，Ｃｏｒｎｅｌｉｓ ＪＪ．Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ ａｓ ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ ａｇｅｎｔｓ．Ｉｎ： Ｓｉｎｋｏｖｉｃｓ ＪＧ，Ｈｏｒｖａｔｈ ＪＣ，ｅｄｓ．Ｖｉｒａｌ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｃａｎｃｅｒｓ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ；２００５，６２７−７５．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
従って、本発明は、治療用の改良パルボウィルスを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明によれば、前記課題は特許請求の範囲に記載の内容により達成される。本発明は、腫瘍溶解とワクチン接種の有益な特長を組み合わせることによって改良腫瘍溶解ウィルスを生成できるという発見に基づいている。腫瘍溶解パルボウィルスベクタは、ウィルスゲノムの増幅を介して腫瘍細胞内に選択的に当該ウィルスベクタが蓄積するように、ゲノム内に追加のＣｐＧモチーフを有するように設計した。すなわち、Ｈ−１ＰＶのＣｐＧモチーフ含有誘導体を作製し、既に確立された肝癌肺転移ラットモデルにおける自己抗腫瘍ワクチンの効果を強化する能力について、その親ウィルスと比較した（Ｒａｙｋｏｖ Ｚ，Ｂａｌｂｏｎｉ Ｇ，Ａｐｒａｈａｍｉａｎ Ｍ，Ｒｏｍｍｅｌａｅｒｅ Ｊ．Ｃａｒｒｉｅｒ ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ ｆｏｒ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ．Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ２００４；ｌ０９：７４２−９）。親ウィルスの複製能と腫瘍溶解特性の両方を保持した、２つのＣｐＧ含有Ｈ−１ＰＶ変異体（ＪａｂＣＧ１及びＪａｂＣＧ２）を作製した。該ウィルスを、担癌動物に皮下注射する前のワクチンに生体外で植菌した。これは、Ｈ−１ＰＶが有意な腫瘍溶解効果を直接転移癌に対して発揮せず、本質的に抗腫瘍免疫応答を誘発するワクチンを効果的に調節するアジュバントとして作用する条件である（Ｒａｙｋｏｖ Ｚ，Ｇｒｅｋｏｖａ Ｓ，Ｇａｌａｂｏｖ ＡＳ，Ｂａｌｂｏｎｉ Ｇ，Ｋｏｃｈ Ｕ，Ａｐｒａｈａｍｉａｎ Ｍ，Ｒｏｍｍｅｌａｅｒｅ Ｊ．Ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ ａｎｄ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ Ｈ−１ ｉｎ ａ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｔｕｍｏｒ ｍｏｄｅｌ．Ｏｎｃｏｌ Ｒｅｐ ２００７；ｌ７：１４９３−９）。増加したＣｐＧ含量を維持した状態では、ＪａｂＣＧ１及びＪａｂＣＧ２ゲノムは、野生型Ｈ−１ＰＶのＤＮＡに比較して、生体外でＴＬＲ９仲介シグナル伝達を強力に誘導することが証明された。抗腫瘍活性は、皮下投与する自己ワクチンのアジュバントとして親及び変異ウィルスを生体外で植菌して、肝癌肺転移ＭＨ３９２４Ａのラットモデルで評価した。
【０００６】
転移癌への直接的な腫瘍溶解効果が排除されたこの設定では、ＪａｂＣＧ２ベクタは免疫原性が増進されており、縦隔（腫瘍所属）リンパ節での細胞性免疫（ＩＦＮ−γ）及び樹状細胞活性化（ＣＤ８０、ＣＤ８６）のマーカが増加した。このことは、他のワクチン接種スケジュール（Ｈ−１ＰＶ−、ＪａｂＣＧ１−、ＪａｂＧＣ−、又は模擬処理細胞）と比較して、著しい転移率の低下（５０％）を導いた。ＣｐＧモチーフは、ウィルスの複製能と腫瘍細胞溶解能を損なうことなく、Ｈ−１ＰＶゲノムに追加することができる。最も興味深いことに、Ｈ−１ＰＶ等のパルボウィルスは、ＣｐＧモチーフを追加することにより、野生型ウィルスではほとんど効果を示さない条件下でも、感染腫瘍細胞を転換してワクチンが発生する免疫刺激の状態及び転移抑制の状態にする能力があるように改善することができた。これは、ウィルス誘発腫瘍抑制が、ウィルスゲノムの活性化因子ＣｐＧモチーフの数を変更することによって促進され、生体内での免疫刺激につながることを最初に示したものである。
【０００７】
要するに、本データは、腫瘍溶解ウィルスにおける免疫刺激性ＣｐＧモチーフの数を増やすことで抗腫瘍ワクチン接種により誘導される抗癌効果を全体的に改善することが可能であることを示す。パルボウィルスは腫瘍細胞内で選択的に複製するため、ＣｐＧモチーフの増幅は腫瘍部位に限定され、副作用のリスクを最小にする。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】ＣｐＧ変異ウィルスの構築と生体外特性を示す。（Ａ）ｐＳＲ１９ベクタのＨｐａＩ部位でクローン化されたＣｐＧ含有フラグメント（ＣｐＧモチーフは太字で示す）の配列を示す。キャプシド（ＶＰ１／２）、非構造蛋白質（ＮＳ１／２）遺伝子及びそれらのプロモータ（Ｐ４、Ｐ３８）の位置と共にＨ−１ＰＶゲノム構成を模式的に示す。ＨｐａＩＩ及びＡｃｌＩ制限部位の位置も示す。ＪａｂＣＧ１の四角で囲まれている配列はＰＩＦ結合モチーフを示す。（Ｂ）異なるＣｐＧウィルス（ＪａｂＣＧ１、ＪａｂＣＧ２、ＪａｂＧＣ）又は参照用の野生型Ｈ−１ＰＶによる（１細胞当たり１複製ユニットの多重度での）感染の４８時間後のＮＢＫ細胞から採取したウィルスＤＮＡのサザンブロット分析の結果を示す。ウィルス一本鎖ＤＮＡ（ｓｓ）、モノマ（ｍＲＦ）、及びダイマ（ｄＲＦ）の複製型の位置を示す。（Ｃ）ＭＴＴアッセイにより測定された生存細胞を、模擬処理培養に対するウィルス処理培養の生細胞の百分率として示す。ＮＢＫ細胞（９６ウェルプレートに２×１０３細胞／ウェルで播種）は、記載された感染多重度（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｉｅｓ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ：ＭＯＩ）でＨ−１ＰＶ又はＣｐＧ変異ウィルスを接種し、７２時間後に分析した。図に示す値は、４重測定の平均値である。（Ｄ）ＪａｂＣＧ２又はＨ−１ＰＶで感染（ＭＯＩ：１）した４８時間後のＮＢＫ細胞から抽出したウィルスＤＮＡのメチル化状態を示す。精製後、ウィルスＤＮＡを示した制限酵素で処理した（又は処理しなかった）。ウィルス複製型の存在及び消化後の大きさの変化を矢印で示す。結果は、３回の実験の代表的なものを示す。
【図２】野生型及び変異Ｈ−１ＰＶのＤＮＡによるマクロファージ及びＨＥＫＴＬＲ９細胞のＴＬＲ９依存活性化を示す。（Ａ）ＲＡＷ２６４．７マクロファージからのＮＯ放出を示す。細胞（９６ウェルプレート中、１×１０５細胞／ウェル）を、示したオリゴヌクレオチド（ＣｐＧ−２８、ＰＴＯＣＧ１、ＰＴＯＣＧ２、及びＰＴＯＧＣ）５μｇ／ｍＬ又はウィルスｓｓＤＮＡ（ＪａｂＣＧ１、ＪａｂＣＧ２、ＪａｂＧＣ、Ｈ−１ＰＶ）５μｇ／ｍＬで刺激する前に、組換えＩＦＮ−γ（１０Ｕ／ｍＬ）で一晩事前に活性化した。陽性対照として同じ濃度の大腸菌ＤＮＡを使用した。ＩＦＮ−γ又はリポフェクタミンを添加した（又は添加していない）培地（ＭＥＤ）で処理したＲＡＷ細胞を陰性対照とした。１８時間後にグレイス（Ｇｒｅｉｓｓ）反応を利用してＮＯレベルを決定した。ｓｓＤＮＡサンプルのあるものは、細胞に適用する前にリポフェクタミンＴＭ２０００（リポフェクタミン：１μｇ／ウェル）でプレインキュベートした。ＲＡＷ２６４．７細胞に取り込まれたｓｓＤＮＡは処理の１８時間後に、Ｈ−１ＰＶ及びＣｐＧ−変異ゲノムの両方に共通の１セットのプライマを使用して、ＰＣＲで検出した。（Ｂ）ウィルスＤＮＡ処理細胞におけるＴＬＲ９依存性シグナル伝達を示す。ｍＴＬＲ９を安定的に発現し、ＮＦκＢにより誘導されるホタルルシフェラーゼレポータ遺伝子を含有するＨＥＫ細胞を９６ウェルプレートに播種し（２×１０３細胞／ウェル）、表示したｓｓＤＮＡ（ＪａｂＣＧ１、ＪａｂＣＧ２、ＪａｂＣＧ：１０μｇ／ｍＬ）で刺激した。陰性及び陽性対照として、それぞれｃＧｐＣＯＤＮ−１８２６及びｓＣｐＧＯＤＮ−１８２６オリゴヌクレオチド（５μｇ／ｍＬ）で処理した。処理の６時間後に、ＴＬＲ９が仲介するＮＦκＢの誘導を細胞ライセートのルシフェラーゼ活性を測定することにより評価した。結果は、３回の独立した実験の平均値で示す。
【図３】ＣｐＧ変異ウィルスの生体内抗癌活性を示す。（Ａ）ラットに、第０日目にＭＨ３９２４Ａ腫瘍細胞を静脈注射し、１０日目にＨ−１ＰＶ又はＪａｂベクタに感染させた放射線照射自己細胞を皮下ワクチン接種し、３０日目に肺転移率を測定した。未処理動物との有意差（ｐ＜０．０５）をアスタリスクで示す。（Ｂ）前記動物群の縦隔リンパ節における免疫学的マーカ発現についてＲＴ−ＰＣＲで検出した結果を示す。各ラットから得られたデータを、レーン上に記載した対応する転移癌（直径２ｍｍ以上）の数と共に示す。サンプルは、β−アクチンを参照にして、整合させた。
【０００９】
このように、本発明は、野生型ゲノムには存在しないＣｐＧモチーフを少なくとも１つ含有する、ＣｐＧモチーフ含有ゲノムを特徴とするパルボウィルス（及びパルボウィルスに基づくベクタ）を提供する。
【００１０】
本明細書で使用される用語「パルボウィルス」は、野生型及び複製能を有するその変異誘導体に加え、それらのウィルス又は誘導体に基づく関連ウィルス又はベクタを含む。好適なパルボウィルス、誘導体等、及び、前記パルボウィルスを産生するために用いることができる細胞は、過度の実験を行うことなく、本明細書の開示に基づいて当該技術分野における知識の範囲内で容易に決定することができる。
【００１１】
用語「ＣｐＧモチーフ」は、５’−ＣＧ−３’ダイマからなるか、又は、当該ダイマを有するオリゴヌクレオチドを意味し、好ましくはＤＮＡである。
【００１２】
用語「ゲノムが、野生型ゲノムには存在しない少なくとも１つの・・・追加のＣｐＧモチーフを含有する」とは、（ａ）パルボウィルスが腫瘍細胞内で増殖し、広がる能力を維持し、かつ（ｂ）腫瘍溶解及び／又は細胞病原性が損なわれていない状態で、当該パルボウィルスのゲノムが追加のＣｐＧモチーフを含有することを意味する。
【００１３】
下記実施例に示された情報に基づいて、当業者は、アジュバント及び治療効果を高める、（ａ）適切なＣｐＧモチーフ挿入部位、及び（ｂ）ＣｐＧモチーフの最適数を決定することができる。
【００１４】
個々のＣｐＧモチーフ間の好適な距離は、１〜２００ｎｔの範囲である。
【００１５】
本発明の好ましい実施形態では、パルボウィルスは、野生型ゲノムには存在しない追加のＣｐＧモチーフを２〜３０個、より好ましくは６〜１２個含有する。特に好ましい実施形態では、パルボウィルスは、野生型ゲノムには存在しない追加のＣｐＧモチーフを６個含有する。
【００１６】
本発明の他の好ましい実施形態では、追加のＣｐＧモチーフは、遺伝子のイントロン又は３’非翻訳領域に挿入される。当業者は、本発明の目的に有用な様々なパルボウィルスのゲノムの公知ヌクレオチド配列に基づいて、ＣｐＧモチーフの好適な挿入部位を容易に決定することができる。更に、ＣｐＧモチーフの挿入は、例えば、部位特異的突然変異生成法等の一般的手順により行うことができる。
【００１７】
本発明のパルボウィルスの更に好ましい実施形態では、ＶＰ転写ユニットの３’末端の非翻訳領域にＣｐＧモチーフを挿入する。または、ＣｐＧモチーフに富むパルボウィルスゲノムは、代わりのコドンを使用することによって得てもよい。例えば、（アルギニンをコードする）ＡＧＡコドンは、ＣＧＡ、ＣＧＴ、ＣＧＧ又はＣＧＣコドンと置換することができ、また、アミノ酸配列Ａｓｐ−Ｖａｌに対してＡＡＣ−ＧＴＴコドンを使用することもできる。
【００１８】
本発明のパルボウィルスの更により好ましい実施形態では、ＣｐＧモチーフは、ＡＡＣＧＴＴ又はＧＴＣＧＴＴのヌクレオチド配列を有する。
【００１９】
特に好ましい実施形態では、本発明のパルボウィルスは、ＶＰ転写ユニットの３’末端の非翻訳領域内に３つのＡＡＣＧＴＴモチーフと３つのＧＴＣＧＴＴモチーフとを有する。
【００２０】
最も好ましい実施形態の一つにおいては、本発明のパルボウィルスはＨ−１ＰＶに基づいており（すなわち、Ｈ−１ＰＶ由来）、ＶＰ転写ユニットの３’末端の非翻訳領域内にヌクレオチド配列、５’−ＧＴＴＡＡＣＧＴＴＴＡＣＡＧＣＴＧＡＣＴＡＧＴＣＧＴＴＴＧＣＴＣＡＧＴＣＴＡＡＣＧＴＴＣＴＴＧＴＣＴＡＴＴＧＴＣＧＴＴＴＡＣＴＡＧＴＣＴＣＴＴＡＡＣＧＴＴＴＣＡＴＣＴＡＣＴＴＧＴＣＧＴＴＡＡＣ−３’を有する。
【００２１】
特に有用なパルボウィルスは、パルボウィルスＨ１（Ｈ−１ＰＶ）、又はＬｕＩＩＩ、マウス微小ウィルス（ｍｏｕｓｅ ｍｉｎｕｔｅ ｖｉｒｕｓ：ＭＭＶ）、マウスパルボウィルス（ｍｏｕｓｅ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ：ＭＰＶ）、ラット微小ウィルス（ｒａｔ ｍｉｎｕｔｅ ｖｉｒｕｓ：ＲＭＶ）、ラットパルボウィルス（ｒａｔ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ：ＲＰＶ）、若しくはラットウィルス（ｒａｔ ｖｉｒｕｓ：ＲＶ）等の関連するげっ歯類パルボウィルスである。
【００２２】
本発明はまた、本発明のパルボウィルス、又は、該パルボウィルスを産生する、例えば、ヒト２９３（Ｔ）、ＮＢＫ、ラットＲＧ２等の細胞を含有する医薬組成物（パルボ治療薬：ｐａｒｖｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｇｅｎｔ）を提供する。
【００２３】
投与のために、パルボ治療薬は他の好適な医薬担体と組み合わせることができる。本技術分野において周知であり、市販で容易に入手できる好適な医薬担体としては、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液、水、油／水乳液等の乳液、種々の湿潤剤、殺菌溶液等を挙げることができる。そのような担体は、好適な用量を患者に投与するために、パルボ治療薬を用いて従来の製剤方法により製剤化することができる。
【００２４】
追加の薬学的に適合する担体としては、ゲル、生体吸収可能なマトリクス材、治療剤含有移植用構成物、又は他の好適な運搬媒体、送達又は調剤の手段又は物質を含むことができる。
【００２５】
本発明のパルボ治療薬により治療可能な患者には、ヒトだけでなく、非ヒト動物も含まれる。非ヒト動物は、これに限定されるものではないが、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、イヌ、及びネコ等の動物を含む。
【００２６】
パルボ治療医薬組成物の患者、例えば、脳腫瘍患者への投与は、種々の好適な方法、例えば、静脈内、腹腔内、皮下、筋内、局所、皮内、頭蓋内及び腫瘍内投与のいずれかにより行うことができる。当然のことながら、投与経路は疾患の状態、医薬組成物に含有される特定の治療剤により異なる。
【００２７】
そのようなパルボ治療薬が血液脳関門を通過できる感染性ウィルス粒子を有する場合、該ウィルス治療剤、例えばＨ１−ＰＶの静脈注射により治療を行うか、又は少なくとも治療を開始する。
【００２８】
長期の静脈注射治療は、ウィルス治療薬に対する中和抗体の形成の結果、効果を失いやすいため、静脈内投与によるウィルスの初回投与後に他の投与方法を採用することができる。または、そのような他の投与方法、例えば、頭蓋内又は腫瘍内ウィルス投与を、パルボウィルス処理の全工程を通して使用することもできる。
【００２９】
その他の具体的投与方法としては、パルボ治療薬（ウイルス、ベクタ及び／又は細胞剤）は、患者に移植された放出源から患者に投与することができる。例えば、シリコーンや他の生体適合性物質のカテーテルを、腫瘍を摘出する際、又はこれと独立した手順によって患者に埋め込まれた小さな皮内リザーバ（リッカム（Ｒｉｃｋｈａｍ）リザーバ）に連結し、更なる外科的介入を必要とせずに、パルボ治療用組成物を局所的に、様々な回数注入することができる。パルボウイルス又はそれに由来するベクタは、定位手術法又はニューロナビゲーション標的法により、例えば腫瘍に、注入することもできる。
【００３０】
パルボウィルス剤又は組成物の投与は、埋め込み式カテーテルを介して、蠕動輸液ポンプや対流増進送達（ＣＥＤ）ポンプ等の適当なポンプシステムを使用して、低流速でウィルス粒子又はウィルス粒子を含有する液を持続的に注入することにより行うこともできる。
【００３１】
更に他のパルボ治療組成物の投与方法では、パルボ治療薬を目的の局所、例えば腫瘍に投与するように構築、配置した埋め込み式デバイスから投与する。例えば、パルボウイルスＨ１などのパルボ治療組成物を含浸させたウエハを用いることができ、当該ウエハは、外科的腫瘍摘出の結果生じた切除腔の端に取り付ける。そのような治療介入では複数のウエハを使用することができる。
【００３２】
パルボウィルスＨ１やＨ１ベクタ等のパルボ治療剤を活発に産生する細胞を、腫瘍等の目的組織や腫瘍摘出後の腫瘍腔に注入することもできる。
【００３３】
前記投与方法の２つ以上を、例えば、並行して、同時に、又は逐次的になど、適当な方法で組み合わせて用いることもできる。
【００３４】
パルボ治療薬の投与レジメンは、患者データ、診断の他、例えば、患者の大きさ、体表面積、年齢、性別、投与される特定のパルボウイルスや細胞など、投与時間や経路、腫瘍の種類や特性等の疾患の種類、患者の全体的な健康状態、及び、患者が受けている他の薬剤又は治療等の、他の臨床因子に基づいて、担当医の下、当業者の技術の範囲で容易に決定することができる。
【００３５】
従って、本発明はまた、腫瘍治療用医薬組成物の製造のための、本発明のパルボウィルス又は前記パルボウィルスを産生する細胞の使用に関する。腫瘍としては、好ましくは、本発明のパルボ治療薬による治療に特に適していると考えられる、膵臓癌、肝臓癌及びリンパ腫である。
【００３６】
下記実施例により本発明をより詳細に説明する。
【００３７】
実施例１．材料及び方法
（Ａ）試薬
制限酵素は、ニューイングランドバイオラボ（フランクフルト、ドイツ）から購入した。ＰＣＲプライマとホスホロチオエートオリゴヌクレオチド［ＣｐＧ−２８（Ｍｅｎｇ Ｙ，Ｃａｒｐｅｎｔｉｅｒ ＡＦ，Ｃｈｅｎ Ｌ， Ｂｏｉｓｓｅｒｉｅ Ｇ，Ｓｉｍｏｎ ＪＭ，Ｍａｚｅｒｏｎ ＪＪ，Ｄｅｌａｔｔｒｅ ＪＹ．Ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｏｃａｌ ＣｐＧ−ＯＤＮ ａｎｄ ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｇｌｉｏｍａ．Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ２００５；ｌ１６：９９２−７）、ＰＴＯ−ＣＧ１、ＰＴＯ−ＣＧ２、ＰＴＯ−ＧＣ］は、ＭＷＧ（Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇ、ドイツ）により合成された。大腸菌ＤＮＡ、ＩＦＮ−γ、並びに刺激オリゴヌクレオチド（ｓＣｐＧＯＤＮ−１８２６）（Ｋｒｉｅｇ ＡＭ． Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ９ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ． Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ ２００６；５：４７１−８４）及び対照ｃＧｐＣＯＤＮ−１８２６オリゴヌクレオチド（反転ＧｐＣモチーフを有する）は、インビボジェン（フランス）から入手した。リポフェクタミンＴＭ２０００はインビトロジェン（Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ、ドイツ）から購入した。他の試薬は全てシグマ（Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｎ、ドイツ）から入手した。
【００３８】
（Ｂ）細胞培養処理及びアッセイ
マウスＴＬＲ９レセプタを安定的に発現するヒト胎児腎臓細胞株ＨＥＫ−ＴＬＲ９は、Ｓｔｅｆａｎ Ｂａｕｅｒ博士（Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、ミュンヘン、ドイツ）（Ｆｉｓｃｈｅｒ ＳＦ，Ｒｅｈｍ Ｍ，Ｂａｕｅｒ Ａ，Ｈｏｆｌｉｎｇ Ｆ，Ｋｉｒｓｃｈｎｅｋ Ｓ，Ｒｕｔｚ Ｍ，Ｂａｕｅｒ Ｓ，Ｗａｇｎｅｒ Ｈ，Ｈａｃｋｅｒ Ｇ．Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ９ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｃａｎ ｓｅｎｓｉｔｉｚｅ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ｆｏｒ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｌｅｔｔ ２００５；９７：ｌ１５−２２）より供与された。ＨＥＫ−ＴＬＲ９、２９３Ｔ及びＮＢＫ線維芽細胞株は、マクロファージＲＡＷ２６４．７細胞（ＡＴＣＣ、マサチューセッツ州、米国）と同様、ＤＭＥＭ中で培養した。ＡＣＩラット肝癌細胞株ＭＨ２９３４Ａ（Ｒａｙｋｏｖ Ｚら、Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ２００４；ｌ０９：７４２−９）は、ＲＰＭＩ中で培養した。これら培地は、全てシグマ社から入手し、ＦＣＳ（１０％）、ペニシリン（１００ユニット／ｍＬ）及びストレプトマイシン（１０ｍｇ／ｍＬ）を添加した。
【００３９】
異なるウィルス分離体の細胞変性作用を、感染の７２時間後のＮＢＫ細胞についてＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾイル-２）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）細胞毒性分析を行うことにより評価した。ＭＨ２９３４Ａ細胞培養物は、注入前に１５Ｇｙのγ線を照射した。両方法も以前記載した方法（Ｒａｙｋｏｖ Ｚら、Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ２００４；ｌ０９：７４２−９）で行った。ＲＡＷ２６４．７マクロファージ培養上清中のＮＯレベルの測定は、Ｆａｉｓｓｔ Ｓら，Ｆａｉｓｓｔ ＳＲ，Ｄｕｐｒｅｓｓｏｉｒ Ｔ，Ｐｌａｚａ Ｓ，Ｐｕｊｏｌ Ａ，Ｊａｕｎｉａｕｘ ＪＣ，Ｒｈｏｄｅ ＳＬ，Ｒｏｍｍｅｌａｅｒｅ Ｊ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｆｕｌｌｙ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｖａｒｉａｎｔ ｏｆ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ Ｈ−１ ｓｕｐｐｌａｎｔｉｎｇ ｔｈｅ ｓｔａｎｄａｒｄ ｓｔｒａｉｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ １９９５；６９：４５３８−４３で報告されているように、グレイス（Ｇｒｅｉｓｓ）呈色反応により行った。ルシフェラーゼは以前記載した（Ｆｉｓｃｈｅｒ ＳＦら、Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｌｅｔｔ ２００５；９７：ｌ１５−２２）ように測定した。リポフェクタミンＴＭ２０００トランスフェクションは、製造者の指示書に従って行った。
【００４０】
（Ｃ）ウィルス及びウィルスＤＮＡ分析
ＪａｂＣＧ１、ＪａｂＣＧ２、及びＪａｂＧＣベクタは、図１Ａに示したＨｐａＩ消化フラグメントを、感染Ｈ−１ＰＶ分子クローンであるｐＳＲ１９ベクタに挿入して構築した（Ｆａｉｓｓｔ Ｓら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ １９９５；６９：４５３８−４３）。ウィルスベクタは、Ｆａｉｓｓｔ Ｓら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ １９９５；６９：４５３８−４３に記載されたように、２９３Ｔ細胞をそれぞれのプラスミドでトランスフェクトした後、ＮＢＫ細胞への感染させ、精製してエンドトキシン濃度を２．５ＥＵ／ｍＬ未満として調整した。ウィルスは、ＮＢＫ細胞を用いた感染中心アッセイ（ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｃｅｎｔｒｅ ａｓｓａｙ）により力価測定した。ハート抽出法（Ｈｉｒｔ'ｓ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）により、精製ビリオン又は感染ＮＢＫ細胞からウィルスＤＮＡを単離した。複製可能なウィルスＤＮＡ構造を酵素消化し、サザンブロッティング（Ｒｕｓｓｅｌｌ ＳＪ， Ｂｒａｎｄｅｎｂｕｒｇｅｒ Ａ， Ｆｌｅｍｍｉｎｇ ＣＬ， Ｃｏｌｌｉｎｓ ＭＫ， Ｒｏｍｍｅｌａｅｒｅ Ｊ． Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ｇｅｎｅｓ ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ ｂｙ ａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ． Ｊ Ｖｉｒｏｌ １９９２；６６：２８２１−８）により解析した。ＤｐｎＩ酵素は、Ｈ−１ＰＶゲノムの複数部位に存在する、ＧＡ‘ＴＣ配列のメチル化（‘）ＤＮＡのみを切断する。ＨｐａＩＩ酵素は、そのうち５つがウィルスゲノムの右端に位置する、非メチル化Ｃ’ＣＧＧモチーフでＤＮＡを分解する（図１Ａ参照）。ＡｃｌＩ酵素は、ＪａｂＣＧ２を生成する上で３コピーが挿入された（図１Ａ）、ＡＡＣ’ＧＴＴ配列内の非メチル化シトシンでのみＤＮＡを切断する。制限酵素反応は全て、製造者が推奨する条件下で行った。
【００４１】
（Ｄ）ＲＴ−ＰＣＲ
処理動物の縦隔リンパ節から全ＲＮＡを抽出し、以前報告した（Ｒａｙｋｏｖ Ｚら、Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ２００４；ｌ０９：７４２−９）ように、ｃＤＮＡに逆転写した。ラットｃＤＮＡの増幅には次のプライマを使用した：ＩＦＮ−γには、５’−ＡＴＣＴＧＧＡＧＧＡＡＣＴＧＧＣＡＡＡＡＧＧＡＣＧ−３’−フォワード、５’−ＣＣＴＴＡＧＧＣＴＡＧＡＴＴＣＴＧＧＴＧＡＣＡＧＣ−３’−リバース、ＣＤ８０には、５’−ＧＧＣＡＴＴＧＣＴＧＴＣＣＴＧＴＧＡＴＴＡＣ−３’−フォワード、５’−ＡＣＴＣＡＧＴＴＡＴＧＴＴＧＧＧＧＧＴＡＧＧ−３’−リバース、ＣＤ８６には、５’−ＧＣＴＣＧＴＡＧＴＡＴＴＴＴＧＧＣＡＧＧＡＣＣ−３’−フォワード、５’−ＣＧＧＧＴＡＴＣＣＴＴＧＣＴＴＡＧＡＴＧＡＧＣ−３’−リバース。対応するＰＣＲ生成物の大きさは、それぞれ２９０ｂｐ（ＩＦＮ−γ）、３１４ｂｐ（ＣＤ８０）、３３７ｂｐ（ＣＤ８６）であった。β−アクチン及びＨ−１ＰＶのＰＣＲのためのプライマ配列は、既に報告されている（Ｒａｙｋｏｖ Ｚら、Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ２００４；ｌ０９：７４２−９）。
【００４２】
（Ｅ）動物及び腫瘍モデル
既に報告したように（Ｒａｙｋｏｖ Ｚら、Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ２００４；ｌ０９：７４２−９）、麻酔したＡＣＩラットの大腿静脈を通してＭＨ３９２４Ａ細胞（１×１０５細胞／動物）を接種し、転移を誘起した。転移誘導の１０日後にワクチン接種した。ＭＨ３９２４Ａ細胞をそれぞれの精製ウィルスで感染させ又は感染させなかった。感染の２４時間後にＰＢＳで十分に洗浄後、細胞を放射線照射し、ラットに皮下注射した（１×１０６細胞／動物）。動物はワクチン接種の２０日後にサクリファイスした。胸腔を開いた後、気管にシリンジでカニューレを挿入し、肺に５〜６ｍＬの０．９％ＮａＣｌ中の２％墨汁溶液を吹き入れた。肺をフェケット溶液（Ｆｅｋｅｔｔｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ：５８％エタノール、３％ホルムアルデヒド、０．０４％氷酢酸）に浸した後、肺組織の黒い背景上に白い転移結節（大きさ：１〜２ｍｍ）を可視化した。組織表面上の結節を拡大鏡を用いて数えた。肺を切除後、縦隔リンパ節を摘出した。全ての実験は、ヨーロッパ及び現地ガイドラインに従って行った。
【００４３】
（Ｆ）統計
細胞生存、刺激及び転移発生について、平均値及び標準偏差を計算した。処理動物群における転移発生の統計的有意差は、一元配置分散分析し、パラメトリック不対スチューデントｔ−検定により評価した。個々の値の相違は、ｐ＜０．０５で有意であると判断した。分析には、Ｉｎｓｔａｔ２．００（登録商標）マッキントッシュソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，サンディエゴ，カリフォルニア州）を使用した。
【００４４】
実施例２．ＣｐＧ変異ウィルスの構築と生体外特性
２回目の感染により目的腫瘍に腫瘍溶解性ウィルスを拡散させるには複製能力が必須であるので、腫瘍細胞内で増殖及び拡散する能力を維持しているＣｐＧ含有パルボウィルスを構築した。Ｈ−１ＰＶゲノムはやや小さく、ウィルスの生活環において重要な機能を有する蛋白質をコードしている。従って、一連のＣｐＧ含有ＤＮＡはＶＰ転写ユニットの３’末端の非翻訳領域に挿入した。図１Ａに示すように、２つのＨ−１ＰＶ変異体（ＪａｂＣＧ１、ＪａｂＣＧ２）にクローン化された配列は、異なる数の２種類のＣｐＧモチーフ：ＡＡＣＧＴＴ（ネズミモデルで活性であると報告されている、普遍的な免疫活性化要素）（Ｍｅｎｇ Ｙら、Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ２００５；ｌ１６：９９２−７）及びＧＴＣＧＴＴ（ヒト細胞の活性化も示すモチーフ）（Ｓｉｖｏｒｉ Ｓ，Ｃａｒｌｏｍａｇｎｏ Ｓ，Ｍｏｒｅｔｔａ Ｌ，Ｍｏｒｅｔｔａ Ａ．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ＣｐＧ ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｃｌａｓｓｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅｉｒ ｃａｐａｂｉｌｉｔｙ ｔｏ ｓｔｉｍｕｌａｔｅ ｈｕｍａｎ ＮＫ ｃｅｌｌｓ．Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００６；３６：９６１−７）を含んでいた。第３の構築物（ＪａｂＧＣ）は、モチーフ内で逆（ＧＣ）方向になっており、対照として使用した。
【００４５】
２９３Ｔ細胞を前記構築物でトランスフェクトして形成されたウィルスのゲノム配列を決定した。許容細胞株及び動物の両者の継代により、ＪａｂＣＧ１ウィルスは、挿入されたＣｐＧモチーフに突然変異を次第に蓄積していくことが見出された（データは非図示）。この傾向は、パルボウィルス開始因子（ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ：ＰＩＦ）への結合部位を構成する隣接したＡＣＧＴモチーフ（図１Ａ、四角に囲まれている部分）がＪａｂＣＧ１内に存在するためであると仮定された（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ Ｊ， Ｃｏｔｍｏｒｅ ＳＦ， Ｔａｔｔｅｒｓａｌｌ Ｐ． Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ＰＩＦ： ａ ｎｏｖｅｌ ｈｕｍａｎ ＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ ｗｈｉｃｈ ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｌｙ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｓ ｔｗｏ ＡＣＧＴ ｍｏｔｉｆｓ． Ｊ Ｖｉｒｏｌ １９９７；７１：５７３３−４１）。これは、本質的な機能を発揮するゲノムの左端起点への結合が可能なＰＩＦの濃度を下げ、挿入においてＰＩＦに結合しない突然変異を選択したためとも思われる。この見解に一致して、（ＰＩＦ結合部位とのホモロジに欠ける）ＪａｂＣＧ２とＪａｂＧＣ変異体は、複数回の継代を通して安定であった（データは非図示）。
【００４６】
（ゲノム力価で）同量を使用した場合、ＪａｂＣＧ１、２及びＪａｂＧＣ変異体は、親ウィルスとして、複製能、及びトランスフェクトＮＢＨ細胞を殺す能力において同等であった（図１Ｂ及びＣ）。従って、挿入は、腫瘍溶解及び増殖のためのウィルスの能力を損なうものではなかった。感染細胞内におけるウィルスＤＮＡのメチル化状態を、メチル化感受性酵素を用いた制限消化により決定した（ＲＦＬＰ分析）。単量体及び二量体のウィルス複製形態（図１Ｄ）は、ＤｐｎＩ消化に抵抗性である。一方、ウィルスＤＮＡはＨｐａＩＩに感受性であり、ＪａｂＣＧウィルスはＣｐＧ挿入に限定された特定部位（ＡＡＣＧＴＴ）を認識するＡｃｌＩに感受性である。要するに、これらの結果は、ウィルスＤＮＡ複製生成物、特に、組み込まれたＣｐＧモチーフ内に存在するシトシン残基が、ＴＬＲ９活性化の誘発に必要であるメチル化をほとんど受けていなかったことを示している（Ｋｒｉｅｇ ＡＭ、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ ２００６；５：４７１−８４）。結論として、Ｈ−１ＰＶゲノムに追加されたＣｐＧモチーフは、ウィルス複製又は細胞病原性を損なうことがなく、ＴＬＲ９レセプタとの相互作用に好適な非メチル化状態を維持していた。
【００４７】
実施例３．野生型及び変異Ｈ−１ＰＶのＤＮＡによるマクロファージ及びＨＥＫＴＬＲ９細胞のＴＬＲ９依存的活性化
次に、異なるウィルスから単離された一本鎖ＤＮＡの、ＩＦＮ−γで予め活性化されたＲＡＷ２６４．７マクロファージからの酸化窒素の放出を刺激する能力について試験した（Ｌｕｎｄｂｅｒｇ Ｐ，Ｗｅｌａｎｄｅｒ Ｐ，Ｈａｎ Ｘ，Ｃａｎｔｉｎ Ｅ．Ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １ ＤＮＡ ｉｓ ｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ２００３；７７：ｌ１１５８−６９）。細胞は、ＲＴ−ＰＣＲによりＴＬＲ９ｍＲＮＡが陽性であること（データは非図示）、及び大腸菌ＤＮＡに機能的に反応する（図２Ａ）ことを確認した。ＲＡＷ２６４．７細胞を、クローニング（図１Ａ参照）に使用したものと同じフラグメントを有するホスホロチオエートオリゴヌクレオチド（ＰＴＯ−ＣＧ１、ＰＴＯ−ＣＧ２、ＰＴＯ−ＧＣ）、又はそれぞれのウィルス（ＪａｂＣＧ１、−ＣＧ２、−ＧＣ又はＨ−１ＰＶ）から単離したｓｓＤＮＡと一緒に培養し、放出されるＮＯを測定した。ＣｐＧ−２８（既に報告されている活性化因子オリゴヌクレオチド：Ｍｅｎｇ Ｙら、Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ２００５；ｌ１６：９９２−７）及び大腸菌ＤＮＡを陽性対照として使用した。図２Ａに示すように、パルボウィルスＤＮＡの追加されたＣｐＧモチーフもまた、活性化能を示した。ＪａｂＣＧ２のｓｓＤＮＡは、ＪａｂＣＧ１よりも含有するＣｐＧモチーフが少ないにも拘らず（６対１３）、その刺激活性は高かった。このことは、これらのモチーフがＪａｂＣＧ１の増殖の間に突然変異を起こした事実と一致する。リポソーム形成剤でのトランスフェクトは、改良エンドソーム送達を通じて微生物ＤＮＡの刺激効果を促進することができるという以前の報告（Ｄａｌｐｋｅ Ａ，Ｆｒａｎｋ Ｊ，Ｐｅｔｅｒ Ｍ，Ｈｅｅｇ Ｋ．Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ９ ｂｙ ＤＮＡ ｆｒｏｍ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｓｐｅｃｉｅｓ．Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ２００６；７４：９４０−６）に一致して、リポフェクタミンを使用してＨ−１ＰＶのｓｓＤＮＡ又はそのＣｐＧ含有誘導体で細胞をトランスフェクトすると、細胞取り込み（ＰＣＲで評価）が高かった（図２Ｂ、下のパネル）。それに応じて、ＲＡＷ２６４．７からのＮＯの放出が上昇した。
【００４８】
ＪａｂＣＧのＤＮＡによるＲＡＷ２６４．７細胞の活性化能が、取り込まれたＣｐＧモチーフをＴＬＲ９が認識することによることを確認するために、マウスＴＬＲ９ｃＤＮＡで安定にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞に対する前記ｓｓＤＮＡの刺激作用を測定した。ＨＥＫ２９３細胞は、通常、いずれのＴＬＲも発現しないので、ＴＲＬ９活性化は、安定に取り込まれたＮＦ−κＢにより促進されるレポータ遺伝子（ルシフェラーゼ）の誘導を介して測定することができた。図２Ｂに示すように、ＪａｂＣＧ１由来ｓｓＤＮＡ及びＪａｂＣＧ２由来ｓｓＤＮＡは、ＪａｂＧＣ由来ｓｓＤＮＡ、陰性対照オリゴヌクレオチド（ｃＧｐＣ−１８２６）及び培地と比較して、有意に高いレベルにルシフェラーゼ発現を誘導した。しかし、ＪａｂＣＧのＤＮＡは、陽性対照オリゴヌクレオチド（ｓＣｐＧ−１８２６）よりも非常に低い活性化効果しか示さず、これは、μｇＤＮＡ当たりのＣｐＧモチーフ量が低いためと考えられた。これらのデータから、Ｈ−１ＰＶｓｓＤＮＡは免疫細胞の活性化を誘発する能力を有し、ＣｐＧ含有がＴＬＲ９活性化を介してこの能力を強めることが結論付けられた。
【００４９】
実施例４．パルボウィルスをＣｐＧモチーフで武装することによる腫瘍抑制力の改善
これらの結果に基づき、挿入されたＣｐＧモチーフの、生体内におけるＨ−１ＰＶの免疫修飾及び癌抑制活性に対する影響を調べた。標的腫瘍に対する直接的な腫瘍溶解効果がない状態でパルボウィルスの免疫刺激能を評価可能なラット肺肝癌転移確立モデルを使用した。感染がない場合に転移に対して限定的な防御しか示さない、Ｘ線照射自己腫瘍細胞（ＭＨ３９２４Ａ）を含むワクチンと共に投与した場合の、Ｈ−１ＰＶ由来Ｊａｂ突然変異体投与のアジュバント効果について試験した。放射線照射前のワクチンにウィルスを生体外で播種し、転移癌を有するラットに皮下注射した。この方法では、処理ラットの肺におけるウィルスはＲＴ−ＰＣＴでは検出できず、肺転移癌に対する腫瘍溶解効果は見られなかったため、該ウィルスは明らかにワクチンアジュバントとしてのみ作用可能であった。図３Ａに示すように、細胞性ワクチンの治療効果は、アジュバントウィルスがＨ−１ＰＶ、ＪａｂＧＣ、又はＪａｂＣＧ１である場合に、わずかな、ほとんど有意差のない程度に改善されるのみであった。このことは、これらのウィルスにおけるＣｐＧモチーフの欠如又は段階的な消失と一致する。反対に、ＪａｂＣＧ２感染ワクチンは、非処理の対照と比較して、転移率を５０％以上低下させた。ＪａｂＣＧ２ワクチンで処理した群では、２ｍｍ以上の大きさの結節の数が非常に少ないのに加えて、大きな壊死結節（５ｍｍ以上）は見られなかった。その他の処理群では、逆に、この進行した疾患が多くみられた。細胞性免疫応答の活性化を示すマーカ（ＩＦＮ−γ）、及び樹状細胞の成熟を示すマーカ（ＣＤ８０，ＣＤ８６）の発現を、転移癌が位置する肺につながる縦隔リンパ節のＲＴ−ＰＣＲにより測定した。図３Ｂに示すように、これらの自然及び獲得免疫応答の指標は、ＪａｂＣＧ２処理群において強く誘導され、好ましい疾患の転帰と相関した。最も興味深いことに、ＪａｂＣＧ１処理群でそのようなマーカの上昇ほとんど示さない動物においても、ほとんど転移が認められなかった。これらの結果は、免疫活性化の向上をもたらすＣｐＧモチーフによりパルボウィルスを武装することにより、パルボウィルスの抗腫瘍能を更に強化することが可能であることが強く示唆した。このことは、その改善アジュバント効果及び治療効果が、複数回継代しても挿入されたＣｐＧモチーフを維持することと明らかに相関していることから、ＪａｂＣＧ２ウィルスにおいて最もよく実証される。
【００５０】
ヒトメラノーマのパルボウィルス腫瘍溶解物は、凍結融解抽出物よりも、樹状細胞の成熟を強く活性化することが近年明らかにされた（Ｍｏｅｈｌｅｒ ＭＨ，Ｚｅｉｄｌｅｒ Ｍ，Ｗｉｌｓｂｅｒｇ Ｖ，Ｃｏｒｎｅｌｉｓ ＪＪ， Ｗｏｅｌｆｅｌ Ｔ， Ｒｏｍｍｅｌａｅｒｅ Ｊ，Ｇａｌｌｅ ＰＲ，Ｈｅｉｋｅ Ｍ．Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ Ｈ−１−ｉｎｄｕｃｅｄ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｖｉａ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ，ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｃｒｏｓｓ−ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ ｂｙ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２００５；１６：９９６−１００５）。この効果は、感染腫瘍細胞のＨＳＰ７２発現の誘導に相関することが見出されている。本結果は、パルボウィルスの免疫刺激活性が、ＣｐＧモチーフをウィルスゲノムに追加することによって強化されることを示している。このことは、推定上のウィルス誘導細胞因子に加えて、ウィルス構成成分が免疫調節に寄与することを意味する。これらの構成成分は、感染腫瘍細胞により産生されるウィルスＤＮＡ種を含む可能性が高い。
【００５１】
Ｈ−１ＰＶゲノムは小さいため、パッケージングを妨げることなく導入できるＣｐＧモチーフの数は制限される。それにもかかわらず、追加する活性化因子ＣｐＧモチーフの数を２倍にすることが可能であり、更に、Ｈ−１ＰＶの腫瘍溶解能を更に改良することが可能であると思われる。これは、代替コドンの使用によるモチーフの生成又はｐ３８プロモータにあるウィルスイントロンにより達成される。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、野生型ゲノムには存在しない少なくとも２つの追加のＣｐＧモチーフを有するＣｐＧ含有ゲノムを特徴とする、パルボウィルスに関する。本発明はまた、癌治療のための上記パルボウィルスの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
げっ歯類パルボウィルス等の腫瘍溶解性ウィルスは、新しい癌治療のツールである。癌細胞を特異的に殺す（腫瘍溶解）他、免疫システムを刺激する危険信号を出してウィルス感染腫瘍を排除する。腫瘍溶解現象の結果、自然及び獲得免疫システムが腫瘍抗原に近づくことができるようになり、クロスプライミングやワクチン接種効果をもたらす。げっ歯類パルボウィルスは、「固有の」腫瘍溶解活性を有する、すなわち、ネズミ及びヒト両起源の癌細胞内で選択的に複製して癌細胞を殺す、一本鎖ＤＮＡウィルスである。（非特許文献１）。ヒトへの臨床応用の最も有望な（Ｈ−１ＰＶを含む）候補は、更にその抗癌効果が改善される必要がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ｒｏｍｍｅｌａｅｒｅ Ｊ，Ｇｉｅｓｅ Ｎ，Ｃｚｉｅｐｌｕｃｈ Ｃ，Ｃｏｒｎｅｌｉｓ ＪＪ．Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ ａｓ ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ ａｇｅｎｔｓ．Ｉｎ： Ｓｉｎｋｏｖｉｃｓ ＪＧ，Ｈｏｒｖａｔｈ ＪＣ，ｅｄｓ．Ｖｉｒａｌ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｃａｎｃｅｒｓ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ；２００５，６２７−７５．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
従って、本発明は、治療用の改良パルボウィルスを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明によれば、前記課題は特許請求の範囲に記載の内容により達成される。本発明は、腫瘍溶解とワクチン接種の有益な特長を組み合わせることによって改良腫瘍溶解ウィルスを生成できるという発見に基づいている。腫瘍溶解パルボウィルスベクタは、ウィルスゲノムの増幅を介して腫瘍細胞内に選択的に当該ウィルスベクタが蓄積するように、ゲノム内に追加のＣｐＧモチーフを有するように設計した。すなわち、Ｈ−１ＰＶのＣｐＧモチーフ含有誘導体を作製し、既に確立された肝癌肺転移ラットモデルにおける自己抗腫瘍ワクチンの効果を強化する能力について、その親ウィルスと比較した（Ｒａｙｋｏｖ Ｚ，Ｂａｌｂｏｎｉ Ｇ，Ａｐｒａｈａｍｉａｎ Ｍ，Ｒｏｍｍｅｌａｅｒｅ Ｊ．Ｃａｒｒｉｅｒ ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ ｆｏｒ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ．Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ２００４；ｌ０９：７４２−９）。親ウィルスの複製能と腫瘍溶解特性の両方を保持した、２つのＣｐＧ含有Ｈ−１ＰＶ変異体（ＪａｂＣＧ１及びＪａｂＣＧ２）を作製した。該ウィルスを、担癌動物に皮下注射する前のワクチンに生体外で植菌した。これは、Ｈ−１ＰＶが有意な腫瘍溶解効果を直接転移癌に対して発揮せず、本質的に抗腫瘍免疫応答を誘発するワクチンを効果的に調節するアジュバントとして作用する条件である（Ｒａｙｋｏｖ Ｚ，Ｇｒｅｋｏｖａ Ｓ，Ｇａｌａｂｏｖ ＡＳ，Ｂａｌｂｏｎｉ Ｇ，Ｋｏｃｈ Ｕ，Ａｐｒａｈａｍｉａｎ Ｍ，Ｒｏｍｍｅｌａｅｒｅ Ｊ．Ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ ａｎｄ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ Ｈ−１ ｉｎ ａ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｔｕｍｏｒ ｍｏｄｅｌ．Ｏｎｃｏｌ Ｒｅｐ ２００７；ｌ７：１４９３−９）。増加したＣｐＧ含量を維持した状態では、ＪａｂＣＧ１及びＪａｂＣＧ２ゲノムは、野生型Ｈ−１ＰＶのＤＮＡに比較して、生体外でＴＬＲ９仲介シグナル伝達を強力に誘導することが証明された。抗腫瘍活性は、皮下投与する自己ワクチンのアジュバントとして親及び変異ウィルスを生体外で植菌して、肝癌肺転移ＭＨ３９２４Ａのラットモデルで評価した。
【０００６】
転移癌への直接的な腫瘍溶解効果が排除されたこの設定では、ＪａｂＣＧ２ベクタは免疫原性が増進されており、縦隔（腫瘍所属）リンパ節での細胞性免疫（ＩＦＮ−γ）及び樹状細胞活性化（ＣＤ８０、ＣＤ８６）のマーカが増加した。このことは、他のワクチン接種スケジュール（Ｈ−１ＰＶ−、ＪａｂＣＧ１−、ＪａｂＧＣ−、又は模擬処理細胞）と比較して、著しい転移率の低下（５０％）を導いた。ＣｐＧモチーフは、ウィルスの複製能と腫瘍細胞溶解能を損なうことなく、Ｈ−１ＰＶゲノムに追加することができる。最も興味深いことに、Ｈ−１ＰＶ等のパルボウィルスは、ＣｐＧモチーフを追加することにより、野生型ウィルスではほとんど効果を示さない条件下でも、感染腫瘍細胞を転換してワクチンが発生する免疫刺激の状態及び転移抑制の状態にする能力があるように改善することができた。これは、ウィルス誘発腫瘍抑制が、ウィルスゲノムの活性化因子ＣｐＧモチーフの数を変更することによって促進され、生体内での免疫刺激につながることを最初に示したものである。
【０００７】
要するに、本データは、腫瘍溶解ウィルスにおける免疫刺激性ＣｐＧモチーフの数を増やすことで抗腫瘍ワクチン接種により誘導される抗癌効果を全体的に改善することが可能であることを示す。パルボウィルスは腫瘍細胞内で選択的に複製するため、ＣｐＧモチーフの増幅は腫瘍部位に限定され、副作用のリスクを最小にする。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】ＣｐＧ変異ウィルスの構築と生体外特性を示す。（Ａ）ｐＳＲ１９ベクタのＨｐａＩ部位でクローン化されたＣｐＧ含有フラグメント（ＣｐＧモチーフは太字で示す）の配列を示す。キャプシド（ＶＰ１／２）、非構造蛋白質（ＮＳ１／２）遺伝子及びそれらのプロモータ（Ｐ４、Ｐ３８）の位置と共にＨ−１ＰＶゲノム構成を模式的に示す。ＨｐａＩＩ及びＡｃｌＩ制限部位の位置も示す。ＪａｂＣＧ１の四角で囲まれている配列はＰＩＦ結合モチーフを示す。（Ｂ）異なるＣｐＧウィルス（ＪａｂＣＧ１、ＪａｂＣＧ２、ＪａｂＧＣ）又は参照用の野生型Ｈ−１ＰＶによる（１細胞当たり１複製ユニットの多重度での）感染の４８時間後のＮＢＫ細胞から採取したウィルスＤＮＡのサザンブロット分析の結果を示す。ウィルス一本鎖ＤＮＡ（ｓｓ）、モノマ（ｍＲＦ）、及びダイマ（ｄＲＦ）の複製型の位置を示す。（Ｃ）ＭＴＴアッセイにより測定された生存細胞を、模擬処理培養に対するウィルス処理培養の生細胞の百分率として示す。ＮＢＫ細胞（９６ウェルプレートに２×１０３細胞／ウェルで播種）は、記載された感染多重度（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｉｅｓ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ：ＭＯＩ）でＨ−１ＰＶ又はＣｐＧ変異ウィルスを接種し、７２時間後に分析した。図に示す値は、４重測定の平均値である。（Ｄ）ＪａｂＣＧ２又はＨ−１ＰＶで感染（ＭＯＩ：１）した４８時間後のＮＢＫ細胞から抽出したウィルスＤＮＡのメチル化状態を示す。精製後、ウィルスＤＮＡを示した制限酵素で処理した（又は処理しなかった）。ウィルス複製型の存在及び消化後の大きさの変化を矢印で示す。結果は、３回の実験の代表的なものを示す。
【図２】野生型及び変異Ｈ−１ＰＶのＤＮＡによるマクロファージ及びＨＥＫＴＬＲ９細胞のＴＬＲ９依存活性化を示す。（Ａ）ＲＡＷ２６４．７マクロファージからのＮＯ放出を示す。細胞（９６ウェルプレート中、１×１０５細胞／ウェル）を、示したオリゴヌクレオチド（ＣｐＧ−２８、ＰＴＯＣＧ１、ＰＴＯＣＧ２、及びＰＴＯＧＣ）５μｇ／ｍＬ又はウィルスｓｓＤＮＡ（ＪａｂＣＧ１、ＪａｂＣＧ２、ＪａｂＧＣ、Ｈ−１ＰＶ）５μｇ／ｍＬで刺激する前に、組換えＩＦＮ−γ（１０Ｕ／ｍＬ）で一晩事前に活性化した。陽性対照として同じ濃度の大腸菌ＤＮＡを使用した。ＩＦＮ−γ又はリポフェクタミンを添加した（又は添加していない）培地（ＭＥＤ）で処理したＲＡＷ細胞を陰性対照とした。１８時間後にグレイス（Ｇｒｅｉｓｓ）反応を利用してＮＯレベルを決定した。ｓｓＤＮＡサンプルのあるものは、細胞に適用する前にリポフェクタミンＴＭ２０００（リポフェクタミン：１μｇ／ウェル）でプレインキュベートした。ＲＡＷ２６４．７細胞に取り込まれたｓｓＤＮＡは処理の１８時間後に、Ｈ−１ＰＶ及びＣｐＧ−変異ゲノムの両方に共通の１セットのプライマを使用して、ＰＣＲで検出した。（Ｂ）ウィルスＤＮＡ処理細胞におけるＴＬＲ９依存性シグナル伝達を示す。ｍＴＬＲ９を安定的に発現し、ＮＦκＢにより誘導されるホタルルシフェラーゼレポータ遺伝子を含有するＨＥＫ細胞を９６ウェルプレートに播種し（２×１０３細胞／ウェル）、表示したｓｓＤＮＡ（ＪａｂＣＧ１、ＪａｂＣＧ２、ＪａｂＣＧ：１０μｇ／ｍＬ）で刺激した。陰性及び陽性対照として、それぞれｃＧｐＣＯＤＮ−１８２６及びｓＣｐＧＯＤＮ−１８２６オリゴヌクレオチド（５μｇ／ｍＬ）で処理した。処理の６時間後に、ＴＬＲ９が仲介するＮＦκＢの誘導を細胞ライセートのルシフェラーゼ活性を測定することにより評価した。結果は、３回の独立した実験の平均値で示す。
【図３】ＣｐＧ変異ウィルスの生体内抗癌活性を示す。（Ａ）ラットに、第０日目にＭＨ３９２４Ａ腫瘍細胞を静脈注射し、１０日目にＨ−１ＰＶ又はＪａｂベクタに感染させた放射線照射自己細胞を皮下ワクチン接種し、３０日目に肺転移率を測定した。未処理動物との有意差（ｐ＜０．０５）をアスタリスクで示す。（Ｂ）前記動物群の縦隔リンパ節における免疫学的マーカ発現についてＲＴ−ＰＣＲで検出した結果を示す。各ラットから得られたデータを、レーン上に記載した対応する転移癌（直径２ｍｍ以上）の数と共に示す。サンプルは、β−アクチンを参照にして、整合させた。
【０００９】
このように、本発明は、野生型ゲノムには存在しないＣｐＧモチーフを少なくとも１つ含有する、ＣｐＧモチーフ含有ゲノムを特徴とするパルボウィルス（及びパルボウィルスに基づくベクタ）を提供する。
【００１０】
本明細書で使用される用語「パルボウィルス」は、野生型及び複製能を有するその変異誘導体に加え、それらのウィルス又は誘導体に基づく関連ウィルス又はベクタを含む。好適なパルボウィルス、誘導体等、及び、前記パルボウィルスを産生するために用いることができる細胞は、過度の実験を行うことなく、本明細書の開示に基づいて当該技術分野における知識の範囲内で容易に決定することができる。
【００１１】
用語「ＣｐＧモチーフ」は、５’−ＣＧ−３’ダイマからなるか、又は、当該ダイマを有するオリゴヌクレオチドを意味し、好ましくはＤＮＡである。
【００１２】
用語「ゲノムが、野生型ゲノムには存在しない少なくとも１つの・・・追加のＣｐＧモチーフを含有する」とは、（ａ）パルボウィルスが腫瘍細胞内で増殖し、広がる能力を維持し、かつ（ｂ）腫瘍溶解及び／又は細胞病原性が損なわれていない状態で、当該パルボウィルスのゲノムが追加のＣｐＧモチーフを含有することを意味する。
【００１３】
下記実施例に示された情報に基づいて、当業者は、アジュバント及び治療効果を高める、（ａ）適切なＣｐＧモチーフ挿入部位、及び（ｂ）ＣｐＧモチーフの最適数を決定することができる。
【００１４】
個々のＣｐＧモチーフ間の好適な距離は、１〜２００ｎｔの範囲である。
【００１５】
本発明の好ましい実施形態では、パルボウィルスは、野生型ゲノムには存在しない追加のＣｐＧモチーフを２〜３０個、より好ましくは６〜１２個含有する。特に好ましい実施形態では、パルボウィルスは、野生型ゲノムには存在しない追加のＣｐＧモチーフを６個含有する。
【００１６】
本発明の他の好ましい実施形態では、追加のＣｐＧモチーフは、遺伝子のイントロン又は３’非翻訳領域に挿入される。当業者は、本発明の目的に有用な様々なパルボウィルスのゲノムの公知ヌクレオチド配列に基づいて、ＣｐＧモチーフの好適な挿入部位を容易に決定することができる。更に、ＣｐＧモチーフの挿入は、例えば、部位特異的突然変異生成法等の一般的手順により行うことができる。
【００１７】
本発明のパルボウィルスの更に好ましい実施形態では、ＶＰ転写ユニットの３’末端の非翻訳領域にＣｐＧモチーフを挿入する。または、ＣｐＧモチーフに富むパルボウィルスゲノムは、代わりのコドンを使用することによって得てもよい。例えば、（アルギニンをコードする）ＡＧＡコドンは、ＣＧＡ、ＣＧＴ、ＣＧＧ又はＣＧＣコドンと置換することができ、また、アミノ酸配列Ａｓｐ−Ｖａｌに対してＡＡＣ−ＧＴＴコドンを使用することもできる。
【００１８】
本発明のパルボウィルスの更により好ましい実施形態では、ＣｐＧモチーフは、ＡＡＣＧＴＴ又はＧＴＣＧＴＴのヌクレオチド配列を有する。
【００１９】
特に好ましい実施形態では、本発明のパルボウィルスは、ＶＰ転写ユニットの３’末端の非翻訳領域内に３つのＡＡＣＧＴＴモチーフと３つのＧＴＣＧＴＴモチーフとを有する。
【００２０】
最も好ましい実施形態の一つにおいては、本発明のパルボウィルスはＨ−１ＰＶに基づいており（すなわち、Ｈ−１ＰＶ由来）、ＶＰ転写ユニットの３’末端の非翻訳領域内にヌクレオチド配列、５’−ＧＴＴＡＡＣＧＴＴＴＡＣＡＧＣＴＧＡＣＴＡＧＴＣＧＴＴＴＧＣＴＣＡＧＴＣＴＡＡＣＧＴＴＣＴＴＧＴＣＴＡＴＴＧＴＣＧＴＴＴＡＣＴＡＧＴＣＴＣＴＴＡＡＣＧＴＴＴＣＡＴＣＴＡＣＴＴＧＴＣＧＴＴＡＡＣ−３’を有する。
【００２１】
特に有用なパルボウィルスは、パルボウィルスＨ１（Ｈ−１ＰＶ）、又はＬｕＩＩＩ、マウス微小ウィルス（ｍｏｕｓｅ ｍｉｎｕｔｅ ｖｉｒｕｓ：ＭＭＶ）、マウスパルボウィルス（ｍｏｕｓｅ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ：ＭＰＶ）、ラット微小ウィルス（ｒａｔ ｍｉｎｕｔｅ ｖｉｒｕｓ：ＲＭＶ）、ラットパルボウィルス（ｒａｔ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ：ＲＰＶ）、若しくはラットウィルス（ｒａｔ ｖｉｒｕｓ：ＲＶ）等の関連するげっ歯類パルボウィルスである。
【００２２】
本発明はまた、本発明のパルボウィルス、又は、該パルボウィルスを産生する、例えば、ヒト２９３（Ｔ）、ＮＢＫ、ラットＲＧ２等の細胞を含有する医薬組成物（パルボ治療薬：ｐａｒｖｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｇｅｎｔ）を提供する。
【００２３】
投与のために、パルボ治療薬は他の好適な医薬担体と組み合わせることができる。本技術分野において周知であり、市販で容易に入手できる好適な医薬担体としては、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液、水、油／水乳液等の乳液、種々の湿潤剤、殺菌溶液等を挙げることができる。そのような担体は、好適な用量を患者に投与するために、パルボ治療薬を用いて従来の製剤方法により製剤化することができる。
【００２４】
追加の薬学的に適合する担体としては、ゲル、生体吸収可能なマトリクス材、治療剤含有移植用構成物、又は他の好適な運搬媒体、送達又は調剤の手段又は物質を含むことができる。
【００２５】
本発明のパルボ治療薬により治療可能な患者には、ヒトだけでなく、非ヒト動物も含まれる。非ヒト動物は、これに限定されるものではないが、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、イヌ、及びネコ等の動物を含む。
【００２６】
パルボ治療医薬組成物の患者、例えば、脳腫瘍患者への投与は、種々の好適な方法、例えば、静脈内、腹腔内、皮下、筋内、局所、皮内、頭蓋内及び腫瘍内投与のいずれかにより行うことができる。当然のことながら、投与経路は疾患の状態、医薬組成物に含有される特定の治療剤により異なる。
【００２７】
そのようなパルボ治療薬が血液脳関門を通過できる感染性ウィルス粒子を有する場合、該ウィルス治療剤、例えばＨ１−ＰＶの静脈注射により治療を行うか、又は少なくとも治療を開始する。
【００２８】
長期の静脈注射治療は、ウィルス治療薬に対する中和抗体の形成の結果、効果を失いやすいため、静脈内投与によるウィルスの初回投与後に他の投与方法を採用することができる。または、そのような他の投与方法、例えば、頭蓋内又は腫瘍内ウィルス投与を、パルボウィルス処理の全工程を通して使用することもできる。
【００２９】
その他の具体的投与方法としては、パルボ治療薬（ウイルス、ベクタ及び／又は細胞剤）は、患者に移植された放出源から患者に投与することができる。例えば、シリコーンや他の生体適合性物質のカテーテルを、腫瘍を摘出する際、又はこれと独立した手順によって患者に埋め込まれた小さな皮内リザーバ（リッカム（Ｒｉｃｋｈａｍ）リザーバ）に連結し、更なる外科的介入を必要とせずに、パルボ治療用組成物を局所的に、様々な回数注入することができる。パルボウイルス又はそれに由来するベクタは、定位手術法又はニューロナビゲーション標的法により、例えば腫瘍に、注入することもできる。
【００３０】
パルボウィルス剤又は組成物の投与は、埋め込み式カテーテルを介して、蠕動輸液ポンプや対流増進送達（ＣＥＤ）ポンプ等の適当なポンプシステムを使用して、低流速でウィルス粒子又はウィルス粒子を含有する液を持続的に注入することにより行うこともできる。
【００３１】
更に他のパルボ治療組成物の投与方法では、パルボ治療薬を目的の局所、例えば腫瘍に投与するように構築、配置した埋め込み式デバイスから投与する。例えば、パルボウイルスＨ１などのパルボ治療組成物を含浸させたウエハを用いることができ、当該ウエハは、外科的腫瘍摘出の結果生じた切除腔の端に取り付ける。そのような治療介入では複数のウエハを使用することができる。
【００３２】
パルボウィルスＨ１やＨ１ベクタ等のパルボ治療剤を活発に産生する細胞を、腫瘍等の目的組織や腫瘍摘出後の腫瘍腔に注入することもできる。
【００３３】
前記投与方法の２つ以上を、例えば、並行して、同時に、又は逐次的になど、適当な方法で組み合わせて用いることもできる。
【００３４】
パルボ治療薬の投与レジメンは、患者データ、診断の他、例えば、患者の大きさ、体表面積、年齢、性別、投与される特定のパルボウイルスや細胞など、投与時間や経路、腫瘍の種類や特性等の疾患の種類、患者の全体的な健康状態、及び、患者が受けている他の薬剤又は治療等の、他の臨床因子に基づいて、担当医の下、当業者の技術の範囲で容易に決定することができる。
【００３５】
従って、本発明はまた、腫瘍治療用医薬組成物の製造のための、本発明のパルボウィルス又は前記パルボウィルスを産生する細胞の使用に関する。腫瘍としては、好ましくは、本発明のパルボ治療薬による治療に特に適していると考えられる、膵臓癌、肝臓癌及びリンパ腫である。
【００３６】
下記実施例により本発明をより詳細に説明する。
【００３７】
実施例１．材料及び方法
（Ａ）試薬
制限酵素は、ニューイングランドバイオラボ（フランクフルト、ドイツ）から購入した。ＰＣＲプライマとホスホロチオエートオリゴヌクレオチド［ＣｐＧ−２８（Ｍｅｎｇ Ｙ，Ｃａｒｐｅｎｔｉｅｒ ＡＦ，Ｃｈｅｎ Ｌ， Ｂｏｉｓｓｅｒｉｅ Ｇ，Ｓｉｍｏｎ ＪＭ，Ｍａｚｅｒｏｎ ＪＪ，Ｄｅｌａｔｔｒｅ ＪＹ．Ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｏｃａｌ ＣｐＧ−ＯＤＮ ａｎｄ ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｇｌｉｏｍａ．Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ２００５；ｌ１６：９９２−７）、ＰＴＯ−ＣＧ１、ＰＴＯ−ＣＧ２、ＰＴＯ−ＧＣ］は、ＭＷＧ（Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇ、ドイツ）により合成された。大腸菌ＤＮＡ、ＩＦＮ−γ、並びに刺激オリゴヌクレオチド（ｓＣｐＧＯＤＮ−１８２６）（Ｋｒｉｅｇ ＡＭ． Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ９ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ． Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ ２００６；５：４７１−８４）及び対照ｃＧｐＣＯＤＮ−１８２６オリゴヌクレオチド（反転ＧｐＣモチーフを有する）は、インビボジェン（フランス）から入手した。リポフェクタミンＴＭ２０００はインビトロジェン（Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ、ドイツ）から購入した。他の試薬は全てシグマ（Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｎ、ドイツ）から入手した。
【００３８】
（Ｂ）細胞培養処理及びアッセイ
マウスＴＬＲ９レセプタを安定的に発現するヒト胎児腎臓細胞株ＨＥＫ−ＴＬＲ９は、Ｓｔｅｆａｎ Ｂａｕｅｒ博士（Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、ミュンヘン、ドイツ）（Ｆｉｓｃｈｅｒ ＳＦ，Ｒｅｈｍ Ｍ，Ｂａｕｅｒ Ａ，Ｈｏｆｌｉｎｇ Ｆ，Ｋｉｒｓｃｈｎｅｋ Ｓ，Ｒｕｔｚ Ｍ，Ｂａｕｅｒ Ｓ，Ｗａｇｎｅｒ Ｈ，Ｈａｃｋｅｒ Ｇ．Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ９ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｃａｎ ｓｅｎｓｉｔｉｚｅ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ｆｏｒ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｌｅｔｔ ２００５；９７：ｌ１５−２２）より供与された。ＨＥＫ−ＴＬＲ９、２９３Ｔ及びＮＢＫ線維芽細胞株は、マクロファージＲＡＷ２６４．７細胞（ＡＴＣＣ、マサチューセッツ州、米国）と同様、ＤＭＥＭ中で培養した。ＡＣＩラット肝癌細胞株ＭＨ２９３４Ａ（Ｒａｙｋｏｖ Ｚら、Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ２００４；ｌ０９：７４２−９）は、ＲＰＭＩ中で培養した。これら培地は、全てシグマ社から入手し、ＦＣＳ（１０％）、ペニシリン（１００ユニット／ｍＬ）及びストレプトマイシン（１０ｍｇ／ｍＬ）を添加した。
【００３９】
異なるウィルス分離体の細胞変性作用を、感染の７２時間後のＮＢＫ細胞についてＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾイル-２）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）細胞毒性分析を行うことにより評価した。ＭＨ２９３４Ａ細胞培養物は、注入前に１５Ｇｙのγ線を照射した。両方法も以前記載した方法（Ｒａｙｋｏｖ Ｚら、Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ２００４；ｌ０９：７４２−９）で行った。ＲＡＷ２６４．７マクロファージ培養上清中のＮＯレベルの測定は、Ｆａｉｓｓｔ Ｓら，Ｆａｉｓｓｔ ＳＲ，Ｄｕｐｒｅｓｓｏｉｒ Ｔ，Ｐｌａｚａ Ｓ，Ｐｕｊｏｌ Ａ，Ｊａｕｎｉａｕｘ ＪＣ，Ｒｈｏｄｅ ＳＬ，Ｒｏｍｍｅｌａｅｒｅ Ｊ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｆｕｌｌｙ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｖａｒｉａｎｔ ｏｆ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ Ｈ−１ ｓｕｐｐｌａｎｔｉｎｇ ｔｈｅ ｓｔａｎｄａｒｄ ｓｔｒａｉｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ １９９５；６９：４５３８−４３で報告されているように、グレイス（Ｇｒｅｉｓｓ）呈色反応により行った。ルシフェラーゼは以前記載した（Ｆｉｓｃｈｅｒ ＳＦら、Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｌｅｔｔ ２００５；９７：ｌ１５−２２）ように測定した。リポフェクタミンＴＭ２０００トランスフェクションは、製造者の指示書に従って行った。
【００４０】
（Ｃ）ウィルス及びウィルスＤＮＡ分析
ＪａｂＣＧ１、ＪａｂＣＧ２、及びＪａｂＧＣベクタは、図１Ａに示したＨｐａＩ消化フラグメントを、感染Ｈ−１ＰＶ分子クローンであるｐＳＲ１９ベクタに挿入して構築した（Ｆａｉｓｓｔ Ｓら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ １９９５；６９：４５３８−４３）。ウィルスベクタは、Ｆａｉｓｓｔ Ｓら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ １９９５；６９：４５３８−４３に記載されたように、２９３Ｔ細胞をそれぞれのプラスミドでトランスフェクトした後、ＮＢＫ細胞への感染させ、精製してエンドトキシン濃度を２．５ＥＵ／ｍＬ未満として調整した。ウィルスは、ＮＢＫ細胞を用いた感染中心アッセイ（ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｃｅｎｔｒｅ ａｓｓａｙ）により力価測定した。ハート抽出法（Ｈｉｒｔ'ｓ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）により、精製ビリオン又は感染ＮＢＫ細胞からウィルスＤＮＡを単離した。複製可能なウィルスＤＮＡ構造を酵素消化し、サザンブロッティング（Ｒｕｓｓｅｌｌ ＳＪ， Ｂｒａｎｄｅｎｂｕｒｇｅｒ Ａ， Ｆｌｅｍｍｉｎｇ ＣＬ， Ｃｏｌｌｉｎｓ ＭＫ， Ｒｏｍｍｅｌａｅｒｅ Ｊ． Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ｇｅｎｅｓ ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ ｂｙ ａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ． Ｊ Ｖｉｒｏｌ １９９２；６６：２８２１−８）により解析した。ＤｐｎＩ酵素は、Ｈ−１ＰＶゲノムの複数部位に存在する、ＧＡ‘ＴＣ配列のメチル化（‘）ＤＮＡのみを切断する。ＨｐａＩＩ酵素は、そのうち５つがウィルスゲノムの右端に位置する、非メチル化Ｃ’ＣＧＧモチーフでＤＮＡを分解する（図１Ａ参照）。ＡｃｌＩ酵素は、ＪａｂＣＧ２を生成する上で３コピーが挿入された（図１Ａ）、ＡＡＣ’ＧＴＴ配列内の非メチル化シトシンでのみＤＮＡを切断する。制限酵素反応は全て、製造者が推奨する条件下で行った。
【００４１】
（Ｄ）ＲＴ−ＰＣＲ
処理動物の縦隔リンパ節から全ＲＮＡを抽出し、以前報告した（Ｒａｙｋｏｖ Ｚら、Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ２００４；ｌ０９：７４２−９）ように、ｃＤＮＡに逆転写した。ラットｃＤＮＡの増幅には次のプライマを使用した：ＩＦＮ−γには、５’−ＡＴＣＴＧＧＡＧＧＡＡＣＴＧＧＣＡＡＡＡＧＧＡＣＧ−３’−フォワード、５’−ＣＣＴＴＡＧＧＣＴＡＧＡＴＴＣＴＧＧＴＧＡＣＡＧＣ−３’−リバース、ＣＤ８０には、５’−ＧＧＣＡＴＴＧＣＴＧＴＣＣＴＧＴＧＡＴＴＡＣ−３’−フォワード、５’−ＡＣＴＣＡＧＴＴＡＴＧＴＴＧＧＧＧＧＴＡＧＧ−３’−リバース、ＣＤ８６には、５’−ＧＣＴＣＧＴＡＧＴＡＴＴＴＴＧＧＣＡＧＧＡＣＣ−３’−フォワード、５’−ＣＧＧＧＴＡＴＣＣＴＴＧＣＴＴＡＧＡＴＧＡＧＣ−３’−リバース。対応するＰＣＲ生成物の大きさは、それぞれ２９０ｂｐ（ＩＦＮ−γ）、３１４ｂｐ（ＣＤ８０）、３３７ｂｐ（ＣＤ８６）であった。β−アクチン及びＨ−１ＰＶのＰＣＲのためのプライマ配列は、既に報告されている（Ｒａｙｋｏｖ Ｚら、Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ２００４；ｌ０９：７４２−９）。
【００４２】
（Ｅ）動物及び腫瘍モデル
既に報告したように（Ｒａｙｋｏｖ Ｚら、Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ２００４；ｌ０９：７４２−９）、麻酔したＡＣＩラットの大腿静脈を通してＭＨ３９２４Ａ細胞（１×１０５細胞／動物）を接種し、転移を誘起した。転移誘導の１０日後にワクチン接種した。ＭＨ３９２４Ａ細胞をそれぞれの精製ウィルスで感染させ又は感染させなかった。感染の２４時間後にＰＢＳで十分に洗浄後、細胞を放射線照射し、ラットに皮下注射した（１×１０６細胞／動物）。動物はワクチン接種の２０日後にサクリファイスした。胸腔を開いた後、気管にシリンジでカニューレを挿入し、肺に５〜６ｍＬの０．９％ＮａＣｌ中の２％墨汁溶液を吹き入れた。肺をフェケット溶液（Ｆｅｋｅｔｔｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ：５８％エタノール、３％ホルムアルデヒド、０．０４％氷酢酸）に浸した後、肺組織の黒い背景上に白い転移結節（大きさ：１〜２ｍｍ）を可視化した。組織表面上の結節を拡大鏡を用いて数えた。肺を切除後、縦隔リンパ節を摘出した。全ての実験は、ヨーロッパ及び現地ガイドラインに従って行った。
【００４３】
（Ｆ）統計
細胞生存、刺激及び転移発生について、平均値及び標準偏差を計算した。処理動物群における転移発生の統計的有意差は、一元配置分散分析し、パラメトリック不対スチューデントｔ−検定により評価した。個々の値の相違は、ｐ＜０．０５で有意であると判断した。分析には、Ｉｎｓｔａｔ２．００（登録商標）マッキントッシュソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，サンディエゴ，カリフォルニア州）を使用した。
【００４４】
実施例２．ＣｐＧ変異ウィルスの構築と生体外特性
２回目の感染により目的腫瘍に腫瘍溶解性ウィルスを拡散させるには複製能力が必須であるので、腫瘍細胞内で増殖及び拡散する能力を維持しているＣｐＧ含有パルボウィルスを構築した。Ｈ−１ＰＶゲノムはやや小さく、ウィルスの生活環において重要な機能を有する蛋白質をコードしている。従って、一連のＣｐＧ含有ＤＮＡはＶＰ転写ユニットの３’末端の非翻訳領域に挿入した。図１Ａに示すように、２つのＨ−１ＰＶ変異体（ＪａｂＣＧ１、ＪａｂＣＧ２）にクローン化された配列は、異なる数の２種類のＣｐＧモチーフ：ＡＡＣＧＴＴ（ネズミモデルで活性であると報告されている、普遍的な免疫活性化要素）（Ｍｅｎｇ Ｙら、Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ２００５；ｌ１６：９９２−７）及びＧＴＣＧＴＴ（ヒト細胞の活性化も示すモチーフ）（Ｓｉｖｏｒｉ Ｓ，Ｃａｒｌｏｍａｇｎｏ Ｓ，Ｍｏｒｅｔｔａ Ｌ，Ｍｏｒｅｔｔａ Ａ．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ＣｐＧ ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｃｌａｓｓｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅｉｒ ｃａｐａｂｉｌｉｔｙ ｔｏ ｓｔｉｍｕｌａｔｅ ｈｕｍａｎ ＮＫ ｃｅｌｌｓ．Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００６；３６：９６１−７）を含んでいた。第３の構築物（ＪａｂＧＣ）は、モチーフ内で逆（ＧＣ）方向になっており、対照として使用した。
【００４５】
２９３Ｔ細胞を前記構築物でトランスフェクトして形成されたウィルスのゲノム配列を決定した。許容細胞株及び動物の両者の継代により、ＪａｂＣＧ１ウィルスは、挿入されたＣｐＧモチーフに突然変異を次第に蓄積していくことが見出された（データは非図示）。この傾向は、パルボウィルス開始因子（ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ：ＰＩＦ）への結合部位を構成する隣接したＡＣＧＴモチーフ（図１Ａ、四角に囲まれている部分）がＪａｂＣＧ１内に存在するためであると仮定された（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ Ｊ， Ｃｏｔｍｏｒｅ ＳＦ， Ｔａｔｔｅｒｓａｌｌ Ｐ． Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ＰＩＦ： ａ ｎｏｖｅｌ ｈｕｍａｎ ＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ ｗｈｉｃｈ ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｌｙ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｓ ｔｗｏ ＡＣＧＴ ｍｏｔｉｆｓ． Ｊ Ｖｉｒｏｌ １９９７；７１：５７３３−４１）。これは、本質的な機能を発揮するゲノムの左端起点への結合が可能なＰＩＦの濃度を下げ、挿入においてＰＩＦに結合しない突然変異を選択したためとも思われる。この見解に一致して、（ＰＩＦ結合部位とのホモロジに欠ける）ＪａｂＣＧ２とＪａｂＧＣ変異体は、複数回の継代を通して安定であった（データは非図示）。
【００４６】
（ゲノム力価で）同量を使用した場合、ＪａｂＣＧ１、２及びＪａｂＧＣ変異体は、親ウィルスとして、複製能、及びトランスフェクトＮＢＨ細胞を殺す能力において同等であった（図１Ｂ及びＣ）。従って、挿入は、腫瘍溶解及び増殖のためのウィルスの能力を損なうものではなかった。感染細胞内におけるウィルスＤＮＡのメチル化状態を、メチル化感受性酵素を用いた制限消化により決定した（ＲＦＬＰ分析）。単量体及び二量体のウィルス複製形態（図１Ｄ）は、ＤｐｎＩ消化に抵抗性である。一方、ウィルスＤＮＡはＨｐａＩＩに感受性であり、ＪａｂＣＧウィルスはＣｐＧ挿入に限定された特定部位（ＡＡＣＧＴＴ）を認識するＡｃｌＩに感受性である。要するに、これらの結果は、ウィルスＤＮＡ複製生成物、特に、組み込まれたＣｐＧモチーフ内に存在するシトシン残基が、ＴＬＲ９活性化の誘発に必要であるメチル化をほとんど受けていなかったことを示している（Ｋｒｉｅｇ ＡＭ、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ ２００６；５：４７１−８４）。結論として、Ｈ−１ＰＶゲノムに追加されたＣｐＧモチーフは、ウィルス複製又は細胞病原性を損なうことがなく、ＴＬＲ９レセプタとの相互作用に好適な非メチル化状態を維持していた。
【００４７】
実施例３．野生型及び変異Ｈ−１ＰＶのＤＮＡによるマクロファージ及びＨＥＫＴＬＲ９細胞のＴＬＲ９依存的活性化
次に、異なるウィルスから単離された一本鎖ＤＮＡの、ＩＦＮ−γで予め活性化されたＲＡＷ２６４．７マクロファージからの酸化窒素の放出を刺激する能力について試験した（Ｌｕｎｄｂｅｒｇ Ｐ，Ｗｅｌａｎｄｅｒ Ｐ，Ｈａｎ Ｘ，Ｃａｎｔｉｎ Ｅ．Ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １ ＤＮＡ ｉｓ ｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ２００３；７７：ｌ１１５８−６９）。細胞は、ＲＴ−ＰＣＲによりＴＬＲ９ｍＲＮＡが陽性であること（データは非図示）、及び大腸菌ＤＮＡに機能的に反応する（図２Ａ）ことを確認した。ＲＡＷ２６４．７細胞を、クローニング（図１Ａ参照）に使用したものと同じフラグメントを有するホスホロチオエートオリゴヌクレオチド（ＰＴＯ−ＣＧ１、ＰＴＯ−ＣＧ２、ＰＴＯ−ＧＣ）、又はそれぞれのウィルス（ＪａｂＣＧ１、−ＣＧ２、−ＧＣ又はＨ−１ＰＶ）から単離したｓｓＤＮＡと一緒に培養し、放出されるＮＯを測定した。ＣｐＧ−２８（既に報告されている活性化因子オリゴヌクレオチド：Ｍｅｎｇ Ｙら、Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ２００５；ｌ１６：９９２−７）及び大腸菌ＤＮＡを陽性対照として使用した。図２Ａに示すように、パルボウィルスＤＮＡの追加されたＣｐＧモチーフもまた、活性化能を示した。ＪａｂＣＧ２のｓｓＤＮＡは、ＪａｂＣＧ１よりも含有するＣｐＧモチーフが少ないにも拘らず（６対１３）、その刺激活性は高かった。このことは、これらのモチーフがＪａｂＣＧ１の増殖の間に突然変異を起こした事実と一致する。リポソーム形成剤でのトランスフェクトは、改良エンドソーム送達を通じて微生物ＤＮＡの刺激効果を促進することができるという以前の報告（Ｄａｌｐｋｅ Ａ，Ｆｒａｎｋ Ｊ，Ｐｅｔｅｒ Ｍ，Ｈｅｅｇ Ｋ．Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ９ ｂｙ ＤＮＡ ｆｒｏｍ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｓｐｅｃｉｅｓ．Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ２００６；７４：９４０−６）に一致して、リポフェクタミンを使用してＨ−１ＰＶのｓｓＤＮＡ又はそのＣｐＧ含有誘導体で細胞をトランスフェクトすると、細胞取り込み（ＰＣＲで評価）が高かった（図２Ｂ、下のパネル）。それに応じて、ＲＡＷ２６４．７からのＮＯの放出が上昇した。
【００４８】
ＪａｂＣＧのＤＮＡによるＲＡＷ２６４．７細胞の活性化能が、取り込まれたＣｐＧモチーフをＴＬＲ９が認識することによることを確認するために、マウスＴＬＲ９ｃＤＮＡで安定にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞に対する前記ｓｓＤＮＡの刺激作用を測定した。ＨＥＫ２９３細胞は、通常、いずれのＴＬＲも発現しないので、ＴＲＬ９活性化は、安定に取り込まれたＮＦ−κＢにより促進されるレポータ遺伝子（ルシフェラーゼ）の誘導を介して測定することができた。図２Ｂに示すように、ＪａｂＣＧ１由来ｓｓＤＮＡ及びＪａｂＣＧ２由来ｓｓＤＮＡは、ＪａｂＧＣ由来ｓｓＤＮＡ、陰性対照オリゴヌクレオチド（ｃＧｐＣ−１８２６）及び培地と比較して、有意に高いレベルにルシフェラーゼ発現を誘導した。しかし、ＪａｂＣＧのＤＮＡは、陽性対照オリゴヌクレオチド（ｓＣｐＧ−１８２６）よりも非常に低い活性化効果しか示さず、これは、μｇＤＮＡ当たりのＣｐＧモチーフ量が低いためと考えられた。これらのデータから、Ｈ−１ＰＶｓｓＤＮＡは免疫細胞の活性化を誘発する能力を有し、ＣｐＧ含有がＴＬＲ９活性化を介してこの能力を強めることが結論付けられた。
【００４９】
実施例４．パルボウィルスをＣｐＧモチーフで武装することによる腫瘍抑制力の改善
これらの結果に基づき、挿入されたＣｐＧモチーフの、生体内におけるＨ−１ＰＶの免疫修飾及び癌抑制活性に対する影響を調べた。標的腫瘍に対する直接的な腫瘍溶解効果がない状態でパルボウィルスの免疫刺激能を評価可能なラット肺肝癌転移確立モデルを使用した。感染がない場合に転移に対して限定的な防御しか示さない、Ｘ線照射自己腫瘍細胞（ＭＨ３９２４Ａ）を含むワクチンと共に投与した場合の、Ｈ−１ＰＶ由来Ｊａｂ突然変異体投与のアジュバント効果について試験した。放射線照射前のワクチンにウィルスを生体外で播種し、転移癌を有するラットに皮下注射した。この方法では、処理ラットの肺におけるウィルスはＲＴ−ＰＣＴでは検出できず、肺転移癌に対する腫瘍溶解効果は見られなかったため、該ウィルスは明らかにワクチンアジュバントとしてのみ作用可能であった。図３Ａに示すように、細胞性ワクチンの治療効果は、アジュバントウィルスがＨ−１ＰＶ、ＪａｂＧＣ、又はＪａｂＣＧ１である場合に、わずかな、ほとんど有意差のない程度に改善されるのみであった。このことは、これらのウィルスにおけるＣｐＧモチーフの欠如又は段階的な消失と一致する。反対に、ＪａｂＣＧ２感染ワクチンは、非処理の対照と比較して、転移率を５０％以上低下させた。ＪａｂＣＧ２ワクチンで処理した群では、２ｍｍ以上の大きさの結節の数が非常に少ないのに加えて、大きな壊死結節（５ｍｍ以上）は見られなかった。その他の処理群では、逆に、この進行した疾患が多くみられた。細胞性免疫応答の活性化を示すマーカ（ＩＦＮ−γ）、及び樹状細胞の成熟を示すマーカ（ＣＤ８０，ＣＤ８６）の発現を、転移癌が位置する肺につながる縦隔リンパ節のＲＴ−ＰＣＲにより測定した。図３Ｂに示すように、これらの自然及び獲得免疫応答の指標は、ＪａｂＣＧ２処理群において強く誘導され、好ましい疾患の転帰と相関した。最も興味深いことに、ＪａｂＣＧ１処理群でそのようなマーカの上昇ほとんど示さない動物においても、ほとんど転移が認められなかった。これらの結果は、免疫活性化の向上をもたらすＣｐＧモチーフによりパルボウィルスを武装することにより、パルボウィルスの抗腫瘍能を更に強化することが可能であることが強く示唆した。このことは、その改善アジュバント効果及び治療効果が、複数回継代しても挿入されたＣｐＧモチーフを維持することと明らかに相関していることから、ＪａｂＣＧ２ウィルスにおいて最もよく実証される。
【００５０】
ヒトメラノーマのパルボウィルス腫瘍溶解物は、凍結融解抽出物よりも、樹状細胞の成熟を強く活性化することが近年明らかにされた（Ｍｏｅｈｌｅｒ ＭＨ，Ｚｅｉｄｌｅｒ Ｍ，Ｗｉｌｓｂｅｒｇ Ｖ，Ｃｏｒｎｅｌｉｓ ＪＪ， Ｗｏｅｌｆｅｌ Ｔ， Ｒｏｍｍｅｌａｅｒｅ Ｊ，Ｇａｌｌｅ ＰＲ，Ｈｅｉｋｅ Ｍ．Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ Ｈ−１−ｉｎｄｕｃｅｄ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｖｉａ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ，ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｃｒｏｓｓ−ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ ｂｙ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２００５；１６：９９６−１００５）。この効果は、感染腫瘍細胞のＨＳＰ７２発現の誘導に相関することが見出されている。本結果は、パルボウィルスの免疫刺激活性が、ＣｐＧモチーフをウィルスゲノムに追加することによって強化されることを示している。このことは、推定上のウィルス誘導細胞因子に加えて、ウィルス構成成分が免疫調節に寄与することを意味する。これらの構成成分は、感染腫瘍細胞により産生されるウィルスＤＮＡ種を含む可能性が高い。
【００５１】
Ｈ−１ＰＶゲノムは小さいため、パッケージングを妨げることなく導入できるＣｐＧモチーフの数は制限される。それにもかかわらず、追加する活性化因子ＣｐＧモチーフの数を２倍にすることが可能であり、更に、Ｈ−１ＰＶの腫瘍溶解能を更に改良することが可能であると思われる。これは、代替コドンの使用によるモチーフの生成又はｐ３８プロモータにあるウィルスイントロンにより達成される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
野生型ゲノムには存在しない少なくとも２個の追加のＣｐＧモチーフを有する、ＣｐＧモチーフ含有ゲノムを特徴とするパルボウィルス。
【請求項２】
野生型ゲノムには存在しない少なくとも５個の追加のＣｐＧモチーフを有することを特徴とする、請求項１に記載のパルボウィルス。
【請求項３】
野生型ゲノムには存在しない５〜２０個の追加のＣｐＧモチーフを有することを特徴とする、請求項１又は請求項２に記載のパルボウィルス。
【請求項４】
追加のＣｐＧモチーフが代替コドンの使用により生成されることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載のパルボウィルス。
【請求項５】
追加のＣｐＧモチーフが遺伝子のイントロン又は３’非翻訳領域に挿入されることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載のパルボウィルス。
【請求項６】
３’非翻訳領域がＶＰ転写ユニットの３’末端の非翻訳領域であることを特徴とする、請求項５に記載のパルボウィルス。
【請求項７】
ＣｐＧモチーフがＡＡＣＧＴＴ又はＧＴＣＧＴＴのヌクレオチド配列を有することを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載のパルボウィルス。
【請求項８】
パルボウィルスが、パルボウィルスＨ１（Ｈ−１ＰＶ）又は関連するげっ歯類パルボウィルスであることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載のパルボウィルス。
【請求項９】
関連するげっ歯類パルボウィルスが、ＬｕＩＩＩ、マウス微小ウィルス（ＭＭＶ）、マウスパルボウィルス（ＭＰＶ）、ラット微小ウィルス（ＲＭＶ）、ラットパルボウィルス（ＲＰＶ）、又はラットウィルス（ＲＶ）であることを特徴とする、請求項８に記載のパルボウィルス。
【請求項１０】
パルボウィルスが、ＶＰ転写ユニットの３’末端の非翻訳領域内に３つのＡＡＣＧＴＴモチーフと３つのＧＴＣＧＴＴモチーフを有することを特徴とする、請求項１〜９のいずれか１項に記載のパルボウィルス。
【請求項１１】
パルボウィルスが、ＶＰ転写ユニットの３’末端の非翻訳領域内にヌクレオチド配列、５’−ＧＴＴＡＡＣＧＴＴＴＡＣＡＧＣＴＧＡＣＴＡＧＴＣＧＴＴＴＧＣＴＣＡＧＴＣＴＡＡＣＧＴＴＣＴＴＧＴＣＴＡＴＴＧＴＣＧＴＴＴＡＣＴＡＧＴＣＴＣＴＴＡＡＣＧＴＴＴＣＡＴＣＴＡＣＴＴＧＴＣＧＴＴＡＡＣ−３’を有することを特徴とする、請求項１０に記載のパルボウィルス。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１つに記載のパルボウィルス又は該パルボウィルスを産生する細胞を含有する医薬組成物。
【請求項１３】
癌治療用医薬組成物の製造のための、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のパルボウィルス又は該パルボウィルスを産生する細胞の使用。
【請求項１４】
癌が膵臓癌、肝臓癌又はリンパ腫である、請求項１３に記載の使用。
【請求項１】
野生型ゲノムには存在しない少なくとも２個の追加のＣｐＧモチーフを有する、ＣｐＧモチーフ含有ゲノムを特徴とするパルボウィルス。
【請求項２】
野生型ゲノムには存在しない少なくとも５個の追加のＣｐＧモチーフを有することを特徴とする、請求項１に記載のパルボウィルス。
【請求項３】
野生型ゲノムには存在しない５〜２０個の追加のＣｐＧモチーフを有することを特徴とする、請求項１又は請求項２に記載のパルボウィルス。
【請求項４】
追加のＣｐＧモチーフが代替コドンの使用により生成されることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載のパルボウィルス。
【請求項５】
追加のＣｐＧモチーフが遺伝子のイントロン又は３’非翻訳領域に挿入されることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載のパルボウィルス。
【請求項６】
３’非翻訳領域がＶＰ転写ユニットの３’末端の非翻訳領域であることを特徴とする、請求項５に記載のパルボウィルス。
【請求項７】
ＣｐＧモチーフがＡＡＣＧＴＴ又はＧＴＣＧＴＴのヌクレオチド配列を有することを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載のパルボウィルス。
【請求項８】
パルボウィルスが、パルボウィルスＨ１（Ｈ−１ＰＶ）又は関連するげっ歯類パルボウィルスであることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載のパルボウィルス。
【請求項９】
関連するげっ歯類パルボウィルスが、ＬｕＩＩＩ、マウス微小ウィルス（ＭＭＶ）、マウスパルボウィルス（ＭＰＶ）、ラット微小ウィルス（ＲＭＶ）、ラットパルボウィルス（ＲＰＶ）、又はラットウィルス（ＲＶ）であることを特徴とする、請求項８に記載のパルボウィルス。
【請求項１０】
パルボウィルスが、ＶＰ転写ユニットの３’末端の非翻訳領域内に３つのＡＡＣＧＴＴモチーフと３つのＧＴＣＧＴＴモチーフを有することを特徴とする、請求項１〜９のいずれか１項に記載のパルボウィルス。
【請求項１１】
パルボウィルスが、ＶＰ転写ユニットの３’末端の非翻訳領域内にヌクレオチド配列、５’−ＧＴＴＡＡＣＧＴＴＴＡＣＡＧＣＴＧＡＣＴＡＧＴＣＧＴＴＴＧＣＴＣＡＧＴＣＴＡＡＣＧＴＴＣＴＴＧＴＣＴＡＴＴＧＴＣＧＴＴＴＡＣＴＡＧＴＣＴＣＴＴＡＡＣＧＴＴＴＣＡＴＣＴＡＣＴＴＧＴＣＧＴＴＡＡＣ−３’を有することを特徴とする、請求項１０に記載のパルボウィルス。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１つに記載のパルボウィルス又は該パルボウィルスを産生する細胞を含有する医薬組成物。
【請求項１３】
癌治療用医薬組成物の製造のための、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のパルボウィルス又は該パルボウィルスを産生する細胞の使用。
【請求項１４】
癌が膵臓癌、肝臓癌又はリンパ腫である、請求項１３に記載の使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公表番号】特表２０１１−５０７５３５（Ｐ２０１１−５０７５３５Ａ）
【公表日】平成２３年３月１０日（２０１１．３．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５４００５７（Ｐ２０１０−５４００５７）
【出願日】平成２０年１２月１９日（２００８．１２．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０１０９７２
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０８３２０２
【国際公開日】平成２１年７月９日（２００９．７．９）
【出願人】（５０００３０６５５）
【出願人】（５０９１６１１４１）ルプレヒト−カールス−ウニヴェルジテート ハイデルベルク (6)
【氏名又は名称原語表記】Ｒｕｐｒｅｃｈｔ−Ｋａｒｌｓ−Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｅｔ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ
【住所又は居所原語表記】Ｇｒａｂｅｎｇａｓｓｅ １， Ｄ−６９１１７ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ， Ｇｅｒｍａｎｙ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年３月１０日（２０１１．３．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１２月１９日（２００８．１２．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０１０９７２
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０８３２０２
【国際公開日】平成２１年７月９日（２００９．７．９）
【出願人】（５０００３０６５５）
【出願人】（５０９１６１１４１）ルプレヒト−カールス−ウニヴェルジテート ハイデルベルク (6)
【氏名又は名称原語表記】Ｒｕｐｒｅｃｈｔ−Ｋａｒｌｓ−Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｅｔ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ
【住所又は居所原語表記】Ｇｒａｂｅｎｇａｓｓｅ １， Ｄ−６９１１７ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ， Ｇｅｒｍａｎｙ
【Ｆターム（参考）】
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