真核細胞における目的遺伝子の発現制御方法、ＲＮＡ分子およびＤＮＡ分子
【課題】本発明が解決すべき課題は、ＲＮＡ酵素やｍＲＮＡ以外のＲＮＡを用いることなく、導入遺伝子の発現を所望の分子により簡便に制御するためのＲＮＡ分子を提供することにある。また、本発明は、当該ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ分子と、当該ＤＮＡ分子を用いて目的遺伝子を真核細胞において発現するための方法を提供することも目的とする。
【解決手段】本発明に係るＲＮＡ分子は、リガンドにより目的遺伝子の発現を制御できるＲＮＡ分子であって、特定の５’末端ステムループ、モジュレータ配列、ａｎｔｉ−ａｎｔｉ−内部リボソーム結合サイト配列、アプタマー配列、ａｎｔｉ−内部リボソーム結合サイト配列、内部リボソーム結合サイトおよび目的遺伝子を５’側から有することを特徴とする。
【解決手段】本発明に係るＲＮＡ分子は、リガンドにより目的遺伝子の発現を制御できるＲＮＡ分子であって、特定の５’末端ステムループ、モジュレータ配列、ａｎｔｉ−ａｎｔｉ−内部リボソーム結合サイト配列、アプタマー配列、ａｎｔｉ−内部リボソーム結合サイト配列、内部リボソーム結合サイトおよび目的遺伝子を５’側から有することを特徴とする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、真核細胞において目的遺伝子の発現を制御するための方法と、当該方法で用いるＲＮＡ分子とＤＮＡ分子に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
細胞は様々な遺伝子発現の調節機構を有しており、例えば、特定の酵素が必要となった際にそれをコードする遺伝子の発現を開始したり、また、特定の遺伝子が過剰に発現したりしないようにしている。
【０００３】
このような機構としては、大腸菌のラクトースオペロンが有名である。ラクトースオペロンでは、グルコースが存在せず且つラクトースが存在するときに、ラクトース分解酵素であるβ−ガラクトシダーゼが産生されるように制御されている。
【０００４】
このラクトースオペロンを利用すれば、原核細胞において、ＩＰＴＧなどのラクトース類縁体による遺伝子発現の促進が可能である。しかし、遺伝子発現の促進に用いられる化合物はラクトース類縁体に限定され、所望の分子により遺伝子発現を制御することはできない。また、真核細胞でこのラクトースオペロンを用いることはできない。
【０００５】
真核細胞で機能する分子応答性の遺伝子発現制御機構も、ごくわずかではあるが見出されている。しかし、やはり発現制御に使用できる化合物が限られる。
【０００６】
その他にも、代謝産物などの特定分子により遺伝子の発現を制御する機構が原核生物で見出されている。詳しくは、図１のとおり、この機構においては、タンパク質をコードする遺伝子の上流にリボソーム結合部位（ＲＢＳ）が存在し、さらにその上流には代謝産物などの結合部位（アプタマー）が存在する。通常は、リボソーム結合部位にリボソームが結合し、その下流の遺伝子が翻訳されるが、代謝産物などがアプタマーに結合するとリボソーム結合部位の構造が変化してリボソームが結合できなくなり、結果として翻訳が阻害される。このようにして、原核細胞の中には、特定遺伝子の過剰発現が抑制されているものがある。このような機構は、リボ核酸（ＲＮＡ）がそれ自体で遺伝子発現を制御していることから、リボスイッチと呼ばれている。
【０００７】
所望の分子に結合するアプタマー自体は、試験管内人工進化法で獲得することが可能であるため、アプタマーを用いた人工リボスイッチシステムの構築方法が確立できれば、所望の分子により遺伝子発現を制御でき得る。また、天然から見出されているリボスイッチは、通常、上述したような遺伝子発現を抑制するタイプのものであるが、産業上より有用な促進タイプのリボスイッチの構築も可能であり得る。実際、原核細胞で働く人工リボスイッチシステムがいくつか報告されている。
【０００８】
ところが、上記の原核細胞のリボスイッチを真核細胞に応用することはできない。真核細胞では、原核細胞と異なり、ｍＲＮＡ内部のリボソーム結合部位へのリボソームの結合の可否により翻訳が制御されているのではなく、リボソームはｍＲＮＡの５’末端に結合し、翻訳が開始されることによる。
【０００９】
しかし、真核生物でも所望の分子によりｍＲＮＡの翻訳を制御する技術が開発されている。
【００１０】
例えば、特許文献１と非特許文献１〜２には、図２のとおり、特定化合物へ選択的に結合するアプタマーをｍＲＮＡの５’非翻訳領域やスプライシングサイトに挿入し、特定分子のアプタマーへの結合によりリボソームによるスキャニングやスプライソソームによるスプライシングを阻害し、結果として翻訳を阻害するシステムが開示されている。しかし、かかるシステムでは翻訳を阻害することはできても、特定分子を用いて翻訳を促進することはできない。
【００１１】
また、特許文献２と非特許文献３〜４には、特定の分子により切断活性が抑制される核酸（リボザイム）や特定の分子により切断活性が付与される核酸（アプタザイム）をｍＲＮＡに挿入したシステムが開示されている。本発明者らは、同様のシステムを応用し、特定の分子を検出するためのシステムを開発している（特許文献３）。ところが、かかるシステムは複雑で設計自体が困難であり、また、核酸の切断を伴うために一方向の制御しかできない上に、システムの応答性は核酸酵素の活性に大きく依存するという欠点を有する。
【００１２】
さらに、特許文献４〜５と非特許文献５〜７には、ｍＲＮＡとは異なるＲＮＡに分子応答性を付与し、アンチセンス効果やＲＮＡｉ効果により翻訳を制御するシステムが記載されている。しかし当該システムでは、ｍＲＮＡとは異なるＲＮＡが必要であるため、二種のＲＮＡの転写量や転写場所の調整が必要である。また、複数のＲＮＡを用いると、他の遺伝子に悪影響を及ぼす可能性が増大するという問題が生じる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００２／０００６６６１号明細書
【特許文献２】国際公開第００／２４９１２号パンフレット
【特許文献３】特開２００８−２２０１９１号公報
【特許文献４】米国特許出願公開第２００６／００８８８６４号明細書
【特許文献５】米国特許出願公開第２００９／０１４３３２７号明細書
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Geoffrey Werstuckら，サイエンス（SCIENCE），第２８２号，第２９６〜２９８頁（１９９８年）
【非特許文献２】Dong-Suk Kimら，ＲＮＡ，第１１号，第１６６７〜１６７７頁（２００５年）
【非特許文献３】Leising Yenら，ネイチャー（Nature），第４３１号，第４７１〜４７６頁（２００４年）
【非特許文献４】Maung Nyan Winら，プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proceedings of the National Academy of Sciences），第１０４号，第３６号，第１４２８３〜１４２８８頁（２００７年）
【非特許文献５】Travis S Bayerら，ネイチャー・バイオテクノロジー（Nature Biotechnology），第２３号，第３号，第３３７〜３４３頁（２００５年）
【非特許文献６】Chase L Beiselら，モレキュラー・システムズ・バイオロジー（Molecular Systems Biology），第４号，第１〜１４頁（２００８年）
【非特許文献７】Deepak Kumarら，ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティ（Journal of the American Chemical Society），第１３１号，第１３９０６〜１３９０７頁（２００９年）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
上述したように、従来、真核細胞において導入遺伝子の発現や翻訳を制御するためのシステムは既に開発されている。しかしながら、ｍＲＮＡ以外のＲＮＡやＲＮＡ酵素を用いることなく、導入遺伝子の発現を所望の分子により簡便に制御できる技術は無かった。
【００１６】
そこで、本発明が解決すべき課題は、ｍＲＮＡ以外のＲＮＡやＲＮＡ酵素を用いることなく、導入遺伝子の発現を所望の分子により簡便に制御するためのＲＮＡ分子を提供することにある。また、本発明は、当該ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ分子と、当該ＤＮＡ分子を用いて目的遺伝子を真核細胞において発現するための方法を提供することも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた。その結果、内部リボソーム結合サイト配列を有するウィルスｍＲＮＡを利用し、特に、その５’末端に５’末端ステムループを導入して真核細胞で主要な５’末端依存性の翻訳を抑制し、且つ適切なモジュレータ配列とアプタマー配列を導入することによりリガンドの存在・不存在時における内部リボソーム結合サイトの三次元構造の変化を制御すれば、リガンドの存在・不存在に応じて目的遺伝子の発現を明確に制御できることを見出して、本発明を完成した。
【００１８】
本発明に係るＲＮＡ分子は、リガンドにより目的遺伝子の発現を制御できるＲＮＡ分子であって、５’側から以下の構造および配列を有することを特徴とする。
【００１９】
（ａ） ５’末端依存性翻訳を阻害する５’末端ステムループ；
（ｂ） リガンド不存在時に、下記アプタマー配列の一部と相補的に結合してモジュレータ配列ステムループを形成するモジュレータ配列；
（ｃ） リガンド不存在時には、モジュレータ配列および下記アプタマー配列の一部と共にステムループを形成し、リガンド存在時には下記ａｎｔｉ−内部リボソーム結合サイト配列（以下、内部リボソーム結合サイトを「ＩＲＥＳ」（Internal Ribosome Entry Site）と略記する）と相補的二重鎖を形成するａｎｔｉ−ａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列；
（ｄ） リガンドとの結合能を有するアプタマー配列；
（ｅ） リガンド不存在時にはＩＲＥＳの一部と相補的二重鎖を形成してＩＲＥＳへのリボソームの結合を阻害し、リガンド存在時にはａｎｔｉ−ａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列と相補的二重鎖を形成するａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列；
（ｆ） ＩＲＥＳ；および
（ｇ） 目的遺伝子
【００２０】
上記ＩＲＥＳに対するａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列の相補塩基長としては、６以上、１２以下が好適である。当該相補塩基長が６以上であれば、リガンドが存在していないときにａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列がＩＲＥＳとより確実に相補鎖を形成し、ＩＲＥＳの働きを阻害してＩＲＥＳ依存性の翻訳を有効に抑制できる。また、当該相補塩基長が１２以下であれば、リガンドの存在によりａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列がより確実にＩＲＥＳから脱離し、ＩＲＥＳ依存性翻訳を開始せしめることが十分に可能になる。
【００２１】
上記ａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列に対するａｎｔｉ−ａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列の相補塩基長としては、６以上、１２以下が好適である。当該相補塩基長が６以上であれば、リガンドが存在しているときにａｎｔｉ−ａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列がａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列とより確実に相補鎖を形成してａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列の働きを阻害し、ＩＲＥＳ依存性の翻訳を有効に進行せしめることが可能になる。また、当該相補塩基長が１２以下であれば、リガンドの不存在時にａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列がａｎｔｉ−ａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列から脱離し、より確実にＩＲＥＳに結合して不活性化することが可能になる。
【００２２】
上記モジュレータ配列がアプタマー配列の一部のみならず、ａｎｔｉ−ａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列の一部とも相補的二重鎖を形成する場合、その相補塩基長としては、５以下が好適である。モジュレータ配列のａｎｔｉ−ａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列の一部に結合する部分の塩基配列は、ａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列の一部と同一にならざるを得ない。よって、上記相補塩基長が過剰に長いと、モジュレータ配列自体がＩＲＥＳに結合し、ＩＲＥＳ配列依存性の翻訳を阻害するおそれがあり得る。しかし上記相補塩基長が５以下であれば、かかる阻害を有効に抑制することができる。
【００２３】
上記アプタマー配列の一部に対するモジュレータ配列の相補塩基長としては、４以上、８以下が好適である。当該相補塩基長が４以上である場合、リガンドが存在しないときにモジュレータ配列がアプタマー配列へより確実に結合し、ＩＲＥＳ依存性の翻訳を有効に抑制できる。一方、当該相補塩基長が８以下である場合には、リガンドの存在によるアプタマーの三次元構造変化に応じてモジュレータ配列がアプタマー配列からより確実に脱離し、ａｎｔｉ−ａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列とａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列との結合を抑制せず、ひいてはＩＲＥＳ依存性の翻訳を促進することができる。即ち、当該相補塩基長が４以上、８以下である場合には、リガンドによるＩＲＥＳ依存性の翻訳のオン−オフスイッチが非常に有効に働く。
【００２４】
但し、アプタマー配列の一部とモジュレータ配列との好適な相補塩基長は、アプタマーの配列にも依存する。よって、同様の好適な態様は、モジュレータ配列ステムループ構造の安定性によって定めることが好ましい。かかる基準として、モジュレータ配列ステムループ構造のギブズ自由エネルギー（ΔＧ）が−１７．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上、−８．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下である場合が好適である。上記で述べた理由と同様に、リガンドの存在・不存在によるモジュレータ配列ステムループ構造、即ちモジュレータ配列とａｎｔｉ−ａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列の一部およびアプタマー配列の一部との結合と脱離が明確となり、リガンドによるＩＲＥＳ依存性の翻訳のスイッチが非常に有効に働く。
【００２５】
上記ＩＲＥＳとしては、チャバネアオカメムシ腸管ウィルスのものが好適であり、また、ａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列としては、チャバネアオカメムシ腸管ウィルスのＩＲＥＳの三次元構造における偽結節ＩＩＩまたはステムループＶに結合可能なものが好適である。これらＩＲＥＳとａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列の優れた効果は、後述する実験により実証されている。
【００２６】
本発明に係るＤＮＡ分子は、上記ＲＮＡ分子をコードするものであり、且つ当該コード領域の上流にプロモータ配列を有することを特徴とする。
【００２７】
本発明に係る目的遺伝子の真核細胞における発現を制御するための第一の方法は、上記ＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子を真核細胞の抽出物と混合し、反応させる工程を含むことを特徴とする。
【００２８】
また、本発明に係る目的遺伝子の真核細胞における発現を制御するための第二の方法は、上記ＤＮＡ分子を真核細胞にトランスフェクションする工程；および、真核細胞にリガンドを導入することにより、内部リボソーム結合サイトを活性化する工程を含むことを特徴とする。
【００２９】
上記ＲＮＡ分子、ＤＮＡ分子と遺伝子発現の制御方法は、真核細胞またはその抽出物を用い、リガンドの存在・不存在に応じて目的遺伝子の発現を明確に制御できる点で非常に有用である。
【発明の効果】
【００３０】
本発明によれば、従来、真核細胞における導入遺伝子発現の制御は複雑なシステムなどを用いない限りオフ制御しかできなかったのに対して、ウィルスのＩＲＥＳ（内部リボソーム結合サイト）を用いた簡便なシステムにより、導入遺伝子の発現をオン制御することができる。
【００３１】
よって本発明は、リガンドを用いた導入遺伝子発現の制御を通じて、タンパク質の他、薬剤などの化合物の製造、疾病の治療や診断、バイオセンサーやバイオイメージング、合成生物学、タンパク質の働きや細胞の活動の網羅的な解析など、幅広い応用が考えられるものとして、産業上非常に有用である。また、本発明に係る核酸は、ウィルスにおいても発現や翻訳が可能であるので、ウィルス研究にも適用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】図１は、原核細胞におけるリボスイッチを模式的に示した図である。
【図２】図２は、真核細胞における人工的なリボスイッチ、即ちアプタマーを用いた人工的なオフスイッチを模式的に示した図である。
【図３】図３は、チャバネアオカメムシ腸管ウィルスのゲノムの模式図である。
【図４】図４は、後述する予備実験（実験例１）で用いた５種の鋳型ｍＲＮＡの構造の模式図である。
【図５】図５は、後述する予備実験（実験例１）におけるルシフェラーゼアッセイの結果を示すグラフである。
【図６】図６は、チャバネアオカメムシ腸管ウィルスのＩＲＥＳの三次元構造を示す図である。
【図７】図７は、ＩＲＥＳの活性に重要な三次元構造を探索した、後述する予備実験（実験例２）におけるルシフェラーゼアッセイの結果を示すグラフである。
【図８】図８は、ＩＲＥＳの活性を抑制するに十分なａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列の相補塩基長を検討した、後述する予備実験（実験例３）におけるルシフェラーゼアッセイの結果を示すグラフである。
【図９】図９は、ａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列のＩＲＥＳ不活性化作用を阻害するに十分なａｎｔｉ−ａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列の相補塩基長を検討した、後述する予備実験（実験例４）におけるルシフェラーゼアッセイの結果を示すグラフである。
【図１０】図１０は、本発明に係るＲＮＡ分子の具体的な一例を示す模式図である。（１）はリガンドが存在しない場合、即ちＩＲＥＳが活性化されておらずＩＲＥＳ依存性翻訳が行われていない場合を示し、（２）はリガンドが存在する場合、即ちＩＲＥＳが活性化されＩＲＥＳ依存性翻訳が開始されている場合を示す。
【図１１】図１１は、本発明に係るＲＮＡ分子において、モジュレータ配列の塩基長を検討した、後述する実施例１におけるルシフェラーゼアッセイの結果を示すグラフである。
【図１２】図１２は、本発明で使用可能なリガンドの例と、それに対応するアプタマーの塩基配列を示す図である。
【図１３】図１３は、様々なリガンドとそのアプタマーを用いた、後述する実施例２におけるルシフェラーゼアッセイの結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
以下、本発明に係るＲＮＡ分子の構造と配列を、５’末端側から説明する。なお、本発明に係るＲＮＡ分子の具体的な一例が図１０に示されている。
【００３４】
（ａ） ５’末端ステムループ
５’末端ステムループは、本発明に係るＲＮＡ分子の５’末端に存在し、その末端配列同士が相補鎖を形成しているステムループ構造を有するものである。その主な役割は、真核細胞での５’末端依存性翻訳、即ち、ｍＲＮＡの５’末端へのリボソームの結合により開始される翻訳を阻害することにある。また、モジュレータ配列とａｎｔｉ−ａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列の一部およびアプタマー配列の一部との相補鎖の形成を安定化するという役割も有する。
【００３５】
５’末端ステムループとしては、上記作用効果を示すものであれば特に制限されないが、その塩基長は少なくとも１０塩基長程度であればよく、好ましくは１０塩基長以上、２００塩基長以下程度、より好ましくは１２塩基長以上、１００塩基長以下程度、さらに好ましくは１５塩基長以上、５０塩基長以下程度である。その両末端配列同士による相補鎖の長さとしては、４塩基長以上、４５塩基長以下程度が好ましく、６塩基長以上、２２塩基長以下程度がより好ましい。ループ部分の長さは、３塩基長以上、１０塩基長以下程度が好ましく、４塩基長以上、５塩基長以下程度がより好ましい。また、Ｔ７ファージのｇ１０ｌｅａｄｅｒ配列の５’末端部など、天然に存在する５’末端ステムループやその人工合成物を利用してもよい。
【００３６】
なお、本発明における相補鎖には、Ａ−ＵおよびＧ−Ｃの組合せのみからなる完全相補鎖のみでなく、その間にそれ以外の組合せが存在していても全体として完全相補鎖と同等の融解温度（Ｔｍ）を示す不完全相補鎖も含まれるものとする。
【００３７】
（ｂ） モジュレータ配列
モジュレータ配列は、リガンドの存在・不存在によるＩＲＥＳ依存性翻訳の制御効率を高めるための配列である。より詳しくは、リガンド不存在時にはａｎｔｉ−ａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列およびアプタマー配列と共にステムループ構造を形成することによりａｎｔｉ−ａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列とａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列との相補鎖の形成を抑制し、ＩＲＥＳ依存性翻訳を抑制する。一方、リガンド存在時には、アプタマーへのリガンドの結合によるアプタマーの三次元構造変化に応じてアプタマー配列から脱離してａｎｔｉ−ａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列とａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列との相補鎖の形成を可能にし、ａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列をＩＲＥＳから脱離させ、ＩＲＥＳ依存性の翻訳を開始できるようにする。
【００３８】
モジュレータ配列は、アプタマー配列の一部と相補的に結合するものであることから、その３’末端部の塩基配列はアプタマー配列の５’末端部と相補的なものとすればよい。
【００３９】
モジュレータ配列は、ａｎｔｉ−ａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列の一部と相補的二重鎖を形成していてもよい。その場合、その５’末端部の塩基配列はａｎｔｉ−ａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列の３’末端部と相補的なものとなる。
【００４０】
モジュレータ配列の塩基長は、上記作用を発揮できるように最適化すればよい。例えば、モジュレータ配列とａｎｔｉ−ａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列との間で相補的二重鎖が形成される場合、当該相補的配列の塩基長は、１以上、５以下とすることが好ましい。モジュレータ配列とａｎｔｉ−ａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列は相補的であり、さらにａｎｔｉ−ａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列とａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列と相補的であることから、モジュレータ配列の一部はａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列と同一となる。よって、上記相補塩基長が過剰に長いと、モジュレータ配列自体がＩＲＥＳに結合し、ＩＲＥＳ配列依存性の翻訳を阻害するおそれがあり得る。しかし上記相補塩基長が５以下であれば、かかる阻害を有効に抑制することができる。
【００４１】
また、モジュレータ配列のアプタマー配列の一部に対する相補塩基長としては、４以上、８以下が好適である。当該相補塩基長が４以上である場合、リガンドが存在しないときにモジュレータ配列がアプタマー配列へより確実に結合し、ＩＲＥＳ依存性の翻訳を有効に抑制できる。一方、当該相補塩基長が８以下である場合には、リガンドの存在によるアプタマーの三次元構造変化に応じてモジュレータ配列がアプタマー配列からより確実に脱離し、ａｎｔｉ−ａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列とａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列との結合を抑制せず、ひいてはＩＲＥＳ依存性の翻訳を促進することができる。即ち、当該相補塩基長が４以上、８以下である場合には、リガンドによるＩＲＥＳ依存性の翻訳のスイッチが非常に有効に働く。
【００４２】
さらに、モジュレータ配列は、モジュレータ配列ステムループ構造のギブズ自由エネルギー（ΔＧ）を計算し、その値が適切なものとなるようにして、非常に簡便にデザインすることが可能である。より詳しくは、先ず、アプタマーについては、後述するようにリガンドを決定すれば、そのリガンドに選択的かつ強固に結合できる塩基配列を常法により決定することができる。また、ａｎｔｉ−ａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列も、ＩＲＥＳの作用を有効に阻害できるａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列を決定すれば、その相補鎖として決定できる。こうして決定されたアプタマー配列の一部とａｎｔｉ−ａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列の一部とステムループ構造を構成できるモジュレータ配列を適当にデザインし、例えば、ＲＮＡ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅなどのコンピュータソフト（Mathews，D．H．ら， Proceedings of the National Academy of Sciences，第１０１号，第７２８７〜７２９２頁（２００４年）参照）によりステムループ構造のギブズ自由エネルギー（ΔＧ）を計算し、その値が好ましくは−１７．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上、−８．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下になるようにすればよい。当該値が−８．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下であれば、リガンドが存在しない場合にモジュレータ配列ステムループ構造を十分安定的に維持でき、ＩＲＥＳ依存性翻訳をより確実に抑制できる。一方、当該値が小さ過ぎるとリガンドが存在していてもモジュレータ配列ステムループ構造が解消されず、ＩＲＥＳ依存性翻訳が開始されないおそれがあり得るので、当該値としては−１７．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上が好ましい。なお、ＲＮＡ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅによるギブズ自由エネルギー（ΔＧ）は、数秒あれば計算可能である。
【００４３】
（ｃ） ａｎｔｉ−ａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列
ａｎｔｉ−ａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列は、リガンドが存在していないときにはモジュレータ配列とモジュレータ配列ステムループを構成する一方で、リガンドが存在しているときにはａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列と相補的二重鎖を形成し、ａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列をＩＲＥＳから脱離させてＩＲＥＳを活性化させる作用を有する。
【００４４】
ａｎｔｉ−ａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列の塩基配列は、モジュレータ配列とステムループを形成するに適する配列とする。例えば、その３’末端部がモジュレータ配列の５’末端部と相補的二重鎖を形成してステムループの幹部分となる場合、両者の塩基配列は、互いに相補的なものとする。また、同時に、リガンド存在時にはａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列と相補的二重鎖を形成するため、ａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列と相補的である必要がある。
【００４５】
ａｎｔｉ−ａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列は、上記作用を十分に発揮できるようデザインすればよいが、好適にはａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列との相補鎖とすることができる。ここで、ａｎｔｉ−ａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列は、ａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列に対する相補塩基長が６以上となるようにすることが好ましい。当該相補塩基長が６以上であれば、リガンドが存在しているときにａｎｔｉ−ａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列がａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列とより確実に相補鎖を形成してａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列の働きを阻害し、ＩＲＥＳ依存性の翻訳を有効に進行せしめることが可能になる。一方、当該相補鎖長が長過ぎると、ａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列との親和性が過剰になり、リガンドが存在しない場合でもａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列によるＩＲＥＳの不活性化作用が十分に発揮されず、ＩＲＥＳ依存性翻訳が開始されるおそれがあり得るので、当該相補鎖長は１５以下が好ましく、１２以下がより好ましい。
【００４６】
（ｄ） アプタマー
アプタマーは、リガンドに対して選択的かつ強固に結合できるものであり、リガンドの存在により三次元構造を変化させてＩＲＥＳを活性化させる作用を有する。より詳しくは、リガンド不存在時にはモジュレータ配列およびａｎｔｉ−ａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列と共にモジュレータ配列ステムループを形成する。一方、リガンド存在時にはリガンドの包接によりその三次元構造が変化し、隣接するａｎｔｉ−ａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列とａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列とを近付けて相補的二重鎖を形成させ、ａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列をＩＲＥＳから脱離させることによりＩＲＥＳを活性化させ、ＩＲＥＳ依存性翻訳を開始させる。
【００４７】
アプタマーの塩基配列は、試験管内人工進化法（ＳＥＬＥＸ（Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment）法ともいわれる。Tuerk，C．ら，Science，第２４０巻，第５０５〜５１０頁（１９９０年）を参照）により、使用するリガンドに応じて最適化することが可能である。この方法は、リガンドに対し、ランダムな塩基配列の多数のオリゴヌクレオチドの混合物であるオリゴヌクレオチドライブラリを作用させ、親和性の高いオリゴヌクレオチドを選出し、選出されたオリゴヌクレオチドを増幅するという作業を繰り返すものである。これによって、リガンドに対して選択的かつ強固に結合するオリゴヌクレオチドを最適化することが可能になる。
【００４８】
（ｅ） ａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列
ａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列は、リガンドの存在・不存在に応じてＩＲＥＳから脱離または結合することにより、ＩＲＥＳを活性化したり或いは不活性化する作用を有するものである。より詳しくは、リガンドが存在しない場合、ａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列はＩＲＥＳの構造中、その重要な部分に結合してＩＲＥＳを不活性化する。一方、リガンドが存在する場合には、ａｎｔｉ−ａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列と相補的二重鎖を形成してＩＲＥＳから脱離するので、ＩＲＥＳは活性化される。
【００４９】
ａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列は、ＩＲＥＳの作用効果の発揮に重要な部分に対する相補鎖としてデザインすることができる。例えば、使用するＩＲＥＳの塩基配列の解析やＸ線結晶構造解析などにより、ループやステムループ、偽結節など、重要な三次元構造を見出す。その上で、ＩＲＥＳに加えて、５’末端ステムループ、ルシフェラーゼなどのレポーター遺伝子およびＩＲＥＳの特定部位に対する相補鎖を有するｍＲＮＡや、当該相補鎖を有さない以外は同様のｍＲＮＡとＩＲＥＳの特定部位に対する相補的なアンチセンスＤＮＡやアンチセンスＲＮＡなどを用いた予備実験で、レポーター遺伝子の発現試験を行い、ＩＲＥＳ依存性翻訳に重要な部分を決定する。ａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列は、このように決定された重要部分に相補的な塩基配列とすればよい。
【００５０】
ａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列のＩＲＥＳに対する相補塩基長としては、６以上が好適である。当該相補塩基長が６以上であれば、リガンドが存在していないときにａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列がＩＲＥＳとより確実に相補鎖を形成し、ＩＲＥＳの働きを阻害してＩＲＥＳ依存性の翻訳を有効に抑制できる。一方、当該相補塩基長が長過ぎると、リガンドが存在していてもａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列がＩＲＥＳから脱離できず、ＩＲＥＳが活性化されないおそれがあり得るので、当該相補塩基長としては、１５以下が好ましく、１２以下がより好ましい。
【００５１】
（ｆ） ＩＲＥＳ
ＩＲＥＳ（内部リボソーム結合サイト）は、主にウィルスのＲＮＡ分子の内部に存在して翻訳の開始に関与するものであり、４０Ｓリボソームや６０Ｓリボソームがここに結合することにより翻訳が開始される。
【００５２】
ＩＲＥＳは、上述したようにその三次元構造を決定し、その作用効果の発揮に重要な部位を特定した上で用いてもよいが、既に塩基配列や三次元構造が明らかにされているものを用いることもできる。そのようなＩＲＥＳとしては、チャバネアオカメムシ腸管ウィルス、コオロギ麻痺病ウィルス、Ｃ型肝炎ウィルス、ポリオウィルスなどのＩＲＥＳを挙げることができる。
【００５３】
なお、本発明者の実験的知見によれば、チャバネアオカメムシ腸管ウィルスのＩＲＥＳにおいては、偽結節ＩＩＩとステムループＶという三次元構造がＩＲＥＳ依存性翻訳にとり非常に重要であるので、ａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列は、これら三次元構造に係る塩基配列と相補的なものとすればよい。
【００５４】
（ｇ） 目的遺伝子
本発明の目的遺伝子は、本発明に係る核酸分子により発現させることを所望する任意のものであればよく、特に制限されない。例えば、生産の望まれる有用なタンパク質をコードする遺伝子；ルシフェラーゼ遺伝子やＧＦＦ遺伝子（診断、バイオセンサー、バイオイメージングなどのため）；その役割やネットワークを明らかにしたいタンパク質をコードする遺伝子（タンパク質の解析などのため）；代謝カスケードの一部を担う遺伝子（合成生物学などのため）などを挙げることができる。
【００５５】
３’末端の配列は、本発明の作用効果を阻害しない限り、特に制限されないし、また、特に設ける必要はない。例えば、目的遺伝子やＩＲＥＳなどに結合し、その発現や作用を阻害するような配列は当然に用いることはできない。一方、エキソヌクレアーゼ対策として、特に問題を起こさない中立的な１００塩基以上の配列を３’末端に設けることも可能である。さらに、ポリＡ配列を導入してもよい。
【００５６】
本発明で用いるリガンドは、本発明に係るＲＮＡ分子において、アプタマーに結合してその三次元構造を変化させ、ＩＲＥＳを活性化させるものであれば特に制限されず、原則として所望のものを用いることができる。例えば、比較的低分子の有機化合物；金属イオンなどの無機化合物；増殖因子、酵素、受容体、膜タンパク質、ウィルスタンパク質などのタンパク質およびその一部などを挙げることができる。
【００５７】
例えば、細胞膜を通じてリガンドを外部から細胞内に取り込ませる場合、水溶性の低分子有機化合物を用いることができる。このようなリガンドとしては、テオフィリン、フラビンモノヌクレオチド、テトラサイクリン、スルホローダミンを挙げることができる。その他、細胞内分子をリガンドとして用いることも可能である。但し、リガンドとしては、細胞毒性を示さないものを用いることが好ましい。
【００５８】
本発明に係るＤＮＡ分子は、上記ＲＮＡ分子をコードするものであり、且つ当該コード領域の上流にプロモータ配列を有することを特徴とする。かかるＤＮＡ分子は、真核細胞自体や真核細胞の抽出物からなる遺伝子発現システムにおいて、所望のリガンドを用いて所望の目的遺伝子を発現させることができる点で有用である。
【００５９】
より詳しくは、本発明に係るＤＮＡ分子を真核細胞にトランスフェクションして発現させ、さらに細胞内にリガンドを導入してＩＲＥＳを活性化させることにより、目的遺伝子を発現せしめることができる。また、遺伝子発現システムを含む真核細胞の抽出物と本発明に係るＤＮＡ分子を混合し、当該ＤＮＡからＲＮＡへの転写とタンパク質への翻訳を促進して、目的遺伝子を発現させることができる。
【００６０】
本発明に係るＤＮＡ分子のプロモータは、使用する真核細胞に応じたものを適宜選択すればよい。例えば、酵母に対してはＧＡＬ、動物に対してはＳＶ４０といったウィルスプロモータを用いることができる。
【００６１】
本発明に係るＤＮＡ分子のトランスフェクション手段は、特に制限されない。一般的には、本発明に係るＤＮＡ分子を、使用する真核細胞に応じたプラスミドベクターやウィルスベクターに組み込んだ上で、真核細胞に導入する。また、本発明に係るＤＮＡ分子の両末端に、使用する真核細胞のＤＮＡの相同配列を設け、相同組換えできる可能性もある。
【００６２】
以上で説明した本発明に係るＲＮＡ分子とＤＮＡ分子は、真核細胞やウィルスへ導入した上で、リガンドを添加することにより、目的遺伝子を発現させることができるし、また、真核細胞の遺伝子発現システムを用い、ｉｎ ｖｉｔｒｏで目的遺伝子を発現させることもできる。即ち、本発明において、真核細胞で目的遺伝子を発現することには、真核細胞自体を用いる態様のみならず、真核細胞の遺伝子発現システムを用いて無細胞的に目的遺伝子を発現させる態様も含むものとする。
【００６３】
真核細胞の抽出物からなる遺伝子発現システムを利用する場合、具体的には、先ず、リボソームなど、ＤＮＡやＲＮＡからタンパク質を合成するための物質を含む真核細胞抽出物を調製する。例えば植物細胞からかかる抽出物は、植物種子を粉砕して胚芽を選別し、胚芽を洗浄してから微粉砕し、メタノールやエタノールなどで抽出することにより得られる。また、かかる抽出物は市販品を用いてもよい。次に、得られた真核細胞抽出物と上記ＤＮＡまたはＲＮＡとを混合し、反応させればよい。その際、アミノ酸などタンパク質合成に必要な基質などを添加してもよいし、ＲＮＡポリメラーゼなど、ＤＮＡからＲＮＡへの転写に必要な物質をさらに添加してもよい。反応温度や反応時間は適宜調整すればよいが、例えば、２０℃以上、４０℃以下程度で、３０分間以上、１０時間以下程度反応させることができる。
【実施例】
【００６４】
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はもとより下記実施例によって制限を受けるものではなく、前・後記の趣旨に適合し得る範囲で適当に変更を加えて実施することも勿論可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に包含される。
【００６５】
実験例１ ＰＳＩＶ ＩＲＥＳの最適化
（１） 鋳型ＤＮＡの調製
チャバネアオカメムシ腸管ウィルス（以下、「ＰＳＩＶ」という）のゲノムＲＮＡ（図３）において、第５９５１〜６２０４塩基であり、非構造タンパク質前駆体をコードする第１ＯＲＦの３’側末端の５３塩基を５’側に、キャプシドタンパク質前駆体をコードする第２ＯＲＦの５’側末端であり、キャプシドタンパク質前駆体のＮ末端の４つのアミノ酸をコードする１２塩基を３’側に、内部リボソーム結合サイト（ＩＲＥＳ）をコードする遺伝子をそれらの間に有するＲＮＡに対応する鋳型ＤＮＡであるｐＰＳＩＶ−ＩＲＥＳ−ＮＣＰ（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ社製の人工合成物）を、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＭＡＸ ＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ社製）を用いたＰＣＲにより増幅した。また、ホタルルシフェラーゼ遺伝子（ｐＥ０１−Ｌｕｃ，以下、「Ｆ−Ｌｕｃ」という）も同様に増幅した。これらＤＮＡをライゲーションし、同様に増幅した。得られたＤＮＡを用い、図６のステムループ構造（以下、「５’−ＳＬ」という）をコードする遺伝子を５’末端に、さらに翻訳を促進するためのＴ７プロモータ配列を有する鋳型ＤＮＡを調製した。
【００６６】
また、上記と同様にして、上記鋳型ＤＮＡにおいて、第１ＯＲＦの３’側末端の５３塩基を含まない、即ち、ＰＳＩＶゲノムの第６００４〜６２０４塩基を含む鋳型ＤＮＡ；並びに、ＩＲＥＳをコードする遺伝子の一部が欠損、即ち、それぞれＰＳＩＶゲノムの第６０１７〜６２０４塩基、第６０７３〜６２０４塩基および第６１０１〜６２０４塩基を含む鋳型ＤＮＡを調製した。
【００６７】
（２） 鋳型ｍＲＮＡの調製
ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ Ｔ７ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用い、上記各鋳型ＤＮＡを転写した鋳型ｍＲＮＡを得た。ＲＮｅａｓｙ ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｃｌｅａｎｕｐ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用い、得られた鋳型ｍＲＮＡを精製し、また、波長２６０ｎｍの光の吸収を利用して鋳型ｍＲＮＡを定量した。
【００６８】
得られた５種の鋳型ｍＲＮＡを、図４に示す。図４中の数字は、ＰＳＩＶゲノムＲＮＡ中の塩基番号を示す。また、ＬとＳＬとＰＫは、翻訳に必要なＩＲＥＳの三次元構造を示し、Ｌはループ（loop）、ＳＬはステムループ（stem-loop）、ＰＫは偽結節（pseudoknot）を示す。また、５’−ＳＬは、配列番号１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）の配列を有し、５’末端のステムループであり、真核細胞における５’末端が介在する翻訳を阻害する役割を有する。Ｎ−ＣＰは、ＰＳＩＶゲノムにおける第６１９３〜６２０４塩基であり、キャプシドタンパク質前駆体をコードする第２ＯＲＦの５’側末端であって、キャプシドタンパク質前駆体のＮ末端の４つのアミノ酸をコードする１２塩基である。当該配列は、ＩＲＥＳが介在する翻訳を促進する役割を有する。Ｆ−Ｌｕｃは、ホタルルシフェラーゼ遺伝子である。
【００６９】
（３） 鋳型ｍＲＮＡの翻訳
ＷＥＰＲＯ１２４０ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｋｉｔ（ＣｅｌｌＦｒｅｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用い、上記で得られた鋳型ｍＲＮＡを無細胞翻訳した。具体的には、上記鋳型ｍＲＮＡ（３ｐｍｏｌ）、小麦胚芽抽出物（ＷＥＰＲＯ１２４０，２μＬ）、クレアチンキナーゼ（終濃度で４０ｎｇ／μＬ）および標準コムギ無細胞タンパク質合成用基質（終濃度で１×）の混合物（１０μＬ）を、２６℃で１時間インキュベートした。
【００７０】
（４） ルシフェラーゼアッセイ
上記（３）の反応混合物を水で１１倍に希釈し、その５μＬをＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製，７５μＬ）と混合した。反応混合液をブラック９６ウェルプレートに入れ、マルチラベルプレートカウンター（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製，Ｗａｌｌａｃ ＡＲＶＯ ＭＸ）を用い、蛍光強度を測定した。以上の翻訳から測定を３回ずつ行い、その平均値を算出した。結果を、２番目の鋳型ｍＲＮＡ（図４の２：ＩＲＥＳ６００４−Ｌｕｃ，以下、「鋳型ｍＲＮＡ２」のように示す）の値を１００％とする相対活性により図５に示す。
【００７１】
図５のとおり、鋳型ｍＲＮＡ２で最も翻訳効率が高かった。鋳型ｍＲＮＡ２は、全ＩＲＥＳを含んでいる一方で、第１ＯＲＦの一部を含んでいない。それに対して、全ＩＲＥＳを含むが第１ＯＲＦの一部を含む鋳型ｍＲＮＡ１では、翻訳効率が低下している。かかる結果は、第１ＯＲＦの一部がＩＲＥＳの三次元構造に影響を与えることによると考えられる。一方、ＩＲＥＳの一部が欠損している鋳型ｍＲＮＡ４〜５では、翻訳活性がほとんど見られなかった。かかる結果からは、本システムにおいては、５’末端が介在する翻訳が５’−ＳＬによりほぼ完全に阻害されていることが分かる。
【００７２】
実験例２ Ａｎｔｉ−ＩＲＥＳによる翻訳の阻害
ｍＲＮＡ発現を制御するためには、リガンドが存在しない場合に翻訳を抑制しなければならない。そのため、ＩＲＥＳ介在性翻訳を効率的に阻害できるＡｎｔｉ−ＩＲＥＳを探索した。
【００７３】
詳しくは、上記実験例１（１）〜（２）と同様の方法により、図６に示す５’末端ステムループ（５’−ＳＬ）とＰＳＩＶ−ＩＲＥＳのＩＲＥＳとの間（Ｘｎ）に、ＩＲＥＳの重要な三次元構造であるループ（Ｌ）、ステムループ（ＳＬ）または偽結節（ＰＫ）の何れかに関与する配列と相補的な以下の配列が挿入されたｍＲＮＡを調製した。
【００７４】
【表１】
【００７５】
得られたｍＲＮＡを用い、上記実験例１（３）〜（４）と同様の方法により、翻訳効率を算出した。結果を、上記実験例１の鋳型ｍＲＮＡ２の値を１００％とする相対活性により図７に示す。
【００７６】
図７のとおり、ＰＫ−ＩＩＩに結合する鋳型ｍＲＮＡ８、ｃＰＫ−ＩＩに結合する鋳型ｍＲＮＡ１１およびＳＬ−Ｖに結合する鋳型ｍＲＮＡ１３の阻害活性が非常に優れており、特に鋳型ｍＲＮＡ８と鋳型ｍＲＮＡ１３が、重要なＩＲＥＳ部分が欠損している鋳型ｍＲＮＡ４と匹敵するほど阻害活性が優れていた。なお、鋳型ｍＲＮＡ８は、ＰＫ−ＩＩＩを構成する配列の一方に結合し、ＩＲＥＳの三次元構造を変化させることにより、ＩＲＥＳ介在性翻訳を阻害すると考えられる。
【００７７】
実験例３ Ａｎｔｉ−ＩＲＥＳの長さの検討
次に、ＩＲＥＳ介在性翻訳を阻害するに十分なａｎｔｉ−ＩＲＥＳの塩基長を調べた。
【００７８】
上記実験例１（１）〜（２）と同様の方法により、以下のとおり、上記実験例２で最も阻害活性に優れていた鋳型ｍＲＮＡ８のａｎｔｉ−ＩＲＥＳの長さを変更した鋳型ｍＲＮＡを調製した。
【００７９】
【表２】
【００８０】
得られたｍＲＮＡを用い、上記実験例１（３）〜（４）と同様の方法により、翻訳効率を算出した。結果を、上記実験例１の鋳型ｍＲＮＡ２の値を１００％とする相対活性により図８に示す。
【００８１】
図８の結果のとおり、ａｎｔｉ−ＩＲＥＳの塩基長が４になると阻害活性が全く無くなった。一方、塩基長が７〜８であればほぼ完全に阻害できることが明らかとなった。
【００８２】
実験例４ Ａｎｔｉ−ＩＲＥＳによる翻訳の阻害の回復
ｍＲＮＡ発現のオン−オフを制御するためには、リガンドにより変化したＩＲＥＳの構造を元に戻し、ＩＲＥＳ介在性翻訳を回復させる必要がある。そこで、ａｎｔｉ−ＩＲＥＳへ相補的に結合してその機能を阻害するａｎｔｉ−ａｎｔｉ−ＩＲＥＳを検討した。
【００８３】
上記実験例１（１）〜（２）と同様の方法により、上記実験例２の鋳型ｍＲＮＡ８において、５’−ＳＬとａｎｔｉ−ＩＲＥＳとの間（Ｙｎ）に、５塩基（ループ）を介して、塩基長の異なる以下のａｎｔｉ−ａｎｔｉ−ＩＲＥＳを有する鋳型ｍＲＮＡを調製した。
【００８４】
【表３】
【００８５】
得られたｍＲＮＡを用い、上記実験例１（３）〜（４）と同様の方法により、翻訳効率を算出した。結果を、上記実験例１の鋳型ｍＲＮＡ２の値を１００％とする相対活性により図９に示す。
【００８６】
図９の結果のとおり、相補塩基長が３〜５では、ａｎｔｉ−ＩＲＥＳにより阻害されたＩＲＥＳ介在性翻訳を回復させることはできなかった。しかし、相補塩基長が７の場合はほぼ５０％までＩＲＥＳ介在性翻訳を回復させることができ、ａｎｔｉ−ＩＲＥＳと同じ塩基長のａｎｔｉ−ａｎｔｉ−ＩＲＥＳを使った場合には、約８０％までＩＲＥＳ介在性翻訳を回復させることができた。このように、ａｎｔｉ−ＩＲＥＳとａｎｔｉ−ａｎｔｉ−ＩＲＥＳとで二本鎖を形成させれば、ＩＲＥＳの構造を元に戻し、ＩＲＥＳ介在性翻訳を回復させることができ得ることが明らかにされた。
【００８７】
実施例１
上記実験例１〜４の結果をもって、リガンドによりｍＲＮＡ発現のオン−オフを制御するシステムとして、以下の戦略を案出した。
・ ５’末端に５’−ＳＬを設け、５’末端介在性翻訳を抑制し、ＩＲＥＳ介在性翻訳を利用する
・ リガンドと強固かつ選択的に結合できるアプタマー配列を、ａｎｔｉ−ＩＲＥＳとａｎｔｉ−ａｎｔｉ−ＩＲＥＳとの間に挿入する
・ モジュレータ配列（ＭＳ）をａｎｔｉ−ａｎｔｉ−ＩＲＥＳの５’側に挿入し、ａｎｔｉ−ＩＲＥＳ／ａｎｔｉ−ａｎｔｉ−ＩＲＥＳの二重鎖の形成を制御する
・ 翻訳効率のオン−オフの比を高めるため、モジュレータ配列を最適化する
上記の戦略に基づく一例を、図１０に示す。
【００８８】
図１０の左図は、リガンドが存在しない場合を示し、モジュレータ配列（ＭＳ）がａｎｔｉ−ａｎｔｉ−ＩＲＥＳの３’末端とアプタマー配列の５’末端と結合してステムループ（ＭＳ−ＳＬ）を形成している。その結果、ａｎｔｉ−ａｎｔｉ−ＩＲＥＳはａｎｔｉ−ＩＲＥＳと結合できないため、ａｎｔｉ−ＩＲＥＳはＩＲＥＳの重要部位と結合し、ＩＲＥＳの三次元構造を変化させる。よって、５’末端介在性翻訳は５’−ＳＬにより阻害されている上に、ＩＲＥＳ介在性翻訳も抑制されるため、ｍＲＮＡは翻訳されない。
【００８９】
一方、アプタマーへ強固かつ選択的に結合するリガンドが存在する場合（図１０の右図）、アプタマーへのリガンドの結合によりモジュレータ配列（ＭＳ）がアプタマーとａｎｔｉ−ａｎｔｉ−ＩＲＥＳから遊離し、ａｎｔｉ−ａｎｔｉ−ＩＲＥＳとａｎｔｉ−ＩＲＥＳとの二重鎖形成が可能となり、その結果、ＩＲＥＳの三次元構造が回復し、ＩＲＥＳ介在性翻訳が進行する。
【００９０】
上記の戦略を実現化すべく、上記実験例４の鋳型ｍＲＮＡ ａａ８を基にして、テオフィリンをリガンドとすることができるｍＲＮＡをデザインし、上記実験例１（１）〜（２）と同様の方法で合成した。具体的には、鋳型ｍＲＮＡ ａａ８において、ａｎｔｉ−ａｎｔｉ−ＩＲＥＳとａｎｔｉ−ＩＲＥＳとの間にテオフィリンアプタマー配列を挿入し、また、ａｎｔｉ−ａｎｔｉ−ＩＲＥＳと５’−ＳＬとの間にモジュレータ配列（ＭＳ）を挿入した。
【００９１】
この際、モジュレータ配列（ＭＳ）において、ａｎｔｉ−ａｎｔｉ−ＩＲＥＳと結合する部分は、５’−ＡＧＡＣ−３’という４塩基に固定し、アプタマー配列と結合する部分を検討した。ａｎｔｉ−ａｎｔｉ−ＩＲＥＳと結合する部分を４塩基に固定した理由は、モジュレータ配列（ＭＳ）の３’側は必然的にａｎｔｉ−ＩＲＥＳの５’側と同じにならざるを得ないので、モジュレータ配列（ＭＳ）自体がＩＲＥＳと結合して翻訳が阻害されるおそれがあるが、上記実験例３の鋳型ｍＲＮＡ８−４と８−ｒ４のとおり、４塩基長であれば、モジュレータ配列（ＭＳ）がＩＲＥＳに結合して無条件に翻訳が阻害されることはないからである。
【００９２】
また、モジュレータ配列（ＭＳ）のうちアプタマー配列と結合する部分（Ｚｎ）は、以下のとおり２〜８塩基長、モジュレータ配列（ＭＳ）全体としては６〜１２塩基長のものをデザインした。
【００９３】
【表４】
【００９４】
上記ｍＲＮＡを用い、１ｍＭテオフィリンが存在する場合と存在しない場合において、上記実験例１（３）〜（４）と同様の方法により、翻訳効率を算出した。結果を、上記実験例１の鋳型ｍＲＮＡ２の値を１００％とする相対活性により図１１に示す。
【００９５】
図１１の結果のとおり、モジュレータ配列（ＭＳ）のうちアプタマー配列に結合する部分が５塩基長以上、全体で９塩基長以上であれば、リガンドであるテオフィリンが存在しない場合における翻訳が十分に抑制されていた。このことは、モジュレータ配列（ＭＳ）がａｎｔｉ−ａｎｔｉ−ＩＲＥＳとアプタマー配列に結合していることから、ａｎｔｉ−ＩＲＥＳがＩＲＥＳと結合してその三次元構造を変化させていることによると考えられる。一方、モジュレータ配列（ＭＳ）のうちアプタマー配列に結合する部分が８塩基長、全体で１２塩基長の場合、テオリフィンが存在していても翻訳が十分に進行しなかった。その理由は、テオリフィンが存在していてもモジュレータ配列（ＭＳ）がａｎｔｉ−ａｎｔｉ−ＩＲＥＳとアプタマー配列から離れず、ａｎｔｉ−ＩＲＥＳもＩＲＥＳから離れられないことによると考えられる。
【００９６】
それに対して、モジュレータ配列（ＭＳ）のうちアプタマー配列に結合する部分が５〜７塩基長、全体で９〜１１塩基長の場合、テオフィリンが存在していない場合に対する存在している場合の比（ＯＮ／ＯＦＦ比）が約８倍から１０倍までと非常に高いものとなっている。このように本発明によれば、リガンドにより遺伝子の発現を制御できることが証明された。また、本実施例では無細胞の真核細胞遺伝子発現システムを用いたが、かかる態様で良好な結果が得られたことにより、真核細胞自体を用いた形質転換技術でも同様の結果が得られると考えられる。
【００９７】
また、各ｍＲＮＡにおいて、ｍＲＮＡ発現のオン−オフ制御に最も重要であるモジュレータ配列ステムループ（ＭＳ−ＳＬ）のギブズ自由エネルギー（ΔＧ）を、ＲＮＡの構造から計算した。結果を図１１に示す。
【００９８】
図１１の結果のとおり、ギブズ自由エネルギー（ΔＧ）が大き過ぎるとおそらくモジュレータ配列ステムループが不安定となり、リガンドが存在しない場合でもＩＲＥＳ依存性翻訳が開始されてしまう一方で、小さ過ぎるとモジュレータ配列ステムループが過剰に安定化し、リガンドが存在してもＩＲＥＳ依存性翻訳が開始されない場合があることが分かった。
【００９９】
実施例２
上記実施例１の結果に基づき、リガンドとしてテオフィリンを用いるシステムを他のリガンドとアプタマー配列との組合せに適用するため、ｍＲＮＡをデザインした。
【０１００】
具体的には、図１２のテオリフィン−アプタマーの他、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）−アプタマー、テトラサイクリン（ｔｃ）−アプタマー、スルホローダミンＢ−アプタマーの組合せを用いたｍＲＮＡにおいて、モジュレータ配列ステムループ（ＭＳ−ＳＬ）のギブズ自由エネルギー（ΔＧ）が、上記実施例１で最もＯＮ／ＯＦＦ比が高かったｍＲＮＡであるｔｈｅｏ５の−１１．７ｋｃａｌ／ｍｏｌに近くなるように、モジュレータ配列（ＭＳ）をデザインし、上記実施例１（１）〜（２）の方法と同様にして調製した。但し、テトラサイクリンなどの濃度が高過ぎるとＩＲＥＳ介在性翻訳が阻害されるおそれがあり得るため、テオフィリンの濃度のみ１ｍＭとし、他の濃度は０．３ｍＭとした。各ｍＲＮＡにおけるモジュレータ配列（ＭＳ）とギブズ自由エネルギー（ΔＧ）を以下に示す。
【０１０１】
【表５】
【０１０２】
上記ｍＲＮＡを用い、各リガンドが存在する場合と存在しない場合において、上記実験例１（３）〜（４）と同様の方法により、翻訳効率を算出した。結果を、上記実験例１の鋳型ｍＲＮＡ２の値を１００％とする相対活性により図１３に示す。
【０１０３】
図１３の結果のとおり、各リガンドを用いない場合の翻訳効率は、ｍＲＮＡ ｔｈｅｏ５と同等に低い一方で、各リガンドを用いた場合の翻訳効率は向上した。特にリガンドとしてテトラサイクリンを用いた場合のＯＮ／ＯＦＦ比は飛び抜けて高く、約３０にも達した。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、真核細胞において目的遺伝子の発現を制御するための方法と、当該方法で用いるＲＮＡ分子とＤＮＡ分子に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
細胞は様々な遺伝子発現の調節機構を有しており、例えば、特定の酵素が必要となった際にそれをコードする遺伝子の発現を開始したり、また、特定の遺伝子が過剰に発現したりしないようにしている。
【０００３】
このような機構としては、大腸菌のラクトースオペロンが有名である。ラクトースオペロンでは、グルコースが存在せず且つラクトースが存在するときに、ラクトース分解酵素であるβ−ガラクトシダーゼが産生されるように制御されている。
【０００４】
このラクトースオペロンを利用すれば、原核細胞において、ＩＰＴＧなどのラクトース類縁体による遺伝子発現の促進が可能である。しかし、遺伝子発現の促進に用いられる化合物はラクトース類縁体に限定され、所望の分子により遺伝子発現を制御することはできない。また、真核細胞でこのラクトースオペロンを用いることはできない。
【０００５】
真核細胞で機能する分子応答性の遺伝子発現制御機構も、ごくわずかではあるが見出されている。しかし、やはり発現制御に使用できる化合物が限られる。
【０００６】
その他にも、代謝産物などの特定分子により遺伝子の発現を制御する機構が原核生物で見出されている。詳しくは、図１のとおり、この機構においては、タンパク質をコードする遺伝子の上流にリボソーム結合部位（ＲＢＳ）が存在し、さらにその上流には代謝産物などの結合部位（アプタマー）が存在する。通常は、リボソーム結合部位にリボソームが結合し、その下流の遺伝子が翻訳されるが、代謝産物などがアプタマーに結合するとリボソーム結合部位の構造が変化してリボソームが結合できなくなり、結果として翻訳が阻害される。このようにして、原核細胞の中には、特定遺伝子の過剰発現が抑制されているものがある。このような機構は、リボ核酸（ＲＮＡ）がそれ自体で遺伝子発現を制御していることから、リボスイッチと呼ばれている。
【０００７】
所望の分子に結合するアプタマー自体は、試験管内人工進化法で獲得することが可能であるため、アプタマーを用いた人工リボスイッチシステムの構築方法が確立できれば、所望の分子により遺伝子発現を制御でき得る。また、天然から見出されているリボスイッチは、通常、上述したような遺伝子発現を抑制するタイプのものであるが、産業上より有用な促進タイプのリボスイッチの構築も可能であり得る。実際、原核細胞で働く人工リボスイッチシステムがいくつか報告されている。
【０００８】
ところが、上記の原核細胞のリボスイッチを真核細胞に応用することはできない。真核細胞では、原核細胞と異なり、ｍＲＮＡ内部のリボソーム結合部位へのリボソームの結合の可否により翻訳が制御されているのではなく、リボソームはｍＲＮＡの５’末端に結合し、翻訳が開始されることによる。
【０００９】
しかし、真核生物でも所望の分子によりｍＲＮＡの翻訳を制御する技術が開発されている。
【００１０】
例えば、特許文献１と非特許文献１〜２には、図２のとおり、特定化合物へ選択的に結合するアプタマーをｍＲＮＡの５’非翻訳領域やスプライシングサイトに挿入し、特定分子のアプタマーへの結合によりリボソームによるスキャニングやスプライソソームによるスプライシングを阻害し、結果として翻訳を阻害するシステムが開示されている。しかし、かかるシステムでは翻訳を阻害することはできても、特定分子を用いて翻訳を促進することはできない。
【００１１】
また、特許文献２と非特許文献３〜４には、特定の分子により切断活性が抑制される核酸（リボザイム）や特定の分子により切断活性が付与される核酸（アプタザイム）をｍＲＮＡに挿入したシステムが開示されている。本発明者らは、同様のシステムを応用し、特定の分子を検出するためのシステムを開発している（特許文献３）。ところが、かかるシステムは複雑で設計自体が困難であり、また、核酸の切断を伴うために一方向の制御しかできない上に、システムの応答性は核酸酵素の活性に大きく依存するという欠点を有する。
【００１２】
さらに、特許文献４〜５と非特許文献５〜７には、ｍＲＮＡとは異なるＲＮＡに分子応答性を付与し、アンチセンス効果やＲＮＡｉ効果により翻訳を制御するシステムが記載されている。しかし当該システムでは、ｍＲＮＡとは異なるＲＮＡが必要であるため、二種のＲＮＡの転写量や転写場所の調整が必要である。また、複数のＲＮＡを用いると、他の遺伝子に悪影響を及ぼす可能性が増大するという問題が生じる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００２／０００６６６１号明細書
【特許文献２】国際公開第００／２４９１２号パンフレット
【特許文献３】特開２００８−２２０１９１号公報
【特許文献４】米国特許出願公開第２００６／００８８８６４号明細書
【特許文献５】米国特許出願公開第２００９／０１４３３２７号明細書
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Geoffrey Werstuckら，サイエンス（SCIENCE），第２８２号，第２９６〜２９８頁（１９９８年）
【非特許文献２】Dong-Suk Kimら，ＲＮＡ，第１１号，第１６６７〜１６７７頁（２００５年）
【非特許文献３】Leising Yenら，ネイチャー（Nature），第４３１号，第４７１〜４７６頁（２００４年）
【非特許文献４】Maung Nyan Winら，プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proceedings of the National Academy of Sciences），第１０４号，第３６号，第１４２８３〜１４２８８頁（２００７年）
【非特許文献５】Travis S Bayerら，ネイチャー・バイオテクノロジー（Nature Biotechnology），第２３号，第３号，第３３７〜３４３頁（２００５年）
【非特許文献６】Chase L Beiselら，モレキュラー・システムズ・バイオロジー（Molecular Systems Biology），第４号，第１〜１４頁（２００８年）
【非特許文献７】Deepak Kumarら，ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティ（Journal of the American Chemical Society），第１３１号，第１３９０６〜１３９０７頁（２００９年）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
上述したように、従来、真核細胞において導入遺伝子の発現や翻訳を制御するためのシステムは既に開発されている。しかしながら、ｍＲＮＡ以外のＲＮＡやＲＮＡ酵素を用いることなく、導入遺伝子の発現を所望の分子により簡便に制御できる技術は無かった。
【００１６】
そこで、本発明が解決すべき課題は、ｍＲＮＡ以外のＲＮＡやＲＮＡ酵素を用いることなく、導入遺伝子の発現を所望の分子により簡便に制御するためのＲＮＡ分子を提供することにある。また、本発明は、当該ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ分子と、当該ＤＮＡ分子を用いて目的遺伝子を真核細胞において発現するための方法を提供することも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた。その結果、内部リボソーム結合サイト配列を有するウィルスｍＲＮＡを利用し、特に、その５’末端に５’末端ステムループを導入して真核細胞で主要な５’末端依存性の翻訳を抑制し、且つ適切なモジュレータ配列とアプタマー配列を導入することによりリガンドの存在・不存在時における内部リボソーム結合サイトの三次元構造の変化を制御すれば、リガンドの存在・不存在に応じて目的遺伝子の発現を明確に制御できることを見出して、本発明を完成した。
【００１８】
本発明に係るＲＮＡ分子は、リガンドにより目的遺伝子の発現を制御できるＲＮＡ分子であって、５’側から以下の構造および配列を有することを特徴とする。
【００１９】
（ａ） ５’末端依存性翻訳を阻害する５’末端ステムループ；
（ｂ） リガンド不存在時に、下記アプタマー配列の一部と相補的に結合してモジュレータ配列ステムループを形成するモジュレータ配列；
（ｃ） リガンド不存在時には、モジュレータ配列および下記アプタマー配列の一部と共にステムループを形成し、リガンド存在時には下記ａｎｔｉ−内部リボソーム結合サイト配列（以下、内部リボソーム結合サイトを「ＩＲＥＳ」（Internal Ribosome Entry Site）と略記する）と相補的二重鎖を形成するａｎｔｉ−ａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列；
（ｄ） リガンドとの結合能を有するアプタマー配列；
（ｅ） リガンド不存在時にはＩＲＥＳの一部と相補的二重鎖を形成してＩＲＥＳへのリボソームの結合を阻害し、リガンド存在時にはａｎｔｉ−ａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列と相補的二重鎖を形成するａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列；
（ｆ） ＩＲＥＳ；および
（ｇ） 目的遺伝子
【００２０】
上記ＩＲＥＳに対するａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列の相補塩基長としては、６以上、１２以下が好適である。当該相補塩基長が６以上であれば、リガンドが存在していないときにａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列がＩＲＥＳとより確実に相補鎖を形成し、ＩＲＥＳの働きを阻害してＩＲＥＳ依存性の翻訳を有効に抑制できる。また、当該相補塩基長が１２以下であれば、リガンドの存在によりａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列がより確実にＩＲＥＳから脱離し、ＩＲＥＳ依存性翻訳を開始せしめることが十分に可能になる。
【００２１】
上記ａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列に対するａｎｔｉ−ａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列の相補塩基長としては、６以上、１２以下が好適である。当該相補塩基長が６以上であれば、リガンドが存在しているときにａｎｔｉ−ａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列がａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列とより確実に相補鎖を形成してａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列の働きを阻害し、ＩＲＥＳ依存性の翻訳を有効に進行せしめることが可能になる。また、当該相補塩基長が１２以下であれば、リガンドの不存在時にａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列がａｎｔｉ−ａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列から脱離し、より確実にＩＲＥＳに結合して不活性化することが可能になる。
【００２２】
上記モジュレータ配列がアプタマー配列の一部のみならず、ａｎｔｉ−ａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列の一部とも相補的二重鎖を形成する場合、その相補塩基長としては、５以下が好適である。モジュレータ配列のａｎｔｉ−ａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列の一部に結合する部分の塩基配列は、ａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列の一部と同一にならざるを得ない。よって、上記相補塩基長が過剰に長いと、モジュレータ配列自体がＩＲＥＳに結合し、ＩＲＥＳ配列依存性の翻訳を阻害するおそれがあり得る。しかし上記相補塩基長が５以下であれば、かかる阻害を有効に抑制することができる。
【００２３】
上記アプタマー配列の一部に対するモジュレータ配列の相補塩基長としては、４以上、８以下が好適である。当該相補塩基長が４以上である場合、リガンドが存在しないときにモジュレータ配列がアプタマー配列へより確実に結合し、ＩＲＥＳ依存性の翻訳を有効に抑制できる。一方、当該相補塩基長が８以下である場合には、リガンドの存在によるアプタマーの三次元構造変化に応じてモジュレータ配列がアプタマー配列からより確実に脱離し、ａｎｔｉ−ａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列とａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列との結合を抑制せず、ひいてはＩＲＥＳ依存性の翻訳を促進することができる。即ち、当該相補塩基長が４以上、８以下である場合には、リガンドによるＩＲＥＳ依存性の翻訳のオン−オフスイッチが非常に有効に働く。
【００２４】
但し、アプタマー配列の一部とモジュレータ配列との好適な相補塩基長は、アプタマーの配列にも依存する。よって、同様の好適な態様は、モジュレータ配列ステムループ構造の安定性によって定めることが好ましい。かかる基準として、モジュレータ配列ステムループ構造のギブズ自由エネルギー（ΔＧ）が−１７．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上、−８．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下である場合が好適である。上記で述べた理由と同様に、リガンドの存在・不存在によるモジュレータ配列ステムループ構造、即ちモジュレータ配列とａｎｔｉ−ａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列の一部およびアプタマー配列の一部との結合と脱離が明確となり、リガンドによるＩＲＥＳ依存性の翻訳のスイッチが非常に有効に働く。
【００２５】
上記ＩＲＥＳとしては、チャバネアオカメムシ腸管ウィルスのものが好適であり、また、ａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列としては、チャバネアオカメムシ腸管ウィルスのＩＲＥＳの三次元構造における偽結節ＩＩＩまたはステムループＶに結合可能なものが好適である。これらＩＲＥＳとａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列の優れた効果は、後述する実験により実証されている。
【００２６】
本発明に係るＤＮＡ分子は、上記ＲＮＡ分子をコードするものであり、且つ当該コード領域の上流にプロモータ配列を有することを特徴とする。
【００２７】
本発明に係る目的遺伝子の真核細胞における発現を制御するための第一の方法は、上記ＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子を真核細胞の抽出物と混合し、反応させる工程を含むことを特徴とする。
【００２８】
また、本発明に係る目的遺伝子の真核細胞における発現を制御するための第二の方法は、上記ＤＮＡ分子を真核細胞にトランスフェクションする工程；および、真核細胞にリガンドを導入することにより、内部リボソーム結合サイトを活性化する工程を含むことを特徴とする。
【００２９】
上記ＲＮＡ分子、ＤＮＡ分子と遺伝子発現の制御方法は、真核細胞またはその抽出物を用い、リガンドの存在・不存在に応じて目的遺伝子の発現を明確に制御できる点で非常に有用である。
【発明の効果】
【００３０】
本発明によれば、従来、真核細胞における導入遺伝子発現の制御は複雑なシステムなどを用いない限りオフ制御しかできなかったのに対して、ウィルスのＩＲＥＳ（内部リボソーム結合サイト）を用いた簡便なシステムにより、導入遺伝子の発現をオン制御することができる。
【００３１】
よって本発明は、リガンドを用いた導入遺伝子発現の制御を通じて、タンパク質の他、薬剤などの化合物の製造、疾病の治療や診断、バイオセンサーやバイオイメージング、合成生物学、タンパク質の働きや細胞の活動の網羅的な解析など、幅広い応用が考えられるものとして、産業上非常に有用である。また、本発明に係る核酸は、ウィルスにおいても発現や翻訳が可能であるので、ウィルス研究にも適用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】図１は、原核細胞におけるリボスイッチを模式的に示した図である。
【図２】図２は、真核細胞における人工的なリボスイッチ、即ちアプタマーを用いた人工的なオフスイッチを模式的に示した図である。
【図３】図３は、チャバネアオカメムシ腸管ウィルスのゲノムの模式図である。
【図４】図４は、後述する予備実験（実験例１）で用いた５種の鋳型ｍＲＮＡの構造の模式図である。
【図５】図５は、後述する予備実験（実験例１）におけるルシフェラーゼアッセイの結果を示すグラフである。
【図６】図６は、チャバネアオカメムシ腸管ウィルスのＩＲＥＳの三次元構造を示す図である。
【図７】図７は、ＩＲＥＳの活性に重要な三次元構造を探索した、後述する予備実験（実験例２）におけるルシフェラーゼアッセイの結果を示すグラフである。
【図８】図８は、ＩＲＥＳの活性を抑制するに十分なａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列の相補塩基長を検討した、後述する予備実験（実験例３）におけるルシフェラーゼアッセイの結果を示すグラフである。
【図９】図９は、ａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列のＩＲＥＳ不活性化作用を阻害するに十分なａｎｔｉ−ａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列の相補塩基長を検討した、後述する予備実験（実験例４）におけるルシフェラーゼアッセイの結果を示すグラフである。
【図１０】図１０は、本発明に係るＲＮＡ分子の具体的な一例を示す模式図である。（１）はリガンドが存在しない場合、即ちＩＲＥＳが活性化されておらずＩＲＥＳ依存性翻訳が行われていない場合を示し、（２）はリガンドが存在する場合、即ちＩＲＥＳが活性化されＩＲＥＳ依存性翻訳が開始されている場合を示す。
【図１１】図１１は、本発明に係るＲＮＡ分子において、モジュレータ配列の塩基長を検討した、後述する実施例１におけるルシフェラーゼアッセイの結果を示すグラフである。
【図１２】図１２は、本発明で使用可能なリガンドの例と、それに対応するアプタマーの塩基配列を示す図である。
【図１３】図１３は、様々なリガンドとそのアプタマーを用いた、後述する実施例２におけるルシフェラーゼアッセイの結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
以下、本発明に係るＲＮＡ分子の構造と配列を、５’末端側から説明する。なお、本発明に係るＲＮＡ分子の具体的な一例が図１０に示されている。
【００３４】
（ａ） ５’末端ステムループ
５’末端ステムループは、本発明に係るＲＮＡ分子の５’末端に存在し、その末端配列同士が相補鎖を形成しているステムループ構造を有するものである。その主な役割は、真核細胞での５’末端依存性翻訳、即ち、ｍＲＮＡの５’末端へのリボソームの結合により開始される翻訳を阻害することにある。また、モジュレータ配列とａｎｔｉ−ａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列の一部およびアプタマー配列の一部との相補鎖の形成を安定化するという役割も有する。
【００３５】
５’末端ステムループとしては、上記作用効果を示すものであれば特に制限されないが、その塩基長は少なくとも１０塩基長程度であればよく、好ましくは１０塩基長以上、２００塩基長以下程度、より好ましくは１２塩基長以上、１００塩基長以下程度、さらに好ましくは１５塩基長以上、５０塩基長以下程度である。その両末端配列同士による相補鎖の長さとしては、４塩基長以上、４５塩基長以下程度が好ましく、６塩基長以上、２２塩基長以下程度がより好ましい。ループ部分の長さは、３塩基長以上、１０塩基長以下程度が好ましく、４塩基長以上、５塩基長以下程度がより好ましい。また、Ｔ７ファージのｇ１０ｌｅａｄｅｒ配列の５’末端部など、天然に存在する５’末端ステムループやその人工合成物を利用してもよい。
【００３６】
なお、本発明における相補鎖には、Ａ−ＵおよびＧ−Ｃの組合せのみからなる完全相補鎖のみでなく、その間にそれ以外の組合せが存在していても全体として完全相補鎖と同等の融解温度（Ｔｍ）を示す不完全相補鎖も含まれるものとする。
【００３７】
（ｂ） モジュレータ配列
モジュレータ配列は、リガンドの存在・不存在によるＩＲＥＳ依存性翻訳の制御効率を高めるための配列である。より詳しくは、リガンド不存在時にはａｎｔｉ−ａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列およびアプタマー配列と共にステムループ構造を形成することによりａｎｔｉ−ａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列とａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列との相補鎖の形成を抑制し、ＩＲＥＳ依存性翻訳を抑制する。一方、リガンド存在時には、アプタマーへのリガンドの結合によるアプタマーの三次元構造変化に応じてアプタマー配列から脱離してａｎｔｉ−ａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列とａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列との相補鎖の形成を可能にし、ａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列をＩＲＥＳから脱離させ、ＩＲＥＳ依存性の翻訳を開始できるようにする。
【００３８】
モジュレータ配列は、アプタマー配列の一部と相補的に結合するものであることから、その３’末端部の塩基配列はアプタマー配列の５’末端部と相補的なものとすればよい。
【００３９】
モジュレータ配列は、ａｎｔｉ−ａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列の一部と相補的二重鎖を形成していてもよい。その場合、その５’末端部の塩基配列はａｎｔｉ−ａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列の３’末端部と相補的なものとなる。
【００４０】
モジュレータ配列の塩基長は、上記作用を発揮できるように最適化すればよい。例えば、モジュレータ配列とａｎｔｉ−ａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列との間で相補的二重鎖が形成される場合、当該相補的配列の塩基長は、１以上、５以下とすることが好ましい。モジュレータ配列とａｎｔｉ−ａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列は相補的であり、さらにａｎｔｉ−ａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列とａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列と相補的であることから、モジュレータ配列の一部はａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列と同一となる。よって、上記相補塩基長が過剰に長いと、モジュレータ配列自体がＩＲＥＳに結合し、ＩＲＥＳ配列依存性の翻訳を阻害するおそれがあり得る。しかし上記相補塩基長が５以下であれば、かかる阻害を有効に抑制することができる。
【００４１】
また、モジュレータ配列のアプタマー配列の一部に対する相補塩基長としては、４以上、８以下が好適である。当該相補塩基長が４以上である場合、リガンドが存在しないときにモジュレータ配列がアプタマー配列へより確実に結合し、ＩＲＥＳ依存性の翻訳を有効に抑制できる。一方、当該相補塩基長が８以下である場合には、リガンドの存在によるアプタマーの三次元構造変化に応じてモジュレータ配列がアプタマー配列からより確実に脱離し、ａｎｔｉ−ａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列とａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列との結合を抑制せず、ひいてはＩＲＥＳ依存性の翻訳を促進することができる。即ち、当該相補塩基長が４以上、８以下である場合には、リガンドによるＩＲＥＳ依存性の翻訳のスイッチが非常に有効に働く。
【００４２】
さらに、モジュレータ配列は、モジュレータ配列ステムループ構造のギブズ自由エネルギー（ΔＧ）を計算し、その値が適切なものとなるようにして、非常に簡便にデザインすることが可能である。より詳しくは、先ず、アプタマーについては、後述するようにリガンドを決定すれば、そのリガンドに選択的かつ強固に結合できる塩基配列を常法により決定することができる。また、ａｎｔｉ−ａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列も、ＩＲＥＳの作用を有効に阻害できるａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列を決定すれば、その相補鎖として決定できる。こうして決定されたアプタマー配列の一部とａｎｔｉ−ａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列の一部とステムループ構造を構成できるモジュレータ配列を適当にデザインし、例えば、ＲＮＡ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅなどのコンピュータソフト（Mathews，D．H．ら， Proceedings of the National Academy of Sciences，第１０１号，第７２８７〜７２９２頁（２００４年）参照）によりステムループ構造のギブズ自由エネルギー（ΔＧ）を計算し、その値が好ましくは−１７．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上、−８．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下になるようにすればよい。当該値が−８．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下であれば、リガンドが存在しない場合にモジュレータ配列ステムループ構造を十分安定的に維持でき、ＩＲＥＳ依存性翻訳をより確実に抑制できる。一方、当該値が小さ過ぎるとリガンドが存在していてもモジュレータ配列ステムループ構造が解消されず、ＩＲＥＳ依存性翻訳が開始されないおそれがあり得るので、当該値としては−１７．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上が好ましい。なお、ＲＮＡ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅによるギブズ自由エネルギー（ΔＧ）は、数秒あれば計算可能である。
【００４３】
（ｃ） ａｎｔｉ−ａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列
ａｎｔｉ−ａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列は、リガンドが存在していないときにはモジュレータ配列とモジュレータ配列ステムループを構成する一方で、リガンドが存在しているときにはａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列と相補的二重鎖を形成し、ａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列をＩＲＥＳから脱離させてＩＲＥＳを活性化させる作用を有する。
【００４４】
ａｎｔｉ−ａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列の塩基配列は、モジュレータ配列とステムループを形成するに適する配列とする。例えば、その３’末端部がモジュレータ配列の５’末端部と相補的二重鎖を形成してステムループの幹部分となる場合、両者の塩基配列は、互いに相補的なものとする。また、同時に、リガンド存在時にはａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列と相補的二重鎖を形成するため、ａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列と相補的である必要がある。
【００４５】
ａｎｔｉ−ａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列は、上記作用を十分に発揮できるようデザインすればよいが、好適にはａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列との相補鎖とすることができる。ここで、ａｎｔｉ−ａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列は、ａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列に対する相補塩基長が６以上となるようにすることが好ましい。当該相補塩基長が６以上であれば、リガンドが存在しているときにａｎｔｉ−ａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列がａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列とより確実に相補鎖を形成してａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列の働きを阻害し、ＩＲＥＳ依存性の翻訳を有効に進行せしめることが可能になる。一方、当該相補鎖長が長過ぎると、ａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列との親和性が過剰になり、リガンドが存在しない場合でもａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列によるＩＲＥＳの不活性化作用が十分に発揮されず、ＩＲＥＳ依存性翻訳が開始されるおそれがあり得るので、当該相補鎖長は１５以下が好ましく、１２以下がより好ましい。
【００４６】
（ｄ） アプタマー
アプタマーは、リガンドに対して選択的かつ強固に結合できるものであり、リガンドの存在により三次元構造を変化させてＩＲＥＳを活性化させる作用を有する。より詳しくは、リガンド不存在時にはモジュレータ配列およびａｎｔｉ−ａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列と共にモジュレータ配列ステムループを形成する。一方、リガンド存在時にはリガンドの包接によりその三次元構造が変化し、隣接するａｎｔｉ−ａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列とａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列とを近付けて相補的二重鎖を形成させ、ａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列をＩＲＥＳから脱離させることによりＩＲＥＳを活性化させ、ＩＲＥＳ依存性翻訳を開始させる。
【００４７】
アプタマーの塩基配列は、試験管内人工進化法（ＳＥＬＥＸ（Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment）法ともいわれる。Tuerk，C．ら，Science，第２４０巻，第５０５〜５１０頁（１９９０年）を参照）により、使用するリガンドに応じて最適化することが可能である。この方法は、リガンドに対し、ランダムな塩基配列の多数のオリゴヌクレオチドの混合物であるオリゴヌクレオチドライブラリを作用させ、親和性の高いオリゴヌクレオチドを選出し、選出されたオリゴヌクレオチドを増幅するという作業を繰り返すものである。これによって、リガンドに対して選択的かつ強固に結合するオリゴヌクレオチドを最適化することが可能になる。
【００４８】
（ｅ） ａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列
ａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列は、リガンドの存在・不存在に応じてＩＲＥＳから脱離または結合することにより、ＩＲＥＳを活性化したり或いは不活性化する作用を有するものである。より詳しくは、リガンドが存在しない場合、ａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列はＩＲＥＳの構造中、その重要な部分に結合してＩＲＥＳを不活性化する。一方、リガンドが存在する場合には、ａｎｔｉ−ａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列と相補的二重鎖を形成してＩＲＥＳから脱離するので、ＩＲＥＳは活性化される。
【００４９】
ａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列は、ＩＲＥＳの作用効果の発揮に重要な部分に対する相補鎖としてデザインすることができる。例えば、使用するＩＲＥＳの塩基配列の解析やＸ線結晶構造解析などにより、ループやステムループ、偽結節など、重要な三次元構造を見出す。その上で、ＩＲＥＳに加えて、５’末端ステムループ、ルシフェラーゼなどのレポーター遺伝子およびＩＲＥＳの特定部位に対する相補鎖を有するｍＲＮＡや、当該相補鎖を有さない以外は同様のｍＲＮＡとＩＲＥＳの特定部位に対する相補的なアンチセンスＤＮＡやアンチセンスＲＮＡなどを用いた予備実験で、レポーター遺伝子の発現試験を行い、ＩＲＥＳ依存性翻訳に重要な部分を決定する。ａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列は、このように決定された重要部分に相補的な塩基配列とすればよい。
【００５０】
ａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列のＩＲＥＳに対する相補塩基長としては、６以上が好適である。当該相補塩基長が６以上であれば、リガンドが存在していないときにａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列がＩＲＥＳとより確実に相補鎖を形成し、ＩＲＥＳの働きを阻害してＩＲＥＳ依存性の翻訳を有効に抑制できる。一方、当該相補塩基長が長過ぎると、リガンドが存在していてもａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列がＩＲＥＳから脱離できず、ＩＲＥＳが活性化されないおそれがあり得るので、当該相補塩基長としては、１５以下が好ましく、１２以下がより好ましい。
【００５１】
（ｆ） ＩＲＥＳ
ＩＲＥＳ（内部リボソーム結合サイト）は、主にウィルスのＲＮＡ分子の内部に存在して翻訳の開始に関与するものであり、４０Ｓリボソームや６０Ｓリボソームがここに結合することにより翻訳が開始される。
【００５２】
ＩＲＥＳは、上述したようにその三次元構造を決定し、その作用効果の発揮に重要な部位を特定した上で用いてもよいが、既に塩基配列や三次元構造が明らかにされているものを用いることもできる。そのようなＩＲＥＳとしては、チャバネアオカメムシ腸管ウィルス、コオロギ麻痺病ウィルス、Ｃ型肝炎ウィルス、ポリオウィルスなどのＩＲＥＳを挙げることができる。
【００５３】
なお、本発明者の実験的知見によれば、チャバネアオカメムシ腸管ウィルスのＩＲＥＳにおいては、偽結節ＩＩＩとステムループＶという三次元構造がＩＲＥＳ依存性翻訳にとり非常に重要であるので、ａｎｔｉ−ＩＲＥＳ配列は、これら三次元構造に係る塩基配列と相補的なものとすればよい。
【００５４】
（ｇ） 目的遺伝子
本発明の目的遺伝子は、本発明に係る核酸分子により発現させることを所望する任意のものであればよく、特に制限されない。例えば、生産の望まれる有用なタンパク質をコードする遺伝子；ルシフェラーゼ遺伝子やＧＦＦ遺伝子（診断、バイオセンサー、バイオイメージングなどのため）；その役割やネットワークを明らかにしたいタンパク質をコードする遺伝子（タンパク質の解析などのため）；代謝カスケードの一部を担う遺伝子（合成生物学などのため）などを挙げることができる。
【００５５】
３’末端の配列は、本発明の作用効果を阻害しない限り、特に制限されないし、また、特に設ける必要はない。例えば、目的遺伝子やＩＲＥＳなどに結合し、その発現や作用を阻害するような配列は当然に用いることはできない。一方、エキソヌクレアーゼ対策として、特に問題を起こさない中立的な１００塩基以上の配列を３’末端に設けることも可能である。さらに、ポリＡ配列を導入してもよい。
【００５６】
本発明で用いるリガンドは、本発明に係るＲＮＡ分子において、アプタマーに結合してその三次元構造を変化させ、ＩＲＥＳを活性化させるものであれば特に制限されず、原則として所望のものを用いることができる。例えば、比較的低分子の有機化合物；金属イオンなどの無機化合物；増殖因子、酵素、受容体、膜タンパク質、ウィルスタンパク質などのタンパク質およびその一部などを挙げることができる。
【００５７】
例えば、細胞膜を通じてリガンドを外部から細胞内に取り込ませる場合、水溶性の低分子有機化合物を用いることができる。このようなリガンドとしては、テオフィリン、フラビンモノヌクレオチド、テトラサイクリン、スルホローダミンを挙げることができる。その他、細胞内分子をリガンドとして用いることも可能である。但し、リガンドとしては、細胞毒性を示さないものを用いることが好ましい。
【００５８】
本発明に係るＤＮＡ分子は、上記ＲＮＡ分子をコードするものであり、且つ当該コード領域の上流にプロモータ配列を有することを特徴とする。かかるＤＮＡ分子は、真核細胞自体や真核細胞の抽出物からなる遺伝子発現システムにおいて、所望のリガンドを用いて所望の目的遺伝子を発現させることができる点で有用である。
【００５９】
より詳しくは、本発明に係るＤＮＡ分子を真核細胞にトランスフェクションして発現させ、さらに細胞内にリガンドを導入してＩＲＥＳを活性化させることにより、目的遺伝子を発現せしめることができる。また、遺伝子発現システムを含む真核細胞の抽出物と本発明に係るＤＮＡ分子を混合し、当該ＤＮＡからＲＮＡへの転写とタンパク質への翻訳を促進して、目的遺伝子を発現させることができる。
【００６０】
本発明に係るＤＮＡ分子のプロモータは、使用する真核細胞に応じたものを適宜選択すればよい。例えば、酵母に対してはＧＡＬ、動物に対してはＳＶ４０といったウィルスプロモータを用いることができる。
【００６１】
本発明に係るＤＮＡ分子のトランスフェクション手段は、特に制限されない。一般的には、本発明に係るＤＮＡ分子を、使用する真核細胞に応じたプラスミドベクターやウィルスベクターに組み込んだ上で、真核細胞に導入する。また、本発明に係るＤＮＡ分子の両末端に、使用する真核細胞のＤＮＡの相同配列を設け、相同組換えできる可能性もある。
【００６２】
以上で説明した本発明に係るＲＮＡ分子とＤＮＡ分子は、真核細胞やウィルスへ導入した上で、リガンドを添加することにより、目的遺伝子を発現させることができるし、また、真核細胞の遺伝子発現システムを用い、ｉｎ ｖｉｔｒｏで目的遺伝子を発現させることもできる。即ち、本発明において、真核細胞で目的遺伝子を発現することには、真核細胞自体を用いる態様のみならず、真核細胞の遺伝子発現システムを用いて無細胞的に目的遺伝子を発現させる態様も含むものとする。
【００６３】
真核細胞の抽出物からなる遺伝子発現システムを利用する場合、具体的には、先ず、リボソームなど、ＤＮＡやＲＮＡからタンパク質を合成するための物質を含む真核細胞抽出物を調製する。例えば植物細胞からかかる抽出物は、植物種子を粉砕して胚芽を選別し、胚芽を洗浄してから微粉砕し、メタノールやエタノールなどで抽出することにより得られる。また、かかる抽出物は市販品を用いてもよい。次に、得られた真核細胞抽出物と上記ＤＮＡまたはＲＮＡとを混合し、反応させればよい。その際、アミノ酸などタンパク質合成に必要な基質などを添加してもよいし、ＲＮＡポリメラーゼなど、ＤＮＡからＲＮＡへの転写に必要な物質をさらに添加してもよい。反応温度や反応時間は適宜調整すればよいが、例えば、２０℃以上、４０℃以下程度で、３０分間以上、１０時間以下程度反応させることができる。
【実施例】
【００６４】
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はもとより下記実施例によって制限を受けるものではなく、前・後記の趣旨に適合し得る範囲で適当に変更を加えて実施することも勿論可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に包含される。
【００６５】
実験例１ ＰＳＩＶ ＩＲＥＳの最適化
（１） 鋳型ＤＮＡの調製
チャバネアオカメムシ腸管ウィルス（以下、「ＰＳＩＶ」という）のゲノムＲＮＡ（図３）において、第５９５１〜６２０４塩基であり、非構造タンパク質前駆体をコードする第１ＯＲＦの３’側末端の５３塩基を５’側に、キャプシドタンパク質前駆体をコードする第２ＯＲＦの５’側末端であり、キャプシドタンパク質前駆体のＮ末端の４つのアミノ酸をコードする１２塩基を３’側に、内部リボソーム結合サイト（ＩＲＥＳ）をコードする遺伝子をそれらの間に有するＲＮＡに対応する鋳型ＤＮＡであるｐＰＳＩＶ−ＩＲＥＳ−ＮＣＰ（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ社製の人工合成物）を、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＭＡＸ ＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ社製）を用いたＰＣＲにより増幅した。また、ホタルルシフェラーゼ遺伝子（ｐＥ０１−Ｌｕｃ，以下、「Ｆ−Ｌｕｃ」という）も同様に増幅した。これらＤＮＡをライゲーションし、同様に増幅した。得られたＤＮＡを用い、図６のステムループ構造（以下、「５’−ＳＬ」という）をコードする遺伝子を５’末端に、さらに翻訳を促進するためのＴ７プロモータ配列を有する鋳型ＤＮＡを調製した。
【００６６】
また、上記と同様にして、上記鋳型ＤＮＡにおいて、第１ＯＲＦの３’側末端の５３塩基を含まない、即ち、ＰＳＩＶゲノムの第６００４〜６２０４塩基を含む鋳型ＤＮＡ；並びに、ＩＲＥＳをコードする遺伝子の一部が欠損、即ち、それぞれＰＳＩＶゲノムの第６０１７〜６２０４塩基、第６０７３〜６２０４塩基および第６１０１〜６２０４塩基を含む鋳型ＤＮＡを調製した。
【００６７】
（２） 鋳型ｍＲＮＡの調製
ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ Ｔ７ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用い、上記各鋳型ＤＮＡを転写した鋳型ｍＲＮＡを得た。ＲＮｅａｓｙ ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｃｌｅａｎｕｐ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用い、得られた鋳型ｍＲＮＡを精製し、また、波長２６０ｎｍの光の吸収を利用して鋳型ｍＲＮＡを定量した。
【００６８】
得られた５種の鋳型ｍＲＮＡを、図４に示す。図４中の数字は、ＰＳＩＶゲノムＲＮＡ中の塩基番号を示す。また、ＬとＳＬとＰＫは、翻訳に必要なＩＲＥＳの三次元構造を示し、Ｌはループ（loop）、ＳＬはステムループ（stem-loop）、ＰＫは偽結節（pseudoknot）を示す。また、５’−ＳＬは、配列番号１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）の配列を有し、５’末端のステムループであり、真核細胞における５’末端が介在する翻訳を阻害する役割を有する。Ｎ−ＣＰは、ＰＳＩＶゲノムにおける第６１９３〜６２０４塩基であり、キャプシドタンパク質前駆体をコードする第２ＯＲＦの５’側末端であって、キャプシドタンパク質前駆体のＮ末端の４つのアミノ酸をコードする１２塩基である。当該配列は、ＩＲＥＳが介在する翻訳を促進する役割を有する。Ｆ−Ｌｕｃは、ホタルルシフェラーゼ遺伝子である。
【００６９】
（３） 鋳型ｍＲＮＡの翻訳
ＷＥＰＲＯ１２４０ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｋｉｔ（ＣｅｌｌＦｒｅｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用い、上記で得られた鋳型ｍＲＮＡを無細胞翻訳した。具体的には、上記鋳型ｍＲＮＡ（３ｐｍｏｌ）、小麦胚芽抽出物（ＷＥＰＲＯ１２４０，２μＬ）、クレアチンキナーゼ（終濃度で４０ｎｇ／μＬ）および標準コムギ無細胞タンパク質合成用基質（終濃度で１×）の混合物（１０μＬ）を、２６℃で１時間インキュベートした。
【００７０】
（４） ルシフェラーゼアッセイ
上記（３）の反応混合物を水で１１倍に希釈し、その５μＬをＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製，７５μＬ）と混合した。反応混合液をブラック９６ウェルプレートに入れ、マルチラベルプレートカウンター（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製，Ｗａｌｌａｃ ＡＲＶＯ ＭＸ）を用い、蛍光強度を測定した。以上の翻訳から測定を３回ずつ行い、その平均値を算出した。結果を、２番目の鋳型ｍＲＮＡ（図４の２：ＩＲＥＳ６００４−Ｌｕｃ，以下、「鋳型ｍＲＮＡ２」のように示す）の値を１００％とする相対活性により図５に示す。
【００７１】
図５のとおり、鋳型ｍＲＮＡ２で最も翻訳効率が高かった。鋳型ｍＲＮＡ２は、全ＩＲＥＳを含んでいる一方で、第１ＯＲＦの一部を含んでいない。それに対して、全ＩＲＥＳを含むが第１ＯＲＦの一部を含む鋳型ｍＲＮＡ１では、翻訳効率が低下している。かかる結果は、第１ＯＲＦの一部がＩＲＥＳの三次元構造に影響を与えることによると考えられる。一方、ＩＲＥＳの一部が欠損している鋳型ｍＲＮＡ４〜５では、翻訳活性がほとんど見られなかった。かかる結果からは、本システムにおいては、５’末端が介在する翻訳が５’−ＳＬによりほぼ完全に阻害されていることが分かる。
【００７２】
実験例２ Ａｎｔｉ−ＩＲＥＳによる翻訳の阻害
ｍＲＮＡ発現を制御するためには、リガンドが存在しない場合に翻訳を抑制しなければならない。そのため、ＩＲＥＳ介在性翻訳を効率的に阻害できるＡｎｔｉ−ＩＲＥＳを探索した。
【００７３】
詳しくは、上記実験例１（１）〜（２）と同様の方法により、図６に示す５’末端ステムループ（５’−ＳＬ）とＰＳＩＶ−ＩＲＥＳのＩＲＥＳとの間（Ｘｎ）に、ＩＲＥＳの重要な三次元構造であるループ（Ｌ）、ステムループ（ＳＬ）または偽結節（ＰＫ）の何れかに関与する配列と相補的な以下の配列が挿入されたｍＲＮＡを調製した。
【００７４】
【表１】
【００７５】
得られたｍＲＮＡを用い、上記実験例１（３）〜（４）と同様の方法により、翻訳効率を算出した。結果を、上記実験例１の鋳型ｍＲＮＡ２の値を１００％とする相対活性により図７に示す。
【００７６】
図７のとおり、ＰＫ−ＩＩＩに結合する鋳型ｍＲＮＡ８、ｃＰＫ−ＩＩに結合する鋳型ｍＲＮＡ１１およびＳＬ−Ｖに結合する鋳型ｍＲＮＡ１３の阻害活性が非常に優れており、特に鋳型ｍＲＮＡ８と鋳型ｍＲＮＡ１３が、重要なＩＲＥＳ部分が欠損している鋳型ｍＲＮＡ４と匹敵するほど阻害活性が優れていた。なお、鋳型ｍＲＮＡ８は、ＰＫ−ＩＩＩを構成する配列の一方に結合し、ＩＲＥＳの三次元構造を変化させることにより、ＩＲＥＳ介在性翻訳を阻害すると考えられる。
【００７７】
実験例３ Ａｎｔｉ−ＩＲＥＳの長さの検討
次に、ＩＲＥＳ介在性翻訳を阻害するに十分なａｎｔｉ−ＩＲＥＳの塩基長を調べた。
【００７８】
上記実験例１（１）〜（２）と同様の方法により、以下のとおり、上記実験例２で最も阻害活性に優れていた鋳型ｍＲＮＡ８のａｎｔｉ−ＩＲＥＳの長さを変更した鋳型ｍＲＮＡを調製した。
【００７９】
【表２】
【００８０】
得られたｍＲＮＡを用い、上記実験例１（３）〜（４）と同様の方法により、翻訳効率を算出した。結果を、上記実験例１の鋳型ｍＲＮＡ２の値を１００％とする相対活性により図８に示す。
【００８１】
図８の結果のとおり、ａｎｔｉ−ＩＲＥＳの塩基長が４になると阻害活性が全く無くなった。一方、塩基長が７〜８であればほぼ完全に阻害できることが明らかとなった。
【００８２】
実験例４ Ａｎｔｉ−ＩＲＥＳによる翻訳の阻害の回復
ｍＲＮＡ発現のオン−オフを制御するためには、リガンドにより変化したＩＲＥＳの構造を元に戻し、ＩＲＥＳ介在性翻訳を回復させる必要がある。そこで、ａｎｔｉ−ＩＲＥＳへ相補的に結合してその機能を阻害するａｎｔｉ−ａｎｔｉ−ＩＲＥＳを検討した。
【００８３】
上記実験例１（１）〜（２）と同様の方法により、上記実験例２の鋳型ｍＲＮＡ８において、５’−ＳＬとａｎｔｉ−ＩＲＥＳとの間（Ｙｎ）に、５塩基（ループ）を介して、塩基長の異なる以下のａｎｔｉ−ａｎｔｉ−ＩＲＥＳを有する鋳型ｍＲＮＡを調製した。
【００８４】
【表３】
【００８５】
得られたｍＲＮＡを用い、上記実験例１（３）〜（４）と同様の方法により、翻訳効率を算出した。結果を、上記実験例１の鋳型ｍＲＮＡ２の値を１００％とする相対活性により図９に示す。
【００８６】
図９の結果のとおり、相補塩基長が３〜５では、ａｎｔｉ−ＩＲＥＳにより阻害されたＩＲＥＳ介在性翻訳を回復させることはできなかった。しかし、相補塩基長が７の場合はほぼ５０％までＩＲＥＳ介在性翻訳を回復させることができ、ａｎｔｉ−ＩＲＥＳと同じ塩基長のａｎｔｉ−ａｎｔｉ−ＩＲＥＳを使った場合には、約８０％までＩＲＥＳ介在性翻訳を回復させることができた。このように、ａｎｔｉ−ＩＲＥＳとａｎｔｉ−ａｎｔｉ−ＩＲＥＳとで二本鎖を形成させれば、ＩＲＥＳの構造を元に戻し、ＩＲＥＳ介在性翻訳を回復させることができ得ることが明らかにされた。
【００８７】
実施例１
上記実験例１〜４の結果をもって、リガンドによりｍＲＮＡ発現のオン−オフを制御するシステムとして、以下の戦略を案出した。
・ ５’末端に５’−ＳＬを設け、５’末端介在性翻訳を抑制し、ＩＲＥＳ介在性翻訳を利用する
・ リガンドと強固かつ選択的に結合できるアプタマー配列を、ａｎｔｉ−ＩＲＥＳとａｎｔｉ−ａｎｔｉ−ＩＲＥＳとの間に挿入する
・ モジュレータ配列（ＭＳ）をａｎｔｉ−ａｎｔｉ−ＩＲＥＳの５’側に挿入し、ａｎｔｉ−ＩＲＥＳ／ａｎｔｉ−ａｎｔｉ−ＩＲＥＳの二重鎖の形成を制御する
・ 翻訳効率のオン−オフの比を高めるため、モジュレータ配列を最適化する
上記の戦略に基づく一例を、図１０に示す。
【００８８】
図１０の左図は、リガンドが存在しない場合を示し、モジュレータ配列（ＭＳ）がａｎｔｉ−ａｎｔｉ−ＩＲＥＳの３’末端とアプタマー配列の５’末端と結合してステムループ（ＭＳ−ＳＬ）を形成している。その結果、ａｎｔｉ−ａｎｔｉ−ＩＲＥＳはａｎｔｉ−ＩＲＥＳと結合できないため、ａｎｔｉ−ＩＲＥＳはＩＲＥＳの重要部位と結合し、ＩＲＥＳの三次元構造を変化させる。よって、５’末端介在性翻訳は５’−ＳＬにより阻害されている上に、ＩＲＥＳ介在性翻訳も抑制されるため、ｍＲＮＡは翻訳されない。
【００８９】
一方、アプタマーへ強固かつ選択的に結合するリガンドが存在する場合（図１０の右図）、アプタマーへのリガンドの結合によりモジュレータ配列（ＭＳ）がアプタマーとａｎｔｉ−ａｎｔｉ−ＩＲＥＳから遊離し、ａｎｔｉ−ａｎｔｉ−ＩＲＥＳとａｎｔｉ−ＩＲＥＳとの二重鎖形成が可能となり、その結果、ＩＲＥＳの三次元構造が回復し、ＩＲＥＳ介在性翻訳が進行する。
【００９０】
上記の戦略を実現化すべく、上記実験例４の鋳型ｍＲＮＡ ａａ８を基にして、テオフィリンをリガンドとすることができるｍＲＮＡをデザインし、上記実験例１（１）〜（２）と同様の方法で合成した。具体的には、鋳型ｍＲＮＡ ａａ８において、ａｎｔｉ−ａｎｔｉ−ＩＲＥＳとａｎｔｉ−ＩＲＥＳとの間にテオフィリンアプタマー配列を挿入し、また、ａｎｔｉ−ａｎｔｉ−ＩＲＥＳと５’−ＳＬとの間にモジュレータ配列（ＭＳ）を挿入した。
【００９１】
この際、モジュレータ配列（ＭＳ）において、ａｎｔｉ−ａｎｔｉ−ＩＲＥＳと結合する部分は、５’−ＡＧＡＣ−３’という４塩基に固定し、アプタマー配列と結合する部分を検討した。ａｎｔｉ−ａｎｔｉ−ＩＲＥＳと結合する部分を４塩基に固定した理由は、モジュレータ配列（ＭＳ）の３’側は必然的にａｎｔｉ−ＩＲＥＳの５’側と同じにならざるを得ないので、モジュレータ配列（ＭＳ）自体がＩＲＥＳと結合して翻訳が阻害されるおそれがあるが、上記実験例３の鋳型ｍＲＮＡ８−４と８−ｒ４のとおり、４塩基長であれば、モジュレータ配列（ＭＳ）がＩＲＥＳに結合して無条件に翻訳が阻害されることはないからである。
【００９２】
また、モジュレータ配列（ＭＳ）のうちアプタマー配列と結合する部分（Ｚｎ）は、以下のとおり２〜８塩基長、モジュレータ配列（ＭＳ）全体としては６〜１２塩基長のものをデザインした。
【００９３】
【表４】
【００９４】
上記ｍＲＮＡを用い、１ｍＭテオフィリンが存在する場合と存在しない場合において、上記実験例１（３）〜（４）と同様の方法により、翻訳効率を算出した。結果を、上記実験例１の鋳型ｍＲＮＡ２の値を１００％とする相対活性により図１１に示す。
【００９５】
図１１の結果のとおり、モジュレータ配列（ＭＳ）のうちアプタマー配列に結合する部分が５塩基長以上、全体で９塩基長以上であれば、リガンドであるテオフィリンが存在しない場合における翻訳が十分に抑制されていた。このことは、モジュレータ配列（ＭＳ）がａｎｔｉ−ａｎｔｉ−ＩＲＥＳとアプタマー配列に結合していることから、ａｎｔｉ−ＩＲＥＳがＩＲＥＳと結合してその三次元構造を変化させていることによると考えられる。一方、モジュレータ配列（ＭＳ）のうちアプタマー配列に結合する部分が８塩基長、全体で１２塩基長の場合、テオリフィンが存在していても翻訳が十分に進行しなかった。その理由は、テオリフィンが存在していてもモジュレータ配列（ＭＳ）がａｎｔｉ−ａｎｔｉ−ＩＲＥＳとアプタマー配列から離れず、ａｎｔｉ−ＩＲＥＳもＩＲＥＳから離れられないことによると考えられる。
【００９６】
それに対して、モジュレータ配列（ＭＳ）のうちアプタマー配列に結合する部分が５〜７塩基長、全体で９〜１１塩基長の場合、テオフィリンが存在していない場合に対する存在している場合の比（ＯＮ／ＯＦＦ比）が約８倍から１０倍までと非常に高いものとなっている。このように本発明によれば、リガンドにより遺伝子の発現を制御できることが証明された。また、本実施例では無細胞の真核細胞遺伝子発現システムを用いたが、かかる態様で良好な結果が得られたことにより、真核細胞自体を用いた形質転換技術でも同様の結果が得られると考えられる。
【００９７】
また、各ｍＲＮＡにおいて、ｍＲＮＡ発現のオン−オフ制御に最も重要であるモジュレータ配列ステムループ（ＭＳ−ＳＬ）のギブズ自由エネルギー（ΔＧ）を、ＲＮＡの構造から計算した。結果を図１１に示す。
【００９８】
図１１の結果のとおり、ギブズ自由エネルギー（ΔＧ）が大き過ぎるとおそらくモジュレータ配列ステムループが不安定となり、リガンドが存在しない場合でもＩＲＥＳ依存性翻訳が開始されてしまう一方で、小さ過ぎるとモジュレータ配列ステムループが過剰に安定化し、リガンドが存在してもＩＲＥＳ依存性翻訳が開始されない場合があることが分かった。
【００９９】
実施例２
上記実施例１の結果に基づき、リガンドとしてテオフィリンを用いるシステムを他のリガンドとアプタマー配列との組合せに適用するため、ｍＲＮＡをデザインした。
【０１００】
具体的には、図１２のテオリフィン−アプタマーの他、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）−アプタマー、テトラサイクリン（ｔｃ）−アプタマー、スルホローダミンＢ−アプタマーの組合せを用いたｍＲＮＡにおいて、モジュレータ配列ステムループ（ＭＳ−ＳＬ）のギブズ自由エネルギー（ΔＧ）が、上記実施例１で最もＯＮ／ＯＦＦ比が高かったｍＲＮＡであるｔｈｅｏ５の−１１．７ｋｃａｌ／ｍｏｌに近くなるように、モジュレータ配列（ＭＳ）をデザインし、上記実施例１（１）〜（２）の方法と同様にして調製した。但し、テトラサイクリンなどの濃度が高過ぎるとＩＲＥＳ介在性翻訳が阻害されるおそれがあり得るため、テオフィリンの濃度のみ１ｍＭとし、他の濃度は０．３ｍＭとした。各ｍＲＮＡにおけるモジュレータ配列（ＭＳ）とギブズ自由エネルギー（ΔＧ）を以下に示す。
【０１０１】
【表５】
【０１０２】
上記ｍＲＮＡを用い、各リガンドが存在する場合と存在しない場合において、上記実験例１（３）〜（４）と同様の方法により、翻訳効率を算出した。結果を、上記実験例１の鋳型ｍＲＮＡ２の値を１００％とする相対活性により図１３に示す。
【０１０３】
図１３の結果のとおり、各リガンドを用いない場合の翻訳効率は、ｍＲＮＡ ｔｈｅｏ５と同等に低い一方で、各リガンドを用いた場合の翻訳効率は向上した。特にリガンドとしてテトラサイクリンを用いた場合のＯＮ／ＯＦＦ比は飛び抜けて高く、約３０にも達した。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リガンドにより目的遺伝子の発現を制御できるＲＮＡ分子であって、５’側から以下の構造および配列を有することを特徴とするＲＮＡ分子。
（ａ） ５’末端依存性翻訳を阻害する５’末端ステムループ；
（ｂ） リガンド不存在時に、下記アプタマー配列の一部と相補的に結合してモジュレータ配列ステムループを形成するモジュレータ配列；
（ｃ） リガンド不存在時には、モジュレータ配列および下記アプタマー配列の一部と共にステムループを形成し、リガンド存在時には下記ａｎｔｉ−内部リボソーム結合サイト配列と相補的二重鎖を形成するａｎｔｉ−ａｎｔｉ−内部リボソーム結合サイト配列；
（ｄ） リガンドとの結合能を有するアプタマー配列；
（ｅ） リガンド不存在時には内部リボソーム結合サイトの一部と相補的二重鎖を形成して内部リボソーム結合サイトへのリボソームの結合を阻害し、リガンド存在時にはａｎｔｉ−ａｎｔｉ−内部リボソーム結合サイト配列と相補的二重鎖を形成するａｎｔｉ−内部リボソーム結合サイト配列；
（ｆ） 内部リボソーム結合サイト；および
（ｇ） 目的遺伝子
【請求項２】
内部リボソーム結合サイトに対するａｎｔｉ−内部リボソーム結合サイト配列の相補塩基長が６以上、１２以下である請求項１に記載のＲＮＡ分子。
【請求項３】
ａｎｔｉ−内部リボソーム結合サイト配列に対するａｎｔｉ−ａｎｔｉ−内部リボソーム結合サイト配列の相補塩基長が６以上、１２以下である請求項１または２に記載のＲＮＡ分子。
【請求項４】
ａｎｔｉ−ａｎｔｉ−内部リボソーム結合サイト配列の一部に対するモジュレータ配列の相補塩基長が５以下である請求項１〜３のいずれかに記載のＲＮＡ分子。
【請求項５】
アプタマー配列の一部に対するモジュレータ配列の相補塩基長が４以上、８以下である請求項１〜４のいずれかに記載のＲＮＡ分子。
【請求項６】
モジュレータ配列ステムループ構造のギブズ自由エネルギー（ΔＧ）が、−１７．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上、−８．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下である請求項１〜５のいずれかに記載のＲＮＡ分子。
【請求項７】
内部リボソーム結合サイトが、チャバネアオカメムシ腸管ウィルスのものである請求項１〜６のいずれかに記載のＲＮＡ分子。
【請求項８】
ａｎｔｉ−内部リボソーム結合サイト配列が、チャバネアオカメムシ腸管ウィルスの内部リボソーム結合サイト配列の三次元構造における偽結節ＩＩＩまたはステムループＶに結合可能なものである請求項７に記載のＲＮＡ分子。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれかに記載のＲＮＡ分子をコードするものであり、且つ当該コード領域の上流にプロモータ配列を有することを特徴とするＤＮＡ分子。
【請求項１０】
目的遺伝子の真核細胞における発現を制御するための方法であって、
請求項１〜８のいずれかに記載のＲＮＡ分子または請求項９に記載のＤＮＡ分子を、真核細胞の抽出物と混合し、反応させる工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項１１】
目的遺伝子の真核細胞における発現を制御するための方法であって、
請求項９に記載のＤＮＡ分子を真核細胞にトランスフェクションする工程；および
真核細胞にリガンドを導入することにより、内部リボソーム結合サイトを活性化する工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項１】
リガンドにより目的遺伝子の発現を制御できるＲＮＡ分子であって、５’側から以下の構造および配列を有することを特徴とするＲＮＡ分子。
（ａ） ５’末端依存性翻訳を阻害する５’末端ステムループ；
（ｂ） リガンド不存在時に、下記アプタマー配列の一部と相補的に結合してモジュレータ配列ステムループを形成するモジュレータ配列；
（ｃ） リガンド不存在時には、モジュレータ配列および下記アプタマー配列の一部と共にステムループを形成し、リガンド存在時には下記ａｎｔｉ−内部リボソーム結合サイト配列と相補的二重鎖を形成するａｎｔｉ−ａｎｔｉ−内部リボソーム結合サイト配列；
（ｄ） リガンドとの結合能を有するアプタマー配列；
（ｅ） リガンド不存在時には内部リボソーム結合サイトの一部と相補的二重鎖を形成して内部リボソーム結合サイトへのリボソームの結合を阻害し、リガンド存在時にはａｎｔｉ−ａｎｔｉ−内部リボソーム結合サイト配列と相補的二重鎖を形成するａｎｔｉ−内部リボソーム結合サイト配列；
（ｆ） 内部リボソーム結合サイト；および
（ｇ） 目的遺伝子
【請求項２】
内部リボソーム結合サイトに対するａｎｔｉ−内部リボソーム結合サイト配列の相補塩基長が６以上、１２以下である請求項１に記載のＲＮＡ分子。
【請求項３】
ａｎｔｉ−内部リボソーム結合サイト配列に対するａｎｔｉ−ａｎｔｉ−内部リボソーム結合サイト配列の相補塩基長が６以上、１２以下である請求項１または２に記載のＲＮＡ分子。
【請求項４】
ａｎｔｉ−ａｎｔｉ−内部リボソーム結合サイト配列の一部に対するモジュレータ配列の相補塩基長が５以下である請求項１〜３のいずれかに記載のＲＮＡ分子。
【請求項５】
アプタマー配列の一部に対するモジュレータ配列の相補塩基長が４以上、８以下である請求項１〜４のいずれかに記載のＲＮＡ分子。
【請求項６】
モジュレータ配列ステムループ構造のギブズ自由エネルギー（ΔＧ）が、−１７．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上、−８．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下である請求項１〜５のいずれかに記載のＲＮＡ分子。
【請求項７】
内部リボソーム結合サイトが、チャバネアオカメムシ腸管ウィルスのものである請求項１〜６のいずれかに記載のＲＮＡ分子。
【請求項８】
ａｎｔｉ−内部リボソーム結合サイト配列が、チャバネアオカメムシ腸管ウィルスの内部リボソーム結合サイト配列の三次元構造における偽結節ＩＩＩまたはステムループＶに結合可能なものである請求項７に記載のＲＮＡ分子。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれかに記載のＲＮＡ分子をコードするものであり、且つ当該コード領域の上流にプロモータ配列を有することを特徴とするＤＮＡ分子。
【請求項１０】
目的遺伝子の真核細胞における発現を制御するための方法であって、
請求項１〜８のいずれかに記載のＲＮＡ分子または請求項９に記載のＤＮＡ分子を、真核細胞の抽出物と混合し、反応させる工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項１１】
目的遺伝子の真核細胞における発現を制御するための方法であって、
請求項９に記載のＤＮＡ分子を真核細胞にトランスフェクションする工程；および
真核細胞にリガンドを導入することにより、内部リボソーム結合サイトを活性化する工程を含むことを特徴とする方法。
【図３】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１】
【図２】
【図４】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
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【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【公開番号】特開２０１２−２３９９８（Ｐ２０１２−２３９９８Ａ）
【公開日】平成２４年２月９日（２０１２．２．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１６４３６４（Ｐ２０１０−１６４３６４）
【出願日】平成２２年７月２１日（２０１０．７．２１）
【出願人】（５０４１４７２５４）国立大学法人愛媛大学 (214)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年２月９日（２０１２．２．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年７月２１日（２０１０．７．２１）
【出願人】（５０４１４７２５４）国立大学法人愛媛大学 (214)
【Ｆターム（参考）】
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