皮内ＨＰＶペプチドワクチン接種
本発明は、皮内投与用であるＨＰＶ関連疾患の治療又は予防用薬剤の製造のための、ＨＰＶ−Ｅ２、−Ｅ６及び／又はＥ７タンパク質に由来するペプチドの使用に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬及び免疫学の分野に関する。特に、本発明は皮内ＨＰＶペプチドワクチン接種に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＨＰＶ感染は、若く、性的に活発な男女の個体間で非常に流行している。大規模なプロスペクティブ研究により、３年間の追跡期間の間に、男性パートナーからＨＰＶに感染することが一般的であり、対象の４０〜６０％に及ぶことが示された（Ｋｏｕｔｓｋｙら、１９９７、Ｈｏら、１９９８、Ｍａｒｒａｚｚｏら、２０００）。したがってＨＰＶは、おそらく最も一般的な性感染症である。
【０００３】
ハイリスク型のパピローマウィルス（例えば、ＨＰＶ１６、１８、３１、３３及び４５）は、子宮頸癌の原因である（Ｂｏｓｃｈら、１９９５、Ｚｕｒ Ｈａｕｓｅｎ、１９９６）。基底上皮細胞が感染した後、ＨＰＶの前初期遺伝子であるＥ１、Ｅ２、Ｅ５、Ｅ６及びＥ７が発現する。Ｅ１及びＥ２遺伝子は、ウィルスの複製を制御する。さらにＥ２タンパク質は、Ｅ６及びＥ７癌タンパク質の発現を調節する。ハイリスク型ＨＰＶのＥ６タンパク質は、ｐ５３に特異的に結合し、ユビキチン経路を介したその迅速な分解を標的とする。Ｐ５３はアポトーシスの開始に関与し、このタンパク質の喪失によりアポトーシスが阻止される（Ｓｃｈｅｆｆｎｅｒら、１９９０）。ハイリスク型のＥ７タンパク質はｐＲＢと結合する。ｐＲＢは通常、細胞周期移行に必要なタンパク質であるＥ２Ｆを不活性化することにより細胞が細胞周期を移行することを妨げている（Ｄｙｓｏｎら、１９８９）。Ｅ７が発現すると、感染細胞は細胞周期から離脱して分化することができなくなる。
【０００４】
Ｅ６及びＥ７癌タンパク質の発現が延長及び上昇することは、ＨＰＶ誘導性異形成及び子宮頸癌への形質転換と非常に密接な関係がある。
【０００５】
ヒトのＨＰＶ関連疾患及びＨＰＶ誘導性癌に対する防御における免疫系の保護的役割は、免疫抑制された腎移植患者及びＨＩＶ感染患者が示す性器ＨＰＶ感染の発生率が正常な対照と比較して１７倍高いことにより示唆される（Ｈｏら、１９９４、Ｍａｔｏｒｒａｓら、１９９１、Ｈａｌｐｅｒｔら、１９８６）。免疫抑制個体のＨＰＶ感染を消散するための能力の減少は、感染早期における免疫系の保護的役割を間接的に示唆する。早期抗原Ｅ２、Ｅ６及びＥ７に対する免疫を介した、ＨＰＶに対する保護の証拠は、癌関連パピローマウィルスに関する主要な動物モデルである、ワタオウサギのパピローマウィルスモデルによりもたらされる。非構造タンパク質のＥ１及びＥ２をワクチン接種することにより、ウィルス誘導性パピローマの退縮が誘導されるが、ウィルス性腫瘍の成長は抑制される。
【０００６】
さらに、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ６及びＥ７の遺伝子の組合せをワクチン接種されたウサギは、ウィルスのチャレンジから完全に保護された（Ｈａｎら、１９９９、Ｓｅｌｖａｋｕｍａｒら、１９９５）。重要なことには、パピローマウィルス誘導性のイボが徐々に成長したウサギは、Ｅ６及びＥ７の長鎖重複ペプチドを含むワクチンを２回注射した後、それらの病変を消滅させるだけでなく、潜伏性ウィルス感染を除去することもできた（Ｖａｍｂｕｔａｓ、Ｖａｃｃｉｎｅ ２００５）。これらのデータは、Ｅ２、Ｅ６及びＥ７に対する免疫が、パピローマウィルス感染の免疫学的予防として、並びにＨＰＶ誘導性病変及び癌の治療に有効であり得ることを示す。
【０００７】
ＨＰＶ１６に対する免疫応答に関連するエピトープの特定に相当関心が高まっており、
これらをサブユニットとしてワクチンに組み込み、又はこれらのエピトープをインビボのワクチン誘導性免疫のモニタリングに使用する可能性が示される。大部分の上皮細胞は、ＭＨＣクラスＩを発現するが、クラスＩＩは発現しないので、今までのところ、殺腫瘍性のＨＰＶ特異的ＣＤ８＋細胞障害性Ｔリンパ球の誘導に注目が集まっている（Ｍｅｌｉｅｆら、２０００；Ｒｅｓｓｉｎｇら、１９９５；Ｒｅｓｓｉｎｇら、２０００；Ｒｅｓｓｉｎｇら、１９９６）。ＨＰＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の反応性は、子宮頸部上皮内新生物、グレードＩＩＩ（ＣＩＮ ＩＩＩ）の病変又は子宮頸癌と診断された患者の末梢血（Ｎｉｍａｋｏら、１９９７；Ｒｅｓｓｉｎｇら、１９９６）及び子宮頸癌の患者から単離された腫瘍浸潤Ｔ細胞集団（Ｅｖａｎｓら、１９９７）において認められた。腫瘍特異的ＣＤ４＋ヘルパーＴ（「Ｔｈ」）免疫もまた、これらの腫瘍の大部分がＭＨＣクラスＩＩを発現しないという事実にもかかわらず、固形腫瘍の効率的な根絶にとって極めて重要であると現在考えられている（Ｍｅｌｉｅｆら、２０００；Ｐａｒｄｏｌｌ及びＴｏｐａｌｉａｎ、１９９８；Ｔｏｅｓら、１９９９に総説がある）。最新の証拠により、ＣＤ４＋腫瘍特異的Ｔ細胞が、ＣＤ８＋腫瘍特異的ＣＴＬの最適な誘導のみならず、これらのＣＴＬによる局所エフェクター細胞機能の最適な活動のためにも必要であることが示されている（Ｏｓｓｅｎｄｏｒｐら、１９９８、Ｔｏｅｓら、１９９９）。ＭＨＣクラスＩ拘束性腫瘍特異的免疫の誘導に関して、プロフェッショナル抗原提示細胞により捕捉されている抗原の交差提示は、主要な役割を担っていると思われる。交差プライミングによる有効な腫瘍特異的ＣＴＬの適切な誘導のためには、腫瘍特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞のヘルプが必要とされる（Ｔｏｅｓら、１９９９、Ｓｃｈｏｅｎｂｅｒｇｅｒら、１９９８）。
【０００８】
ＨＰＶ特異的Ｔｈ免疫の保護的役割に関する強い表れは、性器イボの退縮におけるＣＤ４＋Ｔ細胞の優位により（Ｃｏｌｅｍａｎら、１９９４）、並びにＣＩＮ病変が自然に退縮した対象の大部分において、ＨＰＶ１６ Ｅ７に対する遅延型過敏性応答が検出されたことにより（Ｈｏｐｆｌら、２０００）示唆された。さらに健康なヒトの大部分において、免疫系は、悪性腫瘍の発生前にウィルスの除去に成功している（Ｋｏｕｔｓｋｙ、１９９７；Ｅｖａｎｄｅｒ、１９９５）。このことに従って、検査した健康な全女性の半分より多くが、強い増殖性の、ＨＰＶ１６ Ｅ２及びＥ６特異的Ｔｈ１／Ｔｈ２細胞メモリー応答を示す（ｄｅ Ｊｏｎｇ、２００２；Ｗｅｌｔｅｒｓ、２００３；ｄｅ Ｊｏｎｇ、２００４）。さらに、Ｅ２に対するＴｈ反応性は、ウィルスのクリアランスの時に生じることが発見された（Ｂｏｎｔｋｅｓ、１９９９）。健康な対象は、ＨＰＶ１６のＥ７特異的免疫もまた示す（Ｗｅｌｔｅｒｓ、２００３；ｖａｎ ｄｅｒ Ｂｕｒｇ、２００１）。対照的に、ＨＰＶ誘導性癌の発生は、免疫の機能不全と強く関係している。ＨＰＶ１６＋誘導性新生物を有する患者の末梢血における、ＨＰＶ１６のＥ２、Ｅ６及びＥ７に特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞性免疫の分析により、ハイグレードの外陰部新生物を有する患者の半分（ｖａｎ Ｐｏｅｌｇｅｅｓｔ、２００５）及びＣＩＮ ＩＩＩを有する患者の大部分（ｄｅ Ｊｏｎｇ、２００４）は、適切な免疫応答を開始しないことが明らかになった。検査した子宮頸癌患者のおよそ半数が、任意の検出可能なＴ細胞増殖応答を欠いていた。もう半数は、Ｔｈ１／Ｔｈ２のサイトカインの産生に関係しないがＩＬ−１０の産生に関係する、ＨＰＶ１６ Ｅ２及びＥ６に特異的な、弱いＴ細胞増殖応答を示した（ｄｅ Ｊｏｎｇ、２００４）。このことは、Ｅ６及びＥ７に特異的な増殖応答が存在し得るが（Ｌｕｘｔｏｎ、２００３）、子宮頸癌患者における末梢Ｔｈ１応答は低い（ｄｅ Ｇｒｕｉｊｌ、１９９６；ｄｅ Ｇｒｕｉｊｌ、１９９８）又は欠けている（Ｔｓｕｋｕｉ、１９９６）という先の知見を裏付ける。なぜなら、ＣＤ４＋Ｔ細胞応答は、ＣＤ８＋ＣＴＬ免疫の誘導及び維持に極めて重要であり（Ｍｅｌｉｅｆ、２００２）、これらのデータは、末梢ＨＰＶ１６特異的ＣＴＬがハイグレードな異形成又は癌の患者において検出されることは稀であるが（Ｒｅｓｓｉｎｇ、１９９６；Ｂｏｎｔｋｅｓ、２０００；Ｎｉｍａｋｏ、１９９７；Ｙｏｕｄｅ、２０００）、このようなＣＴＬが、ＨＰＶ１６＋新生物を有していない女性において一般的に検出され得る（Ｎａｋａｇａｗａ、１９９７；Ｎａｋａｇａｗａ、１９９９）理由の説得力のある説明を提示している。
【０００９】
特に、ＨＰＶに対して対象を免疫化する臨床的に関連のある手法としては、特異的ヘルパーＴ細胞及びＣＴＬの双方を誘導することが好ましい。本発明者らは、ＣＴＬの最小エピトープを用いた免疫化は、いくつかのモデルにおいて腫瘍に対する保護をもたらす（Ｋａｓｔら、１９９１）が、他のモデルにおいては、他の形で誘導された場合は保護的であるウィルス特異的ＣＴＬ及び腫瘍特異的ＣＴＬの耐性又は機能的欠失をもたらすことをすでに示した（Ｔｏｅｓら、１９９６ａｂ）。耐性又は機能的欠失の発生により、ワクチン接種の効果は有意に減少する。したがって、この効果に関係するエピトープは免疫化目的には適切ではなかった。ＭＨＣクラスＩ分子、交差プライミング並びに他の機序による提示のための、外来性抗原のプロセッシングは、周知の内因性経路の次の、ＭＨＣクラスＩによる提示のための第２のプロセッシングの経路と、現在では広く認識されている（Ｊｏｎｄａｌら、１９９６、Ｒｅｉｍａｎｎら、１９９７）。この経路を介した抗原プロセッシングの正常な結果は、ＣＤ４＋Ｔ細胞によるＡＰＣの活性化が起こる場合を除いて、ＣＴＬ耐性である（Ｋｕｒｔｓら、１９９７）。耐性又は機能的欠失のこの問題を解消するために、ＷＯ０２／０７０００６は、ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞双方の活性化をもたらす、ＭＨＣクラスＩ及びＩＩ双方の提示可能なエピトープを有する長鎖ＨＰＶペプチドのワクチンとしての使用を開示した。
【００１０】
高用量のペプチド及び／又は連続したワクチン接種が、最適な免疫原性効果を得るために通常使用されているので、ＷＯ０２／０７０００６において開発されたＨＰＶワクチンはさらに改善できる。さらに、ＭｏｎｔａｎｉｄｅＩＳＡ−５１などのアジュバントが、最適な免疫原性効果を得るために普通必要である。これらのアジュバントは、注射部位の長期にわたる局所的腫れ、赤くはれた手、熱、嘔吐、関節の痛み、インフルエンザに感染した時の症状に似た病気の全身症状などの望ましくない副作用を誘導する。これらの副作用は、一般的に不快であり、早期病変を有する患者の治療を妨げると思われる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
したがって、既存のワクチンの欠点を全く有さない改善されたＨＰＶワクチンが未だに必要であり、中でも、本発明に使用するＨＰＶワクチンは、高用量のペプチド及び／又は連続したワクチン接種及び／又はアジュバントを必要としない。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、皮内投与用である、ＨＰＶ関連疾患の治療又は予防用薬剤の製造のための、ＨＰＶ−Ｅ２、−Ｅ６及び／又は−Ｅ７タンパク質に由来するペプチドの使用に関する。
【００１３】
本発明に使用するペプチドの配列は、ＨＰＶ１６又は１８由来のＨＰＶ−Ｅ２、−Ｅ６及び／又は−Ｅ７タンパク質に由来するものである限り重要ではない。好ましくは、このペプチドは、これらのタンパク質の最も免疫原性の高い領域の１つにおいて選択される。より好ましくは、このペプチドは、ＨＰＶ−Ｅ２、−Ｅ６及び／又はＥ７特異的Ｔ細胞応答を誘導及び／又は強化でき、したがってこのペプチドは特異的Ｔ細胞エピトープを含む。
【００１４】
ＨＬＡクラスＩ及びクラスＩＩのエピトープの長さを超える長さの（例えば、本明細書に記載の長さを有する）ペプチドは、それらは、ＷＯ０２／０７０００６において説明されるように、プロフェッショナル抗原提示細胞（ＡＰＣ）、特にＤＣ中に存在するように、抗原取込みのための食細胞機構を要求するために十分長く、含まれているＨＬＡクラスＩ及びクラスＩＩのエピトープの細胞表面提示が起こる前にＤＣにおいてプロセッシングされるので、薬剤としての使用に特に有利である。したがって、（Ｔｏｅｓら、１９９６、ＰＮＡＳ９３：７８５５及びＴｏｅｓら、１９９６、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５６：３
９１１）に示されるような）Ｔ細胞耐性の不利な誘導が、本明細書に示された長さを有するペプチドの使用によって妨げられる（Ｚｗａｖｅｌｉｎｇら、２００２、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：３５０に示される）。したがって、好ましい実施形態において、本発明の使用が提供され、前記ペプチドはＡＰＣを活性化できる配列を含む。ＡＰＣを活性化できる配列とは、ＡＰＣ、好ましくはプロフェッショナルＡＰＣを少なくとも部分的に活性化できる配列を意味する。前記活性化により、好ましくは前記ＡＰＣの表面において、前記ペプチドの少なくとも１つのエピトープの提示がもたらされる。特に好ましい実施形態において、前記ペプチドは、前記抗原に対する少なくとも２つのＴ細胞エピトープを含む。前記抗原に対する少なくとも２つのＴ細胞エピトープの存在は、さらにより有効な、前記抗原特異的Ｔ細胞応答の誘導及び／又は強化を可能にする。
【００１５】
好ましくは、前記エピトープの少なくとも１つは、前記抗原に対するヘルパーＴ細胞エピトープ又は前記抗原に対する細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）エピトープを含む。ペプチド上に存在する少なくとも１つの又は他のエピトープを有することは好ましい。前記ペプチドがヘルパーＴ活性化配列を含む場合、有効な誘導及び／又は強化が達成される。ヘルパーＴ活性化配列とは、本明細書において、ヘルパーＴ細胞を少なくとも部分的に活性化できる配列を意味する。前記活性化は、好ましくは前記抗原特異的Ｔ細胞応答の誘導及び／又は強化の改善をもたらす。一実施形態において、前記ペプチドは、前記抗原に対する少なくとも１つのヘルパーＴ細胞エピトープ及び前記抗原に対する少なくとも１つの細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）エピトープを含む。
【００１６】
したがって、少なくとも１つのＨＬＡクラスＩＩ（ヘルパーＴ細胞）エピトープ及び／又は少なくとも１つのＨＬＡクラスＩ（細胞障害性Ｔ細胞）エピトープが、血清型１６、１８、３１、３３又は４５などのハイリスクなＨＰＶ血清型に由来するＨＰＶ Ｅ２又はＥ６及び／又はＥ７タンパク質のアミノ酸からの連続するアミノ酸配列内に存在するペプチドが好ましく使用される。より好ましくは、使用するペプチド中に存在する連続アミノ酸配列が、ＨＰＶ血清型１６、１８、３１又は３３に由来するＨＰＶ Ｅ２、Ｅ６又はＥ７タンパク質のアミノ酸、さらにより好ましくはＨＰＶ血清型１６又は１８、最も好ましくはＨＰＶ血清型ＨＰＶ１６に由来する。ＨＰＶ１６及びＨＰＶ１８のＥ２、Ｅ６及びＥ７のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１、２、３、４、５及び６で表わす。
【００１７】
好ましくは、連続するアミノ酸配列の長さは、４５アミノ酸未満であり、ＨＰＶ１６又はＨＰＶ１８のＥ２、Ｅ６及び／又はＥ７タンパク質のアミノ酸配列（例えば、配列番号１、２、３、４、５、６）から選択される、少なくとも１９アミノ酸を含み、このペプチドは、少なくとも１つのＨＬＡクラスＩＩエピトープ及び／又は少なくとも１つのＨＬＡクラスＩエピトープを含み、双方ともＨＰＶ Ｅ２、Ｅ６及び／又はＥ７タンパク質のアミノ酸配列に由来する。より好ましくは、ペプチド中の、少なくとも１つのＨＬＡクラスＩＩエピトープ及び／又は少なくとも１つのＨＬＡクラスＩエピトープが、ＨＰＶ Ｅ２、Ｅ６及び／又はＥ７タンパク質のアミノ酸配列に由来する、連続するアミノ配列内に存在する。
【００１８】
明確にすると、本発明に使用するペプチドは、好ましくは少なくとも１つのＨＬＡクラスＩエピトープ及び／又は少なくとも１つのＨＬＡクラスＩＩエピトープを含み、これらのエピトープそれぞれが提示可能であり、本明細書に記載のようにプロセッシングされた後で、細胞上に存在する、対応する特異的ＨＬＡ分子と結合するであろう。したがって、各ＨＬＡエピトープを、ＨＬＡ結合エピトープ及び／又はＨＬＡ提示可能エピトープとも名付けることができる。より好ましくは、使用するペプチドは、ＨＰＶ−Ｅ２、−Ｅ６及び／又はＥ７特異的Ｔ細胞応答を誘導及び／又は強化することができ、このペプチドは、前記ＨＰＶ−Ｅ２、−Ｅ６及び／又はＥ７タンパク質に対して特異的なＴ細胞エピトープを含む。さらにより好ましくは、このペプチドは、ＨＰＶ Ｅ２又はＥ６及び／又はＥ７
タンパク質由来の２２〜４５の連続するアミノ酸残基を含む。
【００１９】
ペプチド内に含まれる、ＨＰＶ Ｅ２、Ｅ６及び／又はＥ７タンパク質由来の連続するアミノ酸配列の長さは、好ましくは、１９〜４５、２２〜４５、２２〜４０、２２〜３５、２４〜４３、２６〜４１、２８〜３９、３０〜４０、３０〜３７、３０〜３５、３２〜３５、３３〜３５、３１〜３４の間のアミノ酸を含む。別の実施形態において、ペプチドは、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４若しくは４５、又は４５を超える、ＨＰＶ Ｅ２、Ｅ６及び／又はＥ７タンパク質の連続するアミノ酸残基を含む。別の好ましい実施形態において、本発明のペプチドは、本明細書において定義されたようなＨＰＶ Ｅ２、Ｅ６及び／又はＥ７タンパク質由来の、連続するアミノ酸配列のいずれかからなる。本発明に使用するペプチドは、容易に合成可能であり、プロフェッショナルＡＰＣにより取り込まれるために十分長く、プロテアソームによりプロセッシングされ、少なくとも１つのＨＬＡクラスＩ及び／又は１つのＨＬＡクラスＩＩエピトープを含むために十分な物理的能力及び長さを有する。したがって上で定義したように、好ましい実施形態において、ペプチドはＡＰＣを活性化できる配列を含む。
【００２０】
又は、先の好ましい実施形態と組み合わせて、ペプチドはヘルパーＴ活性化配列を含む。
【００２１】
さらにより好ましい実施形態において、ペプチドは、前記抗原に対する少なくとも２つのＴ細胞エピトープを含む。より好ましくは、このペプチド中に、前記エピトープの少なくとも１つは、前記抗原に対するヘルパーＴ細胞エピトープ及び／又は前記抗原に対する細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）エピトープを含む。
【００２２】
別の好ましい実施形態において、ペプチド中に存在する抗原は、ＨＰＶ Ｅ２、Ｅ６及び／又はＥ７タンパク質又はそれらの免疫原性部分、誘導体及び／若しくは類似体に由来する。タンパク質の免疫原性部分、誘導体及び／又は類似体は、前記タンパク質それ自体と同じ種類の免疫原性能力を含むが、必ずしも量的に同じである必要はない。このようなタンパク質の誘導体は、好ましい保存的アミノ酸置換によって得ることができる。
【００２３】
より好ましくは、前記ペプチドは、最も免疫原性の高い領域として本明細書において特定されたＥ２、Ｅ６及び／又はＥ７の領域を含む。さらに、この領域にマッピングされた、自然にプロセッシングされた多くのＴｈエピトープがすでに特定されている。健康な血液ドナーに由来する短期及び長期のＰＢＭＣ培養をそれぞれ含む方法は、適切なペプチドを特定するために使用できる。ＰＢＭＣの培養は、検査されるペプチドを用いて刺激され得る。平行して、ＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより検出される、インビボで誘導されるＥ２、Ｅ６及び／又はＥ７に特異的な免疫は、健康な対象並びにＨＰＶ１６＋病変を有すると診断された対象において分析できる。
【００２４】
好ましい実施形態において、本明細書で使用する薬剤は、ＨＰＶ−Ｅ２、Ｅ６及び／又はＥ７タンパク質に由来する、少なくとも２種の異なるペプチドを含む。より好ましくは、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも７種、少なくとも８種又はそれ以上のペプチドを薬剤中に混合物又はプールとして組み合わせて使用する。１つの単回ワクチンを使用して、１つのＨＰＶタンパク質Ｅ２、Ｅ６又はＥ７内に存在する、いくつかの免疫原性エピトープに対するワクチン接種及びその後の保護を得ることができるので、このことは有利である。
【００２５】
又は、先の好ましい実施形態を組み合わせて、この薬剤は、連続するアミノ酸配列が、ＨＰＶ Ｅ２、Ｅ６及びＥ７タンパク質の少なくとも２種、より好ましくはＨＰＶ Ｅ２
、Ｅ６及びＥ７タンパク質の３種すべてに由来するペプチドを含む。１つの単回ワクチンを使用して、いくつかのＨＰＶタンパク質Ｅ２、Ｅ６又はＥ７内に存在する、いくつかの免疫原性エピトープに対するワクチン接種及びその後の保護を得ることができるので、このこともまた有利である。
【００２６】
使用する薬剤が２種以上のペプチドを含む場合、いくつかのペプチドの組合せを、ペプチドのプール又は混合物と名付けることができる。
【００２７】
好ましい実施形態において、この薬剤は以下のペプチドの少なくとも１つを含み、各ペプチドは、ＨＰＶ１６のＥ２、Ｅ６又はＥ７に由来する、以下の配列を含む、又は以下の配列からなる、又は以下の配列と重複する：Ｅ２ ３１〜６０又は配列番号７、Ｅ２ ４６〜７５又は配列番号８、Ｅ２ ３０１〜３３０又は配列番号９、Ｅ２ ３１６〜３４５又は配列番号１０、Ｅ６ １〜３２又は配列番号１１、Ｅ６ １９〜５０又は配列番号１２、Ｅ６ ４１〜６５又は配列番号１３、Ｅ６ ５５〜８０又は配列番号１４、Ｅ６ ７１〜９５又は配列番号１５、Ｅ６ ８５〜１０９又は配列番号１６、Ｅ６ ９１〜１２２又は配列番号１７、Ｅ６ １０９〜１４０又は配列番号１８、Ｅ６ １２７〜１５８又は配列番号１９、Ｅ７ １〜３５又は配列番号２０、Ｅ７ ２２〜５６又は配列番号２１、Ｅ７ ４３〜７７又は配列番号２２、Ｅ７ ６４〜９８又は配列番号２３、Ｅ２ １〜３０、Ｅ２ １６〜４５、Ｅ２ ６１〜９０、Ｅ２ ５１〜７０、Ｅ２ ６１〜７６、Ｅ２
７６〜１０５、Ｅ２ ９１〜１２０、Ｅ２ １０６〜１３５、Ｅ２ １２１〜１５０、Ｅ２ １３６〜１６５、Ｅ２ １５１〜１８０、Ｅ２ １６６〜１９５、Ｅ２ １８１〜２１０、Ｅ２ １９６〜２２５、Ｅ２ ２１１〜２４０、Ｅ２ ２２６〜２５５、Ｅ２ ２４１〜２７０、Ｅ２ ２５６〜２８５、Ｅ２ ２７１〜３００、Ｅ２ ２８６〜３１５、Ｅ２ ３１６〜３３０、Ｅ２ ３１１〜３２５、Ｅ２ ３３１〜３６５、Ｅ２ ３４６〜３５５、Ｅ２ ３５１〜３６５、Ｅ６ １〜２２、Ｅ６ １１〜３２、Ｅ６ ２１〜４２、Ｅ６ ３１〜５２、Ｅ６ ４１〜６２、Ｅ６ ５１〜７２、Ｅ６ ６１〜８２、Ｅ６
７１〜９２、Ｅ６ ８１〜１０２、Ｅ６ ９１〜１１２、Ｅ６ １０１〜１２２、Ｅ６
１１１〜１３２、Ｅ６ １２１〜１４２、Ｅ６ １２７〜１４０、Ｅ６ １３１〜１５２、Ｅ６ １３７〜１５８、Ｅ７ １〜２２、Ｅ７ １１〜３２、Ｅ７ ２１〜４２、Ｅ７ ３０〜５０、Ｅ７ ３１〜５２、Ｅ７ ３５〜５０、Ｅ７ ４１〜６２、Ｅ７ ５０〜６２、Ｅ７ ５１〜７２、Ｅ７ ３５〜７７、Ｅ７ ６１〜８２、Ｅ７ ７１〜９２、Ｅ７ ７７〜９８、中でも、Ｅ２ ３１〜６０又は配列番号７、Ｅ２ ４６〜７５又は配列番号８、Ｅ２ ３０１〜３３０又は配列番号９、Ｅ２ ３１６〜３４５又は配列番号１０、Ｅ６ １〜３２又は配列番号１１、Ｅ６ １９〜５０又は配列番号１２、Ｅ６ ４１〜６５又は配列番号１３、Ｅ６ ５５〜８０又は配列番号１４、Ｅ６ ７１〜９５又は配列番号１５、Ｅ６ ８５〜１０９又は配列番号１６、Ｅ６ ９１〜１２２又は配列番号１７、Ｅ６ １０９〜１４０又は配列番号１８、Ｅ６ １２７〜１５８又は配列番号１９、Ｅ７ １〜３５又は配列番号２０、Ｅ７ ２２〜５６又は配列番号２１、Ｅ７ ４３〜７７又は配列番号２２、Ｅ７ ６４〜９８又は配列番号２３が最も好ましい。これらのペプチドのそれぞれの配列は、配列番号１、２又は３で表わされるＨＰＶ１６の対応するＥ２、Ｅ６又はＥ７の完全長配列から推測できる。
【００２８】
本発明の文脈において、重複は、使用するペプチドの配列が、所与の配列と部分的又は全体的に重複することを意味する。好ましくは、重複は、部分的重複を意味する。好ましくは、部分的は、重複がペプチド配列の５’末端及び／又は３’末端における１つ又は複数のアミノ酸の重複、より好ましくは、５’末端及び／又は３’末端における２つ以上のアミノ酸の重複或いはそれ以上であることを意味する。重複が、ペプチド配列の５’末端における１つ又は複数のアミノ酸の重複、及び／又はペプチド配列の３’末端における２つ以上のアミノ酸の重複或いは逆もまた同様に好ましい。当業者は、得られたペプチドが本明細書において先に定義されたような望ましい免疫原性活性を示す限り、あらゆる種類
の重複が本発明に包含されることを理解するであろう。
【００２９】
別の好ましい実施形態において、本薬剤に使用するペプチドは、保存的アミノ酸置換により上に示された配列に由来する。
【００３０】
より好ましくは、この薬剤は、上に具体的に述べたペプチドの少なくとも２種、又は少なくとも３種、又は少なくとも４種、又は少なくとも５種、又は少なくとも６種又はそれ以上を含む。
【００３１】
最も好ましい実施形態において、この薬剤は、以下のペプチドのプールの少なくとも１つを含み、各ペプチドは、以下の配列を含む、又は以下の配列からなる、又は以下の配列と重複する：
プール１：Ｅ２ ３１〜６０及び／若しくはＥ２ ４６〜７５、並びに／又は
プール２：Ｅ２ ３０１〜３３０及び／若しくはＥ２ ３１６〜３４５、並びに／又は
プール３：Ｅ２ ３１〜６０及び／若しくはＥ２ ４６〜７５、及び／若しくはＥ２ ３０１〜３３０及び／若しくはＥ２ ３１６〜３４５、並びに／又は
プール４：Ｅ６ １〜３２及び／若しくはＥ６ １９〜５０、並びに／又は
プール５：Ｅ６ ４１〜６５、Ｅ６ ５５〜８０及び／若しくはＥ６ ７１〜９５、並びに／又は
プール６：Ｅ６ ８５〜１０９、及び／若しくはＥ６ ９１〜１２２、並びに／又は
プール７：Ｅ６ １０９〜１４０及び／若しくはＥ６ １２７〜１５８、並びに／又は
プール８：Ｅ６ １〜３２及び／若しくはＥ６ １９〜５０、及び／若しくはＥ６ ４１〜６５、及び／若しくはＥ６ ５５〜８０及び／若しくはＥ６ ７１〜９５、及び／若しくはＥ６ ８５〜１０９、及び／若しくはＥ６ ９１〜１２２及び／若しくはＥ６ １０９〜１４０及び／若しくはＥ６ １２７〜１５８、並びに／又は
プール９：Ｅ７ １〜３５及び／若しくはＥ７ ２２〜５６、並びに／又は
プール１０：Ｅ７ ４３〜７７、及び／若しくはＥ７ ６４〜９８、並びに／又は
プール１１：Ｅ７ １〜３５及び／若しくはＥ７ ２２〜５６、及び／若しくはＥ７ ４３〜７７、及び／若しくはＥ７ ６４〜９８、並びに／又は
プール１２：上で定義したようなプール３及びプール８、並びに／又は
プール１３：上で定義したようなプール８及びプール１１、並びに／又は
プール１４：上で定義したようなプール３及びプール１１、並びに／又は
プール１５：上で定義したようなプール３、プール８及びプール１１。
【００３２】
好ましくは、薬剤中に存在するペプチドに含まれるクラスＩＩ ＣＤ４＋Ｔｈ細胞エピトープは、ＨＰＶ誘導性疾患を有する患者及び／又は健康な対象において、ＣＤ４＋Ｔｈ細胞を活性化できる。活性化は、エクスビボ又はインビボで、より好ましくは、ＨＰＶ感染／形質転換細胞が所与の抗原を発現する、ＨＰＶ誘導性疾患を有する患者において好ましく評価される。最も好ましくは、ＨＬＡクラスＩＩエピトープが、ＣＤ４＋Ｔｈメモリー応答を活性化できる、すなわち、ＣＤ４５ＲＯ−陽性ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞を活性化できる。このことは、ＤＣのＣＤ４０誘発を介した「殺しのライセンス（ｌｉｃｅｎｃｅ
ｔｏ ｋｉｌｌ）」シグナルにより（Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ、１９９８、Ｎａｔｕｒｅ ３９３：４１３）、より強固なＣＤ８＋エフェクター及びメモリーＴ細胞応答をもたらすと思われる。
【００３３】
当技術分野では、ペプチドを発生させる多くの方法が知られている。本発明は、発生させたペプチドが最小のＴ細胞エピトープを含む限り、発生させたペプチドのいずれの形態にも限定されない。例としては、薬剤中に存在するペプチドは、タンパク質Ｅ２、Ｅ６又はＥ７から得ることができ、インビトロで又は細胞、例えばコード化核酸を介して合成できる。本薬剤に使用するペプチドは、単一ペプチドとして、又は融合タンパク質に組み込
まれて存在することができる。一実施形態において、前記ペプチドは、細胞の内側の前記ペプチドを、前記細胞の表面上のＭＨＣ分子に輸送され、及び／又は組み込まれ得るようにプロセッシングできる、プロセッシング部位に隣接している。好ましい実施形態において、本薬剤に使用するペプチドは、プロセッシング後にＭＨＣクラスＩＩ分子と複合体を形成できる。ＭＨＣクラスＩＩ拘束性Ｔ細胞性免疫は、現在、例えば、腫瘍細胞の根絶において、前記腫瘍細胞が多くの場合ＭＨＣクラスＩＩ分子を発現しないにもかかわらず重要であると考えられている。本薬剤に使用するペプチドは、ＭＨＣクラスＩ及びＭＨＣクラスＩＩ双方に依存性のＴ細胞の誘発、誘導及び／又は刺激に特に適している。
【００３４】
本薬剤に使用するペプチドは、１つ又は複数のアミノ酸の欠失又は置換により、Ｎ末端及び／又はＣ末端において追加のアミノ酸又は官能基で伸長することにより、さらに修飾されていてもよく、このことは、生体利用率、標的化及びプロフェッショナルＡＰＣによる取り込みを改善でき、或いはアジュバント又は（共）刺激機能を提供する免疫調節物質を含む、又は放出する。Ｎ末端及び／又はＣ末端における任意選択の追加のアミノ酸は、好ましくはＨＰＶ Ｅ２、Ｅ６及び／又はＥ７のアミノ酸配列の対応する位置には存在せず、より好ましくは、それらはＥ２、Ｅ６又はＥ７アミノ酸配列（配列番号１、２、３、４、５、６）には由来しない。
【００３５】
さらに好ましい実施形態において、本薬剤はアジュバントを含まない。より好ましくは、本薬剤は、以下の望ましくない副作用：注射部位の局所的腫れ、赤くはれた手、熱、嘔吐、関節の痛み、インフルエンザに感染した時の症状に似た病気の全身症状などの少なくとも１つを伴うことが現在公知であるアジュバントを含まない。さらにより好ましくは、アジュバントは、不完全フロインドアジュバント又はＩＦＡ、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ−５１又はＭｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ７２０（Ｓｅｐｐｉｃ、フランス）などの、水中油型乳剤ではない。さらにより好ましくは、アジュバントは、デポー機能を有さない、及び／又は生物分解可能である。デポー機能は、好ましくは、ペプチドが注射部位に長期間含まれ、長期間にわたって漏れ出るだけであることを意味する。好ましくは、長期間は少なくとも１カ月であり、より好ましくは、少なくとも２カ月又は３カ月である。さらにより好ましくは、アジュバントはＭｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ−５１（Ｓｅｐｐｉｃ、フランス）ではない。
【００３６】
別のさらに好ましい実施形態において、本薬剤は、本明細書において先に定義された１つ又は複数のペプチド及び不活性な薬学的に許容可能な担体及び／又は賦形剤からなる。不活性な薬学的に許容可能な担体及び／又は賦形剤は、好ましくは免疫応答及び／又は炎症応答或いはアジュバントに関して上に記載した任意の望ましくない副作用を引き起こさないという意味で不活性である。薬剤の処方及び薬学的に許容可能な賦形剤の使用は、当技術分野において公知であり、慣習であり、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ；Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２１版、２００５ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａに記載されている。本発明に使用する薬剤は、皮内投与又は皮内適用に適するように処方する。皮内は、当業者には公知である。本発明の文脈において、皮内（ｉｎｔｒａｄｅｒｍａｌ）は、皮内（ｉｎｔｒａｃｕｔａｎｅｏｕｓ）と同義語であり、皮下とは異なる。物質の最も表面的な適用は、経皮（皮膚上）であり、その次が皮内適用（皮膚中又は皮膚内）、その次が皮下適用（皮膚のすぐ下の組織中）、その次が筋肉内適用（身体の筋肉内）である。皮内適用は、普通注射により実施される。物質の皮内注射は、普通、それに対する反応、アレルギー及び／又は細胞性免疫の可能性を検査するために実施する。皮下適用もまた、普通注射により実施され、針は皮膚の下の組織に差し込まれる。
【００３７】
別のさらに好ましい実施形態において、本発明に使用する薬剤は、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ
ＩＳＡ−５１などの任意のアジュバントを含まないので、この薬剤の処方がより単純で
あり、油−水に基づく乳剤が、好ましくは使用する薬剤中に存在しないことを意味する。したがって、本発明に使用する薬剤は、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ−５１などのアジュバントを含まない、及び／又は水中油に基づく乳剤を含まない。したがって好ましい実施形態において、本発明に使用する薬剤は、生理的イオン強度及び／又はオスモル濃度の緩衝水溶液、例えば、本明細書において先に定義されたような、１つ又は複数のペプチドを含む或いは１つ又は複数のペプチドからなるＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）である。当業者は、このような溶液の調製の仕方を知っている。
【００３８】
本発明に使用する薬剤は、本明細書において先に定義されたようなペプチドを、低用量で皮内投与しても免疫原性効果を達成できるという、別の利点を有する。使用する各ペプチドの量は、好ましくは１〜１０００μｇの間の範囲であり、より好ましくは５〜５００μｇの間の範囲であり、さらにより好ましくは１０〜１００μｇの間の範囲である。
【００３９】
当業者は、予想するペプチド濃度が免疫原性であるかどうかの検査方法を知っているはずである。好ましくは、ＰＢＭＣを、ＷＯ０２／０７０００６に例示されているように、さまざまな濃度の検査ペプチドを用いてインビトロで刺激する。実施例において、ペプチド刺激性ＰＢＭＣが、非刺激性ＰＢＭＣより、少なくとも２倍強い増殖及び／又は少なくとも２倍多いサイトカインの産生及び／又はマーカー（例えば、ＣＤ２５、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ６９、ＣＤ１５４、ＣＤ１３７）の活性化の上方制御を開始した場合、免疫原性効果が達成される。或いは、実施例のように皮膚検査を実施する。簡潔に言うと、選択されたペプチドを、好ましくは２０ｍＭの等張リン酸緩衝液中に約１０〜２０％、より好ましくは約１６％のＤＭＳＯ（ｖ／ｖ）中に約０．１から約０．４ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは０．２ｍｇ／ｍｌのペプチドの０．０５ｍｌ（１０μｇ／ペプチド）を皮内注射する。ペプチドは、上腕の個々の皮膚の検査部位に個別に注射する。
【００４０】
別の好ましい実施形態において、本薬剤は、本明細書において先に定義されたようなペプチド及び少なくとも１つのアジュバントを含み、前記アジュバントは水中油に基づく乳剤に処方されておらず及び／又は本明細書において先に定義されたような水中油型乳剤ではない。この型の薬剤は、単回投与として投与できる。或いは、本明細書において先に定義されたようなペプチド及び／又はアジュバントの投与は、必要に応じて反復でき、並びに／或いは異なるペプチド及び／又は異なるアジュバントを連続して投与できる。本発明のペプチドを皮内投与し、本明細書において定義されたアジュバントを連続して投与することもまた、本発明に包含される。アジュバントは皮内投与できる。しかし、任意の他の投与方法もまた、アジュバントに関して使用できる。
【００４１】
特に好ましいアジュバントは、トール様受容体を介して、及び／又はＲＩＧ−１（レチノイン酸誘導性遺伝子Ｉ）タンパク質を介して、及び／又はエンドセリン受容体を介して作用することが公知のアジュバントである。先天性免疫系を活性化できるアジュバントは、ＴＬＲ１〜１０を含むトール様受容体（ＴＬＲ）を介して、特によく活性化できる。ＴＬＲ受容体を活性化できる化合物並びにそれらの修飾体及び誘導体は、当技術分野において十分立証されている。ＴＬＲ１は、細菌性リポタンパク質及びそれらのアセチル化形態により活性化でき、さらにＴＬＲ２は、グラム陽性細菌の糖脂質、ＬＰＳ、ＬＰＡ、ＬＴＡ、繊毛、外膜タンパク質、細菌起源由来又は宿主由来の熱ショックタンパク質及びマイコバクテリウム・リポアラビノマンナン（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｌ ｌｉｐｏａｒａｂｉｎｏｍａｎｎａｎｓ）により活性化できる。ＴＬＲ３は、ｄｓＲＮＡ、特にウィルス起源のｄｓＲＮＡにより、又は化合物ポリ（Ｉ：Ｃ）により活性化できる。ＴＬＲ４は、グラム陰性ＬＰＳ、ＬＴＡ、宿主由来又は細菌起源由来の熱ショックタンパク質、ウィルスコートタンパク質又はエンベロープタンパク質、タクソール又はその誘導体、オリゴ糖を含むヒアルロン酸及びフィブロネクチンにより活性化できる。ＴＬＲ５は、細菌の鞭毛又はフラジェリンにより活性化できる。ＴＬＲ６は、マイコバクテリアのリポタンパク質
及びＢ群連鎖球菌の易熱性可溶性因子（ＧＢＳ−Ｆ）又はブドウ球菌のモジュリンにより活性化できる。ＴＬＲ７は、イミダゾキノリンにより活性化できる。ＴＬＲ９は、非メチル化ＣｐＧ ＤＮＡ又はクロマチン−ＩｇＧ複合体により活性化できる。特に、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７及びＴＬＲ９は、ウィルス感染に対する先天的免疫応答を仲介する上で、重要な役割を果たし、これらの受容体を活性化できる化合物は、本発明での使用に特に好ましい。特に好ましいアジュバントは、限定するものではないが、ｄｓＲＮＡ、ポリ（Ｉ：Ｃ）、ＴＬＲ３及びＴＬＲ９受容体を誘発する非メチル化ＣｐＧ ＤＮＡ、ＩＣ３１、ＴＬＲ９アゴニスト、ＩＭＳＡＶＡＣ、ＴＬＲ４アゴニストを含む合成化合物を含む。ＲＩＧ−１は、ＴＬＲ３のようなｄｓ−ＲＮＡによって活性化されることが公知である（Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（２００５）、１：１９〜２８）。別の好ましい実施形態において、アジュバントは、本明細書において先に定義されたようなペプチドに物理的に連結している。アジュバント及び共刺激性の化合物又は官能基の、ペプチドを含むＨＬＡクラスＩ及びＨＬＡクラスＩＩのエピトープへの物理的連結は、抗原を取り込み、代謝し、表示する抗原提示細胞、特に樹状細胞の同時刺激により免疫応答の強化を提供する。別の好ましい免疫調節化合物は、Ｔ細胞の接着阻害剤、より好ましくはＢＱ−７８８（Ｂｕｃｋａｎｏｖｉｃｈ
ＲＪら、Ｉｓｈｉｋａｗａ Ｋ、ＰＮＡＳ（１９９４）９１：４８９２）などのエンドセリン受容体の阻害剤である。ＢＱ−７８８は、Ｎ−ｃｉｓ−２，６−ジメチルピペリジノカルボニル−Ｌ−γ−メチルロイシル−Ｄ−１−メトキシカルボニルトリプトファニル−Ｄ−ノルロイシンである。しかし、ＢＱ−７８８の任意の誘導体又はＢＱ−７８８化合物の修飾体もまた、本発明の範囲に包含される。
【００４２】
さらに、本発明に使用する薬剤中に存在するペプチドと組み合わせて、ＷＯ９９／６１０６５及びＷＯ０３／０８４９９９に発表されたようなＡＰＣ（共）刺激性分子の使用が好ましい。特に、４−１−ＢＢ及び／又はＣＤ４０のリガンド、アゴニスト抗体、ＯＸ４０リガンド又はそれらの機能的断片及び誘導体並びに同様のアゴニスト活性を有する合成化合物の使用は、対象の最適な免疫応答の開始をさらに刺激するために、個別に又は薬剤中に存在するペプチドと組み合わせて治療されるべき対象に好ましく投与される。
【００４３】
好ましい実施形態において、アジュバントは、モノホスホリル脂質Ａ及び／又はＣｐＧ核酸などのＴＬＲ（３、４、７、８、９）リガンド及び／又はＣＤ４０リガンドなどのＡＰＣ共刺激性分子、アゴニスト抗体又はそれらの機能的断片及び誘導体及び／又はＧＭ−ＣＳＦを含む。
【００４４】
別の好ましい実施形態において、プロフェッショナル抗原提示細胞又は樹状細胞によるペプチドの提示を促進するために、ペプチドを含む薬剤は、本明細書において先に述べたようなＴＬＲリガンドとしてＤＣ活性化剤をさらに含む。
【００４５】
好ましい実施形態において、ワクチンである本薬剤をヒト又は動物に投与する。より好ましい実施形態において、このヒト又は動物は、ＨＰＶ（持続性）関連疾患を患っている、又は患う危険性がある。前記ＨＰＶ関連疾患は、ＨＰＶ感染、ＨＰＶ関連悪性腫瘍、子宮頸部上皮内新生物（ＣＩＮ）、外陰上皮内新生物（ＶＩＮ）、肛門上皮内新生物（ＡＩＮ）、膣上皮内新生物（ＶＡＩＮ）、陰茎上皮内新生物（ＰＩＮ）、子宮頸癌、頭部及び頸部の癌、特に口腔咽頭癌及びへんとう癌、陰茎癌、肛門癌、膣癌及び外陰癌から選択される。
【００４６】
好ましくは、前記ＨＰＶ関連疾患は、前記免疫応答の誘導及び／又は強化によって、少なくとも部分的に治療可能又は予防可能である。
【００４７】
したがって、本発明の方法は、前記抗原に対する免疫及び／又は前記免疫の強化を、対象に提供するために非常に適している。本発明の方法は、他の免疫化戦略を使用する目的
のいずれに対しても適している。かつての免疫化は、ワクチン接種目的、すなわち、疾患の予防のために使用される。しかし、本発明の方法は、疾患予防だけに適しているわけではない。この方法は、既存の疾患の治療にも使用でき、当然のことながらこの疾患は、抗原特異的Ｔ細胞性免疫の誘導及び／又は強化によって治療可能な範囲に限定される。この特徴を、例えば、ＨＰＶ感染などのウィルス感染に伴う疾患、例えばいくつかの癌の治療に使用できる。好ましい実施形態において、前記ヒト又は動物は、前記免疫応答の誘導及び／又は強化によって少なくとも部分的に治療可能又は予防可能である、ＨＰＶ感染などの疾患を患っている、又は患う危険性がある。好ましくは、前記疾患は、ＨＰＶウィルス性疾患及び／又は癌を含む。
【００４８】
ペプチドの皮内投与は、ワクチンの注射が、疾患部位又は可能な限り疾患部位の近くに実現でき、疾患流入領域リンパ節の局所活性化をもたらし、免疫系のより強い局所活性化をもたらすので非常に注目すべきものである。特に、ＶＩＮ、ＶＡＩＮ、ＡＩＮ、ＰＩＮ、陰茎癌、外陰癌、肛門癌、頭部及び頸部の癌にとって注目すべきものである。
【００４９】
好ましい実施形態において、皮内投与は、病変部位又は疾患部位に直接実施する。本明細書において病変部位においてとは、病変部位から５、２、１、０．５、０．２又は０．１ｃｍ未満内であると理解される。
【００５０】
本明細書において定義されたような薬剤の皮内投与において、Ｔｈ２応答だけでなくＴｈ１応答もまた誘発される。遺伝子銃を介した皮膚の抗原提示は、選択的Ｔｈ２免疫応答をもたらすことがすでに発見されているので、このことは驚くべきことである（Ａｌｖａｒｅｚ Ｄら、２００５）。さらに、観察された免疫応答は、Ａｌｖａｒｅｚ Ｄらに基づいて期待できるように皮膚に限定されない。本発明者らは、ＩＦＮγを分泌する特異的Ｔ細胞が、チャレンジ後の末梢血において検出されたので、二次リンパ系を介して循環することを実証する。
【００５１】
本発明の薬剤の別の重要な利点は、比較的低用量のペプチドを、１回のシングルショットで、単純な処方で、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ−５１などの望ましくない副作用を起こすことが公知の任意のアジュバントを含まずに使用できることである。任意の理論に縛られることを望むものではないが、本発明者らは、本発明に使用するＨＰＶ皮内ペプチド（単数又は複数）が、特異的及び直接的に上皮に存在する表皮ランゲルハンス細胞（ＬＣ）を標的とすると考えている。ランゲルハンス細胞は、一次免疫応答を開始する優れた能力を示すＤＣの特異的サブタイプである（Ｒｏｍａｎｉ Ｎら）。これらのＬＣは、本発明に使用する薬剤に用いられる天然のアジュバントとしてみなし得る。
【００５２】
別の好ましい実施形態において、本発明は、先に定義されたように皮内投与用である、ＨＰＶ関連疾患の治療又は予防用薬剤の製造のための、ＨＰＶ−Ｅ２、−Ｅ６及び／又は−Ｅ７タンパク質に由来するペプチドの使用に関し、さらに、ＨＰＶ−Ｅ２、−Ｅ６及び／又は−Ｅ７タンパク質に由来するペプチドは、さらに皮下投与用である、ＨＰＶ関連疾患の治療又は予防用薬剤の製造のために使用される。
【００５３】
皮内投与用の薬剤は、すでに本明細書において定義されている。皮下投与に使用するペプチドは、皮内投与に使用するペプチドと同じであり、すでに本明細書において定義されている。当業者は、皮下投与に適した薬剤の処方の仕方を知っている。好ましくは、皮下投与に適した薬剤は、すでに本明細書において定義されたペプチドと、アジュバントを組合せて含む。好ましいアジュバントは、本明細書においてすでに述べている。他の好ましいアジュバントは、不完全フロインドアジュバント又はＩＦＡ、ＭｏｎｔａｎｉｄｅＩＳＡ−５１又はＭｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ ７２０（Ｓｅｐｐｉｃ、フランス）などの、水中油型乳剤である。さらに好ましい実施形態において、皮下投与に適した薬剤は、１種
又は複数種のペプチド、アジュバント（双方とも本明細書において先に定義された）並びに本明細書において先に定義されたすべての不活性な薬学的に許容可能な担体及び／又は賦形剤を含む。薬剤の処方及び薬学的に許容可能な賦形剤の使用は、当技術分野において公知であり、慣習であり、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ；Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ
Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２１版、２００５ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａに記載されている。本発明に使用する第２の薬剤は、皮下投与に適するように処方される。
【００５４】
この好ましい実施形態において、皮内投与に適した薬剤は、皮下投与に適した薬剤と同時投与できる。或いは、双方の薬剤を連続して、皮内投与、続けて皮下投与でき、又は逆もまた同様にできる（まず皮下投与、その後に皮内投与）。皮内投与に充てた先の好ましい実施形態のように、この好ましい実施形態において、本明細書において先に定義されたようなペプチドの皮内及び／又は皮下投与並びに／或いはアジュバントの皮内及び／又は皮下投与は必要に応じて反復でき、並びに／或いは異なるペプチド及び／又は異なるアジュバントを連続して皮内及び／又は皮下投与できる。本発明のペプチドを皮内及び／又は皮下投与し、一方、本明細書において定義されたようなアジュバントを連続して投与することもまた、本発明に包含される。アジュバントは皮内及び／又は皮下投与できる。しかし、任意の他の投与方法もまた、アジュバントに関して使用できる。
【００５５】
本発明者らは、本発明による薬剤の皮内投与及び皮下投与の組合せは有利であると期待する。表皮のＤＣは、真皮及び皮下組織のＤＣとは明らかに異なる。皮内（ｉｎｔｒａｃｕｔａｎｅｏｕｓ）（皮内（ｉｎｔｒａｄｅｒｍａｌ））の免疫化は、抗原のプロセッシング及びそれらの樹状ネットワークを介してケラチノサイトと密接にかかわる表皮ＤＣ（ランゲリン陽性ランゲルハンス細胞）の活性化を引き起こすであろう。これはさらに、ランゲルハンス細胞とケラノサイトとの相互作用で炎症経路を最適に活性化し、その後取り込まれた抗原及び活性化ランゲルハンス細胞の、皮膚−流入領域リンパ節への輸送が続く。
【００５６】
皮下投与は他のＤＣサブセットを活性化し、それにより抗原を取り込み、独立して皮膚−流入領域リンパ節に移動するようになる。事によると、皮内及び皮下の両方で投与できる薬剤の使用は、さまざまなＤＣのサブセットによって、これらの流入領域節においてＴ細胞の相乗刺激をもたらし得る。
【００５７】
この文献において、及びその特許請求の範囲において、「含むこと（ｔｏ ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という動詞及びその活用は非限定的意味で使用され、その言葉の後に続く項目が含まれることを意味するが、特に述べていない項目を排除するものではない。さらに、不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」による要素の言及は、文脈が唯一の要素を明らかに要求していない限り、複数の要素が存在する可能性を排除するものではない。したがって、不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」は、通常「少なくとも１つの」を意味する。
【００５８】
本発明を、以下の実施例によりさらに例示するが、これらは本発明の範囲を限定するものと解釈するべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】１９例の健康なドナー（ＨＤ）及び１７例の、子宮頸部新生物の病歴のある患者（Ｐ）のグループにおける、出現の数、日数及び陽性の皮膚反応を誘導した注射抗原の概要を示す図である。直径２ｍｍより大きい丘疹が、注射後２日以上たって出現した場合、皮膚反応は陽性であると考えた。表示のレイアウトは、８種のペプチドプールに使用し、使用したペプチドプールのタンパク質の最初と最後のアミノ酸を示す。太字で印刷したレイアウトはこの時間枠内の少なくとも１つの陽性反応を示し、塗りつぶされた四角は新たに発生した、表示のペプチドプールに対する陽性の皮膚反応を表わす。
【図２】健康なドナーのチャレンジ前の血液試料において、ＩＦＮγ ＥＬＩｓｐｏｔによりＨＰＶ１６特異的Ｔ細胞の検出が、認識されたペプチドプールに対する早期（＜１３日）陽性皮膚反応の出現と有意に相関することを示す図である（ｐ＝０．０００３、両側、フィッシャーの正確確率検定）。特異的応答は、実験ウェルの平均スポット数から、培地対照の平均スポット数＋２×ＳＤを引いて計算した。１００．０００ＰＢＭＣ当たりの特異的スポット数を示す。ペプチドプールの特異的Ｔ細胞頻度が１００．０００ＰＢＭＣにおいて≧５の場合、応答を陽性と考えた。
【図３Ａ】陽性の皮膚反応の出現と健康なドナーのチャレンジ後の血液試料中の循環ＨＰＶ１６特異的Ｔ細胞の同時検出（ＩＦＮγ ＥＬＩｓｐｏｔ）との関連を示す図である（ｐ＜０．０００１、両側、フィッシャーの正確確率検定）。総計８８例の皮膚検査から、３９例が陽性であった。これら３９例の反応のうち、２５例がＥＬＩｓｐｏｔにおいて陽性反応と関連があった（１００．０００ＰＢＭＣ中、Ｔ細胞頻度≧５）。皮膚反応を示さなかった４９例の皮膚検査部位のうち、１０例が陽性のＥＬＩｓｐｏｔと関連があった。
【図３Ｂ】１４日目に、ペプチドプール６（Ｅ６１０９〜１４０、Ｅ６１２７〜１５８）に対して陽性皮膚反応を示した健康なドナー（ＨＤ１０）の例を示す図である（左のパネル）陽性皮膚反応部位のパンチ生検の図である（右側のパネル）。
【図４Ａ】ＩＦＮγ ＥＬＩｓｐｏｔにより、陽性皮膚反応を表わす健康なドナーの、チャレンジ後血液試料中に検出されたＨＰＶ１６特異的Ｔ細胞応答を示す図である。１００．０００ＰＢＭＣ当たりの平均スポット数を表わす。メモリー応答混合物（ＭＲＭ）を、陽性対照として使用した。塗りつぶされたバーは、パンチ生検を採取し培養した陽性皮膚反応部位を示す。
【図４Ｂ】パンチ生検から取り出したＴリンパ球を、サイトカイン駆動増殖期の１４から２８日後、皮膚検査で注射したように、ペプチド（１０μｇ／ｍｌ）又はタンパク質（２０μｇ／ｍｌ）をパルスした単球による刺激に対する、それらの増殖能を検査した図である。フィトヘムアグルチニン（ＰＨＡ）は陽性対照として機能した。増殖は、［３Ｈ］チミジンの組込みにより測定し、増殖応答は刺激指数（ＳＩ）≧３として具体的に定義した。健康なドナー１７（ＨＤ１７）は、非特異的Ｔ細胞からなる陽性皮膚反応部位の例である。
【図４Ｃ】Ｂにおける増殖応答物の上清を、ＩＦＮγ、インターロイキン４（ＩＬ４）、ＩＬ５及び腫瘍壊死因子α、ＩＬ２、ＩＬ１０（図示せず）の存在に関してサイトメトリックビーズアレイにより分析した図である。カットオフ値は、さまざまなサイトカインの標準曲線に基づいた（１００ｐｇ／ｍｌ ＩＦＮγ及び残存サイトカインに関しては２０ｐｇ／ｍｌ）。抗原特異的なサイトカインの産生を、上記のカットオフレベルを超え、且つ＞２×培地対照濃度のサイトカイン濃度として定義した。健康なドナー１５（ＨＤ１５）は、ＩＬ５の高いバックグラウンドレベルを表わすが、抗原刺激後＞２×に上昇する。
【図５】健康なドナー１５（ＨＤ１５）のプール４（Ｅ６４１〜６５、Ｅ６５５〜８０、Ｅ６７１〜９５）の皮膚生検のＴ細胞培養物は、ＨＰＶ１６特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞の双方からなることを示す図である。培養物の特異性を、注射皮膚検査に対応するタンパク質（２０μｇ／ｍｌ）及びペプチド（１０μｇ／ｍｌ）に対して、細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）で検査した。注目すべきことに、４例の生検のうち３例において、ＣＤ８＋ＨＰＶ１６特異的Ｔ細胞が検出された。
【実施例】
【００６０】
材料及び方法
研究計画
上腕に臨床グレードのＨＰＶ１６ペプチドのプールを皮内注射することにより測定する、ＨＰＶ１６ Ｅ２、Ｅ６及びＥ７特異的Ｔ細胞応答を分析する、横断的パイロット研究を、子宮頸部のＨＰＶ関連障害を有する患者及び健康な個人において実施した。遅延型過敏反応は、メモリーＴ細胞応答を表わすので、分析時のＨＰＶ１６陽性の前提条件はなか
った。
【００６１】
対象
子宮頸癌（ｎ＝１２）又はＣＩＮ（ｎ＝５）の病歴のある１７例の女性（Ｐ）及び１９例の健康な個人（ＨＤ）のグループが、インフォームドコンセントを受けた後でこの研究に参加した。ＨＰＶ状態を含む患者の臨床的特徴を、表１に要約する。患者の年齢は２８〜７２歳（年齢の中央値、４６歳）の範囲であった。健康な個人のグループは、年齢の中央値が３１歳（範囲、２０〜５１歳）であり、８０％の女性及び２０％の男性で構成されていた。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、皮膚検査の投与の直前にすべての対象から得た。健康な個人では陽性の皮膚検査の出現が遅いので、１９例の健康なボランティアの１１例から第２の血液試料を採取した。研究計画は、Ｍｅｄｉｃａｌ Ｅｔｈｉｃａｌ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｌｅｉｄｅｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｍｅｄｉｃａｌ
Ｃｅｎｔｒｅの承認を受けた。
【００６２】
ＤＴＨ皮膚検査
遅延型過敏反応（ＤＴＨ）に基づく皮膚検査を、ＨＰＶ特異的細胞性免疫応答のインビボ測定のための、高感度且つ単純な方法として使用できる（Ｈｏｐｆｌ、２０００；Ｈｏｐｆｌ、１９９１）。皮膚検査用調製物は、ＨＰＶ１６ Ｅ６及びＥ７タンパク質の全体及びＨＰＶ１６ Ｅ２タンパク質の最も免疫原性の高い領域にわたる、臨床グレートの長鎖合成ペプチドの８種のプールで構成されていた（ｄｅ Ｊｏｎｇ、２００４）。これらの臨床グレードのペプチドは、ＬＵＭＣの部門間ＧＮＰ−Ｆａｃｉｌｉｔｙで作製された。皮膚検査の各プールは、２又は３種の合成ペプチドからなり、ペプチドでカバーされたタンパク質の領域の最初と最後のアミノ酸で示した。プール１：Ｅ２３１〜６０、Ｅ２４６〜７５、プール２：Ｅ２３０１〜３３０、Ｅ２３１６〜３４５、プール３：Ｅ６１〜３１、Ｅ６１９〜５０、プール４：Ｅ６４１〜６５、Ｅ６５５〜８０、Ｅ６７１〜９５、プール５：Ｅ６８５〜１０９、Ｅ６９１〜１２２、プール６：Ｅ６１０９〜１４０、Ｅ６１２７〜１５８、プール７：Ｅ７１〜３５、Ｅ７２２〜５６、プール８：Ｅ７４３〜７７、Ｅ７６４〜９８。ペプチドプールごとに、２０ｍＭの等張リン酸緩衝液中１６％のＤＭＳＯ中に０．２ｍｇ／ｍｌのペプチドの０．０５ｍｌ（１０μｇ／ペプチド）を皮内に注射した。ペプチドプール及び陰性対象（溶剤のみ）を、上腕の個別の皮膚検査部位に、別々に注射した。皮膚検査部位を、少なくとも３回、ペプチドの注射後７２時間及び７日（Ｈｏｐｆｌ）並びに第１の健康な対象の１例において非常に遅い皮膚反応が最初に報告された３週間後に点検した。直径２ｍｍより大きい丘疹が、注射後２日以上たって出現した場合、反応は陽性であると考えた。陽性の皮膚反応部位からパンチ生検（４ｍｍ）を得、小片に切断し、１０％のヒトＡＢ血清、１０％のＴＣＧＦ並びに５ｎｇ／ｍｌのＩＬ７及びＩＬ１５を含むＩＭＤＭ中で培養し、皮膚組織からのリンパ球の遊出を可能にした。培養の２から４週間後、増殖したＴ細胞を収穫し、それらのＨＰＶ特異的反応性に関して検査した。
【００６３】
インビトロ免疫アッセイのための抗原
皮膚検査に使用したペプチドと類似の一連のペプチドを、Ｔ細胞刺激アッセイ及びＩＦＮγ−ＥＬＩＳＰＯＴアッセイに使用した。４種のＨＰＶ１６ Ｅ２ペプチドは、１５残基が重複した３０−ｍｅｒペプチドからなり、ＨＰＶ１６ Ｅ６は３２−ｍｅｒからなり、ＨＰＶ１６ Ｅ７は３５−ｍｅｒからなり、双方とも１４残基が重複していた。ペプチドは、先に記載したように合成し、溶解した（ｖａｎ ｄｅｒ Ｂｕｒｇ、１９９９）。特に、ＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいて、ペプチドプール４及び５は、皮膚検査に使用したペプチドプールとわずかに異なり、プール４はペプチドＥ６３７〜６８、Ｅ６５５〜８６、Ｅ６７３〜１０４を含み、プール５はペプチドＥ６７３〜１０４、Ｅ６９１〜１２２を含んだ。
【００６４】
破傷風トキソイド（０．７５ Ｌｉｍｕｓ ｆｌｏｃｃｕｌｅｎｔｉｕｓ／ｍｌ； Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ、Ｂｉｌｔｈｏｖｅｎ、オランダ）、ヒト型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）超音波分解物（５μｇ／ｍｌ；Ｄｒ．Ｐ．Ｋｌａｔｓｅｒ、Ｒｏｙａｌ Ｔｒｏｐｉｃａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、アムステルダム、オランダのご厚意により提供された）及びカンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）（０．１５ｍｇ／ｍｌ、ＨＡＬ Ａｌｌｅｒｇｅｎｅｎ Ｌａｂ．、Ｈａａｒｌｅｍ、オランダ）の混合物からなるメモリー応答混合物（ＭＲＭ ５０ｘ）を陽性対象として使用した。組換えＨＰＶ１６ Ｅ２、Ｅ６及びＥ７タンパク質を、先に記載したように組換え大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）において作製した（ｖａｎ ｄｅｒ Ｂｕｒｇ、２００１）。
【００６５】
ＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴによる抗原特異的Ｔｈ細胞の分析
ＨＰＶ１６特異的Ｔｈ細胞の存在を、先に記載したように、ＥＬＩＳＰＯＴにより分析した（ｖａｎ ｄｅｒ Ｂｕｒｇ、２００１）。簡潔に言うと、新鮮なＰＢＭＣを、２×１０６細胞／ウェルの濃度で、２４ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）中の、１０％のヒトＡＢ血清を加えた、表示のＨＰＶ１６ Ｅ２、Ｅ６及びＥ７ペプチドプールを含む、又は含まない１ｍｌのＩＭＤＭ（Ｂｉｏ Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ、Ｖｅｒｖｉｅｒｓ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）に播種した。ペプチドは、５μｇ／ｍｌ／ペプチドの濃度で使用した。３７℃で４日間インキュベートした後で、ＰＢＭＣを収穫し、洗浄し、ＩＦＮγ捕捉抗体（Ｍａｂｔｅｃｈ ＡＢ、Ｎａｃｈａ、スウェーデン）でコーティングしたＭｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ ９６ウェルプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｅｔｔｅｎ−Ｌｅｕｒ、オランダ）中の１０％ＦＣＳを加えたｌ００μｌのＩＭＤＭに、１０５細胞／ウェルの濃度で４つの複製ウェルに播種した。さらに抗体をインキュベートし、ＥＬＩＳＰＯＴの発生を、製造業者（Ｍａｂｔｅｃｈ）の指示書に従って実施した。スポットを全自動コンピューター支援ビデオ画像分析系（Ｂｉｏ Ｓｙｓ）を用いて数えた。特異的スポットを、実験ウェルの平均スポット数から、培地対照の平均スポット数＋２×ＳＤを引いて計算した（ｖａｎ ｄｅｒ Ｂｕｒｇ、２００１）。
【００６６】
Ｔ細胞増殖アッセイ
皮膚生検のＴ細胞培養物を３日間の増殖アッセイにおける特異的ペプチド及びタンパク質の認識に関して検査した（ｖａｎ ｄｅｒ Ｂｕｒｇ、２００１）。簡潔に言うと、自己単球を、ＰＢＭＣから、３７℃においてＸ−ｖｉｖｏ１５培地（Ｃａｍｂｒｅｘ）中で、２時間、平底の９６ウェルプレートに接着させることによって単離した。この単球を、ＡＰＣとして使用し、１０μｇ／ｍｌのペプチド及び２０μｇ／ｍｌのタンパク質を一晩取り込ませた。皮膚検査浸潤リンパ球を、２〜５×１０４細胞／ウェルの濃度で、１０％のＡＢ血清を添加したＩＭＤＭに播種した。培地単独を陰性対照として採取し、フィトヘムアグルチニン（０．５μｇ／ｍｌ）は陽性対照として機能した。増殖は、［３Ｈ］チミジン（５μＣｉ／ｍｍｏｌ）の組み込みにより測定した。増殖応答は刺激指数（ＳＩ）≧３として具体的に定義した。増殖アッセイの上清を、抗原特異的サイトカイン産生の分析のために、インキュベーションの４８時間後に収穫した。
【００６７】
ＨＰＶ１６特異的増殖応答に関与するサイトカインの分析
６種のさまざまなＴｈ１及びＴｈ２サイトカイン：ＩＦＮγ、腫瘍壊死因子α、インターロイキン２（ＩＬ２）、ＩＬ４、ＩＬ５及びＩＬ１０の同時検出を、サイトメトリックビーズアレイ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して、製造業者の指示書に従って実施した。カットオフ値は、さまざまなサイトカインの標準曲線に基づいた（１００ｐｇ／ｍｌ ＩＦＮγ及び残存サイトカインに関しては２０ｐｇ／ｍｌ）。抗原特異的サイトカインの産生を、上記のカットオフレベルを超え、及び＞２×培地対照濃度のサイトカイン濃度として定義した（ｄｅ Ｊｏｎｇ、２００４）。
【００６８】
細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）
陽性皮膚反応部位に由来するＴ細胞培養物の特異性及び特徴を、先に報告したように（ｄｅ Ｊｏｎｇ、２００５）ＩＣＳにより検査した。簡潔に言うと、皮膚検査浸潤リンパ球を収穫し、洗浄し、ＩＭＤＭ＋１０％ＡＢ血清に懸濁し、２〜５×１０４細胞を、５０μｌのペプチド（１０μｇ／ｍｌ）又はタンパク質（２０μｇ／ｍｌ）で、Ｘ ｖｉｖｏ培地中で一晩パルスした自己単球に加えた。培地単独を陰性対照として採取し、フィトヘムアグルチニン（０．５μｇ／ｍｌ）は陽性対照として機能した。試料を、ＦＩＴＣ標識マウス−抗ヒトＩＦＮγ（０．５ｇ／ｍｌ、ＢＤ ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）、ＰＥ標識マウス−抗ヒトＩＬ５（０．２ｍｇ／ｍｌ、ＢＤ ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）、ＡＰＣ標識−抗ＣＤ４（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）及びＰｅｒＣＰ−標識−抗ＣＤ８（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で同時染色した。４℃でインキュベーション後、細胞を洗浄し、１％のパラホルムアルデヒドで固定し、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳｓｃａｎ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により分析した。
【００６９】
統計分析
フィッシャーの正確確率検定（両側）を使用して、ＰＢＭＣ中のＩＦＮγ産生ＨＰＶ特異的Ｔ細胞の検出、皮膚検査反応の存在又は皮膚生検中のＨＰＶ特異的Ｔ細胞の存在の関係、並びに患者と健康な対照との間の、これらのグループ内の皮膚反応の大きさ又は数の違いを分析した。統計分析は、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｉｎｓｔａｔ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（バージョン３．０）及びＧｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ４を使用して実施した。
【００７０】
結果
ＨＰＶ１６ Ｅ２、Ｅ６−及びＥ７のペプチドの皮内注射に対する皮膚反応
本発明者らは、健康な対象及びＨＰＶ誘導性疾患を有する患者の双方における、ＨＰＶ１６ Ｅ２、−Ｅ６及び−Ｅ７のペプチドの皮内注射後の皮膚反応を調査した。陽性皮膚反応は、直径２〜２０ｍｍの扁平な赤みがかった丘疹として現れ、注射後２〜２５日以内に起こった。陽性皮膚反応を、対照グループ中１５２例の皮膚検査の４６例、及び患者グループ中１３６例の皮膚検査部位のうち３０例において検出した。皮膚反応の大きさは、２つのグループ間で差がなかった。全体的に、皮膚検査の各ペプチドプールは、陽性皮膚反応を引き起こすことができた。Ｅ２３１〜７５（１９例の対象のうち１０例）、Ｅ６３７〜１０４（９／１６）及びＥ７４３〜９８（７／１９）に対する最も頻度の高い反応は、対照グループにおいて観察された。この反応パターンは、本発明者らが、ＰＢＭＣにおいて先に観察したパターン（ｄｅ Ｊｏｎｇ、２００２；Ｗｅｌｔｅｒｓ、２００３）及び患者グループにおいて観察したパターン（図１）と似ている。
【００７１】
皮膚反応が現れるまでの時間は、健康なボランティアのグループと患者との間で大幅に異なる。注射後２４から７２時間以内に、古典的ＤＴＨ反応が、わずか３例、２例の患者及び１例の健康な対照において観察された（図１）。患者グループにおける皮膚反応の大部分は、２から２０日以内に発症し、１週間後に最大に達する（図１）。特に、ＨＰＶ１６関連疾患の病歴のある患者９例のうち５例は、８日以内に陽性反応を示した。しかし、対照のグループにおいて、皮膚反応の大部分は１３〜２５日の間に検出された。
【００７２】
健康なドナーにおける皮膚反応は、末梢血においてＨＰＶ１６特異的Ｔ細胞の頻度がより高いことと関連がある。
皮膚検査の結果と循環ＨＰＶ１６特異的１型Ｔ細胞の存在とを比較するために、ＩＦＮγ ＥＬＩｓｐｏｔアッセイを、皮内ペプチドチャレンジが行われる前に収集されたＰＢＭＣに実施した。健康なボランティア１９例のうち５例において、本発明者らは、ＨＰＶ１６特異的免疫応答をＩＦＮγ−ＥＬｌｓｐｏｔにより検出できた。健康な個人のチャレンジ前の血液試料において、循環ＨＰＶ１６特異的Ｔ細胞／１００．０００ＰＢＭＣの検
出が、≧５であることは、同じペプチド配列に対する早期（≦１３日）の陽性皮膚反応と関連があった（ｐ＝０．０００３、両側、フィッシャー正確確率検定、図２）。後期陽性皮膚反応（１４から２５日）を誘導したペプチドに対する、健康なドナーのチャレンジ前の血液試料において、ＨＰＶ１６特異的循環Ｔ細胞は検出されなかった。このことは、循環抗原特異的細胞の頻度が、皮膚反応が現れる遅延時間を決定することを示唆している。
【００７３】
皮膚反応の出現が遅れた時間におけるＨＰＶ特異的Ｔ細胞の頻度を評価するために、１１例の健康なボランティアから追加の血液試料を採取した。８８例のうちこれら個体３９例において、皮膚検査が陽性であった。３９例の陽性皮膚反応の２５例において、及び４９例の陰性皮膚反応の１０例において、≧５／１００．０００ＰＢＭＣのＨＰＶ１６特異的Ｔ細胞が検出された。この時点において、チャレンジ後の血液試料中の循環ＨＰＶ特異的ＩＦＮγ産生Ｔ細胞の検出と、皮膚反応の存在の間に有意な相関が発見された（ｐ＜０．０００１、フィッシャー正確確率検定；図３Ａ）。このことは、健康なボランティアの血液中のＨＰＶ１６特異的Ｔ細胞の頻度が、ＨＰＶ１６ペプチドの皮内チャレンジの後で有意に高くなったことを示し、ペプチド抗原の皮内注射が、健康なボランティアの血液中のＨＰＶ１６特異的Ｔ細胞の数を増加させることを示唆している。
【００７４】
Ｔｈ１／Ｔｈ２−ＣＤ４＋及びＣＤ８＋ＨＰＶ１６特異的Ｔ細胞の双方からなる陽性皮膚反応部位の生検。
健康なボランティアの陽性皮膚反応のおよそ２５％は、血液中のＨＰＶ１６特異的ＩＦＮγ産生Ｔ細胞の検出と関係なく、別の、非ＩＦＮγ産生型のＴ細胞が、ＨＰＶ１６ペプチドの皮内注射後に皮膚に浸潤できることを示唆する。
【００７５】
陽性皮膚反応部位の細胞を特徴付けるために、パンチ生検を採取した（図３Ｂ）。全体で、８例の生検を、７例の健康な対照のさまざまな陽性皮膚反応部位から採取し、抗原刺激なしでＴ細胞がインビトロ成長できるサイトカインのカクテルと共に培養した。８症例の７例において、Ｔ細胞は組織を離脱し３〜４週間以内に増殖する。増殖したＴ細胞を、それらの特異性に関して、短期増殖アッセイにおいて検査した。図４は、皮膚検査期間にもこの部位に注射された（ＨＤ２、ＨＤ１０、ＨＤ１５）ペプチドのプールでパルスされた自己単球、並びにＨＰＶ１６ Ｅ６タンパク質でパルスされた単球で刺激されると特異的に増殖したＴ細胞培養の例を示している（図４ＡＢ）。このことは、これらのＴ細胞が、抗原が自然にプロセッシングされ、提示された後で、それらの同族ＨＬＡ−ペプチド複合体を認識できたことを示唆している。これらの増殖Ｔ細胞培養物の上清の分析により、ＨＰＶ１６特異的Ｔ細胞がＩＦＮγ、ＩＬ−４及びＩＬ−５を産生する、混合Ｔｈ１／Ｔｈ２サイトカインプロフィールが明らかになった（図４Ｃ）。
【００７６】
ＨＰＶ特異的Ｔ細胞が生検培養物中に検出された症例（８例のうち４例）それぞれにおいて、このことは、チャレンジ後の血液試料中の循環ＨＰＶ１６特異的ＩＦＮγ産生Ｔ細胞のＥＬＩｓｐｏｔによる検出と同時に起こった（図４Ａ及びＢを比較されたい）。他の４例の陽性皮膚反応生検の３例（ＨＤ２、ＨＤ１７、ＨＤ１８）において、Ｔ細胞は、ＨＰＶ１６ペプチドに対して応答せず（図４；ＨＤ１７）、１つの症例において、Ｔ細胞は組織から全く離脱しなかった（ＨＤ１３）。これらの４つの症例において、本発明者らは、チャレンジ後の血液試料中に循環ＨＰＶ１６特異的ＩＦＮγ産生Ｔ細胞を検出できなかった。
【００７７】
生検−Ｔ細胞の、ＣＤ４及びＣＤ８細胞表面マーカーによる共染色により、ＨＰＶ１６特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞のみならず、ＨＰＶ１６特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞もまた、ＨＰＶ１６ペプチドの皮内チャレンジにおいて皮膚部位に浸潤することが示された（図５）。全体として、ＨＰＶ１６特異的Ｔ細胞が浸潤した４例の生検のうち３例において、本発明者らは、ＨＰＶ１６特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を検出できた。
【００７８】
総合すれば、ＨＰＶ１６ペプチドの皮内チャレンジにおいて、皮膚に遊走する免疫細胞の集団は、ＨＰＶ１６特異的ＣＤ４＋Ｔｈ１−、Ｔｈ２−及びＣＤ８＋細胞障害性Ｔ細胞を含む。この浸潤は、血液中の循環ＨＰＶ１６特異的ＩＦＮγ産生Ｔ細胞の出現と並行している。
【００７９】
考察
皮膚検査は、細胞性免疫のインビボ測定のための単純なアッセイとしてよく使用される。本発明者らは、早期抗原のＥ２、Ｅ６及びＥ７に対するインビボＨＰＶ１６特異的細胞性免疫応答の測定のための皮膚検査アッセイの使用を、結果を、インビトロアッセイにおけるＴ細胞の反応性の平行測定の結果と比較することによって正当性を立証した。
【００８０】
皮膚検査の投与後２〜８日以内に現れた、ＨＰＶ関連新生物の患者における陽性皮膚反応の大部分は、ＨｏｐｆｌらによりＣＩＮ患者において観察されたことと同様である（Ｈｏｐｆｌ、２０００）。さらに健康なボランティアのグループにおいて、早期皮膚反応は、皮内抗原チャレンジ後４〜１２日の間に現れた。インビトロでＨＰＶ１６特異的１型Ｔ細胞応答を表わすことが公知（ｄｅ Ｊｏｎｇ、２００２；Ｗｅｌｔｅｒｓ、２００３）である、この後者のグループにおいて、早期皮膚反応の出現（１３日以内）は、少なくとも１／２０．０００ＰＢＭＣの頻度でＩＦＮγ産生ＨＰＶ１６特異的Ｔ細胞が検出されることと有意に関連がある（図２、ｐ＜０．００１）。ＩＦＮγ ＥＬＩｓｐｏｔアッセイにおける陽性反応に関する同じカットオフ基準が、Ｊｅｆｆｒｉｅｓらによって推奨されており（Ｊｅｆｆｒｉｅｓ、２００６）、Ｊｅｆｆｒｉｅｓは、数学的ツールを使用し、マントー反応との関連においてＥＬＩＳＰＯＴの適切なカットオフを定義した。循環メモリーＴ細胞の数が少ないことにより（図２）、古典的ＤＴＨ検査と比較して皮膚反応がいくらか遅く現れることの理由が説明できる。Ｔ細胞は、ブースト又は再活性化されることを必要とし、十分な細胞が産生され、局所炎症反応：陽性皮膚検査が引き起こされる前に分裂を始める。実際に、陽性皮膚反応が出現する時に、ＨＰＶ１６特異的Ｔｈ１応答の頻度が高くなることが、末梢血において検出できる（図３）。
【００８１】
健康な個人とは対照的に、患者集団の皮膚反応は、ＩＦＮγ ＥＬＩｓｐｏｔにより測定した循環ＨＰＶ１６特異的１型Ｔ細胞とは関連がなく、ＩＦＮγ以外の他のサイトカインを産生するＨＰＶ１６特異的Ｔ細胞が、患者の皮膚検査部位に浸潤していることを示唆した。歴史的に、Ｔｈ１細胞がＤＴＨ応答を誘導することは前提とされているが、現在ではいくつかの研究により、Ｔｈ２細胞も皮膚検査部位に浸潤することが示されている（Ｗａｎｇ、１９９９；Ｗｏｏｄｆｏｌｋ、２００１）。同様に、この研究は、健康なボランティアの陽性皮膚検査部位が、Ｔｈ１及びＴｈ２型のＨＰＶ１６特異的Ｔ細胞の双方を含むことを示している（図４及び５）。さらに、陽性皮膚反応は、腎細胞癌又はメラノーマの患者のワクチン接種の後の特異的免疫応答を分析するために使用した陽性皮膚検査部位の２つの綿密な研究（Ｂｌｅｕｍｅｒ、２００７）から明らかなように、非特異的Ｔ細胞の流入の結果でもあり得る。さらにこの研究は、健康な対照からの多くの陽性皮膚検査部位が、注射されたＨＰＶ１６抗原に対して応答しなかったＴ細胞によって浸潤されていたことを示した。今までのところ、特異的陽性皮膚反応の理由ははっきりしないままである。しかし、これらの結果及び本発明者らのこれまでの研究の見解に基づき、子宮頸癌患者の大部分が、機能的ＨＰＶ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞性免疫を欠いていることを示し（ｄｅ Ｊｏｎｇ、２００４）、本発明者らは、癌患者の陽性皮膚反応は、循環ＨＰＶ特異的非Ｔｈ１細胞又はＨＰＶ１６に対して非特異的である浸潤Ｔ細胞のどちらかの結果であると推測する。
【００８２】
予期せぬことに、本発明者らは健康な個人の皮膚反応の大部分が、抗原の皮内注射後２〜３週間で現れることを観察した。一方、これらの後期陽性皮膚反応は、チャレンジ前の
血液中の循環ＨＰＶ特異的ＣＤ４＋メモリーＴ細胞の検出と相関しなかった（図２）が、これらの皮膚検査部位の免疫学的構造は、古典的ＤＴＨ検査のものと同様であり（Ｐｌａｔｔ、１９８３；Ｐｏｕｌｔｅｒ、１９８２）、ＨＰＶ１６特異的ＣＤ４＋Ｔｈ１−及びＴｈ２−細胞並びにＨＰＶ１６特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を含む（図４及び５）。本発明者らは、これらの反応がＴ細胞提示の結果であり得るという仮説を立てる。このことは、２ステップのツベルクリン皮膚検査のプロトコルを受けた患者の２９％が、第２の検査期間においてのみ陽性であったことは注目されている。（Ａｋｃａｙ、２００３）。一般的に、ワクチン誘導性Ｔ細胞反応は、ワクチン接種後１０から１４日でピークに達し、３週間でなくなる。しかし、このようなプロトコルでは、より高い抗原用量が多いほど強いアジュバントを注射することになる懸念がある。したがって、皮内チャレンジにより誘導されるＴ細胞応答が、より緩慢に発生し、遅い時期にピークに達すると推定することは理にかなっている。健康なボランティアにおける皮内ペプチドチャレンジは、ＨＰＶ１６に特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞の双方を誘導するので、単回の低用量ワクチン接種として考えるべきである。
【００８３】
このパイロット研究の主要な目的は、１型免疫応答をインビボで検出するためのＨＰＶ１６特異的皮膚検査の使用の正当性を立証することであった。健康なボランティアにおいて、１３日以内の陽性皮膚反応は、実際に、インビトロでＩＦＮγ ＥＬＩｓｐｏｔにより検出された循環ＩＦＮγ産生メモリーＴ細胞の存在と相関している。重要な事には、本発明者らはさらに、皮膚検査により得られた結果とＥＬＩｓｐｏｔにより得られた結果との相違を観察した。多くの症例において、ＨＰＶ１６特異的循環ＩＦＮγ産生Ｔ細胞が、チャレンジ後の血液試料中に検出されたが、付随する皮膚反応はなく、逆もまた同様であり（図３Ａ）、このことは、擬陰性又は擬陽性の結果と考えることができる。ＨＰＶに対する１型免疫の検出の解釈に対するこの影響を完全に理解するために、本発明者らは、インドネシアにおいて、患者及び健康なボランティアの大きなグループで野外試験を始めた。
表１ 患者の特徴
【表１】
ａ 皮膚検査実施前の治療期間
ｂ ＦＩＧＯに従った子宮頸癌のステージ
ｃ ループ型電気メスによる切除法（Ｌｏｏｐ ｅｌｅｃｔｒｏｓｕｒｇｉｃａｌ ｅｘｃｉｓｉｏｎ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）
【００８４】
（参考文献）
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬及び免疫学の分野に関する。特に、本発明は皮内ＨＰＶペプチドワクチン接種に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＨＰＶ感染は、若く、性的に活発な男女の個体間で非常に流行している。大規模なプロスペクティブ研究により、３年間の追跡期間の間に、男性パートナーからＨＰＶに感染することが一般的であり、対象の４０〜６０％に及ぶことが示された（Ｋｏｕｔｓｋｙら、１９９７、Ｈｏら、１９９８、Ｍａｒｒａｚｚｏら、２０００）。したがってＨＰＶは、おそらく最も一般的な性感染症である。
【０００３】
ハイリスク型のパピローマウィルス（例えば、ＨＰＶ１６、１８、３１、３３及び４５）は、子宮頸癌の原因である（Ｂｏｓｃｈら、１９９５、Ｚｕｒ Ｈａｕｓｅｎ、１９９６）。基底上皮細胞が感染した後、ＨＰＶの前初期遺伝子であるＥ１、Ｅ２、Ｅ５、Ｅ６及びＥ７が発現する。Ｅ１及びＥ２遺伝子は、ウィルスの複製を制御する。さらにＥ２タンパク質は、Ｅ６及びＥ７癌タンパク質の発現を調節する。ハイリスク型ＨＰＶのＥ６タンパク質は、ｐ５３に特異的に結合し、ユビキチン経路を介したその迅速な分解を標的とする。Ｐ５３はアポトーシスの開始に関与し、このタンパク質の喪失によりアポトーシスが阻止される（Ｓｃｈｅｆｆｎｅｒら、１９９０）。ハイリスク型のＥ７タンパク質はｐＲＢと結合する。ｐＲＢは通常、細胞周期移行に必要なタンパク質であるＥ２Ｆを不活性化することにより細胞が細胞周期を移行することを妨げている（Ｄｙｓｏｎら、１９８９）。Ｅ７が発現すると、感染細胞は細胞周期から離脱して分化することができなくなる。
【０００４】
Ｅ６及びＥ７癌タンパク質の発現が延長及び上昇することは、ＨＰＶ誘導性異形成及び子宮頸癌への形質転換と非常に密接な関係がある。
【０００５】
ヒトのＨＰＶ関連疾患及びＨＰＶ誘導性癌に対する防御における免疫系の保護的役割は、免疫抑制された腎移植患者及びＨＩＶ感染患者が示す性器ＨＰＶ感染の発生率が正常な対照と比較して１７倍高いことにより示唆される（Ｈｏら、１９９４、Ｍａｔｏｒｒａｓら、１９９１、Ｈａｌｐｅｒｔら、１９８６）。免疫抑制個体のＨＰＶ感染を消散するための能力の減少は、感染早期における免疫系の保護的役割を間接的に示唆する。早期抗原Ｅ２、Ｅ６及びＥ７に対する免疫を介した、ＨＰＶに対する保護の証拠は、癌関連パピローマウィルスに関する主要な動物モデルである、ワタオウサギのパピローマウィルスモデルによりもたらされる。非構造タンパク質のＥ１及びＥ２をワクチン接種することにより、ウィルス誘導性パピローマの退縮が誘導されるが、ウィルス性腫瘍の成長は抑制される。
【０００６】
さらに、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ６及びＥ７の遺伝子の組合せをワクチン接種されたウサギは、ウィルスのチャレンジから完全に保護された（Ｈａｎら、１９９９、Ｓｅｌｖａｋｕｍａｒら、１９９５）。重要なことには、パピローマウィルス誘導性のイボが徐々に成長したウサギは、Ｅ６及びＥ７の長鎖重複ペプチドを含むワクチンを２回注射した後、それらの病変を消滅させるだけでなく、潜伏性ウィルス感染を除去することもできた（Ｖａｍｂｕｔａｓ、Ｖａｃｃｉｎｅ ２００５）。これらのデータは、Ｅ２、Ｅ６及びＥ７に対する免疫が、パピローマウィルス感染の免疫学的予防として、並びにＨＰＶ誘導性病変及び癌の治療に有効であり得ることを示す。
【０００７】
ＨＰＶ１６に対する免疫応答に関連するエピトープの特定に相当関心が高まっており、
これらをサブユニットとしてワクチンに組み込み、又はこれらのエピトープをインビボのワクチン誘導性免疫のモニタリングに使用する可能性が示される。大部分の上皮細胞は、ＭＨＣクラスＩを発現するが、クラスＩＩは発現しないので、今までのところ、殺腫瘍性のＨＰＶ特異的ＣＤ８＋細胞障害性Ｔリンパ球の誘導に注目が集まっている（Ｍｅｌｉｅｆら、２０００；Ｒｅｓｓｉｎｇら、１９９５；Ｒｅｓｓｉｎｇら、２０００；Ｒｅｓｓｉｎｇら、１９９６）。ＨＰＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の反応性は、子宮頸部上皮内新生物、グレードＩＩＩ（ＣＩＮ ＩＩＩ）の病変又は子宮頸癌と診断された患者の末梢血（Ｎｉｍａｋｏら、１９９７；Ｒｅｓｓｉｎｇら、１９９６）及び子宮頸癌の患者から単離された腫瘍浸潤Ｔ細胞集団（Ｅｖａｎｓら、１９９７）において認められた。腫瘍特異的ＣＤ４＋ヘルパーＴ（「Ｔｈ」）免疫もまた、これらの腫瘍の大部分がＭＨＣクラスＩＩを発現しないという事実にもかかわらず、固形腫瘍の効率的な根絶にとって極めて重要であると現在考えられている（Ｍｅｌｉｅｆら、２０００；Ｐａｒｄｏｌｌ及びＴｏｐａｌｉａｎ、１９９８；Ｔｏｅｓら、１９９９に総説がある）。最新の証拠により、ＣＤ４＋腫瘍特異的Ｔ細胞が、ＣＤ８＋腫瘍特異的ＣＴＬの最適な誘導のみならず、これらのＣＴＬによる局所エフェクター細胞機能の最適な活動のためにも必要であることが示されている（Ｏｓｓｅｎｄｏｒｐら、１９９８、Ｔｏｅｓら、１９９９）。ＭＨＣクラスＩ拘束性腫瘍特異的免疫の誘導に関して、プロフェッショナル抗原提示細胞により捕捉されている抗原の交差提示は、主要な役割を担っていると思われる。交差プライミングによる有効な腫瘍特異的ＣＴＬの適切な誘導のためには、腫瘍特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞のヘルプが必要とされる（Ｔｏｅｓら、１９９９、Ｓｃｈｏｅｎｂｅｒｇｅｒら、１９９８）。
【０００８】
ＨＰＶ特異的Ｔｈ免疫の保護的役割に関する強い表れは、性器イボの退縮におけるＣＤ４＋Ｔ細胞の優位により（Ｃｏｌｅｍａｎら、１９９４）、並びにＣＩＮ病変が自然に退縮した対象の大部分において、ＨＰＶ１６ Ｅ７に対する遅延型過敏性応答が検出されたことにより（Ｈｏｐｆｌら、２０００）示唆された。さらに健康なヒトの大部分において、免疫系は、悪性腫瘍の発生前にウィルスの除去に成功している（Ｋｏｕｔｓｋｙ、１９９７；Ｅｖａｎｄｅｒ、１９９５）。このことに従って、検査した健康な全女性の半分より多くが、強い増殖性の、ＨＰＶ１６ Ｅ２及びＥ６特異的Ｔｈ１／Ｔｈ２細胞メモリー応答を示す（ｄｅ Ｊｏｎｇ、２００２；Ｗｅｌｔｅｒｓ、２００３；ｄｅ Ｊｏｎｇ、２００４）。さらに、Ｅ２に対するＴｈ反応性は、ウィルスのクリアランスの時に生じることが発見された（Ｂｏｎｔｋｅｓ、１９９９）。健康な対象は、ＨＰＶ１６のＥ７特異的免疫もまた示す（Ｗｅｌｔｅｒｓ、２００３；ｖａｎ ｄｅｒ Ｂｕｒｇ、２００１）。対照的に、ＨＰＶ誘導性癌の発生は、免疫の機能不全と強く関係している。ＨＰＶ１６＋誘導性新生物を有する患者の末梢血における、ＨＰＶ１６のＥ２、Ｅ６及びＥ７に特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞性免疫の分析により、ハイグレードの外陰部新生物を有する患者の半分（ｖａｎ Ｐｏｅｌｇｅｅｓｔ、２００５）及びＣＩＮ ＩＩＩを有する患者の大部分（ｄｅ Ｊｏｎｇ、２００４）は、適切な免疫応答を開始しないことが明らかになった。検査した子宮頸癌患者のおよそ半数が、任意の検出可能なＴ細胞増殖応答を欠いていた。もう半数は、Ｔｈ１／Ｔｈ２のサイトカインの産生に関係しないがＩＬ−１０の産生に関係する、ＨＰＶ１６ Ｅ２及びＥ６に特異的な、弱いＴ細胞増殖応答を示した（ｄｅ Ｊｏｎｇ、２００４）。このことは、Ｅ６及びＥ７に特異的な増殖応答が存在し得るが（Ｌｕｘｔｏｎ、２００３）、子宮頸癌患者における末梢Ｔｈ１応答は低い（ｄｅ Ｇｒｕｉｊｌ、１９９６；ｄｅ Ｇｒｕｉｊｌ、１９９８）又は欠けている（Ｔｓｕｋｕｉ、１９９６）という先の知見を裏付ける。なぜなら、ＣＤ４＋Ｔ細胞応答は、ＣＤ８＋ＣＴＬ免疫の誘導及び維持に極めて重要であり（Ｍｅｌｉｅｆ、２００２）、これらのデータは、末梢ＨＰＶ１６特異的ＣＴＬがハイグレードな異形成又は癌の患者において検出されることは稀であるが（Ｒｅｓｓｉｎｇ、１９９６；Ｂｏｎｔｋｅｓ、２０００；Ｎｉｍａｋｏ、１９９７；Ｙｏｕｄｅ、２０００）、このようなＣＴＬが、ＨＰＶ１６＋新生物を有していない女性において一般的に検出され得る（Ｎａｋａｇａｗａ、１９９７；Ｎａｋａｇａｗａ、１９９９）理由の説得力のある説明を提示している。
【０００９】
特に、ＨＰＶに対して対象を免疫化する臨床的に関連のある手法としては、特異的ヘルパーＴ細胞及びＣＴＬの双方を誘導することが好ましい。本発明者らは、ＣＴＬの最小エピトープを用いた免疫化は、いくつかのモデルにおいて腫瘍に対する保護をもたらす（Ｋａｓｔら、１９９１）が、他のモデルにおいては、他の形で誘導された場合は保護的であるウィルス特異的ＣＴＬ及び腫瘍特異的ＣＴＬの耐性又は機能的欠失をもたらすことをすでに示した（Ｔｏｅｓら、１９９６ａｂ）。耐性又は機能的欠失の発生により、ワクチン接種の効果は有意に減少する。したがって、この効果に関係するエピトープは免疫化目的には適切ではなかった。ＭＨＣクラスＩ分子、交差プライミング並びに他の機序による提示のための、外来性抗原のプロセッシングは、周知の内因性経路の次の、ＭＨＣクラスＩによる提示のための第２のプロセッシングの経路と、現在では広く認識されている（Ｊｏｎｄａｌら、１９９６、Ｒｅｉｍａｎｎら、１９９７）。この経路を介した抗原プロセッシングの正常な結果は、ＣＤ４＋Ｔ細胞によるＡＰＣの活性化が起こる場合を除いて、ＣＴＬ耐性である（Ｋｕｒｔｓら、１９９７）。耐性又は機能的欠失のこの問題を解消するために、ＷＯ０２／０７０００６は、ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞双方の活性化をもたらす、ＭＨＣクラスＩ及びＩＩ双方の提示可能なエピトープを有する長鎖ＨＰＶペプチドのワクチンとしての使用を開示した。
【００１０】
高用量のペプチド及び／又は連続したワクチン接種が、最適な免疫原性効果を得るために通常使用されているので、ＷＯ０２／０７０００６において開発されたＨＰＶワクチンはさらに改善できる。さらに、ＭｏｎｔａｎｉｄｅＩＳＡ−５１などのアジュバントが、最適な免疫原性効果を得るために普通必要である。これらのアジュバントは、注射部位の長期にわたる局所的腫れ、赤くはれた手、熱、嘔吐、関節の痛み、インフルエンザに感染した時の症状に似た病気の全身症状などの望ましくない副作用を誘導する。これらの副作用は、一般的に不快であり、早期病変を有する患者の治療を妨げると思われる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
したがって、既存のワクチンの欠点を全く有さない改善されたＨＰＶワクチンが未だに必要であり、中でも、本発明に使用するＨＰＶワクチンは、高用量のペプチド及び／又は連続したワクチン接種及び／又はアジュバントを必要としない。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、皮内投与用である、ＨＰＶ関連疾患の治療又は予防用薬剤の製造のための、ＨＰＶ−Ｅ２、−Ｅ６及び／又は−Ｅ７タンパク質に由来するペプチドの使用に関する。
【００１３】
本発明に使用するペプチドの配列は、ＨＰＶ１６又は１８由来のＨＰＶ−Ｅ２、−Ｅ６及び／又は−Ｅ７タンパク質に由来するものである限り重要ではない。好ましくは、このペプチドは、これらのタンパク質の最も免疫原性の高い領域の１つにおいて選択される。より好ましくは、このペプチドは、ＨＰＶ−Ｅ２、−Ｅ６及び／又はＥ７特異的Ｔ細胞応答を誘導及び／又は強化でき、したがってこのペプチドは特異的Ｔ細胞エピトープを含む。
【００１４】
ＨＬＡクラスＩ及びクラスＩＩのエピトープの長さを超える長さの（例えば、本明細書に記載の長さを有する）ペプチドは、それらは、ＷＯ０２／０７０００６において説明されるように、プロフェッショナル抗原提示細胞（ＡＰＣ）、特にＤＣ中に存在するように、抗原取込みのための食細胞機構を要求するために十分長く、含まれているＨＬＡクラスＩ及びクラスＩＩのエピトープの細胞表面提示が起こる前にＤＣにおいてプロセッシングされるので、薬剤としての使用に特に有利である。したがって、（Ｔｏｅｓら、１９９６、ＰＮＡＳ９３：７８５５及びＴｏｅｓら、１９９６、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５６：３
９１１）に示されるような）Ｔ細胞耐性の不利な誘導が、本明細書に示された長さを有するペプチドの使用によって妨げられる（Ｚｗａｖｅｌｉｎｇら、２００２、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：３５０に示される）。したがって、好ましい実施形態において、本発明の使用が提供され、前記ペプチドはＡＰＣを活性化できる配列を含む。ＡＰＣを活性化できる配列とは、ＡＰＣ、好ましくはプロフェッショナルＡＰＣを少なくとも部分的に活性化できる配列を意味する。前記活性化により、好ましくは前記ＡＰＣの表面において、前記ペプチドの少なくとも１つのエピトープの提示がもたらされる。特に好ましい実施形態において、前記ペプチドは、前記抗原に対する少なくとも２つのＴ細胞エピトープを含む。前記抗原に対する少なくとも２つのＴ細胞エピトープの存在は、さらにより有効な、前記抗原特異的Ｔ細胞応答の誘導及び／又は強化を可能にする。
【００１５】
好ましくは、前記エピトープの少なくとも１つは、前記抗原に対するヘルパーＴ細胞エピトープ又は前記抗原に対する細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）エピトープを含む。ペプチド上に存在する少なくとも１つの又は他のエピトープを有することは好ましい。前記ペプチドがヘルパーＴ活性化配列を含む場合、有効な誘導及び／又は強化が達成される。ヘルパーＴ活性化配列とは、本明細書において、ヘルパーＴ細胞を少なくとも部分的に活性化できる配列を意味する。前記活性化は、好ましくは前記抗原特異的Ｔ細胞応答の誘導及び／又は強化の改善をもたらす。一実施形態において、前記ペプチドは、前記抗原に対する少なくとも１つのヘルパーＴ細胞エピトープ及び前記抗原に対する少なくとも１つの細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）エピトープを含む。
【００１６】
したがって、少なくとも１つのＨＬＡクラスＩＩ（ヘルパーＴ細胞）エピトープ及び／又は少なくとも１つのＨＬＡクラスＩ（細胞障害性Ｔ細胞）エピトープが、血清型１６、１８、３１、３３又は４５などのハイリスクなＨＰＶ血清型に由来するＨＰＶ Ｅ２又はＥ６及び／又はＥ７タンパク質のアミノ酸からの連続するアミノ酸配列内に存在するペプチドが好ましく使用される。より好ましくは、使用するペプチド中に存在する連続アミノ酸配列が、ＨＰＶ血清型１６、１８、３１又は３３に由来するＨＰＶ Ｅ２、Ｅ６又はＥ７タンパク質のアミノ酸、さらにより好ましくはＨＰＶ血清型１６又は１８、最も好ましくはＨＰＶ血清型ＨＰＶ１６に由来する。ＨＰＶ１６及びＨＰＶ１８のＥ２、Ｅ６及びＥ７のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１、２、３、４、５及び６で表わす。
【００１７】
好ましくは、連続するアミノ酸配列の長さは、４５アミノ酸未満であり、ＨＰＶ１６又はＨＰＶ１８のＥ２、Ｅ６及び／又はＥ７タンパク質のアミノ酸配列（例えば、配列番号１、２、３、４、５、６）から選択される、少なくとも１９アミノ酸を含み、このペプチドは、少なくとも１つのＨＬＡクラスＩＩエピトープ及び／又は少なくとも１つのＨＬＡクラスＩエピトープを含み、双方ともＨＰＶ Ｅ２、Ｅ６及び／又はＥ７タンパク質のアミノ酸配列に由来する。より好ましくは、ペプチド中の、少なくとも１つのＨＬＡクラスＩＩエピトープ及び／又は少なくとも１つのＨＬＡクラスＩエピトープが、ＨＰＶ Ｅ２、Ｅ６及び／又はＥ７タンパク質のアミノ酸配列に由来する、連続するアミノ配列内に存在する。
【００１８】
明確にすると、本発明に使用するペプチドは、好ましくは少なくとも１つのＨＬＡクラスＩエピトープ及び／又は少なくとも１つのＨＬＡクラスＩＩエピトープを含み、これらのエピトープそれぞれが提示可能であり、本明細書に記載のようにプロセッシングされた後で、細胞上に存在する、対応する特異的ＨＬＡ分子と結合するであろう。したがって、各ＨＬＡエピトープを、ＨＬＡ結合エピトープ及び／又はＨＬＡ提示可能エピトープとも名付けることができる。より好ましくは、使用するペプチドは、ＨＰＶ−Ｅ２、−Ｅ６及び／又はＥ７特異的Ｔ細胞応答を誘導及び／又は強化することができ、このペプチドは、前記ＨＰＶ−Ｅ２、−Ｅ６及び／又はＥ７タンパク質に対して特異的なＴ細胞エピトープを含む。さらにより好ましくは、このペプチドは、ＨＰＶ Ｅ２又はＥ６及び／又はＥ７
タンパク質由来の２２〜４５の連続するアミノ酸残基を含む。
【００１９】
ペプチド内に含まれる、ＨＰＶ Ｅ２、Ｅ６及び／又はＥ７タンパク質由来の連続するアミノ酸配列の長さは、好ましくは、１９〜４５、２２〜４５、２２〜４０、２２〜３５、２４〜４３、２６〜４１、２８〜３９、３０〜４０、３０〜３７、３０〜３５、３２〜３５、３３〜３５、３１〜３４の間のアミノ酸を含む。別の実施形態において、ペプチドは、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４若しくは４５、又は４５を超える、ＨＰＶ Ｅ２、Ｅ６及び／又はＥ７タンパク質の連続するアミノ酸残基を含む。別の好ましい実施形態において、本発明のペプチドは、本明細書において定義されたようなＨＰＶ Ｅ２、Ｅ６及び／又はＥ７タンパク質由来の、連続するアミノ酸配列のいずれかからなる。本発明に使用するペプチドは、容易に合成可能であり、プロフェッショナルＡＰＣにより取り込まれるために十分長く、プロテアソームによりプロセッシングされ、少なくとも１つのＨＬＡクラスＩ及び／又は１つのＨＬＡクラスＩＩエピトープを含むために十分な物理的能力及び長さを有する。したがって上で定義したように、好ましい実施形態において、ペプチドはＡＰＣを活性化できる配列を含む。
【００２０】
又は、先の好ましい実施形態と組み合わせて、ペプチドはヘルパーＴ活性化配列を含む。
【００２１】
さらにより好ましい実施形態において、ペプチドは、前記抗原に対する少なくとも２つのＴ細胞エピトープを含む。より好ましくは、このペプチド中に、前記エピトープの少なくとも１つは、前記抗原に対するヘルパーＴ細胞エピトープ及び／又は前記抗原に対する細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）エピトープを含む。
【００２２】
別の好ましい実施形態において、ペプチド中に存在する抗原は、ＨＰＶ Ｅ２、Ｅ６及び／又はＥ７タンパク質又はそれらの免疫原性部分、誘導体及び／若しくは類似体に由来する。タンパク質の免疫原性部分、誘導体及び／又は類似体は、前記タンパク質それ自体と同じ種類の免疫原性能力を含むが、必ずしも量的に同じである必要はない。このようなタンパク質の誘導体は、好ましい保存的アミノ酸置換によって得ることができる。
【００２３】
より好ましくは、前記ペプチドは、最も免疫原性の高い領域として本明細書において特定されたＥ２、Ｅ６及び／又はＥ７の領域を含む。さらに、この領域にマッピングされた、自然にプロセッシングされた多くのＴｈエピトープがすでに特定されている。健康な血液ドナーに由来する短期及び長期のＰＢＭＣ培養をそれぞれ含む方法は、適切なペプチドを特定するために使用できる。ＰＢＭＣの培養は、検査されるペプチドを用いて刺激され得る。平行して、ＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより検出される、インビボで誘導されるＥ２、Ｅ６及び／又はＥ７に特異的な免疫は、健康な対象並びにＨＰＶ１６＋病変を有すると診断された対象において分析できる。
【００２４】
好ましい実施形態において、本明細書で使用する薬剤は、ＨＰＶ−Ｅ２、Ｅ６及び／又はＥ７タンパク質に由来する、少なくとも２種の異なるペプチドを含む。より好ましくは、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも７種、少なくとも８種又はそれ以上のペプチドを薬剤中に混合物又はプールとして組み合わせて使用する。１つの単回ワクチンを使用して、１つのＨＰＶタンパク質Ｅ２、Ｅ６又はＥ７内に存在する、いくつかの免疫原性エピトープに対するワクチン接種及びその後の保護を得ることができるので、このことは有利である。
【００２５】
又は、先の好ましい実施形態を組み合わせて、この薬剤は、連続するアミノ酸配列が、ＨＰＶ Ｅ２、Ｅ６及びＥ７タンパク質の少なくとも２種、より好ましくはＨＰＶ Ｅ２
、Ｅ６及びＥ７タンパク質の３種すべてに由来するペプチドを含む。１つの単回ワクチンを使用して、いくつかのＨＰＶタンパク質Ｅ２、Ｅ６又はＥ７内に存在する、いくつかの免疫原性エピトープに対するワクチン接種及びその後の保護を得ることができるので、このこともまた有利である。
【００２６】
使用する薬剤が２種以上のペプチドを含む場合、いくつかのペプチドの組合せを、ペプチドのプール又は混合物と名付けることができる。
【００２７】
好ましい実施形態において、この薬剤は以下のペプチドの少なくとも１つを含み、各ペプチドは、ＨＰＶ１６のＥ２、Ｅ６又はＥ７に由来する、以下の配列を含む、又は以下の配列からなる、又は以下の配列と重複する：Ｅ２ ３１〜６０又は配列番号７、Ｅ２ ４６〜７５又は配列番号８、Ｅ２ ３０１〜３３０又は配列番号９、Ｅ２ ３１６〜３４５又は配列番号１０、Ｅ６ １〜３２又は配列番号１１、Ｅ６ １９〜５０又は配列番号１２、Ｅ６ ４１〜６５又は配列番号１３、Ｅ６ ５５〜８０又は配列番号１４、Ｅ６ ７１〜９５又は配列番号１５、Ｅ６ ８５〜１０９又は配列番号１６、Ｅ６ ９１〜１２２又は配列番号１７、Ｅ６ １０９〜１４０又は配列番号１８、Ｅ６ １２７〜１５８又は配列番号１９、Ｅ７ １〜３５又は配列番号２０、Ｅ７ ２２〜５６又は配列番号２１、Ｅ７ ４３〜７７又は配列番号２２、Ｅ７ ６４〜９８又は配列番号２３、Ｅ２ １〜３０、Ｅ２ １６〜４５、Ｅ２ ６１〜９０、Ｅ２ ５１〜７０、Ｅ２ ６１〜７６、Ｅ２
７６〜１０５、Ｅ２ ９１〜１２０、Ｅ２ １０６〜１３５、Ｅ２ １２１〜１５０、Ｅ２ １３６〜１６５、Ｅ２ １５１〜１８０、Ｅ２ １６６〜１９５、Ｅ２ １８１〜２１０、Ｅ２ １９６〜２２５、Ｅ２ ２１１〜２４０、Ｅ２ ２２６〜２５５、Ｅ２ ２４１〜２７０、Ｅ２ ２５６〜２８５、Ｅ２ ２７１〜３００、Ｅ２ ２８６〜３１５、Ｅ２ ３１６〜３３０、Ｅ２ ３１１〜３２５、Ｅ２ ３３１〜３６５、Ｅ２ ３４６〜３５５、Ｅ２ ３５１〜３６５、Ｅ６ １〜２２、Ｅ６ １１〜３２、Ｅ６ ２１〜４２、Ｅ６ ３１〜５２、Ｅ６ ４１〜６２、Ｅ６ ５１〜７２、Ｅ６ ６１〜８２、Ｅ６
７１〜９２、Ｅ６ ８１〜１０２、Ｅ６ ９１〜１１２、Ｅ６ １０１〜１２２、Ｅ６
１１１〜１３２、Ｅ６ １２１〜１４２、Ｅ６ １２７〜１４０、Ｅ６ １３１〜１５２、Ｅ６ １３７〜１５８、Ｅ７ １〜２２、Ｅ７ １１〜３２、Ｅ７ ２１〜４２、Ｅ７ ３０〜５０、Ｅ７ ３１〜５２、Ｅ７ ３５〜５０、Ｅ７ ４１〜６２、Ｅ７ ５０〜６２、Ｅ７ ５１〜７２、Ｅ７ ３５〜７７、Ｅ７ ６１〜８２、Ｅ７ ７１〜９２、Ｅ７ ７７〜９８、中でも、Ｅ２ ３１〜６０又は配列番号７、Ｅ２ ４６〜７５又は配列番号８、Ｅ２ ３０１〜３３０又は配列番号９、Ｅ２ ３１６〜３４５又は配列番号１０、Ｅ６ １〜３２又は配列番号１１、Ｅ６ １９〜５０又は配列番号１２、Ｅ６ ４１〜６５又は配列番号１３、Ｅ６ ５５〜８０又は配列番号１４、Ｅ６ ７１〜９５又は配列番号１５、Ｅ６ ８５〜１０９又は配列番号１６、Ｅ６ ９１〜１２２又は配列番号１７、Ｅ６ １０９〜１４０又は配列番号１８、Ｅ６ １２７〜１５８又は配列番号１９、Ｅ７ １〜３５又は配列番号２０、Ｅ７ ２２〜５６又は配列番号２１、Ｅ７ ４３〜７７又は配列番号２２、Ｅ７ ６４〜９８又は配列番号２３が最も好ましい。これらのペプチドのそれぞれの配列は、配列番号１、２又は３で表わされるＨＰＶ１６の対応するＥ２、Ｅ６又はＥ７の完全長配列から推測できる。
【００２８】
本発明の文脈において、重複は、使用するペプチドの配列が、所与の配列と部分的又は全体的に重複することを意味する。好ましくは、重複は、部分的重複を意味する。好ましくは、部分的は、重複がペプチド配列の５’末端及び／又は３’末端における１つ又は複数のアミノ酸の重複、より好ましくは、５’末端及び／又は３’末端における２つ以上のアミノ酸の重複或いはそれ以上であることを意味する。重複が、ペプチド配列の５’末端における１つ又は複数のアミノ酸の重複、及び／又はペプチド配列の３’末端における２つ以上のアミノ酸の重複或いは逆もまた同様に好ましい。当業者は、得られたペプチドが本明細書において先に定義されたような望ましい免疫原性活性を示す限り、あらゆる種類
の重複が本発明に包含されることを理解するであろう。
【００２９】
別の好ましい実施形態において、本薬剤に使用するペプチドは、保存的アミノ酸置換により上に示された配列に由来する。
【００３０】
より好ましくは、この薬剤は、上に具体的に述べたペプチドの少なくとも２種、又は少なくとも３種、又は少なくとも４種、又は少なくとも５種、又は少なくとも６種又はそれ以上を含む。
【００３１】
最も好ましい実施形態において、この薬剤は、以下のペプチドのプールの少なくとも１つを含み、各ペプチドは、以下の配列を含む、又は以下の配列からなる、又は以下の配列と重複する：
プール１：Ｅ２ ３１〜６０及び／若しくはＥ２ ４６〜７５、並びに／又は
プール２：Ｅ２ ３０１〜３３０及び／若しくはＥ２ ３１６〜３４５、並びに／又は
プール３：Ｅ２ ３１〜６０及び／若しくはＥ２ ４６〜７５、及び／若しくはＥ２ ３０１〜３３０及び／若しくはＥ２ ３１６〜３４５、並びに／又は
プール４：Ｅ６ １〜３２及び／若しくはＥ６ １９〜５０、並びに／又は
プール５：Ｅ６ ４１〜６５、Ｅ６ ５５〜８０及び／若しくはＥ６ ７１〜９５、並びに／又は
プール６：Ｅ６ ８５〜１０９、及び／若しくはＥ６ ９１〜１２２、並びに／又は
プール７：Ｅ６ １０９〜１４０及び／若しくはＥ６ １２７〜１５８、並びに／又は
プール８：Ｅ６ １〜３２及び／若しくはＥ６ １９〜５０、及び／若しくはＥ６ ４１〜６５、及び／若しくはＥ６ ５５〜８０及び／若しくはＥ６ ７１〜９５、及び／若しくはＥ６ ８５〜１０９、及び／若しくはＥ６ ９１〜１２２及び／若しくはＥ６ １０９〜１４０及び／若しくはＥ６ １２７〜１５８、並びに／又は
プール９：Ｅ７ １〜３５及び／若しくはＥ７ ２２〜５６、並びに／又は
プール１０：Ｅ７ ４３〜７７、及び／若しくはＥ７ ６４〜９８、並びに／又は
プール１１：Ｅ７ １〜３５及び／若しくはＥ７ ２２〜５６、及び／若しくはＥ７ ４３〜７７、及び／若しくはＥ７ ６４〜９８、並びに／又は
プール１２：上で定義したようなプール３及びプール８、並びに／又は
プール１３：上で定義したようなプール８及びプール１１、並びに／又は
プール１４：上で定義したようなプール３及びプール１１、並びに／又は
プール１５：上で定義したようなプール３、プール８及びプール１１。
【００３２】
好ましくは、薬剤中に存在するペプチドに含まれるクラスＩＩ ＣＤ４＋Ｔｈ細胞エピトープは、ＨＰＶ誘導性疾患を有する患者及び／又は健康な対象において、ＣＤ４＋Ｔｈ細胞を活性化できる。活性化は、エクスビボ又はインビボで、より好ましくは、ＨＰＶ感染／形質転換細胞が所与の抗原を発現する、ＨＰＶ誘導性疾患を有する患者において好ましく評価される。最も好ましくは、ＨＬＡクラスＩＩエピトープが、ＣＤ４＋Ｔｈメモリー応答を活性化できる、すなわち、ＣＤ４５ＲＯ−陽性ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞を活性化できる。このことは、ＤＣのＣＤ４０誘発を介した「殺しのライセンス（ｌｉｃｅｎｃｅ
ｔｏ ｋｉｌｌ）」シグナルにより（Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ、１９９８、Ｎａｔｕｒｅ ３９３：４１３）、より強固なＣＤ８＋エフェクター及びメモリーＴ細胞応答をもたらすと思われる。
【００３３】
当技術分野では、ペプチドを発生させる多くの方法が知られている。本発明は、発生させたペプチドが最小のＴ細胞エピトープを含む限り、発生させたペプチドのいずれの形態にも限定されない。例としては、薬剤中に存在するペプチドは、タンパク質Ｅ２、Ｅ６又はＥ７から得ることができ、インビトロで又は細胞、例えばコード化核酸を介して合成できる。本薬剤に使用するペプチドは、単一ペプチドとして、又は融合タンパク質に組み込
まれて存在することができる。一実施形態において、前記ペプチドは、細胞の内側の前記ペプチドを、前記細胞の表面上のＭＨＣ分子に輸送され、及び／又は組み込まれ得るようにプロセッシングできる、プロセッシング部位に隣接している。好ましい実施形態において、本薬剤に使用するペプチドは、プロセッシング後にＭＨＣクラスＩＩ分子と複合体を形成できる。ＭＨＣクラスＩＩ拘束性Ｔ細胞性免疫は、現在、例えば、腫瘍細胞の根絶において、前記腫瘍細胞が多くの場合ＭＨＣクラスＩＩ分子を発現しないにもかかわらず重要であると考えられている。本薬剤に使用するペプチドは、ＭＨＣクラスＩ及びＭＨＣクラスＩＩ双方に依存性のＴ細胞の誘発、誘導及び／又は刺激に特に適している。
【００３４】
本薬剤に使用するペプチドは、１つ又は複数のアミノ酸の欠失又は置換により、Ｎ末端及び／又はＣ末端において追加のアミノ酸又は官能基で伸長することにより、さらに修飾されていてもよく、このことは、生体利用率、標的化及びプロフェッショナルＡＰＣによる取り込みを改善でき、或いはアジュバント又は（共）刺激機能を提供する免疫調節物質を含む、又は放出する。Ｎ末端及び／又はＣ末端における任意選択の追加のアミノ酸は、好ましくはＨＰＶ Ｅ２、Ｅ６及び／又はＥ７のアミノ酸配列の対応する位置には存在せず、より好ましくは、それらはＥ２、Ｅ６又はＥ７アミノ酸配列（配列番号１、２、３、４、５、６）には由来しない。
【００３５】
さらに好ましい実施形態において、本薬剤はアジュバントを含まない。より好ましくは、本薬剤は、以下の望ましくない副作用：注射部位の局所的腫れ、赤くはれた手、熱、嘔吐、関節の痛み、インフルエンザに感染した時の症状に似た病気の全身症状などの少なくとも１つを伴うことが現在公知であるアジュバントを含まない。さらにより好ましくは、アジュバントは、不完全フロインドアジュバント又はＩＦＡ、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ−５１又はＭｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ７２０（Ｓｅｐｐｉｃ、フランス）などの、水中油型乳剤ではない。さらにより好ましくは、アジュバントは、デポー機能を有さない、及び／又は生物分解可能である。デポー機能は、好ましくは、ペプチドが注射部位に長期間含まれ、長期間にわたって漏れ出るだけであることを意味する。好ましくは、長期間は少なくとも１カ月であり、より好ましくは、少なくとも２カ月又は３カ月である。さらにより好ましくは、アジュバントはＭｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ−５１（Ｓｅｐｐｉｃ、フランス）ではない。
【００３６】
別のさらに好ましい実施形態において、本薬剤は、本明細書において先に定義された１つ又は複数のペプチド及び不活性な薬学的に許容可能な担体及び／又は賦形剤からなる。不活性な薬学的に許容可能な担体及び／又は賦形剤は、好ましくは免疫応答及び／又は炎症応答或いはアジュバントに関して上に記載した任意の望ましくない副作用を引き起こさないという意味で不活性である。薬剤の処方及び薬学的に許容可能な賦形剤の使用は、当技術分野において公知であり、慣習であり、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ；Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２１版、２００５ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａに記載されている。本発明に使用する薬剤は、皮内投与又は皮内適用に適するように処方する。皮内は、当業者には公知である。本発明の文脈において、皮内（ｉｎｔｒａｄｅｒｍａｌ）は、皮内（ｉｎｔｒａｃｕｔａｎｅｏｕｓ）と同義語であり、皮下とは異なる。物質の最も表面的な適用は、経皮（皮膚上）であり、その次が皮内適用（皮膚中又は皮膚内）、その次が皮下適用（皮膚のすぐ下の組織中）、その次が筋肉内適用（身体の筋肉内）である。皮内適用は、普通注射により実施される。物質の皮内注射は、普通、それに対する反応、アレルギー及び／又は細胞性免疫の可能性を検査するために実施する。皮下適用もまた、普通注射により実施され、針は皮膚の下の組織に差し込まれる。
【００３７】
別のさらに好ましい実施形態において、本発明に使用する薬剤は、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ
ＩＳＡ−５１などの任意のアジュバントを含まないので、この薬剤の処方がより単純で
あり、油−水に基づく乳剤が、好ましくは使用する薬剤中に存在しないことを意味する。したがって、本発明に使用する薬剤は、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ−５１などのアジュバントを含まない、及び／又は水中油に基づく乳剤を含まない。したがって好ましい実施形態において、本発明に使用する薬剤は、生理的イオン強度及び／又はオスモル濃度の緩衝水溶液、例えば、本明細書において先に定義されたような、１つ又は複数のペプチドを含む或いは１つ又は複数のペプチドからなるＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）である。当業者は、このような溶液の調製の仕方を知っている。
【００３８】
本発明に使用する薬剤は、本明細書において先に定義されたようなペプチドを、低用量で皮内投与しても免疫原性効果を達成できるという、別の利点を有する。使用する各ペプチドの量は、好ましくは１〜１０００μｇの間の範囲であり、より好ましくは５〜５００μｇの間の範囲であり、さらにより好ましくは１０〜１００μｇの間の範囲である。
【００３９】
当業者は、予想するペプチド濃度が免疫原性であるかどうかの検査方法を知っているはずである。好ましくは、ＰＢＭＣを、ＷＯ０２／０７０００６に例示されているように、さまざまな濃度の検査ペプチドを用いてインビトロで刺激する。実施例において、ペプチド刺激性ＰＢＭＣが、非刺激性ＰＢＭＣより、少なくとも２倍強い増殖及び／又は少なくとも２倍多いサイトカインの産生及び／又はマーカー（例えば、ＣＤ２５、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ６９、ＣＤ１５４、ＣＤ１３７）の活性化の上方制御を開始した場合、免疫原性効果が達成される。或いは、実施例のように皮膚検査を実施する。簡潔に言うと、選択されたペプチドを、好ましくは２０ｍＭの等張リン酸緩衝液中に約１０〜２０％、より好ましくは約１６％のＤＭＳＯ（ｖ／ｖ）中に約０．１から約０．４ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは０．２ｍｇ／ｍｌのペプチドの０．０５ｍｌ（１０μｇ／ペプチド）を皮内注射する。ペプチドは、上腕の個々の皮膚の検査部位に個別に注射する。
【００４０】
別の好ましい実施形態において、本薬剤は、本明細書において先に定義されたようなペプチド及び少なくとも１つのアジュバントを含み、前記アジュバントは水中油に基づく乳剤に処方されておらず及び／又は本明細書において先に定義されたような水中油型乳剤ではない。この型の薬剤は、単回投与として投与できる。或いは、本明細書において先に定義されたようなペプチド及び／又はアジュバントの投与は、必要に応じて反復でき、並びに／或いは異なるペプチド及び／又は異なるアジュバントを連続して投与できる。本発明のペプチドを皮内投与し、本明細書において定義されたアジュバントを連続して投与することもまた、本発明に包含される。アジュバントは皮内投与できる。しかし、任意の他の投与方法もまた、アジュバントに関して使用できる。
【００４１】
特に好ましいアジュバントは、トール様受容体を介して、及び／又はＲＩＧ−１（レチノイン酸誘導性遺伝子Ｉ）タンパク質を介して、及び／又はエンドセリン受容体を介して作用することが公知のアジュバントである。先天性免疫系を活性化できるアジュバントは、ＴＬＲ１〜１０を含むトール様受容体（ＴＬＲ）を介して、特によく活性化できる。ＴＬＲ受容体を活性化できる化合物並びにそれらの修飾体及び誘導体は、当技術分野において十分立証されている。ＴＬＲ１は、細菌性リポタンパク質及びそれらのアセチル化形態により活性化でき、さらにＴＬＲ２は、グラム陽性細菌の糖脂質、ＬＰＳ、ＬＰＡ、ＬＴＡ、繊毛、外膜タンパク質、細菌起源由来又は宿主由来の熱ショックタンパク質及びマイコバクテリウム・リポアラビノマンナン（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｌ ｌｉｐｏａｒａｂｉｎｏｍａｎｎａｎｓ）により活性化できる。ＴＬＲ３は、ｄｓＲＮＡ、特にウィルス起源のｄｓＲＮＡにより、又は化合物ポリ（Ｉ：Ｃ）により活性化できる。ＴＬＲ４は、グラム陰性ＬＰＳ、ＬＴＡ、宿主由来又は細菌起源由来の熱ショックタンパク質、ウィルスコートタンパク質又はエンベロープタンパク質、タクソール又はその誘導体、オリゴ糖を含むヒアルロン酸及びフィブロネクチンにより活性化できる。ＴＬＲ５は、細菌の鞭毛又はフラジェリンにより活性化できる。ＴＬＲ６は、マイコバクテリアのリポタンパク質
及びＢ群連鎖球菌の易熱性可溶性因子（ＧＢＳ−Ｆ）又はブドウ球菌のモジュリンにより活性化できる。ＴＬＲ７は、イミダゾキノリンにより活性化できる。ＴＬＲ９は、非メチル化ＣｐＧ ＤＮＡ又はクロマチン−ＩｇＧ複合体により活性化できる。特に、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７及びＴＬＲ９は、ウィルス感染に対する先天的免疫応答を仲介する上で、重要な役割を果たし、これらの受容体を活性化できる化合物は、本発明での使用に特に好ましい。特に好ましいアジュバントは、限定するものではないが、ｄｓＲＮＡ、ポリ（Ｉ：Ｃ）、ＴＬＲ３及びＴＬＲ９受容体を誘発する非メチル化ＣｐＧ ＤＮＡ、ＩＣ３１、ＴＬＲ９アゴニスト、ＩＭＳＡＶＡＣ、ＴＬＲ４アゴニストを含む合成化合物を含む。ＲＩＧ−１は、ＴＬＲ３のようなｄｓ−ＲＮＡによって活性化されることが公知である（Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（２００５）、１：１９〜２８）。別の好ましい実施形態において、アジュバントは、本明細書において先に定義されたようなペプチドに物理的に連結している。アジュバント及び共刺激性の化合物又は官能基の、ペプチドを含むＨＬＡクラスＩ及びＨＬＡクラスＩＩのエピトープへの物理的連結は、抗原を取り込み、代謝し、表示する抗原提示細胞、特に樹状細胞の同時刺激により免疫応答の強化を提供する。別の好ましい免疫調節化合物は、Ｔ細胞の接着阻害剤、より好ましくはＢＱ−７８８（Ｂｕｃｋａｎｏｖｉｃｈ
ＲＪら、Ｉｓｈｉｋａｗａ Ｋ、ＰＮＡＳ（１９９４）９１：４８９２）などのエンドセリン受容体の阻害剤である。ＢＱ−７８８は、Ｎ−ｃｉｓ−２，６−ジメチルピペリジノカルボニル−Ｌ−γ−メチルロイシル−Ｄ−１−メトキシカルボニルトリプトファニル−Ｄ−ノルロイシンである。しかし、ＢＱ−７８８の任意の誘導体又はＢＱ−７８８化合物の修飾体もまた、本発明の範囲に包含される。
【００４２】
さらに、本発明に使用する薬剤中に存在するペプチドと組み合わせて、ＷＯ９９／６１０６５及びＷＯ０３／０８４９９９に発表されたようなＡＰＣ（共）刺激性分子の使用が好ましい。特に、４−１−ＢＢ及び／又はＣＤ４０のリガンド、アゴニスト抗体、ＯＸ４０リガンド又はそれらの機能的断片及び誘導体並びに同様のアゴニスト活性を有する合成化合物の使用は、対象の最適な免疫応答の開始をさらに刺激するために、個別に又は薬剤中に存在するペプチドと組み合わせて治療されるべき対象に好ましく投与される。
【００４３】
好ましい実施形態において、アジュバントは、モノホスホリル脂質Ａ及び／又はＣｐＧ核酸などのＴＬＲ（３、４、７、８、９）リガンド及び／又はＣＤ４０リガンドなどのＡＰＣ共刺激性分子、アゴニスト抗体又はそれらの機能的断片及び誘導体及び／又はＧＭ−ＣＳＦを含む。
【００４４】
別の好ましい実施形態において、プロフェッショナル抗原提示細胞又は樹状細胞によるペプチドの提示を促進するために、ペプチドを含む薬剤は、本明細書において先に述べたようなＴＬＲリガンドとしてＤＣ活性化剤をさらに含む。
【００４５】
好ましい実施形態において、ワクチンである本薬剤をヒト又は動物に投与する。より好ましい実施形態において、このヒト又は動物は、ＨＰＶ（持続性）関連疾患を患っている、又は患う危険性がある。前記ＨＰＶ関連疾患は、ＨＰＶ感染、ＨＰＶ関連悪性腫瘍、子宮頸部上皮内新生物（ＣＩＮ）、外陰上皮内新生物（ＶＩＮ）、肛門上皮内新生物（ＡＩＮ）、膣上皮内新生物（ＶＡＩＮ）、陰茎上皮内新生物（ＰＩＮ）、子宮頸癌、頭部及び頸部の癌、特に口腔咽頭癌及びへんとう癌、陰茎癌、肛門癌、膣癌及び外陰癌から選択される。
【００４６】
好ましくは、前記ＨＰＶ関連疾患は、前記免疫応答の誘導及び／又は強化によって、少なくとも部分的に治療可能又は予防可能である。
【００４７】
したがって、本発明の方法は、前記抗原に対する免疫及び／又は前記免疫の強化を、対象に提供するために非常に適している。本発明の方法は、他の免疫化戦略を使用する目的
のいずれに対しても適している。かつての免疫化は、ワクチン接種目的、すなわち、疾患の予防のために使用される。しかし、本発明の方法は、疾患予防だけに適しているわけではない。この方法は、既存の疾患の治療にも使用でき、当然のことながらこの疾患は、抗原特異的Ｔ細胞性免疫の誘導及び／又は強化によって治療可能な範囲に限定される。この特徴を、例えば、ＨＰＶ感染などのウィルス感染に伴う疾患、例えばいくつかの癌の治療に使用できる。好ましい実施形態において、前記ヒト又は動物は、前記免疫応答の誘導及び／又は強化によって少なくとも部分的に治療可能又は予防可能である、ＨＰＶ感染などの疾患を患っている、又は患う危険性がある。好ましくは、前記疾患は、ＨＰＶウィルス性疾患及び／又は癌を含む。
【００４８】
ペプチドの皮内投与は、ワクチンの注射が、疾患部位又は可能な限り疾患部位の近くに実現でき、疾患流入領域リンパ節の局所活性化をもたらし、免疫系のより強い局所活性化をもたらすので非常に注目すべきものである。特に、ＶＩＮ、ＶＡＩＮ、ＡＩＮ、ＰＩＮ、陰茎癌、外陰癌、肛門癌、頭部及び頸部の癌にとって注目すべきものである。
【００４９】
好ましい実施形態において、皮内投与は、病変部位又は疾患部位に直接実施する。本明細書において病変部位においてとは、病変部位から５、２、１、０．５、０．２又は０．１ｃｍ未満内であると理解される。
【００５０】
本明細書において定義されたような薬剤の皮内投与において、Ｔｈ２応答だけでなくＴｈ１応答もまた誘発される。遺伝子銃を介した皮膚の抗原提示は、選択的Ｔｈ２免疫応答をもたらすことがすでに発見されているので、このことは驚くべきことである（Ａｌｖａｒｅｚ Ｄら、２００５）。さらに、観察された免疫応答は、Ａｌｖａｒｅｚ Ｄらに基づいて期待できるように皮膚に限定されない。本発明者らは、ＩＦＮγを分泌する特異的Ｔ細胞が、チャレンジ後の末梢血において検出されたので、二次リンパ系を介して循環することを実証する。
【００５１】
本発明の薬剤の別の重要な利点は、比較的低用量のペプチドを、１回のシングルショットで、単純な処方で、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ−５１などの望ましくない副作用を起こすことが公知の任意のアジュバントを含まずに使用できることである。任意の理論に縛られることを望むものではないが、本発明者らは、本発明に使用するＨＰＶ皮内ペプチド（単数又は複数）が、特異的及び直接的に上皮に存在する表皮ランゲルハンス細胞（ＬＣ）を標的とすると考えている。ランゲルハンス細胞は、一次免疫応答を開始する優れた能力を示すＤＣの特異的サブタイプである（Ｒｏｍａｎｉ Ｎら）。これらのＬＣは、本発明に使用する薬剤に用いられる天然のアジュバントとしてみなし得る。
【００５２】
別の好ましい実施形態において、本発明は、先に定義されたように皮内投与用である、ＨＰＶ関連疾患の治療又は予防用薬剤の製造のための、ＨＰＶ−Ｅ２、−Ｅ６及び／又は−Ｅ７タンパク質に由来するペプチドの使用に関し、さらに、ＨＰＶ−Ｅ２、−Ｅ６及び／又は−Ｅ７タンパク質に由来するペプチドは、さらに皮下投与用である、ＨＰＶ関連疾患の治療又は予防用薬剤の製造のために使用される。
【００５３】
皮内投与用の薬剤は、すでに本明細書において定義されている。皮下投与に使用するペプチドは、皮内投与に使用するペプチドと同じであり、すでに本明細書において定義されている。当業者は、皮下投与に適した薬剤の処方の仕方を知っている。好ましくは、皮下投与に適した薬剤は、すでに本明細書において定義されたペプチドと、アジュバントを組合せて含む。好ましいアジュバントは、本明細書においてすでに述べている。他の好ましいアジュバントは、不完全フロインドアジュバント又はＩＦＡ、ＭｏｎｔａｎｉｄｅＩＳＡ−５１又はＭｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ ７２０（Ｓｅｐｐｉｃ、フランス）などの、水中油型乳剤である。さらに好ましい実施形態において、皮下投与に適した薬剤は、１種
又は複数種のペプチド、アジュバント（双方とも本明細書において先に定義された）並びに本明細書において先に定義されたすべての不活性な薬学的に許容可能な担体及び／又は賦形剤を含む。薬剤の処方及び薬学的に許容可能な賦形剤の使用は、当技術分野において公知であり、慣習であり、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ；Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ
Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２１版、２００５ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａに記載されている。本発明に使用する第２の薬剤は、皮下投与に適するように処方される。
【００５４】
この好ましい実施形態において、皮内投与に適した薬剤は、皮下投与に適した薬剤と同時投与できる。或いは、双方の薬剤を連続して、皮内投与、続けて皮下投与でき、又は逆もまた同様にできる（まず皮下投与、その後に皮内投与）。皮内投与に充てた先の好ましい実施形態のように、この好ましい実施形態において、本明細書において先に定義されたようなペプチドの皮内及び／又は皮下投与並びに／或いはアジュバントの皮内及び／又は皮下投与は必要に応じて反復でき、並びに／或いは異なるペプチド及び／又は異なるアジュバントを連続して皮内及び／又は皮下投与できる。本発明のペプチドを皮内及び／又は皮下投与し、一方、本明細書において定義されたようなアジュバントを連続して投与することもまた、本発明に包含される。アジュバントは皮内及び／又は皮下投与できる。しかし、任意の他の投与方法もまた、アジュバントに関して使用できる。
【００５５】
本発明者らは、本発明による薬剤の皮内投与及び皮下投与の組合せは有利であると期待する。表皮のＤＣは、真皮及び皮下組織のＤＣとは明らかに異なる。皮内（ｉｎｔｒａｃｕｔａｎｅｏｕｓ）（皮内（ｉｎｔｒａｄｅｒｍａｌ））の免疫化は、抗原のプロセッシング及びそれらの樹状ネットワークを介してケラチノサイトと密接にかかわる表皮ＤＣ（ランゲリン陽性ランゲルハンス細胞）の活性化を引き起こすであろう。これはさらに、ランゲルハンス細胞とケラノサイトとの相互作用で炎症経路を最適に活性化し、その後取り込まれた抗原及び活性化ランゲルハンス細胞の、皮膚−流入領域リンパ節への輸送が続く。
【００５６】
皮下投与は他のＤＣサブセットを活性化し、それにより抗原を取り込み、独立して皮膚−流入領域リンパ節に移動するようになる。事によると、皮内及び皮下の両方で投与できる薬剤の使用は、さまざまなＤＣのサブセットによって、これらの流入領域節においてＴ細胞の相乗刺激をもたらし得る。
【００５７】
この文献において、及びその特許請求の範囲において、「含むこと（ｔｏ ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という動詞及びその活用は非限定的意味で使用され、その言葉の後に続く項目が含まれることを意味するが、特に述べていない項目を排除するものではない。さらに、不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」による要素の言及は、文脈が唯一の要素を明らかに要求していない限り、複数の要素が存在する可能性を排除するものではない。したがって、不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」は、通常「少なくとも１つの」を意味する。
【００５８】
本発明を、以下の実施例によりさらに例示するが、これらは本発明の範囲を限定するものと解釈するべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】１９例の健康なドナー（ＨＤ）及び１７例の、子宮頸部新生物の病歴のある患者（Ｐ）のグループにおける、出現の数、日数及び陽性の皮膚反応を誘導した注射抗原の概要を示す図である。直径２ｍｍより大きい丘疹が、注射後２日以上たって出現した場合、皮膚反応は陽性であると考えた。表示のレイアウトは、８種のペプチドプールに使用し、使用したペプチドプールのタンパク質の最初と最後のアミノ酸を示す。太字で印刷したレイアウトはこの時間枠内の少なくとも１つの陽性反応を示し、塗りつぶされた四角は新たに発生した、表示のペプチドプールに対する陽性の皮膚反応を表わす。
【図２】健康なドナーのチャレンジ前の血液試料において、ＩＦＮγ ＥＬＩｓｐｏｔによりＨＰＶ１６特異的Ｔ細胞の検出が、認識されたペプチドプールに対する早期（＜１３日）陽性皮膚反応の出現と有意に相関することを示す図である（ｐ＝０．０００３、両側、フィッシャーの正確確率検定）。特異的応答は、実験ウェルの平均スポット数から、培地対照の平均スポット数＋２×ＳＤを引いて計算した。１００．０００ＰＢＭＣ当たりの特異的スポット数を示す。ペプチドプールの特異的Ｔ細胞頻度が１００．０００ＰＢＭＣにおいて≧５の場合、応答を陽性と考えた。
【図３Ａ】陽性の皮膚反応の出現と健康なドナーのチャレンジ後の血液試料中の循環ＨＰＶ１６特異的Ｔ細胞の同時検出（ＩＦＮγ ＥＬＩｓｐｏｔ）との関連を示す図である（ｐ＜０．０００１、両側、フィッシャーの正確確率検定）。総計８８例の皮膚検査から、３９例が陽性であった。これら３９例の反応のうち、２５例がＥＬＩｓｐｏｔにおいて陽性反応と関連があった（１００．０００ＰＢＭＣ中、Ｔ細胞頻度≧５）。皮膚反応を示さなかった４９例の皮膚検査部位のうち、１０例が陽性のＥＬＩｓｐｏｔと関連があった。
【図３Ｂ】１４日目に、ペプチドプール６（Ｅ６１０９〜１４０、Ｅ６１２７〜１５８）に対して陽性皮膚反応を示した健康なドナー（ＨＤ１０）の例を示す図である（左のパネル）陽性皮膚反応部位のパンチ生検の図である（右側のパネル）。
【図４Ａ】ＩＦＮγ ＥＬＩｓｐｏｔにより、陽性皮膚反応を表わす健康なドナーの、チャレンジ後血液試料中に検出されたＨＰＶ１６特異的Ｔ細胞応答を示す図である。１００．０００ＰＢＭＣ当たりの平均スポット数を表わす。メモリー応答混合物（ＭＲＭ）を、陽性対照として使用した。塗りつぶされたバーは、パンチ生検を採取し培養した陽性皮膚反応部位を示す。
【図４Ｂ】パンチ生検から取り出したＴリンパ球を、サイトカイン駆動増殖期の１４から２８日後、皮膚検査で注射したように、ペプチド（１０μｇ／ｍｌ）又はタンパク質（２０μｇ／ｍｌ）をパルスした単球による刺激に対する、それらの増殖能を検査した図である。フィトヘムアグルチニン（ＰＨＡ）は陽性対照として機能した。増殖は、［３Ｈ］チミジンの組込みにより測定し、増殖応答は刺激指数（ＳＩ）≧３として具体的に定義した。健康なドナー１７（ＨＤ１７）は、非特異的Ｔ細胞からなる陽性皮膚反応部位の例である。
【図４Ｃ】Ｂにおける増殖応答物の上清を、ＩＦＮγ、インターロイキン４（ＩＬ４）、ＩＬ５及び腫瘍壊死因子α、ＩＬ２、ＩＬ１０（図示せず）の存在に関してサイトメトリックビーズアレイにより分析した図である。カットオフ値は、さまざまなサイトカインの標準曲線に基づいた（１００ｐｇ／ｍｌ ＩＦＮγ及び残存サイトカインに関しては２０ｐｇ／ｍｌ）。抗原特異的なサイトカインの産生を、上記のカットオフレベルを超え、且つ＞２×培地対照濃度のサイトカイン濃度として定義した。健康なドナー１５（ＨＤ１５）は、ＩＬ５の高いバックグラウンドレベルを表わすが、抗原刺激後＞２×に上昇する。
【図５】健康なドナー１５（ＨＤ１５）のプール４（Ｅ６４１〜６５、Ｅ６５５〜８０、Ｅ６７１〜９５）の皮膚生検のＴ細胞培養物は、ＨＰＶ１６特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞の双方からなることを示す図である。培養物の特異性を、注射皮膚検査に対応するタンパク質（２０μｇ／ｍｌ）及びペプチド（１０μｇ／ｍｌ）に対して、細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）で検査した。注目すべきことに、４例の生検のうち３例において、ＣＤ８＋ＨＰＶ１６特異的Ｔ細胞が検出された。
【実施例】
【００６０】
材料及び方法
研究計画
上腕に臨床グレードのＨＰＶ１６ペプチドのプールを皮内注射することにより測定する、ＨＰＶ１６ Ｅ２、Ｅ６及びＥ７特異的Ｔ細胞応答を分析する、横断的パイロット研究を、子宮頸部のＨＰＶ関連障害を有する患者及び健康な個人において実施した。遅延型過敏反応は、メモリーＴ細胞応答を表わすので、分析時のＨＰＶ１６陽性の前提条件はなか
った。
【００６１】
対象
子宮頸癌（ｎ＝１２）又はＣＩＮ（ｎ＝５）の病歴のある１７例の女性（Ｐ）及び１９例の健康な個人（ＨＤ）のグループが、インフォームドコンセントを受けた後でこの研究に参加した。ＨＰＶ状態を含む患者の臨床的特徴を、表１に要約する。患者の年齢は２８〜７２歳（年齢の中央値、４６歳）の範囲であった。健康な個人のグループは、年齢の中央値が３１歳（範囲、２０〜５１歳）であり、８０％の女性及び２０％の男性で構成されていた。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、皮膚検査の投与の直前にすべての対象から得た。健康な個人では陽性の皮膚検査の出現が遅いので、１９例の健康なボランティアの１１例から第２の血液試料を採取した。研究計画は、Ｍｅｄｉｃａｌ Ｅｔｈｉｃａｌ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｌｅｉｄｅｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｍｅｄｉｃａｌ
Ｃｅｎｔｒｅの承認を受けた。
【００６２】
ＤＴＨ皮膚検査
遅延型過敏反応（ＤＴＨ）に基づく皮膚検査を、ＨＰＶ特異的細胞性免疫応答のインビボ測定のための、高感度且つ単純な方法として使用できる（Ｈｏｐｆｌ、２０００；Ｈｏｐｆｌ、１９９１）。皮膚検査用調製物は、ＨＰＶ１６ Ｅ６及びＥ７タンパク質の全体及びＨＰＶ１６ Ｅ２タンパク質の最も免疫原性の高い領域にわたる、臨床グレートの長鎖合成ペプチドの８種のプールで構成されていた（ｄｅ Ｊｏｎｇ、２００４）。これらの臨床グレードのペプチドは、ＬＵＭＣの部門間ＧＮＰ−Ｆａｃｉｌｉｔｙで作製された。皮膚検査の各プールは、２又は３種の合成ペプチドからなり、ペプチドでカバーされたタンパク質の領域の最初と最後のアミノ酸で示した。プール１：Ｅ２３１〜６０、Ｅ２４６〜７５、プール２：Ｅ２３０１〜３３０、Ｅ２３１６〜３４５、プール３：Ｅ６１〜３１、Ｅ６１９〜５０、プール４：Ｅ６４１〜６５、Ｅ６５５〜８０、Ｅ６７１〜９５、プール５：Ｅ６８５〜１０９、Ｅ６９１〜１２２、プール６：Ｅ６１０９〜１４０、Ｅ６１２７〜１５８、プール７：Ｅ７１〜３５、Ｅ７２２〜５６、プール８：Ｅ７４３〜７７、Ｅ７６４〜９８。ペプチドプールごとに、２０ｍＭの等張リン酸緩衝液中１６％のＤＭＳＯ中に０．２ｍｇ／ｍｌのペプチドの０．０５ｍｌ（１０μｇ／ペプチド）を皮内に注射した。ペプチドプール及び陰性対象（溶剤のみ）を、上腕の個別の皮膚検査部位に、別々に注射した。皮膚検査部位を、少なくとも３回、ペプチドの注射後７２時間及び７日（Ｈｏｐｆｌ）並びに第１の健康な対象の１例において非常に遅い皮膚反応が最初に報告された３週間後に点検した。直径２ｍｍより大きい丘疹が、注射後２日以上たって出現した場合、反応は陽性であると考えた。陽性の皮膚反応部位からパンチ生検（４ｍｍ）を得、小片に切断し、１０％のヒトＡＢ血清、１０％のＴＣＧＦ並びに５ｎｇ／ｍｌのＩＬ７及びＩＬ１５を含むＩＭＤＭ中で培養し、皮膚組織からのリンパ球の遊出を可能にした。培養の２から４週間後、増殖したＴ細胞を収穫し、それらのＨＰＶ特異的反応性に関して検査した。
【００６３】
インビトロ免疫アッセイのための抗原
皮膚検査に使用したペプチドと類似の一連のペプチドを、Ｔ細胞刺激アッセイ及びＩＦＮγ−ＥＬＩＳＰＯＴアッセイに使用した。４種のＨＰＶ１６ Ｅ２ペプチドは、１５残基が重複した３０−ｍｅｒペプチドからなり、ＨＰＶ１６ Ｅ６は３２−ｍｅｒからなり、ＨＰＶ１６ Ｅ７は３５−ｍｅｒからなり、双方とも１４残基が重複していた。ペプチドは、先に記載したように合成し、溶解した（ｖａｎ ｄｅｒ Ｂｕｒｇ、１９９９）。特に、ＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいて、ペプチドプール４及び５は、皮膚検査に使用したペプチドプールとわずかに異なり、プール４はペプチドＥ６３７〜６８、Ｅ６５５〜８６、Ｅ６７３〜１０４を含み、プール５はペプチドＥ６７３〜１０４、Ｅ６９１〜１２２を含んだ。
【００６４】
破傷風トキソイド（０．７５ Ｌｉｍｕｓ ｆｌｏｃｃｕｌｅｎｔｉｕｓ／ｍｌ； Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ、Ｂｉｌｔｈｏｖｅｎ、オランダ）、ヒト型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）超音波分解物（５μｇ／ｍｌ；Ｄｒ．Ｐ．Ｋｌａｔｓｅｒ、Ｒｏｙａｌ Ｔｒｏｐｉｃａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、アムステルダム、オランダのご厚意により提供された）及びカンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）（０．１５ｍｇ／ｍｌ、ＨＡＬ Ａｌｌｅｒｇｅｎｅｎ Ｌａｂ．、Ｈａａｒｌｅｍ、オランダ）の混合物からなるメモリー応答混合物（ＭＲＭ ５０ｘ）を陽性対象として使用した。組換えＨＰＶ１６ Ｅ２、Ｅ６及びＥ７タンパク質を、先に記載したように組換え大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）において作製した（ｖａｎ ｄｅｒ Ｂｕｒｇ、２００１）。
【００６５】
ＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴによる抗原特異的Ｔｈ細胞の分析
ＨＰＶ１６特異的Ｔｈ細胞の存在を、先に記載したように、ＥＬＩＳＰＯＴにより分析した（ｖａｎ ｄｅｒ Ｂｕｒｇ、２００１）。簡潔に言うと、新鮮なＰＢＭＣを、２×１０６細胞／ウェルの濃度で、２４ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）中の、１０％のヒトＡＢ血清を加えた、表示のＨＰＶ１６ Ｅ２、Ｅ６及びＥ７ペプチドプールを含む、又は含まない１ｍｌのＩＭＤＭ（Ｂｉｏ Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ、Ｖｅｒｖｉｅｒｓ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）に播種した。ペプチドは、５μｇ／ｍｌ／ペプチドの濃度で使用した。３７℃で４日間インキュベートした後で、ＰＢＭＣを収穫し、洗浄し、ＩＦＮγ捕捉抗体（Ｍａｂｔｅｃｈ ＡＢ、Ｎａｃｈａ、スウェーデン）でコーティングしたＭｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ ９６ウェルプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｅｔｔｅｎ−Ｌｅｕｒ、オランダ）中の１０％ＦＣＳを加えたｌ００μｌのＩＭＤＭに、１０５細胞／ウェルの濃度で４つの複製ウェルに播種した。さらに抗体をインキュベートし、ＥＬＩＳＰＯＴの発生を、製造業者（Ｍａｂｔｅｃｈ）の指示書に従って実施した。スポットを全自動コンピューター支援ビデオ画像分析系（Ｂｉｏ Ｓｙｓ）を用いて数えた。特異的スポットを、実験ウェルの平均スポット数から、培地対照の平均スポット数＋２×ＳＤを引いて計算した（ｖａｎ ｄｅｒ Ｂｕｒｇ、２００１）。
【００６６】
Ｔ細胞増殖アッセイ
皮膚生検のＴ細胞培養物を３日間の増殖アッセイにおける特異的ペプチド及びタンパク質の認識に関して検査した（ｖａｎ ｄｅｒ Ｂｕｒｇ、２００１）。簡潔に言うと、自己単球を、ＰＢＭＣから、３７℃においてＸ−ｖｉｖｏ１５培地（Ｃａｍｂｒｅｘ）中で、２時間、平底の９６ウェルプレートに接着させることによって単離した。この単球を、ＡＰＣとして使用し、１０μｇ／ｍｌのペプチド及び２０μｇ／ｍｌのタンパク質を一晩取り込ませた。皮膚検査浸潤リンパ球を、２〜５×１０４細胞／ウェルの濃度で、１０％のＡＢ血清を添加したＩＭＤＭに播種した。培地単独を陰性対照として採取し、フィトヘムアグルチニン（０．５μｇ／ｍｌ）は陽性対照として機能した。増殖は、［３Ｈ］チミジン（５μＣｉ／ｍｍｏｌ）の組み込みにより測定した。増殖応答は刺激指数（ＳＩ）≧３として具体的に定義した。増殖アッセイの上清を、抗原特異的サイトカイン産生の分析のために、インキュベーションの４８時間後に収穫した。
【００６７】
ＨＰＶ１６特異的増殖応答に関与するサイトカインの分析
６種のさまざまなＴｈ１及びＴｈ２サイトカイン：ＩＦＮγ、腫瘍壊死因子α、インターロイキン２（ＩＬ２）、ＩＬ４、ＩＬ５及びＩＬ１０の同時検出を、サイトメトリックビーズアレイ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して、製造業者の指示書に従って実施した。カットオフ値は、さまざまなサイトカインの標準曲線に基づいた（１００ｐｇ／ｍｌ ＩＦＮγ及び残存サイトカインに関しては２０ｐｇ／ｍｌ）。抗原特異的サイトカインの産生を、上記のカットオフレベルを超え、及び＞２×培地対照濃度のサイトカイン濃度として定義した（ｄｅ Ｊｏｎｇ、２００４）。
【００６８】
細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）
陽性皮膚反応部位に由来するＴ細胞培養物の特異性及び特徴を、先に報告したように（ｄｅ Ｊｏｎｇ、２００５）ＩＣＳにより検査した。簡潔に言うと、皮膚検査浸潤リンパ球を収穫し、洗浄し、ＩＭＤＭ＋１０％ＡＢ血清に懸濁し、２〜５×１０４細胞を、５０μｌのペプチド（１０μｇ／ｍｌ）又はタンパク質（２０μｇ／ｍｌ）で、Ｘ ｖｉｖｏ培地中で一晩パルスした自己単球に加えた。培地単独を陰性対照として採取し、フィトヘムアグルチニン（０．５μｇ／ｍｌ）は陽性対照として機能した。試料を、ＦＩＴＣ標識マウス−抗ヒトＩＦＮγ（０．５ｇ／ｍｌ、ＢＤ ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）、ＰＥ標識マウス−抗ヒトＩＬ５（０．２ｍｇ／ｍｌ、ＢＤ ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）、ＡＰＣ標識−抗ＣＤ４（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）及びＰｅｒＣＰ−標識−抗ＣＤ８（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で同時染色した。４℃でインキュベーション後、細胞を洗浄し、１％のパラホルムアルデヒドで固定し、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳｓｃａｎ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により分析した。
【００６９】
統計分析
フィッシャーの正確確率検定（両側）を使用して、ＰＢＭＣ中のＩＦＮγ産生ＨＰＶ特異的Ｔ細胞の検出、皮膚検査反応の存在又は皮膚生検中のＨＰＶ特異的Ｔ細胞の存在の関係、並びに患者と健康な対照との間の、これらのグループ内の皮膚反応の大きさ又は数の違いを分析した。統計分析は、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｉｎｓｔａｔ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（バージョン３．０）及びＧｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ４を使用して実施した。
【００７０】
結果
ＨＰＶ１６ Ｅ２、Ｅ６−及びＥ７のペプチドの皮内注射に対する皮膚反応
本発明者らは、健康な対象及びＨＰＶ誘導性疾患を有する患者の双方における、ＨＰＶ１６ Ｅ２、−Ｅ６及び−Ｅ７のペプチドの皮内注射後の皮膚反応を調査した。陽性皮膚反応は、直径２〜２０ｍｍの扁平な赤みがかった丘疹として現れ、注射後２〜２５日以内に起こった。陽性皮膚反応を、対照グループ中１５２例の皮膚検査の４６例、及び患者グループ中１３６例の皮膚検査部位のうち３０例において検出した。皮膚反応の大きさは、２つのグループ間で差がなかった。全体的に、皮膚検査の各ペプチドプールは、陽性皮膚反応を引き起こすことができた。Ｅ２３１〜７５（１９例の対象のうち１０例）、Ｅ６３７〜１０４（９／１６）及びＥ７４３〜９８（７／１９）に対する最も頻度の高い反応は、対照グループにおいて観察された。この反応パターンは、本発明者らが、ＰＢＭＣにおいて先に観察したパターン（ｄｅ Ｊｏｎｇ、２００２；Ｗｅｌｔｅｒｓ、２００３）及び患者グループにおいて観察したパターン（図１）と似ている。
【００７１】
皮膚反応が現れるまでの時間は、健康なボランティアのグループと患者との間で大幅に異なる。注射後２４から７２時間以内に、古典的ＤＴＨ反応が、わずか３例、２例の患者及び１例の健康な対照において観察された（図１）。患者グループにおける皮膚反応の大部分は、２から２０日以内に発症し、１週間後に最大に達する（図１）。特に、ＨＰＶ１６関連疾患の病歴のある患者９例のうち５例は、８日以内に陽性反応を示した。しかし、対照のグループにおいて、皮膚反応の大部分は１３〜２５日の間に検出された。
【００７２】
健康なドナーにおける皮膚反応は、末梢血においてＨＰＶ１６特異的Ｔ細胞の頻度がより高いことと関連がある。
皮膚検査の結果と循環ＨＰＶ１６特異的１型Ｔ細胞の存在とを比較するために、ＩＦＮγ ＥＬＩｓｐｏｔアッセイを、皮内ペプチドチャレンジが行われる前に収集されたＰＢＭＣに実施した。健康なボランティア１９例のうち５例において、本発明者らは、ＨＰＶ１６特異的免疫応答をＩＦＮγ−ＥＬｌｓｐｏｔにより検出できた。健康な個人のチャレンジ前の血液試料において、循環ＨＰＶ１６特異的Ｔ細胞／１００．０００ＰＢＭＣの検
出が、≧５であることは、同じペプチド配列に対する早期（≦１３日）の陽性皮膚反応と関連があった（ｐ＝０．０００３、両側、フィッシャー正確確率検定、図２）。後期陽性皮膚反応（１４から２５日）を誘導したペプチドに対する、健康なドナーのチャレンジ前の血液試料において、ＨＰＶ１６特異的循環Ｔ細胞は検出されなかった。このことは、循環抗原特異的細胞の頻度が、皮膚反応が現れる遅延時間を決定することを示唆している。
【００７３】
皮膚反応の出現が遅れた時間におけるＨＰＶ特異的Ｔ細胞の頻度を評価するために、１１例の健康なボランティアから追加の血液試料を採取した。８８例のうちこれら個体３９例において、皮膚検査が陽性であった。３９例の陽性皮膚反応の２５例において、及び４９例の陰性皮膚反応の１０例において、≧５／１００．０００ＰＢＭＣのＨＰＶ１６特異的Ｔ細胞が検出された。この時点において、チャレンジ後の血液試料中の循環ＨＰＶ特異的ＩＦＮγ産生Ｔ細胞の検出と、皮膚反応の存在の間に有意な相関が発見された（ｐ＜０．０００１、フィッシャー正確確率検定；図３Ａ）。このことは、健康なボランティアの血液中のＨＰＶ１６特異的Ｔ細胞の頻度が、ＨＰＶ１６ペプチドの皮内チャレンジの後で有意に高くなったことを示し、ペプチド抗原の皮内注射が、健康なボランティアの血液中のＨＰＶ１６特異的Ｔ細胞の数を増加させることを示唆している。
【００７４】
Ｔｈ１／Ｔｈ２−ＣＤ４＋及びＣＤ８＋ＨＰＶ１６特異的Ｔ細胞の双方からなる陽性皮膚反応部位の生検。
健康なボランティアの陽性皮膚反応のおよそ２５％は、血液中のＨＰＶ１６特異的ＩＦＮγ産生Ｔ細胞の検出と関係なく、別の、非ＩＦＮγ産生型のＴ細胞が、ＨＰＶ１６ペプチドの皮内注射後に皮膚に浸潤できることを示唆する。
【００７５】
陽性皮膚反応部位の細胞を特徴付けるために、パンチ生検を採取した（図３Ｂ）。全体で、８例の生検を、７例の健康な対照のさまざまな陽性皮膚反応部位から採取し、抗原刺激なしでＴ細胞がインビトロ成長できるサイトカインのカクテルと共に培養した。８症例の７例において、Ｔ細胞は組織を離脱し３〜４週間以内に増殖する。増殖したＴ細胞を、それらの特異性に関して、短期増殖アッセイにおいて検査した。図４は、皮膚検査期間にもこの部位に注射された（ＨＤ２、ＨＤ１０、ＨＤ１５）ペプチドのプールでパルスされた自己単球、並びにＨＰＶ１６ Ｅ６タンパク質でパルスされた単球で刺激されると特異的に増殖したＴ細胞培養の例を示している（図４ＡＢ）。このことは、これらのＴ細胞が、抗原が自然にプロセッシングされ、提示された後で、それらの同族ＨＬＡ−ペプチド複合体を認識できたことを示唆している。これらの増殖Ｔ細胞培養物の上清の分析により、ＨＰＶ１６特異的Ｔ細胞がＩＦＮγ、ＩＬ−４及びＩＬ−５を産生する、混合Ｔｈ１／Ｔｈ２サイトカインプロフィールが明らかになった（図４Ｃ）。
【００７６】
ＨＰＶ特異的Ｔ細胞が生検培養物中に検出された症例（８例のうち４例）それぞれにおいて、このことは、チャレンジ後の血液試料中の循環ＨＰＶ１６特異的ＩＦＮγ産生Ｔ細胞のＥＬＩｓｐｏｔによる検出と同時に起こった（図４Ａ及びＢを比較されたい）。他の４例の陽性皮膚反応生検の３例（ＨＤ２、ＨＤ１７、ＨＤ１８）において、Ｔ細胞は、ＨＰＶ１６ペプチドに対して応答せず（図４；ＨＤ１７）、１つの症例において、Ｔ細胞は組織から全く離脱しなかった（ＨＤ１３）。これらの４つの症例において、本発明者らは、チャレンジ後の血液試料中に循環ＨＰＶ１６特異的ＩＦＮγ産生Ｔ細胞を検出できなかった。
【００７７】
生検−Ｔ細胞の、ＣＤ４及びＣＤ８細胞表面マーカーによる共染色により、ＨＰＶ１６特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞のみならず、ＨＰＶ１６特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞もまた、ＨＰＶ１６ペプチドの皮内チャレンジにおいて皮膚部位に浸潤することが示された（図５）。全体として、ＨＰＶ１６特異的Ｔ細胞が浸潤した４例の生検のうち３例において、本発明者らは、ＨＰＶ１６特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を検出できた。
【００７８】
総合すれば、ＨＰＶ１６ペプチドの皮内チャレンジにおいて、皮膚に遊走する免疫細胞の集団は、ＨＰＶ１６特異的ＣＤ４＋Ｔｈ１−、Ｔｈ２−及びＣＤ８＋細胞障害性Ｔ細胞を含む。この浸潤は、血液中の循環ＨＰＶ１６特異的ＩＦＮγ産生Ｔ細胞の出現と並行している。
【００７９】
考察
皮膚検査は、細胞性免疫のインビボ測定のための単純なアッセイとしてよく使用される。本発明者らは、早期抗原のＥ２、Ｅ６及びＥ７に対するインビボＨＰＶ１６特異的細胞性免疫応答の測定のための皮膚検査アッセイの使用を、結果を、インビトロアッセイにおけるＴ細胞の反応性の平行測定の結果と比較することによって正当性を立証した。
【００８０】
皮膚検査の投与後２〜８日以内に現れた、ＨＰＶ関連新生物の患者における陽性皮膚反応の大部分は、ＨｏｐｆｌらによりＣＩＮ患者において観察されたことと同様である（Ｈｏｐｆｌ、２０００）。さらに健康なボランティアのグループにおいて、早期皮膚反応は、皮内抗原チャレンジ後４〜１２日の間に現れた。インビトロでＨＰＶ１６特異的１型Ｔ細胞応答を表わすことが公知（ｄｅ Ｊｏｎｇ、２００２；Ｗｅｌｔｅｒｓ、２００３）である、この後者のグループにおいて、早期皮膚反応の出現（１３日以内）は、少なくとも１／２０．０００ＰＢＭＣの頻度でＩＦＮγ産生ＨＰＶ１６特異的Ｔ細胞が検出されることと有意に関連がある（図２、ｐ＜０．００１）。ＩＦＮγ ＥＬＩｓｐｏｔアッセイにおける陽性反応に関する同じカットオフ基準が、Ｊｅｆｆｒｉｅｓらによって推奨されており（Ｊｅｆｆｒｉｅｓ、２００６）、Ｊｅｆｆｒｉｅｓは、数学的ツールを使用し、マントー反応との関連においてＥＬＩＳＰＯＴの適切なカットオフを定義した。循環メモリーＴ細胞の数が少ないことにより（図２）、古典的ＤＴＨ検査と比較して皮膚反応がいくらか遅く現れることの理由が説明できる。Ｔ細胞は、ブースト又は再活性化されることを必要とし、十分な細胞が産生され、局所炎症反応：陽性皮膚検査が引き起こされる前に分裂を始める。実際に、陽性皮膚反応が出現する時に、ＨＰＶ１６特異的Ｔｈ１応答の頻度が高くなることが、末梢血において検出できる（図３）。
【００８１】
健康な個人とは対照的に、患者集団の皮膚反応は、ＩＦＮγ ＥＬＩｓｐｏｔにより測定した循環ＨＰＶ１６特異的１型Ｔ細胞とは関連がなく、ＩＦＮγ以外の他のサイトカインを産生するＨＰＶ１６特異的Ｔ細胞が、患者の皮膚検査部位に浸潤していることを示唆した。歴史的に、Ｔｈ１細胞がＤＴＨ応答を誘導することは前提とされているが、現在ではいくつかの研究により、Ｔｈ２細胞も皮膚検査部位に浸潤することが示されている（Ｗａｎｇ、１９９９；Ｗｏｏｄｆｏｌｋ、２００１）。同様に、この研究は、健康なボランティアの陽性皮膚検査部位が、Ｔｈ１及びＴｈ２型のＨＰＶ１６特異的Ｔ細胞の双方を含むことを示している（図４及び５）。さらに、陽性皮膚反応は、腎細胞癌又はメラノーマの患者のワクチン接種の後の特異的免疫応答を分析するために使用した陽性皮膚検査部位の２つの綿密な研究（Ｂｌｅｕｍｅｒ、２００７）から明らかなように、非特異的Ｔ細胞の流入の結果でもあり得る。さらにこの研究は、健康な対照からの多くの陽性皮膚検査部位が、注射されたＨＰＶ１６抗原に対して応答しなかったＴ細胞によって浸潤されていたことを示した。今までのところ、特異的陽性皮膚反応の理由ははっきりしないままである。しかし、これらの結果及び本発明者らのこれまでの研究の見解に基づき、子宮頸癌患者の大部分が、機能的ＨＰＶ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞性免疫を欠いていることを示し（ｄｅ Ｊｏｎｇ、２００４）、本発明者らは、癌患者の陽性皮膚反応は、循環ＨＰＶ特異的非Ｔｈ１細胞又はＨＰＶ１６に対して非特異的である浸潤Ｔ細胞のどちらかの結果であると推測する。
【００８２】
予期せぬことに、本発明者らは健康な個人の皮膚反応の大部分が、抗原の皮内注射後２〜３週間で現れることを観察した。一方、これらの後期陽性皮膚反応は、チャレンジ前の
血液中の循環ＨＰＶ特異的ＣＤ４＋メモリーＴ細胞の検出と相関しなかった（図２）が、これらの皮膚検査部位の免疫学的構造は、古典的ＤＴＨ検査のものと同様であり（Ｐｌａｔｔ、１９８３；Ｐｏｕｌｔｅｒ、１９８２）、ＨＰＶ１６特異的ＣＤ４＋Ｔｈ１−及びＴｈ２−細胞並びにＨＰＶ１６特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を含む（図４及び５）。本発明者らは、これらの反応がＴ細胞提示の結果であり得るという仮説を立てる。このことは、２ステップのツベルクリン皮膚検査のプロトコルを受けた患者の２９％が、第２の検査期間においてのみ陽性であったことは注目されている。（Ａｋｃａｙ、２００３）。一般的に、ワクチン誘導性Ｔ細胞反応は、ワクチン接種後１０から１４日でピークに達し、３週間でなくなる。しかし、このようなプロトコルでは、より高い抗原用量が多いほど強いアジュバントを注射することになる懸念がある。したがって、皮内チャレンジにより誘導されるＴ細胞応答が、より緩慢に発生し、遅い時期にピークに達すると推定することは理にかなっている。健康なボランティアにおける皮内ペプチドチャレンジは、ＨＰＶ１６に特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞の双方を誘導するので、単回の低用量ワクチン接種として考えるべきである。
【００８３】
このパイロット研究の主要な目的は、１型免疫応答をインビボで検出するためのＨＰＶ１６特異的皮膚検査の使用の正当性を立証することであった。健康なボランティアにおいて、１３日以内の陽性皮膚反応は、実際に、インビトロでＩＦＮγ ＥＬＩｓｐｏｔにより検出された循環ＩＦＮγ産生メモリーＴ細胞の存在と相関している。重要な事には、本発明者らはさらに、皮膚検査により得られた結果とＥＬＩｓｐｏｔにより得られた結果との相違を観察した。多くの症例において、ＨＰＶ１６特異的循環ＩＦＮγ産生Ｔ細胞が、チャレンジ後の血液試料中に検出されたが、付随する皮膚反応はなく、逆もまた同様であり（図３Ａ）、このことは、擬陰性又は擬陽性の結果と考えることができる。ＨＰＶに対する１型免疫の検出の解釈に対するこの影響を完全に理解するために、本発明者らは、インドネシアにおいて、患者及び健康なボランティアの大きなグループで野外試験を始めた。
表１ 患者の特徴
【表１】
ａ 皮膚検査実施前の治療期間
ｂ ＦＩＧＯに従った子宮頸癌のステージ
ｃ ループ型電気メスによる切除法（Ｌｏｏｐ ｅｌｅｃｔｒｏｓｕｒｇｉｃａｌ ｅｘｃｉｓｉｏｎ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）
【００８４】
（参考文献）
【特許請求の範囲】
【請求項１】
皮内投与用である、ＨＰＶ関連疾患の治療又は予防用薬剤の製造のための、ＨＰＶ−Ｅ２、−Ｅ６及び／又は−Ｅ７タンパク質に由来するペプチドの使用。
【請求項２】
少なくとも１つのＨＬＡクラスＩＩエピトープ及び／又は少なくとも１つのＨＬＡクラスＩエピトープが、少なくとも１つのＨＰＶ−Ｅ２、−Ｅ６及び／又はＥ７タンパク質のアミノ酸配列からの連続するアミノ酸配列内に存在する、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
連続するアミノ酸配列の長さが、ＨＰＶ−Ｅ２、Ｅ６及び／又はＥ７タンパク質由来の１９〜４５の連続するアミノ酸残基、好ましくは２２〜４５、より好ましくは２２〜４０、より好ましくは２２〜３５、さらにより好ましくは２２、２５、２８、３２又は３５の連続するアミノ酸である、請求項１又は２に記載の使用。
【請求項４】
薬剤が、ＨＰＶ−Ｅ２、−Ｅ６及び／又は−Ｅ７タンパク質に由来する少なくとも２種の異なるペプチドを含む、請求項１から３までのいずれか一項に記載の使用。
【請求項５】
連続するアミノ酸配列が、ＨＰＶ−Ｅ２、−Ｅ６及び−Ｅ７タンパク質の少なくとも２種、好ましくはＨＰＶ−Ｅ２、−Ｅ６及び−Ｅ７タンパク質の３種すべてのアミノ酸配列に由来する、請求項１から４までのいずれか一項に記載の使用。
【請求項６】
薬剤がアジュバントを含まない、請求項１から５までのいずれか一項に記載の使用。
【請求項７】
薬剤が、請求項１から６までに記載の１種又は複数種のペプチド及び不活性な薬学的に許容可能な担体からなる、請求項１から６までのいずれか一項に記載の使用。
【請求項８】
薬剤が、請求項１から５までに記載のペプチド及び少なくとも１種のアジュバントを含み、前記アジュバントは水中油に基づく乳剤に処方されておらず、及び／又は水中油型乳剤ではない、請求項１から５までのいずれか一項に記載の使用。
【請求項９】
薬剤が、モノホスホリル脂質Ａ及び／又はＣｐＧ核酸などのＴＬＲ（３、４、７、８、９）リガンド、及び／又はＣＤ４０リガンドなどのＡＰＣ共刺激性分子、アゴニスト抗体又はそれらの機能的断片及び誘導体、及び／又はＧＭ−ＣＳＦを含む、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
ＨＰＶ関連疾患が、ＨＰＶ感染、ＨＰＶ関連悪性腫瘍、ＣＩＮ、ＶＩＮ、ＡＩＮ、ＶＡＩＮ、ＰＩＮ、子宮頸癌、外陰癌、肛門癌、頭部及び頸部の癌又は陰茎癌から選択される、請求項１から９までのいずれか一項に記載の使用。
【請求項１１】
薬剤が、病変部位に直接皮内投与される、請求項１から１０までのいずれか一項に記載の使用。
【請求項１２】
更にＨＰＶ−Ｅ２、−Ｅ６及び／又は−Ｅ７タンパク質に由来するペプチドが、皮下投与用であるＨＰＶ関連疾患の治療又は予防用薬剤の製造のために使用される、請求項１から１１までのいずれか一項に記載の使用。
【請求項１】
皮内投与用である、ＨＰＶ関連疾患の治療又は予防用薬剤の製造のための、ＨＰＶ−Ｅ２、−Ｅ６及び／又は−Ｅ７タンパク質に由来するペプチドの使用。
【請求項２】
少なくとも１つのＨＬＡクラスＩＩエピトープ及び／又は少なくとも１つのＨＬＡクラスＩエピトープが、少なくとも１つのＨＰＶ−Ｅ２、−Ｅ６及び／又はＥ７タンパク質のアミノ酸配列からの連続するアミノ酸配列内に存在する、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
連続するアミノ酸配列の長さが、ＨＰＶ−Ｅ２、Ｅ６及び／又はＥ７タンパク質由来の１９〜４５の連続するアミノ酸残基、好ましくは２２〜４５、より好ましくは２２〜４０、より好ましくは２２〜３５、さらにより好ましくは２２、２５、２８、３２又は３５の連続するアミノ酸である、請求項１又は２に記載の使用。
【請求項４】
薬剤が、ＨＰＶ−Ｅ２、−Ｅ６及び／又は−Ｅ７タンパク質に由来する少なくとも２種の異なるペプチドを含む、請求項１から３までのいずれか一項に記載の使用。
【請求項５】
連続するアミノ酸配列が、ＨＰＶ−Ｅ２、−Ｅ６及び−Ｅ７タンパク質の少なくとも２種、好ましくはＨＰＶ−Ｅ２、−Ｅ６及び−Ｅ７タンパク質の３種すべてのアミノ酸配列に由来する、請求項１から４までのいずれか一項に記載の使用。
【請求項６】
薬剤がアジュバントを含まない、請求項１から５までのいずれか一項に記載の使用。
【請求項７】
薬剤が、請求項１から６までに記載の１種又は複数種のペプチド及び不活性な薬学的に許容可能な担体からなる、請求項１から６までのいずれか一項に記載の使用。
【請求項８】
薬剤が、請求項１から５までに記載のペプチド及び少なくとも１種のアジュバントを含み、前記アジュバントは水中油に基づく乳剤に処方されておらず、及び／又は水中油型乳剤ではない、請求項１から５までのいずれか一項に記載の使用。
【請求項９】
薬剤が、モノホスホリル脂質Ａ及び／又はＣｐＧ核酸などのＴＬＲ（３、４、７、８、９）リガンド、及び／又はＣＤ４０リガンドなどのＡＰＣ共刺激性分子、アゴニスト抗体又はそれらの機能的断片及び誘導体、及び／又はＧＭ−ＣＳＦを含む、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
ＨＰＶ関連疾患が、ＨＰＶ感染、ＨＰＶ関連悪性腫瘍、ＣＩＮ、ＶＩＮ、ＡＩＮ、ＶＡＩＮ、ＰＩＮ、子宮頸癌、外陰癌、肛門癌、頭部及び頸部の癌又は陰茎癌から選択される、請求項１から９までのいずれか一項に記載の使用。
【請求項１１】
薬剤が、病変部位に直接皮内投与される、請求項１から１０までのいずれか一項に記載の使用。
【請求項１２】
更にＨＰＶ−Ｅ２、−Ｅ６及び／又は−Ｅ７タンパク質に由来するペプチドが、皮下投与用であるＨＰＶ関連疾患の治療又は予防用薬剤の製造のために使用される、請求項１から１１までのいずれか一項に記載の使用。
【図１】
【図２】
【図３ａ】
【図３ｂ】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３ａ】
【図３ｂ】
【図４】
【図５】
【公表番号】特表２０１０−５３０３６２（Ｐ２０１０−５３０３６２Ａ）
【公表日】平成２２年９月９日（２０１０．９．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５１０２３９（Ｐ２０１０−５１０２３９）
【出願日】平成２０年５月２７日（２００８．５．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＮＬ２００８／０５０３１５
【国際公開番号】ＷＯ２００９／００２１５９
【国際公開日】平成２０年１２月３１日（２００８．１２．３１）
【出願人】（５０９３２９７３０）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年９月９日（２０１０．９．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年５月２７日（２００８．５．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＮＬ２００８／０５０３１５
【国際公開番号】ＷＯ２００９／００２１５９
【国際公開日】平成２０年１２月３１日（２００８．１２．３１）
【出願人】（５０９３２９７３０）
【Ｆターム（参考）】
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