硫酸化多糖類のグループのための新しい治療用途
本発明は哺乳類における変形性関節症の治療又は予防のための医薬の製造のための、イヌリン硫酸、ゲラン硫酸、プルラン硫酸、カードラン硫酸、硫酸化アルギン酸、ラミナリン硫酸及びペクチン硫酸からなる群より選択される酸の形態の硫酸化多糖類又は生理学的に許容されるその塩の使用に関する。この硫酸化多糖類は、好ましくはイヌリン硫酸、より好ましくはイヌリンポリ硫酸ナトリウム塩である。本発明はまた哺乳類における変形性関節症の治療又は予防のための医薬の製造のための、イヌリン、ゲラン、プルラン、カードラン、アルギン酸、ラミナリン及びペクチンよりなる群から選択される多糖類から誘導した硫酸化オリゴ糖の使用に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は変形性関節症（arthrosis、関節症と称する場合もある）の治療又は予防のための医薬の製造のための硫酸化多糖類（sulphated polysaccharide）の使用に関する。同様に、本発明は変形性関節症の治療又は予防のための医薬の製造のための硫酸化オリゴ糖類（sulphated oligosaccharide）の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨関節炎（osteoarthritis）としても知られている、変形性関節症は、６５歳以上の大部分の人々に影響を及ぼす変形性関節疾患（degenerative joint disease）であり、炎症及び疼痛の存在を伴った軟骨組織の段階的な変形を特徴とする。炎症は特に疾患が進行段階にある場合に生じ、そして関節リューマチ（rheumatoid arthritis、慢性関節リューマチと称する場合もある）で観察される炎症とは性質が異なっており、一般的には変形性関節症の僅かな要素（minority component）に過ぎない。変形性関節症はまた硝子軟骨および／または関節軟骨（hyaline articular cartilage）の変形としても定義される。その二次的な作用は、滑膜および肋軟骨下骨への影響（affectation）並びに関節表面の辺縁部（the margins）の新骨の形成である。変形性関節症の病因論は知られておらず、そしてその進展（evolution）はゆっくりである。
【０００３】
軟骨は骨を、相互に滑らせて動かす。軟骨はまた物理的運動により生じる応力を吸収する。変形性関節症においては、軟骨表面が破壊され磨耗しており、骨を相互に対抗する(against)ように運動させ、これが摩擦（friction）、疼痛（pain）、浮腫（swelling）及び関節運動の消失（loss of joint movement）を誘発する。経時的に関節が変形する（deform）場合がある。
【０００４】
変形性関節症の診断の一助として、主に２種の手法、即ち、関節での骨の変化を発見するための最も単純な方法であるＸ線、及びこれとは異なり全ての関節成分を同時に目視可能とする核磁気共鳴（ＮＭＲ）が用いられている。
【０００５】
正常な状態においては、軟骨の更新（renewal）は極めてゆっくりとした過程であり、これは細胞外マトリックス成分の一定の合成（同化作用）及び分解（異化作用）を含む。軟骨細胞は協調されなければならないこの代謝に関与する細胞である。
【０００６】
病理的な状態においては、軟骨の更新が加速されるため、この過程は改変されるが、これが軟骨細胞の同化作用と異化作用のプログラムの間の不均衡により生じる軟骨性組織の早発性の修復（precocious repair）をもたらし、これが軟骨の分解（degradation）を誘発する。修復反応は軟骨細胞による軟骨細胞外マトリックス成分の合成における増大を伴ったこれらの細胞の過剰な増殖（hyperproliferation）の結果である（Ｄ．Ｈａｍｅｒｍａｍら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３２０，１３２２−１３３０（１９８９））。したがって、このホメオスタシス反応（homeostatic reaction）を制御し、そして全身性のホルモン（systemic hormones）及び加齢と共に分泌が減少する成長因子に依存している軟骨の合成と分解との間の均衡が存在する。軟骨の分解は近接する組織の生産する酵素およびフリーラジカルにより調節（regulate）されるが、軟骨細胞自身によっても調節される。
【０００７】
発明者らは変形性関節症のための以下に示す一般的な薬理学的治療（薬）に焦点をあてた。
【０００８】
急速な作用を有する対症作用物質（symptomatic-action substances）、例えば鎮痛剤、非ステロイド抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）、コルチコイド及びシクロオキシゲナーゼ２阻害剤（cyclo-oxygenase 2 inhibitors、ＣＯＸ−２）。
【０００９】
ＳＹＳＡＤＯＡ（Symptomatic Slow Acting Drug for Osteoarthritis：変形性関節症治療用遅効性薬剤）として知られている、より緩徐な態様で作用する、例えばヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸（塩）（chondroitin sulphate、硫酸コンドロイチンとも称する）及びグルコサミン硫酸（塩）（glucosamine sulphate、硫酸グルコサミンとも称する）を含む、対症作用物質（Ｍ．Ｇ．Ｌｅｑｕｅｓｎｅ， Ｒｅｖ．Ｒｈｕｍ．（Ｅｎｇ．／Ｅｄ．），６１，６９−７３（１９９４））。このグループは作用が投与２〜３週の後に始まり、投与終了後２〜６ヶ月間持続することを特徴としている。
【００１０】
本発明の硫酸化多糖類に関する他の用途については文献中に記述が存在している。
【００１１】
Ｒ．Ｖ．Ｊｏｎｅｓはアルカリ金属を用いたイヌリン硫酸塩（inulin sulphate salts、硫酸イヌリン塩とも称する）の製造方法を開示している（ＵＳ２，６８６，７７９）。該特許において、種々の硫酸化度（sulphation）を有するイヌリン硫酸アルカリ塩（inulin sulphate alkaline salts）がペースト濃化剤（paste thickener）、接着剤及び油田採掘で使用する土壌添加剤など化学産業に適用されることが強調されている。
【００１２】
イヌリン硫酸（塩）は抗凝固性（anti-coagulant）を示し（Ａｒｋｉｖ ｆｏｒ ｋｅｍｉ，ｍｉｎｅｒａｌｏｇｉ ｏ．ｇｅｏｌｏｇｉ．，Ｂｄ ２４Ｂ（５），１−４（１９４６））、また、抗脂血活性（antilipemic activity）を示す（Ａｒｃｈ．Ｉｎｔ．Ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎ，ＸＣＩＸ，３３４（１９５４））ことが記載されている。
【００１３】
Ｖ．Ｇ．Ｎａｉｒらは、イヌリンポリ硫酸塩（inulin polysulphate salts、ポリ硫酸イヌリン塩とも称する）（完全硫酸化(completely sulphated)）が彼らの発明によれば、関節リューマチ、全身性エリテマトーデス（systemic erythematous lupus）、特定の型の血管炎（vasculitis）等のような疾患の治療に使用できるような、補体抑制活性（complement-inhibiting activity）を有することを明らかにしている（ＵＳ４，０２１，５４５）。
【００１４】
Ｇ．Ｆｒａｎｚらはプルラン硫酸（塩）（pullulan sulphate、硫酸プルランとも称する）の抗凝固及び抗血栓（anti-thrombotic）活性について記載している（Ｂｉｏａｃｔｉｖｅ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ， ４７−５８， Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ，２０００）。
【００１５】
Ｃ．Ｃ．Ｌｅｅは実施例において記載していないものの、天然の潤滑液を補うためにカラギーナンを含有してよい注射可能な組成物について特許請求の範囲に記載している（ＥＰ４９９．１６４）。この引用文献においてカラギーナンポリ硫酸（塩）（carrageenan polysulphate、ポリ硫酸カラギーナンとも称する）の記載は無い。
【００１６】
Ｔ．Ｋａｎａｍａｒｕらはカードラン硫酸（塩）（curdlan sulphate、硫酸カードランとも称する）が血管新生抑制剤（angiostatic agent）であることを開示している（ＵＳ５，１３５，９２０）。Ｓ．Ａｌｂａｎらは同化合物が抗凝固剤及び抗血栓剤として作用することについて記載している（Ｔｈｒｏｍｂ． Ｒｅｓ． ７８（３），２０１−１０（１９９５））。
【００１７】
Ｔ．Ｈａｔａらは化粧品製剤中の保湿剤（moisturising agent）としての硫酸化アルギン酸（alginic acid sulphate、アルギン酸スルファートとも称する）の適用を示している（ＪＰ０４２５７５０９）。Ｌ．Ｌａｎｇｅらは膵臓コレステロール（pancreatic cholesterol）の抑制のための硫酸化アルギン酸塩（alginate sulphate、硫酸アルギネートとも称する）の使用を記載している（ＥＳ２．０６４．７３６）。
【００１８】
Ｅ．Ｂｅｓｔｅｒｍａｎは多糖類、ラミナリン硫酸（塩）（polysaccharide laminarin sulphate、硫酸ラミナリンとも称する）が抗脂血活性（antilipemic activity）を示すことを記載している（Ｂｒｉｔ．Ｍｅｄ．Ｊ．，３１０（１９５７，Ｉ））。Ｈ．Ｑ．Ｍｉａｏらはラミナリン硫酸（塩）の抗転移（anti-metastatic）活性を明らかにしている（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，８３（３），４２４−３１（１９９９））。Ｐ．Ｂｏｈｌｅｎらは請求項（クレイム）に、糖尿病又は関節炎（arthritis）に、中でも炎症過程（inflammatory processes）に関連するヘパラナーゼ活性を多糖類、ラミナリン硫酸（塩）が阻害することを記載している（ＷＯ０３／００６６４５）。
【００１９】
Ｌ．Ｌａｎｇｅらは多糖類、ペクチン硫酸（塩）（polysaccharide pectin sulphate、硫酸ペクチンとも称する）が高い血中コレステロール濃度を治療するために有用であることを明らかにしている（ＥＳ２．０６４．７３６）。
【００２０】
【特許文献１】米国特許第２，６８６，７７９号明細書
【特許文献２】米国特許第４，０２１，５４５号明細書
【特許文献３】米国特許第５，１３５，９２０号明細書
【特許文献４】特開平４−２５７５０９号公報
【特許文献５】国際公開第０３／００６６４５号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
これまで、変形性関節症の治療又は予防における何れかの硫酸化度のイヌリン硫酸（塩）、ゲラン硫酸（塩）（gellan sulphate、硫酸ゲランとも称する）、プルラン硫酸（塩）、カードラン硫酸（塩）、硫酸化アルギン酸、ラミナリン硫酸（塩）及びペクチン硫酸（塩）、又は、カラギーナンポリ硫酸（塩）の使用の記載は発見されていない。
【００２２】
これまで、本発明者らは変形性関節症の治療又は予防における上記硫酸化多糖類に相当する硫酸化オリゴ糖の使用の如何なる記載も発見していない。
【００２３】
上記全てより、本発明者らは変形性関節症の治療のための有用な薬剤を提供することはなお治療上の課題であると結論した。
【００２４】
本発明により解決される課題は変形性関節症の治療又は予防において使用される、代替となる硫酸化多糖類を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２５】
本発明の第１の特徴に相当する解決法は、哺乳類における変形性関節症の治療又は予防のための医薬の製造のための、イヌリン硫酸、ゲラン硫酸、プルラン硫酸、カードラン硫酸、硫酸化アルギン酸、ラミナリン硫酸及びペクチン硫酸からなる群より選択される、酸の形態の硫酸化多糖類又はその生理学的に許容される塩の使用を指す。
【００２６】
好ましい実施の形態においては、硫酸化多糖類はイヌリン硫酸、ゲラン硫酸、プルラン硫酸及びカードラン硫酸からなる群より選択される。これらのうち、最も好ましいものはイヌリン硫酸およびゲラン硫酸である。
【００２７】
より好ましい実施の形態においては、硫酸化多糖類は、アルカリ金属又はアルカリ土類金属で完全又は部分的に塩化（salify）されている。好ましくは、アルカリ金属はナトリウムであり、そして好ましい多糖類はイヌリン硫酸ナトリウム塩（inulin sulphate sodium salt）である。多糖類、ゲラン硫酸ナトリウム塩も同様に好ましい。
【００２８】
無水物基準で（on anhydrous base）２５％〜６２％の硫酸化度を示すイヌリン硫酸ナトリウム塩がより好ましい。
【００２９】
硫酸化度が無水物基準で５５％〜６２％であるイヌリン硫酸ナトリウム塩が更に好ましい。
【００３０】
別の同様に好ましい実施の形態において、硫酸化多糖類は部分的に加水分解されている。
【００３１】
別の同様に好ましい実施の形態において、硫酸化多糖類はイヌリンポリ硫酸（inulin polysulphate、ポリ硫酸イヌリンとも称する、以下同様）、ゲランポリ硫酸、プルランポリ硫酸、カードランポリ硫酸、ポリ硫酸化アルギン酸、ラミナリンポリ硫酸及びペクチンポリ硫酸からなる群から選択される多硫酸化多糖類（polysulphated polysaccharide）である。これらのうち、最も好ましいものはイヌリンポリ硫酸であり、好ましくは、イヌリンポリ硫酸ナトリウム塩である。同様に好ましいものはゲランポリ硫酸、好ましくは、ゲランポリ硫酸ナトリウム塩である。
【００３２】
本発明の別の特徴は、哺乳類における変形性関節症の治療又は予防のための医薬の製造のためのカラギーナンポリ硫酸の使用である。
【００３３】
本発明の別の特徴は哺乳類における変形性関節症の治療又は予防のための医薬の製造に対する、イヌリン、ゲラン、プルラン、カードラン、アルギン酸、ラミナリン及びペクチンからなる群より選択される多糖類から誘導した、酸の形態の硫酸化オリゴ糖又はその生理学的に許容される塩の使用である。好ましくは、硫酸化オリゴ糖はイヌリンから誘導される。同様に好ましくは、硫酸化オリゴ糖はゲランから誘導される。
【００３４】
好ましい実施の形態においては、硫酸化オリゴ糖は多硫酸化オリゴ糖である。
【００３５】
本発明の別の特徴は、哺乳類における変形性関節症の治療又は予防のための医薬の製造に対する、自身の構造がイヌリン硫酸、ゲラン硫酸、プルラン硫酸、カードラン硫酸、硫酸化アルギン酸、ラミナリン硫酸及びペクチン硫酸からなる群より選択される硫酸化多糖類の構造の部分に相当する、化学合成により製造された、酸の形態の硫酸化オリゴ糖又はその生理学的に許容される塩の使用である。
【００３６】
特に好ましい実施の形態においては、医薬は経口投与に適応する。
【００３７】
同様に、特に好ましい実施の形態においては、薬剤は関節内投与に適応する。
【００３８】
本発明の硫酸化多糖類はよく知られており、そして、多糖類構造中、すなわちイヌリン、ゲラン、プルラン、カードラン、アルギン酸、ラミナリン及びペクチン中に存在する遊離のヒドロキシル基の部分的又は完全なスルホン化（sulphonation）により製造してよい。カラギーナンポリ硫酸はカラギーナン中に存在する遊離のヒドロキシルの全スルホン化により製造する。
【００３９】
ヒドロキシル基のスルホン化により、対応するスルファート基が生じる。
【００４０】
カラギーナンはその構造内に既に数個のスルファート基を含有している。本発明においてはカラギーナンポリ硫酸を使用する。
【００４１】
本明細書において硫酸化度（the degree of sulphation）に言及する場合は、これは（分子に関して）無水物基準のスルファート基の％を指す。
【００４２】
本明細書において硫酸化多糖類に言及する場合は、これは何れかの硫酸化度を有する硫酸化多糖類に関する。文献においては、高い硫酸化度を有する硫酸化多糖類は通常は多硫酸化多糖類と称されており、そして当然ながら、多糖類が完全に硫酸化されている場合は、やはり多硫酸化多糖類と称される。結果として、本発明は多硫酸化多糖類（イヌリンポリ硫酸、カラギーナンポリ硫酸、ゲランポリ硫酸、プルランポリ硫酸、カードランポリ硫酸、ポリ硫酸化アルギン酸（アルギン酸ポリスルファートとも称する）、ラミナリンポリ硫酸及びペクチンポリ硫酸）を包含する。
【００４３】
硫酸化多糖類は文献記載の操作法、例えば、クロロスルホン酸／ピリジンを用いることによる方法（Ｔ．Ａｓｔｒｕｐら、Ａｃｔａ Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｓｃａｎｄ．，８，２１５−２２６（１９４４））、また他には、クロロスルホン酸／ジメチルホルムミドを用いることによる方法（Ｐ．Ｖｏｎｇｃｈａｎ，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３３７，１２３９−１２４２（２００２））、また他には、ピペリジン−Ｎ−スルホン酸を用いる方法（Ｎ．Ｋｉｎｚｏら、Ｃａｒｂｏｈｙｄ．Ｒｅｓ．，２１，４２０−４２６（１９７２））、また他には、３酸化イオウ−ピリジン複合体（the sulphur trioxide-pyridine complex）を用いる方法（Ｃ．Ｍａｈｎｅｒら、Ｃａｒｂｏｈｙｄ．Ｒｅｓ．，３３１，２０３−２０８（２００１））により、上述した市販の多糖類中の遊離ヒドロキシルの部分的又は完全なスルホン化により製造してよい。
【００４４】
種々の硫酸化度を得るために（試薬濃度、反応温度、反応時間等を変更し）、上述の操作法を改変してもよい。更にまた所望により、異なる多糖類ヒドロキシルを多糖類ヒドロキシルの保護／脱保護により選択的にスルホン化してよい。
【００４５】
原料多糖類の平均分子量が高すぎる場合は、所望によりスルホン化の前後に部分的に加水分解することができる。
【００４６】
本発明において使用される硫酸化オリゴ糖は市販の多糖類の酵素的又は化学的な加水分解（文献既知の操作法）とその後のスルホン化によるか、又は、硫酸化多糖類の酵素的又は化学的加水分解により直接製造してよい。それらはまた化学合成により製造してよい。
【００４７】
本明細書において生理学的に許容される塩について言及する場合は、これは例えばナトリウム又はカリウムのようなアルカリ金属の塩、例えばカルシウム又はマグネシウムのようなアルカリ土類金属の塩、又は、例えばトリメチルアミンを有する塩、トリエチルアミンを有する塩、又は、例えばリジン、アルギニン、プロリン、グリシンまたはセリンのようなアミノ酸を有する塩、のような有機塩、を指す。
【００４８】
硫酸化多糖類の塩化は、単純なよく知られた化学的操作法により行ってよい。
【００４９】
変形性関節症の治療又は予防に使用するためには、本発明の硫酸化多糖類は、酸形態又はその生理学的に許容される塩のいずれの場合も、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｈａｎｄｂｏｏｃｋ， Ｍａｃｋ Ｐｕｂ．Ｃｏ．，Ｎ．Ｙ．，ＵＳＡに記載されているもののような従来の手法及び賦形剤又は担体を用いて、適切な医薬組成物中に製剤される。
【００５０】
本発明の医薬組成物は所望の用量において患者に投与してよい。組成物の投与は種々の手段、例えば経口、静脈内、腹腔内、関節内、皮下、筋肉内、局所、舌下、皮内又は鼻腔内に対して行ってよい。本発明の医薬組成物は酸の形態において、又は生理学的に許容されるその塩として、硫酸化多糖類の治療的有効量を含み、その量は多くの要因、例えば患者の身体的状態、年齢、性別、特定の化合物（specific compound）、投与手段及び当該分野でよく知られた他の要因により異なる。更にまた、活性化合物の用量（dosage）は所望の治療効果を得るために単回又は複数回の用量（single- or multiple-dose units）において投与してよい。所望により、他の治療薬を本発明により提供されるものと組み合わせて使用してよい。
【００５１】
一般的に、本発明の医薬品調製物は固体又は液体の形態、又は、ゲルの形態となる。本発明に従って製造してよい固体形態の医薬品調製物は粉末、微細顆粒（ペレット）、丸薬、分散性顆粒（dispersible granules）、カプセル、坐剤及び他の固体の生薬形態を包含する。液体形態の調製物は溶液、懸濁液、乳液及びマイクロスフィアを包含する。使用直前に経口、非経口（parenteral）又は関節内投与用の液体調製物に変換してよい固体形態の調製物もまた意図される。このような液体形態には溶液、懸濁液及び乳液が包含される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５２】
以下の実施例は例示に過ぎず、本発明の範囲を限定するものではない。
【００５３】
［化学実施例］
例１：イヌリンポリ硫酸ナトリウム塩の製造
１−Ａ：クロロスルホン酸／ピリジンを用いたイヌリンポリ硫酸ナトリウム塩の製造
６℃未満の温度で一定の攪拌下に、クロロスルホン酸８８ｍＬ（１．３２モル；１．８水酸化当量（ｅｑ／ＯＨ））を乾燥ピリジン５８０ｍＬ（７．２０モル）に滴下した。得られた混合物を７５℃まで加熱し、その後イヌリン（Ｆｉｂｒｕｌｉｎｅ Ｓｔａｎｄａｒ，Ｔｒａｄｅｓ Ｓ．Ａ．より販売）４０ｇ（０．２５モル）を添加した。攪拌及び１００℃加熱を５時間継続した。その後、反応混合物を約５０℃まで放冷し、そして脱イオン水５０ｍＬを添加することにより過剰なクロロスルホン酸を破壊（destroy）した。この工程の間、周囲温度は僅かに上昇し、２層が生じた。
【００５４】
粗製の反応生成物を周囲温度に到達するまで放置した。上方の（ピリジン）層を吸引により分離し、一方、下方の油層はメタノール中の酢酸ナトリウム１０％溶液に注ぎこんだ。形成した沈殿を沈降させた。上澄みを傾瀉（decanting）により分離し、廃棄した。
【００５５】
この酢酸ナトリウム・メタノール溶液を用いた処理を２回反復し、最終工程において、ｋ−１００深型フィルター（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ．Ｓｅｉｔｚ−ｋ−１００）を用いて真空濾過することにより固体を分離した。
【００５６】
濾過物（茶色固体）を蒸留水に溶解させて、得られた溶液をｋ−１００深型フィルターで真空濾過することにより反応により生じた不溶性物質の残渣を除去した。
【００５７】
前の工程より生じた濾液は暗褐色の溶液であり、これを第四（級）アンモニウム（コータミン）で処理した。その結果、極めて大量の（abundant）固体が形成され、これをハイフロー・アース・プレ−レイヤー（Hyflo earth pre-layer）（１００ｇ）を用いて真空濾過することにより単離した。フィルターは蒸留水で十分洗浄した。
【００５８】
イヌリンポリ硫酸−コータミン複合体（-Quartamin complex）を濾材（filtering earths）から慎重に分離し、８０℃において２時間、２０％ＮａＣｌ水溶液で処理した。
【００５９】
２時間の反応が終了した時点で、加熱を停止し、周囲温度が６０℃に達した時点でイソプロパノールを添加した。攪拌を３０分間継続し、そしてその後、混合物を傾瀉用漏斗（decanting funnel）に注ぎ込み、水相を有機相と分離した。
【００６０】
有機相（イソプロパノール＋第四（級）アンモニウム）を廃棄した。水相を真空濾過してハイフロー・アースの残渣を除去した。
【００６１】
メタノール／アセトン混合物を水相に注ぎ込んだ。形成した茶色の沈殿を沈降させた。上澄みを傾瀉により分離し、廃棄した。沈降物をメタノールで洗浄し、その後脱イオン水に溶解した。
【００６２】
得られた溶液のｐＨを１０％ＮａＯＨで１０．５〜１１に調整した。溶液を５０℃まで加熱し、１５分間Ｈ２Ｏ２で処理した。最後に加熱を停止し、この中間物（medium）のｐＨを２％酢酸溶液で５．５に調整した。
【００６３】
変色した溶液が周囲温度に達した時点で１０％メタノール／酢酸ナトリウム溶液を注ぎ込んだ。白色又は僅かに黄色の沈殿が即座に形成し、沈降した。
【００６４】
上澄みを傾瀉により分離し、沈降物をメタノールで十分脱水した。
【００６５】
イヌリン硫酸をＮｏ．３多孔性プレートを用いて真空濾過することにより分離し、メタノール濃度が０．３％以下になるまで３０℃の真空ヒーター中で乾燥した。
【００６６】
生成物は微細な不定形の粉末の形態で生成され、白色又は僅かに黄色であった。
【００６７】
生成したイヌリンポリ硫酸ナトリウム塩における硫酸化度（有機スルファート）の測定
生成物１５０ｍｇを正確に計量し、水に溶解し、得られた溶液を同じ溶媒で２５０ｍＬにした。この溶液５ｍＬをピペットで５０ｍＬビーカーに移し、水２５ｍＬを添加した。０．１％（０．００２７９Ｍ）Ｎ−セチルピリジニウムクロリド（ＣＰＣ）溶液を用いて、４２０ｎｍで光学的に（photometrically）評価した。
【００６８】
スルファート含有量は以下の式を用いて計算した。
【００６９】
【数１】
【００７０】
ここで、
Ｖ：消費された０．１％ＣＰＣ溶液の容量 （ｍＬ）
Ｗ：試料の重量 （ｍｇ）
ＰＰＳ：生成物の乾燥による重量損失（１０５℃、４時間） （％）
得られた硫酸化度：無水物基準で表示して５８．０％、これは完全に硫酸化されたイヌリン分子に相当（全ヒドロキシルのスルホン化）
遊離の残留ピリジン及び塩形態のピリジン：１２７ｐｐｍ（許容限度は２００ｐｐｍ）
遊離の硫酸塩：０．０８％
IR (KBr) cm-1:2900(C-O-H), 1247(S=O), 800(C-S-O)
【００７１】
１−Ｂ：クロロスルホン酸／ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を用いたイヌリンポリ硫酸ナトリウム塩の製造
温度計及び２つの添加漏斗を有する三つ口（three-neck）反応器（２Ｌ）中、乾燥ＤＭＦ１，０００ｍＬを窒素気流下に添加した。溶媒を６℃未満の温度に冷却し、一定攪拌下にクロロスルホン酸１１２ｍＬ（１．６８モル；１．８水酸化当量）を滴下した。
【００７２】
反応器の温度を１５℃まで到達させ、その後乾燥ＤＭＦ４００ｍＬ中イヌリン５２．６ｇの溶液を添加した。反応は３時間未満周囲温度に維持した。
【００７３】
その後、反応混合物を冷水に注ぎ込んだ。得られた溶液のｐＨを３０％ＮａＯＨで７〜８まで上昇させ、その後溶液をメタノール中酢酸ナトリウムの１０％溶液に注ぎ込んだ。沈殿した固体を沈降させ、上澄みから分離した。
【００７４】
ブフナー漏斗を用いながら真空濾過することにより固体を分離した。これをプロセス水（process water）１，５００ｍＬに溶解し、溶液を第四（級）アンモニウム（コータミン）３５０ｍＬで処理した。形成した白色固体を、ハイフロー・アース・プレ−レイヤー（１００ｇ）を用いて真空濾過することにより単離した。
【００７５】
フィルター上に保持された固体をハイフロー・アース・プレ−レイヤーと共に冷媒とメカニカルスターラーを装着した反応器に移し、これに２０％ＮａＣｌ溶液３，０００ｍＬを添加した。混合物を６時間８０℃で攪拌し、次に濾紙を用いて真空加熱濾過した。濾液（Ａ）を確保し、ブフナー漏斗に保持されている固体を再度反応器に移し、全く同じ条件下に複合体分解工程を反復した。この反復で得られた濾液（Ｂ）を（Ａ）と混合し、残存固体を廃棄した。
【００７６】
メタノール／アセトン混合物３．３容量（部）を濾液（Ａ）および（Ｂ）を合わせたものから製造した溶液に注ぎ込んだ。沈殿した固体を沈降させ、上澄みを吸引することにより単離した。沈降物をメタノールで洗浄し、ブフナー漏斗を介して真空脱液し、プロセス水に溶解した。この溶液中のＮａＣｌ含有量を測定し、１０％（ｗ／Ｖ）に調整した。
【００７７】
メタノール／アセトンを用いた沈殿工程を反復し、容器底部に沈着した固体を脱イオン水に溶解した。
【００７８】
この溶液の塩化ナトリウム濃度を２％（ｗ／Ｖ）に調整し、その後メタノール２容量（部）を添加した。混合物を静置した。生成物は容器底部に堆積した。上澄みを吸引することにより分離し、生成物をプロセス水に溶解することにより約５％（ｗ／Ｖ）の濃度を有する溶液を得た。この溶液を再生セルロースメンブレン（フィルター）ＭＷＣＯ（分画分子量）＝５，０００−１，０００Ｄａを通して透析濾過（ダイアフィルトレーション）した。この工程の間に発生した透過物（permeate）は周期的にＡｇＮＯ３で検査した。透析濾過は塩化物分析（chloride assay）が陰性結果を示した時点で終了とみなした。
【００７９】
透析濾過溶液を凍結乾燥した。生成した凍結乾燥物を粉砕して分篩した。イヌリンポリ硫酸ナトリウム塩を白色〜僅かに黄色の不定形の粉末形態として生成した。
【００８０】
［薬理学的実施例］
軟骨の抵抗性及び修復の能力は細胞外マトリックスの、特にアグリカンのプロテオグリカンにより決定される。関節の軟骨細胞によるこれらのアグリカンの合成及びその質は、変形性関節症の発症（development）に関与する主な要因の１つである年齢と共に低下する。
【００８１】
例１：ヒト軟骨細胞の一次培養物中の細胞外アグリカンの合成に対するイヌリンポリ硫酸のインビトロの作用の評価
この手順を本発明の硫酸化多糖類の評価に適用してよい。
【００８２】
１Ａ：３５Ｓの取り込みにより測定したアグリカンのレベル
＜材料及び方法＞
ヒト関節軟骨細胞をＷ．Ｔ．Ｇｒｅｅｎ Ｊｒ．（Ｃｌｉｎ．Ｏｒｔｈｏｐ．，７５，２４８−２６０（１９７１））及びＫ．Ｅ．Ｋｕｅｔｔｎｅｒら（Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，９３，７４３−７５０（１９８２））により記述された方法に従って単離した。
【００８３】
これらの軟骨細胞をＰ．Ｄ．Ｂｅｎｙａらにより記述され（Ｃｅｌｌ，３０，２１５−２２４，（１９８２））、Ｇ．Ｖｅｒｂｒｕｇｇｅｎら（Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．，８，３７１−３７８（１９９０））およびＭ．Ｃｏｒｎｅｌｉｓｓｅｎら（Ｊ．Ｔｉｓｓ．Ｃｕｌｔ．Ｍｅｔｈ．，１５，１３９−１４６（１９９３））により修正された方法に従ってアガロースゲル中で培養した。
【００８４】
アグリカンの合成は放射性前駆体として標識付けされた硫酸ナトリウムＮａ２３５ＳＯ４を用いた３５Ｓの取り込みにより測定した。２週間の培養の後、放射標識前駆体（radio-labelled precursor）１０μＣｉ／ｍＬを種々の濃度（０．０、０．１、０．５、１．０、５．０μｇ／ｍＬ）において試験すべき化合物（化学実施例１におけるイヌリンポリ硫酸）と同様に４８時間培地に導入した。
【００８５】
合成された３５Ｓアグリカンは、再度、細胞内アガロースマトリックス中に部分的に蓄積するか、又はインキュベーション培地中に放出される。
【００８６】
インキュベーション時間終了後、アガロースゲルを機械的に分解し、その後、プロテイナーゼ阻害剤の存在下、０．０６７Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ６．０）中、５０Ｕ／ｍＬアガロース溶液３ｍＬを用いて消化した。
【００８７】
このようにして形成された懸濁液を遠心分離し；領域内マトリックスの３５Ｓアグリカンを含有する上澄み及び細胞外マトリックスに放出された３５Ｓアグリカン代謝産物を含有するインキュベーション培地を、後にクロマトグラフィーを用いて一体にした（united）。
【００８８】
軟骨細胞及び会合した３５Ｓアグリカンを含有する残留物を、プロテイナーゼ阻害剤を含有する０．０５Ｍ酢酸塩緩衝液（ｐＨ５．８）中、４．０Ｍの塩化グアニジウム溶液１ｍＬで４８時間処理した。
【００８９】
この作業の目的は細胞と会合している３５Ｓアグリカンを抽出することである。得られた溶液を遠心分離することにより上澄みから細胞を分離し、これをその後クロマトグラフィーにより分離した。得られた種々の画分に対するクロマトグラフィー作業は、遊離のＮａ２３５ＳＯ４から３５Ｓアグリカンを分離するために０．０１ＭのＮａ２ＳＯ４を含有するリン酸塩緩衝液（ｐＨ６．８）中のセファデックスＧ２５ゲル上で実施した。
【００９０】
得られた巨大分子の溶出液の各々の放射能を測定し、これを初期培養物中に含有されていた軟骨細胞の数と関連付け、１時間当たり軟骨細胞１００万個当たりのアグリカンに取り込まれた３５ＳＯ４のｐｇ（ピコグラム）として表示した。
【００９１】
［結果］
表１、２及び３に結果を示す。
【００９２】
表は再合成されたアグリコンの総生成量における化学実施例１におけるイヌリンポリ硫酸の顕著な有効性を示している（表３）。化学実施例１におけるイヌリンポリ硫酸はまた領域内マトリックス中のアグリカン並びに細胞に会合しているアグリカンの生成を増大させることも可能である（表２）。
【００９３】
至適活性は約０．５μｇ／ｍＬの濃度で観察されている。
【００９４】
【表１】
【００９５】
【表２】
【００９６】
【表３】
【００９７】
１Ｂ：免疫細胞化学により測定したアグリカンのレベル
＜材料及び方法＞
ヒト関節軟骨細胞を単離し、前述した方法に従って培養した。
【００９８】
軟骨細胞に会合したアグリカンの蓄積はＬ．Ｗａｎｇら（Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｃａｒｔ．，９，２４８−２６０（２００１））により記載された免疫細胞化学法を用いて１週間培養後に測定した。軟骨細胞にインターロイキン−１（ＩＬ−１）を投与することにより炎症及び異化の状況をシミュレーションした。化学実施例１のイヌリンポリ硫酸をＩＬ−１と共に添加した。
【００９９】
インキュベーション時間終了後、軟骨細胞を記載した方法に従ってアガロースゲルから遊離させた。軟骨細胞及び会合しているアグリカンをアグリカンの蛋白部分に対して特異的に指向させたモノクローナル抗体を用いてフラックスサイトメトリーにより試験した。
【０１００】
［結果］
表４に結果を示す。
【０１０１】
本表は細胞に会合しているアグリカンの生産に対する化学実施例１のイヌリンポリ硫酸の有効性を確認するものである。
【０１０２】
更にまた、化合物が高用量であるほど細胞に会合したアグリカンの生産の増大が高値であるため、用量作用関係（dose-effect relationship）が存在することがわかる。
【０１０３】
【表４】
【０１０４】
例２：ＩＬ−１αにより誘導されたアグリカン分解を抑制するイヌリンポリ硫酸の能力の［測定］
この手順を本発明の何れかの硫酸化多糖類の評価に適用してよい。
【０１０５】
＜材料及び方法＞
試験はＬＴＣと称されるラット軟骨肉腫細胞系統由来の軟骨細胞培養物に対して実施した。
【０１０６】
ＬＴＣ細胞は重炭酸ナトリウム（３．７ｇ／Ｌ）、グルタミン（２ｍＭ）、アスコルビン酸（５０ｍｇ／Ｌ）、ゲンタマイシン（５０ｍｇ／Ｌ）及びウシ胎児血清ヒアロン（１０％）を添加したｐＨ７．４のＧｉｂｃｏＤＭＥＭ培地（Dulbecco´s Modification of Eagle´s Medium、Ｄｕｌｂｅｃｃｏの変性イーグル培地）（グルコース４．５ｇ／Ｌ含有）中で単層培養において維持した。
【０１０７】
コンフルエントとなったＬＴＣ（the confluent LTC）細胞培養物をトリプシン処理し、培養物０．５ｍＬ当たり４０，０００個の細胞を４８穴（well）プレートに播種した。これを５日間維持し、その間、各ウェルにグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）１５〜３０μｇを付着させた。
【０１０８】
培地を分離し、細胞の膜を異化培地｛重炭酸ナトリウム（３．７ｇ／Ｌ）、グルタミン（２ｍＭ）および１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１α（インターロイキン−１α）を添加したＤＭＥＭ＋４．５ｇ／Ｌグルコース、ｐＨ７．４｝５×１ｍＬを添加することにより洗浄した。その後、培養をこの培地２００μＬ中に維持し、４日間、化学実施例１のイヌリンポリ硫酸ナトリウム塩を添加又は無添加として、３７℃で培地を交換することなく行った。
【０１０９】
イヌリンポリ硫酸ナトリウム塩のアグリカン分解に対する作用を確認するために、ウエスタンブロット（Western Blot）を行った。
【０１１０】
ウエスタンブロットのためにｐＨ７．３の５０ｍＭトリス酢酸塩２０μＬを各ウェルに添加した。培養物（培地＋細胞の膜）を４時間３７℃でコンドロイチナーゼＡＢＣ５０ｍＵを用いて脱グリコシル化した。その後各ウェルの試料を回収し、１０分間１，４６０ｇで遠心分離した。上澄み２５μＬ画分を電気泳動で分離し（ゲル勾配８〜１２％ＳＤＳ ＰＡＧＥ）、抗アグリカン抗体Ｇ１を用いてウエスタンブロットにより分析した。Ｇ１はやはり抗ＮＩＴＧＥネオエピトープ特異性（neo-epiyope-specific）抗体を用いた免疫反応性により確認されたアグリカナーゼ活性の生成物である。抗血清を１：５，０００希釈で使用し、パーオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗−（ウサギＩｇＧ）はＡｍｅｒｓｈａｍＥＣＬキットを用いて検出した。
【０１１１】
［結果］
これは図１に示す通りであり、ここではウエスタンブロットを示すが、これはラット軟骨肉腫軟骨細胞培養に対して適用した種々の投与の結果を示している。この図において、ＩＬ−１αを軟骨細胞に投与したところアグリカン分解の増大が生じ、抗体ＮＩＴＧＥ Ｇ１で標識付けされたアグリカンフラグメントのバンドがより濃くなっている。一方、培養物にＩＬ−１αの存在下又は非存在下に化学実施例１のイヌリンポリ硫酸を投与したところ、アグリカンの分解は抑制され、上記したバンドはほぼ消失するまで狭小化した。結果として、イヌリンポリ硫酸は軟骨細胞培養物のアグリカン分解を低減することができ、この理由のため、変形性関節症を有する患者の症例における細胞外マトリックスの分解も停止できることになる。
【図面の簡単な説明】
【０１１２】
【図１】ウエスタンブロットを示す図である。上側の矢印は未損傷のアグリカンの領域を示し、下側の矢印は抗体ＮＩＴＧＥ Ｇ１で標識したアグリカンフラグメントの領域を示す。ウェルの第１番目には対照試料（無投与）；第２番目にはインターロイキン−１（ＩＬ−１α）を投与した試料；第３番目には化学実施例１のイヌリンポリ硫酸１００μｇ／ｍｌを投与した試料；そして第４番目にはＩＬ−１αおよび化学実施例１のイヌリンポリ硫酸１００μｇ／ｍｌを投与した試料を播種した。
【技術分野】
【０００１】
本発明は変形性関節症（arthrosis、関節症と称する場合もある）の治療又は予防のための医薬の製造のための硫酸化多糖類（sulphated polysaccharide）の使用に関する。同様に、本発明は変形性関節症の治療又は予防のための医薬の製造のための硫酸化オリゴ糖類（sulphated oligosaccharide）の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨関節炎（osteoarthritis）としても知られている、変形性関節症は、６５歳以上の大部分の人々に影響を及ぼす変形性関節疾患（degenerative joint disease）であり、炎症及び疼痛の存在を伴った軟骨組織の段階的な変形を特徴とする。炎症は特に疾患が進行段階にある場合に生じ、そして関節リューマチ（rheumatoid arthritis、慢性関節リューマチと称する場合もある）で観察される炎症とは性質が異なっており、一般的には変形性関節症の僅かな要素（minority component）に過ぎない。変形性関節症はまた硝子軟骨および／または関節軟骨（hyaline articular cartilage）の変形としても定義される。その二次的な作用は、滑膜および肋軟骨下骨への影響（affectation）並びに関節表面の辺縁部（the margins）の新骨の形成である。変形性関節症の病因論は知られておらず、そしてその進展（evolution）はゆっくりである。
【０００３】
軟骨は骨を、相互に滑らせて動かす。軟骨はまた物理的運動により生じる応力を吸収する。変形性関節症においては、軟骨表面が破壊され磨耗しており、骨を相互に対抗する(against)ように運動させ、これが摩擦（friction）、疼痛（pain）、浮腫（swelling）及び関節運動の消失（loss of joint movement）を誘発する。経時的に関節が変形する（deform）場合がある。
【０００４】
変形性関節症の診断の一助として、主に２種の手法、即ち、関節での骨の変化を発見するための最も単純な方法であるＸ線、及びこれとは異なり全ての関節成分を同時に目視可能とする核磁気共鳴（ＮＭＲ）が用いられている。
【０００５】
正常な状態においては、軟骨の更新（renewal）は極めてゆっくりとした過程であり、これは細胞外マトリックス成分の一定の合成（同化作用）及び分解（異化作用）を含む。軟骨細胞は協調されなければならないこの代謝に関与する細胞である。
【０００６】
病理的な状態においては、軟骨の更新が加速されるため、この過程は改変されるが、これが軟骨細胞の同化作用と異化作用のプログラムの間の不均衡により生じる軟骨性組織の早発性の修復（precocious repair）をもたらし、これが軟骨の分解（degradation）を誘発する。修復反応は軟骨細胞による軟骨細胞外マトリックス成分の合成における増大を伴ったこれらの細胞の過剰な増殖（hyperproliferation）の結果である（Ｄ．Ｈａｍｅｒｍａｍら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３２０，１３２２−１３３０（１９８９））。したがって、このホメオスタシス反応（homeostatic reaction）を制御し、そして全身性のホルモン（systemic hormones）及び加齢と共に分泌が減少する成長因子に依存している軟骨の合成と分解との間の均衡が存在する。軟骨の分解は近接する組織の生産する酵素およびフリーラジカルにより調節（regulate）されるが、軟骨細胞自身によっても調節される。
【０００７】
発明者らは変形性関節症のための以下に示す一般的な薬理学的治療（薬）に焦点をあてた。
【０００８】
急速な作用を有する対症作用物質（symptomatic-action substances）、例えば鎮痛剤、非ステロイド抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）、コルチコイド及びシクロオキシゲナーゼ２阻害剤（cyclo-oxygenase 2 inhibitors、ＣＯＸ−２）。
【０００９】
ＳＹＳＡＤＯＡ（Symptomatic Slow Acting Drug for Osteoarthritis：変形性関節症治療用遅効性薬剤）として知られている、より緩徐な態様で作用する、例えばヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸（塩）（chondroitin sulphate、硫酸コンドロイチンとも称する）及びグルコサミン硫酸（塩）（glucosamine sulphate、硫酸グルコサミンとも称する）を含む、対症作用物質（Ｍ．Ｇ．Ｌｅｑｕｅｓｎｅ， Ｒｅｖ．Ｒｈｕｍ．（Ｅｎｇ．／Ｅｄ．），６１，６９−７３（１９９４））。このグループは作用が投与２〜３週の後に始まり、投与終了後２〜６ヶ月間持続することを特徴としている。
【００１０】
本発明の硫酸化多糖類に関する他の用途については文献中に記述が存在している。
【００１１】
Ｒ．Ｖ．Ｊｏｎｅｓはアルカリ金属を用いたイヌリン硫酸塩（inulin sulphate salts、硫酸イヌリン塩とも称する）の製造方法を開示している（ＵＳ２，６８６，７７９）。該特許において、種々の硫酸化度（sulphation）を有するイヌリン硫酸アルカリ塩（inulin sulphate alkaline salts）がペースト濃化剤（paste thickener）、接着剤及び油田採掘で使用する土壌添加剤など化学産業に適用されることが強調されている。
【００１２】
イヌリン硫酸（塩）は抗凝固性（anti-coagulant）を示し（Ａｒｋｉｖ ｆｏｒ ｋｅｍｉ，ｍｉｎｅｒａｌｏｇｉ ｏ．ｇｅｏｌｏｇｉ．，Ｂｄ ２４Ｂ（５），１−４（１９４６））、また、抗脂血活性（antilipemic activity）を示す（Ａｒｃｈ．Ｉｎｔ．Ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎ，ＸＣＩＸ，３３４（１９５４））ことが記載されている。
【００１３】
Ｖ．Ｇ．Ｎａｉｒらは、イヌリンポリ硫酸塩（inulin polysulphate salts、ポリ硫酸イヌリン塩とも称する）（完全硫酸化(completely sulphated)）が彼らの発明によれば、関節リューマチ、全身性エリテマトーデス（systemic erythematous lupus）、特定の型の血管炎（vasculitis）等のような疾患の治療に使用できるような、補体抑制活性（complement-inhibiting activity）を有することを明らかにしている（ＵＳ４，０２１，５４５）。
【００１４】
Ｇ．Ｆｒａｎｚらはプルラン硫酸（塩）（pullulan sulphate、硫酸プルランとも称する）の抗凝固及び抗血栓（anti-thrombotic）活性について記載している（Ｂｉｏａｃｔｉｖｅ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ， ４７−５８， Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ，２０００）。
【００１５】
Ｃ．Ｃ．Ｌｅｅは実施例において記載していないものの、天然の潤滑液を補うためにカラギーナンを含有してよい注射可能な組成物について特許請求の範囲に記載している（ＥＰ４９９．１６４）。この引用文献においてカラギーナンポリ硫酸（塩）（carrageenan polysulphate、ポリ硫酸カラギーナンとも称する）の記載は無い。
【００１６】
Ｔ．Ｋａｎａｍａｒｕらはカードラン硫酸（塩）（curdlan sulphate、硫酸カードランとも称する）が血管新生抑制剤（angiostatic agent）であることを開示している（ＵＳ５，１３５，９２０）。Ｓ．Ａｌｂａｎらは同化合物が抗凝固剤及び抗血栓剤として作用することについて記載している（Ｔｈｒｏｍｂ． Ｒｅｓ． ７８（３），２０１−１０（１９９５））。
【００１７】
Ｔ．Ｈａｔａらは化粧品製剤中の保湿剤（moisturising agent）としての硫酸化アルギン酸（alginic acid sulphate、アルギン酸スルファートとも称する）の適用を示している（ＪＰ０４２５７５０９）。Ｌ．Ｌａｎｇｅらは膵臓コレステロール（pancreatic cholesterol）の抑制のための硫酸化アルギン酸塩（alginate sulphate、硫酸アルギネートとも称する）の使用を記載している（ＥＳ２．０６４．７３６）。
【００１８】
Ｅ．Ｂｅｓｔｅｒｍａｎは多糖類、ラミナリン硫酸（塩）（polysaccharide laminarin sulphate、硫酸ラミナリンとも称する）が抗脂血活性（antilipemic activity）を示すことを記載している（Ｂｒｉｔ．Ｍｅｄ．Ｊ．，３１０（１９５７，Ｉ））。Ｈ．Ｑ．Ｍｉａｏらはラミナリン硫酸（塩）の抗転移（anti-metastatic）活性を明らかにしている（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，８３（３），４２４−３１（１９９９））。Ｐ．Ｂｏｈｌｅｎらは請求項（クレイム）に、糖尿病又は関節炎（arthritis）に、中でも炎症過程（inflammatory processes）に関連するヘパラナーゼ活性を多糖類、ラミナリン硫酸（塩）が阻害することを記載している（ＷＯ０３／００６６４５）。
【００１９】
Ｌ．Ｌａｎｇｅらは多糖類、ペクチン硫酸（塩）（polysaccharide pectin sulphate、硫酸ペクチンとも称する）が高い血中コレステロール濃度を治療するために有用であることを明らかにしている（ＥＳ２．０６４．７３６）。
【００２０】
【特許文献１】米国特許第２，６８６，７７９号明細書
【特許文献２】米国特許第４，０２１，５４５号明細書
【特許文献３】米国特許第５，１３５，９２０号明細書
【特許文献４】特開平４−２５７５０９号公報
【特許文献５】国際公開第０３／００６６４５号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
これまで、変形性関節症の治療又は予防における何れかの硫酸化度のイヌリン硫酸（塩）、ゲラン硫酸（塩）（gellan sulphate、硫酸ゲランとも称する）、プルラン硫酸（塩）、カードラン硫酸（塩）、硫酸化アルギン酸、ラミナリン硫酸（塩）及びペクチン硫酸（塩）、又は、カラギーナンポリ硫酸（塩）の使用の記載は発見されていない。
【００２２】
これまで、本発明者らは変形性関節症の治療又は予防における上記硫酸化多糖類に相当する硫酸化オリゴ糖の使用の如何なる記載も発見していない。
【００２３】
上記全てより、本発明者らは変形性関節症の治療のための有用な薬剤を提供することはなお治療上の課題であると結論した。
【００２４】
本発明により解決される課題は変形性関節症の治療又は予防において使用される、代替となる硫酸化多糖類を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２５】
本発明の第１の特徴に相当する解決法は、哺乳類における変形性関節症の治療又は予防のための医薬の製造のための、イヌリン硫酸、ゲラン硫酸、プルラン硫酸、カードラン硫酸、硫酸化アルギン酸、ラミナリン硫酸及びペクチン硫酸からなる群より選択される、酸の形態の硫酸化多糖類又はその生理学的に許容される塩の使用を指す。
【００２６】
好ましい実施の形態においては、硫酸化多糖類はイヌリン硫酸、ゲラン硫酸、プルラン硫酸及びカードラン硫酸からなる群より選択される。これらのうち、最も好ましいものはイヌリン硫酸およびゲラン硫酸である。
【００２７】
より好ましい実施の形態においては、硫酸化多糖類は、アルカリ金属又はアルカリ土類金属で完全又は部分的に塩化（salify）されている。好ましくは、アルカリ金属はナトリウムであり、そして好ましい多糖類はイヌリン硫酸ナトリウム塩（inulin sulphate sodium salt）である。多糖類、ゲラン硫酸ナトリウム塩も同様に好ましい。
【００２８】
無水物基準で（on anhydrous base）２５％〜６２％の硫酸化度を示すイヌリン硫酸ナトリウム塩がより好ましい。
【００２９】
硫酸化度が無水物基準で５５％〜６２％であるイヌリン硫酸ナトリウム塩が更に好ましい。
【００３０】
別の同様に好ましい実施の形態において、硫酸化多糖類は部分的に加水分解されている。
【００３１】
別の同様に好ましい実施の形態において、硫酸化多糖類はイヌリンポリ硫酸（inulin polysulphate、ポリ硫酸イヌリンとも称する、以下同様）、ゲランポリ硫酸、プルランポリ硫酸、カードランポリ硫酸、ポリ硫酸化アルギン酸、ラミナリンポリ硫酸及びペクチンポリ硫酸からなる群から選択される多硫酸化多糖類（polysulphated polysaccharide）である。これらのうち、最も好ましいものはイヌリンポリ硫酸であり、好ましくは、イヌリンポリ硫酸ナトリウム塩である。同様に好ましいものはゲランポリ硫酸、好ましくは、ゲランポリ硫酸ナトリウム塩である。
【００３２】
本発明の別の特徴は、哺乳類における変形性関節症の治療又は予防のための医薬の製造のためのカラギーナンポリ硫酸の使用である。
【００３３】
本発明の別の特徴は哺乳類における変形性関節症の治療又は予防のための医薬の製造に対する、イヌリン、ゲラン、プルラン、カードラン、アルギン酸、ラミナリン及びペクチンからなる群より選択される多糖類から誘導した、酸の形態の硫酸化オリゴ糖又はその生理学的に許容される塩の使用である。好ましくは、硫酸化オリゴ糖はイヌリンから誘導される。同様に好ましくは、硫酸化オリゴ糖はゲランから誘導される。
【００３４】
好ましい実施の形態においては、硫酸化オリゴ糖は多硫酸化オリゴ糖である。
【００３５】
本発明の別の特徴は、哺乳類における変形性関節症の治療又は予防のための医薬の製造に対する、自身の構造がイヌリン硫酸、ゲラン硫酸、プルラン硫酸、カードラン硫酸、硫酸化アルギン酸、ラミナリン硫酸及びペクチン硫酸からなる群より選択される硫酸化多糖類の構造の部分に相当する、化学合成により製造された、酸の形態の硫酸化オリゴ糖又はその生理学的に許容される塩の使用である。
【００３６】
特に好ましい実施の形態においては、医薬は経口投与に適応する。
【００３７】
同様に、特に好ましい実施の形態においては、薬剤は関節内投与に適応する。
【００３８】
本発明の硫酸化多糖類はよく知られており、そして、多糖類構造中、すなわちイヌリン、ゲラン、プルラン、カードラン、アルギン酸、ラミナリン及びペクチン中に存在する遊離のヒドロキシル基の部分的又は完全なスルホン化（sulphonation）により製造してよい。カラギーナンポリ硫酸はカラギーナン中に存在する遊離のヒドロキシルの全スルホン化により製造する。
【００３９】
ヒドロキシル基のスルホン化により、対応するスルファート基が生じる。
【００４０】
カラギーナンはその構造内に既に数個のスルファート基を含有している。本発明においてはカラギーナンポリ硫酸を使用する。
【００４１】
本明細書において硫酸化度（the degree of sulphation）に言及する場合は、これは（分子に関して）無水物基準のスルファート基の％を指す。
【００４２】
本明細書において硫酸化多糖類に言及する場合は、これは何れかの硫酸化度を有する硫酸化多糖類に関する。文献においては、高い硫酸化度を有する硫酸化多糖類は通常は多硫酸化多糖類と称されており、そして当然ながら、多糖類が完全に硫酸化されている場合は、やはり多硫酸化多糖類と称される。結果として、本発明は多硫酸化多糖類（イヌリンポリ硫酸、カラギーナンポリ硫酸、ゲランポリ硫酸、プルランポリ硫酸、カードランポリ硫酸、ポリ硫酸化アルギン酸（アルギン酸ポリスルファートとも称する）、ラミナリンポリ硫酸及びペクチンポリ硫酸）を包含する。
【００４３】
硫酸化多糖類は文献記載の操作法、例えば、クロロスルホン酸／ピリジンを用いることによる方法（Ｔ．Ａｓｔｒｕｐら、Ａｃｔａ Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｓｃａｎｄ．，８，２１５−２２６（１９４４））、また他には、クロロスルホン酸／ジメチルホルムミドを用いることによる方法（Ｐ．Ｖｏｎｇｃｈａｎ，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３３７，１２３９−１２４２（２００２））、また他には、ピペリジン−Ｎ−スルホン酸を用いる方法（Ｎ．Ｋｉｎｚｏら、Ｃａｒｂｏｈｙｄ．Ｒｅｓ．，２１，４２０−４２６（１９７２））、また他には、３酸化イオウ−ピリジン複合体（the sulphur trioxide-pyridine complex）を用いる方法（Ｃ．Ｍａｈｎｅｒら、Ｃａｒｂｏｈｙｄ．Ｒｅｓ．，３３１，２０３−２０８（２００１））により、上述した市販の多糖類中の遊離ヒドロキシルの部分的又は完全なスルホン化により製造してよい。
【００４４】
種々の硫酸化度を得るために（試薬濃度、反応温度、反応時間等を変更し）、上述の操作法を改変してもよい。更にまた所望により、異なる多糖類ヒドロキシルを多糖類ヒドロキシルの保護／脱保護により選択的にスルホン化してよい。
【００４５】
原料多糖類の平均分子量が高すぎる場合は、所望によりスルホン化の前後に部分的に加水分解することができる。
【００４６】
本発明において使用される硫酸化オリゴ糖は市販の多糖類の酵素的又は化学的な加水分解（文献既知の操作法）とその後のスルホン化によるか、又は、硫酸化多糖類の酵素的又は化学的加水分解により直接製造してよい。それらはまた化学合成により製造してよい。
【００４７】
本明細書において生理学的に許容される塩について言及する場合は、これは例えばナトリウム又はカリウムのようなアルカリ金属の塩、例えばカルシウム又はマグネシウムのようなアルカリ土類金属の塩、又は、例えばトリメチルアミンを有する塩、トリエチルアミンを有する塩、又は、例えばリジン、アルギニン、プロリン、グリシンまたはセリンのようなアミノ酸を有する塩、のような有機塩、を指す。
【００４８】
硫酸化多糖類の塩化は、単純なよく知られた化学的操作法により行ってよい。
【００４９】
変形性関節症の治療又は予防に使用するためには、本発明の硫酸化多糖類は、酸形態又はその生理学的に許容される塩のいずれの場合も、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｈａｎｄｂｏｏｃｋ， Ｍａｃｋ Ｐｕｂ．Ｃｏ．，Ｎ．Ｙ．，ＵＳＡに記載されているもののような従来の手法及び賦形剤又は担体を用いて、適切な医薬組成物中に製剤される。
【００５０】
本発明の医薬組成物は所望の用量において患者に投与してよい。組成物の投与は種々の手段、例えば経口、静脈内、腹腔内、関節内、皮下、筋肉内、局所、舌下、皮内又は鼻腔内に対して行ってよい。本発明の医薬組成物は酸の形態において、又は生理学的に許容されるその塩として、硫酸化多糖類の治療的有効量を含み、その量は多くの要因、例えば患者の身体的状態、年齢、性別、特定の化合物（specific compound）、投与手段及び当該分野でよく知られた他の要因により異なる。更にまた、活性化合物の用量（dosage）は所望の治療効果を得るために単回又は複数回の用量（single- or multiple-dose units）において投与してよい。所望により、他の治療薬を本発明により提供されるものと組み合わせて使用してよい。
【００５１】
一般的に、本発明の医薬品調製物は固体又は液体の形態、又は、ゲルの形態となる。本発明に従って製造してよい固体形態の医薬品調製物は粉末、微細顆粒（ペレット）、丸薬、分散性顆粒（dispersible granules）、カプセル、坐剤及び他の固体の生薬形態を包含する。液体形態の調製物は溶液、懸濁液、乳液及びマイクロスフィアを包含する。使用直前に経口、非経口（parenteral）又は関節内投与用の液体調製物に変換してよい固体形態の調製物もまた意図される。このような液体形態には溶液、懸濁液及び乳液が包含される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５２】
以下の実施例は例示に過ぎず、本発明の範囲を限定するものではない。
【００５３】
［化学実施例］
例１：イヌリンポリ硫酸ナトリウム塩の製造
１−Ａ：クロロスルホン酸／ピリジンを用いたイヌリンポリ硫酸ナトリウム塩の製造
６℃未満の温度で一定の攪拌下に、クロロスルホン酸８８ｍＬ（１．３２モル；１．８水酸化当量（ｅｑ／ＯＨ））を乾燥ピリジン５８０ｍＬ（７．２０モル）に滴下した。得られた混合物を７５℃まで加熱し、その後イヌリン（Ｆｉｂｒｕｌｉｎｅ Ｓｔａｎｄａｒ，Ｔｒａｄｅｓ Ｓ．Ａ．より販売）４０ｇ（０．２５モル）を添加した。攪拌及び１００℃加熱を５時間継続した。その後、反応混合物を約５０℃まで放冷し、そして脱イオン水５０ｍＬを添加することにより過剰なクロロスルホン酸を破壊（destroy）した。この工程の間、周囲温度は僅かに上昇し、２層が生じた。
【００５４】
粗製の反応生成物を周囲温度に到達するまで放置した。上方の（ピリジン）層を吸引により分離し、一方、下方の油層はメタノール中の酢酸ナトリウム１０％溶液に注ぎこんだ。形成した沈殿を沈降させた。上澄みを傾瀉（decanting）により分離し、廃棄した。
【００５５】
この酢酸ナトリウム・メタノール溶液を用いた処理を２回反復し、最終工程において、ｋ−１００深型フィルター（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ．Ｓｅｉｔｚ−ｋ−１００）を用いて真空濾過することにより固体を分離した。
【００５６】
濾過物（茶色固体）を蒸留水に溶解させて、得られた溶液をｋ−１００深型フィルターで真空濾過することにより反応により生じた不溶性物質の残渣を除去した。
【００５７】
前の工程より生じた濾液は暗褐色の溶液であり、これを第四（級）アンモニウム（コータミン）で処理した。その結果、極めて大量の（abundant）固体が形成され、これをハイフロー・アース・プレ−レイヤー（Hyflo earth pre-layer）（１００ｇ）を用いて真空濾過することにより単離した。フィルターは蒸留水で十分洗浄した。
【００５８】
イヌリンポリ硫酸−コータミン複合体（-Quartamin complex）を濾材（filtering earths）から慎重に分離し、８０℃において２時間、２０％ＮａＣｌ水溶液で処理した。
【００５９】
２時間の反応が終了した時点で、加熱を停止し、周囲温度が６０℃に達した時点でイソプロパノールを添加した。攪拌を３０分間継続し、そしてその後、混合物を傾瀉用漏斗（decanting funnel）に注ぎ込み、水相を有機相と分離した。
【００６０】
有機相（イソプロパノール＋第四（級）アンモニウム）を廃棄した。水相を真空濾過してハイフロー・アースの残渣を除去した。
【００６１】
メタノール／アセトン混合物を水相に注ぎ込んだ。形成した茶色の沈殿を沈降させた。上澄みを傾瀉により分離し、廃棄した。沈降物をメタノールで洗浄し、その後脱イオン水に溶解した。
【００６２】
得られた溶液のｐＨを１０％ＮａＯＨで１０．５〜１１に調整した。溶液を５０℃まで加熱し、１５分間Ｈ２Ｏ２で処理した。最後に加熱を停止し、この中間物（medium）のｐＨを２％酢酸溶液で５．５に調整した。
【００６３】
変色した溶液が周囲温度に達した時点で１０％メタノール／酢酸ナトリウム溶液を注ぎ込んだ。白色又は僅かに黄色の沈殿が即座に形成し、沈降した。
【００６４】
上澄みを傾瀉により分離し、沈降物をメタノールで十分脱水した。
【００６５】
イヌリン硫酸をＮｏ．３多孔性プレートを用いて真空濾過することにより分離し、メタノール濃度が０．３％以下になるまで３０℃の真空ヒーター中で乾燥した。
【００６６】
生成物は微細な不定形の粉末の形態で生成され、白色又は僅かに黄色であった。
【００６７】
生成したイヌリンポリ硫酸ナトリウム塩における硫酸化度（有機スルファート）の測定
生成物１５０ｍｇを正確に計量し、水に溶解し、得られた溶液を同じ溶媒で２５０ｍＬにした。この溶液５ｍＬをピペットで５０ｍＬビーカーに移し、水２５ｍＬを添加した。０．１％（０．００２７９Ｍ）Ｎ−セチルピリジニウムクロリド（ＣＰＣ）溶液を用いて、４２０ｎｍで光学的に（photometrically）評価した。
【００６８】
スルファート含有量は以下の式を用いて計算した。
【００６９】
【数１】
【００７０】
ここで、
Ｖ：消費された０．１％ＣＰＣ溶液の容量 （ｍＬ）
Ｗ：試料の重量 （ｍｇ）
ＰＰＳ：生成物の乾燥による重量損失（１０５℃、４時間） （％）
得られた硫酸化度：無水物基準で表示して５８．０％、これは完全に硫酸化されたイヌリン分子に相当（全ヒドロキシルのスルホン化）
遊離の残留ピリジン及び塩形態のピリジン：１２７ｐｐｍ（許容限度は２００ｐｐｍ）
遊離の硫酸塩：０．０８％
IR (KBr) cm-1:2900(C-O-H), 1247(S=O), 800(C-S-O)
【００７１】
１−Ｂ：クロロスルホン酸／ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を用いたイヌリンポリ硫酸ナトリウム塩の製造
温度計及び２つの添加漏斗を有する三つ口（three-neck）反応器（２Ｌ）中、乾燥ＤＭＦ１，０００ｍＬを窒素気流下に添加した。溶媒を６℃未満の温度に冷却し、一定攪拌下にクロロスルホン酸１１２ｍＬ（１．６８モル；１．８水酸化当量）を滴下した。
【００７２】
反応器の温度を１５℃まで到達させ、その後乾燥ＤＭＦ４００ｍＬ中イヌリン５２．６ｇの溶液を添加した。反応は３時間未満周囲温度に維持した。
【００７３】
その後、反応混合物を冷水に注ぎ込んだ。得られた溶液のｐＨを３０％ＮａＯＨで７〜８まで上昇させ、その後溶液をメタノール中酢酸ナトリウムの１０％溶液に注ぎ込んだ。沈殿した固体を沈降させ、上澄みから分離した。
【００７４】
ブフナー漏斗を用いながら真空濾過することにより固体を分離した。これをプロセス水（process water）１，５００ｍＬに溶解し、溶液を第四（級）アンモニウム（コータミン）３５０ｍＬで処理した。形成した白色固体を、ハイフロー・アース・プレ−レイヤー（１００ｇ）を用いて真空濾過することにより単離した。
【００７５】
フィルター上に保持された固体をハイフロー・アース・プレ−レイヤーと共に冷媒とメカニカルスターラーを装着した反応器に移し、これに２０％ＮａＣｌ溶液３，０００ｍＬを添加した。混合物を６時間８０℃で攪拌し、次に濾紙を用いて真空加熱濾過した。濾液（Ａ）を確保し、ブフナー漏斗に保持されている固体を再度反応器に移し、全く同じ条件下に複合体分解工程を反復した。この反復で得られた濾液（Ｂ）を（Ａ）と混合し、残存固体を廃棄した。
【００７６】
メタノール／アセトン混合物３．３容量（部）を濾液（Ａ）および（Ｂ）を合わせたものから製造した溶液に注ぎ込んだ。沈殿した固体を沈降させ、上澄みを吸引することにより単離した。沈降物をメタノールで洗浄し、ブフナー漏斗を介して真空脱液し、プロセス水に溶解した。この溶液中のＮａＣｌ含有量を測定し、１０％（ｗ／Ｖ）に調整した。
【００７７】
メタノール／アセトンを用いた沈殿工程を反復し、容器底部に沈着した固体を脱イオン水に溶解した。
【００７８】
この溶液の塩化ナトリウム濃度を２％（ｗ／Ｖ）に調整し、その後メタノール２容量（部）を添加した。混合物を静置した。生成物は容器底部に堆積した。上澄みを吸引することにより分離し、生成物をプロセス水に溶解することにより約５％（ｗ／Ｖ）の濃度を有する溶液を得た。この溶液を再生セルロースメンブレン（フィルター）ＭＷＣＯ（分画分子量）＝５，０００−１，０００Ｄａを通して透析濾過（ダイアフィルトレーション）した。この工程の間に発生した透過物（permeate）は周期的にＡｇＮＯ３で検査した。透析濾過は塩化物分析（chloride assay）が陰性結果を示した時点で終了とみなした。
【００７９】
透析濾過溶液を凍結乾燥した。生成した凍結乾燥物を粉砕して分篩した。イヌリンポリ硫酸ナトリウム塩を白色〜僅かに黄色の不定形の粉末形態として生成した。
【００８０】
［薬理学的実施例］
軟骨の抵抗性及び修復の能力は細胞外マトリックスの、特にアグリカンのプロテオグリカンにより決定される。関節の軟骨細胞によるこれらのアグリカンの合成及びその質は、変形性関節症の発症（development）に関与する主な要因の１つである年齢と共に低下する。
【００８１】
例１：ヒト軟骨細胞の一次培養物中の細胞外アグリカンの合成に対するイヌリンポリ硫酸のインビトロの作用の評価
この手順を本発明の硫酸化多糖類の評価に適用してよい。
【００８２】
１Ａ：３５Ｓの取り込みにより測定したアグリカンのレベル
＜材料及び方法＞
ヒト関節軟骨細胞をＷ．Ｔ．Ｇｒｅｅｎ Ｊｒ．（Ｃｌｉｎ．Ｏｒｔｈｏｐ．，７５，２４８−２６０（１９７１））及びＫ．Ｅ．Ｋｕｅｔｔｎｅｒら（Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，９３，７４３−７５０（１９８２））により記述された方法に従って単離した。
【００８３】
これらの軟骨細胞をＰ．Ｄ．Ｂｅｎｙａらにより記述され（Ｃｅｌｌ，３０，２１５−２２４，（１９８２））、Ｇ．Ｖｅｒｂｒｕｇｇｅｎら（Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．，８，３７１−３７８（１９９０））およびＭ．Ｃｏｒｎｅｌｉｓｓｅｎら（Ｊ．Ｔｉｓｓ．Ｃｕｌｔ．Ｍｅｔｈ．，１５，１３９−１４６（１９９３））により修正された方法に従ってアガロースゲル中で培養した。
【００８４】
アグリカンの合成は放射性前駆体として標識付けされた硫酸ナトリウムＮａ２３５ＳＯ４を用いた３５Ｓの取り込みにより測定した。２週間の培養の後、放射標識前駆体（radio-labelled precursor）１０μＣｉ／ｍＬを種々の濃度（０．０、０．１、０．５、１．０、５．０μｇ／ｍＬ）において試験すべき化合物（化学実施例１におけるイヌリンポリ硫酸）と同様に４８時間培地に導入した。
【００８５】
合成された３５Ｓアグリカンは、再度、細胞内アガロースマトリックス中に部分的に蓄積するか、又はインキュベーション培地中に放出される。
【００８６】
インキュベーション時間終了後、アガロースゲルを機械的に分解し、その後、プロテイナーゼ阻害剤の存在下、０．０６７Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ６．０）中、５０Ｕ／ｍＬアガロース溶液３ｍＬを用いて消化した。
【００８７】
このようにして形成された懸濁液を遠心分離し；領域内マトリックスの３５Ｓアグリカンを含有する上澄み及び細胞外マトリックスに放出された３５Ｓアグリカン代謝産物を含有するインキュベーション培地を、後にクロマトグラフィーを用いて一体にした（united）。
【００８８】
軟骨細胞及び会合した３５Ｓアグリカンを含有する残留物を、プロテイナーゼ阻害剤を含有する０．０５Ｍ酢酸塩緩衝液（ｐＨ５．８）中、４．０Ｍの塩化グアニジウム溶液１ｍＬで４８時間処理した。
【００８９】
この作業の目的は細胞と会合している３５Ｓアグリカンを抽出することである。得られた溶液を遠心分離することにより上澄みから細胞を分離し、これをその後クロマトグラフィーにより分離した。得られた種々の画分に対するクロマトグラフィー作業は、遊離のＮａ２３５ＳＯ４から３５Ｓアグリカンを分離するために０．０１ＭのＮａ２ＳＯ４を含有するリン酸塩緩衝液（ｐＨ６．８）中のセファデックスＧ２５ゲル上で実施した。
【００９０】
得られた巨大分子の溶出液の各々の放射能を測定し、これを初期培養物中に含有されていた軟骨細胞の数と関連付け、１時間当たり軟骨細胞１００万個当たりのアグリカンに取り込まれた３５ＳＯ４のｐｇ（ピコグラム）として表示した。
【００９１】
［結果］
表１、２及び３に結果を示す。
【００９２】
表は再合成されたアグリコンの総生成量における化学実施例１におけるイヌリンポリ硫酸の顕著な有効性を示している（表３）。化学実施例１におけるイヌリンポリ硫酸はまた領域内マトリックス中のアグリカン並びに細胞に会合しているアグリカンの生成を増大させることも可能である（表２）。
【００９３】
至適活性は約０．５μｇ／ｍＬの濃度で観察されている。
【００９４】
【表１】
【００９５】
【表２】
【００９６】
【表３】
【００９７】
１Ｂ：免疫細胞化学により測定したアグリカンのレベル
＜材料及び方法＞
ヒト関節軟骨細胞を単離し、前述した方法に従って培養した。
【００９８】
軟骨細胞に会合したアグリカンの蓄積はＬ．Ｗａｎｇら（Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｃａｒｔ．，９，２４８−２６０（２００１））により記載された免疫細胞化学法を用いて１週間培養後に測定した。軟骨細胞にインターロイキン−１（ＩＬ−１）を投与することにより炎症及び異化の状況をシミュレーションした。化学実施例１のイヌリンポリ硫酸をＩＬ−１と共に添加した。
【００９９】
インキュベーション時間終了後、軟骨細胞を記載した方法に従ってアガロースゲルから遊離させた。軟骨細胞及び会合しているアグリカンをアグリカンの蛋白部分に対して特異的に指向させたモノクローナル抗体を用いてフラックスサイトメトリーにより試験した。
【０１００】
［結果］
表４に結果を示す。
【０１０１】
本表は細胞に会合しているアグリカンの生産に対する化学実施例１のイヌリンポリ硫酸の有効性を確認するものである。
【０１０２】
更にまた、化合物が高用量であるほど細胞に会合したアグリカンの生産の増大が高値であるため、用量作用関係（dose-effect relationship）が存在することがわかる。
【０１０３】
【表４】
【０１０４】
例２：ＩＬ−１αにより誘導されたアグリカン分解を抑制するイヌリンポリ硫酸の能力の［測定］
この手順を本発明の何れかの硫酸化多糖類の評価に適用してよい。
【０１０５】
＜材料及び方法＞
試験はＬＴＣと称されるラット軟骨肉腫細胞系統由来の軟骨細胞培養物に対して実施した。
【０１０６】
ＬＴＣ細胞は重炭酸ナトリウム（３．７ｇ／Ｌ）、グルタミン（２ｍＭ）、アスコルビン酸（５０ｍｇ／Ｌ）、ゲンタマイシン（５０ｍｇ／Ｌ）及びウシ胎児血清ヒアロン（１０％）を添加したｐＨ７．４のＧｉｂｃｏＤＭＥＭ培地（Dulbecco´s Modification of Eagle´s Medium、Ｄｕｌｂｅｃｃｏの変性イーグル培地）（グルコース４．５ｇ／Ｌ含有）中で単層培養において維持した。
【０１０７】
コンフルエントとなったＬＴＣ（the confluent LTC）細胞培養物をトリプシン処理し、培養物０．５ｍＬ当たり４０，０００個の細胞を４８穴（well）プレートに播種した。これを５日間維持し、その間、各ウェルにグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）１５〜３０μｇを付着させた。
【０１０８】
培地を分離し、細胞の膜を異化培地｛重炭酸ナトリウム（３．７ｇ／Ｌ）、グルタミン（２ｍＭ）および１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１α（インターロイキン−１α）を添加したＤＭＥＭ＋４．５ｇ／Ｌグルコース、ｐＨ７．４｝５×１ｍＬを添加することにより洗浄した。その後、培養をこの培地２００μＬ中に維持し、４日間、化学実施例１のイヌリンポリ硫酸ナトリウム塩を添加又は無添加として、３７℃で培地を交換することなく行った。
【０１０９】
イヌリンポリ硫酸ナトリウム塩のアグリカン分解に対する作用を確認するために、ウエスタンブロット（Western Blot）を行った。
【０１１０】
ウエスタンブロットのためにｐＨ７．３の５０ｍＭトリス酢酸塩２０μＬを各ウェルに添加した。培養物（培地＋細胞の膜）を４時間３７℃でコンドロイチナーゼＡＢＣ５０ｍＵを用いて脱グリコシル化した。その後各ウェルの試料を回収し、１０分間１，４６０ｇで遠心分離した。上澄み２５μＬ画分を電気泳動で分離し（ゲル勾配８〜１２％ＳＤＳ ＰＡＧＥ）、抗アグリカン抗体Ｇ１を用いてウエスタンブロットにより分析した。Ｇ１はやはり抗ＮＩＴＧＥネオエピトープ特異性（neo-epiyope-specific）抗体を用いた免疫反応性により確認されたアグリカナーゼ活性の生成物である。抗血清を１：５，０００希釈で使用し、パーオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗−（ウサギＩｇＧ）はＡｍｅｒｓｈａｍＥＣＬキットを用いて検出した。
【０１１１】
［結果］
これは図１に示す通りであり、ここではウエスタンブロットを示すが、これはラット軟骨肉腫軟骨細胞培養に対して適用した種々の投与の結果を示している。この図において、ＩＬ−１αを軟骨細胞に投与したところアグリカン分解の増大が生じ、抗体ＮＩＴＧＥ Ｇ１で標識付けされたアグリカンフラグメントのバンドがより濃くなっている。一方、培養物にＩＬ−１αの存在下又は非存在下に化学実施例１のイヌリンポリ硫酸を投与したところ、アグリカンの分解は抑制され、上記したバンドはほぼ消失するまで狭小化した。結果として、イヌリンポリ硫酸は軟骨細胞培養物のアグリカン分解を低減することができ、この理由のため、変形性関節症を有する患者の症例における細胞外マトリックスの分解も停止できることになる。
【図面の簡単な説明】
【０１１２】
【図１】ウエスタンブロットを示す図である。上側の矢印は未損傷のアグリカンの領域を示し、下側の矢印は抗体ＮＩＴＧＥ Ｇ１で標識したアグリカンフラグメントの領域を示す。ウェルの第１番目には対照試料（無投与）；第２番目にはインターロイキン−１（ＩＬ−１α）を投与した試料；第３番目には化学実施例１のイヌリンポリ硫酸１００μｇ／ｍｌを投与した試料；そして第４番目にはＩＬ−１αおよび化学実施例１のイヌリンポリ硫酸１００μｇ／ｍｌを投与した試料を播種した。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類における変形性関節症の治療又は予防のための医薬の製造のための、イヌリン硫酸、ゲラン硫酸、プルラン硫酸、カードラン硫酸、硫酸化アルギン酸、ラミナリン硫酸及びペクチン硫酸からなる群より選択される、酸の形態の硫酸化多糖類又はその生理学的に許容される塩の使用。
【請求項２】
酸の形態の硫酸化多糖類又はその生理学的に許容される塩が、イヌリン硫酸、ゲラン硫酸、プルラン硫酸及びカードラン硫酸からなる群より選択される、請求項１記載の使用。
【請求項３】
前記硫酸化多糖類がイヌリン硫酸である、請求項２記載の使用。
【請求項４】
前記硫酸化多糖類がゲラン硫酸である、請求項２記載の使用。
【請求項５】
前記硫酸化多糖類がアルカリ金属又はアルカリ土類金属で完全又は部分的に塩化されている、請求項１から４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項６】
前記アルカリ金属がナトリウムである、請求項５記載の使用。
【請求項７】
ナトリウム塩の形態の硫酸化多糖類がイヌリン硫酸ナトリウム塩である、請求項６記載の使用。
【請求項８】
ナトリウム塩の形態の硫酸化多糖類がゲラン硫酸ナトリウム塩である、請求項６記載の使用。
【請求項９】
前記イヌリン硫酸ナトリウム塩が無水物基準で２５％から６２％の硫酸化度を示す、請求項７記載の使用。
【請求項１０】
前記硫酸化度が無水物基準で５５％から６２％である、請求項９記載の使用。
【請求項１１】
前記硫酸化多糖類が部分的に加水分解されている、請求項１記載の使用。
【請求項１２】
前記硫酸化多糖類が多硫酸化多糖類である、請求項１または１１に記載の使用。
【請求項１３】
前記多硫酸化多糖類がイヌリンポリ硫酸、ゲランポリ硫酸、プルランポリ硫酸、カードランポリ硫酸、ポリ硫酸化アルギン酸、ラミナリンポリ硫酸及びペクチンポリ硫酸からなる群より選択される、請求項１２記載の使用。
【請求項１４】
前記多硫酸化多糖類がイヌリンポリ硫酸である、請求項１３記載の使用。
【請求項１５】
前記イヌリンポリ硫酸がイヌリンポリ硫酸ナトリウム塩である、請求項１４記載の使用。
【請求項１６】
前記多硫酸化多糖類がゲランポリ硫酸である、請求項１３記載の使用。
【請求項１７】
前記ゲランポリ硫酸がゲランポリ硫酸ナトリウム塩である、請求項１６記載の使用。
【請求項１８】
哺乳類における変形性関節症の治療又は予防のための医薬の製造のためのカラギーナンポリ硫酸の使用。
【請求項１９】
哺乳類における変形性関節症の治療又は予防のための医薬の製造のための、イヌリン、ゲラン、プルラン、カードラン、アルギン酸、ラミナリン及びペクチンからなる群より選択される多糖類から誘導した、酸の形態の硫酸化オリゴ糖又はその生理学的に許容される塩の使用。
【請求項２０】
前記硫酸化オリゴ糖がイヌリンから誘導される、請求項１９記載の使用。
【請求項２１】
前記硫酸化オリゴ糖がゲランから誘導される、請求項１９記載の使用。
【請求項２２】
前記硫酸化オリゴ糖が多硫酸化オリゴ糖である、請求項１９から２１のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２３】
哺乳類における変形性関節症の治療又は予防のための医薬の製造のための、自身の構造がイヌリン硫酸、ゲラン硫酸、プルラン硫酸、カードラン硫酸、硫酸化アルギン酸、ラミナリン硫酸及びペクチン硫酸からなる群より選択される硫酸化多糖類の構造の部分に相当する、化学合成により製造された、酸の形態の硫酸化オリゴ糖又はその生理学的に許容される塩の使用。
【請求項２４】
前記医薬が経口投与のために適合される、請求項１から２３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２５】
前記医薬が関節内投与のために適合される、請求項１から２３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１】
哺乳類における変形性関節症の治療又は予防のための医薬の製造のための、イヌリン硫酸、ゲラン硫酸、プルラン硫酸、カードラン硫酸、硫酸化アルギン酸、ラミナリン硫酸及びペクチン硫酸からなる群より選択される、酸の形態の硫酸化多糖類又はその生理学的に許容される塩の使用。
【請求項２】
酸の形態の硫酸化多糖類又はその生理学的に許容される塩が、イヌリン硫酸、ゲラン硫酸、プルラン硫酸及びカードラン硫酸からなる群より選択される、請求項１記載の使用。
【請求項３】
前記硫酸化多糖類がイヌリン硫酸である、請求項２記載の使用。
【請求項４】
前記硫酸化多糖類がゲラン硫酸である、請求項２記載の使用。
【請求項５】
前記硫酸化多糖類がアルカリ金属又はアルカリ土類金属で完全又は部分的に塩化されている、請求項１から４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項６】
前記アルカリ金属がナトリウムである、請求項５記載の使用。
【請求項７】
ナトリウム塩の形態の硫酸化多糖類がイヌリン硫酸ナトリウム塩である、請求項６記載の使用。
【請求項８】
ナトリウム塩の形態の硫酸化多糖類がゲラン硫酸ナトリウム塩である、請求項６記載の使用。
【請求項９】
前記イヌリン硫酸ナトリウム塩が無水物基準で２５％から６２％の硫酸化度を示す、請求項７記載の使用。
【請求項１０】
前記硫酸化度が無水物基準で５５％から６２％である、請求項９記載の使用。
【請求項１１】
前記硫酸化多糖類が部分的に加水分解されている、請求項１記載の使用。
【請求項１２】
前記硫酸化多糖類が多硫酸化多糖類である、請求項１または１１に記載の使用。
【請求項１３】
前記多硫酸化多糖類がイヌリンポリ硫酸、ゲランポリ硫酸、プルランポリ硫酸、カードランポリ硫酸、ポリ硫酸化アルギン酸、ラミナリンポリ硫酸及びペクチンポリ硫酸からなる群より選択される、請求項１２記載の使用。
【請求項１４】
前記多硫酸化多糖類がイヌリンポリ硫酸である、請求項１３記載の使用。
【請求項１５】
前記イヌリンポリ硫酸がイヌリンポリ硫酸ナトリウム塩である、請求項１４記載の使用。
【請求項１６】
前記多硫酸化多糖類がゲランポリ硫酸である、請求項１３記載の使用。
【請求項１７】
前記ゲランポリ硫酸がゲランポリ硫酸ナトリウム塩である、請求項１６記載の使用。
【請求項１８】
哺乳類における変形性関節症の治療又は予防のための医薬の製造のためのカラギーナンポリ硫酸の使用。
【請求項１９】
哺乳類における変形性関節症の治療又は予防のための医薬の製造のための、イヌリン、ゲラン、プルラン、カードラン、アルギン酸、ラミナリン及びペクチンからなる群より選択される多糖類から誘導した、酸の形態の硫酸化オリゴ糖又はその生理学的に許容される塩の使用。
【請求項２０】
前記硫酸化オリゴ糖がイヌリンから誘導される、請求項１９記載の使用。
【請求項２１】
前記硫酸化オリゴ糖がゲランから誘導される、請求項１９記載の使用。
【請求項２２】
前記硫酸化オリゴ糖が多硫酸化オリゴ糖である、請求項１９から２１のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２３】
哺乳類における変形性関節症の治療又は予防のための医薬の製造のための、自身の構造がイヌリン硫酸、ゲラン硫酸、プルラン硫酸、カードラン硫酸、硫酸化アルギン酸、ラミナリン硫酸及びペクチン硫酸からなる群より選択される硫酸化多糖類の構造の部分に相当する、化学合成により製造された、酸の形態の硫酸化オリゴ糖又はその生理学的に許容される塩の使用。
【請求項２４】
前記医薬が経口投与のために適合される、請求項１から２３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２５】
前記医薬が関節内投与のために適合される、請求項１から２３のいずれか１項に記載の使用。
【図１】
【公表番号】特表２００７−５２３９２５（Ｐ２００７−５２３９２５Ａ）
【公表日】平成１９年８月２３日（２００７．８．２３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５０００９２（Ｐ２００７−５０００９２）
【出願日】平成１７年２月１１日（２００５．２．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００５／００１３９０
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０８４６１０
【国際公開日】平成１７年９月１５日（２００５．９．１５）
【出願人】（５０６０４１７０７）バイオイベリカ ソシエダッド アノニマ (6)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年８月２３日（２００７．８．２３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年２月１１日（２００５．２．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００５／００１３９０
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０８４６１０
【国際公開日】平成１７年９月１５日（２００５．９．１５）
【出願人】（５０６０４１７０７）バイオイベリカ ソシエダッド アノニマ (6)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]