発現ベクター、トランスフェクション系、およびそれらの使用方法
【課題】宿主細胞、特に哺乳動物細胞における目的のポリペプチドの安定かつ高レベルな発現を可能にする新規な発現ベクターを提供すること。
【解決手段】所望のポリペプチドの高発現を提供する発現ベクターおよびトランスフェクション系を提供する。これらの発現ベクターおよびトランスフェクション系を使用する方法、ならびにこれらの組成物および方法によって改変された哺乳動物細胞もまた提供される。１つの局面において、本発明は、（ａ）第１の不活化された選択マーカーをコードする、第１のポリヌクレオチド；（ｂ）目的の異種ポリペプチドをコードする、第２のポリヌクレオチド；および（ｃ）第２の増幅可能な選択マーカーをコードする、第３のポリヌクレオチドを含む、発現ベクターである。
【解決手段】所望のポリペプチドの高発現を提供する発現ベクターおよびトランスフェクション系を提供する。これらの発現ベクターおよびトランスフェクション系を使用する方法、ならびにこれらの組成物および方法によって改変された哺乳動物細胞もまた提供される。１つの局面において、本発明は、（ａ）第１の不活化された選択マーカーをコードする、第１のポリヌクレオチド；（ｂ）目的の異種ポリペプチドをコードする、第２のポリヌクレオチド；および（ｃ）第２の増幅可能な選択マーカーをコードする、第３のポリヌクレオチドを含む、発現ベクターである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、宿主細胞、特に哺乳動物細胞における目的のポリペプチドの安定かつ高レベルな発現を可能にする新規な発現ベクターを提供する。本発明はまた、本明細書中に記載される構築物を使用する、哺乳動物細胞についてのトランスフェクション系を含む。本明細書中に記載される発明は、効率的な機構を提供し、これによって、任意の所望のポリペプチドは、本明細書中に記載されるように、発生された新規な細胞株を使用して高レベルで発現され得る。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
ポリオーマのような細胞溶解ウイルスに基づくベクターは、短期間発現に対して使用されてきたが、不安定である傾向にあり、１細胞サイクルあたり多数回複製する（Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉ，Ｊ．Ｓ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：１９５１−１９６０，１９８４）。ウシ乳頭腫ウイルスに基づくベクターがまた開発されてきているが、一貫して、１細胞サイクルあたり一回も複製しない（Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｄ．Ｍ．ら、Ｃｅｌｌ５０：５９−６８，１９８７；Ｒａｖｎａｎ，Ｊ．−Ｂ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：６９４６−６９５２，１９９２）。さらに、ウシ乳頭腫ウイルスベースのベクターは、高頻度の再編成を示す（Ａｓｈｍａｎ，Ｃ．Ｒ．ら、Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１１：４９９−５０４，１９８５；ＤｕＢｒｉｄｇｅ，Ｒ．Ｂ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：３７９−３８７，１９８７）。
【０００３】
ヒトおよび霊長類の細胞において、エプスタイン−バーウイルスに基づくベクター（ＥＢＶ）が開発されてきた（Ｙａｔｅ，Ｊ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８１：３８０６−３８１０，１９８４；Ｒｅｉｓｍａｎ，Ｄら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：１８２２−１８３２，１９８５；Ｌｕｐｔｏｎ，Ｓら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：２５３３−２５４２，１９８５）。これらのベクターは、代表的に、１細胞サイクルあたり一回複製し（Ａｄａｍ，Ａ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１：１７４３−１７４６，１９８７；Ｙａｔｅｓ，Ｊ．Ｌ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６５：４８３−４８８，１９９１；Ｈａｓｓｅ，Ｓ．Ｂ．ら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９：５０５３−５０５８，１９９１）、そして長期間にわたり低い変異頻度で、安定して維持される（ＤｕＢｒｉｄｇｅ，Ｒ．Ｂ．，ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：３７９−３８７，１９８７；ＤｕＢｒｉｄｇｅ，Ｒ．Ｂ．ら、Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ３：１−９，１９８８；Ｄｒｉｎｋｗａｔｅｒ，Ｎ．Ｒ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：３４０２−３４０６、１９８６）。これらのベクターは、ヒトおよびサルの細胞におけるクローニングおよび発現研究のために使用されてきた（Ｍａｒｇｏｌｓｋｅｅ，Ｒ．Ｆ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：２８３７−２８４７，１９８８；Ｙｏｕｎｇ，Ｊ．Ｍ．ら、Ｇｅｎｅ ６２：１７１−１８５，１９８８；Ｂｅｌｔ，Ｐ．Ｂ．Ｇ．Ｍら、Ｇｅｎｅ ８４：４０７−４１７，１９８９；Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｃ．ら、Ｇｅｎｅ １０７：２７９−２８４、１９９１）。ゲノムへの組み込みが必要とされないので、安定した形質転換頻度が高く、クローン化された配列の回収が、プラスミド抽出によって達成される。しかし、齧歯目細胞は、ＥＢＶ複製に対して許容されず、ＥＢＶの齧歯目対応物は、記載されていない（Ｙａｔｅ，Ｊ．Ｌ．ら、Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）３１３：８１２−８１５，１９８５）。
【０００４】
特許文献１（Ｓａｕｅｒら）は、真核生物細胞における遺伝子移入を達成するために、Ｃｒｅ−Ｌｏｘ部位特異的組換えの使用を開示する。しかし、記載される系は、宿主ゲノムへ転移されるＤＮＡの効率的かつ安定した組み込みを提供しない（例えば、Ｓａｕｅｒら、（１９９３）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｚｙ ２２５：８９８頁を参照のこと）。これは、分子内交換による、ゲノム外への転移されたＤＮＡの切除が、分子間部位特異的組換えによる、ゲノムへのＤＮＡの組み込みよりも優性であるという事実に主に起因する。
特許文献２（Ｌｅｂｏｕｌｃｈら）は、細胞を形質転換して、導入遺伝子の効率的かつ安定した部位特異的組み込みを生じるための方法および組成物を記載する。形質転換は、細胞にアクセプターベクター（好ましくは、レトロウイルスベクター）を導入することによって達成され、これは、細胞のゲノム内に組み込まれる。このアクセプターベクターは、２種の不適合性のｌｏｘ配列、Ｌ１およびＬ２を含む。次いで、ドナーベクターは、同じＬ１およびＬ２配列が隣接する導入遺伝子を含む細胞に導入される。安定した遺伝子転移は、ｌｏｘ Ｌ１およびＬ２配列をＣｒｅリコンビナーゼと接触させることによって開始される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許第４，９５９，３１７号明細書
【特許文献２】米国特許第５，９２８，９１４号明細書
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１） 発現ベクターであって、以下：
（ａ）第１の不活化された選択マーカーをコードする、第１のポリヌクレオチド；
（ｂ）目的の異種ポリペプチドをコードする、第２のポリヌクレオチド；および
（ｃ）第２の増幅可能な選択マーカーをコードする、第３のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
（項目２） 項目１に記載の発現ベクターであって、前記第１の不活化された選択マーカーは、アミノ酸残基１８２で変異を有するネオマイシン耐性遺伝子をコードする配列、アミノ酸残基２６１で変異を有するネオマイシン耐性遺伝子をコードする配列、ならびにアミノ酸残基１８２および２６１で変異を有するネオマイシン耐性遺伝子をコードする配列からなる群より選択される、発現ベクター。
（項目３） 前記第３のポリヌクレオチドが、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｄｈｆｒ）をコードする、項目１に記載の発現ベクター。
（項目４） 前記目的の異種ポリペプチドが、ＣＡＢ−２、ＣＡＢ−４、ｕＰＡＲ、ＶＥＧＦ−Ｄおよびウイルスタンパク質からなる群より選択される、項目１に記載の発現ベクター。
（項目５） 前記目的の異種ポリペプチドが、ウイルス糖タンパク質である、項目１に記載の発現ベクター。
（項目６） ｐＥＳＮ１ｄｈｆｒ、ｐＥＳＮ２ｄｈｆｒ、ｐＥＳＮ３ｄｈｆｒ、ｐｎｅｏ１ｄｈｆｒ５’ｄｅｌ、ｐｎｅｏ３ｄｈｆｒ５’ｄｅｌ、ｐｎｅｏ２ｄｈｆｒ５’ｄｅｌおよびｐｄｈｆｒ３’ｄｅｌからなる群より選択される、プラスミド。
（項目７） プラスミドｐＥＳＮ１ｄｈｆｒ。
（項目８） ｐＥＳＮ２ｄｈｆｒと命名されたプラスミド。
（項目９） ｐＥＳＮ３ｄｈｆｒと命名されたプラスミド。
（項目１０） ｐｎｅｏ１ｄｈｆｒ５’ｄｅｌと命名されたプラスミド。
（項目１１） ｐｎｅｏ３ｄｈｆｒ５’ｄｅｌと命名されたプラスミド。
（項目１２） ｐｎｅｏ２ｄｈｆｒ５’ｄｅｌと命名されたプラスミド。
（項目１３） ｐｄｈｆｒ３’ｄｅｌと命名されたプラスミド。
（項目１４） 宿主細胞において目的のポリペプチドを産生するための方法であって、以下：
（ａ）項目１に記載の発現ベクターを適切な宿主細胞中に導入する工程；
（ｂ）前記第１および第２の選択マーカーを発現する宿主細胞を、安定に組み込まれた発現ベクターについて選択する条件下で、選択する工程；
（ｃ）該安定にトランスフェクトされた宿主細胞を、前記目的のポリペプチドの発現を支持する条件下で、増殖させる工程；および
（ｄ）該目的のポリペプチドを単離する工程
を包含する、方法。
（項目１５） 宿主細胞において目的のポリペプチドを産生するための方法であって、以下：
（ａ）項目６に記載の発現ベクターを適切な宿主細胞中に導入する工程；
（ｂ）前記第１および第２の選択マーカーを発現する宿主細胞を、安定に組み込まれた発現ベクターについて選択する条件下で、選択する工程；
（ｃ）該安定にトランスフェクトされた宿主細胞を、前記目的のポリペプチドの発現を支持する条件下で、増殖させる工程；および
（ｄ）該目的のポリペプチドを単離する工程
を包含する、方法。
（項目１６） 前記目的のポリペプチドが、ＣＡＢ−２、ＣＡＢ−４、ｕＰＡＲ、ＶＥＧＦ−Ｄおよびウイルスタンパク質からなる群より選択される、項目１４に記載の方法。
（項目１７） 前記ポリペプチドが、ウイルスタンパク質である、項目１４に記載の方法。
（項目１８） 前記宿主細胞が、哺乳動物細胞または昆虫細胞である、項目１４に記載の方法。
（項目１９） 目的のポリペプチドを産生する宿主細胞株であって、該ポリペプチドは、項目１４に記載の方法に従って産生される、宿主細胞株。
（項目２０） トランスフェクション系であって、以下：
（ａ）第１の構築物であって、適切な骨格中に、第１の選択マーカーをコードする配列および第２の選択マーカーをコードする配列を含み、該第２の選択マーカーは、そのコード配列中に少なくとも１つの不能化変異を含む、第１の構築物；および
（ｂ）第２の構築物であって、適切な骨格中に、目的のポリヌクレオチドヌクレオチド配列および第３の選択マーカーをコードする配列を含み、ここで、該第３の選択マーカーは、該第２の選択マーカーと同じ選択マーカーであるが、ただし、該第３の選択マーカーは、該第２の選択マーカー中の不能化変異とは異なるコード配列領域にある、少なくとも１つの不能化変異を含む、第２の構築物
を含む、トランスフェクション系。
（項目２１） 前記第１の選択マーカーが、抗生物質耐性をコードする、項目２０に記載のトランスフェクション系。
（項目２２） 前記第１の選択マーカーが、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩをコードする、項目２０に記載のトランスフェクション系。
（項目２３） 前記ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩが、機能的に損なわれている、項目２２に記載のトランスフェクション系。
（項目２４） 前記第１の構築物中の前記第２の選択マーカーが、５’コード領域における少なくとも１つの変異によって不能化されており、そして前記第２の構築物中の第３の選択マーカーが、３’コード領域における少なくとも１つの異なる変異によって不能化されている、項目２０に記載のトランスフェクション系。
（項目２５） 前記変異が、点変異である、項目２４に記載のトランスフェクション系。
（項目２６） 前記変異が、欠失である、項目２０に記載のトランスフェクション系。
（項目２７） 前記第２および第３の選択マーカーが、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）をコードする、項目２０に記載のトランスフェクション系。
（項目２８） 前記構築物が、プラスミドである、項目２０に記載のトランスフェクション系。
（項目２９） 項目２８に記載のトランスフェクション系であって、前記プラスミドが、以下：
（ｃ）それぞれ、前記第１および第２の選択マーカーならびに前記導入遺伝子に作動可能に連結されている、第１、第２および第３のプロモーター；
（ｄ）該第１および第２の選択マーカーならびに該導入遺伝子に作動可能に連結されている、ポリアデニル化部位をコードする配列；および
（ｅ）該第１および第２の選択マーカーならびに該導入遺伝子に作動可能に連結されている、複製起点をコードする配列
をさらに含む、トランスフェクション系。
（項目３０） 前記第１のプロモーターが、ＣＭＶプロモーター、ＲＳＶプロモーターまたはＳＶ−４０初期プロモーターからなる群より選択される、項目２９に記載のトランスフェクション系。
（項目３１） 前記第２のプロモーターが、ＣＭＶプロモーター、ＲＳＶプロモーターまたはＳＶ−４０初期プロモーターからなる群より選択される、項目２９に記載のトランスフェクション系。
（項目３２） 前記第３のプロモーターが、ＣＭＶプロモーター、ＲＳＶプロモーターまたはＳＶ−４０初期プロモーターからなる群より選択される、項目２９に記載のトランスフェクション系。
（項目３３） 前記第１および第３のプロモーターが、ＣＭＶプロモーターであり、そして前記第２のプロモーターが、ＳＶ−４０初期プロモーターである、項目２９に記載のトランスフェクション系。
（項目３４） 選択されたポリヌクレオチド配列の発現のための哺乳動物細胞株を産生するための方法であって、以下
（ａ）ゲノムを有する選択された哺乳動物細胞に、第１の構築物を導入する工程であって、該第１の構築物は、第１の選択マーカーをコードする配列および第２の選択マーカーをコードする配列を含み、該第２の選択マーカーは、そのコード配列中に少なくとも１つの不能化変異を含む、工程；
（ｂ）該第１の選択マーカーを発現する哺乳動物細胞について選択する工程であって、該第１の構築物は、該ゲノムに安定に組み込まれている、工程；
（ｃ）該哺乳動物細胞に、第２の構築物を導入する工程であって、該第２の構築物は、目的のポリヌクレオチド配列および第３の選択マーカーをコードする配列を含み、ここで、該第３の選択マーカーは、該第２の選択マーカーと同じ選択マーカーであるが、ただし、該第３の選択マーカーは、該第２の選択マーカー中の不能化変異とは異なるコード配列領域にある、少なくとも１つの不能化変異を含む、工程；および
（ｄ）該第２の選択マーカーによってコードされる機能的産物を発現する哺乳動物細胞について選択する工程であって、該機能的産物は、該第２の選択マーカーと該第３の選択マーカーとの間の組換え事象によって生じる配列によってコードされ、そして得られた哺乳動物細胞は、該選択されたポリヌクレオチド配列を発現し得る、工程
を包含する、方法。
（項目３５） 前記選択されたポリヌクレオチド配列が、ポリペプチドをコードする、項目３４に記載の方法。
（項目３６） 前記選択されたポリヌクレオチド配列の発現が、前記ポリペプチドの発現を生じる、項目３５に記載の方法。
（項目３７） 項目３４に記載の方法によって産生された、哺乳動物細胞。
（項目３８） 宿主哺乳動物細胞において目的のポリペプチドを産生するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）ゲノムを有する該細胞に、第１の構築物を導入する工程であって、該第１の構築物は、第１の選択マーカーをコードする配列および第２の選択マーカーをコードする配列を含み、該第２の選択マーカーは、そのコード配列中に少なくとも１つの不能化変異を含む、工程；
（ｂ）該第１の選択マーカーを発現する哺乳動物細胞について選択する工程であって、該第１の構築物は、該ゲノムに安定に組み込まれている、工程；
（ｃ）該哺乳動物細胞に、第２の構築物を導入する工程であって、該第２の構築物は、目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列および第３の選択マーカーをコードする配列を含み、ここで、該第３の選択マーカーは、該第２の選択マーカーと同じ選択マーカーであるが、ただし、該第３の選択マーカーは、該第２の選択マーカー中の不能化変異とは異なるコード配列領域にある、少なくとも１つの不能化変異を含む、工程；
（ｄ）該第２の選択マーカーによってコードされる機能的産物を発現する哺乳動物細胞について選択する工程であって、該機能的産物は、該第２の選択マーカーと該第３の選択マーカーとの間の組換え事象によって生じる配列によってコードされ、そして得られた哺乳動物細胞は、該目的のポリペプチドを発現し得る、工程；および
（ｅ）該目的のポリペプチドを産生するような条件下で、該哺乳動物細胞を培養する工程
を包含する、方法。
（項目３９） 前記第１の選択マーカーが、ネオマイシン耐性をコードする、項目３８に記載の方法。
（項目４０） 前記第２および第３の選択マーカーが、ｄｈｆｒをコードする、項目３８に記載の方法。
（項目４１） 前記細胞への前記構築物の導入が、エレクトロポレーションによる、項目３８に記載の方法。
（項目４２） 前記細胞への前記構築物の導入が、リン酸カルシウムトランスフェクションによる、項目３８に記載の方法。
（項目４３） 目的のポリペプチドを産生する哺乳動物細胞株であって、該細胞株は、項目３８に記載の方法によって産生される、哺乳動物細胞株。
（発明の要旨）
１つの局面において、本発明は、発現ベクターであって、以下：（ａ）第１の不活化された（ｃｒｉｐｐｌｅｄ）選択マーカーをコードする、第１のポリヌクレオチド；（ｂ）目的の異種ポリペプチドをコードする、第２のポリヌクレオチド；および（ｃ）第２の増幅可能な選択マーカーをコードする、第３のポリヌクレオチドを含む、発現ベクターを提供する。適切な第１の選択マーカーとしては、１以上の不活化（ｃｒｉｐｐｌｉｎｇ）変異を含む抗生物質（例えば、ネオマイシン）耐性をコードする配列が挙げられる。１つの実施形態において、増幅可能な選択マーカーは、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｄｈｆｒ）である。
【０００７】
本発明はまた、以下の構築物を包含する：ｐＥＳＮ１ｄｈｆｒと称するプラスミド；ｐＥＳＮ２ｄｈｆｒと称するプラスミド；ｐＥＳＮ３ｄｈｆｒと称するプラスミド；ｐｎｅｏ*ｄｈｆｒ５’ｄｅｌと称するプラスミド（例えば、ｐｎｅｏ１ｄｈｆｒ５’ｄｅｌ、ｐｎｅｏ２ｄｈｆｒ５’ｄｅｌ、ｐｎｅｏ３ｄｈｆｒ５’ｄｅｌ）；およびｐｄｈｆｒ３’ｄｅｌと称するプラスミド。
【０００８】
別の局面において、本発明は、宿主細胞において目的のポリペプチドを産生するための方法であって、以下：
（ａ）本明細書中に記載の発現ベクターまたは構築物を適切な宿主細胞中に導入する工程；
（ｂ）前記第１および第２の選択マーカーを発現する宿主細胞を、安定に組み込まれた発現ベクターについて選択する条件下で、選択する工程；
（ｃ）該安定にトランスフェクトされた宿主細胞を、該目的のポリペプチドの発現を支持する条件下で、増殖させる工程；および
（ｄ）該目的のポリペプチドを単離する工程
を包含する、方法を包含する。
【０００９】
特定の実施形態において、異種ポリペプチドは、ウイルスタンパク質（例えば、ＨＩＶタンパク質）であるか、またはＣＡＢ２またはＣＡＢ４であり、そして宿主細胞は、哺乳動物細胞または昆虫細胞である。この方法を使用して目的のポリペプチドを産生する宿主細胞株もまた、本発明に含まれる。
【００１０】
別の局面において、本発明は、トランスフェクション系であって、以下：
（ａ）第１の構築物であって、適切な骨格中に、第１の選択マーカーをコードする配列および第２の選択マーカーをコードする配列を含み、該第２の選択マーカーは、そのコード配列中に少なくとも１つの不能化（ｄｉｓａｂｌｉｎｇ）変異を含む、第１の構築物；および
（ｂ）第２の構築物であって、適切な骨格中に、目的のポリヌクレオチド配列および第３の選択マーカーをコードする配列を含み、ここで、該第３の選択マーカーは、該第２の選択マーカーと同じ選択マーカーであるが、ただし、該第３の選択マーカーは、該第２の選択マーカー中の不能化変異とは異なるコード配列領域にある、少なくとも１つの不能化変異を含む、第２の構築物
を含む、トランスフェクション系を包含する。特定の実施形態において、第１の選択マーカーは、抗生物質耐性をコードし（例えば、野生型または機能的に損なわれたネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩをコードすることによって）、第２の選択マーカーは、５’コード領域における少なくとも１つの変異によって不能化されているｄｈｆｒをコードし、そして第３の選択マーカーは、３’コード領域における少なくとも１つの異なる変異によって不能化されているｄｈｆｒをコードする。この不能化変異は、例えば、点変異または欠失によるものであり得る。構築物が、プラスミドである場合、このトランスフェクション系は、以下：
（ｃ）それぞれ、前記第１および第２の選択マーカーならびに前記導入遺伝子に作動可能に連結されている、第１、第２および第３のプロモーター；
（ｄ）該第１および第２の選択マーカーならびに該導入遺伝子に作動可能に連結されている、ポリアデニル化部位をコードする配列；および
（ｅ）該第１および第２の選択マーカーならびに該導入遺伝子に作動可能に連結されている、複製起点をコードする配列
をさらに含み得る。ＣＭＶプロモーター、ＲＳＶプロモーターまたはＳＶ−４０初期プロモーターのようなプロモーターが、使用され得、そして各配列は、異なるプロモーターに作動可能に連結され得る。
【００１１】
別の局面において、本発明は、選択されたポリヌクレオチド配列の発現のための哺乳動物細胞株を産生するための方法を包含し、該方法は、以下：
（ａ）ゲノムを有する選択された哺乳動物細胞に、第１の構築物を導入する工程であって、該第１の構築物は、第１の選択マーカーをコードする配列および第２の選択マーカーをコードする配列を含み、該第２の選択マーカーは、そのコード配列中に少なくとも１つの不能化変異を含む、工程；
（ｂ）該第１の選択マーカーを発現する哺乳動物細胞について選択する工程であって、該第１の構築物は、該ゲノムに安定に組み込まれている、工程；
（ｃ）該哺乳動物細胞に、第２の構築物を導入する工程であって、該第２の構築物は、目的のポリヌクレオチド配列および第３の選択マーカーをコードする配列を含み、ここで、該第３の選択マーカーは、該第２の選択マーカーと同じ選択マーカーであるが、ただし、該第３の選択マーカーは、該第２の選択マーカー中の不能化変異とは異なるコード配列領域にある、少なくとも１つの不能化変異を含む、工程；および
（ｄ）該第２の選択マーカーによってコードされる機能的産物を発現する哺乳動物細胞について選択する工程であって、該機能的産物は、該第２の選択マーカーと該第３の選択マーカーとの間の組換え事象によって生じる配列によってコードされ、そして得られた哺乳動物細胞は、該選択されたポリヌクレオチド配列を発現し得る、工程
を包含する。特定の実施形態において、選択されたポリヌクレオチド配列は、ポリペプチドをコードし、そして選択されたポリヌクレオチド配列の発現は、このポリペプチドの発現を生じる。この方法によって産生された哺乳動物細胞もまた提供される。
【００１２】
別の局面において、本発明は、宿主哺乳動物細胞において目的のポリペプチドを産生するための方法を包含し、該方法は、以下：
（ａ）ゲノムを有する該細胞に、第１の構築物を導入する工程であって、該第１の構築物は、第１の選択マーカーをコードする配列および第２の選択マーカーをコードする配列を含み、該選択マーカーは、そのコード配列中に少なくとも１つの不能化変異を含む、工程；
（ｂ）該第１の選択マーカーを発現する哺乳動物細胞について選択する工程であって、該第１の構築物は、該ゲノムに安定に組み込まれている、工程；
（ｃ）該哺乳動物細胞に、第２の構築物を導入する工程であって、該第２の構築物は、目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列および第３の選択マーカーをコードする配列を含み、ここで、該第３の選択マーカーは、該第２の選択マーカーと同じ選択マーカーであるが、ただし、該第３の選択マーカーは、該第２の選択マーカー中の不能化変異とは異なるコード配列領域にある、少なくとも１つの不能化変異を含む、工程；
（ｄ）該第２の選択マーカーによってコードされる機能的産物を発現する哺乳動物細胞について選択する工程であって、該機能的産物は、該第２の選択マーカーと該第３の選択マーカーとの間の組換え事象によって生じる配列によってコードされ、そして得られた哺乳動物細胞は、該目的のポリペプチドを発現し得る、工程；および
該目的のポリペプチドを産生するような条件下で、該哺乳動物細胞を培養する工程
を包含する。
【００１３】
１つの実施形態において、第１の選択マーカーは、ネオマイシン耐性をコードし、そして第２および第３の選択マーカーは、ｄｈｆｒをコードする。特定の実施形態において、構築物は、エレクトロポレーションまたはリン酸カルシウムトランスフェクションによってこの細胞内に導入され得る。これらの方法に従って産生された哺乳動物細胞株もまた、包含される。
これらおよび他の実施形態は、本明細書の開示に顧みて当業者に容易に明らかである。
本発明は、以下の図面を参照してより十分に説明される。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１−１】図１は、ＣＡＢ２（配列番号３１）のヌクレオチド配列を示す。小文字は、元の配列を提示する。
【図１−２】 図１は、ＣＡＢ２（配列番号３１）のヌクレオチド配列を示す。小文字は、元の配列を提示する。
【図１−３】 図１は、ＣＡＢ２（配列番号３１）のヌクレオチド配列を示す。小文字は、元の配列を提示する。
【図２】図２は、ｐＥＳＮｄｈｆｒ、ｐＥＳＮ１ｄｈｆｒ、ｐＥＳＮ２ｄｈｆｒおよびｐＥＳＮ３ｄｈｆｒと命名された発現ベクターの模式図である。これらの発現ベクターは、Ｎｅｏ遺伝子の変異の位置および／または数において異なる。ｐＥＳＮｄｈｆｒは、野生型Ｎｅｏ配列を含む。ｐＥＳＮ１ｄｈｆｒは、Ｎｅｏ遺伝子産物のアミノ酸残基１８２を変更する変異を含む。ｐＥＳＮ２ｄｈｆｒは、Ｎｅｏ遺伝子産物のアミノ酸残基２６１を変更する変異を含み、そしてｐＥＳＮ３ｄｈｆｒは、Ｎｅｏ遺伝子産物のアミノ酸残基１８２および２６１の両方を変更する変異を含む。
【図３】図３は、ｐｃＤＮＡ３と命名された発現ベクターの模式図である。このベクターは、５４４６ヌクレオチドであり、そしてｐＵＣ１９ベクター骨格（塩基４４５０〜５３１０）において、以下の配列を含む：ＣＭＶプロモーター（塩基２０９〜８６３）；Ｔ７プロモーター（塩基８６４〜８８２）；ポリリンカー（塩基８８９〜９９４）、Ｓｐ６プロモーター（塩基９９９〜１０１６）；ＢＧＨポリＡ配列（塩基１０１８〜１２４９）；およびＳＶ４０プロモーター（塩基１７９０〜２２１５）；ＳＶ４０複製起点（塩基１９８４〜２０６９）；ネオマイシン耐性をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）（Ｎｅｏr）（塩基２１５１〜２９３２）；ＳＶ４０ポリＡ配列（塩基３１２０〜３２５０）；ならびにアンピシリン耐性をコードするＯＲＦ（Ａｍｐr）（塩基４４５０〜５３１０）。
【図４】図４は、ｐｎｅｏ*ｄｈｆｒ*１と命名されたＤＮＡ構築物の模式図である。これは、変異体ネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ*）および不能化ＤＨＦＲマーカー遺伝子を含み、ここで、ＸＸは、ＤＨＦＲ遺伝子における変異を表す。
【図５】図５は、ｐＸｄｈｆｒ*２と命名されたベクターを示す。これもまた、導入遺伝子および異なる部位（ＸＸによって示される）で変異された不能化されたＤＨＦＲ遺伝子を含む。
【図６】図６は、２つのコピーの不能化されたＤＨＦＲマーカー遺伝子での、ｐＸｄｈｆｒ*２とｐｎｅｏ*ｄｈｆｒ*１との間の相同組換えを示す。
【図７】図７は、相同組換えの産物を示し、ここで、不能化されたＤＨＦＲ遺伝子は、レスキューされ、そして導入遺伝子は、変異体ｎｅｏ*遺伝子に対して近位へのこの導入遺伝子の挿入によって、哺乳動物細胞ゲノムの高発現遺伝子座に配置されている。
【図８】図８は、ｐｄｈｆｒ*２ ＤＮＡ構築物を示す；導入遺伝子（例えば、組換えタンパク質遺伝子）を、ｐｄｈｆｒ*２のポリリンカーに挿入し、ｐＸｄｈｆｒ*２を作製し得る。
【図９】図９は、選択スキームを示し、ここで、ｐｄｈｆｒ３’ｄｅｌとして示されるＤＮＡ構築物は、ＤＨＦＲ遺伝子の欠失変異体を使用し、そしてポリリンカーへの導入遺伝子の挿入が、ｐＸｄｈｆｒ３’ｄｅｌと命名された構築物（例えば、ｐｄｈｆｒ３’ｄｅｌ）を形成する。
【図１０】図１０は、ＤＮＡ構築物、ｐｎｅｏ*ｄｈｆｒ５’ｄｅｌ（例えば、ｐｎｅｏ１ｄｈｆｒ５’ｄｅｌ、ｐｎｅｏ２ｄｈｆｒ５’ｄｅｌ、ｐｎｅｏ３ｄｈｆｒ５’ｄｅｌ）を示す。ここで、ＤＨＦＲ遺伝子は、５’欠失によって不能化され、そしてこの不能化された遺伝子は、変異体*ｎｅｏ遺伝子に共有結合されている。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
（詳細な説明）
本発明は、宿主細胞、特に哺乳動物細胞において、目的のポリペプチドの安定な高レベル発現を可能にする新規発現ベクターを提供する。この構築物は、（ｉ）第１の選択マーカーをコードする第１の配列；（ｉｉ）目的のポリペプチド産物をコードする第２の配列（例えば、「導入遺伝子」）；（ｉｉｉ）第２の選択マーカーをコードする第３の配列を含む。代表的には、これら３つの配列は、少なくとも１つの強力プロモーター（例えば、ＣＭＶプロモーター）に作動可能に連結され、目的の産物の発現を増加し、そして正確なスプライシングを促進する。
【００１６】
本発明はまた、本明細書に記載の構築物を用いる哺乳動物細胞のためのトランスフェクション系を含む。この系は、各構築物が第２の選択マーカー中に不能化（ｄｉｓａｂｌｉｎｇ）変異を有しているが、上記のような第１および第２の構築物を用いる。不能化変異は、第２の選択マーカーの異なる領域中にあり、その結果、この２つの産物間の相同的組換えが機能的産物を生成する。この系は、所望のポリペプチドの高発現を可能にする。本明細書に記載のトランスフェクション系により改変される哺乳動物細胞がまた提供され、これらのトランスフェクトされた細胞を作製する方法もまた提供される。
【００１７】
従って、本明細書に記載の発明は、哺乳動物細胞中の高発現遺伝子座の同定という退屈なプロセスをなくし、そしてそれによって任意の所望のポリペプチドが、本明細書に記載のように生成される新規細胞株を用いて高レベルで発現され得る効率的な機構を提供する。
【００１８】
（定義）
「核酸」分子は、制限されないで、原核生物配列、真核生物ｍＲＮＡ、真核生物ｍＲＮＡからのｃＤＮＡ、真核生物（例えば、哺乳動物）ＤＮＡからのゲノムＤＮＡ配列、および合成ＤＮＡ配列もさえ含む。この用語はまた、ＤＮＡおよびＲＮＡの任意の公知の塩基アナログを含む配列を捕捉する。「コード配列」または選択されたポリペプチドを「コード」する配列は、適切な調節配列（または「制御エレメント」）の制御下に配置されたとき、インビボでポリペプチドに転写され（ＤＮＡの場合）そして翻訳される（ｍＲＮＡの場合）核酸分子である。このコード配列の境界は、５’（アミノ）末端にある開始コドンおよび３’（カルボキシ）末端にある翻訳停止コドンにより決定される。コード配列は、制限されないで、ウイルス、原核生物または真核生物ｍＲＮＡからのｃＤＮＡ、ウイルスまたは原核生物ＤＮＡからのゲノムＤＮＡ配列、および合成ＤＮＡ配列さえも含み得る。転写終結コドンは、このコード配列の３’に位置し得る。
【００１９】
代表的な「制御エレメント」は、制限されないで、転写プロモーター、転写エンハンサーエレメント，転写停止シグナル、ポリアデニル化配列（翻訳停止コドンの３’に位置する）、翻訳の開始の最適化のための配列（コード配列の５’に位置する）、および翻訳終止配列を含む。
【００２０】
「作動可能に連結（される）」は、そのように記載された成分がそれらの通常の機能を実行するように構成されるエレメントの配置をいう。従って、コード配列に作動可能に連結された所定のプロモーターは、適切な酵素が存在するとき、コード配列の発現を行い得る。このプロモーターは、それが、その発現を行うように機能する限り、コード配列と連続する必要はない。従って、例えば、介在する非翻訳ではあるがなお転写される配列が、プロモーター配列とコード配列との間に存在し得、そしてこのプロモーター配列はなお、コード配列に「作動可能に連結される」と考えられ得る。
【００２１】
本明細書で核酸分子を記載するために用いられるような「組換え（体）」は、ゲノム、ｃＤＮＡ，半合成、または合成起源のポリヌクレオチドを意味し、それは、その起源または操作のため：（１）天然でそれが会合しているポリヌクレオチドの全てまたは部分と会合していない；および／または（２）天然でそれが連結しているポリヌクレオチド以外のポリヌレレオチドに連結されている。タンパク質またはポペプチドに関して用いられるとき、用語「組換え（体）」は、組換え体ポリヌクレオチドの発現により産生されるポリペプチドを意味する。「組換宿主細胞」、「宿主細胞」、「細胞」、「細胞株」、「細胞培養」、およびその他のそのような用語は、原核微生物または単細胞実体として培養された真核生物細胞株を示し、交換可能に用いられ、そして組換えベクターまたはその他の移入ＤＮＡのレシピエントとして使用され得る、または使用された細胞をいい、そしてトランスフェクトされた当初の細胞の子孫を含む。１つの親細胞の子孫が、偶発的または意図的な変異に起因して、当初の親と形態においてまたは総ＤＮＡ相補物において必ずしも完全に同一である必要のないことは理解される。所望のポリペプチドをコードする核酸配列の存在のような、関係ある性質によって特徴付けられる、親と十分に類似である親細胞の子孫は、この定義により意図される子孫に含まれ、そして上記の用語によってカバーされる。
【００２２】
核酸およびアミノ酸「配列同一性」を決定する技法は当該分野で公知である。代表的には、このような技法は、遺伝子のｍＲＮＡのヌクレオチド配列を決定することおよび／またはそれによってコードされるアミノ酸配列を決定すること、およびこれらの配列を第２のヌクレオチドまたはアミノ酸配列と比較することを含む。一般に「同一性」は、２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の、それぞれ、正確なヌクレオチド対ヌクレオチドおよびアミノ酸対アミノ酸対応をいう。２つ以上の配列（ポリヌクレオチドまたはアミノ酸）は、それらの「同一性％」を決定することにより比較され得る。２つの配列の同一性％は、核酸またはアミノ酸配列いずれにおいても、より短い配列の長さで除し、そして１００を乗じた、２つのアラインされた配列間の正確なマッチの数である。核酸配列の適切なアラインメントは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ ２：４８２−４８９（１９８１）の局所相同性アルゴリズムにより提供される。このアルゴリズムは、Ｄａｙｈｏｆｆ、Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ編、５ ｓｕｐｐｌ．３：３５３−３５８、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、Ｄ．Ｃ．、ＵＳＡにより開発され、そしてＧｒｉｂｓｋｏｖ、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４（６）：６７４５−６７６３（１９８６）により規準化されたスコアリングマトリックスを用いることによりアミノ酸に適用され得る。配列の同一性％を決定するためのこのアルゴリズムの例示の履行は、「ＢｅｓｔＦｉｔ」ユーティリティアプリケーション中のＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）により提供される。この方法のデフォールトパラメーターは、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ Ｐｒｏｇｒａｍ Ｍａｎｕａｌ、Ｖｅｒｓｉｏｎ ８（１９９５）に記載されている（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩから入手可能）。本発明の文脈において同一性％を確立する好適な方法は、Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ大学が著作権をもつ、Ｊｏｈｎ Ｆ．ＣｏｌｌｉｎｓおよびＳｈａｎｅ
Ｓ．Ｓｔｕｒｒｏｋにより開発され、そしてＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）により頒布されるプログラムのＭＰＳＲＣＨパッケージを用いることである。このパッケージスーツから、上記Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムが採用され得、そこでは、デフォールトパラメーターがスコアリングテーブルのために用いられる（例えば、１２のギャップオープンペナルティ、１のギャップ伸長ペナルティ、および６のギャップ）。生成されたデータから「マッチ」値は「配列同一性」を反映する。配列間の同一性％または類似性％を算出するためのその他の適切なプログラムは、一般に、当該分野で公知である。
【００２３】
２つの核酸フラグメントは、本明細書で記載のように「選択的にハイブリダイズする」と考えられる。２つの核酸分子間の配列同一性の程度は、このような分子間のハイブリダイゼーション事象の効率および強さに影響する。部分的に同一である核酸配列は、完全に同一である配列の標的分子へのハイブリダイゼーションを少なくとも部分的に阻害する。この完全に同一である配列のハイブリダイゼーションの阻害は、当該分野で周知であるハイブリダイゼーションアッセイ（例えば、サザンブロット、ノザンブロット、溶液ハイブリダイゼーションなど、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前述、またはＡｕｓｕｂｅｌら、前述）を用いて評価され得る。このようなアッセイは、変化する程度の選択性を用い、例えば、低〜高ストリンジェンシーで変化する条件を用いて実施され得る。低ストリンジェンシーの条件が採用される場合、非特異的結合の不在は、配列同一性の部分的程度でさえ欠いている第２プローブ（例えば、標的分子と約３０％より少ない配列同一性を有すプローブ）を用いることで評価することができ、その結果、非特異的事象の不在下、この第２プローブは標的にハイブリダイズしない。
【００２４】
ハイブリダイゼーションを基礎にする検出系を利用するとき、標的核酸配列に相補的である核酸プローブが選択され、次いで、適切な条件の選択により、このプローブと標的配列とが、互いに「選択的にハイブリダイズする」、すなわちは結合し、ハイブリッド分子を形成する。「中程度にストリンジェント」下で標的配列に選択的にハイブリダイズし得る核酸分子は、代表的には、選択された核酸プローブの配列と、少なくとも約７０％の配列同一性を有する長さが少なくとも約１０−１４ヌクレオチドの標的核酸配列の検出を可能にする条件下でハイブリダイズする。ストリンジェントハイブリダイゼーション条件は、代表的には、選択された核酸プロープの配列と、約９０−９５％より大きい配列同一性を有する長さが少なくとも約１０−１４ヌクレオチドの標的核酸配列の検出を可能にする。プローブと標的とが所定の程度の配列同一性を有する場合のプローブ／標的ハイブリダイゼーションに有用なハイブリダイゼーション条件は、当該分野で公知のように決定され得る（例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、編者 Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ（１９８５）Ｏｘｆｏｒｄ；Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、Ｄ．Ｃ；ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓを参照のこと）。
【００２５】
ハイブリダイゼーションのストリンジェンシー条件に関し、例えば、以下の因子を変更することによって、特定のストリンジェンシーを確立するために多くの等価な条件が採用され得ることは当該分野で周知である：プローブおよび標的配列の長さおよび性質、種々の配列の塩基組成、塩およびその他のハイブリダイゼーション溶液成分の濃度、ハイブリダイゼーション溶液中のブロッキング薬剤の存在または不在（例えば、ホルムアミド、硫酸デキストラン、およびポリエチレングリコール）、ハイブリダイゼーション温度および時間パラメーター、および、洗浄条件を変えること。特定のセットのハイブリダイゼーション条件の選択は、当該分野で標準的な方法に従って選択される（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前述、またはＡｕｓｕｂｅｌら、前述を参照のこと）。
【００２６】
第１のポリヌクレオチドは、それが第２のポリヌクレオチドの領域、そのｃＤＮＡ、その相補物と同じか、または実質的に同じ塩基対配列を有する場合、またはそれが上記のような配列同一性を提示する場合、第２のポリヌクレオチド「由来」である。第１のポリペプチドは、それが（ｉ）第２のポリヌクレオチド由来の第１のポリヌクレオチドによりコードされるか、または（ｉｉ）上記のように第２のポリペプチドに対し配列同一性を提示する場合、第２のポリペプチドに「由来」する。
【００２７】
「によりコードされる」は、ポリペプチド配列をコードする核酸配列をいい、ここでこのポリペプチド配列またはその部分は、この核酸配列によりコードされるポリペプチドからの、少なくとも３〜５アミノ酸、より好ましくは少なくとも８〜１０アミノ酸、そしてなおより好ましくは少なくとも１５〜２０アミノ酸を含む。これもまた包含されるのは、この配列によりコードされるポリペプチドと免疫学的に同定可能であるポリペプチド配列である。
【００２８】
「精製されたポリヌクレオド」は、それが天然に会合するタンパク質が本質的にない、例えば、約５０％より少なく、好ましくは約７０％より少なく、そしてより好ましくは約９０％より少なく含む、目的のポリヌクレオチドまたはそのフラグメントをいう。目的のポリヌクレオドを精製する技法は、当該分野で周知であり、そして例えば、このポリヌクレオドを含む細胞のカオトロピック試薬を用いた破壊、およびイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーおよび密度による沈降によるポリヌクレオドおよびタンパク質の分離を含む。
【００２９】
用語「トランスフェクション」は、細胞による外来ＤＮＡの取込みをいうために用いる。外来ＤＮＡが細胞膜の内側に導入されたとき、細胞は「トランスフェクトされ」ている。多くのトランスフェクション技法が一般に当該分野で公知である。例えば、Ｇｒａｈａｍら（１９７３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、５２：４５６、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｏｒｉｅｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｄａｖｉｓら（１９８６）Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、およびＣｈｕら（１９８１）Ｇｅｎｅ １３：１９７を参照のこと。このような技法は、１つ以上の外来ＤＮＡ成分を適切な宿主細胞中に導入するために用いられ得る。この用語は、遺伝子物質の安定および一時的取込みの両方をいい、そしてペプチド−または抗体連結ＤＮＡの取込みを含む。
【００３０】
「核酸発現ベクター」または「発現カセット」は、目的の配列または遺伝子の発現を行い得るアセンブリをいう。この核酸発現ベクターは、目的の配列または遺伝子（単数または複数）に作動可能に連結されているプロモーターを含む。その他の制御エレメントが同様に存在し得る。本明細書で記載される発現カセットは、プラスミド構築物内に含まれる得る。発現カセットの成分に加えて、プラスミド構築物はまた、細菌の複製起点、１つ以上の選択マーカー、プラスミド構築物を一本鎖ＤＮＡとして存在させるシグナル（例えば、複製のＭ１３起点）、複数クローニング部位、および「哺乳動物」複製起点（例えば、複製のＳＶ４０またはアデノウイルス起点）を含み得る。ベクター骨格は、さらに詳細に以下に論議される。「ベクター」は、標的細胞（例えば、ウイルスベクター、非ウイルスベクター、粒子状キャリア、およびリポソーム）に遺伝子配列を移入し得る。代表的には、「ベクター構築物」、「発現ベクター」、および「遺伝子移入ベクター」は、目的の遺伝子の発現を行い得る任意の核酸構築物を意味し、そしてこれは、標的細胞に遺伝子配列を移入し得る。従って、この用語は、クローニングおよび発現ビヒクル、ならびにウイルスベクターを含む。
【００３１】
「選択マーカー」または「レポーターマーカー」は、治療的活性を有さず、むしろ遺伝子移入ベクターのより簡単な調製、操作、特徴付けまたは試験を可能にするために含まれる遺伝子移入ベクター中に含まれるヌクレオチド配列をいう。適切な選択マーカーは以下にさらに論議される。
【００３２】
（発現ベクター）
１つの実施形態では、発現ベクターは、（ｉ）第１の不活化された選択マーカー；（ｉｉ）目的の産物、「導入遺伝子」とも呼ばれる；および（ｉｉｉ）第２の増幅可能な選択マーカーをコードするポリヌクレオチドを含む。「不活化された（ｃｒｉｐｐｌｅｄ）」とは、マーカーの機能を減退させるが破壊しない１つ以上の変異を含む、選択マーカーをコードする配列を意味する。１つの実施形態では、第１の不活化された選択マーカーは、ネオマイシン耐性（Ｎｅｏr）配列であり、そこでは、アミノ酸残基１８２（Ｇｌｕ）がＡｓｐに変異している（図２、ｐＥＳＮ１．ｄｈｆｒおよびＹａｎｏｆｓｋｙら、後述を参照のこと）。別の実施形態では、第１の不活化された選択マーカーは、Ｎｅｏr配列であり、そこではアミノ酸残基２６１（Ａｓｐ）がＡｓｎ（Ｎ）に変異されている。（図２、ｐＥＳＮ２．ｄｈｆｒ）。なお別の実施形態では、第１の不活化された選択マーカーは、上記に記載変異の両方を含むＮｅｏr配列であり、例えば、Ｇｌｕ１８２がＡｓｐ、そしてＡｓｐ２６１がＳｎである。（図２、ｐＥＳＮ３，ｄｈｆｒを参照のこと）。不活化変異を作製および試験するその他の選択マーカーおよび方法は、以下に論議される。
【００３３】
発現ベクターにまた含まれるのは、目的の産物をコードする配列（すなわち、「導入遺伝子」）である。適切な導入遺伝子は、目的の任意のポリペプチドをコードするポリペプチドを含む。１つの実施形態では、この導入遺伝子は「ＣＡＢ」のようなキメラタンパク質をコードする。ＣＡＢは、膜補因子タンパク質（ＭＴＰ）および減衰加速因子（ＳＡＦ）の特徴を組み合わせ、補体活性化を阻害する。例えば、Ｈｉｇｇｉｎｓら（１９９７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １５８（６）：２８７２−２８８１を参照のこと。特定の実施形態では、導入遺伝子をコードする配列はまた、本明細書に記載のように、産物の異常ｍＲＮＡスプライシングが減少またはなくなるように設計され得る。
【００３４】
発現ベクターはまた、第２の選択可能な増幅し得るマーカーを含む。この第２の選択し得るマーカーは、導入遺伝子を高レベルで発現するような細胞の選択を容易にする、例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）である。適切なマーカーは詳細に以下に論議される。
【００３５】
本発明の発現ベクターは、当該分野で公知の技法を考慮して、本明細書の教示に従い生成され得る。例えば、導入遺伝子をコードする配列は、市販されているかも知れず、例えば、グリーン蛍光タンパク質（Ｇ．Ｐ．）は、Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡから入手可能であり、そしてルシファース（ｌｕｃｉｆｅｒｓ）は、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ．から入手可能である。本明細書で例示されるのは、キメラタンパク質ＣＡＢの高レベル発現およびＨＩＶタンパク質の発現を行う発現ベクターである。しかし、本発明の発現ベクター、構築物および方法が、目的の任意のポリペプチドの高レベル発現に利用可能であることを理解すべきである。
【００３６】
本発明で用いられるポリヌクレオチドの別の標準的な供給源は、勿論、生物（例えば、細菌）、細胞、または選択された組織から単離されるポリヌクレオチドである。選択された供給源からの核酸は、標準的な手順により単離され得、これは、代表的には、連続的なフェノールおよびフェノール／クロロホルム抽出、次いでエタノール沈殿を含む。沈殿後、ポリヌクレオチドは、核酸分子をフラグメントに切断する制限エンドヌクレアーゼで処理され得る。選択されたサイズのフラグメントは、多くの技法により分離され得、これには、アガロースまたはポリアクリルアミドゲル電気泳動またはパルスフィールドゲル電気泳動（Ｃａｒｅら（１９８４）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１２：５６４７−５６６４；Ｃｈｕら（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３４：１５８２；Ｓｍｉｔｈら（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １５１：４６１）が含まれ、クローニングのための適切なサイズ開始物質を提供する。
【００３７】
発現ベクターまたは構築物のヌクレオチド成分を得る別の方法はＰＣＲである。ＰＣＲの一般的手順は、ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎら、ＰＣＲ：Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＡＰＰＲＯＡＣＨ、（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、（１９９１））に教示されている。各適用反応のためのＰＣＲ条件は、実験的に決定され得る。多くのパラメーターが反応の成功に影響する。これらのパラメーターは、アニーリング温度および時間、伸長時間、Ｍｇ2+およびＡＴＰ濃度、ｐＨ、およびプライマー、テンプレートおよびデオキシヌクレオチドの相対的濃度である。例示のプライマーは実施例で以下に記載する。増幅後、得られるフラグメントは、アガロースゲル電気泳動、次いで臭化エチジウム染色および紫外線照射を用いた可視化により検出され得る。
【００３８】
ポリヌクレオチドを得るための別の方法は、酵素消化による。例えば、ヌクレオチド配列は、適切な認識制限酵素での適切なベクターの消化により生成され得る。制限切断フラグメントは、標準的な技法を用い、４つのデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）の存在下、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｋｌｅｎｏｗ）の大フラグメントを用いた処理により平滑末端とされ得る。
【００３９】
ポリヌクレオチドは、当該分野で周知の方法を用い、適切な骨格、例えば、プラスミド中に挿入される。例えば、挿入物およびベクターＤＮＡを、適切な条件下で制限酵素と接触させ、互いに対合し得る各分子上に相補的末端または平滑末端を作製し得る。あるいは、合成の核酸リンカーをポリヌクレオチドの末端に連結し得る。これらの合成リンカーは、ベクターＤＮＡ内の特定の制限部位に対応する核酸配列を含み得る。その他の手段が当該分野で公知かつ利用可能である。種々の供給源が、成分ポリヌクレオチドのために用いられる得る。
【００４０】
（トランスフェクション系のための構築物）
本発明はまた、第１および第２の構築物を用いること、特に、安定にトランスフェクトされた細胞株、特に哺乳動物細胞株を産生および選択する方法を含む。本明細書に記載のトランスフェクション系では、第１の構築物は、第１および第２の選択マーカーをコードするポリヌクレオチドを含む。第１の選択マーカーは、代表的には、強力プロモーターの制御下にある。上記のように、この第１の選択マーカーは、好ましくは、少なくとも１つの不活化変異を含む。さらに、これらの実施形態では、第２のマーカーは、好ましくは、コード領域の３’または５’にある不能化変異を含む。「不能化（ｄｉｓａｂｌｉｎｇ）」により、機能的遺伝子産物を低減、または好ましくは、排除する変異を意味する。
【００４１】
例示の第１の構築物は図４に示され、そしてｐｎｅｏ*ｄｈｆｒ*１と識別される。この構築物によりコードされる第１の選択マーカーは、ネオマイシンに対する耐性を与える抗生物質耐性マーカー（ｎｅｏ*）、好ましくは、図中ｎｅｏ*で示される、ｎｅｏの不活化変異体である。このｎｅｏ*遺伝子は、強力プロモーター（例えば、ＣＭＶまたはＲＳＶ、ｎｅｏ*遺伝子の３’に示される）に作動可能に連結され、そして、一般に、ポリアデニル化配列（例えば、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化部位）のようなその他の発現調節エレメントに連結され得る。さらに、微生物における増殖に有用な複製起点もまた含まれ得る（例えば、ｆ１ ｏｒｉ）。このＢＧＨポリＡ配列およびｆ１起点は、代表的には、ｎｅｏ*遺伝子の５’にある。
【００４２】
この例では、ｐｎｅｏ*ｄｈｆｒ*１構築物の第２の選択マーカーは、例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）をコードする。しかし、この第２の選択―カーの機能は不能化されている。図４を参照して、ＸＸは、ＤＨＦＲ遺伝子の５’末端に隣接する不能化変異を表す。このＤＨＦＲ遺伝子は、ＳＶ４０初期プロモーターにより駆動され、そしてその３’末端に、ＳＶ４０ポリＡ、ＣｏｌＥ１、ＡｍｐＲ、および（図４に示されるＢｇｌＩＩＩのような）適切な制限部位がある。
【００４３】
このトランスフェクション系の第２のベクター構築物は、目的の異質ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（図では「導入遺伝子」と標識される）、および第１の構築物で用いられる同じ第２のマーカー（即ち、「第２の」選択マーカー）をコードするポリヌクレオチドを含む。しかし、この第２の構築物では、第２のマーカー配列は、好ましくはコード領域の反対の末端上にあり、第１の構築物に対して異なる位置にある不能化変異を含む。第１の構築物の第２の選択マーカーにおける不能化変異の位置、および第２の構築物の選択マーカーにおける不能化変異における位置は、２つのコピーのコード配列間の単一の組換え事象が、機能的な選択マーカーを生成し得るようにある。一旦、第１の構築物が宿主細胞のゲノム中にランダムに組込まれると、組込まれた第１の構築物と第２の構築物との間の相同的組換え事象が、強力プロモーターの制御下にある導入遺伝子の挿入を生じる。機能的な組換えは、第２の選択マーカーをアッセイすることにより容易に選択され得る。従って、例えば、Ｄｅｔｌｏｆｆら（１９９４）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １４：３９３６−６９４１に記載のような、その他の標的系とは異なり、本明細書に記載のトランスフェクション系は、目的の導入遺伝子を改変する相同的組換え事象に依存しない。
【００４４】
例示の第２の構築物は図５に示され、そしてｐＸｄｈｆｒ*２と称される。ここで、導入遺伝子は、ＣＭＶプロモーターに作動可能に連結され、そして３’ＢＧＨポリＡテールおよびｆ１複製起点を含む。第２の選択マーカーであるＤＨＦＲは、第１の構築物における不能化マーカーとはコード領域の反対側にある変異（単数または複数）により不能化されている。従って、図５では、変異（ＸＸで表される）は、ＤＨＦＲ配列の３’末端にある。ｐｎｅｏ*ｄｈｆｒ*１構築物におけるように、この不能化ＤＨＦＲマーカーには、ＳＶ４０ポリＡ、ＣｏｌＥ１、ＡｍｐＲ、およびこの場合ＢｇｌＩＩＩである適合制限部位が続く。
【００４５】
トランスフェクション系における使用のための第１および第２の構築物は、当該分野で公知の方法を用い、例えば、上記のような本明細書の指針に従って生成され得る。
【００４６】
（一般的方法）
本明細書中に記載される発現ベクターおよび方法は、目的の導入遺伝子の発現の改善に有用である。哺乳動物細胞における遺伝子の安定した高レベルの発現は、重要なことに、組み込みの部位およびコピー数の両方に依存する。例えば、通常の濃度のネオマイシンアナログＧ４１８によって課せられる選択圧は、低く、広範な異なる発現レベルで細胞クローンを生じる。導入遺伝子を有する異常なスプライス部位もまた、発現を妨げ得る。本明細書中に記載される発現ベクターは、目的の導入遺伝子に作動可能に連結された不活化された第１の選択可能なマーカー、および第２の増幅可能で選択可能なマーカー（これは、特定の実施形態において、不能化変異を含む）を使用することによって、この課題および他の課題を解決する。不活化マーカーおよび第２のマーカーは、高発現クローンの選択を可能にする。さらに、発現は、異常切断（ｓｌｉｃｉｎｇ）が矯正されるように、導入遺伝子を変更することによって増加され得る。必要に応じて、イントロンおよび／またはエンハンサーを含む強力なプロモーターもまた、導入遺伝子の発現を促進するために付加され得る。
【００４７】
本発明はまた、第１および第２の構築物を使用する、新規なトランスフェクション系を提供する。これらの高度に効率的な方法は、高レベルの所望されるポリペプチドを産生する細胞を生成し得る。細胞は、標的細胞ゲノムにランダムに組み込まれる第１の構築物を用いて形質転換される。代表的な標的細胞として、哺乳動物および細胞株（例えば、ＢＨＫ、ＶＥＲＯ、ＨＴ１０８０、２９３、ＲＤ、ＣＯＳ−７、およびＣＨＯ細胞）が挙げられるが、これらに限定されない。これらの細胞は、第１の選択可能なマーカーに対する適切な基質の存在下（例えば、第１の選択可能なマーカーがネオマイシンをコードする場合には、Ｇ４１８）で増殖される。高濃度の抗生物質中での選択を生存する細胞は、高発現遺伝子座においてネオマイシン耐性遺伝子を組み込んでいる。
【００４８】
次いで、組み込まれた第１の構築物を有する細胞は、以下の技術によって、本発明の細胞株を作製するために使用される。第２の構築物は、第１の構築物の組み込まれたコピーを有する細胞内に導入される。２個の不能化されたＤＨＦＲ遺伝子間の相同組換えは、機能的ＤＨＦＲ遺伝子、ならびに高発現遺伝子座における機能的ポリペプチドをコードする所望の遺伝子の挿入を生じる（図７を参照のこと）。適切な毒素または抗生物質（例えば、メトトレキセート）を用いて選択を生存する細胞株は、首尾良く相同組換えを起こす。
【００４９】
第２の工程は、目的のポリペプチドの高レベルの発現を得るために、機能的ポリペプチドをコードする所望される遺伝子（すなわち、導入遺伝子）における、任意の回数の変更によって繰り返され得る。本明細書中で、この技術は、図を参照してより詳細に記載される。
【００５０】
（導入遺伝子）
本明細書中に記載されるトランスフェクション系は、目的の任意のポリペプチドを発現するのに有用である。本明細書中で使用される場合、用語「導入遺伝子」は、細胞における高レベルでの発現が所望される、哺乳動物細胞のゲノムに挿入される外因性ＤＮＡをいう。本発明に使用される導入遺伝子は、機能的ポリペプチドをコードし、これは、生物学的活性を有するアミノ酸配列であり、または生物学的活性を有するタンパク質の前駆体であるアミノ酸配列である。他のポリペプチド（例えば、エピトープまたは他の免疫学的に活性なポリペプチド）の発現は本発明の範囲内であると考えられるが、この導入遺伝子は、一般的に、天然タンパク質または組換えタンパク質をコードする。本発明の方法を使用して発現され得るタンパク質の例は、ホルモン；サイトカイン（例えば、増殖因子）；酵素；レセプター；オンコジーン；ポリペプチドワクチン、ウイルスタンパク質、ならびに構造タンパク質および分泌タンパク質である。１実施形態において、発現ベクターは、上記のＣＡＢ２をコードする配列を含む。これらの配列は、異常スプライシングが補正されるようにさらに改変された。実施例を参照のこと。別の実施形態において、発現ベクターは、特にＨＩＶから誘導体化されるウイルスポリペプチドをコードする配列を含む。これらのウイルスポリペプチドとして、エンベロープ（Ｅｎｖ）ポリペプチド（例えば、ｇｐ１２０、ｇｐ１６０、ｇｐ１４０、ｇｐ４１、およびモノマーまたはそれらの多量体）、Ｇａｇポリペプチド（例えば、Ｇａｇ、Ｇａｇ−プロテアーゼ、Ｇａｇ−ポリメラーゼ）、ｒｅｖ、ｔａｔなどが挙げられるが、これらに限定されない。さらに、この発現ベクターは、合成ＨＩＶポリペプチドについてコードする導入遺伝子（例えば、実施例に記載される構築物）を含み得る。
【００５１】
本発明の構築物において使用される導入遺伝子は、イントロン領域を保持するクローン化された配列であり得る。遺伝子のエキソン構造体が公知である場合、コードエキソンはこの構造体に挿入され得る。
【００５２】
目的のポリペプチドの発現は、ポリペプチドをコードする配列に対して相同性のあるプロモーターによって指向され得る（例えば、それ自体の転写プロモーター配列の制御下におけるヒトグルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ）。さらに、他の相同性または非相同性の発現制御要素（例えば、転写、翻訳、または翻訳後の事象に影響を及ぼす）が使用され得る。
【００５３】
本発明の哺乳動物細胞における導入遺伝子の発現が安定または一過性であり得ることが理解されるべきである。通常のレベルより高いレベルでの一過性発現でさえ、細胞中の機能的研究、または目的のタンパク質の産生および回復に有用である。
【００５４】
（選択マーカー）
選択マーカーをコードする任意の適切な配列は、本明細書において記載される組成物および方法において第１または第２のマーカーとして使用され得る。代表的には、本発明において使用される選択マーカー遺伝子は、容易に入手可能な供給源から入手され得る。
【００５５】
本発明の１つの実施形態において（付随する図面において記載される）、第１の選択マーカーは、抗生物質に耐性を付与する遺伝子をコードする。たとえば、１つの局面において、この第１の選択マーカーは、ネオマイシン（ｎｅｏ）耐性遺伝子を含む。好ましい実施形態において、ｎｅｏ*と称される、変異体ｎｅｏ遺伝子を使用して、哺乳動物細胞の染色体ＤＮＡ内の高発現の遺伝子座を確立することができる（例えば、以下を参照のこと：Ｙａｎｏｆｓｋｙ ｅｔ ａｌ．９（１９９０）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８７：３４３５−３９）。トランスポゾンＴｎ５のネオマイシン耐性遺伝子は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩをコードし、これは、Ｇ４１８およびカナマイシンを含む種々の抗生物質に対する耐性を付与する。単一塩基置換は、この酵素の機能を有意に損なう。選択マーカーとして使用されるｎｅｏ耐性遺伝子は、制限酵素消化によって同定され得る。なぜなら、塩基変化は、ＸｈｏＩＩ制限部位の喪失を生じるからである。本発明において使用するための変異体ｎｅｏ遺伝子を作製する技術について、以下もまた参照のこと：Ｂｌａｚｑｕｅｚｅｔ ａｌ．，（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，（２９９１）５（６）：１５１１−１５１８）。基質（例えば、Ｇ４１８）の最適な量は、各々の細胞下部について個々に決定され得る。他の類似の選択マーカーとしては、以下に列挙されるものがあげられるがそれらに限定されない。
【００５６】
温度感受性選択マーカーもまた、本発明の実施において使用され得る。例えば、温度感受性ｎｅｏは、非ストリンジェント温度においてほぼ野生型の機能を呈し、そしてストリンジェント温度では、低い活性を有する。エレクトロポレーションおよびｐｎｅｏ*ｔｓ−ｄｈｆｒ*ｌの初期の選択の後、挿入は、Ｇ４１８を非ストリンジェントな温度で用いて行われ得る。コロニーが増殖し始めた後、ストリンジェントな温度を使用して、低い発現挿入を有するコロニーを殺傷して除き得る。
【００５７】
上記のように、第２の選択マーカーを、含ませて発現を増強する。発現ベクターにおいて、第２のマーカーは、代表的に、増幅可能なマーカーであり、例えば、ＤＨＦＲである。ＤＨＦＲは、プリン生合成に必要である。敏感なプリンの非存在下で、この酵素は、増殖に必要である。メトトレキサートは、ＤＨＦＲの強力な競合インヒビターであり、漸増濃度のメトトレキサートにより、ＤＨＦＲの増加したレベルを発現する細胞についての選択を行う。極度に高レベルの、トランスフェクトされた正常ＤＨＦＲ遺伝子の発現は、高い内因性ＤＨＦＲレベルを伴う細胞株の選択に必要である。さらにより高いレベルへ発現を増加させるために、導入遺伝子を、標準的なＤＨＦＲ増幅方法により増幅し得る。
【００５８】
トランスフェクション方法において使用される構築物について、第２の選択マーカーは、請求されたトランスフェクション系の第１の構築物および第２の構築物の両方において見出される。しかし、これらのコピーの第２の選択マーカーは、異なる領域において変異によって不能化されている。これらの変異は、２つの変異したコピーの間の相同組換えが遺伝子の機能をレスキューするように存在する。１つの実施形態において、第２の（不能化された）選択マーカーは、ＤＨＦＲをコードする。
【００５９】
第１の構築物および第２の構築物の第２の選択マーカーに対する不能化変異は、種々の方法により導入され得る。例えば、ＤＨＦＲ遺伝子または他のマーカー遺伝子は、ネイティブ遺伝子配列におけるヌクレオチドの欠失またはヌクレオチドの置換によって不能化され得る。Ｂｕｌｌｅｒｊａｈｎ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．ｏｆ Ｂｉｏ Ｃｈｅｍ．（１９９２）２６７：８６４−８７０）は、残基の欠失および／または置換によってジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＭＭ）酵素の活性がどのように影響を受けるかの概説を提供する。著者らは、重要な領域における欠失を記載した（変更された遺伝子を発現することによって達成された）。これは、アミノ酸の欠失の後の、完全な活性の喪失を伴う活性の低減を生じる。さらに、メトトレキサートに耐性である酵素をコードする変異体ＤＨＦＲ遺伝子も入手可能である（Ｓｉｍｏｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８３）ＰＮＡＳ ＵＳＡ
８０：２４９５−２４９９）。
【００６０】
いくつかの場合において、第２の選択マーカー（例えば、ＤＨＦＲ）をコードする遺伝子を増幅することもまた所望され得る。これは、例えば、基質（たとえば、メトトレキサート）の濃度を増加させることにより達成され得る。したがって、多数回増幅した、ＤＨＦＲ遺伝子の複数コピーを有する細胞は、高レベルに対するメトトレキサートの濃度における連続的な増加によって選択され得る。この技術はまた、安定な形質転換体を同定することをも可能にする。すなわち、この表現型は、しばしば不安定であり、何回かの細胞周期の後に、選択圧の非存在かで喪失するが、他方、不安定なＤＨＦＲ遺伝子の構成は、連続的な選択圧下で安定になる。安定に増幅した細胞は、増幅したＤＨＦＲ遺伝子をその染色体内に含む。
【００６１】
他の選択マーカーであって、安定な形質転換体の単離を可能にするものは、本発明において、第１のマーカーまたは第２の（不能化）マーカーのいずれかとして使用され得ることが理解される。別の選択マーカーの例は、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）である。チミジン、９−β−Ｄ−キシロフラノシルアデニン（Ｘｙｌ−Ａ）および２’−デノキシコホルマイシン（ｄＣＦ）を補充した培地が使用される。Ｘｙｌ−Ａは、Ｘｙｌ−ＡＴＰへと変換され得、そして核酸に取り込まれ得る。これは、細胞死を生じる。Ｘｙｌ−Ａは、そのイノシン誘導体をＡＤＡによって無毒化する。ｄＣＦは、ＡＤＡの中間状態アナログインヒビターであり、そして親の細胞型にとって内因性であるＡＤＡを不活化するために必要である。内因性ＡＤＡのレベルは細胞型により変動することから、選択について適切な濃度のｄＣＰもまた変動する。Ｋａｕｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８６）ＰＮＡＳ ＵＳＡ，８３：３１３６。ＡＤＡ欠失ＣＨＯ細胞もまた利用可能である。
【００６２】
本発明において使用するために適切な選択マーカーはチミジンキナーゼ（ＴＫ）である。以前の章において（ＴＫ-からＴＸ+へ）、完全培地は、ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジンおよびグリシンが補充された（ＨＡＴ培地）。逆選択（ＴＫ+からＴＸ-）では、完全培地は、５−ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）が補充される。正常な増殖条件下で、細胞は、チミジンキナーゼを必要としない。なぜなら、ｄＴＤＰを合成するための通常の手段は、ｄＣＤＰを経由するからである。ＢｒｄＵの培地への添加により、Ｔｋ+細胞が殺傷される。ＢｒｄＵは、ＴＸによりリン酸化されそしてついでＤＮＡへと取り込まれるからである。ＨＡＴ培地におけるＴＫ+細胞の選択は主に、アミノプテリンの存在に起因し、これは、ｄＣＤＰからのｄＴＤＰの形成をブロックする。したがって、細胞は、ＴＫを必要とする経路であるチミジンからｄＴＴＰの合成を必要とする。チミジンキナーゼは、哺乳動物細胞培養において広汎に使用されている。なぜなら、正の選択条件および逆の選択条件の両方が存在するからである。ＡＤＡおよびＤＨＦＲのように。ほとんどの哺乳動物細胞株は、ＴＫを発現することから、ＢｒｄＵがＴＫ-変異体を選択するために使用される場合以外は、これらの株においてマーカーを使用する可能性を除去する。以下を参照のこと：Ｌｉｔｔｌｅｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，（１９６４）Ｓｃｉｅｎｃｅ １４５：７０９−７１０。
【００６３】
本発明において使用するための別の適切なドミナント選択マーカーの例は、キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＸＧＰＲＴ、ｇｐｔ）である。透析したウシ胎仔血清ならびにキサンチン、ヒポキサンチン、チミジン、アミノプテリン、ミコフェノール酸およびＬ−グルタミンを含む培地が使用され得る。アミノプテリンおよびミコフェノール酸はともに、ＧＭＰの合成についてのデノボ経路をブロックする。ＸＧＰＲＴの発現により、細胞は、キサンチンからＧＭＰを合成することができ、これにより、キサンチンを含むがグアニンを含まない培地で増殖することが可能になる。ＸＧＰＲＴは、哺乳動物ホモログを有しない細菌酵素であり、これにより、ＸＧＰＲＴは、ドミナント選択マーカーとして機能することが可能になる。選択のためにミコフェノール酸の量は、細胞型により変動し、そしてグアニンの非存在および存在下での力価測定により決定され得る。以下を参照のこと：Ｍｕｌｌｉｇａｎ ａｔ ａｌ．，（１９８１）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ７８：２０７２−２０７６。
【００６４】
適切なマーカーであるハイグロマイシンＢ−ホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＨ）もまた、使用され得る。完全培地にはハイグロマイシン−Ｂが補充される。ハイグロマイシン−Ｂは、アミノシクリトールであって、トランスロケーションを破壊し、そして誤翻訳を促進することによってタンパク質合成を阻害する。ＨＰＨ遺伝子は、哺乳動物系において使用されてきた。そして、この遺伝子を効率的に発現するベクターが利用可能である。以下を参照のこと：Ｇｒｉｔｚ ｅｔ
ａｌ．，（１９８３）Ｇｅｎｅ ２５：１７９−１８８；およびＰａｌｍｅｒ
ｅｔ ａｌ．，（１９８７）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８４：１０５５−１０５９。
【００６５】
別の有用なマーカーは、クロラムフェニコール耐性である。耐性は、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）によって媒介され、これは、クロラムフェニコールを、モノアセチル化誘導体およびビアセチル化誘導体へと変換することによって不活化する。３つの誘導体は、薄層クロマトグラフィーにより、検出され得る。この酵素は、哺乳動物細胞において発現され、そして容易に検出される。なぜなら、これは、哺乳動物細胞において天然には存在しないからである。この遺伝子は、トランスポゾンＴｎ９を有するｐＢＲ３２２の誘導体から、適切な酵素での切断により入手することができる。これは、ｐＳＶ２ベクターへと導入され得る。このことにより、ｐＳＶ２−ｃａｔプラスミドを得る（ＡＴＣＣ受託番号３７１５５）。これは、ＳＶ４０の初期プロモーターからＣＡＴ遺伝子を発現するプラスミドである。
【００６６】
Ｇｏｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９５）２６８：１７６６−１７６９は、迅速で、大いに増殖する遺伝子発現を、テトラサイクリン存在下で誘導するための、ウイルス転写活性化ドメインとのテトラサイクリン耐性遺伝子リプレッサーの融合物である。これは、低レベルのテトラサイクリンが遺伝子発現を妨害していた既存の系の改変である。テトラサイクリン耐性遺伝子リプレッサーをコードする遺伝子が変異誘発され、そして活性についてテトラサイクリンに依存した変異体融合タンパク質が作製され、そして同定された。この構築物は、遺伝子の高発現のためのオン／オフスイッチを提供する。
【００６７】
別の適切なマーカーは、アデニンホスホリリボシルトランスフェラーゼ（ＡＰＲＴ）である。この酵素ＡＰＲＴは、プリンサルベージ経路の別の酵素であるが、アデニンのＡＭＰへの変換を触媒する。ＡＰＲＴ陽性細胞は、例えば、グルタミンアナログのアザセリンを含む培地中で選択可能であり得る。アザセリンは、プリンのデノボ合成を妨害する。ＡＰＲＴ陰性細胞は、アザセリンおよびアデニンを含む培地中では増殖し得ず、しかも２，６−ジアミノプリンでの処理により選択され得る。この化合物は、正常細胞にとって毒性であるが、ＡＰＲＴ陰性細胞は、生存する。なぜなら、それらは、それを取り込まないからである。
【００６８】
選択マーカーコード配列の発現は、例えば、ＣＭＶ、ＲＳＶ、ポリＡ’−ＢＧＨ、ＳＶ４０などに由来するプロモーター配列の制御下に配置され得、そして他の発現制御エレメント（例えば、転写、翻訳または翻訳後修飾に影響を与える配列）も含み得る。
【００６９】
（調節配列）
選択マーカーおよび導入遺伝子に加え、本明細書において記載される構築物は、適切な調節エレメントを含み得る。調節エレメント（または制御エレメント）は、目的の宿主細胞において使用するために選択される。例えば、選択マーカーを含ませて、微生物における増殖を可能にし得る（例えば、ｆ１複製起点およびアンピシリン耐性コード配列）。そのような調節エレメントとしては、以下が挙げられるがそれらに限定されない：転写プロモーター、転写エンハンサーエレメント、転写終結シグナル、ポリアデニル化配列（翻訳終止コドンの３’に位置する）、翻訳開始の最適化のための配列（コード配列の５’に位置する）、翻訳終止配列、分泌シグナル配列、および翻訳後修飾（例えば、グリコシル化部位）を指示する配列。転写プロモーターとしては、誘導性プロモーター（そのプロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチド配列の発現は、分析物、補因子、調節タンパク質などによって誘導される）、抑制性プロモーター（そのプロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチド配列は、分析物、補因子、調節タンパク質などによって誘導される）および構成的プロモーターが挙げられ得る。
【００７０】
選択マーカーは、各々、プロモーターとポリアデニル化部位（例えば、図に示されるようなＢＧＨ ｐｏｌｙＡ またはＳＶ４０ ｐｏｌｙＡ）との間にサンドイッチされ得る。キメラｍＲＮＡは、プロモーターから転写され、そしてコード領域の３’側に配置されたポリアデニル化シグナルによって安定化される。哺乳動物転写ユニットの構築の間、プラスミド中の任意の細菌性プロモーターは、動物細胞において活性である転写調節配列に置き換えられ得る。２つのそのような配列は、図に示されている：ＣＭＶプロモーターおよびＳＶ４０初期プロモーター。使用され得る非限定的な他のプロモーターの例は、ＲＳＶおよびＨＳＶ−ＴＫである。
【００７１】
通常、遺伝子発現は、構成的であるが、調節性プロモーターが使用され得る。適切な調節プロモーターの例は、Ｔｅｔ、エクジソンおよびｌａｃリプレッサーの配列である。遺伝子発現はまた、メタロチオネイン遺伝子または熱ショック遺伝子の使用によるような、熱、光または金属を用いた転写調節によって制御され得る。
【００７２】
（例示的な「骨格」ベクター）
本発明の上記のトランスフェクション系の成分は、多数の適切な骨格ベクターに取り込まれて、発現ベクターおよび構築物の操作を容易にさせ得る。例えば、微生物における複製を可能にする手段を含むベクターへのこの成分の組み込みは、その構築物の増幅および単離を多大に容易にする（すなわち、シャトルベクターの作製）。例示的な骨格ベクターとしては、ＣＭＶ６ａおよびｐＵＣ１９（実施例１）が挙げられるがそれらに限定されない。
【００７３】
種々のそのような骨格ベクターは、適切な宿主系について利用可能である。
【００７４】
これらの系としては、以下が挙げられるがそれらに限定されない：バキュロウイルス（Ｒｅｉｌｌｙ，Ｐ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，ＢＡＣＵＬＯＶＩＲＵＳ ＥｘＰＲＥＳＳＩＯＮ ＶＥＣＴＯＲＳ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ（１９９２）；Ｂｅａｎｉｅｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ
１１：３７８（１９９１）；Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）；ｐＡｃＣ１３（ｐＡｃＣ１２に由来する、バキュロウイルス発現ベクター系において使用するためのシャトルベクター）（Ｍｕｎｅｍｉｔｓｕ Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１０（１１）：５９７７−５９８２，１９９０），細菌｛ｐＢＲ３２２；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｅｄｉａ ＰＡ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ；Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ；ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）、酵母｛Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．ａｎｄ Ｔｅｋａｍｐ−Ｏｌｓｏｎ，Ｐ．，米国特許第ＲＥ３５，７４９号，１９９８年３月１７日発行；Ｓｈｕｓｔｅｒ，Ｊ．Ｒ．，米国特許第５．６２９，２０３号，１９９７年５月１３日発行；Ｇｅｌｌｉｓｓｅｎ，Ｇ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｏｎｉｅ Ｖａｎ Ｌｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋ，６２（１−２）：７９−９３（１９９２）；Ｒｏｍａｎｏｓ，Ｍ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｙｅａｓｔ ８（６）：４２３−４８８（１９９２）；Ｇｏｅｄｄｅｌ，Ｄ．Ｖ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５（１９９０）；Ｇｕｔｈｒｉｅ，Ｃ．，ａｎｄ Ｇ．Ｒ．Ｆｉｎｋ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １９４（１９９１）、哺乳動物細胞｛Ｃｌｏｎｔｅｃｈ；Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ；例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（Ｈａｙｎｅｓ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１１：６８７−７０６（１９８３）；１９８３，Ｌａｕ，Ｙ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：１４６９−１４７５（１９８４）；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１８５，ｐｐ５３７−５６６ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ（１９９１）｝，ならびに植物細胞（植物クローニングベクター、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ，ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｔｃａｔａｗａｙ，ＮＪ；Ｈｏｏｄ，Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６８：１２９１−１３０１（１９８６）；Ｎａｇｅｌ，Ｒ．，ｅｔａｌ．，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．６７：３２５（１９９０）；Ａｎ，ｅｔ ａｌ．，”Ｂｉｎａｒｙ Ｖｅｃｔｏｒｓ”，ならびに他のベクター（Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｍａｎｕａｌ Ａ３：１−１９（１９８８）；Ｍｉｋｉ，Ｂ．Ｌ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，ｐｐ ２４９−２６５），ならびに他のベクター（Ｐｌａｎｔ ＤＮＡ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ａｇｅｎｔｓ（Ｈｏｈｎ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．）Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｗｉｅｎ，Ａｕｓｔｒｉａ，（１９８７）；Ｐｌａｎｔ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｐ．Ｇ．Ｊｏｎｅｓａｎｄ Ｊ．Ｍ．Ｓｕｔｔｏｎ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ，１９９７；Ｍｉｇｌａｎｉ，Ｇｕｒｂａｃｈａｎ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ ＰｌａｎｔＧｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｆｏｏｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｐｒｅｓｓ，１９９８；Ｈｅｎｒｙ，Ｒ．Ｊ．，Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｃｈａｐｍａｎ ＆ Ｈａｌｌ，１９９７）。
【００７５】
（発現ベクターおよび構築物の誘導）
本明細書において記載されるベクターおよび構築物は、適切な宿主細胞に、種々の方法により導入され得る。特に、本発明のプロセスによって改変される哺乳動物細胞は、ベクターでのトランスフェクションまたは感染によって取得することができる。トランスフェクションは、周知技術によって実施され得る（例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、リポソーム媒介トランスフェクションまたはマイクロインジェクション（Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．，前出））。例示的な方法はまた、実施例においても記載される。トランスフェクションは、複製するために使用可能なＤＮＡフラグメントまたはウイルスベクター中に容易にパッケージングされないＤＮＡを用いて使用され得るか、あるいは、哺乳動物のウイルスＤＮＡの感染は、回避されるべきである。
【００７６】
ビリオンまたはウイルス様粒子を得るウイルスゲノムに由来し得るベクターは、染色体外エレメントとして独立して複製可能であってもなくてもよい。高発現遺伝子座のためのＤＮＡを含むビリオン粒子は、感染によって宿主細胞に導入され得る。このウイルスベクターは、細胞ゲノムへと組み込まれ得る。哺乳動物の形質転換のためのウイルスベクターの例は、ＳＶ４０ベクター、およびパピローマウイルス、アデノウイルス、エプスタインーバーウイルス、ワクシニアウイルスおよびレトロウイルス（例えば、ラウス肉腫ウイルスまたはマウス白血病ウイルス（例えば、モロニーマウス白血病ウイルス））に基づくベクターがある。哺乳動物については、エレクトロポレーションまたはウイルス媒介導入が使用され得る。さらなる有用な送達系およびビヒクルは、本明細書において本発明者らが記載した（例えば、第２．３．１節を参照のこと）。
【００７７】
適切な形質転換トランスフェクション条件は、本明細書における教示にかんがみ当業者により決定され得る。
【００７８】
（細胞）
本発明において使用される細胞（例えば、宿主細胞）としては、すべての哺乳動物細胞、細胞株および細胞培養物が挙げられる。この細胞は、哺乳動物（例えば、マウス、ラットまたは他のげっ歯類、霊長類（例えば、ヒトまたはサル））に由来し得る。哺乳動物生殖細胞または体細胞系の細胞は、この目的のために使用され得る。初代細胞培養物または不死化細胞は、本発明の技術を実施する際に使用され得ることが理解される。
【００７９】
哺乳動物細胞は、ＤＮＡによる形質転換のための細胞培養物中において代表的に増殖する。この細胞は、固形表面に固定され得るか、または適切な栄養培地の懸濁物中で増殖し得る。
【００８０】
本発明において、恒常的な（すなわち、安定した）形質転換が生じることが好ましい。これは、細胞ゲノム中にＤＮＡを組換えにより形質転換することの取り込みにより達成される。挿入的形質転換は、タグ化される高発現の遺伝子座を生じ、通常、そのタグのＤＮＡ構築物の、ランダムなゲノム位置への非相同組換えにより起こる。しかし、相同組換えが生じ得ることが理解される。
【００８１】
抗生物質耐性遺伝子および第２の選択マーカーが染色体ＤＮＡ中の単一の高発現遺伝子座に組み込まれているか否か、あるいは、所定の細胞において複数の高発現遺伝子座を少なくとも形成するための多数の組み込み部位が存在するか否かを決定する試みがなされてこず、本発明の哺乳動物細胞が、少なくとも１つの高発現遺伝子座を含むことが理解される。
【００８２】
本発明の方法により入手された、形質転換された細胞は、その細胞が本質的に不死化している連続的な細胞株の調製のため、またはインビトロで継代培養されるべき能力を有する樹立細胞株の調製のために使用され得る。連続細胞株および樹立細胞株は、種々の生物および器官（例えば、げっ歯類胚；霊長類腎臓；げっ歯類およびヒトの腫瘍；ならびに線維芽細胞、上皮細胞またはリンパ細胞）から得ることができる。最高レベルの発現を示す細胞が所望の場合にクローニングされ得る。
【００８３】
本発明の技術により形質転換され得る、樹立細胞株の例は、ＨｅＬａ細胞、ＣＶ−１細胞、ＣＨＯ細胞、３Ｔ３細胞、Ｌ細胞、およびＴＣ７細胞である。これらの全ての細胞は、アミノグリコシド抗生物質（例えば、Ｇ４１８）に対して感受性であり、そしてその中に発現のためのカナマイシンまたはネオマイシン耐性遺伝子有し得る。
【００８４】
さらに、本発明は、所望の機能性ポリペプチドの発現を参照して記載してきたが、このポリペプチドは本発明の課題ではないことが理解される。本発明は、真核生物遺伝子転写および発現産物（ＲＮＡを含む）の産生のために一般に有用である。
【００８５】
本発明は、以下の実施例においてより完全に記載される。
【実施例】
【００８６】
（実施例１：構築物）
ｐＥＳＮ１ｄｈｆｒを、以下のように構築した。ＰＣＲプライマー：
【００８７】
【化１】
を使用して、ｐｃＤＮＡ３Ｍ１を作製した。これは、野生型ｎｅｏを含むｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．）由来の、変異ｎｅｏ遺伝子を含む。本出願を通じて、適切な場合、プライマーが３’から５’の方向に示される場合は、注意される。ＰＣＲフラグメントを、ＴＡクローニングのためのｐＣＲＩＩにクローニングした。各々別々の変異を含むこのＴＡプラスミドを、ＢｓｓＨＩＩおよびＳｆｕＩで消化して、アミノ酸残基１８２で変異（野生型Ｇｌｕの代わりにＡｓｐ）を含むｎｅｏ遺伝子の領域を除去した。Ｍ１ ＰＣＲフラグメントをＢｓｓＨＩＩおよびＳｆｕＩで消化したｐｃＤＮＡ３に連結することによって、残基１８２でｎｅｏ変異を含むｐｃＤＮＡ３Ｍ１を作製した。ｐｃＭＶ６ｃをＢａｌＩ／ＥｃｏＲＶで消化することによって、ＣＭＶ ＩＥプロモーターを得、このフラグメントを単離し、そしてＮｒｕＩおよびＥｃｏＲＶで消化したｐｃＤＮＡ３Ｍ１にこのフラグメントを連結した。生じたプラスミドをｐＥＳＮ１と名付けた。Ａｄ−ＤＨＦＲ遺伝子をこのプラスミドに加えるために、ｐＥＳＮ１を、Ｂｓｔ１１０７Ｉで平滑末端切断した。プラスミドｐｍＣＳＲ（Ｃｈｉｒｏｎ Ｃｏｒｐ．）を、ＸｈｏＩおよびＢａｍＨＩで消化し、そしてＡｄ−ＤＨＦＲカセットを単離した。次いで、このカセットをＫｌｅｎｏｗで処理して、平滑末端化し、平滑末端化したｐＥＳＮ１に連結してｐＥＳＮ１．ｄｈｆｒを作製した。Ｍ２ ＰＣＲフラグメントをＢｓｓＨＩＩおよびＳｆｕＩで消化したｐｃＤＮＡ３に連結することによって、ｐｃＤＮＡ３Ｍ２を、作製した。ｐｃＤＮＡ３Ｍ３を、ｐｃＤＮＡの消化によって作製した。
【００８８】
ｐＥＳＮ２ｄｈｆｒを、以下のように構築した。プライマー：
【００８９】
【化２】
を使用して、ｐｃＤＮＡ３Ｍ２を作製した。これは、アミノ酸残基２６１でｎｅｏ遺伝子に変異（野生型Ａｓｐの代わりにＡｓｎ）を含む。ＰＣＲフラグメントを、ＴＡクローニングのためのｐＣＲＩＩにクローニングした。各々別々の変異を含むこのＴＡプラスミドを、ＢｓｓＨＩＩおよびＳｆｕＩで消化して、アミノ酸残基１８２で変異（野生型Ｇｌｕの代わりにＡｓｐ）を含むｎｅｏ遺伝子の領域を除去した。Ｍ２ ＰＣＲフラグメントをＢｓｓＨＩＩおよびＳｆｕＩで消化したｐｃＤＮＡ３に連結することによって、残基２６１でｎｅｏ変異を含むｐｃＤＮＡ３Ｍ２を、作製した。ｐｃＭＶ６ｃをＢａｌＩ／ＥｃｏＲＶで消化することによって、ＣＭＶ ＩＥプロモーターを得、このフラグメントを単離し、そしてＮｒｕＩおよびＥｃｏＲＶで消化したｐｃＤＮＡ３Ｍ２にこのフラグメントを連結した。生じたプラスミドをｐＥＳＮ２と名付けた。Ａｄ−ＤＨＦＲ遺伝子をこのプラスミドに加えるために、ｐＥＳＮ２を、Ｂｓｔ１１０７Ｉで平滑末端消化した。プラスミドｐｍＣＳＲ（Ｃｈｉｒｏｎ Ｃｏｒｐ．）を、ＸｈｏＩおよびＢａｍＨＩで消化し、そしてＡｄ−ＤＨＦＲカセットを単離した。次いで、このカセットをＫｌｅｎｏｗで処理して、平滑末端切断し、平滑末端化したｐＥＳＮ１に連結してｐＥＳＮ２．ｄｈｆｒを作製した。
【００９０】
ｐＥＳＮ３ｄｈｆｒを、以下のように構築した。ｐｃＤＮＡ３Ｍ１およびｐｃＤＮＡ３Ｍ２をＳｍａＩおよびＲｓｒＩＩで消化することによって、ｐｃＤＮＡ３Ｍ３を、作製した。次いで、ｐｃＤＮＡ３Ｍ１由来の小フラグメントを、ｐｃＤＮＡ３Ｍ２の大フラグメントに連結してｐｃＤＮＡ３Ｍ３を作製した。これは、ｎｅｏ遺伝子の残基１８２および２６１での変異を含む。ｐＥＳＮ３．ｄｈｆｒを、上記のようにＣＭＶ ＩＥプロモーターおよびＤＨＦＲ遺伝子を挿入することによって作製した。
【００９１】
ｐｎｅｏ*ｄｈｆｒ*１およびｐｎｅｏ*ｄｈｆｒ*２を、以下のように作製した。ＢｓｔＢＩ部位およびＳｔｕＩ部位を作製するプライマーを使用して、マウスＤＨＦＲ遺伝子を、ｐＳＶ２から増幅した。野生型Ｎｅｏｒ遺伝子をｐｃＤＮＡ３から除去し、そして野生型マウスＤＨＦＲ遺伝子で置換してｐｃＤＮＡ３ｄｈｆｒを作製した。次いで、このプラスミドを、ＰＣＲにおいて使用してマウスＤＨＦＲ遺伝子を作製した。ｐｎｅｏ*ｄｈｆｒ*１について、ｄｈｆｒの５’領域における２つの隣接するコドンを、（ｐＳＶ２ｄｈｆｒを使用して）２つの停止コドンで置換して、それにより５’変異のＤＨＦＲ遺伝子を形成する。ｐｎｅｏ*ｄｈｆｒ*２について、３’領域における２つの隣接するコドンを、停止コドンで置換する。変異を、表１に示されるプライマーを使用するｐｃＤＮＡ３ｄｈｆｒのＰＣＲ増幅によって導入した：
（表１）
【００９２】
【表１】
ｄｈｆｒ遺伝子の５’末端における変異を、プライマー＃５、＃６、＃７、および＃８を使用して達成した。３’末端における変異を、プライマー＃６、＃８、＃９、および＃１０を使用して達成した。これらの新たなベクターを、ｐＸｄｈｆｒ*１およびｐＸｄｈｆｒ*２とよび、ここで、Ｘは、任意の導入遺伝子をいう。次いで、ｐＥＳＮ１、ｐＥＳＮ２、またはｐＥＳＮ３由来のｎｅｏ耐性遺伝子の変異形態を、ｐｄｈｆｒ*１またはｐｄｈｆｒ*２に挿入して、ｐｎｅｏ*ｄｈｆｒ*１およびｐｎｅｏ*ｄｈｆｒ*２を作製する。これらの構築物を使用して、以下に記載されるように、宿主細胞における高発現部位を作製し得る。
【００９３】
ｐｄｈｆｒ３’ｄｅｌを、以下のように構築した。ｐｃＤＮＡ３ＤＨＦＲ３’を、ＫｐｎＩ／ＥｃｏＲＶで消化した。ｐＳｅＡＰ−Ｂａｓｉｃ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）をＣｌａＩで消化した後にＫｌｅｎｏｗ処理およびＫｐｎＩで消化することによって、分泌アルカリホスファターゼ（ＳｅＡＰ）を得た。次いで、平滑／粘着性（ｂｌｕｎｔ／ｓｔｉｃｋｙ）条件下で、このフラグメントをｐｃＤＮＡ３ＤＨＦＲ３’に連結した。ｐＸｄｈｆｒ３’ｄｅｌは、任意の導入遺伝子「Ｘ」を含むこのプラスミドをいう。
【００９４】
ｐｎｅｏ*ｄｈｆｒ５’ｄｅｌを、以下のように構築した。ｐｃＤＮＡ３由来の同一のｎｅｏ耐性遺伝子を含むプラスミドｐＦＣ５５（Ｃｈｉｒｏｎ Ｃｏｒｐ）を、ＢｓｓＨＩＩおよびＳｆｕＩで消化して、上記のように得たｎｅｏ変異フラグメントを挿入した。ＢｓｓＨＩＩ／ＳｆｕＩ Ｍ１ｎｅｏフラグメント、Ｍ２ｎｅｏフラグメント、またはＭ３ｎｅｏフラグメントを、ｐＦＣ５５に連結して、それぞれｐＲＳＶＭ１ｎｅｏ、ｐＲＳＶＭ２ｎｅｏまたはｐＲＳＶＭ３ｎｅｏを作製した。ｐｃＤＮＡ３ｄｈｆｒ５’（Ｆ．Ｒａｎｄａｚｚｏ指南）をＮｒｕＩ／ＫｐｎＩで消化して、ポリリンカー領域の上流のＣＭＶプロモーターを除去した。ｐＲＳＶＭ１ｎｅｏをＮｒｕＩ／ＫｐｎＩで消化して、そして生じたフラグメントをｐｃＤＮＡ３ｄｈｆｒ５’に挿入して、ｐＲＳＶＭ１ｎｅｏｄｈｆｒ５’を作製した。生じたプラスミドを、ＢｓｓＨＩＩおよびＫｐｎＩで消化して、ＲＳＶＭ２ｎｅｏフラグメントまたはＲＳＶＭ３ｎｅｏフラグメントのいずれかに挿入した。
【００９５】
ｐＣＭＶＫｍ２：ｐＣＭＶＫｍ２ベクターは、ｐＣＭＶ６ａ（Ｃｈａｐｍａｎら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９９１）１９：３９７９−３９８６）に由来し、そしてカナマイシン選択マーカー、ＣｏｌＥ１複製起点、ＣＭＶプロモーターエンハンサーおよびイントロンＡを含み、以下に記載される合成配列についての挿入配列が続き、ウシ成長ホルモン由来のポリアデニル化シグナルが続く。−−ｐＣＭＶＫｍ２ベクターは、ポリリンカー部位がｐＣＭＶＫｍ２に挿入されて、ｐＣＭＶ−ｌｉｎｋ（１６４６〜１６９７位でのポリリンカー）を作製する点のみがｐＣＭＶ−ｌｉｎｋベクターとは異なる；チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞における発現のためのｐＥＳＮ２ｄｈｆｒおよびｐＣＭＶＰＬＥｄｈｆｒ；および、バキュロウイルス発現系における使用のためのシャトルベクターであるｐＡｃＣ１３（ｐＡｃＣ１３は、Ｍｕｎｅｍｉｔｓｕ Ｓら、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１０（１１）：５９７７−５９８２，１９９０）によって記載されるｐＡｃＣ１２由来である）。
【００９６】
ｐＣＭＶ−ｌｉｎｋは、ＣＭＶプロモーター（ＣＭＶ ＩＥ ＥＮＨ／ＰＲＯ）、ウシ成長ホルモンターミネーター（ＢＧＨ ｐＡ）、カナマイシン選択マーカー（ｋａｎ）、およびＣｏｌＥ１複製起点（ＣｏｌＥ１ ｏｒｉ）を含む。ポリクローニング部位はまた、ＣＭＶプロモーター配列に続いて存在する。
【００９７】
ベクターｐＥＳＮｄｈｆｒ、ｐＥＳＮ１ｄｈｆｒ、ｐＥＳＮ２ｄｈｆｒ、ｐＥＳＮ３ｄｈｆｒについての制限地図を、図２に示す。図において、ＣＭＶプロモーター（ｐＣＭＶ、ｈＣＭＶＩＥ）、ウシ成長ホルモンターミネーター（ＢＧＨｐＡ）、ＳＶ４０複製起点（ＳＶ４０ｏｒｉ）、ネオマイシン選択マーカー（Ｎｅｏ）、ＳＶ４０ポリＡ（ＳＶ４０ｐＡ）、アデノウイルス２後期プロモーター（Ａｄ２ＶＬＰ）、およびマウスｄｈｆｒ遺伝子（ｍｕ ｄｈｆｒ）を示す。図において、ポリクローニング部位はまた、ＣＭＶプロモーター配列に続いて示される。
【００９８】
簡単には、ｐＣＭＶＰＬＥｄｈｆｒの構築は、以下である。ＤＨＦＲカセットを構築するために、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ（内部リボソーム侵入部位（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｅｎｔｒｙ ｓｉｔｅ））リーダーを、ｐＣｉｔｅ−４ａ＋（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）からＰＣＲ増幅し、そしてＸｂａ−ＮｃｏフラグメントとしてｐＥＴ−２３ｄ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）に挿入してｐＥＴ−ＥＭＣＶを得た。ｐＥＳＮ２ｄｈｆｒからｄｈｆｒ遺伝子をＰＣＲ増幅して、翻訳停止コドンの代わりにＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒスペーサーを有する産物を得、そしてＮｃｏ−ＢａｍＨＩフラグメントとして挿入して、ｐＥＴ−Ｅ−ＤＨＦＲを得た。次に、減弱したｎｅｏ遺伝子を、ｐＳＶ２Ｎｅｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）誘導体からＰＣＲ増幅し、ｐＥＴ−Ｅ−ＤＨＦＲの独特なＢａｍＨＩ部位に挿入してｐＥＴ−Ｅ−ＤＨＦＲ／Ｎｅｏ(m2)を得た。最終的に、ｐＣＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｉｎｃ．，Ｃａｒｓｂａｄ，ＣＡ）由来のウシ成長ホルモンターミネーターｎｅｏ遺伝子の下流に挿入して、ｐＥＴ−Ｅ−ＤＨＦＲ／Ｎｅｏ(ｍ2)ＢＧＨｔを得た。ＥＭＣＶ−ｄｈｆｒ／ｎｅｏ選択マーカーカセットフラグメントを、ｐＥＴ−Ｅ−ＤＨＦＲ／Ｎｅｏ(m2)ＢＧＨｔの切断によって調製した。
【００９９】
ＣＭＶエンハンサー／プロモーター＋イントロンＡを、ｐＣＭＶ６ａ（Ｃｈａｐｍａｎら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９９１）１９：３９７９−３９８６）からＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｌＩフラグメントとしてｐＵＣ１９（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）へ移した。ｐＵＣ１９のベクター骨格を、ＮｄｅＩ部位からＳａｐＩ部位を削除した。上記のＤＨＦＲカセットを、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳがＣＭＶに続くようにこの構築物に加えた。このベクターはまた、Ａｍｐ’遺伝子およびＳＶ４０複製起点を含んだ。
【０１００】
合成Ｇａｇ発現カセットを含むｐＣＭＶＫｍ２ベクターは以下のように設計された：代理人整理番号１６２１．００２の同時係属出願に記載されるような、ｐＣＭＶＫｍ２．ＧａｇＭｏｄ．ＳＦ２、ｐＣＭＶＫｍ２．ＧａｇｐｒｏｔＭｏｄ．ＳＦ２．およびｐＣＭＶＫｍ２．ＧａｇｐｏｌＭｏｄ．ＳＦ２。
【０１０１】
ＣＡＢ構築物：記載される全ての構築物を作製し、そして以下の様式にてｐＡｃＣ１３にクローニングした。全ての構築物のＣＡＢ２部位をＰＣＲによって作製したので、全てを配列決定し、ＡＢＩ ｓｙｓｔｅｍの色素ターミネーター配列分析によって確認した。最初に全ての構築物を、中間体クローニングベクターＰＣＲＩＩ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）またはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にクローニングした。これは、配列決定およびさらなるサブクローニングを容易にするために行われた。
【０１０２】
全てのＣＡＢ２構築物を、２つの部分で作製した。まず、ＣＡＢ２分子のＭＣＰ部分（５’末端でのＫｐｎＩ部位からアミノ酸３２１でのＨｉｎｄＩＩＩ部位まで）を作製し、そしてＰＣＲＩＩにクローニングし、そして正確な配列を確認するために分析した。次いで、ＣＡＢ２のこの部分を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ
ＳＫ＋にクローニングした。次いで、このＳＫ＋構築物に、種々の３’末端テールを含むＣＡＢ２の残りの部分（アミノ酸３２１でのＨｉｎｄＩＩＩから５’末端のＥｃｏＲＩ部位まで）をクローニングした。ＨｉｎｄＩＩＩ ５’末端および３’末端を作製するために使用したプライマーは以下であった：
【０１０３】
【化３】
短いヘパリンのコンセンサス、ＴＦＰＩヘパリンコンセンサス、およびＧＰＩテールを含む、元々のＨｉｎｄＩＩＩからＥｃｏＲＩのＰＣＲ産物を、配列分析のために最初にＰＣＲＩＩにクローニングした。長いヘパリンのコンセンサス、２つのフィブロネクチンテール、およびテールを有さない制御配列を含む、元々のＨｉｎｄＩＩＩからＥｃｏＲＩのＰＣＲ産物を、配列分析のためにｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ＋にクローニングした。各々の改変体についてこれらの２つの半分をＳＫ＋に連結して完全なＣＡＢ２を作製した後、次いで、ＫｐｎＩからＥｃｏＲＩのフラグメントをｐＡｃＣＩ３にサブクローニングした。バキュロウイルス系を使用して、全てを昆虫細胞に発現した。
【０１０４】
昆虫細胞発現に加えて、これらの構築物のいくつかを、哺乳動物系における発現のために作製した。これらは、長いヘパリンコンセンサス配列を有するＣＡＢ２、ＴＦＰＩヘパリン結合テール、および非標的化配列を有するコントロールを含む。哺乳動物系ベクターにクローニングするために必要とされる５’制限部位および３’制限部位を変化させるために、これらのＣＡＢ改変体の３つ全てを、ＰＣＲで再度作製した。全ての改変体を、５’末端ＮｏｔＩ部位および３’末端ＸｂａＩ部位を有して作製し、そして配列確認のために中間体ベクターＰＣＲＩＩにクローニングした。ＮｏｔＩからＸｂａＩのクローンを作製するために使用されるＰＣＲプライマーは、制限部位における変化を除いてＫｐｎＩからＥｃｏＲＩのフラグメントを作製するために使用したものと同一であった。次いで、確認した改変体を、ｐＧＥＭ９Ｚ（Ｐｒｏｍｅｇａ）にクローニングした。次いで、これらを、発現のための哺乳動物ベクターに移入した。
【０１０５】
（実施例２：異常なｍＲＮＡスプライシングの同定および補正）
Ｃａｂ２は、膜補因子タンパク質（ＭＣＰ）と減衰加速因子（ｄａｃａｙ ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）（ＤＡＦ）の特徴を併せ持ち、補体活性を阻害する、キメラの１１０ｋＤａタンパク質である。Ｈｉｇｇｉｎｓら、前出。最初に、ＣＨＯ細胞株（Ｎ２１０７）を、ＣＡＢ２．１をコードする配列を保有するｐｃＤＮＡ３ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のトランスフェクション後に確立した。しかし、この細胞株の産生性は低く、そしてさらに、時間とともに減衰した。
【０１０６】
Ｎ２１０７細胞株の上清中に存在するポリペプチド分析は、予期せぬＣＡＢ２．１関連配列を有する４２ｋＤａタンパク質を示した。Ｆａｓｔ Ｔｒａｃｋ（ＩｎＶＩｔｒｏｇｅｎ）を使用してＣＡＢ２含有プラスミドを一過性にトランスフェクトした細胞の細胞ペレットから、ポリ（Ａ＋）ｍＲＮＡを単離した。コード領域に隣接するプライマーを使用して、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ＲＴ−ＰＣＲキットに記載されるようにＲＴ−ＰＣＲ分析を実施した。優勢なＰＣＲ産物は、予想された４２ｋＤａのタンパク質をコードした。いくつかの中間体ＰＣＲ産物および少量の全長（１１０ｋＤａ）ＰＣＲ産物もまた存在した。従って、ＲＴ−ＰＣＲは、４２ｋＤａの夾雑物がＣＡＢ２．１におけるＭＣＰとＤＡＦのキメラドメインの間の異常なｍＲＮＡスプライシングによって生じたことを示した。
【０１０７】
異常なスプライシングを、重複ＰＣＲによって補正し、もはやコンセンサススプライシングに似ないようにアミノ酸を保存するような方法で、哺乳動物細胞由来の代替のタンパク質鎖のプロセスした産物を与えたＲＮＡスプライシングについてのドナー部位およびアクセプター部位を除去することによって、ＣＡＢ２．１、ＣＡＢ４．２およびＣＡＢ４．３のスプライシングを補正した配列を産生した。変化は以下のとおりである：
【０１０８】
【化４】
これらの変化を、以下のプライマーでの重複ＰＣＲを使用して作製した。
アミノ酸４７で開始するドナー部位を変化するために：
【０１０９】
【化５】
アミノ酸１５２で開始するドナー部位を変化するために：
【０１１０】
【化６】
アミノ酸３７２で開始するアクセプター部位を変化するために：
【０１１１】
【化７】
アミノ酸４５９で開始するアクセプター部位を変化するために：
【０１１２】
【化８】
使用した５’Ｋｐｎプライマーは以下であった：
【０１１３】
【化９】
使用した３’ＸｂａＩプライマーは以下であった：
【０１１４】
【化１０】
上記で名付けたＨｉｎｄＩＩＩ５’プライマーおよび３’プライマーをまた使用した。
【０１１５】
スプライシング部位欠失構築物は、完全なＣＡＢ２、ＴＦＰＩヘパリン結合テールを伴うＣＡＢ２、それぞれアミノ酸５７０および５６１であるセリンスレオニン領域の一部および全体の欠失を伴うＣＡＢ２、ならびにＴＦＰＩヘパリンコンセンサス配列の付加を伴うセリンスレオニン領域の完全な欠失を含む。
【０１１６】
この分子の３’末端でのセリンスレオニン欠失を作製するために使用したプライマーは以下である：
【０１１７】
【化１１】
これらの構築物を、元々のＣＡＢ改変体に実施したように、２つの部分で中間体ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ＋に作製した。哺乳動物発現ベクターにおける最終構築物の完成の前に、全ての配列を、ＳＫ＋において確認した。ＲＴ−ＰＣＲおよびノーザンブロッティングによって分析したｍＲＮＡは、異常なスプライシングを示さず、そして正確なサイズのバンドを示した。
【０１１８】
（実施例３：トランスフェクション）
スプライシングの補正されたＣＡＢ２．１およびＣＡＢ４．２を、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ試薬（ＢＲＬ）を使用して、ＣＯＳ−７細胞に、２時間にわたって一過性にトランスフェクトした。ＲＴ−ＰＣＲは、正確な全長ＰＣＲ産物（１１０ｋＤａ）のみを示した。これらの細胞に発現したＣＡＢタンパク質のレベルを、表２に示す。
【０１１９】
（表２）
【０１２０】
【表２】
（実施例４：トランスフェクト方法および選択方法）
プラスミドｐＥＳＮ１．ｄｈｆｒ．ＣＡＢ２．１；ｐＥＳＮ３．ｄｈｆｒ．ＣＡＢ２．１、ｐＥＳＮ１．ｄｈｆｒ．ＣＡＢ４２、またはｐＥＳＮ３．ｄｈｆｒ．ＣＡＢ４．２の、以下の４つのトランスフェクションプロトコールを実施した：（１）エレクトロポレーション；（２）リン酸カルシウム（ＣａＰｏ４）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）；（３）ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）；および（４）ＴｒａｎｓＩＴ ＬＴ−１試薬（ＰａｎＶｅｒａ Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）。トランスフェクションを、エレクトロポレーション以外の全ての方法について製造業者の指導書に従って実施した。エレクトロポレーションに約３×１０6細胞を、そして５０〜８０％コンフルエントな細胞（５〜８×１０5細胞）を他の３つのトランスフェクション法について使用した。
【０１２１】
エレクトロポレーションを、以下のように実施した。ＣＨＯ−ＤＨＦＲ−細胞を、ＳＴＶでトリプシン処理し、そして１０％ＦＢＳを有する培地を、反応をクエンチするために添加した。細胞をＤＭＥＭ（Ｌ−グルタミンを含む）で２回洗浄し、そして約６×１０6細胞／ｍＬに再懸濁した。５００μｌの細胞を、滅菌したキュベットに添加し、約１〜３０μｇの間のＤＮＡを添加した。これらの細胞を、３３０ボルトおよび９７５μファラド静電容量でエレクトロポレーションした。細胞を、１００ｍｍディッシュ中１５ｍｌのα−ＭＥＭ／非選択培地（Ｇ４１８を含む）にプレートし、３７℃で１８〜２４時間インキュベートした。次いで、培地をＤＨＦＲのためのα−ＭＥＭ選択培地で置換して、そして細胞をコロニーが形成するまで増殖した。細胞を再度プレートし（Ｔ７５フラスコ、９６ウェルプレートまたは１００ｍｍディッシュ）そして２０ｎＭメトトレキサートで２〜４週間培養し、この時、メトトレキサートの濃度が４０ｎＭメトトレキサートに増加した。
【０１２２】
約１０μｇのプラスミドＤＮＡを、トランスフェクションに使用した。トランスフェクトした細胞は、ＣＯＳ細胞（ＵＣＳＦ）またはＤＧ４４ ＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞（Ｃｈｉｒｏｎ Ｃｏｒｐ．）であった。トランスフェクション後、細胞を、非選択培地中（５００ｍＬの非選択培地は、４３１．５ｍＬのα−ＭＥＭ、５０ｍＬ ＦＢＳ（非透析）、５ｍＬのペニシリン−ストレプトマイシン、０．５ｍＬのゲンタマイシン、１０ｍＬのグルタミン、１ｍＬのチミジン、１ｍＬのアデノシンおよび１ｍＬのデオキシアデノシンを含む）に１〜２日間回収し得た。１つのトランスフェクションからの細胞を、上記のようにトリプシン処理し、２０ｍＬの選択培地（５００ｍＬの非選択培地は、４３４．５ｍＬのα−ＭＥＭ、１０ｍＬのグルタミン、０．５ｍＬのゲンタマイシン、５ｍＬのペニシリン−ストレプトマイシンおよび５０ｍｌ ＦＢＳ（非透析）を含む）に希釈し、そして９６ウェル培養プレートに適切な選択培地（２５０μｇのＧ４１８（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）、ヌクレオシドを含まないα−ＭＥＭ、１０％ ＦＢＳ（ＤＨＦＲ選択）のいずれかまたは両方の培地）でプレートした。細胞を、約２〜３週間にわたって選択培地中で維持し、この時、トランスフェクトされていない細胞または一過性にトランスフェクトされた細胞は死んだ。生存するコロニーを、トリプシン処理し、そして１ｍＬの選択培地を含む２４ウェル培養プレートに再度プレートした。
【０１２３】
増殖陽性ウェルを、ＥＬＩＳＡを使用してＣＡＢ２．１またはＣＡＢ４．２の発現について試験した。ＣＡＢ２．１またはＣＡＢ４．２を発現するミニプールを、ＤＨＦＲ選択およびメトトレキサート（ＭＴＸ）での増幅のためにスケールアップした。得られた結果は、導入遺伝子の安定な発現を得る際にＣａＰＯ４が最も効果的であることを示した。
【０１２４】
ＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞におけるＣＡＢ２．１またはＣＡＢ４．２の発現は、表３に示される。
【０１２５】
（表３）
【０１２６】
【表３】
ＣＡＢ２に加えて、ｕＰＡＲおよびＶＥＧＦ−Ｄの発現をまた、ｕＰＡＲまたはＶＥＧＦ−Ｄをコードする導入遺伝子を含むｐＥＳＮ２ｄｈｆｒでの、宿主細胞のリン酸カルシウムトランスフェクションによって達成した。約２５０ｍｇ〜約１ｍｇ／リットルの間の発現レベルを達成した。
【０１２７】
（本発明の実施に有用な株の寄託）
以下の株の生物学的に純粋な培養物の寄託を、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡで行った。示された受託番号は、首尾良い生存試験の後に割り当てられ、そして必要な費用が支払われた。寄託物は、Ｂｕｄａｐｅｓｔ Ｔｒｅａｔｙ ｏｎ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｄｅｐｏｓｉｔ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｕｒｐｏｓｅ ｏｆ
Ｐａｔｅｎｔ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ａｎｄ ｔｈｅ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ ｔｈｅｒｅｕｎｄｅｒ（Ｂｕｄａｐｅｓｔ Ｔｒｅａｔｙ）の規定の元でなされた。これは、寄託した日から３０年間および寄託所による寄託のサンプルの供給に対する最も新しい要請後少なくとも５年間にわたる生存培養物の維持を保障する。これらの生物は、米国特許法第１２２条およびそれに準じる長官の規則（米国特許法施行規則１．１２条を含む）に従って表題された、米国特許庁長官によって決定されたものに対して培養物の永久かつ非限定的利用可能性を保障するＢｕｄａｐｅｓｔ Ｔｒｅａｔｙの用語の下でＡＴＣＣによって利用可能にされる。特許査定の際に、寄託された培養物の公的な利用可能性における全ての制限は、変更不可能に除去される。
【０１２８】
これらの寄託物は、単に当業者に便利なように提供されるだけであり、そして寄託が米国特許法第１１２条の下で要求されるという認可ではない。これらのプラスミドの核酸配列、ならびにこれらによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列は、本明細書中の記載と何らかの矛盾が生じた場合に制御する。認可が、寄託された材料を作製、使用または販売するために要求され得、そしてこのような認可を本明細書では認可しない。
【０１２９】
【化１２】
本発明の原理、好ましい実施形態および実施の様式は、前述の明細書に記載されている。しかし、本明細書中で保護されるべき発明は、記載された特定の形態に限定されるようには解釈されるべきではない。なぜなら、限定よりはむしろ例示としてみなされるべきだからである。改変および変化は、本発明の精神から逸脱することなく当業者によってなされ得る。
（配列表）
【数１】
【数２】
【数３】
【数４】
【数５】
【数６】
【数７】
【数８】
【数９】
【数１０】
【数１１】
【数１２】
【数１３】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、宿主細胞、特に哺乳動物細胞における目的のポリペプチドの安定かつ高レベルな発現を可能にする新規な発現ベクターを提供する。本発明はまた、本明細書中に記載される構築物を使用する、哺乳動物細胞についてのトランスフェクション系を含む。本明細書中に記載される発明は、効率的な機構を提供し、これによって、任意の所望のポリペプチドは、本明細書中に記載されるように、発生された新規な細胞株を使用して高レベルで発現され得る。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
ポリオーマのような細胞溶解ウイルスに基づくベクターは、短期間発現に対して使用されてきたが、不安定である傾向にあり、１細胞サイクルあたり多数回複製する（Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉ，Ｊ．Ｓ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：１９５１−１９６０，１９８４）。ウシ乳頭腫ウイルスに基づくベクターがまた開発されてきているが、一貫して、１細胞サイクルあたり一回も複製しない（Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｄ．Ｍ．ら、Ｃｅｌｌ５０：５９−６８，１９８７；Ｒａｖｎａｎ，Ｊ．−Ｂ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：６９４６−６９５２，１９９２）。さらに、ウシ乳頭腫ウイルスベースのベクターは、高頻度の再編成を示す（Ａｓｈｍａｎ，Ｃ．Ｒ．ら、Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１１：４９９−５０４，１９８５；ＤｕＢｒｉｄｇｅ，Ｒ．Ｂ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：３７９−３８７，１９８７）。
【０００３】
ヒトおよび霊長類の細胞において、エプスタイン−バーウイルスに基づくベクター（ＥＢＶ）が開発されてきた（Ｙａｔｅ，Ｊ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８１：３８０６−３８１０，１９８４；Ｒｅｉｓｍａｎ，Ｄら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：１８２２−１８３２，１９８５；Ｌｕｐｔｏｎ，Ｓら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：２５３３−２５４２，１９８５）。これらのベクターは、代表的に、１細胞サイクルあたり一回複製し（Ａｄａｍ，Ａ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１：１７４３−１７４６，１９８７；Ｙａｔｅｓ，Ｊ．Ｌ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６５：４８３−４８８，１９９１；Ｈａｓｓｅ，Ｓ．Ｂ．ら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９：５０５３−５０５８，１９９１）、そして長期間にわたり低い変異頻度で、安定して維持される（ＤｕＢｒｉｄｇｅ，Ｒ．Ｂ．，ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：３７９−３８７，１９８７；ＤｕＢｒｉｄｇｅ，Ｒ．Ｂ．ら、Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ３：１−９，１９８８；Ｄｒｉｎｋｗａｔｅｒ，Ｎ．Ｒ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：３４０２−３４０６、１９８６）。これらのベクターは、ヒトおよびサルの細胞におけるクローニングおよび発現研究のために使用されてきた（Ｍａｒｇｏｌｓｋｅｅ，Ｒ．Ｆ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：２８３７−２８４７，１９８８；Ｙｏｕｎｇ，Ｊ．Ｍ．ら、Ｇｅｎｅ ６２：１７１−１８５，１９８８；Ｂｅｌｔ，Ｐ．Ｂ．Ｇ．Ｍら、Ｇｅｎｅ ８４：４０７−４１７，１９８９；Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｃ．ら、Ｇｅｎｅ １０７：２７９−２８４、１９９１）。ゲノムへの組み込みが必要とされないので、安定した形質転換頻度が高く、クローン化された配列の回収が、プラスミド抽出によって達成される。しかし、齧歯目細胞は、ＥＢＶ複製に対して許容されず、ＥＢＶの齧歯目対応物は、記載されていない（Ｙａｔｅ，Ｊ．Ｌ．ら、Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）３１３：８１２−８１５，１９８５）。
【０００４】
特許文献１（Ｓａｕｅｒら）は、真核生物細胞における遺伝子移入を達成するために、Ｃｒｅ−Ｌｏｘ部位特異的組換えの使用を開示する。しかし、記載される系は、宿主ゲノムへ転移されるＤＮＡの効率的かつ安定した組み込みを提供しない（例えば、Ｓａｕｅｒら、（１９９３）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｚｙ ２２５：８９８頁を参照のこと）。これは、分子内交換による、ゲノム外への転移されたＤＮＡの切除が、分子間部位特異的組換えによる、ゲノムへのＤＮＡの組み込みよりも優性であるという事実に主に起因する。
特許文献２（Ｌｅｂｏｕｌｃｈら）は、細胞を形質転換して、導入遺伝子の効率的かつ安定した部位特異的組み込みを生じるための方法および組成物を記載する。形質転換は、細胞にアクセプターベクター（好ましくは、レトロウイルスベクター）を導入することによって達成され、これは、細胞のゲノム内に組み込まれる。このアクセプターベクターは、２種の不適合性のｌｏｘ配列、Ｌ１およびＬ２を含む。次いで、ドナーベクターは、同じＬ１およびＬ２配列が隣接する導入遺伝子を含む細胞に導入される。安定した遺伝子転移は、ｌｏｘ Ｌ１およびＬ２配列をＣｒｅリコンビナーゼと接触させることによって開始される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許第４，９５９，３１７号明細書
【特許文献２】米国特許第５，９２８，９１４号明細書
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１） 発現ベクターであって、以下：
（ａ）第１の不活化された選択マーカーをコードする、第１のポリヌクレオチド；
（ｂ）目的の異種ポリペプチドをコードする、第２のポリヌクレオチド；および
（ｃ）第２の増幅可能な選択マーカーをコードする、第３のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
（項目２） 項目１に記載の発現ベクターであって、前記第１の不活化された選択マーカーは、アミノ酸残基１８２で変異を有するネオマイシン耐性遺伝子をコードする配列、アミノ酸残基２６１で変異を有するネオマイシン耐性遺伝子をコードする配列、ならびにアミノ酸残基１８２および２６１で変異を有するネオマイシン耐性遺伝子をコードする配列からなる群より選択される、発現ベクター。
（項目３） 前記第３のポリヌクレオチドが、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｄｈｆｒ）をコードする、項目１に記載の発現ベクター。
（項目４） 前記目的の異種ポリペプチドが、ＣＡＢ−２、ＣＡＢ−４、ｕＰＡＲ、ＶＥＧＦ−Ｄおよびウイルスタンパク質からなる群より選択される、項目１に記載の発現ベクター。
（項目５） 前記目的の異種ポリペプチドが、ウイルス糖タンパク質である、項目１に記載の発現ベクター。
（項目６） ｐＥＳＮ１ｄｈｆｒ、ｐＥＳＮ２ｄｈｆｒ、ｐＥＳＮ３ｄｈｆｒ、ｐｎｅｏ１ｄｈｆｒ５’ｄｅｌ、ｐｎｅｏ３ｄｈｆｒ５’ｄｅｌ、ｐｎｅｏ２ｄｈｆｒ５’ｄｅｌおよびｐｄｈｆｒ３’ｄｅｌからなる群より選択される、プラスミド。
（項目７） プラスミドｐＥＳＮ１ｄｈｆｒ。
（項目８） ｐＥＳＮ２ｄｈｆｒと命名されたプラスミド。
（項目９） ｐＥＳＮ３ｄｈｆｒと命名されたプラスミド。
（項目１０） ｐｎｅｏ１ｄｈｆｒ５’ｄｅｌと命名されたプラスミド。
（項目１１） ｐｎｅｏ３ｄｈｆｒ５’ｄｅｌと命名されたプラスミド。
（項目１２） ｐｎｅｏ２ｄｈｆｒ５’ｄｅｌと命名されたプラスミド。
（項目１３） ｐｄｈｆｒ３’ｄｅｌと命名されたプラスミド。
（項目１４） 宿主細胞において目的のポリペプチドを産生するための方法であって、以下：
（ａ）項目１に記載の発現ベクターを適切な宿主細胞中に導入する工程；
（ｂ）前記第１および第２の選択マーカーを発現する宿主細胞を、安定に組み込まれた発現ベクターについて選択する条件下で、選択する工程；
（ｃ）該安定にトランスフェクトされた宿主細胞を、前記目的のポリペプチドの発現を支持する条件下で、増殖させる工程；および
（ｄ）該目的のポリペプチドを単離する工程
を包含する、方法。
（項目１５） 宿主細胞において目的のポリペプチドを産生するための方法であって、以下：
（ａ）項目６に記載の発現ベクターを適切な宿主細胞中に導入する工程；
（ｂ）前記第１および第２の選択マーカーを発現する宿主細胞を、安定に組み込まれた発現ベクターについて選択する条件下で、選択する工程；
（ｃ）該安定にトランスフェクトされた宿主細胞を、前記目的のポリペプチドの発現を支持する条件下で、増殖させる工程；および
（ｄ）該目的のポリペプチドを単離する工程
を包含する、方法。
（項目１６） 前記目的のポリペプチドが、ＣＡＢ−２、ＣＡＢ−４、ｕＰＡＲ、ＶＥＧＦ−Ｄおよびウイルスタンパク質からなる群より選択される、項目１４に記載の方法。
（項目１７） 前記ポリペプチドが、ウイルスタンパク質である、項目１４に記載の方法。
（項目１８） 前記宿主細胞が、哺乳動物細胞または昆虫細胞である、項目１４に記載の方法。
（項目１９） 目的のポリペプチドを産生する宿主細胞株であって、該ポリペプチドは、項目１４に記載の方法に従って産生される、宿主細胞株。
（項目２０） トランスフェクション系であって、以下：
（ａ）第１の構築物であって、適切な骨格中に、第１の選択マーカーをコードする配列および第２の選択マーカーをコードする配列を含み、該第２の選択マーカーは、そのコード配列中に少なくとも１つの不能化変異を含む、第１の構築物；および
（ｂ）第２の構築物であって、適切な骨格中に、目的のポリヌクレオチドヌクレオチド配列および第３の選択マーカーをコードする配列を含み、ここで、該第３の選択マーカーは、該第２の選択マーカーと同じ選択マーカーであるが、ただし、該第３の選択マーカーは、該第２の選択マーカー中の不能化変異とは異なるコード配列領域にある、少なくとも１つの不能化変異を含む、第２の構築物
を含む、トランスフェクション系。
（項目２１） 前記第１の選択マーカーが、抗生物質耐性をコードする、項目２０に記載のトランスフェクション系。
（項目２２） 前記第１の選択マーカーが、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩをコードする、項目２０に記載のトランスフェクション系。
（項目２３） 前記ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩが、機能的に損なわれている、項目２２に記載のトランスフェクション系。
（項目２４） 前記第１の構築物中の前記第２の選択マーカーが、５’コード領域における少なくとも１つの変異によって不能化されており、そして前記第２の構築物中の第３の選択マーカーが、３’コード領域における少なくとも１つの異なる変異によって不能化されている、項目２０に記載のトランスフェクション系。
（項目２５） 前記変異が、点変異である、項目２４に記載のトランスフェクション系。
（項目２６） 前記変異が、欠失である、項目２０に記載のトランスフェクション系。
（項目２７） 前記第２および第３の選択マーカーが、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）をコードする、項目２０に記載のトランスフェクション系。
（項目２８） 前記構築物が、プラスミドである、項目２０に記載のトランスフェクション系。
（項目２９） 項目２８に記載のトランスフェクション系であって、前記プラスミドが、以下：
（ｃ）それぞれ、前記第１および第２の選択マーカーならびに前記導入遺伝子に作動可能に連結されている、第１、第２および第３のプロモーター；
（ｄ）該第１および第２の選択マーカーならびに該導入遺伝子に作動可能に連結されている、ポリアデニル化部位をコードする配列；および
（ｅ）該第１および第２の選択マーカーならびに該導入遺伝子に作動可能に連結されている、複製起点をコードする配列
をさらに含む、トランスフェクション系。
（項目３０） 前記第１のプロモーターが、ＣＭＶプロモーター、ＲＳＶプロモーターまたはＳＶ−４０初期プロモーターからなる群より選択される、項目２９に記載のトランスフェクション系。
（項目３１） 前記第２のプロモーターが、ＣＭＶプロモーター、ＲＳＶプロモーターまたはＳＶ−４０初期プロモーターからなる群より選択される、項目２９に記載のトランスフェクション系。
（項目３２） 前記第３のプロモーターが、ＣＭＶプロモーター、ＲＳＶプロモーターまたはＳＶ−４０初期プロモーターからなる群より選択される、項目２９に記載のトランスフェクション系。
（項目３３） 前記第１および第３のプロモーターが、ＣＭＶプロモーターであり、そして前記第２のプロモーターが、ＳＶ−４０初期プロモーターである、項目２９に記載のトランスフェクション系。
（項目３４） 選択されたポリヌクレオチド配列の発現のための哺乳動物細胞株を産生するための方法であって、以下
（ａ）ゲノムを有する選択された哺乳動物細胞に、第１の構築物を導入する工程であって、該第１の構築物は、第１の選択マーカーをコードする配列および第２の選択マーカーをコードする配列を含み、該第２の選択マーカーは、そのコード配列中に少なくとも１つの不能化変異を含む、工程；
（ｂ）該第１の選択マーカーを発現する哺乳動物細胞について選択する工程であって、該第１の構築物は、該ゲノムに安定に組み込まれている、工程；
（ｃ）該哺乳動物細胞に、第２の構築物を導入する工程であって、該第２の構築物は、目的のポリヌクレオチド配列および第３の選択マーカーをコードする配列を含み、ここで、該第３の選択マーカーは、該第２の選択マーカーと同じ選択マーカーであるが、ただし、該第３の選択マーカーは、該第２の選択マーカー中の不能化変異とは異なるコード配列領域にある、少なくとも１つの不能化変異を含む、工程；および
（ｄ）該第２の選択マーカーによってコードされる機能的産物を発現する哺乳動物細胞について選択する工程であって、該機能的産物は、該第２の選択マーカーと該第３の選択マーカーとの間の組換え事象によって生じる配列によってコードされ、そして得られた哺乳動物細胞は、該選択されたポリヌクレオチド配列を発現し得る、工程
を包含する、方法。
（項目３５） 前記選択されたポリヌクレオチド配列が、ポリペプチドをコードする、項目３４に記載の方法。
（項目３６） 前記選択されたポリヌクレオチド配列の発現が、前記ポリペプチドの発現を生じる、項目３５に記載の方法。
（項目３７） 項目３４に記載の方法によって産生された、哺乳動物細胞。
（項目３８） 宿主哺乳動物細胞において目的のポリペプチドを産生するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）ゲノムを有する該細胞に、第１の構築物を導入する工程であって、該第１の構築物は、第１の選択マーカーをコードする配列および第２の選択マーカーをコードする配列を含み、該第２の選択マーカーは、そのコード配列中に少なくとも１つの不能化変異を含む、工程；
（ｂ）該第１の選択マーカーを発現する哺乳動物細胞について選択する工程であって、該第１の構築物は、該ゲノムに安定に組み込まれている、工程；
（ｃ）該哺乳動物細胞に、第２の構築物を導入する工程であって、該第２の構築物は、目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列および第３の選択マーカーをコードする配列を含み、ここで、該第３の選択マーカーは、該第２の選択マーカーと同じ選択マーカーであるが、ただし、該第３の選択マーカーは、該第２の選択マーカー中の不能化変異とは異なるコード配列領域にある、少なくとも１つの不能化変異を含む、工程；
（ｄ）該第２の選択マーカーによってコードされる機能的産物を発現する哺乳動物細胞について選択する工程であって、該機能的産物は、該第２の選択マーカーと該第３の選択マーカーとの間の組換え事象によって生じる配列によってコードされ、そして得られた哺乳動物細胞は、該目的のポリペプチドを発現し得る、工程；および
（ｅ）該目的のポリペプチドを産生するような条件下で、該哺乳動物細胞を培養する工程
を包含する、方法。
（項目３９） 前記第１の選択マーカーが、ネオマイシン耐性をコードする、項目３８に記載の方法。
（項目４０） 前記第２および第３の選択マーカーが、ｄｈｆｒをコードする、項目３８に記載の方法。
（項目４１） 前記細胞への前記構築物の導入が、エレクトロポレーションによる、項目３８に記載の方法。
（項目４２） 前記細胞への前記構築物の導入が、リン酸カルシウムトランスフェクションによる、項目３８に記載の方法。
（項目４３） 目的のポリペプチドを産生する哺乳動物細胞株であって、該細胞株は、項目３８に記載の方法によって産生される、哺乳動物細胞株。
（発明の要旨）
１つの局面において、本発明は、発現ベクターであって、以下：（ａ）第１の不活化された（ｃｒｉｐｐｌｅｄ）選択マーカーをコードする、第１のポリヌクレオチド；（ｂ）目的の異種ポリペプチドをコードする、第２のポリヌクレオチド；および（ｃ）第２の増幅可能な選択マーカーをコードする、第３のポリヌクレオチドを含む、発現ベクターを提供する。適切な第１の選択マーカーとしては、１以上の不活化（ｃｒｉｐｐｌｉｎｇ）変異を含む抗生物質（例えば、ネオマイシン）耐性をコードする配列が挙げられる。１つの実施形態において、増幅可能な選択マーカーは、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｄｈｆｒ）である。
【０００７】
本発明はまた、以下の構築物を包含する：ｐＥＳＮ１ｄｈｆｒと称するプラスミド；ｐＥＳＮ２ｄｈｆｒと称するプラスミド；ｐＥＳＮ３ｄｈｆｒと称するプラスミド；ｐｎｅｏ*ｄｈｆｒ５’ｄｅｌと称するプラスミド（例えば、ｐｎｅｏ１ｄｈｆｒ５’ｄｅｌ、ｐｎｅｏ２ｄｈｆｒ５’ｄｅｌ、ｐｎｅｏ３ｄｈｆｒ５’ｄｅｌ）；およびｐｄｈｆｒ３’ｄｅｌと称するプラスミド。
【０００８】
別の局面において、本発明は、宿主細胞において目的のポリペプチドを産生するための方法であって、以下：
（ａ）本明細書中に記載の発現ベクターまたは構築物を適切な宿主細胞中に導入する工程；
（ｂ）前記第１および第２の選択マーカーを発現する宿主細胞を、安定に組み込まれた発現ベクターについて選択する条件下で、選択する工程；
（ｃ）該安定にトランスフェクトされた宿主細胞を、該目的のポリペプチドの発現を支持する条件下で、増殖させる工程；および
（ｄ）該目的のポリペプチドを単離する工程
を包含する、方法を包含する。
【０００９】
特定の実施形態において、異種ポリペプチドは、ウイルスタンパク質（例えば、ＨＩＶタンパク質）であるか、またはＣＡＢ２またはＣＡＢ４であり、そして宿主細胞は、哺乳動物細胞または昆虫細胞である。この方法を使用して目的のポリペプチドを産生する宿主細胞株もまた、本発明に含まれる。
【００１０】
別の局面において、本発明は、トランスフェクション系であって、以下：
（ａ）第１の構築物であって、適切な骨格中に、第１の選択マーカーをコードする配列および第２の選択マーカーをコードする配列を含み、該第２の選択マーカーは、そのコード配列中に少なくとも１つの不能化（ｄｉｓａｂｌｉｎｇ）変異を含む、第１の構築物；および
（ｂ）第２の構築物であって、適切な骨格中に、目的のポリヌクレオチド配列および第３の選択マーカーをコードする配列を含み、ここで、該第３の選択マーカーは、該第２の選択マーカーと同じ選択マーカーであるが、ただし、該第３の選択マーカーは、該第２の選択マーカー中の不能化変異とは異なるコード配列領域にある、少なくとも１つの不能化変異を含む、第２の構築物
を含む、トランスフェクション系を包含する。特定の実施形態において、第１の選択マーカーは、抗生物質耐性をコードし（例えば、野生型または機能的に損なわれたネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩをコードすることによって）、第２の選択マーカーは、５’コード領域における少なくとも１つの変異によって不能化されているｄｈｆｒをコードし、そして第３の選択マーカーは、３’コード領域における少なくとも１つの異なる変異によって不能化されているｄｈｆｒをコードする。この不能化変異は、例えば、点変異または欠失によるものであり得る。構築物が、プラスミドである場合、このトランスフェクション系は、以下：
（ｃ）それぞれ、前記第１および第２の選択マーカーならびに前記導入遺伝子に作動可能に連結されている、第１、第２および第３のプロモーター；
（ｄ）該第１および第２の選択マーカーならびに該導入遺伝子に作動可能に連結されている、ポリアデニル化部位をコードする配列；および
（ｅ）該第１および第２の選択マーカーならびに該導入遺伝子に作動可能に連結されている、複製起点をコードする配列
をさらに含み得る。ＣＭＶプロモーター、ＲＳＶプロモーターまたはＳＶ−４０初期プロモーターのようなプロモーターが、使用され得、そして各配列は、異なるプロモーターに作動可能に連結され得る。
【００１１】
別の局面において、本発明は、選択されたポリヌクレオチド配列の発現のための哺乳動物細胞株を産生するための方法を包含し、該方法は、以下：
（ａ）ゲノムを有する選択された哺乳動物細胞に、第１の構築物を導入する工程であって、該第１の構築物は、第１の選択マーカーをコードする配列および第２の選択マーカーをコードする配列を含み、該第２の選択マーカーは、そのコード配列中に少なくとも１つの不能化変異を含む、工程；
（ｂ）該第１の選択マーカーを発現する哺乳動物細胞について選択する工程であって、該第１の構築物は、該ゲノムに安定に組み込まれている、工程；
（ｃ）該哺乳動物細胞に、第２の構築物を導入する工程であって、該第２の構築物は、目的のポリヌクレオチド配列および第３の選択マーカーをコードする配列を含み、ここで、該第３の選択マーカーは、該第２の選択マーカーと同じ選択マーカーであるが、ただし、該第３の選択マーカーは、該第２の選択マーカー中の不能化変異とは異なるコード配列領域にある、少なくとも１つの不能化変異を含む、工程；および
（ｄ）該第２の選択マーカーによってコードされる機能的産物を発現する哺乳動物細胞について選択する工程であって、該機能的産物は、該第２の選択マーカーと該第３の選択マーカーとの間の組換え事象によって生じる配列によってコードされ、そして得られた哺乳動物細胞は、該選択されたポリヌクレオチド配列を発現し得る、工程
を包含する。特定の実施形態において、選択されたポリヌクレオチド配列は、ポリペプチドをコードし、そして選択されたポリヌクレオチド配列の発現は、このポリペプチドの発現を生じる。この方法によって産生された哺乳動物細胞もまた提供される。
【００１２】
別の局面において、本発明は、宿主哺乳動物細胞において目的のポリペプチドを産生するための方法を包含し、該方法は、以下：
（ａ）ゲノムを有する該細胞に、第１の構築物を導入する工程であって、該第１の構築物は、第１の選択マーカーをコードする配列および第２の選択マーカーをコードする配列を含み、該選択マーカーは、そのコード配列中に少なくとも１つの不能化変異を含む、工程；
（ｂ）該第１の選択マーカーを発現する哺乳動物細胞について選択する工程であって、該第１の構築物は、該ゲノムに安定に組み込まれている、工程；
（ｃ）該哺乳動物細胞に、第２の構築物を導入する工程であって、該第２の構築物は、目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列および第３の選択マーカーをコードする配列を含み、ここで、該第３の選択マーカーは、該第２の選択マーカーと同じ選択マーカーであるが、ただし、該第３の選択マーカーは、該第２の選択マーカー中の不能化変異とは異なるコード配列領域にある、少なくとも１つの不能化変異を含む、工程；
（ｄ）該第２の選択マーカーによってコードされる機能的産物を発現する哺乳動物細胞について選択する工程であって、該機能的産物は、該第２の選択マーカーと該第３の選択マーカーとの間の組換え事象によって生じる配列によってコードされ、そして得られた哺乳動物細胞は、該目的のポリペプチドを発現し得る、工程；および
該目的のポリペプチドを産生するような条件下で、該哺乳動物細胞を培養する工程
を包含する。
【００１３】
１つの実施形態において、第１の選択マーカーは、ネオマイシン耐性をコードし、そして第２および第３の選択マーカーは、ｄｈｆｒをコードする。特定の実施形態において、構築物は、エレクトロポレーションまたはリン酸カルシウムトランスフェクションによってこの細胞内に導入され得る。これらの方法に従って産生された哺乳動物細胞株もまた、包含される。
これらおよび他の実施形態は、本明細書の開示に顧みて当業者に容易に明らかである。
本発明は、以下の図面を参照してより十分に説明される。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１−１】図１は、ＣＡＢ２（配列番号３１）のヌクレオチド配列を示す。小文字は、元の配列を提示する。
【図１−２】 図１は、ＣＡＢ２（配列番号３１）のヌクレオチド配列を示す。小文字は、元の配列を提示する。
【図１−３】 図１は、ＣＡＢ２（配列番号３１）のヌクレオチド配列を示す。小文字は、元の配列を提示する。
【図２】図２は、ｐＥＳＮｄｈｆｒ、ｐＥＳＮ１ｄｈｆｒ、ｐＥＳＮ２ｄｈｆｒおよびｐＥＳＮ３ｄｈｆｒと命名された発現ベクターの模式図である。これらの発現ベクターは、Ｎｅｏ遺伝子の変異の位置および／または数において異なる。ｐＥＳＮｄｈｆｒは、野生型Ｎｅｏ配列を含む。ｐＥＳＮ１ｄｈｆｒは、Ｎｅｏ遺伝子産物のアミノ酸残基１８２を変更する変異を含む。ｐＥＳＮ２ｄｈｆｒは、Ｎｅｏ遺伝子産物のアミノ酸残基２６１を変更する変異を含み、そしてｐＥＳＮ３ｄｈｆｒは、Ｎｅｏ遺伝子産物のアミノ酸残基１８２および２６１の両方を変更する変異を含む。
【図３】図３は、ｐｃＤＮＡ３と命名された発現ベクターの模式図である。このベクターは、５４４６ヌクレオチドであり、そしてｐＵＣ１９ベクター骨格（塩基４４５０〜５３１０）において、以下の配列を含む：ＣＭＶプロモーター（塩基２０９〜８６３）；Ｔ７プロモーター（塩基８６４〜８８２）；ポリリンカー（塩基８８９〜９９４）、Ｓｐ６プロモーター（塩基９９９〜１０１６）；ＢＧＨポリＡ配列（塩基１０１８〜１２４９）；およびＳＶ４０プロモーター（塩基１７９０〜２２１５）；ＳＶ４０複製起点（塩基１９８４〜２０６９）；ネオマイシン耐性をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）（Ｎｅｏr）（塩基２１５１〜２９３２）；ＳＶ４０ポリＡ配列（塩基３１２０〜３２５０）；ならびにアンピシリン耐性をコードするＯＲＦ（Ａｍｐr）（塩基４４５０〜５３１０）。
【図４】図４は、ｐｎｅｏ*ｄｈｆｒ*１と命名されたＤＮＡ構築物の模式図である。これは、変異体ネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ*）および不能化ＤＨＦＲマーカー遺伝子を含み、ここで、ＸＸは、ＤＨＦＲ遺伝子における変異を表す。
【図５】図５は、ｐＸｄｈｆｒ*２と命名されたベクターを示す。これもまた、導入遺伝子および異なる部位（ＸＸによって示される）で変異された不能化されたＤＨＦＲ遺伝子を含む。
【図６】図６は、２つのコピーの不能化されたＤＨＦＲマーカー遺伝子での、ｐＸｄｈｆｒ*２とｐｎｅｏ*ｄｈｆｒ*１との間の相同組換えを示す。
【図７】図７は、相同組換えの産物を示し、ここで、不能化されたＤＨＦＲ遺伝子は、レスキューされ、そして導入遺伝子は、変異体ｎｅｏ*遺伝子に対して近位へのこの導入遺伝子の挿入によって、哺乳動物細胞ゲノムの高発現遺伝子座に配置されている。
【図８】図８は、ｐｄｈｆｒ*２ ＤＮＡ構築物を示す；導入遺伝子（例えば、組換えタンパク質遺伝子）を、ｐｄｈｆｒ*２のポリリンカーに挿入し、ｐＸｄｈｆｒ*２を作製し得る。
【図９】図９は、選択スキームを示し、ここで、ｐｄｈｆｒ３’ｄｅｌとして示されるＤＮＡ構築物は、ＤＨＦＲ遺伝子の欠失変異体を使用し、そしてポリリンカーへの導入遺伝子の挿入が、ｐＸｄｈｆｒ３’ｄｅｌと命名された構築物（例えば、ｐｄｈｆｒ３’ｄｅｌ）を形成する。
【図１０】図１０は、ＤＮＡ構築物、ｐｎｅｏ*ｄｈｆｒ５’ｄｅｌ（例えば、ｐｎｅｏ１ｄｈｆｒ５’ｄｅｌ、ｐｎｅｏ２ｄｈｆｒ５’ｄｅｌ、ｐｎｅｏ３ｄｈｆｒ５’ｄｅｌ）を示す。ここで、ＤＨＦＲ遺伝子は、５’欠失によって不能化され、そしてこの不能化された遺伝子は、変異体*ｎｅｏ遺伝子に共有結合されている。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
（詳細な説明）
本発明は、宿主細胞、特に哺乳動物細胞において、目的のポリペプチドの安定な高レベル発現を可能にする新規発現ベクターを提供する。この構築物は、（ｉ）第１の選択マーカーをコードする第１の配列；（ｉｉ）目的のポリペプチド産物をコードする第２の配列（例えば、「導入遺伝子」）；（ｉｉｉ）第２の選択マーカーをコードする第３の配列を含む。代表的には、これら３つの配列は、少なくとも１つの強力プロモーター（例えば、ＣＭＶプロモーター）に作動可能に連結され、目的の産物の発現を増加し、そして正確なスプライシングを促進する。
【００１６】
本発明はまた、本明細書に記載の構築物を用いる哺乳動物細胞のためのトランスフェクション系を含む。この系は、各構築物が第２の選択マーカー中に不能化（ｄｉｓａｂｌｉｎｇ）変異を有しているが、上記のような第１および第２の構築物を用いる。不能化変異は、第２の選択マーカーの異なる領域中にあり、その結果、この２つの産物間の相同的組換えが機能的産物を生成する。この系は、所望のポリペプチドの高発現を可能にする。本明細書に記載のトランスフェクション系により改変される哺乳動物細胞がまた提供され、これらのトランスフェクトされた細胞を作製する方法もまた提供される。
【００１７】
従って、本明細書に記載の発明は、哺乳動物細胞中の高発現遺伝子座の同定という退屈なプロセスをなくし、そしてそれによって任意の所望のポリペプチドが、本明細書に記載のように生成される新規細胞株を用いて高レベルで発現され得る効率的な機構を提供する。
【００１８】
（定義）
「核酸」分子は、制限されないで、原核生物配列、真核生物ｍＲＮＡ、真核生物ｍＲＮＡからのｃＤＮＡ、真核生物（例えば、哺乳動物）ＤＮＡからのゲノムＤＮＡ配列、および合成ＤＮＡ配列もさえ含む。この用語はまた、ＤＮＡおよびＲＮＡの任意の公知の塩基アナログを含む配列を捕捉する。「コード配列」または選択されたポリペプチドを「コード」する配列は、適切な調節配列（または「制御エレメント」）の制御下に配置されたとき、インビボでポリペプチドに転写され（ＤＮＡの場合）そして翻訳される（ｍＲＮＡの場合）核酸分子である。このコード配列の境界は、５’（アミノ）末端にある開始コドンおよび３’（カルボキシ）末端にある翻訳停止コドンにより決定される。コード配列は、制限されないで、ウイルス、原核生物または真核生物ｍＲＮＡからのｃＤＮＡ、ウイルスまたは原核生物ＤＮＡからのゲノムＤＮＡ配列、および合成ＤＮＡ配列さえも含み得る。転写終結コドンは、このコード配列の３’に位置し得る。
【００１９】
代表的な「制御エレメント」は、制限されないで、転写プロモーター、転写エンハンサーエレメント，転写停止シグナル、ポリアデニル化配列（翻訳停止コドンの３’に位置する）、翻訳の開始の最適化のための配列（コード配列の５’に位置する）、および翻訳終止配列を含む。
【００２０】
「作動可能に連結（される）」は、そのように記載された成分がそれらの通常の機能を実行するように構成されるエレメントの配置をいう。従って、コード配列に作動可能に連結された所定のプロモーターは、適切な酵素が存在するとき、コード配列の発現を行い得る。このプロモーターは、それが、その発現を行うように機能する限り、コード配列と連続する必要はない。従って、例えば、介在する非翻訳ではあるがなお転写される配列が、プロモーター配列とコード配列との間に存在し得、そしてこのプロモーター配列はなお、コード配列に「作動可能に連結される」と考えられ得る。
【００２１】
本明細書で核酸分子を記載するために用いられるような「組換え（体）」は、ゲノム、ｃＤＮＡ，半合成、または合成起源のポリヌクレオチドを意味し、それは、その起源または操作のため：（１）天然でそれが会合しているポリヌクレオチドの全てまたは部分と会合していない；および／または（２）天然でそれが連結しているポリヌクレオチド以外のポリヌレレオチドに連結されている。タンパク質またはポペプチドに関して用いられるとき、用語「組換え（体）」は、組換え体ポリヌクレオチドの発現により産生されるポリペプチドを意味する。「組換宿主細胞」、「宿主細胞」、「細胞」、「細胞株」、「細胞培養」、およびその他のそのような用語は、原核微生物または単細胞実体として培養された真核生物細胞株を示し、交換可能に用いられ、そして組換えベクターまたはその他の移入ＤＮＡのレシピエントとして使用され得る、または使用された細胞をいい、そしてトランスフェクトされた当初の細胞の子孫を含む。１つの親細胞の子孫が、偶発的または意図的な変異に起因して、当初の親と形態においてまたは総ＤＮＡ相補物において必ずしも完全に同一である必要のないことは理解される。所望のポリペプチドをコードする核酸配列の存在のような、関係ある性質によって特徴付けられる、親と十分に類似である親細胞の子孫は、この定義により意図される子孫に含まれ、そして上記の用語によってカバーされる。
【００２２】
核酸およびアミノ酸「配列同一性」を決定する技法は当該分野で公知である。代表的には、このような技法は、遺伝子のｍＲＮＡのヌクレオチド配列を決定することおよび／またはそれによってコードされるアミノ酸配列を決定すること、およびこれらの配列を第２のヌクレオチドまたはアミノ酸配列と比較することを含む。一般に「同一性」は、２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の、それぞれ、正確なヌクレオチド対ヌクレオチドおよびアミノ酸対アミノ酸対応をいう。２つ以上の配列（ポリヌクレオチドまたはアミノ酸）は、それらの「同一性％」を決定することにより比較され得る。２つの配列の同一性％は、核酸またはアミノ酸配列いずれにおいても、より短い配列の長さで除し、そして１００を乗じた、２つのアラインされた配列間の正確なマッチの数である。核酸配列の適切なアラインメントは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ ２：４８２−４８９（１９８１）の局所相同性アルゴリズムにより提供される。このアルゴリズムは、Ｄａｙｈｏｆｆ、Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ編、５ ｓｕｐｐｌ．３：３５３−３５８、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、Ｄ．Ｃ．、ＵＳＡにより開発され、そしてＧｒｉｂｓｋｏｖ、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４（６）：６７４５−６７６３（１９８６）により規準化されたスコアリングマトリックスを用いることによりアミノ酸に適用され得る。配列の同一性％を決定するためのこのアルゴリズムの例示の履行は、「ＢｅｓｔＦｉｔ」ユーティリティアプリケーション中のＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）により提供される。この方法のデフォールトパラメーターは、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ Ｐｒｏｇｒａｍ Ｍａｎｕａｌ、Ｖｅｒｓｉｏｎ ８（１９９５）に記載されている（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩから入手可能）。本発明の文脈において同一性％を確立する好適な方法は、Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ大学が著作権をもつ、Ｊｏｈｎ Ｆ．ＣｏｌｌｉｎｓおよびＳｈａｎｅ
Ｓ．Ｓｔｕｒｒｏｋにより開発され、そしてＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）により頒布されるプログラムのＭＰＳＲＣＨパッケージを用いることである。このパッケージスーツから、上記Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムが採用され得、そこでは、デフォールトパラメーターがスコアリングテーブルのために用いられる（例えば、１２のギャップオープンペナルティ、１のギャップ伸長ペナルティ、および６のギャップ）。生成されたデータから「マッチ」値は「配列同一性」を反映する。配列間の同一性％または類似性％を算出するためのその他の適切なプログラムは、一般に、当該分野で公知である。
【００２３】
２つの核酸フラグメントは、本明細書で記載のように「選択的にハイブリダイズする」と考えられる。２つの核酸分子間の配列同一性の程度は、このような分子間のハイブリダイゼーション事象の効率および強さに影響する。部分的に同一である核酸配列は、完全に同一である配列の標的分子へのハイブリダイゼーションを少なくとも部分的に阻害する。この完全に同一である配列のハイブリダイゼーションの阻害は、当該分野で周知であるハイブリダイゼーションアッセイ（例えば、サザンブロット、ノザンブロット、溶液ハイブリダイゼーションなど、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前述、またはＡｕｓｕｂｅｌら、前述）を用いて評価され得る。このようなアッセイは、変化する程度の選択性を用い、例えば、低〜高ストリンジェンシーで変化する条件を用いて実施され得る。低ストリンジェンシーの条件が採用される場合、非特異的結合の不在は、配列同一性の部分的程度でさえ欠いている第２プローブ（例えば、標的分子と約３０％より少ない配列同一性を有すプローブ）を用いることで評価することができ、その結果、非特異的事象の不在下、この第２プローブは標的にハイブリダイズしない。
【００２４】
ハイブリダイゼーションを基礎にする検出系を利用するとき、標的核酸配列に相補的である核酸プローブが選択され、次いで、適切な条件の選択により、このプローブと標的配列とが、互いに「選択的にハイブリダイズする」、すなわちは結合し、ハイブリッド分子を形成する。「中程度にストリンジェント」下で標的配列に選択的にハイブリダイズし得る核酸分子は、代表的には、選択された核酸プローブの配列と、少なくとも約７０％の配列同一性を有する長さが少なくとも約１０−１４ヌクレオチドの標的核酸配列の検出を可能にする条件下でハイブリダイズする。ストリンジェントハイブリダイゼーション条件は、代表的には、選択された核酸プロープの配列と、約９０−９５％より大きい配列同一性を有する長さが少なくとも約１０−１４ヌクレオチドの標的核酸配列の検出を可能にする。プローブと標的とが所定の程度の配列同一性を有する場合のプローブ／標的ハイブリダイゼーションに有用なハイブリダイゼーション条件は、当該分野で公知のように決定され得る（例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、編者 Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ（１９８５）Ｏｘｆｏｒｄ；Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、Ｄ．Ｃ；ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓを参照のこと）。
【００２５】
ハイブリダイゼーションのストリンジェンシー条件に関し、例えば、以下の因子を変更することによって、特定のストリンジェンシーを確立するために多くの等価な条件が採用され得ることは当該分野で周知である：プローブおよび標的配列の長さおよび性質、種々の配列の塩基組成、塩およびその他のハイブリダイゼーション溶液成分の濃度、ハイブリダイゼーション溶液中のブロッキング薬剤の存在または不在（例えば、ホルムアミド、硫酸デキストラン、およびポリエチレングリコール）、ハイブリダイゼーション温度および時間パラメーター、および、洗浄条件を変えること。特定のセットのハイブリダイゼーション条件の選択は、当該分野で標準的な方法に従って選択される（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前述、またはＡｕｓｕｂｅｌら、前述を参照のこと）。
【００２６】
第１のポリヌクレオチドは、それが第２のポリヌクレオチドの領域、そのｃＤＮＡ、その相補物と同じか、または実質的に同じ塩基対配列を有する場合、またはそれが上記のような配列同一性を提示する場合、第２のポリヌクレオチド「由来」である。第１のポリペプチドは、それが（ｉ）第２のポリヌクレオチド由来の第１のポリヌクレオチドによりコードされるか、または（ｉｉ）上記のように第２のポリペプチドに対し配列同一性を提示する場合、第２のポリペプチドに「由来」する。
【００２７】
「によりコードされる」は、ポリペプチド配列をコードする核酸配列をいい、ここでこのポリペプチド配列またはその部分は、この核酸配列によりコードされるポリペプチドからの、少なくとも３〜５アミノ酸、より好ましくは少なくとも８〜１０アミノ酸、そしてなおより好ましくは少なくとも１５〜２０アミノ酸を含む。これもまた包含されるのは、この配列によりコードされるポリペプチドと免疫学的に同定可能であるポリペプチド配列である。
【００２８】
「精製されたポリヌクレオド」は、それが天然に会合するタンパク質が本質的にない、例えば、約５０％より少なく、好ましくは約７０％より少なく、そしてより好ましくは約９０％より少なく含む、目的のポリヌクレオチドまたはそのフラグメントをいう。目的のポリヌクレオドを精製する技法は、当該分野で周知であり、そして例えば、このポリヌクレオドを含む細胞のカオトロピック試薬を用いた破壊、およびイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーおよび密度による沈降によるポリヌクレオドおよびタンパク質の分離を含む。
【００２９】
用語「トランスフェクション」は、細胞による外来ＤＮＡの取込みをいうために用いる。外来ＤＮＡが細胞膜の内側に導入されたとき、細胞は「トランスフェクトされ」ている。多くのトランスフェクション技法が一般に当該分野で公知である。例えば、Ｇｒａｈａｍら（１９７３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、５２：４５６、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｏｒｉｅｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｄａｖｉｓら（１９８６）Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、およびＣｈｕら（１９８１）Ｇｅｎｅ １３：１９７を参照のこと。このような技法は、１つ以上の外来ＤＮＡ成分を適切な宿主細胞中に導入するために用いられ得る。この用語は、遺伝子物質の安定および一時的取込みの両方をいい、そしてペプチド−または抗体連結ＤＮＡの取込みを含む。
【００３０】
「核酸発現ベクター」または「発現カセット」は、目的の配列または遺伝子の発現を行い得るアセンブリをいう。この核酸発現ベクターは、目的の配列または遺伝子（単数または複数）に作動可能に連結されているプロモーターを含む。その他の制御エレメントが同様に存在し得る。本明細書で記載される発現カセットは、プラスミド構築物内に含まれる得る。発現カセットの成分に加えて、プラスミド構築物はまた、細菌の複製起点、１つ以上の選択マーカー、プラスミド構築物を一本鎖ＤＮＡとして存在させるシグナル（例えば、複製のＭ１３起点）、複数クローニング部位、および「哺乳動物」複製起点（例えば、複製のＳＶ４０またはアデノウイルス起点）を含み得る。ベクター骨格は、さらに詳細に以下に論議される。「ベクター」は、標的細胞（例えば、ウイルスベクター、非ウイルスベクター、粒子状キャリア、およびリポソーム）に遺伝子配列を移入し得る。代表的には、「ベクター構築物」、「発現ベクター」、および「遺伝子移入ベクター」は、目的の遺伝子の発現を行い得る任意の核酸構築物を意味し、そしてこれは、標的細胞に遺伝子配列を移入し得る。従って、この用語は、クローニングおよび発現ビヒクル、ならびにウイルスベクターを含む。
【００３１】
「選択マーカー」または「レポーターマーカー」は、治療的活性を有さず、むしろ遺伝子移入ベクターのより簡単な調製、操作、特徴付けまたは試験を可能にするために含まれる遺伝子移入ベクター中に含まれるヌクレオチド配列をいう。適切な選択マーカーは以下にさらに論議される。
【００３２】
（発現ベクター）
１つの実施形態では、発現ベクターは、（ｉ）第１の不活化された選択マーカー；（ｉｉ）目的の産物、「導入遺伝子」とも呼ばれる；および（ｉｉｉ）第２の増幅可能な選択マーカーをコードするポリヌクレオチドを含む。「不活化された（ｃｒｉｐｐｌｅｄ）」とは、マーカーの機能を減退させるが破壊しない１つ以上の変異を含む、選択マーカーをコードする配列を意味する。１つの実施形態では、第１の不活化された選択マーカーは、ネオマイシン耐性（Ｎｅｏr）配列であり、そこでは、アミノ酸残基１８２（Ｇｌｕ）がＡｓｐに変異している（図２、ｐＥＳＮ１．ｄｈｆｒおよびＹａｎｏｆｓｋｙら、後述を参照のこと）。別の実施形態では、第１の不活化された選択マーカーは、Ｎｅｏr配列であり、そこではアミノ酸残基２６１（Ａｓｐ）がＡｓｎ（Ｎ）に変異されている。（図２、ｐＥＳＮ２．ｄｈｆｒ）。なお別の実施形態では、第１の不活化された選択マーカーは、上記に記載変異の両方を含むＮｅｏr配列であり、例えば、Ｇｌｕ１８２がＡｓｐ、そしてＡｓｐ２６１がＳｎである。（図２、ｐＥＳＮ３，ｄｈｆｒを参照のこと）。不活化変異を作製および試験するその他の選択マーカーおよび方法は、以下に論議される。
【００３３】
発現ベクターにまた含まれるのは、目的の産物をコードする配列（すなわち、「導入遺伝子」）である。適切な導入遺伝子は、目的の任意のポリペプチドをコードするポリペプチドを含む。１つの実施形態では、この導入遺伝子は「ＣＡＢ」のようなキメラタンパク質をコードする。ＣＡＢは、膜補因子タンパク質（ＭＴＰ）および減衰加速因子（ＳＡＦ）の特徴を組み合わせ、補体活性化を阻害する。例えば、Ｈｉｇｇｉｎｓら（１９９７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １５８（６）：２８７２−２８８１を参照のこと。特定の実施形態では、導入遺伝子をコードする配列はまた、本明細書に記載のように、産物の異常ｍＲＮＡスプライシングが減少またはなくなるように設計され得る。
【００３４】
発現ベクターはまた、第２の選択可能な増幅し得るマーカーを含む。この第２の選択し得るマーカーは、導入遺伝子を高レベルで発現するような細胞の選択を容易にする、例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）である。適切なマーカーは詳細に以下に論議される。
【００３５】
本発明の発現ベクターは、当該分野で公知の技法を考慮して、本明細書の教示に従い生成され得る。例えば、導入遺伝子をコードする配列は、市販されているかも知れず、例えば、グリーン蛍光タンパク質（Ｇ．Ｐ．）は、Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡから入手可能であり、そしてルシファース（ｌｕｃｉｆｅｒｓ）は、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ．から入手可能である。本明細書で例示されるのは、キメラタンパク質ＣＡＢの高レベル発現およびＨＩＶタンパク質の発現を行う発現ベクターである。しかし、本発明の発現ベクター、構築物および方法が、目的の任意のポリペプチドの高レベル発現に利用可能であることを理解すべきである。
【００３６】
本発明で用いられるポリヌクレオチドの別の標準的な供給源は、勿論、生物（例えば、細菌）、細胞、または選択された組織から単離されるポリヌクレオチドである。選択された供給源からの核酸は、標準的な手順により単離され得、これは、代表的には、連続的なフェノールおよびフェノール／クロロホルム抽出、次いでエタノール沈殿を含む。沈殿後、ポリヌクレオチドは、核酸分子をフラグメントに切断する制限エンドヌクレアーゼで処理され得る。選択されたサイズのフラグメントは、多くの技法により分離され得、これには、アガロースまたはポリアクリルアミドゲル電気泳動またはパルスフィールドゲル電気泳動（Ｃａｒｅら（１９８４）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１２：５６４７−５６６４；Ｃｈｕら（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３４：１５８２；Ｓｍｉｔｈら（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １５１：４６１）が含まれ、クローニングのための適切なサイズ開始物質を提供する。
【００３７】
発現ベクターまたは構築物のヌクレオチド成分を得る別の方法はＰＣＲである。ＰＣＲの一般的手順は、ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎら、ＰＣＲ：Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＡＰＰＲＯＡＣＨ、（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、（１９９１））に教示されている。各適用反応のためのＰＣＲ条件は、実験的に決定され得る。多くのパラメーターが反応の成功に影響する。これらのパラメーターは、アニーリング温度および時間、伸長時間、Ｍｇ2+およびＡＴＰ濃度、ｐＨ、およびプライマー、テンプレートおよびデオキシヌクレオチドの相対的濃度である。例示のプライマーは実施例で以下に記載する。増幅後、得られるフラグメントは、アガロースゲル電気泳動、次いで臭化エチジウム染色および紫外線照射を用いた可視化により検出され得る。
【００３８】
ポリヌクレオチドを得るための別の方法は、酵素消化による。例えば、ヌクレオチド配列は、適切な認識制限酵素での適切なベクターの消化により生成され得る。制限切断フラグメントは、標準的な技法を用い、４つのデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）の存在下、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｋｌｅｎｏｗ）の大フラグメントを用いた処理により平滑末端とされ得る。
【００３９】
ポリヌクレオチドは、当該分野で周知の方法を用い、適切な骨格、例えば、プラスミド中に挿入される。例えば、挿入物およびベクターＤＮＡを、適切な条件下で制限酵素と接触させ、互いに対合し得る各分子上に相補的末端または平滑末端を作製し得る。あるいは、合成の核酸リンカーをポリヌクレオチドの末端に連結し得る。これらの合成リンカーは、ベクターＤＮＡ内の特定の制限部位に対応する核酸配列を含み得る。その他の手段が当該分野で公知かつ利用可能である。種々の供給源が、成分ポリヌクレオチドのために用いられる得る。
【００４０】
（トランスフェクション系のための構築物）
本発明はまた、第１および第２の構築物を用いること、特に、安定にトランスフェクトされた細胞株、特に哺乳動物細胞株を産生および選択する方法を含む。本明細書に記載のトランスフェクション系では、第１の構築物は、第１および第２の選択マーカーをコードするポリヌクレオチドを含む。第１の選択マーカーは、代表的には、強力プロモーターの制御下にある。上記のように、この第１の選択マーカーは、好ましくは、少なくとも１つの不活化変異を含む。さらに、これらの実施形態では、第２のマーカーは、好ましくは、コード領域の３’または５’にある不能化変異を含む。「不能化（ｄｉｓａｂｌｉｎｇ）」により、機能的遺伝子産物を低減、または好ましくは、排除する変異を意味する。
【００４１】
例示の第１の構築物は図４に示され、そしてｐｎｅｏ*ｄｈｆｒ*１と識別される。この構築物によりコードされる第１の選択マーカーは、ネオマイシンに対する耐性を与える抗生物質耐性マーカー（ｎｅｏ*）、好ましくは、図中ｎｅｏ*で示される、ｎｅｏの不活化変異体である。このｎｅｏ*遺伝子は、強力プロモーター（例えば、ＣＭＶまたはＲＳＶ、ｎｅｏ*遺伝子の３’に示される）に作動可能に連結され、そして、一般に、ポリアデニル化配列（例えば、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化部位）のようなその他の発現調節エレメントに連結され得る。さらに、微生物における増殖に有用な複製起点もまた含まれ得る（例えば、ｆ１ ｏｒｉ）。このＢＧＨポリＡ配列およびｆ１起点は、代表的には、ｎｅｏ*遺伝子の５’にある。
【００４２】
この例では、ｐｎｅｏ*ｄｈｆｒ*１構築物の第２の選択マーカーは、例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）をコードする。しかし、この第２の選択―カーの機能は不能化されている。図４を参照して、ＸＸは、ＤＨＦＲ遺伝子の５’末端に隣接する不能化変異を表す。このＤＨＦＲ遺伝子は、ＳＶ４０初期プロモーターにより駆動され、そしてその３’末端に、ＳＶ４０ポリＡ、ＣｏｌＥ１、ＡｍｐＲ、および（図４に示されるＢｇｌＩＩＩのような）適切な制限部位がある。
【００４３】
このトランスフェクション系の第２のベクター構築物は、目的の異質ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（図では「導入遺伝子」と標識される）、および第１の構築物で用いられる同じ第２のマーカー（即ち、「第２の」選択マーカー）をコードするポリヌクレオチドを含む。しかし、この第２の構築物では、第２のマーカー配列は、好ましくはコード領域の反対の末端上にあり、第１の構築物に対して異なる位置にある不能化変異を含む。第１の構築物の第２の選択マーカーにおける不能化変異の位置、および第２の構築物の選択マーカーにおける不能化変異における位置は、２つのコピーのコード配列間の単一の組換え事象が、機能的な選択マーカーを生成し得るようにある。一旦、第１の構築物が宿主細胞のゲノム中にランダムに組込まれると、組込まれた第１の構築物と第２の構築物との間の相同的組換え事象が、強力プロモーターの制御下にある導入遺伝子の挿入を生じる。機能的な組換えは、第２の選択マーカーをアッセイすることにより容易に選択され得る。従って、例えば、Ｄｅｔｌｏｆｆら（１９９４）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １４：３９３６−６９４１に記載のような、その他の標的系とは異なり、本明細書に記載のトランスフェクション系は、目的の導入遺伝子を改変する相同的組換え事象に依存しない。
【００４４】
例示の第２の構築物は図５に示され、そしてｐＸｄｈｆｒ*２と称される。ここで、導入遺伝子は、ＣＭＶプロモーターに作動可能に連結され、そして３’ＢＧＨポリＡテールおよびｆ１複製起点を含む。第２の選択マーカーであるＤＨＦＲは、第１の構築物における不能化マーカーとはコード領域の反対側にある変異（単数または複数）により不能化されている。従って、図５では、変異（ＸＸで表される）は、ＤＨＦＲ配列の３’末端にある。ｐｎｅｏ*ｄｈｆｒ*１構築物におけるように、この不能化ＤＨＦＲマーカーには、ＳＶ４０ポリＡ、ＣｏｌＥ１、ＡｍｐＲ、およびこの場合ＢｇｌＩＩＩである適合制限部位が続く。
【００４５】
トランスフェクション系における使用のための第１および第２の構築物は、当該分野で公知の方法を用い、例えば、上記のような本明細書の指針に従って生成され得る。
【００４６】
（一般的方法）
本明細書中に記載される発現ベクターおよび方法は、目的の導入遺伝子の発現の改善に有用である。哺乳動物細胞における遺伝子の安定した高レベルの発現は、重要なことに、組み込みの部位およびコピー数の両方に依存する。例えば、通常の濃度のネオマイシンアナログＧ４１８によって課せられる選択圧は、低く、広範な異なる発現レベルで細胞クローンを生じる。導入遺伝子を有する異常なスプライス部位もまた、発現を妨げ得る。本明細書中に記載される発現ベクターは、目的の導入遺伝子に作動可能に連結された不活化された第１の選択可能なマーカー、および第２の増幅可能で選択可能なマーカー（これは、特定の実施形態において、不能化変異を含む）を使用することによって、この課題および他の課題を解決する。不活化マーカーおよび第２のマーカーは、高発現クローンの選択を可能にする。さらに、発現は、異常切断（ｓｌｉｃｉｎｇ）が矯正されるように、導入遺伝子を変更することによって増加され得る。必要に応じて、イントロンおよび／またはエンハンサーを含む強力なプロモーターもまた、導入遺伝子の発現を促進するために付加され得る。
【００４７】
本発明はまた、第１および第２の構築物を使用する、新規なトランスフェクション系を提供する。これらの高度に効率的な方法は、高レベルの所望されるポリペプチドを産生する細胞を生成し得る。細胞は、標的細胞ゲノムにランダムに組み込まれる第１の構築物を用いて形質転換される。代表的な標的細胞として、哺乳動物および細胞株（例えば、ＢＨＫ、ＶＥＲＯ、ＨＴ１０８０、２９３、ＲＤ、ＣＯＳ−７、およびＣＨＯ細胞）が挙げられるが、これらに限定されない。これらの細胞は、第１の選択可能なマーカーに対する適切な基質の存在下（例えば、第１の選択可能なマーカーがネオマイシンをコードする場合には、Ｇ４１８）で増殖される。高濃度の抗生物質中での選択を生存する細胞は、高発現遺伝子座においてネオマイシン耐性遺伝子を組み込んでいる。
【００４８】
次いで、組み込まれた第１の構築物を有する細胞は、以下の技術によって、本発明の細胞株を作製するために使用される。第２の構築物は、第１の構築物の組み込まれたコピーを有する細胞内に導入される。２個の不能化されたＤＨＦＲ遺伝子間の相同組換えは、機能的ＤＨＦＲ遺伝子、ならびに高発現遺伝子座における機能的ポリペプチドをコードする所望の遺伝子の挿入を生じる（図７を参照のこと）。適切な毒素または抗生物質（例えば、メトトレキセート）を用いて選択を生存する細胞株は、首尾良く相同組換えを起こす。
【００４９】
第２の工程は、目的のポリペプチドの高レベルの発現を得るために、機能的ポリペプチドをコードする所望される遺伝子（すなわち、導入遺伝子）における、任意の回数の変更によって繰り返され得る。本明細書中で、この技術は、図を参照してより詳細に記載される。
【００５０】
（導入遺伝子）
本明細書中に記載されるトランスフェクション系は、目的の任意のポリペプチドを発現するのに有用である。本明細書中で使用される場合、用語「導入遺伝子」は、細胞における高レベルでの発現が所望される、哺乳動物細胞のゲノムに挿入される外因性ＤＮＡをいう。本発明に使用される導入遺伝子は、機能的ポリペプチドをコードし、これは、生物学的活性を有するアミノ酸配列であり、または生物学的活性を有するタンパク質の前駆体であるアミノ酸配列である。他のポリペプチド（例えば、エピトープまたは他の免疫学的に活性なポリペプチド）の発現は本発明の範囲内であると考えられるが、この導入遺伝子は、一般的に、天然タンパク質または組換えタンパク質をコードする。本発明の方法を使用して発現され得るタンパク質の例は、ホルモン；サイトカイン（例えば、増殖因子）；酵素；レセプター；オンコジーン；ポリペプチドワクチン、ウイルスタンパク質、ならびに構造タンパク質および分泌タンパク質である。１実施形態において、発現ベクターは、上記のＣＡＢ２をコードする配列を含む。これらの配列は、異常スプライシングが補正されるようにさらに改変された。実施例を参照のこと。別の実施形態において、発現ベクターは、特にＨＩＶから誘導体化されるウイルスポリペプチドをコードする配列を含む。これらのウイルスポリペプチドとして、エンベロープ（Ｅｎｖ）ポリペプチド（例えば、ｇｐ１２０、ｇｐ１６０、ｇｐ１４０、ｇｐ４１、およびモノマーまたはそれらの多量体）、Ｇａｇポリペプチド（例えば、Ｇａｇ、Ｇａｇ−プロテアーゼ、Ｇａｇ−ポリメラーゼ）、ｒｅｖ、ｔａｔなどが挙げられるが、これらに限定されない。さらに、この発現ベクターは、合成ＨＩＶポリペプチドについてコードする導入遺伝子（例えば、実施例に記載される構築物）を含み得る。
【００５１】
本発明の構築物において使用される導入遺伝子は、イントロン領域を保持するクローン化された配列であり得る。遺伝子のエキソン構造体が公知である場合、コードエキソンはこの構造体に挿入され得る。
【００５２】
目的のポリペプチドの発現は、ポリペプチドをコードする配列に対して相同性のあるプロモーターによって指向され得る（例えば、それ自体の転写プロモーター配列の制御下におけるヒトグルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ）。さらに、他の相同性または非相同性の発現制御要素（例えば、転写、翻訳、または翻訳後の事象に影響を及ぼす）が使用され得る。
【００５３】
本発明の哺乳動物細胞における導入遺伝子の発現が安定または一過性であり得ることが理解されるべきである。通常のレベルより高いレベルでの一過性発現でさえ、細胞中の機能的研究、または目的のタンパク質の産生および回復に有用である。
【００５４】
（選択マーカー）
選択マーカーをコードする任意の適切な配列は、本明細書において記載される組成物および方法において第１または第２のマーカーとして使用され得る。代表的には、本発明において使用される選択マーカー遺伝子は、容易に入手可能な供給源から入手され得る。
【００５５】
本発明の１つの実施形態において（付随する図面において記載される）、第１の選択マーカーは、抗生物質に耐性を付与する遺伝子をコードする。たとえば、１つの局面において、この第１の選択マーカーは、ネオマイシン（ｎｅｏ）耐性遺伝子を含む。好ましい実施形態において、ｎｅｏ*と称される、変異体ｎｅｏ遺伝子を使用して、哺乳動物細胞の染色体ＤＮＡ内の高発現の遺伝子座を確立することができる（例えば、以下を参照のこと：Ｙａｎｏｆｓｋｙ ｅｔ ａｌ．９（１９９０）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８７：３４３５−３９）。トランスポゾンＴｎ５のネオマイシン耐性遺伝子は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩをコードし、これは、Ｇ４１８およびカナマイシンを含む種々の抗生物質に対する耐性を付与する。単一塩基置換は、この酵素の機能を有意に損なう。選択マーカーとして使用されるｎｅｏ耐性遺伝子は、制限酵素消化によって同定され得る。なぜなら、塩基変化は、ＸｈｏＩＩ制限部位の喪失を生じるからである。本発明において使用するための変異体ｎｅｏ遺伝子を作製する技術について、以下もまた参照のこと：Ｂｌａｚｑｕｅｚｅｔ ａｌ．，（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，（２９９１）５（６）：１５１１−１５１８）。基質（例えば、Ｇ４１８）の最適な量は、各々の細胞下部について個々に決定され得る。他の類似の選択マーカーとしては、以下に列挙されるものがあげられるがそれらに限定されない。
【００５６】
温度感受性選択マーカーもまた、本発明の実施において使用され得る。例えば、温度感受性ｎｅｏは、非ストリンジェント温度においてほぼ野生型の機能を呈し、そしてストリンジェント温度では、低い活性を有する。エレクトロポレーションおよびｐｎｅｏ*ｔｓ−ｄｈｆｒ*ｌの初期の選択の後、挿入は、Ｇ４１８を非ストリンジェントな温度で用いて行われ得る。コロニーが増殖し始めた後、ストリンジェントな温度を使用して、低い発現挿入を有するコロニーを殺傷して除き得る。
【００５７】
上記のように、第２の選択マーカーを、含ませて発現を増強する。発現ベクターにおいて、第２のマーカーは、代表的に、増幅可能なマーカーであり、例えば、ＤＨＦＲである。ＤＨＦＲは、プリン生合成に必要である。敏感なプリンの非存在下で、この酵素は、増殖に必要である。メトトレキサートは、ＤＨＦＲの強力な競合インヒビターであり、漸増濃度のメトトレキサートにより、ＤＨＦＲの増加したレベルを発現する細胞についての選択を行う。極度に高レベルの、トランスフェクトされた正常ＤＨＦＲ遺伝子の発現は、高い内因性ＤＨＦＲレベルを伴う細胞株の選択に必要である。さらにより高いレベルへ発現を増加させるために、導入遺伝子を、標準的なＤＨＦＲ増幅方法により増幅し得る。
【００５８】
トランスフェクション方法において使用される構築物について、第２の選択マーカーは、請求されたトランスフェクション系の第１の構築物および第２の構築物の両方において見出される。しかし、これらのコピーの第２の選択マーカーは、異なる領域において変異によって不能化されている。これらの変異は、２つの変異したコピーの間の相同組換えが遺伝子の機能をレスキューするように存在する。１つの実施形態において、第２の（不能化された）選択マーカーは、ＤＨＦＲをコードする。
【００５９】
第１の構築物および第２の構築物の第２の選択マーカーに対する不能化変異は、種々の方法により導入され得る。例えば、ＤＨＦＲ遺伝子または他のマーカー遺伝子は、ネイティブ遺伝子配列におけるヌクレオチドの欠失またはヌクレオチドの置換によって不能化され得る。Ｂｕｌｌｅｒｊａｈｎ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．ｏｆ Ｂｉｏ Ｃｈｅｍ．（１９９２）２６７：８６４−８７０）は、残基の欠失および／または置換によってジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＭＭ）酵素の活性がどのように影響を受けるかの概説を提供する。著者らは、重要な領域における欠失を記載した（変更された遺伝子を発現することによって達成された）。これは、アミノ酸の欠失の後の、完全な活性の喪失を伴う活性の低減を生じる。さらに、メトトレキサートに耐性である酵素をコードする変異体ＤＨＦＲ遺伝子も入手可能である（Ｓｉｍｏｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８３）ＰＮＡＳ ＵＳＡ
８０：２４９５−２４９９）。
【００６０】
いくつかの場合において、第２の選択マーカー（例えば、ＤＨＦＲ）をコードする遺伝子を増幅することもまた所望され得る。これは、例えば、基質（たとえば、メトトレキサート）の濃度を増加させることにより達成され得る。したがって、多数回増幅した、ＤＨＦＲ遺伝子の複数コピーを有する細胞は、高レベルに対するメトトレキサートの濃度における連続的な増加によって選択され得る。この技術はまた、安定な形質転換体を同定することをも可能にする。すなわち、この表現型は、しばしば不安定であり、何回かの細胞周期の後に、選択圧の非存在かで喪失するが、他方、不安定なＤＨＦＲ遺伝子の構成は、連続的な選択圧下で安定になる。安定に増幅した細胞は、増幅したＤＨＦＲ遺伝子をその染色体内に含む。
【００６１】
他の選択マーカーであって、安定な形質転換体の単離を可能にするものは、本発明において、第１のマーカーまたは第２の（不能化）マーカーのいずれかとして使用され得ることが理解される。別の選択マーカーの例は、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）である。チミジン、９−β−Ｄ−キシロフラノシルアデニン（Ｘｙｌ−Ａ）および２’−デノキシコホルマイシン（ｄＣＦ）を補充した培地が使用される。Ｘｙｌ−Ａは、Ｘｙｌ−ＡＴＰへと変換され得、そして核酸に取り込まれ得る。これは、細胞死を生じる。Ｘｙｌ−Ａは、そのイノシン誘導体をＡＤＡによって無毒化する。ｄＣＦは、ＡＤＡの中間状態アナログインヒビターであり、そして親の細胞型にとって内因性であるＡＤＡを不活化するために必要である。内因性ＡＤＡのレベルは細胞型により変動することから、選択について適切な濃度のｄＣＰもまた変動する。Ｋａｕｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８６）ＰＮＡＳ ＵＳＡ，８３：３１３６。ＡＤＡ欠失ＣＨＯ細胞もまた利用可能である。
【００６２】
本発明において使用するために適切な選択マーカーはチミジンキナーゼ（ＴＫ）である。以前の章において（ＴＫ-からＴＸ+へ）、完全培地は、ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジンおよびグリシンが補充された（ＨＡＴ培地）。逆選択（ＴＫ+からＴＸ-）では、完全培地は、５−ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）が補充される。正常な増殖条件下で、細胞は、チミジンキナーゼを必要としない。なぜなら、ｄＴＤＰを合成するための通常の手段は、ｄＣＤＰを経由するからである。ＢｒｄＵの培地への添加により、Ｔｋ+細胞が殺傷される。ＢｒｄＵは、ＴＸによりリン酸化されそしてついでＤＮＡへと取り込まれるからである。ＨＡＴ培地におけるＴＫ+細胞の選択は主に、アミノプテリンの存在に起因し、これは、ｄＣＤＰからのｄＴＤＰの形成をブロックする。したがって、細胞は、ＴＫを必要とする経路であるチミジンからｄＴＴＰの合成を必要とする。チミジンキナーゼは、哺乳動物細胞培養において広汎に使用されている。なぜなら、正の選択条件および逆の選択条件の両方が存在するからである。ＡＤＡおよびＤＨＦＲのように。ほとんどの哺乳動物細胞株は、ＴＫを発現することから、ＢｒｄＵがＴＫ-変異体を選択するために使用される場合以外は、これらの株においてマーカーを使用する可能性を除去する。以下を参照のこと：Ｌｉｔｔｌｅｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，（１９６４）Ｓｃｉｅｎｃｅ １４５：７０９−７１０。
【００６３】
本発明において使用するための別の適切なドミナント選択マーカーの例は、キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＸＧＰＲＴ、ｇｐｔ）である。透析したウシ胎仔血清ならびにキサンチン、ヒポキサンチン、チミジン、アミノプテリン、ミコフェノール酸およびＬ−グルタミンを含む培地が使用され得る。アミノプテリンおよびミコフェノール酸はともに、ＧＭＰの合成についてのデノボ経路をブロックする。ＸＧＰＲＴの発現により、細胞は、キサンチンからＧＭＰを合成することができ、これにより、キサンチンを含むがグアニンを含まない培地で増殖することが可能になる。ＸＧＰＲＴは、哺乳動物ホモログを有しない細菌酵素であり、これにより、ＸＧＰＲＴは、ドミナント選択マーカーとして機能することが可能になる。選択のためにミコフェノール酸の量は、細胞型により変動し、そしてグアニンの非存在および存在下での力価測定により決定され得る。以下を参照のこと：Ｍｕｌｌｉｇａｎ ａｔ ａｌ．，（１９８１）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ７８：２０７２−２０７６。
【００６４】
適切なマーカーであるハイグロマイシンＢ−ホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＨ）もまた、使用され得る。完全培地にはハイグロマイシン−Ｂが補充される。ハイグロマイシン−Ｂは、アミノシクリトールであって、トランスロケーションを破壊し、そして誤翻訳を促進することによってタンパク質合成を阻害する。ＨＰＨ遺伝子は、哺乳動物系において使用されてきた。そして、この遺伝子を効率的に発現するベクターが利用可能である。以下を参照のこと：Ｇｒｉｔｚ ｅｔ
ａｌ．，（１９８３）Ｇｅｎｅ ２５：１７９−１８８；およびＰａｌｍｅｒ
ｅｔ ａｌ．，（１９８７）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８４：１０５５−１０５９。
【００６５】
別の有用なマーカーは、クロラムフェニコール耐性である。耐性は、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）によって媒介され、これは、クロラムフェニコールを、モノアセチル化誘導体およびビアセチル化誘導体へと変換することによって不活化する。３つの誘導体は、薄層クロマトグラフィーにより、検出され得る。この酵素は、哺乳動物細胞において発現され、そして容易に検出される。なぜなら、これは、哺乳動物細胞において天然には存在しないからである。この遺伝子は、トランスポゾンＴｎ９を有するｐＢＲ３２２の誘導体から、適切な酵素での切断により入手することができる。これは、ｐＳＶ２ベクターへと導入され得る。このことにより、ｐＳＶ２−ｃａｔプラスミドを得る（ＡＴＣＣ受託番号３７１５５）。これは、ＳＶ４０の初期プロモーターからＣＡＴ遺伝子を発現するプラスミドである。
【００６６】
Ｇｏｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９５）２６８：１７６６−１７６９は、迅速で、大いに増殖する遺伝子発現を、テトラサイクリン存在下で誘導するための、ウイルス転写活性化ドメインとのテトラサイクリン耐性遺伝子リプレッサーの融合物である。これは、低レベルのテトラサイクリンが遺伝子発現を妨害していた既存の系の改変である。テトラサイクリン耐性遺伝子リプレッサーをコードする遺伝子が変異誘発され、そして活性についてテトラサイクリンに依存した変異体融合タンパク質が作製され、そして同定された。この構築物は、遺伝子の高発現のためのオン／オフスイッチを提供する。
【００６７】
別の適切なマーカーは、アデニンホスホリリボシルトランスフェラーゼ（ＡＰＲＴ）である。この酵素ＡＰＲＴは、プリンサルベージ経路の別の酵素であるが、アデニンのＡＭＰへの変換を触媒する。ＡＰＲＴ陽性細胞は、例えば、グルタミンアナログのアザセリンを含む培地中で選択可能であり得る。アザセリンは、プリンのデノボ合成を妨害する。ＡＰＲＴ陰性細胞は、アザセリンおよびアデニンを含む培地中では増殖し得ず、しかも２，６−ジアミノプリンでの処理により選択され得る。この化合物は、正常細胞にとって毒性であるが、ＡＰＲＴ陰性細胞は、生存する。なぜなら、それらは、それを取り込まないからである。
【００６８】
選択マーカーコード配列の発現は、例えば、ＣＭＶ、ＲＳＶ、ポリＡ’−ＢＧＨ、ＳＶ４０などに由来するプロモーター配列の制御下に配置され得、そして他の発現制御エレメント（例えば、転写、翻訳または翻訳後修飾に影響を与える配列）も含み得る。
【００６９】
（調節配列）
選択マーカーおよび導入遺伝子に加え、本明細書において記載される構築物は、適切な調節エレメントを含み得る。調節エレメント（または制御エレメント）は、目的の宿主細胞において使用するために選択される。例えば、選択マーカーを含ませて、微生物における増殖を可能にし得る（例えば、ｆ１複製起点およびアンピシリン耐性コード配列）。そのような調節エレメントとしては、以下が挙げられるがそれらに限定されない：転写プロモーター、転写エンハンサーエレメント、転写終結シグナル、ポリアデニル化配列（翻訳終止コドンの３’に位置する）、翻訳開始の最適化のための配列（コード配列の５’に位置する）、翻訳終止配列、分泌シグナル配列、および翻訳後修飾（例えば、グリコシル化部位）を指示する配列。転写プロモーターとしては、誘導性プロモーター（そのプロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチド配列の発現は、分析物、補因子、調節タンパク質などによって誘導される）、抑制性プロモーター（そのプロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチド配列は、分析物、補因子、調節タンパク質などによって誘導される）および構成的プロモーターが挙げられ得る。
【００７０】
選択マーカーは、各々、プロモーターとポリアデニル化部位（例えば、図に示されるようなＢＧＨ ｐｏｌｙＡ またはＳＶ４０ ｐｏｌｙＡ）との間にサンドイッチされ得る。キメラｍＲＮＡは、プロモーターから転写され、そしてコード領域の３’側に配置されたポリアデニル化シグナルによって安定化される。哺乳動物転写ユニットの構築の間、プラスミド中の任意の細菌性プロモーターは、動物細胞において活性である転写調節配列に置き換えられ得る。２つのそのような配列は、図に示されている：ＣＭＶプロモーターおよびＳＶ４０初期プロモーター。使用され得る非限定的な他のプロモーターの例は、ＲＳＶおよびＨＳＶ−ＴＫである。
【００７１】
通常、遺伝子発現は、構成的であるが、調節性プロモーターが使用され得る。適切な調節プロモーターの例は、Ｔｅｔ、エクジソンおよびｌａｃリプレッサーの配列である。遺伝子発現はまた、メタロチオネイン遺伝子または熱ショック遺伝子の使用によるような、熱、光または金属を用いた転写調節によって制御され得る。
【００７２】
（例示的な「骨格」ベクター）
本発明の上記のトランスフェクション系の成分は、多数の適切な骨格ベクターに取り込まれて、発現ベクターおよび構築物の操作を容易にさせ得る。例えば、微生物における複製を可能にする手段を含むベクターへのこの成分の組み込みは、その構築物の増幅および単離を多大に容易にする（すなわち、シャトルベクターの作製）。例示的な骨格ベクターとしては、ＣＭＶ６ａおよびｐＵＣ１９（実施例１）が挙げられるがそれらに限定されない。
【００７３】
種々のそのような骨格ベクターは、適切な宿主系について利用可能である。
【００７４】
これらの系としては、以下が挙げられるがそれらに限定されない：バキュロウイルス（Ｒｅｉｌｌｙ，Ｐ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，ＢＡＣＵＬＯＶＩＲＵＳ ＥｘＰＲＥＳＳＩＯＮ ＶＥＣＴＯＲＳ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ（１９９２）；Ｂｅａｎｉｅｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ
１１：３７８（１９９１）；Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）；ｐＡｃＣ１３（ｐＡｃＣ１２に由来する、バキュロウイルス発現ベクター系において使用するためのシャトルベクター）（Ｍｕｎｅｍｉｔｓｕ Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１０（１１）：５９７７−５９８２，１９９０），細菌｛ｐＢＲ３２２；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｅｄｉａ ＰＡ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ；Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ；ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）、酵母｛Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．ａｎｄ Ｔｅｋａｍｐ−Ｏｌｓｏｎ，Ｐ．，米国特許第ＲＥ３５，７４９号，１９９８年３月１７日発行；Ｓｈｕｓｔｅｒ，Ｊ．Ｒ．，米国特許第５．６２９，２０３号，１９９７年５月１３日発行；Ｇｅｌｌｉｓｓｅｎ，Ｇ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｏｎｉｅ Ｖａｎ Ｌｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋ，６２（１−２）：７９−９３（１９９２）；Ｒｏｍａｎｏｓ，Ｍ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｙｅａｓｔ ８（６）：４２３−４８８（１９９２）；Ｇｏｅｄｄｅｌ，Ｄ．Ｖ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５（１９９０）；Ｇｕｔｈｒｉｅ，Ｃ．，ａｎｄ Ｇ．Ｒ．Ｆｉｎｋ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １９４（１９９１）、哺乳動物細胞｛Ｃｌｏｎｔｅｃｈ；Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ；例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（Ｈａｙｎｅｓ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１１：６８７−７０６（１９８３）；１９８３，Ｌａｕ，Ｙ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：１４６９−１４７５（１９８４）；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１８５，ｐｐ５３７−５６６ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ（１９９１）｝，ならびに植物細胞（植物クローニングベクター、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ，ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｔｃａｔａｗａｙ，ＮＪ；Ｈｏｏｄ，Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６８：１２９１−１３０１（１９８６）；Ｎａｇｅｌ，Ｒ．，ｅｔａｌ．，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．６７：３２５（１９９０）；Ａｎ，ｅｔ ａｌ．，”Ｂｉｎａｒｙ Ｖｅｃｔｏｒｓ”，ならびに他のベクター（Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｍａｎｕａｌ Ａ３：１−１９（１９８８）；Ｍｉｋｉ，Ｂ．Ｌ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，ｐｐ ２４９−２６５），ならびに他のベクター（Ｐｌａｎｔ ＤＮＡ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ａｇｅｎｔｓ（Ｈｏｈｎ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．）Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｗｉｅｎ，Ａｕｓｔｒｉａ，（１９８７）；Ｐｌａｎｔ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｐ．Ｇ．Ｊｏｎｅｓａｎｄ Ｊ．Ｍ．Ｓｕｔｔｏｎ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ，１９９７；Ｍｉｇｌａｎｉ，Ｇｕｒｂａｃｈａｎ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ ＰｌａｎｔＧｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｆｏｏｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｐｒｅｓｓ，１９９８；Ｈｅｎｒｙ，Ｒ．Ｊ．，Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｃｈａｐｍａｎ ＆ Ｈａｌｌ，１９９７）。
【００７５】
（発現ベクターおよび構築物の誘導）
本明細書において記載されるベクターおよび構築物は、適切な宿主細胞に、種々の方法により導入され得る。特に、本発明のプロセスによって改変される哺乳動物細胞は、ベクターでのトランスフェクションまたは感染によって取得することができる。トランスフェクションは、周知技術によって実施され得る（例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、リポソーム媒介トランスフェクションまたはマイクロインジェクション（Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．，前出））。例示的な方法はまた、実施例においても記載される。トランスフェクションは、複製するために使用可能なＤＮＡフラグメントまたはウイルスベクター中に容易にパッケージングされないＤＮＡを用いて使用され得るか、あるいは、哺乳動物のウイルスＤＮＡの感染は、回避されるべきである。
【００７６】
ビリオンまたはウイルス様粒子を得るウイルスゲノムに由来し得るベクターは、染色体外エレメントとして独立して複製可能であってもなくてもよい。高発現遺伝子座のためのＤＮＡを含むビリオン粒子は、感染によって宿主細胞に導入され得る。このウイルスベクターは、細胞ゲノムへと組み込まれ得る。哺乳動物の形質転換のためのウイルスベクターの例は、ＳＶ４０ベクター、およびパピローマウイルス、アデノウイルス、エプスタインーバーウイルス、ワクシニアウイルスおよびレトロウイルス（例えば、ラウス肉腫ウイルスまたはマウス白血病ウイルス（例えば、モロニーマウス白血病ウイルス））に基づくベクターがある。哺乳動物については、エレクトロポレーションまたはウイルス媒介導入が使用され得る。さらなる有用な送達系およびビヒクルは、本明細書において本発明者らが記載した（例えば、第２．３．１節を参照のこと）。
【００７７】
適切な形質転換トランスフェクション条件は、本明細書における教示にかんがみ当業者により決定され得る。
【００７８】
（細胞）
本発明において使用される細胞（例えば、宿主細胞）としては、すべての哺乳動物細胞、細胞株および細胞培養物が挙げられる。この細胞は、哺乳動物（例えば、マウス、ラットまたは他のげっ歯類、霊長類（例えば、ヒトまたはサル））に由来し得る。哺乳動物生殖細胞または体細胞系の細胞は、この目的のために使用され得る。初代細胞培養物または不死化細胞は、本発明の技術を実施する際に使用され得ることが理解される。
【００７９】
哺乳動物細胞は、ＤＮＡによる形質転換のための細胞培養物中において代表的に増殖する。この細胞は、固形表面に固定され得るか、または適切な栄養培地の懸濁物中で増殖し得る。
【００８０】
本発明において、恒常的な（すなわち、安定した）形質転換が生じることが好ましい。これは、細胞ゲノム中にＤＮＡを組換えにより形質転換することの取り込みにより達成される。挿入的形質転換は、タグ化される高発現の遺伝子座を生じ、通常、そのタグのＤＮＡ構築物の、ランダムなゲノム位置への非相同組換えにより起こる。しかし、相同組換えが生じ得ることが理解される。
【００８１】
抗生物質耐性遺伝子および第２の選択マーカーが染色体ＤＮＡ中の単一の高発現遺伝子座に組み込まれているか否か、あるいは、所定の細胞において複数の高発現遺伝子座を少なくとも形成するための多数の組み込み部位が存在するか否かを決定する試みがなされてこず、本発明の哺乳動物細胞が、少なくとも１つの高発現遺伝子座を含むことが理解される。
【００８２】
本発明の方法により入手された、形質転換された細胞は、その細胞が本質的に不死化している連続的な細胞株の調製のため、またはインビトロで継代培養されるべき能力を有する樹立細胞株の調製のために使用され得る。連続細胞株および樹立細胞株は、種々の生物および器官（例えば、げっ歯類胚；霊長類腎臓；げっ歯類およびヒトの腫瘍；ならびに線維芽細胞、上皮細胞またはリンパ細胞）から得ることができる。最高レベルの発現を示す細胞が所望の場合にクローニングされ得る。
【００８３】
本発明の技術により形質転換され得る、樹立細胞株の例は、ＨｅＬａ細胞、ＣＶ−１細胞、ＣＨＯ細胞、３Ｔ３細胞、Ｌ細胞、およびＴＣ７細胞である。これらの全ての細胞は、アミノグリコシド抗生物質（例えば、Ｇ４１８）に対して感受性であり、そしてその中に発現のためのカナマイシンまたはネオマイシン耐性遺伝子有し得る。
【００８４】
さらに、本発明は、所望の機能性ポリペプチドの発現を参照して記載してきたが、このポリペプチドは本発明の課題ではないことが理解される。本発明は、真核生物遺伝子転写および発現産物（ＲＮＡを含む）の産生のために一般に有用である。
【００８５】
本発明は、以下の実施例においてより完全に記載される。
【実施例】
【００８６】
（実施例１：構築物）
ｐＥＳＮ１ｄｈｆｒを、以下のように構築した。ＰＣＲプライマー：
【００８７】
【化１】
を使用して、ｐｃＤＮＡ３Ｍ１を作製した。これは、野生型ｎｅｏを含むｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．）由来の、変異ｎｅｏ遺伝子を含む。本出願を通じて、適切な場合、プライマーが３’から５’の方向に示される場合は、注意される。ＰＣＲフラグメントを、ＴＡクローニングのためのｐＣＲＩＩにクローニングした。各々別々の変異を含むこのＴＡプラスミドを、ＢｓｓＨＩＩおよびＳｆｕＩで消化して、アミノ酸残基１８２で変異（野生型Ｇｌｕの代わりにＡｓｐ）を含むｎｅｏ遺伝子の領域を除去した。Ｍ１ ＰＣＲフラグメントをＢｓｓＨＩＩおよびＳｆｕＩで消化したｐｃＤＮＡ３に連結することによって、残基１８２でｎｅｏ変異を含むｐｃＤＮＡ３Ｍ１を作製した。ｐｃＭＶ６ｃをＢａｌＩ／ＥｃｏＲＶで消化することによって、ＣＭＶ ＩＥプロモーターを得、このフラグメントを単離し、そしてＮｒｕＩおよびＥｃｏＲＶで消化したｐｃＤＮＡ３Ｍ１にこのフラグメントを連結した。生じたプラスミドをｐＥＳＮ１と名付けた。Ａｄ−ＤＨＦＲ遺伝子をこのプラスミドに加えるために、ｐＥＳＮ１を、Ｂｓｔ１１０７Ｉで平滑末端切断した。プラスミドｐｍＣＳＲ（Ｃｈｉｒｏｎ Ｃｏｒｐ．）を、ＸｈｏＩおよびＢａｍＨＩで消化し、そしてＡｄ−ＤＨＦＲカセットを単離した。次いで、このカセットをＫｌｅｎｏｗで処理して、平滑末端化し、平滑末端化したｐＥＳＮ１に連結してｐＥＳＮ１．ｄｈｆｒを作製した。Ｍ２ ＰＣＲフラグメントをＢｓｓＨＩＩおよびＳｆｕＩで消化したｐｃＤＮＡ３に連結することによって、ｐｃＤＮＡ３Ｍ２を、作製した。ｐｃＤＮＡ３Ｍ３を、ｐｃＤＮＡの消化によって作製した。
【００８８】
ｐＥＳＮ２ｄｈｆｒを、以下のように構築した。プライマー：
【００８９】
【化２】
を使用して、ｐｃＤＮＡ３Ｍ２を作製した。これは、アミノ酸残基２６１でｎｅｏ遺伝子に変異（野生型Ａｓｐの代わりにＡｓｎ）を含む。ＰＣＲフラグメントを、ＴＡクローニングのためのｐＣＲＩＩにクローニングした。各々別々の変異を含むこのＴＡプラスミドを、ＢｓｓＨＩＩおよびＳｆｕＩで消化して、アミノ酸残基１８２で変異（野生型Ｇｌｕの代わりにＡｓｐ）を含むｎｅｏ遺伝子の領域を除去した。Ｍ２ ＰＣＲフラグメントをＢｓｓＨＩＩおよびＳｆｕＩで消化したｐｃＤＮＡ３に連結することによって、残基２６１でｎｅｏ変異を含むｐｃＤＮＡ３Ｍ２を、作製した。ｐｃＭＶ６ｃをＢａｌＩ／ＥｃｏＲＶで消化することによって、ＣＭＶ ＩＥプロモーターを得、このフラグメントを単離し、そしてＮｒｕＩおよびＥｃｏＲＶで消化したｐｃＤＮＡ３Ｍ２にこのフラグメントを連結した。生じたプラスミドをｐＥＳＮ２と名付けた。Ａｄ−ＤＨＦＲ遺伝子をこのプラスミドに加えるために、ｐＥＳＮ２を、Ｂｓｔ１１０７Ｉで平滑末端消化した。プラスミドｐｍＣＳＲ（Ｃｈｉｒｏｎ Ｃｏｒｐ．）を、ＸｈｏＩおよびＢａｍＨＩで消化し、そしてＡｄ−ＤＨＦＲカセットを単離した。次いで、このカセットをＫｌｅｎｏｗで処理して、平滑末端切断し、平滑末端化したｐＥＳＮ１に連結してｐＥＳＮ２．ｄｈｆｒを作製した。
【００９０】
ｐＥＳＮ３ｄｈｆｒを、以下のように構築した。ｐｃＤＮＡ３Ｍ１およびｐｃＤＮＡ３Ｍ２をＳｍａＩおよびＲｓｒＩＩで消化することによって、ｐｃＤＮＡ３Ｍ３を、作製した。次いで、ｐｃＤＮＡ３Ｍ１由来の小フラグメントを、ｐｃＤＮＡ３Ｍ２の大フラグメントに連結してｐｃＤＮＡ３Ｍ３を作製した。これは、ｎｅｏ遺伝子の残基１８２および２６１での変異を含む。ｐＥＳＮ３．ｄｈｆｒを、上記のようにＣＭＶ ＩＥプロモーターおよびＤＨＦＲ遺伝子を挿入することによって作製した。
【００９１】
ｐｎｅｏ*ｄｈｆｒ*１およびｐｎｅｏ*ｄｈｆｒ*２を、以下のように作製した。ＢｓｔＢＩ部位およびＳｔｕＩ部位を作製するプライマーを使用して、マウスＤＨＦＲ遺伝子を、ｐＳＶ２から増幅した。野生型Ｎｅｏｒ遺伝子をｐｃＤＮＡ３から除去し、そして野生型マウスＤＨＦＲ遺伝子で置換してｐｃＤＮＡ３ｄｈｆｒを作製した。次いで、このプラスミドを、ＰＣＲにおいて使用してマウスＤＨＦＲ遺伝子を作製した。ｐｎｅｏ*ｄｈｆｒ*１について、ｄｈｆｒの５’領域における２つの隣接するコドンを、（ｐＳＶ２ｄｈｆｒを使用して）２つの停止コドンで置換して、それにより５’変異のＤＨＦＲ遺伝子を形成する。ｐｎｅｏ*ｄｈｆｒ*２について、３’領域における２つの隣接するコドンを、停止コドンで置換する。変異を、表１に示されるプライマーを使用するｐｃＤＮＡ３ｄｈｆｒのＰＣＲ増幅によって導入した：
（表１）
【００９２】
【表１】
ｄｈｆｒ遺伝子の５’末端における変異を、プライマー＃５、＃６、＃７、および＃８を使用して達成した。３’末端における変異を、プライマー＃６、＃８、＃９、および＃１０を使用して達成した。これらの新たなベクターを、ｐＸｄｈｆｒ*１およびｐＸｄｈｆｒ*２とよび、ここで、Ｘは、任意の導入遺伝子をいう。次いで、ｐＥＳＮ１、ｐＥＳＮ２、またはｐＥＳＮ３由来のｎｅｏ耐性遺伝子の変異形態を、ｐｄｈｆｒ*１またはｐｄｈｆｒ*２に挿入して、ｐｎｅｏ*ｄｈｆｒ*１およびｐｎｅｏ*ｄｈｆｒ*２を作製する。これらの構築物を使用して、以下に記載されるように、宿主細胞における高発現部位を作製し得る。
【００９３】
ｐｄｈｆｒ３’ｄｅｌを、以下のように構築した。ｐｃＤＮＡ３ＤＨＦＲ３’を、ＫｐｎＩ／ＥｃｏＲＶで消化した。ｐＳｅＡＰ−Ｂａｓｉｃ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）をＣｌａＩで消化した後にＫｌｅｎｏｗ処理およびＫｐｎＩで消化することによって、分泌アルカリホスファターゼ（ＳｅＡＰ）を得た。次いで、平滑／粘着性（ｂｌｕｎｔ／ｓｔｉｃｋｙ）条件下で、このフラグメントをｐｃＤＮＡ３ＤＨＦＲ３’に連結した。ｐＸｄｈｆｒ３’ｄｅｌは、任意の導入遺伝子「Ｘ」を含むこのプラスミドをいう。
【００９４】
ｐｎｅｏ*ｄｈｆｒ５’ｄｅｌを、以下のように構築した。ｐｃＤＮＡ３由来の同一のｎｅｏ耐性遺伝子を含むプラスミドｐＦＣ５５（Ｃｈｉｒｏｎ Ｃｏｒｐ）を、ＢｓｓＨＩＩおよびＳｆｕＩで消化して、上記のように得たｎｅｏ変異フラグメントを挿入した。ＢｓｓＨＩＩ／ＳｆｕＩ Ｍ１ｎｅｏフラグメント、Ｍ２ｎｅｏフラグメント、またはＭ３ｎｅｏフラグメントを、ｐＦＣ５５に連結して、それぞれｐＲＳＶＭ１ｎｅｏ、ｐＲＳＶＭ２ｎｅｏまたはｐＲＳＶＭ３ｎｅｏを作製した。ｐｃＤＮＡ３ｄｈｆｒ５’（Ｆ．Ｒａｎｄａｚｚｏ指南）をＮｒｕＩ／ＫｐｎＩで消化して、ポリリンカー領域の上流のＣＭＶプロモーターを除去した。ｐＲＳＶＭ１ｎｅｏをＮｒｕＩ／ＫｐｎＩで消化して、そして生じたフラグメントをｐｃＤＮＡ３ｄｈｆｒ５’に挿入して、ｐＲＳＶＭ１ｎｅｏｄｈｆｒ５’を作製した。生じたプラスミドを、ＢｓｓＨＩＩおよびＫｐｎＩで消化して、ＲＳＶＭ２ｎｅｏフラグメントまたはＲＳＶＭ３ｎｅｏフラグメントのいずれかに挿入した。
【００９５】
ｐＣＭＶＫｍ２：ｐＣＭＶＫｍ２ベクターは、ｐＣＭＶ６ａ（Ｃｈａｐｍａｎら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９９１）１９：３９７９−３９８６）に由来し、そしてカナマイシン選択マーカー、ＣｏｌＥ１複製起点、ＣＭＶプロモーターエンハンサーおよびイントロンＡを含み、以下に記載される合成配列についての挿入配列が続き、ウシ成長ホルモン由来のポリアデニル化シグナルが続く。−−ｐＣＭＶＫｍ２ベクターは、ポリリンカー部位がｐＣＭＶＫｍ２に挿入されて、ｐＣＭＶ−ｌｉｎｋ（１６４６〜１６９７位でのポリリンカー）を作製する点のみがｐＣＭＶ−ｌｉｎｋベクターとは異なる；チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞における発現のためのｐＥＳＮ２ｄｈｆｒおよびｐＣＭＶＰＬＥｄｈｆｒ；および、バキュロウイルス発現系における使用のためのシャトルベクターであるｐＡｃＣ１３（ｐＡｃＣ１３は、Ｍｕｎｅｍｉｔｓｕ Ｓら、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１０（１１）：５９７７−５９８２，１９９０）によって記載されるｐＡｃＣ１２由来である）。
【００９６】
ｐＣＭＶ−ｌｉｎｋは、ＣＭＶプロモーター（ＣＭＶ ＩＥ ＥＮＨ／ＰＲＯ）、ウシ成長ホルモンターミネーター（ＢＧＨ ｐＡ）、カナマイシン選択マーカー（ｋａｎ）、およびＣｏｌＥ１複製起点（ＣｏｌＥ１ ｏｒｉ）を含む。ポリクローニング部位はまた、ＣＭＶプロモーター配列に続いて存在する。
【００９７】
ベクターｐＥＳＮｄｈｆｒ、ｐＥＳＮ１ｄｈｆｒ、ｐＥＳＮ２ｄｈｆｒ、ｐＥＳＮ３ｄｈｆｒについての制限地図を、図２に示す。図において、ＣＭＶプロモーター（ｐＣＭＶ、ｈＣＭＶＩＥ）、ウシ成長ホルモンターミネーター（ＢＧＨｐＡ）、ＳＶ４０複製起点（ＳＶ４０ｏｒｉ）、ネオマイシン選択マーカー（Ｎｅｏ）、ＳＶ４０ポリＡ（ＳＶ４０ｐＡ）、アデノウイルス２後期プロモーター（Ａｄ２ＶＬＰ）、およびマウスｄｈｆｒ遺伝子（ｍｕ ｄｈｆｒ）を示す。図において、ポリクローニング部位はまた、ＣＭＶプロモーター配列に続いて示される。
【００９８】
簡単には、ｐＣＭＶＰＬＥｄｈｆｒの構築は、以下である。ＤＨＦＲカセットを構築するために、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ（内部リボソーム侵入部位（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｅｎｔｒｙ ｓｉｔｅ））リーダーを、ｐＣｉｔｅ−４ａ＋（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）からＰＣＲ増幅し、そしてＸｂａ−ＮｃｏフラグメントとしてｐＥＴ−２３ｄ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）に挿入してｐＥＴ−ＥＭＣＶを得た。ｐＥＳＮ２ｄｈｆｒからｄｈｆｒ遺伝子をＰＣＲ増幅して、翻訳停止コドンの代わりにＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒスペーサーを有する産物を得、そしてＮｃｏ−ＢａｍＨＩフラグメントとして挿入して、ｐＥＴ−Ｅ−ＤＨＦＲを得た。次に、減弱したｎｅｏ遺伝子を、ｐＳＶ２Ｎｅｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）誘導体からＰＣＲ増幅し、ｐＥＴ−Ｅ−ＤＨＦＲの独特なＢａｍＨＩ部位に挿入してｐＥＴ−Ｅ−ＤＨＦＲ／Ｎｅｏ(m2)を得た。最終的に、ｐＣＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｉｎｃ．，Ｃａｒｓｂａｄ，ＣＡ）由来のウシ成長ホルモンターミネーターｎｅｏ遺伝子の下流に挿入して、ｐＥＴ−Ｅ−ＤＨＦＲ／Ｎｅｏ(ｍ2)ＢＧＨｔを得た。ＥＭＣＶ−ｄｈｆｒ／ｎｅｏ選択マーカーカセットフラグメントを、ｐＥＴ−Ｅ−ＤＨＦＲ／Ｎｅｏ(m2)ＢＧＨｔの切断によって調製した。
【００９９】
ＣＭＶエンハンサー／プロモーター＋イントロンＡを、ｐＣＭＶ６ａ（Ｃｈａｐｍａｎら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９９１）１９：３９７９−３９８６）からＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｌＩフラグメントとしてｐＵＣ１９（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）へ移した。ｐＵＣ１９のベクター骨格を、ＮｄｅＩ部位からＳａｐＩ部位を削除した。上記のＤＨＦＲカセットを、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳがＣＭＶに続くようにこの構築物に加えた。このベクターはまた、Ａｍｐ’遺伝子およびＳＶ４０複製起点を含んだ。
【０１００】
合成Ｇａｇ発現カセットを含むｐＣＭＶＫｍ２ベクターは以下のように設計された：代理人整理番号１６２１．００２の同時係属出願に記載されるような、ｐＣＭＶＫｍ２．ＧａｇＭｏｄ．ＳＦ２、ｐＣＭＶＫｍ２．ＧａｇｐｒｏｔＭｏｄ．ＳＦ２．およびｐＣＭＶＫｍ２．ＧａｇｐｏｌＭｏｄ．ＳＦ２。
【０１０１】
ＣＡＢ構築物：記載される全ての構築物を作製し、そして以下の様式にてｐＡｃＣ１３にクローニングした。全ての構築物のＣＡＢ２部位をＰＣＲによって作製したので、全てを配列決定し、ＡＢＩ ｓｙｓｔｅｍの色素ターミネーター配列分析によって確認した。最初に全ての構築物を、中間体クローニングベクターＰＣＲＩＩ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）またはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にクローニングした。これは、配列決定およびさらなるサブクローニングを容易にするために行われた。
【０１０２】
全てのＣＡＢ２構築物を、２つの部分で作製した。まず、ＣＡＢ２分子のＭＣＰ部分（５’末端でのＫｐｎＩ部位からアミノ酸３２１でのＨｉｎｄＩＩＩ部位まで）を作製し、そしてＰＣＲＩＩにクローニングし、そして正確な配列を確認するために分析した。次いで、ＣＡＢ２のこの部分を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ
ＳＫ＋にクローニングした。次いで、このＳＫ＋構築物に、種々の３’末端テールを含むＣＡＢ２の残りの部分（アミノ酸３２１でのＨｉｎｄＩＩＩから５’末端のＥｃｏＲＩ部位まで）をクローニングした。ＨｉｎｄＩＩＩ ５’末端および３’末端を作製するために使用したプライマーは以下であった：
【０１０３】
【化３】
短いヘパリンのコンセンサス、ＴＦＰＩヘパリンコンセンサス、およびＧＰＩテールを含む、元々のＨｉｎｄＩＩＩからＥｃｏＲＩのＰＣＲ産物を、配列分析のために最初にＰＣＲＩＩにクローニングした。長いヘパリンのコンセンサス、２つのフィブロネクチンテール、およびテールを有さない制御配列を含む、元々のＨｉｎｄＩＩＩからＥｃｏＲＩのＰＣＲ産物を、配列分析のためにｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ＋にクローニングした。各々の改変体についてこれらの２つの半分をＳＫ＋に連結して完全なＣＡＢ２を作製した後、次いで、ＫｐｎＩからＥｃｏＲＩのフラグメントをｐＡｃＣＩ３にサブクローニングした。バキュロウイルス系を使用して、全てを昆虫細胞に発現した。
【０１０４】
昆虫細胞発現に加えて、これらの構築物のいくつかを、哺乳動物系における発現のために作製した。これらは、長いヘパリンコンセンサス配列を有するＣＡＢ２、ＴＦＰＩヘパリン結合テール、および非標的化配列を有するコントロールを含む。哺乳動物系ベクターにクローニングするために必要とされる５’制限部位および３’制限部位を変化させるために、これらのＣＡＢ改変体の３つ全てを、ＰＣＲで再度作製した。全ての改変体を、５’末端ＮｏｔＩ部位および３’末端ＸｂａＩ部位を有して作製し、そして配列確認のために中間体ベクターＰＣＲＩＩにクローニングした。ＮｏｔＩからＸｂａＩのクローンを作製するために使用されるＰＣＲプライマーは、制限部位における変化を除いてＫｐｎＩからＥｃｏＲＩのフラグメントを作製するために使用したものと同一であった。次いで、確認した改変体を、ｐＧＥＭ９Ｚ（Ｐｒｏｍｅｇａ）にクローニングした。次いで、これらを、発現のための哺乳動物ベクターに移入した。
【０１０５】
（実施例２：異常なｍＲＮＡスプライシングの同定および補正）
Ｃａｂ２は、膜補因子タンパク質（ＭＣＰ）と減衰加速因子（ｄａｃａｙ ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）（ＤＡＦ）の特徴を併せ持ち、補体活性を阻害する、キメラの１１０ｋＤａタンパク質である。Ｈｉｇｇｉｎｓら、前出。最初に、ＣＨＯ細胞株（Ｎ２１０７）を、ＣＡＢ２．１をコードする配列を保有するｐｃＤＮＡ３ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のトランスフェクション後に確立した。しかし、この細胞株の産生性は低く、そしてさらに、時間とともに減衰した。
【０１０６】
Ｎ２１０７細胞株の上清中に存在するポリペプチド分析は、予期せぬＣＡＢ２．１関連配列を有する４２ｋＤａタンパク質を示した。Ｆａｓｔ Ｔｒａｃｋ（ＩｎＶＩｔｒｏｇｅｎ）を使用してＣＡＢ２含有プラスミドを一過性にトランスフェクトした細胞の細胞ペレットから、ポリ（Ａ＋）ｍＲＮＡを単離した。コード領域に隣接するプライマーを使用して、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ＲＴ−ＰＣＲキットに記載されるようにＲＴ−ＰＣＲ分析を実施した。優勢なＰＣＲ産物は、予想された４２ｋＤａのタンパク質をコードした。いくつかの中間体ＰＣＲ産物および少量の全長（１１０ｋＤａ）ＰＣＲ産物もまた存在した。従って、ＲＴ−ＰＣＲは、４２ｋＤａの夾雑物がＣＡＢ２．１におけるＭＣＰとＤＡＦのキメラドメインの間の異常なｍＲＮＡスプライシングによって生じたことを示した。
【０１０７】
異常なスプライシングを、重複ＰＣＲによって補正し、もはやコンセンサススプライシングに似ないようにアミノ酸を保存するような方法で、哺乳動物細胞由来の代替のタンパク質鎖のプロセスした産物を与えたＲＮＡスプライシングについてのドナー部位およびアクセプター部位を除去することによって、ＣＡＢ２．１、ＣＡＢ４．２およびＣＡＢ４．３のスプライシングを補正した配列を産生した。変化は以下のとおりである：
【０１０８】
【化４】
これらの変化を、以下のプライマーでの重複ＰＣＲを使用して作製した。
アミノ酸４７で開始するドナー部位を変化するために：
【０１０９】
【化５】
アミノ酸１５２で開始するドナー部位を変化するために：
【０１１０】
【化６】
アミノ酸３７２で開始するアクセプター部位を変化するために：
【０１１１】
【化７】
アミノ酸４５９で開始するアクセプター部位を変化するために：
【０１１２】
【化８】
使用した５’Ｋｐｎプライマーは以下であった：
【０１１３】
【化９】
使用した３’ＸｂａＩプライマーは以下であった：
【０１１４】
【化１０】
上記で名付けたＨｉｎｄＩＩＩ５’プライマーおよび３’プライマーをまた使用した。
【０１１５】
スプライシング部位欠失構築物は、完全なＣＡＢ２、ＴＦＰＩヘパリン結合テールを伴うＣＡＢ２、それぞれアミノ酸５７０および５６１であるセリンスレオニン領域の一部および全体の欠失を伴うＣＡＢ２、ならびにＴＦＰＩヘパリンコンセンサス配列の付加を伴うセリンスレオニン領域の完全な欠失を含む。
【０１１６】
この分子の３’末端でのセリンスレオニン欠失を作製するために使用したプライマーは以下である：
【０１１７】
【化１１】
これらの構築物を、元々のＣＡＢ改変体に実施したように、２つの部分で中間体ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ＋に作製した。哺乳動物発現ベクターにおける最終構築物の完成の前に、全ての配列を、ＳＫ＋において確認した。ＲＴ−ＰＣＲおよびノーザンブロッティングによって分析したｍＲＮＡは、異常なスプライシングを示さず、そして正確なサイズのバンドを示した。
【０１１８】
（実施例３：トランスフェクション）
スプライシングの補正されたＣＡＢ２．１およびＣＡＢ４．２を、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ試薬（ＢＲＬ）を使用して、ＣＯＳ−７細胞に、２時間にわたって一過性にトランスフェクトした。ＲＴ−ＰＣＲは、正確な全長ＰＣＲ産物（１１０ｋＤａ）のみを示した。これらの細胞に発現したＣＡＢタンパク質のレベルを、表２に示す。
【０１１９】
（表２）
【０１２０】
【表２】
（実施例４：トランスフェクト方法および選択方法）
プラスミドｐＥＳＮ１．ｄｈｆｒ．ＣＡＢ２．１；ｐＥＳＮ３．ｄｈｆｒ．ＣＡＢ２．１、ｐＥＳＮ１．ｄｈｆｒ．ＣＡＢ４２、またはｐＥＳＮ３．ｄｈｆｒ．ＣＡＢ４．２の、以下の４つのトランスフェクションプロトコールを実施した：（１）エレクトロポレーション；（２）リン酸カルシウム（ＣａＰｏ４）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）；（３）ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）；および（４）ＴｒａｎｓＩＴ ＬＴ−１試薬（ＰａｎＶｅｒａ Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）。トランスフェクションを、エレクトロポレーション以外の全ての方法について製造業者の指導書に従って実施した。エレクトロポレーションに約３×１０6細胞を、そして５０〜８０％コンフルエントな細胞（５〜８×１０5細胞）を他の３つのトランスフェクション法について使用した。
【０１２１】
エレクトロポレーションを、以下のように実施した。ＣＨＯ−ＤＨＦＲ−細胞を、ＳＴＶでトリプシン処理し、そして１０％ＦＢＳを有する培地を、反応をクエンチするために添加した。細胞をＤＭＥＭ（Ｌ−グルタミンを含む）で２回洗浄し、そして約６×１０6細胞／ｍＬに再懸濁した。５００μｌの細胞を、滅菌したキュベットに添加し、約１〜３０μｇの間のＤＮＡを添加した。これらの細胞を、３３０ボルトおよび９７５μファラド静電容量でエレクトロポレーションした。細胞を、１００ｍｍディッシュ中１５ｍｌのα−ＭＥＭ／非選択培地（Ｇ４１８を含む）にプレートし、３７℃で１８〜２４時間インキュベートした。次いで、培地をＤＨＦＲのためのα−ＭＥＭ選択培地で置換して、そして細胞をコロニーが形成するまで増殖した。細胞を再度プレートし（Ｔ７５フラスコ、９６ウェルプレートまたは１００ｍｍディッシュ）そして２０ｎＭメトトレキサートで２〜４週間培養し、この時、メトトレキサートの濃度が４０ｎＭメトトレキサートに増加した。
【０１２２】
約１０μｇのプラスミドＤＮＡを、トランスフェクションに使用した。トランスフェクトした細胞は、ＣＯＳ細胞（ＵＣＳＦ）またはＤＧ４４ ＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞（Ｃｈｉｒｏｎ Ｃｏｒｐ．）であった。トランスフェクション後、細胞を、非選択培地中（５００ｍＬの非選択培地は、４３１．５ｍＬのα−ＭＥＭ、５０ｍＬ ＦＢＳ（非透析）、５ｍＬのペニシリン−ストレプトマイシン、０．５ｍＬのゲンタマイシン、１０ｍＬのグルタミン、１ｍＬのチミジン、１ｍＬのアデノシンおよび１ｍＬのデオキシアデノシンを含む）に１〜２日間回収し得た。１つのトランスフェクションからの細胞を、上記のようにトリプシン処理し、２０ｍＬの選択培地（５００ｍＬの非選択培地は、４３４．５ｍＬのα−ＭＥＭ、１０ｍＬのグルタミン、０．５ｍＬのゲンタマイシン、５ｍＬのペニシリン−ストレプトマイシンおよび５０ｍｌ ＦＢＳ（非透析）を含む）に希釈し、そして９６ウェル培養プレートに適切な選択培地（２５０μｇのＧ４１８（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）、ヌクレオシドを含まないα−ＭＥＭ、１０％ ＦＢＳ（ＤＨＦＲ選択）のいずれかまたは両方の培地）でプレートした。細胞を、約２〜３週間にわたって選択培地中で維持し、この時、トランスフェクトされていない細胞または一過性にトランスフェクトされた細胞は死んだ。生存するコロニーを、トリプシン処理し、そして１ｍＬの選択培地を含む２４ウェル培養プレートに再度プレートした。
【０１２３】
増殖陽性ウェルを、ＥＬＩＳＡを使用してＣＡＢ２．１またはＣＡＢ４．２の発現について試験した。ＣＡＢ２．１またはＣＡＢ４．２を発現するミニプールを、ＤＨＦＲ選択およびメトトレキサート（ＭＴＸ）での増幅のためにスケールアップした。得られた結果は、導入遺伝子の安定な発現を得る際にＣａＰＯ４が最も効果的であることを示した。
【０１２４】
ＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞におけるＣＡＢ２．１またはＣＡＢ４．２の発現は、表３に示される。
【０１２５】
（表３）
【０１２６】
【表３】
ＣＡＢ２に加えて、ｕＰＡＲおよびＶＥＧＦ−Ｄの発現をまた、ｕＰＡＲまたはＶＥＧＦ−Ｄをコードする導入遺伝子を含むｐＥＳＮ２ｄｈｆｒでの、宿主細胞のリン酸カルシウムトランスフェクションによって達成した。約２５０ｍｇ〜約１ｍｇ／リットルの間の発現レベルを達成した。
【０１２７】
（本発明の実施に有用な株の寄託）
以下の株の生物学的に純粋な培養物の寄託を、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡで行った。示された受託番号は、首尾良い生存試験の後に割り当てられ、そして必要な費用が支払われた。寄託物は、Ｂｕｄａｐｅｓｔ Ｔｒｅａｔｙ ｏｎ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｄｅｐｏｓｉｔ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｕｒｐｏｓｅ ｏｆ
Ｐａｔｅｎｔ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ａｎｄ ｔｈｅ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ ｔｈｅｒｅｕｎｄｅｒ（Ｂｕｄａｐｅｓｔ Ｔｒｅａｔｙ）の規定の元でなされた。これは、寄託した日から３０年間および寄託所による寄託のサンプルの供給に対する最も新しい要請後少なくとも５年間にわたる生存培養物の維持を保障する。これらの生物は、米国特許法第１２２条およびそれに準じる長官の規則（米国特許法施行規則１．１２条を含む）に従って表題された、米国特許庁長官によって決定されたものに対して培養物の永久かつ非限定的利用可能性を保障するＢｕｄａｐｅｓｔ Ｔｒｅａｔｙの用語の下でＡＴＣＣによって利用可能にされる。特許査定の際に、寄託された培養物の公的な利用可能性における全ての制限は、変更不可能に除去される。
【０１２８】
これらの寄託物は、単に当業者に便利なように提供されるだけであり、そして寄託が米国特許法第１１２条の下で要求されるという認可ではない。これらのプラスミドの核酸配列、ならびにこれらによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列は、本明細書中の記載と何らかの矛盾が生じた場合に制御する。認可が、寄託された材料を作製、使用または販売するために要求され得、そしてこのような認可を本明細書では認可しない。
【０１２９】
【化１２】
本発明の原理、好ましい実施形態および実施の様式は、前述の明細書に記載されている。しかし、本明細書中で保護されるべき発明は、記載された特定の形態に限定されるようには解釈されるべきではない。なぜなら、限定よりはむしろ例示としてみなされるべきだからである。改変および変化は、本発明の精神から逸脱することなく当業者によってなされ得る。
（配列表）
【数１】
【数２】
【数３】
【数４】
【数５】
【数６】
【数７】
【数８】
【数９】
【数１０】
【数１１】
【数１２】
【数１３】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書中に記載の発明。
【請求項１】
本明細書中に記載の発明。
【図１−１】
【図１−２】
【図１−３】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図２】
【図１−２】
【図１−３】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図２】
【公開番号】特開２０１０−２３９９７４（Ｐ２０１０−２３９９７４Ａ）
【公開日】平成２２年１０月２８日（２０１０．１０．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１７３１７６（Ｐ２０１０−１７３１７６）
【出願日】平成２２年７月３０日（２０１０．７．３０）
【分割の表示】特願２００１−５３５５８３（Ｐ２００１−５３５５８３）の分割
【原出願日】平成１１年１２月３０日（１９９９．１２．３０）
【出願人】（５９１０７６８１１）ノバルティス バクシンズ アンド ダイアグノスティックス，インコーポレーテッド (265)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１０月２８日（２０１０．１０．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年７月３０日（２０１０．７．３０）
【分割の表示】特願２００１−５３５５８３（Ｐ２００１−５３５５８３）の分割
【原出願日】平成１１年１２月３０日（１９９９．１２．３０）
【出願人】（５９１０７６８１１）ノバルティス バクシンズ アンド ダイアグノスティックス，インコーポレーテッド (265)
【Ｆターム（参考）】
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