癌の診断薬及び治療薬
【課題】癌において特異的に発現するタンパク質を見出し、これを標的とすることによる癌の新規な診断方法、診断キットおよび治療薬の提供する。
【解決手段】ＨＮＴを含有する癌、好ましくは肺癌、腎臓癌、大腸癌、膵臓癌からなる群より選択される癌に対する抗ＨＮＴ抗体を含有する診断薬及び治療薬を提供するものである。また、被験者から採取された試料に抗ＨＮＴ抗体を反応させ、あるいは被験者に抗ＨＮＴ抗体を投与して、ＨＮＴタンパク質を検出することを特徴とする癌の診断方法。
【解決手段】ＨＮＴを含有する癌、好ましくは肺癌、腎臓癌、大腸癌、膵臓癌からなる群より選択される癌に対する抗ＨＮＴ抗体を含有する診断薬及び治療薬を提供するものである。また、被験者から採取された試料に抗ＨＮＴ抗体を反応させ、あるいは被験者に抗ＨＮＴ抗体を投与して、ＨＮＴタンパク質を検出することを特徴とする癌の診断方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗ＨＮＴ抗体を利用した癌の診断薬及び治療薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、癌細胞に特異的に発現されているタンパク質を標的にした癌の診断および治療方法の開発が盛んである。すなわち、癌細胞に高発現であるが、正常組織では発現が少ないかあるいは発現していない細胞表面タンパク質をターゲットとして、血液および組織等を用いた診断および治療を行う方法である。既に、ハーセプチン等の診断および治療薬が臨床の場に提供され、多くの患者の治療に貢献しているが、全ての癌患者に奏効するというわけではなく、癌に特異性が高く発現しているタンパク質を標的とする治療薬の開発がさらに望まれている。
【０００３】
肺癌は、癌の中でも最も多い癌種の１つであり、癌による死亡原因の上位を占める。例えば、米国において２００６年度に新たに癌であると診断された患者の約１２％が肺癌であり、同年の癌による死亡の２９％が肺癌を原因とする死亡であると予測されている（非特許文献１）。早期発見の手段として、胸部Ｘ線撮影、喀痰による細胞診、またスパイラ
ルＣＴ等が挙げられるが、十分な効果がなく、肺癌はいまだ癌による死亡原因の上位を占めている。
治療面では、外科手術、放射線療法、化学療法に加えて、分子標的薬の開発が盛んに行われている。上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）チロシンキナーゼ阻害剤であるゲフィチニブ、エルロチニブなどが挙げられ、一部の癌に顕著な効果を示している。しかし、全ての肺癌患者に効果があるわけではなく、また、有害事象についても報告されている。そのため、新たな作用機序を持つ分子標的薬の開発が求められている。
【０００４】
腎臓癌に対しては、画像検査技術の進歩により早期発見症例が増えた反面、いまだに遠隔転移を有する症例が減っていないのが現状である。成人の腎臓癌の大多数を占める癌腎細胞癌では、他の癌腫で通常行われる化学療法や放射線療法はほとんど効果を示さないとされている（非特許文献２）。そのため、早期外科的切除が有効とされているが、根治的切除不能例や再発例のような進行性腎細胞癌には有効な治療法がない。その反面、一部の症例に対してインターフェロンα（ＩＦＮα）やインターロイキン２といった免疫療法が奏効することが腎細胞癌の特徴であり、日本では進行性腎細胞癌の治療には広くＩＦＮαが用いられている。しかし、進行性腎細胞癌症例に対するＩＦＮαの奏功率は１０−２０％程度に過ぎない（非特許文献３）。従って、簡便かつ的確な早期発見技術および有効な治療法が望まれている。
【０００５】
大腸癌は、米国の統計資料の２００６年度の予測によれば、男女共に３番目に多い癌種であり、その発生率は１９９８年から２００２年にかけては毎年１．８％づつ増加している（非特許文献１）。浸潤していない癌については、内視鏡的粘膜切除術等の外科的切除が非常に有効であり死亡率は減少している。しかし、腸壁に浸潤しリンパ節転移を来たした大腸癌では、外科的手術と化学療法剤や放射線療法を併用する等の治療法が一般に行われている（非特許文献１）。このような状況の中で、新たな分子標的薬である、血管内皮成長因子受容体（ＶＥＧＦＲ）阻害剤であるベバシズマブ、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に対する抗体であるセツキシマブが開発されている。しかし、これらが奏功するのは大腸癌の一部の症例に対してのみであり、異なる分子を標的とする新たな治療薬がさらに必要である。
【０００６】
膵臓癌患者は、毎年増加する傾向にあり、２００１年の日本国内の年間死亡者数は、約２万人である。また、男性の癌死の第５位、女性の癌死の第６位をそれぞれ占めている。膵臓癌は予後が悪く、切除例の５年生存率は５〜２０％である。膵臓癌の予後が悪い原因は、癌病巣が２ｃｍ程のときに、既に膵臓の外に浸潤をきたし、肝臓に転移するケースが多いためである。従って、膵臓癌は早期診断が非常に重要であるが、現在のところ膵臓癌が周囲臓器に浸潤する前に診断する方法は、存在していない。
【０００７】
日本国内の全国調査では、最初に膵臓癌を発見した方法として、ＣＴが４４％と最も多く、超音波が４１％である。従って、現在この２つの検査方法が膵臓癌の診断に重要である。しかし、現在一般的に使用されているＣＴの場合、癌組織と非癌組織の区別がつきにくく、診断に熟練した技術を要する。膵臓癌の腫瘍マーカーには、ＣＡ１９−９、ＤＵＰＡＮ-２、Ｓｐａｎ−１、ＣＥＡなどがある。これらのマーカーは、いずれも進行癌で陽性となるが、早期の診断率は低く、早期診断に有用と言えるマーカーはない。さらに、ＣＡ１９−９は肝炎、肝硬変、膵炎のような非悪性腫瘍でも血中濃度が上昇するため、膵臓癌の診断への使用は、適切ではないことが知られている。
【０００８】
ＦＤＧ−ＰＥＴによる膵臓癌診断も実施されているが、検査コストが高いことや、画像の分解能が悪い、などといった問題がある。従って、ＰＥＴ検査の費用対効果や効率を考慮した場合、膵臓癌組織を特異的に認識するプローブを開発し、高精度な診断方法を開発することが望まれている。
【０００９】
一方、膵臓癌の治療は、手術、化学療法、放射線療法により行われる。全症例のうち切除が可能なものは、４０％以下である。術後の５年生存率は５〜２０％と、極めて低い。手術による合併症の併発も多く、問題となっている。局所進展や遠隔転移によって見つかった膵臓癌の多くは、手術適応にはならず、化学療法や放射線療法を適応する。放射線療法は、消化管への負担が少ないため、外来でも施行可能であるため、近年では症例が増加する傾向にある。
【００１０】
従って、膵臓癌診断においては、簡便かつ的確な検査が可能な新たな膵臓癌診断マーカーが求められている。また、膵臓癌の治療においては、非侵襲的で、かつ効果的な治療方法、すなわち、膵臓癌細胞に対して特異的に傷害を与える治療薬の開発が望まれている。
【００１１】
ニューロトリミン（以下、ＨＮＴと表記することもある。)は1995年にラットの脳で発生段階で発現する膜蛋白をコードする遺伝子として最初に発表された(非特許文献４) 。その後、この分子が進化的に保存された脳で発現する接着分子の１群として認識され、脳の発達における神経回路形成に関連する分野で研究が進んだ。
接着分子は大きく4つのクラスとして分類されインテグリン、カドヘリン、セレクチン、イムノグロブリン様スーパーファミリー（ＩｇＳＦ)が知られているが、ＨＮＴは、神経細胞同士の接着や神経軸索の伸張に重要な働きをすると考えられているＩｇＳＦに属している。ＩｇＳＦは、膜貫通ドメインをもつ群と膜貫通ドメインをもたないglycosylphosphatidylinositol(ＧＰＩ)アンカー型の接着分子群に分類されるが、ニューロトリミンはＧＰＩアンカー型の分子に属する。
ＧＰＩアンカー型に分類される分子は、哺乳動物から発見された分子の頭文字をとってＩｇＬＯＮサブファミリーと総称される。このＩｇＬＯＮファミリーの構造上の特徴はＧＰＩアンカーで膜状に発現し、イムノグロブリンドメインを3個有することである。
ＩｇＬＯＮファミリーの接着因子は、発生初期から脳に発現し、神経回路の形成に関わるとされている。軸索の繊維束化や神経突起形成、成長円錐(growth cone guidance)を誘導し、特定の神経細胞同士のシナプス形成に関与すると考えられている。ニューロトリミンは、脳橋、小脳と視床に強く発現していることが知られている。
【００１２】
ニューロトリミンと癌との関連については、上皮性卵巣癌で発現が亢進しているという報告（非特許文献５）がある。しかし、特許文献１においては、ニューロトリミンを卵巣癌および大腸癌の癌抑制遺伝子であると同定し、ニューロトリミンの機能を補う癌の治療、および、ニューロトリミンの機能の低下を検出することによる診断方法を開示している。また、特許文献２にも、ＨＮＴと同様にＩｇ様スーパーファミリーに属するＮＣＡＭが、癌では細胞膜上への発現が減少し、接触阻害（contact inhibition）を失うことにより癌細胞の増殖をもたらすことから、ＨＮＴとそのホモローグが癌抑制遺伝子として作用することを示唆している(非特許文献６)。
一方、特許文献３は、ＩｇＣＡＭファミリーの１つであるＧＰＩＭが肺癌、大腸癌、子宮癌、胃癌、乳癌で発現が亢進しているという文献（非特許文献７）を根拠として、ニューロトリミンのバリアントが、同様に肺癌、大腸癌、子宮癌、胃癌、乳癌で発現が亢進しており、抗体やアンチセンス核酸による治療の標的として利用できることを主張しているが、実際にニューロトリミンまたはそのバリアントについてデータを示しているわけではない。非特許文献５に示される通り、ＩｇＬＯＮファミリーに属するＯＰＣＭＬ、ＨＮＴ、ＬＳＡＭＰ、ＮＥＧＲ１などが必ずしも同一の発現傾向を示さないことは明らかであり、ニューロトリミンまたはそのバリアントが、癌細胞の細胞膜上に抗体を利用とした治療の標的として利用できる程の発現があると予測可能であるという蓋然性はない。
このように、ＨＮＴ遺伝子産物が癌細胞の細胞膜上に、抗体を用いた治療薬の標的として利用できる程度に発現しているという報告はない。
【非特許文献１】American Cancer Society, Cancer Facts and Figures 2006
【非特許文献２】J Urol．2000；163:408-17、Lancet.1998;352:1691-6
【非特許文献３】J Urol. 1999；161:381-7、Lancet．1999;353:14-7
【非特許文献４】J. Neurosci. 1995 15: 2141-2156
【非特許文献５】Clin Cancer Res. 2005 11:5764-8
【非特許文献６】J.Cell Biol. 1991 115:1751-1761
【非特許文献７】Oncogene 2002 21;3089-3094
【特許文献１】国際公開第03/002765号パンフレット
【特許文献２】米国特許出願公開第2003/0100485号明細書
【特許文献３】国際公開第04/039942号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、上記事情に鑑み、癌において特異的に発現するタンパク質を見出し、これを標的とすることによる癌の新規な診断方法、診断キットおよび治療薬の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、各種癌組織を用いたＤＮＡマイクロアレイによる遺伝子発現解析の結果より、ＨＮＴ遺伝子の発現量が癌組織において特異的に多いことを見出した。さらに、ＨＮＴタンパク質に対する抗体を作製し、ＨＮＴ発現ＣＨＯ細胞、膵臓癌由来細胞株であるＱＧＰ−１への抗ＨＮＴ抗体の投与によって、ＣＤＣおよび／あるいはＡＤＣＣ活性が測定されることを示した。すなわち、抗ＨＮＴ抗体の投与により癌細胞の細胞死が起こり、抗ＨＮＴ抗体を癌治療薬として用いることができる。また、抗ＨＮＴ抗体に放射性同位元素等の細胞障害活性物質を結合したものは、癌細胞を細胞死させる癌治療薬として用いることができる。
【００１５】
すなわち、本発明は、抗ＨＮＴ抗体を含有する癌、好ましくは肺癌、腎臓癌、大腸癌、膵臓癌からなる群より選択される癌の診断薬及び治療薬を提供するものである。また、本発明は、被験者から採取された試料に抗ＨＮＴ抗体を反応させ、あるいは被験者に抗ＨＮＴ抗体を投与して、ＨＮＴタンパク質を検出することを特徴とする癌の診断方法を提供するものである。
特に、本発明は以下の診断薬、診断方法、治療薬を提供するものである。
（１）抗ＨＮＴ抗体を含有する癌診断薬。
（２）癌が、肺癌、腎臓癌、大腸癌または膵臓癌である（１）に記載の癌診断薬。
（３）抗ＨＮＴ抗体がＨＮＴタンパク質細胞外領域と結合する抗体である（１）又は（２）記載の癌診断薬。
（４）血液中、血清中、血漿中または臓器組織に抗ＨＮＴ抗体を反応させてＨＮＴタンパク質を検出することにより使用されるものである（１）〜（３）のいずれか一に記載の癌診断薬。
（５）標識した抗ＨＮＴ抗体を投与後画像診断によりＨＮＴタンパク質を検出することにより使用されるものである（１）〜（３）のいずれか一に記載の癌診断薬。
（６）癌患者のうち、治療対象患者を選択するための診断薬である（１）〜（５）のいずれか一に記載の癌診断薬。
（７）被験者から採取された試料に抗ＨＮＴ抗体を反応させ、当該試料中のＨＮＴタンパク質を検出することを特徴とする癌の診断方法。
（８）癌が、肺癌、腎臓癌、大腸癌または膵臓癌である（７）に記載の癌の診断方法。
（９）被験者から採取された試料が血液、血清、血漿または臓器組織である（７）又は（８）記載の癌の診断方法。
（１０）抗ＨＮＴ抗体を有効成分とする癌治療薬。
（１１）癌が、肺癌、腎臓癌、大腸癌または膵臓癌である（１０）に記載の癌治療薬。
（１２）抗ＨＮＴ抗体がＨＮＴタンパク質細胞外領域と結合する抗体である（１０）又は（１１）記載の癌治療薬。
（１３）抗ＨＮＴ抗体が細胞傷害活性を有する抗体である（１０）〜（１２）いずれか一に記載の癌治療薬。
（１４）抗ＨＮＴ抗体がアイソトープ標識あるいは細胞傷害活性を有する化合物を結合させた抗体である（１０）〜（１２）のいずれか一に記載の癌治療薬。
【発明の効果】
【００１６】
本発明に係るＨＮＴタンパク質を検出することにより、癌の診断が可能となる。癌細胞膜上に発現する分子は、癌細胞の細胞死、あるいはＨＮＴのＧＰＩアンカーの開裂（Oncogene, 21,3089-3094, 2002）などによって血中に移行することが予測される。また、癌細胞膜上に発現するＨＮＴタンパク質を標的とすることにより、癌の治療の実施が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明により、診断及び治療される疾患は、癌、好ましくは肺癌、腎臓癌、大腸癌、膵臓癌からなる群より選択される癌である。診断及び治療の対象となる動物は、ヒトであることが好ましいが、イヌ、ネコ、ウサギ、マウス、ラット、モルモット等の哺乳類でも良い。
【００１８】
本発明において癌の診断を行う場合、被験者の血液中および臓器組織にＨＮＴタンパク質が検出された場合に、被験者が癌である可能性が高いと判定される。また、癌と診断された患者の血液あるいは組織中ＨＮＴタンパク質濃度を測定することにより、その患者が治療対象患者か否かを判定すること（治療対象患者の選択）ができる。さらに、癌の治療後、ＨＮＴタンパク質測定において、ＨＮＴタンパク質の量が術前より減少した場合、治療の経過が良好であると判定される。一方、治療後のＨＮＴタンパク質の量が低下しないあるいは増加する場合には、再発および転移があると判定される。癌の診断は、画像診断、生検および血液診断により行うことができる。
【００１９】
画像診断においては、標識した抗ＨＮＴ抗体を投与後画像診断によりＨＮＴタンパク質を検出することにより行うことができる。より具体的には、抗ＨＮＴ抗体に、標識物質として放射性同位元素で標識したプローブを被験者に投与し、ＰＥＴまたはＳＰＥＣＴで癌組織を検出することができる。使用する放射性同位元素は、当業者に公知の物質を用いることができるが、好ましくは陽電子放出放射性同位元素であり、さらに好ましくは11Ｃ、13Ｎ、18Ｆ、15Ｏ、94mＴｃ、124Ｉである。抗ＨＮＴ抗体への放射性同位元素の標識は、当業者公知の方法により行うことができる。
【００２０】
生検により癌の診断を行う方法としては、被験者から得られた臓器組織を試料として、免疫学的測定法を行うことができる。例えば、ラジオイムノアッセイ、エンザイムイムノアッセイ、蛍光イムノアッセイ、発光イムノアッセイ、免疫沈降法、免疫比濁法、ウェスタンブロット、免疫染色、免疫拡散法などを挙げることができるが、好ましくは免疫染色である。免疫染色などの上述した免疫学的方法は当業者に公知の方法により行うことが可能である。
【００２１】
生検により癌の診断を行う他の様態として、抗ＨＮＴ抗体を一次抗体として使用した免疫組織学的染色法を行うことができる。具体的には、被験者から得られた検体を公知の方法によりパラフィンや凍結等により固定し、切片を作製する。次いで、切片を一次抗体として抗ＨＮＴ抗体、二次抗体としてＩｇＧを認識するビオチン標識抗体をそれぞれ用いて処理する。二次抗体は、ＩｇＧを認識する公知の抗体を用いることができ、例えばウサギ抗ＩｇＧ抗体などを挙げることができる。二次抗体に標識物質を結合させ、それぞれの標識物質に適した公知の方法により、切片中のＨＮＴタンパク質の有無を検出する。また、二次抗体を使用せず、抗ＨＮＴ抗体に標識物質を結合させ、免疫組織学的染色法を行うこともできる。標識物質は当業者公知の物質を用いることができるが、例えばペルオキシターゼ、ＦＩＴＣなどを挙げることができる。抗体と標識物質の結合は、当業者に公知の方法で行うことができ、具体的には、ストレプトアビジンとビオチンを利用した結合方法を挙げることができる。
【００２２】
癌の診断を行う他の様態としては、被験者から得られた血液、血清、または血漿を試料として、免疫学的測定法を行うことができる。例えば、ラジオイムノアッセイ、エンザイムイムノアッセイ、蛍光イムノアッセイ、発光イムノアッセイ、免疫沈降法、免疫比濁法、ウェスタンブロット、免疫拡散法などを挙げることができるが、好ましくはエンザイムイムノアッセイであり、特に好ましいのは酵素結合免疫吸着定量法(enzyme-linked immunosorbent assay：ＥＬＩＳＡ)（例えば、sandwich ELISA）である。ＥＬＩＳＡなどの上述した免疫学的方法は当業者に公知の方法により行うことが可能である。
【００２３】
血液、血清、または血漿を検体とした癌の診断方法としては、例えば、抗ＨＮＴ抗体を支持体に固定し、ここに被検試料を加え、インキュベートを行い抗ＨＮＴ抗体とタンパク質を結合させた後に洗浄して、抗ＨＮＴ抗体を介して支持体に結合したＨＮＴタンパク質の検出を行う方法を挙げることができる。
【００２４】
本発明において抗ＨＮＴ抗体を固定するために用いられる支持体としては、例えば、アガロース、セルロースなどの不溶性の多糖類、シリコーン樹脂、ポリスチレン樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、ナイロン樹脂、ポリカーボネイト樹脂などの合成樹脂や、ガラス、フェライトなどの不溶性の支持体を挙げることができる。これらの支持体は、ビーズやプレートなどの形状で用いることが可能である。ビーズの場合、これらが充填されたカラムなどを用いることができる。プレートの場合、マルチウェルプレート（９６穴マルチウェルプレート等）、やバイオセンサーチップなどを用いることができる。抗ＨＮＴ抗体と支持体との結合は、化学結合や物理的な吸着などの通常用いられる方法により結合することができる。これらの支持体はすべて市販のものを用いることができる。
【００２５】
抗ＨＮＴ抗体と試料中のＨＮＴタンパク質の結合は、通常、緩衝液中で行われる。緩衝液としては、例えば、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ 緩衝液、クエン酸緩衝液、ホウ酸塩緩衝液、炭酸塩緩衝液などが使用され、通常用いるｐＨの範囲であればよい。また、インキュベーションの条件としては、すでによく用いられている条件、例えば、４℃〜３７℃にて１時間〜２４時間のインキュベーションが行われる。インキュベート後の洗浄は、抗ＨＮＴ抗体とＨＮＴタンパク質の結合を妨げないものであれば何でもよく、例えば、Ｔｗｅｅｎ−２０等の界面活性剤を含む緩衝液などが使用される。
【００２６】
本発明によるＨＮＴタンパク質の検出方法においては、ＨＮＴタンパク質を検出したい被検試料の他に、コントロール試料を設置してもよい。コントロール試料としては、ＨＮＴタンパク質を含まない陰性コントロール試料やＨＮＴタンパク質を含む陽性コントロール試料などがある。この場合、ＨＮＴタンパク質を含まない陰性コントロール試料で得られた結果と、ＨＮＴタンパク質を含む陽性コントロール試料で得られた結果と比較することにより、被検試料中のＨＮＴタンパク質を検出することが可能である。また、濃度を段階的に変化させた一連のコントロール試料を調製し、各コントロール試料に対する検出結果を数値として得て、標準曲線を作成し、被検試料の数値から標準曲線に基づいて、被検試料に含まれるＨＮＴタンパク質を定量的に検出することも可能である。
【００２７】
抗ＨＮＴ抗体を介して支持体に結合したＨＮＴタンパク質の検出の好ましい態様として、標識物質で標識された抗ＨＮＴ抗体を用いる方法を挙げることができる。例えば、支持体に固定された抗ＨＮＴ抗体に被検試料を接触させ、洗浄後に、ＨＮＴタンパク質を特異的に認識する標識抗体を用いて検出する。
【００２８】
抗ＨＮＴ抗体の標識は通常知られている方法により行うことが可能である。標識物質としては、蛍光色素、酵素、補酵素、化学発光物質、放射性物質などの当業者に公知の標識物質を用いることが可能であり、具体的な例としては、ラジオアイソトープ(32P、14C、125I、3H、131Iなど)、フルオレセイン、ローダミン、ダンシルクロリド、ウンベリフェロン、ルシフェラーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、β-グルコシダーゼ、ホースラディッシュパーオキシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、サッカリドオキシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼ、ビオチン、ルテニウムなどを挙げることができる。標識物質としてビオチンを用いる場合には、ビオチン標識抗体を添加後に、ペルオキシダーゼなどの酵素を結合させたストレプトアビジンをさらに添加することが好ましい。標識物質と抗ＨＮＴ抗体との結合には、グルタルアルデヒド法、マレイミド法、ピリジルジスルフィド法、過ヨウ素酸法、などの公知の方法を用いることができる。
【００２９】
具体的には、抗ＨＮＴ抗体を含む溶液をプレートまたはビーズなどの支持体に加え、抗ＨＮＴ抗体を支持体に固定する。プレート、またはビーズを洗浄後、タンパク質の非特異的な結合を防ぐため、例えばＢＳＡ、ゼラチン、アルブミンなどでブロッキングする。再び洗浄し、被検試料をプレートまたはビーズに加える。インキュベートの後、洗浄し、標識抗ＨＮＴ抗体を加える。適度なインキュベーションの後、プレートまたはビーズを洗浄し、支持体に残った標識抗ＨＮＴ抗体を検出する。検出は当業者に公知の方法により行うことができ、例えば、放射性物質による標識の場合には液体シンチレーションやＲＩＡ法により検出することができる。酵素による標識の場合には基質を加え、基質の酵素的変化、例えば発色を吸光度計により検出することができる。基質の具体的な例としては、２，２−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）ジアンモニウム塩（ＡＢＴＳ）、１，２−フェニレンジアミン（オルソ−フェニレンジアミン）、３，３'，５，５'−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）などを挙げることができる。蛍光物質または化学発光物質の場合にはルミノメーターにより検出することができる。
【００３０】
本発明のＨＮＴタンパク質検出方法の特に好ましい態様として、ビオチンで標識された抗ＨＮＴ抗体と、ストレプトアビジンを用いる方法を挙げることができる。
【００３１】
具体的には、抗ＨＮＴ抗体を含む溶液をプレートなどの支持体に加え、抗ＨＮＴ抗体を固定する。プレートを洗浄後、タンパク質の非特異的な結合を防ぐため、例えばＢＳＡなどでブロッキングする。再び洗浄し、被検試料をプレートに加える。インキュベートの後、洗浄し、ビオチン標識抗ＨＮＴ抗体を加える。適度なインキュベーションの後、プレートを洗浄し、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼなどの酵素と結合したアビジンを加える。インキュベーション後、プレートを洗浄し、アビジンに結合している酵素に対応した基質を加え、基質の酵素的変化などを指標にＨＮＴタンパク質を検出する。
【００３２】
本発明のＨＮＴタンパク質検出方法の他の態様として、ＨＮＴタンパク質を特異的に認識する一次抗体を一種類以上、および該一次抗体を特異的に認識する二次抗体を一種類以上用いる方法を挙げることができる。
【００３３】
例えば、支持体に固定された一種類以上の抗ＨＮＴ抗体に被検試料を接触させ、インキュベーションした後、洗浄し、洗浄後に結合しているＨＮＴタンパク質を、一次抗ＨＮＴ抗体、および該一次抗体を特異的に認識する一種類以上の二次抗体により検出する。この場合、二次抗体は好ましくは標識物質により標識されている。
【００３４】
本発明のＨＮＴタンパク質の検出方法の他の態様としては、凝集反応を利用した検出方法を挙げることができる。該方法においては、抗ＨＮＴ抗体を感作した担体を用いてＨＮＴタンパク質を検出することができる。抗体を感作する担体としては、不溶性で、非特異的な反応を起こさず、かつ安定である限り、いかなる担体を使用してもよい。例えば、ラテックス粒子、ベントナイト、コロジオン、カオリン、固定羊赤血球等を使用することができるが、ラテックス粒子を使用するのが好ましい。ラテックス粒子としては、例えば、ポリスチレンラテックス粒子、スチレン−ブタジエン共重合体ラテックス粒子、ポリビニルトルエンラテックス粒子等を使用することができるが、ポリスチレンラテックス粒子を使用するのが好ましい。感作した粒子を試料と混合し、一定時間攪拌する。試料中にＨＮＴタンパク質が高濃度で含まれるほど粒子の凝集度が大きくなるので、凝集を肉眼でみることによりＨＮＴタンパク質を検出することができる。また、凝集による濁度を分光光度計等により測定することによっても検出することが可能である。
【００３５】
本発明のタンパク質の検出方法の他の態様としては、例えば、表面プラズモン共鳴現象を利用したバイオセンサーを用いた方法を挙げることができる。表面プラズモン共鳴現象を利用したバイオセンサーはタンパク質−タンパク質間の相互作用を微量のタンパク質を用いてかつ標識することなく、表面プラズモン共鳴シグナルとしてリアルタイムに観察することが可能である。例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（Biacore International AB社製）等のバイオセンサーを用いることにより抗ＨＮＴ抗体とＨＮＴタンパク質との結合をそれぞれ検出することが可能である。具体的には抗ＨＮＴ抗体を固定化したセンサーチップに、被検試料を接触させ抗ＨＮＴ抗体に結合するＨＮＴタンパク質を共鳴シグナルの変化としてそれぞれ検出することができる。
【００３６】
本発明の検出方法は、種々の自動検査装置を用いて自動化することもでき、一度に大量の試料について検査を行うことも可能である。
【００３７】
本発明の癌の診断薬は、キットの形態であってもよい。本発明の癌の診断薬は少なくとも抗ＨＮＴ抗体を含む。該診断薬がＥＬＩＳＡ法等のＥＩＡ法に基づく場合は、抗体を固相化する担体を含んでいてもよく、抗体があらかじめ担体に結合していてもよい。該診断薬がラテックス等の担体を用いた凝集法に基づく場合は抗体が吸着した担体を含んでいてもよい。また、該診断薬は、適宜、ブロッキング溶液、反応溶液、反応停止液、試料を処理するための試薬等を含んでいてもよい。
【００３８】
本発明の生検組織および血液などの試料を用いた診断用抗ＨＮＴ抗体は、ＨＮＴタンパク質にそれぞれ特異的に結合すればよく、その由来、種類（モノクローナル、ポリクローナル）および形状を問わない。具体的には、マウス抗体、ラット抗体、トリ抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体などの公知の抗体を用いることができる。抗体はポリクローナル抗体でもよいが、モノクローナル抗体であることが好ましく、高感度で特異的な測定が可能であれば、市販されている抗体を使用してもよい。
【００３９】
又、支持体に固定される抗ＨＮＴ抗体と標識物質で標識される抗ＨＮＴ抗体は、ＨＮＴタンパク質の同じエピトープを認識してもよいが、異なるエピトープを認識することが好ましく、部位は特に制限されない。
【００４０】
本発明においてＨＮＴタンパク質細胞外領域とは、配列番号１に示すアミノ酸配列の１〜３２０番目のアミノ酸をいう。アミノ酸配列には、置換・欠失等の変異が含まれることもある。
【００４１】
本発明者らは、ＨＮＴタンパク質が癌細胞の細胞膜上に高発現していることを見出した。よって、本発明において癌の治療を行う場合、抗ＨＮＴ抗体と癌細胞に発現したＨＮＴタンパク質を特異的に結合させ、癌細胞に傷害を与えることにより行うことができる。細胞傷害は、抗ＨＮＴ抗体の細胞傷害活性、例えばＡＤＣＣ活性又はＣＤＣ活性を利用することができる。さらに、本発明で使用される抗体は、糖鎖を改変された抗体であっても良い。抗体の糖鎖を改変することにより、抗体の細胞傷害活性を増強できる。また、癌治療に用いられる抗体は、抗癌作用を有する抗体であれば良く、抗腫瘍効果のある物質を結合させた抗体でも良い。抗体に結合させる事により腫瘍に特異的に集積させることが可能であるため、強い副作用を持つ薬物であっても治療に用いることができる。抗腫瘍効果を持つ薬物や放射性同位元素を結合させた抗体により、癌の治療が可能である。
【００４２】
本発明における細胞傷害活性とは、例えば抗体依存性細胞介在性細胞傷害 (antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity:ＡＤＣＣ)活性、補体依存性細胞傷害 (complement-dependent cytotoxicity:ＣＤＣ)活性などを挙げることができる。本発明においてＣＤＣ活性とは補体系による細胞傷害活性を意味し、ＡＤＣＣ活性とは標的細胞の細胞表面抗原に特異的抗体が付着した際、そのＦｃ部分にＦｃγ受容体保有細胞（免疫細胞等）がＦｃγ受容体を介して結合し、標的細胞に傷害を与える活性を意味する。
【００４３】
抗ＨＮＴ抗体がＡＤＣＣ活性を有するか否か、又はＣＤＣ活性を有するか否かは公知の方法により測定することができる。例えば、予め標的細胞に取り込ませた放射性物質51Ｃｒの放出を指標にした方法［Martin R. et al. (1990) Fine specificity and HLArestriction of myelin basic protein-specific cytotoxic T cell lines from multiple sclerosis patients and healthy individuals. J. Immunol. 145, 540.等］、予め標的細胞に取り込ませた蛍光物質Ｃａｌｃｅｉｎの放出を指標にした方法［Lichtenfels R.et al. (1994) CARE-LASS (calcein-release-assay), an improved fluorescence-basedtest system to measure cytotoxic T lymphocyte activity. J. Immunol. Methods 172, 227.等］、標的細胞に内在する乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の放出を指標にした方法［Korzeniewski C. and Callewaert DM. (1983) An enzyme-release assay for natural cytotoxicity. J. Immunol. Methods 64, 313.等］が報告されている。
【００４４】
具体的には、まず、エフェクター細胞、補体溶液、標的細胞の調製を行う。
（１）エフェクター細胞の調製
ＢＡＬＢ／ｃマウスなどから脾臓を摘出し、ＲＰＭＩ１６４０培地(Invitrogen社製)中で脾臓細胞を分離する。５−１０％ウシ胎児血清(ＦＢＳ)を含む同培地で洗浄後、細胞濃度を５×１０6／ｍＬに調製し、エフェクター細胞を調製する。
【００４５】
（２）補体溶液の調製
Ｂａｂｙ Ｒａｂｂｉｔ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ(CEDARLANE社製)を５−１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０ (Invitrogen社製)にて適宜希釈し、補体溶液を調製する。
【００４６】
（３）標的細胞の調製
ＨＮＴを発現する細胞（ＨＮＴをコードする遺伝子で形質転換された細胞、膵癌細胞）を用意する。予め標的細胞に取り込ませた放射性物質51Ｃｒの放出を指標にした方法で細胞傷害活性を測定する場合は０．２ｍＣｉの51Ｃｒ-クロム酸ナトリウム(ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製)とともに、細胞を１０％ ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地中で３７℃にて１時間培養することにより放射体標識する。放射体標識後、細胞を１０％ ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地にて３回洗浄し、細胞濃度を２×１０5／ｍＬに調製して標的細胞を調製する。
【００４７】
予め標的細胞に取り込ませた蛍光物質の放出を指標にした方法で細胞傷害活性を測定する場合は２５μMのＣａｌｃｅｉｎ−ＡＭ［3',6'-Di(O-acetyl)-4',5'-bis[N,N-bis(carboxymethyl)aminomethyl]fluorescein, tetraacetoxymethyl ester］とともに、細胞をＰＢＳ（Phosphate-Buffered Saline）中で３７℃にて３０分間培養することにより蛍光標識する。蛍光標識後、細胞を５％ ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地（フェノールレッド不含）で２回洗浄し、細胞濃度を２×１０5／ｍＬに調製して標的細胞を調製する。標的細胞に内在する乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の放出を指標にした方法で細胞傷害活性を測定する場合には、細胞を濃度２×１０5／ｍＬに調製してそのまま用いる。
次いで、ＡＤＣＣ活性、又はＣＤＣ活性の測定を行う。ＡＤＣＣ活性の測定の場合は、９６ウェルＵ底プレート(Beckton Dickinson社製)に、標的細胞と、抗ＨＮＴ抗体を５０μＬずつ加え、氷上にて１５分間反応させる。その後、エフェクター細胞１００μＬを加え、炭酸ガスインキュベーター内で４時間培養する。培養後、１００μＬの上清を回収し、51Ｃｒの放出を指標とする場合にはガンマカウンター(COBRAIIAUTO-GMMA、MODELD5005、Packard Instrument Company社製)で放射活性を測定する。細胞傷害活性(％)は(Ａ−Ｃ)／(Ｂ−Ｃ)×１００により求めることができる。Ａは各試料における放射活性(ｃｐｍ)、Ｂは１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００などの界面活性剤を加えて細胞を全溶解した試料における放射活性(ｃｐｍ)、Ｃは標的細胞のみを含む試料の放射活性(ｃｐｍ)を示す。蛍光物質Ｃａｌｃｅｉｎの放出を指標とする場合には蛍光プレートリーダー（励起波長４８５ｎｍ／蛍光波長５２０ｎｍ）で蛍光強度を測定する。標的細胞に内在するＬＤＨの放出を指標とする場合には、ＬＤＨとＤｉａｐｈｏｒａｓｅの共役反応によってテトラゾリウム塩から生成される赤色のホルマザンをマイクロプレートリーダー（波長４９０ｎｍ）で測定する。
【００４８】
一方、ＣＤＣ活性の測定の場合は、９６ウェルU底プレート(Becton Dickinson社製)に、標的細胞５０μＬと、抗ＨＮＴ抗体２０μＬを加え、氷上にて３０分間反応させる。その後、補体溶液１０μＬを加え、炭酸ガスインキュベーター内で４時間培養する。培養後、５０μＬの上清を回収し、放射活性などを測定する。細胞傷害活性はＡＤＣＣ活性の測定と同様にして求めることができる。
【００４９】
さらに、抗ＨＮＴ抗体は、癌治療薬として癌組織に特異的にターゲティングさせるミサイル療法に用いることができる。すなわち、癌細胞に傷害をもたらす薬物を結合させた抗体を投与することにより、癌部特異的に移行させ、治療効果および副作用の軽減を意図した治療方法である。
薬物と抗体の結合は、当業者に公知の方法で行うことができる（Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ. ２００４ Ｊｕｌ １;１０(１３):４５３８-４９.）。抗体に結合させる薬物は、癌細胞に傷害をもたらす公知の物質を用いることができるが、好ましくは抗癌剤と毒素であり、さらに好ましくはＣａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ、ＤＭ１、ＤＭ４、リシン、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓエキソトキシンＡである。
【００５０】
癌治療に用いられる抗体は、ＨＮＴタンパク質と特異的に結合する抗体に、癌細胞に傷害をもたらす放射性同位元素を結合することにより、細胞傷害活性を付加あるいは増強させたものでもよい。抗体と放射性同位元素の結合は、当業者公知の方法により、行うことができる（Bioconjug Chem. 1994 Mar-Apr;5(2):101-4.）。利用する放射性同位元素は、当業者に公知の物質を用いることができるが、好ましくはβ線やα線を放出する核種であり、さらに好ましくは131Ｉ、99mＴｃ、111Ｉｎ、90Ｙである。
【００５１】
放射性同位元素を含む化合物を結合させた抗体を用いた癌治療は、当業者公知の方法により行うことができる（Bioconjug Chem. 1998 Nov-Dec;9(6):773-82.）。具体的には、最初に少量の放射性同位元素を含む化合物を結合させた抗体を患者に投与し、全身のシンチグラムを行う。正常組織の細胞と抗体の結合が少なく、癌細胞と抗体の結合が多いことを確認した上で、放射性同位元素を含む化合物を結合させた抗体を大量に投与する。
【００５２】
本発明の癌治療および画像診断に用いられる抗体は、ＨＮＴタンパク質と特異的に結合する限り、モノクローナル抗体であればキメラ抗体、ヒト化（ＣＤＲ移植）抗体、ヒト抗体のいずれであっても良い。また、それら抗体は、癌に対する治療効果があれば、市販されている抗体を使用してもよい。
【００５３】
本発明で使用される抗ＨＮＴ抗体は、公知の手段を用いてポリクローナルまたはモノクローナル抗体として得ることができる。本発明で使用される抗ＨＮＴ抗体として、哺乳動物由来あるいはトリ由来モノクローナル抗体が好ましい。特に、哺乳動物由来のモノクローナル抗体が好ましい。哺乳動物由来のモノクローナル抗体は、ハイブリドーマにより産生されるもの、および遺伝子工学的手法により抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した宿主に産生されるものを含む。
【００５４】
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、基本的には公知技術を使用し、以下のようにして作製できる。すなわち、ＨＮＴタンパク質を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞をスクリーニングすることによって作製できる。
具体的には、モノクローナル抗体を作製するには次のようにすればよい。
【００５５】
まず、抗体取得の感作抗原として使用されるＨＮＴタンパク質の遺伝子またはアミノ酸配列は公共の遺伝子データベース等より得ることが可能である。例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ ０１６５２２に開示された遺伝子／アミノ酸配列を用いて抗原タンパク質の調製をすることができる。すなわち、ＨＮＴタンパク質をコードするそれぞれの遺伝子配列を公知の発現ベクター系に挿入して適当な宿主細胞を形質転換させた後、その宿主細胞中または培養上清中から目的のＨＮＴタンパク質を公知の方法で精製する。また、天然のＨＮＴタンパク質を精製して用いることもできる。
【００５６】
次に、この精製ＨＮＴタンパク質を感作抗原として用いる。あるいは、ＨＮＴタンパク質の部分ペプチドを感作抗原として使用することもできる。この際、部分ペプチドはＨＮＴタンパク質のアミノ酸配列より化学合成により得ることもできるし、ＨＮＴ遺伝子の一部を発現ベクターに組込んで得ることもでき、さらに天然のＨＮＴタンパク質をタンパク質分解酵素により分解することによっても得ることができる。部分ペプチドとして用いるＨＮＴタンパク質の部分および大きさは限られない。
【００５７】
感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特に限定されるものではないが、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、一般的にはげっ歯類の動物、例えば、マウス、ラット、ハムスター、あるいはトリ、ウサギ、サル等が使用される。
【００５８】
感作抗原を動物に免疫するには、公知の方法にしたがって行われる。例えば、一般的方法として、感作抗原を哺乳動物の腹腔内または皮下に注射することにより行われる。具体的には、感作抗原をＰＢＳ（Phosphate-Buffered Saline）や生理食塩水等で適当量に希釈、懸濁したものに所望により通常のアジュバント、例えばフロイント完全アジュバントを適量混合し、乳化後、哺乳動物に４〜２１日毎に数回投与する。また、感作抗原免疫時に適当な担体を使用することもできる。特に分子量の小さい部分ペプチドを感作抗原として用いる場合には、アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン等の担体タンパク質と結合させて免疫することが望ましい。
【００５９】
このように哺乳動物を免疫し、血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、哺乳動物から免疫細胞を採取し、細胞融合に付されるが、好ましい免疫細胞としては、特に脾細胞が挙げられる。
【００６０】
前記免疫細胞と融合される他方の親細胞として、哺乳動物のミエローマ細胞を用いる。このミエローマ細胞は、公知の種々の細胞株、例えば、Ｐ３（P3x63Ag8.653）（J. Immnol.（1979）123, 1548-1550）、 P3x63Ag8U.1（Current Topics in Microbiology and Immunology（1978）81, 1-7）、 NS-1 （Kohler. G. and Milstein, C. Eur. J. Immunol.（1976）6, 511-519）、MPC-11（Margulies. D.H. et al., Cell（1976）8, 405-415）、SP2/0 （Shulman, M. et al., Nature（1978）276, 269-270）、FO（de St. Groth, S. F. et al., J. Immunol. Methods（1980）35, 1-21）、S194（Trowbridge, I. S. J. Exp. Med.（1978）148, 313-323）、R210（Galfre, G. et al., Nature（1979）277, 131-133）
等が好適に使用される。
【００６１】
前記免疫細胞とミエローマ細胞との細胞融合は、基本的には公知の方法、たとえば、ケーラーとミルステインらの方法（Kohler. G. and Milstein, C.、Methods Enzymol.（1981）73, 3-46）等に準じて行うことができる。
【００６２】
より具体的には、前記細胞融合は、例えば細胞融合促進剤の存在下に通常の栄養培養液中で実施される。融合促進剤としては、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、センダイウイルス（ＨＶＪ）等が使用され、さらに所望により融合効率を高めるためにジメチルスルホキシド等の補助剤を添加使用することもできる。
【００６３】
免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は任意に設定することができる。例えば、ミエローマ細胞に対して免疫細胞を１〜１０倍とするのが好ましい。前記細胞融合に用いる培養液としては、例えば、前記ミエローマ細胞株の増殖に好適なＲＰＭＩ１６４０培養液、ＭＥＭ培養液、その他、この種の細胞培養に用いられる通常の培養液が使用可能であり、さらに、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用することもできる。
【００６４】
細胞融合は、前記免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を前記培養液中でよく混合し、予め３７℃程度に加温したＰＥＧ溶液（例えば平均分子量１０００〜６０００程度）を通常３０〜６０％（ｗ／ｖ）の濃度で添加し、混合することによって目的とする融合細胞（ハイブリドーマ）を形成する。続いて、適当な培養液を逐次添加し、遠心して上清を除去する操作を繰り返すことによりハイブリドーマの生育に好ましくない細胞融合剤等を除去する。
【００６５】
このようにして得られたハイブリドーマは、通常の選択培養液、例えばＨＡＴ培養液（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液）で培養することにより選択される。上記ＨＡＴ培養液での培養は、目的とするハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間（通常、数日〜数週間）継続する。ついで、通常の限界希釈法を実施し、目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングおよび単一クローニングを行う。
【００６６】
目的とする抗体のスクリーニングおよび単一クローニングは、公知の抗原抗体反応に基づくスクリーニング方法で行えばよい。例えば、ポリスチレン等でできたビーズや市販の９６ウェルのマイクロタイタープレート等の担体に抗原を結合させ、ハイブリドーマの培養上清と反応させ、担体を洗浄した後に酵素標識二次抗体等を反応させることにより、培養上清中に感作抗原と反応する目的とする抗体が含まれるかどうか決定できる。目的とする抗体を産生するハイブリドーマを限界希釈法等によりクローニングすることができる。この際、抗原としては免疫に用いたものを用いればよい。
【００６７】
また、ヒト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイブリドーマを得る他に、ヒトリンパ球をｉｎ ｖｉｔｒｏで、ＨＮＴタンパク質に感作し、感作リンパ球をヒト由来の永久分能を有するミエローマ細胞と融合させ、ＨＮＴタンパク質への結合活性を有する所望のヒト抗体を得ることもできる（特公平１−５９８７８号公報参照）。さらに、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物に抗原となるＨＮＴタンパク質を投与して抗ＨＮＴ抗体産生細胞を取得し、これを不死化させた細胞からＨＮＴタンパク質に対するヒト抗体をそれぞれ取得してもよい（ＷＯ９４／２５５８５号パンフレット、ＷＯ９３／１２２２７号パンフレット、ＷＯ９２／０３９１８号パンフレット、ＷＯ ９４／０２６０２号パンフレット参照）。
【００６８】
このようにして作製されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、通常の培養液中で継代培養することが可能であり、また、液体窒素中で長期保存することが可能である。
【００６９】
当該ハイブリドーマからモノクローナル抗体を取得するには、当該ハイブリドーマを通常の方法に従い培養し、その培養上清として得る方法、あるいはハイブリドーマをこれと適合性がある哺乳動物に投与して増殖させ、その腹水として得る方法などが採用される。前者の方法は、高純度の抗体を得るのに適しており、一方、後者の方法は、抗体の大量生産に適している。
【００７０】
本発明では、モノクローナル抗体として、抗体遺伝子をハイブリドーマからクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用いて産生させた組換え型のものを用いることができる（例えば、Vandamme, A. M. et al., Eur.J. Biochem.（1990）192, 767-775, 1990参照）。
具体的には、抗ＨＮＴ抗体を産生するハイブリドーマから、抗ＨＮＴ抗体の可変（Ｖ）領域をコードするｍＲＮＡを単離する。ｍＲＮＡの単離は、公知の方法、例えば、グアニジン超遠心法（Chirgwin, J. M. et al., Biochemistry（1979）18, 5294-5299）、ＡＰＧＣ法（Chomczynski, P.et al., Anal. Biochem.（1987）162, 156-159）等により行って全ＲＮＡを調製し、mRNA Purification Kit （Pharmacia製）等を使用して目的のｍＲＮＡを調製する。また、QuickPrep mRNA Purification Kit（Pharmacia製）を用いることによりｍＲＮＡを直接調製することもできる。
【００７１】
得られたｍＲＮＡから逆転写酵素を用いて抗体Ｖ領域のｃＤＮＡを合成する。ｃＤＮＡの合成は、AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit（生化学工業社製）等を用いて行う。また、ｃＤＮＡの合成および増幅を行うには、５'−Ａｍｐｌｉ ＦＩＮＤＥＲ ＲＡＣＥ Ｋｉｔ（Clontech製）およびＰＣＲを用いた５'-ＲＡＣＥ法（Frohman, M. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA（1988）85, 8998-9002、Belyavsky, A.et al., Nucleic Acids Res.（1989）17, 2919-2932）等を使用することができる。
【００７２】
得られたＰＣＲ産物から目的とするＤＮＡ断片を精製し、ベクターＤＮＡと連結する。さらに、これより組換えベクターを作製し、大腸菌等に導入してコロニーを選択して所望の組換えベクターを調製する。そして、目的とするＤＮＡの塩基配列を公知の方法、例えば、ジデオキシヌクレオチドチェインターミネーション法等により確認する。
【００７３】
目的とする抗ＨＮＴ抗体のV領域をコードするＤＮＡをそれぞれ得たのち、これを、所望の抗体定常領域（Ｃ領域）をコードするＤＮＡを含有する発現ベクターへ組み込む。
【００７４】
本発明で使用される抗ＨＮＴ抗体を製造するには、抗体遺伝子を発現制御領域、例えば、エンハンサー、プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクターに組み込む。次に、この発現ベクターにより、宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させる。
【００７５】
抗体遺伝子の発現は、抗体重鎖（Ｈ鎖）または軽鎖（Ｌ鎖）をコードするＤＮＡを別々に発現ベクターに組み込んで宿主細胞を同時形質転換させてもよいし、あるいはＨ鎖およびＬ鎖をコードするＤＮＡを単一の発現ベクターに組み込んで宿主細胞を形質転換させてもよい（WO 94/11523 号公報参照）。
【００７６】
また、組換え型抗体の産生には上記宿主細胞だけではなく、トランスジェニック動物を使用することができる。例えば、抗体遺伝子を、乳汁中に固有に産生されるタンパク質（ヤギβカゼインなど）をコードする遺伝子の途中に挿入して融合遺伝子として調製する。抗体遺伝子が挿入された融合遺伝子を含むＤＮＡ断片をヤギの胚へ注入し、この胚を雌のヤギへ導入する。胚を受容したヤギから生まれるトランスジェニックヤギまたはその子孫が産生する乳汁から所望の抗体を得る。また、トランスジェニックヤギから産生される所望の抗体を含む乳汁量を増加させるために、適宜ホルモンをトランスジェニックヤギに使用してもよい（Ebert, K.M. et al., Bio/Technology（1994）12, 699-702）。
【００７７】
本発明で使用される抗体は、抗体の全体分子に限られず、ＨＮＴタンパク質に結合する限り、抗体の断片またはその修飾物であってもよく、二価抗体も一価抗体も含まれる。例えば、抗体の断片としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆｖ、1個のＦａｂと完全なＦｃを有するＦａｂ／ｃ、またはＨ鎖若しくはＬ鎖のＦｖを適当なリンカーで連結させたシングルチェインＦｖ（ｓｃＦｖ）が挙げられる。具体的には、抗体を酵素、例えばパパイン、ペプシンで処理し抗体断片を生成させるか、または、これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させる（例えば、Co, M.S. et al., J. Immunol.（1994）152, 2968-2976、Better, M. & Horwitz, A.H. Methods in Enzymology（1989）178, 476-496, Academic Press, Inc.、Plueckthun, A. & Skerra, A. Methods in Enzymology（1989）178, 476-496, Academic Press, Inc.、Lamoyi, E., Methods in Enzymology（1989）121, 652-663、Rousseaux, J. et al., Methods in Enzymology（1989）121, 663-669、Bird, R. E. et al., TIBTECH（1991）9, 132-137参照）。
【００７８】
ｓｃＦｖは、抗体のＨ鎖Ｖ領域とＬ鎖Ｖ領域とを連結することにより得られる。このｓｃＦｖにおいて、Ｈ鎖Ｖ領域とＬ鎖Ｖ領域は、リンカー、好ましくはペプチドリンカーを介して連結される（Huston, J. S. et al.、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.（1988）85,5879-5883）。ｓｃＦｖにおけるＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域は、本明細書に抗体として記載されたもののいずれの由来であってもよい。Ｖ領域を連結するペプチドリンカーとしては、例えばアミノ酸１２〜１９残基からなる任意の一本鎖ペプチドが用いられる。
【００７９】
ｓｃＦｖをコードするＤＮＡは、前記抗体のＨ鎖またはＨ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ、およびＬ鎖またはＬ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡのうち、それらの配列のうちの全部または所望のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ部分を鋳型とし、その両端を規定するプライマー対を用いてＰＣＲ法により増幅し、次いで、さらにペプチドリンカー部分をコードするＤＮＡ、およびその両端が各々Ｈ鎖、Ｌ鎖と連結されるように規定するプライマー対を組み合せて増幅することにより得られる。
【００８０】
また、一旦ｓｃＦｖをコードするＤＮＡが作製されると、それらを含有する発現ベクター、および該発現ベクターにより形質転換された宿主を常法に従って得ることができ、また、その宿主を用いることにより、常法に従ってｓｃＦｖを得ることができる。
【００８１】
これら抗体の断片は、前記と同様にしてその遺伝子を取得し発現させ、宿主により産生させることができる。本発明における「抗体」にはこれらの抗体の断片も包含される。
【００８２】
抗体の修飾物として、標識物質等の各種分子と結合した抗ＨＮＴ抗体を使用することもできる。本発明における「抗体」にはこれらの抗体修飾物も包含される。このような抗体修飾物は、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。なお、抗体の修飾方法はこの分野においてすでに確立されている。
【００８３】
さらに、本発明で使用される抗体は、二重特異性抗体（bispecific antibody）であってもよい。二重特異性抗体は分子上の異なるエピトープを認識する抗原結合部位を有する二重特異性抗体であってもよいし、一方の抗原結合部位がＨＮＴタンパク質を認識し、他方の抗原結合部位が標識物質等を認識してもよい。二重特異性抗体は２種類の抗体のＨ鎖とＬ鎖の一対を結合させて作製することもできるし、異なるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを融合させて二重特異性抗体産生融合細胞を作製し、得ることもできる。さらに、遺伝子工学的手法により二重特異性抗体を作製することも可能である。
【００８４】
本発明のハイブリドーマを用いて“キメラ抗体”を作製することもできる。キメラ抗体とは、例えば、抗体の特異性、親和性および生物学的活性等の性質を保持したまま、マウス抗体遺伝子部分の一部をヒト抗体遺伝子に置き換えることが可能である（Nature 312:604-608, 1984、Nature 314:452-454,1985）。また、抗体のＣＤＲ領域を移植する技術により“ヒト化抗体”を作製する技術も公知である。ヒト抗体遺伝子のＣＤＲ領域を本発明の抗体のＣＤＲ領域に置き換えることが可能である（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:969-973, 1994）。本発明の抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体を含む。
【００８５】
前記のように構築した抗体遺伝子は、公知の方法により発現させ、取得することができる。哺乳類細胞の場合、常用される有用なプロモーター、発現させる抗体遺伝子、その３′側下流にポリＡシグナルを機能的に結合させて発現させることができる。例えばプロモーター／エンハンサーとしては、ヒトサイトメガロウイルス前期プロモーター／エンハンサー（human cytomegalovirus immediate early promoter/enhancer）を挙げることができる。
【００８６】
また、その他に本発明で使用される抗体発現に使用できるプロモーター／エンハンサーとして、レトロウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）等のウイルスプロモーター／エンハンサー、あるいはヒトエロンゲーションファクター１α（ＨＥＦ１α）などの哺乳類細胞由来のプロモーター／エンハンサー等が挙げられる。
【００８７】
ＳＶ４０プロモーター／エンハンサーを使用する場合はMulliganらの方法（Nature（1979）277, 108）により、また、ＨＥＦ１αプロモーター／エンハンサーを使用する場合はMizushimaらの方法（Nucleic Acids Res.（1990）18, 5322）により、容易に遺伝子発現を行うことができる。
【００８８】
大腸菌の場合、常用される有用なプロモーター、抗体分泌のためのシグナル配列および発現させる抗体遺伝子を機能的に結合させて当該遺伝子を発現させることができる。プロモーターとしては、例えばｌａｃＺプロモーター、ａｒａＢプロモーターを挙げることができる。ｌａｃＺプロモーターを使用する場合はWardらの方法（Nature（1098）341, 544-546 ; FASEBJ.（1992）6, 2422-2427）により、あるいはａｒａＢプロモーターを使用する場合はBetterらの方法（Science（1988）240, 1041-1043）により発現することができる。
【００８９】
抗体分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、ｐｅｌＢシグナル配列（Lei, S. P. et al J. Bacteriol.（1987）169, 4379）を使用すればよい。そして、ペリプラズムに産生された抗体を分離した後、抗体の構造を適切に組み直して（ｒｅｆｏｌｄ）使用する。
【００９０】
複製起源としては、ＳＶ４０、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）等の由来のものを用いることができ、さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクターは、選択マーカーとしてアミノグリコシドトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）遺伝子、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｅｃｏｇｐｔ）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）遺伝子等を含むことができる。
【００９１】
本発明で使用される抗体の製造のために、任意の発現系、例えば真核細胞または原核細胞系を使用することができる。真核細胞としては、例えば樹立された哺乳類細胞系、昆虫細胞系、真糸状菌細胞および酵母細胞などの動物細胞等が挙げられ、原核細胞としては、例えば大腸菌細胞等の細菌細胞が挙げられる。
【００９２】
好ましくは、本発明で使用される抗体は、哺乳類細胞、例えばＣＨＯ、ＣＯＳ、ミエローマ、ＢＨＫ、Ｖｅｒｏ、ＨｅＬａ細胞中で発現される。
【００９３】
次に、形質転換された宿主細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで培養して目的とする抗体を産生させる。宿主細胞の培養は公知の方法に従い行う。例えば、培養液として、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、ＩＭＤＭを使用することができ、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用することもできる。
【００９４】
前記のように発現、産生された抗体は、細胞、宿主動物から分離し均一にまで精製することができる。本発明で使用される抗体の分離、精製はアフィニティーカラムを用いて行うことができる。例えば、プロテインＡカラムを用いたカラムとして、ＨｙｐｅｒＤ、ＰＯＲＯＳ、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（Pharmacia製）等が挙げられる。その他、通常のタンパク質で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。例えば、上記アフィニティーカラム以外のクロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析等を適宜選択、組み合わせることにより、抗体を分離、精製することができる（Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988）。
【００９５】
本発明の癌治療薬は、抗ＨＮＴ抗体を当該技術分野においてよく知られる薬学的に許容しうる担体とともに、混合、溶解、顆粒化、錠剤化、乳化、カプセル封入、凍結乾燥等により、製剤化することができる。
【００９６】
経口投与用には、抗ＨＮＴ抗体を、薬学的に許容しうる溶媒、賦形剤、結合剤、安定化剤、分散剤等とともに、錠剤、丸薬、糖衣剤、軟カプセル、硬カプセル、溶液、懸濁液、乳剤、ゲル、シロップ、スラリー等の剤形に製剤化することができる。
【００９７】
非経口投与用には、抗ＨＮＴ抗体を、薬学的に許容しうる溶媒、賦形剤、結合剤、安定化剤、分散剤等とともに、注射用溶液、懸濁液、乳剤、クリーム剤、軟膏剤、吸入剤、座剤等の剤形に製剤化することができる。注射用の処方においては、抗ＨＮＴ抗体を水性溶液、好ましくはハンクス溶液、リンゲル溶液、または生理的食塩緩衝液等の生理学的に適合性の緩衝液中に溶解することができる。さらに、組成物は、油性または水性のベヒクル中で、懸濁液、溶液、または乳濁液等の形状をとることができる。あるいは、治療剤を粉体の形態で製造し、使用前に滅菌水等を用いて水溶液または懸濁液を調製してもよい。吸入による投与用には、抗ＨＮＴ抗体を粉末化し、ラクトースまたはデンプン等の適当な基剤とともに粉末混合物とすることができる。坐剤処方は、抗ＨＮＴ抗体をカカオバター等の慣用の坐剤基剤と混合することにより製造することができる。さらに、本発明の治療剤は、ポリマーマトリクス等に封入して、持続放出用製剤として処方することができる。
【００９８】
投与量および投与回数は、剤形および投与経路、ならびに患者の症状、年齢、体重によって異なるが、一般に、抗ＨＮＴ抗体は、１日あたり体重１ｋｇあたり、約０．００１ｍｇから１０００ｍｇの範囲、好ましくは約０．０１ｍｇから１０ｍｇの範囲となるよう、１日に１回から数回投与することができる。
【００９９】
本発明の癌治療薬は通常非経口投与経路で、例えば注射剤（皮下注、静注、筋注、腹腔内注など）、経皮、経粘膜、経鼻、経肺などで投与するのが好ましい。
【実施例】
【０１００】
以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【０１０１】
実施例１ ＤＮＡマイクロアレイによる各種癌細胞におけるＨＮＴ遺伝子発現解析
癌において発現が亢進する遺伝子を探索するために、各種ヒト組織におけるＲＮＡ、グリア芽腫、肺癌、肝癌、胃癌、大腸癌、腎癌および膵臓癌(表１)、および分化度の異なる２０例の膵癌、前癌病変１例、膵管癌２例、膵管内乳頭粘液性腫瘍１例の各摘出組織、および対照としての正常組織（摘出された膵癌組織の非癌部）４例よりレーザーマイクロダイセクション法（Laser Capture Microdissection）で回収したサンプルよりＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社）を用い定法に従って全ＲＮＡを調製した。
【０１０２】
上記全ＲＮＡを各１０ｎｇずつ用い、各種ヒト組織より抽出したＲＮＡをＧｅｎｅＣｈｉｐＵ−１３３Ｂ（Affimetrix社製）に供しＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｍａｎｕａｌ（Affimetrix社製）に準じて遺伝子発現解析した。全遺伝子の発現スコアの平均値を１００とし、癌細胞において発現が亢進する遺伝子を探索したところ、ＨＮＴ（プローブID： 227566_at HG-U133B）が正常膵臓（９４．０）と比較して、膵臓癌では発現スコア(平均値：４６９．４７)が５．０倍と、膵臓癌において発現が亢進していた。また、膵臓癌３例の正常膵臓組織に対する発現量は、それぞれ８．８倍、１．７倍、４．５倍と全例で発現亢進していることが明らかになった。（図１Ａ、Ｂ）。
また、小細胞癌、扁平上皮癌、腺癌などの肺癌、腎臓癌、大腸癌においても発現が亢進していた（図１Ａ、Ｂ）。
摘出した膵臓癌組織に関して高分化型４例、中分化型１７例、低分化型３例ならびに正常膵４例、前癌病変１例、膵管癌２例、膵管内乳頭粘液性腫瘍１例から調製した全ＲＮＡを各１０ｎｇずつ用い、ＧｅｎｅＣｈｉｐＵ１３３Ｐｌｕｓ２．０（Affimetrix社製）で遺伝子発現解析した。ＧｅｎｅＣｈｉｐＵ１３３Ｐｌｕｓ２．０での全遺伝子の発現スコアの平均値を１００としたときの各組織での発現スコアを示す。その結果、ＨＮＴｍＲＮＡ（プローブID：227566 at HG-U133 plus2）は、正常膵、前癌病変では発現スコアが低いのに対し、膵臓癌では発現が亢進していることが明らかになった（図２）。
【０１０３】
【表１】
【０１０４】
実施例２ ＨＮＴｃＤＮＡのクローニング
ＨＮＴのｃＤＮＡは、ヒト胎児脳のｃＤＮＡをテンプレートにしたＰＣＲ法によって増幅した。この時、ＧｅｎＢａｎｋ番号（ＮＭ＿０１６５２２）の配列情報を元にＯＲＦ領域（open reading flame）を含む断片を増幅するように設計されたプライマーセットＨＮＴ−ＳｐｅＩ−ＦＷ (配列番号２：ＧＧＡＣＴＡＧＴＡＣＣＡＴＧＧＧＧＧＴＣＴＧＴＧＧＧＴＡＣ)とＨＮＴ−ＸｂａＩ−ＲＶ (配列番号３：ＴＡＣＴＣＴＡＧＡＣＴＡＡＡＴＴＴＧＡＧＡＡＧＣＡＧＧＴＧＣＡＡＧＡＣ)を用いた。このＰＣＲ反応にはＫＯＤ−ｐｌｕｓ（東洋紡社）を用い、条件は９４℃−３０秒、５５℃-３０秒、６８℃−６０秒、３０サイクルで行った。
その後、アガロースゲル電気泳動により目的のサイズの約１．２ｋｂｐのバンドを含むゲルを切り出し、このゲル断片からキアクイックゲル抽出キット（QIAquick gel extraction kit；キアゲン社）を用いて精製を行い、ＨＮＴの全長ｃＤＮＡ（以下、ＨＮＴｆｕｌｌｃＤＮＡ）を得た。ＨＮＴｆｕｌｌｃＤＮＡの配列は常法に従いＮＭ＿０１６５２２と一致することを確認した。
【０１０５】
実施例３ ＨＮＴの抗原の調製
（１）ＨＮＴの全長ｃＤＮＡのほ乳類動物細胞での発現ベクターの作製
前述のＨＮＴｆｕｌｌｃＤＮＡをほ乳類発現用ベクターｐＥＦ４／Ｍｙｃ−ＨｉｓＢ(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製)へ挿入するために、２種類の制限酵素ＳｐｅＩ（ＴａＫａＲａ社製）およびＸｂａＩ（ＴａＫａＲａ社製）で３７℃、１時間処理した後、同じくＳｐｅＩ／ＸｂａＩで処理したｐＥＦ４／Ｍｙｃ−ＨｉｓＢにラピッドＤＮＡライゲーションキット（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）によってライゲーションすることによって挿入した。定法により塩基配列解析を行い、目的の発現ベクターｐＥＦ４／ＨＮＴｆｕｌｌを得た。
【０１０６】
（２）ＨＮＴの細胞外領域に相当する部分長ｃＤＮＡのほ乳類動物細胞での発現ベクターの作製
ＨＮＴの全長ｃＤＮＡ（ＨＮＴｆｕｌｌｃＤＮＡ）をテンプレートにし、ＧｅｎＢａｎｋ番号（ＮＭ＿０１６５２２）の配列情報を元にＨＮＴの細胞外領域に相当する部分のｃＤＮＡ断片（ｓＨＮＴｃＤＮＡ）を増幅するように設計されたプライマーセットＨＮＴ−Ｆ（ＨｉｎｄＩＩＩ） (配列番号４：ＣＧＣＡＡＧＣＴＴＡＣＣＡＴＧＧＧＧＧＴＣＴＧＴＧＧＧＴＡＣＣＴＧＴＴＣＣＴＧ)とｓＨＮＴ−Ｒ（Ｈｉｓ−ＮｏｔＩ）(配列番号５：ＡＣＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＡＴＧＧＣＴＣＡＣＣＴＣＧＣＴＧＡＣＧＧＣ)を用いてＰＣＲ反応を行った。この反応にはＫＯＤ−ｐｌｕｓ（東洋紡社）を用い、条件は９４℃-１５秒、５５℃-３０秒、６８℃−９０秒、３０サイクルで行った。
アガロースゲル電気泳動により目的のサイズに近い約１０００ｂｐのバンドを含むゲルを切り出し、ゲル断片からキアクイックゲル抽出キット（QIAquick gel extraction kit；キアゲン社）を用いて精製を行うことによって目的のｓＨＮＴｃＤＮＡを得た。
このｓＨＮＴｃＤＮＡをほ乳類発現用ベクターｐＥＢ６ＣＡＧＭＣＳ−Ｉ−ＧＦＰ へ挿入するために、２種類の制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ（ＴａＫａＲａ社製）およびＮｏｔＩ（ＴａＫａＲａ社製）で処理した後、同じくＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｏｔＩで処理したｐＥＢ６ＣＡＧＭＣＳ−Ｉ−ＧＦＰにＴ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ（プロメガ社製）によってライゲーションすることによって挿入した。定法により塩基配列解析を行い、目的の発現ベクターｐＥＢ６ＣＡＧＭＣＳ／ｓＨＮＴを得た。
【０１０７】
（３）ＨＮＴ全長タンパク質およびｓＨＮＴタンパク質の発現
ＦｕＧＥＮＥ６トランスフェクション試薬（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）のプロトコールに準じて、トランスフェクション前日に径１０ｃｍディッシュに８×１０5 ｃｅｌｌのＣＨＯ細胞を播種し一晩培養を行い、翌日に、８μgの発現ベクターｐＥＦ４／ＨＮＴｆｕｌｌまたはｐＥＢ６ＣＡＧＭＣＳ／ｓＨＮＴと１６μＬのＦｕＧＥＮＥ６試薬を４００μＬの無血清Ｏｐｔｉ-ＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に混合し、１５〜４５分間の室温におけるインキュベーションを行った後、細胞培養液に加えトランスフェクションを行った。トランスフェクション翌々日に限界希釈法および選択試薬であるＺｅｏｃｉｎ（ｐＥＦ４／ＨＮＴｆｕｌｌの場合、Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社製）あるいはＧ４１８（ｐＥＢ６ＣＡＧＭＣＳ／ｓＨＮＴの場合、Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社製）を用いてクローニングを開始した。
ＨＮＴ全長発現ＣＨＯは、抗ＨＮＴモノクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いたウェスタンブロットおよび抗ＨＮＴヤギ・ポリクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いたフローサイトメトリー(ベクトンディッキンソン社製ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒを使用)を用いることにより、シグナルが強く、しかも増殖が良好なクローンを選択した。その結果、ＨＮＴ全長発現ＣＨＯクローン（ＥＸＺ１９０３−４）が得られ、ＥＸＺ１９０３−４をモノクローナル抗体作製時のスクリーニングに使用した。
ｓＨＮＴ発現ＣＨＯ細胞のスクリーニングは、抗ＨＮＴモノクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いたウェスタンブロットで培養上清中に分泌されるｓＨＮＴの濃度を解析することで行った。培養上清中への分泌量が多く、しかも増殖が良好なクローンを選択した結果、ｓＨＮＴ発現ＣＨＯクローン（ＥＸＺ１８０２）が得られた。この選択されたｓＨＮＴ発現ＣＨＯクローン（ＥＸＺ１８０２）を培養面積１，５００ｃｍ2のローラーボトル３本を用い、ローラーボトル１本あたり無血清培地ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ−II（Invitrogen社）３３３ｍＬにて７２時間培養を行い、培養上清を回収した。得られた培養上清からＨｉｓＴｒａｐＨＰカラム (ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製)によるアフィニティークロマトグラフィーとＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ｐｇカラムによるゲル濾過クロマトグラフィーによって精製ｓＨＮＴ Ｈｉｓ ｔａｇ融合タンパク質（以下、ｓＨＮＴタンパク質として示す）を得た。非還元下のＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析したところ、９５％以上の純度であることが確認された。この精製された融合タンパク質をＰＢＳに対し透析を行い、免疫用抗原およびエピトープ同定などの解析用抗原として用いた。ｓＨＮＴタンパク質の濃度は、既知濃度の純品のウシ血清アルブミンを検量線としたＢＣＡ法（ＰＩＥＲＣＥ社製キットを使用）で算出した。
【０１０８】
（４）ＨＮＴ全長を発現する組み換えバキュロウイルスの作製
（１）で作製したｐＥＦ４／ＨＮＴｆｕｌｌを２種類の制限酵素ＫｐｎＩ（ＴａＫａＲａ社）およびＰｍｅＩ（ＴａＫａＲａ社）で３７℃、１時間処理した後、アガロースゲル電気泳動によって分離し、目的のＨＮＴ全長およびＭｙｃ−Ｈｉｓタグ部分を含むｃＤＮＡ断片を切り出しキアクイックゲル抽出キット（QIAquick gel extraction kit；キアゲン社）を用いて目的のｃＤＮＡ断片を精製した。
トランスファーベクターｐＢｌｕｅＢａｃ４．５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ（ＴａＫａＲａ社）で３７℃、１時間処理した後、ＤＮＡ Ｂｌｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ社）によって末端を平滑化し、制限酵素ＫｐｎＩ（ＴａＫａＲａ社））によって３７℃、１時間処理した。アガロースゲル電気泳動を行い目的のバンドを含むゲルを切り出し、ゲル断片からキアクイックゲル抽出キット（QIAquick gel extraction kit；キアゲン社）を用いて目的のベクターを精製した。
このようにして精製したＨＮＴ全長およびＭｙｃ−Ｈｉｓタグ部分を含むｃＤＮＡ断片をトランスファーベクターｐＢｌｕｅＢａｃ４．５にラピッドＤＮＡライゲーションキット（ロシュ・ダイアグノスティックス社）によって挿入した。定法により塩基配列解析を行い、目的の発現ベクターｐＢｌｕｅＢａｃ４．５／ＨＮＴｆｕｌｌを得た。次いで、４μｇのｐＢｌｕｅＢａｃ４．５／ＨＮＴｆｕｌｌを制限酵素ＢｐＩＩ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ社）にて切断直鎖化した後、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社の指示書に準じてＢａｃ−Ｎ−Ｂｌｕｅ ＤＮＡと共にＳｆ９細胞に導入し、ＨＮＴ全長タンパク質発現組み換えバキュロウイルスを調製した。
上記により調製した組み換えバキュロウイルスをＳｆ９細胞（２×１０6個細胞／ｍＬ）にＭＯＩが５となるように加え感染させた後、２７℃で３日間培養した。ＨＮＴ全長タンパク質を発現する発芽型バキュロウイルス（ＢＶ）は３日間培養後の培養上清より回収した。すなわち、培養液を８００ｘｇで１５分間遠心し、細胞ならびに細胞破砕物を除去した後、回収した培養上清を４５，０００ｇで３０分間遠心した。沈殿物をＰＢＳで懸濁した標品をＨＮＴｆｕｌｌ−ＢＶとし免疫抗原およびスクリーング用抗原に使用した。
【０１０９】
実施例４ 抗ＨＮＴモノクローナル抗体の作製
ｓＨＮＴタンパク質を免疫原としたモノクローナル抗体の作製
生理食塩水に溶解した５０μｇのｓＨＮＴタンパク質とＴｉｔｅｒ−ＭＡＸ（TiterMax USA, Inc.）を等量混合してＭＲＬ／ｌｐｒマウス（三共ラボサービス）に腹腔内および皮下に注射する事により初回免疫を行った。２回目以降の免疫は同様に調製した２５μｇタンパク質量相当のｓＨＮＴタンパク質とＴｉｔｅｒ−ＭＡＸを混合して腹腔内および皮下に注射することにより実施した。最終免疫から３日後にマウスから脾臓細胞を無菌的に調製し、ポリエチレングリコール法によってマウスミエローマ細胞ＮＳ―１との細胞融合を行った。
【０１１０】
（２）ＨＮＴｆｕｌｌ−ＢＶを免疫原としたモノクローナル抗体の作製
上述の方法により調製したＨＮＴｆｕｌｌ−ＢＶを生理食塩水に懸濁し、１ｍｇのタンパク量に相当するＨＮＴｆｕｌｌ−ＢＶと２００ｎｇの百日咳毒素と混合したものをｇｐ６４トランスジェニックマウス（ＷＯ０３／１０４４５３）の皮下に注射することで初回免疫を行った。２回目以降の免疫は５００μgタンパク量相当のＨＮＴｆｕｌｌ−ＢＶのみを皮下注射した。最終免疫として２５０μｇのＨＮＴｆｕｌｌ−ＢＶを腹腔内注射し、その3日後にマウスから脾臓細胞を無菌的に調製し、ポリエチレングリコール法によってマウスミエローマ細胞ＮＳ−１と細胞融合した。
【０１１１】
（３）抗ＨＮＴ抗体産生ハイブリドーマのスクリーニング
ハイブリドーマ培養上清中の抗ＨＮＴ抗体の１ｓｔスクリーニングは、ｓＨＮＴタンパク質を免疫原として作製したハイブリドーマ株についてはｓＨＮＴ固相化ＥＬＩＳＡおよびＨＮＴｆｕｌｌ−ＢＶ固相化ＥＬＩＳＡ、ＨＮＴｆｕｌｌ−ＢＶを免疫原として作製したハイブリドーマ株についてはｓＨＮＴ固相化ＥＬＩＳＡによって行った。すなわち、ｓＨＮＴの場合は２．５μｇ／ｍＬ、ＨＮＴｆｕｌｌ−ＢＶの場合は５μｇ／ｍＬの濃度の抗原をＥＬＩＳＡ用プレートのウェルに５０μＬずつ分注し４℃で一夜放置することで抗原を固相化した。次いで０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ (以後、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳ)でウェルを洗浄し、４０％ブロックエース（雪印乳業製）を含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ, １５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ８．０（４０％ ＢＡ−ＴＢＳ）を２００μＬ／ｗｅｌｌ分注して室温で１時間放置することでプレート上の未吸着部分をブロッキングした。Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳでウェルを洗浄後、ハイブリドーマ培養上清を５０μＬ／ｗｅｌｌ分注し、室温で１時間反応させた。
Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳでウェルを洗浄後、１０％ブロックエース（雪印乳業製）を含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ, １５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ８．０（１０％ＢＡ−ＴＢＳ）で１５０００倍に希釈したペルオキダーゼ標識抗マウス抗体ヒツジＩｇＧを５０μＬ／ｗｅｌｌ分注し、室温で１時間反応させた。Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、ＴＭＢ試薬（ＳＣＹＴＥＫ社）で暗所にて室温、３０分間反応させたのち、ＳＴＯＰ液（ＳＣＹＴＥＫ社）にて反応を停止させ、マイクロプレートリーダーにて波長４５０ｎｍでの吸光度を測定した。
１ｓｔスクリーニングのＥＬＩＳＡで陽性であったウェルのハイブリドーマの培養上清につき、２ｎｄスクリーニングとしてＨＮＴ全長発現ＣＨＯクローン（ＥＸＺ１９０３−４）および膵癌細胞株ＱＧＰ−１またはＫＰ−４用いたフローサイトメトリーを行った
まず、ＨＮＴ全長発現ＣＨＯ細胞および膵癌細胞株ＱＧＰ−１またはＫＰ−４の細胞膜表面にＨＮＴが発現しているか否かをＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（ベクトンディッキンソン社製）を用いたフローサイトメトリーで解析した。すなわち、ＨＮＴ全長発現ＣＨＯクローン（ＥＸＺ１９０３−４）および膵癌細胞株ＱＧＰ−１またはＫＰ−４を２ｍＭ ＥＤＴＡ−ＰＢＳで処理することで培養プレートから剥離後、１×１０6個／ｍＬとなるようにＦＡＣＳ溶液（１％ウシ血清アルブミン、０．１ｍＭＥＤＴＡ、０．１％ ＮａＮ3を含有するＰＢＳ）に懸濁した。この細胞懸濁液を５０μＬ／ｗｅｌｌとなるように９６ウェルプレート（BDファルコン社製）に播種し市販の抗ＨＮＴヤギ・ポリクローナル抗体（０．０３μｇ／ｗｅｌｌ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を加えて４℃で６０分間反応させ、ＦＡＣＳ溶液（２００μＬ／ｗｅｌｌ）で2回洗浄した後、ＦＩＴＣ標識抗ヤギＩｇＧ・ウサギＩｇＧ抗体（カペル社製）を加えて、４℃で３０分間反応させた。
そしてＦＡＣＳ溶液で２回洗浄した後、使用説明書に準じてＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ(ベクトンディッキンソン社製)を用いてフローサイトメトリーを実施した。抗ＨＮＴヤギ・ポリクローナル抗体の陰性コントロールには正常ヤギＩｇＧを用いた。
得られた抗ＨＮＴ抗体産生ハイブリドーマ株（ＰＰＺ４０３４）についての結果を図３Ａ〜Ｄに示す。ＨＮＴ発現ＣＨＯ細胞では強いシフトが認められ、膵臓癌由来細胞株ＱＧＰ−１でもシフトが認められた。膵臓癌由来細胞株ＰＫ−４５Ｐではシフトが認められず、ＰＫ−４５ＰではＨＮＴの細胞膜上への発現が無いかごく少ないことがわかる。
【０１１２】
実施例５ 全長ＨＮＴ発現ＣＨＯ細胞に対する抗ＨＮＴ抗体の細胞傷害活性（ＣＤＣ活性）
ＣＤＣ活性の測定は、標的細胞に内在する乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の放出を指標にする方法によった。具体的には、ＣｙｔｏＴｏｘ９６ Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（プロメガ社製）を用い、キットに添付のプロトコールに従って以下の通り実施した。
【０１１３】
標的細胞として、全長ＨＮＴ発現ＣＨＯ細胞を用いた。これらの細胞をプレートから剥離後、２×１０5個／ｍＬとなるように１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地に懸濁し、９６ウェルＵ底プレート（Beckton Dickinson社製）に１００μＬ／ｗｅｌｌで分注して炭酸ガスインキュベーター中で一夜培養した。翌日、プレート底面に接着した細胞を５％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地（フェノールレッド不含）で２回洗浄した後、各ウェルに５％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地（フェノールレッド不含）を３０μＬ／ｗｅｌｌ分注し、さらにハイブリドーマ培養上清を３０μL／Ｗｅｌｌ分注た後、氷上で３０分間インキュベーションした。
次いで、Ｂａｂｙ Ｒａｂｂｉｔ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ（CEDARLANE社製）を５％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ培地（フェノールレッド不含）で１６倍に希釈した補体標品（標的細胞がＨＮＴ全長発現ＣＨＯクローン（ＥＸＺ１９０３−４）の場合）あるいは同培地で８倍に希釈した補体標品（標的細胞が膵癌由来細胞株ＫＰ−４あるいはＱＧＰ−１の場合）を２０μＬ／ｗｅｌｌ分注し、炭酸ガスインキュベーター中で４時間培養した。培養後、５０μＬの上清を回収し、平底の酵素アッセイ用プレートへ移した。そこへ、キット付属の基質混合液を５０μＬ／ｗｅｌｌ添加し、遮光下、室温で３０分間インキュベートした。インキュベート後、反応停止液５０μＬ／ｗｅｌｌを添加した。反応停止後、マイクロプレートリーダーを用いて波長４９０ｎｍにて吸光度を測定した。なお、陽性コントロールとして市販のヤギ抗ＨＮＴポリクローナル抗体（Ｒ＆Ｄシステムズ社）を、陰性コントロールとしてＨＮＴと反応しないことが予め明らかである抗体（Ｋ７１２４）を用いた。
【０１１４】
標的細胞として膵臓癌由来細胞株ＱＧＰ−１を用いて同様の方法でＣＤＣ活性を測定した。なお、陽性コントロールとして市販のヤギ抗ＨＮＴポリクローナル抗体（Ｒ＆Ｄシステムズ社）を、陰性コントロールとしてＨＮＴと反応しないことが予め明らかである市販のヤギポリクローナル抗体を用いた。
【０１１５】
細胞傷害活性は、以下の通り求めた。
細胞傷害活性（％）＝（Ａ−Ｂ−Ｃ）／（Ｄ−Ｃ）×１００
Ａ：[各試料における吸光度]−[培養液のバックグラウンドの吸光度]
Ｂ：[補体に由来するＬＤＨによる吸光度]−[培養液のバックグラウンドの吸光度]
Ｃ：[標的細胞から自然に放出されるＬＤＨによる吸光度]−[培養液のバックグラウン
ドの吸光度]
Ｄ：[０．９％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００添加により標的細胞から１００％放出されたＬＤＨによる吸光度] −[培養液のバックグラウンドの吸光度]
【０１１６】
ハイブリドーマＰＰＺ４０３４、ＰＰＺ４０３８、ＰＰＺ４０７０のＣＤＣ活性の測定結果を表２に示した。
【０１１７】
【表２】
【０１１８】
実施例６ 全長ＨＮＴ発現ＣＨＯ細胞に対する抗ＨＮＴ抗体の細胞傷害活性（ＡＤＣＣ活性）
ＡＤＣＣ活性の測定は、標的細胞に内在する乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の放出を指標にする方法によった。具体的には、ＣｙｔｏＴｏｘ９６ Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（プロメガ社製）を用い、キットに添付のプロトコールに従って以下の通り実施した。
【０１１９】
（１）エフェクター細胞の調製
Ｃ３Ｈマウス（８週齢、オス、埼玉実験動物）から脾臓を摘出し、１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地中で脾細胞を分離した。同培地で洗浄後、細胞濃度を５×１０6個／ｍＬに調製し、５００Ｕ／ｍＬ ヒトＩＬ−２（ＰＥＰＲＯＴＥＣＨＥＣ社製）、１０ｎｇ／ｍＬ マウスＧＭ−ＣＳＦ（ＰＥＰＲＯＴＥＣＨＥＣ社製）存在下で３日間培養した。測定当日、脾細胞を回収し、５％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地（フェノールレッド不含）で洗浄後、同培地で１．２５×１０7個／ｍＬに調製し、エフェクター細胞とした。
【０１２０】
（２）標的細胞の調製
標的細胞として、全長ＨＮＴ発現ＣＨＯ細胞を用いた。細胞をプレートから剥離後、５％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地（フェノールレッド不含）に懸濁し、２×１０4個／ｗｅｌｌとなるように９６ウェルＵ底プレート（Beckton Dickinson社製）に２０μＬ／ｗｅｌｌ分注した。
【０１２１】
（３）ＡＤＣＣ活性の測定
標的細胞にハイブリドーマの培養上清を３０μＬ／ｗｅｌｌ分注した後、３０分間インキュベーションした。次いで、エフェクター細胞を３０μＬ／ｗｅｌｌ分注し、炭酸ガスインキュベーター中で４時間培養した。培養後、５０μＬの上清を回収し、平底の酵素アッセイ用プレートへ移した。そこへ、キット付属の基質混合液を５０μＬ／ｗｅｌｌ添加し、遮光下、室温で３０分間インキュベートした。インキュベート後、反応停止液５０μＬ／ｗｅｌｌを添加し、マイクロプレートリーダーを用いて波長４９０ｎｍにて吸光度を測定した。
【０１２２】
細胞傷害活性は、以下の通り求めた。
細胞傷害活性（％）＝（Ａ−Ｂ−Ｃ）／（Ｄ−Ｃ）×１００
Ａ：[各試料における吸光度]−[培養液のバックグラウンドの吸光度]
Ｂ：[エフェクター細胞に由来するＬＤＨによる吸光度]−[培養液のバックグラウンドの吸光度]
Ｃ：[標的細胞から自然に放出されるＬＤＨによる吸光度]−[培養液のバックグラウンドの吸光度]
Ｄ：[０．９％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００添加により標的細胞から１００％放出されたＬＤＨによる吸光度] −[培養液のバックグラウンドの吸光度]
【０１２３】
３種のハイブリドーマについての結果を表３に示した。表中、陰性対照とはＨＮＴに反応性を示さないことが事前に判明している抗体である。この陰性対照の抗体が示したＡＤＣＣ活性値１４．３％に対し、２０％以上の高いＡＤＣＣ活性を示す結果が得られた。
【０１２４】
【表３】
【図面の簡単な説明】
【０１２５】
【図１】正常組織（Ａ）及び各種癌組織（Ｂ）におけるＨＮＴｍＲＮＡを示す。
【図２】膵臓癌患者より採取した腫瘍組織の癌部のＨＮＴｍＲＮＡの発現を示す。
【図３】各種細胞に抗ＨＮＴ抗体を反応させてフローサイトメトリーを行った結果を示す。横軸の正の方向へのピークのシフトが大きいほど抗ＨＮＴ抗体が結合した細胞数が多いことを表す。Ａ：ＨＮＴ発現ＣＨＯ細胞、Ｂ：膵臓癌由来細胞株ＱＧＰ−１、Ｃ:ＣＨＯ細胞、Ｄ：膵臓癌由来細胞株ＰＫ−４５Ｐ
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗ＨＮＴ抗体を利用した癌の診断薬及び治療薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、癌細胞に特異的に発現されているタンパク質を標的にした癌の診断および治療方法の開発が盛んである。すなわち、癌細胞に高発現であるが、正常組織では発現が少ないかあるいは発現していない細胞表面タンパク質をターゲットとして、血液および組織等を用いた診断および治療を行う方法である。既に、ハーセプチン等の診断および治療薬が臨床の場に提供され、多くの患者の治療に貢献しているが、全ての癌患者に奏効するというわけではなく、癌に特異性が高く発現しているタンパク質を標的とする治療薬の開発がさらに望まれている。
【０００３】
肺癌は、癌の中でも最も多い癌種の１つであり、癌による死亡原因の上位を占める。例えば、米国において２００６年度に新たに癌であると診断された患者の約１２％が肺癌であり、同年の癌による死亡の２９％が肺癌を原因とする死亡であると予測されている（非特許文献１）。早期発見の手段として、胸部Ｘ線撮影、喀痰による細胞診、またスパイラ
ルＣＴ等が挙げられるが、十分な効果がなく、肺癌はいまだ癌による死亡原因の上位を占めている。
治療面では、外科手術、放射線療法、化学療法に加えて、分子標的薬の開発が盛んに行われている。上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）チロシンキナーゼ阻害剤であるゲフィチニブ、エルロチニブなどが挙げられ、一部の癌に顕著な効果を示している。しかし、全ての肺癌患者に効果があるわけではなく、また、有害事象についても報告されている。そのため、新たな作用機序を持つ分子標的薬の開発が求められている。
【０００４】
腎臓癌に対しては、画像検査技術の進歩により早期発見症例が増えた反面、いまだに遠隔転移を有する症例が減っていないのが現状である。成人の腎臓癌の大多数を占める癌腎細胞癌では、他の癌腫で通常行われる化学療法や放射線療法はほとんど効果を示さないとされている（非特許文献２）。そのため、早期外科的切除が有効とされているが、根治的切除不能例や再発例のような進行性腎細胞癌には有効な治療法がない。その反面、一部の症例に対してインターフェロンα（ＩＦＮα）やインターロイキン２といった免疫療法が奏効することが腎細胞癌の特徴であり、日本では進行性腎細胞癌の治療には広くＩＦＮαが用いられている。しかし、進行性腎細胞癌症例に対するＩＦＮαの奏功率は１０−２０％程度に過ぎない（非特許文献３）。従って、簡便かつ的確な早期発見技術および有効な治療法が望まれている。
【０００５】
大腸癌は、米国の統計資料の２００６年度の予測によれば、男女共に３番目に多い癌種であり、その発生率は１９９８年から２００２年にかけては毎年１．８％づつ増加している（非特許文献１）。浸潤していない癌については、内視鏡的粘膜切除術等の外科的切除が非常に有効であり死亡率は減少している。しかし、腸壁に浸潤しリンパ節転移を来たした大腸癌では、外科的手術と化学療法剤や放射線療法を併用する等の治療法が一般に行われている（非特許文献１）。このような状況の中で、新たな分子標的薬である、血管内皮成長因子受容体（ＶＥＧＦＲ）阻害剤であるベバシズマブ、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に対する抗体であるセツキシマブが開発されている。しかし、これらが奏功するのは大腸癌の一部の症例に対してのみであり、異なる分子を標的とする新たな治療薬がさらに必要である。
【０００６】
膵臓癌患者は、毎年増加する傾向にあり、２００１年の日本国内の年間死亡者数は、約２万人である。また、男性の癌死の第５位、女性の癌死の第６位をそれぞれ占めている。膵臓癌は予後が悪く、切除例の５年生存率は５〜２０％である。膵臓癌の予後が悪い原因は、癌病巣が２ｃｍ程のときに、既に膵臓の外に浸潤をきたし、肝臓に転移するケースが多いためである。従って、膵臓癌は早期診断が非常に重要であるが、現在のところ膵臓癌が周囲臓器に浸潤する前に診断する方法は、存在していない。
【０００７】
日本国内の全国調査では、最初に膵臓癌を発見した方法として、ＣＴが４４％と最も多く、超音波が４１％である。従って、現在この２つの検査方法が膵臓癌の診断に重要である。しかし、現在一般的に使用されているＣＴの場合、癌組織と非癌組織の区別がつきにくく、診断に熟練した技術を要する。膵臓癌の腫瘍マーカーには、ＣＡ１９−９、ＤＵＰＡＮ-２、Ｓｐａｎ−１、ＣＥＡなどがある。これらのマーカーは、いずれも進行癌で陽性となるが、早期の診断率は低く、早期診断に有用と言えるマーカーはない。さらに、ＣＡ１９−９は肝炎、肝硬変、膵炎のような非悪性腫瘍でも血中濃度が上昇するため、膵臓癌の診断への使用は、適切ではないことが知られている。
【０００８】
ＦＤＧ−ＰＥＴによる膵臓癌診断も実施されているが、検査コストが高いことや、画像の分解能が悪い、などといった問題がある。従って、ＰＥＴ検査の費用対効果や効率を考慮した場合、膵臓癌組織を特異的に認識するプローブを開発し、高精度な診断方法を開発することが望まれている。
【０００９】
一方、膵臓癌の治療は、手術、化学療法、放射線療法により行われる。全症例のうち切除が可能なものは、４０％以下である。術後の５年生存率は５〜２０％と、極めて低い。手術による合併症の併発も多く、問題となっている。局所進展や遠隔転移によって見つかった膵臓癌の多くは、手術適応にはならず、化学療法や放射線療法を適応する。放射線療法は、消化管への負担が少ないため、外来でも施行可能であるため、近年では症例が増加する傾向にある。
【００１０】
従って、膵臓癌診断においては、簡便かつ的確な検査が可能な新たな膵臓癌診断マーカーが求められている。また、膵臓癌の治療においては、非侵襲的で、かつ効果的な治療方法、すなわち、膵臓癌細胞に対して特異的に傷害を与える治療薬の開発が望まれている。
【００１１】
ニューロトリミン（以下、ＨＮＴと表記することもある。)は1995年にラットの脳で発生段階で発現する膜蛋白をコードする遺伝子として最初に発表された(非特許文献４) 。その後、この分子が進化的に保存された脳で発現する接着分子の１群として認識され、脳の発達における神経回路形成に関連する分野で研究が進んだ。
接着分子は大きく4つのクラスとして分類されインテグリン、カドヘリン、セレクチン、イムノグロブリン様スーパーファミリー（ＩｇＳＦ)が知られているが、ＨＮＴは、神経細胞同士の接着や神経軸索の伸張に重要な働きをすると考えられているＩｇＳＦに属している。ＩｇＳＦは、膜貫通ドメインをもつ群と膜貫通ドメインをもたないglycosylphosphatidylinositol(ＧＰＩ)アンカー型の接着分子群に分類されるが、ニューロトリミンはＧＰＩアンカー型の分子に属する。
ＧＰＩアンカー型に分類される分子は、哺乳動物から発見された分子の頭文字をとってＩｇＬＯＮサブファミリーと総称される。このＩｇＬＯＮファミリーの構造上の特徴はＧＰＩアンカーで膜状に発現し、イムノグロブリンドメインを3個有することである。
ＩｇＬＯＮファミリーの接着因子は、発生初期から脳に発現し、神経回路の形成に関わるとされている。軸索の繊維束化や神経突起形成、成長円錐(growth cone guidance)を誘導し、特定の神経細胞同士のシナプス形成に関与すると考えられている。ニューロトリミンは、脳橋、小脳と視床に強く発現していることが知られている。
【００１２】
ニューロトリミンと癌との関連については、上皮性卵巣癌で発現が亢進しているという報告（非特許文献５）がある。しかし、特許文献１においては、ニューロトリミンを卵巣癌および大腸癌の癌抑制遺伝子であると同定し、ニューロトリミンの機能を補う癌の治療、および、ニューロトリミンの機能の低下を検出することによる診断方法を開示している。また、特許文献２にも、ＨＮＴと同様にＩｇ様スーパーファミリーに属するＮＣＡＭが、癌では細胞膜上への発現が減少し、接触阻害（contact inhibition）を失うことにより癌細胞の増殖をもたらすことから、ＨＮＴとそのホモローグが癌抑制遺伝子として作用することを示唆している(非特許文献６)。
一方、特許文献３は、ＩｇＣＡＭファミリーの１つであるＧＰＩＭが肺癌、大腸癌、子宮癌、胃癌、乳癌で発現が亢進しているという文献（非特許文献７）を根拠として、ニューロトリミンのバリアントが、同様に肺癌、大腸癌、子宮癌、胃癌、乳癌で発現が亢進しており、抗体やアンチセンス核酸による治療の標的として利用できることを主張しているが、実際にニューロトリミンまたはそのバリアントについてデータを示しているわけではない。非特許文献５に示される通り、ＩｇＬＯＮファミリーに属するＯＰＣＭＬ、ＨＮＴ、ＬＳＡＭＰ、ＮＥＧＲ１などが必ずしも同一の発現傾向を示さないことは明らかであり、ニューロトリミンまたはそのバリアントが、癌細胞の細胞膜上に抗体を利用とした治療の標的として利用できる程の発現があると予測可能であるという蓋然性はない。
このように、ＨＮＴ遺伝子産物が癌細胞の細胞膜上に、抗体を用いた治療薬の標的として利用できる程度に発現しているという報告はない。
【非特許文献１】American Cancer Society, Cancer Facts and Figures 2006
【非特許文献２】J Urol．2000；163:408-17、Lancet.1998;352:1691-6
【非特許文献３】J Urol. 1999；161:381-7、Lancet．1999;353:14-7
【非特許文献４】J. Neurosci. 1995 15: 2141-2156
【非特許文献５】Clin Cancer Res. 2005 11:5764-8
【非特許文献６】J.Cell Biol. 1991 115:1751-1761
【非特許文献７】Oncogene 2002 21;3089-3094
【特許文献１】国際公開第03/002765号パンフレット
【特許文献２】米国特許出願公開第2003/0100485号明細書
【特許文献３】国際公開第04/039942号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、上記事情に鑑み、癌において特異的に発現するタンパク質を見出し、これを標的とすることによる癌の新規な診断方法、診断キットおよび治療薬の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、各種癌組織を用いたＤＮＡマイクロアレイによる遺伝子発現解析の結果より、ＨＮＴ遺伝子の発現量が癌組織において特異的に多いことを見出した。さらに、ＨＮＴタンパク質に対する抗体を作製し、ＨＮＴ発現ＣＨＯ細胞、膵臓癌由来細胞株であるＱＧＰ−１への抗ＨＮＴ抗体の投与によって、ＣＤＣおよび／あるいはＡＤＣＣ活性が測定されることを示した。すなわち、抗ＨＮＴ抗体の投与により癌細胞の細胞死が起こり、抗ＨＮＴ抗体を癌治療薬として用いることができる。また、抗ＨＮＴ抗体に放射性同位元素等の細胞障害活性物質を結合したものは、癌細胞を細胞死させる癌治療薬として用いることができる。
【００１５】
すなわち、本発明は、抗ＨＮＴ抗体を含有する癌、好ましくは肺癌、腎臓癌、大腸癌、膵臓癌からなる群より選択される癌の診断薬及び治療薬を提供するものである。また、本発明は、被験者から採取された試料に抗ＨＮＴ抗体を反応させ、あるいは被験者に抗ＨＮＴ抗体を投与して、ＨＮＴタンパク質を検出することを特徴とする癌の診断方法を提供するものである。
特に、本発明は以下の診断薬、診断方法、治療薬を提供するものである。
（１）抗ＨＮＴ抗体を含有する癌診断薬。
（２）癌が、肺癌、腎臓癌、大腸癌または膵臓癌である（１）に記載の癌診断薬。
（３）抗ＨＮＴ抗体がＨＮＴタンパク質細胞外領域と結合する抗体である（１）又は（２）記載の癌診断薬。
（４）血液中、血清中、血漿中または臓器組織に抗ＨＮＴ抗体を反応させてＨＮＴタンパク質を検出することにより使用されるものである（１）〜（３）のいずれか一に記載の癌診断薬。
（５）標識した抗ＨＮＴ抗体を投与後画像診断によりＨＮＴタンパク質を検出することにより使用されるものである（１）〜（３）のいずれか一に記載の癌診断薬。
（６）癌患者のうち、治療対象患者を選択するための診断薬である（１）〜（５）のいずれか一に記載の癌診断薬。
（７）被験者から採取された試料に抗ＨＮＴ抗体を反応させ、当該試料中のＨＮＴタンパク質を検出することを特徴とする癌の診断方法。
（８）癌が、肺癌、腎臓癌、大腸癌または膵臓癌である（７）に記載の癌の診断方法。
（９）被験者から採取された試料が血液、血清、血漿または臓器組織である（７）又は（８）記載の癌の診断方法。
（１０）抗ＨＮＴ抗体を有効成分とする癌治療薬。
（１１）癌が、肺癌、腎臓癌、大腸癌または膵臓癌である（１０）に記載の癌治療薬。
（１２）抗ＨＮＴ抗体がＨＮＴタンパク質細胞外領域と結合する抗体である（１０）又は（１１）記載の癌治療薬。
（１３）抗ＨＮＴ抗体が細胞傷害活性を有する抗体である（１０）〜（１２）いずれか一に記載の癌治療薬。
（１４）抗ＨＮＴ抗体がアイソトープ標識あるいは細胞傷害活性を有する化合物を結合させた抗体である（１０）〜（１２）のいずれか一に記載の癌治療薬。
【発明の効果】
【００１６】
本発明に係るＨＮＴタンパク質を検出することにより、癌の診断が可能となる。癌細胞膜上に発現する分子は、癌細胞の細胞死、あるいはＨＮＴのＧＰＩアンカーの開裂（Oncogene, 21,3089-3094, 2002）などによって血中に移行することが予測される。また、癌細胞膜上に発現するＨＮＴタンパク質を標的とすることにより、癌の治療の実施が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明により、診断及び治療される疾患は、癌、好ましくは肺癌、腎臓癌、大腸癌、膵臓癌からなる群より選択される癌である。診断及び治療の対象となる動物は、ヒトであることが好ましいが、イヌ、ネコ、ウサギ、マウス、ラット、モルモット等の哺乳類でも良い。
【００１８】
本発明において癌の診断を行う場合、被験者の血液中および臓器組織にＨＮＴタンパク質が検出された場合に、被験者が癌である可能性が高いと判定される。また、癌と診断された患者の血液あるいは組織中ＨＮＴタンパク質濃度を測定することにより、その患者が治療対象患者か否かを判定すること（治療対象患者の選択）ができる。さらに、癌の治療後、ＨＮＴタンパク質測定において、ＨＮＴタンパク質の量が術前より減少した場合、治療の経過が良好であると判定される。一方、治療後のＨＮＴタンパク質の量が低下しないあるいは増加する場合には、再発および転移があると判定される。癌の診断は、画像診断、生検および血液診断により行うことができる。
【００１９】
画像診断においては、標識した抗ＨＮＴ抗体を投与後画像診断によりＨＮＴタンパク質を検出することにより行うことができる。より具体的には、抗ＨＮＴ抗体に、標識物質として放射性同位元素で標識したプローブを被験者に投与し、ＰＥＴまたはＳＰＥＣＴで癌組織を検出することができる。使用する放射性同位元素は、当業者に公知の物質を用いることができるが、好ましくは陽電子放出放射性同位元素であり、さらに好ましくは11Ｃ、13Ｎ、18Ｆ、15Ｏ、94mＴｃ、124Ｉである。抗ＨＮＴ抗体への放射性同位元素の標識は、当業者公知の方法により行うことができる。
【００２０】
生検により癌の診断を行う方法としては、被験者から得られた臓器組織を試料として、免疫学的測定法を行うことができる。例えば、ラジオイムノアッセイ、エンザイムイムノアッセイ、蛍光イムノアッセイ、発光イムノアッセイ、免疫沈降法、免疫比濁法、ウェスタンブロット、免疫染色、免疫拡散法などを挙げることができるが、好ましくは免疫染色である。免疫染色などの上述した免疫学的方法は当業者に公知の方法により行うことが可能である。
【００２１】
生検により癌の診断を行う他の様態として、抗ＨＮＴ抗体を一次抗体として使用した免疫組織学的染色法を行うことができる。具体的には、被験者から得られた検体を公知の方法によりパラフィンや凍結等により固定し、切片を作製する。次いで、切片を一次抗体として抗ＨＮＴ抗体、二次抗体としてＩｇＧを認識するビオチン標識抗体をそれぞれ用いて処理する。二次抗体は、ＩｇＧを認識する公知の抗体を用いることができ、例えばウサギ抗ＩｇＧ抗体などを挙げることができる。二次抗体に標識物質を結合させ、それぞれの標識物質に適した公知の方法により、切片中のＨＮＴタンパク質の有無を検出する。また、二次抗体を使用せず、抗ＨＮＴ抗体に標識物質を結合させ、免疫組織学的染色法を行うこともできる。標識物質は当業者公知の物質を用いることができるが、例えばペルオキシターゼ、ＦＩＴＣなどを挙げることができる。抗体と標識物質の結合は、当業者に公知の方法で行うことができ、具体的には、ストレプトアビジンとビオチンを利用した結合方法を挙げることができる。
【００２２】
癌の診断を行う他の様態としては、被験者から得られた血液、血清、または血漿を試料として、免疫学的測定法を行うことができる。例えば、ラジオイムノアッセイ、エンザイムイムノアッセイ、蛍光イムノアッセイ、発光イムノアッセイ、免疫沈降法、免疫比濁法、ウェスタンブロット、免疫拡散法などを挙げることができるが、好ましくはエンザイムイムノアッセイであり、特に好ましいのは酵素結合免疫吸着定量法(enzyme-linked immunosorbent assay：ＥＬＩＳＡ)（例えば、sandwich ELISA）である。ＥＬＩＳＡなどの上述した免疫学的方法は当業者に公知の方法により行うことが可能である。
【００２３】
血液、血清、または血漿を検体とした癌の診断方法としては、例えば、抗ＨＮＴ抗体を支持体に固定し、ここに被検試料を加え、インキュベートを行い抗ＨＮＴ抗体とタンパク質を結合させた後に洗浄して、抗ＨＮＴ抗体を介して支持体に結合したＨＮＴタンパク質の検出を行う方法を挙げることができる。
【００２４】
本発明において抗ＨＮＴ抗体を固定するために用いられる支持体としては、例えば、アガロース、セルロースなどの不溶性の多糖類、シリコーン樹脂、ポリスチレン樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、ナイロン樹脂、ポリカーボネイト樹脂などの合成樹脂や、ガラス、フェライトなどの不溶性の支持体を挙げることができる。これらの支持体は、ビーズやプレートなどの形状で用いることが可能である。ビーズの場合、これらが充填されたカラムなどを用いることができる。プレートの場合、マルチウェルプレート（９６穴マルチウェルプレート等）、やバイオセンサーチップなどを用いることができる。抗ＨＮＴ抗体と支持体との結合は、化学結合や物理的な吸着などの通常用いられる方法により結合することができる。これらの支持体はすべて市販のものを用いることができる。
【００２５】
抗ＨＮＴ抗体と試料中のＨＮＴタンパク質の結合は、通常、緩衝液中で行われる。緩衝液としては、例えば、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ 緩衝液、クエン酸緩衝液、ホウ酸塩緩衝液、炭酸塩緩衝液などが使用され、通常用いるｐＨの範囲であればよい。また、インキュベーションの条件としては、すでによく用いられている条件、例えば、４℃〜３７℃にて１時間〜２４時間のインキュベーションが行われる。インキュベート後の洗浄は、抗ＨＮＴ抗体とＨＮＴタンパク質の結合を妨げないものであれば何でもよく、例えば、Ｔｗｅｅｎ−２０等の界面活性剤を含む緩衝液などが使用される。
【００２６】
本発明によるＨＮＴタンパク質の検出方法においては、ＨＮＴタンパク質を検出したい被検試料の他に、コントロール試料を設置してもよい。コントロール試料としては、ＨＮＴタンパク質を含まない陰性コントロール試料やＨＮＴタンパク質を含む陽性コントロール試料などがある。この場合、ＨＮＴタンパク質を含まない陰性コントロール試料で得られた結果と、ＨＮＴタンパク質を含む陽性コントロール試料で得られた結果と比較することにより、被検試料中のＨＮＴタンパク質を検出することが可能である。また、濃度を段階的に変化させた一連のコントロール試料を調製し、各コントロール試料に対する検出結果を数値として得て、標準曲線を作成し、被検試料の数値から標準曲線に基づいて、被検試料に含まれるＨＮＴタンパク質を定量的に検出することも可能である。
【００２７】
抗ＨＮＴ抗体を介して支持体に結合したＨＮＴタンパク質の検出の好ましい態様として、標識物質で標識された抗ＨＮＴ抗体を用いる方法を挙げることができる。例えば、支持体に固定された抗ＨＮＴ抗体に被検試料を接触させ、洗浄後に、ＨＮＴタンパク質を特異的に認識する標識抗体を用いて検出する。
【００２８】
抗ＨＮＴ抗体の標識は通常知られている方法により行うことが可能である。標識物質としては、蛍光色素、酵素、補酵素、化学発光物質、放射性物質などの当業者に公知の標識物質を用いることが可能であり、具体的な例としては、ラジオアイソトープ(32P、14C、125I、3H、131Iなど)、フルオレセイン、ローダミン、ダンシルクロリド、ウンベリフェロン、ルシフェラーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、β-グルコシダーゼ、ホースラディッシュパーオキシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、サッカリドオキシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼ、ビオチン、ルテニウムなどを挙げることができる。標識物質としてビオチンを用いる場合には、ビオチン標識抗体を添加後に、ペルオキシダーゼなどの酵素を結合させたストレプトアビジンをさらに添加することが好ましい。標識物質と抗ＨＮＴ抗体との結合には、グルタルアルデヒド法、マレイミド法、ピリジルジスルフィド法、過ヨウ素酸法、などの公知の方法を用いることができる。
【００２９】
具体的には、抗ＨＮＴ抗体を含む溶液をプレートまたはビーズなどの支持体に加え、抗ＨＮＴ抗体を支持体に固定する。プレート、またはビーズを洗浄後、タンパク質の非特異的な結合を防ぐため、例えばＢＳＡ、ゼラチン、アルブミンなどでブロッキングする。再び洗浄し、被検試料をプレートまたはビーズに加える。インキュベートの後、洗浄し、標識抗ＨＮＴ抗体を加える。適度なインキュベーションの後、プレートまたはビーズを洗浄し、支持体に残った標識抗ＨＮＴ抗体を検出する。検出は当業者に公知の方法により行うことができ、例えば、放射性物質による標識の場合には液体シンチレーションやＲＩＡ法により検出することができる。酵素による標識の場合には基質を加え、基質の酵素的変化、例えば発色を吸光度計により検出することができる。基質の具体的な例としては、２，２−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）ジアンモニウム塩（ＡＢＴＳ）、１，２−フェニレンジアミン（オルソ−フェニレンジアミン）、３，３'，５，５'−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）などを挙げることができる。蛍光物質または化学発光物質の場合にはルミノメーターにより検出することができる。
【００３０】
本発明のＨＮＴタンパク質検出方法の特に好ましい態様として、ビオチンで標識された抗ＨＮＴ抗体と、ストレプトアビジンを用いる方法を挙げることができる。
【００３１】
具体的には、抗ＨＮＴ抗体を含む溶液をプレートなどの支持体に加え、抗ＨＮＴ抗体を固定する。プレートを洗浄後、タンパク質の非特異的な結合を防ぐため、例えばＢＳＡなどでブロッキングする。再び洗浄し、被検試料をプレートに加える。インキュベートの後、洗浄し、ビオチン標識抗ＨＮＴ抗体を加える。適度なインキュベーションの後、プレートを洗浄し、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼなどの酵素と結合したアビジンを加える。インキュベーション後、プレートを洗浄し、アビジンに結合している酵素に対応した基質を加え、基質の酵素的変化などを指標にＨＮＴタンパク質を検出する。
【００３２】
本発明のＨＮＴタンパク質検出方法の他の態様として、ＨＮＴタンパク質を特異的に認識する一次抗体を一種類以上、および該一次抗体を特異的に認識する二次抗体を一種類以上用いる方法を挙げることができる。
【００３３】
例えば、支持体に固定された一種類以上の抗ＨＮＴ抗体に被検試料を接触させ、インキュベーションした後、洗浄し、洗浄後に結合しているＨＮＴタンパク質を、一次抗ＨＮＴ抗体、および該一次抗体を特異的に認識する一種類以上の二次抗体により検出する。この場合、二次抗体は好ましくは標識物質により標識されている。
【００３４】
本発明のＨＮＴタンパク質の検出方法の他の態様としては、凝集反応を利用した検出方法を挙げることができる。該方法においては、抗ＨＮＴ抗体を感作した担体を用いてＨＮＴタンパク質を検出することができる。抗体を感作する担体としては、不溶性で、非特異的な反応を起こさず、かつ安定である限り、いかなる担体を使用してもよい。例えば、ラテックス粒子、ベントナイト、コロジオン、カオリン、固定羊赤血球等を使用することができるが、ラテックス粒子を使用するのが好ましい。ラテックス粒子としては、例えば、ポリスチレンラテックス粒子、スチレン−ブタジエン共重合体ラテックス粒子、ポリビニルトルエンラテックス粒子等を使用することができるが、ポリスチレンラテックス粒子を使用するのが好ましい。感作した粒子を試料と混合し、一定時間攪拌する。試料中にＨＮＴタンパク質が高濃度で含まれるほど粒子の凝集度が大きくなるので、凝集を肉眼でみることによりＨＮＴタンパク質を検出することができる。また、凝集による濁度を分光光度計等により測定することによっても検出することが可能である。
【００３５】
本発明のタンパク質の検出方法の他の態様としては、例えば、表面プラズモン共鳴現象を利用したバイオセンサーを用いた方法を挙げることができる。表面プラズモン共鳴現象を利用したバイオセンサーはタンパク質−タンパク質間の相互作用を微量のタンパク質を用いてかつ標識することなく、表面プラズモン共鳴シグナルとしてリアルタイムに観察することが可能である。例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（Biacore International AB社製）等のバイオセンサーを用いることにより抗ＨＮＴ抗体とＨＮＴタンパク質との結合をそれぞれ検出することが可能である。具体的には抗ＨＮＴ抗体を固定化したセンサーチップに、被検試料を接触させ抗ＨＮＴ抗体に結合するＨＮＴタンパク質を共鳴シグナルの変化としてそれぞれ検出することができる。
【００３６】
本発明の検出方法は、種々の自動検査装置を用いて自動化することもでき、一度に大量の試料について検査を行うことも可能である。
【００３７】
本発明の癌の診断薬は、キットの形態であってもよい。本発明の癌の診断薬は少なくとも抗ＨＮＴ抗体を含む。該診断薬がＥＬＩＳＡ法等のＥＩＡ法に基づく場合は、抗体を固相化する担体を含んでいてもよく、抗体があらかじめ担体に結合していてもよい。該診断薬がラテックス等の担体を用いた凝集法に基づく場合は抗体が吸着した担体を含んでいてもよい。また、該診断薬は、適宜、ブロッキング溶液、反応溶液、反応停止液、試料を処理するための試薬等を含んでいてもよい。
【００３８】
本発明の生検組織および血液などの試料を用いた診断用抗ＨＮＴ抗体は、ＨＮＴタンパク質にそれぞれ特異的に結合すればよく、その由来、種類（モノクローナル、ポリクローナル）および形状を問わない。具体的には、マウス抗体、ラット抗体、トリ抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体などの公知の抗体を用いることができる。抗体はポリクローナル抗体でもよいが、モノクローナル抗体であることが好ましく、高感度で特異的な測定が可能であれば、市販されている抗体を使用してもよい。
【００３９】
又、支持体に固定される抗ＨＮＴ抗体と標識物質で標識される抗ＨＮＴ抗体は、ＨＮＴタンパク質の同じエピトープを認識してもよいが、異なるエピトープを認識することが好ましく、部位は特に制限されない。
【００４０】
本発明においてＨＮＴタンパク質細胞外領域とは、配列番号１に示すアミノ酸配列の１〜３２０番目のアミノ酸をいう。アミノ酸配列には、置換・欠失等の変異が含まれることもある。
【００４１】
本発明者らは、ＨＮＴタンパク質が癌細胞の細胞膜上に高発現していることを見出した。よって、本発明において癌の治療を行う場合、抗ＨＮＴ抗体と癌細胞に発現したＨＮＴタンパク質を特異的に結合させ、癌細胞に傷害を与えることにより行うことができる。細胞傷害は、抗ＨＮＴ抗体の細胞傷害活性、例えばＡＤＣＣ活性又はＣＤＣ活性を利用することができる。さらに、本発明で使用される抗体は、糖鎖を改変された抗体であっても良い。抗体の糖鎖を改変することにより、抗体の細胞傷害活性を増強できる。また、癌治療に用いられる抗体は、抗癌作用を有する抗体であれば良く、抗腫瘍効果のある物質を結合させた抗体でも良い。抗体に結合させる事により腫瘍に特異的に集積させることが可能であるため、強い副作用を持つ薬物であっても治療に用いることができる。抗腫瘍効果を持つ薬物や放射性同位元素を結合させた抗体により、癌の治療が可能である。
【００４２】
本発明における細胞傷害活性とは、例えば抗体依存性細胞介在性細胞傷害 (antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity:ＡＤＣＣ)活性、補体依存性細胞傷害 (complement-dependent cytotoxicity:ＣＤＣ)活性などを挙げることができる。本発明においてＣＤＣ活性とは補体系による細胞傷害活性を意味し、ＡＤＣＣ活性とは標的細胞の細胞表面抗原に特異的抗体が付着した際、そのＦｃ部分にＦｃγ受容体保有細胞（免疫細胞等）がＦｃγ受容体を介して結合し、標的細胞に傷害を与える活性を意味する。
【００４３】
抗ＨＮＴ抗体がＡＤＣＣ活性を有するか否か、又はＣＤＣ活性を有するか否かは公知の方法により測定することができる。例えば、予め標的細胞に取り込ませた放射性物質51Ｃｒの放出を指標にした方法［Martin R. et al. (1990) Fine specificity and HLArestriction of myelin basic protein-specific cytotoxic T cell lines from multiple sclerosis patients and healthy individuals. J. Immunol. 145, 540.等］、予め標的細胞に取り込ませた蛍光物質Ｃａｌｃｅｉｎの放出を指標にした方法［Lichtenfels R.et al. (1994) CARE-LASS (calcein-release-assay), an improved fluorescence-basedtest system to measure cytotoxic T lymphocyte activity. J. Immunol. Methods 172, 227.等］、標的細胞に内在する乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の放出を指標にした方法［Korzeniewski C. and Callewaert DM. (1983) An enzyme-release assay for natural cytotoxicity. J. Immunol. Methods 64, 313.等］が報告されている。
【００４４】
具体的には、まず、エフェクター細胞、補体溶液、標的細胞の調製を行う。
（１）エフェクター細胞の調製
ＢＡＬＢ／ｃマウスなどから脾臓を摘出し、ＲＰＭＩ１６４０培地(Invitrogen社製)中で脾臓細胞を分離する。５−１０％ウシ胎児血清(ＦＢＳ)を含む同培地で洗浄後、細胞濃度を５×１０6／ｍＬに調製し、エフェクター細胞を調製する。
【００４５】
（２）補体溶液の調製
Ｂａｂｙ Ｒａｂｂｉｔ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ(CEDARLANE社製)を５−１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０ (Invitrogen社製)にて適宜希釈し、補体溶液を調製する。
【００４６】
（３）標的細胞の調製
ＨＮＴを発現する細胞（ＨＮＴをコードする遺伝子で形質転換された細胞、膵癌細胞）を用意する。予め標的細胞に取り込ませた放射性物質51Ｃｒの放出を指標にした方法で細胞傷害活性を測定する場合は０．２ｍＣｉの51Ｃｒ-クロム酸ナトリウム(ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製)とともに、細胞を１０％ ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地中で３７℃にて１時間培養することにより放射体標識する。放射体標識後、細胞を１０％ ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地にて３回洗浄し、細胞濃度を２×１０5／ｍＬに調製して標的細胞を調製する。
【００４７】
予め標的細胞に取り込ませた蛍光物質の放出を指標にした方法で細胞傷害活性を測定する場合は２５μMのＣａｌｃｅｉｎ−ＡＭ［3',6'-Di(O-acetyl)-4',5'-bis[N,N-bis(carboxymethyl)aminomethyl]fluorescein, tetraacetoxymethyl ester］とともに、細胞をＰＢＳ（Phosphate-Buffered Saline）中で３７℃にて３０分間培養することにより蛍光標識する。蛍光標識後、細胞を５％ ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地（フェノールレッド不含）で２回洗浄し、細胞濃度を２×１０5／ｍＬに調製して標的細胞を調製する。標的細胞に内在する乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の放出を指標にした方法で細胞傷害活性を測定する場合には、細胞を濃度２×１０5／ｍＬに調製してそのまま用いる。
次いで、ＡＤＣＣ活性、又はＣＤＣ活性の測定を行う。ＡＤＣＣ活性の測定の場合は、９６ウェルＵ底プレート(Beckton Dickinson社製)に、標的細胞と、抗ＨＮＴ抗体を５０μＬずつ加え、氷上にて１５分間反応させる。その後、エフェクター細胞１００μＬを加え、炭酸ガスインキュベーター内で４時間培養する。培養後、１００μＬの上清を回収し、51Ｃｒの放出を指標とする場合にはガンマカウンター(COBRAIIAUTO-GMMA、MODELD5005、Packard Instrument Company社製)で放射活性を測定する。細胞傷害活性(％)は(Ａ−Ｃ)／(Ｂ−Ｃ)×１００により求めることができる。Ａは各試料における放射活性(ｃｐｍ)、Ｂは１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００などの界面活性剤を加えて細胞を全溶解した試料における放射活性(ｃｐｍ)、Ｃは標的細胞のみを含む試料の放射活性(ｃｐｍ)を示す。蛍光物質Ｃａｌｃｅｉｎの放出を指標とする場合には蛍光プレートリーダー（励起波長４８５ｎｍ／蛍光波長５２０ｎｍ）で蛍光強度を測定する。標的細胞に内在するＬＤＨの放出を指標とする場合には、ＬＤＨとＤｉａｐｈｏｒａｓｅの共役反応によってテトラゾリウム塩から生成される赤色のホルマザンをマイクロプレートリーダー（波長４９０ｎｍ）で測定する。
【００４８】
一方、ＣＤＣ活性の測定の場合は、９６ウェルU底プレート(Becton Dickinson社製)に、標的細胞５０μＬと、抗ＨＮＴ抗体２０μＬを加え、氷上にて３０分間反応させる。その後、補体溶液１０μＬを加え、炭酸ガスインキュベーター内で４時間培養する。培養後、５０μＬの上清を回収し、放射活性などを測定する。細胞傷害活性はＡＤＣＣ活性の測定と同様にして求めることができる。
【００４９】
さらに、抗ＨＮＴ抗体は、癌治療薬として癌組織に特異的にターゲティングさせるミサイル療法に用いることができる。すなわち、癌細胞に傷害をもたらす薬物を結合させた抗体を投与することにより、癌部特異的に移行させ、治療効果および副作用の軽減を意図した治療方法である。
薬物と抗体の結合は、当業者に公知の方法で行うことができる（Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ. ２００４ Ｊｕｌ １;１０(１３):４５３８-４９.）。抗体に結合させる薬物は、癌細胞に傷害をもたらす公知の物質を用いることができるが、好ましくは抗癌剤と毒素であり、さらに好ましくはＣａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ、ＤＭ１、ＤＭ４、リシン、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓエキソトキシンＡである。
【００５０】
癌治療に用いられる抗体は、ＨＮＴタンパク質と特異的に結合する抗体に、癌細胞に傷害をもたらす放射性同位元素を結合することにより、細胞傷害活性を付加あるいは増強させたものでもよい。抗体と放射性同位元素の結合は、当業者公知の方法により、行うことができる（Bioconjug Chem. 1994 Mar-Apr;5(2):101-4.）。利用する放射性同位元素は、当業者に公知の物質を用いることができるが、好ましくはβ線やα線を放出する核種であり、さらに好ましくは131Ｉ、99mＴｃ、111Ｉｎ、90Ｙである。
【００５１】
放射性同位元素を含む化合物を結合させた抗体を用いた癌治療は、当業者公知の方法により行うことができる（Bioconjug Chem. 1998 Nov-Dec;9(6):773-82.）。具体的には、最初に少量の放射性同位元素を含む化合物を結合させた抗体を患者に投与し、全身のシンチグラムを行う。正常組織の細胞と抗体の結合が少なく、癌細胞と抗体の結合が多いことを確認した上で、放射性同位元素を含む化合物を結合させた抗体を大量に投与する。
【００５２】
本発明の癌治療および画像診断に用いられる抗体は、ＨＮＴタンパク質と特異的に結合する限り、モノクローナル抗体であればキメラ抗体、ヒト化（ＣＤＲ移植）抗体、ヒト抗体のいずれであっても良い。また、それら抗体は、癌に対する治療効果があれば、市販されている抗体を使用してもよい。
【００５３】
本発明で使用される抗ＨＮＴ抗体は、公知の手段を用いてポリクローナルまたはモノクローナル抗体として得ることができる。本発明で使用される抗ＨＮＴ抗体として、哺乳動物由来あるいはトリ由来モノクローナル抗体が好ましい。特に、哺乳動物由来のモノクローナル抗体が好ましい。哺乳動物由来のモノクローナル抗体は、ハイブリドーマにより産生されるもの、および遺伝子工学的手法により抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した宿主に産生されるものを含む。
【００５４】
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、基本的には公知技術を使用し、以下のようにして作製できる。すなわち、ＨＮＴタンパク質を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞をスクリーニングすることによって作製できる。
具体的には、モノクローナル抗体を作製するには次のようにすればよい。
【００５５】
まず、抗体取得の感作抗原として使用されるＨＮＴタンパク質の遺伝子またはアミノ酸配列は公共の遺伝子データベース等より得ることが可能である。例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ ０１６５２２に開示された遺伝子／アミノ酸配列を用いて抗原タンパク質の調製をすることができる。すなわち、ＨＮＴタンパク質をコードするそれぞれの遺伝子配列を公知の発現ベクター系に挿入して適当な宿主細胞を形質転換させた後、その宿主細胞中または培養上清中から目的のＨＮＴタンパク質を公知の方法で精製する。また、天然のＨＮＴタンパク質を精製して用いることもできる。
【００５６】
次に、この精製ＨＮＴタンパク質を感作抗原として用いる。あるいは、ＨＮＴタンパク質の部分ペプチドを感作抗原として使用することもできる。この際、部分ペプチドはＨＮＴタンパク質のアミノ酸配列より化学合成により得ることもできるし、ＨＮＴ遺伝子の一部を発現ベクターに組込んで得ることもでき、さらに天然のＨＮＴタンパク質をタンパク質分解酵素により分解することによっても得ることができる。部分ペプチドとして用いるＨＮＴタンパク質の部分および大きさは限られない。
【００５７】
感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特に限定されるものではないが、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、一般的にはげっ歯類の動物、例えば、マウス、ラット、ハムスター、あるいはトリ、ウサギ、サル等が使用される。
【００５８】
感作抗原を動物に免疫するには、公知の方法にしたがって行われる。例えば、一般的方法として、感作抗原を哺乳動物の腹腔内または皮下に注射することにより行われる。具体的には、感作抗原をＰＢＳ（Phosphate-Buffered Saline）や生理食塩水等で適当量に希釈、懸濁したものに所望により通常のアジュバント、例えばフロイント完全アジュバントを適量混合し、乳化後、哺乳動物に４〜２１日毎に数回投与する。また、感作抗原免疫時に適当な担体を使用することもできる。特に分子量の小さい部分ペプチドを感作抗原として用いる場合には、アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン等の担体タンパク質と結合させて免疫することが望ましい。
【００５９】
このように哺乳動物を免疫し、血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、哺乳動物から免疫細胞を採取し、細胞融合に付されるが、好ましい免疫細胞としては、特に脾細胞が挙げられる。
【００６０】
前記免疫細胞と融合される他方の親細胞として、哺乳動物のミエローマ細胞を用いる。このミエローマ細胞は、公知の種々の細胞株、例えば、Ｐ３（P3x63Ag8.653）（J. Immnol.（1979）123, 1548-1550）、 P3x63Ag8U.1（Current Topics in Microbiology and Immunology（1978）81, 1-7）、 NS-1 （Kohler. G. and Milstein, C. Eur. J. Immunol.（1976）6, 511-519）、MPC-11（Margulies. D.H. et al., Cell（1976）8, 405-415）、SP2/0 （Shulman, M. et al., Nature（1978）276, 269-270）、FO（de St. Groth, S. F. et al., J. Immunol. Methods（1980）35, 1-21）、S194（Trowbridge, I. S. J. Exp. Med.（1978）148, 313-323）、R210（Galfre, G. et al., Nature（1979）277, 131-133）
等が好適に使用される。
【００６１】
前記免疫細胞とミエローマ細胞との細胞融合は、基本的には公知の方法、たとえば、ケーラーとミルステインらの方法（Kohler. G. and Milstein, C.、Methods Enzymol.（1981）73, 3-46）等に準じて行うことができる。
【００６２】
より具体的には、前記細胞融合は、例えば細胞融合促進剤の存在下に通常の栄養培養液中で実施される。融合促進剤としては、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、センダイウイルス（ＨＶＪ）等が使用され、さらに所望により融合効率を高めるためにジメチルスルホキシド等の補助剤を添加使用することもできる。
【００６３】
免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は任意に設定することができる。例えば、ミエローマ細胞に対して免疫細胞を１〜１０倍とするのが好ましい。前記細胞融合に用いる培養液としては、例えば、前記ミエローマ細胞株の増殖に好適なＲＰＭＩ１６４０培養液、ＭＥＭ培養液、その他、この種の細胞培養に用いられる通常の培養液が使用可能であり、さらに、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用することもできる。
【００６４】
細胞融合は、前記免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を前記培養液中でよく混合し、予め３７℃程度に加温したＰＥＧ溶液（例えば平均分子量１０００〜６０００程度）を通常３０〜６０％（ｗ／ｖ）の濃度で添加し、混合することによって目的とする融合細胞（ハイブリドーマ）を形成する。続いて、適当な培養液を逐次添加し、遠心して上清を除去する操作を繰り返すことによりハイブリドーマの生育に好ましくない細胞融合剤等を除去する。
【００６５】
このようにして得られたハイブリドーマは、通常の選択培養液、例えばＨＡＴ培養液（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液）で培養することにより選択される。上記ＨＡＴ培養液での培養は、目的とするハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間（通常、数日〜数週間）継続する。ついで、通常の限界希釈法を実施し、目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングおよび単一クローニングを行う。
【００６６】
目的とする抗体のスクリーニングおよび単一クローニングは、公知の抗原抗体反応に基づくスクリーニング方法で行えばよい。例えば、ポリスチレン等でできたビーズや市販の９６ウェルのマイクロタイタープレート等の担体に抗原を結合させ、ハイブリドーマの培養上清と反応させ、担体を洗浄した後に酵素標識二次抗体等を反応させることにより、培養上清中に感作抗原と反応する目的とする抗体が含まれるかどうか決定できる。目的とする抗体を産生するハイブリドーマを限界希釈法等によりクローニングすることができる。この際、抗原としては免疫に用いたものを用いればよい。
【００６７】
また、ヒト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイブリドーマを得る他に、ヒトリンパ球をｉｎ ｖｉｔｒｏで、ＨＮＴタンパク質に感作し、感作リンパ球をヒト由来の永久分能を有するミエローマ細胞と融合させ、ＨＮＴタンパク質への結合活性を有する所望のヒト抗体を得ることもできる（特公平１−５９８７８号公報参照）。さらに、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物に抗原となるＨＮＴタンパク質を投与して抗ＨＮＴ抗体産生細胞を取得し、これを不死化させた細胞からＨＮＴタンパク質に対するヒト抗体をそれぞれ取得してもよい（ＷＯ９４／２５５８５号パンフレット、ＷＯ９３／１２２２７号パンフレット、ＷＯ９２／０３９１８号パンフレット、ＷＯ ９４／０２６０２号パンフレット参照）。
【００６８】
このようにして作製されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、通常の培養液中で継代培養することが可能であり、また、液体窒素中で長期保存することが可能である。
【００６９】
当該ハイブリドーマからモノクローナル抗体を取得するには、当該ハイブリドーマを通常の方法に従い培養し、その培養上清として得る方法、あるいはハイブリドーマをこれと適合性がある哺乳動物に投与して増殖させ、その腹水として得る方法などが採用される。前者の方法は、高純度の抗体を得るのに適しており、一方、後者の方法は、抗体の大量生産に適している。
【００７０】
本発明では、モノクローナル抗体として、抗体遺伝子をハイブリドーマからクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用いて産生させた組換え型のものを用いることができる（例えば、Vandamme, A. M. et al., Eur.J. Biochem.（1990）192, 767-775, 1990参照）。
具体的には、抗ＨＮＴ抗体を産生するハイブリドーマから、抗ＨＮＴ抗体の可変（Ｖ）領域をコードするｍＲＮＡを単離する。ｍＲＮＡの単離は、公知の方法、例えば、グアニジン超遠心法（Chirgwin, J. M. et al., Biochemistry（1979）18, 5294-5299）、ＡＰＧＣ法（Chomczynski, P.et al., Anal. Biochem.（1987）162, 156-159）等により行って全ＲＮＡを調製し、mRNA Purification Kit （Pharmacia製）等を使用して目的のｍＲＮＡを調製する。また、QuickPrep mRNA Purification Kit（Pharmacia製）を用いることによりｍＲＮＡを直接調製することもできる。
【００７１】
得られたｍＲＮＡから逆転写酵素を用いて抗体Ｖ領域のｃＤＮＡを合成する。ｃＤＮＡの合成は、AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit（生化学工業社製）等を用いて行う。また、ｃＤＮＡの合成および増幅を行うには、５'−Ａｍｐｌｉ ＦＩＮＤＥＲ ＲＡＣＥ Ｋｉｔ（Clontech製）およびＰＣＲを用いた５'-ＲＡＣＥ法（Frohman, M. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA（1988）85, 8998-9002、Belyavsky, A.et al., Nucleic Acids Res.（1989）17, 2919-2932）等を使用することができる。
【００７２】
得られたＰＣＲ産物から目的とするＤＮＡ断片を精製し、ベクターＤＮＡと連結する。さらに、これより組換えベクターを作製し、大腸菌等に導入してコロニーを選択して所望の組換えベクターを調製する。そして、目的とするＤＮＡの塩基配列を公知の方法、例えば、ジデオキシヌクレオチドチェインターミネーション法等により確認する。
【００７３】
目的とする抗ＨＮＴ抗体のV領域をコードするＤＮＡをそれぞれ得たのち、これを、所望の抗体定常領域（Ｃ領域）をコードするＤＮＡを含有する発現ベクターへ組み込む。
【００７４】
本発明で使用される抗ＨＮＴ抗体を製造するには、抗体遺伝子を発現制御領域、例えば、エンハンサー、プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクターに組み込む。次に、この発現ベクターにより、宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させる。
【００７５】
抗体遺伝子の発現は、抗体重鎖（Ｈ鎖）または軽鎖（Ｌ鎖）をコードするＤＮＡを別々に発現ベクターに組み込んで宿主細胞を同時形質転換させてもよいし、あるいはＨ鎖およびＬ鎖をコードするＤＮＡを単一の発現ベクターに組み込んで宿主細胞を形質転換させてもよい（WO 94/11523 号公報参照）。
【００７６】
また、組換え型抗体の産生には上記宿主細胞だけではなく、トランスジェニック動物を使用することができる。例えば、抗体遺伝子を、乳汁中に固有に産生されるタンパク質（ヤギβカゼインなど）をコードする遺伝子の途中に挿入して融合遺伝子として調製する。抗体遺伝子が挿入された融合遺伝子を含むＤＮＡ断片をヤギの胚へ注入し、この胚を雌のヤギへ導入する。胚を受容したヤギから生まれるトランスジェニックヤギまたはその子孫が産生する乳汁から所望の抗体を得る。また、トランスジェニックヤギから産生される所望の抗体を含む乳汁量を増加させるために、適宜ホルモンをトランスジェニックヤギに使用してもよい（Ebert, K.M. et al., Bio/Technology（1994）12, 699-702）。
【００７７】
本発明で使用される抗体は、抗体の全体分子に限られず、ＨＮＴタンパク質に結合する限り、抗体の断片またはその修飾物であってもよく、二価抗体も一価抗体も含まれる。例えば、抗体の断片としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆｖ、1個のＦａｂと完全なＦｃを有するＦａｂ／ｃ、またはＨ鎖若しくはＬ鎖のＦｖを適当なリンカーで連結させたシングルチェインＦｖ（ｓｃＦｖ）が挙げられる。具体的には、抗体を酵素、例えばパパイン、ペプシンで処理し抗体断片を生成させるか、または、これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させる（例えば、Co, M.S. et al., J. Immunol.（1994）152, 2968-2976、Better, M. & Horwitz, A.H. Methods in Enzymology（1989）178, 476-496, Academic Press, Inc.、Plueckthun, A. & Skerra, A. Methods in Enzymology（1989）178, 476-496, Academic Press, Inc.、Lamoyi, E., Methods in Enzymology（1989）121, 652-663、Rousseaux, J. et al., Methods in Enzymology（1989）121, 663-669、Bird, R. E. et al., TIBTECH（1991）9, 132-137参照）。
【００７８】
ｓｃＦｖは、抗体のＨ鎖Ｖ領域とＬ鎖Ｖ領域とを連結することにより得られる。このｓｃＦｖにおいて、Ｈ鎖Ｖ領域とＬ鎖Ｖ領域は、リンカー、好ましくはペプチドリンカーを介して連結される（Huston, J. S. et al.、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.（1988）85,5879-5883）。ｓｃＦｖにおけるＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域は、本明細書に抗体として記載されたもののいずれの由来であってもよい。Ｖ領域を連結するペプチドリンカーとしては、例えばアミノ酸１２〜１９残基からなる任意の一本鎖ペプチドが用いられる。
【００７９】
ｓｃＦｖをコードするＤＮＡは、前記抗体のＨ鎖またはＨ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ、およびＬ鎖またはＬ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡのうち、それらの配列のうちの全部または所望のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ部分を鋳型とし、その両端を規定するプライマー対を用いてＰＣＲ法により増幅し、次いで、さらにペプチドリンカー部分をコードするＤＮＡ、およびその両端が各々Ｈ鎖、Ｌ鎖と連結されるように規定するプライマー対を組み合せて増幅することにより得られる。
【００８０】
また、一旦ｓｃＦｖをコードするＤＮＡが作製されると、それらを含有する発現ベクター、および該発現ベクターにより形質転換された宿主を常法に従って得ることができ、また、その宿主を用いることにより、常法に従ってｓｃＦｖを得ることができる。
【００８１】
これら抗体の断片は、前記と同様にしてその遺伝子を取得し発現させ、宿主により産生させることができる。本発明における「抗体」にはこれらの抗体の断片も包含される。
【００８２】
抗体の修飾物として、標識物質等の各種分子と結合した抗ＨＮＴ抗体を使用することもできる。本発明における「抗体」にはこれらの抗体修飾物も包含される。このような抗体修飾物は、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。なお、抗体の修飾方法はこの分野においてすでに確立されている。
【００８３】
さらに、本発明で使用される抗体は、二重特異性抗体（bispecific antibody）であってもよい。二重特異性抗体は分子上の異なるエピトープを認識する抗原結合部位を有する二重特異性抗体であってもよいし、一方の抗原結合部位がＨＮＴタンパク質を認識し、他方の抗原結合部位が標識物質等を認識してもよい。二重特異性抗体は２種類の抗体のＨ鎖とＬ鎖の一対を結合させて作製することもできるし、異なるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを融合させて二重特異性抗体産生融合細胞を作製し、得ることもできる。さらに、遺伝子工学的手法により二重特異性抗体を作製することも可能である。
【００８４】
本発明のハイブリドーマを用いて“キメラ抗体”を作製することもできる。キメラ抗体とは、例えば、抗体の特異性、親和性および生物学的活性等の性質を保持したまま、マウス抗体遺伝子部分の一部をヒト抗体遺伝子に置き換えることが可能である（Nature 312:604-608, 1984、Nature 314:452-454,1985）。また、抗体のＣＤＲ領域を移植する技術により“ヒト化抗体”を作製する技術も公知である。ヒト抗体遺伝子のＣＤＲ領域を本発明の抗体のＣＤＲ領域に置き換えることが可能である（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:969-973, 1994）。本発明の抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体を含む。
【００８５】
前記のように構築した抗体遺伝子は、公知の方法により発現させ、取得することができる。哺乳類細胞の場合、常用される有用なプロモーター、発現させる抗体遺伝子、その３′側下流にポリＡシグナルを機能的に結合させて発現させることができる。例えばプロモーター／エンハンサーとしては、ヒトサイトメガロウイルス前期プロモーター／エンハンサー（human cytomegalovirus immediate early promoter/enhancer）を挙げることができる。
【００８６】
また、その他に本発明で使用される抗体発現に使用できるプロモーター／エンハンサーとして、レトロウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）等のウイルスプロモーター／エンハンサー、あるいはヒトエロンゲーションファクター１α（ＨＥＦ１α）などの哺乳類細胞由来のプロモーター／エンハンサー等が挙げられる。
【００８７】
ＳＶ４０プロモーター／エンハンサーを使用する場合はMulliganらの方法（Nature（1979）277, 108）により、また、ＨＥＦ１αプロモーター／エンハンサーを使用する場合はMizushimaらの方法（Nucleic Acids Res.（1990）18, 5322）により、容易に遺伝子発現を行うことができる。
【００８８】
大腸菌の場合、常用される有用なプロモーター、抗体分泌のためのシグナル配列および発現させる抗体遺伝子を機能的に結合させて当該遺伝子を発現させることができる。プロモーターとしては、例えばｌａｃＺプロモーター、ａｒａＢプロモーターを挙げることができる。ｌａｃＺプロモーターを使用する場合はWardらの方法（Nature（1098）341, 544-546 ; FASEBJ.（1992）6, 2422-2427）により、あるいはａｒａＢプロモーターを使用する場合はBetterらの方法（Science（1988）240, 1041-1043）により発現することができる。
【００８９】
抗体分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、ｐｅｌＢシグナル配列（Lei, S. P. et al J. Bacteriol.（1987）169, 4379）を使用すればよい。そして、ペリプラズムに産生された抗体を分離した後、抗体の構造を適切に組み直して（ｒｅｆｏｌｄ）使用する。
【００９０】
複製起源としては、ＳＶ４０、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）等の由来のものを用いることができ、さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクターは、選択マーカーとしてアミノグリコシドトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）遺伝子、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｅｃｏｇｐｔ）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）遺伝子等を含むことができる。
【００９１】
本発明で使用される抗体の製造のために、任意の発現系、例えば真核細胞または原核細胞系を使用することができる。真核細胞としては、例えば樹立された哺乳類細胞系、昆虫細胞系、真糸状菌細胞および酵母細胞などの動物細胞等が挙げられ、原核細胞としては、例えば大腸菌細胞等の細菌細胞が挙げられる。
【００９２】
好ましくは、本発明で使用される抗体は、哺乳類細胞、例えばＣＨＯ、ＣＯＳ、ミエローマ、ＢＨＫ、Ｖｅｒｏ、ＨｅＬａ細胞中で発現される。
【００９３】
次に、形質転換された宿主細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで培養して目的とする抗体を産生させる。宿主細胞の培養は公知の方法に従い行う。例えば、培養液として、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、ＩＭＤＭを使用することができ、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用することもできる。
【００９４】
前記のように発現、産生された抗体は、細胞、宿主動物から分離し均一にまで精製することができる。本発明で使用される抗体の分離、精製はアフィニティーカラムを用いて行うことができる。例えば、プロテインＡカラムを用いたカラムとして、ＨｙｐｅｒＤ、ＰＯＲＯＳ、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（Pharmacia製）等が挙げられる。その他、通常のタンパク質で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。例えば、上記アフィニティーカラム以外のクロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析等を適宜選択、組み合わせることにより、抗体を分離、精製することができる（Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988）。
【００９５】
本発明の癌治療薬は、抗ＨＮＴ抗体を当該技術分野においてよく知られる薬学的に許容しうる担体とともに、混合、溶解、顆粒化、錠剤化、乳化、カプセル封入、凍結乾燥等により、製剤化することができる。
【００９６】
経口投与用には、抗ＨＮＴ抗体を、薬学的に許容しうる溶媒、賦形剤、結合剤、安定化剤、分散剤等とともに、錠剤、丸薬、糖衣剤、軟カプセル、硬カプセル、溶液、懸濁液、乳剤、ゲル、シロップ、スラリー等の剤形に製剤化することができる。
【００９７】
非経口投与用には、抗ＨＮＴ抗体を、薬学的に許容しうる溶媒、賦形剤、結合剤、安定化剤、分散剤等とともに、注射用溶液、懸濁液、乳剤、クリーム剤、軟膏剤、吸入剤、座剤等の剤形に製剤化することができる。注射用の処方においては、抗ＨＮＴ抗体を水性溶液、好ましくはハンクス溶液、リンゲル溶液、または生理的食塩緩衝液等の生理学的に適合性の緩衝液中に溶解することができる。さらに、組成物は、油性または水性のベヒクル中で、懸濁液、溶液、または乳濁液等の形状をとることができる。あるいは、治療剤を粉体の形態で製造し、使用前に滅菌水等を用いて水溶液または懸濁液を調製してもよい。吸入による投与用には、抗ＨＮＴ抗体を粉末化し、ラクトースまたはデンプン等の適当な基剤とともに粉末混合物とすることができる。坐剤処方は、抗ＨＮＴ抗体をカカオバター等の慣用の坐剤基剤と混合することにより製造することができる。さらに、本発明の治療剤は、ポリマーマトリクス等に封入して、持続放出用製剤として処方することができる。
【００９８】
投与量および投与回数は、剤形および投与経路、ならびに患者の症状、年齢、体重によって異なるが、一般に、抗ＨＮＴ抗体は、１日あたり体重１ｋｇあたり、約０．００１ｍｇから１０００ｍｇの範囲、好ましくは約０．０１ｍｇから１０ｍｇの範囲となるよう、１日に１回から数回投与することができる。
【００９９】
本発明の癌治療薬は通常非経口投与経路で、例えば注射剤（皮下注、静注、筋注、腹腔内注など）、経皮、経粘膜、経鼻、経肺などで投与するのが好ましい。
【実施例】
【０１００】
以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【０１０１】
実施例１ ＤＮＡマイクロアレイによる各種癌細胞におけるＨＮＴ遺伝子発現解析
癌において発現が亢進する遺伝子を探索するために、各種ヒト組織におけるＲＮＡ、グリア芽腫、肺癌、肝癌、胃癌、大腸癌、腎癌および膵臓癌(表１)、および分化度の異なる２０例の膵癌、前癌病変１例、膵管癌２例、膵管内乳頭粘液性腫瘍１例の各摘出組織、および対照としての正常組織（摘出された膵癌組織の非癌部）４例よりレーザーマイクロダイセクション法（Laser Capture Microdissection）で回収したサンプルよりＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社）を用い定法に従って全ＲＮＡを調製した。
【０１０２】
上記全ＲＮＡを各１０ｎｇずつ用い、各種ヒト組織より抽出したＲＮＡをＧｅｎｅＣｈｉｐＵ−１３３Ｂ（Affimetrix社製）に供しＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｍａｎｕａｌ（Affimetrix社製）に準じて遺伝子発現解析した。全遺伝子の発現スコアの平均値を１００とし、癌細胞において発現が亢進する遺伝子を探索したところ、ＨＮＴ（プローブID： 227566_at HG-U133B）が正常膵臓（９４．０）と比較して、膵臓癌では発現スコア(平均値：４６９．４７)が５．０倍と、膵臓癌において発現が亢進していた。また、膵臓癌３例の正常膵臓組織に対する発現量は、それぞれ８．８倍、１．７倍、４．５倍と全例で発現亢進していることが明らかになった。（図１Ａ、Ｂ）。
また、小細胞癌、扁平上皮癌、腺癌などの肺癌、腎臓癌、大腸癌においても発現が亢進していた（図１Ａ、Ｂ）。
摘出した膵臓癌組織に関して高分化型４例、中分化型１７例、低分化型３例ならびに正常膵４例、前癌病変１例、膵管癌２例、膵管内乳頭粘液性腫瘍１例から調製した全ＲＮＡを各１０ｎｇずつ用い、ＧｅｎｅＣｈｉｐＵ１３３Ｐｌｕｓ２．０（Affimetrix社製）で遺伝子発現解析した。ＧｅｎｅＣｈｉｐＵ１３３Ｐｌｕｓ２．０での全遺伝子の発現スコアの平均値を１００としたときの各組織での発現スコアを示す。その結果、ＨＮＴｍＲＮＡ（プローブID：227566 at HG-U133 plus2）は、正常膵、前癌病変では発現スコアが低いのに対し、膵臓癌では発現が亢進していることが明らかになった（図２）。
【０１０３】
【表１】
【０１０４】
実施例２ ＨＮＴｃＤＮＡのクローニング
ＨＮＴのｃＤＮＡは、ヒト胎児脳のｃＤＮＡをテンプレートにしたＰＣＲ法によって増幅した。この時、ＧｅｎＢａｎｋ番号（ＮＭ＿０１６５２２）の配列情報を元にＯＲＦ領域（open reading flame）を含む断片を増幅するように設計されたプライマーセットＨＮＴ−ＳｐｅＩ−ＦＷ (配列番号２：ＧＧＡＣＴＡＧＴＡＣＣＡＴＧＧＧＧＧＴＣＴＧＴＧＧＧＴＡＣ)とＨＮＴ−ＸｂａＩ−ＲＶ (配列番号３：ＴＡＣＴＣＴＡＧＡＣＴＡＡＡＴＴＴＧＡＧＡＡＧＣＡＧＧＴＧＣＡＡＧＡＣ)を用いた。このＰＣＲ反応にはＫＯＤ−ｐｌｕｓ（東洋紡社）を用い、条件は９４℃−３０秒、５５℃-３０秒、６８℃−６０秒、３０サイクルで行った。
その後、アガロースゲル電気泳動により目的のサイズの約１．２ｋｂｐのバンドを含むゲルを切り出し、このゲル断片からキアクイックゲル抽出キット（QIAquick gel extraction kit；キアゲン社）を用いて精製を行い、ＨＮＴの全長ｃＤＮＡ（以下、ＨＮＴｆｕｌｌｃＤＮＡ）を得た。ＨＮＴｆｕｌｌｃＤＮＡの配列は常法に従いＮＭ＿０１６５２２と一致することを確認した。
【０１０５】
実施例３ ＨＮＴの抗原の調製
（１）ＨＮＴの全長ｃＤＮＡのほ乳類動物細胞での発現ベクターの作製
前述のＨＮＴｆｕｌｌｃＤＮＡをほ乳類発現用ベクターｐＥＦ４／Ｍｙｃ−ＨｉｓＢ(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製)へ挿入するために、２種類の制限酵素ＳｐｅＩ（ＴａＫａＲａ社製）およびＸｂａＩ（ＴａＫａＲａ社製）で３７℃、１時間処理した後、同じくＳｐｅＩ／ＸｂａＩで処理したｐＥＦ４／Ｍｙｃ−ＨｉｓＢにラピッドＤＮＡライゲーションキット（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）によってライゲーションすることによって挿入した。定法により塩基配列解析を行い、目的の発現ベクターｐＥＦ４／ＨＮＴｆｕｌｌを得た。
【０１０６】
（２）ＨＮＴの細胞外領域に相当する部分長ｃＤＮＡのほ乳類動物細胞での発現ベクターの作製
ＨＮＴの全長ｃＤＮＡ（ＨＮＴｆｕｌｌｃＤＮＡ）をテンプレートにし、ＧｅｎＢａｎｋ番号（ＮＭ＿０１６５２２）の配列情報を元にＨＮＴの細胞外領域に相当する部分のｃＤＮＡ断片（ｓＨＮＴｃＤＮＡ）を増幅するように設計されたプライマーセットＨＮＴ−Ｆ（ＨｉｎｄＩＩＩ） (配列番号４：ＣＧＣＡＡＧＣＴＴＡＣＣＡＴＧＧＧＧＧＴＣＴＧＴＧＧＧＴＡＣＣＴＧＴＴＣＣＴＧ)とｓＨＮＴ−Ｒ（Ｈｉｓ−ＮｏｔＩ）(配列番号５：ＡＣＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＡＴＧＧＣＴＣＡＣＣＴＣＧＣＴＧＡＣＧＧＣ)を用いてＰＣＲ反応を行った。この反応にはＫＯＤ−ｐｌｕｓ（東洋紡社）を用い、条件は９４℃-１５秒、５５℃-３０秒、６８℃−９０秒、３０サイクルで行った。
アガロースゲル電気泳動により目的のサイズに近い約１０００ｂｐのバンドを含むゲルを切り出し、ゲル断片からキアクイックゲル抽出キット（QIAquick gel extraction kit；キアゲン社）を用いて精製を行うことによって目的のｓＨＮＴｃＤＮＡを得た。
このｓＨＮＴｃＤＮＡをほ乳類発現用ベクターｐＥＢ６ＣＡＧＭＣＳ−Ｉ−ＧＦＰ へ挿入するために、２種類の制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ（ＴａＫａＲａ社製）およびＮｏｔＩ（ＴａＫａＲａ社製）で処理した後、同じくＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｏｔＩで処理したｐＥＢ６ＣＡＧＭＣＳ−Ｉ−ＧＦＰにＴ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ（プロメガ社製）によってライゲーションすることによって挿入した。定法により塩基配列解析を行い、目的の発現ベクターｐＥＢ６ＣＡＧＭＣＳ／ｓＨＮＴを得た。
【０１０７】
（３）ＨＮＴ全長タンパク質およびｓＨＮＴタンパク質の発現
ＦｕＧＥＮＥ６トランスフェクション試薬（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）のプロトコールに準じて、トランスフェクション前日に径１０ｃｍディッシュに８×１０5 ｃｅｌｌのＣＨＯ細胞を播種し一晩培養を行い、翌日に、８μgの発現ベクターｐＥＦ４／ＨＮＴｆｕｌｌまたはｐＥＢ６ＣＡＧＭＣＳ／ｓＨＮＴと１６μＬのＦｕＧＥＮＥ６試薬を４００μＬの無血清Ｏｐｔｉ-ＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に混合し、１５〜４５分間の室温におけるインキュベーションを行った後、細胞培養液に加えトランスフェクションを行った。トランスフェクション翌々日に限界希釈法および選択試薬であるＺｅｏｃｉｎ（ｐＥＦ４／ＨＮＴｆｕｌｌの場合、Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社製）あるいはＧ４１８（ｐＥＢ６ＣＡＧＭＣＳ／ｓＨＮＴの場合、Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社製）を用いてクローニングを開始した。
ＨＮＴ全長発現ＣＨＯは、抗ＨＮＴモノクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いたウェスタンブロットおよび抗ＨＮＴヤギ・ポリクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いたフローサイトメトリー(ベクトンディッキンソン社製ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒを使用)を用いることにより、シグナルが強く、しかも増殖が良好なクローンを選択した。その結果、ＨＮＴ全長発現ＣＨＯクローン（ＥＸＺ１９０３−４）が得られ、ＥＸＺ１９０３−４をモノクローナル抗体作製時のスクリーニングに使用した。
ｓＨＮＴ発現ＣＨＯ細胞のスクリーニングは、抗ＨＮＴモノクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いたウェスタンブロットで培養上清中に分泌されるｓＨＮＴの濃度を解析することで行った。培養上清中への分泌量が多く、しかも増殖が良好なクローンを選択した結果、ｓＨＮＴ発現ＣＨＯクローン（ＥＸＺ１８０２）が得られた。この選択されたｓＨＮＴ発現ＣＨＯクローン（ＥＸＺ１８０２）を培養面積１，５００ｃｍ2のローラーボトル３本を用い、ローラーボトル１本あたり無血清培地ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ−II（Invitrogen社）３３３ｍＬにて７２時間培養を行い、培養上清を回収した。得られた培養上清からＨｉｓＴｒａｐＨＰカラム (ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製)によるアフィニティークロマトグラフィーとＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ｐｇカラムによるゲル濾過クロマトグラフィーによって精製ｓＨＮＴ Ｈｉｓ ｔａｇ融合タンパク質（以下、ｓＨＮＴタンパク質として示す）を得た。非還元下のＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析したところ、９５％以上の純度であることが確認された。この精製された融合タンパク質をＰＢＳに対し透析を行い、免疫用抗原およびエピトープ同定などの解析用抗原として用いた。ｓＨＮＴタンパク質の濃度は、既知濃度の純品のウシ血清アルブミンを検量線としたＢＣＡ法（ＰＩＥＲＣＥ社製キットを使用）で算出した。
【０１０８】
（４）ＨＮＴ全長を発現する組み換えバキュロウイルスの作製
（１）で作製したｐＥＦ４／ＨＮＴｆｕｌｌを２種類の制限酵素ＫｐｎＩ（ＴａＫａＲａ社）およびＰｍｅＩ（ＴａＫａＲａ社）で３７℃、１時間処理した後、アガロースゲル電気泳動によって分離し、目的のＨＮＴ全長およびＭｙｃ−Ｈｉｓタグ部分を含むｃＤＮＡ断片を切り出しキアクイックゲル抽出キット（QIAquick gel extraction kit；キアゲン社）を用いて目的のｃＤＮＡ断片を精製した。
トランスファーベクターｐＢｌｕｅＢａｃ４．５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ（ＴａＫａＲａ社）で３７℃、１時間処理した後、ＤＮＡ Ｂｌｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ社）によって末端を平滑化し、制限酵素ＫｐｎＩ（ＴａＫａＲａ社））によって３７℃、１時間処理した。アガロースゲル電気泳動を行い目的のバンドを含むゲルを切り出し、ゲル断片からキアクイックゲル抽出キット（QIAquick gel extraction kit；キアゲン社）を用いて目的のベクターを精製した。
このようにして精製したＨＮＴ全長およびＭｙｃ−Ｈｉｓタグ部分を含むｃＤＮＡ断片をトランスファーベクターｐＢｌｕｅＢａｃ４．５にラピッドＤＮＡライゲーションキット（ロシュ・ダイアグノスティックス社）によって挿入した。定法により塩基配列解析を行い、目的の発現ベクターｐＢｌｕｅＢａｃ４．５／ＨＮＴｆｕｌｌを得た。次いで、４μｇのｐＢｌｕｅＢａｃ４．５／ＨＮＴｆｕｌｌを制限酵素ＢｐＩＩ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ社）にて切断直鎖化した後、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社の指示書に準じてＢａｃ−Ｎ−Ｂｌｕｅ ＤＮＡと共にＳｆ９細胞に導入し、ＨＮＴ全長タンパク質発現組み換えバキュロウイルスを調製した。
上記により調製した組み換えバキュロウイルスをＳｆ９細胞（２×１０6個細胞／ｍＬ）にＭＯＩが５となるように加え感染させた後、２７℃で３日間培養した。ＨＮＴ全長タンパク質を発現する発芽型バキュロウイルス（ＢＶ）は３日間培養後の培養上清より回収した。すなわち、培養液を８００ｘｇで１５分間遠心し、細胞ならびに細胞破砕物を除去した後、回収した培養上清を４５，０００ｇで３０分間遠心した。沈殿物をＰＢＳで懸濁した標品をＨＮＴｆｕｌｌ−ＢＶとし免疫抗原およびスクリーング用抗原に使用した。
【０１０９】
実施例４ 抗ＨＮＴモノクローナル抗体の作製
ｓＨＮＴタンパク質を免疫原としたモノクローナル抗体の作製
生理食塩水に溶解した５０μｇのｓＨＮＴタンパク質とＴｉｔｅｒ−ＭＡＸ（TiterMax USA, Inc.）を等量混合してＭＲＬ／ｌｐｒマウス（三共ラボサービス）に腹腔内および皮下に注射する事により初回免疫を行った。２回目以降の免疫は同様に調製した２５μｇタンパク質量相当のｓＨＮＴタンパク質とＴｉｔｅｒ−ＭＡＸを混合して腹腔内および皮下に注射することにより実施した。最終免疫から３日後にマウスから脾臓細胞を無菌的に調製し、ポリエチレングリコール法によってマウスミエローマ細胞ＮＳ―１との細胞融合を行った。
【０１１０】
（２）ＨＮＴｆｕｌｌ−ＢＶを免疫原としたモノクローナル抗体の作製
上述の方法により調製したＨＮＴｆｕｌｌ−ＢＶを生理食塩水に懸濁し、１ｍｇのタンパク量に相当するＨＮＴｆｕｌｌ−ＢＶと２００ｎｇの百日咳毒素と混合したものをｇｐ６４トランスジェニックマウス（ＷＯ０３／１０４４５３）の皮下に注射することで初回免疫を行った。２回目以降の免疫は５００μgタンパク量相当のＨＮＴｆｕｌｌ−ＢＶのみを皮下注射した。最終免疫として２５０μｇのＨＮＴｆｕｌｌ−ＢＶを腹腔内注射し、その3日後にマウスから脾臓細胞を無菌的に調製し、ポリエチレングリコール法によってマウスミエローマ細胞ＮＳ−１と細胞融合した。
【０１１１】
（３）抗ＨＮＴ抗体産生ハイブリドーマのスクリーニング
ハイブリドーマ培養上清中の抗ＨＮＴ抗体の１ｓｔスクリーニングは、ｓＨＮＴタンパク質を免疫原として作製したハイブリドーマ株についてはｓＨＮＴ固相化ＥＬＩＳＡおよびＨＮＴｆｕｌｌ−ＢＶ固相化ＥＬＩＳＡ、ＨＮＴｆｕｌｌ−ＢＶを免疫原として作製したハイブリドーマ株についてはｓＨＮＴ固相化ＥＬＩＳＡによって行った。すなわち、ｓＨＮＴの場合は２．５μｇ／ｍＬ、ＨＮＴｆｕｌｌ−ＢＶの場合は５μｇ／ｍＬの濃度の抗原をＥＬＩＳＡ用プレートのウェルに５０μＬずつ分注し４℃で一夜放置することで抗原を固相化した。次いで０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ (以後、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳ)でウェルを洗浄し、４０％ブロックエース（雪印乳業製）を含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ, １５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ８．０（４０％ ＢＡ−ＴＢＳ）を２００μＬ／ｗｅｌｌ分注して室温で１時間放置することでプレート上の未吸着部分をブロッキングした。Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳでウェルを洗浄後、ハイブリドーマ培養上清を５０μＬ／ｗｅｌｌ分注し、室温で１時間反応させた。
Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳでウェルを洗浄後、１０％ブロックエース（雪印乳業製）を含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ, １５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ８．０（１０％ＢＡ−ＴＢＳ）で１５０００倍に希釈したペルオキダーゼ標識抗マウス抗体ヒツジＩｇＧを５０μＬ／ｗｅｌｌ分注し、室温で１時間反応させた。Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、ＴＭＢ試薬（ＳＣＹＴＥＫ社）で暗所にて室温、３０分間反応させたのち、ＳＴＯＰ液（ＳＣＹＴＥＫ社）にて反応を停止させ、マイクロプレートリーダーにて波長４５０ｎｍでの吸光度を測定した。
１ｓｔスクリーニングのＥＬＩＳＡで陽性であったウェルのハイブリドーマの培養上清につき、２ｎｄスクリーニングとしてＨＮＴ全長発現ＣＨＯクローン（ＥＸＺ１９０３−４）および膵癌細胞株ＱＧＰ−１またはＫＰ−４用いたフローサイトメトリーを行った
まず、ＨＮＴ全長発現ＣＨＯ細胞および膵癌細胞株ＱＧＰ−１またはＫＰ−４の細胞膜表面にＨＮＴが発現しているか否かをＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（ベクトンディッキンソン社製）を用いたフローサイトメトリーで解析した。すなわち、ＨＮＴ全長発現ＣＨＯクローン（ＥＸＺ１９０３−４）および膵癌細胞株ＱＧＰ−１またはＫＰ−４を２ｍＭ ＥＤＴＡ−ＰＢＳで処理することで培養プレートから剥離後、１×１０6個／ｍＬとなるようにＦＡＣＳ溶液（１％ウシ血清アルブミン、０．１ｍＭＥＤＴＡ、０．１％ ＮａＮ3を含有するＰＢＳ）に懸濁した。この細胞懸濁液を５０μＬ／ｗｅｌｌとなるように９６ウェルプレート（BDファルコン社製）に播種し市販の抗ＨＮＴヤギ・ポリクローナル抗体（０．０３μｇ／ｗｅｌｌ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を加えて４℃で６０分間反応させ、ＦＡＣＳ溶液（２００μＬ／ｗｅｌｌ）で2回洗浄した後、ＦＩＴＣ標識抗ヤギＩｇＧ・ウサギＩｇＧ抗体（カペル社製）を加えて、４℃で３０分間反応させた。
そしてＦＡＣＳ溶液で２回洗浄した後、使用説明書に準じてＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ(ベクトンディッキンソン社製)を用いてフローサイトメトリーを実施した。抗ＨＮＴヤギ・ポリクローナル抗体の陰性コントロールには正常ヤギＩｇＧを用いた。
得られた抗ＨＮＴ抗体産生ハイブリドーマ株（ＰＰＺ４０３４）についての結果を図３Ａ〜Ｄに示す。ＨＮＴ発現ＣＨＯ細胞では強いシフトが認められ、膵臓癌由来細胞株ＱＧＰ−１でもシフトが認められた。膵臓癌由来細胞株ＰＫ−４５Ｐではシフトが認められず、ＰＫ−４５ＰではＨＮＴの細胞膜上への発現が無いかごく少ないことがわかる。
【０１１２】
実施例５ 全長ＨＮＴ発現ＣＨＯ細胞に対する抗ＨＮＴ抗体の細胞傷害活性（ＣＤＣ活性）
ＣＤＣ活性の測定は、標的細胞に内在する乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の放出を指標にする方法によった。具体的には、ＣｙｔｏＴｏｘ９６ Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（プロメガ社製）を用い、キットに添付のプロトコールに従って以下の通り実施した。
【０１１３】
標的細胞として、全長ＨＮＴ発現ＣＨＯ細胞を用いた。これらの細胞をプレートから剥離後、２×１０5個／ｍＬとなるように１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地に懸濁し、９６ウェルＵ底プレート（Beckton Dickinson社製）に１００μＬ／ｗｅｌｌで分注して炭酸ガスインキュベーター中で一夜培養した。翌日、プレート底面に接着した細胞を５％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地（フェノールレッド不含）で２回洗浄した後、各ウェルに５％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地（フェノールレッド不含）を３０μＬ／ｗｅｌｌ分注し、さらにハイブリドーマ培養上清を３０μL／Ｗｅｌｌ分注た後、氷上で３０分間インキュベーションした。
次いで、Ｂａｂｙ Ｒａｂｂｉｔ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ（CEDARLANE社製）を５％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ培地（フェノールレッド不含）で１６倍に希釈した補体標品（標的細胞がＨＮＴ全長発現ＣＨＯクローン（ＥＸＺ１９０３−４）の場合）あるいは同培地で８倍に希釈した補体標品（標的細胞が膵癌由来細胞株ＫＰ−４あるいはＱＧＰ−１の場合）を２０μＬ／ｗｅｌｌ分注し、炭酸ガスインキュベーター中で４時間培養した。培養後、５０μＬの上清を回収し、平底の酵素アッセイ用プレートへ移した。そこへ、キット付属の基質混合液を５０μＬ／ｗｅｌｌ添加し、遮光下、室温で３０分間インキュベートした。インキュベート後、反応停止液５０μＬ／ｗｅｌｌを添加した。反応停止後、マイクロプレートリーダーを用いて波長４９０ｎｍにて吸光度を測定した。なお、陽性コントロールとして市販のヤギ抗ＨＮＴポリクローナル抗体（Ｒ＆Ｄシステムズ社）を、陰性コントロールとしてＨＮＴと反応しないことが予め明らかである抗体（Ｋ７１２４）を用いた。
【０１１４】
標的細胞として膵臓癌由来細胞株ＱＧＰ−１を用いて同様の方法でＣＤＣ活性を測定した。なお、陽性コントロールとして市販のヤギ抗ＨＮＴポリクローナル抗体（Ｒ＆Ｄシステムズ社）を、陰性コントロールとしてＨＮＴと反応しないことが予め明らかである市販のヤギポリクローナル抗体を用いた。
【０１１５】
細胞傷害活性は、以下の通り求めた。
細胞傷害活性（％）＝（Ａ−Ｂ−Ｃ）／（Ｄ−Ｃ）×１００
Ａ：[各試料における吸光度]−[培養液のバックグラウンドの吸光度]
Ｂ：[補体に由来するＬＤＨによる吸光度]−[培養液のバックグラウンドの吸光度]
Ｃ：[標的細胞から自然に放出されるＬＤＨによる吸光度]−[培養液のバックグラウン
ドの吸光度]
Ｄ：[０．９％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００添加により標的細胞から１００％放出されたＬＤＨによる吸光度] −[培養液のバックグラウンドの吸光度]
【０１１６】
ハイブリドーマＰＰＺ４０３４、ＰＰＺ４０３８、ＰＰＺ４０７０のＣＤＣ活性の測定結果を表２に示した。
【０１１７】
【表２】
【０１１８】
実施例６ 全長ＨＮＴ発現ＣＨＯ細胞に対する抗ＨＮＴ抗体の細胞傷害活性（ＡＤＣＣ活性）
ＡＤＣＣ活性の測定は、標的細胞に内在する乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の放出を指標にする方法によった。具体的には、ＣｙｔｏＴｏｘ９６ Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（プロメガ社製）を用い、キットに添付のプロトコールに従って以下の通り実施した。
【０１１９】
（１）エフェクター細胞の調製
Ｃ３Ｈマウス（８週齢、オス、埼玉実験動物）から脾臓を摘出し、１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地中で脾細胞を分離した。同培地で洗浄後、細胞濃度を５×１０6個／ｍＬに調製し、５００Ｕ／ｍＬ ヒトＩＬ−２（ＰＥＰＲＯＴＥＣＨＥＣ社製）、１０ｎｇ／ｍＬ マウスＧＭ−ＣＳＦ（ＰＥＰＲＯＴＥＣＨＥＣ社製）存在下で３日間培養した。測定当日、脾細胞を回収し、５％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地（フェノールレッド不含）で洗浄後、同培地で１．２５×１０7個／ｍＬに調製し、エフェクター細胞とした。
【０１２０】
（２）標的細胞の調製
標的細胞として、全長ＨＮＴ発現ＣＨＯ細胞を用いた。細胞をプレートから剥離後、５％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地（フェノールレッド不含）に懸濁し、２×１０4個／ｗｅｌｌとなるように９６ウェルＵ底プレート（Beckton Dickinson社製）に２０μＬ／ｗｅｌｌ分注した。
【０１２１】
（３）ＡＤＣＣ活性の測定
標的細胞にハイブリドーマの培養上清を３０μＬ／ｗｅｌｌ分注した後、３０分間インキュベーションした。次いで、エフェクター細胞を３０μＬ／ｗｅｌｌ分注し、炭酸ガスインキュベーター中で４時間培養した。培養後、５０μＬの上清を回収し、平底の酵素アッセイ用プレートへ移した。そこへ、キット付属の基質混合液を５０μＬ／ｗｅｌｌ添加し、遮光下、室温で３０分間インキュベートした。インキュベート後、反応停止液５０μＬ／ｗｅｌｌを添加し、マイクロプレートリーダーを用いて波長４９０ｎｍにて吸光度を測定した。
【０１２２】
細胞傷害活性は、以下の通り求めた。
細胞傷害活性（％）＝（Ａ−Ｂ−Ｃ）／（Ｄ−Ｃ）×１００
Ａ：[各試料における吸光度]−[培養液のバックグラウンドの吸光度]
Ｂ：[エフェクター細胞に由来するＬＤＨによる吸光度]−[培養液のバックグラウンドの吸光度]
Ｃ：[標的細胞から自然に放出されるＬＤＨによる吸光度]−[培養液のバックグラウンドの吸光度]
Ｄ：[０．９％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００添加により標的細胞から１００％放出されたＬＤＨによる吸光度] −[培養液のバックグラウンドの吸光度]
【０１２３】
３種のハイブリドーマについての結果を表３に示した。表中、陰性対照とはＨＮＴに反応性を示さないことが事前に判明している抗体である。この陰性対照の抗体が示したＡＤＣＣ活性値１４．３％に対し、２０％以上の高いＡＤＣＣ活性を示す結果が得られた。
【０１２４】
【表３】
【図面の簡単な説明】
【０１２５】
【図１】正常組織（Ａ）及び各種癌組織（Ｂ）におけるＨＮＴｍＲＮＡを示す。
【図２】膵臓癌患者より採取した腫瘍組織の癌部のＨＮＴｍＲＮＡの発現を示す。
【図３】各種細胞に抗ＨＮＴ抗体を反応させてフローサイトメトリーを行った結果を示す。横軸の正の方向へのピークのシフトが大きいほど抗ＨＮＴ抗体が結合した細胞数が多いことを表す。Ａ：ＨＮＴ発現ＣＨＯ細胞、Ｂ：膵臓癌由来細胞株ＱＧＰ−１、Ｃ:ＣＨＯ細胞、Ｄ：膵臓癌由来細胞株ＰＫ−４５Ｐ
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗ＨＮＴ抗体を含有する癌診断薬。
【請求項２】
癌が、肺癌、腎臓癌、大腸癌または膵臓癌である請求項１に記載の癌診断薬。
【請求項３】
抗ＨＮＴ抗体がＨＮＴタンパク質細胞外領域と結合する抗体である請求項１又は２記載の癌診断薬。
【請求項４】
血液中、血清中、血漿中または臓器組織に抗ＨＮＴ抗体を反応させてＨＮＴタンパク質を検出することにより使用されるものである請求項１〜４いずれか１項記載の癌診断薬。
【請求項５】
標識した抗ＨＮＴ抗体を投与後画像診断によりＨＮＴタンパク質を検出することにより使用されるものである請求項１〜３いずれか１項記載の癌診断薬。
【請求項６】
癌患者のうち、治療対象患者を選択するための診断薬である請求項１〜５のいずれか１項記載の癌診断薬。
【請求項７】
被験者から採取された試料に抗ＨＮＴ抗体を反応させ、当該試料中のＨＮＴタンパク質を検出することを特徴とする癌の診断方法。
【請求項８】
癌が、肺癌、腎臓癌、大腸癌または膵臓癌である請求項７に記載の癌の診断方法。
【請求項９】
被験者から採取された試料が血液、血清、血漿または臓器組織である請求項７又は８記載の癌の診断方法。
【請求項１０】
抗ＨＮＴ抗体を有効成分とする癌治療薬。
【請求項１１】
癌が、肺癌、腎臓癌、大腸癌または膵臓癌である請求項１０に記載の癌治療薬。
【請求項１２】
抗ＨＮＴ抗体がＨＮＴタンパク質細胞外領域と結合する抗体である請求項１０又は１１記載の癌治療薬。
【請求項１３】
抗ＨＮＴ抗体が細胞傷害活性を有する抗体である請求項１０〜１２いずれか１項記載の癌治療薬。
【請求項１４】
抗ＨＮＴ抗体がアイソトープ標識あるいは細胞傷害活性を有する化合物を結合させた抗体である請求項１０〜１２いずれか１項記載の癌治療薬。
【請求項１】
抗ＨＮＴ抗体を含有する癌診断薬。
【請求項２】
癌が、肺癌、腎臓癌、大腸癌または膵臓癌である請求項１に記載の癌診断薬。
【請求項３】
抗ＨＮＴ抗体がＨＮＴタンパク質細胞外領域と結合する抗体である請求項１又は２記載の癌診断薬。
【請求項４】
血液中、血清中、血漿中または臓器組織に抗ＨＮＴ抗体を反応させてＨＮＴタンパク質を検出することにより使用されるものである請求項１〜４いずれか１項記載の癌診断薬。
【請求項５】
標識した抗ＨＮＴ抗体を投与後画像診断によりＨＮＴタンパク質を検出することにより使用されるものである請求項１〜３いずれか１項記載の癌診断薬。
【請求項６】
癌患者のうち、治療対象患者を選択するための診断薬である請求項１〜５のいずれか１項記載の癌診断薬。
【請求項７】
被験者から採取された試料に抗ＨＮＴ抗体を反応させ、当該試料中のＨＮＴタンパク質を検出することを特徴とする癌の診断方法。
【請求項８】
癌が、肺癌、腎臓癌、大腸癌または膵臓癌である請求項７に記載の癌の診断方法。
【請求項９】
被験者から採取された試料が血液、血清、血漿または臓器組織である請求項７又は８記載の癌の診断方法。
【請求項１０】
抗ＨＮＴ抗体を有効成分とする癌治療薬。
【請求項１１】
癌が、肺癌、腎臓癌、大腸癌または膵臓癌である請求項１０に記載の癌治療薬。
【請求項１２】
抗ＨＮＴ抗体がＨＮＴタンパク質細胞外領域と結合する抗体である請求項１０又は１１記載の癌治療薬。
【請求項１３】
抗ＨＮＴ抗体が細胞傷害活性を有する抗体である請求項１０〜１２いずれか１項記載の癌治療薬。
【請求項１４】
抗ＨＮＴ抗体がアイソトープ標識あるいは細胞傷害活性を有する化合物を結合させた抗体である請求項１０〜１２いずれか１項記載の癌治療薬。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２０１０−１３３７０５（Ｐ２０１０−１３３７０５Ａ）
【公開日】平成２２年６月１７日（２０１０．６．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−６８０５３（Ｐ２００７−６８０５３）
【出願日】平成１９年３月１６日（２００７．３．１６）
【出願人】（５０３１９６７７６）株式会社ペルセウスプロテオミクス (25)
【出願人】（５０４１３７９１２）国立大学法人 東京大学 (1,942)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年６月１７日（２０１０．６．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年３月１６日（２００７．３．１６）
【出願人】（５０３１９６７７６）株式会社ペルセウスプロテオミクス (25)
【出願人】（５０４１３７９１２）国立大学法人 東京大学 (1,942)
【Ｆターム（参考）】
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