相異なる蛍光色の二光子蛍光プローブを用いてナトリウム／カルシウム活性を同時にイメージ化する方法及び二光子蛍光プローブの製造方法
【課題】相異なる蛍光色の二光子蛍光プローブを用いてナトリウム／カルシウム活性を同時にイメージ化する方法及び二光子蛍光プローブの製造方法を提供する。
【解決手段】本発明による細胞膜近傍のカルシウムイオン二光子蛍光プローブは、カルシウム陽イオンと反応して強い二光子蛍光を表わし、カルシウムイオンとともに錯体を形成して細胞膜に選択的であり、容易にローディングされうる。また、６０分以上の時間に亘って１００〜２００μｍ深さの生体細胞及び生体組織で選択的にカルシウムイオンを探知することができるので、生体細胞または組織でカルシウム陽イオンの分布をイメージングすることができる。また、相異なる蛍光色の二つの標識子を生体細胞または組織に同時に染色することによって、カルシウムとナトリウムとの活動性を相異なるチャンネルで映像化させることができる。
【解決手段】本発明による細胞膜近傍のカルシウムイオン二光子蛍光プローブは、カルシウム陽イオンと反応して強い二光子蛍光を表わし、カルシウムイオンとともに錯体を形成して細胞膜に選択的であり、容易にローディングされうる。また、６０分以上の時間に亘って１００〜２００μｍ深さの生体細胞及び生体組織で選択的にカルシウムイオンを探知することができるので、生体細胞または組織でカルシウム陽イオンの分布をイメージングすることができる。また、相異なる蛍光色の二つの標識子を生体細胞または組織に同時に染色することによって、カルシウムとナトリウムとの活動性を相異なるチャンネルで映像化させることができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、相異なる蛍光色の二光子蛍光プローブを用いてナトリウム／カルシウム活性を同時にイメージ化する方法及び二光子蛍光プローブの製造方法に係り、具体的には、高い感度と選択性とで生体細胞膜イオンチャンネル近傍のカルシウムイオンの活動性をイメージングすることができる二光子蛍光プローブと、これを他の蛍光色の二光子ナトリウムプローブと同時に染色することによって、生体細胞または組織で起こるナトリウム／カルシウム陽イオンの交換及び活動性を二つのチャンネルで同時イメージングすることができる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞内カルシウムイオン分布の変化を測定することは、生理、病理的な現象研究で非常に重要である。細胞内カルシウムイオンの濃度は、原形質膜と各器官の膜とに存在するポンプあるいはチャネルを通じて細胞内の多様な状況に合わせて調節される。これにより、細胞膜近傍のカルシウムイオンの濃度は、細胞内平均値より遥かに高く存在し、生理的活性によって１００μｍｏｌ以上増加する。このような細胞膜近傍高濃度のカルシウムイオンは、ホルモンと神経伝達物質のエキソサイトーシス（ｅｘｏｃｙｔｏｓｉｓ）、信号伝逹で２次伝達者（ｓｅｃｏｎｄ ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ）などの過程で重要な役割を行うものと知られている。
【０００３】
このようなカルシウムイオン濃度変化を調節する代表的な生体物質は、Ｎａ＋／Ｃａ２＋イオン交換体（ＮＣＸ）である。ＮＣＸの機能は、細胞内にカルシウムイオン濃度が高くなれば、恒常性（ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ）を維持するために、カルシウムイオンは細胞外に出し、ナトリウムは細胞内に入るようにする。これをＮａ＋／Ｃａ２＋交換と言う。
【０００４】
このような機能を理解するために、多様な単一光子蛍光プローブが開発されて来たが、個別的なイオンの活性を研究するのに止められており、相異なるイオンを同時に映像化させることによって、これらの相互作用を同時に映像化させた例は全くない。また、大部分の単一光子プローブの共通的な問題点は、それらの短い励起波長（＜５００ｎｍ）である。このような短い励起波長は、透過性が浅く（＜１００μｍ）、光漂白（ｐｈｏｔｏｂｌｅａｃｈｉｎｇ）及び細胞自己蛍光の問題があり組織イメージングに対する適用が制限される。
【０００５】
このような問題は、励起のために低いエネルギーの２個の近赤外線光子を用いる二光子顕微鏡（ＴＰＭ）によって理想的に解決できる。二光子顕微鏡を使えば、完全な組織が７０μメーターよりさらに大きい組織切片の内部に延びることができる組織準備成形物から最小限の干渉を作りながら長期間にイメージを作りうる。しかし、生体組織の内部深さ（＞１００μｍ）に存在する細胞膜近傍のカルシウムと細胞内部のナトリウムイオン分布を同時にイメージで作ることができる相異なる蛍光色の二光子プローブは、現在まで開発されていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明が解決しようとする第１の課題は、小さな分子量を有しながら細胞膜に選択的に染色され、細胞膜近傍のカルシウムイオンに対する選択性と活動性とを映像化させるのに適した二光子蛍光プローブを提供することである。
【０００７】
本発明が解決しようとする第２の課題は、前記二光子蛍光プローブを用いて生体細胞または組織で細胞膜近傍のカルシウムイオン分布を選択的にイメージングする方法を提供することである。
【０００８】
本発明が解決しようとする第３の課題は、前記二光子蛍光プローブと相異なる二光子蛍光色のナトリウムプローブとを用いて生体細胞または組織でＮａ＋／Ｃａ２＋交換を同時に映像化する方法を提供することである。
【０００９】
本発明が解決しようとする第４の課題は、前記細胞膜近傍のカルシウムイオン二光子蛍光プローブの製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、下記化学式１で表される二光子蛍光プローブを提供する。
【００１１】
【化１】
【００１２】
前記化学式１で、Ｘは、Ｏ、ＳまたはＮＨである。
【００１３】
また、本発明は、
１）６−ブロモ−Ｎ−メチル−２−ナフチルアミン（６−ｂｒｏｍｏ−Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ−２−ｎａｐｈｔｈｙｌａｍｉｎｅ）、プロトンスポンジ（ｐｒｏｔｏｎ−ｓｐｏｎｇｅ）、及びｔｅｒｔ‐ブチルブロモアセタート（ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌ ｂｒｏｍｏａｃｅｔａｔｅ）の混合物を還流させて、下記化学式２で表される化合物Ｂを製造する段階と、
２）前記化合物Ｂ、ベンズオキサゾール（ｂｅｎｚｏｘａｚｏｌｅ）、Ｐｄ（ＩＩ）ＯＡｃ、ＰＰｈ３、ＣｕＩ、及びＣｓＣＯ３の混合物を撹拌して、下記化学式３で表される化合物Ａを製造する段階と、
３）前記化合物Ａ、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（１−ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ）及び下記化学式４で表される化合物Ｄを混合し、反応させる段階と、を含む前記化学式１で表される二光子蛍光プローブの製造方法を提供する。
【００１４】
【化２】
【００１５】
【化３】
【００１６】
【化４】
【００１７】
前記化学式３で、Ｘは、Ｏ、ＳまたはＮＨである。
【００１８】
また、本発明は、前記化学式１で表される二光子蛍光プローブを用いて生体細胞または組織のカルシウムイオン分布を選択的にイメージングする方法を提供する。
【００１９】
また、本発明は、前記化学式１で表される二光子蛍光プローブ及びナトリウムイオン感知用の二光子蛍光プローブを用いて生体細胞または組織でＮａ＋／Ｃａ２＋交換を同時にイメージングする方法を提供する。
【発明の効果】
【００２０】
本発明による細胞膜近傍のカルシウムイオン二光子蛍光プローブは、カルシウム陽イオンと反応して強い二光子蛍光を表わす。細胞膜に選択的であり、容易にローディングされることができて、細胞膜近傍のカルシウムイオンとともに錯体を形成することができ、細胞内で解離定数（Ｋｄｉ）が７８±５μＭで、この近傍のカルシウムイオンの活動性を感知することに適した。また、６０分以上の時間に亘って１００〜２００μｍ深さの生体細胞及び生体組織で選択的にカルシウムイオンを探知することができるので、生体細胞または組織でカルシウム陽イオンの分布をイメージングすることができる。また、相異なる蛍光色の二つの標識子を生体細胞または組織に同時に染色することによって、カルシウムとナトリウムとの活動性を相異なるチャンネルで映像化させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】本発明の一具体例としてＢＣａ１の単一光子蛍光スペクトル及びＨ２Ｏ内のＢＣａ１の濃度による蛍光強度を示す図である。
【図２】本発明の一具体例として１，４−ジオキサン、ＥｔＯＨ、ＤＭＦ及びＨ２Ｏ内のＢＣａ１の標準吸収スペクトル及び標準放出スペクトルを示す図である。
【図３】ＨｅＬａ細胞内のＢＣａ１及びＡＮａ１の標準放出スペクトルを示す図である。
【図４】本発明の一具体例として単一光子蛍光スペクトルを示す図である。
【図５】本発明の一具体例としてＢＣａ１の単一光子吸収曲線、ＢＣａ１の単一光子及び二光子蛍光適正曲線、及びＢＣａ１の単一光子及び二光子Ｈｉｌｌ曲線を示す図である。
【図６】本発明の一具体例として多様な陽イオンに対するＢＣａ１の相対的な蛍光強度及びＢＣａ１の単一光子蛍光強度に対するｐＨの影響を示す図である。
【図７】本発明の一具体例として二光子蛍光作動スペクトルを示す図である。
【図８】本発明の一具体例としてＢＣａ１の単一光子蛍光スペクトル及びＢＣａ１のＨｉｌｌ曲線を示す図である。
【図９】本発明の一具体例としてＬＵＶｓ内のＢＣａ１の標準放出スペクトル及びＨｅＬａ細胞内のＢＣａ１の標準放出スペクトルを示す図である。
【図１０】（ａ）は、本発明の一具体例としてＢＣａ１でラベルされたＨｅＬａ細胞のＴＰＭイメージを示す図であり、（ｂ）は、それによる分析図表を示す図である。
【図１１】本発明の一具体例としてＢＣａ１でラベルされたＨｅｌａ細胞の電子写真及び蛍光強度を示す図である。
【図１２】本発明の一具体例としてＢＣａ１でラベルされたＨｅｌａ細胞のＴＰＭイメージを示す図である。
【図１３】本発明の一具体例としてＢＣａ１及びＡＮａ１でラベルされたＨｅＬａ細胞のＴＰＭイメージ及び蛍光強度を示す図である。
【図１４】本発明の一具体例としてＢＣａ１及びＡＮａ１で着色されたモルモット海馬切片のイメージを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
以下、本発明をより具体的に説明する。
【００２３】
本発明による二光子蛍光プローブは、下記化学式１で表されることを特徴とする。
【００２４】
［化１］
【００２５】
前記化学式１で、Ｘは、Ｏ、ＳまたはＮＨであり、Ｏであることがより望ましい。
【００２６】
本発明による前記化学式１で表される二光子蛍光プローブは、生体細胞または組織でカルシウムイオンの検出用として適用可能である。
【００２７】
前記化学式１で表される二光子蛍光プローブは、２−（２'−モルホリノ−２'−オキソエトキシ）−Ｎ，Ｎ−ビス（ヒドロキシカルボニルメチル）アニリン（２−（２'−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ−２'−ｏｘｏｅｔｈｏｘｙ）−Ｎ，Ｎｂｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌｍｅｔｈｙｌ）ａｎｉｌｉｎｅ、ＭＯＢＨＡ）をカルシウム陽イオン受容体として含み、６−（ベンゾ［ｄ］オキサゾール−２'−イル）−２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）ナフタレン（６−（ｂｅｎｚｏ［ｄ］ｏｘａｚｏｌ−２'−ｙｌ）−２−（Ｎ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ）をリポーターとして含む。
【００２８】
また、本発明による前記化学式１で表される二光子蛍光プローブの製造方法の一具体例は、１）６−ブロモ−Ｎ−メチル−２−ナフチルアミン（６−ｂｒｏｍｏ−Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ−２−ｎａｐｈｔｈｙｌａｍｉｎｅ）、プロトンスポンジ（ｐｒｏｔｏｎ−ｓｐｏｎｇｅ）、及びｔｅｒｔ‐ブチルブロモアセタート（ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌ ｂｒｏｍｏａｃｅｔａｔｅ）の混合物を還流させて、下記化学式２で表される化合物Ｂを製造する段階、２）前記化合物Ｂ、ベンズオキサゾール（ｂｅｎｚｏｘａｚｏｌｅ）、Ｐｄ（ＩＩ）ＯＡｃ、ＰＰｈ３、ＣｕＩ、及びＣｓＣＯ３の混合物を撹拌して、下記化学式３で表される化合物Ａを製造する段階、及び３）前記化合物Ａ、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（１−ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ）及び下記化学式４で表される化合物Ｄを混合し、反応させる段階を含む。
【００２９】
［化２］
【００３０】
［化３］
【００３１】
［化４］
【００３２】
前記化学式３で、Ｘは、Ｏ、ＳまたはＮＨであり、Ｏであることがより望ましい。
【００３３】
本発明による前記化学式１で表される二光子蛍光プローブの製造方法は、後述する実施例により具体的に表わした。
【００３４】
また、本発明は、前記化学式１で表される二光子蛍光プローブを用いて生体細胞または組織のカルシウムイオン分布を選択的にイメージングする方法を提供する。より具体的に、前記生体細胞または組織で細胞膜近傍のカルシウムイオン分布を選択的にイメージングすることができる。
【００３５】
本発明による前記化学式１で表される二光子蛍光プローブは、カルシウム陽イオンと応じて強い二光子蛍光を表わし、カルシウムイオンとともに錯体を形成して細胞膜に選択的であり、容易にローディングされうる。また、６０分以上の時間に亘って１００〜２００μｍ深さの生体細胞及び生体組織で選択的にカルシウムイオンを探知することができるので、生体細胞または組織でカルシウム陽イオンの分布をイメージングすることができる。
【００３６】
また、本発明は、前記化学式１で表される二光子蛍光プローブ及びナトリウムイオン感知用の二光子蛍光プローブを用いて生体細胞または組織でＮａ＋／Ｃａ２＋交換を同時にイメージングする方法を提供する。
【００３７】
前記ナトリウムイオン感知用の二光子蛍光プローブは、下記ＡＮａ１で表されることができるが、これにのみ限定されるものではない。
【００３８】
［ＡＮａ１］
【００３９】
前記のように、本発明によれば、相異なる蛍光色の二つの標識子を生体細胞または組織に同時に染色することによって、カルシウムとナトリウムとの活動性を相異なるチャンネルで同時に映像化させることができる。
【００４０】
以下、本発明の理解を助けるために、望ましい実施例を提示する。しかし、下記の実施例は、本発明をより容易に理解するために提供されるものであって、これにより、本発明の内容が限定されるものではない。
【実施例１】
【００４１】
二光子蛍光プローブ（ＢＣａ１）の製造
６−ブロモ−Ｎ−メチル−２−ナフチルアミン（６−Ｂｒｏｍｏ−Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ−２−ｎａｐｈｔｈｙｌａｍｉｎｅ）及び２−（２'−モルホリノ−２'−オキソエトキシ）−４−ニトロ−Ｎ，Ｎ−ビス（ヒドロキシカルボニルメチル）アニリン（２−（２'−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ−２'−ｏｘｏｅｔｈｏｘｙ）−４−ｎｉｔｒｏ−Ｎ，Ｎ−ｂｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌｍｅｔｈｙｌ）ａｎｉｌｉｎｅ、化合物Ｃ）を従来技術によって合成した。他の化合物の合成は、下記に表わした。
【００４２】
［反１］
【００４３】
前記反応式１で、（ａ）は、ｔ−ブチルブロモアセタート（ｔ−ｂｕｔｙｌ ｂｒｏｍｏａｃｅｔａｔｅ）／プロトンスポンジ（ｐｒｏｔｏｎ−ｓｐｏｎｇｅ）／ＭｅＣＮ、（ｂ）は、ベンズオキサゾール（ｂｅｎｚｏｘａｚｏｌｅ）／Ｐｄ（ＩＩ）ＯＡｃ／ＰＰｈ３／ＣｕＩ／ＣｓＣＯ３／ＤＭＦ、及びＣＦ３ＣＯ２Ｈ／ＣＨ２Ｃｌ２、（ｃ）は、ＤＣＣ／ＨＯＢｔ／ＣＨ２Ｃｌ２及びＫＯＨ／ＥｔＯＨ／ジオキサン（ｄｉｏｘａｎｅ）の反応条件である。
【００４４】
１）２−ブロモ−６−Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）メチル−Ｎ−メチルアミノナフタレン（２−Ｂｒｏｍｏ−６−Ｎ−（ｔｅｒｔ−ｂｕｔｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ−Ｎ−ｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ、化合物Ｂ）の製造
６−ブロモ−Ｎ−メチル−２−ナフチルアミン（６−ｂｒｏｍｏ−Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ−２−ｎａｐｈｔｈｙｌａｍｉｎｅ、２．０ｇ、８．５ｍｍｏｌ）、プロトンスポンジ（ｐｒｏｔｏｎ−ｓｐｏｎｇｅ、２．０ｇ、９．４ｍｍｏｌ）、及びｔｅｒｔ‐ブチルブロモアセタート（ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌ ｂｒｏｍｏａｃｅｔａｔｅ、２．０ｇ、１．５ｍＬ、１０．２ｍｍｏｌ）の混合物をＭｅＣＮ内でＮ２下で１２時間還流させた。生成物を酢酸エチルで抽出し、塩水（ｂｒｉｎｅ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濃縮させた後、溶離液（ｅｌｕｅｎｔ）としてヘキサン／酢酸エチル（５：１）を利用したシリカゲルカラムで精製した。
【００４５】
収率：２．６ｇ（８７％）；
ｍｐ：６３℃；
ＩＲ（ＫＢｒ）：１，７３６ｃｍ−１；
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ７．７９（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝２Ｈｚ）、７．５７（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝９Ｈｚ）、７．４８（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝９Ｈｚ）、７．３８（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝９、Ｊ＝２Ｈｚ）、７．０５（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝９、Ｊ＝２Ｈｚ）、６．８２（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝２Ｈｚ）、４．０４（ｓ、２Ｈ）、３．１４（ｓ、３Ｈ）、１．４０（ｓ、９Ｈ）；
１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ＝１７０．３、１４７．５、１３３．８、１２９．８、１２９．７、１２８．４、１２８．３、１２８．２、１１６．７、１１５．７、１０６．７、８２．２、５６．０、４０．５、２８．７ｐｐｍ。
【００４６】
Ａｎａｌ．Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ１７Ｈ２０ＢｒＮＯ２：Ｃ、５８．３０；Ｈ、５．７６；Ｎ、４．００．Ｆｏｕｎｄ：Ｃ、５８．４３；Ｈ、５．６５；Ｎ、４．０６。
【００４７】
２）化合物Ａの製造
化合物Ｂ（１．０ｇ、２．９ｍｍｏｌ）、ベンズオキサゾール（ｂｅｎｚｏｘａｚｏｌｅ、０．４１ｇ、３．４ｍｍｏｌ）、Ｐｄ（ＩＩ）ＯＡｃ（０．０３３ｇ、０．１５ｍｍｏｌ）、ＰＰｈ３（０．０７３ｇ、０．２９ｍｍｏｌ）、ＣｕＩ（０．１１ｇ、０．５８ｍｍｏｌ）、及びＣｓＣＯ３（１．１ｇ、３．５ｍｍｏｌ）の混合物をＤＭＦ内でＮ２下で１４０℃で１２時間撹拌した。反応混合物を濾過し、酢酸エチルで希釈し、塩水（ｂｒｉｎｅ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させた後、濃縮させた。粗生成物を溶離液（ｅｌｕｅｎｔ）としてヘキサン／酢酸エチル（３：１）を利用したシリカゲルカラムで精製した。
【００４８】
収率：０．６４ｇ（５７％）；
ｍｐ：１６５℃；
ＩＲ（ＫＢｒ）：１，７３８ｃｍ−１；
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ８．５６（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝２Ｈｚ）、８．１４（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝９、Ｊ＝２Ｈｚ）、７．７８（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝９Ｈｚ）、７．７３（ｍ、１Ｈ）、７．６９（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝９Ｈｚ）、７．５４（ｍ、１Ｈ）、７．３０（ｍ、２Ｈ）、７．０６（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝９、Ｊ＝２Ｈｚ）、６．８５（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝２Ｈｚ）、４．０５（ｓ、２Ｈ）、３．１５（ｓ、３Ｈ）、１．４１（ｓ、９Ｈ）；
１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ＝１６９．７、１６４．０、１５０．９、１４８．６、１４２．６、１３６．８、１３０．３、１２８．１、１２７．０、１２６．４、１２４．７、１２４．５、１２４．４、１２０．７、１１９．９、１１６．２、１１０．６、１０６．４、８２．１、５５．７、４０．２、２８．４ｐｐｍ。
【００４９】
Ａｎａｌ．Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ２４Ｈ２４Ｎ２Ｏ３：Ｃ、７４．２１；Ｈ、６．２３；Ｎ、７．２１．Ｆｏｕｎｄ：Ｃ、７４．３３；Ｈ、６．３５；Ｎ、７．１１。
【００５０】
ＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）内の前記エステル（０．５０ｇ、１．３ｍｍｏｌ）溶液にＣＦ３ＣＯ２Ｈ（２ｍＬ）を追加し、混合物をＮ２下で２４時間撹拌した。溶媒を眞空下で除去した。生成物をヘキサンで洗浄し、濾過した。
【００５１】
収率：０．２９ｇ（６８％）；
ｍｐ：１８８℃；
ＩＲ（ＫＢｒ）：２，９００、１，７１８ｃｍ−１；
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３／ＣＤ３ＯＤ）：δ８．５７（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝２Ｈｚ）、８．１２（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝９、Ｊ＝２Ｈｚ）、７．８４（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝９Ｈｚ）、７．７５（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝９Ｈｚ）、７．７１（ｍ、１Ｈ）、７．６０（ｍ、１Ｈ）、７．３６（ｍ、２Ｈ）、７．１６（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝９、Ｊ＝２Ｈｚ）、６．９４（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝２Ｈｚ）、４．２２（ｓ、２Ｈ）、３．２２（ｓ、３Ｈ）；
１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３／ＣＤ３ＯＤ）：δ＝１７３．１、１６４．３、１５０．９、１４８．８、１４２．１、１３７．０、１３０．６、１２８．４、１２７．３、１２６．４、１２５．２、１２４．９、１２４．６、１２０．３、１１９．６、１１６．４、１１０．８、１０６．３、５４．６、４０．１ｐｐｍ。
【００５２】
Ａｎａｌ．Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ２０Ｈ１６Ｎ２Ｏ３：Ｃ、７２．２８；Ｈ、４．８５；Ｎ、８．４３．Ｆｏｕｎｄ：Ｃ、７２．１７；Ｈ、４．９１；Ｎ、８．４０。
【００５３】
３）２−（２'−モルホリノ−２'−オキソエトキシ）−Ｎ，Ｎ−ビス（メトキシカルボニルメチル）−１，４−フェニレンジアミン（２−（２'−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ−２'−ｏｘｏｅｔｈｏｘｙ）−Ｎ，Ｎ−ｂｉｓ（ｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌｍｅｔｈｙｌ）−１，４−ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ、化合物Ｄ）の製造
化合物Ｃ（０．６７ｇ、１．６ｍｍｏｌ）及びカーボン上のＰｄ（０．０３３ｇ、０．３１ｍｍｏｌ）を酢酸エチル（５０ｍＬ）内で混合し、水素下で１２時間振った。反応混合物をセライト（Ｃｅｌｉｔｅ）で濾過し、溶媒は眞空下で除去した。
【００５４】
収率：０．５８ｇ（９２％）；
ＩＲ（ＫＢｒ）：１，７４０、１，６４２ｃｍ−１；
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ６．７７（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝８Ｈｚ）、６．２６（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝２Ｈｚ）、６．１７（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝８、Ｊ＝２Ｈｚ）、４．６５（ｓ、２Ｈ）、３．９７（ｓ、４Ｈ）、３．５９（ｓ、６Ｈ）、３．５８−３．５３（ｍ、８Ｈ）；
１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ＝１７１．６、１６６．６、１５１．６、１４３．３、１３０．６、１２２．６、１０８．６、１０３．０、６８．４、６６．８、５４．０、５１．６、４５．８ｐｐｍ。
【００５５】
Ａｎａｌ．Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ１８Ｈ２５Ｎ３Ｏ７：Ｃ、５４．６８；Ｈ、６．３７；Ｎ、１０．６３．Ｆｏｕｎｄ：Ｃ、５４．５９；Ｈ、６．５０；Ｎ、１０．５８。
【００５６】
４）二光子蛍光プローブ（ＢＣａ１）の製造
化合物Ａ（０．１０ｇ、０．３０ｍｍｏｌ）、１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド（１，３−ｄｉｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ、０．０６０ｇ、０．３０ｍｍｏｌ）、及び１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（１−ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ、０．０３４ｇ、０．２５ｍｍｏｌ）の混合物をＣＨ２Ｃｌ２内で１時間攪拌した。前記混合物にＣＨ２Ｃｌ２内の化合物Ｄ（０．１０ｇ、０．２５ｍｍｏｌ）を追加し、Ｎ２下で１２時間撹拌した。結果として得られた混合物を濾過し、濾過物を眞空下で濃縮させた。粗生成物を溶離液（ｅｌｕｅｎｔ）としてＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ（２０：１）を利用したカラムクロマトグラフィー（シリカゲル）によって精製した。
【００５７】
収率：０．１２ｇ（６６％）；
ｍｐ：８０℃；
ＩＲ（ＫＢｒ）：１，７４３、１，６２６、１，５１６ｃｍ−１；
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ８．６５（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝２Ｈｚ）、８．２７（ｓ、１Ｈ）、８．２３（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝９、Ｊ＝２Ｈｚ）、７．８８（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝９Ｈｚ）、７．７９（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝９Ｈｚ）、７．７６（ｍ、１Ｈ）、７．５９（ｍ、１Ｈ）、７．３８（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝２Ｈｚ）、７．３４（ｍ、２Ｈ）、７．１６（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝９、Ｊ＝２Ｈｚ）、７．０９（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝２Ｈｚ）、６．８７（ｍ、２Ｈ）、４．７４（ｓ、２Ｈ）、４．１３（ｓ、４Ｈ）、４．１０（ｓ、２Ｈ）、３．６６（ｓ、６Ｈ）、３．５０−３．６１（ｍ、８Ｈ）、３．２２（ｓ、３Ｈ）；
１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ＝１７１．６、１６８．２、１６６．２、１６３．６、１５０．７、１５０．１、１４８．６、１４２．３、１３６．２、１３５．９、１３３．０、１３０．６、１２７．９、１２７．３、１２６．９、１２５．０、１２４．９、１２４．７、１２１．３、１２０．６、１１９．８、１１６．６、１１３．８、１１０．７、１０７．５、１０７．３、６７．５、６６．８、６０．７、５３．８、５２．１、４５．７、４０．４ｐｐｍ。
【００５８】
Ａｎａｌ．Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ３８Ｈ３９Ｎ５Ｏ９：Ｃ、６４．３１；Ｈ、５．５４；Ｎ、９．８７．Ｆｏｕｎｄ：Ｃ、６４．７１；Ｈ、５．６０；Ｎ、９．７９。
【００５９】
ＭｅＯＨ／ｄｉｏｘａｎｅ（１／１ｍＬ）内の前記中間体（０．１０ｇ、０．１４ｍｍｏｌ）溶液にＫＯＨ（１Ｍ、０．３５ｍＬ、０．３５ｍｍｏｌ）を一定比率方式で追加し、反応混合物を１５時間撹拌した。溶媒を蒸発させ、結果混合物を蒸溜水（ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ ｗａｔｅｒ、２０ｍＬ）に溶かし、エーテルで抽出した後、水溶液を収集した。ＨＣｌ（１Ｍ、０．３５ｍＬ、０．３５ｍｍｏｌ）をゆっくり追加し、ＡｃＯＨ２滴を追加した。沈殿物を収集し、蒸溜水で洗浄した。
【００６０】
収率：５７ｍｇ（６０％）；
ｍｐ：１６２℃；
ＩＲ（ＫＢｒ）：２，９７０、１，６２６、１，５１４ｃｍ−１；
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３／ＣＤ３ＯＤ）：δ８．６０（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝２Ｈｚ）、８．１６（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝９、Ｊ＝２Ｈｚ）、７．８８（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝９Ｈｚ）、７．７８（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝９Ｈｚ）、７．７３（ｍ、１Ｈ）、７．６０（ｍ、１Ｈ）、７．３７（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝２Ｈｚ）、７．３４（ｍ、２Ｈ）、７．１７（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝９、Ｊ＝２Ｈｚ）、７．０４（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝２Ｈｚ）、６．９３（ｍ、２Ｈ）、４．７６（ｓ、２Ｈ）、４．１４（ｓ、２Ｈ）、４．０３（ｓ、４Ｈ）、３．５１−３．５９（ｍ、８Ｈ）、３．２４（ｓ、３Ｈ）；
１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ＝１７２．９、１６８．２、１６６．４、１６３．６、１５０．７、１４９．９、１４９．７、１４２．４、１３６．９、１３５．２、１３３．７、１３０．６、１２８．２、１２７．４、１２５．９、１２５．６、１２５．３、１２４．５、１２０．０、１１９．８、１１９．６、１１７．１、１１２．８、１１１．３、１０６．７、１０６．２、１０５．８、６７．０、６６．７、５６．１、５４．１、４５．６ｐｐｍ。
Ａｎａｌ．Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ３６Ｈ３５Ｎ５Ｏ９：Ｃ、６３．４３；Ｈ、５．１８；Ｎ、１０．２７．Ｆｏｕｎｄ：Ｃ、６３．２２；Ｈ、５．２１；Ｎ、１０．１９。
【実施例２】
【００６１】
１）水溶解度（Ｗａｔｅｒ ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ）特性結果
ＤＭＳＯに染料を溶かしてストック溶液（１．０×１０−２Ｍ）を製造した。溶液を（６．０×１０−３〜６．０×１０−５）Ｍで希釈させ、マイクロシリンジを用いてＨ２Ｏ ３．０ｍＬを含有するキュベット（ｃｕｖｅｔｔｅ）に追加した。あらゆる場合、Ｈ２Ｏ内のＤＭＳＯの濃度は、０．２％に維持させた。染料濃度に対する蛍光強度のグラフは、低い濃度で線形であり、高い濃度では下側に曲がった形態であった（図１）。線形領域の最大濃度を溶解度として測定したところ、水に対するＢＣａ１の溶解度は、約５．０μＭであった。これは、細胞を着色するに十分である。
【００６２】
前記ＢＣａ１の単一光子蛍光スペクトルを下記図１の（ａ）に表わし、Ｈ２Ｏ内のＢＣａ１の濃度による蛍光強度を下記図１の（ｂ）に表わした。励起状態の波長は、３６０ｎｍであった。
【００６３】
２）分光学的特性結果
吸収スペクトルは、ヒューレットパッカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）８４５３ダイオードアレイ分光光度計から測定し、蛍光スペクトルは、１ｃｍ標準石英セルを有したＡｍｉｃｏ−Ｂｏｗｍａｎ ｓｅｒｉｅｓ２発光分光計から測定した。蛍光量子収率は、従来に知られた方法を利用し、クマリン３０７（Φ＝０．９５ ｉｎ ＭｅＯＨ）を用いて決定した。
【００６４】
１，４−ジオキサン、ＥｔＯＨ、ＤＭＦ及びＨ２Ｏ内のＢＣａ１の標準吸収スペクトルを下記図２の（ａ）に表わし、１，４−ジオキサン、ＥｔＯＨ、ＤＭＦ及びＨ２Ｏ内のＢＣａ１の標準放出スペクトルを下記図２の（ｂ）に表わした。
【００６５】
図２の結果のように、ＢＣａ１の吸収及び放出スペクトルは、溶媒極性の増加によって漸進的な赤色移動を表わした。
【００６６】
ＨｅＬａ細胞内のＢＣａ１及びＡＮａ１の標準放出スペクトルを下記図３に表わした。図３の結果のように、ＢＣａ１の放出バンドは、ＡＮａ１の放出バンドと区分されるようによく分離されていることが分かる。
【００６７】
自由Ｃａ２＋（０〜２．５ｍＭ）の存在下で１μＭ ＢＣａ１（３０ｍＭ ＭＯＰＳ、１００ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ７．２）の単一光子蛍光スペクトルを下記図４に表わした。図４の結果のように、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（３−（Ｎ−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ、ＭＯＰＳ）バッファ溶液（３０ｍＭ、１００ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ ７．２）内のＢＣａ１にＣａ２＋を追加した時、蛍光強度は、金属イオンの濃度の関数として急増し、これは、金属イオンとの複合化による光−誘導電子輸送（ｐｈｏｔｏ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｔｒａｎｓｆｅｒ、ＰｅＴ）工程の封鎖に起因したものである。ほぼ同一の結果が、二光子工程でも観察された。
【００６８】
ＡＮａ１及びＢＣａ１に対する光物理学的実験結果を下記表１に表わした。
【００６９】
【表１】
【００７０】
λ（１）ｍａｘ：単一光子吸収及び放出スペクトル（ｎｍ）
Φ：蛍光光子効率（誤差範囲：±１０％）
ＫＴＰｄ：バッファ内の二光子工程によって測定されたＣａ２＋に対する解離定数（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｃｏｎｓｔａｎｔ）
Ｋｉｄ：細胞内の二光子工程によって測定されたＣａ２＋に対する解離定数（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｃｏｎｓｔａｎｔ）
ＦＥＦ：蛍光向上因子（（Ｆ−Ｆｍｉｎ）／Ｆｍｉｎ＝ＦＥＦ）、前記表１のＦＥＦ値で括弧内の数は、二光子工程に対するものである。
【００７１】
λ（２）ｍａｘ：二光子励起スペクトル（ｎｍ）
δΦ：１０−５０ｃｍ４ｓ／光子（ＧＭ）で二光子作動断面積（誤差範囲：±１５％）
ｎｄ：二光子励起蛍光強度があまりにも弱くて正確に断面積が測定されない。
【００７２】
λｆｌｍａｘ：ＤＰＰＣ／ＣＨＬ（（１，２−ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ／ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ）、浮遊混合物及びＤＯＰＣ（１，２−ｄｉｏｌｅｏｙｌｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ）で構成されたＬＵＶｓ内の測定値。
【００７３】
また、バッファ及びＬＵＶｓ内で測定されたＫＯＰｄ値は、それぞれ９０±２μＭ及び８１±４μＭであった。
【００７４】
自由Ｃａ２＋の存在下で１μＭ ＢＣａ１（３０ｍＭ ＭＯＰＳ、１００ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ７．２）の複合体に対する単一光子吸収曲線を下記図５の（ａ）に表わし、単一光子及び二光子蛍光適正曲線を下記図５の（ｂ）に表わし、単一光子及び二光子Ｈｉｌｌ曲線を下記図５の（ｃ）に表わした。
【００７５】
単一光子及び二光子工程に対するＢＣａ１の解離定数（ＫＯＰｄ及びＫＴＰｄ）は、図５の（ｂ）の蛍光適正曲線から計算された。
【００７６】
多様な陽イオンに対する１μＭ ＢＣａ１の相対的な蛍光強度を下記図６の（ａ）に表わし、ＢＣａ１の単一光子蛍光強度に対するｐＨの影響を下記図６の（ｂ）に表わした。ＢＣａ１は、Ｍｇ２＋、Ｚｎ２＋及びＭｎ２＋に対して弱い反応を表わし、Ｆｅ２＋、Ｃｕ２＋及びＣｏ２＋に対して何らの反応を表わさなかった。したがって、このようなプローブは、他の生物学的関連陽イオンから最小限の干渉を受けながら、Ｃａ２＋を選択的に検出することがある。また、ＢＣａ１は、ｐＨに対して影響を受けなかった。
【００７７】
過量のＣａ２＋を含有するＭＯＰＳバッファ内のＢＣａ１の二光子動作スペクトルは、δΦ値として７８０ｎｍで１５０ＧＭを表わし、このような値は、Ｃａｌｃｉｕｍ−Ｇｒｅｅｎ−Ｃａ２＋及びＦｕｒａ−２−Ｃａ２＋より３〜５倍向上したということが分かる（図７参照）。したがって、ＢＣａ１で着色されたセルのＴＰＭイメージは、他の商業用プローブで着色されたものより明るいイメージを表わすことができるということが分かる。
【００７８】
３）大きい単一膜リポソーム（Ｌａｒｇｅ ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅｓ、ＬＵＶｓ）の製造
単一光子及び二光子スペクトルの測定のためのＬＵＶｓを押出法による多重膜リポソーム（ｍｕｌｔｉｌａｍｅｌｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅｓ）の水和懸濁（ｈｙｄｒａｔｅｄｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）によって製造した。脂肪質（Ｌｉｐｉｄｓ）をＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ（９５／５ｖｏｌ％）に溶かし、Ｎ２流れ及び眞空下で乾燥させた。結果フィルムを懸濁液が均質になるまで６０℃で振りながら、ＭＯＰＳ ｂｕｆｆｅｒ（３０ｍＭ ＭＯＰＳ、１００ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ７．２）内で水和させた。混合物を３回凝固−解凍（ｆｒｅｅｚｅ−ｔｈａｗ）サイクルを行った後、１００ｎｍ気孔メンブレン（ＡｖａｎｔｉＰｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）を通過させてＬＵＶｓを押出した。リポソームを着色するために、ＤＭＳＯ内にＢＣａ１を追加し、３０分間待った。リポソーム内のプローブの比率は、３００：１であった。温度は、０．１℃の精度を有するデジタル温度計を用いて測定した。
【００７９】
ＤＯＰＣ／スフィンゴミエリン（ｓｐｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎ）／コレステロール（ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ）（１：１：１、浮遊混合物）で構成されたＬＵＶｓ内の自由Ｃａ２＋（０〜２．５ｍＭ）と１μＭ ＢＣａ１との複合体に対する単一光子蛍光スペクトルを下記図８の（ａ）に表わし、Ｈｉｌｌ曲線を下記図８の（ｂ）に表わした。
【００８０】
２５±０．５℃でＤＰＰＣ／ＣＨＬ（黒曲線）、ＤＯＰＣ／スフィンゴミエリン（ｓｐｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎ）／ＣＨＬ（１：１：１、浮遊混合物）（青色曲線）、及びＤＯＰＣ（ピンク曲線）で構成されたＬＵＶｓ内の自由Ｃａ２＋（２．５ｍＭ）を含むＢＣａ１の標準放出スペクトルを下記図９の（ａ）に表わし、ＨｅＬａ細胞内のＢＣａ１の標準放出スペクトルを下記図９の（ｂ）に表わした。浮遊混合物（ｒａｆｔ ｍｉｘｔｕｒｅ）によるスペクトルは、４３６及び４６７ｎｍに集中された二つのガウス曲線（空色曲線）によく合った。また、細胞からのスペクトルは、４３０及び４６０ｎｍに集中された二つのガウス曲線（緑色曲線）によく合った。
【００８１】
４）二光子断面積の測定結果
二光子断面積（δ）は、フェムト秒単位（ｆｅｍｔｏ ｓｅｃｏｎｄ、ｆｓ）蛍光測定法を用いて測定した。３０ｍＭ ＭＯＰＳバッファ（２．５ｍＭ ＣａＣｌ２、１００ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ７．２）にＢＣａ１を５．０×１０−６Ｍの濃度で溶かした後、蛍光強度が誘導された二光子は、７４０〜９４０ｎｍでフルオレセイン（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ、８．０×１０−５Ｍ、ｐＨ＝１１）を用いて測定した。レファレンスとサンプルのＴＰＥＦスペクトル強度は、同一の励起波長で決定された。ＴＰＡ断面は、下記数式１を用いて計算した。
【００８２】
【数１】
前記数式１で、ｓ及びｒは、サンプル及びレファレンス分子を表わし、Ｓは、ＣＣＤ検出器から収集された信号強度を表わし。Фは、蛍光量子収率を表わし、ｆは、実験機器の全体蛍光収集効率を表わし、ｃは、溶液内の分子密度を表わし、δｒは、レファレンス分子のＴＰＡ断面積を表わす。
【００８３】
５）細胞培養（Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ）
ＨｅＬａ細胞は、熱非活性化された１０％（ｖ／ｖ）のｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ；Ｇｉｂｃｏ）、１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬペニシリン（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）及び１００ｍｇ／ｍＬストレプトマイシン（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）が補充されたＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｓ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ；Ｇｉｂｃｏ）内で培養された。細胞は、３７℃でａｉｒ／ＣＯ２の比率が９５：５である加湿環境で成長された。イメージング４日前に細胞をトリプシン（ｔｒｙｐｓｉｎ）−ＥＤＴＡ溶液で分離し、５０，０００ｃｅｌｌｓ／ｍｍ２の細胞をガラス底ディッシュ（ＭａｔＴｅｋ）に平板培養した。細胞は、３７℃で２０分間、２μＭのＡＮａ１で培養され、次いで、常温で０．５μＭのＢＣａ１を取りこませた。１０分後に、細胞を還元されたカルシウム補正塩溶液（ＲＣＢＳＳ；１２７ｍＭ ＮａＣｌ、３．８ｍＭ ＫＣｌ、１．２ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、０．８ｍＭ ＭｇＣｌ２、５ｍＭグルコース、及び１０ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファ）で２回洗浄した後、イメージ化した。
【００８４】
６）二光子蛍光顕微鏡イメージの測定
プローブでラベルされたＨｅＬａ細胞及び組織の二光子蛍光顕微鏡イメージは、共焦点及び多光子顕微鏡（ｓｐｅｃｔｒａｌ ｃｏｎｆｏｃａｌ ａｎｄ ｍｕｌｔｉｐｈｏｔｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅｓ、Ｌｅｉｃａ ＴＣＳ ＳＰ２）を用いて測定した。
【００８５】
ＢＣａ１でラベルされたＨｅＬａ細胞のＴＰＭイメージ及びそれによる分析図表を下記図１０に表わした。
【００８６】
３９０〜４５０ｎｍで収集されたＢＣａ１（０．５μＭ）でラベルされたＨｅＬａ細胞の明るい領域イメージ（ａ）、ＴＰＭイメージ（ｂ）、及び時間による相対的なＴＰＥＦ強度（ｃ）を下記図１１に表わした。
【００８７】
また、０．５μＭのＢＣａ１及び２μＭのＡＮａ１でラベルされたＨｅＬａ細胞のＴＰＭイメージを図１２に表わした。より具体的には、図１２の（ａ）は、３９０〜４５０ｎｍでの０．５μＭのＢＣａ１でラベルされたＨｅＬａ細胞のＴＰＭイメージであり、（ｂ）は、５００〜５６０ｎｍでの０．５μＭのＢＣａ１でラベルされたＨｅＬａ細胞のＴＰＭイメージであり、（ｃ）は、３９０〜４５０ｎｍでの２μＭのＡＮａ１でラベルされたＨｅＬａ細胞のＴＰＭイメージであり、（ｄ）は、５００〜５６０ｎｍでの２μＭのＡＮａ１でラベルされたＨｅＬａ細胞のＴＰＭイメージである。
【００８８】
ＢＣａ１及びＡＮａ１でラベルされたＨｅＬａ細胞のＴＰＭイメージ及び蛍光強度を下記図１３に表わした。より具体的に、図１３の（ａ）は、３９０〜４５０ｎｍでＢＣａ１でラベルされたＴＭＰイメージを表わしたものであり、（ｂ）は、５００〜５６０ｎｍでＡＮａ１でラベルされたＴＰＭイメージを表わしたものであり、（ｃ）は、前記（ａ）及び（ｂ）を統合したものであり、（ｄ）は、（ｃ）のボックス部分を拡大したものであり、（ｅ）は、（ｄ）の１及び２で表示した部分の蛍光強度を表わしたものである。
前述のように、ＢＣａ１及びＡＮａ１の組合わせからＮａ＋／Ｃａ２＋変化をモニタリングすることができる。
【００８９】
７）モルモットの海馬及び視床下部組織切片の製造及び着色
２週齢のモルモットの海馬から切片を準備した。振動ブレード切断機（ｖｉｂｒａｔｉｎｇ−ｂｌａｄｅ ｍｉｃｒｏｔｏｍｅ）を用いて人工脳脊髄液（ａｒｔｉｆｉｃｉａｌｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ ｆｌｕｉｄ、ＡＣＳＦ；１３８．６ｍＭ ＮａＣｌ、３．５ｍＭ ＫＣｌ、２１ｍＭ ＮａＨＣＯ３、０．６ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、９．９ｍＭ Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｅ、１ｍＭ ＣａＣｌ２、及び３ｍＭ ＭｇＣｌ２）内で冠状切片を４００μｍの厚さで切断した。切片を３７℃で４０分間に、９５％ Ｏ２及び５％ ＣＯ２を噴き出すＡＣＳＦ内で１０ｍＭのＢＣａ１及び２０ｍＭのＡＮａ１で培養させた。次いで、切片をＡＣＳＦで３回洗浄し、ガラス底ディッシュ（ＭａｔＴｅｋ）に移動させ、これを電子顕微鏡で観察した。
【００９０】
ＢＣａ１及びＡＮａ１で着色されたモルモット海馬切片のイメージを下記図１４に表わした。より具体的に、図１４の（ａ）及び（ｂ）は、１０×倍率による歯状回（ｄｅｎｔａｔｅ ｇｙｒｕｓ）のみならず、ＣＡ１−ＣＡ３領域の明るい領域及びＴＰＭイメージを表わしたものであって、（ｂ）は、３９０〜４５０ｎｍ（チャンネル１）及び５００〜５６０ｎｍ（チャンネル２）で収集された２５ＴＰＭイメージを表わしたものである。図１４の（ｃ）ないし（ｅ）は、ＣＡ３領域のＴＰＭイメージを表わしたものであって、（ｃ）及び（ｄ）は、それぞれ１００×倍率で１００〜２００μｍの深さでチャンネル１及びチャンネル２で収集されたＴＰＭイメージを表わしたものであり、（ｅ）は、それを併合したものである。
【００９１】
前記のように、本発明による細胞膜近傍のカルシウムイオン二光子蛍光プローブは、カルシウム陽イオンと反応して強い二光子蛍光を表わし、カルシウムイオンとともに錯体を形成して細胞膜に選択的であり、容易に取り込まれるということが分かる。また、６０分以上の時間に亘って１００〜２００μｍ深さの生体細胞及び生体組織で選択的にカルシウムイオンを探知することができるので、生体細胞または組織でカルシウム陽イオンの分布をイメージングすることができる。また、相異なる蛍光色の二つの標識子を生体細胞または組織に同時に染色することによって、カルシウムとナトリウムとの活動性を相異なるチャンネルで映像化させることができる。
【産業上の利用可能性】
【００９２】
本発明は、相異なる蛍光色の二光子蛍光プローブを用いてナトリウム／カルシウム活性を同時にイメージ化する方法及び二光子蛍光プローブの製造方法に関連する分野に適用されうる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、相異なる蛍光色の二光子蛍光プローブを用いてナトリウム／カルシウム活性を同時にイメージ化する方法及び二光子蛍光プローブの製造方法に係り、具体的には、高い感度と選択性とで生体細胞膜イオンチャンネル近傍のカルシウムイオンの活動性をイメージングすることができる二光子蛍光プローブと、これを他の蛍光色の二光子ナトリウムプローブと同時に染色することによって、生体細胞または組織で起こるナトリウム／カルシウム陽イオンの交換及び活動性を二つのチャンネルで同時イメージングすることができる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞内カルシウムイオン分布の変化を測定することは、生理、病理的な現象研究で非常に重要である。細胞内カルシウムイオンの濃度は、原形質膜と各器官の膜とに存在するポンプあるいはチャネルを通じて細胞内の多様な状況に合わせて調節される。これにより、細胞膜近傍のカルシウムイオンの濃度は、細胞内平均値より遥かに高く存在し、生理的活性によって１００μｍｏｌ以上増加する。このような細胞膜近傍高濃度のカルシウムイオンは、ホルモンと神経伝達物質のエキソサイトーシス（ｅｘｏｃｙｔｏｓｉｓ）、信号伝逹で２次伝達者（ｓｅｃｏｎｄ ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ）などの過程で重要な役割を行うものと知られている。
【０００３】
このようなカルシウムイオン濃度変化を調節する代表的な生体物質は、Ｎａ＋／Ｃａ２＋イオン交換体（ＮＣＸ）である。ＮＣＸの機能は、細胞内にカルシウムイオン濃度が高くなれば、恒常性（ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ）を維持するために、カルシウムイオンは細胞外に出し、ナトリウムは細胞内に入るようにする。これをＮａ＋／Ｃａ２＋交換と言う。
【０００４】
このような機能を理解するために、多様な単一光子蛍光プローブが開発されて来たが、個別的なイオンの活性を研究するのに止められており、相異なるイオンを同時に映像化させることによって、これらの相互作用を同時に映像化させた例は全くない。また、大部分の単一光子プローブの共通的な問題点は、それらの短い励起波長（＜５００ｎｍ）である。このような短い励起波長は、透過性が浅く（＜１００μｍ）、光漂白（ｐｈｏｔｏｂｌｅａｃｈｉｎｇ）及び細胞自己蛍光の問題があり組織イメージングに対する適用が制限される。
【０００５】
このような問題は、励起のために低いエネルギーの２個の近赤外線光子を用いる二光子顕微鏡（ＴＰＭ）によって理想的に解決できる。二光子顕微鏡を使えば、完全な組織が７０μメーターよりさらに大きい組織切片の内部に延びることができる組織準備成形物から最小限の干渉を作りながら長期間にイメージを作りうる。しかし、生体組織の内部深さ（＞１００μｍ）に存在する細胞膜近傍のカルシウムと細胞内部のナトリウムイオン分布を同時にイメージで作ることができる相異なる蛍光色の二光子プローブは、現在まで開発されていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明が解決しようとする第１の課題は、小さな分子量を有しながら細胞膜に選択的に染色され、細胞膜近傍のカルシウムイオンに対する選択性と活動性とを映像化させるのに適した二光子蛍光プローブを提供することである。
【０００７】
本発明が解決しようとする第２の課題は、前記二光子蛍光プローブを用いて生体細胞または組織で細胞膜近傍のカルシウムイオン分布を選択的にイメージングする方法を提供することである。
【０００８】
本発明が解決しようとする第３の課題は、前記二光子蛍光プローブと相異なる二光子蛍光色のナトリウムプローブとを用いて生体細胞または組織でＮａ＋／Ｃａ２＋交換を同時に映像化する方法を提供することである。
【０００９】
本発明が解決しようとする第４の課題は、前記細胞膜近傍のカルシウムイオン二光子蛍光プローブの製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、下記化学式１で表される二光子蛍光プローブを提供する。
【００１１】
【化１】
【００１２】
前記化学式１で、Ｘは、Ｏ、ＳまたはＮＨである。
【００１３】
また、本発明は、
１）６−ブロモ−Ｎ−メチル−２−ナフチルアミン（６−ｂｒｏｍｏ−Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ−２−ｎａｐｈｔｈｙｌａｍｉｎｅ）、プロトンスポンジ（ｐｒｏｔｏｎ−ｓｐｏｎｇｅ）、及びｔｅｒｔ‐ブチルブロモアセタート（ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌ ｂｒｏｍｏａｃｅｔａｔｅ）の混合物を還流させて、下記化学式２で表される化合物Ｂを製造する段階と、
２）前記化合物Ｂ、ベンズオキサゾール（ｂｅｎｚｏｘａｚｏｌｅ）、Ｐｄ（ＩＩ）ＯＡｃ、ＰＰｈ３、ＣｕＩ、及びＣｓＣＯ３の混合物を撹拌して、下記化学式３で表される化合物Ａを製造する段階と、
３）前記化合物Ａ、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（１−ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ）及び下記化学式４で表される化合物Ｄを混合し、反応させる段階と、を含む前記化学式１で表される二光子蛍光プローブの製造方法を提供する。
【００１４】
【化２】
【００１５】
【化３】
【００１６】
【化４】
【００１７】
前記化学式３で、Ｘは、Ｏ、ＳまたはＮＨである。
【００１８】
また、本発明は、前記化学式１で表される二光子蛍光プローブを用いて生体細胞または組織のカルシウムイオン分布を選択的にイメージングする方法を提供する。
【００１９】
また、本発明は、前記化学式１で表される二光子蛍光プローブ及びナトリウムイオン感知用の二光子蛍光プローブを用いて生体細胞または組織でＮａ＋／Ｃａ２＋交換を同時にイメージングする方法を提供する。
【発明の効果】
【００２０】
本発明による細胞膜近傍のカルシウムイオン二光子蛍光プローブは、カルシウム陽イオンと反応して強い二光子蛍光を表わす。細胞膜に選択的であり、容易にローディングされることができて、細胞膜近傍のカルシウムイオンとともに錯体を形成することができ、細胞内で解離定数（Ｋｄｉ）が７８±５μＭで、この近傍のカルシウムイオンの活動性を感知することに適した。また、６０分以上の時間に亘って１００〜２００μｍ深さの生体細胞及び生体組織で選択的にカルシウムイオンを探知することができるので、生体細胞または組織でカルシウム陽イオンの分布をイメージングすることができる。また、相異なる蛍光色の二つの標識子を生体細胞または組織に同時に染色することによって、カルシウムとナトリウムとの活動性を相異なるチャンネルで映像化させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】本発明の一具体例としてＢＣａ１の単一光子蛍光スペクトル及びＨ２Ｏ内のＢＣａ１の濃度による蛍光強度を示す図である。
【図２】本発明の一具体例として１，４−ジオキサン、ＥｔＯＨ、ＤＭＦ及びＨ２Ｏ内のＢＣａ１の標準吸収スペクトル及び標準放出スペクトルを示す図である。
【図３】ＨｅＬａ細胞内のＢＣａ１及びＡＮａ１の標準放出スペクトルを示す図である。
【図４】本発明の一具体例として単一光子蛍光スペクトルを示す図である。
【図５】本発明の一具体例としてＢＣａ１の単一光子吸収曲線、ＢＣａ１の単一光子及び二光子蛍光適正曲線、及びＢＣａ１の単一光子及び二光子Ｈｉｌｌ曲線を示す図である。
【図６】本発明の一具体例として多様な陽イオンに対するＢＣａ１の相対的な蛍光強度及びＢＣａ１の単一光子蛍光強度に対するｐＨの影響を示す図である。
【図７】本発明の一具体例として二光子蛍光作動スペクトルを示す図である。
【図８】本発明の一具体例としてＢＣａ１の単一光子蛍光スペクトル及びＢＣａ１のＨｉｌｌ曲線を示す図である。
【図９】本発明の一具体例としてＬＵＶｓ内のＢＣａ１の標準放出スペクトル及びＨｅＬａ細胞内のＢＣａ１の標準放出スペクトルを示す図である。
【図１０】（ａ）は、本発明の一具体例としてＢＣａ１でラベルされたＨｅＬａ細胞のＴＰＭイメージを示す図であり、（ｂ）は、それによる分析図表を示す図である。
【図１１】本発明の一具体例としてＢＣａ１でラベルされたＨｅｌａ細胞の電子写真及び蛍光強度を示す図である。
【図１２】本発明の一具体例としてＢＣａ１でラベルされたＨｅｌａ細胞のＴＰＭイメージを示す図である。
【図１３】本発明の一具体例としてＢＣａ１及びＡＮａ１でラベルされたＨｅＬａ細胞のＴＰＭイメージ及び蛍光強度を示す図である。
【図１４】本発明の一具体例としてＢＣａ１及びＡＮａ１で着色されたモルモット海馬切片のイメージを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
以下、本発明をより具体的に説明する。
【００２３】
本発明による二光子蛍光プローブは、下記化学式１で表されることを特徴とする。
【００２４】
［化１］
【００２５】
前記化学式１で、Ｘは、Ｏ、ＳまたはＮＨであり、Ｏであることがより望ましい。
【００２６】
本発明による前記化学式１で表される二光子蛍光プローブは、生体細胞または組織でカルシウムイオンの検出用として適用可能である。
【００２７】
前記化学式１で表される二光子蛍光プローブは、２−（２'−モルホリノ−２'−オキソエトキシ）−Ｎ，Ｎ−ビス（ヒドロキシカルボニルメチル）アニリン（２−（２'−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ−２'−ｏｘｏｅｔｈｏｘｙ）−Ｎ，Ｎｂｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌｍｅｔｈｙｌ）ａｎｉｌｉｎｅ、ＭＯＢＨＡ）をカルシウム陽イオン受容体として含み、６−（ベンゾ［ｄ］オキサゾール−２'−イル）−２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）ナフタレン（６−（ｂｅｎｚｏ［ｄ］ｏｘａｚｏｌ−２'−ｙｌ）−２−（Ｎ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ）をリポーターとして含む。
【００２８】
また、本発明による前記化学式１で表される二光子蛍光プローブの製造方法の一具体例は、１）６−ブロモ−Ｎ−メチル−２−ナフチルアミン（６−ｂｒｏｍｏ−Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ−２−ｎａｐｈｔｈｙｌａｍｉｎｅ）、プロトンスポンジ（ｐｒｏｔｏｎ−ｓｐｏｎｇｅ）、及びｔｅｒｔ‐ブチルブロモアセタート（ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌ ｂｒｏｍｏａｃｅｔａｔｅ）の混合物を還流させて、下記化学式２で表される化合物Ｂを製造する段階、２）前記化合物Ｂ、ベンズオキサゾール（ｂｅｎｚｏｘａｚｏｌｅ）、Ｐｄ（ＩＩ）ＯＡｃ、ＰＰｈ３、ＣｕＩ、及びＣｓＣＯ３の混合物を撹拌して、下記化学式３で表される化合物Ａを製造する段階、及び３）前記化合物Ａ、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（１−ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ）及び下記化学式４で表される化合物Ｄを混合し、反応させる段階を含む。
【００２９】
［化２］
【００３０】
［化３］
【００３１】
［化４］
【００３２】
前記化学式３で、Ｘは、Ｏ、ＳまたはＮＨであり、Ｏであることがより望ましい。
【００３３】
本発明による前記化学式１で表される二光子蛍光プローブの製造方法は、後述する実施例により具体的に表わした。
【００３４】
また、本発明は、前記化学式１で表される二光子蛍光プローブを用いて生体細胞または組織のカルシウムイオン分布を選択的にイメージングする方法を提供する。より具体的に、前記生体細胞または組織で細胞膜近傍のカルシウムイオン分布を選択的にイメージングすることができる。
【００３５】
本発明による前記化学式１で表される二光子蛍光プローブは、カルシウム陽イオンと応じて強い二光子蛍光を表わし、カルシウムイオンとともに錯体を形成して細胞膜に選択的であり、容易にローディングされうる。また、６０分以上の時間に亘って１００〜２００μｍ深さの生体細胞及び生体組織で選択的にカルシウムイオンを探知することができるので、生体細胞または組織でカルシウム陽イオンの分布をイメージングすることができる。
【００３６】
また、本発明は、前記化学式１で表される二光子蛍光プローブ及びナトリウムイオン感知用の二光子蛍光プローブを用いて生体細胞または組織でＮａ＋／Ｃａ２＋交換を同時にイメージングする方法を提供する。
【００３７】
前記ナトリウムイオン感知用の二光子蛍光プローブは、下記ＡＮａ１で表されることができるが、これにのみ限定されるものではない。
【００３８】
［ＡＮａ１］
【００３９】
前記のように、本発明によれば、相異なる蛍光色の二つの標識子を生体細胞または組織に同時に染色することによって、カルシウムとナトリウムとの活動性を相異なるチャンネルで同時に映像化させることができる。
【００４０】
以下、本発明の理解を助けるために、望ましい実施例を提示する。しかし、下記の実施例は、本発明をより容易に理解するために提供されるものであって、これにより、本発明の内容が限定されるものではない。
【実施例１】
【００４１】
二光子蛍光プローブ（ＢＣａ１）の製造
６−ブロモ−Ｎ−メチル−２−ナフチルアミン（６−Ｂｒｏｍｏ−Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ−２−ｎａｐｈｔｈｙｌａｍｉｎｅ）及び２−（２'−モルホリノ−２'−オキソエトキシ）−４−ニトロ−Ｎ，Ｎ−ビス（ヒドロキシカルボニルメチル）アニリン（２−（２'−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ−２'−ｏｘｏｅｔｈｏｘｙ）−４−ｎｉｔｒｏ−Ｎ，Ｎ−ｂｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌｍｅｔｈｙｌ）ａｎｉｌｉｎｅ、化合物Ｃ）を従来技術によって合成した。他の化合物の合成は、下記に表わした。
【００４２】
［反１］
【００４３】
前記反応式１で、（ａ）は、ｔ−ブチルブロモアセタート（ｔ−ｂｕｔｙｌ ｂｒｏｍｏａｃｅｔａｔｅ）／プロトンスポンジ（ｐｒｏｔｏｎ−ｓｐｏｎｇｅ）／ＭｅＣＮ、（ｂ）は、ベンズオキサゾール（ｂｅｎｚｏｘａｚｏｌｅ）／Ｐｄ（ＩＩ）ＯＡｃ／ＰＰｈ３／ＣｕＩ／ＣｓＣＯ３／ＤＭＦ、及びＣＦ３ＣＯ２Ｈ／ＣＨ２Ｃｌ２、（ｃ）は、ＤＣＣ／ＨＯＢｔ／ＣＨ２Ｃｌ２及びＫＯＨ／ＥｔＯＨ／ジオキサン（ｄｉｏｘａｎｅ）の反応条件である。
【００４４】
１）２−ブロモ−６−Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）メチル−Ｎ−メチルアミノナフタレン（２−Ｂｒｏｍｏ−６−Ｎ−（ｔｅｒｔ−ｂｕｔｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ−Ｎ−ｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ、化合物Ｂ）の製造
６−ブロモ−Ｎ−メチル−２−ナフチルアミン（６−ｂｒｏｍｏ−Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ−２−ｎａｐｈｔｈｙｌａｍｉｎｅ、２．０ｇ、８．５ｍｍｏｌ）、プロトンスポンジ（ｐｒｏｔｏｎ−ｓｐｏｎｇｅ、２．０ｇ、９．４ｍｍｏｌ）、及びｔｅｒｔ‐ブチルブロモアセタート（ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌ ｂｒｏｍｏａｃｅｔａｔｅ、２．０ｇ、１．５ｍＬ、１０．２ｍｍｏｌ）の混合物をＭｅＣＮ内でＮ２下で１２時間還流させた。生成物を酢酸エチルで抽出し、塩水（ｂｒｉｎｅ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濃縮させた後、溶離液（ｅｌｕｅｎｔ）としてヘキサン／酢酸エチル（５：１）を利用したシリカゲルカラムで精製した。
【００４５】
収率：２．６ｇ（８７％）；
ｍｐ：６３℃；
ＩＲ（ＫＢｒ）：１，７３６ｃｍ−１；
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ７．７９（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝２Ｈｚ）、７．５７（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝９Ｈｚ）、７．４８（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝９Ｈｚ）、７．３８（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝９、Ｊ＝２Ｈｚ）、７．０５（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝９、Ｊ＝２Ｈｚ）、６．８２（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝２Ｈｚ）、４．０４（ｓ、２Ｈ）、３．１４（ｓ、３Ｈ）、１．４０（ｓ、９Ｈ）；
１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ＝１７０．３、１４７．５、１３３．８、１２９．８、１２９．７、１２８．４、１２８．３、１２８．２、１１６．７、１１５．７、１０６．７、８２．２、５６．０、４０．５、２８．７ｐｐｍ。
【００４６】
Ａｎａｌ．Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ１７Ｈ２０ＢｒＮＯ２：Ｃ、５８．３０；Ｈ、５．７６；Ｎ、４．００．Ｆｏｕｎｄ：Ｃ、５８．４３；Ｈ、５．６５；Ｎ、４．０６。
【００４７】
２）化合物Ａの製造
化合物Ｂ（１．０ｇ、２．９ｍｍｏｌ）、ベンズオキサゾール（ｂｅｎｚｏｘａｚｏｌｅ、０．４１ｇ、３．４ｍｍｏｌ）、Ｐｄ（ＩＩ）ＯＡｃ（０．０３３ｇ、０．１５ｍｍｏｌ）、ＰＰｈ３（０．０７３ｇ、０．２９ｍｍｏｌ）、ＣｕＩ（０．１１ｇ、０．５８ｍｍｏｌ）、及びＣｓＣＯ３（１．１ｇ、３．５ｍｍｏｌ）の混合物をＤＭＦ内でＮ２下で１４０℃で１２時間撹拌した。反応混合物を濾過し、酢酸エチルで希釈し、塩水（ｂｒｉｎｅ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させた後、濃縮させた。粗生成物を溶離液（ｅｌｕｅｎｔ）としてヘキサン／酢酸エチル（３：１）を利用したシリカゲルカラムで精製した。
【００４８】
収率：０．６４ｇ（５７％）；
ｍｐ：１６５℃；
ＩＲ（ＫＢｒ）：１，７３８ｃｍ−１；
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ８．５６（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝２Ｈｚ）、８．１４（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝９、Ｊ＝２Ｈｚ）、７．７８（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝９Ｈｚ）、７．７３（ｍ、１Ｈ）、７．６９（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝９Ｈｚ）、７．５４（ｍ、１Ｈ）、７．３０（ｍ、２Ｈ）、７．０６（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝９、Ｊ＝２Ｈｚ）、６．８５（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝２Ｈｚ）、４．０５（ｓ、２Ｈ）、３．１５（ｓ、３Ｈ）、１．４１（ｓ、９Ｈ）；
１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ＝１６９．７、１６４．０、１５０．９、１４８．６、１４２．６、１３６．８、１３０．３、１２８．１、１２７．０、１２６．４、１２４．７、１２４．５、１２４．４、１２０．７、１１９．９、１１６．２、１１０．６、１０６．４、８２．１、５５．７、４０．２、２８．４ｐｐｍ。
【００４９】
Ａｎａｌ．Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ２４Ｈ２４Ｎ２Ｏ３：Ｃ、７４．２１；Ｈ、６．２３；Ｎ、７．２１．Ｆｏｕｎｄ：Ｃ、７４．３３；Ｈ、６．３５；Ｎ、７．１１。
【００５０】
ＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）内の前記エステル（０．５０ｇ、１．３ｍｍｏｌ）溶液にＣＦ３ＣＯ２Ｈ（２ｍＬ）を追加し、混合物をＮ２下で２４時間撹拌した。溶媒を眞空下で除去した。生成物をヘキサンで洗浄し、濾過した。
【００５１】
収率：０．２９ｇ（６８％）；
ｍｐ：１８８℃；
ＩＲ（ＫＢｒ）：２，９００、１，７１８ｃｍ−１；
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３／ＣＤ３ＯＤ）：δ８．５７（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝２Ｈｚ）、８．１２（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝９、Ｊ＝２Ｈｚ）、７．８４（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝９Ｈｚ）、７．７５（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝９Ｈｚ）、７．７１（ｍ、１Ｈ）、７．６０（ｍ、１Ｈ）、７．３６（ｍ、２Ｈ）、７．１６（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝９、Ｊ＝２Ｈｚ）、６．９４（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝２Ｈｚ）、４．２２（ｓ、２Ｈ）、３．２２（ｓ、３Ｈ）；
１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３／ＣＤ３ＯＤ）：δ＝１７３．１、１６４．３、１５０．９、１４８．８、１４２．１、１３７．０、１３０．６、１２８．４、１２７．３、１２６．４、１２５．２、１２４．９、１２４．６、１２０．３、１１９．６、１１６．４、１１０．８、１０６．３、５４．６、４０．１ｐｐｍ。
【００５２】
Ａｎａｌ．Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ２０Ｈ１６Ｎ２Ｏ３：Ｃ、７２．２８；Ｈ、４．８５；Ｎ、８．４３．Ｆｏｕｎｄ：Ｃ、７２．１７；Ｈ、４．９１；Ｎ、８．４０。
【００５３】
３）２−（２'−モルホリノ−２'−オキソエトキシ）−Ｎ，Ｎ−ビス（メトキシカルボニルメチル）−１，４−フェニレンジアミン（２−（２'−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ−２'−ｏｘｏｅｔｈｏｘｙ）−Ｎ，Ｎ−ｂｉｓ（ｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌｍｅｔｈｙｌ）−１，４−ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ、化合物Ｄ）の製造
化合物Ｃ（０．６７ｇ、１．６ｍｍｏｌ）及びカーボン上のＰｄ（０．０３３ｇ、０．３１ｍｍｏｌ）を酢酸エチル（５０ｍＬ）内で混合し、水素下で１２時間振った。反応混合物をセライト（Ｃｅｌｉｔｅ）で濾過し、溶媒は眞空下で除去した。
【００５４】
収率：０．５８ｇ（９２％）；
ＩＲ（ＫＢｒ）：１，７４０、１，６４２ｃｍ−１；
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ６．７７（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝８Ｈｚ）、６．２６（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝２Ｈｚ）、６．１７（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝８、Ｊ＝２Ｈｚ）、４．６５（ｓ、２Ｈ）、３．９７（ｓ、４Ｈ）、３．５９（ｓ、６Ｈ）、３．５８−３．５３（ｍ、８Ｈ）；
１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ＝１７１．６、１６６．６、１５１．６、１４３．３、１３０．６、１２２．６、１０８．６、１０３．０、６８．４、６６．８、５４．０、５１．６、４５．８ｐｐｍ。
【００５５】
Ａｎａｌ．Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ１８Ｈ２５Ｎ３Ｏ７：Ｃ、５４．６８；Ｈ、６．３７；Ｎ、１０．６３．Ｆｏｕｎｄ：Ｃ、５４．５９；Ｈ、６．５０；Ｎ、１０．５８。
【００５６】
４）二光子蛍光プローブ（ＢＣａ１）の製造
化合物Ａ（０．１０ｇ、０．３０ｍｍｏｌ）、１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド（１，３−ｄｉｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ、０．０６０ｇ、０．３０ｍｍｏｌ）、及び１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（１−ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ、０．０３４ｇ、０．２５ｍｍｏｌ）の混合物をＣＨ２Ｃｌ２内で１時間攪拌した。前記混合物にＣＨ２Ｃｌ２内の化合物Ｄ（０．１０ｇ、０．２５ｍｍｏｌ）を追加し、Ｎ２下で１２時間撹拌した。結果として得られた混合物を濾過し、濾過物を眞空下で濃縮させた。粗生成物を溶離液（ｅｌｕｅｎｔ）としてＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ（２０：１）を利用したカラムクロマトグラフィー（シリカゲル）によって精製した。
【００５７】
収率：０．１２ｇ（６６％）；
ｍｐ：８０℃；
ＩＲ（ＫＢｒ）：１，７４３、１，６２６、１，５１６ｃｍ−１；
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ８．６５（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝２Ｈｚ）、８．２７（ｓ、１Ｈ）、８．２３（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝９、Ｊ＝２Ｈｚ）、７．８８（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝９Ｈｚ）、７．７９（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝９Ｈｚ）、７．７６（ｍ、１Ｈ）、７．５９（ｍ、１Ｈ）、７．３８（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝２Ｈｚ）、７．３４（ｍ、２Ｈ）、７．１６（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝９、Ｊ＝２Ｈｚ）、７．０９（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝２Ｈｚ）、６．８７（ｍ、２Ｈ）、４．７４（ｓ、２Ｈ）、４．１３（ｓ、４Ｈ）、４．１０（ｓ、２Ｈ）、３．６６（ｓ、６Ｈ）、３．５０−３．６１（ｍ、８Ｈ）、３．２２（ｓ、３Ｈ）；
１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ＝１７１．６、１６８．２、１６６．２、１６３．６、１５０．７、１５０．１、１４８．６、１４２．３、１３６．２、１３５．９、１３３．０、１３０．６、１２７．９、１２７．３、１２６．９、１２５．０、１２４．９、１２４．７、１２１．３、１２０．６、１１９．８、１１６．６、１１３．８、１１０．７、１０７．５、１０７．３、６７．５、６６．８、６０．７、５３．８、５２．１、４５．７、４０．４ｐｐｍ。
【００５８】
Ａｎａｌ．Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ３８Ｈ３９Ｎ５Ｏ９：Ｃ、６４．３１；Ｈ、５．５４；Ｎ、９．８７．Ｆｏｕｎｄ：Ｃ、６４．７１；Ｈ、５．６０；Ｎ、９．７９。
【００５９】
ＭｅＯＨ／ｄｉｏｘａｎｅ（１／１ｍＬ）内の前記中間体（０．１０ｇ、０．１４ｍｍｏｌ）溶液にＫＯＨ（１Ｍ、０．３５ｍＬ、０．３５ｍｍｏｌ）を一定比率方式で追加し、反応混合物を１５時間撹拌した。溶媒を蒸発させ、結果混合物を蒸溜水（ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ ｗａｔｅｒ、２０ｍＬ）に溶かし、エーテルで抽出した後、水溶液を収集した。ＨＣｌ（１Ｍ、０．３５ｍＬ、０．３５ｍｍｏｌ）をゆっくり追加し、ＡｃＯＨ２滴を追加した。沈殿物を収集し、蒸溜水で洗浄した。
【００６０】
収率：５７ｍｇ（６０％）；
ｍｐ：１６２℃；
ＩＲ（ＫＢｒ）：２，９７０、１，６２６、１，５１４ｃｍ−１；
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３／ＣＤ３ＯＤ）：δ８．６０（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝２Ｈｚ）、８．１６（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝９、Ｊ＝２Ｈｚ）、７．８８（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝９Ｈｚ）、７．７８（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝９Ｈｚ）、７．７３（ｍ、１Ｈ）、７．６０（ｍ、１Ｈ）、７．３７（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝２Ｈｚ）、７．３４（ｍ、２Ｈ）、７．１７（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝９、Ｊ＝２Ｈｚ）、７．０４（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝２Ｈｚ）、６．９３（ｍ、２Ｈ）、４．７６（ｓ、２Ｈ）、４．１４（ｓ、２Ｈ）、４．０３（ｓ、４Ｈ）、３．５１−３．５９（ｍ、８Ｈ）、３．２４（ｓ、３Ｈ）；
１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ＝１７２．９、１６８．２、１６６．４、１６３．６、１５０．７、１４９．９、１４９．７、１４２．４、１３６．９、１３５．２、１３３．７、１３０．６、１２８．２、１２７．４、１２５．９、１２５．６、１２５．３、１２４．５、１２０．０、１１９．８、１１９．６、１１７．１、１１２．８、１１１．３、１０６．７、１０６．２、１０５．８、６７．０、６６．７、５６．１、５４．１、４５．６ｐｐｍ。
Ａｎａｌ．Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ３６Ｈ３５Ｎ５Ｏ９：Ｃ、６３．４３；Ｈ、５．１８；Ｎ、１０．２７．Ｆｏｕｎｄ：Ｃ、６３．２２；Ｈ、５．２１；Ｎ、１０．１９。
【実施例２】
【００６１】
１）水溶解度（Ｗａｔｅｒ ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ）特性結果
ＤＭＳＯに染料を溶かしてストック溶液（１．０×１０−２Ｍ）を製造した。溶液を（６．０×１０−３〜６．０×１０−５）Ｍで希釈させ、マイクロシリンジを用いてＨ２Ｏ ３．０ｍＬを含有するキュベット（ｃｕｖｅｔｔｅ）に追加した。あらゆる場合、Ｈ２Ｏ内のＤＭＳＯの濃度は、０．２％に維持させた。染料濃度に対する蛍光強度のグラフは、低い濃度で線形であり、高い濃度では下側に曲がった形態であった（図１）。線形領域の最大濃度を溶解度として測定したところ、水に対するＢＣａ１の溶解度は、約５．０μＭであった。これは、細胞を着色するに十分である。
【００６２】
前記ＢＣａ１の単一光子蛍光スペクトルを下記図１の（ａ）に表わし、Ｈ２Ｏ内のＢＣａ１の濃度による蛍光強度を下記図１の（ｂ）に表わした。励起状態の波長は、３６０ｎｍであった。
【００６３】
２）分光学的特性結果
吸収スペクトルは、ヒューレットパッカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）８４５３ダイオードアレイ分光光度計から測定し、蛍光スペクトルは、１ｃｍ標準石英セルを有したＡｍｉｃｏ−Ｂｏｗｍａｎ ｓｅｒｉｅｓ２発光分光計から測定した。蛍光量子収率は、従来に知られた方法を利用し、クマリン３０７（Φ＝０．９５ ｉｎ ＭｅＯＨ）を用いて決定した。
【００６４】
１，４−ジオキサン、ＥｔＯＨ、ＤＭＦ及びＨ２Ｏ内のＢＣａ１の標準吸収スペクトルを下記図２の（ａ）に表わし、１，４−ジオキサン、ＥｔＯＨ、ＤＭＦ及びＨ２Ｏ内のＢＣａ１の標準放出スペクトルを下記図２の（ｂ）に表わした。
【００６５】
図２の結果のように、ＢＣａ１の吸収及び放出スペクトルは、溶媒極性の増加によって漸進的な赤色移動を表わした。
【００６６】
ＨｅＬａ細胞内のＢＣａ１及びＡＮａ１の標準放出スペクトルを下記図３に表わした。図３の結果のように、ＢＣａ１の放出バンドは、ＡＮａ１の放出バンドと区分されるようによく分離されていることが分かる。
【００６７】
自由Ｃａ２＋（０〜２．５ｍＭ）の存在下で１μＭ ＢＣａ１（３０ｍＭ ＭＯＰＳ、１００ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ７．２）の単一光子蛍光スペクトルを下記図４に表わした。図４の結果のように、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（３−（Ｎ−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ、ＭＯＰＳ）バッファ溶液（３０ｍＭ、１００ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ ７．２）内のＢＣａ１にＣａ２＋を追加した時、蛍光強度は、金属イオンの濃度の関数として急増し、これは、金属イオンとの複合化による光−誘導電子輸送（ｐｈｏｔｏ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｔｒａｎｓｆｅｒ、ＰｅＴ）工程の封鎖に起因したものである。ほぼ同一の結果が、二光子工程でも観察された。
【００６８】
ＡＮａ１及びＢＣａ１に対する光物理学的実験結果を下記表１に表わした。
【００６９】
【表１】
【００７０】
λ（１）ｍａｘ：単一光子吸収及び放出スペクトル（ｎｍ）
Φ：蛍光光子効率（誤差範囲：±１０％）
ＫＴＰｄ：バッファ内の二光子工程によって測定されたＣａ２＋に対する解離定数（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｃｏｎｓｔａｎｔ）
Ｋｉｄ：細胞内の二光子工程によって測定されたＣａ２＋に対する解離定数（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｃｏｎｓｔａｎｔ）
ＦＥＦ：蛍光向上因子（（Ｆ−Ｆｍｉｎ）／Ｆｍｉｎ＝ＦＥＦ）、前記表１のＦＥＦ値で括弧内の数は、二光子工程に対するものである。
【００７１】
λ（２）ｍａｘ：二光子励起スペクトル（ｎｍ）
δΦ：１０−５０ｃｍ４ｓ／光子（ＧＭ）で二光子作動断面積（誤差範囲：±１５％）
ｎｄ：二光子励起蛍光強度があまりにも弱くて正確に断面積が測定されない。
【００７２】
λｆｌｍａｘ：ＤＰＰＣ／ＣＨＬ（（１，２−ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ／ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ）、浮遊混合物及びＤＯＰＣ（１，２−ｄｉｏｌｅｏｙｌｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ）で構成されたＬＵＶｓ内の測定値。
【００７３】
また、バッファ及びＬＵＶｓ内で測定されたＫＯＰｄ値は、それぞれ９０±２μＭ及び８１±４μＭであった。
【００７４】
自由Ｃａ２＋の存在下で１μＭ ＢＣａ１（３０ｍＭ ＭＯＰＳ、１００ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ７．２）の複合体に対する単一光子吸収曲線を下記図５の（ａ）に表わし、単一光子及び二光子蛍光適正曲線を下記図５の（ｂ）に表わし、単一光子及び二光子Ｈｉｌｌ曲線を下記図５の（ｃ）に表わした。
【００７５】
単一光子及び二光子工程に対するＢＣａ１の解離定数（ＫＯＰｄ及びＫＴＰｄ）は、図５の（ｂ）の蛍光適正曲線から計算された。
【００７６】
多様な陽イオンに対する１μＭ ＢＣａ１の相対的な蛍光強度を下記図６の（ａ）に表わし、ＢＣａ１の単一光子蛍光強度に対するｐＨの影響を下記図６の（ｂ）に表わした。ＢＣａ１は、Ｍｇ２＋、Ｚｎ２＋及びＭｎ２＋に対して弱い反応を表わし、Ｆｅ２＋、Ｃｕ２＋及びＣｏ２＋に対して何らの反応を表わさなかった。したがって、このようなプローブは、他の生物学的関連陽イオンから最小限の干渉を受けながら、Ｃａ２＋を選択的に検出することがある。また、ＢＣａ１は、ｐＨに対して影響を受けなかった。
【００７７】
過量のＣａ２＋を含有するＭＯＰＳバッファ内のＢＣａ１の二光子動作スペクトルは、δΦ値として７８０ｎｍで１５０ＧＭを表わし、このような値は、Ｃａｌｃｉｕｍ−Ｇｒｅｅｎ−Ｃａ２＋及びＦｕｒａ−２−Ｃａ２＋より３〜５倍向上したということが分かる（図７参照）。したがって、ＢＣａ１で着色されたセルのＴＰＭイメージは、他の商業用プローブで着色されたものより明るいイメージを表わすことができるということが分かる。
【００７８】
３）大きい単一膜リポソーム（Ｌａｒｇｅ ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅｓ、ＬＵＶｓ）の製造
単一光子及び二光子スペクトルの測定のためのＬＵＶｓを押出法による多重膜リポソーム（ｍｕｌｔｉｌａｍｅｌｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅｓ）の水和懸濁（ｈｙｄｒａｔｅｄｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）によって製造した。脂肪質（Ｌｉｐｉｄｓ）をＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ（９５／５ｖｏｌ％）に溶かし、Ｎ２流れ及び眞空下で乾燥させた。結果フィルムを懸濁液が均質になるまで６０℃で振りながら、ＭＯＰＳ ｂｕｆｆｅｒ（３０ｍＭ ＭＯＰＳ、１００ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ７．２）内で水和させた。混合物を３回凝固−解凍（ｆｒｅｅｚｅ−ｔｈａｗ）サイクルを行った後、１００ｎｍ気孔メンブレン（ＡｖａｎｔｉＰｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）を通過させてＬＵＶｓを押出した。リポソームを着色するために、ＤＭＳＯ内にＢＣａ１を追加し、３０分間待った。リポソーム内のプローブの比率は、３００：１であった。温度は、０．１℃の精度を有するデジタル温度計を用いて測定した。
【００７９】
ＤＯＰＣ／スフィンゴミエリン（ｓｐｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎ）／コレステロール（ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ）（１：１：１、浮遊混合物）で構成されたＬＵＶｓ内の自由Ｃａ２＋（０〜２．５ｍＭ）と１μＭ ＢＣａ１との複合体に対する単一光子蛍光スペクトルを下記図８の（ａ）に表わし、Ｈｉｌｌ曲線を下記図８の（ｂ）に表わした。
【００８０】
２５±０．５℃でＤＰＰＣ／ＣＨＬ（黒曲線）、ＤＯＰＣ／スフィンゴミエリン（ｓｐｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎ）／ＣＨＬ（１：１：１、浮遊混合物）（青色曲線）、及びＤＯＰＣ（ピンク曲線）で構成されたＬＵＶｓ内の自由Ｃａ２＋（２．５ｍＭ）を含むＢＣａ１の標準放出スペクトルを下記図９の（ａ）に表わし、ＨｅＬａ細胞内のＢＣａ１の標準放出スペクトルを下記図９の（ｂ）に表わした。浮遊混合物（ｒａｆｔ ｍｉｘｔｕｒｅ）によるスペクトルは、４３６及び４６７ｎｍに集中された二つのガウス曲線（空色曲線）によく合った。また、細胞からのスペクトルは、４３０及び４６０ｎｍに集中された二つのガウス曲線（緑色曲線）によく合った。
【００８１】
４）二光子断面積の測定結果
二光子断面積（δ）は、フェムト秒単位（ｆｅｍｔｏ ｓｅｃｏｎｄ、ｆｓ）蛍光測定法を用いて測定した。３０ｍＭ ＭＯＰＳバッファ（２．５ｍＭ ＣａＣｌ２、１００ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ７．２）にＢＣａ１を５．０×１０−６Ｍの濃度で溶かした後、蛍光強度が誘導された二光子は、７４０〜９４０ｎｍでフルオレセイン（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ、８．０×１０−５Ｍ、ｐＨ＝１１）を用いて測定した。レファレンスとサンプルのＴＰＥＦスペクトル強度は、同一の励起波長で決定された。ＴＰＡ断面は、下記数式１を用いて計算した。
【００８２】
【数１】
前記数式１で、ｓ及びｒは、サンプル及びレファレンス分子を表わし、Ｓは、ＣＣＤ検出器から収集された信号強度を表わし。Фは、蛍光量子収率を表わし、ｆは、実験機器の全体蛍光収集効率を表わし、ｃは、溶液内の分子密度を表わし、δｒは、レファレンス分子のＴＰＡ断面積を表わす。
【００８３】
５）細胞培養（Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ）
ＨｅＬａ細胞は、熱非活性化された１０％（ｖ／ｖ）のｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ；Ｇｉｂｃｏ）、１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬペニシリン（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）及び１００ｍｇ／ｍＬストレプトマイシン（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）が補充されたＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｓ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ；Ｇｉｂｃｏ）内で培養された。細胞は、３７℃でａｉｒ／ＣＯ２の比率が９５：５である加湿環境で成長された。イメージング４日前に細胞をトリプシン（ｔｒｙｐｓｉｎ）−ＥＤＴＡ溶液で分離し、５０，０００ｃｅｌｌｓ／ｍｍ２の細胞をガラス底ディッシュ（ＭａｔＴｅｋ）に平板培養した。細胞は、３７℃で２０分間、２μＭのＡＮａ１で培養され、次いで、常温で０．５μＭのＢＣａ１を取りこませた。１０分後に、細胞を還元されたカルシウム補正塩溶液（ＲＣＢＳＳ；１２７ｍＭ ＮａＣｌ、３．８ｍＭ ＫＣｌ、１．２ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、０．８ｍＭ ＭｇＣｌ２、５ｍＭグルコース、及び１０ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファ）で２回洗浄した後、イメージ化した。
【００８４】
６）二光子蛍光顕微鏡イメージの測定
プローブでラベルされたＨｅＬａ細胞及び組織の二光子蛍光顕微鏡イメージは、共焦点及び多光子顕微鏡（ｓｐｅｃｔｒａｌ ｃｏｎｆｏｃａｌ ａｎｄ ｍｕｌｔｉｐｈｏｔｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅｓ、Ｌｅｉｃａ ＴＣＳ ＳＰ２）を用いて測定した。
【００８５】
ＢＣａ１でラベルされたＨｅＬａ細胞のＴＰＭイメージ及びそれによる分析図表を下記図１０に表わした。
【００８６】
３９０〜４５０ｎｍで収集されたＢＣａ１（０．５μＭ）でラベルされたＨｅＬａ細胞の明るい領域イメージ（ａ）、ＴＰＭイメージ（ｂ）、及び時間による相対的なＴＰＥＦ強度（ｃ）を下記図１１に表わした。
【００８７】
また、０．５μＭのＢＣａ１及び２μＭのＡＮａ１でラベルされたＨｅＬａ細胞のＴＰＭイメージを図１２に表わした。より具体的には、図１２の（ａ）は、３９０〜４５０ｎｍでの０．５μＭのＢＣａ１でラベルされたＨｅＬａ細胞のＴＰＭイメージであり、（ｂ）は、５００〜５６０ｎｍでの０．５μＭのＢＣａ１でラベルされたＨｅＬａ細胞のＴＰＭイメージであり、（ｃ）は、３９０〜４５０ｎｍでの２μＭのＡＮａ１でラベルされたＨｅＬａ細胞のＴＰＭイメージであり、（ｄ）は、５００〜５６０ｎｍでの２μＭのＡＮａ１でラベルされたＨｅＬａ細胞のＴＰＭイメージである。
【００８８】
ＢＣａ１及びＡＮａ１でラベルされたＨｅＬａ細胞のＴＰＭイメージ及び蛍光強度を下記図１３に表わした。より具体的に、図１３の（ａ）は、３９０〜４５０ｎｍでＢＣａ１でラベルされたＴＭＰイメージを表わしたものであり、（ｂ）は、５００〜５６０ｎｍでＡＮａ１でラベルされたＴＰＭイメージを表わしたものであり、（ｃ）は、前記（ａ）及び（ｂ）を統合したものであり、（ｄ）は、（ｃ）のボックス部分を拡大したものであり、（ｅ）は、（ｄ）の１及び２で表示した部分の蛍光強度を表わしたものである。
前述のように、ＢＣａ１及びＡＮａ１の組合わせからＮａ＋／Ｃａ２＋変化をモニタリングすることができる。
【００８９】
７）モルモットの海馬及び視床下部組織切片の製造及び着色
２週齢のモルモットの海馬から切片を準備した。振動ブレード切断機（ｖｉｂｒａｔｉｎｇ−ｂｌａｄｅ ｍｉｃｒｏｔｏｍｅ）を用いて人工脳脊髄液（ａｒｔｉｆｉｃｉａｌｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ ｆｌｕｉｄ、ＡＣＳＦ；１３８．６ｍＭ ＮａＣｌ、３．５ｍＭ ＫＣｌ、２１ｍＭ ＮａＨＣＯ３、０．６ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、９．９ｍＭ Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｅ、１ｍＭ ＣａＣｌ２、及び３ｍＭ ＭｇＣｌ２）内で冠状切片を４００μｍの厚さで切断した。切片を３７℃で４０分間に、９５％ Ｏ２及び５％ ＣＯ２を噴き出すＡＣＳＦ内で１０ｍＭのＢＣａ１及び２０ｍＭのＡＮａ１で培養させた。次いで、切片をＡＣＳＦで３回洗浄し、ガラス底ディッシュ（ＭａｔＴｅｋ）に移動させ、これを電子顕微鏡で観察した。
【００９０】
ＢＣａ１及びＡＮａ１で着色されたモルモット海馬切片のイメージを下記図１４に表わした。より具体的に、図１４の（ａ）及び（ｂ）は、１０×倍率による歯状回（ｄｅｎｔａｔｅ ｇｙｒｕｓ）のみならず、ＣＡ１−ＣＡ３領域の明るい領域及びＴＰＭイメージを表わしたものであって、（ｂ）は、３９０〜４５０ｎｍ（チャンネル１）及び５００〜５６０ｎｍ（チャンネル２）で収集された２５ＴＰＭイメージを表わしたものである。図１４の（ｃ）ないし（ｅ）は、ＣＡ３領域のＴＰＭイメージを表わしたものであって、（ｃ）及び（ｄ）は、それぞれ１００×倍率で１００〜２００μｍの深さでチャンネル１及びチャンネル２で収集されたＴＰＭイメージを表わしたものであり、（ｅ）は、それを併合したものである。
【００９１】
前記のように、本発明による細胞膜近傍のカルシウムイオン二光子蛍光プローブは、カルシウム陽イオンと反応して強い二光子蛍光を表わし、カルシウムイオンとともに錯体を形成して細胞膜に選択的であり、容易に取り込まれるということが分かる。また、６０分以上の時間に亘って１００〜２００μｍ深さの生体細胞及び生体組織で選択的にカルシウムイオンを探知することができるので、生体細胞または組織でカルシウム陽イオンの分布をイメージングすることができる。また、相異なる蛍光色の二つの標識子を生体細胞または組織に同時に染色することによって、カルシウムとナトリウムとの活動性を相異なるチャンネルで映像化させることができる。
【産業上の利用可能性】
【００９２】
本発明は、相異なる蛍光色の二光子蛍光プローブを用いてナトリウム／カルシウム活性を同時にイメージ化する方法及び二光子蛍光プローブの製造方法に関連する分野に適用されうる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記化学式１で表されることを特徴とする二光子蛍光プローブ：
［化１］
前記化学式１で、Ｘは、Ｏ、ＳまたはＮＨである。
【請求項２】
前記二光子蛍光プローブは、カルシウムイオンと反応して錯体を形成することを特徴とする請求項１に記載の二光子蛍光プローブ。
【請求項３】
下記化学式１で表される化合物を含む生体細胞または組織のカルシウムイオン検出用の二光子蛍光プローブ：
［化１］
前記化学式１で、Ｘは、Ｏ、ＳまたはＮＨである。
【請求項４】
１）６−ブロモ−Ｎ−メチル−２−ナフチルアミン（６−ｂｒｏｍｏ−Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ−２−ｎａｐｈｔｈｙｌａｍｉｎｅ）、プロトンスポンジ（ｐｒｏｔｏｎ−ｓｐｏｎｇｅ）、及びｔｅｒｔ‐ブチルブロモアセタート（ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌ ｂｒｏｍｏａｃｅｔａｔｅ）の混合物を還流させて、下記化学式２で表される化合物Ｂを製造する段階と、
２）前記化合物Ｂ、ベンズオキサゾール（ｂｅｎｚｏｘａｚｏｌｅ）、Ｐｄ（ＩＩ）ＯＡｃ、ＰＰｈ３、ＣｕＩ、及びＣｓＣＯ３の混合物を撹拌して、下記化学式３で表される化合物Ａを製造する段階と、
３）前記化合物Ａ、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（１−ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ）及び下記化学式４で表される化合物Ｄを混合し、反応させる段階と、
を含む下記化学式１で表されることを特徴とする二光子蛍光プローブの製造方法：
［化１］
［化２］
［化３］
［化４］
前記化学式１及び化学式３で、Ｘは、Ｏ、ＳまたはＮＨである。
【請求項５】
下記化学式１で表される二光子蛍光プローブを用いて生体細胞または組織のカルシウムイオン分布を選択的にイメージングする方法：
［化１］
前記化学式１で、Ｘは、Ｏ、ＳまたはＮＨである。
【請求項６】
前記イメージングの深さは、１００〜２００μｍであることを特徴とする請求項５に記載の生体細胞または組織のカルシウムイオン分布を選択的にイメージングする方法。
【請求項７】
下記化学式１で表される二光子蛍光プローブ及びナトリウムイオン感知用の二光子蛍光プローブを用いて生体細胞または組織でＮａ＋／Ｃａ２＋交換を同時にイメージングする方法：
［化１］
前記化学式１で、Ｘは、Ｏ、ＳまたはＮＨである。
【請求項８】
前記ナトリウムイオン感知用の二光子蛍光プローブは、下記ＡＮａ１で表されることを特徴とする請求項７に記載の生体細胞または組織でＮａ＋／Ｃａ２＋交換を同時にイメージングする方法：
［ＡＮａ１］
。
【請求項１】
下記化学式１で表されることを特徴とする二光子蛍光プローブ：
［化１］
前記化学式１で、Ｘは、Ｏ、ＳまたはＮＨである。
【請求項２】
前記二光子蛍光プローブは、カルシウムイオンと反応して錯体を形成することを特徴とする請求項１に記載の二光子蛍光プローブ。
【請求項３】
下記化学式１で表される化合物を含む生体細胞または組織のカルシウムイオン検出用の二光子蛍光プローブ：
［化１］
前記化学式１で、Ｘは、Ｏ、ＳまたはＮＨである。
【請求項４】
１）６−ブロモ−Ｎ−メチル−２−ナフチルアミン（６−ｂｒｏｍｏ−Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ−２−ｎａｐｈｔｈｙｌａｍｉｎｅ）、プロトンスポンジ（ｐｒｏｔｏｎ−ｓｐｏｎｇｅ）、及びｔｅｒｔ‐ブチルブロモアセタート（ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌ ｂｒｏｍｏａｃｅｔａｔｅ）の混合物を還流させて、下記化学式２で表される化合物Ｂを製造する段階と、
２）前記化合物Ｂ、ベンズオキサゾール（ｂｅｎｚｏｘａｚｏｌｅ）、Ｐｄ（ＩＩ）ＯＡｃ、ＰＰｈ３、ＣｕＩ、及びＣｓＣＯ３の混合物を撹拌して、下記化学式３で表される化合物Ａを製造する段階と、
３）前記化合物Ａ、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（１−ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ）及び下記化学式４で表される化合物Ｄを混合し、反応させる段階と、
を含む下記化学式１で表されることを特徴とする二光子蛍光プローブの製造方法：
［化１］
［化２］
［化３］
［化４］
前記化学式１及び化学式３で、Ｘは、Ｏ、ＳまたはＮＨである。
【請求項５】
下記化学式１で表される二光子蛍光プローブを用いて生体細胞または組織のカルシウムイオン分布を選択的にイメージングする方法：
［化１］
前記化学式１で、Ｘは、Ｏ、ＳまたはＮＨである。
【請求項６】
前記イメージングの深さは、１００〜２００μｍであることを特徴とする請求項５に記載の生体細胞または組織のカルシウムイオン分布を選択的にイメージングする方法。
【請求項７】
下記化学式１で表される二光子蛍光プローブ及びナトリウムイオン感知用の二光子蛍光プローブを用いて生体細胞または組織でＮａ＋／Ｃａ２＋交換を同時にイメージングする方法：
［化１］
前記化学式１で、Ｘは、Ｏ、ＳまたはＮＨである。
【請求項８】
前記ナトリウムイオン感知用の二光子蛍光プローブは、下記ＡＮａ１で表されることを特徴とする請求項７に記載の生体細胞または組織でＮａ＋／Ｃａ２＋交換を同時にイメージングする方法：
［ＡＮａ１］
。
【図２】
【図１】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【公開番号】特開２０１２−３７４９８（Ｐ２０１２−３７４９８Ａ）
【公開日】平成２４年２月２３日（２０１２．２．２３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２４２６００（Ｐ２０１０−２４２６００）
【出願日】平成２２年１０月２８日（２０１０．１０．２８）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 第１０５回 韓国化学学会 予稿集 平成２２年４月２９日
【出願人】（５０９００５９３７）アジュ ユニバーシティ インダストリー−アカデミック コーポレーション ファウンデーション (6)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年２月２３日（２０１２．２．２３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１０月２８日（２０１０．１０．２８）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 第１０５回 韓国化学学会 予稿集 平成２２年４月２９日
【出願人】（５０９００５９３７）アジュ ユニバーシティ インダストリー−アカデミック コーポレーション ファウンデーション (6)
【Ｆターム（参考）】
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