相同的組み換えを用いる牛β−カゼイン遺伝子ターゲッティングベクター
本発明は、（１）牛β−カゼイン遺伝子のプロモータを有し、このプロモータの前後に位置した牛β−カゼイン遺伝子のエクソン１、イントロン１およびエクソン２からなり、牛β−カゼイン遺伝子の核酸配列に相同である５〜１２ｋｂ長の核酸配列を有する第１領域と、（２）目的のタンパク質をコードする核酸クローニング部位と、（３）ポジティブ選別マーカー領域と、（４）牛β−カゼイン遺伝子のエクソン５、６、７、８およびイントロン５、６、７からなり、牛β−カゼイン遺伝子核酸配列に相同である２．８〜３．５ｋｂ長の核酸配列を有する第２領域とを含み、牛β−カゼイン遺伝子の核酸配列の５’−３’配列において、第１領域が上流に該当し、第２領域が下流に該当することを特徴とする、牛β−カゼイン遺伝子ターゲッティングベクターに関する。また、前記ベクターを用いて牛β−カゼイン遺伝子に目的のタンパク質遺伝子がターゲッティングされた形質転換牛を製造する方法、および形質転換牛のミルクから目的のタンパク質を大量収得する方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔技術分野〕
本発明は、相同的組み換えによる牛β−カゼイン遺伝子ターゲッティングベクター、前記ベクターで遺伝子ターゲッティングされた牛体細胞、および前記牛細胞を用いた核移植により得られた受精卵に関する。また、本発明は、前記受精欄を着床させて製造された形質転換牛のミルクから目的のタンパク質を大量収得する方法に関する。
【０００２】
〔背景技術〕
遺伝子の存在および役割を究明するための動物遺伝学の持続的な努力は、形質転換動物の生産を可能にした。形質転換動物は、薬品や農業などの産業全般にわたって大きい経済的な利益を創出することができる。このような形質転換または遺伝子操作された動物を製造するために、マイクロインジェクション（microinjection）、ウィルス感染（viral transfection）、精子ベクター（sperm vector）、胚性幹細胞（ＥＳ）の利用、および体細胞核移植法（ＳＮＣＴ）などの様々な技術が開発されてきた。
【０００３】
マイクロインジェクションは、ＤＮＡを受精卵の前核に挿入する方法であって（Harbers et al., Nature., 293(5833); 540-2, 1981; Brinster et al., Cell., 27;223-231, 1981; Gordon et al., Proc Natl Acad Sci USA., 77(12);7380-7384; Costantini et al., Nature., 294(5836);92-94）、現在まで、形質転換動物を生産するために広く用いられてきた（Hammer et al., Nature., 315(6021);680-683, 1985; van Berkel et al., Nat Biotechnol., 20(5);484-487, 2002; Damak et al., Biotechnology(NY), 14(2);185-186, 1996）。ところが、マイクロインジェクションによってＤＮＡが挿入された受精卵からの形質転換産子の生産効率は２〜３％と非常に低い（Clark et al., Transgenic Res., 9;263-275, 2000）。よって、マイクロインジェクションによる形質転換動物の生産は、大きな労働力を要し、多くの動物および精巧な付帯私設を要するので、高い費用がかかる（Brink et al., Theriogenology, 53;139-148, 2000）。しかも、マイクロインジェクションは、発現させようとする外来遺伝子の挿入位置と数を決定することができないという短所もある。このため、無作為的な挿入により、形質転換動物における外来タンパク質は、発現が調節されないので不規則的に発現され、その量も少量である。その上、外来遺伝子の無作為的な発現は、胚の発達に致命的な問題を引き起こすと報告された（Wei et al., Annu Rev Pharmacol Toxicol., 37;119-141, 1997）。
【０００４】
レトロウィルス媒介方法も、動物の遺伝子操作のために広く用いられている（Soriano et al., Genes Dev., 1(4);366-375, 1987; Hirata et al., Cloning Stem Cells., 6(1);31-36, 2004）。レトロウィルス媒介方法において、挿入しようとする遺伝子は、ウィルスベクターを介して動物の遺伝子に導入される。この方法は、マイクロインジェクションよりさらに効率的ではあるが、依然として外来遺伝子の無作為的な挿入とモザイク現象（mosaicism）が問題視される（Piedrahita et al., Theriogenology, 53(1);105-116, 2000）。しかも、挿入しようとする遺伝子の最大サイズが７ｋｂに制限されるうえ、ウィルスによって発現されるタンパク質が問題になることもある（Wei et al., Annu Rev Pharmacol Toxicol., 37;119-141, 1997; Yanez et al., Gene Ther., 5(2);149-159, 1998）。
【０００５】
かかる問題点を克服して、特定の遺伝子を除去または挿入することが可能な遺伝子ターゲッティング技術が開発された。遺伝子ターゲッティング技術は、マウス胚性幹細胞を用いた遺伝子機能研究で最初に使用された。マウス胚性幹細胞は、胚芽への所定の遺伝子操作に使用される。マウス胚性幹細胞に遺伝子ターゲッティング法を用いることにより、多数の特定の遺伝子ターゲッティングされたマウスが生産された（Brandon et al., Curr Biol., 5(6);625-634, 1995; Capecchi et al., Science, 244(4910);1288-1292, 1989; Thompson et al., Cell, 56(2);313-321, 1989; Hamanaka et al., Hum Mol Genet., 9(3);353-361, 2000; Thomas et al, Cell, 51(3);503-512, 1987; te Riele et al., Proc Natl Acad Sci USA, 89(11);5182-5132, 1992; Mansour et al., Nature, 336(6197), 348-352, 1988; Luo et al., Oncogene, 20(3);320-328, 2001）。遺伝子ターゲッティング法が他の哺乳類、特に家畜に適用されるとき、治療タンパク質および疾病モデル動物の大量生産といった大きい生物医学的な利益をもたらす。
【０００６】
今まで、組み換え治療タンパク質は、酵素、バクテリア、動物細胞などの細胞を用いた細胞培養システムによって生産されてきた。ところが、細胞培養システムは、特性上、大量生産が不可能なので、非常に高価である。また、幾つかのタンパク質は、適切な翻訳修飾（posttranslational modification）、例えばグリコシル化（glycosylation）、γ−カルボキシル化（γ-carboxylation）、ヒドロキシル化（hydroxylation）などを導入するために付加的な実験が要求される（Houdebine et al., Transgenic Res., 9(4-5);305-320, 2000; Lubo et al., Transgenic Res., 9(4-5);301-304, 2000）。
【０００７】
しかしながら、形質転換動物から治療タンパク質などを生産する動物生体反応器(animal bioreactor)システムは、非常に経済的で効率の良い発現システムとして評価される。特に、形質転換牛からの組み換え治療タンパク質の大量生産は、細胞培養システムと比較して非常に効率的である（van Berkel et al., Nat Biotechnol., 20(5);484-487, 2002）。その中でも、動物のミルクから生産される組み換えタンパク質は、ヒトタンパク質とほぼ同様に、翻訳後修飾されるものと知られている（Edmunds et al., Blood, 91(12);4561-4571, 1998; Velander et al., Proc Natl Acad Sci USA., 89(24);12003-12007, 1992; van Berkel et al, Nat Biotechnol., 20(5);484-487, 2002）。
【０００８】
牛のミルクは、約８８％の水分、３．３％のタンパク質を含有し、残部が炭水化物と脂質からなっている。カゼインは、乳タンパク質の８０％を占めるが、アルファＳ１、アルファＳ２、ベータ、およびカッパカゼインがあり、特にβ−カゼインは、牛のミルクにおいて１０ｍｇ／ｍＬの濃度で発現される最も豊かな乳タンパク質である（Brophy et al., Nat Biotechnology., 21(2);157-162, 2003）。
【０００９】
体細胞核移植法（ＳＣＮＴ）が形質転換動物の製造においてマイクロインジェクションよりさらに効率的であるが、これは、形質転換された体細胞から由来した複製動物の殆どが形質転換動物であるからである（Brink et al., Theriogenology, 53;139-148, 2000）。また、体細胞核移植法を用いる場合、生産しようとする動物の性別を決定することができ、遺伝的に同じ動物の生産が可能であるという利点がある（Lubo et al., Transgenic Res., 9(4-5);301-304, 2000; van Berkel et al., Nat Biotechnol., 20(5);484- 487, 2002）。
【００１０】
最近まで、遺伝子ターゲッティングされた動物を生産するために、胚性幹細胞と遺伝子ターゲッティングベクターが必須的な要素として考えられてきた。豚と牛において胚性幹細胞とほぼ同様の細胞株が報告されたにも拘わらず、家畜からの胚性幹細胞の使用は制限される（Doetschman et al., Dev Biol., 127(1);224-227, 1988; Stice et al., Biol Reprod., 54(1);100-110, 1996; Sukoyan et al., Mol Reprod Dev., 36(2);148-158, 1993; Iannaccone et al., Dev Biol., 163(1);288-292, 1994; Pain et al., Development, 122(8);2339-2348, 1996; Thomson et al., Proc Natl Acad Sci USA., 92(17);7844-7848, 1995; Wheeler et al., Reprod Fertil Dev., 6(5);563-568, 1994）。
【００１１】
その代わりに、核供与細胞として一般体細胞が遺伝子ターゲッティングに使用できるという可能性が提示されることにより、形質転換牛の生産のための実質的かつ効率的な方法として提案された（Brophy et al., Nat Biotechnol., 21(2);157-162, 2003; Cibelli et al., Science, 280(5367);1256-1258, 1998; Campbell et al., Nature, 380(6569);64-66, 1996; Wilmut et al., Experientia, 47(9);905-912, 1997; Denning et al., Cloning stem cells, 3(4);221-231, 2001）。
【００１２】
体細胞核移植法を利用しながら、乳タンパク質遺伝子のプロモータ部分は、形質転換大動物のミルクにおける組み換えタンパク質の発現を誘導するために使用されてきた（Schnieke et al. Science, 278(5346);2130-2133, 1997; Baguisi et al., Nat Biotechnol., 17(5);456-461, 1999; Brophy et al., Nat Biotechnol., 21(2);157-162, 2003）。ところが、外来遺伝子の無作為な挿入により引き起こされる組み換えタンパク質の少量発現や正規場所外の発現といった問題点が解決されない限り、体細胞核移植法による形質転換家畜の生産は依然として現実性がない。外来遺伝子の正規場所外の発現は、胚の発達に致命的な障害を起こし、胚芽発達の後期と出生後の初期に大部分が発達する神経システムにも非常に致命的である（Gao et al., Neurochem Res., 24(9);1181-1188, 1999）。このような副作用を無くすために、外来遺伝子を授乳期中に乳腺組織のみで特異的に発現させる新規方法が開発された（Houdebine et al., Transgenic Res., 9(4-5);305-320, 2000）。相同的組み換え（homologous recombination）によってゲノム遺伝子の特定の部位を操作するものと知られている遺伝子ターゲッティング方法は、組み換えタンパク質の組織特異的な発現のための最適の手段である（Muller et al., Mech Dev., 82(1-2);3-21, 1999; Clark et al., J Mammary Gland Biol Neoplasia., 3(3);337-350, 1998）。
【００１３】
外来遺伝子がターゲッティングされた複製羊の初生産は、治療タンパク質遺伝子がターゲッティングされた大動物の生産の可能性を開いた（McCreath et al., Nature, 405(6790);1066-1069, 2000）。線維芽細胞で多く発現されるＣＯＬ１Ａ１遺伝子ターゲッティングのためのＣＯＬＴ−２ターゲッティングベクターが製作された。このベクターは、遺伝子ターゲッティングを誘導するために、プロモータ−トラップエンリッチメント（promoter-trap enrichment）を利用した。外来遺伝子ＡＡＴＣ２は、羊β−ラクトグロブリン発現ベクター内にヒトα１−抗トリプシン（ＡＡＴ）を持っており、独立的な転写単位を有し、乳腺における発現を誘導するために製作された。遺伝子ターゲッティングされた羊から分泌されるＡＡＴの量は、無作為的に外来遺伝子が挿入された羊と比較して約３７倍も多かった（McCreath et al., Nature, 405(6790);1066-1069, 2000）。したがって、遺伝子ターゲッティング方法は、治療タンパク質の大量生産のための最上の手段として考えられている。ところが、プロモータ−トラップ（promoter-trap）を利用した遺伝子ターゲッティングベクターの使用は、遺伝子の導入される体細胞で活発に転写される遺伝子に制限される。一般に、活発に転写される遺伝子は、全く転写が起こらない遺伝子と比較して、相同的組み換えがより頻繁に起こるものと知られている（Kuroiwa et al., Nat Genet., 36(7);775-780, 2004）。
【００１４】
乳腺組織は、乳タンパク質が組織特異的に過量発現される組織である。したがって、このような乳タンパク質をコードする遺伝子の操作によって、胚の発達または出生後の発達に障害を起こすことなく、外来タンパク質を大量発現させることができる。その中でも、最も高い濃度で発現されるβ−カゼインが好ましい。牛のβ−カゼイン遺伝子は、全体ゲノムのＤＮＡ上に１つ存在し、乳腺組織以外の一般体細胞では全く発現されない遺伝子である。体細胞で全く発現されないゲノムβ−カゼイン遺伝子に外来の目的タンパク質をターゲティングするために、プロモータ−トラップを用いる遺伝子ターゲッティングベクターが利用できない。
【００１５】
そこで、本発明者らは、牛β−カゼイン遺伝子特異的なターゲッティングベクターカセットを製造し、前記ベクターが牛体細胞の牛β−カゼイン遺伝子に正確にターゲッティングされて遺伝子ターゲッティング効率が非常に高いことを見い出し、牛におけるβ−カゼイン遺伝子特異的にターゲッティングされるベクターシステム、およびこれを用いて目的のタンパク質を大量生産する形質転換牛を製造するシステムを完成した。
【００１６】
〔発明の概要〕
本発明の目的は、（１）牛β−カゼイン遺伝子のプロモータを有し、このプロモータの前後に位置した牛ベータ−カゼイン遺伝子のエクソン１、イントロン１およびエクソン２からなり、牛β−カゼイン遺伝子の核酸配列に相同である５〜１２ｋｂ長の核酸配列を有する第１領域と、（２）目的のタンパク質をコードする核酸クローニング部位と、（３）ポジティブ選別マーカー領域と、（４）牛β−カゼイン遺伝子のエクソン５、６、７、８およびイントロン５、６、７からなり、牛β−カゼイン遺伝子核酸配列に相同である２．８〜３．５ｋｂ長の核酸配列を有する第２領域とを含み、β−カゼイン遺伝子の核酸配列の５’−３’配列において、第１領域が上流（upstream）に該当し、第２領域が下流（downstream）に該当することを特徴とする、牛β−カゼイン遺伝子ターゲッティングベクターを提供することにある。
【００１７】
本発明の別の目的は、前記ベクターで遺伝子ターゲッティングされた牛の体細胞を提供することにある。
【００１８】
本発明の別の目的は、前記体細胞を用いた核移植により得られた受精卵を提供することにある。
【００１９】
本発明の別の目的は、（１）牛β−カゼイン遺伝子ターゲッティングベクターで牛の体細胞を形質転換させる段階と、（２）牛の体細胞を培養して相同的組み換えを誘導する段階と、（３）相同的組み換えによって、牛β−カゼイン遺伝子がターゲッティングされた牛の体細胞を選別する段階とを含む、牛β−カゼイン遺伝子がターゲッティングされた牛の体細胞を製造する方法を提供することにある。
【００２０】
本発明の別の目的は、（１）前記牛β−カゼイン遺伝子ターゲッティングベクターで牛の体細胞を形質転換させる段階と、（２）牛の体細胞を培養して相同的組み換えを誘導する段階と、（３）相同的組み換えによって、牛β−カゼイン遺伝子がターゲッティングされた牛の体細胞を選別する段階と、（４）牛の卵子の核を除去し、遺伝子ターゲッティングされた細胞を導入して、体細胞核移植による受精卵を製造する段階と、（５）前記受精卵を着床させる段階とを含む、形質転換牛を製造する方法を提供することにある。
【００２１】
本発明の別の目的は、前記方法によって製造された形質転換牛のミルクから目的のタンパク質を大量収得する方法を提供することにある。
【００２２】
〔発明の詳細な説明〕
本発明は、バイオ医薬品として作用する様々な目的のタンパク質を牛のミルクから大量生産し得るようにするために、遺伝子ターゲッティングされた形質転換牛の生産に用いられる牛β−カゼインターゲッティングベクターを提供する。山羊と羊の年間乳量がそれぞれ約３００Ｌ、約２００Ｌであるが、これに対し、牛は年間６，３００Ｌ以上のミルクを生産するため、生体反応器として最適の動物である。ところが、今まで、牛の乳タンパク質遺伝子に目的の遺伝子をターゲッティングしようとする試みがなかった。そこで、本発明者らは、牛の乳タンパク質遺伝子である牛β−カゼイン遺伝子を効率よくターゲッティングすることが可能なベクターを提供し、これを用いて目的のタンパク質を大量生産する、β−カゼイン遺伝子ターゲッティングされた形質転換牛を製造する方法を提供する。
【００２３】
一様態において、本発明は、（１）牛β−カゼイン遺伝子のプロモータを有し、このプロモータの前後に位置した牛ベータ−カゼイン遺伝子のエクソン１、イントロン１およびエクソン２からなり、牛β−カゼイン遺伝子の核酸配列に相同である５〜１２ｋｂ長の核酸配列を有する第１領域と、（２）目的のタンパク質をコードする核酸クローニング部位と、（３）ポジティブ選別マーカー領域と、（４）牛β−カゼイン遺伝子のエクソン５、６、７、８およびイントロン５、６、７からなり、牛β−カゼイン遺伝子核酸配列に相同である２．８〜３．５ｋｂ長の核酸配列を有する第２領域とを含み、β−カゼイン遺伝子の核酸配列の５’−３’配列において、第１領域が上流（upstream）に該当し、第２領域が下流（downstream）に該当することを特徴とする、牛β−カゼイン遺伝子ターゲッティングベクターに関する。
【００２４】
本発明において、「遺伝子ターゲッティングベクター（gene targeting vector）」とは、ゲノムの特定の遺伝子座に対して目的の遺伝子を除去または挿入することが可能なベクターであって、相同的組み換え（homologous recombination）が起こるようにターゲッティングしようとする特定の遺伝子に相同な塩基配列を含む。本発明の遺伝子ターゲッティングベクターは、目的のタンパク質をコードする核酸配列がゲノム上のβ−カゼイン遺伝子に５’−３’配列で挿入されるβ−カゼインターゲッティングベクターである。「ベクター」と「ベクターカセット」は、同一の意味で使用されており、円形または線形である。本発明の遺伝子ターゲッティングベクターは、牛のβ−カゼイン遺伝子をターゲッティングするベクターである。
【００２５】
本発明の「β−カゼインターゲッティングベクター」は、目的のタンパク質をコードする核酸クローニング部位の左右にβ−カゼイン遺伝子の核酸配列に相同な配列を有する第１領域と第２領域を含む。第１領域はロングアームに該当し、第２領域はショットアームに該当する。
【００２６】
本発明のβ−カゼインターゲッティングベクターの構成要素、特に第１領域と第２領域の選定は、ベクターシステムの効率を決定する重要な要素であって、本発明のベクターは、次の特徴を持つ。
【００２７】
本発明の「第１領域」は、牛β−カゼイン遺伝子のプロモータを有し、このプロモータの前後に位置した牛β−カゼイン遺伝子のエクソン１、２およびイントロン１を含み、牛β−カゼイン遺伝子の核酸配列に相同である５〜１２ｋｂ長の核酸配列を持つ。牛β−カゼイン遺伝子プロモータは、外来タンパク質の発現を効果的に発現させるものと知られており（Kim et al., J Biochem(Tokyo)., 126(2);320-325, 1999）、これは、外来の目的タンパク質を大量生産しようとする本発明の目的に適する。より好ましくは５．５ｋｂ〜１０ｋｂの長さを持つ。
【００２８】
本発明の「第２領域」は、牛β−カゼイン遺伝子のエクソン５、６、７、８およびイントロン５、６、７からなり、牛β−カゼイン遺伝子の核酸配列に相同である２．８〜３．５ｋｂ長の核酸配列を有する第２領域を含む。より好ましくは３．０〜３．２ｋｂ長の核酸配列を持つ。
【００２９】
この際、β−カゼイン遺伝子の核酸配列の５’−３’配列において、第１領域が上流に該当し、第２領域が下流に該当する。
【００３０】
本発明において、「相同（homologous）」とは、第１領域または第２領域とこれに相当するβ−カゼイン遺伝子の核酸配列との同一性の程度を示すもので、少なくとも９０％以上同一であり、好ましくは９５％以上同一である。
【００３１】
本発明の「目的のタンパク質をコードする核酸クローニング部位」とは、特定の制限酵素と認知されて切断される部位であって、切断された部位に、目的のタンパク質をコードする核酸配列が簡便に挿入できる。
【００３２】
前記ベクターのクローニング部位に挿入可能な医学・産業的に有用な目的タンパク質の例には、ホルモン、サイトカイン、酵素、凝固因子、輸送タンパク質、受容体、調節タンパク質、構造タンパク質、転写因子、抗原、抗体などがある。
【００３３】
目的のタンパク質の具体的な例としては、トロンボポエチン、ヒト成長ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、成長ホルモン放出ペプチド、インターフェロン類、インターフェロン受容体類、コロニー刺激因子類、グルカゴン様ペプチド類（ＧＬＰ−１など）、Ｇタンパク連結型受容体、インターロイキン類、インターロイキン受容体類、酵素類、インターロイキン結合タンパク質類、サイトカイン結合タンパク質類、マクロファージ活性因子、マクロファージペプチド、Ｂ細胞因子、Ｔ細胞因子、タンパク質Ａ、アレルギー抑制因子、細胞壊死糖蛋白質、免疫毒素、リンポ毒素、腫瘍壊死因子、腫瘍抑制因子、転移成長因子、α−１抗トリプシン、アルブミン、α−ラクトアルブミン、アポリポタンパク質−Ｅ、赤血球生成因子、高糖鎖化赤血球生成因子、アンギオポエチン類、ヘモグロビン、トロンビン、トロンビン受容体活性ペプチド、トロンボモジュリン、血液因子VII、VIIａ、VIII、IXおよびXIII、プラスミノゲン活性因子、フィブリン結合ペプチド、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、ヒルジン、タンパク質Ｃ、Ｃ−反応性タンパク質、レニンインヒビター、コラゲナーゼ阻害剤、スーパーオキシドジスムターゼ、レプチン、血素板由来成長因子、上皮細胞成長因子、表皮細胞成長因子、アンギオスタチン、アンギオテンシン、骨形成成長因子、骨形成促進タンパク質、カルシトニン、インシュリン、アトリオペプチン、軟骨誘導因子、エルカトニン、結合組織活性因子、組織因子経路抑制剤、濾胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、黄体形成ホルモン放出ホルモン、神経成長因子類、副甲状線ホルモン、レラキシン、セクレチン、ソマトメジン、インシュリン様成長因子、副腎皮質ホルモン、グルカゴン、コレシストキニン、膵臓ポリペプチド、ガストリン放出ペプチド、副腎皮質刺激ホルモン放出因子、甲状線刺激ホルモン、オートタキシン、ラクトフェリン、ミオスタチン、受容体類、受容体拮抗物質、細胞表面抗原、ウィルス由来ワクチン抗原、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体および抗体断片などがあり、これらに制限されるものではない。
【００３４】
本発明において、「選別マーカー（selection marker）」は、遺伝子ターゲッティングベクターで形質転換された細胞を選別するためのものであって、薬物耐性、栄養要求性、細胞毒性剤に対する耐性または表面タンパク質の発現などの選択可能表現型を与えるマーカーが使用でき、ポジティブ選別マーカーとネガティブ選別マーカーがある。
【００３５】
本発明のベクターは、ポジティブ選別マーカーを含む。「ポジティブ選別マーカー」は、選択剤（selective agent）が処理された環境で選択マーカーを発現する細胞のみが生存するようにしてポジティブ選択を可能にするマーカーであって、ネオマイシン（Ｎｅｏ）、ハイグロマイシン（Ｈｙｇ）、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ（ｈｉｓＤ）またはグアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｇｐｔ）などがあるが、これらに制限されるものではない。本発明では、ネオマイシンをポジティブ選別マーカーとして使用した。
【００３６】
また、本発明のベクターは、ネガティブ選別マーカーをさらに含むことができる。「ネガティブ選別マーカー」は、無作為的挿入（random insertion）の行われた細胞を選別して除去するネガティブ選択を可能にするマーカーであって、単純ヘルペスウィルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｈｐｒｔ）、シトシンデアミナーゼ、ジフテリア毒素などがあるが、これらに制限されるものではない。ネガティブ選別マーカーは、第１領域の５’末端側または第２領域の３’末端側に位置する。本発明では、ジフテリア毒素をネガティブ選別マーカーとして使用した。ジフテリア毒素は、チミジンキナーゼと比較していろいろの利点がある。第一に、チミジンキナーゼはｇａｎｃｙｃｌｏｖｉｒ（ＧＡＮＣ）処理を要求するが、これに対し、ジフテリア毒素はいずれの処理も要求しないという点で便利である。第二に、チミジンキナーゼ／ｇａｎｃｙｃｌｏｖｉｒ（ＧＡＮＣ）システムは、チミジンキナーゼ遺伝子のない細胞も死滅する可能性が高いということが既に報告されたことがある（Yoshiyasu Kaneko et al., Cancer Letters, 96;105-110, 1995）。このような点において、ネガティブ選別マーカーとしてジフテリア毒素が有利である。
【００３７】
この際、ポジティブおよびネガティブ選別マーカーは、別個のプロモータ、ｐｏｌｙＡなどを持つことを特徴とする。使用されるプロモータは、例えば猿ウィルス４０（ＳＶ４０）、マウス乳房腫瘍ウィルス（ＭＭＴＶ）プロモータ、ＨＩＶの長い末端反復部（ＬＴＲ）プロモータ、モロニーウィルス、シトメガロウィルス（ＣＭＶ）プロモータ、エプスタインバーウィルス（ＥＢＶ）プロモータ、ＲＳウィルス（Respiratory Syncytical Virus、ＲＳＶ）プロモータ、ＲＮＡポリメラーゼIIプロモータ、β−アクチンプロモータ、ヒトヘモグロビンプロモータ、ヒト筋肉クレアチンプロモータなどがあるが、これらに制限されるものではない。
【００３８】
前記ベクターとゲノム上のβ−カゼイン遺伝子の相同的組み換えが起こると、ベクター上の目的のタンパク質をコードする核酸が宿主細胞のβ−カゼインゲノム遺伝子に統合（integration）され、宿主細胞のβ−カゼインプロモータによってβ−カゼインタンパク質の代わりに発現される。
【００３９】
本発明の牛β−カゼインベクターは、細胞内で相同的組み換えの効率を高めるために、次の特徴を持つ。
【００４０】
ゲノム上の特定の遺伝子と目的のタンパク質をコードする核酸配列が相同的組み換えによって統合される効率は、ターゲッティングベクターシステム、特に２つの組み換え配列間の同一程度と相同標的配列の長さに多く左右される（Scheerer et al., Mol Cell Biol., 14(10)6663-6673, 1994; Thomas et al., Cell, 51(3);503-512, 1987; Hasty et al., Mol Cell Biol., 11(11);5586-5591, 1991; Lu et al., Blood, 102(4);1531-1533, 2003）。本発明は、このような点を考慮し、第１領域と第２領域の相同標的部位と長さを最適化した。また、本発明のベクターは、ゲノムの牛β−カゼイン遺伝子と本発明のベクターを整列したとき、ポジティブ選別マーカー位置に該当する領域、例えばエクソン３〜４、イントロン２〜４に該当する部分がベクターに含まれないように操作して、相同的組み換えの際にゲノムとベクターの整列時の空間的な妨害を最小化した。また、第１領域が終わる部位に目的のタンパク質を挿入するＭＣＳを置くようにして、目的のタンパク質を第１領域の任意の位置に挿入させる既存の方法に比べて遺伝的操作を便利にした。また、本発明のベクターは、相同領域が目的の遺伝子およびポジティブ選別マーカーを中心として左右にのみ存在するようにして交差地点が２つのみ生成されるようにした。これに反し、第２領域の任意の位置に目的のタンパク質を挿入させる既存の方法（SHEN Wei et al., Chinese Journal of Biotechnology, 20(3);361-365, 2004）によれば、交差地点が３つ発生するので、ターゲッティングされたクローンの選別に難しさが伴って効率も減少する。
【００４１】
上述した特徴を有する本発明のベクターシステムを利用する場合、β−カゼイン遺伝子が全く発現されない牛の体細胞においても効率よく相同的組み換えが誘導され、牛ゲノム上のβ−カゼイン遺伝子と目的のタンパク質をコードする核酸を安定的に統合させた。
【００４２】
本発明の具体的な様態において、β−カゼインターゲッティングベクターとして、ｐＢＣＫＩI、ｐＢＣＫＩIIベクター、および前記ベクターにネガティブ選別マーカーをさらに含むｐＢＣＫＩＤＴI、ｐＢＣＫＩＤＴIIベクターを製造した。
【００４３】
ｐＢＣＫＩIは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIＳＫ（＋）プラスミド骨格の１８．８ｋｂ長を有するベクターであって、牛β−カゼイン遺伝子プロモータを含む８ｋｂとエクソン１、イントロン１およびエクソン２を有する合計１０ｋｂ程度の第１領域を有する。第２領域は、３．１ｋｂ程度の長さを有し、牛β−カゼイン遺伝子のエクソン５、６、７、８、イントロン５、６、７、８およびイントロン断片４、８を含む。また、ｐＢＣＫＩIはｎｅｏ選別マーカー領域を持つ。ｐＢＣＫＩIベクターは、ＳａｃII、ＮｏｔIおよびＢａｍＨIの３つの制限酵素部位を有し、この制限酵素部位に目的のタンパク質をコードする遺伝子を簡便に挿入することができる（図１）。
【００４４】
ｐＢＣＫＩIIは、ｐＧＥＭ７Ｚｆ（＋）プラスミド骨格の１４．８ｋｂ長さを有するベクターであって、牛β−カゼイン遺伝子プロモータを含む４ｋｂ、エクソン１、イントロン１およびエクソン２を有する合計６ｋｂ程度の第１領域を持つ。第２領域は、３．１ｋｂ程度の長さを有し、牛β−カゼイン遺伝子のエクソン５、６、７、８とイントロン５、６、７とイントロン断片４、８を含む。また、ｐＢＣＫＩIは、ｎｅｏ選別マーカー領域を持つ。ｐＢＣＫＩIベクターは、ＳａｃII、ＮｏｔIおよびＢａｍＨIの３つの制限酵素部位を有し、この制限酵素部位に、目的のタンパク質をコードする遺伝子を簡便に挿入することができる（図２）。
【００４５】
ｐＢＣＫＩＤＴI、ｐＢＣＫＩＤＴIIベクターは、それぞれｐＢＣＫＩI、ｐＢＣＫＩIIベクターのＸｈｏIおよびＳａｌI部位に１．３ｂｋｂ ＤＴ遺伝子を挿入して製作した。
【００４６】
前記ベクター製作は、当該技術分野でよく知られている遺伝子組み換え技術を用いて製造することができ、部位特異的ＤＮＡの切断および連結は、当該技術分野で一般に知られている酵素などを使用する。
【００４７】
前記製作したベクターにヒトトロンボポエチン（ＴＰＯ）遺伝子を挿入した（図１７、図１８、図１９）。０．３ｋｂ牛成長ホルモン（ｂＧＨ）の付いた１ｋｂヒトトロンボポエチン（ＴＰＯ）遺伝子ｃＤＮＡを製作した（Sohn et al., DNA Cell Biol., 18(11);845-852, 1999）。牛成長ホルモンは、ｍＲＮＡを安定的に発現させるために挿入された。ヒトトロンボポエチンは、血素板の生産に関与する巨核細胞（megakaryocyte）の増殖と分化のような巨核細胞発生の重要な調節因子中の一つである。血素板生産の主要な調節因子として、巨核細胞の分化と成熟を促進させる中枢的な役割をする。過度な化学療法と骨髄利殖手術を経た患者は、激しい好中球減少症（neutropenia）と血素板減少症を示す（Lok et al., Stem Cells, 12(6);586-598, 1994; Kaushansky et al., Stem Cells, 15(1);97-102, 102-103, 1997; Kaushansky et al., Ann Intern Med., 126(9);731-733, 1997; Kaushansky et al., Leukemia, 11(3);426-427, 1997; Kaushansky et al., Annu Rev Med., 48;1-11, 1997）。実験動物モデルにおいて、組み換えトロンボポエチン（ＴＰＯ）タンパク質は、血素板減少症を軽減させるものと確認され、治療の目的として使用できる明確な可能性を示した。トロンボポエチン（ＴＰＯ）遺伝子は、ｐｈａｓｅ１臨床実験で安定性と効能が検定された（Fanucchi et al., N Engl J Med., 336(6);404-409, 1997; Basser et al., Lancet., 348(9037);1279-1281, 1996; O'Malley et al., Blood, 88(9);3288-3298, 1996）。また、トロンボポエチン遺伝子は、抗癌化学療法を受けている骨髄抑制（myelosuppressed）患者の血素板生産能力を回復させるために使用できるということが明らかになった。
【００４８】
その中でも、ｐＢＣＴＰＯＫＩＤＴIIを大腸菌（Escherichia coli）に導入し、２００５年１０月１７日にＫＣＴＣ（Korea collection for Type Cultures）（韓国大田市儒城區魚隠洞５２番地の韓国生命工学研究院）に寄託番号第ＫＣＴＣ １０８６４ＢＰ号で寄託した。
【００４９】
前記ベクターのうち、第１領域が約６ｋｂ長さを有するｐＢＣＫＩIIがｐＢＣＫＩIベクターよりゲノムのβ−カゼイン遺伝子にターゲッティングされる効率が高かった。そして、ネガティブ選別マーカーを有するｐＢＣＫＩＤＴIIベクターがｐＢＣＫＩIIより約４倍〜５倍程度増加したターゲッティング効率を持つ。ｐＢＣＴＰＯＫＩＤＴIIベクターは、牛胚芽線維芽細胞（bovine fetal fibroblasts）を３６．６％、牛耳組織線維芽細胞（bovine ear skin fibroblasts）を４１．４％の効率で遺伝子ターゲッティングさせたが、これは、既存のＧｏａｔ ｆｅｔａｌ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ（SHEN Wei et al., Chinese Journal of Biotechnology, 20(3);361-365, 2004）における１２．７％遺伝子ターゲッティング効率より約３．３倍（４１．４％／１２．７％）程度優れた。これにより、本発明のベクターシステムは、牛体細胞のβ−カゼイン遺伝子に目的の遺伝子を高効率で打ち込むことが可能な高効率のベクターであることを証明した。
【００５０】
別の様態において、本発明は、前記ベクターで遺伝子ターゲッティングされた牛の体細胞に関する。
【００５１】
本発明のベクターでターゲッティングされる細胞は、牛から由来する１次、２次または永久細胞である。好ましくは、前記細胞は、牛、羊、山羊、豚、馬、ウサギ、犬、猿などから由来するが、これらに制限されるものではない。細胞を分離または活性化し得る有用な組織としては、肝、腎臓、脾臓、骨、骨髄、胸腺、心臓、筋肉、肺臓、脳、精素、卵巣、膵島（islet）、内臓、骨髄、耳、皮膚、胆汁組織、前立腺、膀胱、胚芽（embryo）、免疫系および造血系などがあるが、これらに制限されるものではない。細胞タイプは、線維芽細胞、上皮細胞、神経細胞、胚芽細胞、肝細胞、および濾胞細胞などがあるが、これらに制限されるものではない。好ましくは、線維亜細胞または耳組織細胞である。本発明の具体的な実施例によって、胚芽線維芽細胞より耳組織線維芽細胞においてベクターの遺伝子ターゲッティング効率がさらに高かった。
【００５２】
前記細胞内に本発明のベクターを導入する方法は、核酸を細胞内に導入するいずれの方法も含み、当該分野で公知になっているように、適切な標準技術を選択して行うことができる。エレクトロポレーション（electroporation）、リン酸カルシウム共沈（calcium phosphate co-precipitaion）、レトロウィルス感染（retroviral infection）、マイクロインジェクション（microinjection）、ＤＥＡＥ−デキストラン（DEAE-dextran）、陽イオンリポソーム（cationic liposome）法などがあり、これらに制限されるものではない。この際、円形のベクターを適切な制限酵素で切断し、線形のベクターの形態またはプラスミドを除去した線形のベクターの形態で導入することが好ましい。
【００５３】
本発明の具体的な実施では、牛胚芽線維芽細胞（ｂＥＴ）と牛耳組織線維芽細胞（ｂＥＳＦ）に、ヒトトロンボポエチン（ｈＴＰＯ）遺伝子が挿入されたβ−カゼインターゲッティングベクターを、リポフェクタミンＴＭ２０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（登録商標）を使用する陽イオンリポソーム法を用いてターゲッティングした。陽イオンリポソームは、（−）電荷を有するＤＮＡと効率よく結合して細胞膜に結合することによりＤＮＡの中性化を成し、結局ＤＮＡは細胞内に導入される。そして、ベクターがゲノムのβ−カゼイン遺伝子に正確にターゲッティングされたか否かは、抗生剤に抵抗性を持って生き残った細胞のゲノムＤＮＡをｌｏｎｇ ｒａｎｇｅ ＰＣＲとサザンブロットによって確認した。このような過程により、牛の体細胞から、ヒトトロンボポエチン（ｈＴＰＯ）遺伝子がゲノムのβ−カゼイン遺伝子に正確にターゲッティングされた細胞株を製造することができた。その中でも、牛耳組織線維芽細胞にｐＢＣＴＰＯＫＩIIベクターがターゲッティングされた８１番の細胞株をＢＣＴＰＯＫＩｂＥＳＦ８１と命名し、ＫＣＴＣ（韓国大田市儒城區魚隠洞５２番地）に２００４年１１月１０日付で第ＫＣＴＣ １０７２０ＢＰ号で寄託した。
【００５４】
別の様態において、本発明は、牛体細胞を用いた核移植により得られた受精卵に関する。
【００５５】
本発明において、「核移植（nuclear transfer）」とは、細胞の核を、既に核を除去した卵子に入れて移植させることを意味し、このように核移植された受精卵を着床させて生まれた個体は、核供与細胞の遺伝的物質がレシピエント細胞質にそのまま伝達されたため、遺伝的に全く同一の複製個体である。
【００５６】
別の様態において、本発明は、（１）牛β−カゼイン遺伝子ターゲッティングベクターで牛の体細胞を形質転換させる段階と、（２）牛の体細胞を培養して相同的組み換えを誘導する段階と、（３）相同的組み換えによって、牛β−カゼイン遺伝子がターゲッティングされた牛の体細胞を選別する段階とを含む、牛β−カゼイン遺伝子がターゲッティングされた牛の体細胞を製造する方法に関する。
【００５７】
本発明の牛β−カゼイン遺伝子ターゲッティングベクター、具体的にｐＢＣＫＩI、ｐＢＣＫＩII、ｐＢＣＫＩＤＴIおよびｐＢＣＫＩＤＴIIは、牛β−カゼイン遺伝子ターゲッティングに最適化されたベクターなので、前記ベクターを用いる場合、β−カゼイン遺伝子がターゲッティングされた牛の体細胞製造効率を高めることができる。
【００５８】
また、β−カゼイン遺伝子がターゲッティングされた牛の体細胞を製造する際に効率を増加させるために、（１）段階で円形のベクターの形で形質転換させるのではなく、制限酵素でベクターを切断して線形のベクターの形で形質転換させ、或いは本発明のベクター骨格からプラスミド骨格を除去した線形のベクターの形で形質転換させた。
【００５９】
別の様態において、本発明は、（１）前記牛β−カゼイン遺伝子ターゲッティングベクターで牛の体細胞を形質転換させる段階と、（２）前記牛の体細胞を培養して相同的組み換えを誘導する段階と、（３）相同的組み換えによって、牛β−カゼイン遺伝子がターゲッティングされた牛の体細胞を選別する段階と、（４）牛卵子の核を除去し、遺伝子ターゲッティングされた細胞を導入して、体細胞核移植による受精卵を製造する段階と、（５）受精卵を着床させる段階とを含む、形質転換牛を製造する方法に関する。
【００６０】
上述したように、本発明のベクターは、牛のβ−カゼイン遺伝子へのターゲッティングが最適化されたベクターなので、形質転換牛の製造に適する。
【００６１】
卵子の遺伝物質を除去する方法には、物理的な方法、化学的な方法、サイトカラシン（Cytochalasin）Ｂを使用した遠心分離法などがある（Tatham et al., Hum Reprod., 11(7);1499-1503, 1996）。本発明では、ガラスマイクロピペット（glass micropipette）を用いた物理的な核除去方法を使用した。
【００６２】
遺伝子ターゲッティングされた体細胞は、細胞膜融合法、細胞質内微細注入法などを用いて、核の除去された卵子内に導入される。細胞膜融合法は、簡単でありながら、大規模受精卵の生産に適するという利点があり、細胞質内微細注入法は、核と卵子内物質との接触を極大化させるという利点がある。
【００６３】
体細胞と核除去卵子との融合は、電気刺激によって細胞膜の粘度を変化させて融合させる方法によって組み換える。この際、微細電流・電圧を自由に調整することが可能な電気融合器を利用すれば便利である。
【００６４】
別の様態において、本発明は、（１）前記本発明に係るベクターで動物の体細胞を形質転換させる段階と、（２）相同的組み換えによって、目的のタンパク質がターゲッティングされた細胞を選別する段階と、（３）遺伝子ターゲッティングされた細胞を核の除去された動物の胚芽に導入する段階と、（４）形質転換動物を製造するために、ミルク生産動物に受精卵を着床させる段階と、（５）形質転換動物からミルクを生産する段階を含む、ミルクから目的のタンパク質を生産する方法に関する。
【００６５】
核移植された受精卵は、活性化させて移植可能な段階まで発生させた後、代理母に着床される。
【００６６】
複製受精卵の活性化は、受精卵が分裂し得るように成熟過程で一時的に停止された細胞周期をさらに稼動させることを意味する。複製受精卵の活性化のためには、細胞周期停止要素、例えばＭＰＦ、ＭＡＰキナーゼなどの細胞信号伝達物質の活性を低下させなければならないが、このためには、複製受精卵内のカルシウムイオンの増加が必須的である。大きくは、電気的刺激によって細胞膜透過度を変形して細胞外からカルシウム流入を急激に増加させる方法と、イノマイシン（ionomycin）および６−ＤＭＡＰなどの化学的物質を用いて細胞周期停止要素の活性を直接阻害させる方法などがあるが、これらの方法は、単独でまたは組み合わせて使用する。本発明では、イノマイシンと６−ＤＭＡＰを処理して卵子を活性化させ、胚盤胞発達段階まで体外培養した。
【００６７】
その後、生まれた個体は、授乳期にβ−カゼインの代わりに目的のタンパク質を発現する形質転換牛である。すなわち、前記β−カゼイン遺伝子ターゲッティングベクターが、ターゲッティングされた細胞を用いて核移植された受精卵を着床させて形質動物を作る場合、副作用、例えば動物の発達障害なしに目的のタンパク質を形質転換牛のミルクから大量で収得することができる。
【００６８】
別の様態において、本発明は、前記方法によって製造された形質転換牛のミルクから目的のタンパク質を収得する方法に関する。
【００６９】
形質転換牛のミルクで過多発現される目的のタンパク質は、通常の方式で精製できる。塩析（例えば、硫酸アンモニウム沈澱、リン酸ナトリウム沈澱など）、溶媒沈澱（例えば、アセトン、エタノールなどを用いたタンパク質分画沈殿）、透析、ゲル濾過、イオン交換、逆相カラムクロマトグラフィなどのカラムクロマトグラフィおよび限外濾過などの技法を単独でまたは組み合わせて適用させ、本発明の目的タンパク質を得ることができる（Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.(1982); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989); Deutscher, M., Guide to Protein Purification Methods Enzymology, vol. 182. Academic Press. Inc., San Diego, CA(1990)）。
【００７０】
以下、下記実施例によって本発明をさらに詳しく説明する。但し、下記実施例は、本発明を例示するためのものに過ぎず、本発明の範囲を限定するものではない。
【００７１】
〔実施例１：牛β−カゼイン遺伝子ターゲティングベクターの製作〕
〔１−１ ｐＢＣＫＩIとｐＢＣＫＩIIベクターの製作〕
遺伝子ターゲッティングベクターの製作のために、ミルクにおいて外来治療タンパク質遺伝子の発現を誘導すると知られている牛β−カゼインプロモータ部位を含んでいる牛β−カゼイン遺伝子を利用した。
【００７２】
ｐＢＣ１０ベクター（図９）は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIＳＫ（＋）プラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）ベクター内に牛β−カゼイン遺伝子５’側塩基配列８ｋｂプロモータ、エクソン１、２ｋｂイントロン１およびエクソン２の５’ＵＴＲを含む（Sohn et al., J Biotechnol., 103(1);11-19, 2003）。ｐＢＣ１０ベクターのβ−カゼイン遺伝子部位は、本発明のベクター、すなわちｐＢＣＫＩIおよびｐＢＣＩＫＩIIのロングアーム（第１領域に該当）として使用された。図１０に示すように、１０ｋｂβ−カゼイン遺伝子をＳａｃIとＳａｃII制限酵素で切断し、これをｐＢＣＫＩIベクターの第１領域として使用した（図１０と図１４）。ＡａｔIIとＳａｃII制限酵素で切断された牛β−カゼイン遺伝子の４ｋｂプロモータ、解読されないエクソン１、２およびイントロン１を含む６ｋｂβ−カゼインプロモータ部位は、ｐＢＣＫＩIIのロングアーム（第１領域に該当）として使用した（図１１および図１４）。
【００７３】
ｐＢＣ３．１ベクター（図１２）は、本発明の第２領域に該当する部位を含む。牛ゲノムＤＮＡからエクソン５、６、７、８とイントロン５、６、７とイントロン切片４、８を含んでいる牛β−カゼイン遺伝子塩基配列４６７６〜７８９８の３．２ｋｂ断片をＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ反応のために使用されたプライマーの塩基配列は、次の通りである。
配列番号１順方向プライマー：５’−attcagtcgagtggaacataaactttcagcc−３’
配列番号２逆方向プライマー：５’−catatgtcgactgtgagattgtattttgact−３’
太字（配列番号１によって示される配列においては、５’末端から数えて第７および８番目のｔおよびｃが「太字」に相当し、配列番号２によって示される配列においては、５’末端から数えて第９および１１番目のｇおよびｃが「太字」に相当する）は、ＸｈｏI、ＳａｌI制限酵素部位を作るために変わった塩基を示す。
【００７４】
ＰＣＲ産物（図１２）は、ＸｈｏIとＳａｌI制限酵素によって切断した後、ｐＧＥＭ−Ｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）ベクターのＳａｌI部位に連結した。ｐＢＣ１０ベクターに挿入するための適切な制限酵素部位を作るために、ｐＧＥＭ−Ｔベクター内にある３．２ｋｂ牛β−カゼイン遺伝子断片をＨｉｎｃIIとＳａｌI制限酵素を用いて切断した。そのβ−カゼイン遺伝子３．１ｋｂ断片は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIＳＫ（＋）のＳａｌI部位に連結し、その結果、ＢＣ３．１ベクターを完成した。
【００７５】
選別マーカーとして用いられるｎｅｏ遺伝子断片をｐＢＣ１０ベクターに挿入した。ＳＶ４０ｏｒｉ、初期プロモータ、ＳＶ４０初期スプライシング部位およびポリアデニル化部位を含むｎｅｏ遺伝子断片を得るために、ｐＭＡＭｎｅｏ（ＣＬＯＮＴＨＥＣＨ）ベクターを使用した。ｐＭＡＭｎｅｏをＢａｍＨI制限酵素で切断して得た２．７ｋｂ ＤＮＡ断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIＳＫ（＋）のＢａｍＨI部位に連結し、連結されたベクター内にある２ｋｂｎｅｏ遺伝子断片をＢｇｌIIとＢａｍＨI制限酵素で切断した後、ｐＳＰ７３（Ｐｒｏｍｅｇａ）ベクターのＢｇｌII部位に連結した。最後に、ｐＳＰ７３内にある２ｋｂｎｅｏ遺伝子断片は、ＢｌｇIIとＥｃｏＲＶ制限酵素で切断した後、０．７ｋｂ ｐＭＡＭｎｅｏ遺伝子断片を持っているｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIＳＫ（＋）のＢｇｌIIとＥｃｏＲＶ部位にさらに連結した。このようなＤＮＡ切断および連結過程は、ｐＢＣ１０ベクター内に２．７ｋｂｎｅｏ遺伝子断片を挿入するために要求された（図１４）。
【００７６】
図１４に示すように、ｐＢＣＫＩI、ｐＢＣＫＩIIベクターカセットは、ｐＢＣ１０ベクター内にｐｎｅｏ２．７とｐＢＣ３．１の遺伝子断片を組み込むことにより完成した。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIＳＫ（＋）内にあるｎｅｏ遺伝子をＢａｍＨI、ＥｃｏＲV制限酵素で切った後、ｐＢＣ１０ベクターのＢａｍＨI、ＥｃｏＲV制限酵素部位に連結した。ｐＢＣ３．１ベクターは、ＥｃｏＲV、ＳａｌI制限酵素で切断した後、ｐＭＡＭｎｅｏ遺伝子断片を持っているｐＢＣ１０ベクターのＥｃｏＲV、ＳａｌI認識部位に連結し、その結果ｐＢＣＫＩIベクターを完成した。ｐＢＣＫＩIベクターカセットをＡａｔII、ＳａｌI制限酵素で切断した後、ｐＧＥＭ−７Ｚｆ（Ｐｒｏｍｅｇａ）のＡａｔII、ＸｈｏI認識部位に連結し、その結果ｐＢＣＫＩIIベクターカセットを完成した。
【００７７】
〔１−２ ｐＢＣＫＩＤＴIとｐＢＣＫＩＤＴIIベクターの製作〕
前記で製作したベクターにネガティブ選別マーカー（negative selection marker）としてのＤＴ遺伝子が挿入されたベクターを製作しようとした（図３と図１６）。ネガティブ選別マーカーを持つｐＢＣＫＩＤＴI、ｐＢＣＫＩＤＴIIベクターを用いる場合、無作為的にベクターが細胞に挿入された場合、細胞は死滅するので、遺伝子ターゲッティングされた細胞のみを選別することが可能な効率を高められる（図３と図１６）。本発明に使用されたＤＴ遺伝子は、Ｌｅｘｉｃｏｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｔｈｅ Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ、Ｔｅｘ．）社のｐＫＯ ＳｅｌｅｃｔＤＴベクターカセットから由来した。制限酵素ＲｓｒIIを使用することにより、ＳＶ４０ＰｏｌｙＡとＲＮＡポリメラーゼIIプロモータと共にジフテリア毒素Ａ鎖（ＤＴ）遺伝子が選別された。選別されたＤＴ遺伝子をｋｌｅｎｏｗ ｆｉｌｌｉｎｇした後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIＫＳ（＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＨｉｎｄII部位に挿入することにより、ｐＫＳ ＤＴベクターを完成した。ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIＫＳ（＋）にあるＤＴ遺伝子をＸｈｏIとＥｃｏＲVで切断した後、ｐＳＰ７３（Ｐｒｏｍｅｇａ）ベクターのＸｈｏIとＰｖｕII部位に挿入することにより、ｐＳＰ７３ ＤＴベクターを完成した（図１５）。ｐＳＰ７３ ＤＴベクターに挿入されているＤＴ遺伝子は、ＸｈｏIとＳａｌI遺伝子によって選別した後、ｐＢＣＫＩIベクターカセットのＳａｌI部位に挿入することにより、ｐＢＣＫＩＤＴIベクターカセットを完成した。完成したｐＢＣＫＩＤＴIベクターカセットをＡａｔIIとＳａｌIで切った後、ｐＧＥＭ−７Ｚｆ（＋）（Ｐｒｏｍｅｇａ）ベクターのＡａｔIIとＸｈｏI部位に挿入することにより、ｐＢＣＫＩＤＴIIベクターカセットを完成した（図１６）。
【００７８】
ＰＣＲによって合成または連結されたＤＮＡ断片を酵素マッピング（enzyme mapping）およびシーケンシングして前記β−カゼインターゲッティングベクターが正確に製作されたかを確認した。
【００７９】
〔実施例２：牛β−カゼイン遺伝子ターゲティングベクターへのヒトトロンボポエチン遺伝子の挿入〕
図１７、図１８および図１９に示すように、３００ｂｐ牛成長ホルモン遺伝子と共に、１ｋｂヒトトロンボポエチン（ｈＴＰＯ）遺伝子をｐＢＣＫＩI、ｐＢＣＫＩIIおよびｐＢＣＫＩＤＴIIベクターカセットに挿入した。ＳａｃIIとＮｏｔI制限酵素部位を持っているその１．３ｋｂ外来遺伝子をｐＢＣＫＩI、ｐＢＣＫＩII、ｐＢＣＴＰＯＫＩＤＴIIベクターのＳａｃIIとＮｏｔI制限酵素部位に連結し、その結果、ｐＢＣＴＰＯＫＩI、ｐＢＣＴＰＯＫＩIIおよびｐＢＣＴＰＯＫＩＤＴIIベクター構造物を完成した（図１７、図１８および図１９）。その中でも、ｐＢＣＴＰＯＫＩＤＴIIを大腸菌（Escherichia coli）に導入して２００５年１０月１７日にＫＣＴＣ（韓国大田市儒城區魚隠洞５２番地の韓国生命工学研究院）に寄託番号第ＫＣＴＣ １０８６４ＢＰ号で寄託した。
【００８０】
〔実施例３：ｐＢＣＴＰＯＫＩI、ｐＢＣＴＰＯＫＩII、ｐＢＣＴＰＯＫＩＤＴIIの牛胚芽線維芽細胞（ｂＥＦ）と牛耳組織線維芽細胞（ｂＥＳＦ）内への導入〕
〔３−１ 線形ベクターの導入〕
プラスミドＤＮＡであるｐＢＣＴＰＯＫＩIとｐＢＣＴＰＯＫＩIIを「ＱＩＡｆｉｌｔｅｒ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｄｉ ｋｉｔｓ」（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製した後、円形ＤＮＡをＣｓＣｌ−エチジウムブロマイドグラジエント（CsCl-ethidium bromide gradient）による平衡遠心分離を用いて分離した。分離されたｐＢＣＴＰＯＫＩIとｐＢＣＴＰＯＫＩIIプラスミドをそれぞれ制限酵素ＳａｌI（図２０）とＡａｔII（図２１）で切って線形化した。エタノール沈澱過程によって精製されたＤＮＡの濃度を分光光度計（spectrophotometer）を用いて測定した。
【００８１】
線形化されたｐＢＣＴＰＯＫＩIとｐＢＣＴＰＯＫＩII構造物を継代２または３のｂＥＦとｂＥＳＦ細胞にリポフェクタミン２０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（商標登録）を用いて導入した。ＢＥＦは、各２、４、１０μｌ濃度のトランスフェクション試薬と２、４μｇＤＮＡ濃度別にトランスフェクションをテストした。ＢＥＳＦは、各２、４、１０μｌ濃度のトランスフェクション試薬と１、２、４μｇＤＮＡ濃度別にトランスフェクションをテストした。細胞は、トランスフェクション試薬−ＤＮＡ複合体に２４時間露出させた。
【００８２】
ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、０．００１％ゲンタマイシン（Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、１％ＭＥＭ非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）組成の培養液で５％ＣＯ２、３７℃の条件で細胞を培養した。培養液は毎日取り替えた。培養液の分量は、下記表のとおり、細胞培養容器に応じて調節した。
【００８３】
【表１】
【００８４】
コンフルアンスに達するまで成長した細胞は、１×トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）溶液を用いて３７℃の条件で３分間置いて細胞を培養容器から分離した後、ＤＰＢＳ（Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline）（Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて細胞を２回洗浄した。１×トリプシン−ＥＤＴＡ処理によって容器から分離した細胞株をゆっくりピペットしてそれぞれの細胞に解離した後、より広い培養容器に移して増殖させた。使用する１×トリプシン−ＥＤＴＡ溶液の分量は、下記表のとおり、培養容器のタイプに応じて異にした。
【００８５】
【表２】
【００８６】
実験順序は、次のとおりである：
【００８７】
【表３】
【００８８】
９６ウェル培養容器上でコンフルアンスに達するまで成長した細胞を４８ウェル培養容器に継代培養した後、漸次２４ウェル、１２ウェル、６ウェルおよび１００ｍｍの培養容器に移して培養した。６ウェル培養容器で、細胞の半分はＰＣＲ反応のために使用し、残りは６ウェル培養容器の２つのウェルに分けて培養した。
【００８９】
〔３−２ プラスミド部分を除去した線形ベクターの導入〕
ｐＢＣＴＰＯＫＩII、ｐＢＣＴＰＯＫＩＤＴIIベクター構造物において制限酵素ＡａｔIIとＣｌａIを用いてベクターからプラスミド部分を除去し線形化させた後、前記の方法と同様に牛耳組織線維芽細胞（ｂＥＳＦ）と牛胚芽線維芽細胞（ｂＥＦ）に形質転換させた（図２２と図２３）。
【００９０】
〔実施例４：それぞれの細胞株に対するＰＣＲ分析〕
Ｇ４１８抗生剤に抵抗性を有するそれぞれの細胞株に対して外来遺伝子導入有無または形質転換有無を確認するためにＰＣＲ分析を行った。「ＡｃｃｕＰｒｅｐ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ」（Ｂｉｏｎｅｅｒ）を用いて、６ウェル培養容器で培養された細胞の半分からゲノムＤＮＡを抽出し、「ＡｃｃｕＰｏｗｅｒ ＰＣＲ Ｐｒｅｍｉｘ」（Ｂｉｏｎｅｅｒ）を用いてＰＣＲを行った。ヒトトロンボポエチン遺伝子（ｈＴＰＯ）に対するプライマーセットと温度サイクリング（thermal cycling）条件は、次のとおりである。
配列番号３順方向プライマー：GGA GCT GAC TGA ATT GCT CCT CGT
配列番号４逆方向プライマー：CCT GAC GCA GAG GGT GGA CCC TCC
【００９１】
【表４】
【００９２】
ＰＣＲ結果より、Ｇ４１８抗生剤に抵抗性を有する大部分の細胞株は形質転換セルであることが分かった（図２５）。
【００９３】
〔実施例５：遺伝子ターゲッティング有無確認のためのＬｏｎｇ−ｒａｎｇｅ ＰＣＲ分析〕
形質転換された細胞株の中で遺伝子ターゲッティングされた細胞株を確認するために、Ｌｏｎｇ−ｒａｎｇｅ ＰＣＲを行った。形質転換細胞株のゲノムＤＮＡは、「ＡｃｃＰｒｅｐ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ」（Ｂｉｏｎｅｅｒ）を用いて抽出し、あるいは約５つ程度の細胞を液体窒素に約１分間浸漬した後、沸かし湯に約１分間浸漬する過程を３〜４回繰り返し行うことで細胞を分解し、ＤＮＡを露出させた。Ｌｏｎｇ−ｒａｎｇｅ ＰＣＲは、「ＡｃｃｕＰｏｗｅｒ ＨＬ ＰＣＲ Ｐｒｅｍｉｘ」（Ｂｉｏｎｅｅｒ）を用いて行った。
【００９４】
図７に示すように、ベクター構造物内にあるｎｅｏ遺伝子の３’末端に結合するように５’プライマーを準備し、３’プライマーは、ベクター構造物には含まれない内生的牛β−カゼインのイントロン８に結合するように準備した。遺伝子ターゲッティングされた細胞株は、１％アガロースゲルで４ｋｂＰＣＲ産物によって確認可能である。プライマーセットの塩基配列と温度サイクリング条件は次のとおりである。
配列番号５順方向プライマー：５’−ccacacaggcatagagtgtctgc−３’
配列番号６逆方向プライマー：５’−ccacagaattgactgcgactgg−３’
【００９５】
【表５】
【００９６】
実施例３−１と実施例３−２の方法によって遺伝子ターゲッティング有無とその効率を比較した。
【００９７】
実施例３−１の方法によるｌｏｎｇ−ｒａｎｇｅ ＰＣＲ分析の結果、２つの細胞クローンが遺伝子ターゲッティングされたことを確認することができた（図２８）。
【００９８】
実施例３−１の方法によってベクターを形質転換させる場合の効率は、次のとおりである。ｐＢＣＴＯＫＩIベクターが導入された体細胞のうち、合計４１個の細胞株を選別し、その中で３８個（９３％）の細胞株が形質転換されたと確認され、遺伝子ターゲッティングされた細胞株（０％）は得ることができなかった。また、実施例３−１の方法で形質転換させた場合、ｐＢＣＴＰＯＫＩIIベクターが導入された体細胞のうち、合計３１個の細胞株を選別し、その中で２９個（９４％）が形質転換されたと確認され、２個（７％）の遺伝子ターゲッティングされた細胞株を得ることができた（表６および図２８）。
【００９９】
【表６】
【０１００】
実施例３−２の方法によってベクターを形質転換させる場合の効率は、次のとおりである。ｐＢＣＴＰＯＫＩII、ｐＢＣＴＰＯＫＩＤＴIIをｂＥＦとｂＥＳＦ細胞に導入（transfection）した後、遺伝子ターゲッティング有無をｌｏｎｇ−ｔｅｍｐｌａｔｅ ＰＣＲによって確認した。少量のＤＮＡサンプルに対して第２ＰＣＲを行った（図２７と図２９）。
【０１０１】
第２ＰＣＲは、同一の条件にプライマーセット：５’−ttcactgcattctagttgtggtttgtcca−３’（配列番号８）；５’−tctaggaccaaacatcggcttactt−３’（配列番号９）を使用した。第２ＰＣＲまで行われた、遺伝子ターゲッティングされた細胞株は、３．４ｋｂ位置にバンド（band）を示す。
【０１０２】
図２９において、Ａは、ｂＥＳＦ細胞にｐＢＣＴＰＯＫＩＤＴIIベクターをトランスフェクションした細胞株に対するｌｏｎｇ−ｔｅｍｐｌａｔｅトＰＣＲの結果であり、５、３０、１７、１８、２０、２１、２６番の細胞株が遺伝子ターゲッティングされたことを示す。Ｂは、ｂＥＳＦ細胞にｐＢＣＴＰＯＫＩIIベクターをトランスフェクションした細胞株に対するｌｏｎｇ−ｔｅｍｐｌａｔｅ ＰＣＲ結果であり、１６番細胞株が遺伝子ターゲッティングされたことを示す。Ｃは、ネガティブコントロール（−）として使用された牛のゲノムＤＮＡとポジティブコントロール（＋）として使用されたｐｎｅｏＢＣ３．７に対するｌｏｎｇ−ｔｅｍｐｌａｔｅ ＰＣＲ結果である。
【０１０３】
ｐＢＣＴＰＯＫＩIIベクターとｐＢＣＴＰＯＫＩＤＴIIベクターをｂＥＦとｂＥＳＦ細胞にトランスフェクションさせた後、遺伝子ターゲッティング効率を比較した。その結果、ｐＢＣＴＰＯＫＩIIベクターがトランスフェクションされたｂＥＦ細胞における遺伝子ターゲッティング比率は１８．２％（１０／５５）であるが、これに対し、ｐＢＣＴＰＯＫＩＤＴIIベクターがトランスフェクションされたｂＥＦ細胞における遺伝子ターゲッティング比率は４１．４％（１２／２９）であって、ｐＢＣＴＰＯＫＩIIより遺伝子ターゲッティング効率が約２．３（４１．４％／１８．２％）倍高かった。また、ｐＢＣＴＰＯＫＩIIベクターがトランスフェクションされたｂＥＳＦ細胞における遺伝子ターゲッティング比率は５．７％（１２／２１２）であるが、これに対し、ｐＢＣＴＰＯＫＩＤＴIIベクターがトランスフェクションされたｂＥＳＦ細胞における遺伝子ターゲッティング比率は３６．６（６３／１７２）であって、ｐＢＣＴＰＯＫＩIIより遺伝子ターゲッティング効率が約６．４（３６．６％／５．７％）倍高かった。平均的にｐＢＣＴＰＯＫＩＤＴIIベクターは、ｐＢＣＴＰＯＫＩIIベクターより遺伝子ターゲッティング比率が約４．５（３７．３％／８．３％）倍高かった。これにより、ｐＢＣＫＩＤＴIIベクターカセットがｐＢＣＫＩIIベクターカセットに比べて遺伝子ターゲッティング効率が非常に高いことを確認した（表７）。また、ｐＢＣＴＰＯＫＩＤＴIIベクターによる、ｂＥＦにおける４１．４％の遺伝子ターゲッティング効率は、既存のＧｏａｔ ｆｅｔａｌ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓで１２．７％（SHEN Wei et al., Chinese Journal of Biotechnology, 20(3);361-365, 2004）の遺伝子ターゲッティング効率より３倍（４１．４％／１２．７％）以上高かった。これにより、本ｐＢＣＴＰＯＫＩＤＴIIベクターの遺伝子ターゲッティング効率が非常に優れることを確認した。
【０１０４】
【表７】
【０１０５】
〔実施例６：遺伝子ターゲッティング有無確認のためのサザンブロック（Southern blot）分析〕
実施例１で製作した様々な形の牛カゼイン遺伝子ターゲッティングベクターの体細胞へのターゲッティングを実施例３の方法によって行った結果、製作されたベクターの体細胞への遺伝子ターゲッティングが高効率で成功し、ターゲッティング効率は形質転換方法によって異なった。
【０１０６】
その中でも実施例３−１の方法で形質転換させ、ＰＣＲ分析によって、ＢＣＴＰＯＫＩIIベクターで遺伝子ターゲッティングされたものと確認された２つのクローンをサザンブロットによって再確認した。各細胞クローンを２つの１００ｍｍの培養容器で拡張培養した後、その一つはゲノムＤＮＡを抽出するために、細胞を集めて少なくとも１０μｇＤＮＡをそれぞれのクローンから抽出した。その後、３７℃の条件で１６時間ＥｃｏＲI制限酵素によって制限した。ＥｃｏＲIで制限されたＤＮＡを、１６時間１×ＴＡＥバッファで５０Ｖにて０．７５％アガロースゲル上に電気泳動することにより分離した。そのＤＮＡを、陽電荷を有する膜（membranes positively charged : Boehringer Mannheim）に移し、ヒトＴＰＯ ｃＤＮＡ（図３０）のあるベクター構造物に対する、指針書（Ｒｏｃｈｅ）に基づいてＲａｎｄｏｍ ｐｒｉｍｅｄ ＤＩＧ−ｌａｂｅｌｉｎｇ技術を用いて製作されたプローブでハイブリダイゼーションを行った。サザンブロット用プローブは、配列番号３および４のプライマーを用いてＰＣＲ ＤＩＧ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｍｉｘ（Ｒｏｃｈｅ）とＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて製作された。ＰＣＲ反応の温度サイクリングの条件は、次のとおりである。
【０１０７】
【表８】
【０１０８】
ＰＣＲ反応により、ＢＣＴＰＯＫＩIIベクターが牛β−カゼイン遺伝子ターゲッティングされたものと選定された２つの細胞株がターゲッティングされたことを再確認した（図３１）。８１番、８９番の２つの細胞株は、発明したベクターがゲノムの牛β−カゼイン遺伝子座にターゲッティングされたことが再確認された。
【０１０９】
この中でも、８１番クローンをＢＣＴＰＯＫＩｂＥＳＦ８１と命名し、ＫＣＴＣ（韓国大田市儒城區魚隠洞５２番地）に２００４年１１月１０日付けで第ＫＣＴＣ １０７２０ＢＰ号で寄託した。
【０１１０】
〔実施例７：牛体細胞の準備〕
韓国の畜産研究所の動物管理指針に基づいてこの実験を行った。１年に１２，０００ｋｇ以上のミルクを生産する牛（ホルスタイン種）の妊娠後４５日目となる胎児から牛胚芽線維芽細胞（ｂＥＦ）を分離し、既に報告された論文に従って細胞を準備した（Koo et al., Biol Reprod., 63(4);986-992, 2000）。胎児の頭部は、解剖用鋏を用いて除去し、肝と内臓などの柔らかい組織は、２つのｗａｔｃｈｍａｒｋｅｒ’ｓ ｆｏｒｃｅｐｓで掻き出して除去した。牛（ホルスタイン種）の耳組織線維芽細胞（ｂＥＳＦ）は、１年に１２，０００ｋｇ以上のミルクを生産する２年齢の牛の耳から分離した。ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）で２回洗浄した後、ｂＥＦとｂＥＳＦを１００ｍｍの培養容器上で解剖用刃を用いて薄切りにした。この実験の手続きは常温で行った。薄切りにした組織を０．０５％（ｗ／ｖ）トリプシン／０．５３ｍＭ ＥＤＴＡ溶液１０ｍＬに仕込み、３０分間３８．５℃の培養器で培養した。同量の１０％ＦＢＳを含んでいる細胞培養液を添加してトリプシンの活性を抑制した。細胞培養液は、ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、ペニシリン１００ユニット、ストレプトマイシン１０００μｇ／ｍＬ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）から組成した。強いピペットを行った後、５分間１５０×ｇの条件で遠心分離した。細胞を浮遊させた後、２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ程度の細胞濃度を持つように濃度を調整して１７５−ｃｍ２組織培養容器（Ｎｕｎｃ、Ｒｏｓｋｉｌｄｅ、Ｄｅｎｍａｒｋ）にコンフルアンスに達するまで成長するよう３７℃、５％ＣＯ２の条件で１０ｍＬの培養液を仕込んで培養した。ｂＥＦとｂＥＳＦ細胞を、２０％ＦＢＳと１０％ＤＭＳＯ（dimethyl sulphoxide）を含んでいる冷たいＤＰＢＳ（Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline）溶液を用いて凍結させた後、１６時間−７０℃に保管し、その後、外来遺伝子導入実験を行うまで液体窒素中に保管した。
【０１１１】
遺伝子ターゲッティングされた細胞株を得るためには、ＤＮＡの導入された細胞が老化または変形なしに体外培養システムで長期間生存することができなければならない。本発明において、ＢＣＴＰＯＫＩIとＢＣＴＰＯＫＩIIベクターは、牛胚芽線維芽細胞（ｂＥＦ）と牛耳組織線維芽細胞（ｂＥＳＦ）に導入された。羊の場合、出生した羊の線維芽細胞が胚芽線維芽細胞より体外培養でさらに安定的な染色体の数を示しながら長期間持続されるということが報告された（Williams et al., Mol Reprod Dev., 66(2);115-125, 2003）。本発明において、牛耳組織線維芽細胞（ｂＥＳＦ）は、牛胚芽線維芽細胞（ｂＥＦ）より体外培養において変形なしにさらに長期間培養された（表９）。
【０１１２】
【表９】
【０１１３】
継代４にある３０４個の牛耳組織線維芽細胞由来の細胞株のうち、５１個（１７％）の細胞株が継代８まで正常的な模様を示しながら体外培養された。これに対し、牛胚芽線維芽の場合、６％（９／１４９）の細胞株のみが継代８まで培養された。
【０１１４】
〔実施例８：遺伝子タターゲッティングされた細胞の解凍および凍結〕
実施例６のサザンブロット分析によって準備された、遺伝子ターゲッティングされた細胞を２つの１００ｍｍの培養容器でコンフルアンスに達するまで培養し、その中のいずれか一つの培養容器内にある細胞に対してサザンブロット分析を行った。残った他の容器内の細胞の半分を培養し続け、残りの半分は１６時間−７０℃で凍結した後、液体窒素に保管した。核供与細胞として用いられる、出来る限り多数の細胞を確保するために、継代培養と保管過程を繰り返し行った。細胞凍結液は、２０％ＦＢＳと１０％ＤＭＳＯを含むＤＭＥＭから組成した。
【０１１５】
凍結されている遺伝子ターゲッティングされた細胞の入っている１つのチューブを出来る限り速く解凍した後、９ｍＬの培養液を入れた１５ｍＬのチューブにその解凍液を仕込んで３分間１０００ｒｐｍで遠心分離した。細胞沈殿物を３ｍＬの培養液で浮揚させた後、６ウェル培養容器に仕込み、核移植に用いられるまで３７℃、５％ＣＯ２の培養器で培養した。
【０１１６】
〔実施例９：核移植〕
牛卵子を屠殺場の卵巣から獲得し、３８．５７℃、５％ＣＯ２と水分のある状態で２２時間成熟培養液で培養した。成熟培養液は、Ｅａｇｌｅ ｓａｌｔｓと１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）の補充されたＬ−グルタミンと１μｇ／ｍＬエストラジオール（estradiol）と１μＬ／ｍＬ ＦＳＨ−Ｐ（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ Ｃｏｒｐ．，Ｋｅｎｉｌｗｏｒｔｈ、ＮＪ）と２５ｍＭ ＮａＨＣＯ３とＴＣＭ−１９９（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）から組成した。体外成熟させた後、卵子を０．１％ヒアルロニダーゼ（hyaluronidase）の入っている５００μＬのＴＬ−Ｈｅｐｅｓに仕込んで卵子の卵丘（cumulus）を強いピペットで除去した。卵丘細胞の除去された卵子の透明帯を精巧なガラス針を用いて部分的に切開した（Tsunoda et al., J Exp Zool., 240(1);119-125, 1986）。卵子操作、例えば核除去や細胞挿入などは、逆像顕微鏡（Ｌｅｉｔｚ、Ｅｒｎｓｔ Ｌｅｉｔｚ Ｗｅｔｚｌａｒ ＧｍｂＨ、Ｇｅｒｍａｎｙ）付き極微操作装置（micromanipulator）によって行った。操作のために使用された培養液は、７．５μｇ／ｍＬのサイトカラシンＢ（cytochalasin B）を含んでいるＴＬ−Ｈｅｐｅｓである。一番目の極体と中期II(metaphase II)染色体を含んでいる部分的な細胞質を直径２０μｍのマイクロピペットを用いて除去した。一つの遺伝子ターゲッティングされた細胞をそれぞれレシピエント細胞質体（recipient cytoplast）の卵黄周囲腔（perivitelline space）に組み込んだ。細胞−細胞質体（cell-cytoplast）複合体を１０〜２０秒間５０μＬの細胞融合培養液内に置いた後、細胞融合培養液に覆われた２つの電極１ｍｍアパート（electrodes 1mm apart）のある融合容器に移した。細胞融合培養液は、０．３Ｍマンニトール、０．５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、０．０１％ＢＳＡ、０．１ｍＭ ＣａＣｌ２、０．１ｍＭ ＭｇＣｌ２から組成した。細胞−細胞質体複合体をＥｌｅｃｔｒｏ Ｃｅｌｌ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｏｒ２００１（ＢＴＸ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）でそれぞれ２０×１０−６ｓｅｃの間直接的な１．６ｋＶ／ｃｍで電流を流すように１回のパルスで融合を誘導した。このような過程は常温で行った。体細胞が見えない、再構成された受精卵は、融合パルス以後１時間経過したときに融合された受精卵と決定される。電気的融合以後４時間が経過した後、融合された受精卵を５分間５μＭイノマイシンで処理して活性化させた後、１０％ＦＢＳの入っているＣＲ１ａａ ｍｅｄｉｕｍ（Rosenkrans et al., Biol Reprod., 49(3);459-462, 1993）に２．５ｍＭ ６−ジメチル−アミノプリンを３８．５℃、５％ＣＯ２の条件で３．５時間処理する。
【０１１７】
〔実施例１０：再構成された受精卵の培養〕
再構成された受精卵を、１ｍＭグルタミンと１×イグル必須アミノ酸溶液（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）の入っているＣＲ１ａａ培養液で培養した。３日間培養の後、分裂された受精卵をマウス胚芽線維芽細胞単層（mouse embryonic fibroblasts monolayer）上で７５０μＬ ＣＲ１ａａ（ｗｉｔｈ１０％ＦＢＳ）のある４ウェル培養容器の各ウェルで４日間３８．５℃、５％ＣＯ２の条件で培養した（Park et al., Anim Reprod Sci., 59(1-2);13-22, 2000）。培養７日以後、胚盤胞形成が観察された。
【０１１８】
〔実施例１１：組み換えされた受精卵のＰＣＲ分析〕
各受精卵を５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＬ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．５. ０．５％Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ４０、０．５％ Ｔｗｅｅｎ、４００μｇ／ｍＬプロテイナーゼＫからなるリーシスバッファ２０μＬ内に入れた後、３０分間６５℃の条件で置いた。そして、反応を１０分間９５℃に置くことにより、プロテイナーゼＫの活性を中止させた（McCreath et al., Nature, 405(6790);1066-1069, 2000）。溶解されたそれぞれの受精卵に対し、第１ＰＣＲは配列番号３および４のプライマーとしてＡｃｃｕＰｏｗｅｒ ＰＣＲ Ｐｒｅｍｉｘ（Ｂｉｏｎｅｅｒ）を用いて行った後、ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲを第１ＰＣＲ産物１μＬを用いて行った。配列番号３および７のプライマーを使用し、温度サイクリング（thermal cycling）条件は、次のとおりである：
Ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ
配列番号７逆方向プライマー：５’−gagacggacctgtccagaaagctg−３’
【０１１９】
【表１０】
【０１２０】
様々な発達段階にある組み換えされた複製胚芽のＰＣＲによって確認された形質転換有無は、次のとおりである（表１１）。
【０１２１】
【表１１】
【０１２２】
３３個の複製胚芽のうち３３個（１００％）全てが形質転換されたことが分かる。これは、発明が本遺伝子ターゲッティングされた体細胞を使用することにより、遺伝子ターゲッティングされた複製動物を生産するために用いられることを意味する。
【０１２３】
図３２は８１番細胞株の細胞から核移植された受精卵のＰＣＲ分析結果である（図３２）。
【０１２４】
〔実施例１２：複製された胎児由来の胎盤細胞のｌｏｎｇ−ｒａｎｇｅ ＰＣＲ分析〕
胚盤胞段階にある複製受精卵は、非手術的な方法を用いて、妊娠準備された母牛に移植した。移植後、妊娠３６日と確認された母牛の子宮から、フォーリーカテーテル（Ａｇｔｅｃｈ、Ｍａｎｈａｔａｎ、ＫＳ）を用いて、非手術的な方法によって、胎盤と共に、胎膜に取り囲まれている胎児を抽出した。胎児と胎児由来の胎膜組織を実施例７と同様の方法によって細胞培養した。細胞培養した胎膜組織をｌｏｎｇ−ｒａｎｇｅ ＰＣＲ方法によってβ−カゼイン遺伝子ターゲッティングを確認した結果、４ｋｂバンドを介してβ−カゼイン遺伝子ターゲッティングされたことが分かる（図３３）。ゲノムＤＮＡ抽出過程とｌｏｎｇ−ｒａｎｇｅ ＰＣＲ方法は、前記実施例５と同様である。
【０１２５】
〔産業上の利用可能性〕
上述したように、本発明のβ−カゼイン遺伝子ターゲッティングベクターがターゲッティングされた細胞を用いて核移植された受精卵を着床させて形質転換牛を製造する場合、医薬、産業的に有用な高付加価値タンパク質を副作用、例えば動物の発達障害なしに形質転換牛のミルクから大量獲得することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１２６】
【図１】図１は、牛β−カゼイン遺伝子ターゲッティングのために製作されたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIＳＫ（＋）プラスミド内にある１８．８ｋｂ ｐＢＣＫＩIベクターカセットを示す。ベクターカセットはｎｅｏ遺伝子の前にＳａｃII、ＮｏｔI、ＢａｍＨI制限酵素部位を含んでおり、ショットアーム（short arm）部位の後ろにＢａｍＨI制限酵素部位を持っている。
【図２】図２は、牛β−カゼイン遺伝子ターゲッティングのために製作されたｐＧＥＭ７Ｚｆ（＋）プラスミド内にある１４．８ｋｂ ｐＢＣＫＩIIベクターカセットを示す。
【図３】図３は、牛β−カゼイン遺伝子ターゲッティングのために製作されたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIＳＫ（＋）プラスミド内にある１６．１ｋｂ ｐＢＣＫＩIベクターカセットを示す。ベクターカセットは、ｎｅｏ遺伝子の前にＳａｃII、ＮｏｔI、ＢａｍＨI制限酵素部位を含んでおり、ショットアーム部位の後ろに陰性選別マーカーとしての１．３ｋｂジフテリア毒素（ＤＴ）遺伝子を持っている。ジフテリア毒素遺伝子部位の後ろにＢａｍＨI制限酵素部位を持っている。
【図４】図４は、ｐＢＣＫＩIベクターカセットとターゲッティングされたβ−カゼイン遺伝子間の相同的組み換え現象を示す。牛β−カゼイン遺伝子座における二重交差による結果として、内生的（endogenous）β−カゼイン塩基配列がベクターカセットの塩基配列で交替されることを示す。
【図５】図５は、ｐＢＣＫＩIIベクターカセットとターゲッティングされたβ−カゼイン遺伝子間の相同的組み換え現象を示す。牛β−カゼイン遺伝子座における二重交差による結果として、内生的β−カゼイン塩基配列がベクターカセットの塩基配列で交替されることを示す。
【図６】図６は、ｐＢＣＫＩＤＴIIベクターカセットとターゲッティングされたβ−カゼイン遺伝子間の相同的組み換え現象を示す。牛β−カゼイン遺伝子座における二重交差による結果として、内生的β−カゼイン塩基配列がベクターカセットの塩基配列で交替されることを示す。相同的組み換えが起こると、ジフテリア毒素（ＤＴ）遺伝子は脱落する。
【図７】図７は、ｐＢＣＫＩIとｐＢＣＫＩIIベクターカセットによる牛β−カゼイン遺伝子座で起こる遺伝子ターゲティングを確認するために使用されたＰＣＲ分析戦略と、ターゲッティングされたβ−カゼイン遺伝子座の接合点部位とベクターカセット内の制限酵素部位の塩基配列を示す。上位絵は、ｎｅｏ遺伝子からベクターカセット内に存在しない内生的β−カゼイン遺伝子座までの４ｋｂ ＤＮＡ断片を合成するためのプライマーセットの適切な位置を示す。塩基配列Ａは、ロングアーム（long arm）とｎｅｏ遺伝子接合点部位の塩基配列である。塩基配列Ｂは、ショットアームとｎｅｏ遺伝子接合点部分の塩基配列であって、５ＰＣＲプライマーが位置する。塩基配列Ｃは、ショットアームとベクターカセットには存在しない内生的β−カゼイン遺伝子接合点部位の塩基配列を示し、３’ＰＣＲプライマーが位置する。
【図８】図８は、ｐＢＣＫＩＤＴIIベクターカセットによる牛β−カゼイン遺伝子座で起こる遺伝子ターゲッティングを確認するために使用されたＰＣＲ分析戦略と、ターゲッティングされたβ−カゼイン遺伝子座の接合点部位とベクターカセット内の制限酵素部位の塩基配列を示す。上位絵は、ｎｅｏ遺伝子からベクターカセット内に存在しない内生的β−カゼイン遺伝子座までの４ｋｂ ＤＮＡ断片と３．４ｋｂ ＤＮＡ断片の適切な位置を示す。この際、少量のＤＮＡ試料においてもターゲッティング有無を確認するために、第１ＰＣＲプライマーで合成した後、第２ＰＣＲプライマーで再合成した。塩基配列Ａは、ロングアームとｎｅｏ遺伝子接合点部位の塩基配列である。塩基配列Ｂは、ショットアームとｎｅｏ遺伝子接合点部分の塩基配列であって、５’ＰＣＲプライマーが位置する。塩基配列Ｃは、ショットアームとベクターカセットには存在しない内生的β−カゼイン遺伝子接合点部位の塩基配列を示し、３’ＰＣＲプライマーが位置する。
【図９】図９は、前で報告されたｐＢＣ１０ベクターを示す（Kim et a l., J Biochem (Tokyo)., 126(2);320-5, 1999）。ｐＢＣ１０ベクターは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIＳＫベクター内にある牛β−カゼインプロモータ部位１０ｋｂを含んでいる。牛β−カゼイン遺伝子プロモータ部位は、遺伝子５’−フランキング（flanking）配列の８ｋｂ、解読されないエクソン１および２（Vertical open boxes）、イントロン１の２ｋｂを含んでいる。プロモータは、ＳａｃI、ＡａｔII、ＳａｃII制限酵素部位を持っているが、ＳｍａI、ＢａｍＨI、ＳａｌI、ＳｐｅI、ＣｌａIなどの制限酵素部位はない。
【図１０】図１０は、ｐＢＣ１０ベクターをＳａｃIとＳａｃII制限酵素で切断することにより分離された１０ｋｂ ＤＮＡ断片を示している。分離された１０ｋｂ ＤＮＡ断片は、ｐＢＣＫＩIベクターカセットのロングアームに使用した。
【図１１】図１１は、ｐＢＣ１０ベクターをＡａｔIIとＳａｃII制限酵素で切断することにより分離された６ｋｂ ＤＮＡを示している。分離された６ｋｂ ＤＮＡは、ｐＢＣＫＩIIベクターカセットのロングアームに使用した。
【図１２】図１２は、ｐＢＣＫＩIとｐＢＣＫＩIIベクターカセットのショットアームに使用されたｐＢＣ３．１ベクターの製作順序を示す。牛β−カゼイン遺伝子のエクソン５、６、７、８を含んでいる３．２ｋｂ ＤＮＡ断片を、ＸｈｏIとＳａｌI（太字）制限酵素部位を持っているプライマーセットを用いて牛染色体ＤＮＡ（chromosomal DNA）からＰＣＲ合成した。合成されたＤＮＡ断片をＸｈｏIとＳａｌI制限酵素を用いて切断した後、ｐＧＥＭ−Ｔベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）のＳａｌI認識部位に連結した。ｐＧＥＭ−Ｔベクター内にある３．２ｋｂ ＤＮＡ断片をＨｉｎｃIIとＳａｌI制限酵素でさらに切断した後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIＳＫ（＋）のＳａｌI認識部位に連結した。
【図１３】図１３は、ｐＭＡＭｎｅｏベクター（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）からＳＶ４０ ｏｒｉ、初期プロモータ（early promoter）、ネオマイシン抵抗性遺伝子、ＳＶ４０初期スプライシング（early splicing）部位、ポリアデニル化（polyadenylation）部位を含んでいるｎｅｏ遺伝子を選別する過程を示す。ＢａｍＨI制限酵素で切断された２．７ｋｂ ｎｅｏ遺伝子断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIＳＫ（＋）のＢａｍＨI制限酵素部位に連結した。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIＳＫ（＋）内にあるｎｅｏ遺伝子の２ｋｂ ＤＮＡ断片をＢｇｌIIとＢａｍＨI制限酵素で切断した後、ｐＳＰ７３ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）のＢａｌII制限酵素部位に連結した。ＢｇｌIIとＥｃｏＲＶ制限酵素で切断したｐＳＰ７３ベクターの２ｋｂ断片を、ｐｎｅｏ２．７ベクター構造物を作るために０．７ｋｂ ｎｅｏ遺伝子を含んでいるｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIＳＫ（＋）ベクターのＢｇｌIIとＥｃｏＲＶ制限酵素部位に再連結した。
【図１４】図１４は、ｐＢＣＫＩIとｐＢＣＫＩIIベクターカセットの製作過程を示す。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIＳＫ（＋）ベクター内にある陽性選別マーカーとショットアームに相当するＤＮＡ断変を適切な制限酵素を用いて切断した後、ＢａｍＨI、ＥｃｏＲＶ、ＳａｌI制限酵素部位を用いて、ｐＢＣ１０ ＤＮＡ断片を含んでいるｐＢｌｅｕｓｃｒｉｐｔIIＳＫ（＋）ベクター内に連結した。結果的に、ｐＢＣＫＩIベクターカセットは、１０ｋｂロングアーム、選別マーカー遺伝子、およびショットアームを含んでいる。ｐＢＣＫＩIベクターのロングアームの長さを短くするために、ＡａｔIIとＳａｌI制限酵素で切断したＤＮＡ断片をｐＧＥＭ７Ｚｆ（＋）ベクターのＡａｔIIとＸｈｏI制限酵素部位に連結した。その結果、６ｋｂロングアーム、ｎｅｏ遺伝子およびショットアームを持っているｐＢＣＫＩIIベクターカセットを完成した。
【図１５】図１５は、本ｐＢＣＫＩＤＴIIベクターカセットに使用されたＤＴ遺伝子をｐＫＯ ＳｅｌｅｃｔＤＴ（Ｌｅｘｉｃｏｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）ベクターから選別する過程を示す。制限酵素ＲｓｒIIとして使用することにより、ＳＶ４０ＰｏｌｙＡおよびＲＮＡポリメラーゼIIプロモータと共にジフテリア毒素Ａ鎖（ＤＴ）遺伝子が選別された。選別されたＤＴ遺伝子をｋｌｅｎｏｗ ｆｉｌｌｉｎｇした後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIＫＳ（＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＨｉｎｄII部位に挿入することにより、ｐＫＳ ＤＴベクターを完成した。ｐＫＳ ＤＴベクターにあるＤＴ遺伝子をＸｈｏIとＥｃｏＲＶで切断した後、ｐＳＰ７３（Ｐｒｏｍｅｇａ）ベクターのＸｈｏIとＰｖｕII部位に挿入することにより、ｐＳＰ７３ ＤＴベクターを完成した。
【図１６】図１６は、ｐＢＣＫＩＤＴIIベクターカセットの製作過程を示す。ｐＳＰ７３ ＤＴベクターに挿入されているＤＴ遺伝子を、ＸｈｏIとＳａｌI遺伝子によって選別した後、ｐＢＣＫＩIベクターカセットのＳａｌI部位に挿入することにより、ｐＢＣＫＩＤＴIベクターカセットを完成した。完成したｐＢＣＫＩＤＴIベクターカセットをＡａｔIIとＳａｌIで切断した後、ｐＧＥＭ−７Ｚｆ（＋）（Ｐｒｏｍｅｇａ）ベクターのＡａｔIIとＸｈｏI部位に挿入することにより、ｐＢＣＫＩＤＴIIベクターカセットを完成した。
【図１７】図１７は、ｐＢＣＫＩIベクターカセット内への有用な遺伝子の挿入を示す。治療用タンパク質遺伝子の一例として、ヒトトロンボポエチン遺伝子（ｈＴＰＯ）を発明したｐＢＣＫＩIベクターカセットに挿入した。われわれの以前研究において、ヒトトロンボポエチンｃＤＮＡ全体１ｋｂをＰＣＲによって増幅し、牛成長ホルモン（ｂＧＨ）遺伝子の３００ｂｐ ｐｏｌｙ（Ａ）付加的配列（additional sequence）を、増幅されたｃＤＮＡ断片の下部にあるＫｐｎI制限酵素部位に連結させた（Sohn, DNA Cell Biol., 18(11);845-852, 1999）。ｈＴＰＯ ｃＤＮＡとｂＧＨ遺伝子を含んでいる１．３ｋｂ ＤＮＡ断片は、ｐＢＣＫＩIベクターカセットのＳａｃIIとＮｏｔI制限酵素部位に挿入された。その結果、２０．１ｋｂ ｐＢＣＴＰＯＫＩIベクター構造物が完成された。
【図１８】図１８は、ｐＢＣＫＩIIベクターカセット内へのｈＴＰＯ ｃＤＮＡの導入を示す。結果的に、１６．１ｋｂ ｐＢＣＴＰＯＫＩIIベクター構造物を作った。その順序は図１７での説明と同様である。
【図１９】図１９は、ｐＢＣＫＩＤＴIIベクターカセット内へのｈＴＰＯ ｃＤＮＡの導入を示す。結果的に、１７．４ｋｂ ｐＢＣＴＰＯＫＩＤＴIIベクター構造物を作った。その順序は図１７での説明と同様である。
【図２０】図２０は、制限酵素ＳａｌIによる切断の後、細胞内導入のために使用された線形化ｐＢＣＴＰＯＫＩIベクター構造を示す。
【図２１】図２１は、制限酵素ＡａｔIIによる切断の後、細胞内導入のために使用された線形化ｐＢＣＴＰＯＫＩIIベクター構造を示す。
【図２２】図２２は、制限酵素ＡａｔIIとＣｌａIによるプラスミドベクターの除去の後、細胞内導入のために使用された線形化ｐＢＣＴＰＯＫＩＤＴIIベクター構造を示す。
【図２３】図２３は、制限酵素ＡａｔIIとＣｌａIによるプラスミドベクターの除去の後、細胞内導入のために使用された線形化ｐＢＣＴＰＯＫＩIIベクター構造を示す。図２１ではｐＢＣＴＰＯＫＩIIベクターがＡａｔIIによってのみ線形化されたので、プラスミドベクターをもって細胞内に導入されたが、図２３におけるｐＢＣＴＰＯＫＩIIベクターは、ＡａｔIIとＣｌａIによってプラスミドベクターが除去されたので、プラスミドベクターが切断されてから細胞内に導入された。
【図２４】図２４は、牛胚芽線維芽細胞（ｂＥＦ）と牛耳組織線維芽細胞（ｂＥＳＦ）の形態を示す。ＡとＢは、コンフルアンスに達するまで成長した、ＤＮＡが導入されていない（正常）ｂＥＦとｂＥＳＦである。ＣとＤは、本発明のベクターが導入された後コロニー形成を示すｂＥＦとｂＥＳＦである。抗生剤抵抗性ｎｅｏ遺伝子を含み、遺伝子ターゲッティングベクターをリポフェクタミン２０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）方法を用いてｂＥＦとｂＥＳＦに導入した後、Ｇ４１８（Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を処理して生き残った細胞株は、外来遺伝子の導入有無を分析した。
【図２５】図２５は、ｐＢＣＫＩIIトランスフェクションの後に生き残った細胞株のＰＣＲ分析を示す。矢印で表された５００ｂｐ ＰＣＲ ＤＮＡ断片に対する陽性シグナルは「＋」で示し、陰性シグナルは「−」で示した。本発明のｐＢＣＴＰＯＫＩIIベクターは陽性対照区として使用し、ＰＣＲはｈＴＰＯ遺伝子に対するプライマーを利用した。
【図２６】図２６は、ｌｏｎｇ−ｒａｎｇｅ ＰＣＲ分析のために対照区として使用されたｐｎｅｏＢＣ３．７ベクターの製作順序を示す。牛β−カゼイン遺伝子の塩基７８８８〜８４７９に相応するイントロン８とエクソン９を含んでいる５９１ｂｐ ＤＮＡ断片は、プライマーセットを用いて、牛染色体ＤＮＡからＰＣＲ増幅によって準備した。３’プライマーは、太字で表記されているように、ＸｈｏI制限酵素部位を持っている。増幅されたＰＣＲ ＤＮＡ断片は、ｐＧＥＭ−Ｔベクター内に挿入された。その結果、ｐＢＣ５９１ベクター構造物を完成した。
【図２７】図２７は、ｌｏｎｇ−ｒａｎｇｅ ＰＣＲ分析のために対照区として使用されたｐｎｅｏＢＣ３．７ベクターの製作順序を示す。ｐＢＣ５９１ベクターをＳａｌIとＸｈｏI制限酵素を用いて切断した後、そのＤＮＡ断片をｐＢＣ３．１ベクターのＳａｌI制限酵素部位内に連結した。同時に、ｐｎｅｏＢＣ２．７ベクターをＢａｍＨIとＥｃｏＲＶ制限酵素で切断した後、ＢａｍＨIとＥｃｏＲV制限酵素で切断されたｐＢＣ３．１ベクターに連結した。その結果、ｐｎｅｏＢＣ３．７ベクターが完成された。矢印は、４ｋｂと３．４ｋｂのｌｏｎｇ−ｒａｎｇｅ ＰＣＲ合成のためのプライマーセットを示す。
【図２８】図２８は、ｐＢＣＴＰＯＫＩIIベクターが導入されたｂＥＳＦ細胞株のｌｏｎｇ−ｒａｎｇｅ ＰＣＲ分析結果を示す。矢印で表わされる４ｋｂ陽性シグナルは、細胞株８１と８９番がβ−カゼイン遺伝子ターゲッティングされたことを示す。それ以外の他の細胞株は、陰性シグナル（−）を示した。ｐｎｅｏＢＣ３．７ベクターを陽性対照区として使用した。
【図２９】図２９は、ｐＢＣＴＰＯＫＩＤＴIIとｐＢＣＴＰＯＫＩIIベクターの導入されたｂＥＳＦ細胞株のｌｏｎｇ−ｒａｎｇｅ ＰＣＲ分析結果を示す。矢印で表わされる３．４ｋｂ陽性シグナルは、β−カゼイン遺伝子がターゲッティングされたことを示す。約５個の細胞において第１ＰＣＲを行った後、第２ＰＣＲを行うことにより、３．４ｋｂ陽性シグナルを確認した（図８）。Ａは、ｐＢＣＴＰＯＫＩＤＴIIベクターを導入した細胞株に対するｌｏｎｇ−ｔｅｍｐｌａｔｅ ＰＣＲの結果であり、５、３０、１７、１８、２０、２１、２６番の細胞株がβ−カゼイン遺伝子ターゲッティングされたことを示す。Ｂは、ｐＢＣＴＰＯＫＩIIベクターを導入した細胞株に対するｌｏｎｇ−ｔｅｍｐｌａｔｅ ＰＣＲの結果であり、１６番の細胞株が遺伝子ターゲッティングされたことを示す。Ｃは、陰性対照区（−）として使用された牛のゲノムＤＮＡと陽性対照区（＋）として使用されたｐｎｅｏＢＣ３．７に対するｌｏｎｇ−ｔｅｍｐｌａｔｅ ＰＣＲの結果である。
【図３０】図３０は、ターゲッティングされた塩基配列を再確認するためのサザンブロット分析のための戦略を示す。外来遺伝子の導入された細胞株から、精製されたゲノムＤＮＡ（genomic DNA）とｐＢＣＴＰＯＫＩIIベクターをＥｃｏＲI制限酵素で切断した。ＥｃｏＲIによって切られたＢＣＴＰＯＫＩIIベクターのＤＮＡ（Ａ）とゲノムＤＮＡ（Ｂ）の断片サイズは、それぞれ９．２ｋｂと９．９ｋｂである。ｈＴＰＯ遺伝子の下にあるバーは、サザンブロット分析のために使用されたプローブの位置を示す。プローブとして用いられるｈＴＰＯ ｃＤＮＡの５００ｂｐ断片をＰＣＲによって増幅した。
【図３１】図３１は、サザンブロット分析によって、遺伝子ターゲッティングされたものと確認された細胞株を示す。８１番と８９番の２つの細胞株は、発明したベクターが内生的牛β−カゼイン遺伝子座にターゲッティングされたことが再確認された。ターゲッティングされた細胞株は、９．９ｋｂ断片を示し、９７、４７、４３、３４番の細胞株は、いずれのシグナルも示していない。様々な濃度の牛ゲノムＤＮＡを陰性対照区として使用し、様々な濃度のｐＢＣＴＰＯＫＩIIベクターから由来した９．２ｋｂ断片は陽性対照区として使用した。
【図３２】図３２は、８１番細胞株の細胞から核移植された受精卵のｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ分析を示す。３５６ｂｐの陽性シグナルは、体細胞から複製された受精卵が本発明のターゲッティングベクターを持っていることを示す。ｐＢＣＴＰＯＫＩIIベクターを陽性シグナルとして使用し、ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲは陽性シグナルを再確認するために行った。
【図３３】図３３は、８９番クローンの細胞から核移植された受精卵を妊娠準備済みの母牛に移植した後、妊娠３６日目の母牛から取り出した胎膜に取り囲まれている胎児（Ａ）、胎膜を除去した胎児（Ｂ）、胎膜細胞（Ｃ）、胎膜細胞のｌｏｎｇ−ｒａｎｇｅ ＰＣＲ分析（Ｄ）を示す。４ｋｂ陽性シグナルは、胎児由来の胎膜細胞がβ−カゼイン遺伝子ターゲッティングされたことを示す。ｐｎｅｏＢＣ３．７ベクターを陽性対照区として使用した。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔技術分野〕
本発明は、相同的組み換えによる牛β−カゼイン遺伝子ターゲッティングベクター、前記ベクターで遺伝子ターゲッティングされた牛体細胞、および前記牛細胞を用いた核移植により得られた受精卵に関する。また、本発明は、前記受精欄を着床させて製造された形質転換牛のミルクから目的のタンパク質を大量収得する方法に関する。
【０００２】
〔背景技術〕
遺伝子の存在および役割を究明するための動物遺伝学の持続的な努力は、形質転換動物の生産を可能にした。形質転換動物は、薬品や農業などの産業全般にわたって大きい経済的な利益を創出することができる。このような形質転換または遺伝子操作された動物を製造するために、マイクロインジェクション（microinjection）、ウィルス感染（viral transfection）、精子ベクター（sperm vector）、胚性幹細胞（ＥＳ）の利用、および体細胞核移植法（ＳＮＣＴ）などの様々な技術が開発されてきた。
【０００３】
マイクロインジェクションは、ＤＮＡを受精卵の前核に挿入する方法であって（Harbers et al., Nature., 293(5833); 540-2, 1981; Brinster et al., Cell., 27;223-231, 1981; Gordon et al., Proc Natl Acad Sci USA., 77(12);7380-7384; Costantini et al., Nature., 294(5836);92-94）、現在まで、形質転換動物を生産するために広く用いられてきた（Hammer et al., Nature., 315(6021);680-683, 1985; van Berkel et al., Nat Biotechnol., 20(5);484-487, 2002; Damak et al., Biotechnology(NY), 14(2);185-186, 1996）。ところが、マイクロインジェクションによってＤＮＡが挿入された受精卵からの形質転換産子の生産効率は２〜３％と非常に低い（Clark et al., Transgenic Res., 9;263-275, 2000）。よって、マイクロインジェクションによる形質転換動物の生産は、大きな労働力を要し、多くの動物および精巧な付帯私設を要するので、高い費用がかかる（Brink et al., Theriogenology, 53;139-148, 2000）。しかも、マイクロインジェクションは、発現させようとする外来遺伝子の挿入位置と数を決定することができないという短所もある。このため、無作為的な挿入により、形質転換動物における外来タンパク質は、発現が調節されないので不規則的に発現され、その量も少量である。その上、外来遺伝子の無作為的な発現は、胚の発達に致命的な問題を引き起こすと報告された（Wei et al., Annu Rev Pharmacol Toxicol., 37;119-141, 1997）。
【０００４】
レトロウィルス媒介方法も、動物の遺伝子操作のために広く用いられている（Soriano et al., Genes Dev., 1(4);366-375, 1987; Hirata et al., Cloning Stem Cells., 6(1);31-36, 2004）。レトロウィルス媒介方法において、挿入しようとする遺伝子は、ウィルスベクターを介して動物の遺伝子に導入される。この方法は、マイクロインジェクションよりさらに効率的ではあるが、依然として外来遺伝子の無作為的な挿入とモザイク現象（mosaicism）が問題視される（Piedrahita et al., Theriogenology, 53(1);105-116, 2000）。しかも、挿入しようとする遺伝子の最大サイズが７ｋｂに制限されるうえ、ウィルスによって発現されるタンパク質が問題になることもある（Wei et al., Annu Rev Pharmacol Toxicol., 37;119-141, 1997; Yanez et al., Gene Ther., 5(2);149-159, 1998）。
【０００５】
かかる問題点を克服して、特定の遺伝子を除去または挿入することが可能な遺伝子ターゲッティング技術が開発された。遺伝子ターゲッティング技術は、マウス胚性幹細胞を用いた遺伝子機能研究で最初に使用された。マウス胚性幹細胞は、胚芽への所定の遺伝子操作に使用される。マウス胚性幹細胞に遺伝子ターゲッティング法を用いることにより、多数の特定の遺伝子ターゲッティングされたマウスが生産された（Brandon et al., Curr Biol., 5(6);625-634, 1995; Capecchi et al., Science, 244(4910);1288-1292, 1989; Thompson et al., Cell, 56(2);313-321, 1989; Hamanaka et al., Hum Mol Genet., 9(3);353-361, 2000; Thomas et al, Cell, 51(3);503-512, 1987; te Riele et al., Proc Natl Acad Sci USA, 89(11);5182-5132, 1992; Mansour et al., Nature, 336(6197), 348-352, 1988; Luo et al., Oncogene, 20(3);320-328, 2001）。遺伝子ターゲッティング法が他の哺乳類、特に家畜に適用されるとき、治療タンパク質および疾病モデル動物の大量生産といった大きい生物医学的な利益をもたらす。
【０００６】
今まで、組み換え治療タンパク質は、酵素、バクテリア、動物細胞などの細胞を用いた細胞培養システムによって生産されてきた。ところが、細胞培養システムは、特性上、大量生産が不可能なので、非常に高価である。また、幾つかのタンパク質は、適切な翻訳修飾（posttranslational modification）、例えばグリコシル化（glycosylation）、γ−カルボキシル化（γ-carboxylation）、ヒドロキシル化（hydroxylation）などを導入するために付加的な実験が要求される（Houdebine et al., Transgenic Res., 9(4-5);305-320, 2000; Lubo et al., Transgenic Res., 9(4-5);301-304, 2000）。
【０００７】
しかしながら、形質転換動物から治療タンパク質などを生産する動物生体反応器(animal bioreactor)システムは、非常に経済的で効率の良い発現システムとして評価される。特に、形質転換牛からの組み換え治療タンパク質の大量生産は、細胞培養システムと比較して非常に効率的である（van Berkel et al., Nat Biotechnol., 20(5);484-487, 2002）。その中でも、動物のミルクから生産される組み換えタンパク質は、ヒトタンパク質とほぼ同様に、翻訳後修飾されるものと知られている（Edmunds et al., Blood, 91(12);4561-4571, 1998; Velander et al., Proc Natl Acad Sci USA., 89(24);12003-12007, 1992; van Berkel et al, Nat Biotechnol., 20(5);484-487, 2002）。
【０００８】
牛のミルクは、約８８％の水分、３．３％のタンパク質を含有し、残部が炭水化物と脂質からなっている。カゼインは、乳タンパク質の８０％を占めるが、アルファＳ１、アルファＳ２、ベータ、およびカッパカゼインがあり、特にβ−カゼインは、牛のミルクにおいて１０ｍｇ／ｍＬの濃度で発現される最も豊かな乳タンパク質である（Brophy et al., Nat Biotechnology., 21(2);157-162, 2003）。
【０００９】
体細胞核移植法（ＳＣＮＴ）が形質転換動物の製造においてマイクロインジェクションよりさらに効率的であるが、これは、形質転換された体細胞から由来した複製動物の殆どが形質転換動物であるからである（Brink et al., Theriogenology, 53;139-148, 2000）。また、体細胞核移植法を用いる場合、生産しようとする動物の性別を決定することができ、遺伝的に同じ動物の生産が可能であるという利点がある（Lubo et al., Transgenic Res., 9(4-5);301-304, 2000; van Berkel et al., Nat Biotechnol., 20(5);484- 487, 2002）。
【００１０】
最近まで、遺伝子ターゲッティングされた動物を生産するために、胚性幹細胞と遺伝子ターゲッティングベクターが必須的な要素として考えられてきた。豚と牛において胚性幹細胞とほぼ同様の細胞株が報告されたにも拘わらず、家畜からの胚性幹細胞の使用は制限される（Doetschman et al., Dev Biol., 127(1);224-227, 1988; Stice et al., Biol Reprod., 54(1);100-110, 1996; Sukoyan et al., Mol Reprod Dev., 36(2);148-158, 1993; Iannaccone et al., Dev Biol., 163(1);288-292, 1994; Pain et al., Development, 122(8);2339-2348, 1996; Thomson et al., Proc Natl Acad Sci USA., 92(17);7844-7848, 1995; Wheeler et al., Reprod Fertil Dev., 6(5);563-568, 1994）。
【００１１】
その代わりに、核供与細胞として一般体細胞が遺伝子ターゲッティングに使用できるという可能性が提示されることにより、形質転換牛の生産のための実質的かつ効率的な方法として提案された（Brophy et al., Nat Biotechnol., 21(2);157-162, 2003; Cibelli et al., Science, 280(5367);1256-1258, 1998; Campbell et al., Nature, 380(6569);64-66, 1996; Wilmut et al., Experientia, 47(9);905-912, 1997; Denning et al., Cloning stem cells, 3(4);221-231, 2001）。
【００１２】
体細胞核移植法を利用しながら、乳タンパク質遺伝子のプロモータ部分は、形質転換大動物のミルクにおける組み換えタンパク質の発現を誘導するために使用されてきた（Schnieke et al. Science, 278(5346);2130-2133, 1997; Baguisi et al., Nat Biotechnol., 17(5);456-461, 1999; Brophy et al., Nat Biotechnol., 21(2);157-162, 2003）。ところが、外来遺伝子の無作為な挿入により引き起こされる組み換えタンパク質の少量発現や正規場所外の発現といった問題点が解決されない限り、体細胞核移植法による形質転換家畜の生産は依然として現実性がない。外来遺伝子の正規場所外の発現は、胚の発達に致命的な障害を起こし、胚芽発達の後期と出生後の初期に大部分が発達する神経システムにも非常に致命的である（Gao et al., Neurochem Res., 24(9);1181-1188, 1999）。このような副作用を無くすために、外来遺伝子を授乳期中に乳腺組織のみで特異的に発現させる新規方法が開発された（Houdebine et al., Transgenic Res., 9(4-5);305-320, 2000）。相同的組み換え（homologous recombination）によってゲノム遺伝子の特定の部位を操作するものと知られている遺伝子ターゲッティング方法は、組み換えタンパク質の組織特異的な発現のための最適の手段である（Muller et al., Mech Dev., 82(1-2);3-21, 1999; Clark et al., J Mammary Gland Biol Neoplasia., 3(3);337-350, 1998）。
【００１３】
外来遺伝子がターゲッティングされた複製羊の初生産は、治療タンパク質遺伝子がターゲッティングされた大動物の生産の可能性を開いた（McCreath et al., Nature, 405(6790);1066-1069, 2000）。線維芽細胞で多く発現されるＣＯＬ１Ａ１遺伝子ターゲッティングのためのＣＯＬＴ−２ターゲッティングベクターが製作された。このベクターは、遺伝子ターゲッティングを誘導するために、プロモータ−トラップエンリッチメント（promoter-trap enrichment）を利用した。外来遺伝子ＡＡＴＣ２は、羊β−ラクトグロブリン発現ベクター内にヒトα１−抗トリプシン（ＡＡＴ）を持っており、独立的な転写単位を有し、乳腺における発現を誘導するために製作された。遺伝子ターゲッティングされた羊から分泌されるＡＡＴの量は、無作為的に外来遺伝子が挿入された羊と比較して約３７倍も多かった（McCreath et al., Nature, 405(6790);1066-1069, 2000）。したがって、遺伝子ターゲッティング方法は、治療タンパク質の大量生産のための最上の手段として考えられている。ところが、プロモータ−トラップ（promoter-trap）を利用した遺伝子ターゲッティングベクターの使用は、遺伝子の導入される体細胞で活発に転写される遺伝子に制限される。一般に、活発に転写される遺伝子は、全く転写が起こらない遺伝子と比較して、相同的組み換えがより頻繁に起こるものと知られている（Kuroiwa et al., Nat Genet., 36(7);775-780, 2004）。
【００１４】
乳腺組織は、乳タンパク質が組織特異的に過量発現される組織である。したがって、このような乳タンパク質をコードする遺伝子の操作によって、胚の発達または出生後の発達に障害を起こすことなく、外来タンパク質を大量発現させることができる。その中でも、最も高い濃度で発現されるβ−カゼインが好ましい。牛のβ−カゼイン遺伝子は、全体ゲノムのＤＮＡ上に１つ存在し、乳腺組織以外の一般体細胞では全く発現されない遺伝子である。体細胞で全く発現されないゲノムβ−カゼイン遺伝子に外来の目的タンパク質をターゲティングするために、プロモータ−トラップを用いる遺伝子ターゲッティングベクターが利用できない。
【００１５】
そこで、本発明者らは、牛β−カゼイン遺伝子特異的なターゲッティングベクターカセットを製造し、前記ベクターが牛体細胞の牛β−カゼイン遺伝子に正確にターゲッティングされて遺伝子ターゲッティング効率が非常に高いことを見い出し、牛におけるβ−カゼイン遺伝子特異的にターゲッティングされるベクターシステム、およびこれを用いて目的のタンパク質を大量生産する形質転換牛を製造するシステムを完成した。
【００１６】
〔発明の概要〕
本発明の目的は、（１）牛β−カゼイン遺伝子のプロモータを有し、このプロモータの前後に位置した牛ベータ−カゼイン遺伝子のエクソン１、イントロン１およびエクソン２からなり、牛β−カゼイン遺伝子の核酸配列に相同である５〜１２ｋｂ長の核酸配列を有する第１領域と、（２）目的のタンパク質をコードする核酸クローニング部位と、（３）ポジティブ選別マーカー領域と、（４）牛β−カゼイン遺伝子のエクソン５、６、７、８およびイントロン５、６、７からなり、牛β−カゼイン遺伝子核酸配列に相同である２．８〜３．５ｋｂ長の核酸配列を有する第２領域とを含み、β−カゼイン遺伝子の核酸配列の５’−３’配列において、第１領域が上流（upstream）に該当し、第２領域が下流（downstream）に該当することを特徴とする、牛β−カゼイン遺伝子ターゲッティングベクターを提供することにある。
【００１７】
本発明の別の目的は、前記ベクターで遺伝子ターゲッティングされた牛の体細胞を提供することにある。
【００１８】
本発明の別の目的は、前記体細胞を用いた核移植により得られた受精卵を提供することにある。
【００１９】
本発明の別の目的は、（１）牛β−カゼイン遺伝子ターゲッティングベクターで牛の体細胞を形質転換させる段階と、（２）牛の体細胞を培養して相同的組み換えを誘導する段階と、（３）相同的組み換えによって、牛β−カゼイン遺伝子がターゲッティングされた牛の体細胞を選別する段階とを含む、牛β−カゼイン遺伝子がターゲッティングされた牛の体細胞を製造する方法を提供することにある。
【００２０】
本発明の別の目的は、（１）前記牛β−カゼイン遺伝子ターゲッティングベクターで牛の体細胞を形質転換させる段階と、（２）牛の体細胞を培養して相同的組み換えを誘導する段階と、（３）相同的組み換えによって、牛β−カゼイン遺伝子がターゲッティングされた牛の体細胞を選別する段階と、（４）牛の卵子の核を除去し、遺伝子ターゲッティングされた細胞を導入して、体細胞核移植による受精卵を製造する段階と、（５）前記受精卵を着床させる段階とを含む、形質転換牛を製造する方法を提供することにある。
【００２１】
本発明の別の目的は、前記方法によって製造された形質転換牛のミルクから目的のタンパク質を大量収得する方法を提供することにある。
【００２２】
〔発明の詳細な説明〕
本発明は、バイオ医薬品として作用する様々な目的のタンパク質を牛のミルクから大量生産し得るようにするために、遺伝子ターゲッティングされた形質転換牛の生産に用いられる牛β−カゼインターゲッティングベクターを提供する。山羊と羊の年間乳量がそれぞれ約３００Ｌ、約２００Ｌであるが、これに対し、牛は年間６，３００Ｌ以上のミルクを生産するため、生体反応器として最適の動物である。ところが、今まで、牛の乳タンパク質遺伝子に目的の遺伝子をターゲッティングしようとする試みがなかった。そこで、本発明者らは、牛の乳タンパク質遺伝子である牛β−カゼイン遺伝子を効率よくターゲッティングすることが可能なベクターを提供し、これを用いて目的のタンパク質を大量生産する、β−カゼイン遺伝子ターゲッティングされた形質転換牛を製造する方法を提供する。
【００２３】
一様態において、本発明は、（１）牛β−カゼイン遺伝子のプロモータを有し、このプロモータの前後に位置した牛ベータ−カゼイン遺伝子のエクソン１、イントロン１およびエクソン２からなり、牛β−カゼイン遺伝子の核酸配列に相同である５〜１２ｋｂ長の核酸配列を有する第１領域と、（２）目的のタンパク質をコードする核酸クローニング部位と、（３）ポジティブ選別マーカー領域と、（４）牛β−カゼイン遺伝子のエクソン５、６、７、８およびイントロン５、６、７からなり、牛β−カゼイン遺伝子核酸配列に相同である２．８〜３．５ｋｂ長の核酸配列を有する第２領域とを含み、β−カゼイン遺伝子の核酸配列の５’−３’配列において、第１領域が上流（upstream）に該当し、第２領域が下流（downstream）に該当することを特徴とする、牛β−カゼイン遺伝子ターゲッティングベクターに関する。
【００２４】
本発明において、「遺伝子ターゲッティングベクター（gene targeting vector）」とは、ゲノムの特定の遺伝子座に対して目的の遺伝子を除去または挿入することが可能なベクターであって、相同的組み換え（homologous recombination）が起こるようにターゲッティングしようとする特定の遺伝子に相同な塩基配列を含む。本発明の遺伝子ターゲッティングベクターは、目的のタンパク質をコードする核酸配列がゲノム上のβ−カゼイン遺伝子に５’−３’配列で挿入されるβ−カゼインターゲッティングベクターである。「ベクター」と「ベクターカセット」は、同一の意味で使用されており、円形または線形である。本発明の遺伝子ターゲッティングベクターは、牛のβ−カゼイン遺伝子をターゲッティングするベクターである。
【００２５】
本発明の「β−カゼインターゲッティングベクター」は、目的のタンパク質をコードする核酸クローニング部位の左右にβ−カゼイン遺伝子の核酸配列に相同な配列を有する第１領域と第２領域を含む。第１領域はロングアームに該当し、第２領域はショットアームに該当する。
【００２６】
本発明のβ−カゼインターゲッティングベクターの構成要素、特に第１領域と第２領域の選定は、ベクターシステムの効率を決定する重要な要素であって、本発明のベクターは、次の特徴を持つ。
【００２７】
本発明の「第１領域」は、牛β−カゼイン遺伝子のプロモータを有し、このプロモータの前後に位置した牛β−カゼイン遺伝子のエクソン１、２およびイントロン１を含み、牛β−カゼイン遺伝子の核酸配列に相同である５〜１２ｋｂ長の核酸配列を持つ。牛β−カゼイン遺伝子プロモータは、外来タンパク質の発現を効果的に発現させるものと知られており（Kim et al., J Biochem(Tokyo)., 126(2);320-325, 1999）、これは、外来の目的タンパク質を大量生産しようとする本発明の目的に適する。より好ましくは５．５ｋｂ〜１０ｋｂの長さを持つ。
【００２８】
本発明の「第２領域」は、牛β−カゼイン遺伝子のエクソン５、６、７、８およびイントロン５、６、７からなり、牛β−カゼイン遺伝子の核酸配列に相同である２．８〜３．５ｋｂ長の核酸配列を有する第２領域を含む。より好ましくは３．０〜３．２ｋｂ長の核酸配列を持つ。
【００２９】
この際、β−カゼイン遺伝子の核酸配列の５’−３’配列において、第１領域が上流に該当し、第２領域が下流に該当する。
【００３０】
本発明において、「相同（homologous）」とは、第１領域または第２領域とこれに相当するβ−カゼイン遺伝子の核酸配列との同一性の程度を示すもので、少なくとも９０％以上同一であり、好ましくは９５％以上同一である。
【００３１】
本発明の「目的のタンパク質をコードする核酸クローニング部位」とは、特定の制限酵素と認知されて切断される部位であって、切断された部位に、目的のタンパク質をコードする核酸配列が簡便に挿入できる。
【００３２】
前記ベクターのクローニング部位に挿入可能な医学・産業的に有用な目的タンパク質の例には、ホルモン、サイトカイン、酵素、凝固因子、輸送タンパク質、受容体、調節タンパク質、構造タンパク質、転写因子、抗原、抗体などがある。
【００３３】
目的のタンパク質の具体的な例としては、トロンボポエチン、ヒト成長ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、成長ホルモン放出ペプチド、インターフェロン類、インターフェロン受容体類、コロニー刺激因子類、グルカゴン様ペプチド類（ＧＬＰ−１など）、Ｇタンパク連結型受容体、インターロイキン類、インターロイキン受容体類、酵素類、インターロイキン結合タンパク質類、サイトカイン結合タンパク質類、マクロファージ活性因子、マクロファージペプチド、Ｂ細胞因子、Ｔ細胞因子、タンパク質Ａ、アレルギー抑制因子、細胞壊死糖蛋白質、免疫毒素、リンポ毒素、腫瘍壊死因子、腫瘍抑制因子、転移成長因子、α−１抗トリプシン、アルブミン、α−ラクトアルブミン、アポリポタンパク質−Ｅ、赤血球生成因子、高糖鎖化赤血球生成因子、アンギオポエチン類、ヘモグロビン、トロンビン、トロンビン受容体活性ペプチド、トロンボモジュリン、血液因子VII、VIIａ、VIII、IXおよびXIII、プラスミノゲン活性因子、フィブリン結合ペプチド、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、ヒルジン、タンパク質Ｃ、Ｃ−反応性タンパク質、レニンインヒビター、コラゲナーゼ阻害剤、スーパーオキシドジスムターゼ、レプチン、血素板由来成長因子、上皮細胞成長因子、表皮細胞成長因子、アンギオスタチン、アンギオテンシン、骨形成成長因子、骨形成促進タンパク質、カルシトニン、インシュリン、アトリオペプチン、軟骨誘導因子、エルカトニン、結合組織活性因子、組織因子経路抑制剤、濾胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、黄体形成ホルモン放出ホルモン、神経成長因子類、副甲状線ホルモン、レラキシン、セクレチン、ソマトメジン、インシュリン様成長因子、副腎皮質ホルモン、グルカゴン、コレシストキニン、膵臓ポリペプチド、ガストリン放出ペプチド、副腎皮質刺激ホルモン放出因子、甲状線刺激ホルモン、オートタキシン、ラクトフェリン、ミオスタチン、受容体類、受容体拮抗物質、細胞表面抗原、ウィルス由来ワクチン抗原、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体および抗体断片などがあり、これらに制限されるものではない。
【００３４】
本発明において、「選別マーカー（selection marker）」は、遺伝子ターゲッティングベクターで形質転換された細胞を選別するためのものであって、薬物耐性、栄養要求性、細胞毒性剤に対する耐性または表面タンパク質の発現などの選択可能表現型を与えるマーカーが使用でき、ポジティブ選別マーカーとネガティブ選別マーカーがある。
【００３５】
本発明のベクターは、ポジティブ選別マーカーを含む。「ポジティブ選別マーカー」は、選択剤（selective agent）が処理された環境で選択マーカーを発現する細胞のみが生存するようにしてポジティブ選択を可能にするマーカーであって、ネオマイシン（Ｎｅｏ）、ハイグロマイシン（Ｈｙｇ）、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ（ｈｉｓＤ）またはグアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｇｐｔ）などがあるが、これらに制限されるものではない。本発明では、ネオマイシンをポジティブ選別マーカーとして使用した。
【００３６】
また、本発明のベクターは、ネガティブ選別マーカーをさらに含むことができる。「ネガティブ選別マーカー」は、無作為的挿入（random insertion）の行われた細胞を選別して除去するネガティブ選択を可能にするマーカーであって、単純ヘルペスウィルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｈｐｒｔ）、シトシンデアミナーゼ、ジフテリア毒素などがあるが、これらに制限されるものではない。ネガティブ選別マーカーは、第１領域の５’末端側または第２領域の３’末端側に位置する。本発明では、ジフテリア毒素をネガティブ選別マーカーとして使用した。ジフテリア毒素は、チミジンキナーゼと比較していろいろの利点がある。第一に、チミジンキナーゼはｇａｎｃｙｃｌｏｖｉｒ（ＧＡＮＣ）処理を要求するが、これに対し、ジフテリア毒素はいずれの処理も要求しないという点で便利である。第二に、チミジンキナーゼ／ｇａｎｃｙｃｌｏｖｉｒ（ＧＡＮＣ）システムは、チミジンキナーゼ遺伝子のない細胞も死滅する可能性が高いということが既に報告されたことがある（Yoshiyasu Kaneko et al., Cancer Letters, 96;105-110, 1995）。このような点において、ネガティブ選別マーカーとしてジフテリア毒素が有利である。
【００３７】
この際、ポジティブおよびネガティブ選別マーカーは、別個のプロモータ、ｐｏｌｙＡなどを持つことを特徴とする。使用されるプロモータは、例えば猿ウィルス４０（ＳＶ４０）、マウス乳房腫瘍ウィルス（ＭＭＴＶ）プロモータ、ＨＩＶの長い末端反復部（ＬＴＲ）プロモータ、モロニーウィルス、シトメガロウィルス（ＣＭＶ）プロモータ、エプスタインバーウィルス（ＥＢＶ）プロモータ、ＲＳウィルス（Respiratory Syncytical Virus、ＲＳＶ）プロモータ、ＲＮＡポリメラーゼIIプロモータ、β−アクチンプロモータ、ヒトヘモグロビンプロモータ、ヒト筋肉クレアチンプロモータなどがあるが、これらに制限されるものではない。
【００３８】
前記ベクターとゲノム上のβ−カゼイン遺伝子の相同的組み換えが起こると、ベクター上の目的のタンパク質をコードする核酸が宿主細胞のβ−カゼインゲノム遺伝子に統合（integration）され、宿主細胞のβ−カゼインプロモータによってβ−カゼインタンパク質の代わりに発現される。
【００３９】
本発明の牛β−カゼインベクターは、細胞内で相同的組み換えの効率を高めるために、次の特徴を持つ。
【００４０】
ゲノム上の特定の遺伝子と目的のタンパク質をコードする核酸配列が相同的組み換えによって統合される効率は、ターゲッティングベクターシステム、特に２つの組み換え配列間の同一程度と相同標的配列の長さに多く左右される（Scheerer et al., Mol Cell Biol., 14(10)6663-6673, 1994; Thomas et al., Cell, 51(3);503-512, 1987; Hasty et al., Mol Cell Biol., 11(11);5586-5591, 1991; Lu et al., Blood, 102(4);1531-1533, 2003）。本発明は、このような点を考慮し、第１領域と第２領域の相同標的部位と長さを最適化した。また、本発明のベクターは、ゲノムの牛β−カゼイン遺伝子と本発明のベクターを整列したとき、ポジティブ選別マーカー位置に該当する領域、例えばエクソン３〜４、イントロン２〜４に該当する部分がベクターに含まれないように操作して、相同的組み換えの際にゲノムとベクターの整列時の空間的な妨害を最小化した。また、第１領域が終わる部位に目的のタンパク質を挿入するＭＣＳを置くようにして、目的のタンパク質を第１領域の任意の位置に挿入させる既存の方法に比べて遺伝的操作を便利にした。また、本発明のベクターは、相同領域が目的の遺伝子およびポジティブ選別マーカーを中心として左右にのみ存在するようにして交差地点が２つのみ生成されるようにした。これに反し、第２領域の任意の位置に目的のタンパク質を挿入させる既存の方法（SHEN Wei et al., Chinese Journal of Biotechnology, 20(3);361-365, 2004）によれば、交差地点が３つ発生するので、ターゲッティングされたクローンの選別に難しさが伴って効率も減少する。
【００４１】
上述した特徴を有する本発明のベクターシステムを利用する場合、β−カゼイン遺伝子が全く発現されない牛の体細胞においても効率よく相同的組み換えが誘導され、牛ゲノム上のβ−カゼイン遺伝子と目的のタンパク質をコードする核酸を安定的に統合させた。
【００４２】
本発明の具体的な様態において、β−カゼインターゲッティングベクターとして、ｐＢＣＫＩI、ｐＢＣＫＩIIベクター、および前記ベクターにネガティブ選別マーカーをさらに含むｐＢＣＫＩＤＴI、ｐＢＣＫＩＤＴIIベクターを製造した。
【００４３】
ｐＢＣＫＩIは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIＳＫ（＋）プラスミド骨格の１８．８ｋｂ長を有するベクターであって、牛β−カゼイン遺伝子プロモータを含む８ｋｂとエクソン１、イントロン１およびエクソン２を有する合計１０ｋｂ程度の第１領域を有する。第２領域は、３．１ｋｂ程度の長さを有し、牛β−カゼイン遺伝子のエクソン５、６、７、８、イントロン５、６、７、８およびイントロン断片４、８を含む。また、ｐＢＣＫＩIはｎｅｏ選別マーカー領域を持つ。ｐＢＣＫＩIベクターは、ＳａｃII、ＮｏｔIおよびＢａｍＨIの３つの制限酵素部位を有し、この制限酵素部位に目的のタンパク質をコードする遺伝子を簡便に挿入することができる（図１）。
【００４４】
ｐＢＣＫＩIIは、ｐＧＥＭ７Ｚｆ（＋）プラスミド骨格の１４．８ｋｂ長さを有するベクターであって、牛β−カゼイン遺伝子プロモータを含む４ｋｂ、エクソン１、イントロン１およびエクソン２を有する合計６ｋｂ程度の第１領域を持つ。第２領域は、３．１ｋｂ程度の長さを有し、牛β−カゼイン遺伝子のエクソン５、６、７、８とイントロン５、６、７とイントロン断片４、８を含む。また、ｐＢＣＫＩIは、ｎｅｏ選別マーカー領域を持つ。ｐＢＣＫＩIベクターは、ＳａｃII、ＮｏｔIおよびＢａｍＨIの３つの制限酵素部位を有し、この制限酵素部位に、目的のタンパク質をコードする遺伝子を簡便に挿入することができる（図２）。
【００４５】
ｐＢＣＫＩＤＴI、ｐＢＣＫＩＤＴIIベクターは、それぞれｐＢＣＫＩI、ｐＢＣＫＩIIベクターのＸｈｏIおよびＳａｌI部位に１．３ｂｋｂ ＤＴ遺伝子を挿入して製作した。
【００４６】
前記ベクター製作は、当該技術分野でよく知られている遺伝子組み換え技術を用いて製造することができ、部位特異的ＤＮＡの切断および連結は、当該技術分野で一般に知られている酵素などを使用する。
【００４７】
前記製作したベクターにヒトトロンボポエチン（ＴＰＯ）遺伝子を挿入した（図１７、図１８、図１９）。０．３ｋｂ牛成長ホルモン（ｂＧＨ）の付いた１ｋｂヒトトロンボポエチン（ＴＰＯ）遺伝子ｃＤＮＡを製作した（Sohn et al., DNA Cell Biol., 18(11);845-852, 1999）。牛成長ホルモンは、ｍＲＮＡを安定的に発現させるために挿入された。ヒトトロンボポエチンは、血素板の生産に関与する巨核細胞（megakaryocyte）の増殖と分化のような巨核細胞発生の重要な調節因子中の一つである。血素板生産の主要な調節因子として、巨核細胞の分化と成熟を促進させる中枢的な役割をする。過度な化学療法と骨髄利殖手術を経た患者は、激しい好中球減少症（neutropenia）と血素板減少症を示す（Lok et al., Stem Cells, 12(6);586-598, 1994; Kaushansky et al., Stem Cells, 15(1);97-102, 102-103, 1997; Kaushansky et al., Ann Intern Med., 126(9);731-733, 1997; Kaushansky et al., Leukemia, 11(3);426-427, 1997; Kaushansky et al., Annu Rev Med., 48;1-11, 1997）。実験動物モデルにおいて、組み換えトロンボポエチン（ＴＰＯ）タンパク質は、血素板減少症を軽減させるものと確認され、治療の目的として使用できる明確な可能性を示した。トロンボポエチン（ＴＰＯ）遺伝子は、ｐｈａｓｅ１臨床実験で安定性と効能が検定された（Fanucchi et al., N Engl J Med., 336(6);404-409, 1997; Basser et al., Lancet., 348(9037);1279-1281, 1996; O'Malley et al., Blood, 88(9);3288-3298, 1996）。また、トロンボポエチン遺伝子は、抗癌化学療法を受けている骨髄抑制（myelosuppressed）患者の血素板生産能力を回復させるために使用できるということが明らかになった。
【００４８】
その中でも、ｐＢＣＴＰＯＫＩＤＴIIを大腸菌（Escherichia coli）に導入し、２００５年１０月１７日にＫＣＴＣ（Korea collection for Type Cultures）（韓国大田市儒城區魚隠洞５２番地の韓国生命工学研究院）に寄託番号第ＫＣＴＣ １０８６４ＢＰ号で寄託した。
【００４９】
前記ベクターのうち、第１領域が約６ｋｂ長さを有するｐＢＣＫＩIIがｐＢＣＫＩIベクターよりゲノムのβ−カゼイン遺伝子にターゲッティングされる効率が高かった。そして、ネガティブ選別マーカーを有するｐＢＣＫＩＤＴIIベクターがｐＢＣＫＩIIより約４倍〜５倍程度増加したターゲッティング効率を持つ。ｐＢＣＴＰＯＫＩＤＴIIベクターは、牛胚芽線維芽細胞（bovine fetal fibroblasts）を３６．６％、牛耳組織線維芽細胞（bovine ear skin fibroblasts）を４１．４％の効率で遺伝子ターゲッティングさせたが、これは、既存のＧｏａｔ ｆｅｔａｌ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ（SHEN Wei et al., Chinese Journal of Biotechnology, 20(3);361-365, 2004）における１２．７％遺伝子ターゲッティング効率より約３．３倍（４１．４％／１２．７％）程度優れた。これにより、本発明のベクターシステムは、牛体細胞のβ−カゼイン遺伝子に目的の遺伝子を高効率で打ち込むことが可能な高効率のベクターであることを証明した。
【００５０】
別の様態において、本発明は、前記ベクターで遺伝子ターゲッティングされた牛の体細胞に関する。
【００５１】
本発明のベクターでターゲッティングされる細胞は、牛から由来する１次、２次または永久細胞である。好ましくは、前記細胞は、牛、羊、山羊、豚、馬、ウサギ、犬、猿などから由来するが、これらに制限されるものではない。細胞を分離または活性化し得る有用な組織としては、肝、腎臓、脾臓、骨、骨髄、胸腺、心臓、筋肉、肺臓、脳、精素、卵巣、膵島（islet）、内臓、骨髄、耳、皮膚、胆汁組織、前立腺、膀胱、胚芽（embryo）、免疫系および造血系などがあるが、これらに制限されるものではない。細胞タイプは、線維芽細胞、上皮細胞、神経細胞、胚芽細胞、肝細胞、および濾胞細胞などがあるが、これらに制限されるものではない。好ましくは、線維亜細胞または耳組織細胞である。本発明の具体的な実施例によって、胚芽線維芽細胞より耳組織線維芽細胞においてベクターの遺伝子ターゲッティング効率がさらに高かった。
【００５２】
前記細胞内に本発明のベクターを導入する方法は、核酸を細胞内に導入するいずれの方法も含み、当該分野で公知になっているように、適切な標準技術を選択して行うことができる。エレクトロポレーション（electroporation）、リン酸カルシウム共沈（calcium phosphate co-precipitaion）、レトロウィルス感染（retroviral infection）、マイクロインジェクション（microinjection）、ＤＥＡＥ−デキストラン（DEAE-dextran）、陽イオンリポソーム（cationic liposome）法などがあり、これらに制限されるものではない。この際、円形のベクターを適切な制限酵素で切断し、線形のベクターの形態またはプラスミドを除去した線形のベクターの形態で導入することが好ましい。
【００５３】
本発明の具体的な実施では、牛胚芽線維芽細胞（ｂＥＴ）と牛耳組織線維芽細胞（ｂＥＳＦ）に、ヒトトロンボポエチン（ｈＴＰＯ）遺伝子が挿入されたβ−カゼインターゲッティングベクターを、リポフェクタミンＴＭ２０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（登録商標）を使用する陽イオンリポソーム法を用いてターゲッティングした。陽イオンリポソームは、（−）電荷を有するＤＮＡと効率よく結合して細胞膜に結合することによりＤＮＡの中性化を成し、結局ＤＮＡは細胞内に導入される。そして、ベクターがゲノムのβ−カゼイン遺伝子に正確にターゲッティングされたか否かは、抗生剤に抵抗性を持って生き残った細胞のゲノムＤＮＡをｌｏｎｇ ｒａｎｇｅ ＰＣＲとサザンブロットによって確認した。このような過程により、牛の体細胞から、ヒトトロンボポエチン（ｈＴＰＯ）遺伝子がゲノムのβ−カゼイン遺伝子に正確にターゲッティングされた細胞株を製造することができた。その中でも、牛耳組織線維芽細胞にｐＢＣＴＰＯＫＩIIベクターがターゲッティングされた８１番の細胞株をＢＣＴＰＯＫＩｂＥＳＦ８１と命名し、ＫＣＴＣ（韓国大田市儒城區魚隠洞５２番地）に２００４年１１月１０日付で第ＫＣＴＣ １０７２０ＢＰ号で寄託した。
【００５４】
別の様態において、本発明は、牛体細胞を用いた核移植により得られた受精卵に関する。
【００５５】
本発明において、「核移植（nuclear transfer）」とは、細胞の核を、既に核を除去した卵子に入れて移植させることを意味し、このように核移植された受精卵を着床させて生まれた個体は、核供与細胞の遺伝的物質がレシピエント細胞質にそのまま伝達されたため、遺伝的に全く同一の複製個体である。
【００５６】
別の様態において、本発明は、（１）牛β−カゼイン遺伝子ターゲッティングベクターで牛の体細胞を形質転換させる段階と、（２）牛の体細胞を培養して相同的組み換えを誘導する段階と、（３）相同的組み換えによって、牛β−カゼイン遺伝子がターゲッティングされた牛の体細胞を選別する段階とを含む、牛β−カゼイン遺伝子がターゲッティングされた牛の体細胞を製造する方法に関する。
【００５７】
本発明の牛β−カゼイン遺伝子ターゲッティングベクター、具体的にｐＢＣＫＩI、ｐＢＣＫＩII、ｐＢＣＫＩＤＴIおよびｐＢＣＫＩＤＴIIは、牛β−カゼイン遺伝子ターゲッティングに最適化されたベクターなので、前記ベクターを用いる場合、β−カゼイン遺伝子がターゲッティングされた牛の体細胞製造効率を高めることができる。
【００５８】
また、β−カゼイン遺伝子がターゲッティングされた牛の体細胞を製造する際に効率を増加させるために、（１）段階で円形のベクターの形で形質転換させるのではなく、制限酵素でベクターを切断して線形のベクターの形で形質転換させ、或いは本発明のベクター骨格からプラスミド骨格を除去した線形のベクターの形で形質転換させた。
【００５９】
別の様態において、本発明は、（１）前記牛β−カゼイン遺伝子ターゲッティングベクターで牛の体細胞を形質転換させる段階と、（２）前記牛の体細胞を培養して相同的組み換えを誘導する段階と、（３）相同的組み換えによって、牛β−カゼイン遺伝子がターゲッティングされた牛の体細胞を選別する段階と、（４）牛卵子の核を除去し、遺伝子ターゲッティングされた細胞を導入して、体細胞核移植による受精卵を製造する段階と、（５）受精卵を着床させる段階とを含む、形質転換牛を製造する方法に関する。
【００６０】
上述したように、本発明のベクターは、牛のβ−カゼイン遺伝子へのターゲッティングが最適化されたベクターなので、形質転換牛の製造に適する。
【００６１】
卵子の遺伝物質を除去する方法には、物理的な方法、化学的な方法、サイトカラシン（Cytochalasin）Ｂを使用した遠心分離法などがある（Tatham et al., Hum Reprod., 11(7);1499-1503, 1996）。本発明では、ガラスマイクロピペット（glass micropipette）を用いた物理的な核除去方法を使用した。
【００６２】
遺伝子ターゲッティングされた体細胞は、細胞膜融合法、細胞質内微細注入法などを用いて、核の除去された卵子内に導入される。細胞膜融合法は、簡単でありながら、大規模受精卵の生産に適するという利点があり、細胞質内微細注入法は、核と卵子内物質との接触を極大化させるという利点がある。
【００６３】
体細胞と核除去卵子との融合は、電気刺激によって細胞膜の粘度を変化させて融合させる方法によって組み換える。この際、微細電流・電圧を自由に調整することが可能な電気融合器を利用すれば便利である。
【００６４】
別の様態において、本発明は、（１）前記本発明に係るベクターで動物の体細胞を形質転換させる段階と、（２）相同的組み換えによって、目的のタンパク質がターゲッティングされた細胞を選別する段階と、（３）遺伝子ターゲッティングされた細胞を核の除去された動物の胚芽に導入する段階と、（４）形質転換動物を製造するために、ミルク生産動物に受精卵を着床させる段階と、（５）形質転換動物からミルクを生産する段階を含む、ミルクから目的のタンパク質を生産する方法に関する。
【００６５】
核移植された受精卵は、活性化させて移植可能な段階まで発生させた後、代理母に着床される。
【００６６】
複製受精卵の活性化は、受精卵が分裂し得るように成熟過程で一時的に停止された細胞周期をさらに稼動させることを意味する。複製受精卵の活性化のためには、細胞周期停止要素、例えばＭＰＦ、ＭＡＰキナーゼなどの細胞信号伝達物質の活性を低下させなければならないが、このためには、複製受精卵内のカルシウムイオンの増加が必須的である。大きくは、電気的刺激によって細胞膜透過度を変形して細胞外からカルシウム流入を急激に増加させる方法と、イノマイシン（ionomycin）および６−ＤＭＡＰなどの化学的物質を用いて細胞周期停止要素の活性を直接阻害させる方法などがあるが、これらの方法は、単独でまたは組み合わせて使用する。本発明では、イノマイシンと６−ＤＭＡＰを処理して卵子を活性化させ、胚盤胞発達段階まで体外培養した。
【００６７】
その後、生まれた個体は、授乳期にβ−カゼインの代わりに目的のタンパク質を発現する形質転換牛である。すなわち、前記β−カゼイン遺伝子ターゲッティングベクターが、ターゲッティングされた細胞を用いて核移植された受精卵を着床させて形質動物を作る場合、副作用、例えば動物の発達障害なしに目的のタンパク質を形質転換牛のミルクから大量で収得することができる。
【００６８】
別の様態において、本発明は、前記方法によって製造された形質転換牛のミルクから目的のタンパク質を収得する方法に関する。
【００６９】
形質転換牛のミルクで過多発現される目的のタンパク質は、通常の方式で精製できる。塩析（例えば、硫酸アンモニウム沈澱、リン酸ナトリウム沈澱など）、溶媒沈澱（例えば、アセトン、エタノールなどを用いたタンパク質分画沈殿）、透析、ゲル濾過、イオン交換、逆相カラムクロマトグラフィなどのカラムクロマトグラフィおよび限外濾過などの技法を単独でまたは組み合わせて適用させ、本発明の目的タンパク質を得ることができる（Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.(1982); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989); Deutscher, M., Guide to Protein Purification Methods Enzymology, vol. 182. Academic Press. Inc., San Diego, CA(1990)）。
【００７０】
以下、下記実施例によって本発明をさらに詳しく説明する。但し、下記実施例は、本発明を例示するためのものに過ぎず、本発明の範囲を限定するものではない。
【００７１】
〔実施例１：牛β−カゼイン遺伝子ターゲティングベクターの製作〕
〔１−１ ｐＢＣＫＩIとｐＢＣＫＩIIベクターの製作〕
遺伝子ターゲッティングベクターの製作のために、ミルクにおいて外来治療タンパク質遺伝子の発現を誘導すると知られている牛β−カゼインプロモータ部位を含んでいる牛β−カゼイン遺伝子を利用した。
【００７２】
ｐＢＣ１０ベクター（図９）は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIＳＫ（＋）プラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）ベクター内に牛β−カゼイン遺伝子５’側塩基配列８ｋｂプロモータ、エクソン１、２ｋｂイントロン１およびエクソン２の５’ＵＴＲを含む（Sohn et al., J Biotechnol., 103(1);11-19, 2003）。ｐＢＣ１０ベクターのβ−カゼイン遺伝子部位は、本発明のベクター、すなわちｐＢＣＫＩIおよびｐＢＣＩＫＩIIのロングアーム（第１領域に該当）として使用された。図１０に示すように、１０ｋｂβ−カゼイン遺伝子をＳａｃIとＳａｃII制限酵素で切断し、これをｐＢＣＫＩIベクターの第１領域として使用した（図１０と図１４）。ＡａｔIIとＳａｃII制限酵素で切断された牛β−カゼイン遺伝子の４ｋｂプロモータ、解読されないエクソン１、２およびイントロン１を含む６ｋｂβ−カゼインプロモータ部位は、ｐＢＣＫＩIIのロングアーム（第１領域に該当）として使用した（図１１および図１４）。
【００７３】
ｐＢＣ３．１ベクター（図１２）は、本発明の第２領域に該当する部位を含む。牛ゲノムＤＮＡからエクソン５、６、７、８とイントロン５、６、７とイントロン切片４、８を含んでいる牛β−カゼイン遺伝子塩基配列４６７６〜７８９８の３．２ｋｂ断片をＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ反応のために使用されたプライマーの塩基配列は、次の通りである。
配列番号１順方向プライマー：５’−attcagtcgagtggaacataaactttcagcc−３’
配列番号２逆方向プライマー：５’−catatgtcgactgtgagattgtattttgact−３’
太字（配列番号１によって示される配列においては、５’末端から数えて第７および８番目のｔおよびｃが「太字」に相当し、配列番号２によって示される配列においては、５’末端から数えて第９および１１番目のｇおよびｃが「太字」に相当する）は、ＸｈｏI、ＳａｌI制限酵素部位を作るために変わった塩基を示す。
【００７４】
ＰＣＲ産物（図１２）は、ＸｈｏIとＳａｌI制限酵素によって切断した後、ｐＧＥＭ−Ｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）ベクターのＳａｌI部位に連結した。ｐＢＣ１０ベクターに挿入するための適切な制限酵素部位を作るために、ｐＧＥＭ−Ｔベクター内にある３．２ｋｂ牛β−カゼイン遺伝子断片をＨｉｎｃIIとＳａｌI制限酵素を用いて切断した。そのβ−カゼイン遺伝子３．１ｋｂ断片は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIＳＫ（＋）のＳａｌI部位に連結し、その結果、ＢＣ３．１ベクターを完成した。
【００７５】
選別マーカーとして用いられるｎｅｏ遺伝子断片をｐＢＣ１０ベクターに挿入した。ＳＶ４０ｏｒｉ、初期プロモータ、ＳＶ４０初期スプライシング部位およびポリアデニル化部位を含むｎｅｏ遺伝子断片を得るために、ｐＭＡＭｎｅｏ（ＣＬＯＮＴＨＥＣＨ）ベクターを使用した。ｐＭＡＭｎｅｏをＢａｍＨI制限酵素で切断して得た２．７ｋｂ ＤＮＡ断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIＳＫ（＋）のＢａｍＨI部位に連結し、連結されたベクター内にある２ｋｂｎｅｏ遺伝子断片をＢｇｌIIとＢａｍＨI制限酵素で切断した後、ｐＳＰ７３（Ｐｒｏｍｅｇａ）ベクターのＢｇｌII部位に連結した。最後に、ｐＳＰ７３内にある２ｋｂｎｅｏ遺伝子断片は、ＢｌｇIIとＥｃｏＲＶ制限酵素で切断した後、０．７ｋｂ ｐＭＡＭｎｅｏ遺伝子断片を持っているｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIＳＫ（＋）のＢｇｌIIとＥｃｏＲＶ部位にさらに連結した。このようなＤＮＡ切断および連結過程は、ｐＢＣ１０ベクター内に２．７ｋｂｎｅｏ遺伝子断片を挿入するために要求された（図１４）。
【００７６】
図１４に示すように、ｐＢＣＫＩI、ｐＢＣＫＩIIベクターカセットは、ｐＢＣ１０ベクター内にｐｎｅｏ２．７とｐＢＣ３．１の遺伝子断片を組み込むことにより完成した。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIＳＫ（＋）内にあるｎｅｏ遺伝子をＢａｍＨI、ＥｃｏＲV制限酵素で切った後、ｐＢＣ１０ベクターのＢａｍＨI、ＥｃｏＲV制限酵素部位に連結した。ｐＢＣ３．１ベクターは、ＥｃｏＲV、ＳａｌI制限酵素で切断した後、ｐＭＡＭｎｅｏ遺伝子断片を持っているｐＢＣ１０ベクターのＥｃｏＲV、ＳａｌI認識部位に連結し、その結果ｐＢＣＫＩIベクターを完成した。ｐＢＣＫＩIベクターカセットをＡａｔII、ＳａｌI制限酵素で切断した後、ｐＧＥＭ−７Ｚｆ（Ｐｒｏｍｅｇａ）のＡａｔII、ＸｈｏI認識部位に連結し、その結果ｐＢＣＫＩIIベクターカセットを完成した。
【００７７】
〔１−２ ｐＢＣＫＩＤＴIとｐＢＣＫＩＤＴIIベクターの製作〕
前記で製作したベクターにネガティブ選別マーカー（negative selection marker）としてのＤＴ遺伝子が挿入されたベクターを製作しようとした（図３と図１６）。ネガティブ選別マーカーを持つｐＢＣＫＩＤＴI、ｐＢＣＫＩＤＴIIベクターを用いる場合、無作為的にベクターが細胞に挿入された場合、細胞は死滅するので、遺伝子ターゲッティングされた細胞のみを選別することが可能な効率を高められる（図３と図１６）。本発明に使用されたＤＴ遺伝子は、Ｌｅｘｉｃｏｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｔｈｅ Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ、Ｔｅｘ．）社のｐＫＯ ＳｅｌｅｃｔＤＴベクターカセットから由来した。制限酵素ＲｓｒIIを使用することにより、ＳＶ４０ＰｏｌｙＡとＲＮＡポリメラーゼIIプロモータと共にジフテリア毒素Ａ鎖（ＤＴ）遺伝子が選別された。選別されたＤＴ遺伝子をｋｌｅｎｏｗ ｆｉｌｌｉｎｇした後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIＫＳ（＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＨｉｎｄII部位に挿入することにより、ｐＫＳ ＤＴベクターを完成した。ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIＫＳ（＋）にあるＤＴ遺伝子をＸｈｏIとＥｃｏＲVで切断した後、ｐＳＰ７３（Ｐｒｏｍｅｇａ）ベクターのＸｈｏIとＰｖｕII部位に挿入することにより、ｐＳＰ７３ ＤＴベクターを完成した（図１５）。ｐＳＰ７３ ＤＴベクターに挿入されているＤＴ遺伝子は、ＸｈｏIとＳａｌI遺伝子によって選別した後、ｐＢＣＫＩIベクターカセットのＳａｌI部位に挿入することにより、ｐＢＣＫＩＤＴIベクターカセットを完成した。完成したｐＢＣＫＩＤＴIベクターカセットをＡａｔIIとＳａｌIで切った後、ｐＧＥＭ−７Ｚｆ（＋）（Ｐｒｏｍｅｇａ）ベクターのＡａｔIIとＸｈｏI部位に挿入することにより、ｐＢＣＫＩＤＴIIベクターカセットを完成した（図１６）。
【００７８】
ＰＣＲによって合成または連結されたＤＮＡ断片を酵素マッピング（enzyme mapping）およびシーケンシングして前記β−カゼインターゲッティングベクターが正確に製作されたかを確認した。
【００７９】
〔実施例２：牛β−カゼイン遺伝子ターゲティングベクターへのヒトトロンボポエチン遺伝子の挿入〕
図１７、図１８および図１９に示すように、３００ｂｐ牛成長ホルモン遺伝子と共に、１ｋｂヒトトロンボポエチン（ｈＴＰＯ）遺伝子をｐＢＣＫＩI、ｐＢＣＫＩIIおよびｐＢＣＫＩＤＴIIベクターカセットに挿入した。ＳａｃIIとＮｏｔI制限酵素部位を持っているその１．３ｋｂ外来遺伝子をｐＢＣＫＩI、ｐＢＣＫＩII、ｐＢＣＴＰＯＫＩＤＴIIベクターのＳａｃIIとＮｏｔI制限酵素部位に連結し、その結果、ｐＢＣＴＰＯＫＩI、ｐＢＣＴＰＯＫＩIIおよびｐＢＣＴＰＯＫＩＤＴIIベクター構造物を完成した（図１７、図１８および図１９）。その中でも、ｐＢＣＴＰＯＫＩＤＴIIを大腸菌（Escherichia coli）に導入して２００５年１０月１７日にＫＣＴＣ（韓国大田市儒城區魚隠洞５２番地の韓国生命工学研究院）に寄託番号第ＫＣＴＣ １０８６４ＢＰ号で寄託した。
【００８０】
〔実施例３：ｐＢＣＴＰＯＫＩI、ｐＢＣＴＰＯＫＩII、ｐＢＣＴＰＯＫＩＤＴIIの牛胚芽線維芽細胞（ｂＥＦ）と牛耳組織線維芽細胞（ｂＥＳＦ）内への導入〕
〔３−１ 線形ベクターの導入〕
プラスミドＤＮＡであるｐＢＣＴＰＯＫＩIとｐＢＣＴＰＯＫＩIIを「ＱＩＡｆｉｌｔｅｒ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｄｉ ｋｉｔｓ」（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製した後、円形ＤＮＡをＣｓＣｌ−エチジウムブロマイドグラジエント（CsCl-ethidium bromide gradient）による平衡遠心分離を用いて分離した。分離されたｐＢＣＴＰＯＫＩIとｐＢＣＴＰＯＫＩIIプラスミドをそれぞれ制限酵素ＳａｌI（図２０）とＡａｔII（図２１）で切って線形化した。エタノール沈澱過程によって精製されたＤＮＡの濃度を分光光度計（spectrophotometer）を用いて測定した。
【００８１】
線形化されたｐＢＣＴＰＯＫＩIとｐＢＣＴＰＯＫＩII構造物を継代２または３のｂＥＦとｂＥＳＦ細胞にリポフェクタミン２０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（商標登録）を用いて導入した。ＢＥＦは、各２、４、１０μｌ濃度のトランスフェクション試薬と２、４μｇＤＮＡ濃度別にトランスフェクションをテストした。ＢＥＳＦは、各２、４、１０μｌ濃度のトランスフェクション試薬と１、２、４μｇＤＮＡ濃度別にトランスフェクションをテストした。細胞は、トランスフェクション試薬−ＤＮＡ複合体に２４時間露出させた。
【００８２】
ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、０．００１％ゲンタマイシン（Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、１％ＭＥＭ非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）組成の培養液で５％ＣＯ２、３７℃の条件で細胞を培養した。培養液は毎日取り替えた。培養液の分量は、下記表のとおり、細胞培養容器に応じて調節した。
【００８３】
【表１】
【００８４】
コンフルアンスに達するまで成長した細胞は、１×トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）溶液を用いて３７℃の条件で３分間置いて細胞を培養容器から分離した後、ＤＰＢＳ（Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline）（Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて細胞を２回洗浄した。１×トリプシン−ＥＤＴＡ処理によって容器から分離した細胞株をゆっくりピペットしてそれぞれの細胞に解離した後、より広い培養容器に移して増殖させた。使用する１×トリプシン−ＥＤＴＡ溶液の分量は、下記表のとおり、培養容器のタイプに応じて異にした。
【００８５】
【表２】
【００８６】
実験順序は、次のとおりである：
【００８７】
【表３】
【００８８】
９６ウェル培養容器上でコンフルアンスに達するまで成長した細胞を４８ウェル培養容器に継代培養した後、漸次２４ウェル、１２ウェル、６ウェルおよび１００ｍｍの培養容器に移して培養した。６ウェル培養容器で、細胞の半分はＰＣＲ反応のために使用し、残りは６ウェル培養容器の２つのウェルに分けて培養した。
【００８９】
〔３−２ プラスミド部分を除去した線形ベクターの導入〕
ｐＢＣＴＰＯＫＩII、ｐＢＣＴＰＯＫＩＤＴIIベクター構造物において制限酵素ＡａｔIIとＣｌａIを用いてベクターからプラスミド部分を除去し線形化させた後、前記の方法と同様に牛耳組織線維芽細胞（ｂＥＳＦ）と牛胚芽線維芽細胞（ｂＥＦ）に形質転換させた（図２２と図２３）。
【００９０】
〔実施例４：それぞれの細胞株に対するＰＣＲ分析〕
Ｇ４１８抗生剤に抵抗性を有するそれぞれの細胞株に対して外来遺伝子導入有無または形質転換有無を確認するためにＰＣＲ分析を行った。「ＡｃｃｕＰｒｅｐ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ」（Ｂｉｏｎｅｅｒ）を用いて、６ウェル培養容器で培養された細胞の半分からゲノムＤＮＡを抽出し、「ＡｃｃｕＰｏｗｅｒ ＰＣＲ Ｐｒｅｍｉｘ」（Ｂｉｏｎｅｅｒ）を用いてＰＣＲを行った。ヒトトロンボポエチン遺伝子（ｈＴＰＯ）に対するプライマーセットと温度サイクリング（thermal cycling）条件は、次のとおりである。
配列番号３順方向プライマー：GGA GCT GAC TGA ATT GCT CCT CGT
配列番号４逆方向プライマー：CCT GAC GCA GAG GGT GGA CCC TCC
【００９１】
【表４】
【００９２】
ＰＣＲ結果より、Ｇ４１８抗生剤に抵抗性を有する大部分の細胞株は形質転換セルであることが分かった（図２５）。
【００９３】
〔実施例５：遺伝子ターゲッティング有無確認のためのＬｏｎｇ−ｒａｎｇｅ ＰＣＲ分析〕
形質転換された細胞株の中で遺伝子ターゲッティングされた細胞株を確認するために、Ｌｏｎｇ−ｒａｎｇｅ ＰＣＲを行った。形質転換細胞株のゲノムＤＮＡは、「ＡｃｃＰｒｅｐ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ」（Ｂｉｏｎｅｅｒ）を用いて抽出し、あるいは約５つ程度の細胞を液体窒素に約１分間浸漬した後、沸かし湯に約１分間浸漬する過程を３〜４回繰り返し行うことで細胞を分解し、ＤＮＡを露出させた。Ｌｏｎｇ−ｒａｎｇｅ ＰＣＲは、「ＡｃｃｕＰｏｗｅｒ ＨＬ ＰＣＲ Ｐｒｅｍｉｘ」（Ｂｉｏｎｅｅｒ）を用いて行った。
【００９４】
図７に示すように、ベクター構造物内にあるｎｅｏ遺伝子の３’末端に結合するように５’プライマーを準備し、３’プライマーは、ベクター構造物には含まれない内生的牛β−カゼインのイントロン８に結合するように準備した。遺伝子ターゲッティングされた細胞株は、１％アガロースゲルで４ｋｂＰＣＲ産物によって確認可能である。プライマーセットの塩基配列と温度サイクリング条件は次のとおりである。
配列番号５順方向プライマー：５’−ccacacaggcatagagtgtctgc−３’
配列番号６逆方向プライマー：５’−ccacagaattgactgcgactgg−３’
【００９５】
【表５】
【００９６】
実施例３−１と実施例３−２の方法によって遺伝子ターゲッティング有無とその効率を比較した。
【００９７】
実施例３−１の方法によるｌｏｎｇ−ｒａｎｇｅ ＰＣＲ分析の結果、２つの細胞クローンが遺伝子ターゲッティングされたことを確認することができた（図２８）。
【００９８】
実施例３−１の方法によってベクターを形質転換させる場合の効率は、次のとおりである。ｐＢＣＴＯＫＩIベクターが導入された体細胞のうち、合計４１個の細胞株を選別し、その中で３８個（９３％）の細胞株が形質転換されたと確認され、遺伝子ターゲッティングされた細胞株（０％）は得ることができなかった。また、実施例３−１の方法で形質転換させた場合、ｐＢＣＴＰＯＫＩIIベクターが導入された体細胞のうち、合計３１個の細胞株を選別し、その中で２９個（９４％）が形質転換されたと確認され、２個（７％）の遺伝子ターゲッティングされた細胞株を得ることができた（表６および図２８）。
【００９９】
【表６】
【０１００】
実施例３−２の方法によってベクターを形質転換させる場合の効率は、次のとおりである。ｐＢＣＴＰＯＫＩII、ｐＢＣＴＰＯＫＩＤＴIIをｂＥＦとｂＥＳＦ細胞に導入（transfection）した後、遺伝子ターゲッティング有無をｌｏｎｇ−ｔｅｍｐｌａｔｅ ＰＣＲによって確認した。少量のＤＮＡサンプルに対して第２ＰＣＲを行った（図２７と図２９）。
【０１０１】
第２ＰＣＲは、同一の条件にプライマーセット：５’−ttcactgcattctagttgtggtttgtcca−３’（配列番号８）；５’−tctaggaccaaacatcggcttactt−３’（配列番号９）を使用した。第２ＰＣＲまで行われた、遺伝子ターゲッティングされた細胞株は、３．４ｋｂ位置にバンド（band）を示す。
【０１０２】
図２９において、Ａは、ｂＥＳＦ細胞にｐＢＣＴＰＯＫＩＤＴIIベクターをトランスフェクションした細胞株に対するｌｏｎｇ−ｔｅｍｐｌａｔｅトＰＣＲの結果であり、５、３０、１７、１８、２０、２１、２６番の細胞株が遺伝子ターゲッティングされたことを示す。Ｂは、ｂＥＳＦ細胞にｐＢＣＴＰＯＫＩIIベクターをトランスフェクションした細胞株に対するｌｏｎｇ−ｔｅｍｐｌａｔｅ ＰＣＲ結果であり、１６番細胞株が遺伝子ターゲッティングされたことを示す。Ｃは、ネガティブコントロール（−）として使用された牛のゲノムＤＮＡとポジティブコントロール（＋）として使用されたｐｎｅｏＢＣ３．７に対するｌｏｎｇ−ｔｅｍｐｌａｔｅ ＰＣＲ結果である。
【０１０３】
ｐＢＣＴＰＯＫＩIIベクターとｐＢＣＴＰＯＫＩＤＴIIベクターをｂＥＦとｂＥＳＦ細胞にトランスフェクションさせた後、遺伝子ターゲッティング効率を比較した。その結果、ｐＢＣＴＰＯＫＩIIベクターがトランスフェクションされたｂＥＦ細胞における遺伝子ターゲッティング比率は１８．２％（１０／５５）であるが、これに対し、ｐＢＣＴＰＯＫＩＤＴIIベクターがトランスフェクションされたｂＥＦ細胞における遺伝子ターゲッティング比率は４１．４％（１２／２９）であって、ｐＢＣＴＰＯＫＩIIより遺伝子ターゲッティング効率が約２．３（４１．４％／１８．２％）倍高かった。また、ｐＢＣＴＰＯＫＩIIベクターがトランスフェクションされたｂＥＳＦ細胞における遺伝子ターゲッティング比率は５．７％（１２／２１２）であるが、これに対し、ｐＢＣＴＰＯＫＩＤＴIIベクターがトランスフェクションされたｂＥＳＦ細胞における遺伝子ターゲッティング比率は３６．６（６３／１７２）であって、ｐＢＣＴＰＯＫＩIIより遺伝子ターゲッティング効率が約６．４（３６．６％／５．７％）倍高かった。平均的にｐＢＣＴＰＯＫＩＤＴIIベクターは、ｐＢＣＴＰＯＫＩIIベクターより遺伝子ターゲッティング比率が約４．５（３７．３％／８．３％）倍高かった。これにより、ｐＢＣＫＩＤＴIIベクターカセットがｐＢＣＫＩIIベクターカセットに比べて遺伝子ターゲッティング効率が非常に高いことを確認した（表７）。また、ｐＢＣＴＰＯＫＩＤＴIIベクターによる、ｂＥＦにおける４１．４％の遺伝子ターゲッティング効率は、既存のＧｏａｔ ｆｅｔａｌ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓで１２．７％（SHEN Wei et al., Chinese Journal of Biotechnology, 20(3);361-365, 2004）の遺伝子ターゲッティング効率より３倍（４１．４％／１２．７％）以上高かった。これにより、本ｐＢＣＴＰＯＫＩＤＴIIベクターの遺伝子ターゲッティング効率が非常に優れることを確認した。
【０１０４】
【表７】
【０１０５】
〔実施例６：遺伝子ターゲッティング有無確認のためのサザンブロック（Southern blot）分析〕
実施例１で製作した様々な形の牛カゼイン遺伝子ターゲッティングベクターの体細胞へのターゲッティングを実施例３の方法によって行った結果、製作されたベクターの体細胞への遺伝子ターゲッティングが高効率で成功し、ターゲッティング効率は形質転換方法によって異なった。
【０１０６】
その中でも実施例３−１の方法で形質転換させ、ＰＣＲ分析によって、ＢＣＴＰＯＫＩIIベクターで遺伝子ターゲッティングされたものと確認された２つのクローンをサザンブロットによって再確認した。各細胞クローンを２つの１００ｍｍの培養容器で拡張培養した後、その一つはゲノムＤＮＡを抽出するために、細胞を集めて少なくとも１０μｇＤＮＡをそれぞれのクローンから抽出した。その後、３７℃の条件で１６時間ＥｃｏＲI制限酵素によって制限した。ＥｃｏＲIで制限されたＤＮＡを、１６時間１×ＴＡＥバッファで５０Ｖにて０．７５％アガロースゲル上に電気泳動することにより分離した。そのＤＮＡを、陽電荷を有する膜（membranes positively charged : Boehringer Mannheim）に移し、ヒトＴＰＯ ｃＤＮＡ（図３０）のあるベクター構造物に対する、指針書（Ｒｏｃｈｅ）に基づいてＲａｎｄｏｍ ｐｒｉｍｅｄ ＤＩＧ−ｌａｂｅｌｉｎｇ技術を用いて製作されたプローブでハイブリダイゼーションを行った。サザンブロット用プローブは、配列番号３および４のプライマーを用いてＰＣＲ ＤＩＧ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｍｉｘ（Ｒｏｃｈｅ）とＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて製作された。ＰＣＲ反応の温度サイクリングの条件は、次のとおりである。
【０１０７】
【表８】
【０１０８】
ＰＣＲ反応により、ＢＣＴＰＯＫＩIIベクターが牛β−カゼイン遺伝子ターゲッティングされたものと選定された２つの細胞株がターゲッティングされたことを再確認した（図３１）。８１番、８９番の２つの細胞株は、発明したベクターがゲノムの牛β−カゼイン遺伝子座にターゲッティングされたことが再確認された。
【０１０９】
この中でも、８１番クローンをＢＣＴＰＯＫＩｂＥＳＦ８１と命名し、ＫＣＴＣ（韓国大田市儒城區魚隠洞５２番地）に２００４年１１月１０日付けで第ＫＣＴＣ １０７２０ＢＰ号で寄託した。
【０１１０】
〔実施例７：牛体細胞の準備〕
韓国の畜産研究所の動物管理指針に基づいてこの実験を行った。１年に１２，０００ｋｇ以上のミルクを生産する牛（ホルスタイン種）の妊娠後４５日目となる胎児から牛胚芽線維芽細胞（ｂＥＦ）を分離し、既に報告された論文に従って細胞を準備した（Koo et al., Biol Reprod., 63(4);986-992, 2000）。胎児の頭部は、解剖用鋏を用いて除去し、肝と内臓などの柔らかい組織は、２つのｗａｔｃｈｍａｒｋｅｒ’ｓ ｆｏｒｃｅｐｓで掻き出して除去した。牛（ホルスタイン種）の耳組織線維芽細胞（ｂＥＳＦ）は、１年に１２，０００ｋｇ以上のミルクを生産する２年齢の牛の耳から分離した。ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）で２回洗浄した後、ｂＥＦとｂＥＳＦを１００ｍｍの培養容器上で解剖用刃を用いて薄切りにした。この実験の手続きは常温で行った。薄切りにした組織を０．０５％（ｗ／ｖ）トリプシン／０．５３ｍＭ ＥＤＴＡ溶液１０ｍＬに仕込み、３０分間３８．５℃の培養器で培養した。同量の１０％ＦＢＳを含んでいる細胞培養液を添加してトリプシンの活性を抑制した。細胞培養液は、ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、ペニシリン１００ユニット、ストレプトマイシン１０００μｇ／ｍＬ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）から組成した。強いピペットを行った後、５分間１５０×ｇの条件で遠心分離した。細胞を浮遊させた後、２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ程度の細胞濃度を持つように濃度を調整して１７５−ｃｍ２組織培養容器（Ｎｕｎｃ、Ｒｏｓｋｉｌｄｅ、Ｄｅｎｍａｒｋ）にコンフルアンスに達するまで成長するよう３７℃、５％ＣＯ２の条件で１０ｍＬの培養液を仕込んで培養した。ｂＥＦとｂＥＳＦ細胞を、２０％ＦＢＳと１０％ＤＭＳＯ（dimethyl sulphoxide）を含んでいる冷たいＤＰＢＳ（Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline）溶液を用いて凍結させた後、１６時間−７０℃に保管し、その後、外来遺伝子導入実験を行うまで液体窒素中に保管した。
【０１１１】
遺伝子ターゲッティングされた細胞株を得るためには、ＤＮＡの導入された細胞が老化または変形なしに体外培養システムで長期間生存することができなければならない。本発明において、ＢＣＴＰＯＫＩIとＢＣＴＰＯＫＩIIベクターは、牛胚芽線維芽細胞（ｂＥＦ）と牛耳組織線維芽細胞（ｂＥＳＦ）に導入された。羊の場合、出生した羊の線維芽細胞が胚芽線維芽細胞より体外培養でさらに安定的な染色体の数を示しながら長期間持続されるということが報告された（Williams et al., Mol Reprod Dev., 66(2);115-125, 2003）。本発明において、牛耳組織線維芽細胞（ｂＥＳＦ）は、牛胚芽線維芽細胞（ｂＥＦ）より体外培養において変形なしにさらに長期間培養された（表９）。
【０１１２】
【表９】
【０１１３】
継代４にある３０４個の牛耳組織線維芽細胞由来の細胞株のうち、５１個（１７％）の細胞株が継代８まで正常的な模様を示しながら体外培養された。これに対し、牛胚芽線維芽の場合、６％（９／１４９）の細胞株のみが継代８まで培養された。
【０１１４】
〔実施例８：遺伝子タターゲッティングされた細胞の解凍および凍結〕
実施例６のサザンブロット分析によって準備された、遺伝子ターゲッティングされた細胞を２つの１００ｍｍの培養容器でコンフルアンスに達するまで培養し、その中のいずれか一つの培養容器内にある細胞に対してサザンブロット分析を行った。残った他の容器内の細胞の半分を培養し続け、残りの半分は１６時間−７０℃で凍結した後、液体窒素に保管した。核供与細胞として用いられる、出来る限り多数の細胞を確保するために、継代培養と保管過程を繰り返し行った。細胞凍結液は、２０％ＦＢＳと１０％ＤＭＳＯを含むＤＭＥＭから組成した。
【０１１５】
凍結されている遺伝子ターゲッティングされた細胞の入っている１つのチューブを出来る限り速く解凍した後、９ｍＬの培養液を入れた１５ｍＬのチューブにその解凍液を仕込んで３分間１０００ｒｐｍで遠心分離した。細胞沈殿物を３ｍＬの培養液で浮揚させた後、６ウェル培養容器に仕込み、核移植に用いられるまで３７℃、５％ＣＯ２の培養器で培養した。
【０１１６】
〔実施例９：核移植〕
牛卵子を屠殺場の卵巣から獲得し、３８．５７℃、５％ＣＯ２と水分のある状態で２２時間成熟培養液で培養した。成熟培養液は、Ｅａｇｌｅ ｓａｌｔｓと１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）の補充されたＬ−グルタミンと１μｇ／ｍＬエストラジオール（estradiol）と１μＬ／ｍＬ ＦＳＨ−Ｐ（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ Ｃｏｒｐ．，Ｋｅｎｉｌｗｏｒｔｈ、ＮＪ）と２５ｍＭ ＮａＨＣＯ３とＴＣＭ−１９９（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）から組成した。体外成熟させた後、卵子を０．１％ヒアルロニダーゼ（hyaluronidase）の入っている５００μＬのＴＬ−Ｈｅｐｅｓに仕込んで卵子の卵丘（cumulus）を強いピペットで除去した。卵丘細胞の除去された卵子の透明帯を精巧なガラス針を用いて部分的に切開した（Tsunoda et al., J Exp Zool., 240(1);119-125, 1986）。卵子操作、例えば核除去や細胞挿入などは、逆像顕微鏡（Ｌｅｉｔｚ、Ｅｒｎｓｔ Ｌｅｉｔｚ Ｗｅｔｚｌａｒ ＧｍｂＨ、Ｇｅｒｍａｎｙ）付き極微操作装置（micromanipulator）によって行った。操作のために使用された培養液は、７．５μｇ／ｍＬのサイトカラシンＢ（cytochalasin B）を含んでいるＴＬ−Ｈｅｐｅｓである。一番目の極体と中期II(metaphase II)染色体を含んでいる部分的な細胞質を直径２０μｍのマイクロピペットを用いて除去した。一つの遺伝子ターゲッティングされた細胞をそれぞれレシピエント細胞質体（recipient cytoplast）の卵黄周囲腔（perivitelline space）に組み込んだ。細胞−細胞質体（cell-cytoplast）複合体を１０〜２０秒間５０μＬの細胞融合培養液内に置いた後、細胞融合培養液に覆われた２つの電極１ｍｍアパート（electrodes 1mm apart）のある融合容器に移した。細胞融合培養液は、０．３Ｍマンニトール、０．５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、０．０１％ＢＳＡ、０．１ｍＭ ＣａＣｌ２、０．１ｍＭ ＭｇＣｌ２から組成した。細胞−細胞質体複合体をＥｌｅｃｔｒｏ Ｃｅｌｌ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｏｒ２００１（ＢＴＸ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）でそれぞれ２０×１０−６ｓｅｃの間直接的な１．６ｋＶ／ｃｍで電流を流すように１回のパルスで融合を誘導した。このような過程は常温で行った。体細胞が見えない、再構成された受精卵は、融合パルス以後１時間経過したときに融合された受精卵と決定される。電気的融合以後４時間が経過した後、融合された受精卵を５分間５μＭイノマイシンで処理して活性化させた後、１０％ＦＢＳの入っているＣＲ１ａａ ｍｅｄｉｕｍ（Rosenkrans et al., Biol Reprod., 49(3);459-462, 1993）に２．５ｍＭ ６−ジメチル−アミノプリンを３８．５℃、５％ＣＯ２の条件で３．５時間処理する。
【０１１７】
〔実施例１０：再構成された受精卵の培養〕
再構成された受精卵を、１ｍＭグルタミンと１×イグル必須アミノ酸溶液（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）の入っているＣＲ１ａａ培養液で培養した。３日間培養の後、分裂された受精卵をマウス胚芽線維芽細胞単層（mouse embryonic fibroblasts monolayer）上で７５０μＬ ＣＲ１ａａ（ｗｉｔｈ１０％ＦＢＳ）のある４ウェル培養容器の各ウェルで４日間３８．５℃、５％ＣＯ２の条件で培養した（Park et al., Anim Reprod Sci., 59(1-2);13-22, 2000）。培養７日以後、胚盤胞形成が観察された。
【０１１８】
〔実施例１１：組み換えされた受精卵のＰＣＲ分析〕
各受精卵を５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＬ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．５. ０．５％Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ４０、０．５％ Ｔｗｅｅｎ、４００μｇ／ｍＬプロテイナーゼＫからなるリーシスバッファ２０μＬ内に入れた後、３０分間６５℃の条件で置いた。そして、反応を１０分間９５℃に置くことにより、プロテイナーゼＫの活性を中止させた（McCreath et al., Nature, 405(6790);1066-1069, 2000）。溶解されたそれぞれの受精卵に対し、第１ＰＣＲは配列番号３および４のプライマーとしてＡｃｃｕＰｏｗｅｒ ＰＣＲ Ｐｒｅｍｉｘ（Ｂｉｏｎｅｅｒ）を用いて行った後、ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲを第１ＰＣＲ産物１μＬを用いて行った。配列番号３および７のプライマーを使用し、温度サイクリング（thermal cycling）条件は、次のとおりである：
Ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ
配列番号７逆方向プライマー：５’−gagacggacctgtccagaaagctg−３’
【０１１９】
【表１０】
【０１２０】
様々な発達段階にある組み換えされた複製胚芽のＰＣＲによって確認された形質転換有無は、次のとおりである（表１１）。
【０１２１】
【表１１】
【０１２２】
３３個の複製胚芽のうち３３個（１００％）全てが形質転換されたことが分かる。これは、発明が本遺伝子ターゲッティングされた体細胞を使用することにより、遺伝子ターゲッティングされた複製動物を生産するために用いられることを意味する。
【０１２３】
図３２は８１番細胞株の細胞から核移植された受精卵のＰＣＲ分析結果である（図３２）。
【０１２４】
〔実施例１２：複製された胎児由来の胎盤細胞のｌｏｎｇ−ｒａｎｇｅ ＰＣＲ分析〕
胚盤胞段階にある複製受精卵は、非手術的な方法を用いて、妊娠準備された母牛に移植した。移植後、妊娠３６日と確認された母牛の子宮から、フォーリーカテーテル（Ａｇｔｅｃｈ、Ｍａｎｈａｔａｎ、ＫＳ）を用いて、非手術的な方法によって、胎盤と共に、胎膜に取り囲まれている胎児を抽出した。胎児と胎児由来の胎膜組織を実施例７と同様の方法によって細胞培養した。細胞培養した胎膜組織をｌｏｎｇ−ｒａｎｇｅ ＰＣＲ方法によってβ−カゼイン遺伝子ターゲッティングを確認した結果、４ｋｂバンドを介してβ−カゼイン遺伝子ターゲッティングされたことが分かる（図３３）。ゲノムＤＮＡ抽出過程とｌｏｎｇ−ｒａｎｇｅ ＰＣＲ方法は、前記実施例５と同様である。
【０１２５】
〔産業上の利用可能性〕
上述したように、本発明のβ−カゼイン遺伝子ターゲッティングベクターがターゲッティングされた細胞を用いて核移植された受精卵を着床させて形質転換牛を製造する場合、医薬、産業的に有用な高付加価値タンパク質を副作用、例えば動物の発達障害なしに形質転換牛のミルクから大量獲得することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１２６】
【図１】図１は、牛β−カゼイン遺伝子ターゲッティングのために製作されたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIＳＫ（＋）プラスミド内にある１８．８ｋｂ ｐＢＣＫＩIベクターカセットを示す。ベクターカセットはｎｅｏ遺伝子の前にＳａｃII、ＮｏｔI、ＢａｍＨI制限酵素部位を含んでおり、ショットアーム（short arm）部位の後ろにＢａｍＨI制限酵素部位を持っている。
【図２】図２は、牛β−カゼイン遺伝子ターゲッティングのために製作されたｐＧＥＭ７Ｚｆ（＋）プラスミド内にある１４．８ｋｂ ｐＢＣＫＩIIベクターカセットを示す。
【図３】図３は、牛β−カゼイン遺伝子ターゲッティングのために製作されたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIＳＫ（＋）プラスミド内にある１６．１ｋｂ ｐＢＣＫＩIベクターカセットを示す。ベクターカセットは、ｎｅｏ遺伝子の前にＳａｃII、ＮｏｔI、ＢａｍＨI制限酵素部位を含んでおり、ショットアーム部位の後ろに陰性選別マーカーとしての１．３ｋｂジフテリア毒素（ＤＴ）遺伝子を持っている。ジフテリア毒素遺伝子部位の後ろにＢａｍＨI制限酵素部位を持っている。
【図４】図４は、ｐＢＣＫＩIベクターカセットとターゲッティングされたβ−カゼイン遺伝子間の相同的組み換え現象を示す。牛β−カゼイン遺伝子座における二重交差による結果として、内生的（endogenous）β−カゼイン塩基配列がベクターカセットの塩基配列で交替されることを示す。
【図５】図５は、ｐＢＣＫＩIIベクターカセットとターゲッティングされたβ−カゼイン遺伝子間の相同的組み換え現象を示す。牛β−カゼイン遺伝子座における二重交差による結果として、内生的β−カゼイン塩基配列がベクターカセットの塩基配列で交替されることを示す。
【図６】図６は、ｐＢＣＫＩＤＴIIベクターカセットとターゲッティングされたβ−カゼイン遺伝子間の相同的組み換え現象を示す。牛β−カゼイン遺伝子座における二重交差による結果として、内生的β−カゼイン塩基配列がベクターカセットの塩基配列で交替されることを示す。相同的組み換えが起こると、ジフテリア毒素（ＤＴ）遺伝子は脱落する。
【図７】図７は、ｐＢＣＫＩIとｐＢＣＫＩIIベクターカセットによる牛β−カゼイン遺伝子座で起こる遺伝子ターゲティングを確認するために使用されたＰＣＲ分析戦略と、ターゲッティングされたβ−カゼイン遺伝子座の接合点部位とベクターカセット内の制限酵素部位の塩基配列を示す。上位絵は、ｎｅｏ遺伝子からベクターカセット内に存在しない内生的β−カゼイン遺伝子座までの４ｋｂ ＤＮＡ断片を合成するためのプライマーセットの適切な位置を示す。塩基配列Ａは、ロングアーム（long arm）とｎｅｏ遺伝子接合点部位の塩基配列である。塩基配列Ｂは、ショットアームとｎｅｏ遺伝子接合点部分の塩基配列であって、５ＰＣＲプライマーが位置する。塩基配列Ｃは、ショットアームとベクターカセットには存在しない内生的β−カゼイン遺伝子接合点部位の塩基配列を示し、３’ＰＣＲプライマーが位置する。
【図８】図８は、ｐＢＣＫＩＤＴIIベクターカセットによる牛β−カゼイン遺伝子座で起こる遺伝子ターゲッティングを確認するために使用されたＰＣＲ分析戦略と、ターゲッティングされたβ−カゼイン遺伝子座の接合点部位とベクターカセット内の制限酵素部位の塩基配列を示す。上位絵は、ｎｅｏ遺伝子からベクターカセット内に存在しない内生的β−カゼイン遺伝子座までの４ｋｂ ＤＮＡ断片と３．４ｋｂ ＤＮＡ断片の適切な位置を示す。この際、少量のＤＮＡ試料においてもターゲッティング有無を確認するために、第１ＰＣＲプライマーで合成した後、第２ＰＣＲプライマーで再合成した。塩基配列Ａは、ロングアームとｎｅｏ遺伝子接合点部位の塩基配列である。塩基配列Ｂは、ショットアームとｎｅｏ遺伝子接合点部分の塩基配列であって、５’ＰＣＲプライマーが位置する。塩基配列Ｃは、ショットアームとベクターカセットには存在しない内生的β−カゼイン遺伝子接合点部位の塩基配列を示し、３’ＰＣＲプライマーが位置する。
【図９】図９は、前で報告されたｐＢＣ１０ベクターを示す（Kim et a l., J Biochem (Tokyo)., 126(2);320-5, 1999）。ｐＢＣ１０ベクターは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIＳＫベクター内にある牛β−カゼインプロモータ部位１０ｋｂを含んでいる。牛β−カゼイン遺伝子プロモータ部位は、遺伝子５’−フランキング（flanking）配列の８ｋｂ、解読されないエクソン１および２（Vertical open boxes）、イントロン１の２ｋｂを含んでいる。プロモータは、ＳａｃI、ＡａｔII、ＳａｃII制限酵素部位を持っているが、ＳｍａI、ＢａｍＨI、ＳａｌI、ＳｐｅI、ＣｌａIなどの制限酵素部位はない。
【図１０】図１０は、ｐＢＣ１０ベクターをＳａｃIとＳａｃII制限酵素で切断することにより分離された１０ｋｂ ＤＮＡ断片を示している。分離された１０ｋｂ ＤＮＡ断片は、ｐＢＣＫＩIベクターカセットのロングアームに使用した。
【図１１】図１１は、ｐＢＣ１０ベクターをＡａｔIIとＳａｃII制限酵素で切断することにより分離された６ｋｂ ＤＮＡを示している。分離された６ｋｂ ＤＮＡは、ｐＢＣＫＩIIベクターカセットのロングアームに使用した。
【図１２】図１２は、ｐＢＣＫＩIとｐＢＣＫＩIIベクターカセットのショットアームに使用されたｐＢＣ３．１ベクターの製作順序を示す。牛β−カゼイン遺伝子のエクソン５、６、７、８を含んでいる３．２ｋｂ ＤＮＡ断片を、ＸｈｏIとＳａｌI（太字）制限酵素部位を持っているプライマーセットを用いて牛染色体ＤＮＡ（chromosomal DNA）からＰＣＲ合成した。合成されたＤＮＡ断片をＸｈｏIとＳａｌI制限酵素を用いて切断した後、ｐＧＥＭ−Ｔベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）のＳａｌI認識部位に連結した。ｐＧＥＭ−Ｔベクター内にある３．２ｋｂ ＤＮＡ断片をＨｉｎｃIIとＳａｌI制限酵素でさらに切断した後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIＳＫ（＋）のＳａｌI認識部位に連結した。
【図１３】図１３は、ｐＭＡＭｎｅｏベクター（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）からＳＶ４０ ｏｒｉ、初期プロモータ（early promoter）、ネオマイシン抵抗性遺伝子、ＳＶ４０初期スプライシング（early splicing）部位、ポリアデニル化（polyadenylation）部位を含んでいるｎｅｏ遺伝子を選別する過程を示す。ＢａｍＨI制限酵素で切断された２．７ｋｂ ｎｅｏ遺伝子断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIＳＫ（＋）のＢａｍＨI制限酵素部位に連結した。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIＳＫ（＋）内にあるｎｅｏ遺伝子の２ｋｂ ＤＮＡ断片をＢｇｌIIとＢａｍＨI制限酵素で切断した後、ｐＳＰ７３ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）のＢａｌII制限酵素部位に連結した。ＢｇｌIIとＥｃｏＲＶ制限酵素で切断したｐＳＰ７３ベクターの２ｋｂ断片を、ｐｎｅｏ２．７ベクター構造物を作るために０．７ｋｂ ｎｅｏ遺伝子を含んでいるｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIＳＫ（＋）ベクターのＢｇｌIIとＥｃｏＲＶ制限酵素部位に再連結した。
【図１４】図１４は、ｐＢＣＫＩIとｐＢＣＫＩIIベクターカセットの製作過程を示す。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIＳＫ（＋）ベクター内にある陽性選別マーカーとショットアームに相当するＤＮＡ断変を適切な制限酵素を用いて切断した後、ＢａｍＨI、ＥｃｏＲＶ、ＳａｌI制限酵素部位を用いて、ｐＢＣ１０ ＤＮＡ断片を含んでいるｐＢｌｅｕｓｃｒｉｐｔIIＳＫ（＋）ベクター内に連結した。結果的に、ｐＢＣＫＩIベクターカセットは、１０ｋｂロングアーム、選別マーカー遺伝子、およびショットアームを含んでいる。ｐＢＣＫＩIベクターのロングアームの長さを短くするために、ＡａｔIIとＳａｌI制限酵素で切断したＤＮＡ断片をｐＧＥＭ７Ｚｆ（＋）ベクターのＡａｔIIとＸｈｏI制限酵素部位に連結した。その結果、６ｋｂロングアーム、ｎｅｏ遺伝子およびショットアームを持っているｐＢＣＫＩIIベクターカセットを完成した。
【図１５】図１５は、本ｐＢＣＫＩＤＴIIベクターカセットに使用されたＤＴ遺伝子をｐＫＯ ＳｅｌｅｃｔＤＴ（Ｌｅｘｉｃｏｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）ベクターから選別する過程を示す。制限酵素ＲｓｒIIとして使用することにより、ＳＶ４０ＰｏｌｙＡおよびＲＮＡポリメラーゼIIプロモータと共にジフテリア毒素Ａ鎖（ＤＴ）遺伝子が選別された。選別されたＤＴ遺伝子をｋｌｅｎｏｗ ｆｉｌｌｉｎｇした後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIＫＳ（＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＨｉｎｄII部位に挿入することにより、ｐＫＳ ＤＴベクターを完成した。ｐＫＳ ＤＴベクターにあるＤＴ遺伝子をＸｈｏIとＥｃｏＲＶで切断した後、ｐＳＰ７３（Ｐｒｏｍｅｇａ）ベクターのＸｈｏIとＰｖｕII部位に挿入することにより、ｐＳＰ７３ ＤＴベクターを完成した。
【図１６】図１６は、ｐＢＣＫＩＤＴIIベクターカセットの製作過程を示す。ｐＳＰ７３ ＤＴベクターに挿入されているＤＴ遺伝子を、ＸｈｏIとＳａｌI遺伝子によって選別した後、ｐＢＣＫＩIベクターカセットのＳａｌI部位に挿入することにより、ｐＢＣＫＩＤＴIベクターカセットを完成した。完成したｐＢＣＫＩＤＴIベクターカセットをＡａｔIIとＳａｌIで切断した後、ｐＧＥＭ−７Ｚｆ（＋）（Ｐｒｏｍｅｇａ）ベクターのＡａｔIIとＸｈｏI部位に挿入することにより、ｐＢＣＫＩＤＴIIベクターカセットを完成した。
【図１７】図１７は、ｐＢＣＫＩIベクターカセット内への有用な遺伝子の挿入を示す。治療用タンパク質遺伝子の一例として、ヒトトロンボポエチン遺伝子（ｈＴＰＯ）を発明したｐＢＣＫＩIベクターカセットに挿入した。われわれの以前研究において、ヒトトロンボポエチンｃＤＮＡ全体１ｋｂをＰＣＲによって増幅し、牛成長ホルモン（ｂＧＨ）遺伝子の３００ｂｐ ｐｏｌｙ（Ａ）付加的配列（additional sequence）を、増幅されたｃＤＮＡ断片の下部にあるＫｐｎI制限酵素部位に連結させた（Sohn, DNA Cell Biol., 18(11);845-852, 1999）。ｈＴＰＯ ｃＤＮＡとｂＧＨ遺伝子を含んでいる１．３ｋｂ ＤＮＡ断片は、ｐＢＣＫＩIベクターカセットのＳａｃIIとＮｏｔI制限酵素部位に挿入された。その結果、２０．１ｋｂ ｐＢＣＴＰＯＫＩIベクター構造物が完成された。
【図１８】図１８は、ｐＢＣＫＩIIベクターカセット内へのｈＴＰＯ ｃＤＮＡの導入を示す。結果的に、１６．１ｋｂ ｐＢＣＴＰＯＫＩIIベクター構造物を作った。その順序は図１７での説明と同様である。
【図１９】図１９は、ｐＢＣＫＩＤＴIIベクターカセット内へのｈＴＰＯ ｃＤＮＡの導入を示す。結果的に、１７．４ｋｂ ｐＢＣＴＰＯＫＩＤＴIIベクター構造物を作った。その順序は図１７での説明と同様である。
【図２０】図２０は、制限酵素ＳａｌIによる切断の後、細胞内導入のために使用された線形化ｐＢＣＴＰＯＫＩIベクター構造を示す。
【図２１】図２１は、制限酵素ＡａｔIIによる切断の後、細胞内導入のために使用された線形化ｐＢＣＴＰＯＫＩIIベクター構造を示す。
【図２２】図２２は、制限酵素ＡａｔIIとＣｌａIによるプラスミドベクターの除去の後、細胞内導入のために使用された線形化ｐＢＣＴＰＯＫＩＤＴIIベクター構造を示す。
【図２３】図２３は、制限酵素ＡａｔIIとＣｌａIによるプラスミドベクターの除去の後、細胞内導入のために使用された線形化ｐＢＣＴＰＯＫＩIIベクター構造を示す。図２１ではｐＢＣＴＰＯＫＩIIベクターがＡａｔIIによってのみ線形化されたので、プラスミドベクターをもって細胞内に導入されたが、図２３におけるｐＢＣＴＰＯＫＩIIベクターは、ＡａｔIIとＣｌａIによってプラスミドベクターが除去されたので、プラスミドベクターが切断されてから細胞内に導入された。
【図２４】図２４は、牛胚芽線維芽細胞（ｂＥＦ）と牛耳組織線維芽細胞（ｂＥＳＦ）の形態を示す。ＡとＢは、コンフルアンスに達するまで成長した、ＤＮＡが導入されていない（正常）ｂＥＦとｂＥＳＦである。ＣとＤは、本発明のベクターが導入された後コロニー形成を示すｂＥＦとｂＥＳＦである。抗生剤抵抗性ｎｅｏ遺伝子を含み、遺伝子ターゲッティングベクターをリポフェクタミン２０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）方法を用いてｂＥＦとｂＥＳＦに導入した後、Ｇ４１８（Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を処理して生き残った細胞株は、外来遺伝子の導入有無を分析した。
【図２５】図２５は、ｐＢＣＫＩIIトランスフェクションの後に生き残った細胞株のＰＣＲ分析を示す。矢印で表された５００ｂｐ ＰＣＲ ＤＮＡ断片に対する陽性シグナルは「＋」で示し、陰性シグナルは「−」で示した。本発明のｐＢＣＴＰＯＫＩIIベクターは陽性対照区として使用し、ＰＣＲはｈＴＰＯ遺伝子に対するプライマーを利用した。
【図２６】図２６は、ｌｏｎｇ−ｒａｎｇｅ ＰＣＲ分析のために対照区として使用されたｐｎｅｏＢＣ３．７ベクターの製作順序を示す。牛β−カゼイン遺伝子の塩基７８８８〜８４７９に相応するイントロン８とエクソン９を含んでいる５９１ｂｐ ＤＮＡ断片は、プライマーセットを用いて、牛染色体ＤＮＡからＰＣＲ増幅によって準備した。３’プライマーは、太字で表記されているように、ＸｈｏI制限酵素部位を持っている。増幅されたＰＣＲ ＤＮＡ断片は、ｐＧＥＭ−Ｔベクター内に挿入された。その結果、ｐＢＣ５９１ベクター構造物を完成した。
【図２７】図２７は、ｌｏｎｇ−ｒａｎｇｅ ＰＣＲ分析のために対照区として使用されたｐｎｅｏＢＣ３．７ベクターの製作順序を示す。ｐＢＣ５９１ベクターをＳａｌIとＸｈｏI制限酵素を用いて切断した後、そのＤＮＡ断片をｐＢＣ３．１ベクターのＳａｌI制限酵素部位内に連結した。同時に、ｐｎｅｏＢＣ２．７ベクターをＢａｍＨIとＥｃｏＲＶ制限酵素で切断した後、ＢａｍＨIとＥｃｏＲV制限酵素で切断されたｐＢＣ３．１ベクターに連結した。その結果、ｐｎｅｏＢＣ３．７ベクターが完成された。矢印は、４ｋｂと３．４ｋｂのｌｏｎｇ−ｒａｎｇｅ ＰＣＲ合成のためのプライマーセットを示す。
【図２８】図２８は、ｐＢＣＴＰＯＫＩIIベクターが導入されたｂＥＳＦ細胞株のｌｏｎｇ−ｒａｎｇｅ ＰＣＲ分析結果を示す。矢印で表わされる４ｋｂ陽性シグナルは、細胞株８１と８９番がβ−カゼイン遺伝子ターゲッティングされたことを示す。それ以外の他の細胞株は、陰性シグナル（−）を示した。ｐｎｅｏＢＣ３．７ベクターを陽性対照区として使用した。
【図２９】図２９は、ｐＢＣＴＰＯＫＩＤＴIIとｐＢＣＴＰＯＫＩIIベクターの導入されたｂＥＳＦ細胞株のｌｏｎｇ−ｒａｎｇｅ ＰＣＲ分析結果を示す。矢印で表わされる３．４ｋｂ陽性シグナルは、β−カゼイン遺伝子がターゲッティングされたことを示す。約５個の細胞において第１ＰＣＲを行った後、第２ＰＣＲを行うことにより、３．４ｋｂ陽性シグナルを確認した（図８）。Ａは、ｐＢＣＴＰＯＫＩＤＴIIベクターを導入した細胞株に対するｌｏｎｇ−ｔｅｍｐｌａｔｅ ＰＣＲの結果であり、５、３０、１７、１８、２０、２１、２６番の細胞株がβ−カゼイン遺伝子ターゲッティングされたことを示す。Ｂは、ｐＢＣＴＰＯＫＩIIベクターを導入した細胞株に対するｌｏｎｇ−ｔｅｍｐｌａｔｅ ＰＣＲの結果であり、１６番の細胞株が遺伝子ターゲッティングされたことを示す。Ｃは、陰性対照区（−）として使用された牛のゲノムＤＮＡと陽性対照区（＋）として使用されたｐｎｅｏＢＣ３．７に対するｌｏｎｇ−ｔｅｍｐｌａｔｅ ＰＣＲの結果である。
【図３０】図３０は、ターゲッティングされた塩基配列を再確認するためのサザンブロット分析のための戦略を示す。外来遺伝子の導入された細胞株から、精製されたゲノムＤＮＡ（genomic DNA）とｐＢＣＴＰＯＫＩIIベクターをＥｃｏＲI制限酵素で切断した。ＥｃｏＲIによって切られたＢＣＴＰＯＫＩIIベクターのＤＮＡ（Ａ）とゲノムＤＮＡ（Ｂ）の断片サイズは、それぞれ９．２ｋｂと９．９ｋｂである。ｈＴＰＯ遺伝子の下にあるバーは、サザンブロット分析のために使用されたプローブの位置を示す。プローブとして用いられるｈＴＰＯ ｃＤＮＡの５００ｂｐ断片をＰＣＲによって増幅した。
【図３１】図３１は、サザンブロット分析によって、遺伝子ターゲッティングされたものと確認された細胞株を示す。８１番と８９番の２つの細胞株は、発明したベクターが内生的牛β−カゼイン遺伝子座にターゲッティングされたことが再確認された。ターゲッティングされた細胞株は、９．９ｋｂ断片を示し、９７、４７、４３、３４番の細胞株は、いずれのシグナルも示していない。様々な濃度の牛ゲノムＤＮＡを陰性対照区として使用し、様々な濃度のｐＢＣＴＰＯＫＩIIベクターから由来した９．２ｋｂ断片は陽性対照区として使用した。
【図３２】図３２は、８１番細胞株の細胞から核移植された受精卵のｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ分析を示す。３５６ｂｐの陽性シグナルは、体細胞から複製された受精卵が本発明のターゲッティングベクターを持っていることを示す。ｐＢＣＴＰＯＫＩIIベクターを陽性シグナルとして使用し、ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲは陽性シグナルを再確認するために行った。
【図３３】図３３は、８９番クローンの細胞から核移植された受精卵を妊娠準備済みの母牛に移植した後、妊娠３６日目の母牛から取り出した胎膜に取り囲まれている胎児（Ａ）、胎膜を除去した胎児（Ｂ）、胎膜細胞（Ｃ）、胎膜細胞のｌｏｎｇ−ｒａｎｇｅ ＰＣＲ分析（Ｄ）を示す。４ｋｂ陽性シグナルは、胎児由来の胎膜細胞がβ−カゼイン遺伝子ターゲッティングされたことを示す。ｐｎｅｏＢＣ３．７ベクターを陽性対照区として使用した。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）牛β−カゼイン遺伝子のプロモータを有し、このプロモータの前後に位置した牛β−カゼイン遺伝子のエクソン１、イントロン１およびエクソン２からなり、牛β−カゼイン遺伝子の核酸配列に相同である５〜１２ｋｂ長の核酸配列を有する第１領域と、
（２）目的のタンパク質をコードする核酸クローニング部位と、
（３）ポジティブ選別マーカー領域と、
（４）牛β−カゼイン遺伝子のエクソン５、６、７、８およびイントロン５、６、７からなり、牛β−カゼイン遺伝子核酸配列に相同である２．８〜３．５ｋｂ長の核酸配列を有する第２領域とを含み、
β−カゼイン遺伝子の核酸配列の５’−３’配列において、第１領域が上流（upstream）に該当し、第２領域が下流（downstream）に該当することを特徴とする、牛β−カゼイン遺伝子ターゲッティングベクター。
【請求項２】
第１領域が５．５〜１０ｋｂの長さを有する、請求項１に記載のベクター。
【請求項３】
第２領域が３．０〜３．２ｋｂの長さを有する、請求項１に記載のベクター。
【請求項４】
ポジティブ選別マーカーが、ネオマイシン（Ｎｅｏ）、ハイグロマイシン（Ｈｙｇ）、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ（ｈｉｓＤ）またはグアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｇｐｔ）である、請求項１に記載のベクター。
【請求項５】
ネガティブ選別マーカーをさらに含む、請求項１に記載のベクター。
【請求項６】
ネガティブ選別マーカーがジフテリア毒素である、請求項５に記載のベクター。
【請求項７】
請求項１または５に記載の、図１に開示されているｐＢＣＫＩI、図２に開示されているｐＢＣＫＩII、図１６に開示されているｐＢＣＫＩＤＴI、または図３に開示されているｐＢＣKＩＤＴIIであるベクター。
【請求項８】
請求項１または５に記載のベクターで遺伝子ターゲッティングされた牛の体細胞。
【請求項９】
請求項８に記載の牛の体細胞を用いた核移植により得られた受精卵。
【請求項１０】
（１）請求項１または５に記載の牛β−カゼイン遺伝子ターゲッティングベクターで牛の体細胞を形質転換させる段階と、
（２）牛の体細胞を培養して相同的組み換えを誘導する段階と、
（３）相同的組み換えによって、牛β−カゼイン遺伝子がターゲッティングされた牛の体細胞を選別する段階とを含む、牛β−カゼイン遺伝子がターゲッティングされた牛の体細胞を製造する方法。
【請求項１１】
段階（１）で線形のベクターまたはプラスミド骨格が除去された線形のベクターの形で形質転換させる請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
（１）請求項１または５に記載の牛β−カゼイン遺伝子ターゲッティングベクターで牛の体細胞を形質転換させる段階と、
（２）牛の体細胞を培養して相同的組み換えを誘導する段階と、
（３）相同的組み換えによって、牛β−カゼイン遺伝子がターゲッティングされた牛の体細胞を選別する段階と、
（４）牛卵子の核を除去し、遺伝子ターゲッティングされた細胞を導入することにより、体細胞核移植による受精卵を製造する段階と、
（５）前記受精卵を着床させる段階とを含む、形質転換牛を製造する方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法によって製造された形質転換牛のミルクから目的のタンパク質を大量収得する方法。
【請求項１】
（１）牛β−カゼイン遺伝子のプロモータを有し、このプロモータの前後に位置した牛β−カゼイン遺伝子のエクソン１、イントロン１およびエクソン２からなり、牛β−カゼイン遺伝子の核酸配列に相同である５〜１２ｋｂ長の核酸配列を有する第１領域と、
（２）目的のタンパク質をコードする核酸クローニング部位と、
（３）ポジティブ選別マーカー領域と、
（４）牛β−カゼイン遺伝子のエクソン５、６、７、８およびイントロン５、６、７からなり、牛β−カゼイン遺伝子核酸配列に相同である２．８〜３．５ｋｂ長の核酸配列を有する第２領域とを含み、
β−カゼイン遺伝子の核酸配列の５’−３’配列において、第１領域が上流（upstream）に該当し、第２領域が下流（downstream）に該当することを特徴とする、牛β−カゼイン遺伝子ターゲッティングベクター。
【請求項２】
第１領域が５．５〜１０ｋｂの長さを有する、請求項１に記載のベクター。
【請求項３】
第２領域が３．０〜３．２ｋｂの長さを有する、請求項１に記載のベクター。
【請求項４】
ポジティブ選別マーカーが、ネオマイシン（Ｎｅｏ）、ハイグロマイシン（Ｈｙｇ）、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ（ｈｉｓＤ）またはグアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｇｐｔ）である、請求項１に記載のベクター。
【請求項５】
ネガティブ選別マーカーをさらに含む、請求項１に記載のベクター。
【請求項６】
ネガティブ選別マーカーがジフテリア毒素である、請求項５に記載のベクター。
【請求項７】
請求項１または５に記載の、図１に開示されているｐＢＣＫＩI、図２に開示されているｐＢＣＫＩII、図１６に開示されているｐＢＣＫＩＤＴI、または図３に開示されているｐＢＣKＩＤＴIIであるベクター。
【請求項８】
請求項１または５に記載のベクターで遺伝子ターゲッティングされた牛の体細胞。
【請求項９】
請求項８に記載の牛の体細胞を用いた核移植により得られた受精卵。
【請求項１０】
（１）請求項１または５に記載の牛β−カゼイン遺伝子ターゲッティングベクターで牛の体細胞を形質転換させる段階と、
（２）牛の体細胞を培養して相同的組み換えを誘導する段階と、
（３）相同的組み換えによって、牛β−カゼイン遺伝子がターゲッティングされた牛の体細胞を選別する段階とを含む、牛β−カゼイン遺伝子がターゲッティングされた牛の体細胞を製造する方法。
【請求項１１】
段階（１）で線形のベクターまたはプラスミド骨格が除去された線形のベクターの形で形質転換させる請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
（１）請求項１または５に記載の牛β−カゼイン遺伝子ターゲッティングベクターで牛の体細胞を形質転換させる段階と、
（２）牛の体細胞を培養して相同的組み換えを誘導する段階と、
（３）相同的組み換えによって、牛β−カゼイン遺伝子がターゲッティングされた牛の体細胞を選別する段階と、
（４）牛卵子の核を除去し、遺伝子ターゲッティングされた細胞を導入することにより、体細胞核移植による受精卵を製造する段階と、
（５）前記受精卵を着床させる段階とを含む、形質転換牛を製造する方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法によって製造された形質転換牛のミルクから目的のタンパク質を大量収得する方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【公表番号】特表２００７−５１０４３７（Ｐ２００７−５１０４３７Ａ）
【公表日】平成１９年４月２６日（２００７．４．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５４６８６２（Ｐ２００６−５４６８６２）
【出願日】平成１７年１１月１８日（２００５．１１．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００５／００３９２３
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０５７４９９
【国際公開日】平成１８年６月１日（２００６．６．１）
【出願人】（５０５０９３３６７）コリア リサーチ インスティチュート オブ バイオサイエンス アンド バイオテクノロジー (13)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年４月２６日（２００７．４．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１１月１８日（２００５．１１．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００５／００３９２３
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０５７４９９
【国際公開日】平成１８年６月１日（２００６．６．１）
【出願人】（５０５０９３３６７）コリア リサーチ インスティチュート オブ バイオサイエンス アンド バイオテクノロジー (13)
【Ｆターム（参考）】
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