癌抑制遺伝子ＷＴ１の産物に基づく癌抗原
【課題】癌抗原、及びそれを含む癌ワクチンの提供。
【解決手段】Ｗｉｌｍｓ腫瘍癌抑制遺伝子ＷＴ１の産物、又は該アミノ酸配列中、主要組織適合性抗原（ＭＨＣ）クラスＩとの結合のアンカーアミノ酸を含む連続する７〜３０個のアミノ酸から成るペプチド。
【解決手段】Ｗｉｌｍｓ腫瘍癌抑制遺伝子ＷＴ１の産物、又は該アミノ酸配列中、主要組織適合性抗原（ＭＨＣ）クラスＩとの結合のアンカーアミノ酸を含む連続する７〜３０個のアミノ酸から成るペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｗｉｌｍｓ腫瘍の癌抑制遺伝子ＷＴ１の産物に基づく癌抗原に関する。この癌抗原は、白血病、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、悪性リンパ腫などの血液の癌、又は固形癌、例えば胃癌、大腸癌、肺癌、乳癌、胚細胞癌、肝癌、皮膚癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮癌、子宮頸癌、卵巣癌等、並びにさらにはＷＴ１を発現するすべての癌に対する抗癌ワクチンとして有用である。
【背景技術】
【０００２】
異物を排除するための免疫機構には、一般に、抗原を認識して抗原提示細胞として機能するマクロファージ、該マクロファージの抗原提示を認識して種々のリンホカインを産生して他のＴ−細胞等を活性化するヘルパーＴ−細胞、該リンホカインの作用により抗体産生細胞に分化するＢ−リンパ球等が関与する液性免疫と、抗原の提示を受けて分化したキラーＴ−細胞が標的細胞を攻撃し破壊する細胞性免疫とがある。
【０００３】
現在のところ、癌の免疫は主として、キラーＴ−細胞が関与する細胞性免疫によるものと考えられている。キラーＴ−細胞による癌免疫においては、主要組織適合抗原（Major Histocompatibility Complex ; MHC）クラスＩと癌抗原との複合体の形で提示された癌抗原を認識した前駆体Ｔ−細胞が分化増殖して生成したキラーＴ−細胞が癌細胞を攻撃し、破壊する。この際、癌細胞はＭＨＣクラスＩ抗原と癌抗原との複合体をその細胞表面に提示しており、これがキラーＴ−細胞の標的とされる（非特許文献１〜４）。
【０００４】
標的細胞である癌細胞上にＭＨＣクラスＩ抗原により提示される前記の癌抗原は、癌細胞内で合成された抗原蛋白質が細胞内プロテアーゼによりプロセシングされて生成した約８〜１２個のアミノ酸から成るペプチドであると考えられている（非特許文献１〜４）。
【０００５】
現在、種々の癌について抗原蛋白質の検索が行われているが、癌特異抗原として証明されているものは少ない。
【０００６】
Ｗｉｌｍｓ腫瘍の癌抑制遺伝子ＷＴ１（ＷＴ１遺伝子）は、Ｗｉｌｍｓ腫瘍、無紅彩、泌尿生殖器異常、精神発達遅滞などを合併するＷＡＧＲ症候群の解析からＷｉｌｍｓ腫瘍の原因遺伝子の１つとして染色体１１ｐ１３から単離された（非特許文献５）ものであり、ゲノムＤＮＡは約５０kbで１０のエキソンから成り、そのｃＤＮＡは約３kbである。ｃＤＮＡから推定されるアミノ酸配列は、配列番号：１に示す通りである（非特許文献６）。
【０００７】
ＷＴ１遺伝子はヒト白血病で高発現しており、白血病細胞をＷＴ１アンチセンスオリゴマーで処理するとその細胞増殖が抑制される（特許文献１）ことなどから、ＷＴ１遺伝子は白血病細胞の増殖に促進的に働いていることが示唆されている。さらに、ＷＴ１遺伝子は、胃癌、大腸癌、肺癌、乳癌、胚細胞癌、肝癌、皮膚癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮癌、子宮頸癌、卵巣癌等の固形癌においても高発現しており（特許文献２）、ＷＴ１遺伝子は白血病及び固形癌における新しい腫瘍マーカーであることが判明した。しかしながら、ＷＴ１遺伝子発現生成物が癌ワクチンとして有用な癌特異抗原であることは立証されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開平９−１０４６２７号公報
【特許文献２】特開平１１−３５４８４号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Cur. Opin, Immunol., 5, 709, 1993
【非特許文献２】Cur. Opin, Immunol., 5, 719, 1993
【非特許文献３】Cell, 82, 13, 1995
【非特許文献４】Immunol. Rev, 146, 167, 1995
【非特許文献５】Gessler, M. ら、Nature,Vol. 343, p.774-778 (1990)
【非特許文献６】Mol. Cell. Biol., 11, 1707, 1991
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
従って本発明は、ＷＴ１遺伝子発現生成物が癌抗原である可能性を確認し、新規な癌抗原を提供しようとするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記の課題を解決すべく種々検討した結果、ＷＴ１遺伝子の発現生成物のアミノ酸配列中で、マウス及びヒトのＭＨＣクラスＩ及びＭＨＣクラスIIとの結合において、アンカーアミノ酸として機能すると予想される少なくとも１個のアミノ酸を含有する連続する７〜３０個のアミノ酸から成るポリペプチドを合成し、これらのペプチドがＭＨＣ蛋白質と結合することを確認すると共に、ＭＨＣクラスＩ抗原と結合した場合にキラーＴ−細胞を誘導し、且つ標的細胞に殺細胞効果を及ぼすことを確認して本発明を完成した。
【００１２】
従って本発明は、マウスＷＴ１発現産物、又はその部分を含んで成る癌抗原を提供する。好ましい態様において、本発明は、ＷＴ１のｃＤＮＡに対応する配列番号：１に示すアミノ酸配列において、ＭＨＣ抗原との結合のためのアンカーアミノ酸を含む６〜３０個のアミノ酸から成るペプチドを活性成分とする癌抗原を提供する。
【００１３】
さらに、本発明は、ヒトＷＴ１のｃＤＮＡに対応する配列番号：２に示すアミノ酸配列において、ＭＨＣ抗原との結合のためのアンカーアミノ酸を含む７〜３０個のアミノ酸から成るペプチドを活性成分とする癌抗原を提供する。
【００１４】
本発明はまた、上記の癌抗原を含んで成る癌ワクチンを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、実施例１における、Ｄｂ 126 ペプチドで免疫した細胞と非免疫細胞のフローサイトメトリーにおけるＣＤ４＋ 細胞とＣＤ８＋ 細胞の比率を示すグラフである。
【図２】図２は、実施例２における、Ｄｂ 126 ペプチドにより免疫した細胞の、Ｄｂ 126 ペプチドでパルスした標的細胞とパルスしていない標的細胞に対する殺細胞作用を比較したグラフである。
【図３】図３は、図２と同じ意味のグラフである。
【図４】図４において、Ａは、実施例３における、Ｄｂ 126 ペプチドを用いて誘導したＣＴＬの、Ｄｂ 126 ペプチドをパルスしたＴ２細胞に対する殺細胞効果を示し、Ｂは実施例３における、ＷＨ 187ペプチドを用いて誘導したＣＴＬの、ＷＨ 187ペプチドをパルスしたＴ２細胞に対する殺細胞効果を示すグラフである。
【図５】図５は、Ｄｂ 126 ペプチドにより誘導されたＣＴＬの表面マーカーをＦＡＣＳにより解析した結果を示すチャートである（ＣＤ１９細胞及びＣＤ３細胞）。
【図６】図６は、ＣＤ４細胞及びＣＤ８細胞についての、図５と同様のチャートである。
【図７】図７は、ＣＤ 56 細胞についての図５と同様のチャートである。
【図８】図８は、ＷＨ 187ペプチドにより誘導したＣＴＬの表面マーカーをＦＡＣＳにより解析した結果を示すチャートである（ＣＤ 19 細胞及びＣＤ３細胞）。
【図９】図９は、ＣＤ４細胞及びＣＤ８細胞についての、図８と同様のチャートである。
【図１０】図１０は、ＣＤ 56 細胞についての、図８と同様のチャートである。
【図１１】図１１は、Ｄｂ 126 ペプチド特異的ＣＴＬによる、Ｄｂ 126 ペプチドをパルスしたＴ２細胞に対する特異的細胞溶解に対する抗ＨＬＡ−Ａ２．１抗体の影響を示すグラフである。
【図１２】図１２は、ＷＴ１を発現している標的細胞又はＷＴ１を発現していない標的細胞に対する、Ｄｂ 126 ペプチド特異的ＣＴＬの細胞溶解活性を比較したグラフである。ａはＥ：Ｔ比が７．５：１の場合の結果を示し、ｂはＥ：Ｔ比が１５：１の場合の結果を示す。
【図１３】図１３は、生来的にＷＴ１を発現する腫瘍細胞（ＦＢＬ３）及びＷＴ１を発現しない腫瘍細胞（ＲＭＡ）に対する、Ｄｂ 126 ペプチド特異的ＣＴＬの細胞溶解効果を比較したグラフである。
【図１４】図１４は、ＷＴ１遺伝子により形質転換された細胞及び形質転換されていない同じ細胞に対する、Ｄｂ 126 ペプチド特異的ＣＴＬの細胞溶解効果を比較したグラフである。
【図１５】図１５は、Ｄｂ 126 ペプチド特異的ＣＴＬの細胞毒性に対する、抗Ｈ−２クラスＩ抗体の影響を示すグラフである。
【図１６】図１６は、Ｄｂ 126 ペプチドをワクチンとして使用してマウスを免疫した場合の、インビボ免疫効果を示すグラフである。
【図１７】図１７は、ＷＴ１を発現するプラスミドをＤＮＡワクチンとしてマウスに投与した場合の免疫効果を示すグラフである。
【図１８】図１８は、図１７の対照であって、ＷＴ１を発現しないプラスミドを投与した場合に免疫効果が生じないことを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明においては、癌抗原ペプチドを設計する際の基礎として、マウスＭＨＣクラスＩのＫｂ 及びＤｂ 、並びにヒトＨＬＡのＡ＊ ０２０１を選択し、これらと高い親和性を有すると予想されるペプチドを選択した。
【００１７】
Immunogenetics Vol.41, p.178-228 (1995) の記載から、Ｋｂ への結合のアンカーアミノ酸として５番目のＰｈｅ及びＴｒｙ並びに８番目のＬｅｕ及びＭｅｔ等が予想され、またＤｂ への結合のアンカーアミノ酸として５番目のＡｓｎ並びに９番目のＭｅｔ及びＩｌｅ等が予想される。
【００１８】
また、癌細胞の表面においてＭＨＣクラスＩにより提示される癌抗原ペプチドのサイズはおよそ８〜１２個であることが知られている。従って、本発明の癌抗原ペプチドは、配列番号：１に示すＷＴ１遺伝子産物のアミノ酸配列において、アンカーアミノ酸を含む、連続する７〜３０個のアミノ酸から成るペプチドである。アミノ酸の数は好ましくは８〜１２個であり、例えば８又は９個である。
【００１９】
本発明においては、その具体例として、ＭＨＣクラスＩのＫｂ に結合するペプチドとして、アミノ酸８個からなる下記ペプチド：
Ｋｂ 45 Gly Ala Ser Ala Tyr Gly Ser Leu（配列番号：３）
Ｋｂ 330 Cys Asn Lys Arg Tyr Phe Lys Leu（配列番号：４）
ＭＨＣクラスＩのＤｂ に結合するペプチドとして、アミノ酸９個から成る下記のペプチド：
Ｄｂ 126 Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu（配列番号：５）
Ｄｂ 221 Tyr Ser Ser Asp Asn Leu Tyr Gln Met（配列番号：６）
Ｄｂ 235 Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu（配列番号：７）
を使用した。上記配列において下線を付したアミノ酸がアンカーとして機能すると予想されるアミノ酸である。
【００２０】
次に、これらのペプチドの内、Ｋｂ 45及びＫｂ 330 についてはＭＨＣクラスＩのＫｂ との結合性を、Ｄｂ 126 ，Ｄｂ 221 及びＤｂ 235 についてはＭＨＣクラスＩのＤｂ との結合性を、抗原ペプチドを提示していないが（ｅｍｐｔｙ）、Ｋｂ 及びＤｂ は発現されているセルライン（ＲＭＡ−Ｓ）を用いて測定した。
【００２１】
すなわち、ＲＭＡ−Ｓを２６℃にて培養してＭＨＣクラスＩを高発現せしめ、この培養細胞を被験ペプチド溶液と３７℃にて１時間インキュベートした。これにより、ペプチドと結合しないＭＨＣ分子は不安定になって細胞表面から消失し、ペプチドを結合したＭＨＣクラスＩ分子のみが残る。次に、ＭＨＣクラスＩ（Ｋｂ ，Ｄｂ ）を認識する蛍光標識モノクローナル抗体によりＲＭＡ−Ｓ細胞を染色した。最後に、ＦＡＣＳ解析により、細胞当りの平均蛍光量から結合解離定数を計算した（Immunol. Lett., 47, 1, 1995）。
【００２２】
その結果、次の結果が得られた。
Ｋｂ 45 −４．５７８４８３８（log）
Ｋｂ 330 −５．７６１７７３２
Ｄｂ 126 −６．２８３４９６８
Ｄｂ 221 −５．７５４５３９８
Ｄｂ 235 −６．１４５７６２４
【００２３】
以上の通り、いずれもＫｂ 又はＤｂ と強〜中程度の結合親和性（kd値）を有しているが、最も高い結合親和性を示すＤｂ 126 ペプチドを以後の実験において用いた。
【００２４】
また、ヒトについては、Immunogenetics Vol. 41, p. 178-228 (1995) の記載から、ヒトのＨＬＡ−Ａ＊ ０２０１への結合アンカーアミノ酸として、Ｎ−末端から２番目のＬｅｕ及びＭｅｔ、並びにＮ−末端から９番目のＶａｌ及びＬｅｕが予想される。そこで、ヒトＷＴ１蛋白質のアミノ酸配列（Mol. Coll. Biol. Vol. 11, p. 1707-1712, 1991）（配列番号：２）中で、上の条件に合致する、９個のアミノ酸から成る２種類のペプチドを合成した。
Ｄｂ 126; Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu（配列番号：５）
（マウスにおけるＤｂ 126 の配列と同じ）
ＷＨ 187; Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val（配列番号:８）
（下線はアンカーアミノ酸を示す。）
【００２５】
上記ペプチドと、ＨＬＡ−Ａ＊ ０２０１との結合能を次のようにして測定した。
【００２６】
上記ペプチドと、ｅｍｐｔｙなＨＬＡ−Ａ＊ ０２０１をもつＴ２細胞（J. Immunol., 150, 1763, 1993; Blood, 88, 2450, 1996）を３７℃、１時間インキュベート後、ＨＬＡ−Ａ２．１を認識する蛍光標識モノクローナル抗体で、Ｔ２細胞を染色し、ＦＡＣＳ解析で、細胞当りの平均蛍光量から結合解離定数を計算した。
結 合 能
ペプチド Ｋｄ（Ｍ）
Ｄｂ 126 １．８９×１０−６
WH 187 ７．６１×１０−６
２種類のペプチドは、ともに中等度以上の結合親和性を有する。
【００２７】
ヒトＭＨＣに対応するペプチドとして、上記Ｄｂ 126 及びＷＨ 187を用いて、以下の実験を行った。
【００２８】
本発明はまた前記抗原を有効成分とする癌ワクチンに関する。このワクチンは、ＷＴ１遺伝子の発現レベルの上昇を伴う癌、例えば白血病、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、悪性リンパ腫などの血液の癌、胃癌、大腸癌、肺癌、乳癌、胚細胞癌、肝癌、皮膚癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮癌、子宮頸癌、卵巣癌等の固形癌の予防又は治療のために使用することができる。このワクチンは、経口投与、又は非経口投与、例えば腹腔内投与、皮下投与、皮内投与、筋肉内投与、静脈内投与、鼻腔内投与等により投与することができる。
【００２９】
さらに、本発明のワクチンの投与方法として、患者の末梢血から単核球を集め、その中から樹状細胞を取り出し、本発明のペプチドをパルスして患者に皮下投与などで患者に戻す方法も行われる。
【００３０】
ワクチンは、前記有効成分としての投与ペプチドのほかに、医薬として許容されるキャリアー、例えば適当なアジュバンド、例えば水酸化アルミニウムのごとき鉱物ゲル；リソレシチン、プルロニックポリオールのごとき界面活性剤；ポリアニオン；ペプチド；又は油乳濁液を含むことができる。あるいは、リポゾーム中へ混合し、又は多糖及び／又はワクチン中に配合される他の集合体を含むことができる。投与量は一般に、１日当り０．１μｇ〜１mg／kgである。
【００３１】
本発明はまた、上記のポリペプチドワクチンをコードするＤＮＡもワクチン（ＤＮＡワクチン）として使用することができる。すなわち、ＷＴ１又はその部分をコードする核酸、好ましくはＤＮＡを、適切なベクター、好ましくは発現ベクターに挿入した後、動物に投与することにより、癌免疫を生じさせることができる。その具体例を実施例９に示す。
【実施例】
【００３２】
次に、実施例により、本発明のペプチドが癌抗原及び癌ワクチンとして有用なことを、明らかにする。
【００３３】
実施例１
Ｄｂ 126 ペプチド１００μｇ、ブタ由来の乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）２００μｇ、及びフロイントの不完全アジュバント０．５mlをＣ５７ＢＬ／６マウスの腹腔内に、１週毎に２回注射して免疫処理した。この免疫処理の１週間後にマウスの脾臓を摘出し、脾臓細胞の浮遊液を調製した。他方、Ｄｂ 126 ペプチドをパルスした同系マウスの放射線照射脾細胞を、ペプチド５０μｇ／mlを含む溶液と３７℃にて３０分間インキュベートし、抗原提示細胞とした。
【００３４】
前記の免疫処理した脾細胞と放射線照射した脾細胞を混合して、５日間共培養し、キラーＴ−細胞を誘導調製した。他方Ｄｂ 126 ペプチドによりパルス（１００μｇ／mlのペプチド溶液と３７℃にて３０分間インキュベート）した Europium ラベルＥＬ−４細胞（Ｋｂ 及びＤｂ を発現している）を標的細胞とし、通常の方法を用いて、次の操作によりＫｉｌｌｉｎｇアッセイを行った（表１）。
【００３５】
その結果、Ｄｂ 126 をパルスしたＥＬ−４細胞を標的にした場合は、殺細胞効果が見られたが、Ｄｂ 126 をパルスしていないＥＬ−４細胞標的した場合は、殺細胞効果はほとんど見られなかった。
【００３６】
【表１】
【００３７】
次に、Ｋｉｌｌｉｎｇアッセイにより有意な殺細胞効果を示した脾細胞試料を、蛍光標識した抗ＣＤ４抗体又は抗ＣＤ８抗体で染色しフローサイトメトリーにより、ＣＤ４及びＣＤ８の発現を解析した。
【００３８】
その結果、図１に示すごとく、非免疫対照細胞に比べて、Ｄｂ 126 ペプチドで免疫処理した脾細胞においては、キラーＴ−細胞により代表されるＣＤ８＋ 細胞が増加し、ヘルパーＴ−細胞等により代表されるＣＤ４＋ 細胞に対するＣＤ８＋ 細胞の比率が逆転増加していた。
【００３９】
実施例２
Ｃ５７ＢＬ／６マウスの骨髄由来の樹状細胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ；ＤＣ）を次の様にして調製した。常法に従い、骨髄細胞をＧＭ−ＣＳＦ存在下で培養し、骨髄由来樹状細胞を調製した（J. Exp. Med. 182, 255, 1995）。
【００４０】
７日間培養した樹状細胞と１０μＭのＯＶＡII（Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ II ）及び１μＭのＤｂ 126 ペプチドと共に３時間インキュベートした後、洗浄した。
【００４１】
次に、Ｃ５７ＢＬ／６マウスのｆｏｏｔ ｐａｄｓとｈａｎｄｓとに上記ＤＣ細胞を皮内注射し、５日目に所属リンパ節を取り出し、細胞浮遊液を調製した。他方、Ｄｂ 126 ペプチドでパルスし、放射線照射したＢ７．１−ＲＭＡ−Ｓ細胞（Ｃｏ−ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｍｏｌｅｃｕｌｅであるＢ７．１をコードする遺伝子をトランスフェクトしたＲＭＡ−Ｓ細胞）を調製した。
【００４２】
次に、上記のリンパ節由来細胞浮遊液とＢ７．１−ＲＭＡ−Ｓ細胞とを混合して培養することによりインビトロで再刺激した。
【００４３】
次に、インビトロでの再刺激の５日目に、５１ＣｒでラベルしたＲＭＡ−Ｓ細胞を標的としてＫｉｌｌｉｎｇアッセイを行った。再刺激５日目に回収されたリンパ球全体の１／８をエフェクター細胞として用いた時を、最大のＥ／Ｔ比（１．０）とした。
【００４４】
図２及び図３に示すごとく、Ｄｂ 126 ペプチドにより免疫されたマウスのリンパ節由来のエフェクター細胞は、該ペプチドでパルスされた標的細胞を殺したのに対して、該ペプチドでパルスされない標的細胞は殺さなかった。
【００４５】
また、実施例１と同様にして行ったフローサイトメトリーでＣＤ４＋ 細胞とＣＤ８＋ 細胞の比を解析したところ、ＣＤ４：ＣＤ８＝１：１．４〜１．７であり、非免疫マウス細胞（対照）に比べて、Ｄｂ 126 ペプチドで免疫されたマウス細胞においては、ＣＤ８＋ 細胞が増加し、ＣＤ４＋ 細胞：ＣＤ８＋ 細胞の比（対照細胞においては約２：１）が免疫された細胞においては逆転していた。
【００４６】
実施例３
ペプチドＤｂ 126 又はＷＨ 187（４０μｇ／ml）と１時間インキュベートした後に放射線照射したＴ２細胞５×１０４ 個とＨＬＡ−Ａ＊ ０２０１をもつ健常人の末梢単核球１×１０６ 個とを共培養した。一週間後、ペプチド（２０μｇ／ml）と１時間インキュベートした後に放射線照射したＴ２細胞を上記の共培養系に加え、再刺激を行なった。その翌日から、ヒトＩＬ−２（最終濃度１００ JRU／ml）を培養液に加えた。
【００４７】
以後、ペプチドでパルス後に放射線照射されたＴ２細胞での刺激を５回くり返した後、ペプチドをパルスされたＴ２細胞、あるいは、ペプチドをパルスされていないＴ２細胞を標的にして、Ｋｉｌｌｉｎｇ ａｓｓａｙを行なった。また、誘導されたＣＴＬの表面マーカーをＦＡＣＳ解析した。
【００４８】
Ｋｉｌｌｉｎｇ ａｓｓａｙは常法に従いＥｕｒｏｐｉｕｍでラベルしたＴ２細胞にペプチドをパルスしたものを標的として行った。
Ｅｆｆｅｃｔｏｒ：Ｔａｒｇｅｔ比（Ｅ／Ｔ ratio）は１０：１
共培養時間：３時間
培養液中のペプチド濃度：５μｇ／ml
【００４９】
結果を図４に示す。図４のＡはＤｂ 126 ペプチドを用いて誘導したＣＴＬの、Ｄｂ 126 ペプチドをパルスしたＴ２細胞に対する殺細胞効果を示し、図４のＢはＷＨ 187ペプチドを用いて誘導したＣＴＬの、ＷＨ 187ペプチドをパルスしたＴ２細胞に対する殺細胞効果を示す。
【００５０】
いずれの場合でも、ペプチドをパルスしたＴ２細胞に対してより強い殺細胞効果が見られた。
【００５１】
ＦＡＣＳ解析の結果を図５〜図１０に示す。図５〜７にＤｂ 126ペプチドで誘導したヒトのＣＴＬの結果を示し、ほとんどの細胞がＣＤ８陽性であった。図８〜図１０はＷＨ 187ペプチドで誘導されたヒトのＣＴＬの結果を示す。ＣＤ４陽性細胞とＣＤ８陽性細胞がほぼ同数であった。
【００５２】
実施例４
Ｄｂ 126 ペプチド特異的ＣＴＬの細胞溶解活性のＭＨＣ拘束性を試験するため、ペプチドでパルスしたＴ２細胞に対するＣＴＬの細胞毒性活性をブロックするために抗ＨＬＡ−Ａ２．１モノクローナル抗体を用いた。Ｄｂ 126 ペプチドでパルスしたＴ２細胞の特異的細胞溶解を５：１のＥ／Ｔ比において、ＨＬＡ−Ａ２．１分子に対するブロッキングモノクローナル抗体（ＢＢ７．２）の存在下又は不存在下で測定した。
【００５３】
結果を図１１に示す。この図において＊ 印は抗ＨＬＡ−Ａ２．１モノクローナル抗体の代りに抗Ｈ−２Ｋｂ モノクローナル抗体を使用した結果を示す。この図から明らかな通り、６０μｇ／mlの抗ＨＬＡ−Ａ２．１モノクローナル抗体の添加により、細胞毒性は、Ｔ２細胞の細胞溶解のバックグラウンドまで低下した。アイソタイプが同じ無関係のモノクローナル抗体（抗Ｈ−２Ｋｂ モノクローナル抗体Ｙ３）はＴ２細胞の溶解に効果を有しなかった。
【００５４】
実施例５
Ｄｂ 126 ペプチド特異的ＣＴＬが、生来的にＷＴ１を発現するＨＬＡ−Ａ２．１陽性白血病細胞を殺すことができるか否かを試験した。標的細胞としてＴＦ１細胞（ＷＴ−１を発現し、ＨＬＡ−Ａ２．１陽性）、ＪＹ細胞（ＷＴ１を発現せず、ＨＬＡ−Ａ２．１陽性）、及びＭｏｌｔ−４細胞（ＷＴ１を発現し、ＨＬＡ−Ａ２．１陰性）を用い、７．５：１（ａ）又は１５：１のＥ：Ｔ比において、細胞毒性を測定した。
【００５５】
結果を図１２に示す。Ｄｂ 126 ペプチド特異的ＣＴＬは生来的にＷＴ１を発現しＨＬＡ−Ａ２．１陽性の白血病細胞ＴＦ１に対して有意な細胞毒性を示したが、Ｍｏｌｔ−４（ＷＴ１を発現し、ＨＬＡ−Ａ２．１−陰性）又はＪＹ細胞（ＷＴ１を発現せず、ＨＬＡ−Ａ２．１−陽性）に対してはバックグラウンドレベルの細胞溶解を示した。
【００５６】
実施例６
Ｄｂ 126 ペプチド特異的ＣＴＬが、生来的にＷＴ１を発現する腫瘍細胞を認識しそして細胞溶解するか否かを試験した。ＷＴ１を発現する腫瘍細胞（ＦＢＬ３）もしくはＷＴ１を発現しない腫瘍細胞（ＲＭＡ）（図１３）、又はＷＴ１遺伝子をトランスフェクトされたＣ１４９８細胞もしくはＴＷ１遺伝子をトランスフェクトされていないＣ１４９８細胞（図１４）について、特異的細胞溶解を図１３及び図１４に示すＥ／Ｔ比において測定した。
【００５７】
図１３に示す通り、Ｄｂ 126 ペプチド特異的ＣＴＬは、生来的にＷＴ１を発現するＦＢＬ３細胞を溶解したがＷＴ１を発現しないＲＭＡ細胞を溶解しなかった。図１４に示す通り、さらに、Ｄｂ 126ペプチド特異的ＣＴＬは、ＷＴ１を発現しない親Ｃ１４９８細胞に比べて、マウスＷＴ１遺伝子をトランスフェクトされたＣ１４９８細胞を殺した。これにより、ＣＴＬによる殺細胞のために標的化された分子が確かにＷＴ１ペプチドであることが確認された。これらの結果は、Ｄｂ 126 ペプチド特異的ＣＴＬが、ＷＴ１蛋白質の細胞内プロセシングにより天然に産生され、そしてＷＴ１発現細胞のＨ−２Ｄｂ 分子上に存在するＤｂ 126 ペプチド又は関連ペプチドを認識することができることを示唆している。
【００５８】
実施例７
ＣＴＬの細胞溶解活性がＭＨＣ拘束性であるか否かを試験するため、Ｈ−２クラスＩ分子に対する抗体の存在下で測定を行った。すなわち、Ｄｂ 126 ペプチド特異的ＣＴＬによる、Ｄｂ 126 ペプチドでパルスしたＲＭＡ−Ｓ細胞、Ｈ−２Ｋｂ （２８．１３．３Ｓ）、Ｈ−２Ｄｂ （２８．１１．５Ｓ）又はＨ−２Ｌｄ （ＭＡ１４３）に対する、タイターを調整したモノクローナル抗体の存在下で試験した。対照モノクローナル抗体としてアイソタイプが一致したモノクローナル抗体を使用した。
【００５９】
結果を図１５に示す。Ｈ−２Ｄｂ に対する抗体の濃度の増加に依存して、Ｄｂ 126 ペプチドでパルスしたＲＭＡ−Ｓ細胞に対するＣＴＬの細胞溶解活性が抑制されたが、Ｈ−２Ｋｂ 又はＨ−２Ｌｄ に対する抗体はＣＴＬの細胞溶解活性を抑制しなかった。これらの結果は、ＣＴＬがＨ−２Ｄｂ 拘束的に細胞溶解活性を発揮することを示している。
【００６０】
実施例８
Ｄｂ 126 ペプチドによる積極的免疫化により生体内腫瘍免疫が惹起されるか否かを試験した。Ｄｂ 126 ペプチドによりパルスされたＬＰＳ活性化脾細胞（図１６中の実線）、ＬＰＳ活性化脾細胞のみ（網線）、又はリン酸緩衝液のみ（ＰＢＳ）（破線）により、１週間に１回マウスを免疫した。３週間の免疫の後、３×１０７ 個のＦＢＬ３白血病細胞を腹腔内注射した。
【００６１】
結果を図１６に示す。Ｄｂ 126 ペプチドにより免疫されたマウスは腫瘍チャレンジを克服しそして生存したが、非免疫マウス及びＬＰＳ活性化脾細胞のみで免疫されたマウスは腫瘍チャレンジを拒絶することができず、死亡した。免疫されたマウス及び非免疫マウスの両方について、腫瘍細胞の前記腹腔内接種の後３日間で腹水が観察された。非免疫マウスにおいては腹水が増加し続け、そしてマウスは死んだ。他方、免疫マウスにおいては、腹水はその後徐々に減少し、マウスは腫瘍チャレンジを完全に拒絶し、そして生存した。非免疫マウスにおいて、自然的退行（ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ）が時々観察された。この退行は、Ｆｒｉｅｎｄ白血病ウイルス（ＦＢＬ３白血病細胞はこのウイルスにより形質転換される）に対して特異的なＣＴＬの自然的誘導によるものと予想される。なぜなら、このようなＣＴＬ誘導は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて時おり観察されるからである。
【００６２】
実施例９ ＤＮＡワクチン
６〜８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスに、１００μｇのＷＴ１を発現するプラスミッドＤＮＡ（マウスＷＴ１ｃＤＮＡ（Molecular and Cellular Biology, vol.11, No.3, p.1707-1712(1991), p.1709の左欄）のＳｕｎ ３ＡＩ断片をＣＭＶ−ＩＥプロモーターに連結し、ＷＴ１を持続発現するプラスミッドを作製）(Proc.Natl.Acod.Su, USA., 92, 11105-11109(1995))を１０日毎に、計３回筋肉注射した。最後の筋肉注射の１０日後、マウスの脾を取り出し脾細胞を調整し、この脾細胞と、ＷＴ１を発現しているｍＷＴ１Ｃ１４９８細胞（４０Ｇｙ放射線照射）と６日間、３７℃で共培養を行なった後、標的細胞として、ＷＴ１を発現しているＣ１４９８（ＰＭ５Ｇ−ｍＷＴ１）とＷＴ１を発現していないＣ１４９８（ＰＭ５Ｇ）を用いて、Ｋｉｌｌｉｎｇ ａｓｓａｙ（Ｅｕｒｏｐｉｕｍでラベル）を行った。なお、Ｃ１４９８はＷＴ１を発現しないマウス骨髄性白血病細胞株である。
【００６３】
ＷＴ１を発現している、Ｃ１４９８（ＰＭ５Ｇ−ｍＷＴ１）細胞を殺すが、ＷＴ１を発現していない細胞は殺さない細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）が誘導された。
【００６４】
結果を図１７に示す。
対照として、上記と同様の実験を行ったが、ＷＴ１を発現しているプラスミッドの代りに、ＷＴ１を発現しない（ＷＴ１ｃＤＮＡをもたない）プラスミッドをマウスに筋肉注射した。上記の実験と同じように脾細胞を採取し、ＷＴ１を発現しているＣ１４９８（ＰＭ５Ｇ−ｍＷＴ１）でｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激後、Ｋｉｌｌｉｎｇ ａｓｓａｙを行った。
【００６５】
図１８に示す通り、ＷＴ１ｃＤＮＡをもたないコントロールプラスミッドＤＮＡの筋肉注射からは、ＷＴ１タンパク特異的ＣＴＬは誘導されなかった。
【産業上の利用可能性】
【００６６】
上記の結果から、本発明のペプチドは確かに癌抗原として機能し、癌細胞に対するキラーＴ−細胞（癌細胞傷害性Ｔ細胞）を誘導増殖させたことが立証された。従って、本発明の癌抗原ペプチドは、ＷＴ１遺伝子の発現の上昇を伴う白血病及び固形癌に対する癌ワクチンとして有用である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｗｉｌｍｓ腫瘍の癌抑制遺伝子ＷＴ１の産物に基づく癌抗原に関する。この癌抗原は、白血病、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、悪性リンパ腫などの血液の癌、又は固形癌、例えば胃癌、大腸癌、肺癌、乳癌、胚細胞癌、肝癌、皮膚癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮癌、子宮頸癌、卵巣癌等、並びにさらにはＷＴ１を発現するすべての癌に対する抗癌ワクチンとして有用である。
【背景技術】
【０００２】
異物を排除するための免疫機構には、一般に、抗原を認識して抗原提示細胞として機能するマクロファージ、該マクロファージの抗原提示を認識して種々のリンホカインを産生して他のＴ−細胞等を活性化するヘルパーＴ−細胞、該リンホカインの作用により抗体産生細胞に分化するＢ−リンパ球等が関与する液性免疫と、抗原の提示を受けて分化したキラーＴ−細胞が標的細胞を攻撃し破壊する細胞性免疫とがある。
【０００３】
現在のところ、癌の免疫は主として、キラーＴ−細胞が関与する細胞性免疫によるものと考えられている。キラーＴ−細胞による癌免疫においては、主要組織適合抗原（Major Histocompatibility Complex ; MHC）クラスＩと癌抗原との複合体の形で提示された癌抗原を認識した前駆体Ｔ−細胞が分化増殖して生成したキラーＴ−細胞が癌細胞を攻撃し、破壊する。この際、癌細胞はＭＨＣクラスＩ抗原と癌抗原との複合体をその細胞表面に提示しており、これがキラーＴ−細胞の標的とされる（非特許文献１〜４）。
【０００４】
標的細胞である癌細胞上にＭＨＣクラスＩ抗原により提示される前記の癌抗原は、癌細胞内で合成された抗原蛋白質が細胞内プロテアーゼによりプロセシングされて生成した約８〜１２個のアミノ酸から成るペプチドであると考えられている（非特許文献１〜４）。
【０００５】
現在、種々の癌について抗原蛋白質の検索が行われているが、癌特異抗原として証明されているものは少ない。
【０００６】
Ｗｉｌｍｓ腫瘍の癌抑制遺伝子ＷＴ１（ＷＴ１遺伝子）は、Ｗｉｌｍｓ腫瘍、無紅彩、泌尿生殖器異常、精神発達遅滞などを合併するＷＡＧＲ症候群の解析からＷｉｌｍｓ腫瘍の原因遺伝子の１つとして染色体１１ｐ１３から単離された（非特許文献５）ものであり、ゲノムＤＮＡは約５０kbで１０のエキソンから成り、そのｃＤＮＡは約３kbである。ｃＤＮＡから推定されるアミノ酸配列は、配列番号：１に示す通りである（非特許文献６）。
【０００７】
ＷＴ１遺伝子はヒト白血病で高発現しており、白血病細胞をＷＴ１アンチセンスオリゴマーで処理するとその細胞増殖が抑制される（特許文献１）ことなどから、ＷＴ１遺伝子は白血病細胞の増殖に促進的に働いていることが示唆されている。さらに、ＷＴ１遺伝子は、胃癌、大腸癌、肺癌、乳癌、胚細胞癌、肝癌、皮膚癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮癌、子宮頸癌、卵巣癌等の固形癌においても高発現しており（特許文献２）、ＷＴ１遺伝子は白血病及び固形癌における新しい腫瘍マーカーであることが判明した。しかしながら、ＷＴ１遺伝子発現生成物が癌ワクチンとして有用な癌特異抗原であることは立証されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開平９−１０４６２７号公報
【特許文献２】特開平１１−３５４８４号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Cur. Opin, Immunol., 5, 709, 1993
【非特許文献２】Cur. Opin, Immunol., 5, 719, 1993
【非特許文献３】Cell, 82, 13, 1995
【非特許文献４】Immunol. Rev, 146, 167, 1995
【非特許文献５】Gessler, M. ら、Nature,Vol. 343, p.774-778 (1990)
【非特許文献６】Mol. Cell. Biol., 11, 1707, 1991
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
従って本発明は、ＷＴ１遺伝子発現生成物が癌抗原である可能性を確認し、新規な癌抗原を提供しようとするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記の課題を解決すべく種々検討した結果、ＷＴ１遺伝子の発現生成物のアミノ酸配列中で、マウス及びヒトのＭＨＣクラスＩ及びＭＨＣクラスIIとの結合において、アンカーアミノ酸として機能すると予想される少なくとも１個のアミノ酸を含有する連続する７〜３０個のアミノ酸から成るポリペプチドを合成し、これらのペプチドがＭＨＣ蛋白質と結合することを確認すると共に、ＭＨＣクラスＩ抗原と結合した場合にキラーＴ−細胞を誘導し、且つ標的細胞に殺細胞効果を及ぼすことを確認して本発明を完成した。
【００１２】
従って本発明は、マウスＷＴ１発現産物、又はその部分を含んで成る癌抗原を提供する。好ましい態様において、本発明は、ＷＴ１のｃＤＮＡに対応する配列番号：１に示すアミノ酸配列において、ＭＨＣ抗原との結合のためのアンカーアミノ酸を含む６〜３０個のアミノ酸から成るペプチドを活性成分とする癌抗原を提供する。
【００１３】
さらに、本発明は、ヒトＷＴ１のｃＤＮＡに対応する配列番号：２に示すアミノ酸配列において、ＭＨＣ抗原との結合のためのアンカーアミノ酸を含む７〜３０個のアミノ酸から成るペプチドを活性成分とする癌抗原を提供する。
【００１４】
本発明はまた、上記の癌抗原を含んで成る癌ワクチンを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、実施例１における、Ｄｂ 126 ペプチドで免疫した細胞と非免疫細胞のフローサイトメトリーにおけるＣＤ４＋ 細胞とＣＤ８＋ 細胞の比率を示すグラフである。
【図２】図２は、実施例２における、Ｄｂ 126 ペプチドにより免疫した細胞の、Ｄｂ 126 ペプチドでパルスした標的細胞とパルスしていない標的細胞に対する殺細胞作用を比較したグラフである。
【図３】図３は、図２と同じ意味のグラフである。
【図４】図４において、Ａは、実施例３における、Ｄｂ 126 ペプチドを用いて誘導したＣＴＬの、Ｄｂ 126 ペプチドをパルスしたＴ２細胞に対する殺細胞効果を示し、Ｂは実施例３における、ＷＨ 187ペプチドを用いて誘導したＣＴＬの、ＷＨ 187ペプチドをパルスしたＴ２細胞に対する殺細胞効果を示すグラフである。
【図５】図５は、Ｄｂ 126 ペプチドにより誘導されたＣＴＬの表面マーカーをＦＡＣＳにより解析した結果を示すチャートである（ＣＤ１９細胞及びＣＤ３細胞）。
【図６】図６は、ＣＤ４細胞及びＣＤ８細胞についての、図５と同様のチャートである。
【図７】図７は、ＣＤ 56 細胞についての図５と同様のチャートである。
【図８】図８は、ＷＨ 187ペプチドにより誘導したＣＴＬの表面マーカーをＦＡＣＳにより解析した結果を示すチャートである（ＣＤ 19 細胞及びＣＤ３細胞）。
【図９】図９は、ＣＤ４細胞及びＣＤ８細胞についての、図８と同様のチャートである。
【図１０】図１０は、ＣＤ 56 細胞についての、図８と同様のチャートである。
【図１１】図１１は、Ｄｂ 126 ペプチド特異的ＣＴＬによる、Ｄｂ 126 ペプチドをパルスしたＴ２細胞に対する特異的細胞溶解に対する抗ＨＬＡ−Ａ２．１抗体の影響を示すグラフである。
【図１２】図１２は、ＷＴ１を発現している標的細胞又はＷＴ１を発現していない標的細胞に対する、Ｄｂ 126 ペプチド特異的ＣＴＬの細胞溶解活性を比較したグラフである。ａはＥ：Ｔ比が７．５：１の場合の結果を示し、ｂはＥ：Ｔ比が１５：１の場合の結果を示す。
【図１３】図１３は、生来的にＷＴ１を発現する腫瘍細胞（ＦＢＬ３）及びＷＴ１を発現しない腫瘍細胞（ＲＭＡ）に対する、Ｄｂ 126 ペプチド特異的ＣＴＬの細胞溶解効果を比較したグラフである。
【図１４】図１４は、ＷＴ１遺伝子により形質転換された細胞及び形質転換されていない同じ細胞に対する、Ｄｂ 126 ペプチド特異的ＣＴＬの細胞溶解効果を比較したグラフである。
【図１５】図１５は、Ｄｂ 126 ペプチド特異的ＣＴＬの細胞毒性に対する、抗Ｈ−２クラスＩ抗体の影響を示すグラフである。
【図１６】図１６は、Ｄｂ 126 ペプチドをワクチンとして使用してマウスを免疫した場合の、インビボ免疫効果を示すグラフである。
【図１７】図１７は、ＷＴ１を発現するプラスミドをＤＮＡワクチンとしてマウスに投与した場合の免疫効果を示すグラフである。
【図１８】図１８は、図１７の対照であって、ＷＴ１を発現しないプラスミドを投与した場合に免疫効果が生じないことを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明においては、癌抗原ペプチドを設計する際の基礎として、マウスＭＨＣクラスＩのＫｂ 及びＤｂ 、並びにヒトＨＬＡのＡ＊ ０２０１を選択し、これらと高い親和性を有すると予想されるペプチドを選択した。
【００１７】
Immunogenetics Vol.41, p.178-228 (1995) の記載から、Ｋｂ への結合のアンカーアミノ酸として５番目のＰｈｅ及びＴｒｙ並びに８番目のＬｅｕ及びＭｅｔ等が予想され、またＤｂ への結合のアンカーアミノ酸として５番目のＡｓｎ並びに９番目のＭｅｔ及びＩｌｅ等が予想される。
【００１８】
また、癌細胞の表面においてＭＨＣクラスＩにより提示される癌抗原ペプチドのサイズはおよそ８〜１２個であることが知られている。従って、本発明の癌抗原ペプチドは、配列番号：１に示すＷＴ１遺伝子産物のアミノ酸配列において、アンカーアミノ酸を含む、連続する７〜３０個のアミノ酸から成るペプチドである。アミノ酸の数は好ましくは８〜１２個であり、例えば８又は９個である。
【００１９】
本発明においては、その具体例として、ＭＨＣクラスＩのＫｂ に結合するペプチドとして、アミノ酸８個からなる下記ペプチド：
Ｋｂ 45 Gly Ala Ser Ala Tyr Gly Ser Leu（配列番号：３）
Ｋｂ 330 Cys Asn Lys Arg Tyr Phe Lys Leu（配列番号：４）
ＭＨＣクラスＩのＤｂ に結合するペプチドとして、アミノ酸９個から成る下記のペプチド：
Ｄｂ 126 Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu（配列番号：５）
Ｄｂ 221 Tyr Ser Ser Asp Asn Leu Tyr Gln Met（配列番号：６）
Ｄｂ 235 Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu（配列番号：７）
を使用した。上記配列において下線を付したアミノ酸がアンカーとして機能すると予想されるアミノ酸である。
【００２０】
次に、これらのペプチドの内、Ｋｂ 45及びＫｂ 330 についてはＭＨＣクラスＩのＫｂ との結合性を、Ｄｂ 126 ，Ｄｂ 221 及びＤｂ 235 についてはＭＨＣクラスＩのＤｂ との結合性を、抗原ペプチドを提示していないが（ｅｍｐｔｙ）、Ｋｂ 及びＤｂ は発現されているセルライン（ＲＭＡ−Ｓ）を用いて測定した。
【００２１】
すなわち、ＲＭＡ−Ｓを２６℃にて培養してＭＨＣクラスＩを高発現せしめ、この培養細胞を被験ペプチド溶液と３７℃にて１時間インキュベートした。これにより、ペプチドと結合しないＭＨＣ分子は不安定になって細胞表面から消失し、ペプチドを結合したＭＨＣクラスＩ分子のみが残る。次に、ＭＨＣクラスＩ（Ｋｂ ，Ｄｂ ）を認識する蛍光標識モノクローナル抗体によりＲＭＡ−Ｓ細胞を染色した。最後に、ＦＡＣＳ解析により、細胞当りの平均蛍光量から結合解離定数を計算した（Immunol. Lett., 47, 1, 1995）。
【００２２】
その結果、次の結果が得られた。
Ｋｂ 45 −４．５７８４８３８（log）
Ｋｂ 330 −５．７６１７７３２
Ｄｂ 126 −６．２８３４９６８
Ｄｂ 221 −５．７５４５３９８
Ｄｂ 235 −６．１４５７６２４
【００２３】
以上の通り、いずれもＫｂ 又はＤｂ と強〜中程度の結合親和性（kd値）を有しているが、最も高い結合親和性を示すＤｂ 126 ペプチドを以後の実験において用いた。
【００２４】
また、ヒトについては、Immunogenetics Vol. 41, p. 178-228 (1995) の記載から、ヒトのＨＬＡ−Ａ＊ ０２０１への結合アンカーアミノ酸として、Ｎ−末端から２番目のＬｅｕ及びＭｅｔ、並びにＮ−末端から９番目のＶａｌ及びＬｅｕが予想される。そこで、ヒトＷＴ１蛋白質のアミノ酸配列（Mol. Coll. Biol. Vol. 11, p. 1707-1712, 1991）（配列番号：２）中で、上の条件に合致する、９個のアミノ酸から成る２種類のペプチドを合成した。
Ｄｂ 126; Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu（配列番号：５）
（マウスにおけるＤｂ 126 の配列と同じ）
ＷＨ 187; Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val（配列番号:８）
（下線はアンカーアミノ酸を示す。）
【００２５】
上記ペプチドと、ＨＬＡ−Ａ＊ ０２０１との結合能を次のようにして測定した。
【００２６】
上記ペプチドと、ｅｍｐｔｙなＨＬＡ−Ａ＊ ０２０１をもつＴ２細胞（J. Immunol., 150, 1763, 1993; Blood, 88, 2450, 1996）を３７℃、１時間インキュベート後、ＨＬＡ−Ａ２．１を認識する蛍光標識モノクローナル抗体で、Ｔ２細胞を染色し、ＦＡＣＳ解析で、細胞当りの平均蛍光量から結合解離定数を計算した。
結 合 能
ペプチド Ｋｄ（Ｍ）
Ｄｂ 126 １．８９×１０−６
WH 187 ７．６１×１０−６
２種類のペプチドは、ともに中等度以上の結合親和性を有する。
【００２７】
ヒトＭＨＣに対応するペプチドとして、上記Ｄｂ 126 及びＷＨ 187を用いて、以下の実験を行った。
【００２８】
本発明はまた前記抗原を有効成分とする癌ワクチンに関する。このワクチンは、ＷＴ１遺伝子の発現レベルの上昇を伴う癌、例えば白血病、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、悪性リンパ腫などの血液の癌、胃癌、大腸癌、肺癌、乳癌、胚細胞癌、肝癌、皮膚癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮癌、子宮頸癌、卵巣癌等の固形癌の予防又は治療のために使用することができる。このワクチンは、経口投与、又は非経口投与、例えば腹腔内投与、皮下投与、皮内投与、筋肉内投与、静脈内投与、鼻腔内投与等により投与することができる。
【００２９】
さらに、本発明のワクチンの投与方法として、患者の末梢血から単核球を集め、その中から樹状細胞を取り出し、本発明のペプチドをパルスして患者に皮下投与などで患者に戻す方法も行われる。
【００３０】
ワクチンは、前記有効成分としての投与ペプチドのほかに、医薬として許容されるキャリアー、例えば適当なアジュバンド、例えば水酸化アルミニウムのごとき鉱物ゲル；リソレシチン、プルロニックポリオールのごとき界面活性剤；ポリアニオン；ペプチド；又は油乳濁液を含むことができる。あるいは、リポゾーム中へ混合し、又は多糖及び／又はワクチン中に配合される他の集合体を含むことができる。投与量は一般に、１日当り０．１μｇ〜１mg／kgである。
【００３１】
本発明はまた、上記のポリペプチドワクチンをコードするＤＮＡもワクチン（ＤＮＡワクチン）として使用することができる。すなわち、ＷＴ１又はその部分をコードする核酸、好ましくはＤＮＡを、適切なベクター、好ましくは発現ベクターに挿入した後、動物に投与することにより、癌免疫を生じさせることができる。その具体例を実施例９に示す。
【実施例】
【００３２】
次に、実施例により、本発明のペプチドが癌抗原及び癌ワクチンとして有用なことを、明らかにする。
【００３３】
実施例１
Ｄｂ 126 ペプチド１００μｇ、ブタ由来の乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）２００μｇ、及びフロイントの不完全アジュバント０．５mlをＣ５７ＢＬ／６マウスの腹腔内に、１週毎に２回注射して免疫処理した。この免疫処理の１週間後にマウスの脾臓を摘出し、脾臓細胞の浮遊液を調製した。他方、Ｄｂ 126 ペプチドをパルスした同系マウスの放射線照射脾細胞を、ペプチド５０μｇ／mlを含む溶液と３７℃にて３０分間インキュベートし、抗原提示細胞とした。
【００３４】
前記の免疫処理した脾細胞と放射線照射した脾細胞を混合して、５日間共培養し、キラーＴ−細胞を誘導調製した。他方Ｄｂ 126 ペプチドによりパルス（１００μｇ／mlのペプチド溶液と３７℃にて３０分間インキュベート）した Europium ラベルＥＬ−４細胞（Ｋｂ 及びＤｂ を発現している）を標的細胞とし、通常の方法を用いて、次の操作によりＫｉｌｌｉｎｇアッセイを行った（表１）。
【００３５】
その結果、Ｄｂ 126 をパルスしたＥＬ−４細胞を標的にした場合は、殺細胞効果が見られたが、Ｄｂ 126 をパルスしていないＥＬ−４細胞標的した場合は、殺細胞効果はほとんど見られなかった。
【００３６】
【表１】
【００３７】
次に、Ｋｉｌｌｉｎｇアッセイにより有意な殺細胞効果を示した脾細胞試料を、蛍光標識した抗ＣＤ４抗体又は抗ＣＤ８抗体で染色しフローサイトメトリーにより、ＣＤ４及びＣＤ８の発現を解析した。
【００３８】
その結果、図１に示すごとく、非免疫対照細胞に比べて、Ｄｂ 126 ペプチドで免疫処理した脾細胞においては、キラーＴ−細胞により代表されるＣＤ８＋ 細胞が増加し、ヘルパーＴ−細胞等により代表されるＣＤ４＋ 細胞に対するＣＤ８＋ 細胞の比率が逆転増加していた。
【００３９】
実施例２
Ｃ５７ＢＬ／６マウスの骨髄由来の樹状細胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ；ＤＣ）を次の様にして調製した。常法に従い、骨髄細胞をＧＭ−ＣＳＦ存在下で培養し、骨髄由来樹状細胞を調製した（J. Exp. Med. 182, 255, 1995）。
【００４０】
７日間培養した樹状細胞と１０μＭのＯＶＡII（Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ II ）及び１μＭのＤｂ 126 ペプチドと共に３時間インキュベートした後、洗浄した。
【００４１】
次に、Ｃ５７ＢＬ／６マウスのｆｏｏｔ ｐａｄｓとｈａｎｄｓとに上記ＤＣ細胞を皮内注射し、５日目に所属リンパ節を取り出し、細胞浮遊液を調製した。他方、Ｄｂ 126 ペプチドでパルスし、放射線照射したＢ７．１−ＲＭＡ−Ｓ細胞（Ｃｏ−ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｍｏｌｅｃｕｌｅであるＢ７．１をコードする遺伝子をトランスフェクトしたＲＭＡ−Ｓ細胞）を調製した。
【００４２】
次に、上記のリンパ節由来細胞浮遊液とＢ７．１−ＲＭＡ−Ｓ細胞とを混合して培養することによりインビトロで再刺激した。
【００４３】
次に、インビトロでの再刺激の５日目に、５１ＣｒでラベルしたＲＭＡ−Ｓ細胞を標的としてＫｉｌｌｉｎｇアッセイを行った。再刺激５日目に回収されたリンパ球全体の１／８をエフェクター細胞として用いた時を、最大のＥ／Ｔ比（１．０）とした。
【００４４】
図２及び図３に示すごとく、Ｄｂ 126 ペプチドにより免疫されたマウスのリンパ節由来のエフェクター細胞は、該ペプチドでパルスされた標的細胞を殺したのに対して、該ペプチドでパルスされない標的細胞は殺さなかった。
【００４５】
また、実施例１と同様にして行ったフローサイトメトリーでＣＤ４＋ 細胞とＣＤ８＋ 細胞の比を解析したところ、ＣＤ４：ＣＤ８＝１：１．４〜１．７であり、非免疫マウス細胞（対照）に比べて、Ｄｂ 126 ペプチドで免疫されたマウス細胞においては、ＣＤ８＋ 細胞が増加し、ＣＤ４＋ 細胞：ＣＤ８＋ 細胞の比（対照細胞においては約２：１）が免疫された細胞においては逆転していた。
【００４６】
実施例３
ペプチドＤｂ 126 又はＷＨ 187（４０μｇ／ml）と１時間インキュベートした後に放射線照射したＴ２細胞５×１０４ 個とＨＬＡ−Ａ＊ ０２０１をもつ健常人の末梢単核球１×１０６ 個とを共培養した。一週間後、ペプチド（２０μｇ／ml）と１時間インキュベートした後に放射線照射したＴ２細胞を上記の共培養系に加え、再刺激を行なった。その翌日から、ヒトＩＬ−２（最終濃度１００ JRU／ml）を培養液に加えた。
【００４７】
以後、ペプチドでパルス後に放射線照射されたＴ２細胞での刺激を５回くり返した後、ペプチドをパルスされたＴ２細胞、あるいは、ペプチドをパルスされていないＴ２細胞を標的にして、Ｋｉｌｌｉｎｇ ａｓｓａｙを行なった。また、誘導されたＣＴＬの表面マーカーをＦＡＣＳ解析した。
【００４８】
Ｋｉｌｌｉｎｇ ａｓｓａｙは常法に従いＥｕｒｏｐｉｕｍでラベルしたＴ２細胞にペプチドをパルスしたものを標的として行った。
Ｅｆｆｅｃｔｏｒ：Ｔａｒｇｅｔ比（Ｅ／Ｔ ratio）は１０：１
共培養時間：３時間
培養液中のペプチド濃度：５μｇ／ml
【００４９】
結果を図４に示す。図４のＡはＤｂ 126 ペプチドを用いて誘導したＣＴＬの、Ｄｂ 126 ペプチドをパルスしたＴ２細胞に対する殺細胞効果を示し、図４のＢはＷＨ 187ペプチドを用いて誘導したＣＴＬの、ＷＨ 187ペプチドをパルスしたＴ２細胞に対する殺細胞効果を示す。
【００５０】
いずれの場合でも、ペプチドをパルスしたＴ２細胞に対してより強い殺細胞効果が見られた。
【００５１】
ＦＡＣＳ解析の結果を図５〜図１０に示す。図５〜７にＤｂ 126ペプチドで誘導したヒトのＣＴＬの結果を示し、ほとんどの細胞がＣＤ８陽性であった。図８〜図１０はＷＨ 187ペプチドで誘導されたヒトのＣＴＬの結果を示す。ＣＤ４陽性細胞とＣＤ８陽性細胞がほぼ同数であった。
【００５２】
実施例４
Ｄｂ 126 ペプチド特異的ＣＴＬの細胞溶解活性のＭＨＣ拘束性を試験するため、ペプチドでパルスしたＴ２細胞に対するＣＴＬの細胞毒性活性をブロックするために抗ＨＬＡ−Ａ２．１モノクローナル抗体を用いた。Ｄｂ 126 ペプチドでパルスしたＴ２細胞の特異的細胞溶解を５：１のＥ／Ｔ比において、ＨＬＡ−Ａ２．１分子に対するブロッキングモノクローナル抗体（ＢＢ７．２）の存在下又は不存在下で測定した。
【００５３】
結果を図１１に示す。この図において＊ 印は抗ＨＬＡ−Ａ２．１モノクローナル抗体の代りに抗Ｈ−２Ｋｂ モノクローナル抗体を使用した結果を示す。この図から明らかな通り、６０μｇ／mlの抗ＨＬＡ−Ａ２．１モノクローナル抗体の添加により、細胞毒性は、Ｔ２細胞の細胞溶解のバックグラウンドまで低下した。アイソタイプが同じ無関係のモノクローナル抗体（抗Ｈ−２Ｋｂ モノクローナル抗体Ｙ３）はＴ２細胞の溶解に効果を有しなかった。
【００５４】
実施例５
Ｄｂ 126 ペプチド特異的ＣＴＬが、生来的にＷＴ１を発現するＨＬＡ−Ａ２．１陽性白血病細胞を殺すことができるか否かを試験した。標的細胞としてＴＦ１細胞（ＷＴ−１を発現し、ＨＬＡ−Ａ２．１陽性）、ＪＹ細胞（ＷＴ１を発現せず、ＨＬＡ−Ａ２．１陽性）、及びＭｏｌｔ−４細胞（ＷＴ１を発現し、ＨＬＡ−Ａ２．１陰性）を用い、７．５：１（ａ）又は１５：１のＥ：Ｔ比において、細胞毒性を測定した。
【００５５】
結果を図１２に示す。Ｄｂ 126 ペプチド特異的ＣＴＬは生来的にＷＴ１を発現しＨＬＡ−Ａ２．１陽性の白血病細胞ＴＦ１に対して有意な細胞毒性を示したが、Ｍｏｌｔ−４（ＷＴ１を発現し、ＨＬＡ−Ａ２．１−陰性）又はＪＹ細胞（ＷＴ１を発現せず、ＨＬＡ−Ａ２．１−陽性）に対してはバックグラウンドレベルの細胞溶解を示した。
【００５６】
実施例６
Ｄｂ 126 ペプチド特異的ＣＴＬが、生来的にＷＴ１を発現する腫瘍細胞を認識しそして細胞溶解するか否かを試験した。ＷＴ１を発現する腫瘍細胞（ＦＢＬ３）もしくはＷＴ１を発現しない腫瘍細胞（ＲＭＡ）（図１３）、又はＷＴ１遺伝子をトランスフェクトされたＣ１４９８細胞もしくはＴＷ１遺伝子をトランスフェクトされていないＣ１４９８細胞（図１４）について、特異的細胞溶解を図１３及び図１４に示すＥ／Ｔ比において測定した。
【００５７】
図１３に示す通り、Ｄｂ 126 ペプチド特異的ＣＴＬは、生来的にＷＴ１を発現するＦＢＬ３細胞を溶解したがＷＴ１を発現しないＲＭＡ細胞を溶解しなかった。図１４に示す通り、さらに、Ｄｂ 126ペプチド特異的ＣＴＬは、ＷＴ１を発現しない親Ｃ１４９８細胞に比べて、マウスＷＴ１遺伝子をトランスフェクトされたＣ１４９８細胞を殺した。これにより、ＣＴＬによる殺細胞のために標的化された分子が確かにＷＴ１ペプチドであることが確認された。これらの結果は、Ｄｂ 126 ペプチド特異的ＣＴＬが、ＷＴ１蛋白質の細胞内プロセシングにより天然に産生され、そしてＷＴ１発現細胞のＨ−２Ｄｂ 分子上に存在するＤｂ 126 ペプチド又は関連ペプチドを認識することができることを示唆している。
【００５８】
実施例７
ＣＴＬの細胞溶解活性がＭＨＣ拘束性であるか否かを試験するため、Ｈ−２クラスＩ分子に対する抗体の存在下で測定を行った。すなわち、Ｄｂ 126 ペプチド特異的ＣＴＬによる、Ｄｂ 126 ペプチドでパルスしたＲＭＡ−Ｓ細胞、Ｈ−２Ｋｂ （２８．１３．３Ｓ）、Ｈ−２Ｄｂ （２８．１１．５Ｓ）又はＨ−２Ｌｄ （ＭＡ１４３）に対する、タイターを調整したモノクローナル抗体の存在下で試験した。対照モノクローナル抗体としてアイソタイプが一致したモノクローナル抗体を使用した。
【００５９】
結果を図１５に示す。Ｈ−２Ｄｂ に対する抗体の濃度の増加に依存して、Ｄｂ 126 ペプチドでパルスしたＲＭＡ−Ｓ細胞に対するＣＴＬの細胞溶解活性が抑制されたが、Ｈ−２Ｋｂ 又はＨ−２Ｌｄ に対する抗体はＣＴＬの細胞溶解活性を抑制しなかった。これらの結果は、ＣＴＬがＨ−２Ｄｂ 拘束的に細胞溶解活性を発揮することを示している。
【００６０】
実施例８
Ｄｂ 126 ペプチドによる積極的免疫化により生体内腫瘍免疫が惹起されるか否かを試験した。Ｄｂ 126 ペプチドによりパルスされたＬＰＳ活性化脾細胞（図１６中の実線）、ＬＰＳ活性化脾細胞のみ（網線）、又はリン酸緩衝液のみ（ＰＢＳ）（破線）により、１週間に１回マウスを免疫した。３週間の免疫の後、３×１０７ 個のＦＢＬ３白血病細胞を腹腔内注射した。
【００６１】
結果を図１６に示す。Ｄｂ 126 ペプチドにより免疫されたマウスは腫瘍チャレンジを克服しそして生存したが、非免疫マウス及びＬＰＳ活性化脾細胞のみで免疫されたマウスは腫瘍チャレンジを拒絶することができず、死亡した。免疫されたマウス及び非免疫マウスの両方について、腫瘍細胞の前記腹腔内接種の後３日間で腹水が観察された。非免疫マウスにおいては腹水が増加し続け、そしてマウスは死んだ。他方、免疫マウスにおいては、腹水はその後徐々に減少し、マウスは腫瘍チャレンジを完全に拒絶し、そして生存した。非免疫マウスにおいて、自然的退行（ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ）が時々観察された。この退行は、Ｆｒｉｅｎｄ白血病ウイルス（ＦＢＬ３白血病細胞はこのウイルスにより形質転換される）に対して特異的なＣＴＬの自然的誘導によるものと予想される。なぜなら、このようなＣＴＬ誘導は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて時おり観察されるからである。
【００６２】
実施例９ ＤＮＡワクチン
６〜８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスに、１００μｇのＷＴ１を発現するプラスミッドＤＮＡ（マウスＷＴ１ｃＤＮＡ（Molecular and Cellular Biology, vol.11, No.3, p.1707-1712(1991), p.1709の左欄）のＳｕｎ ３ＡＩ断片をＣＭＶ−ＩＥプロモーターに連結し、ＷＴ１を持続発現するプラスミッドを作製）(Proc.Natl.Acod.Su, USA., 92, 11105-11109(1995))を１０日毎に、計３回筋肉注射した。最後の筋肉注射の１０日後、マウスの脾を取り出し脾細胞を調整し、この脾細胞と、ＷＴ１を発現しているｍＷＴ１Ｃ１４９８細胞（４０Ｇｙ放射線照射）と６日間、３７℃で共培養を行なった後、標的細胞として、ＷＴ１を発現しているＣ１４９８（ＰＭ５Ｇ−ｍＷＴ１）とＷＴ１を発現していないＣ１４９８（ＰＭ５Ｇ）を用いて、Ｋｉｌｌｉｎｇ ａｓｓａｙ（Ｅｕｒｏｐｉｕｍでラベル）を行った。なお、Ｃ１４９８はＷＴ１を発現しないマウス骨髄性白血病細胞株である。
【００６３】
ＷＴ１を発現している、Ｃ１４９８（ＰＭ５Ｇ−ｍＷＴ１）細胞を殺すが、ＷＴ１を発現していない細胞は殺さない細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）が誘導された。
【００６４】
結果を図１７に示す。
対照として、上記と同様の実験を行ったが、ＷＴ１を発現しているプラスミッドの代りに、ＷＴ１を発現しない（ＷＴ１ｃＤＮＡをもたない）プラスミッドをマウスに筋肉注射した。上記の実験と同じように脾細胞を採取し、ＷＴ１を発現しているＣ１４９８（ＰＭ５Ｇ−ｍＷＴ１）でｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激後、Ｋｉｌｌｉｎｇ ａｓｓａｙを行った。
【００６５】
図１８に示す通り、ＷＴ１ｃＤＮＡをもたないコントロールプラスミッドＤＮＡの筋肉注射からは、ＷＴ１タンパク特異的ＣＴＬは誘導されなかった。
【産業上の利用可能性】
【００６６】
上記の結果から、本発明のペプチドは確かに癌抗原として機能し、癌細胞に対するキラーＴ−細胞（癌細胞傷害性Ｔ細胞）を誘導増殖させたことが立証された。従って、本発明の癌抗原ペプチドは、ＷＴ１遺伝子の発現の上昇を伴う白血病及び固形癌に対する癌ワクチンとして有用である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：１または配列番号：２のアミノ酸配列において、ＭＨＣ分子に結合するために必要なアンカーアミノ酸を含む、連続する７〜３０個のアミノ酸からなるペプチド。
【請求項２】
前記ペプチドが、
Ｋb 45 Gly Ala Ser Ala Tyr Gly Ser Leu（配列番号：３）
Ｋb 330 Cys Asn Lys Arg Tyr Phe Lys Leu（配列番号：４）
Ｄb 221 Tyr Ser Ser Asp Asn Leu Tyr Gln Met（配列番号：６）
Ｄb 235 Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu（配列番号：７）
のいずれかである、請求項１記載のペプチド。
【請求項３】
請求項１または２に記載のペプチドを有効成分として含有する癌ワクチン用医薬組成物。
【請求項４】
請求項１または２に記載のペプチドをコードする遺伝子を有効成分として含有する癌ワクチン用医薬組成物。
【請求項１】
配列番号：１または配列番号：２のアミノ酸配列において、ＭＨＣ分子に結合するために必要なアンカーアミノ酸を含む、連続する７〜３０個のアミノ酸からなるペプチド。
【請求項２】
前記ペプチドが、
Ｋb 45 Gly Ala Ser Ala Tyr Gly Ser Leu（配列番号：３）
Ｋb 330 Cys Asn Lys Arg Tyr Phe Lys Leu（配列番号：４）
Ｄb 221 Tyr Ser Ser Asp Asn Leu Tyr Gln Met（配列番号：６）
Ｄb 235 Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu（配列番号：７）
のいずれかである、請求項１記載のペプチド。
【請求項３】
請求項１または２に記載のペプチドを有効成分として含有する癌ワクチン用医薬組成物。
【請求項４】
請求項１または２に記載のペプチドをコードする遺伝子を有効成分として含有する癌ワクチン用医薬組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【公開番号】特開２０１０−５９１７２（Ｐ２０１０−５９１７２Ａ）
【公開日】平成２２年３月１８日（２０１０．３．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２５１０７９（Ｐ２００９−２５１０７９）
【出願日】平成２１年１０月３０日（２００９．１０．３０）
【分割の表示】特願２０００−５６２３９８（Ｐ２０００−５６２３９８）の分割
【原出願日】平成１１年７月３０日（１９９９．７．３０）
【出願人】（５０５４４３９５３）株式会社癌免疫研究所 (8)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年３月１８日（２０１０．３．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１０月３０日（２００９．１０．３０）
【分割の表示】特願２０００−５６２３９８（Ｐ２０００−５６２３９８）の分割
【原出願日】平成１１年７月３０日（１９９９．７．３０）
【出願人】（５０５４４３９５３）株式会社癌免疫研究所 (8)
【Ｆターム（参考）】
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