癌細胞凝集塊およびその調製法
【課題】生体内での癌細胞の挙動を正確に反映できるような新規な癌細胞凝集塊およびその調製方法を提供すること。
【解決手段】
癌組織由来細胞塊または個体から得られる癌組織を単一細胞化した後に該単一細胞化物中の細胞同士が細胞数３個以上に凝集することによって形成される凝集物またはその培養物であって、インビトロにおいて、増殖能を保持することができる癌細胞凝集塊を調製する。
【解決手段】
癌組織由来細胞塊または個体から得られる癌組織を単一細胞化した後に該単一細胞化物中の細胞同士が細胞数３個以上に凝集することによって形成される凝集物またはその培養物であって、インビトロにおいて、増殖能を保持することができる癌細胞凝集塊を調製する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌細胞凝集塊およびその調製方法に関する。より詳細には、本発明は、インビトロで癌を再構築でき、かつ増殖能を保持する癌細胞凝集塊に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、がんを克服するため様々な研究が積み重ねられてきた結果、早期がんの治療成績は飛躍的に向上している。しかし、進行がんの治療は依然として困難で、がんは日本人の死因のトップを占め続けている。厚生労働省による平成１９年人口動態統計では、年間３４万人以上ががんにより死亡している。
【０００３】
これまでのがん研究では、特にインビトロにおいてその挙動を調べる場合は、培養に最適化した条件で継代培養され確立された癌細胞株を用いた実験が主流である。このような癌細胞株には、ヒト乳癌細胞株（ＭＤＦ７、ＮＣＩ／ＡＤＲ ＨＳ５７８Ｔ、ＭＤＡ−ＭＢ−２２２３１／ＡＴＣＣ、ＭＤＡ−ＭＢ−４３３５、ＭＤＡ−Ｎ、ＢＴ−５４９、Ｔ−４７Ｄ）、ヒト子宮頸癌細胞株（ＨｅＬａ）、ヒト肺癌細胞株（Ａ５４９、ＥＫＶＸ, ＨＯＰ−６２、ＨＯＰ−９２、ＮＣＩ−Ｈ２３、ＮＣＩ−Ｈ２２６、ＮＣＩ−Ｈ３２２Ｍ、ＮＣＩ−Ｈ４６０、ＮＣＩ−Ｈ５２２）及びヒト大腸癌細胞株（Ｃａｃｏ−２、ＣＯＬＯ ２０５、ＨＣＣ−２９９８、ＨＣＴ−１５、ＨＣＴ−１１６、ＨＴ２９、ＫＭ１２、ＳＷ−６２０）ヒト前立腺癌細胞株（ＤＵ−１４５、ＰＣ−３、ＬＮＣａＰ）、などが含まれ、実際に広く研究に用いられている。
【０００４】
がんの患者別の診断や治療実現等の為に、癌細胞の初代培養が有望とされ、研究が進められている。例えば初代培養細胞を用いたＣＤ−ＤＳＴ法（Collagen gel droplet embedded drug sensitivity test）などが開発されている。このインビトロの試験法は、患者からの単離組織あるいは細胞をコラーゲン・ゲル小滴内に包埋し、三次元培養と画像比色定量法を組み合わせて検証する薬剤感受性試験である（例えば非特許文献１）。しかしながら、初代培養細胞については、培養法が確立しておらず、取り扱いが困難である。
【０００５】
癌細胞の研究の成果として、がんを構成する癌細胞は複数の亜集団から成り立っている可能性があり、「腫瘍始原細胞」あるいは「腫瘍幹細胞」と呼ばれる、小集団であるが自己複製が可能で、分化によって大多数の癌細胞の源となりえる亜集団の存在を支持する報告が相次いでいる（例えば、非特許文献２および３）。このような幹細胞は、例えば、生体から摘出した腫瘍を、単一の細胞にまで分離してソートすることによって取得することができ、そのうちのいくらかがインビトロにおいても増殖能を示すとされている（非特許文献４）。しかしながら、このようにがんの起源を幹細胞で説明する説には、否定的な報告もあり（非特許文献５）、仮説の域を出ない。
【０００６】
がん研究が広く行われている現状にあってもなお、がんについては未知の点が多い。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Takamura Yら（2002）Prediction of chemotherapeutic response by collagen gel droplet embedded culture-drug sensitivity test in human breast cancers. Int．J．Cancer，98，450-455
【非特許文献２】Vermeulen Lら（2008）Single-cell cloning of colon cancer stem cells reveals a multi-lineage differentiation capacity. PNAS Vol.105 No.36 13427-13432
【非特許文献３】Ricci-Vitiani Lら（2007）Identification and expansion of human colon-cancer-initiating cells. Nature Vol.445 111-115
【非特許文献４】Todaro Mら(2007)Colon cancer stem cells dictate tumor growth and resist cell death by production of interleukin-4. Cell Stem Cell 1:389-402
【非特許文献５】Shmelkov S V ら（2008）CD133 expression is not restricted to stem cells, and both CD133+ and CD133- metastatic colon cancer cells initiate tumors. The Journal of Clinical Investigation Vol. 118 2111-2120
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、生体内での癌細胞の挙動をインビトロにおいて再現することができ、薬剤感受性試験あるいは放射線感受性試験などで生体内での効果を正確に検証し得る、癌の分析や治療の研究の為の試料として有用な、新規な癌細胞凝集塊を提供することにある。
【０００９】
本発明はまた、異種動物への移植において、少量で十分な定着性を有し、簡便な癌動物モデルの作成に利用し得る、癌の分析や治療の研究のための試料として有用な、新規な癌細胞凝集塊を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、個々の癌患者の治療感受性試験を行うことを企図し、癌研究の研究材料として用いられてきた細胞株が患者癌とは異質のものである可能性を考慮して、前記課題を解決すべく研究材料としての癌細胞の初代培養法について鋭意検討を重ねた結果、新規な癌細胞凝集塊およびその調製方法を見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち本発明は、癌組織由来細胞塊を単一細胞化処理した後に該単一細胞化物中の細胞同士が細胞数３個以上に凝集することによって形成される凝集物またはその培養物、または個体から得られる癌組織を単一細胞化した後に該単一細胞化物中の細胞同士が細胞数３個以上に凝集することによって形成される凝集物またはその培養物であって、インビトロにおいて、増殖能を保持することができる癌細胞凝集塊、に関する。
【００１２】
本発明はまた、癌組織由来細胞塊または個体から得られる癌組織を単一細胞化した後に、ＲＯＣＫ（Ｒｈｏ結合キナーゼ）阻害剤存在下にて該単一細胞化物中の細胞同士が細胞数３個以上に凝集することによって形成される凝集物またはその培養物であって、インビトロにおいて、増殖能を保持することができる癌細胞凝集塊、に関する。
【００１３】
上記ＲＯＣＫ阻害剤は、Ｙ２７６３２（登録商標）であり得る。
【００１４】
本発明はまた、３個以上の癌細胞集合体を含み、略球形あるいは楕円球形を呈する癌細胞凝集塊、に関する。
【００１５】
本発明はまた、３個以上の癌細胞集合体：および該癌細胞集合体の外周面に存在する基底膜様物を含み、略球形あるいは楕円球形を呈する癌細胞凝集塊、に関する。
【００１６】
上記癌細胞凝集塊は、実質的に癌細胞以外の細胞を含まないことが好ましい。
【００１７】
上記基底膜様物は、ラミニンであり得る。
【００１８】
上記癌細胞凝集塊は、直径が４０μｍ〜２５０μｍであり得る。
【００１９】
上記癌細胞は、上皮癌細胞由来であり得る。
【００２０】
上記癌細胞は、大腸癌、卵巣癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、腎癌、膀胱癌、咽頭癌、膵癌由来であり得る。
【００２１】
本発明はまた、癌組織由来細胞塊または生体から摘出した癌組織を酵素処理して単一細胞化する工程；および
該単一細胞化物中の細胞同士を、細胞数３個以上に凝集させる工程を含む、癌細胞凝集塊の調製方法、に関する。
【００２２】
本発明はまた、癌組織由来細胞塊または生体から摘出した癌組織を酵素処理して単一細胞化する工程；および
該単一細胞化物中の細胞同士を、ＲＯＣＫ阻害剤の存在下にて、細胞数３個以上に凝集させる工程
を含む、癌細胞凝集塊の調製方法、に関する。
【００２３】
上記癌細胞凝集塊の調製方法において、さらに、前記凝集させた成分を３時間以上培養する工程を含み得る。
【００２４】
上記酵素処理は、トリプシンを用いた処理であり得る。
【００２５】
上記ＲＯＣＫ阻害剤は、Ｙ２７６３２（登録商標）であり得る。
【００２６】
本発明はまた、上記の調製方法によって得られる癌細胞凝集塊、に関する。
【発明の効果】
【００２７】
本発明の癌細胞凝集塊は、インビトロで生体内と同様の挙動を示し、またそのような挙動を示すものを再構築することができ、かつ一定期間以上に渡って、増殖能を保持し得る。このような癌細胞凝集塊は、癌細胞の培養による増幅に使用でき、またインビトロにおいて薬剤感受性試験あるいは放射線感受性試験に幅広く好都合に利用することができる。異種動物に対する腫瘍定着性にも優れることから、簡易な腫瘍形成動物の作成に利用することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】マウスから得た癌組織由来細胞塊を示す図である。
【図２】様々な癌組織から得られた癌組織由来細胞塊を示す図である。
【図３】マウス膵島腫瘍から得られた癌組織由来細胞塊を示す図である。
【図４】癌組織由来細胞塊から得られた癌細胞凝集塊を示す図である。
【図５】ヒト大腸癌手術検体由来の癌細胞凝集塊を示す図である。
【図６】癌組織由来細胞塊をトリプシン処理後凍結保存し融解した後の状態を示す図である。
【図７】癌組織由来細胞塊を凍結保存し融解した後の細胞の回収率を、トリプシン処理の有無で比較した図である。
【図８】癌組織由来細胞塊を凍結保存し融解した後の増殖能を、トリプシン処理の有無で比較した図である。
【図９】本発明の癌細胞凝集塊を用いた、インビトロにおけるドキソルビシンによる薬剤感受性試験の結果を示す図である。
【図１０】本発明の癌細胞凝集塊をマウスに移植して得られた腫瘍組織の図である。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本発明の癌細胞凝集塊は、癌組織由来細胞塊または個体から得られる癌組織を、単一細胞化した後に該単一細胞化物中の個々の細胞同士または完全には個々の細胞にまでは分離されなかったいくつかの細胞の集合同士、または個々の細胞と完全には個々の細胞にまでは分離されなかったいくつかの細胞とが、全体として細胞数３個以上に凝集することによって形成される凝集物またはその培養物であって、インビトロにおいて、増殖能を保持することができるようなものである。
【００３０】
ここで、「癌組織由来細胞塊または個体から得られる癌組織を単一細胞化する」とは、癌組織由来細胞塊または得られた癌組織の少なくとも一部をインビトロにおいて単一細胞にまで分離させる処理を施すことをいう。従って、典型的には、このような処理後に、個々の単一細胞にまで分離した細胞が存在する中に、いくらかの細胞が個々にまでは分離されない状態で混在する場合もあり、このような場合であっても、本明細書でいう「単一細胞化する」に該当する。この時に混在する個々にまでは分離されない状態のものには、細胞数１０個までの集合体、好ましくは細胞数２〜３個の集合体が含まれる。
【００３１】
まず、ここで、本発明の癌細胞凝集塊の出発材料となり得る癌組織由来細胞塊について説明する。癌組織由来細胞塊は、本発明者らが見出した新規な細胞塊であり、それ自身は、個体から得られた癌組織から３個以上の癌細胞を含む塊として分離処理された分離物またはその培養物であり、インビトロにおいて、増殖能を保持することができるようなものであり得る。
【００３２】
ここで、「個体から得られた癌組織から３個以上の癌細胞を含む塊として分離処理された分離物」とは、生体内で発生した癌から得られた癌組織を処理して得られた３個以上、好ましくは８個以上の癌細胞を含む分離物を指す。このような分離物には、単一細胞にまで分離されているものは含まれず、また単一細胞に分離されてから再構築した構成物は含まれない。但し、この分離物は、生体から分離した直後の物だけではなく、例えば生理食塩水中で一定時間保持したものや冷凍または冷蔵した物も含む。
【００３３】
「個体から得られた癌組織から３個以上の癌細胞を含む塊として分離処理された分離物の培養物」とは、生体内で発生した癌から得られた癌組織を処理して得られた３個以上の癌細胞を含む塊として分離処理された分離物をインビトロにおいて培養することによって得られるものを指す。培養する時間は特に限定されず、わずかな時間でも培地中に存在させたものであればよい。このような培養物は、一定期間、好ましくは３時間以上培養することによって、略球形あるいは楕円球形を呈する場合が多い。ここでの培養物には、このような一定期間経過後の略球形あるいは楕円球形の培養物も、そこに至るまでの不定形の培養物も含まれる。さらに、このような略球形あるいは楕円球形の培養物をさらに分割して得られる不定形、さらなる培養による略球形物あるいは楕円球形物もここでいう培養物である。
【００３４】
このような癌組織由来細胞塊は、そのまま培養を続けることでも１０日以上、好ましくは１３日以上、さらに好ましくは３０日以上の期間において増殖能を保持し得るが、さらに培養中に定期的に機械的分割を行うか、本発明の癌細胞凝集塊にすることで、実質的に無期限に増殖能を保持し得る。
【００３５】
機械分割は手術用メス、ナイフ、ハサミの他、眼科尖刀などを用いて行うことができる。あるいは注射器に注射針を装着して培養液と共に癌組織由来細胞塊を吸引排出することを繰り返すことによっても行うことができる。本発明に好ましく用いられるのは、例えば１ｍｌ注射器と２７Ｇの注射針であるが、限定はされない。
【００３６】
ここで、本発明の癌組織由来細胞塊の培養の為の培地は、特に限定はされないが、好ましくは、動物細胞培養用培地が用いられる。特に好ましくは、幹細胞培養用の無血清培地が用いられる。このような無血清培地は、幹細胞の培養に用いられるものであればなんら限定はされない。癌組織由来細胞塊を培養するための培地および条件は、癌細胞凝集塊を培養する場合と同じである。
【００３７】
癌組織由来細胞塊を構成する癌細胞は、少なくとも３個以上、好ましくは８個以上、より好ましくは１０個以上、さらに好ましくは２０個以上、もっとも好ましくは５０個以上である。癌組織由来細胞塊が、分離物である場合には、好ましくは１０００個以下、より好ましくは、５００個以下程度である。分離物を培養した後の培養物であれば、培養によってその数を増加させることが可能である。但し、培養物であっても好ましくは１万個以下、より好ましくは５０００個以下である。
【００３８】
本発明では、特に大腸癌組織由来、卵巣癌組織由来、乳癌組織由来、肺癌組織由来、前立腺癌組織由来、腎癌組織由来、膀胱癌組織由来、咽頭癌組織由来、または膵臓癌由来であることが特に好ましいが、限定はされない。
【００３９】
大腸癌組織由来の癌組織由来細胞塊である場合には、含まれる癌細胞は、特に限定はされないが、ＣＤ１３３を発現することもある。
【００４０】
癌組織由来細胞塊は、あるいは、３個以上の癌細胞集合体を含み、略球形あるいは楕円球形を呈するものであり得る。
【００４１】
限定はされないが、該癌細胞集合体の外周面に存在する基底膜様物を含む場合もある。
【００４２】
本発明の癌組織由来細胞塊においては、薄い膜状の基底膜様物が塊の大きさによって、数nm程度、好ましくは、４０から１２０nm程形成されていることが好ましいが限定はされない。
【００４３】
本発明の癌組織由来細胞塊のサイズは、限定はされず、粒径または体積平均粒径８μｍ〜１０μｍ程度の不定形のものも含まれ、また、培養した後に大きく成長した１ｍｍ粒径以上のものも含まれる。好ましくは、直径が４０μｍ〜１０００μｍであり、より好ましくは４０μｍ〜２５０μｍ、さらに好ましくは、８０μｍ〜２００μｍである。
【００４４】
本発明の癌組織由来細胞塊では、特に棚状配列、シート状配列、重層配列および合胞状配列からなる群より選択される１以上の配列を有する場合が多いが、特に限定はされない。
【００４５】
本発明の癌組織由来細胞塊は、典型的には、生体から摘出した癌組織の細片化物を酵素処理する工程；および酵素処理物のうち、３個以上の癌細胞を含む塊を選別回収する工程を含む方法によって調製され得る。
【００４６】
さらに、限定はされないが、本発明の癌組織由来細胞塊は、このようにして回収した成分を３時間以上培養する工程を含む方法によって調製され得る。
【００４７】
まず、生体から摘出した癌組織は、そのまま細片化することもでき、また、まず、細片化前に、動物細胞培養用培地で維持することができる。このような動物細胞培養用培地には、特に限定はされないが、ダルベッコＭＥＭ（ＤＭＥＭ Ｆ１２など）、イーグルＭＥＭ 、ＲＰＭＩ、Ｈａｍ‘ｓ Ｆ１２、アルファＭＥＭ、イスコフ改変ダルベッコなどが含まれる。この際に、細胞非接着性の培養器にて、浮遊培養することが好ましい。
【００４８】
癌組織はまた、細片化に先立って洗浄することも好ましい。このような洗浄には、限定はされないが、酢酸緩衝液（酢酸 ＋ 酢酸ナトリウム）、リン酸緩衝液（リン酸 ＋ リン酸ナトリウム）、クエン酸緩衝液（クエン酸 + クエン酸ナトリウム) 、ホウ酸緩衝液、酒石酸緩衝液、トリス緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水などの緩衝液等を用いることができる。本発明においては、特に好ましくは、ＨＢＳＳ中で組織の洗浄を行うことができる。洗浄の回数は、１回から３回が適度である。
【００４９】
細片化は、洗浄後の組織を、ナイフ、はさみ、カッター（手動、自動）などで分割することによって行うことができる。細片化後のサイズや形は特に限定されず、ランダムに行い得るが、好ましくは、１ｍｍ〜５ｍｍ角、より好ましくは１ｍｍ〜２ｍｍ角の均一なサイズとする。
【００５０】
次にこのようにして得られる細片化物は酵素処理に供される。このような酵素処理は、コラゲナーゼ、トリプシン、パパイン、ヒアルロニダーゼ、C. histolyticum neutral protease、サーモリシン、およびディスパーゼのうちの1種、またはこれらの２種以上の組合せによる処理であり得る。酵素処理条件は、生理学的に許容されるｐＨ、例えば約６〜８、好ましくは約７．２〜７．６に緩衝された等張の塩溶液、例えばＰＢＳやハンクスのバランス塩溶液中で、例えば約２０〜４０℃、好ましくは約２５〜３９℃で、結合組織を分解するために十分な時間、例えば約１〜１８０分間、好ましくは３０〜１５０分間で、そのために十分な濃度、例えば約０．０００１〜５％ｗ／ｖ、好ましくは約０．００１％〜０．５％ ｗ／ｖであり得る。
【００５１】
限定はされないが、この酵素処理の条件は、例えば、コラゲナーゼを含む混合酵素で処理することであり得る。より好ましくは、C. histolyticum neutral protease、thermolysin、およびディスパーゼからなる群より選択される１種以上のプロテアーゼ；およびコラゲナーゼＩ、コラゲナーゼＩＩ、およびコラゲナーゼＩＶからなる群より選択される1種以上のコラゲナーゼを含む混合酵素で処理することが含まれる。
【００５２】
このような混合酵素には、限定はされないが、リベラーゼブレンザイム１（登録商標）などが含まれる。
【００５３】
次にこのようにして得られた酵素処理物のうち、３個以上の癌細胞を含む塊を選別回収することが好ましい。選別回収の方法は特に限定されず、サイズを振分ける当業者に公知のいずれの方法も使用することができる。
【００５４】
サイズの振分け方法としては、簡便な方法としては、目視、位相差顕微鏡による分別、あるいは篩によるが、当業者に利用可能な粒子径による分別法であれば特に限定されない。篩を使う場合は、篩メッシュサイズ２０μｍを通過し、かつ５００μｍを通過しない成分を回収することが好ましい。より好ましくは篩メッシュサイズ４０μｍを通過し、かつ２５０μｍを通過しない成分を回収する。
【００５５】
ここで、選別の対象となる３個以上の癌細胞を含む塊は、本発明の癌組織由来細胞塊であり、一定範囲のサイズを有する。一定範囲のサイズとは、体積平均粒子径８μｍ〜１０μｍ程度の小さなものも含まれるが、球形に近い場合は、直径２０μｍ以上５００μｍ以下、好ましくは３０μｍ以上４００μｍ以下、より好ましくは４０μｍ以上２５０μｍ以下、楕円形状の場合には、長径２０μｍ以上５００μｍ以下、好ましくは３０μｍ以上４００μｍ以下、より好ましくは４０μｍ以上２５０μｍ以下、不定形の場合には、体積平均粒子径２０μｍ以上５００μｍ以下、好ましくは３０μｍ以上４００μｍ以下、より好ましくは４０μｍ以上２５０μｍ以下、である。体積平均粒子径の測定には、位相差顕微鏡（ＩＸ７０；オリンパス社製）にＣＣＤカメラを取り付けたものを用い、粒度分布及び粒子形状を評価することによって行うことができる。
【００５６】
このようにして得られた選別回収成分である分離処理物あるいはその培養物のいずれもが、癌組織由来細胞塊である。培養物は、選別回収成分たる分離物を、わずかな時間に培地中に存在したものであってもよいし、例えば、少なくとも３時間以上、好ましくは１０時間以上３６時間まで、より好ましくは２４時間〜３６時間以上の期間培養することで、略球形あるいは略楕円球形の形状になったものでもよい。培養時間は、３６時間を超えて、数日、あるいは１０日以上、１３日以上、または３０日以上経過したものであってもよい。
【００５７】
培養は、培地中で長期間そのまま行うことも可能であるが、好ましくは、培養途中で定期的に機械的分割を行うことで、実質的に無限に増殖能を保持させることもできる。
【００５８】
次に本発明の癌細胞凝集塊について、詳細に説明する。本発明で、個体から「得られた癌組織」とは、手術等により摘出することで得られる癌組織の他、注射針や内視鏡で組織検査用としてインビトロで取り扱い可能なように取得された癌組織を指す。
【００５９】
「細胞数３個以上に凝集」とは、生体内で発生した癌から得られた癌組織または本発明者らが見出した癌組織由来細胞塊を単一細胞化処理して得られた個々の細胞同士または個々にまでは分離されなかったいくつかの細胞の集合体同士、またはそれらの組合せ同士が、少なくとも３個あるいはそれ以上の複数の細胞を含むように集まった状態を指す。
【００６０】
癌組織由来細胞塊または生体内で発生した癌から得られた癌組織を単一細胞化処理に供する場合は、限定はされないが、個体から得られた癌組織を、酵素処理することが含まれる。
【００６１】
酵素処理は、典型的には、トリプシン、ディスパーゼ、および場合により、コラゲナーゼ、パパイン、ヒアルロニダーゼ、C. histolyticum neutral protease、およびサーモリシンのうちの1種、またはこれらの２種以上の組合せによる処理であり得る。酵素処理条件は、生理学的に許容されるｐＨ、例えば約６〜８、好ましくは約７．２〜７．６に緩衝された等張の塩溶液、例えばＰＢＳやハンクスのバランス塩溶液中で、例えば約２０〜４０℃、好ましくは約２５〜３９℃で、結合組織を分解するために十分な時間、例えば約１〜１８０分間、好ましくは３０〜１５０分間で、そのために十分な濃度、例えば約０．０００１〜５％ｗ／ｖ、好ましくは約０．００１％〜０．５％ ｗ／ｖであり得る。
【００６２】
限定はされないが、この酵素処理は、典型的には、トリプシンまたはディスパーゼ処理単独でもよい。
【００６３】
単一細胞化処理の後には、通常個々に分離された細胞が得られる。但し、個々にまで完全に分離されない細胞も含まれる。
【００６４】
このような細胞は、このまま凝集させてもよいが、好ましくは、例えば、単一細胞化処理後ただちにROCK阻害剤を存在させ、凝集させる。
【００６５】
ROCKとは、Rho-associated coiled-coilキナーゼ（ＲＯＣＫ：GenBankアクセッション番号：NM_005406）のことであり、Ｒｈｏ ＧＴＰａｓｅの主たるエフェクター分子の１つで、多様な生理現象を制御していることが知られている（Rho結合キナーゼともいう）。ROCK阻害剤としては、例えば、Ｙ２７６３２、などが例示される。その他に、Ｆａｓｕｄｉｌ（ＨＡ１０７７）、Ｈ−１１５２、Ｗｆ−５３６（これらはすべて和光純薬工業株式会社から入手できる）、及びそれらの誘導体、並びにＲＯＣＫに対するアンチセンス核酸、ＲＮＡ干渉誘導性核酸やこれらを含むベクターが挙げられる。
【００６６】
トリプシン処理（例えば限定はされないが、0.25%トリプシン-EDTA、37℃5分間処理）によって単一細胞または１０個以下の細胞の集合にまで分離した処理物を、凝集に先立って、96ウェル培養プレートに低密度（例えば500個/0.32cm2、培地容量0.15ml程度)で播種する。維持培養液中にただちに、あるいは数日培養後に、ROCK阻害剤を1〜１００μＭ程度、好ましくは10μM程度の濃度添加することができる。
【００６７】
このような凝集物をインビトロにおいて培養することができる。培養する時間は特に限定されず、わずかな時間でも培地中に存在させたものであればよい。このような培養物は、一定期間、好ましくは３時間以上培養することによって、略球形あるいは楕円球形を呈する場合が多い。ここでの培養物には、このような一定期間経過後の略球形あるいは楕円球形の培養物も、そこに至るまでの不定形の培養物も含まれる。さらに、このような略球形あるいは楕円球形の培養物をさらに分割して得られる不定形、さらなる培養による略球形物あるいは楕円球形物もここでいう培養物である。
【００６８】
本発明の癌細胞凝集塊が、インビトロにおいて、「増殖能を保持することができる」とは、温度３７℃、５％ＣＯ2インキュベーターの細胞培養条件下で、少なくとも１０日以上、好ましくは１３日以上、さらに好ましくは３０日以上の期間増殖能を保持することができることをいう。
【００６９】
このような癌細胞凝集塊は、そのまま培養を続けることでも１０日以上、好ましくは１３日以上、さらに好ましくは３０日以上の期間において増殖能を保持し得るが、さらに培養中に定期的に機械的分割を行うことで、またはさらに単細胞化処理と凝集を行うことで、実質的に無期限に増殖能を保持し得る。
【００７０】
機械分割は手術用メス、ナイフ、ハサミの他、眼科尖刀などを用いて行うことができる。あるいは注射器に注射針を装着して培養液と共に癌細胞凝集塊を吸引排出することを繰り返すことによっても行うことができる。本発明に好ましく用いられるのは、例えば１ｍｌ注射器と２７Ｇの注射針であるが、限定はされない。
【００７１】
ここで、本発明の癌細胞凝集塊の培養の為の培地は、特に限定はされないが、好ましくは、動物細胞培養用培地が用いられる。特に好ましくは、幹細胞培養用の無血清培地が用いられる。このような無血清培地は、幹細胞の培養に用いられるものであればなんら限定はされない。無血清培地とは、無調製または未精製の血清を含まない培地を指し、精製された血液由来成分や動物組織由来成分（例えば、増殖因子）を添加して使用することができる。
【００７２】
本発明の無血清培地は、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製し得る。基礎培地としては、例えば、BME培地、BGJb培地、CMRL 1066培地、Glasgow MEM培地、Improved MEM Zinc Option培地、IMDM培地、Medium 199培地、Eagle MEM培地、αMEM培地、DMEM培地、RPMI 1640培地、Fischer’s培地、およびこれらの組合せが挙げられる。
【００７３】
このような無血清培地に、血清代替物を添加して、本発明の癌細胞凝集塊を培養することができる。血清代替物は、例えば、アルブミン、アミノ酸（例えば、非必須アミノ酸）、トランスフェリン、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、２−メルカプトエタノールまたは３’チオールグリセロール、あるいはこれらの均等物などを適宜含有するものであり得る。
【００７４】
本発明の培養方法においては、市販の血清代替物を使用することもできる。このような市販の血清代替物としては、例えば、ノックアウト血清リプレースメント（ＫＳＲ）、Chemically-defined Lipid concentrated脂肪酸濃縮液（Gibco社製）、グルタマックス（Gibco社製）が挙げられる。
【００７５】
本発明の癌細胞凝集塊を培養するための培地はまた、ビタミン、増殖因子、サイトカイン、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類等を含有し得る。
【００７６】
特に、ＥＧＦとｂＦＧＦを含む無血清培地、例えばノックアウト血清リプレースメント（ＫＳＲ、インビトロジェン社製）のような血清代替物とｂＦＧＦとを含む無血清培地等の任意の無血清培地を好ましく使用することができる。血清代替物あるいはＥＧＦ等の含有量は、培地全体の１０〜３０％ｗ／ｖであることが好ましい。
【００７７】
このような培地としては限定はされないが、市販品としては、ＳＴＥＭＰＲＯヒトＥＳ細胞用無血清培地（Ｇｉｂｃｏ）が挙げられる。
【００７８】
癌細胞凝集塊の培養に用いられる培養器は、一般的に動物細胞の培養が可能なものであれば特に限定されないが、例えば、フラスコ、組織培養用フラスコ、ディッシュ、ペトリデッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウエルプレート、マルチプレート、マルチウエルプレート、チャンバースライド、シャーレ、チューブ、トレイ、培養バック、ローラーボトルが挙げられる。
【００７９】
培養器は、細胞非接着性で、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）等による細胞支持用基質を培地に共存させて三次元培養することが好ましい。細胞支持用基質は、癌細胞凝集塊の接着を目的とするものであり得る。このような細胞支持用基質としては、細胞外マトリックスを用いたマトリゲル、例えば、コラーゲンゲルや、ゼラチン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリ−Ｄ−リジン、ラミニン、フィブロネクチンが挙げられる。このような条件は、特に本発明の癌細胞凝集塊を増殖させたい場合に好適に用いられる。
【００８０】
その他の培養条件は、適宜設定でき、例えば、培養温度は、限定されるものではないが好ましくは、約３０〜４０℃である。最も好ましくは３７℃である。ＣＯ２濃度は、例えば約１〜１０％、好ましくは約２〜５％である。
【００８１】
本発明の癌細胞凝集塊は、このような培地および培養条件で培養し得る。さらに癌細胞凝集塊の培養には、その個別の性質によって、他の細胞との共培養が好ましい場合、あるいはホルモンのような追加の特殊な補充物の存在が必要な場合もあり得る。
【００８２】
具体的には、共培養を、フィーダー細胞と共に行ってもよい。フィーダー細胞としては、胎児線維芽細胞等のストローマ細胞等を用いることができる。具体的には、限定はされないが、ＮＩＨ３Ｔ３などが好ましい。
【００８３】
あるいは、特定種類の乳癌、子宮癌、前立腺癌に対しては、ホルモンを存在させて培養することが好ましい。具体的には、乳癌に対するエストロゲン、子宮癌に対するプロフェステロン、前立腺癌に対するテストステロンなどであるが、これらに限定されず、各種ホルモンを添加し、培養条件を好都合に調整することができる。さらに、このようなホルモンの存在によって、癌細胞凝集塊の培養後の挙動がどのように変化するかを調べることで、由来する患者の癌のホルモン依存性がわかり、抗ホルモン薬治療の有効性が予測できる可能性がある。
【００８４】
本発明の癌細胞凝集塊は、浮遊培養で培養することも可能である。浮遊培養では、培地中において、培養器に対して非接着性の条件下で癌細胞凝集塊を培養する。このような浮遊培養としては、例えば、胚様体培養法（Kellerら, Curr. Opin. Cell Biol. 7, 862-869 (1995)）、ＳＦＥＢ法（例、Watanabeら, Nature Neuroscience 8, 288-296 (2005)；国際公開第2005/123902号参照）が挙げられる 。特に癌細胞凝集塊の増殖ではなく、維持したい場合に好ましい。
【００８５】
癌細胞凝集塊を構成する癌細胞は、少なくとも３個以上、好ましくは８個以上、より好ましくは１０個以上、さらに好ましくは２０個以上であり、その数において上限は特にはない。本発明の癌細胞凝集塊が、分離物である場合には、好ましくは１０００個以下、より好ましくは、５００個以下程度である。分離物を培養した後の培養物であれば、培養によってその数を増加させることが可能である。但し、培養物であっても好ましくは１万個以下、より好ましくは５０００個以下である。
【００８６】
本発明で「癌細胞」というときは、通常用いられる意味で使用され、生体内において、制限のない分裂・増殖とアポトーシスからの逸脱という、正常細胞で見られる秩序が乱れた細胞をいう。より詳細には、細胞増殖制御機能を失っているか極めて減弱している細胞を指し、典型的には、８０％以上の高い頻度で無限増殖能力を獲得しており、その多くは浸潤転移能力も備えている事が多く、その結果ヒトをはじめとする、特には哺乳動物を、死に至らしめる悪性新生物と位置付けられる細胞であることを意味する。
【００８７】
本発明では、由来する癌組織の種類は特に限定されず、哺乳類を始めとする動物に生じる、リンパ腫、芽腫、肉腫、脂肪肉腫、神経内分泌腫瘍、中皮腫、神経鞘腫、髄膜腫、腺腫、黒色腫、白血病、リンパ性悪性腫などであり得るが、特には哺乳類の上皮細胞に生じる癌腫であることが好ましい。このような上皮細胞に生じる癌腫には、非小細胞肺癌、肝細胞癌、胆道癌、食道癌、胃癌、結腸直腸癌、膵臓癌、子宮頚癌、卵巣癌、子宮内膜癌、膀胱癌、咽頭癌、乳癌、唾液腺癌、腎癌、前立腺癌、陰唇癌、肛門癌、陰茎癌、精巣癌、甲状腺癌、頭頸部癌などが含まれる。哺乳類をはじめとする動物に特に限定はないが、サルやヒトを含む霊長目に属する動物、マウス、リス、ラットなどのげっ歯目に属する動物、ウサギ目に属する動物、イヌ、ネコなどのネコ目に属する動物が例示される。
【００８８】
そのうち、本発明では、特に大腸癌組織由来、卵巣癌組織由来、乳癌組織由来、肺癌組織由来、前立腺癌組織由来、腎癌組織由来、膀胱癌組織由来、咽頭癌組織由来、または膵臓癌由来であることが特に好ましいが、限定はされない。
【００８９】
大腸癌組織由来の癌細胞凝集塊である場合には、含まれる癌細胞は、特に限定はされないが、ＣＤ１３３を発現することもある。
【００９０】
本発明の癌細胞凝集塊は、あるいは、３個以上の癌細胞集合体を含み、略球形あるいは楕円球形を呈するものであり得る。
【００９１】
限定はされないが、該癌細胞集合体の外周面に存在する基底膜様物を含む場合もある。
【００９２】
ここで、特に限定はされないが、集合体を形成する癌細胞は、ＣＤ１３３、ＣＤ４４、ＣＤ１６６、ＣＤ１１７、ＣＤ２４、およびＥＳＡからなる群より選択される1種以上の表面抗原を細胞表面に有する場合が多い。ＣＤ１３３、ＣＤ４４、ＣＤ１６６、ＣＤ１１７、ＣＤ２４、およびＥＳＡは、一般的には、リンパ球等の白血球、線維芽細胞、上皮細胞、腫瘍細胞などの細胞に発現している表面抗原である。これらの表面抗原は、細胞-細胞間、細胞-マトリックス間接着としての機能の他、様々なシグナル伝達に関わるが、各種幹細胞の表面マーカーでもある。
【００９３】
本発明において、細胞群が、ＣＤ１３３のような表面抗原を「発現する」というときには、細胞群中に存在する細胞の８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは実質的にすべてが表面抗原を示している状態を指す。
【００９４】
本明細書において、「基底膜様物」とは、限定はされないが、好ましくは、コラーゲン、ラミニン、ニドゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカンなどのプロテオグリカン、フィブロネクチンなどの糖タンパク質のうち少なくともいずれか１種を含有する物質を指す。本発明では、ラミニンを含有する基底膜様物であることが好ましい。
【００９５】
ラミニンは基底膜を構成する高分子糖タンパク質である。ラミニンの機能は、多岐に渡り、例えば、細胞接着、細胞間信号伝達、正常細胞および癌細胞の増殖などの細胞機能に関与している。ラミニンは、3つの異なるサブユニットのそれぞれがジスルフィド結合で結ばれた構造を有しており、それぞれのサブユニットの異なる種類によって、11種類が見出されている。
【００９６】
これらのうち、ラミニン５は、通常、上皮細胞のみから産生され、上皮細胞の基底膜への接着や運動機能を促進する活性を有する成分として知られている。このラミニン５はα３鎖、β３鎖、γ２鎖のそれぞれ１本ずつが複合体を形成した構造を有し、特にγ２鎖はＬＮ５固有と考えられており、他のＬＮ分子種には含まれていない。
【００９７】
本発明の癌細胞凝集塊は、癌細胞の集合体の外周がこのような基底膜様物が形成する膜に全体として包まれた構成を有し得る。このような形態は、癌細胞凝集塊の電子顕微鏡による観察あるいは基底膜構成要素の免疫染色、またはその両方を組み合わせることによって解析することができる。
【００９８】
ラミニンの存在は、例えば、ラミニンを認識する抗体、例えば、シグマ−アルドリッチ社のマウスラミニン由来ラビット抗体と癌細胞凝集塊とを接触させ、抗体抗原反応を測定することによって検出することができる。
【００９９】
また、ラミニンの種類までを特定する特異的な抗体を用いることも可能である。例えば、ラミニン５の存在は、例えば、特に上記の固有のγ２鎖あるいはその断片に反応性を有する抗体と癌細胞凝集塊とを接触させ、抗体の反応を測定することによって、検出することができる。
【０１００】
本発明の癌細胞凝集塊においては、薄い膜状の基底膜様物が塊の大きさによって、数μｍ程度、好ましくは、４０から１２０nm程形成されていることが好ましいが限定はされない。
【０１０１】
本発明の癌細胞凝集塊のサイズは、限定はされず、粒径または体積平均粒径８μｍ〜１０μｍ程度の不定形のものも含まれ、また、培養した後に大きく成長した１ｍｍ粒径以上のものも含まれる。好ましくは、直径が４０μｍ〜１０００μｍであり、より好ましくは４０μｍ〜２５０μｍ、さらに好ましくは、８０μｍ〜２００μｍである。
【０１０２】
本発明の癌細胞凝集塊では、特に棚状配列、シート状配列、重層配列および合胞状配列からなる群より選択される１以上の配列を有する場合が多いが、特に限定はされない。
【０１０３】
本発明の癌細胞凝集塊は、典型的には、生体から摘出した癌組織を単一細胞化する工程；および該単一細胞化物中の細胞同士を細胞数３個以上に凝集させる工程を含む方法によって調製され得る。
【０１０４】
さらに、限定はされないが、本発明の癌細胞凝集塊は、凝集した成分を３時間以上培養する工程を含む方法によって調製され得る。
【０１０５】
まず、本発明の癌細胞凝集塊が、癌組織由来細胞塊から得られる場合には、そのまま酵素処理に供するが、生体から摘出した癌組織は、そのまま酵素処理に供することで単一細胞化することもできる一方で、酵素処理に先立って、細片化することが好ましい。細片化前に、動物細胞培養用培地で維持することができる。このような動物細胞培養用培地には、特に限定はされないが、ダルベッコＭＥＭ（ＤＭＥＭ Ｆ１２など）、イーグルＭＥＭ 、ＲＰＭＩ、Ｈａｍ‘ｓ Ｆ１２、アルファＭＥＭ、イスコフ改変ダルベッコなどが含まれる。この際に、細胞非接着性の培養器にて、浮遊培養することが好ましい。
【０１０６】
癌組織はまた、細片化に先立って洗浄することも好ましい。このような洗浄には、限定はされないが、酢酸緩衝液（酢酸 ＋ 酢酸ナトリウム）、リン酸緩衝液（リン酸 ＋ リン酸ナトリウム）、クエン酸緩衝液（クエン酸 + クエン酸ナトリウム) 、ホウ酸緩衝液、酒石酸緩衝液、トリス緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水などの緩衝液等を用いることができる。本発明においては、特に好ましくは、ＨＢＳＳ中で組織の洗浄を行うことができる。洗浄の回数は、１回から３回が適度である。
【０１０７】
細片化は、洗浄後の組織を、ナイフ、はさみ、カッター（手動、自動）などで分割することによって行うことができる。細片化後のサイズや形は特に限定されず、ランダムに行い得るが、好ましくは、１ｍｍ〜５ｍｍ角、より好ましくは１ｍｍ〜２ｍｍ角の均一なサイズとする。
【０１０８】
次にこのようにして得られる細片化物は酵素処理に供される。このような酵素処理は、前述の通り、主にトリプシン処理またはディスパーゼ処理であり得る。
【０１０９】
次にこのようにして得られた単一細胞化物中の細胞同士が細胞数３個以上に凝集するようにする。凝集に先立って、好ましくは、単一細胞化物に速やかにROCK阻害剤を添加することができる。
【０１１０】
ここで、凝集により得られる３個以上の癌細胞を含む凝集物は、本発明の癌細胞凝集塊であり、一定範囲のサイズを有する。一定範囲のサイズとは、体積平均粒子径８μｍ〜１０μｍ程度の小さなものも含まれるが、球形に近い場合は、直径２０μｍ以上５００μｍ以下、好ましくは３０μｍ以上４００μｍ以下、より好ましくは４０μｍ以上２５０μｍ以下、楕円形状の場合には、長径２０μｍ以上５００μｍ以下、好ましくは３０μｍ以上４００μｍ以下、より好ましくは４０μｍ以上２５０μｍ以下、不定形の場合には、体積平均粒子径２０μｍ以上５００μｍ以下、好ましくは３０μｍ以上４００μｍ以下、より好ましくは４０μｍ以上２５０μｍ以下、である。体積平均粒子径の測定には、位相差顕微鏡（ＩＸ７０；オリンパス社製）にＣＣＤカメラを取り付けたものを用い、粒度分布及び粒子形状を評価することによって行うことができる。
【０１１１】
このようにして得られた凝集物またはその培養物のいずれもが、本発明の癌細胞凝集塊である。培養物は、選別回収成分たる分離物を、わずかな時間に培地中に存在したものであってもよいし、例えば、少なくとも３時間以上、好ましくは１０時間以上３６時間まで、より好ましくは２４時間〜３６時間以上の期間培養することで、略球形あるいは略楕円球形の形状になったものでもよい。培養時間は、３６時間を超えて、数日、あるいは１０日以上、１３日以上、または３０日以上経過したものであってもよい。
【０１１２】
培養は、培地中で長期間そのまま行うことも可能であるが、好ましくは、培養途中で定期的に機械的分割を行うことで、実質的に無限に増殖能を保持させることもできる。
【０１１３】
このようにして得られる本発明の癌細胞凝集塊は、インビトロにおいて、生体内の癌組織と同様の挙動を示し、安定的に培養することができ、しかも増殖能を保持する。従って、例えば得られた癌組織由来の腫瘍が感受性を有する既存薬剤の種類の特定、あるいは放射線への感受性の有無を、患者毎に個別に確認するのに有用である。薬剤あるいは放射線感受性は、公知のあらゆる方法を使用することができ、限定はされない。薬剤感受性は、インビトロにおける癌細胞凝集塊の増殖率の測定によって行われ得る。このような測定には、例えば、被験薬剤添加後、数時間後、あるいは数日後の生存細胞数を対照例とともに目視観察すること、ＣＣＤカメラ撮影後に画像解析すること、あるいはそれぞれの細胞に含まれる蛋白質結合性色素（例えば、スルホローダミンＢ）による染色により蛋白量として比色測定することなどが含まれる。
【０１１４】
このような癌細胞凝集塊はまた、未知の薬剤のスクリーニングに有用である。このような未知の薬剤感受性もまた、インビトロにおける癌細胞凝集塊の増殖率の測定、または細胞の生死判定によって行われ得る。増殖率の測定には、例えば、被験薬剤添加後、数時間後、あるいは数日後の生存細胞数を対照例とともに目視観察すること、ＣＣＤカメラ撮影後に画像解析すること、あるいはそれぞれの細胞に含まれる蛋白質結合性色素スルホローダミンＢによる染色により蛋白量として比色測定すること、SD(Succinyl dehidrogenase)活性を測定することなどが含まれる。
【０１１５】
すべてのヒト培養細胞の被験化合物感受性測定データ、すなわち、細胞増殖を５０％阻害する濃度（ＧＩ５０）、見かけ上細胞増殖を抑える濃度（ＴＧＩ）及び細胞数を播き込み時の５０％に減少させる濃度（ＬＣ５０）等を計算し、情報処理を行うことが可能である。ＧＩ５０、ＴＧＩ、ＬＣ５０値はそれぞれ試験される癌細胞凝集塊固有の数値が得られる。その全体平均ＧＩ５０、ＴＧＩ、ＬＣ５０値を求め、この平均値と個々の細胞でのＬｏｇ ＧＩ５０値との差を求め、それらを平均Ｌｏｇ ＧＩ５０値を基準にし、絶対値化して正負にて表記する。正の値が大きい場合ほど感受性が高い薬剤であると判断できる。
【０１１６】
本発明の癌細胞凝集塊を用いた放射線感受性試験としては、Ｘ線、コバルトの放射性同位体を線源とするγ線、電子線を直線型加速装置で加速した粒子線や、サイクロトロンなどにより取り出されるα線などの重粒子線等を単独で用いるか、あるいは放射線増感剤との併用で用いる、公知の試験が含まれる。
【０１１７】
さらに、本発明の癌細胞凝集塊は、例えば、直径１００マイクロメーターの癌細胞凝集塊１０個以下（細胞１０００個以下に相当）でも、異種動物への移植における定着度が高い。従って、本発明の癌細胞凝集塊は、マウスを始めとする癌モデル動物の簡便な作成に有用であり、より厳密な癌組織の検証、薬剤感受性の評価、あるいは放射線治療を始めとする治療態様の評価が可能となる。
【０１１８】
本発明の癌細胞凝集塊は、冷凍保存することが可能であり、通常の保存状態においてその増殖能を保持することができる。
【産業上の利用可能性】
【０１１９】
本発明の癌細胞凝集塊は、インビトロにおいて、培養可能な状態で凍結保存することが可能であり、幅広い用途に使用できる。そして、培養によって増殖させることができ、微量検体からの癌細胞増殖を可能にする。さらに、本発明の癌細胞凝集塊は、薬剤感受性試験あるいは放射線感受性試験に広く用いることができ、しかも簡易な腫瘍形成動物の作成に利用することが可能である。この為、本発明の癌細胞凝集塊は、現在一般的には試行錯誤的あるいはカクテル療法的に用いられる制癌剤や放射線治療について飛躍的な改善をもたらすことができる。すなわち、そのような療法を行う前に、患者それぞれから得られる癌細胞凝集塊で、あらかじめ薬剤や放射線治療の効果を予測することができ、効果のある薬剤のみを患者に投与することが可能になる。さらに、本発明の癌細胞凝集塊は、注射針で採取できる大きさでもあり得るために、手術を行う前の患者から得ることも可能であり、患者への負担が少ない状態で制癌剤や放射線治療の効果の予測を行うこともできる。
【実施例】
【０１２０】
以下に、実施例によって本発明を具体的に説明するが、本発明はこれら実施例によって限定されるものではない。なお、各例中の部および％はいずれも重量基準である。以下に特に規定のない培養条件は全て３７℃５％ＣＯ２インキュベーター条件下である。遠心分離の条件は特に言及しない限り、４℃、１０００ｒｐｍ、５分である。
【０１２１】
（実施例１）
（マウス大腸癌移植腫瘍からの癌組織由来細胞塊の調製）
マウス大腸癌移植腫瘍を、以下のように異種移植法にて作製した。
【０１２２】
まず、無菌操作下でヒト腫瘍（大腸癌）の手術摘出標本を約２ｍｍ立方に細切する。次に重症免疫不全マウス（ヌードマウス、好ましくはＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス）の背部に約５ｍｍの小切開を加えて皮下組織を剥離する。用意した腫瘍片を皮下に挿入した後、皮膚縫合クリップで閉創する。一部の移植腫瘍は約14日後から３ヶ月後に皮下腫瘍として観察される。
【０１２３】
得られた大腸癌マウスをＳＰＦ（specific pathogen free）飼育条件で飼育し、腫瘍が1ｃｍ大になった時点で、腫瘍の摘出を行い、２０ｍｌのDMEM(Gibco;11965-092)＋１% Pen Strep(Gibco;15140-022)(ともに最終濃度として100units/ml ペニシリン, 100μg/ml)を入れた50ml遠心分離用チューブ(IWAKI;2345-050)に回収した。
【０１２４】
次に20ml HBSS(Gibco;14025-092)を入れて、転倒混和により腫瘍を洗浄した。次に新しいHBSSを20ml入れ、この操作を２回繰返し、腫瘍組織を10cm組織培養用ディッシュ（組織培養 ディッシュ）(IWAKI;3020-100)に移した。この培養ディッシュ上で、手術用ナイフを用いて壊死組織を除去した。
【０１２５】
壊死組織を除去した腫瘍片を、HBSS 30ｍｌを入れた新しい10cm ディッシュへ移した。次に、手術用ナイフを用いて、腫瘍片を、約2mm角に細片化した。
【０１２６】
HBSSごと腫瘍細片を新しい50ml 遠心分離用チューブへ移した後、遠心分離を行い、上清を捨て、20ml HBSSにて、転倒混和により洗浄した。
【０１２７】
遠心分離及び洗浄を繰り返した。その後、20mlのDMEM＋１% Pen Strep＋０．２８U/ml （最終濃度） Blendzyme 1 (Roche; 11988417001) を入れて混和した。これを、100mlの三角フラスコへ移し、３７°C恒温槽内で、スターラーを低速で回転しながら２時間、リベラーゼブレンザイム１（ロッシュダイアグノスティックス社製）で処理した。
【０１２８】
次に、酵素処理物を、50ml 遠心分離用チューブに回収し、遠心分離し、上清を捨て、20ml HBSS を入れて混和した。ステンレスメッシュ（500μm）に通し、フィルターを通過した成分を50ml 遠心分離用チューブに回収し、さらに、遠心分離操作を行った。上清を捨て、1mg/ml DNaseI 溶液 (Roche; 1284932) （10mg/mlストック100μl＋PBS 900μl)を入れて混和し、４℃にて 5分静置し、さらに20mlHBSSを加え入れて混和した後、遠心分離を行い、上清を捨てた。20ml HBSSと混和した後、500−250−100μｍと段階的に篩にかけ、次に40μmセルストレーナー（BD; 352340）に通した。HBSS 30ｍｌを入れた10cm 組織培養用ディッシュ（組織培養 ディッシュ）にセルストレーナーを浸して軽くゆすり、単細胞、40μm 以下の小細胞塊、およびくずを除去した。HBSS 30ｍｌを入れた別の10cm 組織培養用ディッシュ（組織培養 ディッシュ）にセルストレーナーを移し、セルストレーナーに捕捉された細胞塊をピペッティングにより回収した。
【０１２９】
さらに、上記と同様の遠心分離操作を数回行って、得られた成分に、4ml StemPro hESC SFM (Gibco;A10007-01) + 8ng/ml bFGF (Invitrogen;13256-029) + 0.1mM 2-メルカプトエタノール(Wako;137-06862) + １％ PenStrep + 25μg/ml Amphotericin B (Wako;541-01961) を入れて混和し、6cm non-treated ディッシュ (EIKEN CHEMICAL;AG2000)に移した。
【０１３０】
これを、37°Cにて、 5％CO2 インキュベーター（サンヨー社製ＭＣＯ−１７ＡＩＣ）で３６時間培養した。
【０１３１】
この結果、図１に示すように、時間の経過と共に、不定形から整った球形へ変化し、少なくとも３〜６時間後には略球形であり、24時間後には完全に整った球形状の癌組織由来細胞塊が得られた。
【０１３２】
（実施例２）
（ヒト大腸癌手術検体からの癌組織由来細胞塊の調製）
大腸癌手術検体を用いた以外は、実施例１と同様にして癌組織由来細胞塊を取得した。この結果、図２に示す通り、少なくとも１２時間後には図１と同様のほぼ球形状の癌組織由来細胞塊が得られた。
【０１３３】
（実施例３）
（ヒト卵巣癌手術検体からの癌組織由来細胞塊の調製）
卵巣癌手術検体を用いた以外は、実施例２と同様にして癌組織由来細胞塊を取得した。この結果、図２に示す通り、少なくとも１２時間後には図１と同様のほぼ球形状の癌組織由来細胞塊が得られた。
【０１３４】
（実施例４）
（ヒトすい臓癌手術検体からの癌組織由来細胞塊の調製）
すい臓癌手術検体を用いた以外は、実施例２と同様にして癌組織由来細胞塊を取得した。この結果、図２に示す通り、少なくとも１２時間後には図１と同様のほぼ球形状の癌組織由来細胞塊が得られた。
【０１３５】
（実施例５）
（ヒト小細胞癌手術検体からの癌組織由来細胞塊の調製）
肺癌の一種である小細胞癌手術検体を用いた以外は、実施例２と同様にして癌組織由来細胞塊を取得した。この結果、図２に示す通り、少なくとも１２時間後には図１と同様のほぼ球形状の癌組織由来細胞塊が得られた。
【０１３６】
（実施例６）
（ヒト腎癌手術検体からの癌組織由来細胞塊の調製）
腎癌手術検体を用いた以外は、実施例２と同様にして癌組織由来細胞塊を取得した。この結果、図２に示す通り、少なくとも１２時間後には図１と同様のほぼ球形状の癌組織由来細胞塊が得られた。
【０１３７】
（実施例７）
（ヒト膀胱癌手術検体からの癌組織由来細胞塊の調製）
膀胱癌手術検体を用いた以外は、実施例２と同様にして癌組織由来細胞塊を取得した。この結果、図２に示す通り、少なくとも１２時間後には図１と同様のほぼ球形状の癌組織由来細胞塊が得られた。
【０１３８】
（実施例８）
（ヒト乳癌手術検体からの癌組織由来細胞塊の調製）
乳癌手術検体を用いた以外は、実施例２と同様にして癌組織由来細胞塊を取得した。この結果、図２に示す通り、少なくとも１２時間後には図１と同様のほぼ球形状の癌組織由来細胞塊が得られた。
【０１３９】
（実施例９）
（ヒト前立腺癌手術検体からの癌組織由来細胞塊の調製）
前立腺癌手術検体を用いた以外は、実施例２と同様にして組織由来細胞塊を取得した。培養培地に、１０-８モル／Ｌ濃度のジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）を添加し、実施例１と同様に培養した。この結果、図２に示す通り、少なくとも１２時間後には図１と同様のほぼ球形状の癌組織由来細胞塊が得られた。
【０１４０】
（実施例１０）
（ヒト咽頭癌手術検体からの癌組織由来細胞塊の調製）
咽頭癌手術検体を用いた以外は、実施例２と同様にして癌組織由来細胞塊を取得した。この結果、図２に示す通り、少なくとも１２時間後には図１と同様のほぼ球形状の癌組織由来細胞塊が得られた。
【０１４１】
（実施例１１）
（マウス膵島腫瘍からの癌組織由来細胞塊の調製）
RipTagはラットインスリンプロモーターの支配下にSV40-T antigenを強制発現させたトランスジェニックマウスで、膵島に腫瘍が発生する。RipTagマウスの膵島腫瘍を用いた以外は、実施例２と同様にして癌組織由来細胞塊を取得した。この結果、少なくとも１２時間後には図１と同様のほぼ球形状の癌組織由来細胞塊が得られた（図３）。
【０１４２】
（実施例１２）
（癌組織由来細胞塊からの癌細胞凝集塊の調製）
実施例２と同様の方法で得られた癌組織由来細胞塊を、用いて以下の処理を行った。まず、24 ウェルプレート(未処理のディッシュ)中央にコラーゲンゲル(Cell Matrix type I-A : 5x DMEM : ゲル再構成用緩衝液 = 7 : 2 : 1) 50 ・L / wellを敷いた。37℃、30分静置してコラーゲンゲルを固化した。浮遊培養の癌組織由来細胞塊を(ウエルあたり１００個)、1.5 mLチューブに回収する。これを5秒程度遠心分離し、上清を除去した。癌組織由来細胞塊を、コラーゲンゲル(ウエルあたり30μL)で懸濁し、予め固化したゲルの上に30μLずつ乗せた。37℃、30分静置して固化させ、 StemPro(EGF 50 ng/mL) 600μL /ウェルずつ入れた。2〜3日に一度培地を交換しながら、10日間培養した。
次に、培地を、1 mL / wellのDMEM（Gibco; 11965-092、コラゲナーゼIV 200 mg/mL含む）に交換し、37℃、5時間程度培養した。
培養後、1.5 mLエッペンチューブに移し、遠心分離(約5秒)し、上清を除去して、1 mLのPBSを加えて懸濁し、遠心分離(チビタン、約5秒)後上清除去を2回繰り返した。Trypsin / EDTA (0.05%)を1 mL加えて懸濁し、37℃で8分静置した。数回懸濁して、癌組織由来細胞塊様の大きな塊がなくなったことを確認した。これを、15 mLチューブに移し、2 mLのDMEM(Gibco; 11965-092)を加えて懸濁した。
次に、懸濁液を、遠心分離(1000 rpm、5分)し、上清を除去した。2 mL のStemPro(EGF 50 ng/mL、Y-27632 10μM)で懸濁し、φ35mm non-treated dish (Iwaki: 1000-035)に移した。これを、37℃で一晩培養した。
12時間経過後、直径40μm程度の癌組織由来細胞塊形成を確認した。培地をStemPro(EGF 50 ng/mL)に交換した。
【０１４３】
この結果、図４に示すように、4日後には完全に整った球形状の癌細胞凝集塊が得られた。
【０１４４】
（実施例１３）
（ヒト大腸癌手術検体からの癌細胞凝集塊の調製）
大腸癌手術検体を用いた以外は、実施例１２と同様にして癌細胞凝集塊を取得した。この結果、図５に示す通り、少なくとも１２時間後には図１と同様のほぼ球形状の癌細胞凝集塊が得られた。
【０１４５】
(実施例１４)
実施例２と同様の方法で得られた癌組織由来細胞塊の細胞保存を行った。癌組織由来細胞塊を実施例１２と同様の方法で、トリプシン処理して単細胞化処理を行った。凍結保存液はセルバンカー1(十慈フィールド)にY-27632を添加したものを用いた。
【０１４６】
単細胞化して１０日間凍結保存したものを、その後３７℃のウォーターバスで短時間復温した。これをＰＢＳに懸濁し、さらに１０００rpm、４℃にて遠心分離し、上清を捨てた。得られた沈殿物をStemPro（インビトロ社製）に懸濁して、培養した。図６に示すように、融解後24時間の細胞の状態は、良好で、融解後に癌組織由来細胞塊を再形成した。
【０１４７】
次に、凍結保存した癌組織由来細胞塊の回収率を検討した。1,000個の癌組織由来細胞塊を凍結保存して７日後に融解した。癌組織由来細胞塊を単細胞化して凍結保存した場合と癌組織由来細胞塊のまま凍結保存した場合の回収率を比較した。浮遊培養を行い、2日後に直径40μm以上の球状の細胞塊を癌組織由来細胞塊としてカウントした。その結果、癌組織由来細胞塊を単細胞化して凍結保存した方が、癌組織由来細胞塊のまま凍結保存するよりも癌組織由来細胞塊の回収率が有意に良かった(図７)。単細胞化した場合、1,000個の癌組織由来細胞塊から約9,000個の癌組織由来細胞塊を回収することができた。
【０１４８】
凍結保存した癌組織由来細胞塊の増殖能を検討した。癌組織由来細胞塊を三次元培養し、その大きさにより癌組織由来細胞塊の増殖能を観察した。癌組織由来細胞塊を単細胞化して凍結保存した。これを融解し、癌組織由来細胞塊を再形成させた後、コラーゲンゲル(新田ゼラチン：CellMatrix typeI-A)中で6日間培養した。凍結保存前の癌組織由来細胞塊を同様に培養したものを対照とした。凍結保存後の癌組織由来細胞塊も凍結保存前の癌組織由来細胞塊とほとんど差が見られず、直径が約3倍になり、凍結保存後も凍結保存前と変わらない増殖能を保持していることが確認された(図８)。
【０１４９】
実施例等における評価項目は下記のようにして測定を行った。
【０１５０】
＜表面抗原の同定＞
【０１５１】
実施例１で得られた癌細胞凝集塊をトリプシン・ＥＤＴＡを用いて単細胞に分散させた。これらの細胞を蛍光で標識した表面抗原特異的抗体と反応させた後、フローサイトメトリー法により解析した。
【０１５２】
＜基底膜様物の確認＞
実施例１２で得られた癌細胞凝集塊を温度３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターの培養条件下で、ＳＴＥＭＰＲＯヒトＥＳ細胞用無血清培地（Ｇｉｂｃｏ）1ｃｃで３日間培養を行った。これをホルマリン固定後パラフィン包埋し、薄切して抗ラミニン抗体染色（シグマ−アルドリッチ社製、マウスラミニン由来ラビット抗体）を、製造元の指示書に従って行ったところ、癌細胞凝集塊の外周および、外周に近い細胞の細胞質内にラミニンの抗原性が観察された。これによって、本発明の癌細胞凝集塊は、癌細胞の集合体の周辺をラミニンが取り囲んでいることが判明した。一方、手術検体処理後２４時間ではラミニンの発現は確認できなかった。
【０１５３】
＜低酸素の検知＞
ピモニダゾールを用いた低酸素の検知の例
ニトロイミダゾール系化合物ピモニダゾールは酸素非存在下では蛋白や核酸とAdductを形成する特性を持つ。低酸素下でピモニダゾール処理された組織の低酸素領域は、ピモニダゾールを特異的に認識する抗体を用いて認識することができる。癌組織では血管から約１００マイクロメーター離れると低酸素領域が出現するが、実施例１２で得られた癌細胞凝集塊でも外縁より約１００マイクロメーターを境にして内部は低酸素領域で、広範な細胞死が観察された。
【０１５４】
＜インビトロでの増殖能の評価＞
インビトロにおける癌細胞凝集塊の増殖能は、以下のようにして検証した。実施例１２で得られた癌細胞凝集塊をコラーゲンゲル（CellMatrix typeIA（Nitta Gelatin）：5x DMEM (Gibco;12100-038)：ゲル再構成用緩衝液(50mM NaOH, 260mM NaHCO3, 200mM HEPES)=７：２：１）に×10個ずつ包埋し、温度３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターの培養条件下で、ＳＴＥＭＰＲＯヒトＥＳ細胞用無血清培地（Ｇｉｂｃｏ）1ｃｃで培養を行った。定期的に細胞の状態を観察し、ＣＣＤカメラを装着した位相差顕微鏡（倍率40倍）で大きさを測定した。その結果、機械的分割なしに、少なくとも１３日間増殖能を保持することができた。さらに、１３日目に機械的分割を行ったところ、さらに少なくとも１３日間増殖能を保持していることが確認された。なお、機械的分割は、直径５００マイクロメーターの癌細胞凝集塊を眼科尖刀で４分割することで行った。
【０１５５】
＜細胞数の確認＞
実施例１２と同様の方法で、１００から２５０μｍの癌細胞凝集塊をトリプシン0. 25％、EDTA2.6mMで３分間処理し、約３０回ピペッティングで機械的に分解した。これを９６ウェル培養プレート１ウェルに１個の割合で細胞が入るように希釈して分注した。単細胞化されていない細胞塊については構成する細胞数をカウントして記録した。その後培養（同上の条件）をおこない、各ウェルの細胞数の増加を記録し、３０日間培養観察をおこなった。その結果、３個の細胞があれば、細胞塊が成長できることが確認された。
【０１５６】
＜薬剤感受性試験＞
腫瘍細胞のDNAの塩基対間に挿入し、DNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼ、トポイソメラーゼII反応を阻害し、DNA、RNA双方の生合成を抑制することによって抗腫瘍効果を発揮することが知られているドキソルビシンを用いて、実施例１２の試料による薬剤感受性試験を行った。試験は、癌細胞凝集塊をコラーゲンゲル（CellMatrix typeIA（Nitta Gelatin）：5x DMEM (Gibco;12100-038)：ゲル再構成用緩衝液(50mM NaOH, 260mM NaHCO3, 200mM HEPES)=７：２：１）に×10個ずつ包埋し、温度３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターの培養条件下で、ＳＴＥＭＰＲＯヒトＥＳ細胞用無血清培地（Ｇｉｂｃｏ）1ｃｃで培養を行った。さらにドキソルビシンを０．１μＭ、１μＭ、１０μＭの濃度で適用し、培養８日目の状態を比較評価した。その結果を、図９に示す。癌細胞凝集塊の面積に関する増大率について、薬剤非適用培養での面積に関する増大率を１として相対的に表記した。図９において、ドキソルビシンの濃度依存的に、培養８日目における癌細胞増殖が抑制されており、本発明の癌細胞凝集塊が、薬剤感受性試験で有用であることが実際に証明された。
【０１５７】
＜異種動物への移植試験＞
実施例１２で得られた本発明の３日間培養した直径約100マイクロメーターの癌細胞凝集塊 ×10個をMatrigel(BＤ社)に懸濁して、ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスの背部皮下に投与移植した。腫瘍形成の評価は、経時的に腫瘍のサイズを計測することにより行なった。その結果、本発明の実施例２の癌細胞凝集塊を移植したマウス個体には顕著な腫瘍形成が認められ、本発明の癌細胞凝集塊が高い腫瘍形成能を有することが確認された。この組織を解析すると、マウスに移植して形成された腫瘍と、生体内に存在していた腫瘍とで類似した組織型が得られていることがわかった（図１０）。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌細胞凝集塊およびその調製方法に関する。より詳細には、本発明は、インビトロで癌を再構築でき、かつ増殖能を保持する癌細胞凝集塊に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、がんを克服するため様々な研究が積み重ねられてきた結果、早期がんの治療成績は飛躍的に向上している。しかし、進行がんの治療は依然として困難で、がんは日本人の死因のトップを占め続けている。厚生労働省による平成１９年人口動態統計では、年間３４万人以上ががんにより死亡している。
【０００３】
これまでのがん研究では、特にインビトロにおいてその挙動を調べる場合は、培養に最適化した条件で継代培養され確立された癌細胞株を用いた実験が主流である。このような癌細胞株には、ヒト乳癌細胞株（ＭＤＦ７、ＮＣＩ／ＡＤＲ ＨＳ５７８Ｔ、ＭＤＡ−ＭＢ−２２２３１／ＡＴＣＣ、ＭＤＡ−ＭＢ−４３３５、ＭＤＡ−Ｎ、ＢＴ−５４９、Ｔ−４７Ｄ）、ヒト子宮頸癌細胞株（ＨｅＬａ）、ヒト肺癌細胞株（Ａ５４９、ＥＫＶＸ, ＨＯＰ−６２、ＨＯＰ−９２、ＮＣＩ−Ｈ２３、ＮＣＩ−Ｈ２２６、ＮＣＩ−Ｈ３２２Ｍ、ＮＣＩ−Ｈ４６０、ＮＣＩ−Ｈ５２２）及びヒト大腸癌細胞株（Ｃａｃｏ−２、ＣＯＬＯ ２０５、ＨＣＣ−２９９８、ＨＣＴ−１５、ＨＣＴ−１１６、ＨＴ２９、ＫＭ１２、ＳＷ−６２０）ヒト前立腺癌細胞株（ＤＵ−１４５、ＰＣ−３、ＬＮＣａＰ）、などが含まれ、実際に広く研究に用いられている。
【０００４】
がんの患者別の診断や治療実現等の為に、癌細胞の初代培養が有望とされ、研究が進められている。例えば初代培養細胞を用いたＣＤ−ＤＳＴ法（Collagen gel droplet embedded drug sensitivity test）などが開発されている。このインビトロの試験法は、患者からの単離組織あるいは細胞をコラーゲン・ゲル小滴内に包埋し、三次元培養と画像比色定量法を組み合わせて検証する薬剤感受性試験である（例えば非特許文献１）。しかしながら、初代培養細胞については、培養法が確立しておらず、取り扱いが困難である。
【０００５】
癌細胞の研究の成果として、がんを構成する癌細胞は複数の亜集団から成り立っている可能性があり、「腫瘍始原細胞」あるいは「腫瘍幹細胞」と呼ばれる、小集団であるが自己複製が可能で、分化によって大多数の癌細胞の源となりえる亜集団の存在を支持する報告が相次いでいる（例えば、非特許文献２および３）。このような幹細胞は、例えば、生体から摘出した腫瘍を、単一の細胞にまで分離してソートすることによって取得することができ、そのうちのいくらかがインビトロにおいても増殖能を示すとされている（非特許文献４）。しかしながら、このようにがんの起源を幹細胞で説明する説には、否定的な報告もあり（非特許文献５）、仮説の域を出ない。
【０００６】
がん研究が広く行われている現状にあってもなお、がんについては未知の点が多い。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Takamura Yら（2002）Prediction of chemotherapeutic response by collagen gel droplet embedded culture-drug sensitivity test in human breast cancers. Int．J．Cancer，98，450-455
【非特許文献２】Vermeulen Lら（2008）Single-cell cloning of colon cancer stem cells reveals a multi-lineage differentiation capacity. PNAS Vol.105 No.36 13427-13432
【非特許文献３】Ricci-Vitiani Lら（2007）Identification and expansion of human colon-cancer-initiating cells. Nature Vol.445 111-115
【非特許文献４】Todaro Mら(2007)Colon cancer stem cells dictate tumor growth and resist cell death by production of interleukin-4. Cell Stem Cell 1:389-402
【非特許文献５】Shmelkov S V ら（2008）CD133 expression is not restricted to stem cells, and both CD133+ and CD133- metastatic colon cancer cells initiate tumors. The Journal of Clinical Investigation Vol. 118 2111-2120
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、生体内での癌細胞の挙動をインビトロにおいて再現することができ、薬剤感受性試験あるいは放射線感受性試験などで生体内での効果を正確に検証し得る、癌の分析や治療の研究の為の試料として有用な、新規な癌細胞凝集塊を提供することにある。
【０００９】
本発明はまた、異種動物への移植において、少量で十分な定着性を有し、簡便な癌動物モデルの作成に利用し得る、癌の分析や治療の研究のための試料として有用な、新規な癌細胞凝集塊を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、個々の癌患者の治療感受性試験を行うことを企図し、癌研究の研究材料として用いられてきた細胞株が患者癌とは異質のものである可能性を考慮して、前記課題を解決すべく研究材料としての癌細胞の初代培養法について鋭意検討を重ねた結果、新規な癌細胞凝集塊およびその調製方法を見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち本発明は、癌組織由来細胞塊を単一細胞化処理した後に該単一細胞化物中の細胞同士が細胞数３個以上に凝集することによって形成される凝集物またはその培養物、または個体から得られる癌組織を単一細胞化した後に該単一細胞化物中の細胞同士が細胞数３個以上に凝集することによって形成される凝集物またはその培養物であって、インビトロにおいて、増殖能を保持することができる癌細胞凝集塊、に関する。
【００１２】
本発明はまた、癌組織由来細胞塊または個体から得られる癌組織を単一細胞化した後に、ＲＯＣＫ（Ｒｈｏ結合キナーゼ）阻害剤存在下にて該単一細胞化物中の細胞同士が細胞数３個以上に凝集することによって形成される凝集物またはその培養物であって、インビトロにおいて、増殖能を保持することができる癌細胞凝集塊、に関する。
【００１３】
上記ＲＯＣＫ阻害剤は、Ｙ２７６３２（登録商標）であり得る。
【００１４】
本発明はまた、３個以上の癌細胞集合体を含み、略球形あるいは楕円球形を呈する癌細胞凝集塊、に関する。
【００１５】
本発明はまた、３個以上の癌細胞集合体：および該癌細胞集合体の外周面に存在する基底膜様物を含み、略球形あるいは楕円球形を呈する癌細胞凝集塊、に関する。
【００１６】
上記癌細胞凝集塊は、実質的に癌細胞以外の細胞を含まないことが好ましい。
【００１７】
上記基底膜様物は、ラミニンであり得る。
【００１８】
上記癌細胞凝集塊は、直径が４０μｍ〜２５０μｍであり得る。
【００１９】
上記癌細胞は、上皮癌細胞由来であり得る。
【００２０】
上記癌細胞は、大腸癌、卵巣癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、腎癌、膀胱癌、咽頭癌、膵癌由来であり得る。
【００２１】
本発明はまた、癌組織由来細胞塊または生体から摘出した癌組織を酵素処理して単一細胞化する工程；および
該単一細胞化物中の細胞同士を、細胞数３個以上に凝集させる工程を含む、癌細胞凝集塊の調製方法、に関する。
【００２２】
本発明はまた、癌組織由来細胞塊または生体から摘出した癌組織を酵素処理して単一細胞化する工程；および
該単一細胞化物中の細胞同士を、ＲＯＣＫ阻害剤の存在下にて、細胞数３個以上に凝集させる工程
を含む、癌細胞凝集塊の調製方法、に関する。
【００２３】
上記癌細胞凝集塊の調製方法において、さらに、前記凝集させた成分を３時間以上培養する工程を含み得る。
【００２４】
上記酵素処理は、トリプシンを用いた処理であり得る。
【００２５】
上記ＲＯＣＫ阻害剤は、Ｙ２７６３２（登録商標）であり得る。
【００２６】
本発明はまた、上記の調製方法によって得られる癌細胞凝集塊、に関する。
【発明の効果】
【００２７】
本発明の癌細胞凝集塊は、インビトロで生体内と同様の挙動を示し、またそのような挙動を示すものを再構築することができ、かつ一定期間以上に渡って、増殖能を保持し得る。このような癌細胞凝集塊は、癌細胞の培養による増幅に使用でき、またインビトロにおいて薬剤感受性試験あるいは放射線感受性試験に幅広く好都合に利用することができる。異種動物に対する腫瘍定着性にも優れることから、簡易な腫瘍形成動物の作成に利用することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】マウスから得た癌組織由来細胞塊を示す図である。
【図２】様々な癌組織から得られた癌組織由来細胞塊を示す図である。
【図３】マウス膵島腫瘍から得られた癌組織由来細胞塊を示す図である。
【図４】癌組織由来細胞塊から得られた癌細胞凝集塊を示す図である。
【図５】ヒト大腸癌手術検体由来の癌細胞凝集塊を示す図である。
【図６】癌組織由来細胞塊をトリプシン処理後凍結保存し融解した後の状態を示す図である。
【図７】癌組織由来細胞塊を凍結保存し融解した後の細胞の回収率を、トリプシン処理の有無で比較した図である。
【図８】癌組織由来細胞塊を凍結保存し融解した後の増殖能を、トリプシン処理の有無で比較した図である。
【図９】本発明の癌細胞凝集塊を用いた、インビトロにおけるドキソルビシンによる薬剤感受性試験の結果を示す図である。
【図１０】本発明の癌細胞凝集塊をマウスに移植して得られた腫瘍組織の図である。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本発明の癌細胞凝集塊は、癌組織由来細胞塊または個体から得られる癌組織を、単一細胞化した後に該単一細胞化物中の個々の細胞同士または完全には個々の細胞にまでは分離されなかったいくつかの細胞の集合同士、または個々の細胞と完全には個々の細胞にまでは分離されなかったいくつかの細胞とが、全体として細胞数３個以上に凝集することによって形成される凝集物またはその培養物であって、インビトロにおいて、増殖能を保持することができるようなものである。
【００３０】
ここで、「癌組織由来細胞塊または個体から得られる癌組織を単一細胞化する」とは、癌組織由来細胞塊または得られた癌組織の少なくとも一部をインビトロにおいて単一細胞にまで分離させる処理を施すことをいう。従って、典型的には、このような処理後に、個々の単一細胞にまで分離した細胞が存在する中に、いくらかの細胞が個々にまでは分離されない状態で混在する場合もあり、このような場合であっても、本明細書でいう「単一細胞化する」に該当する。この時に混在する個々にまでは分離されない状態のものには、細胞数１０個までの集合体、好ましくは細胞数２〜３個の集合体が含まれる。
【００３１】
まず、ここで、本発明の癌細胞凝集塊の出発材料となり得る癌組織由来細胞塊について説明する。癌組織由来細胞塊は、本発明者らが見出した新規な細胞塊であり、それ自身は、個体から得られた癌組織から３個以上の癌細胞を含む塊として分離処理された分離物またはその培養物であり、インビトロにおいて、増殖能を保持することができるようなものであり得る。
【００３２】
ここで、「個体から得られた癌組織から３個以上の癌細胞を含む塊として分離処理された分離物」とは、生体内で発生した癌から得られた癌組織を処理して得られた３個以上、好ましくは８個以上の癌細胞を含む分離物を指す。このような分離物には、単一細胞にまで分離されているものは含まれず、また単一細胞に分離されてから再構築した構成物は含まれない。但し、この分離物は、生体から分離した直後の物だけではなく、例えば生理食塩水中で一定時間保持したものや冷凍または冷蔵した物も含む。
【００３３】
「個体から得られた癌組織から３個以上の癌細胞を含む塊として分離処理された分離物の培養物」とは、生体内で発生した癌から得られた癌組織を処理して得られた３個以上の癌細胞を含む塊として分離処理された分離物をインビトロにおいて培養することによって得られるものを指す。培養する時間は特に限定されず、わずかな時間でも培地中に存在させたものであればよい。このような培養物は、一定期間、好ましくは３時間以上培養することによって、略球形あるいは楕円球形を呈する場合が多い。ここでの培養物には、このような一定期間経過後の略球形あるいは楕円球形の培養物も、そこに至るまでの不定形の培養物も含まれる。さらに、このような略球形あるいは楕円球形の培養物をさらに分割して得られる不定形、さらなる培養による略球形物あるいは楕円球形物もここでいう培養物である。
【００３４】
このような癌組織由来細胞塊は、そのまま培養を続けることでも１０日以上、好ましくは１３日以上、さらに好ましくは３０日以上の期間において増殖能を保持し得るが、さらに培養中に定期的に機械的分割を行うか、本発明の癌細胞凝集塊にすることで、実質的に無期限に増殖能を保持し得る。
【００３５】
機械分割は手術用メス、ナイフ、ハサミの他、眼科尖刀などを用いて行うことができる。あるいは注射器に注射針を装着して培養液と共に癌組織由来細胞塊を吸引排出することを繰り返すことによっても行うことができる。本発明に好ましく用いられるのは、例えば１ｍｌ注射器と２７Ｇの注射針であるが、限定はされない。
【００３６】
ここで、本発明の癌組織由来細胞塊の培養の為の培地は、特に限定はされないが、好ましくは、動物細胞培養用培地が用いられる。特に好ましくは、幹細胞培養用の無血清培地が用いられる。このような無血清培地は、幹細胞の培養に用いられるものであればなんら限定はされない。癌組織由来細胞塊を培養するための培地および条件は、癌細胞凝集塊を培養する場合と同じである。
【００３７】
癌組織由来細胞塊を構成する癌細胞は、少なくとも３個以上、好ましくは８個以上、より好ましくは１０個以上、さらに好ましくは２０個以上、もっとも好ましくは５０個以上である。癌組織由来細胞塊が、分離物である場合には、好ましくは１０００個以下、より好ましくは、５００個以下程度である。分離物を培養した後の培養物であれば、培養によってその数を増加させることが可能である。但し、培養物であっても好ましくは１万個以下、より好ましくは５０００個以下である。
【００３８】
本発明では、特に大腸癌組織由来、卵巣癌組織由来、乳癌組織由来、肺癌組織由来、前立腺癌組織由来、腎癌組織由来、膀胱癌組織由来、咽頭癌組織由来、または膵臓癌由来であることが特に好ましいが、限定はされない。
【００３９】
大腸癌組織由来の癌組織由来細胞塊である場合には、含まれる癌細胞は、特に限定はされないが、ＣＤ１３３を発現することもある。
【００４０】
癌組織由来細胞塊は、あるいは、３個以上の癌細胞集合体を含み、略球形あるいは楕円球形を呈するものであり得る。
【００４１】
限定はされないが、該癌細胞集合体の外周面に存在する基底膜様物を含む場合もある。
【００４２】
本発明の癌組織由来細胞塊においては、薄い膜状の基底膜様物が塊の大きさによって、数nm程度、好ましくは、４０から１２０nm程形成されていることが好ましいが限定はされない。
【００４３】
本発明の癌組織由来細胞塊のサイズは、限定はされず、粒径または体積平均粒径８μｍ〜１０μｍ程度の不定形のものも含まれ、また、培養した後に大きく成長した１ｍｍ粒径以上のものも含まれる。好ましくは、直径が４０μｍ〜１０００μｍであり、より好ましくは４０μｍ〜２５０μｍ、さらに好ましくは、８０μｍ〜２００μｍである。
【００４４】
本発明の癌組織由来細胞塊では、特に棚状配列、シート状配列、重層配列および合胞状配列からなる群より選択される１以上の配列を有する場合が多いが、特に限定はされない。
【００４５】
本発明の癌組織由来細胞塊は、典型的には、生体から摘出した癌組織の細片化物を酵素処理する工程；および酵素処理物のうち、３個以上の癌細胞を含む塊を選別回収する工程を含む方法によって調製され得る。
【００４６】
さらに、限定はされないが、本発明の癌組織由来細胞塊は、このようにして回収した成分を３時間以上培養する工程を含む方法によって調製され得る。
【００４７】
まず、生体から摘出した癌組織は、そのまま細片化することもでき、また、まず、細片化前に、動物細胞培養用培地で維持することができる。このような動物細胞培養用培地には、特に限定はされないが、ダルベッコＭＥＭ（ＤＭＥＭ Ｆ１２など）、イーグルＭＥＭ 、ＲＰＭＩ、Ｈａｍ‘ｓ Ｆ１２、アルファＭＥＭ、イスコフ改変ダルベッコなどが含まれる。この際に、細胞非接着性の培養器にて、浮遊培養することが好ましい。
【００４８】
癌組織はまた、細片化に先立って洗浄することも好ましい。このような洗浄には、限定はされないが、酢酸緩衝液（酢酸 ＋ 酢酸ナトリウム）、リン酸緩衝液（リン酸 ＋ リン酸ナトリウム）、クエン酸緩衝液（クエン酸 + クエン酸ナトリウム) 、ホウ酸緩衝液、酒石酸緩衝液、トリス緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水などの緩衝液等を用いることができる。本発明においては、特に好ましくは、ＨＢＳＳ中で組織の洗浄を行うことができる。洗浄の回数は、１回から３回が適度である。
【００４９】
細片化は、洗浄後の組織を、ナイフ、はさみ、カッター（手動、自動）などで分割することによって行うことができる。細片化後のサイズや形は特に限定されず、ランダムに行い得るが、好ましくは、１ｍｍ〜５ｍｍ角、より好ましくは１ｍｍ〜２ｍｍ角の均一なサイズとする。
【００５０】
次にこのようにして得られる細片化物は酵素処理に供される。このような酵素処理は、コラゲナーゼ、トリプシン、パパイン、ヒアルロニダーゼ、C. histolyticum neutral protease、サーモリシン、およびディスパーゼのうちの1種、またはこれらの２種以上の組合せによる処理であり得る。酵素処理条件は、生理学的に許容されるｐＨ、例えば約６〜８、好ましくは約７．２〜７．６に緩衝された等張の塩溶液、例えばＰＢＳやハンクスのバランス塩溶液中で、例えば約２０〜４０℃、好ましくは約２５〜３９℃で、結合組織を分解するために十分な時間、例えば約１〜１８０分間、好ましくは３０〜１５０分間で、そのために十分な濃度、例えば約０．０００１〜５％ｗ／ｖ、好ましくは約０．００１％〜０．５％ ｗ／ｖであり得る。
【００５１】
限定はされないが、この酵素処理の条件は、例えば、コラゲナーゼを含む混合酵素で処理することであり得る。より好ましくは、C. histolyticum neutral protease、thermolysin、およびディスパーゼからなる群より選択される１種以上のプロテアーゼ；およびコラゲナーゼＩ、コラゲナーゼＩＩ、およびコラゲナーゼＩＶからなる群より選択される1種以上のコラゲナーゼを含む混合酵素で処理することが含まれる。
【００５２】
このような混合酵素には、限定はされないが、リベラーゼブレンザイム１（登録商標）などが含まれる。
【００５３】
次にこのようにして得られた酵素処理物のうち、３個以上の癌細胞を含む塊を選別回収することが好ましい。選別回収の方法は特に限定されず、サイズを振分ける当業者に公知のいずれの方法も使用することができる。
【００５４】
サイズの振分け方法としては、簡便な方法としては、目視、位相差顕微鏡による分別、あるいは篩によるが、当業者に利用可能な粒子径による分別法であれば特に限定されない。篩を使う場合は、篩メッシュサイズ２０μｍを通過し、かつ５００μｍを通過しない成分を回収することが好ましい。より好ましくは篩メッシュサイズ４０μｍを通過し、かつ２５０μｍを通過しない成分を回収する。
【００５５】
ここで、選別の対象となる３個以上の癌細胞を含む塊は、本発明の癌組織由来細胞塊であり、一定範囲のサイズを有する。一定範囲のサイズとは、体積平均粒子径８μｍ〜１０μｍ程度の小さなものも含まれるが、球形に近い場合は、直径２０μｍ以上５００μｍ以下、好ましくは３０μｍ以上４００μｍ以下、より好ましくは４０μｍ以上２５０μｍ以下、楕円形状の場合には、長径２０μｍ以上５００μｍ以下、好ましくは３０μｍ以上４００μｍ以下、より好ましくは４０μｍ以上２５０μｍ以下、不定形の場合には、体積平均粒子径２０μｍ以上５００μｍ以下、好ましくは３０μｍ以上４００μｍ以下、より好ましくは４０μｍ以上２５０μｍ以下、である。体積平均粒子径の測定には、位相差顕微鏡（ＩＸ７０；オリンパス社製）にＣＣＤカメラを取り付けたものを用い、粒度分布及び粒子形状を評価することによって行うことができる。
【００５６】
このようにして得られた選別回収成分である分離処理物あるいはその培養物のいずれもが、癌組織由来細胞塊である。培養物は、選別回収成分たる分離物を、わずかな時間に培地中に存在したものであってもよいし、例えば、少なくとも３時間以上、好ましくは１０時間以上３６時間まで、より好ましくは２４時間〜３６時間以上の期間培養することで、略球形あるいは略楕円球形の形状になったものでもよい。培養時間は、３６時間を超えて、数日、あるいは１０日以上、１３日以上、または３０日以上経過したものであってもよい。
【００５７】
培養は、培地中で長期間そのまま行うことも可能であるが、好ましくは、培養途中で定期的に機械的分割を行うことで、実質的に無限に増殖能を保持させることもできる。
【００５８】
次に本発明の癌細胞凝集塊について、詳細に説明する。本発明で、個体から「得られた癌組織」とは、手術等により摘出することで得られる癌組織の他、注射針や内視鏡で組織検査用としてインビトロで取り扱い可能なように取得された癌組織を指す。
【００５９】
「細胞数３個以上に凝集」とは、生体内で発生した癌から得られた癌組織または本発明者らが見出した癌組織由来細胞塊を単一細胞化処理して得られた個々の細胞同士または個々にまでは分離されなかったいくつかの細胞の集合体同士、またはそれらの組合せ同士が、少なくとも３個あるいはそれ以上の複数の細胞を含むように集まった状態を指す。
【００６０】
癌組織由来細胞塊または生体内で発生した癌から得られた癌組織を単一細胞化処理に供する場合は、限定はされないが、個体から得られた癌組織を、酵素処理することが含まれる。
【００６１】
酵素処理は、典型的には、トリプシン、ディスパーゼ、および場合により、コラゲナーゼ、パパイン、ヒアルロニダーゼ、C. histolyticum neutral protease、およびサーモリシンのうちの1種、またはこれらの２種以上の組合せによる処理であり得る。酵素処理条件は、生理学的に許容されるｐＨ、例えば約６〜８、好ましくは約７．２〜７．６に緩衝された等張の塩溶液、例えばＰＢＳやハンクスのバランス塩溶液中で、例えば約２０〜４０℃、好ましくは約２５〜３９℃で、結合組織を分解するために十分な時間、例えば約１〜１８０分間、好ましくは３０〜１５０分間で、そのために十分な濃度、例えば約０．０００１〜５％ｗ／ｖ、好ましくは約０．００１％〜０．５％ ｗ／ｖであり得る。
【００６２】
限定はされないが、この酵素処理は、典型的には、トリプシンまたはディスパーゼ処理単独でもよい。
【００６３】
単一細胞化処理の後には、通常個々に分離された細胞が得られる。但し、個々にまで完全に分離されない細胞も含まれる。
【００６４】
このような細胞は、このまま凝集させてもよいが、好ましくは、例えば、単一細胞化処理後ただちにROCK阻害剤を存在させ、凝集させる。
【００６５】
ROCKとは、Rho-associated coiled-coilキナーゼ（ＲＯＣＫ：GenBankアクセッション番号：NM_005406）のことであり、Ｒｈｏ ＧＴＰａｓｅの主たるエフェクター分子の１つで、多様な生理現象を制御していることが知られている（Rho結合キナーゼともいう）。ROCK阻害剤としては、例えば、Ｙ２７６３２、などが例示される。その他に、Ｆａｓｕｄｉｌ（ＨＡ１０７７）、Ｈ−１１５２、Ｗｆ−５３６（これらはすべて和光純薬工業株式会社から入手できる）、及びそれらの誘導体、並びにＲＯＣＫに対するアンチセンス核酸、ＲＮＡ干渉誘導性核酸やこれらを含むベクターが挙げられる。
【００６６】
トリプシン処理（例えば限定はされないが、0.25%トリプシン-EDTA、37℃5分間処理）によって単一細胞または１０個以下の細胞の集合にまで分離した処理物を、凝集に先立って、96ウェル培養プレートに低密度（例えば500個/0.32cm2、培地容量0.15ml程度)で播種する。維持培養液中にただちに、あるいは数日培養後に、ROCK阻害剤を1〜１００μＭ程度、好ましくは10μM程度の濃度添加することができる。
【００６７】
このような凝集物をインビトロにおいて培養することができる。培養する時間は特に限定されず、わずかな時間でも培地中に存在させたものであればよい。このような培養物は、一定期間、好ましくは３時間以上培養することによって、略球形あるいは楕円球形を呈する場合が多い。ここでの培養物には、このような一定期間経過後の略球形あるいは楕円球形の培養物も、そこに至るまでの不定形の培養物も含まれる。さらに、このような略球形あるいは楕円球形の培養物をさらに分割して得られる不定形、さらなる培養による略球形物あるいは楕円球形物もここでいう培養物である。
【００６８】
本発明の癌細胞凝集塊が、インビトロにおいて、「増殖能を保持することができる」とは、温度３７℃、５％ＣＯ2インキュベーターの細胞培養条件下で、少なくとも１０日以上、好ましくは１３日以上、さらに好ましくは３０日以上の期間増殖能を保持することができることをいう。
【００６９】
このような癌細胞凝集塊は、そのまま培養を続けることでも１０日以上、好ましくは１３日以上、さらに好ましくは３０日以上の期間において増殖能を保持し得るが、さらに培養中に定期的に機械的分割を行うことで、またはさらに単細胞化処理と凝集を行うことで、実質的に無期限に増殖能を保持し得る。
【００７０】
機械分割は手術用メス、ナイフ、ハサミの他、眼科尖刀などを用いて行うことができる。あるいは注射器に注射針を装着して培養液と共に癌細胞凝集塊を吸引排出することを繰り返すことによっても行うことができる。本発明に好ましく用いられるのは、例えば１ｍｌ注射器と２７Ｇの注射針であるが、限定はされない。
【００７１】
ここで、本発明の癌細胞凝集塊の培養の為の培地は、特に限定はされないが、好ましくは、動物細胞培養用培地が用いられる。特に好ましくは、幹細胞培養用の無血清培地が用いられる。このような無血清培地は、幹細胞の培養に用いられるものであればなんら限定はされない。無血清培地とは、無調製または未精製の血清を含まない培地を指し、精製された血液由来成分や動物組織由来成分（例えば、増殖因子）を添加して使用することができる。
【００７２】
本発明の無血清培地は、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製し得る。基礎培地としては、例えば、BME培地、BGJb培地、CMRL 1066培地、Glasgow MEM培地、Improved MEM Zinc Option培地、IMDM培地、Medium 199培地、Eagle MEM培地、αMEM培地、DMEM培地、RPMI 1640培地、Fischer’s培地、およびこれらの組合せが挙げられる。
【００７３】
このような無血清培地に、血清代替物を添加して、本発明の癌細胞凝集塊を培養することができる。血清代替物は、例えば、アルブミン、アミノ酸（例えば、非必須アミノ酸）、トランスフェリン、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、２−メルカプトエタノールまたは３’チオールグリセロール、あるいはこれらの均等物などを適宜含有するものであり得る。
【００７４】
本発明の培養方法においては、市販の血清代替物を使用することもできる。このような市販の血清代替物としては、例えば、ノックアウト血清リプレースメント（ＫＳＲ）、Chemically-defined Lipid concentrated脂肪酸濃縮液（Gibco社製）、グルタマックス（Gibco社製）が挙げられる。
【００７５】
本発明の癌細胞凝集塊を培養するための培地はまた、ビタミン、増殖因子、サイトカイン、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類等を含有し得る。
【００７６】
特に、ＥＧＦとｂＦＧＦを含む無血清培地、例えばノックアウト血清リプレースメント（ＫＳＲ、インビトロジェン社製）のような血清代替物とｂＦＧＦとを含む無血清培地等の任意の無血清培地を好ましく使用することができる。血清代替物あるいはＥＧＦ等の含有量は、培地全体の１０〜３０％ｗ／ｖであることが好ましい。
【００７７】
このような培地としては限定はされないが、市販品としては、ＳＴＥＭＰＲＯヒトＥＳ細胞用無血清培地（Ｇｉｂｃｏ）が挙げられる。
【００７８】
癌細胞凝集塊の培養に用いられる培養器は、一般的に動物細胞の培養が可能なものであれば特に限定されないが、例えば、フラスコ、組織培養用フラスコ、ディッシュ、ペトリデッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウエルプレート、マルチプレート、マルチウエルプレート、チャンバースライド、シャーレ、チューブ、トレイ、培養バック、ローラーボトルが挙げられる。
【００７９】
培養器は、細胞非接着性で、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）等による細胞支持用基質を培地に共存させて三次元培養することが好ましい。細胞支持用基質は、癌細胞凝集塊の接着を目的とするものであり得る。このような細胞支持用基質としては、細胞外マトリックスを用いたマトリゲル、例えば、コラーゲンゲルや、ゼラチン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリ−Ｄ−リジン、ラミニン、フィブロネクチンが挙げられる。このような条件は、特に本発明の癌細胞凝集塊を増殖させたい場合に好適に用いられる。
【００８０】
その他の培養条件は、適宜設定でき、例えば、培養温度は、限定されるものではないが好ましくは、約３０〜４０℃である。最も好ましくは３７℃である。ＣＯ２濃度は、例えば約１〜１０％、好ましくは約２〜５％である。
【００８１】
本発明の癌細胞凝集塊は、このような培地および培養条件で培養し得る。さらに癌細胞凝集塊の培養には、その個別の性質によって、他の細胞との共培養が好ましい場合、あるいはホルモンのような追加の特殊な補充物の存在が必要な場合もあり得る。
【００８２】
具体的には、共培養を、フィーダー細胞と共に行ってもよい。フィーダー細胞としては、胎児線維芽細胞等のストローマ細胞等を用いることができる。具体的には、限定はされないが、ＮＩＨ３Ｔ３などが好ましい。
【００８３】
あるいは、特定種類の乳癌、子宮癌、前立腺癌に対しては、ホルモンを存在させて培養することが好ましい。具体的には、乳癌に対するエストロゲン、子宮癌に対するプロフェステロン、前立腺癌に対するテストステロンなどであるが、これらに限定されず、各種ホルモンを添加し、培養条件を好都合に調整することができる。さらに、このようなホルモンの存在によって、癌細胞凝集塊の培養後の挙動がどのように変化するかを調べることで、由来する患者の癌のホルモン依存性がわかり、抗ホルモン薬治療の有効性が予測できる可能性がある。
【００８４】
本発明の癌細胞凝集塊は、浮遊培養で培養することも可能である。浮遊培養では、培地中において、培養器に対して非接着性の条件下で癌細胞凝集塊を培養する。このような浮遊培養としては、例えば、胚様体培養法（Kellerら, Curr. Opin. Cell Biol. 7, 862-869 (1995)）、ＳＦＥＢ法（例、Watanabeら, Nature Neuroscience 8, 288-296 (2005)；国際公開第2005/123902号参照）が挙げられる 。特に癌細胞凝集塊の増殖ではなく、維持したい場合に好ましい。
【００８５】
癌細胞凝集塊を構成する癌細胞は、少なくとも３個以上、好ましくは８個以上、より好ましくは１０個以上、さらに好ましくは２０個以上であり、その数において上限は特にはない。本発明の癌細胞凝集塊が、分離物である場合には、好ましくは１０００個以下、より好ましくは、５００個以下程度である。分離物を培養した後の培養物であれば、培養によってその数を増加させることが可能である。但し、培養物であっても好ましくは１万個以下、より好ましくは５０００個以下である。
【００８６】
本発明で「癌細胞」というときは、通常用いられる意味で使用され、生体内において、制限のない分裂・増殖とアポトーシスからの逸脱という、正常細胞で見られる秩序が乱れた細胞をいう。より詳細には、細胞増殖制御機能を失っているか極めて減弱している細胞を指し、典型的には、８０％以上の高い頻度で無限増殖能力を獲得しており、その多くは浸潤転移能力も備えている事が多く、その結果ヒトをはじめとする、特には哺乳動物を、死に至らしめる悪性新生物と位置付けられる細胞であることを意味する。
【００８７】
本発明では、由来する癌組織の種類は特に限定されず、哺乳類を始めとする動物に生じる、リンパ腫、芽腫、肉腫、脂肪肉腫、神経内分泌腫瘍、中皮腫、神経鞘腫、髄膜腫、腺腫、黒色腫、白血病、リンパ性悪性腫などであり得るが、特には哺乳類の上皮細胞に生じる癌腫であることが好ましい。このような上皮細胞に生じる癌腫には、非小細胞肺癌、肝細胞癌、胆道癌、食道癌、胃癌、結腸直腸癌、膵臓癌、子宮頚癌、卵巣癌、子宮内膜癌、膀胱癌、咽頭癌、乳癌、唾液腺癌、腎癌、前立腺癌、陰唇癌、肛門癌、陰茎癌、精巣癌、甲状腺癌、頭頸部癌などが含まれる。哺乳類をはじめとする動物に特に限定はないが、サルやヒトを含む霊長目に属する動物、マウス、リス、ラットなどのげっ歯目に属する動物、ウサギ目に属する動物、イヌ、ネコなどのネコ目に属する動物が例示される。
【００８８】
そのうち、本発明では、特に大腸癌組織由来、卵巣癌組織由来、乳癌組織由来、肺癌組織由来、前立腺癌組織由来、腎癌組織由来、膀胱癌組織由来、咽頭癌組織由来、または膵臓癌由来であることが特に好ましいが、限定はされない。
【００８９】
大腸癌組織由来の癌細胞凝集塊である場合には、含まれる癌細胞は、特に限定はされないが、ＣＤ１３３を発現することもある。
【００９０】
本発明の癌細胞凝集塊は、あるいは、３個以上の癌細胞集合体を含み、略球形あるいは楕円球形を呈するものであり得る。
【００９１】
限定はされないが、該癌細胞集合体の外周面に存在する基底膜様物を含む場合もある。
【００９２】
ここで、特に限定はされないが、集合体を形成する癌細胞は、ＣＤ１３３、ＣＤ４４、ＣＤ１６６、ＣＤ１１７、ＣＤ２４、およびＥＳＡからなる群より選択される1種以上の表面抗原を細胞表面に有する場合が多い。ＣＤ１３３、ＣＤ４４、ＣＤ１６６、ＣＤ１１７、ＣＤ２４、およびＥＳＡは、一般的には、リンパ球等の白血球、線維芽細胞、上皮細胞、腫瘍細胞などの細胞に発現している表面抗原である。これらの表面抗原は、細胞-細胞間、細胞-マトリックス間接着としての機能の他、様々なシグナル伝達に関わるが、各種幹細胞の表面マーカーでもある。
【００９３】
本発明において、細胞群が、ＣＤ１３３のような表面抗原を「発現する」というときには、細胞群中に存在する細胞の８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは実質的にすべてが表面抗原を示している状態を指す。
【００９４】
本明細書において、「基底膜様物」とは、限定はされないが、好ましくは、コラーゲン、ラミニン、ニドゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカンなどのプロテオグリカン、フィブロネクチンなどの糖タンパク質のうち少なくともいずれか１種を含有する物質を指す。本発明では、ラミニンを含有する基底膜様物であることが好ましい。
【００９５】
ラミニンは基底膜を構成する高分子糖タンパク質である。ラミニンの機能は、多岐に渡り、例えば、細胞接着、細胞間信号伝達、正常細胞および癌細胞の増殖などの細胞機能に関与している。ラミニンは、3つの異なるサブユニットのそれぞれがジスルフィド結合で結ばれた構造を有しており、それぞれのサブユニットの異なる種類によって、11種類が見出されている。
【００９６】
これらのうち、ラミニン５は、通常、上皮細胞のみから産生され、上皮細胞の基底膜への接着や運動機能を促進する活性を有する成分として知られている。このラミニン５はα３鎖、β３鎖、γ２鎖のそれぞれ１本ずつが複合体を形成した構造を有し、特にγ２鎖はＬＮ５固有と考えられており、他のＬＮ分子種には含まれていない。
【００９７】
本発明の癌細胞凝集塊は、癌細胞の集合体の外周がこのような基底膜様物が形成する膜に全体として包まれた構成を有し得る。このような形態は、癌細胞凝集塊の電子顕微鏡による観察あるいは基底膜構成要素の免疫染色、またはその両方を組み合わせることによって解析することができる。
【００９８】
ラミニンの存在は、例えば、ラミニンを認識する抗体、例えば、シグマ−アルドリッチ社のマウスラミニン由来ラビット抗体と癌細胞凝集塊とを接触させ、抗体抗原反応を測定することによって検出することができる。
【００９９】
また、ラミニンの種類までを特定する特異的な抗体を用いることも可能である。例えば、ラミニン５の存在は、例えば、特に上記の固有のγ２鎖あるいはその断片に反応性を有する抗体と癌細胞凝集塊とを接触させ、抗体の反応を測定することによって、検出することができる。
【０１００】
本発明の癌細胞凝集塊においては、薄い膜状の基底膜様物が塊の大きさによって、数μｍ程度、好ましくは、４０から１２０nm程形成されていることが好ましいが限定はされない。
【０１０１】
本発明の癌細胞凝集塊のサイズは、限定はされず、粒径または体積平均粒径８μｍ〜１０μｍ程度の不定形のものも含まれ、また、培養した後に大きく成長した１ｍｍ粒径以上のものも含まれる。好ましくは、直径が４０μｍ〜１０００μｍであり、より好ましくは４０μｍ〜２５０μｍ、さらに好ましくは、８０μｍ〜２００μｍである。
【０１０２】
本発明の癌細胞凝集塊では、特に棚状配列、シート状配列、重層配列および合胞状配列からなる群より選択される１以上の配列を有する場合が多いが、特に限定はされない。
【０１０３】
本発明の癌細胞凝集塊は、典型的には、生体から摘出した癌組織を単一細胞化する工程；および該単一細胞化物中の細胞同士を細胞数３個以上に凝集させる工程を含む方法によって調製され得る。
【０１０４】
さらに、限定はされないが、本発明の癌細胞凝集塊は、凝集した成分を３時間以上培養する工程を含む方法によって調製され得る。
【０１０５】
まず、本発明の癌細胞凝集塊が、癌組織由来細胞塊から得られる場合には、そのまま酵素処理に供するが、生体から摘出した癌組織は、そのまま酵素処理に供することで単一細胞化することもできる一方で、酵素処理に先立って、細片化することが好ましい。細片化前に、動物細胞培養用培地で維持することができる。このような動物細胞培養用培地には、特に限定はされないが、ダルベッコＭＥＭ（ＤＭＥＭ Ｆ１２など）、イーグルＭＥＭ 、ＲＰＭＩ、Ｈａｍ‘ｓ Ｆ１２、アルファＭＥＭ、イスコフ改変ダルベッコなどが含まれる。この際に、細胞非接着性の培養器にて、浮遊培養することが好ましい。
【０１０６】
癌組織はまた、細片化に先立って洗浄することも好ましい。このような洗浄には、限定はされないが、酢酸緩衝液（酢酸 ＋ 酢酸ナトリウム）、リン酸緩衝液（リン酸 ＋ リン酸ナトリウム）、クエン酸緩衝液（クエン酸 + クエン酸ナトリウム) 、ホウ酸緩衝液、酒石酸緩衝液、トリス緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水などの緩衝液等を用いることができる。本発明においては、特に好ましくは、ＨＢＳＳ中で組織の洗浄を行うことができる。洗浄の回数は、１回から３回が適度である。
【０１０７】
細片化は、洗浄後の組織を、ナイフ、はさみ、カッター（手動、自動）などで分割することによって行うことができる。細片化後のサイズや形は特に限定されず、ランダムに行い得るが、好ましくは、１ｍｍ〜５ｍｍ角、より好ましくは１ｍｍ〜２ｍｍ角の均一なサイズとする。
【０１０８】
次にこのようにして得られる細片化物は酵素処理に供される。このような酵素処理は、前述の通り、主にトリプシン処理またはディスパーゼ処理であり得る。
【０１０９】
次にこのようにして得られた単一細胞化物中の細胞同士が細胞数３個以上に凝集するようにする。凝集に先立って、好ましくは、単一細胞化物に速やかにROCK阻害剤を添加することができる。
【０１１０】
ここで、凝集により得られる３個以上の癌細胞を含む凝集物は、本発明の癌細胞凝集塊であり、一定範囲のサイズを有する。一定範囲のサイズとは、体積平均粒子径８μｍ〜１０μｍ程度の小さなものも含まれるが、球形に近い場合は、直径２０μｍ以上５００μｍ以下、好ましくは３０μｍ以上４００μｍ以下、より好ましくは４０μｍ以上２５０μｍ以下、楕円形状の場合には、長径２０μｍ以上５００μｍ以下、好ましくは３０μｍ以上４００μｍ以下、より好ましくは４０μｍ以上２５０μｍ以下、不定形の場合には、体積平均粒子径２０μｍ以上５００μｍ以下、好ましくは３０μｍ以上４００μｍ以下、より好ましくは４０μｍ以上２５０μｍ以下、である。体積平均粒子径の測定には、位相差顕微鏡（ＩＸ７０；オリンパス社製）にＣＣＤカメラを取り付けたものを用い、粒度分布及び粒子形状を評価することによって行うことができる。
【０１１１】
このようにして得られた凝集物またはその培養物のいずれもが、本発明の癌細胞凝集塊である。培養物は、選別回収成分たる分離物を、わずかな時間に培地中に存在したものであってもよいし、例えば、少なくとも３時間以上、好ましくは１０時間以上３６時間まで、より好ましくは２４時間〜３６時間以上の期間培養することで、略球形あるいは略楕円球形の形状になったものでもよい。培養時間は、３６時間を超えて、数日、あるいは１０日以上、１３日以上、または３０日以上経過したものであってもよい。
【０１１２】
培養は、培地中で長期間そのまま行うことも可能であるが、好ましくは、培養途中で定期的に機械的分割を行うことで、実質的に無限に増殖能を保持させることもできる。
【０１１３】
このようにして得られる本発明の癌細胞凝集塊は、インビトロにおいて、生体内の癌組織と同様の挙動を示し、安定的に培養することができ、しかも増殖能を保持する。従って、例えば得られた癌組織由来の腫瘍が感受性を有する既存薬剤の種類の特定、あるいは放射線への感受性の有無を、患者毎に個別に確認するのに有用である。薬剤あるいは放射線感受性は、公知のあらゆる方法を使用することができ、限定はされない。薬剤感受性は、インビトロにおける癌細胞凝集塊の増殖率の測定によって行われ得る。このような測定には、例えば、被験薬剤添加後、数時間後、あるいは数日後の生存細胞数を対照例とともに目視観察すること、ＣＣＤカメラ撮影後に画像解析すること、あるいはそれぞれの細胞に含まれる蛋白質結合性色素（例えば、スルホローダミンＢ）による染色により蛋白量として比色測定することなどが含まれる。
【０１１４】
このような癌細胞凝集塊はまた、未知の薬剤のスクリーニングに有用である。このような未知の薬剤感受性もまた、インビトロにおける癌細胞凝集塊の増殖率の測定、または細胞の生死判定によって行われ得る。増殖率の測定には、例えば、被験薬剤添加後、数時間後、あるいは数日後の生存細胞数を対照例とともに目視観察すること、ＣＣＤカメラ撮影後に画像解析すること、あるいはそれぞれの細胞に含まれる蛋白質結合性色素スルホローダミンＢによる染色により蛋白量として比色測定すること、SD(Succinyl dehidrogenase)活性を測定することなどが含まれる。
【０１１５】
すべてのヒト培養細胞の被験化合物感受性測定データ、すなわち、細胞増殖を５０％阻害する濃度（ＧＩ５０）、見かけ上細胞増殖を抑える濃度（ＴＧＩ）及び細胞数を播き込み時の５０％に減少させる濃度（ＬＣ５０）等を計算し、情報処理を行うことが可能である。ＧＩ５０、ＴＧＩ、ＬＣ５０値はそれぞれ試験される癌細胞凝集塊固有の数値が得られる。その全体平均ＧＩ５０、ＴＧＩ、ＬＣ５０値を求め、この平均値と個々の細胞でのＬｏｇ ＧＩ５０値との差を求め、それらを平均Ｌｏｇ ＧＩ５０値を基準にし、絶対値化して正負にて表記する。正の値が大きい場合ほど感受性が高い薬剤であると判断できる。
【０１１６】
本発明の癌細胞凝集塊を用いた放射線感受性試験としては、Ｘ線、コバルトの放射性同位体を線源とするγ線、電子線を直線型加速装置で加速した粒子線や、サイクロトロンなどにより取り出されるα線などの重粒子線等を単独で用いるか、あるいは放射線増感剤との併用で用いる、公知の試験が含まれる。
【０１１７】
さらに、本発明の癌細胞凝集塊は、例えば、直径１００マイクロメーターの癌細胞凝集塊１０個以下（細胞１０００個以下に相当）でも、異種動物への移植における定着度が高い。従って、本発明の癌細胞凝集塊は、マウスを始めとする癌モデル動物の簡便な作成に有用であり、より厳密な癌組織の検証、薬剤感受性の評価、あるいは放射線治療を始めとする治療態様の評価が可能となる。
【０１１８】
本発明の癌細胞凝集塊は、冷凍保存することが可能であり、通常の保存状態においてその増殖能を保持することができる。
【産業上の利用可能性】
【０１１９】
本発明の癌細胞凝集塊は、インビトロにおいて、培養可能な状態で凍結保存することが可能であり、幅広い用途に使用できる。そして、培養によって増殖させることができ、微量検体からの癌細胞増殖を可能にする。さらに、本発明の癌細胞凝集塊は、薬剤感受性試験あるいは放射線感受性試験に広く用いることができ、しかも簡易な腫瘍形成動物の作成に利用することが可能である。この為、本発明の癌細胞凝集塊は、現在一般的には試行錯誤的あるいはカクテル療法的に用いられる制癌剤や放射線治療について飛躍的な改善をもたらすことができる。すなわち、そのような療法を行う前に、患者それぞれから得られる癌細胞凝集塊で、あらかじめ薬剤や放射線治療の効果を予測することができ、効果のある薬剤のみを患者に投与することが可能になる。さらに、本発明の癌細胞凝集塊は、注射針で採取できる大きさでもあり得るために、手術を行う前の患者から得ることも可能であり、患者への負担が少ない状態で制癌剤や放射線治療の効果の予測を行うこともできる。
【実施例】
【０１２０】
以下に、実施例によって本発明を具体的に説明するが、本発明はこれら実施例によって限定されるものではない。なお、各例中の部および％はいずれも重量基準である。以下に特に規定のない培養条件は全て３７℃５％ＣＯ２インキュベーター条件下である。遠心分離の条件は特に言及しない限り、４℃、１０００ｒｐｍ、５分である。
【０１２１】
（実施例１）
（マウス大腸癌移植腫瘍からの癌組織由来細胞塊の調製）
マウス大腸癌移植腫瘍を、以下のように異種移植法にて作製した。
【０１２２】
まず、無菌操作下でヒト腫瘍（大腸癌）の手術摘出標本を約２ｍｍ立方に細切する。次に重症免疫不全マウス（ヌードマウス、好ましくはＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス）の背部に約５ｍｍの小切開を加えて皮下組織を剥離する。用意した腫瘍片を皮下に挿入した後、皮膚縫合クリップで閉創する。一部の移植腫瘍は約14日後から３ヶ月後に皮下腫瘍として観察される。
【０１２３】
得られた大腸癌マウスをＳＰＦ（specific pathogen free）飼育条件で飼育し、腫瘍が1ｃｍ大になった時点で、腫瘍の摘出を行い、２０ｍｌのDMEM(Gibco;11965-092)＋１% Pen Strep(Gibco;15140-022)(ともに最終濃度として100units/ml ペニシリン, 100μg/ml)を入れた50ml遠心分離用チューブ(IWAKI;2345-050)に回収した。
【０１２４】
次に20ml HBSS(Gibco;14025-092)を入れて、転倒混和により腫瘍を洗浄した。次に新しいHBSSを20ml入れ、この操作を２回繰返し、腫瘍組織を10cm組織培養用ディッシュ（組織培養 ディッシュ）(IWAKI;3020-100)に移した。この培養ディッシュ上で、手術用ナイフを用いて壊死組織を除去した。
【０１２５】
壊死組織を除去した腫瘍片を、HBSS 30ｍｌを入れた新しい10cm ディッシュへ移した。次に、手術用ナイフを用いて、腫瘍片を、約2mm角に細片化した。
【０１２６】
HBSSごと腫瘍細片を新しい50ml 遠心分離用チューブへ移した後、遠心分離を行い、上清を捨て、20ml HBSSにて、転倒混和により洗浄した。
【０１２７】
遠心分離及び洗浄を繰り返した。その後、20mlのDMEM＋１% Pen Strep＋０．２８U/ml （最終濃度） Blendzyme 1 (Roche; 11988417001) を入れて混和した。これを、100mlの三角フラスコへ移し、３７°C恒温槽内で、スターラーを低速で回転しながら２時間、リベラーゼブレンザイム１（ロッシュダイアグノスティックス社製）で処理した。
【０１２８】
次に、酵素処理物を、50ml 遠心分離用チューブに回収し、遠心分離し、上清を捨て、20ml HBSS を入れて混和した。ステンレスメッシュ（500μm）に通し、フィルターを通過した成分を50ml 遠心分離用チューブに回収し、さらに、遠心分離操作を行った。上清を捨て、1mg/ml DNaseI 溶液 (Roche; 1284932) （10mg/mlストック100μl＋PBS 900μl)を入れて混和し、４℃にて 5分静置し、さらに20mlHBSSを加え入れて混和した後、遠心分離を行い、上清を捨てた。20ml HBSSと混和した後、500−250−100μｍと段階的に篩にかけ、次に40μmセルストレーナー（BD; 352340）に通した。HBSS 30ｍｌを入れた10cm 組織培養用ディッシュ（組織培養 ディッシュ）にセルストレーナーを浸して軽くゆすり、単細胞、40μm 以下の小細胞塊、およびくずを除去した。HBSS 30ｍｌを入れた別の10cm 組織培養用ディッシュ（組織培養 ディッシュ）にセルストレーナーを移し、セルストレーナーに捕捉された細胞塊をピペッティングにより回収した。
【０１２９】
さらに、上記と同様の遠心分離操作を数回行って、得られた成分に、4ml StemPro hESC SFM (Gibco;A10007-01) + 8ng/ml bFGF (Invitrogen;13256-029) + 0.1mM 2-メルカプトエタノール(Wako;137-06862) + １％ PenStrep + 25μg/ml Amphotericin B (Wako;541-01961) を入れて混和し、6cm non-treated ディッシュ (EIKEN CHEMICAL;AG2000)に移した。
【０１３０】
これを、37°Cにて、 5％CO2 インキュベーター（サンヨー社製ＭＣＯ−１７ＡＩＣ）で３６時間培養した。
【０１３１】
この結果、図１に示すように、時間の経過と共に、不定形から整った球形へ変化し、少なくとも３〜６時間後には略球形であり、24時間後には完全に整った球形状の癌組織由来細胞塊が得られた。
【０１３２】
（実施例２）
（ヒト大腸癌手術検体からの癌組織由来細胞塊の調製）
大腸癌手術検体を用いた以外は、実施例１と同様にして癌組織由来細胞塊を取得した。この結果、図２に示す通り、少なくとも１２時間後には図１と同様のほぼ球形状の癌組織由来細胞塊が得られた。
【０１３３】
（実施例３）
（ヒト卵巣癌手術検体からの癌組織由来細胞塊の調製）
卵巣癌手術検体を用いた以外は、実施例２と同様にして癌組織由来細胞塊を取得した。この結果、図２に示す通り、少なくとも１２時間後には図１と同様のほぼ球形状の癌組織由来細胞塊が得られた。
【０１３４】
（実施例４）
（ヒトすい臓癌手術検体からの癌組織由来細胞塊の調製）
すい臓癌手術検体を用いた以外は、実施例２と同様にして癌組織由来細胞塊を取得した。この結果、図２に示す通り、少なくとも１２時間後には図１と同様のほぼ球形状の癌組織由来細胞塊が得られた。
【０１３５】
（実施例５）
（ヒト小細胞癌手術検体からの癌組織由来細胞塊の調製）
肺癌の一種である小細胞癌手術検体を用いた以外は、実施例２と同様にして癌組織由来細胞塊を取得した。この結果、図２に示す通り、少なくとも１２時間後には図１と同様のほぼ球形状の癌組織由来細胞塊が得られた。
【０１３６】
（実施例６）
（ヒト腎癌手術検体からの癌組織由来細胞塊の調製）
腎癌手術検体を用いた以外は、実施例２と同様にして癌組織由来細胞塊を取得した。この結果、図２に示す通り、少なくとも１２時間後には図１と同様のほぼ球形状の癌組織由来細胞塊が得られた。
【０１３７】
（実施例７）
（ヒト膀胱癌手術検体からの癌組織由来細胞塊の調製）
膀胱癌手術検体を用いた以外は、実施例２と同様にして癌組織由来細胞塊を取得した。この結果、図２に示す通り、少なくとも１２時間後には図１と同様のほぼ球形状の癌組織由来細胞塊が得られた。
【０１３８】
（実施例８）
（ヒト乳癌手術検体からの癌組織由来細胞塊の調製）
乳癌手術検体を用いた以外は、実施例２と同様にして癌組織由来細胞塊を取得した。この結果、図２に示す通り、少なくとも１２時間後には図１と同様のほぼ球形状の癌組織由来細胞塊が得られた。
【０１３９】
（実施例９）
（ヒト前立腺癌手術検体からの癌組織由来細胞塊の調製）
前立腺癌手術検体を用いた以外は、実施例２と同様にして組織由来細胞塊を取得した。培養培地に、１０-８モル／Ｌ濃度のジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）を添加し、実施例１と同様に培養した。この結果、図２に示す通り、少なくとも１２時間後には図１と同様のほぼ球形状の癌組織由来細胞塊が得られた。
【０１４０】
（実施例１０）
（ヒト咽頭癌手術検体からの癌組織由来細胞塊の調製）
咽頭癌手術検体を用いた以外は、実施例２と同様にして癌組織由来細胞塊を取得した。この結果、図２に示す通り、少なくとも１２時間後には図１と同様のほぼ球形状の癌組織由来細胞塊が得られた。
【０１４１】
（実施例１１）
（マウス膵島腫瘍からの癌組織由来細胞塊の調製）
RipTagはラットインスリンプロモーターの支配下にSV40-T antigenを強制発現させたトランスジェニックマウスで、膵島に腫瘍が発生する。RipTagマウスの膵島腫瘍を用いた以外は、実施例２と同様にして癌組織由来細胞塊を取得した。この結果、少なくとも１２時間後には図１と同様のほぼ球形状の癌組織由来細胞塊が得られた（図３）。
【０１４２】
（実施例１２）
（癌組織由来細胞塊からの癌細胞凝集塊の調製）
実施例２と同様の方法で得られた癌組織由来細胞塊を、用いて以下の処理を行った。まず、24 ウェルプレート(未処理のディッシュ)中央にコラーゲンゲル(Cell Matrix type I-A : 5x DMEM : ゲル再構成用緩衝液 = 7 : 2 : 1) 50 ・L / wellを敷いた。37℃、30分静置してコラーゲンゲルを固化した。浮遊培養の癌組織由来細胞塊を(ウエルあたり１００個)、1.5 mLチューブに回収する。これを5秒程度遠心分離し、上清を除去した。癌組織由来細胞塊を、コラーゲンゲル(ウエルあたり30μL)で懸濁し、予め固化したゲルの上に30μLずつ乗せた。37℃、30分静置して固化させ、 StemPro(EGF 50 ng/mL) 600μL /ウェルずつ入れた。2〜3日に一度培地を交換しながら、10日間培養した。
次に、培地を、1 mL / wellのDMEM（Gibco; 11965-092、コラゲナーゼIV 200 mg/mL含む）に交換し、37℃、5時間程度培養した。
培養後、1.5 mLエッペンチューブに移し、遠心分離(約5秒)し、上清を除去して、1 mLのPBSを加えて懸濁し、遠心分離(チビタン、約5秒)後上清除去を2回繰り返した。Trypsin / EDTA (0.05%)を1 mL加えて懸濁し、37℃で8分静置した。数回懸濁して、癌組織由来細胞塊様の大きな塊がなくなったことを確認した。これを、15 mLチューブに移し、2 mLのDMEM(Gibco; 11965-092)を加えて懸濁した。
次に、懸濁液を、遠心分離(1000 rpm、5分)し、上清を除去した。2 mL のStemPro(EGF 50 ng/mL、Y-27632 10μM)で懸濁し、φ35mm non-treated dish (Iwaki: 1000-035)に移した。これを、37℃で一晩培養した。
12時間経過後、直径40μm程度の癌組織由来細胞塊形成を確認した。培地をStemPro(EGF 50 ng/mL)に交換した。
【０１４３】
この結果、図４に示すように、4日後には完全に整った球形状の癌細胞凝集塊が得られた。
【０１４４】
（実施例１３）
（ヒト大腸癌手術検体からの癌細胞凝集塊の調製）
大腸癌手術検体を用いた以外は、実施例１２と同様にして癌細胞凝集塊を取得した。この結果、図５に示す通り、少なくとも１２時間後には図１と同様のほぼ球形状の癌細胞凝集塊が得られた。
【０１４５】
(実施例１４)
実施例２と同様の方法で得られた癌組織由来細胞塊の細胞保存を行った。癌組織由来細胞塊を実施例１２と同様の方法で、トリプシン処理して単細胞化処理を行った。凍結保存液はセルバンカー1(十慈フィールド)にY-27632を添加したものを用いた。
【０１４６】
単細胞化して１０日間凍結保存したものを、その後３７℃のウォーターバスで短時間復温した。これをＰＢＳに懸濁し、さらに１０００rpm、４℃にて遠心分離し、上清を捨てた。得られた沈殿物をStemPro（インビトロ社製）に懸濁して、培養した。図６に示すように、融解後24時間の細胞の状態は、良好で、融解後に癌組織由来細胞塊を再形成した。
【０１４７】
次に、凍結保存した癌組織由来細胞塊の回収率を検討した。1,000個の癌組織由来細胞塊を凍結保存して７日後に融解した。癌組織由来細胞塊を単細胞化して凍結保存した場合と癌組織由来細胞塊のまま凍結保存した場合の回収率を比較した。浮遊培養を行い、2日後に直径40μm以上の球状の細胞塊を癌組織由来細胞塊としてカウントした。その結果、癌組織由来細胞塊を単細胞化して凍結保存した方が、癌組織由来細胞塊のまま凍結保存するよりも癌組織由来細胞塊の回収率が有意に良かった(図７)。単細胞化した場合、1,000個の癌組織由来細胞塊から約9,000個の癌組織由来細胞塊を回収することができた。
【０１４８】
凍結保存した癌組織由来細胞塊の増殖能を検討した。癌組織由来細胞塊を三次元培養し、その大きさにより癌組織由来細胞塊の増殖能を観察した。癌組織由来細胞塊を単細胞化して凍結保存した。これを融解し、癌組織由来細胞塊を再形成させた後、コラーゲンゲル(新田ゼラチン：CellMatrix typeI-A)中で6日間培養した。凍結保存前の癌組織由来細胞塊を同様に培養したものを対照とした。凍結保存後の癌組織由来細胞塊も凍結保存前の癌組織由来細胞塊とほとんど差が見られず、直径が約3倍になり、凍結保存後も凍結保存前と変わらない増殖能を保持していることが確認された(図８)。
【０１４９】
実施例等における評価項目は下記のようにして測定を行った。
【０１５０】
＜表面抗原の同定＞
【０１５１】
実施例１で得られた癌細胞凝集塊をトリプシン・ＥＤＴＡを用いて単細胞に分散させた。これらの細胞を蛍光で標識した表面抗原特異的抗体と反応させた後、フローサイトメトリー法により解析した。
【０１５２】
＜基底膜様物の確認＞
実施例１２で得られた癌細胞凝集塊を温度３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターの培養条件下で、ＳＴＥＭＰＲＯヒトＥＳ細胞用無血清培地（Ｇｉｂｃｏ）1ｃｃで３日間培養を行った。これをホルマリン固定後パラフィン包埋し、薄切して抗ラミニン抗体染色（シグマ−アルドリッチ社製、マウスラミニン由来ラビット抗体）を、製造元の指示書に従って行ったところ、癌細胞凝集塊の外周および、外周に近い細胞の細胞質内にラミニンの抗原性が観察された。これによって、本発明の癌細胞凝集塊は、癌細胞の集合体の周辺をラミニンが取り囲んでいることが判明した。一方、手術検体処理後２４時間ではラミニンの発現は確認できなかった。
【０１５３】
＜低酸素の検知＞
ピモニダゾールを用いた低酸素の検知の例
ニトロイミダゾール系化合物ピモニダゾールは酸素非存在下では蛋白や核酸とAdductを形成する特性を持つ。低酸素下でピモニダゾール処理された組織の低酸素領域は、ピモニダゾールを特異的に認識する抗体を用いて認識することができる。癌組織では血管から約１００マイクロメーター離れると低酸素領域が出現するが、実施例１２で得られた癌細胞凝集塊でも外縁より約１００マイクロメーターを境にして内部は低酸素領域で、広範な細胞死が観察された。
【０１５４】
＜インビトロでの増殖能の評価＞
インビトロにおける癌細胞凝集塊の増殖能は、以下のようにして検証した。実施例１２で得られた癌細胞凝集塊をコラーゲンゲル（CellMatrix typeIA（Nitta Gelatin）：5x DMEM (Gibco;12100-038)：ゲル再構成用緩衝液(50mM NaOH, 260mM NaHCO3, 200mM HEPES)=７：２：１）に×10個ずつ包埋し、温度３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターの培養条件下で、ＳＴＥＭＰＲＯヒトＥＳ細胞用無血清培地（Ｇｉｂｃｏ）1ｃｃで培養を行った。定期的に細胞の状態を観察し、ＣＣＤカメラを装着した位相差顕微鏡（倍率40倍）で大きさを測定した。その結果、機械的分割なしに、少なくとも１３日間増殖能を保持することができた。さらに、１３日目に機械的分割を行ったところ、さらに少なくとも１３日間増殖能を保持していることが確認された。なお、機械的分割は、直径５００マイクロメーターの癌細胞凝集塊を眼科尖刀で４分割することで行った。
【０１５５】
＜細胞数の確認＞
実施例１２と同様の方法で、１００から２５０μｍの癌細胞凝集塊をトリプシン0. 25％、EDTA2.6mMで３分間処理し、約３０回ピペッティングで機械的に分解した。これを９６ウェル培養プレート１ウェルに１個の割合で細胞が入るように希釈して分注した。単細胞化されていない細胞塊については構成する細胞数をカウントして記録した。その後培養（同上の条件）をおこない、各ウェルの細胞数の増加を記録し、３０日間培養観察をおこなった。その結果、３個の細胞があれば、細胞塊が成長できることが確認された。
【０１５６】
＜薬剤感受性試験＞
腫瘍細胞のDNAの塩基対間に挿入し、DNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼ、トポイソメラーゼII反応を阻害し、DNA、RNA双方の生合成を抑制することによって抗腫瘍効果を発揮することが知られているドキソルビシンを用いて、実施例１２の試料による薬剤感受性試験を行った。試験は、癌細胞凝集塊をコラーゲンゲル（CellMatrix typeIA（Nitta Gelatin）：5x DMEM (Gibco;12100-038)：ゲル再構成用緩衝液(50mM NaOH, 260mM NaHCO3, 200mM HEPES)=７：２：１）に×10個ずつ包埋し、温度３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターの培養条件下で、ＳＴＥＭＰＲＯヒトＥＳ細胞用無血清培地（Ｇｉｂｃｏ）1ｃｃで培養を行った。さらにドキソルビシンを０．１μＭ、１μＭ、１０μＭの濃度で適用し、培養８日目の状態を比較評価した。その結果を、図９に示す。癌細胞凝集塊の面積に関する増大率について、薬剤非適用培養での面積に関する増大率を１として相対的に表記した。図９において、ドキソルビシンの濃度依存的に、培養８日目における癌細胞増殖が抑制されており、本発明の癌細胞凝集塊が、薬剤感受性試験で有用であることが実際に証明された。
【０１５７】
＜異種動物への移植試験＞
実施例１２で得られた本発明の３日間培養した直径約100マイクロメーターの癌細胞凝集塊 ×10個をMatrigel(BＤ社)に懸濁して、ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスの背部皮下に投与移植した。腫瘍形成の評価は、経時的に腫瘍のサイズを計測することにより行なった。その結果、本発明の実施例２の癌細胞凝集塊を移植したマウス個体には顕著な腫瘍形成が認められ、本発明の癌細胞凝集塊が高い腫瘍形成能を有することが確認された。この組織を解析すると、マウスに移植して形成された腫瘍と、生体内に存在していた腫瘍とで類似した組織型が得られていることがわかった（図１０）。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌組織由来細胞塊または個体から得られる癌組織を単一細胞化した後に該単一細胞化物中の細胞同士が細胞数３個以上に凝集することによって形成される凝集物またはその培養物であって、
インビトロにおいて、増殖能を保持することができる、
癌細胞凝集塊。
【請求項２】
癌組織由来細胞塊または個体から得られる癌組織を単一細胞化した後に、ＲＯＣＫ（Ｒｈｏ結合キナーゼ）阻害剤存在下にて該単一細胞同士が細胞数３個以上に凝集することによって形成される凝集物またはその培養物であって、
インビトロにおいて、増殖能を保持することができる、
癌細胞凝集塊。
【請求項３】
前記ＲＯＣＫ阻害剤が、Ｙ２７６３２（登録商標）である、請求項２記載の癌細胞凝集塊。
【請求項４】
３個以上の癌細胞集合体を含み、略球形あるいは楕円球形を呈する癌細胞凝集塊。
【請求項５】
３個以上の癌細胞集合体：および
該癌細胞集合体の外周面に存在する基底膜様物
を含み、略球形あるいは楕円球形を呈する癌細胞凝集塊。
【請求項６】
実質的に癌細胞以外の細胞を含まない、請求項１から５までのいずれかに記載の癌細胞凝集塊。
【請求項７】
前記基底膜様物がラミニンである、請求項５に記載の癌細胞凝集塊。
【請求項８】
直径が４０μｍ〜２５０μｍである、請求項１から７までのいずれか１項に記載の癌細胞凝集塊。
【請求項９】
前記癌細胞が、上皮癌細胞由来である、請求項１から８までのいずれかに記載の癌細胞凝集塊。
【請求項１０】
前記癌細胞が、大腸癌、卵巣癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、腎癌、膀胱癌、咽頭癌、膵癌由来である、請求項９に記載の癌細胞凝集塊。
【請求項１１】
癌組織由来細胞塊または生体から摘出した癌組織を酵素処理して単一細胞化する工程；および
該単一細胞化物中の細胞同士を、細胞数３個以上に凝集させる工程
を含む、癌細胞凝集塊の調製方法。
【請求項１２】
癌組織由来細胞塊または生体から摘出した癌組織を酵素処理して単一細胞化する工程；および
該単一細胞化物中の細胞同士を、ＲＯＣＫ阻害剤の存在下にて、細胞数３個以上に凝集させる工程
を含む、請求項１１記載の癌細胞凝集塊の調製方法。
【請求項１３】
さらに、前記凝集させた成分を３時間以上培養する工程を含む、請求項１１または１２記載の癌細胞凝集塊の調製方法。
【請求項１４】
前記酵素処理が、トリプシンを用いた処理であることである、請求項１１から１３までのいずれか１項に記載の癌細胞凝集塊の調製方法。
【請求項１５】
前記ＲＯＣＫ阻害剤が、Ｙ２７６３２（登録商標）である、請求項１２から１４までのいずれか1項に記載の癌細胞凝集塊の調製方法。
【請求項１６】
請求項１１から１５までのいずれか１項に記載の調製方法によって得られる癌細胞凝集塊。
【請求項１】
癌組織由来細胞塊または個体から得られる癌組織を単一細胞化した後に該単一細胞化物中の細胞同士が細胞数３個以上に凝集することによって形成される凝集物またはその培養物であって、
インビトロにおいて、増殖能を保持することができる、
癌細胞凝集塊。
【請求項２】
癌組織由来細胞塊または個体から得られる癌組織を単一細胞化した後に、ＲＯＣＫ（Ｒｈｏ結合キナーゼ）阻害剤存在下にて該単一細胞同士が細胞数３個以上に凝集することによって形成される凝集物またはその培養物であって、
インビトロにおいて、増殖能を保持することができる、
癌細胞凝集塊。
【請求項３】
前記ＲＯＣＫ阻害剤が、Ｙ２７６３２（登録商標）である、請求項２記載の癌細胞凝集塊。
【請求項４】
３個以上の癌細胞集合体を含み、略球形あるいは楕円球形を呈する癌細胞凝集塊。
【請求項５】
３個以上の癌細胞集合体：および
該癌細胞集合体の外周面に存在する基底膜様物
を含み、略球形あるいは楕円球形を呈する癌細胞凝集塊。
【請求項６】
実質的に癌細胞以外の細胞を含まない、請求項１から５までのいずれかに記載の癌細胞凝集塊。
【請求項７】
前記基底膜様物がラミニンである、請求項５に記載の癌細胞凝集塊。
【請求項８】
直径が４０μｍ〜２５０μｍである、請求項１から７までのいずれか１項に記載の癌細胞凝集塊。
【請求項９】
前記癌細胞が、上皮癌細胞由来である、請求項１から８までのいずれかに記載の癌細胞凝集塊。
【請求項１０】
前記癌細胞が、大腸癌、卵巣癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、腎癌、膀胱癌、咽頭癌、膵癌由来である、請求項９に記載の癌細胞凝集塊。
【請求項１１】
癌組織由来細胞塊または生体から摘出した癌組織を酵素処理して単一細胞化する工程；および
該単一細胞化物中の細胞同士を、細胞数３個以上に凝集させる工程
を含む、癌細胞凝集塊の調製方法。
【請求項１２】
癌組織由来細胞塊または生体から摘出した癌組織を酵素処理して単一細胞化する工程；および
該単一細胞化物中の細胞同士を、ＲＯＣＫ阻害剤の存在下にて、細胞数３個以上に凝集させる工程
を含む、請求項１１記載の癌細胞凝集塊の調製方法。
【請求項１３】
さらに、前記凝集させた成分を３時間以上培養する工程を含む、請求項１１または１２記載の癌細胞凝集塊の調製方法。
【請求項１４】
前記酵素処理が、トリプシンを用いた処理であることである、請求項１１から１３までのいずれか１項に記載の癌細胞凝集塊の調製方法。
【請求項１５】
前記ＲＯＣＫ阻害剤が、Ｙ２７６３２（登録商標）である、請求項１２から１４までのいずれか1項に記載の癌細胞凝集塊の調製方法。
【請求項１６】
請求項１１から１５までのいずれか１項に記載の調製方法によって得られる癌細胞凝集塊。
【図２】
【図８】
【図１】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図９】
【図１０】
【図８】
【図１】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図９】
【図１０】
【公開番号】特開２０１１−１１５１０６（Ｐ２０１１−１１５１０６Ａ）
【公開日】平成２３年６月１６日（２０１１．６．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２７６７７７（Ｐ２００９−２７６７７７）
【出願日】平成２１年１２月４日（２００９．１２．４）
【出願人】（３０８００９５０９）株式会社ＲＥＩメディカル (7)
【出願人】（５０６２８６９２８）地方独立行政法人 大阪府立病院機構 (13)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年６月１６日（２０１１．６．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１２月４日（２００９．１２．４）
【出願人】（３０８００９５０９）株式会社ＲＥＩメディカル (7)
【出願人】（５０６２８６９２８）地方独立行政法人 大阪府立病院機構 (13)
【Ｆターム（参考）】
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